KR20070104881A - 말라리아 프라임/부스트 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 적절한 항원보강제하에서, RTS,S와 같은 정제된 재조합 단백질 백신 및 플라즈모듐 팔시파륨(Plasmodium falciparum) 유래의 항원을 코드하는 핵산을 갖는 낮은-중성화 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하여 특이한 프라임/부스트 요법을 적용하는 새로운 백신 요법에 관한 것이다.

말라리아, 항원보강, 플라즈모듐 팔시파륨, 재조합 아데노바이러스, 포자소체(CS) 항원, 프라임/부스트

Description

말라리아 프라임/부스트 백신{Malaria prime/boost vaccines}

본 발명은 약물 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 열대열 말라리아(falciparum malaria)의 예방을 위하여 항원보강제(애쥬번트) 하에서 재조합으로 생성된 아데노바이러스 벡터 및 정제된 단백질을 사용하는 새로운 프라임/부스트 백신 전략에 관한 것이다.

현재 말라리아는 전 세계적으로 열대 및 아열대 지방에서 가장 만연된 전염병 중 하나로 나타난다. 해마다, 말라리아 감염이 개발도상국과 신생국들에서 270만명에 달하는 인간들을 사망하게 한다. 말라리아의 광범위한 발생과 증가된 출현은 약제 내성 원충과 살충제 내성 원충 벡터의 수가 증가하고 있기 때문이다. 다른 요인은 환경 및 기후의 변화, 사회 불안, 및 인구의 증가된 이동성을 포함한다.

말라리아는 플라즈모듐(Plasmodium) 속에 속하는 모기-유래 혈액 원생동물(hematoprotozoan) 원충(parasite)에 의하여 유발된다. 4종류의 플라즈모듐 원생동물(P. falciparum , P. vivax , P. ovale , 및 P. malariae)이 인간의 질병의 원인이 되고; 피. 요엘리(P. yoelii) 및 피.베르게이(P.berghei)와 같은 많은 다른 종류가 동물 질병을 유발한다. 피.팔시파륨(P.falciparum)은 인간에 있어서 대다수의 감염에 책임이 있고 가장 치명적인 형태이다. 말라리아 원충은 4가지 분리된 단계로 이루 어진 생체 사이클을 가진다. 이들 단계 각각은 이 원충을 향한 특이적 면역반응과 상응하여 발생하는 단계-특이적 항원을 유도할 수 있으나, 자연적으로 유도된 말라리아는 재감염을 방지하지 못한다.

말라리아 원충은 여러 종류의 암컷 아노펠레스(Anopheles) 모기에 의하여 인간에게 전달된다. 감염된 모기는 포유동물의 혈류로 말라리아 원충의 포자소체(sporozoite)를 주입한다. 포자소체는 간세포 침입 전 순환계에서 수분간 유지된다. 이 단계에서 이 원충은 세포외 환경에 위치하고, 주로 포자소체 표면의 주성분인 포자소체(circumsporozoite: CS) 막단백질에 대한 항체의 공격에 노출된다. 일단, 간에서 이 원충은 복제되어 분열체(schizont)로 발전된다. 이 단계 동안, 침입한 원충은 감염된 세포당 20,000 이하의 딸 분열소체(merozoite)를 생성하여 무성 증식할 것이다. 원충의 이러한 세포내 단계 동안 숙주 면역반응의 주 활동자는 T-임파구, 특히 CD8+ T-임파구이다(Romero et al. 1989). 간 감염의 약 1주일 후 수천 개의 분열소체가 혈류로 해리되어 적혈구들(RBC's)로 들어가서 항체 매개 면역 반응과 T-세포 분비 시토킨의 표적이 된다. 적혈구를 침입한 후, 분열소체는 여러 단계의 복제를 거쳐 영양체(trophozoite) 및 분열체로 형질전환되어 새로운 세대의 분열소체를 생성하고 이어서 새로운 RBC's를 감염시킨다. 적혈구 단계는 명백한 임상적 질병과 관련된다. 보다 소수의 영양체가 원충의 유성 단계인 암 또는 수 생식모세포(gametocyte)로 발전한다. 감염되기 쉬운 모기가 생식모세포를 섭취한 경우 이들 생식세포의 번식은 접합체 형성 및 이어서 운동접합체(ookinete), 그 다음 난포낭(oocyst), 그리고 최종적으로 포자소체로의 형질전환을 유도하는데, 이는 타액 선으로 이동하여 사이클을 완성하게 한다.

원충의 체내로의 유입을 일으키는 병원균-특이적 면역반응의 두 가지 주요 지류는 세포성 및 체액성이다. 한 지류인 세포성 반응은 면역 반응에 참여하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포와 관련된다. 세포독성 T 임파구(CTL's)는 CD8을 발현하고 세포 표면상의 병원성 항원을 발현하는 감염된 세포들을 특이적으로 사멸시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 T 헬퍼 세포는 CTL's의 성장을 도와주고, 다양한 시토킨을 생산하고, 그리고 또한 B 세포가 분화되어 항원들에 특이적인 항체를 생산하도록 유도하는 것을 돕는다. 체액성 반응 동안, 특정 항원에 특이적인 B 세포는 활성화, 복제, 분화되어 항원-특이적 항체를 생산한다.

면역반응의 두 지류 모두가 말라리아 감염을 방어하는 것과 관련이 있다. 감염성 포자소체가 간으로 이동하여 간세포로 들어갈 때, 포자소체들은 세포내 병원균이 되어, 감염된 세포밖에서는 거의 머물지 않는다. 이 단계에서 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포가 특히 중요한데, 이는 이들 T 세포와 인터페론-γ(IFN-γ)와 같은 이들의 시토킨 생성물이 감염된 숙주 간세포의 사멸에 기여하기 때문이다. 쥣과 말라리아 모델에서 세포내 간 원충의 제거는 간 단계 원충에 의하여 발현된 펩티드에 대항하여 유도된 CD8+ T 세포 반응에 의존하는 것으로 발견된다(Hoffman and Doolan, 2000). CD8+ T 세포의 고갈은 포자소체 도전에 대한 방어를 저지하고, 실험 대상이 아닌 동물에 CD8+ T 세포를 양자 전이하는 것은 방어작용을 부여한다.

분열소체가 RBC's에서 복제되는 적혈구 단계에 말라리아 감염이 도달할 때, 분열소체는 혈류에서 자유로이 순환하는 것이 또한 발견된다. 적혈구가 T 세포와 동족 상호작용을 위하여 요구되는 클래스 I 또는 II MHC 분자 중 하나를 발현하지 않기 때문에, 항체 반응이 이 단계에서 가장 중요하다고 생각된다. 결론적으로 원충이 인체 내에서 발생하는 다른 단계를 다루기 위한 강한 세포성 면역 반응뿐만 아니라 강한 체액성 면역 반응을 유도한다면 가능한 말라리아 백신 접근이 가장 유용할 것이다.

말라리아 백신 발전에 대한 현재의 접근은 상기한 바와 같은 원충의 다른 발전적 단계에 따라 분류될 수 있다. 가능한 백신의 세 가지 형태는 구별될 수 있다:

- 포자소체 및/또는 분열체-감염된 간세포에 대항하여 유도된 예비-적혈구성 백신. 역사적으로, 이러한 접근은 (CS)-기저 전략에 의하여 지배되어 왔다. 감염의 예비-적혈구 단계가 무증후성이므로, 예비-적혈구 백신은 이상적으로 멸균 면역을 부여하고, 체액성 및 세포성 면역에 의하여 중재되고, 잠복성 말라리아 감염을 완전히 방어해야만 한다.

- 감염된 RBC 또는 분열소체 그 자체에 대항하여 유도된 무성 혈액 단계 백신은 임상적 심각성을 최소화하도록 디자인된다. 이들 백신은 질병률과 사망률을 감소시켜야만 하고 원충이 적혈구에 들어가고/들어가거나 발전하는 것을 방지한다는 것을 의미한다.

- 모기 숙주에서 원충 성장을 방해하도록 디자인된 전달-차단 백신. 이 형태의 백신은 전체 인구 말라리아 감염율 감소에 기여해야만 한다.

최종적으로, 원충 생체 사이클의 다단계를 목표로 하는 개발중인 조합 말라리아 백신의 실현 가능성은 소위 다성분 및/또는 다단계 백신에서 추구되고 있다.

말라리아에 대한 백신의 개발이 30여년 전부터 시작되었음에도 불구하고, 말라리아에 대한 상업적으로 유용한 백신이 현재 존재하지 않는다. 방사선-감쇠된 포자소체로 설치류, 비-인간 영장류, 및 인간을 면역화하는 것은 생존하는 포자소체들의 연속적 도전에 대한 방어작용을 부여한다(Nussenzweig et al. 1967; Clyde et al. 1973). 그러나, 현재까지 방사선 조사된 포자소체의 생산을 위한 실현 가능한 대규모 배양 시스템의 비용과 부족이 이러한 백신의 광범위한 적용을 방해하고 있다(Luke et al. 2003).

현재까지, 인간에게 시험된 가장 유망한 백신 후보는 소수의 포자소체 표면 항원에 기초하고 있다. CS 단백질은, 흔히 충분하지 않은 수준임에도 불구하고, 모기-유래의 감염에 대하여 인간에게 활성 면역의 기초로 사용될 때 말라리아를 지속적으로 예방하는 것으로 입증된 유일한 피.팔시파륨(P.falciparum)이다. 이론적인 분석은 백신 효율뿐만 아니라 백신 방어 범위가 85% 이상이어야만 하고, 그렇지 않으면 더 전염성 강한 돌연변이가 고질적 지역에서 탈출할 수 있다고 하였다(Gandon et al. 2001).

포유동물에서 면역 반응을 유발하는 한가지 방법은 그 게놈에 항원을 코드하는 핵산을 보유한 감염성 벡터를 투여하는 것에 의한 것이다. 이러한 담체는 E1 영역과 같이 일반적으로 복제에 필수적인 게놈 내의 영역을 제거하여 복제-결함으로 만들어버린 재조합 아데노바이러스이다. 항원 코드 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 예는 당해 기술분야에서 공지되어 있다(WO 96/39178). 예를 들어, 재조합 아데노바이러스에 의하여 운반된다면, HIV-유래의 항원 성분들이 면역 반응을 제공할 수 있다는 것이 입증되었다(WO 01/02607; WO 02/22080; US 6,733,993). 말라리아에서, 재조합 아데노바이러스-기저 백신이 개발되어 왔다. 이들 벡터는 마우스 말라리아 모델 중 하나인 피.요엘리(P.yoelii)의 전체 CS 단백질을 발현하고, 이들 벡터는 단일 면역화 투여량에 반응하여 마우스에서 멸균 면역을 유도할 수 있는 것으로 나타났다(Bruna-Romero et al. 2001). CD8+ T 세포가 주로 이 아데노바이러스-유도 방어를 매개한다는 것이 입증되었다.

고 비율의 개체가 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)과 같은 일반적으로 사용되는 아데노바이러스 벡터에 대하여 기존 면역을 가지기 때문에, 오직 낮은 비율의 건강한 개체에서만 항체를 중화하는 형태로 재조합 복제-결함 아데노바이러스가 기존 면역에 대항하는 혈청형들에 기초하는 새로운 기술들이 이 기술 분야에서 발전되었다. 이들 혈청형은 저-중화된 혈청형 또는 희귀 혈청형으로 일반적으로 불린다. 특히 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49, 및 Ad50이 사용된다는 것이 발견되었다(WO 00/70071; WO 02/40665; WO 2004/037294; WO 2004/083418; Vogels et al. 2003).

피.팔시파륨 CS 단백질을 발현하는 플라즈미드를 함유하는 DNA-기저 백신이 Vical, Inc. San Diego, CA, USA 및 Naval Medical Research Center에 의하여 개발되었다(Horn et al. 1995). 마우스 모델에 대한 연구는 항원-특이적 CTL의 유도와 플라즈미드 DNA로 면역화하는 것으로 이어지는 항체 반응을 실증하였다(Doolan et al. 1998). 그러나 현재까지의 DNA 백신의 유일한 사용은 인간에서 방어적 면역 반응을 유도하기 위한 차선책임을 보여주었다. 이들의 CTL 반응이 중요하기는 하지 만, DNA 백신을 사용하여 백신접종된 지원자들은 재조합 및 합성 펩티드에 대한 ELISA와 대기 중 건조된 포자소체에 대한 간접적 형광 항체 테스트(IFAT)에 의하여 측정된 CS 단백질에 대한 항체가 생기지 않는다는 것을 발견하였다(Wang et al. 2001).

대조적으로, RTS,S(정제 단백질) 말라리아 백신 접근(Gordon et al. 1995; US 6,306,625; WO 93/10152)이 CS 단백질에 대한 강력한 항체 반응을 유도할 수 있는(Kester et al. 2001; Stoute et al. 1997 and 1998) 반면, 이것은 Th1 타입 세포성 및 체액성 면역의 강력한 유도제이기도 하다. 가장 중요하게는, 이 백신이 거의 절반의 피접종자를 반복적으로 방어할 수 있다는 것이다. 그러나, RTS,S에 의하여 발생한 방어는 단기간 지속된다(Stoute et al. 1998). RTS,S로 면역화하는 것은 항-CS 항체 및 CD4+ T세포-의존성 IFN-γ 반응을 유도하지만, CD8+ T세포-의존성 CTL 또는 IFN-γ 반응 유도에는 열등하다(Lalvani et al. 1999). 그러나, 생성된 이들 최소한의 CD8+ 반응이 인간에 대한 시도에서 방어와 관련된다는 것이 입증되었다(Sun et al. 2003). 따라서, 합리적인 개선점은 RTS,S에 의하여 유도된 CS에 대한 CD8+ T 세포 반응의 유도 향상에 초점이 맞추어질 것이다.

85% 이상의 방어율을 갖는 팔시파륨 말라리아 백신을 개발하는 과제는 아직 해결되지 않았다. 홍역이나 천연두와 같이 흔한 다른 치명적 질병과는 달리 말라리아 사전 노출과 천연 면역의 전개는 이어지는 말라리아 감염을 방어하지 못하기 때문에 이 작업은 특히 어렵다. 현재까지 시험된 모든 백신 후보와 백신 전달 전략 중 오직 RTS,S만이 어느 정도의 방어 수준을 지속적으로 제공해왔다. 다른 시험된 후보물질들은 면역이 생기도록 하기에는 부적절하거나 또는 면역성은 있으나 적절하게 방어하지 못했다.

본 발명은 재조합 복제-결함 아데노바이러스 벡터에 의하여 제공된 매우 우수한 세포성 반응의 유도와 함께 단백질/항원보강제 접근의 적절한 혈청학적 면역성의 장점을 이용하도록 디자인된 백신 제제의 전략적 조합을 개시한다.

발명의 요약

본 발명은 적절한 부형제내 복제-결함 재조합 아데노바이러스; 및 항원보강된(adjuvated) 단백질성 항원을 포함하는 성분(parts)의 키트(kit)에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 말라리아-유발 원충 유래의 포자소체항원 (circumsporozoite(CS) antigen)을 코드하는 이종성 핵산을 포함하고; 상기 단백질성 항원 또한 바람직하기는 말라리아-유발 원충 유래인 것이고; 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 단백질성 항원은 RTS,S를 포함한다. 바람직한 말라리아-유발 원충은 플라즈모듐 팔시파륨(Plasmodium falciparum: 열대열원충)이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 또한 말라리아 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 말라리아-유발 원충 유래인 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산 및 바람직하게는 플라즈모듐 팔시파륨과 같은 말라리아-유발 원충 유래인 항원보강된 단백질성 항원을 포함하는 복제-결함 재조합 아데노바이러스의 용도에 관한 것으로, 상기 재조합 아데노바이러스는 시미안 아데노바이러스 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 또는 50이다.

본 발명은 특정한 바람직한 프라임-부스트 요법을 개시하는데, 여기에서 복제-결함 재조합 아데노바이러스가 프라임 조성물로 사용되고, 항원보강된 단백질성 항원이 부스트 조성물로 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 적절한 부형제에서 복제-결함 재조합 아데노바이러스로 포유동물을 프라임하고, 그리고 항원보강된 단백질성 항원, 바람직하게는 RTS,S로 상기 포유동물을 부스트하는 단계를 포함하는 말라리아 감염에 대한 포유동물의 백신접종 방법에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 말라리아-유발 원충 유래의 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제에 복제-결함 재조합 아데노바이러스; 및 항원보강된 단백질성 항원을 포함하는 성분의 키트(kit)에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 말라리아-유발 원충 유래의 포자소체(CS) 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함하고; 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 35이다. 또한 바람직하기는 본 발명에 따른 키트에서, 상기 단백질성 항원이 말라리아-유발 원충 유래의 CS 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것이다. 상기 단백질성 항원은 B형 간염 바이러스 유래 표면 항원(HBsAg)을 갖는 지단백(lipoprotein) 입자의 형태로, HBsAg에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것이 바람직하다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 단백질성 항원은 RTS,S를 포함한다. 상기 단백질성 항원은 바람직하기는 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제에서, QS21 및 3D-MPL로 항원보강된 것이 또한 바람직하다.

비록 당업계에 다른 원충들이 인간에게 말라리아를 발병시킨다는 것이 공지되어 있으나, 본 발명의 한 구체예는 본 발명에 따른 성분의 키트에서 말라리아-유발 원충이 플라즈모듐 팔시파륨인 것이다.

적절한 면역 반응을 위하여, 포유동물, 바람직하게는 인간에서 코드화된 단백질의 생성 증가를 위하여 상기 이종성 핵산은 코돈-최적화된 것이 바람직하다. 재조합 아데노바이러스는 항원보강제(애쥬번트)와의 혼합물로 존재할 수 있다.

인간 유전자 요법 또는 백신에 사용하기 위한 시미안 아데노바이러스의 적용가능성은 당업자에게 잘 이해될 수 있다. 이 외에, 개과와 소과 아데노바이러스와 같은 다른 비-인간 아데노바이러스는 인 비트로에서 인간 세포를 감염시키는 것으로 발견되었고, 따라서 이들의 혈청 발병률은 인간 샘플에서 낮기 때문에, 인간용으로 적용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약학적으로 허용가능한 부형제에 복제-결함 재조합 시미안, 개과, 소과 아데노바이러스; 및 RTS,S를 포함하는 항원보강된 단백질성 항원을 포함하는 성분의 키트에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 플라즈모듐 팔시파륨 유래의 코돈-최적화된 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함하며, 상기 단백질성 항원이 바람직하기는 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제에서, QS21 및 3D-MPL로 항원보강된 것이 또한 바람직하다.

본 발명에서는, 개시된 성분의 키트의 다른 성분들이 특정 순서로 투여된다면, 면역 반응에 있어서 특정한 프라임-부스트 요법이 예상되지 못한 놀라운 결과를 제공한다는 것을 개시한다. 따라서, 본 발명은 또한 복제-결함 재조합 아데노바이러스가 프라임 조성물이고, 항원보강된 단백질성 항원이 부스트 조성물인 본 발명에 따른 성분의 키트에 관한 것이다. 백신의 단일 투여(프라임)로 촉발된 면역반응은 흔히 효율적인 방어를 제공하는데 있어 충분히 강력하지 못하고/못하거나 충분히 지속적이지 못하다. 반복적 투여(부스트)는 백신 항원에 대한 체액성 및 세포성 반응을 현저하게 향상시킬 수 있다(예: Estcourt et al. 2002 참조).

본 발명은 또한 말라리아 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 말라리아-유발 원충 유래의 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산 및 항원보강된 단백질성 항원을 포함하는 복제-결함 재조합 아데노바이러스의 용도에 관한 것으로, 상기 재조합 아데노바이러스는 시미안, 개과, 소과의 아데노바이러스 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 또는 50이며, 상기 복제-결함 재조합 아데노바이러스가 프라임 조성물로 사용되고 상기 항원보강된 단백질성 항원이 부스트 조성물로 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 키트의 용도에 관한 것으로, 단백질성 항원이 말라리아-유발 원충, 바람직하게는 플라즈모듐 팔시파륨 유래의 CS 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것이다. 상기 단백질성 항원은 B형 간염 바이러스 유래의 표면 항원(HBsAg)을 갖는 지단백 입자의 형태로, HBsAg에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것이 바람직하다. RTS,S가 바람직한 항원보강된 단백질성 항원이기는 하지만, 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제에서는 바람직한 항원보강제는 QS21 및 3D-MPL인 것이다.

포유동물, 바람직하게는 인간에서 적절한 면역 반응으로 이어지는 최적의 발현을 위하여, 본 발명에 사용되는 이종성 핵산은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 코드화된 단백질의 생산을 증가시키도록 코돈-최적화된 것이다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 부형제에서 복제-결함 재조합 아데노바이러스로 포유동물을 프라임하고, 그리고 HBsAg를 갖는 지단백 입자의 형태로, HBsAg에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 항원보강된 단백질성 항원으로 상기 포유동물을 부스트하는 단계를 포함하는 말라리아 감염에 대한 포유동물의 백신접종 방법에 관한 것으로, 상기 아데노바이러스는 말라리아-유발 원충 유래의 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함한다. 단백질성 항원은 바람직하기는 RTS,S을 포함하고, 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제에서는 바람직하기는 항원보강제가 QS21 및 3D-MPL인 것이며, 바람직한 말라리아-유발 원충은 플라즈모듐 팔시파륨이다.

본 발명의 방법에서 사용되고, 재조합 아데노바이러스를 생산하기 위하여 사용되는 바람직한 아데노바이러스는 인간 또는 비-인간 아데노바이러스, 예를 들어 시미안-, 개과-, 및 소과 아데노바이러스일 수 있는데, 이는 재조합 바이러스가 투여되는 (인간) 숙주에서 기존의 면역과 충돌하지 않는 아데노바이러스를 사용하는 것이 매우 바람직하기 때문이다. 여기 개시된 바와 같이 이를 위하여 시미안 아데노바이러스와 특정한 혈청형의 인간 아데노바이러스가 매우 적합하다. 본 발명에 따른 방법, 용도, 및 성분의 키트에 사용되는 바람직한 인간 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 성분의 키트를 사용하여 말라리아 감염에 대해 포유동물을 백신접종하는 방법에 관한 것이다. 만약 본 발명에 따른 성분의 키트가 여기 개시된 바와 같이 바람직한 프라임-부스트 요법을 이용하여 말라리아 감염에 대해 포유동물을 백신접종하기 위하여 사용된다면, 부스트는 한번 이상의 연속적인 부스트로 이어지는 것이 바람직하다.

본 발명은 프라임/부스트 요법에서 하나의 항원보강된 단백질과 이종의 조합으로 사용되고, 그리고 하나 이상의 말라리아 항원의 담체로서의 재조합 아데노바이러스의 용도에 관한 것이다. 놀랍게도 이종의 프라임/부스트 요법에 바이러스 벡터와 항원보강된 단백질을 조합하는 것은 초기 T 세포 반응과 면역 반응의 지속성 면에서 영장류에 우수한 면역 반응을 제공한다는 것이 발견되었다. 특히, 항원을 코드하는 핵산을 운반하는 바이러스 벡터로 포유동물을 프라임한 다음 항원보강된 단백질성 항원을 단일 또는 수회 주사함으로써 부스트하는 것이 양적 그리고/또는 질적 면역 반응의 면에서 우수한 결과를 제공하다는 것이 발견되었다. 바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이고, 더 바람직하기는 인간 아데노바이러스 벡터이고, 보다 더 바람직하기는 투여되는 포유동물 숙주에 낮은 수준의 중화활성을 일으키는 인간 아데노바이러스 벡터이다. 매우 바람직한 혈청형은 아데노바이러스 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50이다.

바람직한 구체예에 따르면, 바이러스 벡터에 의하여 코드되는 항원과 단백질성 항원은 말라리아 항원이고, 더 바람직하기는 플라즈모듐 팔시파륨 포자소체(CS) 단백질, 또는 면역원성 유도체 및/또는 이의 단편이다. 이 개념의 한 예로써, 바이러스 벡터에 의하여 코드되는 폴리펩티드는 N-말단부, 중앙 부분 반복 영역, (최대 14개의 C-말단 아미노산: GPI 앵커(anchor) 서열이 결실된) C-말단부를 포함하여, 피.팔시파륨 CS 단백질을 코드하는 핵산을 포함하는 반면, 단백질성 항원은 N-말단 영역이 부족한 구조체 RTS,S를 포함한다.

본 발명의 어떤 면 또는 모든 면에서 사용하기 위한 항원보강된 단백질성 항원은 융합 단백질 형태일 수 있는 피. 팔시파륨 유래 CS 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 B형 간염 바이러스 유래의 표면 항원(HBsAg)에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있는데, 하이브리드 단백질은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 발현될 수 있고, 지단백 입자 형태를 가질 수도 있다. 융합 단백질은 예를 들어 실질적으로 CS 단백질의 C-말단부 전체, 면역 지배 영역의 4 이상의 단위 반복부(tandem repeat), 및 B형 간염 바이러스 유래 표면 항원(HBsAg)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 단백질은 CS 단백질의 C-말단부에 실질적으로 상동인 160개 이상의 아미노산을 갖는 서열을 포함하고, CS 단백질의 C-말단으로부터 단부 아미노산들, 예를 들어 마지막 10 내지 12개의 아미노산이 없을 수 있다. 하이브리드 단백질은 예를 들면 HBsAg를 갖는 혼합된 지단백 입자 형태일 수 있다.

특히, WO 93/10152에는 "RTS^*"로 정의되어 있지만, 여기에서는 "RTS"로 지칭되는 하이브리드 단백질이 상기 문헌에서 제공되는데, 여기서 RTS,S로 정의된 HBsAg를 갖는 혼합된 지단백 입자의 형태일 수 있다. 이 혼합된 입자에서 하이브리드 단백질:S 항원의 비는 예를 들어 1:4이다.

여기서 "RTS"로 정의된 하이브리드 단백질은 피.팔시파륨 NF54 (클론 3D7: Caspers et al. 1989) 유래 CS 단백질 유전자 서열을 사용하여 생성되었고, 실질적으로 피.팔시파륨 NF54 유래 CS 단백질의 전체 영역 207 내지 395를 포함한다. RTS에 포함된 NF54 (3D7) CS 단백질 서열의 부분은 다음의 189개 아미노산 서열이다:

특히 RTS는:

- 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) TDH3 유전자 서열로부터 유도된 뉴클레오티드 1059-1061로 코드되는 메티오닌 잔기(이 판독 프레임 내 뉴클레오티드 1-1058가 TDH3 프로모터 그 자체를 구성한다)(Must et al. 1983)

- 하이브리드 유전자를 구축하기 위해 사용되는 클로닝 공정에 의하여 창조된 뉴클레오티드 서열(1062-1070)로부터 유래되는 세 아미노산: Met Ala Pro.

- 피. 팔시파륨 균주 NF54의 CS단백질의 아미노산 207 내지 395를 나타내는 1071-1637에 의하여 코드되는 (위의 SEQ ID NO: 1으로 주어진) 189개 아미노산 스트레치(클론 3D7; Caspers et al. 1989)

- 하이브리드 유전자를 구축하기 위해 사용되는 클로닝 공정에 의하여 창조된 뉴클레오티드 1638 내지 1640에 의하여 코드되는 아미노산(Gly)

- 뉴클레오티드 1641 내지 1652에 의하여 코드되고, B형 간염 바이러스(adw 혈청형) preS2 단백질의 4개의 카르복시 말단 잔기를 나타내는 네개의 아미노산: Pro Val Thr Asn(Valenzuela et al. 1979).

- 뉴클레오티드 1653 내지 2330에 의하여 코드되고, B형 간염 바이러스(adw 혈청형)의 S 단백질을 특성화하는 226개 아미노산의 스트레치(Valenzuela et al. 1979)

RTS는 RTS:S의 비가 예를 들어 1:4인 혼합 입자 형태인, RTS,S일 수 있다.

본 발명이 결코 말라리아 항원으로 한정되지는 않는다 하더라도, 본 발명은 항원보강된 단백질성 말라리아 항원과 함께 말라리아 항원을 코드하는 바이러스 벡터를 사용하여 매우 상세하게 설명될 것이다. 당업자는 원충, 박테리아, 바이러스, 이스트, 또는 심지어는 이에 한정되지는 않지만, 종양 항원(예: PSA, gp100, CEA, MUC1, Her2/neu)을 포함하는 자기-항원 등을 포함하여 다른 병원체 제제로부터 다른 항원성 삽입체 및 상응하는 단백질성 항원을 사용하여 여기 제공된 일반적 개시사항을 수정할 수 있을 것이다.

본 발명은 플라즈모듐 팔시파륨의 항원을 코드하는 이종성 핵산 서열을 포함하는 복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다, 바람직한 구체예에서, 상기 바이러스 벡터는 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49, 및 Ad50으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혈청형에서 유래된 아데노바이러스이다. 인간 아데노바이러스를 선택하는 이유는 인간이 통상적인 감기와 같이 가볍거나 불현성인 질병을 유발하는 야생형 아데노바이러스에 주기적으로 감염된다는 사실에 의하여 일반적으로 아데노바이러스를 백신 벡터로서 사용하는 것이 전형적으로 방해되기 때문이다. 이처럼 어버이의 야생형 혈청형으로 감염되는 동안 생겨난 면역 반응은 아데노바이러스가 투여되는 말라리아에 대한 백신과 같은 것이 다음에 재조합 백신 벡터로 사용될 때 재조합 아데노바이러스 혈청형의 효율에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 전세계적으로 분포된 인류에 다른 아데노바이러스 혈청형의 분포는 지리적 영역마다 다르다. 일반적으로, 바람직한 혈청형은 당업계에서 몇몇 보고서에 정리된 바와 같이 세계 대부분의 지역에서 숙주에서 낮은 중화 활성을 직면한다.

본 발명의 발명자들은 백신화 요법이 프라임/부스트 백신의 다른 성분에 의하여 유도된 다른 면역반응을 이용하는, 이종성 프라임/부스트로 지칭되는 이어지는 백신화 요법에 있어서 재조합 아데노바이러스와 정제된 단백질 사이의 새로운 조합을 지금 완성하게 되었다. 재조합 벡터의 선택은 백신접종이 필요한 낮은 비율의 인간 집단에서 중화 활성을 직면하는 것으로 영향을 받는다. 놀랍게도, 아데노바이러스-벡터화 항원과 항원보강된 단백질 항원의 조합은 면역반응에서 양쪽 백신 중 하나를 사용하여 보여지는 면역반응을 넘는 현저한 향상을 제공한다. 여기 개시된 바와 같이, 면역 향상은 레소스 머카크(rhesus macaques)에 인 비보로 주어진 면역 반응을 인 비트로로 감지하여 설명된다.

다른 구체예에서, 재조합 복제-결함 아데노바이러스는 침팬지에서 단리된 것과 같은 시미안 바이러스이다. 적절한 예는 C68(Pan 9로도 알려짐; US 6,083,716) 및 Pan 5, 6, 및 7을 포함한다(WO 03/046124).

본 발명의 한 구체예에 있어서, 복제-결함 재조합 바이러스 벡터는 CS 단백질을 코드하는 핵산 서열, 또는 면역원성 부분 또는 이의 단편을 포함한다. 바람직하기는, 상기 이종성 핵산 서열은 포유동물, 바람직하기는 인간에서 증가된 발현을 위하여 코돈-최적화된 것이다. 코돈-최적화는 요구되는 아미노산 함량, 원하는 포유동물에서 일반적인 최적의 코돈 사용, 및 적절한 발현을 보장하기 위하여 피해야만하는 다수의 상황들에 기초한다. 이러한 상황들은 스플라이스 공여자 또는 -수여자 부위, 정지 코돈, Chi-부위, 폴리(A) 스트레치, GC- 및 AT-풍부 서열, 내부 TATA 박스 등일 수 있다. 포유동물 숙주를 위한 코돈 최적화 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 분자 생물학 문헌 내 여러 곳에서 발견될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 이종성 핵산의 아데닌 플러스 티민 함량이 시토신 플러스 구아닌 함량에 비하여 87% 미만, 바람직하기는 80% 미만, 더 바람직하기는 59% 미만, 가장 바람직하기는 약 45%인, 본 발명에 따른 복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 한 구체예에서 CS 단백질이 WO 2004/055187호에 개시된 CS 단백질 중 하나이고, 가장 바람직하기는 피. 팔시파륨 유래 CS 단백질 또는 이의 면역원성 단편인 복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다.

이종성 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스 벡터의 생산은 당해 기술분야에 공지되고, 전형적으로 패키지 세포주, 어댑터 구조체 및 코즈미드의 사용과 아데노바이러스 게놈 유래 E1 영역의 적어도 기능성 부분의 결실을 포함한다(패키지 시스템 및 바람직한 세포주에 대한 하기 기재를 참조).

본 발명은 또한 성분들을 포함하는 키트에 관한 것으로서, 상기 성분들은 한편으로는 숙주에서 낮은 중화활성에 직면하는 재조합 아데노바이러스 벡터와 다른 한편으로는 정제된 단백질, 여기서 정제된 단백질이 항원보강제와 혼합하여 제공되는 것이 바람직한 것이다. 바람직한 항원보강제는 QS21 및 3D-MPL로서, 바람직하기는 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제 내에 있는 것이다. 상기 성분들은 이종성 프라임/부스트 백신 전달 전략에 사용되는 데, 여기서 프라임 제제로 재조합 아데노바이러스 벡터를 먼저 투여한 다음 부스트 제제로서 정제된 단백질을 투여하는 것이 바람직하며, 부스트는 한 번 이상 반복될 수 있다. 전형적으로 상기 성분들은 약학적으로 허용가능한 담체 내에 유지된다. 약학적으로 허용가능한 담체들은 당업계에 널리 알려져 있고, 광범위한 치료제에 널리 사용된다. 바람직하기는, 담체가 백신 내에서 잘 작동하도록 투여된다. 더 바람직한 것은 항원보강제를 더 포함하는 백신이다. 항원보강제는 투여된 항원에 대한 면역 반응을 더 증가시키기 위하여 당업계에 공지된 것이다. 본 발명은 또한 말라리아의 치료적, 예방적, 또는 진단적 처치에 본 발명에 따른 키트를 사용하는 것에 관한 것이다.

본 발명은 포유동물에서 말라리아 감염을 예방하거나 말라리아 감염에 대하여 포유동물을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 피.팔시파륨의 항원을 운반하는 재조합 아데노바이러스를 투여하는 단계; 및 하나 이상의 정제된 피.팔시파륨 단백질을 투여하는 단계(어느 순서든지 또는 동시에)를 포함하고, 상기 단백질이 항원보강제와 혼합된 것이다. 바람직하기는 재조합 아데노바이러스는 Ad11, Ad24, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, 및 Ad50으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것으로, 이 재조합 아데노바이러스는 CS 단백질을 코드하는 유전자 또는 이의 면역원성 단편을 갖는 것이 바람직하다. 재조합 아데노바이러스와 함께 사용되는 바람직한 정제 단백질은 RTS,S인 반면, 바람직한 항원보강제는 QS21 및 3D-MPL로서, 바람직하기는 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제 내에 있는 것이다.

면역 반응의 전개 배후의 원동력은 면역시스템의 세포를 돕는 역할을 하고, Th1 또는 Th2 반응 중 하나로 궁극적인 면역 반응을 인도하는 수많은 동정된 단백질 메신저, 시토킨이다. 따라서, 높은 수준의 Th1-형 시토킨은 주어진 항원에 대한 세포 매개의 면역 반응을 유도하는 경향이 있는 반면, 높은 수준의 Th2-형 시토킨은 항원에 대한 체액성 면역반응을 유도하는 경향이 있다. Th1 및 Th2-형 면역 반응의 구분이 명확하지 않다는 것을 기억하는 것이 중요하다. 사실, 개체는 Th1 우세 또는 Th2 우세로 설명되는 면역반응을 지원할 것이다. 그러나, Mosmann and Coffman(1989)에 의한 쥣과 CD4+ T 세포 클론에 기재된 것의 관점에서 시토킨 부류를 고려하는 것이 종종 편리하다. 전통적으로 Th1-형 반응은 T-림프구에 의한 INF-y 및 IL-2 시토킨의 생산에 관련된다. Th1-형 면역반응의 유도와 종종 직접적으로 연관된 다른 시토킨은 종종 IL-12와 같은 T-세포에 의하여 생산되지 않는다. 대조적으로, Th2-형 반응은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 종양 괴사 인자-ss(TNF-ss)의 분비와 연관된다.

본 발명에 사용하기 위한 적절한 항원보강제는 알루미늄 하이드록시드 겔(알룸) 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염을 포함하지만, 칼슘, 철, 또는 아연 염이 될 수도 있으며 또는 아실화 티로신, 또는 아실화 슈가, 양이온적 또는 음이온적으로 유도체화된 다당류, 폴리포스파젠, 또는 몬타나이드 리포좀의 불용성 현탁액이 될 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위한 백신 제제에서, 아데노바이러스 벡터와 관련하여 항원보강제는 투여될 수도 있고 되지않을 수도 있다. 혼합물의 단백질 성분의 경우 항원보강제 조성물은 우선적인 Th1 반응을 유도하도록 선택될 수 있다. 또한, 다른 체액성 반응을 포함하여 다른 반응이 포함될 수도 있다.

특정한 백신 항원보강제는 Th1 또는 Th2-형 시토킨 반응 중 하나의 자극에 특히 적합하다. 전통적으로는, 백신접종 또는 감염 후 면역 반응의 Th1:Th2 균형의 가장 좋은 지시자는 항원으로 재자극한 후 인 비트로에서 T 림프구에 의한 Th1 또는 Th2 시토킨의 생산을 직접적으로 측정하는 것 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1 : IgG2a 비를 측정하는 것을 포함한다. 따라서, Th1-형 항원보강제는 인 비트로에서 항원으로 재자극될 때 높은 수준의 Th1-형 시토킨을 제조하도록 단리된 T-세포 집단을 자극하고, Th1-형 아이소타이프와 연관된 항원 특이적 이뮤노글로불린 반응을 유도하는 것이다. 예를 들면, 본 발명에서 사용하기에 적합한 항원보강제를 생산하기 위하여 제제화될 수 있는 Th1-형 면역 자극제는 모노포스포릴 리피드 A, 특히 3-디-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)를 포함할 수 있다. 3D-MPL은 Ribi Immunochem, Montana에 의하여 제조된 공지된 항원보강제이다. 화학적으로 흔히 4, 5, 또는 6 아실화 사슬 중 어느 하나와 3-디-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A의 혼합물로 제공되기도 한다. 이것은 디포스포릴 리피드 A 및 이의 3-O-디아실화 변형체의 제조를 개시하고 있는 참고문헌인 GB 2122204B에 개시된 방법으로 정제되고 제조될 수 있다. 다른 정제되고 합성된 지다당류가 개시되어 있다(US Pat. 6,005,099, EP 0729473B1, EP 0549074B1). 한 구체예에서, 3D-MPL은 직경이 0.2㎛ 미만의 작은 입자 크기를 갖는 특정한 제제 형태이며, 그 제조방법은 EP 0689454에 개시된다.

사포닌은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 Th1 면역자극제의 다른 예이다. 사포닌은 공지된 항원보강제이다. 예를 들어, [남아메리카의 나무 킬라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 나무껍질에서 유래된] Quil A 및 이의 분획이 US Pat. 5,057,540 및 EP 0362279B1에 개시되어 있다. 용혈성 사포닌 QS21 및QS17(Quil A의 HPLC 정제 분획들)은 강력한 전신성 항원보강제로 알려져 왔으며, 이 제조방법은 US Pat. 5,057,540 및 EP 0362279B1에 개시된다. 또한, 이들 참고문헌에 기재된 것은 전신성 백신을 위하여 강력한 항원보강제로 작용하는 QS7(Quil A의 비-용혈성 분획)의 사용이다. QS21 및 폴리솔베이트 또는 시클로덱스트린의 조합이 또한 공지된다(WO 99/10008). QS21 및 QS7과 같은 Quil A의 분획을 포함하는 특정한 항원보강제 시스템이 WO 96/33739 및 WO 96/11711에 기재되어 있다.

면역촉진제의 또 다른 예는 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드("CpG")를 함유하는 면역촉진성 올리고뉴클레오티드이다. CpG는 DNA에 존재하는 시토신-구아닌 디뉴클레오티드 모티브의 약자이다. CpG는 전신 및 점막 경로 모두에 의하여 투여될 때 항원보강제가 되는 것으로 당업계에 잘 알려져있다(WO 96/02555, EP 0468520). 역사적으로, 바실러스 칼메트 구에린(bacillus Calmette-Guerin: BCG)의 DNA 분획이 항-종양 효과를 부여할 수 있다는 것이 관찰되었다. 추가 연구에서, BCG 유전자 서열로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드가 면역촉진 효과(인 비트로와 인 비보 모두)를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 이들 연구의 저자는 중앙 CG 모티브를 포함하여 특정 팔린드롬 서열이 이 활성을 운반한다고 결론지었다. 세부적인 분석은 CG 모티브가 특정 서열 목록 내에 있어야만 하며, 이러한 서열이 박테리아 DNA에는 통상적이지만 척추동물 DNA에는 드물다는 것을 보여주었다. 면역 자극성 서열은 종종 퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘이며; 여기서 CG 모티브는 메틸화되지 않지만, 다른 메틸화되지 않은 CpG 서열이 면역 촉진적인 것으로 알려지고 본 발명에서 사용될 수 있다.

6개 뉴클레오티드의 특정 조합에서, 팔린드롬 서열이 존재할 수 있다. 이들 모티브 중 몇몇은 다른 모티브들의 조합 또는 하나의 모티브의 반복체로서 동일한 올리고뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 함유하는 이들 면역자극 서열 중 하나 이상의 존재가 (인터페론 y를 생산하고, 세포 용해 활성을 가지는) 천연 킬러 세포 및 대식세포를 포함하여 다양한 면역 서브세트를 활성화할 수 있다. 이 콘센서스 서열을 가지지 않는 다른 메틸화되지 않는 CpG 함유 서열이 지금 면역 조절할 수 있는 것으로 또한 나타났다. 백신으로 제조될 때, CpG는 일반적으로 유리 항원과 함께 유리 용액에 투여되거나(WO 96/02555, 68) 또는 항원에 공유적으로 결합되거나(WO 98/16247), 또는 알루미늄 하이드록시드(간염 표면 항원)과 같은 담체와 함께 제제화된다.

상기한 이러한 면역촉진제는 예를 들어 리포좀, 수중유 에멀젼, 및/또는 (알루미늄 하이드록시드와 같은) 알루미늄 염을 포함하는 금속염과 같은 담체와 함께 제제화될 수 있다. 예를 들면, 3D-MPL은 알루미늄 하이드록시드(EP 0689454) 또는 수중유 에멀젼(WO 95/17210)와 함께 제제화될 수 있고; QS21은 콜레스테롤 함유 리포좀(WO 96/33739), 수중유 에멀젼(WO 95/17210) 또는 알룸(WO 98/15287)과 함께 제제화될 수 있고; CpG는 알룸 또는 다른 양이온성 담체로 제제화될 수 있다.

면역 촉진제의 조합은 또한 모노포스포릴화 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합(WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 98/05355; WO 99/12565; WO 99/11241) 또는 WO 94/00153에 개시된 QS21 및 3D-MPL의 조합이 사용될 수 있다. 또는, CpG 플러스 QS21과 같은 사포닌의 조합이 본 발명에서 사용될 수도 있다. 따라서, 적절한 항원보강제 시스템은 예를 들어 알루미늄 염과 함께 3D-MPL과 같은 모노포스포릴 리피드 A의 조합을 포함한다. 다른 구체예는 WO 94/00153에 개시된 바와 같이 QS21과 3D-MPL의 조합, 또는 WO 96/33739에 개시된 바와 같은 콜레스테롤 함유 리포좀(DQ)에 QS21이 담금질된 낮은 반응원성 조성물과 같은 모노포스포릴화 리피드 A와 사포닌 유도체를 배합한다. QS21, 3D-MPL 및 수중유 에멀젼 내의 토코페롤을 포함하는 또 다른 항원보강제제는 WO 95/17210호에 개시된다. 다른 구체예에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 알루미늄 염과 함께 또는 단독으로 사용된다.

본 발명에 사용하기 위한 적절한 항원보강제는 임의로 콜레스테롤-함유 리포좀과 함께 QS와 같은 사포닌 또는 3D-MPL과 같은 모노포스포릴 리피드 A 유도체를 포함하는 항원보강제, 또는 이 둘 모두를 포함하는 항원보강제와 같은 바람직한 Th1 자극성 항원보강제이다. 콜레스테롤-함유 리포좀을 갖는 제제에서 QS21 및 3D-MPL의 조합은 예를 들어 WO 96/33739에 개시되어 있다.

본 발명의 장점은 다양성에 있다. 재조합 아데노바이러스와 같은 재조합 바이러스는 안전하다고 여겨지고, 어떠한 동물- 또는 인간 유도된 성분들도 함유하지 않는 매질을 사용하여 매우 많은 부피로 현탁액에서 성장할 수 있는 세포들을 사용하여 매우 높은 적정량으로 생산될 수 있다. 또한, 재조합 아데노바이러스가 아데노바이러스 게놈에서 이종성 핵산 서열에 의하여 코드된 단백질에 대한 현저한 면역 반응을 일으킨다는 것이 알려져 있다. 본 발명은 부스트 반응에 항원보강된 단백질을 사용하여 피.팔시파륨의 포자소체 유전자를 갖는 벡터에서 이들 특성을 결합한다. 또한, 이 유전자는 인간에서 적절한 면역 반응을 부여하기에 적합한 발현 수준을 주기 위하여 코돈-최적화되었다. 본 발명은 중화 항체들의 높은 적정량을 직면하지 않는 아데노바이러스를 사용하여 말라리아 감염에 대항하는 백신을 제공한다. 이 목적을 위한 매우 바람직한 아데노바이러스는 혈청형 11 및 35이다(Ad11 및 Ad35, WO 00/70071 및 WO 02/40665 참조).

피.팔시파륨과 같은 말라리아-유발 병원체와 호모 사피엔스와 같은 원하는 숙주 사이의 핵산 함량은 매우 다르다. 본 발명은 인간과 같은 포유동물에 더 높은 발현 수준을 제공하는 코돈-최적화 핵산을 제공한다.

여기 개시된 프라임/부스트 요법을 위한 다른 개체의 사용은 면역 시스템의 세포성 및 체액성 지류 모두의 적절한 면역 반응을 제공하는 백신화 방법을 제공한다. 이것은 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 항체들을 포함한다. 이들 백신 단독으로는 어느 것도 항원-특이적 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 및 항체들의 최적 수준을 발동하는 지속가능한 면역 반응을 수립할 수 없다. 또한, 다른 성분들이 투여되는 순서는 이들 면역 반응을 수정할 수 있고 미래의 감염에 대항하여 가능한 다른 기간의 방어를 일으킬 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 자유 순환 포자소체 및 분열소체에서부터 감염된 간세포 및 RBC's까지 인간 내 원충의 라이프 사이클의 다른 모든 단계들을 다루는 면역 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 연장된 기간을 넘어 말라리아 감염에 대한 지속적인 방어를 제공한다.

바람직한 구체예에서, E1 영역은 새로 제조된 아데노바이러스의 복제-, 전사-, 번역- 및 패키지 공정에 요구되기 때문에 본 발명은 아데노바이러스 게놈 내 E1 영역의 적어도 일부의 제거를 거친 복제 결함인 재조합 아데노바이러스의 용도에 관한 것이다. E1 결실된 벡터들은 일반적으로 결실된 E1 기능을 보완하는 세포주 상에 제조된다. 이러한 세포주 및 재조합 바이러스의 제조를 위한 이의 용도가 광범위하게 개시되어 있으며, 당업계에 잘 공지되어 있다. 바람직하기는, Center for Applied Microbiology and Research(CAMR, UK)의 European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)에 ECACC No.96022940으로 기탁된 세포로 표시되는 PER.C6^ⓒ 세포 또는 이의 유도체가 복제가능 아데노바이러스(rca)의 생산을 방지하도록 사용되고 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)를 위해 유래된 것 이외의 재조합 아데노바이러스 성장을 지원하는 세포가 적용되고 있다. B-형아데노바이러스의 적절한 상보성을 제공하기 위하여 Ad35로부터 E1으로 불멸화된 HER 세포 상에 또는 Ad35로부터 E1 유전자를 추가로 포함하는 PER.C6^ⓒ 세포 상에 제조될 수 있는, Ad5 뿐만 아니라 재조합 복제-결함 Ad35와 같은 다른 아데노바이러스 혈청형을 위한 rca-없는 아데노바이러스 스톡을 얻기 위한 방법 및 수단을 위한 참고문헌으로, 공보 WO 97/00326, WO 01/05945, WO 01/07571, WO 00/70071, WO 02/40665 및 WO 99/55132를 들 수 있다.

여기서, 공개된 문헌인 WO 00/03029, WO 02/24730, WO 00/70071, 및 WO 02/40665에서 Ad50이 실수로 Ad51로 지칭되었다는 것을 주목해야만 한다. 상기한 문헌에 언급되어 있는 Ad51 혈청형은 De Jong et al.(1999)에 의한 문헌에서 혈청형 Ad50과 동일한 것으로, 여기에서 이것은 B-그룹 아데노바이러스로 표시되었다. 명확하게 하기 위하여, 본 명세서에서 사용된 Ad50은 De Jong et al.(1999)에 의하여 언급된 B-그룹 Ad50 혈청형이다.

본 발명의 백신은 전형적으로 프라임/부스트 세팅에 사용되는데, 예를 들어 Ad/단백질; 단백질/Ad; 단백질/Ad/Ad; Ad/단백질/Ad; Ad/Ad/단백질; Ad/단백질/단백질/단백질; Ad/단백질/바이러스 벡터/단백질 등을 들 수 있다. (아데노바이러스와는 다른 재조합 바이러스 벡터 또는 네이키드 DNA와 같은) 또 다른 종류의 백신과의 조합이 본 발명의 프라임/부스트 제제와 함께 적용될 수 있다는 것이 예상될 수 있다. 추가의 말라리아 항원 또는 (폴리)펩티드가 또한 사용될 수 있다.

만약 핵산이 야생형 바이러스로부터 얻어진 야생형 서열로부터 직접 클로닝을 통하여 얻어질 수 있는 반면, 이들이 예를 들어 주형으로서 DNA의 다른 조각을 사용하여 PCR을 통해 얻어질 수 있다면, 서열은 여기에서 사용된 바와 같이 '유도된(derived)' 것이다. 이러한 서열들은 개변된 형태뿐만 아니라 야생형이 될 수 있다는 것을 또한 의미한다. 동일한 결과에 도달하기 위한 다른 선택은 합성 DNA를 결합하는 것에 의해서이다. '유도된' 것은 야생형 DNA의 직접 클로닝을 광범위하게 의미하지는 않는다는 것을 이해해야만 한다. 당업자는 또한 핵산의 특정 조각의 돌연변이 형태를 얻기 위하여 분자 생물학의 가능성들을 알게 될 것이다. '이의 기능성 부분, 유도체 및/또는 상사체'라는 용어들은 이들이 관련된 핵산 서열의 균등물로 이해될 것이다. 당업자는 특정한 결실, 교체(swaps), (점) 돌연변이, 부가 등이 여전히 원래의 핵산 서열과 유사한 기능을 가지는 핵산 서열이 될 수 있으며, 일단 번역되어 유사하거나 심지어는 동일한 폴리펩티드를 생산해야만 한다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 핵산 서열의 기능성을 현저하게 변경하지 않는 이러한 개변들은 본 발명의 범위 내라는 것이 이해될 수 있다. 어떤 아데노바이러스 벡터가 선택된 어떤 아데노바이러스 혈청형으로부터 유도된다며, 최종 생성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 게놈 DNA의 특정 조각을 직접 클로닝하고 합성하는 것과 같은 간접적인 방법을 통하여 얻어질 수 있다는 것이 또한 이해될 수 있다. 본 발명의 특징을 변경하지 않는 어떤 결실, 돌연변이, 게놈 함량의 다른 변화는 여전히 본 발명의 일부로 간주된다. 이러한 변화의 예는 예를 들어 이종성 핵산의 더 큰 조각의 클로닝이 가능한 바이러스 골격의 결실이다. 이러한 돌연변이의 예는 아데노바이러스 E2 및/또는 E4 단백질을 코드하는 영역의 결실 및/또는 변화, 또는 E3 결실이다. 아데노바이러스 골격에 적용되는 이러한 변화는 당업계에 공지되어 흔히 적용되는데, 그 이유는 공간이 패키지될 아데노바이러스를 위한 제한 요인이고; 이는 아데노바이러스 게놈의 특정 부분이 결실되는 주된 이유이기 때문이다. 게놈의 E2, E3, 및/또는 E4 영역을 개변하는 다른 이유는 예를 들어 WO 03/104467 및 WO 2004/001032에 개시된 바와 같이 아데노바이러스 벡터의 안정성 또는 보전성에 관련될 수 있다. 이들 출원은 다른 것 중에서 패키지 세포주에서 복제 및 패키지하는 동안 E4orf6 활성과 E1B-55K 활성 사이의 보완성을 보증하기 위하여 다른 서브그룹 유래의 아데노바이러스의 골격에 한 서브그룹의 혈청형에서 유래한 E4orf6 유전자의 용도에 관한 것이다. 또한, 이들은 보다 더 안전한 재조합 아데노바이러스 벡터와 더 높은 pIX 발현 수준을 얻기 위한 적절한 기능의 pIX 프로모터의 용도에 관한 것이다.

여기서 사용된 '복제 결함'은 바이러스 벡터가 비-보완성 세포 내에서 복제되지 못한다는 것을 의미한다. 보완성 세포(complementing cell)에서, 복제에 요구되는 기능 및 이에 따른 바이러스 벡터의 생산이 보완 세포에 의하여 제공된다. 본 발명의 복제 결함 바이러스 벡터는 보완성 세포 이외의 다른 숙주 세포에서 복제될 수 있는 모든 성분을 보유하지는 않는다.

핵산과 관련하여 여기에 사용된 '이종성'이라는 용어는 이종성 핵산이 클로닝되는 바이러스 벡터의 야생형 버젼과는 다른 출처에서 핵산 서열이 유래된다는 것을 의미한다. 예를 들어 아데노바이러스의 경우, 복제 결함 아데노바이러스 벡터에 클로닝된 이종성 핵산이 아데노바이러스 핵산 서열이 아니고, 원하는 다른 어떤 병원성 제제에서 유래하는 것이다.

프라임-부스트 백신 전략과 관련하여 여기에 사용된 '이종성'이라는 용어는 현재까지 산업에서 일반적이었던, 한 성분이 여러 번 투여되는 것보다는 신중한 조합으로서 하나의 재조합 비-복제 아데노바이러스 벡터와 하나의 항원보강된 단백질에 의하여 예시되는 둘 이상의 별개 성분이 사용되는 것을 의미한다.

여기 사용된 '항원'이라는 용어는 결정부가 전달(투여)되는 숙주내 면역 반응을 일으키는 출처에서 유래된 모든 항원을 의미한다. 항원은 병원체, 원충과 같은 외부 공급원으로부터 유래될 수 있고 또는 심지어 자기-항원이 될 수도 있다. 본 발명의 복제-결함 재조합 바이러스를 사용하여 전달될 수 있는 플라즈모듐의 항원의 예는 포자소체 단백질(CS), SE36 폴리펩티드, 분열소체 표면 단백질-1 19kDa C-말단 폴리펩티드(MSP-1p19), MSP-1, MSP-1p42, 정점 분열소체 항원-1(Apical Merozoite Antigen: AMA-1), 간 단계 항원-1(LSA-1) 또는 간 단계 항원-3(LSA-3), 또는 이들의 단편이다. 바람직한 면에서, 본 발명은 피.팔시파륨 유래의 포자소체(CS) 단백질에 관한 것이다.

여기 개시된 '코돈-최적화'라는 용어는 단백질을 코드하는 유전자가 전달되는 원하는 숙주에서 원하는 단백질의 충분히 높은 발현 수준을 유지하도록 서열의 핵산 함량이 변경되었다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 충분히 높은 발현 수준이란 감염 또는 질병을 방어하기 위하여 단백질 수준이 숙주에 면역 반응을 일으키도록 충분히 높아야만 한다는 것을 의미한다. 백신접종된 개체의 약 60%가 병원체(e.g. 포자소체)로 연속적으로 도전됨으로써 유도되는 질병을 방어하는 것을 통하여 어떤 백신이 인간에 면역 반응을 부여한다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 만약 처치된 개체 중 60% 이상이 이어지는 감염을 방어한다면 발현 수준은 충분하다고 여겨진다. 여기 개시된 항원의 선택과 적용될 수 있는 아데노바이러스적 관점의 조합으로 이러한 비율에 도달할 수 있다는 것이 믿어진다. 바람직하기는 개체의 85%가 방어되는 것이지만, 가장 바람직하기는 백신접종된 숙주의 90% 이상이 이어지는 도전에 대한 방어를 갖는 것이다. 본 발명에 개시된 핵산은 인간에서 발현되기 위하여 코돈-최적화된 것이다. Narum et al.(2001)에 따르면, 호모 사피엔스의 DNA 내 아데닌 플러스 티민(A+T) 함량은 시토신 플러스 구아닌(C+G) 비율에 비하여 약 59%이다. 전반적으로 피.팔시파륨 내 아데닌 플러스 티민 함량은 약 80%이다. 피.팔시파륨의 CS 유전자의 아데닌 플러스 티민 함량은 약 87%이다. 충분한 방어를 얻기 위해서 숙주 내 생산 수준을 증가시킬 필요가 있는 것으로 믿어진다. 이를 달성하는 하나의 방법은 동일한 최종 아미노산을 얻기 위하여 코돈 사용을 조정하는 것이지만, 포유동물 발현의 더 전형적인 코돈 서열을 사용하는 것이다. 이를 위하여, 본 발명에 따른 복제-결함 재조합 바이러스 벡터는 본 발명의 이종성 핵산 내에서 87% 미만, 바람직하기는 80% 미만, 그리고 더 바람직하기는 59% 미만 또는 약 59%의 아데닌 플러스 티민 함량을 가진다. 피.팔시파륨 및 피.요엘리의 CS 유전자의 아미노산 함량과 인간 내 코돈-사용에 기초하여, 코돈 최적화된 유전자의 비율은 본 발명에 개시된 바와 같이 아미노산 함량으로 약 45%에 달하여 매우 낮다. 따라서, CS 유전자에 관한 한, 약 45%의 아데닌 플러스 티민 함량을 가지는 것이 바람직하다. 만약 다른 아데닌 플러스 티민 농도(59% 미만 또는 초과) 및/또는 다른 코돈 사용을 가질 수 있는 인간 외의 다른 종들이 치료된다면, 본 발명의 CS 단백질을 코드하는 유전자가 원하는 함량을 맞추기 위하여 조정될 수 있으며 특정 숙주의 적절한 발현 수준을 일으킨다는 것이 이해될 것이다. 물론 함량의 약간의 변화가 전 세계의 다른 지리적 영역에서 약간의 발현 수준 변화를 일으킬 수 있다는 것 또한 배제될 수 없다. 다수의 반복부의 약간의 변화가 단백질의 아미노산 서열에 포함되어 이에 따라 그 비율이 달라질 수 있다는 것 또한 이해될 수 있다. 원하는 다른 항원이 유사하게 수정될 수 있다. 이들 모든 조정된 함량은 본 발명의 일부가 된다.

RTS,S로 명명된 단백질은 B형 간염 표면 항원을 가지고 융합 단백질로 발현되는 피.팔시파륨 CS 단백질의 C-말단 절반(중앙 41 NANP-반복부 중 17개 플러스 대부분의 C-말단부)으로 이루어지는 융합 단백질이다.

복제-불능 아데노바이러스 벡터에 의하여 제공된 명확한 장점 중 하나는 면역억제되는 개체들을 포함하여 모든 개체에서 이들 벡터에 의하여 유발된 현저한 질병의 입증된 부족 및 어버이 바이러스의 낮은 병원성이다. 말라리아, 피.요엘리의 마우스 모델에서의 연구는 재조합 아데노바이러스 구조체가 현저한 세포성 면역 반응을 일으킬 뿐만 아니라 CS 단백질을 발현하고, 이들이 감염에 대한 훌륭한 방어를 제공한다는 것을 나타내었다. 따라서, T 세포 반응의 강도 및 CS에 대한 전체 면역 반응 기간을 증가하기 위한 노력에 있어서, 본 발명의 발명자들은 새로운 이종성 프라임-부스트 전략에서 재조합 단백질 접근과 아데노바이러스 접근을 결합하는 것을 결정하였다.

불행하게도, 마우스는 인간의 반응을 예측하기 위한 이상적인 모델이 아니다. 이것은 특히 아데노바이러스 35(Ad35)에서는 사실이다. 표준 복제-불능 벡터는 아데노바이러스 5(Ad5)인데 이는 상당한 비율의 대부분의 전세계 인류가 어버이 바이러스에 기존 면역을 가진다는 사실 및 상기 바이러스의 널리 보급된 풍토성때문에 벡터 성능을 최적화함으로 어떤 문제들을 나타내었던 것이다. Ad35는 백신 벡터로 향상된 유용성을 나타낼 가능성을 가진다. Ad-5 및 Ad-35 CSP-보유 구조체의 이용성은 CS 면역의 질문에 특이적으로 구조체를 구별하여 두개의 연속적 이종 아데노바이러스 면역화의 평가를 가능하게 한다.

수지상 세포(dendritic cell: DC)들은 체내에서 가장 강력한 항원-발현 세포이고, 인간과 붉은털 원숭이(rhesus monkey: 레소스 원숭이) DC를 표적으로 하는 Ad5와 Ad35 모두가 이들을 이처럼 우수한 백신 벡터로 만드는 이들의 생리학의 측면 중 하나라는 사실이다. 그러나, 단지 Ad5 만이 쥣과 DC를 효율적으로 감염시키고; Ad35만이 영장류 DC를 신뢰성있게 감염시킨다. 따라서, 비록 Ad35 구조체에 대한 기본적 유효성 질문들에 대하여 작은 동물 모델에서 답변을 얻을 수 있기는 하지만, Ad35를 포함하여 실질적인 면역원성 질문은 비-인간 영장류에서만 질문될 수 있다.

본 발명자들은 만약 항-말라리아 세포성 및/또는 체액성 반응이 RTS,S 단독에서 보이는 반응에서 향상될 수 있는지를 결정하기 위하여 CS 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터로 RTS,S의 프라임-부스트 조합을 검사하도록 결정하였다. 또한, 두 가지 투여량의 아데노바이러스 백신 단독의 요법이 최적화되었다.

도 1은 이종의 프라임/부스트 백신접종 요법(regimens) 후 이어지는 CS의 C-말단과 관련된 IFN-γ ELISPOT 분석으로 T 세포 반응을 측정한 것이다. 반응은 최 종 부스트 2주 후 측정되었다. 가로선은 기하평균을 나타낸다.

도 2는 CS의 C-말단과 관련된 IFN-γ ELISPOT 분석으로 측정된 T 세포 반응을 나타낸 것이다. 반응은 최종 부스트 3개월 후 측정되었다. 가로선은 기하평균을 나타낸다.

도 3은 부스트 2주 후 CS의 반복 영역에 관련된 ELISA로 측정된 항체 반응을 나타낸다. 가로선은 기하평균을 나타낸다.

도 4는 부스트 3개월 후 CS의 반복 영역에 관련된 ELISA로 측정된 항체 반응을 나타낸다. 가로선은 기하평균을 나타낸다.

도 5는 재조합 Ad35-CS 벡터로 프라임하고, RTS,S 또는 Ad35-CS로 부스트한 실험에서, 2주 후(좌측) 또는 3개월 후(우측) IFN-γ ELISPOT으로 측정된 T 세포 반응을 나타낸다. 동종의 프라임/부스트/부스트 요법 RTS,S/RTS,S/RTS,S가 기준으로 사용되었다.

도 6은 재조합 Ad35-CS 벡터로 프라임하고, RTS,S 또는 Ad35-CS로 부스트한 실험에서, 2주 후(좌측) 또는 3개월 후(우측) ELISA로 측정된 항체 반응을 나타낸다. 동종의 프라임/부스트/부스트 요법 RTS,S/RTS,S/RTS,S가 기준으로 사용되었다.

도 7은 재조합 Ad35-CS 벡터로 부스트하고, RTS,S 또는 Ad5-CS로 프라임한 실험에서, 2주 후(좌측) 또는 3개월 후(우측) 측정된 T 세포 반응을 나타낸다. 동종의 프라임/부스트/부스트 요법 RTS,S/RTS,S/RTS,S가 기준으로 사용되었다.

도 8은 재조합 Ad35-CS 벡터로 부스트하고, RTS,S 또는 Ad5-CS로 프라임한 실험에서, 2주 후(좌측) 또는 3개월 후(우측) 측정된 항체 반응을 나타낸다. 동종 의 프라임/부스트/부스트 요법 RTS,S/RTS,S/RTS,S가 기준으로 사용되었다.

도 9는 부스트 2주 후 CS의 N-말단과 관련된 IFN-γ ELISPOT 분석으로 측정된 T 세포 반응을 나타낸다. 가로선은 기하평균을 나타낸다.

도 10은 부스트 3개월 후 CS의 N-말단과 관련된 IFN-γ ELISPOT 분석으로 측정된 T 세포 반응을 나타낸다. 가로선은 기하평균을 나타낸다.

도 11은 재조합 Ad35-CS 벡터로 프라임하고, RTS,S 또는 Ad35-CS로 부스트한 실험에서, 2주 후(좌측) 또는 3개월 후(우측) 측정된 N-말단에 대한 T 세포 반응을 나타낸다. 동종의 프라임/부스트/부스트 요법 RTS,S/RTS,S/RTS,S가 기준으로 사용되었다.

도 12는 재조합 Ad35-CS 벡터로 부스트하고, RTS,S 또는 Ad5-CS로 프라임한 실험에서, 2주 후(좌측) 또는 3개월 후(우측) 측정된 N-말단에 대한 T 세포 반응을 나타낸다. 동종의 프라임/부스트/부스트 요법 RTS,S/RTS,S/RTS,S가 기준으로 사용되었다.

붉은털 원숭이에 재조합 아데노바이러스 벡터와 정제된 항원보강 단백질을 사용하는 이종성 프라임 / 부스트 백신 접종

이 실험의 목적은 표준 3-투여 RTS,S 면역화 요법과 표준 2-투여 Ad35 요법을 직접 비교하여, RTS,S에 이어지는 Ad35, 및 Ad35에 이어지는 RTS,S를 평가하는 것이었다. 두번째 목적은 2-투여 아데노바이러스 요법을 최적화하는 것이었다. 조합 내 이들 구조체의 여러가지 다른 요법 동안 및 그 후 혈청학적 및 세포성 면역 반응이 연구되었다.

붉은털 원숭이(Macaca mulatta)는 훨씬 가까운 계통발생학적 관계로 인하여 인간 면역 반응을 위한 훌륭한 모델을 만든다. MHC 클래스 II 대립형질들이 특별히 잘 보존되고; 인간과 붉은털 원숭이의 종 분화를 선행하여 몇몇 공유된 대립형질들의 세대가 2천5백만년 전에 평가된다. 따라서, 이 모델에서 예상치를 현저하게 향상시키는 Th 세포로 항원을 발현하는 데 유사한 항원결정기의 사용법이 있다. 보다 중요하게는, 과거에 붉은털 원숭이 모델은 말라리아 항원뿐 아니라, 면역 반응의 복잡성에 의하여 방해되어 왔던 백신의 개발을 위한 다른 인간 질병, HIV를 위하여도 인간 면역원성 반응을 잘 예견하는 것으로 입증되었다.

예비 실험은 우수한 면역원성과 예상 효율을 나타내는 마우스 말라리아 피. 요엘리의 아데노바이러스-CS 구조체를 가지고 마우스에서 이미 실시되었다. 그러나, 팔시파륨 말라리아용 백신의 개발을 위한 연구에서 마우스 말라리아 모델에서부터 인간을 직접적으로 예측하려는 오랜 역사의 성공적이지 못한 시도가 비-인간 영장류 모델에서의 중간 단계를 요구한다. 붉은털 원숭이(rhesus macaque)는 종의 선택에 있어 최선으로 나타내는데, 그 이유는 인간에 대한 계통발생학적 접근성, 이 종에서 이들 백신의 사전 정보의 광범위한 데이타베이스가 있으며, 이들의 크기는 면역 반응의 적절한 평가를 보장하기 위해 충분한 부피의 혈액 샘플을 허용하고, 이 종에 이미 최적화된 시약과 검사가 존재하여 부수적 프로토콜 및 개발에 장기간이 요구되지 않기 때문이다. 추가적으로, 아데노바이러스 35 구조체는 다른 포유동물의 수지상 세포들을 효율적으로 침입하지 못하는 이 바이러스의 기능때문에 비-인간 영장류에서만 적절하게 시험될 수 있다.

이 연구에서 사용된 피.팔시파륨 CS 코드 유전자(Ad5CS 및 Ad35CS)를 보유하는 재조합, 복제-결함 아데노바이러스의 구조체 및 생산이 WO 2004/055187호의 실시예에 매우 상세하게 기재되어 있다(클론 02-659; 도 2 참조). 간략하게, 이들 아데노벡터는 다른 것들 중에서 N-말단 시그널 서열, 27 NANP 반복부, 3NVDP 반복부와 하나의 분리된 NVDP 반복부의 클러스터, 보편적인 항원결정기(Lockyer et al. 1989; Zevering et al. 1994; Nardin et al. 2001) 및 (C-말단에서) 마지막 14개 아미노산의 결실을 갖는, NF54 균주, 3D7 클론의 CS 단백질에 유사한 아미노산 서열을 갖는 CS 단백질을 코드하는 이종성 유전자를 포함한다. RTS,S의 단백질과의 차이는 RTS,S가 N-말단 시그널 서열, 및 아데노바이러스 구조체에 존재하지 않는, 대부분의 C-말단부에 위치한 GPI 앵커 시그널 서열뿐만 아니라 반복 영역의 많은 부분이 부족하다는 것이다.

이 실험은 Ad5 및 Ad35 CS-보유 구조체(Ad5CS 및 Ad35CS)로 RTS,S의 프라임-부스트 전략을 최적화하고, Ad5CS 및 Ad35CS 만을 최적화하기 위하여 다양한 조합과 타이밍 전략의 랜덤화된 무계획적(blinded) 안전성과 면역원성 연구였다. 새로운 전략들에 비교되는 이전의 최고 요법은 0, 1, 및 3개월에 주어진 항원보강제와 함께 50㎍의 RTS,S를 3번 근육내 투여하는 것이었다. 이는 그룹 1, 양성 대조군이었다. 모든 그룹은 표 1A에 요약되어 있다. 모든 경우에서, 항원보강제는 WO 96/33739호에 개시된 바와 같은 콜레스테롤-함유 리포좀과의 제제에서 50㎍의 3D-MPL, 50㎍의 QS21로 이루어졌다.

그룹 2는 0 및 1개월에 RTS,S/항원보강제 2회 투여 후 3개월에 Ad35CS 1회 투여로 이어지는 처치를 받았다. 그룹 3은 0개월에 Ad35CS 1회 투여 후 1 및 3개월에 RTS,S/항원보강제 2회 투여로 이어지는 처치를 받았다. 그룹 4, 5 및 6은 아데노바이러스 구조체만을 처치받았다. 다른 질병들에서 아데노바이러스 5 구조체의 2회 투여로 예비 실험한 것은 면역화 사이의 간격이 적어도 6개월일 때 최적의 혈청학적 및 세포성 면역 반응이 얻어졌음을 나타내었다. 인간 또는 비-인간 영장류에서 Ad35 구조체를 평가할 필요성 때문에, 이 벡터의 투여 사이의 최적의 시간은 아직 확립되지 않았다. 따라서, 그룹 4는 0, 3개월 스케쥴에서 Ad35CS를 2회 투여받았고, 그룹 5는 0, 6개월 스케쥴로 2회 투여받았다. 동일한 아데노바이러스 구조체의 2회 투여가 CS 단백질을 위한 구조체의 변경에 열등한지 아닌지에 대한 질문을 평가하기 위하여, 그룹 5는 0, 6개월 스케쥴에서 Ad5CS 다음에 Ad35CS로 이어지도록 투여되는 그룹 6과 비교되었다. 최종적으로, 대조 그룹 7은 면역원성 측정을 위한 면역화 대조 그룹으로서 제공되도록 0 및 3 개월에서 2회의 플레인 (말라리아 유전자 삽입이 없음) Ad35를 투여받았다.

주사 부위는 백신 반응원성의 관찰을 용이하게 하기 위하여 클립으로 고정되고, 명확하게 표지되었다. 추가로, 동물들에게 진정제가 투여되었고, 24, 48, 및 72 시간 및 7 내지 14일 후-주사에서 주사 부위의 경화, 부풀어오름, 열, 붉어짐, 또는 다른 이상 징후를 직접 조사하였다. 전신 독성 징후가 예상되지는 않았지만, 동물에게 다시 진정제가 투여되었고, 이들 시점에서 림프절증, 봉와직염, 농양, 관절염, 식욕부진, 및 체중 감소를 조사하였고, 그리고 이들의 혈액학적 및 임상적 화학수치가 변경을 위하여 관찰되었다. BUN, 크레아티닌, AST, ALT, GGT, 및 CK의 측정(그러나 반드시 이로 한정되는 것은 아님)을 포함하는 임상적 화학 검사의 패널을 위하여 그리고 전혈구 검사(CBC)를 위하여 주사 시점, 및 각 주사 후 24, 48, 및 72시간 및 7 및 14일에서 혈액이 채혈되었다. 비-복제성 벡터 발산이 없음을 확인하기 위하여, 각 아데노바이러스 주사를 위하여, 이어지는 아데노바이러스 테스트를 위하여 0-10일 매일의 배변 샘플이 수집되어 -70℃에서 보존되었다.

ELISA에 의하여 CS R32(CS 단백질에 대한 표준화된 ELISA 검사를 개발하는데 사용되었던 CS 단백질의 반복 영역, 아래 참조)에 대한 항체 반응의 성질 및 규모를 측정하기 위하여, 혈청 1-3ml가 모든 주사 시점 및 매 주사 후 1, 2, 및 4주, 그리고 그 후 매달 한 번 이상 수집되었다. 혈청 샘플은 사용할 때까지 -70℃에서 보관되었고, 이 샘플들은 검사내 변이를 최소화하기 위하여 실험 끝 부근에서 배치 가공되었다. 각 아데노바이러스 주사를 위하여 0, 1, 7, 및 14일, 및 그 후 적어도 매 4주로부터 혈청 중 0.5-1.0㎖가 항-아데노바이러스 항체 적정 측정에 사용될 수 있기 위해서, 수집된 혈청 부피는 적당했다. EDTA- 또는 헤파린-항-응고혈의 대용량(20-40㎖)이 1차 면역화 전, 2차 면역화 4주 후(부피 요구가 허용된다면), 및 3차 면역화 4주 후, 3차 면역화 6개월 후에 세포 수확을 위하여 수집되었다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)는 밀도 원심분리의 표준 방법을 이용하여 이들 샘플로부터 농축되었다. 한 개체 동물로부터 다른 개체 동물이 세포 수율이 매우 다양할 수 있기는 하지만 일반적으로 샘플의 부피가 클수록, 회수되는 세포의 수도 더 많다. 정확한 세포 회수율을 예상하는 것은 불가능하기 때문에 충분한 세포들이 통계적 타당 성을 목적으로 검사가 반복되어 얻어지기 위하여 가능한한 더 큰 샘플을 취하는 것이 더 바람직하다. 세포들은 나중 시점에서 배치 가공을 허용하고 이로 인하여 품질 조절을 향상하도록 냉동되었다. 세포들은 제어된 온도 감소율에서 10% DMSO로 자가 유래 혈청내에 냉동되고 사용 전 최소 일 주일 동안 증기상 액체 질소에 보관되었다.

CBC 데이타가 내성이 잘 생길 수 있다고 지시한 더 큰 동물들로부터, 세포 수확을 위한 추가 샘플은 프라임 후, 그러나 부스트 전에 회수되었다. RTS,S/항원보강제의 2회 투여를 받은 14마리 원숭이(두 그룹)와 8번째 주 전에 Ad35CS 1회 투여를 받은 14마리 원숭이가 있었기 때문에, 최소한 절반 이상을 시험하여, 이로 인하여 통계적 유의성을 유지하는 것이 기대되었다. 세포 수확은 주사 후 4주 직후 일어날 수 있을 것이다. 아데노바이러스 구조체만을 받은 그룹들은 단지 2회 주사되고, 따라서 3회 주사되는 원숭이에 비하여 더 적게 요구되는 출혈 스케쥴을 가지기 때문에 두 번의 주사 사이에 세포 수확 중간체가 어떠한 결핍도 겪지 않을 것으로 예상되었다.

세포성 면역 반응의 분석들은 항원-특이적 IFN-γ 생성 세포의 정량화를 위한 단기간 ELISpot 검사를 포함하였다. 항원-자극된 세포의 흐름 혈구 계산 검사는 ELISpot 검사에서 수집된 데이타를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 반응하고 있는 항원-특이성 세포의 표현형에 대한 추가적인 정보도 제공한다. 따라서, 세포내 염색 및 흐름 혈구 계산에 의한 항원-특이성 CD8+ IFN-γ 분비 서브세트의 측정이 또한 조사된다.

실행되는 추가적인 검사는 추가 시토킨을 위한 벌크 ELISpot 검사, 추가 시토킨의 T 세포 서브세트 계수를 위한 세포내 염색, 항원-특이적 T 세포 서브세트 시토킨 생성의 정량을 위한 다른 흐름-혈구 계산-기초 검사, 및 다른 방법들과의 상관관계를 위한 정량적인 RT-PCR을 포함한다.

원숭이들은 나이, 성별, 체중, 및 지리적 기원에 따라 균등하게 맞추어진 그룹으로 나누어진 다음 그룹을 랜덤화하였다. 모든 임상적 평가와 안정성 종점 측정은 원숭이의 그룹 연구 할당에 대한 지식 없이 측정되었다. 유사하게, 모든 면역학적 검사는 개개 샘플이 속하는 그룹에 대한 사전 지식없이 실행되었다. 이러한 블라인딩 정책의 예외는 0, 1, 및 3에 대비되는 0 및 6개월 스케쥴에서 면역화되는 동물이었으나; 블라인딩은 주어진 특정 주사에 대하여 유지되었다.

테스트 그룹당 7마리 동물의 그룹 크기(및 대조군에서는 4마리)는 그룹 사이즈를 최소화하는 반면, 유사한 실험, 그러나 다만 관련이 먼 실험으로부터 이전 데이타에 기초하여 그룹 사이의 차이를 정확하게 감지하기 위하여 이상적이다.

ELISA 측정 결과의 기하평균은 등분산 및 양쪽꼬리를 가정하여, 스튜던트 t-검정 및 ANOVA와 같은 표준 분석을 사용하여 매개변수에 의하여 비교되었다. 200,000 세포당 지점에 나타난 ELISpot 검사 결과가 유사하게 처리되었고 또한 크루스칼-왈리스 검정과 같은 비-매개변수적 분석을 사용하여 조사되었다. 그룹간 비교가 요구되는 경우, 원래 또는 로그-변형된 데이타에 대한 스튜던트 t-검정이 모든 그룹 쌍 사이의 차이를 측정하기 위하여 사용된다.

주사에 앞서, 털이 클립으로 고정되고, 피부는 70% 소독용 알코올로 세척되 고, 그리고 이어지는 촉진(觸診) 및 반응성 측정을 위한 주사부위의 위치를 알아내기 쉽도록 지워지지 않는 잉크로 피부에 2.5-3 cm 원이 그려졌다. RTS,S의 주사는 원숭이 경로로 들어가기 직전 항원보강제와 혼합되었다. 최종 주사 부피는 0.5㎖였고, 대퇴부 전방 근육조직 내로 25-29 게이지 바늘을 통해 전달되었다. 아데노바이러스 구조체는 완충 염수 내에서 (WO 2004/055187)에 개시된 바와 같이 제조되었으며, 또한 최종 부피 0.5㎖로 동일한 근육내 부위에 투여되었다.

혈청이나 세포를 위한 주된 생체 시료는 혈액이었다. 채혈 스케쥴은 표 1B에 요약되어 있다. 반복적 바이오 샘플 수집을 유지하기 위하여 개체의 수용능력을 나타내거나, 계획된 바이오 샘플 수집 스케쥴이 줄어든다는 것을 나타냄에 의하여; 동물들의 혈액 상태가 관찰되었다. 혈액이 채취될 때마다, (미-응집 혈액 ＜50㎕를 요구하는) 전혈 계수(CBC)가 쿨터(Coulter) 자동화 혈액 세포 계수기로 실시되었다. 유지와 보존을 위하여 제조자 추천 GLP-유사 지침이 실시되었다. 동물들이 빈혈이 되지 않는다는 것을 보장하기 위하여, 헤마토크리트, 헤모글로빈, 평균 유리세포 부피(MCV), 적혈구(RBC) 수, 및 망상 적혈구 비율을 면밀하게 주시하였다.

정맥혈이 주사기 또는 진공 튜브 중 하나와 20-24 게이지 바늘을 이용하여 대퇴부 정맥, 복재(복부) 정맥, 또는 두부 정맥으로부터 수집되었다. 일반적으로, 복재 정맥 또는 두부 정맥은 10㎖ 미만의 채혈에 바람직하고, 대퇴부 정맥은 10㎖를 넘는 부피가 제거될 때 전체 정맥주사를 줄이고, 용혈을 피하기에 바람직했다.

말초 혈액 단핵세포(PBMC's)는 면역화 전, 최종 면역화 후 2주, 및 최종 면역화 후 3개월에 동물들로부터 수확되었다. 이러한 프로토콜에서, PBMC's는 밀도 원심분리의 표준 방법으로 분리되어, 45% 자가이식 혈청(45% 염수와 10% DMSO)에 냉동보존되었다. 간략하게, 전혈이 Lymphoprep^®(Axis-Shield, Oslo, Norway) 피콜-하이파크(ficoll-hypaque) 세포 분리 매질에 적층되고, 650g에서 20분 동안 원심분리되었다. 세포층이 제거되고 400g에서 15분 동안 dPBS(BioWhittaker, Walkersville, MD)로 두번 세척하였다. 생존가능한 세포가 쿨터 ACT*10 혈구 계산기를 사용하여 계수되었다. 펠렛은 50% dPBS, 50% 염수에 1×10⁷/㎖에 재현탁되었다. DMSO가 최종 10% 부피로 적하식으로 첨가되었다. 세포는 -70℃ 냉동기에서 밤새도록 제어된 온도감소 이소로파놀 배쓰에 두어 정확하게 5백만개 세포마다의 0.55㎖ 분획으로 냉동되었고, 사용시까지 액체 질소 증기상에 보존되었다.

최종 백신접종 후, 다른 원숭이로부터 얻은 혈액 샘플 내 인터페론 감마(IFN-γ) 분비 T-세포가 전체 항원과 C- 및 N-말단 특이적 펩티드 풀로 자극된 후 효소-연결된 면역스폿(ELISpot) 검사로 동정되었다(세부 사항은 아래에 기재된 바와 같음). 결과는 도 1(최종 백신접종 2주 후) 및 도 2(최종 백신접종 3개월 후)에 나타내었고, 각각 표 2와 4에 세포 백만개당 평균 스폿 형성 단위(SFU)로서 표현되었고; 로그-변형된 데이타의 분산분석(ANOVA)를 사용하여 통계적 비교가 실시되었다. 모든 그룹이 비교되었다. 통계적 유의성이 결정되었을 경우 포스트-호크(post-hoc) 분석이 그룹 대 그룹 비교를 위하여 실시될 수 있다(결과는 나타내지 않음).

다른 처리 전략 사이의 ELISpot 결과를 비교하기 위하여, 기하평균 적정의 비율이, 프라임 처리로서 Ad35를 갖는 전략을 위하여 계산되었다. 이들 비율에서, (0, 2, 3 개월에서) RTS,S만을 처리하여 얻어진 기하평균 적정이 기준 처리로서 채택되었다(도 5 및 6, 표 10). 유사하게, 비율들이 부스트 처리로서 Ad35를 갖는 전략을 위하여 또한 계산되었다(도 7 및 8, 표 11).

유사한 분석이 N-말단-특이 자극 T 세포 ELISpots의 결과를 위하여 행하여 졌다. 결과는 각각 도 9 및 10과 표 12 및 14에 나타내었다. 최종적으로, 비율을 계산하여 도 11(Ad35 프라임 전략) 및 도 12(Ad35 부스트 전략) 및 표 16 및 17에 각각 나타내었다.

ELISpots은 표준 방법을 사용하여 PVDF-하부 멀티스크린-IP ELISpot 플레이트(Millipore, Bedfore, MA)에서 해동된 냉동 보존 PBMC's에서 실시되었다. 멸균 기술은 최종 스폿 전개를 위하여 2일(Day 2)에 제거될 때까지 완벽하게 고수되었다.

사용된 매질: 완전 매질(cRPMI)은 1:100 페니실린/스트렙토마이신, 1:100 L-글루타민, 1:200 NaHCO₃(Sigma, St. Louis, MO), 1:100 비-필수 아미노산, 1: 100 피루베이트, 및 1:300 2-ME(Gibco)의 첨가와 함께 RPMI-1640(BioWhittaker, Walkersville, MD)로부터 새로 제조되었다. 우수한 원숭이 세포 성장이 자극적 배경을 거의 제공하지 않는다는 것을 뒷받침하기 위하여, 비특이적 증식 검사로 미리 특징지워진 송아지 태아 혈청(FCS, HyClone, Logan, UT)이 cRPMI-10을 위해서는 10% 최종 부피, cRPMI-20를 위해서는 20% 등으로 첨가되었다. 매질-플러스(M+)는 1:500으로 항-원숭이 CD28과 항-원숭이 CD49D 항체(BD Pharmingen, San Jose, CA)로 추가적으로 보강되었다.

다음의 자극제가 추가 혈청없이 M+에 원하는 최종 농도의 두배로 새로 제조되었다:

Con A: 모든 바이알용 양성 대조구로서 2.5㎍/㎖(최종 1.25㎍/㎖) 콘카나발린 A(Sigma).

CS -C: 2.5㎍/㎖(최종 1.35㎍/㎖)의 각 펩티드에 PfCS 분자(GSK, Rixensart, Belgium에서 공급됨)의 C-말단부를 덮는, 11개 아미노산에 의하여 중복되는 15-mer 폴리펩티드의 풀.

CS -N: PfCS 분자의 N-말단부를 덮는, 11개에 의하여 중복되는 15mer 펩티드의 유사한 풀.

RTS ,S: 2㎍/㎖(최종 1㎍/㎖) 세포 배양액(GSK)에 적합한 정제된 전체 단백질 복합체 RTS,S 항원.

HEF: 23.2㎍/㎖(최종 11.6㎍/㎖) 세포 배양액(GSK)에 또한 적합한 정제된 B형 간염 표면항원(HbS) 전체 단백질(RTS,S의 "S" 성분).

HbS -P: 2.5㎍/㎖의 각 펩티드(최종 1.25㎍/㎖)에 HbS 15mer 펩티드(GSK)의 풀.

음성 대조구는 추가 보충없는 M+였다.

플레이트는 다음과 같이 제조되었다. 플레이트는 일차 모노클론성 항-원숭이 IFN-γ 항체(UcyTech #21-43-09, Utrecht, the Netherlands)의 멸균 dPBS에서 1:100 희석의 50㎕/웰로 코팅되고, 4℃에서 5-6시간 동안 플라스틱 백에서 배양되었다. 사용 1시간 전, 코팅 항체가 제거되고, 플레이트는 5% CO₂ 습기-제어 세포 배양 인큐베이터, 37℃에서 cRPMI-10으로 차단되었다. 사용 직전, 차단 매질이 제거되었다.

해동되는 냉동보존된 PBMC: 냉동 바이알을 거의 해동될 때까지만 따뜻한 수도물(37-40℃)에서 휘저었고, 0.55㎖ 내용물은 곧 8㎖ RPMI-20으로 전달되었다. 세포는 13분 동안 350g에서 세척되고, 펠렛은 2.0㎖ cRPMI-20에 조심스럽게 재현탁되었다. 그 다음 멸균 40㎕ 분획이 제거되어 생존 가능한 세포 수를 확인하고, 이 부피는 단일 세포 현탁액 2×10⁶ 세포/㎖를 제공하는 데 필요한 만큼 조정되었다.

예비-자극: M+내의 자극제와 cRPMI-20내의 세포 현탁액의 동일 부피가 폴리프로필렌 세포 배양액 튜브에서 혼합되어 모든 시약의 최종 원하는 농도를 제공하였다. 그 다음 세포들은 가스 교환을 용이하게 하도록 느슨한 뚜껑을 가지고, 기울어진 위치로 최소 5시간 동안 인큐베이터에 보관되었다.

최종 자극: 배양 5-6시간 후, 세포들은 400g에서 10분 동안 회전되었고, 상징액이 폐기되었다. 그 다음 즉시 세포들은 cRPMI-20 절반과 자극제 절반에서 다시 재현탁되었다. 이들은 pH 안정화가 가능하도록 10-20분 동안 인큐베이터로 되돌려보냈다. 그 다음, 세포들을 간단히 혼합하고, 200㎕(200,000 세포들)를 차단되고 비워진 플레이트 상의 적절한 웰로 조심스럽게 피펫으로 옮겼다. 웰들이 완전히 마르지 않는 것을 보증하기 위하여 모든 단계에서 주의를 기울였다. 그 다음 플레이 트가 방해되지 않고 밤새도록(＞16시간) 배양되었다.

스폿 전개: 2차 다중클론성 항-원숭이-IFN-γ 항체(UCyTech)의 1:100 희석액이 2% FCS로 dPBS에서 제조되었다. 세포와 매질이 플레이트 밖으로 살짝 넘겨지고; 웰들은 dPBS-0.5% Tween 20(Sigma)로 8번 세척되고, 희석된 2차 항체 50㎕를 로딩하였다. 플레이트는 플라스틱 백에서 상온에서 3시간 동안 흔들리는 패널판 위에서 배양되었다. 플레이트는 dPBS-0.5% Tween 20으로 다시 8번 세정되었고, 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트(Southern Biotech #7100-04, Birmingham, AL)의 1:1000 희석액 50㎕/웰이 로딩되었다. 그 다음 플레이트는 흔들리는 패널판 상의 플라스틱 백에 상온에서 추가로 2 시간 동안 배양되었다. 최종적으로, 플레이트는 그전과 같이 8번 세정된 다음 증류수로 한번 세정되고, 색소발생성 NBT-BCIP 기질(Pierce Biotech, Rockford, IL) 100㎕/웰이 추가되었다. 배경이 어두워질 때까지, 색은 10-20분 동안 전개되도록 허용되었다. 그 다음 플레이트는 300㎕ 증류수로 두 번 이상 세정되어 헹구어지고 판독 전에 밤새 공기 중에서 건조시켰다.

플레이트 판독: 플레이트는 AID ELISpot 판독기 v3.1.1.을 사용하여 AID ELHR01 ELISpot 판독기에서 판독되었다. 모든 웰은 시각적으로 검사되었고, 부적절한 스폿 수(작은 조각이나 다른 부스러기들)가 수동으로 배제되었다. 데이타는 엑셀(Excel) 워크시트로 저장되었다. 이중 또는 삼중 반복 웰의 평균을 내고, 이 수d에 5를 곱하여 스폿/백만 세포로 최종 미가공 데이타를 제공하였다.

품질 제어: 냉동/해동 후의 평균 생존가능한 세포 회복은 95%를 초과하였다. 만약 배지 대조 웰이 20스폿/백만을 넘는 평균을 가진다거나, ConA 웰이 500 스폿/ 백만 미만이라면 시행이 반복되었다. 또한, 전반적으로, 7-AAD 염료 배제와 표면 염색으로 흐름 세포계수를 사용하여 평가될 때 CD4+ 및 CD8+ 생존율 모두는 90%를 초과하여야만 하고 아니면 시행이 반복되었다(데이타는 포함되지 않았음).

표 1A: 피.팔시파륨의 CS 단백질을 코드하는 유전자 및 단백질성 항원 성분으로서 항원보강된 RTS,S를 포함하는 혈청형 5 및 35에 기초한 재조합 아데노바이러스 벡터를 사용하는 붉은털 원숭이에서 프라임/부스트 요법을 위한 실험적 요법.

표 1B: 채혈 스케쥴. CBC 및 세포 수확은 전혈을 요구하고; 화학 및 ELISA는 혈청을 요구한다. 혈청 1㎖는 전혈 2㎖를 나타내는 것으로 예상된다. 전혈 부피만이 개시되어있다. 범위는 더 많은 샘플이 더 큰 원숭이로부터 수집될 수 있다는 것을 나타낸다. CBC/chem 열에서 "0.5"는 그 당시 시행된 CBC만을 나타낸다. *는 이 시점에서 모든 원숭이가 방혈(bleed)된 것은 아니라는 것을 나타낸다.

아래 표들에서, RTS,S는 단순히 "RTS"로 지칭된다.

표 2: 부스트 2주 후 PfCS C-말단-특이적 T-세포 면역: 중앙값(median) 및 기하평균 IFN-γ ELISpot(SFU/백만 세포로) 및 ANOVA 비교. 다른 프라임/부스트 요법이 주어진다(좌측).

표 3: 스튜던트 T-검정. 부스트(최종 백신 접종) 2주 후 표 2에 나타난 바와 같은 PfCS C-말단-특이적 IFN-γ ELISpot 비교를 위한 p-값.

표 4: 부스트 3개월 후 C-말단-특이적 IFN-γ T-세포면역: 중앙값 및 기하평균ELISpot(SFU/백만 세포로) 및 ANOVA 비교. 다른 프라임/부스트 요법이 주어진다(좌측).

표 5: 스튜던트 T-검정. 부스트(최종 백신 접종) 3개월 후 표 4에 나타난 바와 같은 ELISpot 비교를 위한 p-값.

표 6: 최종 부스트 2주 후 B 세포 면역(항-반복부 항체 적정농도): 중앙값 및 기하평균ELISA 적정농도 및 ANOVA 비교. 다른 프라임/부스트 요법이 주어진다(좌측).

표 7: 스튜던트 T-검정. 최종 부스트(최종 백신 접종) 2주 후 표 6에 나타난 바와 같은 항체 비교를 위한 p-값.

표 8: 피.팔시파륨 CS 관련 부스트 3개월후 B 세포 면역(항체 적정농도):중앙값 및 기하평균 ELISA(SFU로)와 ANOVA 비교. 다른 프라임/부스트 요법이 주어진다(좌측).

표 9: 스튜던트 T-검정. 부스트(최종 백신 접종) 3개월 후 표 8에 나타난 바와 같은 항체 비교를 위한 p-값.

표 10: 기하평균들의 비^*. T 세포 및 B 세포 반응. 프라임 백신으로서 Ad35 사용.

* 기준으로서 RTS,RTS,RTS

표 11: 기하평균들의 비^*. T 세포 및 B 세포 반응. 부스트 백신으로서 Ad35 사용.

* 기준으로서 RTS,RTS,RTS

표 12: 최종 백신접종 2주 후 PfCS N-말단-특이적 IFN-γ T-세포 면역: 중앙값 및 기하평균 ELISpot(SFU/백만 세포로)과 ANOVA 비교. 다른 프라임/부스트 요법이 주어진다(좌측).

표 13: 스튜던트 T-검정. 최종 부스트(최종 백신 접종) 2주 후 표 12에 나타난 바와 같은 ELISpot 비교를 위한 p-값.

표 14: 부스트 3개월후 PfCS N-말단-특이적 IFN-γ T-세포 면역: 중앙값 및 기하평균 ELISpot(SFU/백만 세포로)과 ANOVA 비교. 다른 프라임/부스트 요법이 주어진다(좌측).

표 15: 스튜던트 T-검정. 최종 부스트(최종 백신 접종) 3개월 후 표 14에 나타난 바와 같은 ELISpot 비교를 위한 p-값.

표 16: PfCS의 N-말단에 대한 T 세포 반응 기하평균들의 비^*. 프라임 백신으로서 Ad35CS가 사용됨.

* 기준으로서 RTS,RTS,RTS

표 17: CS의 N-말단에 대한 T 세포 반응 기하평균들의 비^*. 부스트 백신으로서 Ad35CS가 사용됨.

* 기준으로서 RTS,RTS,RTS

본 발명은 열대열 말라리아(falciparum malaria)의 예방을 위하여 보조제 하에서 재조합으로 생성된 아데노바이러스 벡터 및 정제된 단백질을 사용하는 새로운 프라임/부스트 백신을 제공한다.

참고문헌

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Claims (31)

1. - 약학적으로 허용가능한 부형제내의 복제-결함 재조합 아데노바이러스, 상기 아데노바이러스는 말라리아-유발 원충 유래의 포자소체(CS) 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함함; 및

   - 항원보강된 단백질성 항원:

   을 포함하는 성분들의 키트로서, 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 성분들의 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 35인 성분들의 키트.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 말라리아-유발 원충 유래의 CS 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 성분들의 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 B형 간염 바이러스 유래 표면 항원(HBsAg)을 갖는 지단백 입자의 형태로, HBsAg에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 성분들의 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 RTS,S를 포함하는 성분들의 키트.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 QS21 및 3D-MPL을 포함하는 항원보강제(애쥬번트)로 항원보강된 것인 성분들의 키트.
7. 제6항에 있어서, 상기 항원보강제는 콜레스테롤-함유 리포좀을 추가로 포함하는 것인 성분들의 키트.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 말라리아-유발 원충이 플라즈모듐 팔시파륨(Plasmodium falciparum)인 성분들의 키트.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이종성 핵산이 포유동물, 바람직하기는 인간에서 코드된 단백질의 증가된 생성을 위하여 코돈-최적화된 것인 성분들의 키트.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 항원보강제와 혼합물로 존재하는 것인 성분들의 키트.
11. - 약학적으로 허용가능한 부형제내의 복제-결함 재조합 시미안, 개과, 또는 소과 아데노바이러스, 상기 아데노바이러스는 플라즈모듐 팔시파륨 유래의 코돈-최 적화된 포자소체(CS) 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함하는 것임; 및

    RTS,S를 포함하는 항원보강된 단백질성 항원:

    을 포함하는 성분들의 키트.
12. 제11항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 QS21 및 3D-MPL을 포함하는 항원보강제로 항원보강된 것인 성분들의 키트.
13. 제12항에 있어서, 상기 항원보강제는 콜레스테롤-함유 리포좀을 추가로 포함하는 것인 성분들의 키트.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 복제-결함 재조합 아데노바이러스는 프라임 조성물이고, 상기 항원보강된 단백질성 항원은 부스트 조성물인 성분들의 키트.
15. 말라리아의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 말라리아-유발 원충 유래의 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산 및 항원보강된 단백질성 항원을 포함하는 복제-결함 재조합 아데노바이러스의 용도로서, 상기 재조합 아데노바이러스는 시미안, 개과, 소과의 아데노바이러스 또는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 또는 50인 용도.
16. 제15항에 있어서, 상기 복제-결함 재조합 아데노바이러스가 프라임 조성물로 사용되고 상기 항원보강된 단백질성 항원이 부스트 조성물로 사용되는 것인 용도.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 말라리아-유발 원충 유래의 CS 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것인 용도.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 말라리아-유발 원충이 플라즈모듐 팔시파륨인 용도.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 B형 간염 바이러스 유래의 표면 항원(HBsAg)을 갖는 지단백 입자의 형태로, HBsAg에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 것인 용도.
20. 제19항에 있어서, 상기 항원보강된 단백질성 항원이 RTS,S를 포함하는 것인 용도.
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질성 항원이 QS21 및 3D-MPL로 항원보강된 것인 용도.
22. 제15항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이종성 핵산이 포유동물, 바람직하기는 인간에서 코드된 단백질의 증가된 생성을 위하여 코돈-최적화된 것인 용도.
23. 약학적으로 허용가능한 부형제에서 복제-결함 재조합 아데노바이러스로 포유동물을 프라임하는 단계, 상기 아데노바이러스는 말라리아-유발 원충 유래의 CS 항원을 코드하는 이종성 핵산을 포함함; 및

    B형 간염 바이러스 유래 표면 항원(HBsAg)을 갖는 지단백 입자의 형태로, HBsAg에 융합된 CS 단백질의 하이브리드 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 항원보강된 단백질성 항원으로 상기 포유동물을 부스트하는 단계:

    를 포함하는 말라리아 감염에 대하여 포유동물을 백신접종하는 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 RTS,S를 포함하는 것인 백신접종 방법.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 인간, 시미안, 개과, 또는 소과의 아데노바이러스인 백신접종 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 11, 24, 26, 34, 35, 48, 49, 및 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 아 데노바이러스인 백신접종 방법.
27. 제23항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질성 항원은 QS21 및 3D-MPL로 항원보강된 것인 백신접종 방법.
28. 제23항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 말라리아-유발 원충은 플라즈모듐 팔시파륨인 백신접종 방법.
29. 제23항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이종성 핵산은 포유동물, 바람직하기는 인간에서 코드화된 단백질의 증가된 생산을 위하여 코돈-최적화된 것인 백신접종 방법.
30. 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 성분들의 키트를 사용하여 말라리아 감염에 대하여 포유동물을 백신접종하는 방법.
31. 제14항에 따른 성분들의 키트를 사용하여 말라리아 감염에 대하여 포유동물을 백신접종하는 방법으로서, 부스트는 하나 이상의 뒤따른 부스트로 이어지는 것인 백신접종 방법.

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