TWI676636B - 包含ｐｄ－１抗原或ｐｄ－１配體抗原的類病毒粒子 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含病毒結構蛋白質及衍生自PD-1或PD-1之配體之抗原的類病毒粒子，以及包含該類病毒粒子之組成物或套組、其於免疫反應上之用途等。

Description

包含PD-1抗原或PD-1配體抗原的類病毒粒子 交互參照之相關申請案
本案請求於2013年7月12日申請之美國臨時專利申請案61/845,712號之權益，該案之全部內容以參考方式納入本文。
本發明係關於包含病毒結構蛋白質及衍生自PD-1或PD-1之配體之抗原的類病毒粒子，以及包含該類病毒粒子之組成物或套組、其於免疫反應上之用途等。
計畫性細胞死亡1或PD-1(亦稱為PDCD1)為CD28超家族之50至55kDa第I型跨膜受體，其藉由與特異性配體交互作用而負調節T-細胞抗原受體傳訊，且其被表明在維持自體耐受性上扮有角色。
PD-1抗原幾乎與免疫反應之每一態樣有關，包括自體免疫、腫瘤免疫、感染性免疫、移植免疫、過敏及免疫特權(immunological privilege)。
PD-1係在活化T細胞、B細胞及巨噬細胞之 表面表現(Y.Agata et al.,International Immunology vol.8,No.5 p765-772,1996)，此表明與在免疫系統中亦扮演重要調節角色之CTLA-4相比，PD-1更廣泛地負調節免疫反應。
一般而言，提供用於免疫失調諸如，舉例而言，免疫疾病、發炎疾病、過敏、移植物排斥、癌症、免疫缺乏及其他免疫系統相關疾病之安全且有效的治療方法有其需要。涉及此等疾病之免疫反應之調節可藉由操控PD-1路徑而達成。
PD-1具有二配體：PD-L1(計畫性死亡配體1或PDCD1L1或B7-H1)及PD-L2(計畫性死亡配體2或PDCD1L2或B7-DC)，該二配體為B7家族配體之成員。
在一方法中，封阻(block)PD-1與其配體(PD-L1、PD-L2或二者)之交互作用可提供有效的腫瘤及病毒免疫治療方式。
US 5,629,204及US 5,698,520係關於與人類PD-1及編碼該蛋白質之DNA相關的膜蛋白，並指出PD-1蛋白質可能有利於各種感染、免疫抑制或促進、或腫瘤等之治療。
US 7,595,048及US 2011/0081341係關於以抑制PD-1、PD-L1或PD-L2所誘發之免疫抑制信號為特徵之免疫增強作用、用於治療癌症或感染之組成物及使用此等之療法。
數家大型藥品公司彼此競爭各自的PD-1抗體以搶在第一個上市。現有3種單株抗體諸如：默克公司 (Merck)之來伯里茲單抗(Lambrolizumab)(MK-3475)，其為對抗PD-1之人化單株IgG4抗體、必治妥-施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb)之尼佛魯單抗(Nivolumab)(BMS-936558)，其為全抗人類PD-1抗體、以及羅氏基因科技公司(Roche Genentech)之MPDL3280A，其不會封阻PD-1，但會封阻PD-L1。
然而，仍強烈需要標定PD-1之更強效且安全的化合物。
類病毒粒子(VLPs)係模擬真實天然病毒的組織及構型的多蛋白結構，但缺乏病毒基因組，有生產較安全且較便宜疫苗候選物之潛力。目前世界上有少數預防性VLP系疫苗已商業化：葛蘭素史克藥廠(GlaxoSmithKline)之安在時(Engerix®)(B型肝炎病毒)及保蓓(Cervarix®)(人類乳突病毒)，以及默克公司之重組B型肝炎疫苗(Recombivax HB®)(B型肝炎病毒)及加衛苗(Gardasil®)(人類乳突病毒)為若干實例。其他VLP系疫苗候選物則在臨床試驗中或正進行臨床前評估，諸如流感病毒、小病毒(parvovirus)、諾瓦克(Norwalk)病毒及各種嵌合VLP。許多其他候選物儘管在臨床前試驗中成功，但仍局限於小規模基礎研究。大規模VLP生產之意涵於製程控制、監測及最佳化之內容中討論。順應地鑑別及討論主要的上下游技術挑戰。成功的VLP系疫苗大轟動與來自臨床試驗之最新結果及以嵌合VLP為主之治療性或預防性疫苗接種用技術之最近發展皆簡要地發表於Expert Rev.Vaccines 9(10), 1149-1176,2010。
自從基孔肯雅病毒(Chikungunya virus(CHIKV))於2004年從肯亞再現後，該α病毒在非洲、歐洲及亞洲已感染數百萬人。在缺乏疫苗或抗病毒療法下，該疾病之嚴重性及流行性病毒之蔓延已呈現嚴重的公衛威脅。據報導，流行性基孔肯雅病毒之VLP疫苗保護非人類的靈長類動物而免於感染(Nat Med.2010 March；16(3)：334-338)。美國專利公開案第2012/0003266號揭示包含一種或多種基孔肯雅病毒結構蛋白質之類病毒粒子(VLP)，其有利於調配用於基孔肯雅病毒之疫苗或抗原性組成物；此等疫苗或抗原性組成物誘發針對感染或其至少一種症狀之免疫力。WO2012/106356揭示經修飾之α病毒或黃病毒之類病毒粒子(VLPs)以及增加經修飾之VLPs之產量的方法，藉此用於預防或治療α病毒或黃病毒媒介型疾病(此等引用文獻以參考方式納入本文)。
在第一態樣中，本發明提供一種粒子，其包含病毒結構蛋白質以及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原。
在第二態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含用於表現含有病毒結構蛋白質以及抗原之粒子的核苷酸序列，該抗原係選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組。
在第三態樣中，本發明提供一種醫藥組成物 及包含醫藥組成物之套組，其中，該醫藥組成物包含粒子或核酸分子；該粒子包含病毒結構蛋白質以及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原；該核酸分子包含用於表現含有病毒結構蛋白質以及抗原之粒子的核苷酸序列，該抗原係選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組；以及醫藥上可接受之載劑。
在第四態樣中，本發明提供一種粒子或核酸分子用於製造於個體中調節免疫反應、治療癌症或治療感染性疾病之醫藥組成物或套組的用途；該粒子包含病毒結構蛋白質以及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原；該核酸分子包含用於表現含有病毒結構蛋白質以及抗原之粒子的核苷酸序列，該抗原係選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組。
第1圖顯示ELISA之結果，其中檢測結合至PD-1之N-端(1-167aa)之抗體。
第2圖顯示ELISA之結果，其中檢測結合至FD-1-Fc之抗體。
(1)包含病毒結構蛋白質以及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組之抗原的粒子
在第一態樣中，本發明提供一種粒子，其包含病毒結構蛋白質以及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原。
本發明亦提供可藉由修飾上述粒子而製備之上述粒子之衍生物。修飾之實例包括，但不限於，一個或多個胺基酸殘基之添加、刪除或置換。
本發明所提供之粒子可為包含或由下述(i)及(ii)所組成之粒子：(i)至少一個病毒結構蛋白質；以及(ii)至少一個衍生自PD-1之抗原或至少一個衍生自PD-1之配體之抗原。該至少一個病毒結構蛋白質可由一種或多種蛋白質或胜肽組成，且可自發性地組裝形成本發明所提供之粒子。在一具體實施例中，本發明所提供之粒子具有直徑為至少10nm，舉例而言，至少20nm，較佳為至少50nm。在一具體實施例中，該粒子之分子量為從100kDa至100,000kDa，較佳為從400kDa至30,000kDa。
較佳地，本發明所使用之病毒結構蛋白質可為衍生自α病毒或黃病毒之病毒結構蛋白質。因此，本發明所提供之粒子可為類病毒粒子，包括衍生自α病毒或黃病毒之類病毒粒子。
α病毒或黃病毒之實例包括，但不限於，奧拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus，BFV)、貝巴魯病毒(Bebaru virus)、卡巴斯歐病毒(Cabassou virus)，基孔肯雅病毒(CHIKV)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV)、埃拉特病毒 (Eilat virus)、沼澤地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、格塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、馬亞羅病毒(Mayaro virus)、米池病毒(Me Tri virus)、米德爾堡病毒(Middleburg virus)、莫斯達斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、恩杜姆病毒(Ndumu virus)、奧絨絨病毒(O’ nyong-nyong virus)、皮克孫納病毒(Pixuna virus)、里奧內格羅病毒(Rio Negro virus)、羅斯河病毒(Ross River virus，RRV)、鮭魚胰腺病毒(Salmon pancreas disease virus)、西門利克森林病毒(Semliki Forest virus)、欣德比斯病毒(Sindbis virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、托納特病毒(Tonate virus)、特羅卡拉病毒(Trocara virus)、烏納病毒(Una virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)、懷塔羅瓦病毒(Whataroa virus)、西尼羅病毒(West Nilevirus virus)、登革熱病毒、蜱媒腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)及黃熱病病毒。
病毒結構蛋白質可為殼體蛋白質、外膜蛋白，其片段或其複合物。因此，本發明所使用之病毒結構蛋白質可包含或由殼體蛋白質及/或外膜蛋白及/或其片段組成。在一具體實施例中，本發明所提供之類病毒粒子包含或由殼體、E2及E1組成。抗原可插入E2中。舉例而言，本發明所提供之類病毒粒子可藉由組裝240個殼體、240 個E1蛋白質及240個E2蛋白質而形成，其中，PD-1抗原插入每一E2蛋白質中。
本文所用之術語「PD-1抗原」係指衍生自PD-1之抗原。較佳地，PD-1係人類PD-1。衍生自PD-1之抗原可為PD-1之片段或PD-1之片段之衍生物。
本文所用之術語「PD-1配體抗原」係指衍生自PD-1之配體之抗原。PD-1之配體之實例包括，但不限於，PD-L1及PD-L2。較佳地，PD-1之配體為人類PD-L1或人類PD-L2。衍生自PD-L1或PD-L2之抗原可為PD-L1或PD-L2之片段；或PD-L1或PD-L2之片段之衍生物。
用於本發明所提供之粒子中所含之抗原的PD-L1或PD-L2之片段可根據PD-1、PD-L1或PD-L2之胺基酸序列及/或其三級結構來選擇。
舉例而言，用於該抗原之片段可包含或由位於PD-1、PD-L1或PD-L2之表面之片段所組成。較佳地，對抗包含於本發明所提供之粒子中之抗原的抗體封阻PD-1與PD-L1之間或PD-1與PD-L2之間的交互作用。用於該抗原之PD-1、PD-L1或PD-L2之片段在長度上可為10至300個胺基酸殘基(例如10至120、10至30或15至30個胺基酸殘基)。
在一具體實施例中，用於該抗原之片段可經選擇，使得當該抗原之N-端殘基與C-端殘基之間之空間距離係在該抗原或含有該抗原之自然存在之蛋白質或其經修飾之蛋白質的晶體中測定時，該距離為30Å或以下。舉例 而言，本發明提供之粒子所使用之抗原可用包括PyMOL(例如，PyMOL v0.99：http：/www.pymol.org)之免費軟體來設計。在一具體實施例中，該抗原之N-端殘基與C-端殘基之間之空間距離為30Å(埃)或以下、20Å或以下、或10Å或以下(例如從5Å至15Å、從5Å至12Å、從5Å至11Å、從5Å至10Å、從5Å至8Å、從8Å至15Å、從8Å至13Å、從8Å至12Å、從8Å至11Å、從9Å至12Å、從9Å至11Å、從9Å至10Å或從10Å至11Å)。
用於抗原之PD-1之片段之實例包括，但不限於，lnwyrmspsnqtdklaaf(SEQ ID NO.：4)、mlnwyrmspsnqtdklaafs(SEQ ID NO.：5)、vlnwyrmspsnqtdklaafp(SEQ ID NO.：6)、gaislhpkakiees(SEQ ID NO.：7)、cgaislhpkakieec(SEQ ID NO.：8)、VLNWYRMSPSNQTDKLAAF(SEQ ID NO.：9)、GAISLAPKAQIKES(SEQ ID NO.：10)、RNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVT(SEQ ID NO.：11)、以及RNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVT(SEQ ID NO.：12)。用於抗原之PD-L1之片段之實例包括，但不限於，ciisyggadyc(SEQ ID NO.：13)、CMISYGGADYC(SEQ ID NO.：14)、LQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVN(SEQ ID NO.：15)、LQDAGVYRAMISYGGADYKRITVKVN(SEQ ID NO.：16)、DLAALIVYWEMEDKNIIQFVH(SEQ ID NO.：17)、DLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGG(SEQ ID NO.：18)、FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVE(SEQ ID NO.：19)、Lqdagvycciisyggadykritlkvn(SEQ ID NO.：20)、lqdagvyaaiisyggadykritlkvn(SEQ ID NO.：21)、dllalvvywekedeqviqfva (SEQ ID NO.：22)、dllalvvywekedeqviqfvagg(SEQ ID NO.：23)以及ftitapkdlyvveygsnvtmecrfpve(SEQ ID NO.：24)。
PD-1、PD-L1或PD-L2之片段之衍生物可藉由在PD-1、PD-L1或PD-L2之片段中添加、刪除或置換1個或數個胺基酸殘基而製備。在一具體實施例中，PD-1、PD-L1或PD-L2之片段之衍生物與自然存在之PD-1、PD-L1或PD-L2之對應片段具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。在一具體實施例中，PD-1、PD-L1或PD-L2之片段之衍生物為自然存在的PD-1、PD-L1或PD-L2之對應片段之突變體，該突變體中至多10%之胺基酸係經刪除、取代及/或附加。
在本發明所提供之粒子中，病毒結構蛋白質與抗原可經由至少一個呈現於該病毒結構蛋白質之第一連結位點(attachment site)及至少一個呈現於該抗原之第二連結位點而連接。
本文所用之每一「第一連結位點」及「第二連結位點」係指超過一個物質彼此連接之位點。
在一具體實施例中，病毒結構蛋白質與抗原係直接融合。在一具體實施例中，一或兩個連接基可介入抗原之N-端殘基與病毒結構蛋白質之間及/或抗原之C-端殘基與病毒結構蛋白質之間。
抗原或病毒結構蛋白質可被截斷及以短連接基置換。在若干具體實施例中，抗原或病毒結構蛋白質包括一個或多個胜肽連接基。連接基典型地由2至25個胺 基酸組成。通常，其在長度上為2至15個胺基酸，惟在特定情況下，可僅為一個，諸如單一甘胺酸殘基。
在一具體實施例中，核酸分子在宿主中表現，於該核酸分子中，編碼病毒結構蛋白質之多核苷酸係與編碼抗原之多核苷酸基因性融合，使得第一連結位點與第二連結位點經由胜肽鍵而連接。在此情形下，病毒結構蛋白質與抗原經由胜肽鍵連接。關於此具體實施例，第一連結位點及/或第二連結位點可從原始蛋白質或抗原經基因性修飾而得。舉例而言，第一連結位點係從病毒結構蛋白質修飾而得，使得該蛋白質經由包括SG、GS、SGG、GGS及SGSG之連接基胜肽與該抗原接合。
當病毒結構蛋白質與抗原化學性接合時，第一連結位點及第二連結位點可經由為化學化合物之化學交聯劑而連接。
交聯劑之實例包括，但不限於，SMPH、磺基-MBS、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-SIAB、磺基-SMPB、磺基-SMCC、SVSB、SIA及可得自皮爾斯化學公司之其他交聯劑。
較佳地，抗原可與基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質連接，如同以遺傳工程方式所產生之融合蛋白質。
本發明所使用之基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質可為基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之外膜蛋白或殼體，或為一個或多個外 膜蛋白及/或殼體蛋白質之複合物。
基孔肯雅病毒之實例包括，但不限於，病毒株37997及LR2006 OPY-1。
委內瑞拉馬腦炎病毒之實例包括，但不限於，TC-83。
本發明所使用之基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質可為自然存在之病毒結構蛋白質或其經修飾之蛋白質。經修飾之蛋白質可為自然存在之病毒結構蛋白質之片段。在一具體實施例中，經修飾之蛋白質與自然存在之病毒殼體及/或外膜蛋白具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列一致性。在一具體實施例中，經修飾之蛋白質為自然存在之病毒殼體及/或外膜蛋白之突變體，該突變體中至多10%之胺基酸係經刪除、取代及/或添加。舉例而言，K64A或K64N突變可導入本發明所使用之委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之殼體中。
基孔肯雅或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質可包含或由殼體、E2及E1組成。
基孔肯雅病毒結構蛋白質之實例包括，但不限於，基孔肯雅病毒株37997之殼體-E2-E1、以及基孔肯雅病毒株LR2006 OPY-1之殼體-E2-E1。
委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之實例包括，但不限於，委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83之殼體-E2-E1。
基因銀行登錄編號ABX40006.1提供例示性之基孔肯雅病毒結構蛋白質序列，其如下述(SEQ ID NO.：1)：
Figure TWI676636B_D0001
基因銀行登錄編號ABX40011.1提供另一例示性之基孔肯雅病毒結構蛋白質序列，其如下述(SEQ ID NO.：2)：
Figure TWI676636B_D0002
例示性之委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質係如下述(SEQ ID NO.：3)：
Figure TWI676636B_D0003
在一具體實施例中，第一連結位點包含胺基，較佳為離胺酸殘基之胺基。在一具體實施例中，第二連結位點包含巰基，較佳為半胱胺酸之巰基。
根據本發明，可提供類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，其包含基孔肯雅或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質，及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組中的抗原，其中，該基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質與該抗原係表現為融合蛋白質。
選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原可與基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之任何位 點融合。舉例而言，選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原可直接或間接連接至基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之N-或C-端，或者選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原(例如PD-L1、PD-L2所組成之群組的抗原)可插入基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之中。
在一具體實施例中，至少一個選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原係插入基孔肯雅病毒結構蛋白質或委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質之E2中。舉例而言，關於基孔肯雅病毒結構蛋白質，至少一個選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原係插入SEQ ID NOs.：1或2之殘基519與520之間(即SEQ ID NOs.：1或2之519-位之G與520-位之Q之間)；SEQ ID NOs.：1或2之殘基530與531之間(即SEQ ID NOs.：1或2之530-位之G與531-位之S之間)；SEQ ID NOs.：1或2之殘基531與532之間(即SEQ ID NOs.：1或2之531-位之S與532-位之N之間)；SEQ ID NOs.：1或2之殘基529與530之間(即SEQ ID NOs.：1或2之529-位之G與530-位之G之間)；或SEQ ID NOs.：1或2之殘基510與511之間(即SEQ ID NOs.：1或2之510-位之S與511-位之G之間)；或SEQ ID NOs.：1或2之殘基511與512之間(即SEQ ID NOs.：1或2之511-位之G與512-位之N之 間)；或SEQ ID NOs.：1或2之殘基509與510之間(即SEQ ID NOs.：1或2之509-位之Q與510-位之S之間)。VLP_CHI 532載體(SEQ ID NO.：25)可用於製備類基孔肯雅病毒粒子，於該類基孔肯雅病毒粒子中，抗原係插入SEQ ID NOs.：1或2之殘基531與532之間。
舉例而言，關於委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質，至少一個選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原係插入SEQ ID NO.：3之殘基517與518之間(即SEQ ID NO.：3之517-位之G與518-位之S之間)；SEQ ID NO.：3之殘基518與519之間(即SEQ ID NO.：3之518-位之S與519-位之S之間)；SEQ ID NO.：3之殘基519與520之間(即SEQ ID NO.：3之519-位之S與520-位之V之間)；SEQ ID NO.：3之殘基515與516之間(即SEQ ID NO.：3之515-位之L與516-位之S之間)；SEQ ID NO.：3之殘基516與517之間(即SEQ ID NO.：3之516-位之S與517-位之G之間)；SEQ ID NO.：3之殘基536與537之間(即SEQ ID NO.：3之536-位之C與537-位之G之間)；SEQ ID NO.：3之殘基537與538之間(即SEQ ID NO.：3之537-位之G與538-位之G之間)；SEQ ID NO.：3之殘基538與539之間(即SEQ ID NO.：3之538-位之G與539-位之T之間)。VLP_VEEV VLP 518載體(SEQ ID NO.：26)可用於製備類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，於該類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子中，抗原係插入SEQ ID NO.：3之殘基517與518之間。
可使用本領域中之習用技術來表現融合蛋白質。可使用各種表現系統來表現該融合蛋白質。舉例而言，該融合蛋白質可於293細胞、Sf9細胞或大腸桿菌中表現。
衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之蛋白質可為自然存在之病毒蛋白質或其經修飾之蛋白質。
當衍生自病毒之蛋白質與衍生自抗原之蛋白質接合時，可使用連接基胜肽，包括SG、GS、SGG、GGS、SGSG及TRGGS。衍生自病毒之蛋白質(下文稱做「PFV」)與衍生自抗原之蛋白質(下文稱做「PFA」)接合的實例包括，但不限於，PFV-SG-PFA-GS-PFV；PFV-SG-PFA-GGS-PFV；PFV-SSG-PFA-GS-PFV；PFV-SGG-PFA-GGS-PFV；PFV-SGSG-PFA-GS-PFV；及PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV。
在一具體實施例中，本發明提供類病毒粒子，其包含衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之蛋白質與衍生自PD-1或PD-L1之蛋白質的融合蛋白質，其中，該類病毒粒子係藉由將包含核酸分子之表現載體轉染至哺乳動物細胞(例如293F細胞)而製備，該核酸分子包含SEQ ID NO.：27至32所示之核苷酸序列。關於此具體實施例，經修飾之融合蛋白質亦可用於本發明所提供之類病毒粒子，該經修飾之融合蛋白質可藉由將包含核酸分子之表現載體轉染至哺乳動物細胞(例如293F細胞)而製備，該核酸分子包含與SEQ ID NO.：27至32具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之核苷 酸序列一致性的核苷酸序列。
在一具體實施例中，本發明提供類病毒粒子，其包含或由下述者組成：一個或多個之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體；一個或多個之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1；以及一個或多個之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2，其中，選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原係插入基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2中。舉例而言，本發明提供類病毒粒子，其包含或由下述者所組成：240個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體；240個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1；以及240個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2，其中，選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)的抗原所組成之群組的抗原係插入基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之每一E2中。
在此具體實施例中，該經抗原插入之E2可由SEQ ID NOs.：33至36所示之胺基酸序列組成；該E1可 由SEQ ID NO.：37所示之胺基酸序列組成；以及該殼體可由SEQ ID NO.：38所示之胺基酸序列組成；或者該經抗原插入之E2可由SEQ ID NOs.：39至42所示之胺基酸序列組成；該E1可由SEQ ID NO.：43所示之胺基酸序列組成；以及該殼體可由SEQ ID NO.：44所示之胺基酸序列組成。
再者，關於此具體實施例，經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體、經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1，及經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2可用於類病毒粒子。舉例而言，該經修飾基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體可與SEQ ID NO.：38或SEQ ID NO.：44所示之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的胺基酸序列一致性；該經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1可與SEQ ID NO.：37或SEQ ID NO.：43所示之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的胺基酸序列一致性；及/或該經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2可與SEQ ID NOs.：33至36或SEQ ID NOs.：39至42所示之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%的胺基酸序列一致性。又，該經修飾之殼體、E1或E2可為由SEQ ID NO.：38或SEQ ID NO.：44所示之胺基酸序列所組成之殼體的突變體；由SEQ ID NO.：37或SEQ ID NO.：43所示之胺基酸序列所組成之E1的突變體；及/或由SEQ ID NOs.：33至36或SEQ ID NOs.：39至42所示之胺基酸序列所組成之E2的突變體，該等突變體中至多10%之胺基酸係經刪除、取代及/或添加。
類病毒粒子可藉由將包含DNA分子的表現載體導入細胞(例如293細胞)中，並使用超離心方法從條件培養基中回收該類病毒粒而製備，該DNA分子具有編碼該類病毒粒子之核苷酸序列。
(2)核苷酸、載體、宿主細胞
在第二態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含用於表現所揭示之粒子之核苷酸序列，該所揭示之粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原。
本發明所提供之核酸分子可為用於表現類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之單離核酸分子，此等類病毒粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組的抗原。
熟習此技術之人士可依據SEQ ID NO.：63至64所示之編碼殼體及/或外膜之例示性核苷酸序列來製備上述本發明所提供之核酸分子。
舉例而言，熟習此技術之人士可將編碼衍生自PD-1或PD-L1之抗原的核苷酸序列導入編碼基孔肯雅或委內瑞拉馬病毒結構蛋白質之E2的核苷酸序列中，進 而製備核酸分子，該核酸分子係導入載體中用以表現包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組之抗原的類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬病毒粒子。如上述之核苷酸序列(其中抗原衍生序列係導入E2中)的實例包括，但不限於，SEQ ID NOs.：27或29所示之核苷酸序列(用於表現包含PD-1抗原之類基孔肯雅病毒粒子)；SEQ ID NO.：31所示之核苷酸序列(用於表現包含PD-L1抗原之類基孔肯雅病毒粒子)；SEQ ID NOs.：28或30所示之核苷酸序列(用於表現包含PD-1抗原之類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子)；以及SEQ ID NO.：32所示之核苷酸序列(用於表現包含PD-L1抗原之類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子)。
在一具體實施例中，本發明提供一種包含上述核酸分子之載體，其中，該載體視需要包含可操作性連接至該核酸分子之表現控制序列。
表現控制序列之實例包括，但不限於，啟動子，諸如CMV啟動子；噬菌體λ PL啟動子；大腸桿菌lac、phoA及tac啟動子；SV40早期及晚期啟動子；及逆轉錄病毒LTR之啟動子。
在此具體實施例中，包含可操作性連接至上述核酸分子之表現控制序列的載體可用作為表現載體，用於製備本發明所提供之粒子。
熟習此技術之人士可依據WO/2012/006180製備該表現載體，該案之全部內容係以參考方式納入本文。
可用於表現類病毒粒子(包含衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)之蛋白質與衍生自PD-1之抗原之融合蛋白質)之載體的實例包括VLP31.11載體(SEQ ID NO.：45)及VLP274.11載體(SEQ ID NO.：46)所示之載體。
可用於表現類病毒粒子(包含衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)之蛋白質與衍生自PD-L1之抗原之融合蛋白質)之載體的實例包括VLP299.15載體(SEQ ID NO.：47)所示之載體。
可用於表現類病毒粒子(包含衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之蛋白質與衍生自PD-1之抗原之融和蛋白質)之載體的實例包括VLP31.21載體(SEQ ID NO.：48)及VLP274.21載體(SEQ ID NO.：49)所示之載體。
可用於表現類病毒粒子(包含衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之蛋白質與衍生自PD-L1之抗原之融合蛋白質)之載體的實例包括VLP299.25載體(SEQ ID NO.：50)所示之載體。
本發明亦提供與具有SEQ ID NOs.：45至50中任一者所示之核苷酸序列的核酸分子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之核苷酸序列一致性的核酸分子，以及可為突變體之核酸分子，其為具有SEQ ID NOs.：45至50中任一者所示之核苷酸序列的核酸分子之突變體，該突變體中至多10%之核苷酸係經刪除、取代及/或添加。
此外，本發明提供一種重組細胞，其係藉由 將上述載體導入宿主細胞中而製備。舉例而言，使用CHO細胞或293細胞作為宿主細胞。
(3)醫藥組成物、套組
在第三態樣中，本發明提供一種醫藥組成物及一種包含醫藥組成物之套組，其中，該醫藥組成物包含粒子或核酸分子，該粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組的抗原；該核酸分子包含用於表現粒子之核苷酸序列，該粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組的抗原；以及醫藥上可接受之載劑。
在一具體實施例中，本發明提供一種醫藥組成物或包含醫藥組成物之套組，其中，該醫藥組成物包含如上述之類α病毒粒子或黃熱病毒粒子(例如類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子)，或如上述之核酸分子；以及醫藥上可接受之載劑。該類α病毒粒子或黃熱病毒粒子之含量及該核酸分子之含量可為醫藥組成物之0.00001至1w/w%。
本發明所提供之粒子(例如CHIKV VLP或VEEV VLP)的劑量可為1-500μg/日。
本發明所提供之醫藥組成物可使用一個或多個PD-1抗原或PD-1配體抗原。
該醫藥組成物可進一步包含佐劑。佐劑之實例包括，但不限於，李畢溶液(Ribi solution)(Sigma佐劑系統， Sigma-Aldrich)。本發明所提供之醫藥組成物可含有緩衝劑，諸如磷酸氫二鈉水合物、磷酸二氫鈉及氯化鈉；以及防腐劑，諸如硫柳汞(thimerosal)。在一具體實施例中，該醫藥組成物係水溶液，其含有0.001至1w/w%之包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原之粒子(例如CHIKV VLP或VEEV VLP)；1至10w/w%之緩衝劑；0.01至1w/w%之佐劑；及0.00001至0.001w/w%之防腐劑。
熟習此技術之人士可使用習知技術製備此醫藥組成物。舉例而言，將包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組之抗原的粒子(例如CHIKV VLP或VEEV VLP)與具有生理pH(例如pH 5至9、pH7)的緩衝溶液混合，藉以製備本發明所提供之醫藥組成物。
在一具體實施例中，該醫藥組成物係包含粒子之疫苗或免疫刺激劑，該粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組的抗原。舉例而言，本發明所提供之疫苗組成物可用於免疫治療(例如治療癌症)。
在一具體實施例中，該醫藥組成物係包含核酸分子之DNA疫苗，該核酸分子包含用於表現粒子之核苷酸序列，該粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組的抗原。在一具體實施例中，本發明所提供之DNA疫苗包含含 有寡核苷酸之CpG。
本發明之第三態樣所提供之醫藥組成物可投予一次或多次。當本發明之第三態樣所提供之醫藥組成物投予超過一次時，可於每一次投予使用不同的本發明第一態樣所提供之粒子(例如CHIKV VLP或VEEV VLP)。在一具體實施例中，採用下述組合：使用本發明第一態樣所提供之CHIKV VLP進行免疫及使用本發明之第一態樣所提供之VEEV VLP進行免疫。舉例而言，本發明之第一態樣所提供之CHIKV VLP可用於進行第一次免疫，而本發明之第一態樣所提供之VEEV VLP可用於進行第二次免疫；或者本發明之第一態樣所提供之VEEV VLP可用於進行第一次免疫，而使用本發明之第一態樣所提供之CHIKV VLP可用於進行第二次免疫。
熟習本技術之人士可決定使用本發明所提供之組成物或疫苗進行免疫的時機。舉例而言，第二次免疫在第一次免疫之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週後進行。
在一具體實施例中，本發明提供一種套組，該套組包含：(a)包含本發明之第一態樣所提供之粒子的醫藥組成物；以及(b)包含本發明之第一態樣所提供之粒子的另一醫藥組成物；其中，(a)中所含之粒子係與(b)中所含之粒子不同的類病毒 粒子。在此具體實施例中，(a)中所含之粒子可為類基孔肯雅病毒粒子，而(b)中所含之粒子可為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子。
在一具體實施例中，本發明提供一種套組，該套組包含：(a)包含本發明之第一態樣所提供之粒子的醫藥組成物；以及(b)包含本發明之第一態樣所提供之粒子的另一醫藥組成物，(c)一個或多個醫藥組成物，每一醫藥組成物包含本發明之第一態樣所提供之粒子，其中，(a)係用於起始免疫，而(b)及(c)係用於增強免疫；且(a)中所含之粒子係與(b)中所含之粒子不同的類病毒粒子；(c)中所含之粒子與(a)及(b)中所含之粒子不同，或與(a)或(b)中所含之粒子相同。
上述套組所含之各個醫藥組成物可同時、分開或相繼投予。
本發明之第一態樣所提供的類α病毒或黃病毒粒子(例如基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒)，或本發明之第二態樣所提供的核酸分子可用於本發明之第三態樣所提供的醫藥組成物。
舉例而言，類基孔肯雅或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子包含或由下述者組成：一個或多個(例如240個)基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內 瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體；一個或多個(例如240個)基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1；以及一個或多個(例如240個)基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2，其中，PD-1抗原係插入基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2，該類基孔肯雅或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子可用於製備本發明之第三態樣所提供的組成物或疫苗。該經抗原插入之E2可由SEQ ID NOs.：33至36所示之胺基酸序列組成；該E1可由SEQ ID NO.：37所示之胺基酸序列組成；及該殼體可由SEQ ID NO.：38所示之胺基酸序列組成；或該經抗原插入之E2可由SEQ ID NOs.：39至42所示之胺基酸序列組成；該E1可由SEQ ID NO.：43所示之胺基酸序列組成；及該殼體可由SEQ ID NO.：44所示之胺基酸序列組成。
(4)經揭示之粒子之用途等
在第四態樣中，本發明提供一種粒子或核酸分子製造治療或預防癌症或感染性疾病；在哺乳動物(例如人類)中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體；調節免疫反應；免疫刺激；抑制PD-1與PD-1之配體間的交互作用；或抑制PD-1活性的醫藥組成物或套組之用途；該粒子包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體的抗原所組成之群組的抗原；該核酸分子包含用於表現含有病毒結構蛋白質以及抗原之粒子的核苷酸序列，該抗 原係選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組。本發明亦提供本文所揭示之用於治療或預防癌症或感染性疾病；在哺乳動物(例如人類)中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體；免疫刺激；抑制PD-1與PD-1之配體間的交互作用；或抑制PD-1活性之方法的粒子、醫藥組成物或套組。
此醫藥組成物可經由肌內(i.m.)、皮內(i.c.)、皮下(s.c.)、真皮內(i.d.)或腹膜內(i.p.)投予至哺乳動物(例如人類)。
在一具體實施例中，該醫藥組成物為疫苗，其可應用於免疫治療(例如治療癌症)。
可治療之癌症的實例包括，但不限於，黑色素瘤、腎臟癌、前列腺癌、乳癌、結腸癌或非小細胞肺癌。其他癌症之實例包括，但不限定於，骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸之癌症、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域之癌症、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、柔軟組織之肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、兒童實性瘤(solid tumor)、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管之癌症、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)之腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、 腫瘤血管新生、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鱗狀細胞癌、T-細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括由石棉誘發者)，以及此等之組合。
可治療之感染性疾病的實例包括，但不限於，HIV、流行性感冒、皰疹、梨形鞭毛蟲病(giardia)、瘧疾、利什曼原蟲症；由下列病毒引起之致病性感染：肝炎病毒(A、B及C)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II、及CMV、EB病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃熱病毒、埃可病毒(Echovirus)、鼻病毒、柯薩奇病毒(Coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒(arboviral encephalitis virus)；由下列細菌引起之致病性感染：衣原菌、立克次體菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌及淋病球菌、克雷白氏菌(Klebsiella)、變形桿菌、鋸桿菌(Serratia)、假單胞菌、退伍軍人桿菌、白喉菌、沙門氏菌、桿菌、霍亂菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽菌、鼠疫菌、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆氏病之細菌；由下列真菌引起之致病性感染：念珠菌(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌(煙麴黴、黑麴黴等)、毛黴目(Mucorales)(毛黴菌(mucor)、犁頭黴菌(absidia)、根黴菌(rhizophus))、申克氏 孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)；以及由下列寄生蟲引起之致病性感染：溶組織阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、變形纖毛蟲(Naegleria fowleri)、棘狀變形蟲屬(Acanthamoeba sp.)、梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺胞囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、小鼠焦蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓蟲(Toxoplasma gondi)及巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
當將包含病毒結構蛋白質及選自由衍生自PD-1或PD-1之配體之抗原所組成之群組之抗原的醫藥組成物投予至哺乳動物(例如人類)時，在該哺乳動物之血液中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體。經產生之抗體可調節免疫反應、顯示免疫刺激功效、抑制PD-1與PD-1之配體(例如PD-L1、PD-L2)之間的交互作用、或抑制PD-1活性。
使用習知技術可將經生產之抗體人化。使用本發明之第一態樣所提供的粒子可製備單株抗體或多株抗體。
在一具體實施例中，本發明提供一種產生對抗PD-1 或PD-1之配體之抗體的方法，包含投予本發明之第一態樣所提供的粒子至非人類哺乳動物，以及人化非人類哺乳動物所產生的抗體。
本文所用之術語「抗體」係指能與抗原決定位(epitope)或抗原決定子(antigenic determinant)結合的分子。該術語理應包括完整抗體及其抗原結合片段，包括單鏈抗體。此等抗體包括人類抗原結合抗體片段，以及包括，但不限於，Fab、Fab'及F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、經二硫連接之Fvs(sdFv)，及包含VL及VH域之一者之片段。此等抗體可來自任何動物來源，包括鳥類及哺乳動物。此等抗體較佳係來自哺乳動物，例如人類、鼠類、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬等，或來自其他適合之動物，例如雞。本文所用之「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體，及包括從人類免疫球蛋白庫或基因移轉動物中單離之抗體，該基因移轉動物係用於表現一種或多種人類免疫球蛋白且不表現內源性免疫球蛋白，舉例而言，如美國專利第5,939,598號所述者，該美國專利案之揭示內容全部以參考方式納入本文。
術語「PD-1活性」係指一種或多種與PD-1相關之免疫調節活性。舉例而言，PD-1為TcR/CD28媒介型免疫反應的負調節劑。因此，免疫反應之調節的實例包括，但不限於，增強TcR/CD28-媒介型免疫反應。
在一具體實施例中，本發明提供一種產生本發明之第一態樣所提供的類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞 拉馬腦炎病毒粒子的方法，其包含：製備設計用於表現該粒子之載體；培養經該載體轉染之細胞以表現該粒子；以及回收該粒子。在此具體實施例中，可使用習知方法進行轉染。用於轉染之細胞可為293細胞。回收VLP可包括在以載體轉染細胞後，收集條件培養液，及可進一步包括使用超離心從該條件培養液純化VLP。
本發明進一步提供以下例示性之具體實施例(1)至(35)：(1)一種粒子，其包含病毒結構蛋白質以及至少一個選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原；(2)一種粒子，其係如(1)所述之粒子之衍生物；(3)如(1)或(2)所述之粒子，其中，該抗原係衍生自PD-1、PD-L1或PD-L2；(4)如(1)至(3)中任一者所述之粒子，其中，該粒子投予至動物誘發對抗該抗原之抗體，且該抗體封阻PD-1與PD-L1之交互作用或PD-1與PD-L2之交互作用；(5)如(1)至(4)中任一者所述之粒子，其中，該粒子係類病毒粒子；(6)如(1)至(5)中任一者所述之粒子，其中，該粒子係衍生自α病毒或黃熱病毒之類病毒粒子；(7)如(1)至(6)中任一者所述之粒子，其中，該粒子係衍生自基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子； (8)如(1)至(7)中任一者所述之粒子，其中，該病毒結構蛋白質包含至少一個第一連結位點，及該至少一個抗原包含至少一個第二連結位點，以及其中，該病毒結構蛋白質與該抗原係經由該至少一個第一及該至少一個第二連結位點連接，以及其中，該粒子係類病毒粒子；(9)如(1)至(8)中任一者所述之粒子，其中，該病毒結構蛋白質包含殼體及/或外膜蛋白E1及E2；(10)如(9)所述之粒子，其中，至少一個衍生自PD-1之抗原或至少一個衍生自PD-L1之抗原係插入外膜蛋白E2中；(11)如(1)至(10)中任一者所述之粒子，其中，該病毒結構蛋白質係一種衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之蛋白質；(12)如(1)至(11)中任一者所述之粒子，其中，該粒子為類基孔肯雅病毒粒子，該粒子係由一個或多個經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2、一個或多個外膜蛋白E1及一個或多個殼體所組成；以及其中，該經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2係由SEQ ID NOs.：33至35所示之胺基酸序列所組成；該外膜蛋白E1係由SEQ ID NO.：37所示之胺基酸序列所組成；以及該殼體係由SEQ ID NO.：38所示之胺基酸序列所組成；(13)如(1)至(11)中任一者所述之粒子，其中，該粒子為類委內瑞拉馬病毒粒子，該粒子係由一個或多個經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2、一個或多個外膜蛋白E1 及一個或多個殼體所組成；以及其中，該經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2係由SEQ ID NOs.：39至41所示之胺基酸序列所組成；該外膜蛋白E1係由SEQ ID NO.：43所示之胺基酸序列所組成；以及該殼體係由SEQ ID NO.：44所示之胺基酸序列所組成；(14)如(1)至(11)中任一者所述之粒子，其中，該粒子為類基孔肯雅病毒粒子，該粒子係由一個或多個經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2、一個或多個外膜蛋白E1及一個或多個殼體所組成；以及其中，該經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2係由SEQ ID NO.：36所示之胺基酸序列所組成；該外膜蛋白E1係由SEQ ID NO.：37所示之胺基酸序列所組成；以及該殼體係由SEQ ID NO.：38所示之胺基酸序列所組成；(15)如(1)至(11)中任一者所述之粒子，其中，該粒子為類委內瑞拉馬病毒粒子，該粒子係由一個或多個經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2、一個或多個外膜蛋白E1及一個或多個殼體所組成；以及其中，該經衍生自PD-1之抗原插入之外膜蛋白E2係由SEQ ID NO.：42所示之胺基酸序列所組成；該外膜蛋白E1係由SEQ ID NO.：43所示之胺基酸序列所組成；以及該殼體係由SEQ ID NO.：44所示之胺基酸序列所組成；(16)一種粒子，其係由胺基酸序列所組成，該胺基酸序列與(1)至(15)中任一者所述之粒子之胺基酸序列具有90%或以上(或95%或以上)的序列一致性； (17)一種單離之核酸分子，其包含用於表現如(1)至(16)中任一者所述之粒子的核苷酸序列；(18)一種單離之核酸分子，其係由與SEQ ID NOs.：27至32中任一者所示之核苷酸序列具有90%或以上之序列一致性的核苷酸序列所組成；(19)如(18)所述之核酸分子，其中，該核酸分子係由SEQ ID NOs.：27至32中任一者所示之核苷酸序列所組成；(20)一種載體，其包含如(17)至(19)中任一者所述之核酸分子，其中，該載體視需要包含可操作性連接至該核酸分子之表現控制序列(例如，由SEQ ID NOs.：45、46、47、48、49或50所示之核苷酸序列所組成之載體)；(21)一種醫藥組成物，其包含：(a)如(1)至(16)中任一者所述之粒子、如(17)至(19)中任一者所述之核酸分子、及/或如(20)所述之載體；以及(b)醫藥上可接受之載劑；(22)如(21)所述之醫藥組成物(例如疫苗)，其包含如(1)至(16)中任一者所述之粒子以及醫藥上可接受之載劑；(23)一種如(1)至(16)中任一者所述之粒子、如(17)至(19)中任一者所述之核酸分子、及/或如(20)所述之載體用於製造治療或預防癌症或感染性疾病；在哺乳動物中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體；調節免疫反應；免疫刺激；抑制PD-1與PD-1之配體間的交互作用；或抑制PD-1活性之醫藥組成物或套組之用途；(24)如(23)所述之用途，其中，該醫藥組成物係經投予 以抑制PD-L1及/或PD-L2與PD-1之結合；(25)如(23)或(24)所述之用途，其中，該癌症係黑色素瘤、腎臟癌、前列腺癌、乳癌、結腸癌或非小細胞肺癌；(26)如(23)或(24)所述之用途，其中，該癌症係選自下列所組成之群組：骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸之癌症、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域之癌症、胃癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、柔軟組織之肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、兒童實性瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管之癌症、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)之腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管新生、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鱗狀細胞癌、T-細胞淋巴瘤、環境誘發之癌症(包括由石棉誘發者)，以及此等之組合；(27)如(23)或(24)所述之用途，其中，該感染性疾病係選自下列所組成之群組：HIV、流行性感冒、皰疹、梨形鞭毛蟲病(giardia)、瘧疾、利什曼原蟲症；由下列病毒所引起之致病性感染：肝炎病毒(A、B及C)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II、及CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黃熱病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、 麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒性腦炎病毒；由下列細菌所引起之致病性感染：衣原菌、立克次體菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌及淋病球菌、克雷白氏菌、變形桿菌、鋸桿菌、假單胞菌、退伍軍人桿菌、白喉菌、沙門氏菌、桿菌、霍亂菌、破傷風菌、肉毒桿菌、炭疽菌、鼠疫菌、鉤端螺旋體病及萊姆氏病之細菌；由下列真菌所引起之致病性感染：念珠菌(白色念珠菌、克魯斯念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、麴菌(煙麴黴、黑麴黴等)、毛黴目(毛黴菌、犁頭黴菌、根黴菌)、申克氏孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌及莢膜組織胞漿菌，以及由下列寄生蟲所引起之致病性感染：溶組織阿米巴、大腸纖毛蟲、變形纖毛蟲、棘狀變形蟲屬、梨形鞭毛蟲、隱孢子蟲屬、肺胞肺囊蟲、間日瘧原蟲、小鼠焦蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、黑熱病利什曼原蟲、弓蟲及巴西鼠鉤蟲；(28)一種套組，其包含：(a)包含如(1)至(16)中任一者所述之粒子的醫藥組成物；以及(b)包含如(1)至(16)中任一者所述之粒子的另一醫藥組成物，其中，(a)中所含之粒子為與(b)中所含之粒子不同的類病毒粒子； (29)如(28)所述之套組，其中，(a)中所含之粒子為類基孔肯雅病毒粒子，而(b)中所含之粒子為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子；或(a)中所含之粒子為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，而(b)中所含之粒子為類基孔肯雅病毒粒子；(30)如(28)或(29)所述之套組，其進一步包含：(c)一個或多個醫藥組成物，每一醫藥組成物包含如(1)至(16)中任一主所述之粒子，其中，(a)係用於起始免疫，(b)及(c)係用於增強免疫，且(c)中所含之粒子與(a)及(b)中所含之粒子不同，或與(a)或(b)中所含之粒子相同；(31)如(28)至(30)中任一者所述之套組，其中，各個醫藥組成物係同時、分開或相繼投予；(32)如(1)至(16)中任一者所述之粒子、如(17)至(20)中任一者所述之核酸分子、如(20)所述之載體、如(21)或(22)所述之醫藥組成物、或如(28)至(31)中任一者所述之套組，係用於治療或預防癌症或感染性疾病；在哺乳動物中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體；調節免疫反應；免疫刺激；抑制PD-1與PD-1之配體間的交互作用；或抑制PD-1活性之方法；(33)如(1)至(16)中任一者所述之粒子、如(17)至(20)中任一者所述之核酸分子、如(20)所述之載體、如(21)或(22)所述之醫藥組成物、或如(28)至(31)中任一者所述之套組係用於治療或預防癌症之方法，其中，該癌症係選自如(25)或(26)中所述之癌症；(34)如(1)至(16)中任一者所述之粒子、如(17)至(20)中 任一者所述之核酸分子、如(20)所述之載體、如(21)或(22)所述之醫藥組成物、或如(28)至(31)中任一者所述之套組係用於治療或預防感染性疾病之方法，其中，該感染性疾病係選自如(27)所述之感染性疾病；(35)一種用於產生類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之方法，其包含培養經如(20)所述之載體轉染之細胞以表現該粒子；以及使用超離心純化該粒子。
參考以下實施例詳細說明本發明，然而，非意圖以此等實施例限制本發明之範圍。
[實施例] 實施例1：包含病毒結構蛋白質及PD-1抗原片段之類基孔肯雅病毒(CHIKV)粒子之製備
使用下述PD-1之多核苷酸插入VLP_CHI 532載體(SEQ ID NO.：25)中。N端連接基在胺基酸序列中為SGG(在核苷酸序列中為TCCGGAGGA)，以及C端連接基在胺基酸序列中為GGS(在核苷酸序列中為GGAGGATCC)。
1.VLP31(PD-1序列NO.1)：附有連接基之PD-1片段之序列，其係用於抗原：核苷酸序列
Tccggaggactaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttcggaggatcc(SEQ ID NO.：51)
胺基酸序列
sgglnwyrmspsnqtdklaafggs(SEQ ID NO.：52)
2. VLP32(PD-1序列NO.2)：附有連接基之PD-1片段之 另一序列，其係用於抗原：核苷酸序列
Tccggaggaatgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttctcaggaggatcc(SEQ ID NO.：53)
胺基酸序列
sggmlnwyrmspsnqtdklaafsggs(SEQ ID NO.：54)
3. VLP33(PD-1序列NO.3)：附有連接基之PD-1片段之另一序列，其係用於抗原：核苷酸序列
Tccggaggagtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccggaggatcc(SEQ ID NO.：55)
胺基酸序列
sggvlnwyrmspsnqtdklaafpggs(SEQ ID NO.：56)
將各個多核苷酸插入SEQ ID NO.：2中編碼531-位之Ser的密碼子與編碼532-位之Asn的密碼子之間，藉此建構出用於表現類基孔肯雅病毒粒子之質體(下文稱做VLP31_11、VLP32_11或VLP33_11)，其中，經修飾之PD-1-衍生胜肽係插入基孔肯雅病毒結構蛋白質之E2中。
使用PEI(GE Healthcare)或GeneX(ATCC)將293F細胞(Life Technology)以該質體轉染。轉染4日後，收集條件培養液並以3000rpm離心15分鐘，藉此將其與細胞分離。使用0.45μm過濾器過濾上清液，得到類病毒粒子。將該類病毒粒子使用TFF管柱濃縮，並使用QXL管柱(GE Healthcare)純化，得到經純化之類病毒粒子。
包含與基孔肯雅病毒結構蛋白質接合的VLP31、32或33之VLP表現係藉由使用CHIKV(ATCC：VR-1241AF)專一性抗體之西方轉漬法(Western Blot)確認。
實施例2：包含病毒結構蛋白質及PD-1抗原之片段之類委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子的製備
使用與實施例1所用者相同之PD-1的多核苷酸插入VLP_VEEV VLP 518載體(SEQ ID NO.：26)中。N端連接基及C端連接基與實施例1中者相同。
將各個多核苷酸插入SEQ ID NO.：3中編碼518-位之Ser的密碼子與編碼519-位之Ser的密碼子之間，藉此建構出用於表現類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之質體(下文稱做VLP31_21、VLP32_21或VLP33_21)，其中，該經修飾之PD-1-衍生胜肽係插入委內瑞拉馬腦炎結構蛋白質之E2中。
如同實施例1，將293F細胞以該質體轉染。包含與委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋白質接合之VLP31、32或33)之VLP表現係藉由使用VEEV專一性抗體的西方轉漬法來確認。
實施例3：包含病毒結構蛋白質及PD-1抗原或PD-L1抗原片段之類基孔肯雅病毒(CHIKV)粒子及類委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子的製備
使用下列小鼠PD-1及小鼠PD-L1之多核苷酸插入VLP_CHI 532載體(SEQ ID NO.：25)中，或插入VLP_VEEV VLP 518載體(SEQ ID NO.：26)中。N端連接基在胺基酸序列 中為SGG(在核苷酸序列中為TCCGGAGGA)，而C端連接基在胺基酸序列中為GGS(在核苷酸序列中為GGAGGATCC)。
1.VLP299(小鼠PD-L1序列)：附有連接基之小鼠PD-L1域3S(Domain3S)之片段的序列，其係用於抗原：核苷酸序列
Tccggaggatgcatcatcagctacggcggagccgactacggaggatcc(SEQ ID NO.：57)
胺基酸序列
SGG-ciisyggadyC-GGS(SEQ ID NO.：58)
2. VLP274(小鼠PD-1序列)：附有連接基之小鼠PD-1域2短(domain2short)之片段的序列，其係用於抗原： 核苷酸序列
Tccggaggaggcgccatcagcctgcaccccaaggccaagatcgaggaatctggaggatcc(SEQ ID NO.：59)
胺基酸序列
SGG-gaislhpkakiees-GS(SEQ ID NO.：60)
3. VLP275(小鼠PD-1序列)：附有連接基之小鼠PD-1域2短_v2(domain2short_v2)之片段的序列，其係用於抗原：核苷酸序列
Tccggaggatgtggcgccatcagcctgcaccccaaggccaagatcgaggaaggaggatcc(SEQ ID NO.：61)
胺基酸序列
SGG-cgaislhpkakieeC-GGS(SEQ ID NO.：62)
將各個多核苷酸插入SEQ ID NO.：2之編碼531-位之Ser與編碼532-位之Asn的密碼子之間，藉此建構出用於表現類基孔肯雅病毒粒子之質體(下文將插有VLP299之載體稱做VLP299_15、VLP299_25；將插有VLP274之載體稱做VLP274_11、VLP274_15；將插有VLP275之載體稱做VLP275_11、VLP275_15)，其中，該經修飾之PD-1-衍生胜肽或經修飾之PD-L1-衍生胜肽係插入基孔肯雅病毒結構蛋白質之E2中。
如同實施例1，將293F細胞以該質體轉染。包含與基孔肯雅病毒結構蛋白質接合之VLP299、274或275)之VLP表現係藉由使用CHIKV或VEEV專一性抗體的西方轉漬法來確認。
實施例4：PD-1之免疫原性(Immunogenicity)
使用下列人類PD-1之多核苷酸(其亦於小鼠PD-1基因中發現)插入VLP_CHI 532載體(SEQ ID NO.：25)中，或插入VLP_VEEV VLP 518載體(SEQ ID NO.：26)中。N端連接基在胺基酸序列中為SGG(在核苷酸序列中為TCCGGAGGA)，C端連接基在胺基酸序列中為GGS(在核苷酸序列中為GGAGGATCC)。
核苷酸序列
Tccggaggactaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttcggaggatcc(SEQ ID NO.：51)
胺基酸序列
SGGLNWYRMSPSNQTDKLAAFGGS(SEQ ID NO.：52)
將多核苷酸插入SEQ ID NO.：2之編碼531-位之Ser的密碼子與編碼532-位之Asn的密碼子之間，藉此建構出用於表現類基孔肯雅病毒粒子之質體(下文稱做pCHIKV-hPD-1)，其中，該經修飾之PD-1-衍生胜肽係插入基孔肯雅病毒結構蛋白質之E2中。又，將多核苷酸插入SEQ ID NO.：3之編碼518-位之Ser的密碼子與編碼519-位之Ser的密碼子之間，藉此建構出用於表現類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之質體(下文稱做pVEEV-hPD-1)，其中，該經修飾之PD-1-衍生胜肽係插入委內瑞拉馬腦炎結構蛋白質之E2中。
使用PEI(GE Healthcare)或GeneX(ATCC)，將293F細胞(Lifetechnology)以該質體轉染。轉染4天後，收集條件培養液，並以3000rpm離心15分鐘，藉此將與細胞分離。使用0.45μm過濾器過濾上清液，得到類病毒粒子。將該類病毒粒子使用TFF管柱濃縮，並使用QXL管柱(GE Healthcare)純化，得到經純化之類病毒粒子。將該經純化之類病毒粒子進一步使用旋轉管柱(spin column)(截留分子量：100kDa)濃縮，藉此製備用於免疫的類病毒粒子(CHIKV-hPD-1及VEEV-hPD-1)。
將小鼠(4週齡雄鼠)於第0週及第8週時用含有佐劑Ribi之VEEV-hPD-1經由肌內注射進行免疫2次(每隻小鼠20μg VLP)，以及於第4週時用含有佐劑Ribi(Sigma佐劑系統，Sigma-Aldrich)之CHIKV-hPD-1經由肌內注射進行免疫1次(每隻小鼠20μg VLP)。於第一次免疫後10週 採血。
將96孔ELISA盤之每一孔以含有50ng之PD-1重組N-端片段(1-167aa)或PD-1-Fc接合物的100ul PBS緩衝液塗覆。經2小時培育後，將該盤用含有0.05% Tween-20之TBS緩衝液清洗三次，並用含有0.05% Tween-20及5%奶粉之TBS緩衝液封阻。將來自小鼠之熱失活且經稀釋之血清加入該封阻緩衝液中，並於室溫培育1小時。清洗3次後，添加經1：4000稀釋之經過氧化氫酶標記之山羊抗-小鼠IgG，並於室溫培育1小時。清洗3次後，添加過氧化氫酶受質以顯影，培育10分鐘後添加2N H2SO4以停止顯影。使用Gen5(BioTek)及GraphPad Prism6(GraphPad software Inc)分析數據。
免疫原性示於第1及2圖中。如第1及2圖所見，在經CHIKV-PD-1及VEEV-PD-1免疫之小鼠的血清中發現對抗PD-1之抗體。
實施例5：包含具有病毒結構蛋白質及PD-1抗原之片段的類基孔肯雅病毒(CHIKV)粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子之醫藥組成物的製備
依照實施例4，製備包含病毒結構蛋白質及PD-1抗原之片段的類基孔肯雅病毒(CHIKV)粒子、以及包含病毒結構蛋白質及PD-1抗原之片段的類委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子。
為了製備為疫苗組成物的醫藥組成物，將80μg之每一經製備之粒子與1ml之蔗糖磷酸鹽溶液(pH 7.2，無內毒 素，Teknova製，簡稱SP緩衝液)混合。
<110> VLP醫療股份有限公司
<120> 包含PD-1抗原或PD-1配體抗原的類病毒粒子
<130> 569106
<150> US 61/845712
<151> 2013-07-12
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1248
<212> PRT
<213> 基孔肯雅病毒
<400> 1
Figure TWI676636B_D0004
Figure TWI676636B_D0005
Figure TWI676636B_D0006
Figure TWI676636B_D0007
Figure TWI676636B_D0008
Figure TWI676636B_D0009
<210> 2
<211> 1248
<212> PRT
<213> 基孔肯雅病毒
<400> 2
Figure TWI676636B_D0010
Figure TWI676636B_D0011
Figure TWI676636B_D0012
Figure TWI676636B_D0013
Figure TWI676636B_D0014
Figure TWI676636B_D0015
Figure TWI676636B_D0016
<210> 3
<211> 1255
<212> PRT
<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒
<400> 3
Figure TWI676636B_D0017
Figure TWI676636B_D0018
Figure TWI676636B_D0019
Figure TWI676636B_D0020
Figure TWI676636B_D0021
Figure TWI676636B_D0022
Figure TWI676636B_D0023
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 4
Figure TWI676636B_D0024
<210> 5
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 5
Figure TWI676636B_D0025
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 6
Figure TWI676636B_D0026
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 7
Figure TWI676636B_D0027
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 8
Figure TWI676636B_D0028
<210> 9
<211> 19
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 9
Figure TWI676636B_D0029
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 10
Figure TWI676636B_D0030
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 11
Figure TWI676636B_D0031
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-1抗原
<400> 12
Figure TWI676636B_D0032
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 13
Figure TWI676636B_D0033
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 14
Figure TWI676636B_D0034
<210> 15
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 15
Figure TWI676636B_D0035
<210> 16
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 16
Figure TWI676636B_D0036
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 17
Figure TWI676636B_D0037
Figure TWI676636B_D0038
<210> 18
<211> 23
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 18
Figure TWI676636B_D0039
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 19
Figure TWI676636B_D0040
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 20
Figure TWI676636B_D0041
<210> 21
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 21
Figure TWI676636B_D0042
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 22
Figure TWI676636B_D0043
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 23
Figure TWI676636B_D0044
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> PD-L1抗原
<400> 24
Figure TWI676636B_D0045
<210> 25
<211> 8410
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP_CHI 532載體
<400> 25
Figure TWI676636B_D0046
Figure TWI676636B_D0047
Figure TWI676636B_D0048
Figure TWI676636B_D0049
Figure TWI676636B_D0050
Figure TWI676636B_D0051
<210> 26
<211> 8431
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 518載體
<400> 26
Figure TWI676636B_D0052
Figure TWI676636B_D0053
Figure TWI676636B_D0054
Figure TWI676636B_D0055
Figure TWI676636B_D0056
Figure TWI676636B_D0057
<210> 27
<211> 3813
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP31_11(CHI_VLP_532 PD-1-1)核苷酸序列(VLP區)
<400> 27
Figure TWI676636B_D0058
Figure TWI676636B_D0059
Figure TWI676636B_D0060
<210> 28
<211> 3837
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP31_21(VEEV 519載體PD-1-1)核苷酸序列(VLP區)
<400> 28
Figure TWI676636B_D0061
Figure TWI676636B_D0062
Figure TWI676636B_D0063
Figure TWI676636B_D0064
<210> 29
<211> 3798
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP274_11(CHI_VLP_532 PD-1-1)核苷酸序列(VLP區)
<400> 29
Figure TWI676636B_D0065
Figure TWI676636B_D0066
Figure TWI676636B_D0067
<210> 30
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> VLP274_21(VEEV 519載體PD-1-1)核苷酸序列(VLP區)
<400> 30
Figure TWI676636B_D0068
Figure TWI676636B_D0069
Figure TWI676636B_D0070
<210> 31
<211> 3792
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> VLP299_15(CHI_VLP_532 PD-L1-1)核苷酸序列(VLP區)
<400> 31
Figure TWI676636B_D0071
Figure TWI676636B_D0072
Figure TWI676636B_D0073
<210> 32
<211> 3816
<212> DNA
<213> 人造序列
<220>
<223> VLP299_25(VEEV 519載體PD-L1-1)核苷酸序列(VLP區)
<400> 32
Figure TWI676636B_D0074
Figure TWI676636B_D0075
Figure TWI676636B_D0076
<210> 33
<211> 446
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 31_11插入有人類PD-1之E2 CHIKV胺基酸
<400> 33
Figure TWI676636B_D0077
Figure TWI676636B_D0078
Figure TWI676636B_D0079
<210> 34
<211> 440
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 274_11插入有鼠PD-1之E2 CHIKV胺基酸
<400> 34
Figure TWI676636B_D0080
Figure TWI676636B_D0081
Figure TWI676636B_D0082
<210> 35
<211> 443
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 275_11插入有人類PD-1之E2 CHIKV胺基酸
<400> 35
Figure TWI676636B_D0083
Figure TWI676636B_D0084
<210> 36
<211> 439
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 299_15插入有人類PD-L1之E2 CHIKV胺基酸
<400> 36
Figure TWI676636B_D0085
Figure TWI676636B_D0086
<210> 37
<211> 439
<212> PRT
<213> 基孔肯雅病毒
<400> 37
Figure TWI676636B_D0087
Figure TWI676636B_D0088
Figure TWI676636B_D0089
<210> 38
<211> 261
<212> PRT
<213> 基孔肯雅病毒
<400> 38
Figure TWI676636B_D0090
Figure TWI676636B_D0091
<210> 39
<211> 447
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 31_21插有人類PD-1之E2 VEEV胺基酸
<400> 39
Figure TWI676636B_D0092
Figure TWI676636B_D0093
Figure TWI676636B_D0094
<210> 40
<211> 442
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 274_21插有人類PD-1之E2 VEEV胺基酸
<400> 40
Figure TWI676636B_D0095
Figure TWI676636B_D0096
Figure TWI676636B_D0097
<210> 41
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 275_21插有人類PD-1之E2 VEEV胺基酸
<400> 41
Figure TWI676636B_D0098
Figure TWI676636B_D0099
Figure TWI676636B_D0100
<210> 42
<211> 440
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> 299_25插有人類PD-L1之E2 VEEV胺基酸
<400> 42
Figure TWI676636B_D0101
Figure TWI676636B_D0102
Figure TWI676636B_D0103
<210> 43
<211> 442
<212> PRT
<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒
<400> 43
Figure TWI676636B_D0104
Figure TWI676636B_D0105
Figure TWI676636B_D0106
<210> 44
<211> 275
<212> PRT
<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒
<400> 44
Figure TWI676636B_D0107
Figure TWI676636B_D0108
Figure TWI676636B_D0109
<210> 45
<211> 8467
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP31.11載體
<400> 45
Figure TWI676636B_D0110
Figure TWI676636B_D0111
Figure TWI676636B_D0112
Figure TWI676636B_D0113
Figure TWI676636B_D0114
Figure TWI676636B_D0115
<210> 46
<211> 8452
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP274.11載體
<400> 46
Figure TWI676636B_D0116
Figure TWI676636B_D0117
Figure TWI676636B_D0118
Figure TWI676636B_D0119
Figure TWI676636B_D0120
Figure TWI676636B_D0121
<210> 47
<211> 7290
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP299.15載體
<400> 47
Figure TWI676636B_D0122
Figure TWI676636B_D0123
Figure TWI676636B_D0124
Figure TWI676636B_D0125
Figure TWI676636B_D0126
<210> 48
<211> 8491
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP31.21載體
<400> 48
Figure TWI676636B_D0127
Figure TWI676636B_D0128
Figure TWI676636B_D0129
Figure TWI676636B_D0130
Figure TWI676636B_D0131
Figure TWI676636B_D0132
<210> 49
<211> 8476
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP274.21載體
<400> 49
Figure TWI676636B_D0133
Figure TWI676636B_D0134
Figure TWI676636B_D0135
Figure TWI676636B_D0136
Figure TWI676636B_D0137
Figure TWI676636B_D0138
<210> 50
<211> 7290
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP299.25載體
<400> 50
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Figure TWI676636B_D0141
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<210> 51
<211> 72
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP31插子
<400> 51
Figure TWI676636B_D0145
<210> 52
<211> 24
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> VLP31插子
<400> 52
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<210> 53
<211> 78
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP32插子
<400> 53
Figure TWI676636B_D0147
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> VLP32插子
<400> 54
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<210> 55
<211> 78
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP33插子
<400> 55
Figure TWI676636B_D0149
<210> 56
<211> 26
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> VLP33插子
<400> 56
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<210> 57
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP299插子
<400> 57
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<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> VLP299插子
<400> 58
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<210> 59
<211> 60
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP274插子
<400> 59
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<210> 60
<211> 19
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> VLP274插子
<400> 60
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<210> 61
<211> 60
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> VLP275插子
<400> 61
Figure TWI676636B_D0155
<210> 62
<211> 21
<212> PRT
<213> 人造的
<220>
<223> VLP275插子
<400> 62
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<210> 63
<211> 3747
<212> DNA
<213> 基孔肯雅病毒
<400> 63
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<210> 64
<211> 3765
<212> DNA
<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒
<400> 64
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Claims (12)

  1. 一種類病毒粒子，其包含：240個病毒結構蛋白質，該病毒結構蛋白質各包含基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)或委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)的外膜蛋白E1及E2；以及選自由衍生自PD-1之抗原及衍生自PD-1之配體之抗原所組成之群組的抗原，其中，該衍生自PD-1之抗原係具有10至300個胺基酸殘基之PD-1的片段，以及該衍生自PD-1之配體之抗原係具有10至300個胺基酸殘基之PD-L1或PD-L2之片段。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，其中，該衍生自PD-1之抗原係選自SEQ ID NOs.4至12之胺基酸片段，以及該衍生自PD-1之配體之抗原係選自SEQ ID NOs.13至24之PD-L1的胺基酸片段。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，該類病毒粒子係由240個病毒結構蛋白質所組成的類基孔肯雅病毒粒子，該病毒結構蛋白質各包含經衍生自PD-1或PD-L1之抗原插入的外膜蛋白E2、外膜蛋白E1及殼體；其中，該經衍生自PD-1或PD-L1之抗原插入的外膜蛋白E2係由SEQ ID NOs.33至36所示之胺基酸序列所組成；該外膜蛋白E1係由SEQ ID NO.37所示之胺基酸序列所組成；以及該殼體係由SEQ ID NO.38所示之胺基酸序列所組成。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子，其中，該類病毒粒子係由240個病毒結構蛋白質所組成的類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子，該病毒結構蛋白質各包含經衍生自PD-1或PD-L1之抗原插入的外膜蛋白E2、外膜蛋白E1及殼體；其中，該經衍生自PD-1或PD-L1之抗原插入的外膜蛋白E2係由SEQ ID NOs.39至42所示之胺基酸序列所組成；該外膜蛋白E1係由SEQ ID NO.43所示之胺基酸序列所組成；以及該殼體係由SEQ ID NO.44所示之胺基酸序列所組成。
  5. 一種由胺基酸序列所組成之類病毒粒子，其中，該胺基酸序列與如申請專利範圍第3項所述之類病毒粒子之胺基酸序列具有90%或以上之序列一致性。
  6. 一種由胺基酸序列所組成之類病毒粒子，其中，該胺基酸序列與如申請專利範圍第4項所述之類病毒粒子之胺基酸序列具有90%或以上之序列一致性。
  7. 一種單離之核酸分子，其包含用以表現如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之類病毒粒子的核苷酸序列。
  8. 一種載體，其包含如申請專利範圍第7項所述之核酸分子，其中，該載體視需要包含可操作地連接至該核酸分子的表現控制序列。
  9. 一種醫藥組成物，其包含：(a)如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之類病毒粒子、如申請專利範圍第7項所述之核酸分子或如申請專利範圍第8項所述之載體；以及(b)醫藥上可接受之載劑。
  10. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之類病毒粒子之用途，係用於製造治療或預防癌症或感染性疾病之醫藥組成物；用於製造在哺乳動物中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體之醫藥組成物；用於製造調節免疫反應之醫藥組成物；用於製造用於免疫刺激之醫藥組成物；用於製造抑制PD-1與PD-1之配體之間的交互作用之醫藥組成物；或用於製造抑制PD-1活性之醫藥組成物。
  11. 一種如申請專利範圍第7項所述之核酸分子之用途，係用於製造治療或預防癌症或感染性疾病之醫藥組成物；用於製造在哺乳動物中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體之醫藥組成物；用於製造調節免疫反應之醫藥組成物；用於製造用於免疫刺激之醫藥組成物；用於製造抑制PD-1與PD-1之配體之間的交互作用之醫藥組成物；或用於製造抑制PD-1活性之醫藥組成物。
  12. 一種如申請專利範圍第8項所述之載體之用途，係用於製造治療或預防癌症或感染性疾病之醫藥組成物；用於製造在哺乳動物中產生對抗PD-1或PD-1之配體的抗體之醫藥組成物；用於製造調節免疫反應之醫藥組成物；用於製造用於免疫刺激之醫藥組成物；用於製造抑制PD-1與PD-1之配體之間的交互作用之醫藥組成物；或用於製造抑制PD-1活性之醫藥組成物。
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