JP4790984B2 - アルファウイルスレプリコンベクター系 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は2001年9月6日出願の米国仮特許出願第60/317722号からの優先権を主張するものであり、その全てを参照により本明細書に組み込む。

［発明の分野］
本発明は、感染性疾患および癌のための免疫治療、ならびに治療目的のための遺伝子の送達に有用である組換えアルファウイルス粒子の作製のための改善された構築物および方法に関する。

アルファウイルスは現在感染性疾患のためのワクチンを開発するベクター基盤として用いられている（例えば米国特許第5,792,462号;第6,156,558号;第5,811,407号;第5,789,245号;第6,015,694号;第5,739,026号;Pushkoら、Virology 239(2):389-401(1997);Frolovら、J.Virol.71(1):248-258(1997);SmerdouおよびLiljestrom、J.Virol.73(2):1092-1098(1999)参照）。アルファウイルスはトガウイルスの属を含み、そして属のメンバーは世界中至る所で、脊椎および無脊椎の双方の宿主において見出される。ベクター基盤に関して最も研究されているアルファウイルスは属のプロトタイプのメンバーであるベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ:Venezuelan Equine Encephalitis）ウイルス、セミリキ森林ウイルス（ＳＦＶ:Semiliki Forest Virus）、およびシンドビスウイルス(Sindbis Virus)である。ワクチン適用において免疫原性および有効性を高めるために種々の構築物が開発されている。またこれらの構築物の多くは組換えにより複製コンピテントイルスの形成の可能性を低減するように設計されている。Johnstonら（米国特許第5,79,2462号および第6,156,558号、前記で引用）は単一のヘルパー系からの組換えの可能性（ここで、アルファウイルスの構造タンパク質の完全なセットは１つのＲＮＡ分子にあり、非構造タンパク質および目的の遺伝子は別の分子にある）を認識しており、従って構造タンパク質をコードするための２つのヘルパーＲＮＡを利用する「二重ヘルパー」系を設計した。Dubenskyら（米国特許第5,789,245号）およびPoloら（米国特許第6,242,259号）はアルファウイルスレプリコンまたはその他のアルファウイルスベクターをパッケージングするための２つのＤＮＡアルファウイルス構造タンパク質発現カセットの使用について記載している。Liljestromおよび共同研究者は「単一のヘルパー系」が組換えにより野生型ウイルス粒子を生じることを確認するデータを提示している(Berglandら、Biotechnology 11(8):916-920(1993))。

前記した技術におけるように、その２つがヘルパー系を含む３つの核酸間でウイルス遺伝子を分配することにより、複製コンピテントイルスを創る組換えの理論的頻度は単一ヘルパー系に相対して有意に低減する。これらの既存の系はアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識シグナルの使用を含み、そのためにヘルパー系は増幅およびヘルパー機能の効率的な発現のためにアルファウイルス複製機構の存在を利用することができる。しかしながら、ヘルパーＲＮＡでの末端認識シグナルの存在はまた、ヘルパー構築物がＲＮＡ組換えによりレプリコンＲＮＡの末端に組み込まれている組換え体が依然複製可能であることをも意味する。ｎｓＰ１のキャプシド結合領域が、アルファウイルスＲＮＡがウイルスまたはウイルス様粒子にパケージングするのに必要であり、そのためにこの領域を除去することでパッケージングが低減される(Levisら、Cell 44:137(1986)およびWeissら、J.Virol.63:530(1989)参照)ということが認識されている(例えばLiljestromら、米国特許第6,190,666号、コラム17、45-48行)。

従って、既存のレプリコン系では、公知のパッケージングシグナルが典型的にはレプリコンＲＮＡに含まれ、ヘルパー構築物から排除される。しかしながら、ヘルパーＲＮＡはそれにもかかわらず、低頻度でパッケージングされるかまたは同時パッケージングされ(LuおよびSilver、J.Virol.Methods 91(1):59-65(2001))、そして末端認識シグナルを伴うヘルパー構築物は増幅され、そしてレプリコンの存在下で発現され、そしてさらなる組換え事象を生じる可能性がある。

Johnstonらに記載されるベクターレプリコン粒子、またはDubenskyらに記載される組換えアルファウイルス粒子の現行の好ましい投与量は、およそ１０⁶から１０⁸粒子である。チンパンジーの投与の場合、Ｄｕｂｅｎｓｋｙらは、シンドビス−ＨＢＶワクチンを伴って、各々が１０⁷−１０⁸粒子を含有する４回の注射の必要性を推定した。このような投与量は大規模製造手順を必要とし、このような規模で生成される量は、これらの既存の系で複製コンピテントイルスの予測される発生頻度よりも大きいことがある。

従って、複製コンピテントイルスの予測される形成頻度をさらに低減し、製造計画および経費を最適化するアルファウイルスレプリコン粒子を製造するための系をさらに改善する必要性が依然として在る。

本発明は、アルファウイルス許容細胞(alphavirus-permissive cell)において感染性の複製欠損(replication-defective)アルファウイルスレプリコン粒子を生成するための改善されたアルファウイルスレプリコンベクター系を提供する。本発明は、ウイルス構造タンパク質を発現するための改善されたレプリコンＲＮＡおよび改善されたヘルパー核酸を包含する。組換えアルファウイルス粒子の生成中に組換え単独により、またはヘルパーパッケージングおよび組換えの組み合わせにより、複製コンピテントイルス粒子の作製が起こり得る。従って、これらの事象の１つまたは双方の発生を排除または最小にする構築物が提供される。加えて、またこれらの構築物を製造複雑性およびこのような構築物で作製された粒子のコストを最小にするように設計する。本発明はまた特許請求する構築物を使用して組換えアルファウイルス粒子を作製する方法、およびこれらの組換えアルファウイルス粒子を含む医薬用組成物をも提供する。

第一の態様では、分解ＤＮＡヘルパー(resolving DNA helper)、すなわち（ｉ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第一の核酸配列と、（ii）リボザイムをコードする第二の核酸配列と、（iii）ＩＲＥＳをコードする第三の核酸配列と、（iv）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第四の核酸配列と（ここで、第四の核酸配列によりコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質は、第一の核酸配列によりコードされない）を順番に含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子が提供される。

本発明の分解ＤＮＡヘルパーの別の実施形態では、（ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第一の核酸配列と、（ii）（ａ）タンパク質コードＲＮＡ配列の転写を促進するＲＮＡ配列または（ｂ）ＩＲＥＳのいずれかをコードする第二の核酸配列と、（iii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第三の核酸配列と、（iv）３’アルファウイルス複製認識配列をコードする第四の核酸配列と、（ｖ）リボザイムをコードする第五の核酸配列と、（vi）ＩＲＥＳをコードする第六の核酸配列と、（vii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第七の核酸配列と（ここで、第七の核酸配列によりコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質は、第三の核酸配列によりコードされない）を順番に含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子が提供される。

分解ＤＮＡヘルパーのさらに別の実施形態では、本発明は（ｉ）ＩＲＥＳをコードする第一の核酸配列と、（ii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第二の核酸配列と、（iii）リボザイムをコードする第三の核酸配列と、（iv）ＩＲＥＳをコードする第四の核酸配列と、（ｖ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第五の核酸配列と（ここで、第五の核酸配列によりコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質は、第二の核酸配列によりコードされない）を順番に含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子を提供する。

本発明の第二の態様では、感染性の複製欠損粒子が生成するように、本発明で特許請求する（一つまたは複数の）分解ＤＮＡヘルパーと、少なくとも１つの異種性ＲＮＡ(heterologous RNA)をコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡとを、アルファウイルス許容細胞の集団に導入するステップを含む感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を生成するための方法が提供される。

第三の態様では、本発明は分解ＲＮＡヘルパー、すなわち（ｉ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、（ii）ＩＲＥＳと、（iii）自己プロテアーゼ(autoprotease)の活性部位を除去するように修飾されているアルファウイルスキャプシドタンパク質をコードする核酸配列と、（iv）非自己触媒性プロテアーゼ(non-autocatalytic protease)認識部位と、（ｖ）少なくとも１つのアルファウイルス糖タンパク質をコードする核酸配列とを含むアルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子を提供する。

本発明の分解ＲＮＡヘルパーの別の実施形態では、（ｉ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、（ii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（iii）非自己触媒性プロテアーゼ認識部位と、（iv）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と（ここで、（ii）および（iv）の核酸配列は同一ではない）を含むインビボで分解ＲＮＡヘルパーを発現するための組換えＤＮＡ分子が提供される。この態様の好ましい実施形態では、プロモーターはヘルパー細胞で作動可能であるＲＮＡポリメラーゼIIプロモーターである。

本発明の分解ＲＮＡヘルパーのさらに別の実施形態では、（ｉ）アルファウイルス５’複製認識配列をコードする第一の核酸配列と、（ii）転写プロモーターと、（iii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（iv）非自己触媒性プロテアーゼ認識部位と、（ｖ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（vi）アルファウイルス３’複製認識配列と（ここで、（iii）および（ｖ）の核酸配列は同一ではない）含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、インビトロでＲＮＡヘルパーを発現するための組換えＤＮＡ分子が提供される。

第四の態様では、感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子が細胞で生成されるように、（ｉ）１つまたはそれ以上の本発明の分解ＲＮＡヘルパーと、（ii）非自己触媒性プロテアーゼ認識部位を認識するプロテアーゼと、（iii）少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡとを、細胞の集団に導入するステップを含む感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を生成するための方法が提供される。この態様の特定の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを認識するＲＮＡポリメラーゼもまたヘルパー細胞中で組換えＤＮＡ分子と共に利用可能になり、ＤＮＡ分子がインビボで転写されてアルファウイルスレプリコン粒子のパッケージングに十分なアルファウイルス構造タンパク質を生成するようになる。

本発明の第五の態様では、（ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第一の核酸配列と、（ii）アルファウイルス非構造タンパク質、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２およびｎｓｐ３をコードする第二の核酸と、（iii）（ａ）転写プロモーターまたは（ｂ）ＩＲＥＳのいずれかと、（iv）少なくとも１つの目的の異種性遺伝子(heterologous gene)をコードする核酸と、（ｖ）ＩＲＥＳと、（vi）アルファウイルス非構造タンパク質、ｎｓｐ４をコードする第三の核酸と、（vii）３’アルファウイルス複製認識配列をコードする第四の核酸とを順番に含む再構成されたアルファウイルスＲＮＡレプリコンベクターが提供される。この態様の別の実施形態では、再構成されたアルファウイルスレプリコンＲＮＡのｃＤＮＡに作動可能なように連結された５’プロモーターを含むベクター構築物が提供される。

第六の態様では、感染性の欠損アルファウイルス粒子の集団を含む組成物であって、各粒子は本発明の再構成されたアルファウイルスレプリコンＲＮＡを含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡを含有し、集団は細胞培養における継代による測定により検出可能な複製コンピテントイルスを有さない組成物が提供される。

第七の態様では、非複製ＤＮＡヘルパー、すなわち完全なアルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列をコードするＤＮＡ配列（ただし、ＤＮＡ配列は、アルファウイルス５’および３’複製認識配列ならびにアルファウイルス・サブゲノムプロモーター(subgenomic promoter)をコードしない）に作動可能なように連結されたＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含むアルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子が提供される。

第八の態様では、キメラアルファウイルスＲＮＡヘルパー、すなわち５’アルファウイルス複製認識配列と、プロモーターと、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、３’アルファウイルス複製認識配列とを順番に含む組換えＲＮＡ分子であって、プロモーターは少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列に作動可能なように連結されおり、転写開始配列およびＲＮＡポリメラーゼ認識配列はベネズエラウマ脳炎ウイルスの非構造ウイルスタンパク質により認識され、転写開始配列およびＲＮＡポリメラーゼ認識配列は構造タンパク質をコードするアルファウイルス以外のウイルスに由来する組換えＲＮＡ分子が提供される。

第九の態様では、アルファウイルス以外のウイルスに基づき、２つのＲＮＡ分子を含むアルファウイルス構造タンパク質発現系であって、（ａ）第一のＲＮＡは、ウイルスレプリカーゼタンパク質のための配列をコードし、（ｂ）第二の組換えＲＮＡは、（ｉ）（ａ）のウイルスレプリカーゼタンパク質を含む複製複合体のための５’複製認識配列と、（ii）１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質と、（iii）（ａ）のウイルスレプリカーゼタンパク質を含む複製複合体とのための３’複製認識配列のための配列をコードし、第一のＲＮＡおよび第二のＲＮＡがヘルパー細胞に導入された場合、第一のＲＮＡは第二のＲＮＡを複製し、次いで第二のＲＮＡは翻訳されて１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質を生成するアルファウイルス構造タンパク質発現系が提供される。この態様の好ましい実施形態では、組換えＲＮＡおよびウイルスレプリカーゼタンパク質は、ノダウイルスに由来する。

本発明の第十の態様では、ヘルパーがアルファウイルス構造タンパク質の全てを発現するように、非複製ＤＮＡヘルパー、キメラアルファウイルスヘルパー、および非アルファウイルスに基づくヘルパー系(non-alphavirus based helper system)からなる群から選択される１つまたはそれ以上のヘルパー核酸と、少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡとをアルファウイルス許容細胞の集団に導入するステップと、前記アルファウイルスレプリコン粒子を細胞で生成するステップと、前記アルファウイルスレプリコン粒子を細胞から収集するステップとを含む、感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を生成するための方法が提供される。

本発明の第十一の態様では、本明細書の前記で開示されたヘルパーのいずれかの組み合わせを利用して、アルファウイルス許容細胞中に、（ｉ）分解ＤＮＡヘルパー、分解ＲＮＡヘルパー、非複製ＤＮＡヘルパー、キメラアルファウイルスヘルパーおよび非アルファウイルスヘルパー系からなる群から選択される１つまたはそれ以上の組換え核酸分子と、（ii）少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡと（ここで、１つまたはそれ以上の組換え核酸ヘルパーが、総合して、アルファウイルスレプリコン粒子に共に組み立てられる全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードする）を含む感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を発現するためのヘルパー細胞が提供される。

［定義］
本明細書で用いる「アルファウイルス」なる用語は当分野で慣用される意味を有し、種々の種、例えばＶＥＥ、ＳＦＶ、シンドビス、ロスリバーウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニア、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６、エバーグレーズ(Everglades)ウイルス、ムカンボ、バルマ森林ウイルス、ミドレブルクウイルス、ピクスナウイルス、オニョンニョンウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、バンバンキ(Banbanki)ウイルス、Kyzylagachウイルス、ハイランズ(Highlands)Ｊウイルス、フォートモルガン(Fort Morgan)ウイルス、Ndumuウイルス、およびバギークリーク(Buggy Creek)ウイルスなどがある。本発明で特許請求する構築物および方法に用いられる好ましいアルファウイルスはＶＥＥ、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６、シンドビス、（例えばＴＲ３３９、米国特許第6008035号参照）、およびＳＦＶである。

「５’アルファウイルス複製認識配列」および「３’アルファウイルス複製認識配列」なる用語は、非構造アルファウイルスレプリカーゼタンパク質により認識され、ウイルスＲＮＡの複製を導く、アルファウイルスに見出される配列、またはそれに由来する配列を意味する。これらはしばしば５’および３’末端、またはアルファウイルス５’および３’配列と称される。本発明の構築物では、これらの５’および３’末端の使用により、結果的に２つの末端の間でコードされるＲＮＡ配列が複製される。これらの配列を標準的な分子生物学的技術により修飾して、これらが依然アルファウイルス複製機構により認識されるという条件で、組換えまたはクローニング部位を導入するための潜在能力を最小にすることができる。

「最小５’アルファウイルス複製認識配列」なる用語はアルファウイルスの非構造タンパク質による認識は可能であるが、配列を含有するＲＮＡ分子の有意なパッケージング／組換えには至らない最小配列を意味する。好ましい実施形態では、５’アルファウイルス複製認識配列は、観察された、その配列を含有するＲＮＡのパッケージング／組換えの頻度は結果的に５０から１００倍の低下に至る。ヘルパーのパッケージング／組換えをいくつかの方法、例えばLuおよびSilver(J.Virol.Methods 91(1):59-65(2001))に記載される方法により評価することができる。

「アルファウイルスＲＮＡレプリコン」、「アルファウイルスレプリコンＲＮＡ」および「アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン」は互換的に用いられ、それ独自の複製（増幅）を志向することができ、最低で、５’および３’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列、およびポリアデニル化経路を含むように非構造タンパク質遺伝子を発現するＲＮＡ分子を意味する。これはまたプロモーターまたはＩＲＥＳを含有することができる。またこれを、アルファウイルス構造タンパク質を発現するように操作することもできる。JohnstonらおよびPoloら（背景で引用）はこのようなアルファウイルスＲＮＡレプリコンのための多くの構築物について記載しており、このような構築物は参照により本明細書に組み込む。特許請求する本発明で利用するアルファウイルスＲＮＡレプリコンの具体的な実施形態は、１つまたはそれ以上の弱毒変異(attenuating mutation)を含有でき、弱毒変異は１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、付加、または置換であるか、または適当な野生型アルファウイルスに比較して変異を含有する生存ウイルスにおいて、毒性の喪失に至る再構成またはキメラ構築物を含む変異である。弱毒ヌクレオチド置換（レプリコンにおけるアミノ酸変化に至る）の実例にはアルファウイルスＳ．Ａ．ＡＲ８６のｎｓＰ１アミノ酸位置５３８、ｎｓＰ２アミノ酸位置９６、またはｎｓＰ２アミノ酸位置３７２での変異などがある。

「アルファウイルス構造タンパク質／（複数の）タンパク質」なる用語はアルファウイルスによりコードされる構造タンパク質の１つまたは組み合わせを意味する。これはポリタンパク質としてウイルスにより生成され、そして概して文献にはＣ−Ｅ３−Ｅ２−６ｋ−Ｅ１として表されている。Ｅ３および６ｋは２つの糖タンパク質、Ｅ２およびＥ１の膜転位／輸送シグナルとして提供される。従って、本明細書におけるＥ１なる用語の使用はＥ１、Ｅ３−Ｅ１、６ｋ−Ｅ１またはＥ３−６ｋ−Ｅ１を意味し、そしてＥ２なる用語の使用はＥ２、Ｅ３−Ｅ２、６ｋ−Ｅ２またはＥ３−６ｋ−Ｅ２を意味する。

「（複数の）ヘルパー」なる用語は１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現できる核酸分子を意味する。

「ヘルパー細胞」および「パッケージング細胞」なる用語は、本明細書では互換的に用いられ、そしてアルファウイルスレプリコン粒子が生成される細胞を意味する。ヘルパー細胞は１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするヘルパーのセットを含む。本明細書に開示するように、ヘルパーはＲＮＡまたはＤＮＡでよい。細胞はアルファウイルス許容性であるいずれかの細胞、すなわちウイルスＲＮＡ転写物の導入時にアルファウイルス粒子を生成することができる細胞でよい。アルファウイルス許容細胞には、特に限定されるものではないが、ベロ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、２９３、２９３Ｔ、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などがある。特許請求する本発明の特定の実施形態では、ヘルパーまたはパッケージング細胞はさらに異種性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび／または配列特異的プロテアーゼを含めることができる。

「アルファウイルスレプリコン粒子」、「ウイルスレプリコン粒子」または「組換えアルファウイルス粒子」なる用語は本明細書では互換的に用いられ、１つまたはそれ以上の異種性ＲＮＡ配列を発現するアルファウイルスレプリコンＲＮＡを組み込むビリオン様構造複合体を意味する。典型的には、ビリオン様構造複合体には、脂質エンベロープに包埋された１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質などがあり、前記脂質エンベロープは、今度はＲＮＡを封入するヌクレオキャプシドを封入する。脂質エンベロープは典型的には粒子が生成される細胞の細胞質膜に由来する。好ましくは、アルファウイルスレプリコンＲＮＡはアルファウイルスキャプシドタンパク質を含んだヌクレオキャプシド構造により取り囲まれており、そしてアルファウイルス糖タンパク質は細胞由来の脂質エンベロープに包埋されている。アルファウイルスレプリコン粒子は感染性であるが、複製欠損である、すなわちレプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする（複数の）ヘルパー核酸の不在下で宿主細胞において複製できない。

本明細書の以下で詳細に記載するように、本発明は複製コンピテントイルス形成に関する潜在能力が低減しており、そしてワクチンまたはそれを含む治療薬の商業用規模の製造に適している、および／または有利である、改善されたアルファウイルスに基づくレプリコン系を提供する。本発明は改善されたアルファウイルスＲＮＡレプリコンおよびアルファウイルス構造タンパク質を発現するための改善されたヘルパーを提供する。

本発明の１つの実施形態では、一連の「ヘルパー構築物」すなわちアルファウイルス構造タンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子であって、インビボで自身を２つの別個の分子に分解する単一のヘルパーが構築されるものが開示される。従って、製造の容易さおよび生成の効率に関して単一のヘルパーの使用の有利性が保持されるが、二連性発現系を用いることなく二連性ヘルパー系の有利性が捕らえられる。これらの実施形態の１つのセットではＤＮＡヘルパー構築物を用いるが、第二のセットではＲＮＡヘルパーベクターを用いる。複製および転写のためのアルファウイルス認識シグナルを用いないＤＮＡヘルパー構築物の場合、組換えの理論上の頻度はこのようなシグナルを用いる二連性ＲＮＡヘルパー系よりも低い。

本発明の構築物の好ましい実施形態では、ＤＮＡからのＲＮＡの転写を志向するプロモーター、すなわちＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いる。ＲＮＡヘルパーの実施形態では、プロモーターを利用してインビトロ転写反応においてＲＮＡを合成し、そしてこの使用に適した特異的プロモーターには、ＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどがある。ＤＮＡヘルパーの実施形態では、プロモーターは細胞内でＲＮＡの転写を志向するように機能する。構築物のインビボ転写に関して潜在能力のあるプロモーターには、真核細胞プロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼIIIプロモーター、またはウイルスプロモーター、例えばＭＭＴＶおよびＭｏＳＶ ＬＴＲ、ＳＶ４０初期領域、ＲＳＶまたはＣＭＶなどがある。本発明のための多くのその他の適当な哺乳動物およびウイルスプロモーターが当分野で利用可能である。また別に、細菌またはバクテリオファージ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３をインビボでの使用のために用いることができ、別個のプラスミド、ＲＮＡベクター、またはウイルスベクターのいずれかを介して、適合するＲＮＡポリメラーゼが細胞に提供される。具体的な実施形態では、誘導可能なプロモーターの調節下で適合するＲＮＡポリメラーゼを安定してヘルパー細胞株に形質転換することができる。細胞内で機能する構築物は細胞にトランスフェクトされた自律性プラスミドとして機能することができるか、またはゲノムに安定して形質転換されることができる。安定して形質転換された細胞株では、プロモーターは誘導可能なプロモーターでよく、それにより細胞は適当な刺激（インデューサー）に暴露された場合に、安定して形質転換された構築物によりコードされるＲＮＡポリメラーゼのみを生成する。インデューサーへの暴露と同時に、その前に、またはその後にヘルパー構築物を安定して形質転換された細胞に導入し、それによりアルファウイルス構造タンパク質が発現される。また別に、細胞内で機能するように設計された構築物を哺乳動物pol IIプロモーターを伴ってウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、およびバキュロウイルスを介して細胞に導入することができる。

一度本発明のヘルパーまたはＲＮＡレプリコンベクターをコードするＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）がヘルパー細胞内に存在すると（前記したようにインビトロまたはインビボのいずれかの研究法により）、それは翻訳されてコードされたポリペプチドまたはタンパク質を生成する。ｍＲＮＡからの翻訳の開始はリボソームサブユニットのｍＲＮＡへの補充を可能にする厳しく制御された一連の事象に関与する。２つの区別される機構が真核細胞において展開して翻訳を開始する。そのうちの１つでは、「キャップ」として公知のｍＲＮＡの５’末端で存在するメチル−７−Ｇ（５’）ｐｐｐＮ構造が、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ４Ａから構成される開始因子ｅＩＦ４Ｆにより認識される。加えて、開始前複合体形成には、とりわけ、イニシエーターｔＲＮＡ−Ｍｅｔ_iへの結合に寄与する開始因子ｅＩＦ２、および４０Ｓリボソームサブユニットと相互作用するｅＩＦ３の協奏的作用を必要とする(HersheyおよびMerrick、Translational Control of Gene Expression、33-38頁(2000)、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに概説されている)。

また別の機構では、翻訳開始は転写時に内部的に起こり、そして、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ:internal ribosome entry site）として公知のシス作用性エレメントにより媒介され、これはトランス作用性因子の助けをかりて翻訳機構のｍＲＮＡの内部開始コドンに補充される(Jackson、Translational Control of Gene Expression、127-184頁(2000)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに概説されている)。多くのウイルス感染の間、および別の細胞ストレス条件で、三元複合体ｅＩＦ２−ＧＴＰ−ｔＲＮＡ−Ｍｅｔ_iのレベルを低下させるｅＩＦ２のリン酸化部位の変化によりタンパク質合成の全体的な阻止に至る。逆に、キャップ依存性開始の特異的シャットオフはｅＩＦ４Ｆ機能性の修飾に依存する(ThompsonおよびSarnow、Current Opinion in Microbiology 3:366-370(2000))。

ＩＲＥＳエレメントはキャップ依存性翻訳阻止を迂回する；従って、ＩＲＥＳにより志向される翻訳を「キャップ非依存的」と称される。故に、ＩＲＥＳ誘導の翻訳開始は多くのウイルス感染、例えばピコナウイルス感染の間に広まっている(MacejakおよびSarnow、Nature 353:90-94(1991))。これらの環境下ではキャップ依存的な開始は少量の機能的ｅＩＦ４Ｆの存在に因って阻止されるか、またはひどく危うくなる。これはｅＩＦ４Ｇの切断または可溶性の喪失(Gradiら、Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 95:11089-11094(1998));４Ｅ−ＢＰ脱リン酸化(Gingrasら、Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 93:5578-5583(1996))またはポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）切断(Joachimsら、Journal of Virology 73:718-727(1999))により引き起こされる。

ＩＲＥＳ配列は脊椎動物および無脊椎動物細胞に感染するウイルス由来の多くの転写物、ならびに脊椎動物および無脊椎動物遺伝子由来の転写物に見出されている。本発明での使用に適したＩＲＥＳエレメントの実例には、ピコナウイルス、例えばポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の、フラビウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来の、ペスチウイルス、例えば古典的ブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）由来の、レトロウイルス、例えばネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来の、レンチウイルス、例えばサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来のウイルス性ＩＲＥＳエレメント、または細胞性ｍＲＮＡ ＩＲＥＳ、例えば翻訳開始因子、例えばｅＩＦ４ＧまたはＤＡＰ５由来の、転写因子、例えばｃ−Ｍｙｓ(YangおよびSarnow、Nucleic Asids Research 25:2800-2807(1997))またはＮＦ−κＢ抑制因子（ＮＲＦ）由来の、成長因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ Ｂ）由来の、ホメオティック遺伝子、例えばアンテナペディア由来の、生存タンパク質、例えばアポトーシスのＸ連結インヒビター（ＸＩＡＰ）もしくはＡｐａｆ−１、またはシャペロン、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質ＢｉＰ由来のものなどがある(Martinez-Salasら、Journal of General Virology 82:973-984(2001))。

これらの実施形態で利用できる好ましいＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎（ＥＭＣＶ、アクセッション番号NC001479）、コオロギ麻痺病ウイルス（アクセッション番号AF218039）、ショウジョウバエＣウイルス（アクセッション番号AF014388）、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス（アクセッション番号AB006531）、ムギクビレアブラムシウイルス（アクセッション番号AF022937）、ヒメトビＰウイルス（アクセッション番号AB017037）、ミツバチ急性麻痺病ウイルス（アクセッション番号AF150629）、ブラック・クイーン細胞(Black queen cell)ウイルス（アクセッション番号AF183905）、サシガメウイルス（アクセッション番号AF178440）、エンドウヒゲナガアブラムシウイルス（アクセッション番号AF024514）、感染性軟化病ウイルス（アクセッション番号AB000906）、およびサックブルードウイルス（アクセッション番号AF092924）に由来する。前記で列挙した天然発生ＩＲＥＳエレメントに加えて、天然発生ＩＲＥＳ配列の機能を擬似するように設計された合成ＩＲＥＳ配列を用いることもできる。ＩＲＥＳをプロモーター誘導構築物の翻訳に用いる実施形態では、ＩＲＥＳは昆虫ＩＲＥＳまたは別の組換えアルファウイルス粒子のパッケージングのために選択された細胞株で発現されるが、標的宿主では発現されないか、または弱くしか発現されない非哺乳動物のＩＲＥＳでよい。２つのＩＲＥＳエレメントを含むこれらの実施形態では、２つのエレメントは同一または異なっていてよい。

［再構成されたアルファウイルスＲＮＡレプリコンベクター］
目的の異種性遺伝子を発現するためにアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを用いる今日までに記載された全ての系では、アルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓｐ:nonstructural protein）をコードするアルファウイルスゲノムの部分が無傷で維持される、すなわちレプリコンベクターではアルファウイルスで現れるのとちょうど同じ様に現れる。本明細書で開示するのは、ｎｓｐ４をコードする配列がｎｓｐ１−３をコードする配列と分離されており、そして別個の翻訳調節エレメント、例えばＩＲＥＳの調節下に置かれている、再構成されたアルファウイルスＲＮＡレプリコンベクターである。これは別個の調節下にあり、別の非構造コード配列に置換されているが、レプリコンがヘルパー細胞に導入された場合に非構造タンパク質が生成されるように、ｎｓｐ４をコードする配列は、入ってきたウイルスのプラス鎖から転写される。目的の異種性遺伝子の発現を志向するカセットは２つの非構造遺伝子配列（これは、総合して、アルファウイルス非構造タンパク質の全てをコードする。）の間に置かれている。

既存の三連性アルファウイルスレプリコン系（２つのヘルパー分子およびベクターレプリコン）では、（複数の）ヘルパーとレプリコンとの間の組換えが複製コンピテントイルスを作製するのに必要である。これらの系では、ウイルスポリメラーゼ複合体はヘルパー分子とレプリコン分子との間を移動し（「鎖スイッチ」）、３つ全ての分子から配列を複製する。これらの系では、異種性ＲＮＡの発現を志向するレプリコン３’から２６Ｓプロモーターまでのどこかで鎖スイッチが起こり得て、そして依然非構造ポリタンパク質コード領域「ｎｓｐ１−４」の全てを複製できる。本明細書で特許請求する再構成されたレプリコンでは、異種性遺伝子領域へのいずれかの組換えの結果、組換え体の下流のｎｓｐ４遺伝子の喪失に至るので、複製コンピテントイルスの理論的発生頻度はさらに低い。

従って、本明細書では、（ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第一の核酸配列と、（ii）アルファウイルス非構造タンパク質、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２およびｎｓｐ３をコードする第二の核酸と、（iii）ＩＲＥＳと、（iv）少なくとも１つの目的の異種性遺伝子をコードする核酸配列と、（ｖ）ＩＲＥＳと、（vi）アルファウイルス非構造タンパク質と、ｎｓｐ４をコードする第三の核酸と、（vii）３’アルファウイルス複製認識配列をコードする第四の核酸とを順番に含む組換え核酸について開示する。別の実施形態では、エレメント（iii）は転写プロモーター、例えばアルファウイルスサブゲノムプロモーター（これを２６Ｓプロモーターまたはウイルス接合領域プロモーターとも称する）である。特定の実施形態では、ベクターレプリコンＲＮＡはインビトロでＤＮＡプラスミドから転写され、次にエレクトロポレーションによりヘルパー細胞に導入される。別の実施形態では、本発明のベクターレプリコンＲＮＡはインビボで、ヘルパー細胞にトランスフェクトされたＤＮＡベクタープラスミドから転写される（例えば米国特許第5,814,482号参照）か、またはこれはウイルスもしくはウイルス様粒子を介してヘルパー細胞に送達される。

目的の異種性遺伝子は本明細書にて異種性ＲＮＡまたは異種性配列とも称され、ウイルス、原核細胞または真核細胞に由来する広範な種類の配列から選択され得る。異種性配列のカテゴリーの実例には、特に限定されるものではないが、免疫原、サイトカイン、毒素、治療用タンパク質、酵素、アンチセンス配列、および免疫応答モデュレーターなどがある。

好ましい実施形態では、レプリコン構築物で用いられる３’アルファウイルス非コード配列はおよそ３００ヌクレオチドの長さであり、これは３’複製認識配列を含有する。アルファウイルス間で保存される最小３’複製認識配列は１９ヌクレオチド配列である(Hillら、Journal of Virology 2693-2704(1997))。標準的な分子生物学の技術により、３’非コード配列を修飾して複製機能を保存し、さらに３’末端の大きさを最小にすることができる。

［分解ＤＮＡヘルパー］
分解ＤＮＡヘルパー構築のいくつかの具体的な実施形態を本明細書の以下に開示する。１つの実施形態では、本発明は、（ｉ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第一の核酸配列と、（ii）リボザイムをコードする第二の核酸配列と、（iii）ＩＲＥＳをコードする第三の核酸配列と、（iv）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第四の核酸配列と（ここで、第四の核酸配列によりコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質は、第一の核酸配列によりコードされない）を順番に含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子を開示する。

そのさらに具体的な実施形態では、第一の核酸配列は、キャプシド、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２糖タンパク質、キャプシドおよびＥ１糖タンパク質、またはキャプシドおよびＥ２糖タンパク質をコードする核酸配列の群から選択される。これらの具体的な実施形態では、第四の核酸配列によりコードされる（複数の）構造遺伝子核酸配列はこの同一の群から選択される。好ましい実施形態では、第一および第四の核酸配列によりコードされる配列の組み合わせは、組換えアルファウイルス粒子を組み立てるのに必要な全ての構造タンパク質を包含する。さらに具体的な実施形態では、１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、例えば米国特許第5,792,462号および第6,156,558号に定義されるような１つまたはそれ以上の弱毒変異をコードできる。ＶＥＥ Ｅ１糖タンパク質のための具体的な弱毒変異には、Ｅ１アミノ酸位置８１、２７２または２５３のいずれか１つでの弱毒変異などがある。ＶＥＥ−３０４２から作られたアルファウイルスレプリコン粒子はＥ１−８１でのイソロイシン置換を含有し、そしてＶＥＥ−３０４０から作られたウイルスレプリコン粒子はＥ１−２５３で弱毒変異を含有する。ＶＥＥ Ｅ２糖タンパク質に関する具体的な弱毒変異には、Ｅ２アミノ酸位置７６、１２０または２０９のいずれか１つでの弱毒変異などがある。ＶＥＥ−３０１４から作られたアルファウイルスレプリコン粒子はＥ１−２７２およびＥ２−２０９の双方で弱毒変異を含有する（米国特許第5,792,492号参照）。ＶＥＥ Ｅ３糖タンパク質のための具体的な弱毒変異には、Ｅ３アミノ酸５６〜５９の欠失からなる弱毒変異などがある。ＶＥＥ−３５２６変異体から作られたウイルスレプリコン粒子はＥ３（アミノ酸５６〜５９）におけるこの欠失およびＥ１−２５３での第二の弱毒変異を含有する。Ｓ．Ａ．ＡＲ８６Ｅ２糖タンパク質に関する具体的な弱毒変異には、Ｅ２アミノ酸位置３０４、３１４、３７２または３７６でのいずれか１つでの弱毒変異などがある。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第一の核酸配列と、（ii）（ａ）タンパク質コードＲＮＡ配列の転写を促進するＲＮＡ配列、または（ｂ）ＩＲＥＳのいずれかをコードする第二の核酸配列と、（iii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第三の核酸配列と、（iv）３’アルファウイルス複製認識配列をコードする第四の核酸配列と、（ｖ）リボザイムをコードする第五の核酸配列と、（vi）ＩＲＥＳをコードする第六の核酸配列と、（vii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第七の核酸配列と（ここで、第七の核酸配列によりコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質は、第三の核酸配列によりコードされない）を順番に含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子を開示する。好ましい実施形態では、プロモーターはpol IIプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーターであり、本明細書で前記した方法のいずれか１つのパッケージング細胞においてＴ７ポリメラーゼが提供される。その具体的な実施形態では、第三の核酸配列は、キャプシド、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２糖タンパク質、キャプシドおよびＥ１糖タンパク質、またはキャプシドおよびＥ２糖タンパク質をコードする核酸配列の群から選択される。これらの具体的な実施形態では、第七の核酸配列によりコードされる（複数の）構造遺伝子核酸配列はこの同一の群から選択される。その好ましい実施形態では、第３および第七の核酸配列によりコードされる配列の組み合わせは、組換えアルファウイルス粒子を組み立てるのに必要な全ての構造タンパク質を包含する。さらに具体的な実施形態では、第三の核酸によりコードされる配列は１つまたはそれ以上のアルファウイルス糖タンパク質遺伝子を含み、第七の核酸によりコードされる配列はアルファウイルスキャプシド遺伝子を含む。さらに具体的な実施形態では、１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、例えば米国特許第5,792,462号および第6,156,558号に定義されるような１つまたはそれ以上の弱毒変異をコードでき、その実施形態は本明細書の前記で列挙した。

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＩＲＥＳをコードする第一の核酸配列と、（ii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第二の核酸配列と、（iii）リボザイムをコードする第三の核酸配列と、（iv）ＩＲＥＳをコードする第四の核酸配列と、（ｖ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする第五の核酸配列と（ここで、第五の核酸配列によりコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質は、第二の核酸配列によりコードされない）を順番に含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子を開示する。好ましい実施形態では、プロモーターはpol IIプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターである。別の実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーターであり、本明細書で前記した方法のいずれか１つのパッケージング細胞においてＴ７ポリメラーゼが提供される。その具体的な実施形態では、第二の核酸配列は、キャプシド、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２糖タンパク質、キャプシドおよびＥ１糖タンパク質、またはキャプシドおよびＥ２糖タンパク質をコードする核酸配列の群から選択される。これらの具体的な実施形態では、第五の核酸配列によりコードされる（複数の）構造遺伝子核酸配列はこの同一の群から選択される。その好ましい実施形態では、第二および第五の核酸配列によりコードされる配列の組み合わせは、組換えアルファウイルス粒子を組み立てるのに必要な全ての構造タンパク質を包含する。さらに具体的な実施形態では、１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質は、例えば米国特許第5,792,462号および第6,156,558号に定義されるような１つまたはそれ以上の弱毒変異をコードでき、その実施形態は本明細書の前記で列挙した。

前記したように、ＤＮＡヘルパー構築物の分解能力は、リボザイムを挿入することによる。リボザイムは、ＤＮＡベクターからのインビボでのＲＮＡの転写に続いて、それ自体（シス）または別の（トランス）１本鎖ＲＮＡ切除（切断）を特異的に触媒する能力を有している触媒性ＲＮＡ分子である。リボザイムは特異的ＲＮＡ配列を標的とし、異なるリボザイムは異なるＲＮＡ配列を標的とする。これらのリボザイムをコードするヌクレオチド配列のＤＮＡベクターへの挿入により、ＲＮＡ転写物内で特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を操作することができる(Cech、T.Amer.Med.Assn.260:3030(1988))。本明細書で記載するような単一のＤＮＡヘルパー構築物をパッケージング細胞に導入する場合、リボザイムはリボザイム標的配列で、導入されたＤＮＡ構築物からインビボで合成された単一のＲＮＡ転写物を切断し、その結果、各々が１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする２つの別個のＲＮＡ分子が細胞内で作製される。

本発明の態様では、例えばグループＩイントロンリボザイム(Cechら、米国特許第4,987,071号);グループIIイントロンリボザイム(Michelら、EMBO J.2:33-38(1983));ヘアピン・リボザイム(Hampelら、Nucl.Acids Res.18:299-304(1990)、米国特許第5,254,678号および欧州特許公開第0360257号)、ハンマーヘッド・リボザイム(Rossi,J.J.ら、Pharmac.Ther.50:245-254(1991);ForsterおよびSymons、Cell 48:211-220(1987);HaseloffおよびGerlach、Nature 328:596-600(1988);WalbotおよびBruening、Nature 334:196(1988);HaseloffおよびGerlach、Nature 334:585(1988))、肝炎デルタウイルスリボザイム(PerrottaおよびBeen、Biochem.31:16(1992))、アカパンカビＶａｋｒｕｄサテライト（ＶＳ）リボザイム(AndersonおよびCollins、Mol.Cell 5:4690478(2000))、ＲＮアーゼＰリボザイム(Takadaら、Cell 35:849(1983));およびその他の型のリボザイム（例えば国際公開公報第95/29241号、および国際公開公報第95/31551号）などの広範な種類のリボザイムを利用することができる。リボザイムの別の実例には米国特許第5,116,742号、第5,225,337号および第5,246,921号に記載されるものなどがある。

グループＩイントロンリボザイムは1982年にCechおよび共同研究者により記載されたテトラヒメナの最初の公知のリボザイムであった(Krugerら、Cell 31:147-157(1992))。このリボザイムは独特な自己スプライシング様式によりリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のプロセシングに関与していることが見出された。ｒＲＮＡの自己スプライシングは２工程メカニズムにより生じる。第一に、切断されることになっているイントロン−エクソン接合部としてグアニンヌクレオチドをイントロンの５’末端に付加する。次いで自由になった、グアニンを伴う５’イントロンが３’イントロン−エクソン接合部で攻撃して、イントロンを放出し、スプライシングされたエクソンを生じる(Zaugら、Nature 324:429-433(1986))。リボヌクレアーゼＰは触媒性ＲＮＡおよび小型のサブユニットタンパク質を含有する。これは細菌において発見され、前駆体転写物の内ヌクレオチド触媒性切断によるｔＲＮＡの成熟５’末端を作製することができる(Guerrier-Takadaら、Cell 35:849-857(1983))。ハンマーヘッド・リボザイムによる切断のメカニズムは当分野で特徴づけられている［例えばReddyら、米国特許第5,246,921号;Tairaら、米国特許第5,500,357号;Goldbergら、米国特許第5,225,347号参照］。

特許請求する本発明を実施するのにリボザイムの正確なメカニズムを理解する必要はないが、一般に、ＲＮＡ基質配列とリボザイムの２つの結合領域との間のワトソン−クリック対形成を介して２つの対合した領域を形成することによりリボザイムが基質ＲＮＡ分子に付着すると考えられている。最初の脱プロトン化反応は基質切断部位の３’側で２’糖に起こる。この脱プロトン化は隣接するリン酸ジエステル結合の求核攻撃、続いて５’オキシアニオン切断基のプロトン化を引き起こし、それにより２’，３’−サイクリックホスフェートおよび５’ヒドロキシル末端を生じる。

ハンマーヘッド・リボザイムと同様に、ヘアピン・リボザイムは植物ビロイドにも見出され、それはハンマーヘッド・リボザイムに対する作用の類似の様式により作用する(Feldsteinら、Gene 82:53-61(1989))。ＲＮＡ基質を切断するためのヘアピン・リボザイムの設計および使用は当分野で記載されている(Hampelら、米国特許第5,527,895号)。

概して、リボザイムの標的配列はおよそ３から２０ヌクレオチドの長さに変化し得る。この配列の長さは標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションおよび切断されたＲＮＡからのリボザイムの解離を可能にするのに十分である。

Haseloffら(米国特許第6,071,730号)はこれもまた正確な切断部位を提供するトランススプライシング・リボザイムについて記載している。トランススプライシング・リボザイムを前記した実施形態の代替に用いることができ、ここでリボザイムを含む組換え核酸のエレメントは従ってリボザイム標的配列で置換されている。次いでリボザイム自体は別個のＤＮＡまたはＲＮＡ分子としてトランスで提供される。

Thompsonら(米国特許第6183959号)は天然発生の自己切断性ＲＮＡに由来する酵素性ＲＮＡ分子の少なくとも７個の塩基変種について記載している。リボザイムを用いる本発明の実施形態では、リボザイムはしばしばこのようなプロモーターによりさらに効率的に転写され得る広範な２次構造を有するので、代替の実施形態はpol IIIプロモーターの使用を採用している。

本明細書で前記したように、本発明の実施形態の１つのセットでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列は５’および３’アルファウイルス複製認識配列の間に配置され、その結果アルファウイルスレプリカーゼタンパク質によりこの核酸が増幅される。好ましい実施形態では、最小５’アルファウイルス複製認識配列を利用する。具体的な実施形態では、全てのアルファウイルス構造タンパク質は単一のプロモーターから発現される。次いで単一の転写物がリボザイム部位での正確な切断により２つの複製可能な（すなわち増幅可能な）ＲＮＡに分解され（５’および３’アルファウイルス複製認識配列の存在に因り複製可能である）、その各々はアルファウイルス構造タンパク質のサブセットのみをコードする。次いでこれらのＲＮＡを構造タンパク質コード配列に対して５’に位置するＩＲＥＳ配列から翻訳する。

本発明の具体的な好ましい実施形態では、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイムを利用する(Wuら、Science 243:652-655(1989))。肝炎デルタウイルスのＲＮＡはハンマーヘッドおよびヘアピン・リボザイムに類似する自己触媒性ＲＮＡプロセシング活性を有し、そして双方のデルタ鎖のリボザイム切断点およびそれを含有するドメインは明確に定義される。ＨＤＶリボザイムはおよそ８０から９０ヌクレオチドの長さであり、シスでのみ機能的である。このリボザイムの使用の利点は（ｉ）５’切断部位で非特異的配列が要求される、および（ii）切断生成物が定義された３’末端で作製されるということである。米国特許第5,225,337号（参照により本明細書に組み込む）で記載されるように、ＨＤＶリボザイムに関する好ましい実施形態は、ＨＤＶの保存領域から少なくとも１８個の連続したヌクレオチドから構成される配列であり、ここでＨＤＶ ＲＮＡの保存された領域はゲノム鎖の６１１と７７１の残基の間のリボザイム活性を有しているＨＤＶの領域か、または相補的アンチゲノム鎖の８４５と９８０の残基の間の領域のいずれかの中に見出される。リボザイム活性を有している選択された配列は標的ＲＮＡ分子を切断して、２’，３’サイクリックホスフェートおよび５’ヒドロキシルを形成する。

本発明の特定の実施形態では、さらなる配列変化がリボザイム領域から下流で作られる。リボザイム切断事象は、ヌクレオチド配列が未変化で残るようにクリーンな３’末端に至る。いくつかのリボザイムでの切断事象の結果である下流の分子の５’末端は残留するリボザイム配列を含有することができ、この残留する配列の可能性のある２次構造は、例えばＩＲＥＳにより誘導される下流の翻訳活性、または下流のフラグメントの５’配列のいずれかその他の機能的役割に及ぼす有害な影響を有し得る。従って、このような干渉の潜在能力を最小にするために、本発明のいくつかの実施形態では、リボザイム配列から下流で無関係の非翻訳ヌクレオチド配列の領域を含むことも有用である。クリーンな５’末端を生じるための代替の実施形態では、第二のアンチゲノムリボザイム、例えばＨＤＶをセンスリボザイムから下流に付加することができる。この第二のリボザイムは陰性センス鎖においてのみ機能的であり、従って、下流の配列の５’末端でそのクリーンな「３’末端」を生じる。

［分解ＲＮＡヘルパー］
本発明の分解ヘルパーの別の実施形態では、ヘルパー構築物は、プロモーターがＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７ポリメラーゼプロモーターであり、このプロモーターが１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質；好ましくはキャプシドと、少なくとも１つの糖タンパク質とを志向するＤＮＡヘルパーである。ヘルパーはさらにアルファウイルス構造タンパク質をコードする配列の間にインフレーム挿入されたプロテアーゼ認識配列をコードする。従って、（ｉ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、（ii）ＩＲＥＳと、（iii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（iv）非自己触媒性プロテアーゼ認識部位と、（ｖ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と（ここで、（iii）および（ｖ）の核酸配列は同一ではない）を含むアルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡ分子が開示される。

別の実施形態では、（ｉ）ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと、（ii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（iii）非自己触媒性プロテアーゼ認識部位と、（iv）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と（ここで、（ii）および（iv）の核酸配列は同一ではない）を含むインビボで分解ＲＮＡヘルパーを発現するためのＤＮＡヘルパーが提供される。好ましい実施形態では、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターである。

別の実施形態では、ＲＮＡヘルパーは、（ｉ）アルファウイルス５’複製認識配列をコードする第一の核酸配列と、（ii）転写プロモーターと、（iii）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（iv）非自己触媒性プロテアーゼ認識部位と、（ｖ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列と、（vi）アルファウイルス３’複製認識配列と（ここで、（iii）および（ｖ）の核酸配列は同一ではない）含むＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を志向するプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子からインビトロで生成される。好ましい実施形態では、プロモーターはＴ７プロモーターであり、エレメント（ii）の転写プロモーターはアルファウイルスサブゲノムプロモーターである。

これらのヘルパーの好ましい実施形態では、構築物はポリタンパク質キャプシド−プロテアーゼ・Ｅ２−Ｅ１部位を生成する。別の実施形態では、ポリタンパク質はＥ２−Ｅ１プロテアーゼ・キャプシド部位またはキャプシド−Ｅ１−プロテアーゼ・部位Ｅ２である。必要に応じて、Ｅ３または６ｋ等のシグナル配列が、Ｅ１および／またはＥ２配列に含まれる。アルファウイルスキャプシドタンパク質をコードするこれらの構築物では、キャプシドタンパク質は、キャプシドの自己分解活性のための活性部位を除去するように修飾するべきである(米国特許第5,792,462号;コラム11、9-19行;Straussら、Seminars in Virology 1:347(1990))。

プロテアーゼ認識配列は好ましくはヘルパー細胞のコード配列にはそれほど頻繁には現れない、相対的に稀な配列である。このようなプロテアーゼ配列には当分野で広く知られており、例えばＸａ因子、エンテロペプチダーゼおよびスロンビンなどがあるが、これらのプロテアーゼのいくつかはその標的認識／切断部位に関する低い特異性を示しており、タンパク質を規準部位で切断しない。この理由で、宿主細胞またはアルファウイルスタンパク質レパートリーに存在する可能性が低い、特異的切断認識部位を伴う稀なプロテアーゼの使用が本発明の好ましい実施形態であろう。このような稀なプロテアーゼ部位の実例はタバコ・エッチ(tobaddo etch)ウイルスＮＩａプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）のプロテアーゼ部位である。ＴＥＶプロテアーゼは高い特異性でＱとＧの間でアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧを切断する。加えて、技術分野の近年の進歩により、多くの方法によりＴＥＶプロテアーゼの活性を有意に上昇させることができるということが実証されている。１つの方法は、融合タンパク質の形態でプロテアーゼを生成することによりプロテアーゼの溶解性を上昇させることである。第二の方法は、細胞内のプロテアーゼの機能的レベルをひどく低下させるプロテアーゼの固有の自己触媒機能を削除することである。標準的な変異誘発技術を用いて、自己触媒ドメインを変化させ、その活性形態でプロテアーゼの高レベルを維持するように導く(Kapustら、Protein Engineering 14:993-1000(2001))。アルファウイルスベクターまたは宿主細胞内でコンセンサス切断認識部位が存在するという稀な事象を本発明で用いることができる。プロテアーゼが哺乳動物配列を認識する機会を減らすために、これらの代替は非哺乳動物の起源に由来する可能性が最も高い。このようなプロテアーゼには、好ましくは植物ウイルスのポティウイルスファミリーのメンバー、例えばアミノ酸配列ＸＶＲＨＱ（ここでＸはいずれかの脂肪族アミノ酸である）を認識するカブモザイクポティウイルス（ＴｕＭＶ）に由来するプロテアーゼなどがある。本発明はまたその他のプロテアーゼ例えば、小麦縞モザイクウイルス、プラムポックスウイルス、ジャガイモＹウイルス、タバコ葉脈斑(tobacco vein mottling virus)，オーニソガラム・モザイクウイルス、ヤム・モザイクウイルス、シャロット・ポティウイルス、マメ黄斑モザイク(bean yellow mosaic)ウイルス、パパイヤ輪点ウイルス、エンドウ種子伝染モザイクウイルス、セイバンモロコシモザイクウイルス、ホソムギモザイクウイルス、サツマイモ微斑ウイルス、または割り当てられていないＣ４ペプチダーゼのファミリーのいずれかその他のメンバーを利用することもできる。本発明のプロテアーゼで必要とされる唯一の特徴は、ベクター構築物中の標的配列のみを認識し、宿主またはその他のアルファウイルス配列を切断できる非特異的プロテアーゼ活性を欠如するその限定的な能力である。

プロテアーゼ認識部位を含む前記の実施形態では、プロモーターは全てのコードアルファウイルス構造タンパク質の発現を志向する。ＤＮＡヘルパーをＴ７ポリメラーゼの供給源（例えば安定して形質転換された発現カセット、別個の発現プラスミド、またはポリメラーゼタンパク質）と共にヘルパー細胞に導入し、単一のＲＮＡ転写物がポリタンパク質のキャップ非依存的翻訳を志向するＩＲＥＳを含有するプロモーターから生成され、次いでこれをヘルパー細胞で提供されたプロテアーゼにより切断する。インビトロでＤＮＡヘルパーベクターから転写されたＲＮＡヘルパーを、好ましくはエレクトロポレーションによりヘルパー細胞に導入し、ここでそれを増幅し、ポリタンパク質に翻訳する。前記のように、いくつかの様式のいずれか１つでプロテアーゼをヘルパー細胞に提供し、そしてプロテアーゼの存在下でポリタンパク質を切断する。

具体的な実施形態では、プロテアーゼはヘルパー細胞のゲノムに安定して形質転換されたカセットとして存在できる。この実施形態では、プロテアーゼをコードする遺伝子は誘導可能なプロモーターも、例えば熱ショックまたはメタロチオネン応答プロモーターの調節下にあるのが好ましい。別の実施形態では、プロテアーゼ遺伝子および／またはＴ７ポリメラーゼ遺伝子は、アルファウイルス５’末端、プロテアーゼの発現を志向するアルファウイルスサブゲノムプロモーター、およびアルファウイルス３’末端を含むアルファウイルスサブゲノム発現カセットとしてヘルパー細胞に存在できる。このカセットはヘルパー細胞で誘導可能であり、アルファウイルスＲＮＡレプリコンが細胞に導入された場合にのみ発現される。また別に、プロテアーゼを、別個に翻訳可能なＲＮＡとしてかまたはタンパク質として、ＲＮＡヘルパーおよびＲＮＡレプリコンと同時にヘルパー細胞に加えることができる。

［非複製ＤＮＡヘルパー］
本発明の実施形態の別のセットでは、配列間でコードされるＲＮＡの増幅を可能にするアルファウイルス複製認識配列を組み込まないＤＮＡヘルパーを開示する。ヘルパー細胞で生じ得る機能的組換え分子の頻度に寄与し得る、このような配列を欠如させることにより、組換えアルファウイルス粒子を生成するのに必要な全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードする単一のＤＮＡヘルパーは、ヘルパー細胞内でパッケージング／組換えが有し得る影響を最小にすることができる。二連性ＲＮＡ系と比較して、検出されたパッケージング／組換えの現象は少なくとも一桁少なく；好ましい実施形態では、２、３または４桁少ない。従って、特許請求する発明の別の実施形態は、全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能なように連結されたプロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を発現するための組換えＤＮＡを含む。好ましい実施形態では、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターである。

このＤＮＡヘルパーをアルファウイルス許容細胞に導入するための好ましい方法もまた開示し、該方法には、カチオン脂質、例えばFuGene（登録商標）およびLipofectamine（登録商標）、エレクトロポレーション、またはウイルスベクターなどがある。本明細書に開示する方法に従ってこのような組み合わせを試験することにより、細胞型の組み合わせおよびトランスフェクション法を最適化することができる。具体的な実施形態では、２９３ＴおよびVero細胞を用いることができる。好ましい実施形態では、レプリコンＲＮＡの導入前に、例えばレプリコンＲＮＡの細胞へのエレクトロポレーションの３０分、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２４または４８時間前にＤＮＡヘルパーを導入する。レプリコンＲＮＡのトランスフェクション効率の有意な低下に至り、細胞によるＶＲＶの十分なパッケージングが可能になる時間が適当である。

また別の実施形態では、本発明のＤＮＡヘルパーをアルファウイルスレプリコンＲＮＡと共にヘルパー細胞に同時エレクトロポレートすることができる。エレクトロポレーションのパラメーターをＲＮＡまたはＤＮＡ単独のエレクトロポレーションに用いるパラメーターから調整し、ヘルパー細胞からのＶＲＰの収量を最適化する。

［キメラアルファウイルスＲＮＡヘルパー］
実施形態の別のセットでは、構造タンパク質が由来するアルファウイルス以外のアルファウイルスに由来する複製認識シグナル（５’および３’）を利用するＲＮＡヘルパーを開示する。これらの実施形態では、プロモーターは少なくとも１つの構造タンパク質の発現を志向し、ヘルパーの複製を志向するアルファウイルス５’および３’末端が増幅を可能にするが、これらのヘルパーによるパッケージング／組換えの頻度は、その他のアルファウイルスのアルファウイルス構造タンパク質による１つのアルファウイルスのパッケージングシグナルの認識の低効率性または完全な欠如のために低下する。好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡヘルパーは１つまたはそれ以上のＶＥＥ構造タンパク質をコードし、シンドビス（特にＴＲ３３９）、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６、セミリキ森林ウイルスまたはロスリバーウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスに由来する複製認識シグナルを利用する。

［非アルファウイルスＲＮＡヘルパー］
本発明の実施形態の別のセットでは、アルファウイルス以外のウイルスに由来するウイルスＲＮＡ複製機構を利用する、１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現するヘルパー構築物を開示する。２つのＲＮＡ分子を含むアルファウイルス構造タンパク質発現系であって、（ａ）第一のＲＮＡはウイルスレプリカーゼタンパク質のための配列をコードし、（ｂ）第二の組換えＲＮＡは（ｉ）（ａ）のウイルスレプリカーゼタンパク質を含む複製複合体のための５’複製認識配列と、（ii）１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質と、（iii）（ａ）のウイルスレプリカーゼタンパク質を含む複製複合体のための３’複製認識配列とのための配列をコードする発現系を開示する。２つのＲＮＡ分子のヘルパー細胞への導入に続いて、第一のＲＮＡが１つまたはそれ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする第二のＲＮＡを複製し、次にヘルパー細胞の翻訳機構が第二の組換えＲＮＡでコードされる（複数の）構造タンパク質配列を翻訳する。

好ましい実施形態では、第一および第二のＲＮＡ分子はノダウイルスに由来する。ノダウイルス科は、２本に分節した陽性センスＲＮＡゲノム小型の非エンベロープの正多面体ウイルスのファミリーである(BallおよびJohnson、「In The Insect Viruses」、L.K.MillerおよびL.A.Ball編、New York:Plenum、225-267頁(1998))。ノダウイルスゲノムは公知の全ての動物ウイルスのなかでもとりわけ最小であり、５ｋｂ未満の遺伝物質を含有する。ゲノムノダウイルスＲＮＡは昆虫、植物(Selling,B.H.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:434-438(1990))および哺乳動物(Ball,L.A.ら、J.Virol.66:2326-2334(1992))細胞に対して感染性である。ノダウイルスは、ノダウイルス特異的ＲＮＡ複製(Zhong,W.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11146-11150(1992);Ball,L.A.およびLi,Y.、J.Virol.67:3544-3551(1993);Li,Y.およびBall,L.A.、J.Virol.67:3854-3860(1993);Ball,L.A.、J.Virol.69:720-727(1995))およびパッケージングシグナル(Zhong,W.ら、前出(1992))などの独特な制御シス・エレメントを用いる。双方のゲノムセグメントはその５’末端でキャップされているが、ポリＡテイルを欠如する(NewmanおよびBrown、Journal of General Virology 30:137-140(1976))。ＲＮＡ２と称されるより小型のセグメントはノダウイルスコートまたはキャプシド、タンパク質の前駆体をコードする。ＲＮＡ１と称されるより大型のセグメントはウイルス部分のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードし、これはＲＮＡ１および２の双方を複製する（ＢａｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ、前出（１９９８））。ノダウイルスのＲＮＡ１は、細胞質レベルの高い、キャップされた、および機能的なｍＲＮＡ、すなわちＲＮＡ１およびＲＮＡ２を合成するその能力は注目に値する。いくつかのノダウイルスＲＮＡ１分子の配列が最近報告され、ＲＮＡ２配列は以前に開示されている(Johnsonら、J.Gen.Virol.82:1855-1866(2001)およびGenBankアクセッション番号を含むそこに引用されている参照文献を参照)。

出願者はノダウイルス複製およびアルファウイルス複製を同一細胞内で同時に生じることができることを決定した。従って、本発明の実施形態の１つのセットでは、ノダウイルスに基づくアルファウイルス構造タンパク質発現系を開示し、この系では選択されたノダウイルスのＲＮＡ１を、組換えアルファウイルス粒子がパッケージングされる細胞に、同一または異なるノダウイルス由来の、操作されたＲＮＡ２と共に供給する。ノダウイルスキャプシド遺伝子をコードする配列の部分を除去するようにＲＮＡ２を操作し、従って少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする配列に置き換える。本発明の方法の具体的な実施形態では、これらの２つのノダウイルスＲＮＡ（すなわちＲＮＡ１および操作されたＲＮＡ２）をアルファウイルスＲＮＡレプリコンと共に３つ全てのＲＮＡを発現する細胞に同時エレクトロポレートする。好ましい実施形態では、ノダウイルスＲＮＡ１、アルファウイルスキャプシド遺伝子を発現する組換えノダウイルスＲＮＡ２、アルファウイルスＲＮＡレプリコン、およびアルファウイルス糖タンパク質を発現する第二のヘルパーＲＮＡを、４つのＲＮＡ全てを発現できる細胞に同時エレクトロポレートし、結果的にレプリコンの組換えアルファウイルス粒子へのパッケージングに至る。特許請求する発明で使用するのに適したノダウイルスにはノダムラウイルス（ＮｏＶ）、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）、ゴキブリウイルス（ＢＢＶ）、ブーララ(Boolarra)ウイルス（ＢｏＶ）、マイマイガウイルス（ＧＭＶ）、およびマナワツ(Manawatu)ウイルス（ＭｗＶ）などがある。好ましいノダウイルスはＦＨＶおよびＮｏＶである。別の実施形態では、ＲＮＡ１および組換えＲＮＡ２をウイルスまたはウイルス様粒子、例えば哺乳動物pol IIプロモーターを伴うアデノウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、ＳＶ−４０、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ノダウイルス、ピコルナウイルス、水疱性口内炎ウイルス、およびバキュロウイルスによりヘルパー細胞に導入する。

［アルファウイルスレプリコン粒子を作製するための方法］
本発明のヘルパーおよび／またはアルファウイルスＲＮＡレプリコンを利用する、１つまたはそれ以上の異種性配列を発現するアルファウイルスレプリコン粒子を作製するための方法をも開示する。本発明の方法を用いて、培養中のアルファウイルス許容細胞における継代による決定により検出可能な複製コンピテントアルファウイルス粒子を含有しない、アルファウイルスレプリコン粒子の調製物を生成する。

粒子を作製するために、感染性粒子を組み立てるのに必要な全てのアルファウイルス構造タンパク質を提供するようなヘルパーまたはヘルパーの組み合わせを選択する。好ましい実施形態では、ヘルパーまたはヘルパーの組み合わせはキャプシド、Ｅ１およびＥ２をコードする。１つ以上のヘルパーを含む実施形態では、１つのヘルパーを当分野で公知のヘルパー、例えば本明細書で参照する標準的なスプリットＲＮＡヘルパーから選択する。本発明の少なくとも１つの実施形態を含むヘルパーまたはヘルパーの組み合わせを用いていずれかのアルファウイルスレプリコンＲＮＡをパッケージングすることができる。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリコンＲＮＡは、本明細書で特許請求されるように再構成されたアルファウイルスＲＮＡレプリコンまたは本明細書で参照した標準的なアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。具体的な、好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリコン粒子はＶＥＥに基づく粒子である、すなわちヘルパーはＶＥＥアルファウイルス構造タンパク質をコードし、レプリコンＲＮＡはＶＥＥに由来する。

当業者に公知の技術と組み合わせた、本明細書に開示する方法に従って、アルファウイルスレプリコン粒子を調製する。方法には、最初に選択された（複数の）ヘルパーおよび１つまたはそれ以上の異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡをアルファウイルス許容細胞の集団に導入するステップと、次にアルファウイルスレプリコン粒子の生成を可能にする条件下で細胞をインキュベートするステップとが含まれる。（複数の）ヘルパーおよびアルファウイルスレプリコンＲＮＡをヘルパー細胞の集団に導入する工程を、本明細書に開示するかまたは一般的な当業者に公知のいずれかの適当な手段により実施することができる。本明細書で記載するように、細胞の集団はプロモーター、トランス作動性リボザイム、プロテアーゼ、またはいずれかのその組み合わせを提供する安定して形質転換された細胞株でよい。また別に、前記プロモーターはトランス作動性リボザイムまたはプロテアーゼを、別個に複製できるかまたは複製できない核酸またはタンパク質の形態で、規定どおりに細胞集団に加えることができる。

当分野で公知の慣用される技術、例えば米国特許第5,492,462号；第6,156,558号を用いて、アルファウイルスレプリコン粒子の組成物または調製物をヘルパー細胞の集団から収集し、これが培養中のアルファウイルス許容細胞での継代による測定により検出可能な、複製許容アルファウイルス粒子を含有しないという事実によりこれらの組成物を特徴づけする。

当業者に理解されるように、特許請求する発明の各々の態様に関していくつかの実施形態およびエレメントがあり、異なるエレメントの全ての組み合わせがそれにより予測され、本明細書に例示する具体的な組み合わせは特許請求する発明の範囲の限定としては解釈されない。具体的なエレメントを除去するかまたは組み合わせで利用可能なエレメントの群に加える場合、次いでエレメントの群はこのような変化が組み込まれていると解釈される。

出版物、特許出願、および特許などの本明細書で引用されたすべの参照文献は、各々が個々におよび具体的に参照文献に組み込まれていることが示されている場合、同一の程度まで参照により本明細書に組み込み、その全てが本明細書で再現された。

以下の実施例は本発明を説明するために提供するものであって、その限定と解釈すべきではない。これらの実施例ではｎｍはナノメートルを意味し、ｍｌはミリリットルを意味し、ｐｆｕ／ｍｌはプラーク形成単位／ミリリットルを意味し、ｎｔは（複数の）ヌクレオチドを意味し、ＰＢＳはリン酸塩緩衝生理食塩水を意味し、ＶＥＥはベネズエラウマ脳炎を意味し、ＥＭＣは脳心筋炎ウイルスを意味し、ＢＨＫはベビーハムスター腎臓細胞を意味し、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質を意味し、Ｇｐは糖タンパク質を意味し、ＣＡＴはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味し、ＩＦＡは免疫蛍光アッセイを意味し、ＩＲＥＳはリボソーム内部進入部位を意味する。「Ｅ２アミノ酸（例えばｌｙｓ、ｔｈｒ等）番号」発現はＥ２遺伝子の指定された残基の指定されたアミノ酸を示し、Ｅ１タンパク質およびＥ３タンパク質における特異的な残基でのアミノ酸に言及するのにも用いられる。

以下に続く実施例では、種々ヘルパープラスミドを構築するための出発材料を以下のいずれかから選択することができる。ＶＥＥのｃＤＮＡクローン全長、すなわちＶＥＥの毒性のトリニダード・ロバ株であるｐＶ３０００；または弱毒変異を伴うこれらのクローンのいずれか：pV3014(E2 lys209、E1 thr272)、p3042(E1 ile81)、pV3519(E2 lys76、E2 lys209、E1 thr272)およびpV3526(E3 56-59の欠失、E1 ser253)、これはＶＥＥトリニダード・ロバ株の遺伝的背景にある。米国特許第5,792,462号に記載されるように、これらのプラスミドは制限酵素により消化され、再ライゲートされて非構造タンパク質コード領域を除去する。また別に、既存のヘルパープラスミド、例えばPushkoら(1997、前出)に記載されたもので、または本明細書に記載するように出発することができる。

［実施例１］
［ＶＥＥレプリコン粒子］
ワクチンとして使用するための、または遺伝子治療のためのレプリコン粒子を、ＶＥＥに基づくベクター系を用いて生成することができる（例えば米国特許第5,792,462号参照）。これらの実施例では、１つまたはそれ以上の弱毒変異(例えばJohnstonおよびSmith、Virology 162(2):437-443(1988);Davisら、Virology 171(1):189-204(1989);Davisら、(1990))をＶＥＥ配列に挿入して弱毒ＶＥＥレプリコン粒子を作製することができた(Davisら、Virology 183(1):20-31(1991);Davisら、Virology 212(1):102-110(1995);Grinderら、Virology 206(2):994-1006(1995))。

本明細書の実施例はＲＮＡレプリコン、すなわち自己増幅し、発現するＲＮＡの構築、およびパッケージングを可能にする構造タンパク質をコードする１つまたはそれ以上のヘルパー核酸について記載する。レプリコンＲＮＡは１つまたはそれ以上の外来性遺伝子、例えば免疫原またはレポーター遺伝子をコードする遺伝子を運ぶ。レプリコンＲＮＡおよびヘルパー核酸（これは本明細書で後記するようにアルファウイルス構造タンパク質を発現する）を次いで単一の細胞、すなわちヘルパーまたはパッケージング細胞に導入し、ここでレプリコンＲＮＡは１サイクルに関してのみ感染性であるウイルス様粒子（本明細書では「ウイルスレプリコン粒子」または「ＶＲＰ」と称する）にパッケージングされる。アルファウイルスに基づくベクターの特徴は、単一の感染サイクルの間、ＶＲＰが標的化する細胞、例えばリンパ節の細胞におけるレプリコンＲＮＡの発現レベルを非常に高くする。

得られたワクチンベクターは無毒性であり、動物、特に限定されるものではないが、げっ歯類、ウマ、非ヒトの霊長類、およびヒトなどにおける致死ウイルス誘発に対して完全な保護を提供する。

［実施例２］
［標準的なＶＥＥレプリコンおよびＲＮＡヘルパー］
米国特許第5,792,462号、Pushkoら、(Virology 239:389-401(1997))、および国際公開公報第02/03917号(Olmstedら)に記載されるように、ＶＥＥに基づく標準的なアルファウイルスレプリコンはＶＥＥ非構造遺伝子および２６ＳサブゲノムＲＮＡプロモーターの単一のコピー、続いて多重クローニング部位を含有する。ワクチン構築物では、免疫原をコードする１つまたはそれ以上の遺伝子をこのクローニング部位に挿入する。本発明の新規構造タンパク質発現カセットの能力を実証する目的のために、ＧＦＰまたはＣＡＴ遺伝子をこのクローニング部位に挿入することによりＶＥＥレプリコンを構築する。本明細書に記載する構造タンパク質発現カセットの種々の組み合わせで作られた粒子からのこれらのレポーター遺伝子の発現により、これらのカセットの有用性および新規性が実証される。

米国特許第5,792,462号、Pushkoら、(Virology 239:389-401(1997))、およびPCT国際公開公報第02/03917号(Olmstedら)に記載されるように、標準的なＶＥＥスプリットＲＮＡヘルパー系を本明細書では「ＣａｐまたはＧｐ ＲＮＡ」、「野生型Ｇｐ ＲＮＡヘルパー」、「糖タンパク質ヘルパー」、「ＧｐヘルパーＲＮＡ」、「Ｇｐヘルパー」、「キャプシドヘルパー」、または「Ｃ−ヘルパー」として記載する。引用された参照文献に記載されるように、これらのＲＮＡヘルパーをＤＮＡプラスミドから作り、これらのＤＮＡプラスミドは、例えばＰＣＲ増幅により構造タンパク質コードフラグメントを得るための便利な供給源であり得る。また別に、これらのコードフラグメントをＶＥＥの全長クローンまたはその弱毒変種から得ることができる（米国特許第5,185,440号；米国特許第5,505,947号）。これらの標準的なＶＥＥヘルパーを、本明細書で開示する本発明のヘルパーとの組み合わせで、および／または本明細書で開示する新しい系との比較実験で用いる。

［実施例３］
［再構成されたアルファウイルスＲＮＡレプリコンベクター］
ＡｖｒＩＩおよびＡｐＩ制限酵素で消化することにより標準ＶＥＥ ＧＦＰ発現レプリコンベクター（実施例２参照）からｎｓＰ４領域を欠失させ、続いてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで消化したＤＮＡの処理により平滑末端を作製し、ＤＮＡの再ライゲーションによりｐＧＦＰΔｎｓＰ４−１を作製した。インビトロでｐＧＦＰΔｎｓＰ４−１ ＤＮＡプラスミドから転写されたＲＮＡを細胞にエレクトロポレートする場合、ＧＦＰは発現されない。しかしながら、ＧＦＰΔｎｓＰ４−１ ＲＮＡおよび非修飾レプリコンベクターＲＮＡと同時エレクトロポレートされた細胞において、ＧＦＰタンパク質を容易に検出することができる。これは別のレプリコンＲＮＡによりトランスで提供されるｎｓＰ４タンパク質がＧＦＰΔｎｓＰ４−１ベクターを補完することができることを実証している。この結果は、ｎｓｐ４遺伝子が、別の非構造タンパク質から別個に発現される場合に機能することができることを示している。

次いでｎｓｐ４遺伝子（ｎｓＰ２プロテアーゼ切断部位を維持するためにｎｓｐ３の部分を含む）をＥＭＣＶ ＩＲＥＳの下流にクローン化した。ｎｓＰ３４順行（配列番号３３）およびｎｓｐＰ停止（配列番号３４）プライマーを用いてｎｓＰ４領域を標準ＶＥＥレプリコンベクターからＰＣＲ増幅した（表３もまた参照）。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩを５’および３’制限酵素部位を用いて、増幅されたｎｓＰ４遺伝子フラグメントをＥＭＣＶ ＩＲＥＳを含有するトランスファーベクターにクローン化した。次いでプライマーの第二のセットを用いてＥＭＣＶ−ｎｓＰ４構築物をトランスファーベクター：ＥＭＣＶ順行ＡｓｃＩ（配列番号３５）およびＥＭＣＶ逆行ＡｓｃＩ（配列番号３６）から増幅した（表３もまた参照）。ＥＭＣＶ−ｎｓＰ４ ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ制限酵素で消化し、そしてＡｓｃＩ直線化ｐＧＦＰΔｎｓＰ４−１ベクターＤＮＡにライゲートし、ｐＧＦＰΔｎｓＰ４−１．１．を作製した。クローン化したｎｓＰ４遺伝子領域（ｎｓＰ２プロテアーゼ部位を含有するｎｓＰ３の部分を含む）をシークエンシングして、クローニング中にｎｓＰ４に変異が導入されなかったことを確認した。

インビトロでｐＧＦＰΔｎｓＰ４−１．１．ＤＮＡから転写されたＲＮＡをベロ、ＢＨＫ、２９３ＴおよびＣＥＦ細胞にエレクトロポレートし、そしてＧＦＰタンパク質発現を全ての細胞型において検出した。

［実施例４］
［最小５’アルファウイルス複製認識配列を伴うヘルパーの構築］
Ａ．最小５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を決定するための構築物
高い感染効率（ＭＯＩ）でＶＥＥレプリコン粒子（ＶＲＰ）をベロ細胞の新鮮培養物に接種する場合、抗キャプシド免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ；以下の表５参照）によりキャプシドタンパク質を検出することができる。ＶＲＰ感染細胞におけるキャプシドタンパク質の検出は、ＶＲＰにキャプシド遺伝子が存在することを示している。これに類似の知見が他の研究者により報告されている(LuおよびSilver、前出(2001))。これは少なくとも３つの方法で起こり得る。１）キャプシドヘルパーＲＮＡとレプリコンＲＮＡとの間の組換え事象の結果として、２）粒子を含有するＶＥＥレプリコンＲＮＡへのキャプシドヘルパーＲＮＡの同時パッケージングの結果として、または３）粒子へのキャプシドヘルパーＲＮＡ単独のパッケージングの結果として（ＶＥＥレプリコンＲＮＡは存在しない）。当分野で以前に記載されたＶＥＥヘルパー(Johnstonら、前出;Pushkoら、前出)はＶＥＥ ＲＮＡの５’領域の５１９ヌクレオチドを含有する。具体的には５’領域は４５ｎｔ非翻訳領域（ＵＴＲ）および４７４ｎｔのｎｓＰ１オープンリーディグフレーム（ＯＲＦ）をコードする。これらのヘルパーＲＮＡは元来、粒子へのウイルスＲＮＡのパッケージングに関与すると考えられていたＶＥＥヌクレオチド領域を除去するように設計された。この設計はシンドビスウイルスを用いて実施された研究に基づき、この研究でゲノムのおよそ１０００ｎｔに位置するｎｓＰ１の領域はパッケージングシグナルをコードすると考えられていた(Bredenbeek,P.J.ら、J.Virol.67:6439-6446(1993);Levisら、Cell 44:137-145(1986);Weissら、J.Virol.63:5310-5318(1989))。ヘルパー構築物をさらに最適化するために、５’ＵＴＲに欠失を増やしてヘルパーに必要な最小配列を決定し、（ｉ）許容されるＶＲＰ収量および（ii）ＶＲＰ調製物で同時パッケージング／組換えするキャプシド遺伝子に関する理論上最低の頻度を提供した。

１．５’トランケートされたＶＥＥキャプシドヘルパーの構築
ＶＥＥキャプシド遺伝子に関する配列を含有するキャプシドヘルパープラスミドを以前に記載したように構築した。この構築物は、キャプシドコード配列に関するＡＴＧ開始コドンから上流（すなわち５’）に位置する「５’ＵＴＲ」である５１９ヌクレオチドの配列を含有し、これを本明細書で「ｈｃａｐ１０」と称する。

（ａ）ＰＣＲに基づく構築物
ＶＥＥキャプシドヘルパーに存在する５１９ｎｔＵＴＲに各々およそ５０ｎｔの９個の連続した欠失を作った（実施例２参照）。５’ＵＴＲの３’末端から以下の欠失を作った。

個々の構築物のクローニングを必要としないＰＣＲ方法を用いて、キャプシドヘルパーの最初のセット（「Ｈｃａｐ」）構築物を生成した。２つの別個の工程で手順を実施した。第一に、〜５０ｎｔ離れてＶＥＥレプリコンの４７０位置までの５７ＵＴＲに相補的である９個の逆プライマー（Ｈｃａｐ１−９逆行）を設計し、ＡｐａＩ制限部位を含有するように操作した。

これらのプライマーの各々の配列を表４に示す。Ｈｃａｐ順行プライマー、１３−１０１．ｐｒ１（配列番号３７）（表４もまた参照）を、逆行プライマーのいずれか１つと組み合わせて使用した場合、これがＴ７プロモーターおよび個別の５’ＵＴＲ欠失を含有するフラグメントを増幅するように設計した。第２に、フラグメントが以下の組成を有するようにプライマーを設計し、既存のキャプシドヘルパーの中からキャプシド遺伝子を増幅した。５’ＡｐａＩ制限部位、２６Ｓプロモーター、キャプシド遺伝子、３’ＵＴＲ−３’。これらのプライマーは４８−１３２．ｐｒ１（配列番号４８）および３−８ｐｒ４（配列番号４９）である（表４もまた参照）。増幅されたＰＣＲ生成物をＡｐａＩ酵素で消化し、共通のＡｐａＩ部位で一緒にライゲートした。これらのライゲートされたＤＮＡを鋳型として用いて、プライマー１３−１０１．ｐｒ１（配列番号３７）および１３−１０１．ｐｒ４（配列番号３８）を用いてＨｃａｐ構築物の各々をＰＣＲ増幅し、これは個別に各ヘルパーの５’および３’領域をフランキングする。ＶＲＰパッケージング実験に用いるために増幅されたＨｃａｐヘルパーＤＮＡを用いてＲＮＡをインビトロで転写した。

（ｂ）選択されたトランケートされたヘルパーのプラスミド構築
選択されたＨｃａｐクローンのプラスミド版を構築するために、前記したように各５’ＵＴＲをＰＣＲ増幅して、ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩ制限酵素で消化し、次に標準ＶＥＥレプリコンベクター（実施例２参照）にライゲートし、これをＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩ制限酵素で消化した。得られた「空の」ヘルパーベクター（Δヘルパー）は各々９個の欠失５’ＵＴＲ領域の１つを含有した。次いで前記したようにプライマー４８−１３２．ｐｒ１および３−８ｐｒ４を用いて標準キャプシドヘルパープラスミドからキャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅し、ＡｐａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化し、これもまたＡｐａＩおよびＮｏｔＩ酵素で直線化したΔヘルパーの各々にライゲートした。

Ｂ．トランケートされたヘルパー構築物の分析
トランケートされたヘルパー構築物の各々を、免疫原（例えばＨＩＶ由来のＧａｇタンパク質）をＶＲＰに発現するレプリコンＲＮＡをパッケージングするその能力に関して別個に試験した。３つのＲＮＡの各々３０μｇ（すなわちトランケートされたキャプシドヘルパー、標準ＶＥＥ Ｇｐヘルパー、およびＨＩＶ−Ｇａｇ発現レプリコンＲＮＡ）をＣＨＯまたはベロ細胞にエレクトロポレートした。

１．エレクトロポレートされたＣＨＯ細胞のＩＦＡ分析

２．ＣＨＯ細胞におけるパッケージング／組換え分析
ＣＨＯ細胞に生じたＶＲＰに関してパッケージング／組換え研究を実施した（表６）。得られたＧＡＧ ＶＲＰおよびキャプシド発現粒子の力価を新鮮細胞の感染およびＧＡＧまたはキャプシドタンパク質のＩＦＡを実施することにより決定した。

Ｈｃａｐ−１からＨｃａｐ−６を用いてＣＨＯ細胞において高い力価のＶＲＰ（＞１ｘ１０＾８／ｍｌ）を生じた。これらのＨｃａｐ ＲＮＡで生じた最高のＣＨＯ細胞ＶＲＰ調製物ではキャプシド同時パッケージング／組換え力価が、Ｈｃａｐ１０（標準物質、「５’ＵＴＲ全長」キャプシドヘルパー）と比較して、２０から＞１００倍低下した。

３．選択されたヘルパーを用いるベロ細胞におけるパッケージング／組換え分析
Ｈｃａｐ１からＨｃａｐ４のトランケートされた５’ＵＴＲに関してプラスミドクローンを調製し、そしてクローンをシークエンシングしてその同一性を確認した。Ｈｃａｐ４トランケートされたヘルパーを用いてキャプシドタンパク質を提供するために、ＨＩＶ−Ｇａｇ ＶＥＥレプリコンＲＮＡおよび標準Ｇｐ ＲＮＡヘルパーと共にベロ細胞に同時エレクトロポレートした後にＶＲＰを生成した（実施例２参照）。

ＭＯＩ〜５０−１００（細胞の１００％感染を確実にするため）でこれらのＶＲＰで感染したベロ細胞のＩＦＡ分析を感染後１６時間に抗キャプシド抗体を用いて実施した。キャプシドに関してＩＦＡ陽性であった細胞数を１０Ｘの拡大率で、視野あたりで決定し、そしてこの数を用いてキャプシドに関する同時パッケージング・組換え力価をミリリットルあたりを基礎にして算出した。表７はこのトランケートされたヘルパーを用いて、標準キャプシドヘルパーと比較した結果を提供する（「Ｈｃａｐ１０」）。

［実施例４］
［Ｔ７ポリメラーゼ誘導ヘルパー］
Ａ．Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＶＥＥ糖タンパク質ヘルパー
Ｇｐヘルパーの糖タンパク質（Ｇｐ）遺伝子をＰＣＲにより増幅し、そしてＥＭＣ ＩＲＥＳから下流でクローン化する。次いでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの調節下でＥＭＣ／ＧｐフラグメントをｐＣＲＢｌｕｎｔ(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)にクローン化する。このｐＣＲＢｌｕｎｔ−ＥＭＣ／Ｇｐ ＤＮＡ（図６、Boehringer Mannheim、Indianapolis、インディアナ州）のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を発現するＢＨＫ−２１細胞へのトランスフェクションの結果、ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞においてＩＦＡにより決定されるようなＶＥＥ Ｇｐタンパク質が発現された。

Ｂ．Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＶＥＥ 分解ＤＮＡヘルパー
ＶＥＥ 分解ＤＮＡヘルパーの構築
ＶＥＥＣａｐＦ／ＸｂａＩプライマー（配列番号２３）およびＶＥＥＣａｐＲ／ＢａｍＨＩプライマー（配列番号２４）（表８もまた参照）を用いてＶＥＥキャプシドタンパク質を標準Ｃヘルパープラスミドから増幅する（表２参照）。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ(InVitrogen Corp.、Carlsbad、カリフォルニア州)にクローン化し、ｐＣ４−Ｖキャプシドに至り、そしてＳｐｅＩを用いる制限酵素分析により配向を検証する。ＶＥＥＧｐＴＥＰ／ＢａｍＨＩプライマー（タバコ・エッチ(tobacco etch)ウイルスプロテアーゼ認識配列（ＴＥＰ）をコードする２１ｎｔ配列を含有する；配列番号２５）およびＶＥＥＧｐ／ＥｃｏＲＶプライマー（配列番号２６）（表８もまた参照）を用いてＶＥＥ糖タンパク質遺伝子を標準ＧｐヘルパープラスミドからＰＣＲ増幅し、続いてＢａｍＨＩで制限酵素消化した。ｐＣＲ４−ＶＣａｐｓｉｄクローンをＢａｍＨＩおよびＰｍｅＩで消化し、そしてＢａｍＨＩ消化したＶＥＥＧｐ ＰＣＲ産物とライゲートしてキャプシドとＧｐ配列との間にプロテアーゼ認識配列を伴う構造タンパク質コードカセットを作製する。ＥＭＣＶ−２順行（配列番号１７）および逆行（配列番号１８）プライマーを用いてｐＩＲＥＳからＥＭＣＶ ＩＲＥＳをＰＣＲ増幅し、ＮｈｅＩで消化し、そしてｐＣＲ４−ＶＳｐのＸｂａＩ制限酵素部位にクローン化し、そしてＥＭＣＶ−２順行およびＶＥＥＣａｐＲ／ＢａｍＨＩを用いるＰＣＲ分析により配向を検証する。

［実施例５］
［Ｐｏｌ ＩＩプロモーター誘導非複製ヘルパー］
Ａ．ヘルパーの構築
独特の制限酵素部位を有する遺伝子特異的プライマーを用いてアルファウイルス構造タンパク質遺伝子をＰＣＲ増幅し、トランスフェクトされた細胞で遺伝子発現するためにＤＮＡポリメラーゼIIプロモーターの下流にクローン化する。ＶＥＥ構築物の場合、キャプシドおよび／またはＧｐ遺伝子をＣヘルパーまたはＧｐヘルパーからＰＣＲ増幅し、ＣＭＶプロモーターの調節下でｐＣＤＮＡ−３．１(InVitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)にクローン化した。いずれかのＶＥＥ５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたは２６Ｓ ＲＮＡ配列を保持するクローンはなかった。以下の構築物を作製した。

ｐＣＤＮＡ−ＶＳｐを構築するために、ＶＥＥＧｐＦ／ＸｂａＩプライマー（配列番号２７）およびＶＥＥＧｐＲ／ＮｈｅＩプライマー（配列番号２８）（表９もまた参照）を用いて標準Ｇｐヘルパープラスミド（実施例２参照）からＶＥＥ糖タンパク質遺伝子をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＮｈｅＩ制限酵素で消化し、ｐＣＤＮＡ３．１（−）のＸｂａＩ部位にクローン化してｐＣＤＮＡ−ＶＧｐ（Ｘ／Ｎ）を作製した。ＣＭＶ最初期プロモーターに関する配向をＸｂａＩおよびＳｐｅＩを用いる制限酵素分析により検証した。ＶＥＥＣａｐＦ／ＸｂａＩプライマー（配列番号２９）および３−４２ｐｒ４プライマー（配列番号３０）（表９もまた参照）を用いて標準Ｃヘルパープラスミド（実施例２参照）からＶＥＥキャプシド遺伝子全長をＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩ制限酵素部位でｐＣＤＮＡ−ＶＧｐ（Ｘ／Ｎ）にライゲートしてｐＣＤＮＡ−ＶＳｐを作製した。ＳｐｅＩを用いる制限酵素分析により配向を検証した。

Ｂ．ｐＣＤＮＡ−ＶＳｐでのトランスフェクション
Fugene（登録商標）(Roshe、Indianapolis、インディアナ州)またはLipofectamine（登録商標）2000（LF2K;Gibco-BRL、Gaithersburg、メリーランド州）を用いてｐＣＤＮＡ−ＶＳｐ ＤＮＡ ２０μｇでＴ−１７５フラスコ中の２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、そして細胞を５％ＣＯ₂と共に３７℃で６または２４時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ ８００μｌ中１．２×１０⁷セル／ｍｌで再懸濁した。次いで細胞を、ＧＦＰをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡ ３０μｇと混合し、そして０．４ｃｍギャップ・エレクトロポレーション・キュベットに移した。細胞およびＲＮＡに４５０Ｖおよび２５μＦで３回パルスを与えた。室温で１０分後、細胞をＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳの入ったＴ７５フラスコに播種した。各エレクトロポレーションのサンプルを免疫蛍光分析のために９６ウェルプレートに等分し、そして全細胞を５％ＣＯ₂と共に３７℃でインキュベートした。

エレクトロポレーション後およそ１６時間に９６ウェルプレートの細胞を２％ホルムアルデヒド；０．２％グルタルアルデヒドで固定し、そしてＧＦＰタンパク質発現に関して分析した。また別にサンプルをＭｅＯＨで固定し、そしてＶＥＥキャプシドおよびＧｐタンパク質発現に関してＩＦＡにより分析した。結果をエレクトロポレートされた細胞が発現するタンパク質のパーセンテージとして表１０にまとめる。

ウェスタン分析により、ｐＣＤＮＡ−ＶＳｐで形質転換した細胞におけるキャプシドタンパク質の存在および適切なプロセシングが実証される。

Ｃ．ＤＮＡヘルパーを用いるＧＦＰ発現ＶＲＰ生成
（Ａ．）で記載した構築物の各々を別個にまたは組み合わせで、レポーター（例えばＧＦＰタンパク質）を発現するレプリコン粒子をパッケージングする能力に関して試験した。

１．２９３Ｔ細胞
ＤＮＡ構築物で形質転換した２９３Ｔ細胞をＧＦＰ発現ＲＮＡ ３０μｇでエレクトロポレートした。キャプシドまたはＧｐヘルパーＲＮＡ ３０μｇを各々ＧｐまたはキャプシドＤＮＡのみを受け取る細胞のエレクトロポレーションに含めた。（Ｂ．）に記載したようにレプリコンＲＮＡエレクトロポレーションのおよそ２４時間後に、培養培地を収穫し、そしてスイング・バケット・ローターで、２０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞細片を除去した。上澄を新たな５０ｍｌ コニカル・チューブに移し、そして４℃で保存した。アルファウイルスＧＦＰ−ＶＲＰを含有する、清澄化した培養培地の１０倍連続希釈を調製し、そして各希釈の３０μｌを９６ウェルプレート中のベロ細胞に接種した。細胞を５％ＣＯ₂と共に３７℃で一晩インキュベートし、続いて２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒドで固定した。可能な最低の希釈で５つの視野においてＧＦＰ陽性であった細胞の数を計数することにより力価を決定した。結果を以下の表１１にまとめる。

２．２９３Ｔ細胞におけるＤＮＡトランスフェクションの最適化、それに続くｐＣＤＮＡ−ＶＳｐを用いるエレクトロポレーション
（Ｂ．）に記載したようにレプリコンＲＮＡエレクトロポレーションのおよそ２４時間後、培養培地を収穫し、そしてスイング・バケット・ローターで、２０００ｒｐｍで５分間遠心することにより細胞細片を除去した。上澄を新たな５０ｍｌ コニカル・チューブに移し、そして４℃で保存した。アルファウイルスＧＦＰ−ＶＲＰを含有する、清澄化した培養培地の１０倍連続希釈を調製し、そして各希釈の３０μｌを９６ウェルプレート中のベロ細胞に接種した。細胞を５％ＣＯ₂と共に３７℃で一晩インキュベートし、続いて２％ホルムアルデヒド／０．２％グルタルアルデヒドで固定した。可能な最低の希釈で５つの視野においてＧＦＰ陽性であった細胞の数を計数することにより力価を決定した。結果を以下の表１２にまとめる。

Ｄ．ｐＣＤＮＡ−ＶＳｐヘルパーを用いたＨＩＶ−Ｇａｇ発現ＶＲＰ生成
前記のようにＴ１７５フラスコ中２９３Ｔ細胞をｐＣＤＮＡ−ＶＳｐ ＤＮＡでトランスフェクトし、６時間後に収集し、そして次にＨＩＶ−ＧａｇレプリコンＲＮＡ ３０μｇでエレクトロポレートした(Olmstedら、国際公開公報第02/03917号参照)。エレクトロポレートした細胞をＴ７５フラスコに播種し、そしてサンプルを９６ウェルプレートに等分した。エレクトロポレーション後１６時間に、９６ウェルプレート中のヘルパー細胞のサンプルをメタノールで固定し、そしてＩＦＡによりＨＩＶ−Ｇａｇ、ＶＥＥ キャプシド またはＶＥＥ Ｇｐタンパク質発現に関して分析した。

エレクトロポレートされた細胞から放出されたＶＲＰを含有する培養培地を収集し、そして組換えアルファウイルス粒子収量を決定するために力価を測定した。ＨＩＶ−Ｇａｇ発現ＶＲＰ、ならびにキャプシドおよびＧｐ同時パッケージング／単一組換え体に関する力価をＩＦＡにより決定した（表１３）。

表１３の結果により、ｐＣＤＮＡ−ＶＳｐヘルパーからのＨＩＶ−Ｇａｇ ＶＲＰ力価は、二連性ＲＮＡヘルパー系（「Ｃａｐ／Ｇｐ ＲＮＡ」）で得られた力価の１０分の１未満であるが、パッケージング／組換え頻度は少なくとも３オーダー分だけ減少したことが実証される。

［実施例６］
［分解ＤＮＡヘルパーの構築］
Ａ．分解ＤＮＡヘルパーＡ
本発明のこの実施形態を構築するために、アルファウイルスキャプシドおよび糖タンパク質構造タンパク質遺伝子を単一のヘルパーＤＮＡ分子の２つの別個の位置にクローン化する。第一の位置に在る少なくとも１つの構造遺伝子をＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼII（pol II）プロモーターの直ぐ下流にクローン化する。第一の位置でコードされない１つまたはそれ以上の構造遺伝子は第二の位置に在り、pol IIプロモーターに志向される発現の結果である転写物が下流位置の（複数の）構造タンパク質遺伝子に直ぐの５’でＩＲＥＳエレメントを含有するように、第一の位置の直ぐ下流に位置する。

構築の１つの方法は、これもまた独特の制限酵素部位をコードする構造遺伝子特異的プライマーを用いて、選択されたアルファウイルスキャプシドまたは糖タンパク質構造タンパク質を増幅する第一のＰＣＲを用いる。第一の位置に在る（複数の）構造タンパク質遺伝子をコードする配列を、選択したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼII（pol II）プロモーターに基づく発現ベクターに直接クローン化する。実際にプロモーターに志向される発現の結果である転写物が、第二の位置で（複数の）構造タンパク質遺伝子コード化配列に直ぐの５’でＩＲＥＳエレメントを含有するように、第二の位置に在る（複数の）構造タンパク質遺伝子をコードする配列を最初にＩＲＥＳ配列を含有するトランスファーベクターにクローン化する。

リボザイム配列を挿入するために、リボザイムをコードする重複する相補的プライマーをアニーリングさせて、各々の末端に独特な５’および３’制限部位を有するリボザイムリンカー配列を生成する。次いで、ＩＲＥＳ構造タンパク質遺伝子フラグメントをトランスファーベクターから消化し、第一の位置の（複数の）遺伝子をコードする配列の独特な３’制限部位で、およびＩＲＥＳ構造タンパク質遺伝子ＤＮＡフラグメントの３’部位に適合するさらに下流の別の独特な制限部位でpol II発現ベクターを消化する。リボザイムリンカー配列の末端の適合する５’および３’部位でＩＲＥＳ構造タンパク質遺伝子フラグメントおよびpol II発現ベクターを一緒にライゲートすることにより構築を完了する。

［ＶＥＥヘルパーＡの構築］
ＰＣＲの鋳型として各々ＧＰヘルパーおよびＣヘルパープラスミドを用いて、ＶＥＥ糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子をＧＰ順行（配列番号１）およびＧＰ逆行プライマー（配列番号２）（表１もまた参照）を用いて増幅し、そしてＶＥＥキャプシド（Ｃ）遺伝子をＣ順行（配列番号５）およびＣ逆行プライマー（配列番号６）（表１もまた参照）を用いて増幅する(例えばPushkoら、(1997))。ＶＥＥ ＧＲ ＰＣＲ産物をＮｈｅＩおよびＡｐａＩ制限酵素で消化し、そして同一の制限酵素で直線化された、およびpol IIプロモーター含有の適当なベクター、例えば市販により入手可能なｐＣＤＮＡ３．１(Invitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州；このベクターおよび市販により入手可能なその他のベクターを、哺乳動物細胞培養において購入したプラスミドを使用するために選択することができるマーカーと共に操作するが、特許請求する発明はこのようなマーカーを必要としないので、（複数の）ＶＥＥ構造タンパク質コード配列の挿入の前にそれを除去することに注意されたい)にライゲートする。ｐＣＤＮＡ３．１を用いる場合、次いでＶＥＥ ＧＰ遺伝子をＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーターの下流に配置し、ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｐ１を作製する。

ＶＥＥキャプシドＰＣＲフラグメントをＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、そして同一の制限酵素で直線化した、およびＩＲＥＳとして、例えば市販により入手可能なＸｂａＩ／ＳａｌＩ直線化ｐＩＲＥＳ ＤＮＡ(Clontech、Palo Alto、カリフォルニア州)含有の適当なベクターにライゲートする。この操作によりｐＩＲＥＳ／ｓｐ２を作製する。肝炎デルタリボザイム（ｈｄＲ）をコードする、重複する相補的プライマーｈｄＲ順行（配列番号７）およびｈｄＲ逆行（配列番号８）（表１もまた参照）を一緒にアニーリングして、各々５’および３’末端でＡｐａＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有するｈｄＲリンカー配列を作製する。ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｐ１をＡｐａＩおよびＮｏｔＩ制限酵素で消化することにより、ベクター部分の構築物を生成する。ｐＩＲＥＳ／ｓｐ２ ＤＮＡおよびＡｐａＩ／ＸｈｏＩ ｈｄＲリンカーフラグメントから消化した１５０２塩基対ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ＩＲＥＳ／ｓｐ２フラグメントをＡｐａＩ／ＮｏｔＩ直線化ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｐ１と共にライゲートしてＶＥＥヘルパーＡを作製する。

Ｂ．分解ＤＮＡヘルパーＢおよびＣ
本発明の別の実施形態を構築するために、アルファウイルス構造タンパク質ヘルパーベクター（例えばアルファウイルス５’複製認識配列、アルファウイルス転写プロモーター（ここではヘルパーＢ；例えば２６Ｓアルファウイルスサブゲノムプロモーター）またはリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）（ここではヘルパーＣ；例えばＥＭＣＶ ＩＲＥＳ）のいずれか、上流の（複数の）アルファウイルス構造タンパク質遺伝子をコードする核酸配列、およびアルファウイルス３’複製認識配列を含む）を選択したpol IIプロモーターに基づく発現ベクターに直接クローン化する（実施例５参照）。同時に、下流のフラグメントの（複数の）アルファウイルス構造タンパク質遺伝子をコードする核酸配列を、本明細書で記載したＩＲＥＳ配列を含有するトランスファーベクターにクローン化する。ヘルパーＢを組み立てるために、次にＩＲＥＳ構造タンパク質コード配列フラグメントをトランスファーベクターから消化し、そしてpol IIプロモーターは上流および下流の双方の位置で構造タンパク質の発現を志向するように、放出されたフラグメントをプロモーター発現ベクターにライゲートする。

ヘルパーＢから２つの工程でヘルパーＣを調製する。第一の工程はヘルパーＢから２６Ｓプロモーターを除去するが、その場所に独特な制限部位を導入することである。第二の工程はＩＲＥＳ配列を独特な操作された制限部位にクローン化することである。

［ＶＥＥヘルパーＢの構築］
ＣＭＶ順行プライマー（配列番号９）およびＣＭＶ逆行プライマー（配列番号１０）（表１もまた参照）を用いてＣＭＶ ＩＥプロモーターをｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅する。ＧＰ−２順行プライマー（配列番号３）およびＧＰ−２逆行プライマー（配列番号４）（表１もまた参照）を用いてＶＥＥ５’非コード領域、２６Ｓプロモーター、ＧＰ遺伝子およびＶＥＥ３’非コード領域をＧＰヘルパープライマー（実施例４Ａもまた参照）から増幅する。ＣＭＶ ＩＥ ＰＣＲ産物およびＧＰヘルパーＰＣＲ産物は各々３’および５’末端で５３ｎｔ領域の相同性を有する。この領域の相同性により、重複ＰＣＲ反応によりＧＰヘルパー配列のＶＥＥ５’末端で転写を開始するＣＭＶ ＩＥプロモーターを含有する遺伝子構築物を生成することが可能になる。次いでＣＭＶ ＩＥ／ＧＰヘルパーフラグメントをＮｈｅＩ制限酵素で消化する。pol IIプロモーターに基づくベクターｐＣＤＮＡ３．１をＢｇｌＩＩ制限酵素で直線化し、次にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を生成する。ベクターをさらにＮｈｅＩで消化して、ベクターから既存のＣＭＶ ＩＥおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを放出させる。次いでＮｈｅＩ消化したＣＭＶ ＩＥ／ＧＰヘルパー ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ（Ｔ４処理した）／ＮｈｅＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１ベクターにライゲートしてｐＣＤＮＡ３．１／ｓｐ１．２を作製する。次いでｐＩＲＥＳ／ｓｐ２ ＤＮＡから消化した１０５２塩基対ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ＩＲＥＳ／ｓｐ２フラグメントおよびＡｐａＩ／ＸｈｏＩ ｈｄＲリンカーフラグメントをＡｐａＩ／ＮｏｔＩ直線化ｐＣＤＮＡ３．１／ｓｐ１．２にライゲートしてＶＥＥヘルパーＢを作製する。

［ＶＥＥヘルパーＣの構築］
プライマーの２つのセットを用いてＰＣＲによるヘルパーＢの２６Ｓプロモーターの除去を達成する。プライマーの第一のセット（ｄ２６Ｓ順行（配列番号１１）およびｄ２６Ｓ逆行（配列番号１２）；表１もまた参照）はＣＭＶ ＩＥおよびＶＥＥ ５’非コード領域（ＮＣＲ）を含有するフラグメントを増幅する。ｄ２６Ｓ逆行プライマーは、ＰＣＲ産物に含まれないように、２６Ｓプロモーターから上流でアニーリングする。ＣＭＶ ＩＥ／ＶＥＥ ５’ＮＣＲ ＰＣＲ産物は、ヘルパーＢ ＤＮＡのバックボーンに見出される５’ＰｖｕＩ部位およびＶＥＥ ５’ＮＣＲの３’末端の操作された独特のＡｓｃＩ制限部位をコードする。プライマーの第二のセット（Ｅ３順行（配列番号１３）および６Ｋ逆行（配列番号１４）；表１もまた参照）は、これもまた２６Ｓプロモーターを含有しないＧＰヘルパーのＶＥＥ Ｅ３−６Ｋ領域を含有する生成物を増幅する。Ｅ３−６Ｋ生成物は、操作された５’ＡｓｃＩ部位および６Ｋ遺伝子に見出される独特な３’ＳｇｒＡＩ制限部位を含有する。ＰＣＲ増幅の後、ＣＭＶ ＩＥ／ＶＥＥ ５’ＮＣＲ ＰＣＲ産物をＰｖｕＩおよびＡｓｃＩ制限酵素で消化し、そしてＥ３−６Ｋ産物をＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ制限酵素で消化する。ヘルパーＢ ＤＮＡ（前記を参照）をＰｖｕＩおよびＳｇｒＡＩ制限酵素で消化して、ＣＭＶ ＩＥ／ＶＥＥ ５’ＮＣＲ−２６Ｓ−Ｅ３−６Ｋ領域を放出させる。次いでＰｖｕＩ／ＡｓｃＩ ＣＭＶ ＩＥ／ＶＥＥ ５’ＮＣＲ消化フラグメントおよびＡｓｃＩ／ＳｇｒＡＩ Ｅ３−６Ｋ消化フラグメントをＰｖｕＩ／ＳｇｒＡＩ消化ヘルパーＢベクターとライゲートすることにより、新たなヘルパーを再構成してヘルパーＢ．２を作製する。ヘルパーＢ．２は２６Ｓプロモーターが除去されており、独特なＡｓｃＩ制限部位がそれに置き換わっていることを除いてヘルパーＢと同一である。

双方共に操作された５’ＡｓｃＩ制限部位を含有するＥＭＣＶ順行プライマー（配列番号１５）およびＥＭＣＶ逆行プライマー（配列番号１６）（表１もまた参照）を用いてｐＩＲＥＳベクターからＥＭＣＶ ＩＲＥＳを増幅する。増幅後、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ制限酵素で消化し、ＡｓｃＩ直線化ヘルパーＢ．２ ＤＮＡにライゲートしてヘルパーＣを作製する。

Ｃ．分解ＤＮＡヘルパーＤ
ヘルパーＡを、上流および下流位置でアルファウイルス構造タンパク質のキャップ非依存的翻訳を志向するＩＲＥＳエレメントを含有するように修飾することにより本発明の別の実施形態を構築することができ、本明細書では構築物をヘルパーＤと称する。

［ＶＥＥ ヘルパーＤの構築］
各々操作された５’ＮｈｅＩ制限部位を含有するＥＭＣＶ−２順行プライマー（配列番号１７）およびＥＭＣＶ−２逆行プライマー（配列番号１８）（表１もまた参照）を用いてｐＩＲＥＳベクターからＥＭＣＶ ＩＲＥＳを増幅する。増幅後、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ制限酵素で消化し、ＮｈｅＩ直線化ＶＥＥヘルパーＡにライゲートして、ＶＥＥ ヘルパーＤを作製する。

［実施例７］
［キメラアルファウイルスＲＮＡヘルパー］
Ａ．ＶＥＥ−ＳＩＮヘルパーの構築
ｐＳＩＮｒｅｐ５レプリコンベクター(InVitrogen、Carlsbad、カリフォルニア州)のＸｂａＩ制限部位にＶＥＥ キャプシド遺伝子をクローン化した。ｐＳＩＮｒｅｐ５／ＶＥＥ キャプシド構築物からシンドビスｎｓＰ領域の部分を欠失させることにより、ＶＥＥ キャプシド遺伝子を含有するシンドビスに基づくヘルパーを構築した。ｐＳＩＮｒｅｐ５／ＶＥＥ キャプシドＤＮＡをＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化して、ｎｓＰ遺伝子の６５６７塩基対（ｂｐ）を欠失させることによりｐΔＳＩＮ／ＶＥＥ キャプシド ＤＮＡを調製した。ΔＳＩＮ２６Ｓ／ＲｓｒＩＩ順行（配列番号３１）およびΔＳＩＮ−ＡｐａＩ／逆行（配列番号３２）（表１４もまた参照）を用いてｐΔＳＩＮ／ＶＥＥキャプシドの領域をＰＣＲ増幅し、そしてそれをＲｓｒＩＩおよびＡｐａＩ直線化ｐΔＳＩＮ／ＶＥＥキャプシドＤＮＡにライゲートすることにより、ｎｓＰ領域のさらなる６６７ｂｐを欠く第二のヘルパー構築物（ｐΔＳＩＮ／ＶＥＥｃａｐ−２）を調製した。

Ｂ．キメラアルファウイルスヘルパーを用いるＨＩＶ−Ｇａｇ発現ＶＲＰ生成
ΔＳＩＮ／ＶＥＥキャプシドまたはΔＳＩＮ／ＶＥＥｃａｐ−２ヘルパーを用いてベロ細胞においＶＥＥ Ｇｐ ＲＮＡヘルパー（本明細書で前記したように）およびＶＥＥ ＲＮＡレプリコン発現ＨＩＶ Ｇａｇ遺伝子を伴うＶＲＰを作製した。ΔＳＩＮ／ＶＥＥキャプシドまたはΔＳＩＮ／ＶＥＥｃａｐ−２ヘルパーのいずれかを用いて作製したＨＩＶ−Ｇａｇ ＶＲＰを含有する培養培地を収集し、そしてＨＩＶ−Ｇａｇ ＩＦＡを用いてＶＲＰの収量を決定した。ΔＳＩＮ／ＶＥＥキャプシドヘルパーを用いて、ＶＲＰ力価２．６×１０⁶／ｍｌが得られ；ΔＳＩＮ／ＶＥＥｃａｐ−２ヘルパーを用いて、ＶＲＰ力価１．９×１０⁶／ｍｌが得られた。

［実施例８］
［ノダウイルスに基づくヘルパーＲＮＡの構築］
概して以下のように構築物を生成する。制限酵素部位を導入する遺伝子特異的プライマーを用いてアルファウイルスキャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅産物をノダウイルスＲＮＡ２（フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）またはノダムラ（ＮｏＶ）のいずれかから作製）に直接クローン化し、これを適合する制限酵素で消化する。

［ノダウイルスＶＥＥキャプシドヘルパーの構築］
鋳型としてｐＣＤＮＡ ＶＳｐ（実施例５参照）を用いて、ＭｌｕＩ部位を導入するキャプシドＦ（ＭｌｕＩ）プライマー（配列番号１９）およびキャプシドＲ（ＭｌｕＩ）プライマー（配列番号２０）（表１も参照）でＶＥＥキャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅する。ＶＥＥキャプシドＰＣＲ産物をＭｌｕＩで消化し、ＭｌｕＩ消化ＦＨＶ ＲＮＡ２ベクターおよびＢｓｓＨＩＩ消化ＮｏＶ ＲＮＡ２にライゲートする。ＢｓｓＨＩＩ消化によりＭｌｕＩに適合する付着末端が生成される。得られたクローンをシークエンシングして配向を決定し、配列の精度を検証する。

また別に、ＶＥＥキャプシド遺伝子をＦＨＶ ＲＮＡ２のＮｃｏＩおよびＭｌｕＩ部位およびＮｏＶ ＲＮＡ２のＮｃｏＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位に方向性をもってクローン化することができる。このＮｃｏＩ部位は各々ＦＨＶおよびＮｏＶ ＲＮＡ２のＭｌｕＩまたはＢｓｓＨＩＩ部位に対して５’であり、１ヌクレオチドにより分けられている。鋳型としてｐＣＤＮＡ ＶＳｐ（実施例５参照）を用いて、ＮｃｏＩ部位を含有する２つの順行プライマー、キャプシドＦ１（ＮｃｏＩ）（配列番号２１）およびキャプシドＦ２（ＮｃｏＩ）（配列番号２２）の１つ、ならびにＭｌｕＩ部位を含有する逆行プライマーであるキャプシドＲ（ＭｌｕＩ）（配列番号２０）を用いてＶＥＥキャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅する。得られたＶＥＥキャプシド１およびＶＥＥキャプシド２ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＭｌｕＩで消化し、そしてＮｃｏＩ／ＭｌｕＩ消化ＦＨＶ ＲＮＡ２ベクターおよびＮｃｏＩ／ＢｓｓＨＩＩ消化ＮｏＶ ＲＮＡ２ベクターにライゲートする。

加えて、適当なプライマーを用いて前記したようにＶＥＥ糖タンパク質遺伝子および全ＶＥＥ構造タンパク質遺伝子カセットをＦＨＶ ＲＮＡ２およびＮｏＶ ＲＮＡ２発現ベクターにクローン化することができる。

本明細書で記載したノダウイルスキャプシドヘルパーを２８ＣでＲＮＡ１、ＶＥＥ ＧＰヘルパー(例えばPushkoら、前出(1997))およびＨＩＶ ｇａｇタンパク質を発現するＶＥＥ ＲＮＡレプリコン(Olmstedら、国際公開公報第02/03917号)と共にベロ細胞に同時エレクトロポレートする。ＦＨＶ ＲＮＡ１および２を用いる場合、組換えアルファウイルス粒子収量はｍｌあたり４．３×１０⁶であった。Ｎｏｖ ＲＮＡ１および２を用いる場合、粒子収量はｍｌあたりおよそ２×１０⁵であった。

［実施例９］
［ＤＮＡまたはＲＮＡヘルパーを用いるレプリコン粒子の生成］
当分野で一般に公知のいくつかの異なる技術、例えばエレクトロポレーション、トランスフェクション（例えばリン酸カルシウム沈殿またはマイクロビーズもしくはナノ粒子への核酸沈着を用いる）、脂質媒介のＤＮＡ取り込み、マイクロもしくはナノプロジェクタイル、安定した形質転換、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、ＳＶ４０、ポックスウイルス（例えば修飾されたワクシニア・アンカラ）、ノダウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスへの取り込み、またはウイルスベクター例えばアデノウイルスへのコーティングによる、の１つまたはそれ以上により、レプリコンＲＮＡおよびヘルパー核酸をヘルパー細胞に導入することができる。ＤＮＡヘルパー核酸およびＲＮＡレプリコンの組み合わせを用いる場合、異なる技術を用いて異なる回数でこれらの分子を導入することができる。タイミングの差により、細胞による回復のための時間を提供することができ、そしてＲＮＡベクターと比較して、ＤＮＡベクターからの発現の異なった動態を最適化することも可能になる。各核酸分子の細胞への導入の間のタイミングは３０分、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または２４時間でよい。異なる手段による、そしてレプリコンＲＮＡ（および、必要に応じてヘルパーＲＮＡ）のエレクトロポレーションの前の（複数の）ＤＮＡヘルパーの導入は、ＲＮＡエレクトロポレーションの効率に有意な有害な影響を及ぼさない。

［ＤＮＡヘルパーのトランスフェクション］
脂質媒介
Fugene（登録商標）６(Boehringer Mannheim、Indianapolis、インディアナ州)を用いるリポフェクションにより、２９３Ｔ、ベロまたはＤＦ１細胞を最初にＤＮＡヘルパーでトランスフェクトする。１０％ＦＢＳを含有する培地中、FugeneおよびＤＮＡの存在下で細胞を１から２４時間インキュベートする。インキュベーションの後、それをＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシン処理することにより収集する。

エレクトロポレーション
市販により入手可能なカチオン脂質、例えばＦｕＧＥｎｅおよびLipofectamineを用いるＤＮＡのベロ細胞へのトランスフェクションは典型的には効率が悪い（〜１％効率）。これらの方法は特定の適用には十分ではあるが、ＤＮＡヘルパーのベロ細胞へのエレクトロポレーションは好ましい代替研究法である。エレクトロポレーション法の種々のパラメーターを最適化してベロ細胞へのＤＮＡの進入の効率を高めることができる。

例えば、精製されたＤＮＡ構築物を使用するのが好ましい。例えば、高純度のマキシプレップ系（例えばQiagen（登録商標）；Promega Corporation、Madison、ウィスコンシン州)を用いて、ＣＭＶプロモーターの調節下で遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを最初に単離する。このような最初に精製されたＤＮＡを臭化エチジウムおよび高塩の存在下でフェノール抽出することによりさらに精製するのが好ましい(参照文献:Stemmer,W.P.、Biotechniques 10(6):726(1991年6月))。エレクトロポレーションの前にこのさらに精製されたＤＮＡをヌクレアーゼ不含水に再懸濁する。

ベロ細胞の培養条件に関与する別の最適化工程をＤＮＡのエレクトロポレーションに関して最適化できる。最初にベロ細胞をＥＭＥＭ培地で培養し、そして後期対数期まで成長させ、次いでトリプシン処理により収穫し、Invitrus（登録商標）(Cell Culture Technologies GmBh、Zurich、スイス)で２回洗浄し、そしてInvitrus培地８００μｌに再懸濁する。

このInvitrus浴させた細胞を最適量の精製されたＤＮＡ（典型的には、１０μｇから２００μｇの範囲の濃度）と組み合わせ、そして次に０．４ｃｍ²ギャップ・キュベットに移す。Biorad Gene Pulser（登録商標）(BioRad Laboratories,Inc.、Hercules、カリフォルニア州)を用いて５０μＦ、４パルスで、電圧の範囲にわたって（５００から７００Ｖ）エレクトロポレーションを実施する。エレクトロポレーションの後、ベロ細胞を６ウェルプレートに播種し、そして５％ＣＯ₂と共に３７℃で２４時間インキュベートした。

最適化パラメーターを決定する場合、エレクトロポレーション後１６および２３時間に最初にタンパク質の発現を分析する。１％から４０％の範囲にわたるトランスフェクトされた細胞のパーセンテージにより前記パラメーターを変化させる；パラメーターの最適化セットの実例は、精製されたプラスミドＤＮＡ １５０μｇおよび６５０Ｖ、５０μＦで４回パルスを与えることである。加えて、典型的にはエレクトロポレーション後１７から２３時間の間にさらに５から１０％発現が増加する。

細胞サイクルの特定の相においてベロ細胞を同調させることによりエレクトロポレーション効率を増強させることもできる。一例では、エレクトロポレーションの前にアフィジコリン（１ｍｇ／ｍｌ）でＧ２／Ｍ相で細胞を同調させる(Golzio,M.、Biochem Biophys Acta 1563(1-2):23-28(2002年6月13日))。これらの同調化細胞を前記したように取り扱い、そしてエレクトロポレーションの前にプラスミドＤＮＡ ５０μｇと組み合わせる。この実例では、アフィジコリン処理細胞は未処理（同調化していない）細胞と比較して、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの２倍の増加を示す。

アルファウイルスレプリコンＲＮＡのエレクトロポレーション
本発明のＤＮＡヘルパーの導入の後、次に以下の条件下、レプリコンＲＮＡおよび適当なヘルパーＲＮＡ（必要な場合）の存在下で１．２×１０⁷セルをエレクトロポレートする。４５０Ｖ（２９３Ｔ）または８５０Ｖ（ベロおよびＤＦ１）および０．４ｃｍギャップ・エレクトロポレーション・キュベット中２５μＦ（パルス間４秒で３回パルスを与える）。次にエレクトロポレートされた細胞を１０分間回復させた後、１０％ＦＢＳを含有する培地２５ｍｌに播種する。

ＲＮＡレプリコンおよびＲＮＡヘルパー組み合わせを用いる場合、全てのＲＮＡを同じ時間にヘルパー細胞に同時エレクトロポレートすることができる。ＲＮＡエレクトロポレーションの方法は前記したとおりである。また別の実施形態では、エレクトロポレーションを介してＤＮＡヘルパーをヘルパー細胞に導入する場合、レプリコンＲＮＡをＤＮＡヘルパーと共に同時エレクトロポレートすることができる。

配列表

Claims (19)

1. アルファウイルス許容細胞中に
   （ｉ）完全なアルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列（ただし、ＤＮＡ配列は、アルファウイルス５’および３’複製認識配列ならびにアルファウイルスサブゲノムプロモーターをコードしない）に作動可能なように連結されたＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を指向するための構成性プロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を一過的に発現するための組換えＤＮＡ分子と；
   （ｉｉ）少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡと;
   を含む、感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を産生するためのヘルパー細胞。
2. 前記細胞が、２９３、ＢＨＫ、ベロ、ＣＨＯ、ＣＥＦおよびＤＦ−１細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のヘルパー細胞。
3. アルファウイルス構造タンパク質が、ＶＥＥ構造タンパク質、シンドビス構造タンパク質、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６構造タンパク質、セミリキ森林ウイルス構造タンパク質およびロスリバーウイルス構造タンパク質からなる群から選択される、請求項１または２に記載のヘルパー細胞。
4. アルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列が、１つまたはそれ以上の弱毒変異を含む、請求項１〜３に記載のヘルパー細胞。
5. （ｉ）完全なアルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列（ただし、ＤＮＡ配列は、アルファウイルス５’および３’複製認識配列ならびにアルファウイルスサブゲノムプロモーターをコードしない）に作動可能なように連結されたＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を指向するための構成性プロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を一過的に発現するための組換えＤＮＡ分子と、（ｉｉ）少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡとを、アルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列が前記ＤＮＡ分子から一過的に発現し、アルファウイルス構造タンパク質を産生して感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子が生成される条件下で、細胞の集団に一過的に導入するステップを含む、感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を生成する方法。
6. 前記組換えＤＮＡ分子が、前記細胞の集団にエレクトロポーレーションにより導入される請求項５に記載の方法。
7. （ｉ）少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質コード配列をコードするＤＮＡ配列（ただし、当該ＤＮＡ配列は、アルファウイルス５’および３’複製認識配列ならびにアルファウイルスサブゲノムプロモーターをコードしない）に作動可能なように連結されたＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を指向するための構成性プロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を一過的に発現するための第一の組換えＤＮＡ分子と、
   （ｉｉ）前記第一の組換えＤＮＡ分子の少なくとも一つのアルファウイルス構造タンパク質コード配列中に存在しない少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質コード配列をコードするＤＮＡ配列（ただし、当該ＤＮＡ配列は、アルファウイルス５’および３’複製認識配列ならびにアルファウイルスサブゲノムプロモーターをコードせず、前記第一および第二の組換えＤＮＡ分子が、全体として、全てのアルファウイルス構造タンパク質をコードする）に作動可能なように連結されたＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を指向するための構成性プロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を一過的に発現するための第二の組換えＤＮＡ分子と、
   （ｉｉｉ）少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡと
   を、前記第一および第二の組換えＤＮＡ分子が自律的プラスミドから発現し、前記アルファウイルス構造タンパク質コード配列が前記第一および第二の組換えＤＮＡ分子から一過的に発現し、アルファウイルス構造タンパク質を産生して感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子が生成される条件下で、細胞の集団に一過的に導入するステップであって、前記第一および第二の組換えＤＮＡ分子が、エレクトロポーレーションによって細胞の集団に導入される、ステップを含む、感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子を生成する方法。
8. 前記細胞の集団が、２９３、ＢＨＫ、ベロ、ＣＨＯ、ＣＥＦおよびＤＦ−１細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記第一の組換えＤＮＡ分子の前記アルファウイルス構造タンパク質が、ＶＥＥ構造タンパク質、シンドビス構造タンパク質、Ｓ．Ａ．ＳＲ８６構造タンパク質、セミリキ森林ウイルス構造タンパク質およびロスリバーウイルス構造タンパク質からなる群から選択される、請求項７または８に記載の方法。
10. 前記第二の組換えＤＮＡ分子の前記アルファウイルス構造タンパク質が、ＶＥＥ構造タンパク質、シンドビス構造タンパク質、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６構造タンパク質、セミリキ森林ウイルス構造タンパク質およびロスリバーウイルス構造タンパク質からなる群から選択される、請求項７または８に記載の方法。
11. 少なくとも前記第一の組換えＤＮＡ分子もしくは前記第二の組換えＤＮＡ分子、または前記第一および第二の組換えＤＮＡ分子の双方の前記アルファウイルス構造タンパク質コード配列が、１つまたはそれ以上の弱毒変異を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記細胞の集団が、２９３、ＢＨＫ、ベロ、ＣＨＯ、ＣＥＦおよびＤＦ−１細胞からなる群から選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記アルファウイルス構造タンパク質が、ＶＥＥ構造タンパク質、シンドビス構造タンパク質、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６構造タンパク質、セミリキ森林ウイルス構造タンパク質およびロスリバーウイルス構造タンパク質からなる群から選択される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記アルファウイルス構造タンパク質コード配列が、１つまたはそれ以上の弱毒変異を含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. （ｉ）完全なアルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列を含むＤＮＡ配列（ただし、ＤＮＡ配列は、アルファウイルス５’および３’複製認識配列ならびにアルファウイルスサブゲノムプロモーターをコードしない）に作動可能なように連結されたＤＮＡ配列からのＲＮＡの転写を指向するための構成性プロモーターを含む、アルファウイルス構造タンパク質を一過的に発現するための組換えＤＮＡ分子と、（ｉｉ）少なくとも１つの異種性ＲＮＡをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡとを、アルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列が前記ＤＮＡ分子から一過的に発現し、アルファウイルス構造タンパク質を産生し、感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子の集団が生成される条件下で、細胞の集団に一過的に導入するステップを含む、二連性ＲＮＡヘルパー系の使用により産生された感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子の集団と比べて、組み換え／パッケージングの減少した頻度を有する感染性の複製欠損アルファウイルスレプリコン粒子の集団を生成する方法。
16. 前記細胞の集団が、２９３、ＢＨＫ、ベロ、ＣＨＯ、ＣＥＦおよびＤＦ−１細胞からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記アルファウイルス構造タンパク質が、ＶＥＥ構造タンパク質、シンドビス構造タンパク質、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６構造タンパク質、セミリキ森林ウイルス構造タンパク質およびロスリバーウイルス構造タンパク質からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記アルファウイルス構造ポリタンパク質コード配列が、１つまたはそれ以上の弱毒化変異を含む、請求項１５〜１７に記載の方法。
19. 前記組換えＤＮＡ分子が、前記細胞の集団にエレクトロポーレーションにより導入される、請求項１５〜１８に記載の方法。