JP5268196B2 - キメラアルファウイルスレプリコン粒子 - Google Patents

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Description

（技術分野）
本発明は、一般にキメラアルファウイルスに関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１つのアルファウイルス由来のＲＮＡおよび少なくとも２つの異なるアルファウイルス由来の１つ以上の構造エレメント（キャプシドおよび／またはエンベロープ）を有するキメラアルファウイルスの調製に関する。本発明のキメラアルファウイルスは、治療適用または予防適用を有する異種遺伝子のエキソビボ投与およびインビボ投与において有用である。
（背景）
アルファウイルスは、遺伝的、構造的および血清学的に関連するＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーの節足動物提示（ｂｏｒｎｅ）ウイルスの１つのセットを含む。２６個の公知のウイルスおよびウイルスサブタイプが、アルファウイルス属（シンドビスウイルス、セミリキ森林ウイルス、ロス川ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む）に分類される。
シンドビスウイルスは、ＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーのＡｌｐｈａｖｉｒｕｓ属のプロトタイプのメンバーである。その複製ストラテジーは、種々の培養細胞において十分特徴付けられており、他のアルファウイルスについてのモデルとして働く。簡単には、シンドビスウイルス（他のアルファウイルスと同様）のゲノムは、キャップおよびポリアデニル化されている約１２ｋｂの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡ分子であり、ウイルスコードキャプシドタンパク質シェル内に含まれる。核キャプシドはさらに、宿主由来脂質エンベロープによって囲まれ、ここに２つのウイルス特異的糖タンパク質Ｅ１およびＥ２が挿入され、そして細胞質テールによってこの核キャプシドにアンカーされる。特定のアルファウイルス（例えば、ＳＦＶ）はまた、Ｅ２前駆体タンパク質ＰＥ２の切断産物である、さらなるタンパク質Ｅ３を維持する。
ウイルス粒子の標的細胞への吸収、侵入、およびウイルスゲノムＲＮＡの細胞質への核キャプシドの放出に対する非コート化の後、複製プロセスは、そのウイルスゲノムの５’側の２／３から翻訳される、４つのアルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ）を介して生じる。全長ネガティブ鎖ＲＮＡの合成は、さらなるポジティブ鎖ゲノムＲＮＡの合成についてのテンプレート、および連結領域プロモーターで内在的に開始される異常に発現される２６ＳサブゲノムＲＮＡを順々に提供する。アルファウイルス構造タンパク質は、ｎｓＰのように、そのゲノムの３’側の１／３を示すサブゲノム２６Ｓ ＲＮＡより翻訳され、その個々のタンパク質に翻訳後修飾的にプロセスされる。
アルファウイルス属のいくつかのメンバーは、ワクチンおよび治療剤としての用途のための「レプリコン」発現ベクターとして開発されてきた。レプリコンベクターは、いくつかの形式（ＤＮＡ、ＲＮＡおよび組換えレプリコン粒子）において使用され得る。このようなレプリコンベクターは、例えば、シンドビスウイルス（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、セミリキ森林ウイルス（非特許文献５；非特許文献６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（非特許文献７）を含むアルファウイルスから誘導された。文献の広範な内容（ｂｏｄｙ）は、ワクチン（例えば、非特許文献２；非特許文献６；非特許文献３、非特許文献７；非特許文献４；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照のこと）のような適用についてのアルファウイルスレプリコンベクターの効率を現在実証している。一般にいうと、「レプリコン」粒子は、自己複製する核酸を含有するウイルス粒子をいう。レプリコン粒子自体は、一般に複製無能または複製「欠損」とみなされ、これは、細胞をレプリコン粒子で感染させる場合に子孫レプリコン粒子が生じない。数年を経て、レプリコン粒子を記載するために使用されるいくつかの同義語が、現れてきた。これらの用語としては、組換えウイルス粒子、組換えアルファウイルス粒子、アルファウイルスレプリコン粒子およびレプリコン粒子が挙げられる。しかし、本明細書中で使用される場合、これらの用語は全て、ウイルス由来ＲＮＡベクターレプリコン（特に、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン）を含むビリオン様単位をいう。さらに、これらの用語は、ベクター、ベクター構築物または遺伝子送達ベクターとしてひとまとめにしていわれ得る。
現在、いくつかのアルファウイルスが、ワクチンおよび他の治療適用のための遺伝子送達系として開発されている。全ての特性（例えば、構造、複製）において概して非常に類似するが、個々のアルファウイルスは、独特な、いくつかの特定の特性（例えば、レセプター結合、インターフェロン感受性および疾患プロファイル）を示し得る。各ウイルス由来の最も好ましい特性を利用するために、キメラレプリコン粒子アプローチが開発されてきた。特に、キメラアルファウイルスレプリコン粒子は、１つのウイルス由来のＲＮＡおよび異なるウイルス由来の１つ以上の構造成分を有し得る。このウイルス成分は、一般に非常に関連したウイルス由来であるが、多様なウイルスファミリーから作製されるキメラウイルス粒子が可能である。
キメラアルファウイルスレプリコン粒子が作製され得ることが以前に実証され、ここで、このＲＮＡベクターは、第１のアルファウイルス由来であり、そしてその構造「コート」タンパク質（例えば、エンベロープ糖タンパク質）は、第２のアルファウイルス由来である（例えば、米国特許出願番号０９／２３６，１４０を参照のこと；米国特許第５，７８９，２４５号、同第５，８４２，７２３号、同第５，７８９，２４５号、同第５，８４２，７２３号および同第６，０１５，６９４号；ならびにＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９７／３８０８７およびＷＯ９９／１８２２６を参照のこと）。しかし、以前に記載されたストラテジーはいくつかのアルファウイルスキメラを作製するために首尾よいが、このようなキメラ粒子は、商業的に実行可能な収量で常には産生されない。これは、おそらく、生産性の減少を生じるウイルスＲＮＡと構造タンパク質との間の効率的でない相互作用に起因する。
従って、キメラレプリコン粒子およびレプリコンを含む組成物、キメラレプリコン粒子およびレプリコンを作製する方法ならびにキメラレプリコン粒子を使用する方法（例えば、変更された細胞親和性および組織親和性ならびに／または構造タンパク質表面抗原性を有する遺伝子送達ビヒクルとしての使用）についての必要性が存在する。
Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９ Ｈａｒｉｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８ Ｐｏｌｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＰＮＡＳ ９６：４５９８−４６０３ Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３５６−１３６１ Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５６２−５６５ Ｐｕｓｈｋｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１ Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７４：３７１−３７８ Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｄｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４３４−４３９ Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：４９７−５０７
（要旨）
本発明は、キメラアルファウイルスおよびアルファウイルスレプリコン粒子を含む組成物、ならびにこれらの粒子を作製および使用する方法に関する。
１つの局面において、本発明は、以下を含むキメラアルファウイルス粒子を提供する：１つ以上のアルファウイルス由来のＲＮＡ；および構造タンパク質（ここで、この構造タンパク質の少なくとも１つは、２つ以上のアルファウイルス由来である）。特定の実施形態において、ＲＮＡは、第１のアルファウイルス由来であり、構造タンパク質は、以下を含む：（ａ）以下を有するハイブリッドキャプシド：（ｉ）上記の第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質相互作用ドメインを有するハイブリッドキャプシドタンパク質；ならびに（ｂ）上記の第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質。他の実施形態において、ＲＮＡは、第１のアルファウイルス由来であり、構造タンパク質は、以下を含む：（ａ）第１のアルファウイルス由来のキャプシドタンパク質；ならびに（ｂ）以下を有するエンベロープ糖タンパク質：（ｉ）細胞質テール部分、および（ｉｉ）残りの部分（ここで、細胞質テール部分は、上記の第１のアルファウイルス由来であり、残りの部分は、第２のアルファウイルス由来である）。核酸は、同一のウイルス由来のウイルスキャプシド内に含まれる第１のウイルス由来であるが、第２のウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質成分を有する。なおさらなる実施形態において、キメラ粒子は、ハイブリッドキャプシドタンパク質およびハイブリッドエンベロープタンパク質を含む。さらに、ハイブリッドタンパク質は、典型的には、第１のアルファウイルス由来の少なくとも１つの機能ドメインを含むが、そのタンパク質の残りの部分は、１つ以上のよりさらなるアルファウイルス由来（例えば、この第１のウイルス、第２のウイルスまたは２つ以上のウイルスの組み合わせ由来のエンベロープ糖タンパク質成分）である。残りの部分は、異なるアルファウイルス由来の配列の２５％〜１００％（またはその間の任意の値）を含み得る。
従って、本発明の改変された（またはキメラの）アルファウイルスレプリコン粒子としては、以下が挙げられるがこれに限定されない：（例えば、欠損ヘルパーまたは他の構造タンパク質遺伝子発現カセットによって提供される）２つ以上のアルファウイルス由来の少なくとも１つの構造エレメント（キャプシドおよび／またはエンベロープタンパク質）内に含まれる、１つ以上のアルファウイルス由来の核酸から構成されるレプリコン粒子（レプリコンベクターにより提供される）。例えば、キメラ粒子は、第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ、第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ結合ドメインを有するハイブリッドキャプシドタンパク質、および第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質相互作用ドメイン、ならびに第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を含む。他の実施形態において、本発明の粒子は、第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ、この第１のアルファウイルス由来のキャプシドタンパク質、およびこの第１のアルファウイルス由来の細胞質テールを第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質の残りの部分とともに有するエンベロープ糖タンパク質を含む。さらに別の実施形態において、キメラアルファウイルス粒子は、第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ、（例えば、欠失した非構造タンパク質遺伝子領域に）挿入された第２のアルファウイルス由来のパッケージングシグナルを有するＲＮＡ、ならびに第２のアルファウイルス由来のキャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を含む。
別の局面において、本発明は、以下を含むキメラアルファウイルス粒子に関する：（ａ）第１のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質をコードするＲＮＡ、およびこの第１のアルファウイルスとは異なる第２のアルファウイルス由来のパッケージングシグナル（例えば、ｎｓＰ３とｎｓＰ４との連結部、ｎｓＰ４のオープンリーディングフレームの後、および非構造タンパク質遺伝子における欠失からなる群より選択される部位に挿入される、パッケージングシグナル）；（ｂ）上記の第２のアルファウイルス由来のキャプシドタンパク質；ならびに（ｃ）上記の第１のアルファウイルスとは異なるアルファウイルス由来のエンベロープタンパク質。特定の実施形態において、エンベロープタンパク質は、第２のアルファウイルス由来である。
本明細書中に記載される任意のキメラ粒子において、ＲＮＡは、５’から３’の順番に以下を含む：（ｉ）非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’配列、（ｉｉ）アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）異種核酸を発現する手段（例えば、ウイルス連結領域プロモーター）、（ｉｖ）異種核酸配列（例えば、免疫原）、（ｖ）非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’配列、および（ｖｉ）ポリアデニル化トラクト。特定の実施形態において、異種核酸配列は、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子を置換する。さらに、本明細書中に記載される任意の実施形態において、キメラは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）由来の配列から構成され、例えば、ここで、この第１のアルファウイルスがＶＥＥであり、この第２のアルファウイルスがＳＩＮであるか、またはここで、この第１のアルファウイルスがＶＥＥであり、この第２のアルファウイルスがＳＩＮである。
他の局面において、本発明は、以下を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡに関する：非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、非アルファウイルス異種性配列、および非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’配列。ここで、上記非構造タンパク質の少なくとも１つは、バイオセイフティーレベル３（ＢＳＬ−３）アルファウイルス由来であり、ここで、上記のレプリコンＲＮＡの配列は、ＢＳＬ−３アルファウイルスのゲノムの少なくとも１／３（であるが２／３未満で）に同一である配列を示す。特定の実施形態において、これらのレプリコンのｃＤＮＡコピーは、真核生物階層ベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＬＶＩＳ））中の核酸ベクター配列（例えば、真核生物細胞中でｃＤＮＡからＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーターを含有するＥＬＶＩＳベクター）、および自身の複製を指向し得異種性配列を発現し得る核酸ベクター配列として含まれる。このＢＳＬ−３アルファウイルスは、例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）であり得る。
本明細書中に記載される任意のキメラ粒子およびレプリコンにおいて、ＲＮＡは、異種核酸配列（例えば、治療剤または免疫原（抗原））をさらに含み得る。この異種核酸配列は、構造タンパク質コード配列を複製し得る。さらに、この異種ヌクレオチド配列は、例えば、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌または寄生体のような感染性因子）由来のポリペプチド抗原をコードし得る。好ましい実施形態において、抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来（例えば、ｇａｇ、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｔａｔおよびｎｅｆ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来（例えば、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）、インフルエンザウイルス由来（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルスまたはＲＳウイルスまたは麻疹ウイルス）由来（例えば、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｈ）、ヘルペスウイルス由来（例えば、糖タンパク質Ｂ、糖タンパク質Ｄ）、フラビウイルス（例えば、マールブルグウイルスまたはエボラウイルス）由来（例えば、ＮＰ、ＧＰ）、ブンヤウイルス（例えば、ハンターンウイルスまたはリフトバレー熱ウイルス）由来（例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｎ）、またはフラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルス）由来（例えば、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ３、ＮＳ５）である。本明細書中に記載される任意の組成物または方法において、ＲＮＡは、非構造タンパク質３遺伝子（ｎｓＰ３遺伝子）の欠失した非必須領域内に挿入された第２のアルファウイルス由来のパッケージングシグナルをさらに含む。
別の局面において、アルファウイルスレプリコン粒子を調製（産生）する方法が提供される。特定の実施形態において、粒子は、この粒子の形成を可能にする条件下で適切な宿主細胞に本明細書中に記載される任意のレプリコンおよび欠損ヘルパーＲＮＡを導入することによって調製される。本明細書中に記載される任意の方法において、この欠損ヘルパーＲＮＡは、本明細書中に記載されるようなキメラおよび／またはハイブリッド構造タンパク質（またはこれらのキメラ／ハイブリッドタンパク質をコードする配列）を含み得る。例えば、特定の実施形態において、本方法は、以下を宿主細胞に導入する工程を包含する：（ａ）１つ以上のアルファウイルス由来のアルファウイルスレプリコンＲＮＡ（１つ以上の異種性配列をさらに含む）；および（ｂ）このレプリコンＲＮＡには存在しない構造タンパク質をコードする少なくとも１つの別々の欠損ヘルパーＲＮＡ。ここで、この構造タンパク質の少なくとも１つは、２つ以上のアルファウイルス由来であり、ここで、アルファウイルスレプリコン粒子が産生される。レプリコンＲＮＡは、１つ以上のアルファウイルス由来であり得、この構造タンパク質は、１つ以上のハイブリッドタンパク質（例えば、第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ結合ドメインを有するハイブリッドキャプシドタンパク質、および第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質相互作用ドメイン）；ならびに／または細胞質テールタンパク質および残りの部分を有するハイブリッドエンベロープタンパク質を含み得る。ここで、この細胞質テール部分は、第１のアルファウイルス由来であり、上記のエンベロープ糖タンパク質の残りの部分は、上記の第１のアルファウイルスとは異なる１つ以上のアルファウイルス由来である。
さらに別の局面において、本発明は、以下を宿主細胞に導入する工程を包含する、アルファウイルスレプリコン粒子を産生するための方法を提供する：（ａ）第１のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質、（例えば、ｎｓＰ３とｎｓＰ４との連結部、ｎｓＰ４のオープンリーディングフレームの後、および非構造タンパク質遺伝子における欠失からなる群より選択される部位に挿入される）第２のアルファウイルス由来のパッケージングシグナル、および１つ以上の異種性配列をコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡ；ならびに（ｂ）このレプリコンＲＮＡには存在しない構造タンパク質をコードする少なくとも１つの別々の欠損ヘルパーＲＮＡ。ここで、この構造タンパク質の少なくとも１つは、この第２のアルファウイルス由来のキャプシドタンパク質であり、この構造タンパク質の少なくとも１つは、この第１のアルファウイルスとは異なるアルファウイルス由来のエンベロープタンパク質である。
なお別の局面において、本発明は、１つ以上の構造タンパク質をコードする配列を含む１つ以上の構造タンパク質発現カセットを含むアルファウイルスパッケージング細胞株に関し、ここで、少なくとも１つのこの構造タンパク質は、２つ以上のアルファウイルス由来である。特定の実施形態において、１つ以上の構造タンパク質発現カセットは、欠損ヘルパーＲＮＡのｃＤＮＡコピー、および必要に応じて、アルファウイルスサブゲノムプロモーターを含む。さらに、これらの実施形態のいずれかにおいて、欠損ヘルパーＲＮＡは、構造タンパク質の発現を指向し得る。
なお別の局面において、パッケージング細胞株を使用するウイルスレプリコン粒子を産生する方法が提供される。典型的には、本方法は、任意のアルファウイルスパッケージング細胞株に本明細書中に記載されるアルファウイルスレプリコンＲＮＡのいずれかを導入する工程を包含し、ここで、１つ以上の異種性ＲＮＡ配列を含むアルファウイルス粒子が産生される。よって、特定の実施形態において、このＲＮＡは、異なるアルファウイルス由来のパッケージングシグナル挿入を含む。他の実施形態において、パッケージング細胞は、３つの別々のＲＮＡ分子（例えば、第１の欠損へＲＮＡ分子は、ウイルスキャプシド構造タンパク質をコードし、第２の欠損ヘルパーＲＮＡ分子は、１つ以上のウイルスエンベロープ構造糖タンパク質をコードし、そして必要とされる非構造レプリカーゼタンパク質をコードする遺伝子およびウイルス構造タンパク質で置換された目的の異種性遺伝子を含む第３のレプリコンＲＮＡベクター）を含み、ここで、これらのＲＮＡ分子の少なくとも１つは、２つ以上のアルファウイルス由来の配列を含む。改変は、キメラアルファウイルスレポーター粒子を生成する目的で細胞（例えば、パッケージング細胞）に導入される別々の核酸分子のいずれか１つ以上になされ得る。例えば、本明細書中で記載されるようなハイブリッドキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を有する第１の欠損ヘルパーＲＮＡが、調製され得る。１つの実施形態において、ハイブリッドキャプシドタンパク質は、第１のアルファウイルス由来のＲＮＡ結合ドメイン、および第２のアルファウイルス由来の糖タンパク質相互作用ドメインを有する。第２の欠損ヘルパーＲＮＡは、第２のアルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子を有し得るが、レプリコンベクターＲＮＡは、第１のアルファウイルス由来である。他の実施形態において、ＲＮＡレプリコンベクター構築物は、第２のアルファウイルス由来のパッケージングシグナルを有する第１のアルファウイルス由来であり、例えば、欠失された非構造タンパク質遺伝子領域内に挿入される。第１および第２の欠損ヘルパーＲＮＡは、第２のアルファウイルス由来のキャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有する。他の実施形態において、キメラアルファウイルスレプリコン粒子は、キャプシドタンパク質（レプリコンベクター供給源ウイルスと同一である第１のアルファウイルス由来）をコードする第１の欠損ヘルパーＲＮＡ、ならびに第１のヘルパーＲＮＡのキャプシドタンパク質と同一のアルファウイルス由来の細胞質テールフラグメントおよび第２のアルファウイルス由来の糖タンパク質の表面曝露「エクトドメイン」を有するハイブリッドエンベロープ糖タンパク質をコードする第２の欠損ヘルパーＲＮＡを使用して作製される。このテールフラグメントは、第１のウイルス由来のＲＮＡおよびキャプシドを有するキャプシドタンパク質およびキメラレプリコン粒子と相互作用し、そして主に第２のウイルスに由来するエンベロープが生じる。
別の局面において、本発明は、アルファウイルスレプリコン粒子を産生するための方法を提供し、この方法は、以下を許容される細胞に導入する工程：（ａ）制御エレメントおよび以下をコードするポリペプチドコード配列を含む、本明細書中に記載されるアルファウイルスレプリコンＲＮＡのいずれか：（ｉ）生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質および（ｉｉ）異種性タンパク質；ならびに（ｂ）制御エレメントおよび少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードするポリペプチドコード配列を含む１つ以上の欠損ヘルパーＲＮＡ（ここで、この制御エレメントは、５’から３’の方向に、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、ポリペプチドコード配列を発現する手段、および非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列を含み得、そしてさらにここで、１つ以上の上記のＲＮＡレプリコン制御エレメントは、上記の欠損ヘルパーＲＮＡ制御エレメントとは異なる）、そしてレポーター粒子の産生を可能にするに十分な時間にわたって適切な条件下で上記の細胞をインキュベートする工程を包含する。特定の実施形態において、レプリコンＲＮＡおよび上記の欠損ヘルパーＲＮＡはさらに、サブゲノム５’−ＮＴＲを含む。他の実施形態において、レプリコンＲＮＡのサブゲノム５’−ＮＴＲは、欠損ヘルパーＲＮＡのサブゲノム５’−ＮＴＲとは異なり；レプリコンＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列は、欠損ヘルパーＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列とは異なり；レプリコンＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列は、欠損ヘルパーＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列とは異なり；および／またはレプリコンＲＮＡのポリペプチドコード配列を発現するための手段は、欠損ヘルパーＲＮＡのポリペプチドコード配列を発現するための手段とは異なる。
なおさらなる局面において、温血動物内の免疫応答を刺激するための方法が提供され、この方法は、少なくとも１つの病原性因子由来の１つ以上の抗原を発現する本発明に従うアルファウイルスレプリコン粒子の調製物を温血動物に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、この抗原は、腫瘍細胞由来である。他の実施形態において、この抗原は、感染性因子（例えば、ウイルス、細菌、真菌または寄生体）由来である。好ましい実施形態において、この抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来（例えば、ｇａｇ、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１６０、ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｔａｔおよびｎｅｆ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来（例えば、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５）、インフルエンザウイルス由来（例えば、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルスまたはＲＳウイルスまたは麻疹ウイルス）由来（例えば、ＮＰ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｈ）、ヘルペスウイルス由来（例えば、糖タンパク質Ｂ、糖タンパク質Ｄ）、フラビウイルス（例えば、マールブルグウイルスまたはエボラウイルス）由来（例えば、ＮＰ、ＧＰ）、ブンヤウイルス（例えば、ハンターンウイルスまたはリフトバレー熱ウイルス）由来（例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｎ）、またはフラビウイルス（例えば、ダニ媒介脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルス）由来（例えば、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ３、ＮＳ５）である。本明細書中に記載される任意の方法はさらに、リンホカイン、ケモカイン、および／またはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、γインターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＬＣ、ＭＩＰ３αおよびＭＩＰ３β）を投与する工程含み得る。リンホカイン、ケモカインおよび／またはサイトカインは、ポリペプチドとして投与されてもポリヌクレオチド（例えば、この抗原をコードする同一または異なるレプリコン）によってコードされてもよい。あるいは、リンホカイン、ケモカインおよび／またはサイトカインをコードする本発明のレプリコン粒子は、免疫応答を刺激するものとして使用され得る。
従って、本明細書中に記載される任意の組成物および方法において、配列は、少なくとも２つのアルファウイルス（例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ））由来である。
他の局面において、アルファウイルスレプリコン粒子を産生する方法および上記の粒子の産生の間レプリコンコンピテントウイルス（例えば、野生型ウイルス）を作製する確率を減少させる方法が提供され、この方法は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡおよび少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上の欠損ヘルパーＲＮＡを許容された細胞に導入する工程、ならびにレプリコン粒子の産生を可能にするに十分な時間にわたって適切な条件下で上記の細胞をインキュベートする工程を包含し、ここで、上記のレプリコンＲＮＡは、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、発現される場合に生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列、１つ以上の異種性配列を発現するための手段、タンパク質コード遺伝子である異種性配列（この遺伝子は、レプリコン内の３’隣接遺伝子である）、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列、ポリアデニル化トラクト、ならびに必要に応じてサブゲノム５’−ＮＴＲを含み；ここで、この欠損ヘルパーＲＮＡは、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、１つ以上の異種性配列を発現するための手段、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする遺伝子（この遺伝子は、この欠損ヘルパー内の３’隣接遺伝子である）、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列、ポリアデニル化トラクト、ならびに必要に応じてサブゲノム５’−ＮＴＲを含み；そしてここで、このレプリコンＲＮＡは、以下からなる群より選択されるエレメントの少なくとも１つにおいて少なくとも１つの欠損ヘルパーＲＮＡとは異なる：非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、３’隣接遺伝子を発現するための手段、サブゲノム５’−ＮＴＲ、および非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列。
本発明のこれらおよび他の局面ならびにこれらおよび他の実施形態は、以下に詳述される記載、添付の図面、および特定の手順または組成物（例えば、プラスミド、配列など）をより詳細に記載する本明細書中に記載の種々の参考文献に関する証拠となる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下のキメラアルファウイルス粒子などが提供される：
（項目１）
キメラアルファウイルス粒子であって：
１つ以上のアルファウイルス由来のＲＮＡ；および
構造タンパク質、
を含み、ここで、少なくとも１つの該構造タンパク質が、２つ以上のアルファウイルスに由来する、キメラアルファウイルス粒子。
（項目２）
前記ＲＮＡが、第１アルファウイルスに由来し、そして前記構造タンパク質が、以下：
（ａ）（ｉ）該第１アルファウイルス由来のＲＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）第２アルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質相互作用ドメイン、を有するハイブリッドキャプシドタンパク質；ならびに
（ｂ）該第２アルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質、
を含む、項目１に記載のキメラアルファウイルス粒子。
（項目３）
前記ＲＮＡが、第１アルファウイルスに由来し、そして前記構造タンパク質が、以下：
（ａ）該第１アルファウイルス由来のキャプシドタンパク質；ならびに
（ｂ）（ｉ）該第１アルファウイルス由来の細胞質テール部分、および（ｉｉ）第２アルファウイルス由来の残りの部分、を有するエンベロープ糖タンパク質、
を含む、項目１に記載のキメラアルファウイルス粒子。
（項目４）
キメラアルファウイルス粒子であって：
第１アルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質および該第１アルファウイルスと異なる第２アルファウイルス由来のパッケージングシグナルをコードするＲＮＡであって、ここで、該パッケージングシグナルが、ｎｓＰ３とｎｓＰ４との連結部、ｎｓＰ４のオープンリーディングフレームの後、および非構造タンパク質遺伝子における欠失からなる群より選択される部位に挿入される、ＲＮＡ；
該第２アルファウイルス由来のキャプシドタンパク質；ならびに
該第１アルファウイルスと異なるアルファウイルス由来のエンベロープタンパク質、
を含む、キメラアルファウイルス粒子。
（項目５）
前記パッケージングシグナルが、非構造タンパク質遺伝子におけるカルボキシ末端欠失に挿入される、項目４に記載のキメラアルファウイルス粒子。
（項目６）
前記エンベロープタンパク質が、前記第２アルファウイルス由来である、項目４または項目５に記載のキメラアルファウイルス粒子。
（項目７）
前記粒子がレプリコン粒子であり、さらに、前記ＲＮＡが５’から３’への順番で、（ｉ）非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、（ｉｉ）アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）異種核酸を発現するための手段、（ｉｖ）該異種核酸配列、（ｖ）非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列、および（ｖｉ）ポリアデニル化トラクト、を含み、該異種核酸配列は、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子と置き換わる、項目１〜６のいずれかに記載のアルファウイルス粒子。
（項目８）
前記第１アルファウイルスが、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）であり、そして前記第２アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）である、項目１〜７のいずれかに記載のキメラアルファウイルス粒子。
（項目９）
前記第１アルファウイルスがＶＥＥであり、前記第２アルファウイルスがＳＩＮである、項目１〜７のいずれかに記載のキメラアルファウイルス粒子。
（項目１０）
前記ＲＮＡが、異種核酸配列をさらに含む、項目１〜９のいずれかに記載のアルファウイルス粒子。
（項目１１）
前記異種核酸が、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質と置き換わる、項目１０に記載のアルファウイルス粒子。
（項目１２）
前記異種核酸配列が、治療因子または免疫原をコードする、項目１０または項目１１に記載のアルファウイルスレプリコン粒子。
（項目１３）
アルファウイルスレプリコンＲＮＡであって、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、非アルファウイルス異種配列、および非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列を含み、該非構造タンパク質の少なくとも１つをコードする配列は、バイオセーフティーレベル３（ＢＳＬ−３）のアルファウイルスに由来し、そして該レプリコンＲＮＡの配列は、ＢＳＬ−３アルファウイルスのゲノムの少なくとも３分の１であるが、３分の２未満と同一の配列を示す、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ。
（項目１４）
真核生物階層ベクター開始システムであって、真核生物細胞中でｃＤＮＡからのＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、およびその独自の複製を指示し得、そして異種配列を発現し得る核酸ベクター配列を含み、該核酸ベクター配列は、項目１３に記載のレプリコンのｃＤＮＡコピーである、真核生物階層ベクター開始システム。
（項目１５）
前記ＢＳＬ−３アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）である、項目１３または１４に記載のレプリコン。
（項目１６）
アルファウイルスレプリコン粒子を生成する方法であって、宿主細胞に、以下：
ａ）１つ以上のアルファウイルス由来であり、１つ以上の異種配列をさらに含む、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ；および
ｂ）レプリコンＲＮＡを含まない構造タンパク質をコードする少なくとも１つの別個の欠損ヘルパーＲＮＡであって、ここで、少なくとも１つの該構造タンパク質が、２つ以上のアルファウイルスに由来する、ＲＮＡ、
を導入する工程を包含し、ここで、アルファウイルスレプリコン粒子が生成される、方法。
（項目１７）
前記レプリコンＲＮＡが、第１アルファウイルス由来であり、そして該構造タンパク質が、以下：
（ａ）（ｉ）該第１アルファウイルス由来のＲＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）第２アルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質相互作用ドメイン、を有するハイブリッドキャプシドタンパク質；ならびに
（ｂ）該第２アルファウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質、
を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＲＮＡが、前記第１アルファウイルスに由来し、そして前記構造タンパク質が、以下：
（ａ）該第１アルファウイルス由来のキャプシドタンパク質；ならびに
（ｂ）（ｉ）該第１アルファウイルス由来の細胞質テール部分、および（ｉｉ）第２アルファウイルス由来の残りの部分、を有するエンベロープ糖タンパク質、
を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
アルファウイルスレプリコン粒子を生成する方法であって、宿主細胞に、以下：
ａ）第１アルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質、第２アルファウイルス由来のパッケージングシグナル、および１つ以上の異種配列をコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡであって、ここで、該パッケージングシグナルが、ｎｓＰ３とｎｓＰ４との連結部、ｎｓＰ４のオープンリーディングフレームの後、および非構造タンパク質遺伝子における欠失からなる群より選択される部位に挿入される、ＲＮＡ；ならびに
ｂ）該レプリコンＲＮＡを含まない構造タンパク質をコードする少なくとも１つの別個の欠損ヘルパーＲＮＡであって、ここで、少なくとも１つの該構造タンパク質が、該第２アルファウイルス由来のキャプシドタンパク質であり、そして少なくとも１つの該構造タンパク質が、該第１アルファウイルスと異なるアルファウイルス由来のエンベロープタンパク質である、ＲＮＡ、
を導入する工程を包含し、ここで、アルファウイルスレプリコン粒子が生成される、方法。
（項目２０）
アルファウイルスパッケージング細胞株であって、１つ以上の構造タンパク質をコードする配列を含む１つ以上の構造タンパク質発現カセットを含み、ここで、少なくとも１つの該構造タンパク質が、２つ以上のアルファウイルスに由来する、パッケージング細胞株。
（項目２１）
前記１つ以上の構造タンパク質発現カセットが、欠損ヘルパーＲＮＡのｃＤＮＡコピーを含む、項目２０に記載のパッケージング細胞株。
（項目２２）
前記欠損ヘルパーＲＮＡが、前記構造タンパク質の発現を指示する、項目２１に記載のパッケージング細胞株。
（項目２３）
前記欠損ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルスサブゲノムプロモーターをさらに含む、項目２１または２２に記載のパッケージング細胞株。
（項目２４）
組換えアルファウイルスレプリコン粒子を生成する方法であって、項目２０〜２３のいずれかに記載のアルファウイルスパッケージング細胞株および、１つ以上のアルファウイルス由来のアルファウイルスレプリコンＲＮＡを導入する工程を包含し、ここで、１つ以上の異種ＲＮＡ配列を含むアルファウイルス粒子が、生成される、方法。
（項目２５）
アルファウイルスレプリコン粒子を生成する方法であって、該方法は、許容細胞に、以下：
（ａ）制御エレメント、ならびに（ｉ）生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質および（ｉｉ）異種タンパク質をコードするポリペプチドコード配列を含む、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ；および
（ｂ）制御エレメント、ならびに少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードするポリペプチドコード配列を含む、１つ以上の欠損ヘルパーＲＮＡであって、ここで、該制御エレメントは、５’から３’の順番で、非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、該ポリペプチドコード配列を発現するための手段、および非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列を含み、さらに、１つ以上の該ＲＮＡレプリコン制御エレメントは、該欠損ヘルパーＲＮＡ制御エレメントと異なる、ＲＮＡ
を導入する工程；ならびに
適切な条件下で、レプリコン粒子を生成し得るのに十分な時間、該細胞をインキュベートする工程、
を包含する、方法。
（項目２６）
前記レプリコンＲＮＡおよび前記欠損ヘルパーＲＮＡが、サブゲノム５’−ＮＴＲをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記レプリコンＲＮＡのサブゲノム５’−ＮＴＲが、前記欠損ヘルパーＲＮＡの前記サブゲノム５’−ＮＴＲと異なる、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記レプリコンＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列が、前記欠損ヘルパーＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列と異なる、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２９）
前記レプリコンＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列が、前記欠損ヘルパーＲＮＡの非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列と異なる、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３０）
前記レプリコンＲＮＡの前記ポリペプチドコード配列を発現するための手段が、前記欠損ヘルパーＲＮＡの前記ポリペプチドコード配列を発現するための手段と異なる、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３１）
哺乳動物において免疫応答を生成する方法であって、該方法は、該哺乳動物に、項目１２に記載のキメラアルファウイルス粒子を投与する工程を包含し、それによって、免疫応答を生成する、方法。
図１は、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）遺伝子合成フラグメントおよびＶＥＥレプリコンのアセンブリのために使われた制限酵素部位を示す。 図２は、ＶＥＥ ｎｓＰフラグメント２のオリゴヌクレオチドベースの合成を示す。（配列番号５１および配列番号５２）。 図２は、ＶＥＥ ｎｓＰフラグメント２のオリゴヌクレオチドベースの合成を示す。（配列番号５１および配列番号５２）。 図３は、ＶＥＥ遺伝子合成フラグメントおよび構造タンパク質遺伝子のアセンブリのために使われた制限酵素部位を示す。 図４は、キメラシンドビスウイルス（ＳＩＮ）／ＶＥＥアルファウイルス粒子の効率的な産生のためのハイブリッドキャプシドタンパク質を示す。 図５は、キメラＳＩＮ／ＶＥＥアルファウイルス粒子の効率的な産生のための、ハイブリッドＥ２糖タンパク質を示す。 図６は、ＳＩＮ構造タンパク質を用いた効率的なパッケージングのための、異種のＳＩＮパッケージシグナルでのＶＥＥレプリコンを示す。 図７は、（本発明の教示に従って作製されたキメラ１Ａ中で使われるような）ｎｓＰ４／短縮型結合領域プロモーターでの、ＳＩＮパッケージシグナル挿入を示す。 図８は、（本発明の教示に従って作製されたキメラ１Ｂ中で使われるような）ｎｓＰ４／非短縮型結合領域プロモーターでの、ＳＩＮパッケージシグナル挿入を示す。 図９は、ＶＥＥ非構造的タンパク質遺伝子（ｎｓＰ３）欠失への、ＳＩＮパッケージシグナルのＳＩＮ／ＶＥＥパッケージキメラ番号２の挿入を示す。 図１０は、ＶＥＥ ｎｓＰ３のカルボキシ末端での、ＳＩＮパッケージシグナルのＳＩＮ／ＶＥＥパッケージングキメラ番号３の挿入を示す。 図１１は、ＳＩＮパッケージシグナルのための、ｎｓＰ３／ｎｓＰ４末端の改変を示す。 図１２は、ＨＩＶ抗原を発現するアルファウイルスレプリコン粒子キメラの免疫原性を示すグラフである。
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に表示しない限り、当業者において、慣習的に化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の習慣的な方法を使用する。このような技術は文献において十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，編．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍら，編，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），第２版．（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ編，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照のこと。
上記または下記のいずれにしても、本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体において参考として、本明細書中に援用される。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使われる場合、単数形態の「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が、明らかに別の意味を示していなければ、複数の言及を含む。従って、例えば、「ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ」という言及は、２つ以上のそのような粒子の混合物を含む。
本発明を記載する前に、本明細書中でこれ以降用いられる特定の用語の定義を記載する。
「核酸」分子は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡまたは他のＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡの配列さえも挙げられ得るが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの、任意の公知の塩基アナログを含む配列を表し、そして、天然の配列に対する（一般的に、天然に保存される）欠失、付加および置換のような、改変を含む。これらの改変は、部位定方向突然変異誘発を通すように意図的であっても、偶発的であってもよい。ポリヌクレオチドの改変は、例えば、多くの影響（宿主細胞中のポリペプチド産物の発現を促進することが挙げられる）を有し得る。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを参照し、産物の最小の長さを限定しない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体など、が、定義に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方ともが、定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）も含む。さらに、本発明の目的において、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り，ネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換のような、（一般的に、天然に保存される））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位定方向突然変異誘発を通すように意図的でも、タンパク質を生成する宿主の変異またはＰＣＲ増幅に帰するエラーのように、偶発的であっても良い。さらに、改変は、以下の影響の一つ以上を有するようになされ得る：毒性を減少させること；細胞プロセシングを促進（例えば、分泌、抗原提示など）すること；ならびにＢ細胞および／またはＴ細胞に対する提示を促進すること。
「作動可能に連結された」は、エレメントの整列をいい、記載される構成要素は、通常の機能を果たすように配置される。従って、コード配列に作動可能なように連結した所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される介在性配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、プロモーター配列は、さらに、コード配列に「作動可能に連結された」と考慮され得る。
アミノ酸配列の「類似性」を決定するための技術は、当該分野において周知である。一般的に、「類似性」は、適切な（アミノ酸が同一であるか、あるいは類似の化学的性質および／または物理的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する）位置における、２つ以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸との正確な比較を意味する。次いで、いわゆる「類似性パーセント」は、比較されるペプチド配列の間で決定され得る。核酸配列およびアミノ酸配列の相同性を決定するための技術はまた、当該分野において周知であり、（通常、ｃＤＮＡ中間体を介した）遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定、およびその遺伝子にコードされているアミノ酸配列の決定、ならびにこのアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との比較が挙げられる。一般的に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、それぞれヌクレオチドとヌクレオチドとの、またはアミノ酸とアミノ酸との、正確な対応をいう。
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することにより比較され得る。さらに、２つ以上のアミノ酸配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することにより、同様に比較され得る。一般的に、核酸配列であれペプチド配列であれ、２つの配列の同一性パーセントは、より短い配列の長さにより分配される、整列した２つの配列の間で正確な適合の数として示され、１００が掛けられる。核酸配列に対して似ている整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ ｓｕｐｐｌ． ３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５〜６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリクスを用いることで、使用の幅をペプチド配列に広げられ得る。核酸配列およびペプチド配列に対する、このアルゴリズムの手段は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、ＢｅｓｔＦｉｔ ｕｔｉｌｉｔｙアプリケーションにおいて提供される。この方法についてのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）中に記載されている。一般的に、配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントの算出について、他の同等に適したプログラムが、当該分野で公知である。
例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの、デフォルトスコアリングテーブルおよび６箇所のヌクレオチド部位のギャップペナルティを用いた同一性アルゴリズムを用いて決定され得る。本発明の文脈中で、別の同一性パーセントが確立している方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があるＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムの使用である。このプログラムは、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分配される。この一式のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが用いられ得る。ここで、デフォルトパラメータはスコアリングテーブル（例えば、１２個のギャップオープンペナルティ、１つのギャップ伸長ペナルティおよび６個のギャップ）に対して使用される。生じたデータから、「適合」値は、「配列同一性」をいう。一般的に、配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の適切なプログラム（例えば、デフォルトパラメータをまた使用し得る、アライメントプログラムＢＬＡＳＴ）は、当該分野で公知である。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用し得る：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）＝５０配列；並べ替え＝ハイスコア（ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ）；データベース＝ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ（重複なし）。これらのプログラムの詳細は、下記のインターネットアドレスで見出し得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
当業者は、上記のプログラムにおいて、所定の配列に対して使用する適切な検索パラメータを、容易に決定し得る。例えば、検索パラメータは、当該の配列のサイズに基づいて、変わり得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、ヌクレオチドに隣接するＸを有する、単離ポリヌクレオチドを含む。ここで、（ｉ）ヌクレオチドに隣接するＸは、本明細書中に記載される任意の配列から誘導されるヌクレオチドに隣接するＹに対して、少なくとも約５０％の同一性を有する、（ｉｉ）ＸとＹは同等である、および（ｉｉｉ）Ｘは６ヌクレオチド以上であり、そして５０００ヌクレオチドに及ぶ、好ましくは、Ｘは８ヌクレオチド以上であり、そして５０００ヌクレオチドに及ぶ、より好ましくは、Ｘは１０〜１２ヌクレオチドであり、そして５０００ヌクレオチドに及ぶ、そしてさらにより好ましくは、１５〜２０ヌクレオチドであり、本明細書中に記載される全長配列（例えば、配列表および請求項を参照のこと）に存在するヌクレオチドの数（上述の範囲に当てはまる全ての整数値を含む）に及ぶ。
２つの核酸フラグメントは、本明細書中に記載される場合、「選択的にハイブリダイズする」とみなされる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような配列間のハイブリダイゼーション現象の効率および強度に影響する。部分的に同一な核酸配列は、完全に同一な配列が標的分子にハイブリダイズすることを、少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を用いて評価され得る。このようなアッセイは、選択性の程度の変化（例えば、低いストリンジェンシーから高いストリンジェンシーへの条件の変化）を用いることにより、行われ得る。低いストリンジェンシー条件を用いる場合、非特異的結合の非存在は、配列同一性を一部分程度欠いた二次プローブ（（例えば、ターゲットの分子に対して約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）つまり、非特異的結合現象の非存在において、二次プローブは、標的とハイブリダイズしない）を用いてでさえ評価し得る。
ハイブリダイゼーションに基づく塩基の検出システムを利用する場合、核酸プローブは、標的核酸配列に対して相補的である核酸が選択され、次いで、適切な条件を選択することにより、プローブ配列および標的配列は、ハイブリッド分子を形成するために、互いに「選択的にハイブリダイズする」か、または結合する。「中程度のストリンジェンシー」下で、標的の配列と選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列に対して、少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出が可能である条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列に対して、約９０〜９５％以上の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能とする。プローブと標的とが特定の程度の配列同一性を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションに対して有用な、ハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のように（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，編者Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、決定され得る。
ハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシー条件に関して、例えば、下記の要因を変えることにより、特定のストリンジェンシーを確立するために、多数の同等の条件が用いられ得ることは、当該分野で周知である：プローブ配列および標的配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩濃度および他のハイブリダイゼーション溶液組成物濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤の有無（例えば、ホルムアミド、デキストランサルフェート、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応の温度ならびに時間パラメータ、および種々の洗浄条件。特定のハイブリダーゼ−ション条件の設定の選択は、当該分野において、下記の標準的な方法が選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ１ｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
用語「から誘導される」は、アルファウイルスの供給源の分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド）を同定するために使われる。第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補体の領域と同じ塩基対配列または実質的に同じ塩基対配列を有する場合、あるいは上記に記載されるような配列同一性を示す場合、第一のポリヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチド「から誘導される」。従って、アルファウイルスの配列またはポリヌクレオチドは、（ｉ）アルファウイルスの配列と同じ配列または実質的に同じ配列を有する場合、あるいは（ｉｉ）上に記載されるように、アルファウイルスのポリペプチドに対して配列同一性を示す場合、特定のアルファウイルス（例えば、種）「から誘導される」。
第一のポリペプチドは、（ｉ）第二のポリヌクレオチドから誘導された第一のポリヌクレオチドによりコードされる場合、または（ｉｉ）上に記載されるような、第二のポリペプチドに対して配列同一性を示す場合、第二のポリペプチド「から誘導される」。従って、アルファウイルスポリペプチド（タンパク質）は、（ｉ）アルファウイルスのポリヌクレオチド（αヴァイラルポリヌクレオチド）のオープンリーディングフレームによってコードされている場合、または（ｉｉ）上で記載されるように、アルファウイルスのポリペプチドに対して配列同一性を示す場合、特定のアルファウイルス「から誘導される」。
ポリヌクレオチド分子およびポリペプチド分子の両方とも、アルファウイルスから自然法則により誘導され得るか、あるいは組換えによってまたは合成によって（例えば、既知の配列に基づいて）生成され得る。
代表的には、「コントロールエレメント」は、転写、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンに対して３’側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’側に位置する）、翻訳終結配列、非構造的タンパク質媒介性増幅のために必要とされる５’配列、非構造的タンパク質媒介性増幅のために必要とされる３’配列および一つ以上の異種配列を発現するための手段（例えば、サブゲノム結合領域プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ＭｃＣａｕｇｈａｎら（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：５４３１〜５４３５； Ｋｏｃｈｅｔｏｖら（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４４０：３５１〜３５５を参照のこと）。
「アルファウイルスＲＮＡレプリコンベクター」、「ＲＮＡレプリコンベクター」、「レプリコンベクター」または「レプリコン」は、標的細胞内で、インビボで自己の増幅または自己複製を指示できるＲＮＡ分子をいう。自己の増幅を指示するために、ＲＮＡ分子はＲＮＡの増幅を触媒するために必要とされるポリメラーゼ（例えば、アルファウイルス非構造的タンパク質である、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードすべきであり、そしてまた、コードされたポリメラーゼにより認識されそして利用される、複製において必要とされるｃｉｓＲＮＡ配列を含むべきである。アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、以下のｃｉｓエレメントを含むべきである：非構造的タンパク質媒介性増幅に必要とされる５’ウイルス配列および５’細胞配列（５’ＣＳＥ、もしくは５’ｃｉｓ複製配列、または複製に対してｃｉｓにおいて必要とされる５’ウイルス配列、またはアルファウイルスの転写を開始し得る５’配列とも言及され得る）、発現した場合、生物学的に活性なアルファウイルス非構造的タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および非構造的タンパク質媒介性増幅に必要とされる３’ウイルス配列もしくは３’細胞配列（３’ＣＳＥ、または複製に対してｃｉｓにおいて必要とされる３’ウイルス配列、あるいはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも言及され得る）。アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンはまた、一つ以上の異種配列（例えば、ＩＲＥＳまたはウイルス（例えば、アルファウイルス）のサブゲノムプロモーター（例えば、結合領域プロモーター））を発現させる手段、および発現されるべき一つ以上の異種配列を含むべきであり、特定の実施形態において、これは、サブゲノムフラグメントの転写ウイルスを増加もしくは減少させるために、または欠損性ヘルパータンパク質もしくは構造タンパク質の発現カセットとの相同性を下げるために改変され得る。レプリコンはまた、さらなる配列（例えば、一つ以上のポリペプチド（例えば、タンパク質をコードする遺伝子、または３’隣接遺伝子）をコードする、一つ以上の異種配列および／またはポリアデニル酸領域）を含み得る。
「組換えアルファウイルス粒子」、「アルファウイルスレプリコン粒子」および「レプリコン粒子」は、アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含む、ビリオン様ユニットのことをいう。一般的に、組換えアルファウイルス粒子は、一つ以上のアルファウイルス構造タンパク質、脂質エンベロープおよびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、この組換えアルファウイルス粒子は、一つ以上のアルファウイルスエンベロープ剤糖タンパク質（例えば、Ｅ２、Ｅ１）が埋め込まれた、原形質膜のような、宿主細胞由来の脂質二重膜内に含まれる、ヌクレオキャプシド構造を含む。この粒子はまた、アルファウイルスが誘導された粒子の親和性を方向付ける、他の成分（例えば、ビオチンのような標的エレメント、他のウイルスの構造タンパク質もしくはその一部分、ハイブリッドエンベロープまたは他のレセプター結合リガンド）を含む。一般的に、アルファウイルスＲＮＡと、レプリコン粒子またはヌクレオキャプシドを効率的に形成するために必要な構造タンパク質との間での相互作用は、キャプシドタンパク質とＲＮＡ内に含まれるパッケージシグナル（またはパッケージ配列）との間のＲＮＡ−タンパク質相互作用であり得る。
「アルファウイルスパッケージング細胞」は、一つ以上のアルファウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、そしてアルファウイルスＲＮＡベクターレプリコン、真核生物の層状ベクターイニシエーションシステム（ｌａｙｅｒｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）または組換えアルファウイルス粒子の導入後、組換えアルファウイルス粒子（レプリコン粒子）を生成する細胞をいう。親細胞は、哺乳類由来であっても、非哺乳類由来であっても良い。好ましい実施形態において、パッケージング細胞は、構造タンパク質発現カセットを用いて、安定に形質転換される。
「欠損（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）ヘルパーＲＮＡ」は、真核生物細胞がまた、機能的なアルファウイルス非構造的タンパク質「レプリカーゼ」タンパク質を含む場合に、真核生物細胞内で増幅され得、そして１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現し得るＲＮＡ分子をいう。このアルファウイルス非構造的タンパク質は、アルファウイルスＲＮＡレプリコンベクターまたは他の方法により、細胞内で発現され得る。アルファウイルス非構造的タンパク質により媒介される増幅および構造タンパク質の発現を可能にするために、欠損ヘルパーＲＮＡ分子は、増幅において必要とされるＲＮＡ５’−末端配列およびＲＮＡ３’−末端配列（これは、非構造的タンパク質によって認識され、そして利用される）、ならびに一つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現する手段を含むべきである。従って、アルファウイルス欠損ヘルパーＲＮＡは、以下の要求されるエレメントを含むべきである：ＲＮＡ増幅のためにアルファウイルス非構造的タンパク質により必要とされる、５’ウイルス配列または細胞配列（５’ＣＳＥ、または５’ｃｉｓ複製配列または複製のためのｃｉｓにおいて必要とされる５’ウイルス配列、またはアルファウイルスの転写開始を可能にする５’配列とも、他で称される）、一つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現する手段、発現した場合、一つ以上のアルファウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ２、Ｅ１）をコードする遺伝子配列、増幅のためにアルファウイルス非構造的タンパク質により必要とされる３’ウイルス配列または３’細胞配列（３’ＣＳＥ、または複製においてｃｉｓに必要とされる３’ウイルス配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも称される）、および好ましくはポリアデニル酸領域。一般的に、欠損ヘルパーＲＮＡは、四つの全てのアルファウイルス非構造的タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）を、その全体においてそれ自体にコードするべきでも、発現するべきでもないが、これらのタンパク質またはその一部のサブセットをコードまたは発現し得るか、あるいは一つ以上の非構造的タンパク質遺伝子由来の配列を含み得る（しかし、欠損ヘルパー中にそれらの遺伝子を含む性質により、非構造的タンパク質またはその一部を発現しない）。アルファウイルス構造タンパク質の発現手段として、欠損ヘルパーＲＮＡは、特定の実施形態において、サブゲノムフラグメントの転写を調整するために、またはレプリコンＲＮＡとの相同性を減少させるために改変され得るか、あるいはアルファウイルス構造タンパク質の発現をもたらす代表的な他のいくつかの手段（例えば、内部リボソームエントリー部位、リボソームリードスルー（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）エレメントを含み得る）ウイルス（例えば、アルファウイルス）のサブゲノムプロモーターを含み得る。好ましくは、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子は、欠損ヘルパー内の３’隣接遺伝子である。さらに、欠損ヘルパーＲＮＡが、アルファウイルス構造タンパク質とのＲＮＡ−タンパク質相互作用を促進する、およびヌクレオキャプシド内、ビリオン様粒子内またはアルファウイルスレプリコン粒子内へのパッケージを促進する配列を含まないことがまた望ましい。欠損ヘルパーＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質発現カセットの１つの特定の実施形態である。
「真核生物階層ベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）」は、目的の配列または目的の遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。この真核生物層状ベクターイニシエーションシステムは、インビボ（すなわち、真核生物細胞内）で、ｃＤＮＡからＲＮＡ合成を開始することが可能な５’プロモーター、および真核生物細胞内でそれ自体の複製の指向することが可能であり、そして異種配列の発現も可能な核酸ベクター配列（例えば、ウイルスベクター）を含むべきである。好ましくは、核酸ベクター配列は、アルファウイルス由来の配列であり、非構造的タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス配列または５’細胞配列（５’ＣＳＥ、または５’ｃｉｓ複製配列または複製のためにｃｉｓにおいて必要とされる５’ウイルス配列、またはアルファウイルスの転写を開始することが可能な５’配列とも称される）を含み、そして、発現した場合、生物学的に活性なアルファウイルス非構造的タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および非構造的タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス配列または３’細胞配列（３’ＣＳＥ、または複製のためにｃｉｓにおいて必要とされる３’ウイルス配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも称される）である。さらに、ベクター配列は、異種配列（例えば、ウイルス（例えば、アルファウイルス）のサブゲノムプロモーター（例えば、結合領域プロモーター）、および発現されるべき一つ以上の異種配列）を発現させるための手段を含み得、特定の実施形態において、サブゲノムフラグメントのウイルス転写を予防する、増加もしくは減少させるために、または欠損ヘルパーもしくは構造タンパク質発現カセットの相同性を下げるために改変され得る。好ましくは、この相同配列は、タンパク質をコードする遺伝子を含み、上記遺伝子は、ベクター配列内の３’隣接遺伝子である。真核生物層状ベクターイニシエーション系はまた、ポリアデニル化配列、スプライシング認識配列、触媒性リボザイムプロセシング配列、核外移行シグナルおよび転写終結配列を含み得る。特定の実施形態において、ｃＤＮＡからのベクター核酸配列のインビボ合成は、誘導可能プロモーターを用いることにより制御され得るか、またはサブゲノムの発現は翻訳レギュレーターもしくは改変された非構造的タンパク質の使用を通して誘導され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「キメラアルファウイルス粒子」および「キメラアルファウイルスレプリコン粒子」は、キャプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質のいずれかから（例えば、異なるウイルスから）誘導されたアルファウイルス以外のアルファウイルスから誘導された核酸を含むように、特異的に改変または操作されたキメラまたはキメラ粒子（例えば、ウイルス、またはウイルス様粒子）をいう。このような粒子において、アルファウイルスから誘導された核酸は、ゲノム長（非構造タンパク質および構造タンパク質をコードする）およびレプリコン長（１以上の構造タンパク質を欠失する）が挙げられるが、これらに限定されない、任意の数の異なる長さのうちの１つを含む、ＲＮＡ分子である。例えば、限定することを意図しないが、本発明の教示に従って作製されるキメラリプリコン粒子としては、シンドビスウイルスＲＮＡ結合ドメインを有するキャプシド内のシンドビスウイルス（ＳＩＮ）レプリコンＲＮＡ、およびＶＥＥ糖タンパク質エンベロープによって取り囲まれたベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）エンベロープ糖タンパク質相互作用ドメインが挙げられる。
用語「３’隣接遺伝子」は、レプリコンベクター、真核生物階層ベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、不完全ヘルパーＲＮＡまたは構造タンパク質発現カセット内に含まれ、そして別のエレメントに対して特定の位置内に配置された、タンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。この３’隣接遺伝子の位置は、非構造タンパク質媒介増殖（上に定義される）に必要とされる３’配列に対して決定されるべきであり、ここで、３’隣接遺伝子は、タンパク質コード配列５’（上流）にあり、そしてこのエレメントの直前にある。この３’隣接遺伝子は、リプリコンベクターまたは真核生物層状ベクター開始システムに対して言及される場合、一般に、非相同配列（例えば、抗原−コード遺伝子）であるか、あるいは不完全ヘルパーＲＮＡまたは構造タンパク質発現カセットに対して言及される場合、一般に、構造タンパク質遺伝子（例えば、アルファウイルスＣ、Ｅ２、Ｅ１）である。
用語「非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’ウイルス配列または細胞配列」または「非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列」は、ウイルスまたはウイルス誘導ベクターが、ポジティブ鎖ＲＮＡを合成する認識部位を提供する機能的エレメントをいう。従って、これは、ウイルスまたはベクター内に含まれる正確な配列の相補体であり、マイナス鎖ＲＮＡコピーの３’末端に対応し、非構造タンパク質レプリカーゼ複合体、あるいはさらなる宿主細胞因子によって結合され、これにより、ポジティブ鎖ＲＮＡの転写が、開始される。広範な種々の配列が、この機能のために利用され得る。例えば、この配列は、アルファウイルス５’−末端非翻訳領域（ＮＴＲ）および他の隣接配列（例えば、ヌクレオチド２１０、２５０、３００、３５０、４００、または４５０を通る配列）を含み得る。あるいは、非アルファウイルスまたは他の配列は、このエレメントとして利用され得るが、同様の機能的な能力（例えば、ＳＩＮの場合、ｔＲＮＡ アスパラギンに対するヌクレオチド１０−７５）を維持する（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，０９１，３０９号）。この用語は、用語５’ＣＳＥ、または複製に対してｃｉｓで必要とされる５’ウイルス配列、またはアルファウイルスの転写を開始し得る５’配列と互換可能に使用される。
用語「ウイルスサブゲノムプロモーター」は、ウイルス起点の配列をいい、必要とされるウイルスポリメラーゼおよび細胞ポリメラーゼならびに他の因子と一緒になって、ゲノム長未満のＲＮＡ分子の転写を可能にする。アルファウイルス（アルファウイルス）サブゲノムプロモーターまたはアルファウイルスサブゲノム接合領域について、この配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と構造タンパク質のオープンリーディングフレームとの間の領域から一般に誘導され、そして通常、サブゲノムｍＲＮＡの転写を制御する。代表的に、アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、ほとんどのプロモーターに関連する活性を提供するコア配列、およびプロモーターに関連する活性をさらに増強する隣接領域（例えば、伸張プロモーターまたはネイティブプロモーター）からなる。例えば、アルファウイルスプロトタイプの場合において、シンドビスウイルス、正常なサブゲノム接合領域プロモーターは、代表的に、ほぼヌクレオチド数７５７９で開始し、そして少なくともヌクレオチド数７６１２（可能な場合それを超える）を通って続く。最小で、ヌクレオチド７５７９〜７６０２が、サブゲノムフラグメントの転写のために必要なコア配列として役立つと考えられる。
用語「非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’ウイルス配列または細胞配列」または「非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列」は、用語３’ＣＳＥ、または３’ｃｉｓ複製配列、または複製に対してｃｉｓで必要とされる３’ウイルス配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列と互換可能に使用される。この配列は、ウイルスまたはウイルス誘導ベクターが、ネガティブＲＮＡ鎖の合成によって複製（増幅）を開始する認識部位を提供する機能的エレメントである。広範な種々の配列は、この機能のために利用され得る。例えば、この配列は、完全なアルファウイルス３’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）を含み得、例えば、ＳＩＮと共に、ヌクレオチド１１，６４７から１１，７０３、または３’ＮＴＲの短縮型領域を含み、認識配列（例えば、ヌクレオチド１１，６８４〜１１，７０３）のような機能をさらに維持する。この文脈において利用され得る配列の他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ネガティブ鎖ＲＮＡ合成の開始を可能にする類似の機能的能力を維持する、非アルファウイルスまたは他の配列（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６−９７８５に記載される配列）。
「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、体液性抗原特異的応答および／または細胞抗原特異的応答を作製する、１種以上のエピトープ（線状、立体配座、またはその両方のいずれか）を含む分子をいう。この用語は、用語「免疫原」と互換可能に使用される。通常、エピトープは、約３個〜１５個の間、一般に、約５個〜１５個の間の核酸を含む。Ｂ細胞エピトープは，通常、約５個のアミノ酸であるが、３〜４個程度のアミノ酸であり得る。Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＣＴＬエピトープ）は、少なくとも約７〜９個のアミノ酸を含み、そしてヘルパーＴ細胞エピトープは、少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。通常、エピトープは、約７個と１５個との間のアミノ酸（例えば、９、１０、１２、または１５個のアミノ酸）を含む。用語「抗原」は、両方のサブユニット抗原（すなわち、抗原が天然に関連する全器官から、分別および分離される抗原）、および殺傷されるか、減弱されるか、または不活化される細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、または他の微生物、ならびに腫瘍抗原（Ｔ細胞エピトープを含み得る細胞表面レセプターおよび細胞内部分の細胞外ドメインを含む）を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体、またはそのフラグメント）、および合成ペプチドミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）（これは、抗原または抗原決定基を模倣し得る）はまた、本明細書中で使用される場合、抗原の規定下で、捕捉される。同様に、インビボにおいて抗原または抗原決定基（例えば、遺伝子治療およびＤＮＡ免疫化適用）を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはまた、本明細書中で抗原の規定において含まれる。
所定のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知である、任意の数のエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編，１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（このペプチドは、タンパク質分子の部分に対応する）を同時に合成すること、およびこのペプチドを抗体と反応させ、さらにこのペプチドを、支持体に装着させることによって決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：７０９−７１５（全ては、本明細書中でその全体が参考として援用されている）に記載されている。
同様に、立体配座エピトープは、例えば、ｘ線結晶解析および核磁気共鳴のようなアミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することによって、容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，前出を参照のこと。
本発明の目的のために、抗原が、以下により完全に記載されているように、腫瘍および／または任意の数種の公知のウイルス、細菌、寄生虫、および真菌から誘導され得る。この用語はまた、免疫応答が所望される、任意の種々の腫瘍抗原または任意の他の抗原を意図する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、このタンパク質が、本明細書中で規定される場合、免疫応答を惹起するための能力を維持する限り、ネイティブ配列に対して、改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、天然において保存的である））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的な変異誘発の場合、故意であり得るか、または抗原を産生する宿主の突然変異の場合、偶然であり得る。
抗原または組成物に対する「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する抗原に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子（分泌（ＩｇＡ）分子またはＩｇＧ分子を含む）によって媒介される免疫応答をいうが、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞性免疫応答の１つの重要な局面は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質に付随して存在するペプチド抗原、および細胞表面上で発現するペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊の誘導および促進を補助するか、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞表面上でＭＨＣ分子に結合するペプチド抗原を提示する細胞に対して、その機能を刺激すること、および非特異的エフェクター細胞の活性を集中することを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、および活性化されたＴ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞から誘導される白血球を含む）によって産生される他のそのような分子の産生をいう。さらに、ケモカイン応答は、投与された抗原に応答して、種々の全身または内皮細胞によって誘導され得る。
細胞性免疫応答を誘発する組成物およびワクチンは、細胞表面でのＭＨＣ分子と結合する抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように働き得る。細胞媒介免疫応答は、それらの表面で抗原を提示する細胞に、またはその細胞の近傍に方向付けられる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来の防御を可能にするために産生され得る。
特定の抗原が細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する能力は、多くのアッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイ、または感作された被験体中で抗原に対して特異的なＴリンパ球についてアッセイすること）によって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照のこと。細胞媒介免疫応答を測定する最近の方法には、細胞内サイトカインまたはＴ細胞集団によるサイトカイン分泌の測定（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ技術による）、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の測定（例えば、テトラマー技術による）（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．およびＯ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７（９）：１３６７−１３７１、１９９８；Ｍｃｈｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５０：５−２１、１９９６；Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９−８６５、１９９７によって概説される）が含まれる。
従って、本明細書中で使用されるような免疫学的応答は、ＣＴＬおよび／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。ケモカインおよび／またはサイトカインの産生はまた、刺激され得る。目的の抗原はまた、抗体媒介免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、１以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）；および／またはサプレッサーサイトカインＴ細胞またはヘルパーおよび／あるいは目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原に特異的に方向付けられたγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和するように、および／または抗体−補体もしくは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するように働き、免疫された宿主に対する防御を提供し得る。このような応答は、当該分野で公知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
「免疫原性組成物」は、抗原分子（または抗原分子をコードするヌクレオチド配列）を含む組成物であり、この組成物の被験体への投与により、目的の抗原分子に対する、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答および／または粘膜性免疫応答の被験体における発症を生じる。この免疫原性組成物は、例えば、注射、吸入、経口、経鼻または任意の他の非経口投与経路または粘膜投与経路（例えば、直腸内または膣内）によって、レシピエント被験体に直接導入され得る。
「サブユニットワクチン」は、１種以上の選択された抗原（目的の病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫または真菌）からの抗原由来、またはその抗原に対して相同性、の全ての抗原ではない）を含むワクチン組成物を意味する。このような組成物は、インタクトな病原体細胞または病原体粒子、あるいはこうような細胞または粒子の溶解産物を実質的に含まない。従って、「サブユニットワクチン」は、病原体またはそのアナログ由来の、少なくとも部分的に精製された（好ましくは、実質的に精製された）免疫原性ポリペプチドから調製され得る。従って、サブユニットワクチンに含まれる抗原を得る方法としては、標準的な精製技術、組換え体の産生、または合成物の生成が挙げられる。
（１．０．導入）
アルファウイルス遺伝子の数種のメンバーは、ワクチンのために遺伝子送達系および他の治療適用（ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：４３４−９ １９９９）として開発されている。上記および米国特許第５，７８９，２４５号、同第５，８４３，７２３号、同第５，８１４，４８２号、および同第６，１５６，６９４号、ならびにＷＯ００／６１７７２により詳細に記載されるように、アルファウイルスベクター構造体の代表的な「レプリコン」構成は、アルファウイルスＲＮＡ、アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、隣接非相同性核酸配列の発現を指向するウイルスサブゲノム接合領域プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ認識配列、および好ましくはポリアデニレートトラクトの転写を開始する、５’配列を含む。同一のエレメントを規定する他の用語もまた、当該分野で公知である。
しばしば、インビトロワクチンおよび治療適用に関して、アルファウイルスＲＮＡレプリコンベクターまたはレプリコンＲＮＡは、最初に、ウイルス様粒子（アルファウイルス構造タンパク質（例えば、キャプシドタンパク質およびエンベロープ糖タンパク質）を含む）にパッケージングされる。それらの構成のために、ベクターレプリコンは、組換えアルファウイルスレプリコン粒子にパッケージングするために必要な、これらのアルファウイルス構造タンパク質を発現しない。従って、レプリコン粒子を産生するために、この構造タンパク質は、トランスで提供されなければならない。パッケージングは、種々の方法によって達成され得、この方法としては、以下が挙げられる：インビトロで転写されたレプリコンおよび欠失ヘルパーＲＮＡの同時トランスフェクション（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３５６−１３６１，１９９１；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３；Ｆｒｏｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２８１９−２８２９，１９９７；Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１，１９９７；米国特許第５，７８９，２４５号および同第５，８４２，７２３号）、またはプラスミドＤＮＡベースレプリコンおよび欠失ヘルパー構造物（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）のような一過性アプローチ、および安定なパッケージング細胞株（ＰＣＬ）へのアルファウイルスレプリコンの導入（Ｐｏｌｏら、ＰＮＡＳ ９６：４５９８−４６０３，１９９９；米国特許第５，７８９，２４５号、同第５，８４２，７２３号、同第６，０１５，６９４号；ＷＯ９７３８０８７およびＷＯ９９１８２２６）。
このトランスパッケージング方法論は、１以上の構造タンパク質遺伝子の改変（例えば、減弱化変異体のようなアルファウイルス改変体の配列を取り込むため（米国特許第５，７８９，２４５号、同第５，８４２，７２３号、同第６，０１５，６９４号））、続いて、改変された構造タンパク質の、最終レプリコン粒子への続く取込みを可能にする。さらに、このようなパッケージングは、ベクター構造体とは異なる第２アルファウイルス由来の構造タンパク質を使用して、第１アルファウイルス由来のベクター構造体またはＲＮＡレプリコンをパッケージングすることによって、アルファウイルスレプリコン粒子の全改変を可能にする（ＷＯ９５／０７９９４；Ｐｏｌｏら，１９９９，同書；Ｇａｒｄｎｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｌ．，７４：１１８４９−１１８５７，２０００）。このアプローチは、単一レプリコン粒子中の複数のアルファウイルスから所望の特性を利用するためのメカニズムを提供する。例えば、全てのアルファウイルスは、一般に、それらの全てのレプリコンおよびビリオン構造体のメカニズムと極めて類似しているが、アルファウイルス遺伝子の種々のメンバーは、インビトロにおいて、それらの生物学的特性（例えば、リンパ細胞に対する向性、インターフェロン感受性、疾患プロフィール）においていくつかの特徴的な差異を示し得る。さらに、複数のアルファウイルスは、バイオセイフティーレベル３（ＢＳＬ−３）生物体（これは、ヒトの使用を容易にし、かつ、可能にする粒子の産生（例えば、製造）に関して問題となる）として分類されるが、他は、バイオセイフティーレベル２（ＢＬ−２）として分類される。アルファウイルスレプリコン粒子キメラは、ＢＬ−２レベルウイルス由来のレプリコン粒子中の、ＢＳＬ−３レベルアルファウイルスの粒子特性を含むようなメカニズムを提供する。例えば、ＢＳＬ−３リンパ指向性ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）由来のエンベロープは、非天然のリンパ指向性ＢＬ−２ウイルス（例えば、シンドビスウイルス）に取り込まれ得る。
しかし、今日まで、キメラアルファウイルス粒子の商業的に許容可能な高力価調製物を効果的かつ慣用的に産生するのに限られた成功しかなされてこなかった。このようなキメラアルファウイルス粒子は、特定の向性または組織特異性、宿主による変更された表面抗原性および変更された認識を含む、いくつかの理由のために所望される。これに関して、動物の免疫系は、一般に、ウイルス表面抗原（例えば、エンベロープ糖タンパク質）を認識し、そして内部ウイルス抗原（例えば、キャプシドタンパク質）が免疫系に対して曝露される前に、このウイルス表面抗原に対して特異的な細胞性応答および体液性応答を指向する。結果として、レプリコン粒子レシピエントは、ベクター表面抗原（感作された宿主）に対して指向された抗体を予め持っていた場合、このレプリコン粒子は、標的組織に対してその治療学的充填物を送達し得る前に、攻撃および破壊され得る。ほとんどの成功したレプリコン粒子の多くが、天然に存在する感染ウイルス由来である場合、少なくともいくつかの強力なレプリコン粒子レシピエントが、レプリコン粒子と天然の感染ウイルスとの間で共通である表面抗原に予め曝露され、そしてその表面抗原に対して免疫応答を展開された。逆の免疫応答の可能性はまた、複数の投与において増加される。従って、この可能性を減少または排除するために、サブ配列遺伝子の送達レプリコン粒子は、キメラレプリコン粒子を使用して作製され得、このレシピエントは、同一構造タンパク質を複数回見る必要はない。
効率的な構造相互作用を示すキメラアルファウイルス粒子が、本明細書中に記載される。従って、本発明は、例えば、ＳＩＮ／ＶＥＥキメラを使用する、パッケージング／産生の有意な増加した効率を伴って、組換えキメラアルファウイルス粒子を構築および得るための組成物および方法を提供する。
本発明の利点は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）市販の実行可能なレベルのキメラアルファウイルス粒子を提供すること；（ｉｉ）例えば、組換えおよび／または構造遺伝子パッケージングにより生じる所望しない事象の可能性を減少させるための能力；（ｉｉｉ）特定の組織向性および細胞向性を有する遺伝子送達ビヒクルを提供すること（例えば、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）への抗原送達）。
本明細書において提供される教示により、当業者は、特に、このようなアルファウイルスの配列が既に刊行された場合、広範な種々の異なるアルファウイルス由来のキメラアルファウイルス粒子を構築し得る。真核生物層状ベクター開始システム（ＥＬＶＩＳ）はまた、これらのキメラ組成物を使用して設計され得る。本明細書中に開示されるように、パッケージングのレベルを最適化することによって、キメラリプリコン粒子が、ワクチンに含まれる種々の適用および治療適用において使用するために、提供され得る。
（２．０．０．アルファウイルスレプリコンおよび粒子）
上記のように、本明細書中に記載されるキメラ粒子は、代表的に、１種以上のポリヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ）を含む。粒子として見出される場合、これらのポリヌクレオチドは、１種以上の構造タンパク質によって取り囲まれる（そして、このタンパク質と相互作用する）。本発明の粒子中に使用され得るポリヌクレオチド配列および構造タンパク質の非制限例は、本明細書中に記載される。
（２．１．０．ヌクレオチド成分）
本明細書中に記載される粒子、ベクターおよびレプリコンは、代表的に、種々の核酸配列、コード配列と非コード配列との両方を含む。本明細書中に記載されるキメラ組成物は、一般に、完全なアルファウイルスゲノム未満を含む（例えば、アルファウイルスのゲノム中に含まれる、全てのコード配列および／または非コード配列未満を含む）ことは明らかである。
さらに、本発明において有用な種々のエレメントの本明細書における例示のために、非相同性ウイルス由来のアルファウイルス配列は、利用されるエレメントが、レプリコンまたは欠失ヘルパーＲＮＡにおいて存在するか否かに関係なく（例えば、両方が存在する場合、粒子産生の間）、レプリコン中に使用される非構造タンパク質の供給源であるアルファウイルスと異なるアルファウイルス由来であると考えられることが示されるべきである。
（２．１．１．非コードポリヌクレオチド成分）
本明細書中に記載されるキメラ粒子およびレプリコンは、代表的に、ポリペプチド（例えば、構造タンパク質または非構造タンパク質）をコードする配列、および非コード配列（例えば、コントロールエレメント）を含む。非コード配列の非制限例は、非構造タンパク質媒介増幅のために必用とされる５’配列、３’隣接遺伝子を発現するための手段、サブゲノムｍＲＮＡ ５’末端非翻訳領域（サブゲノム５’ＮＴＲ）、および非構造タンパク質媒介増幅のために必用とされる３’配列を含む（米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６９４号；同第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３８０８７；ＷＯ００／６１７７２）。本明細書中に記載される、１つの配列、１以上の配列または全ての配列は、本明細書中に記載される粒子、ベクターおよび／またはレプリコン中に含まれ得、そしてさらに、これらの配列の１つ以上は、本明細書中の開示に従って、改変されるか、またはそうでなければ操作され得ることが明らかである。
従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドは、代表的に、非構造タンパク質媒介増幅のために必用とされる５’配列を含む。適切な５’配列の非制限例は、以下のようなコントロールエレメントを含む：相同性ウイルス由来のネイティブアルファウイルス５’末端、非相同性ウイルス由来のネイティブアルファウイルス５’末端、相同性ウイルス由来の非ネイティブＤＩアルファウイルス５’末端、非相同性ウイルス由来の非ネイティブＤＩアルファウイルス５’末端、非アルファウイルス由来のウイルス配列（例えば、トガウイルス、植物ウイルス）、細胞ＲＮＡ由来の配列（例えば、ｔＲＮＡエレメント）（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら、ＰＮＡＳ ８０：３２７９−３２８３，１９８３）、相同性を減少させるための上記配列のいずれかの変異体／欠失体（例えば、Ｎｉｅｓｔｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４１６２−４１６８，１９９０；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６４：１６３９−１６４７，１９９０を参照のこと）、および／またはヘルパー中の最小５’配列（約２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個のヌクレオチド）。
ポリヌクレオチド配列はまた、一般に、３’隣接遺伝子（例えば、非相同性配列、ポリペプチドコード配列）を発現するための手段を含む。このような手段の非制限例は、以下のプロモーターなどのようなコントロールエレメントを含む：例えば、相同性ウイルス由来のネイティブアルファウイルスサブゲノムプロモーター、非相同性ウイルス由来のネイティブアルファウイルスサブゲノムプロモーター、コアアルファウイルスサブゲノムプロモーター（相同性または非相同性）、コアサブゲノムプロモーターから上流または下流の最小配列、コアサブゲノムまたはネイティブサブゲノムのプロモーターの変異体／欠失体／付加体、非アルファウイルス由来の適合性サブゲノムプロモーター（例えば、植物ウイルス）、内部リボソーム入口部位（ＩＲＥＳ）、および／またはリボソームリードスルーエレメント（例えば、ＢｉＰ）。
適切なサブゲノムｍＲＮＡ ５’末端非翻訳領域（サブゲノム５’ＮＴＲ）は、以下を含むがこれらに限定されない：相同性ウイルス由来のネイティブアルファウイルスサブゲノム５’ＮＴＲ、非相同性ウイルス由来のネイティブアルファウイルスサブゲノム５’ＮＴＲ、非アルファウイルス由来のウイルス５’ＮＴＲ（例えば、植物ウイルス）、細胞性遺伝子由来の５’ＮＴＲ（例えば、βグロブリン）ならびに／あるいはネイティブアルファウイルスサブゲノム５’ＮＴＲに対して変異体、欠失体および／または付加体を含む配列。
非構造的タンパク質媒介性増幅に必要な適切な３’配列の非限定的な例としては、相同ウイルス由来のネイティブなアルファウイルス３’末端、異種ウイルス由来のネイティブなアルファウイルス３’末端、相同ウイルス由来のネイティブではないＤＩアルファウイルス３’末端、異種ウイルス由来のネイティブではないＤＩアルファウイルス３’末端、非アルファウイルス由来ウイルス配列（例えば、トガウイルス、植物ウイルス）、細胞ＲＮＡ由来配列、相同性を減少するために上記配列の変異、欠失もしくは付加を含む配列（例えば、Ｋｕｈｎら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１４６５−１４７６を参照のこと）、約（２０、３０、５０、１００、２００ヌクレオチド）に対するヘルパーにおける最小配列、および／または細胞修復３’アルファウイルスＣＳＥ由来の配列のような制御エレメントが挙げられる。ポリアデニル化配列もまた、例えば、３’末端配列内に組み込まれ得る（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６−９７８５を参照のこと）。
（２．１．２．コード配列）
本明細書中で記載される組成物はまた、種々のアルファウイルスポリペプチド（例えば、非構造的アルファウイルスポリペプチド（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４））または構造的アルファウイルスポリペプチド（例えば、キャプシド、エンベロープ）のうち１つ以上）をコードする１つ以上の配列を含み得る。
上記のＳｔｒａｕｓｓら（１９８４）に記載されるように、野生型ＳＩＮゲノムは、５’キャップおよび３’末端ポリ（Ａ）トラクトを除いて、１１，７０３ヌクレオチド長である。５’末端キャップの後ろに、５９ヌクレオチドの５’非翻訳核酸、続いて、非構造ポリペプチドをコードし単一のオパール終末コドンを除いてオープンである７５３９ヌクレオチドのリーディングフレームが、存在する。非構造タンパク質コード配列と構造タンパク質コード配列とを分離する連結領域内に位置される４８個の非翻訳塩基に続いて、構造タンパク質をコードする３７３５ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームが存在する。最終的に、３’非翻訳領域は、３２２ヌクレオチド長である。この非構造タンパク質は、２つのポリタンパク質前駆体としてゲノムＲＮＡから翻訳される。一方は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３を含み、１８９６アミノ酸長であり、１８９７位におけるオパールコドンで終止する。４番目の非構造タンパク質であるｎｓＰ４は、オパールコドンの読み抜け（ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）が２５１３アミノ酸長の第２のポリタンパク質前駆体（これは、次いで翻訳後修飾的に切断される）を産生する場合に産生される。
代表的かつ一般的に使用される３つのアルファウイルスＳＩＮ、ＳＦＶおよびＶＥＥのゲノムから非構造タンパク質遺伝子を規定するおよその境界は、以下の通りである。

野生型アルファウイルスゲノムはまた、構造タンパク質をコードする配列を含む。ＳＩＮにおいて、構造タンパク質は、ヌクレオチド７５９８で開始し４１０６ヌクレオチド長であるサブゲノムメッセージから翻訳され（ポリ（Ａ）トラクトの両端を除く）、そしてゲノムＲＮＡの３’末端と同時に終止する。非構造タンパク質と同様に、構造タンパク質もまた、ヌクレオキャプシドタンパク質を産生するように切断されるポリタンパク質前駆体、不可欠である２つの膜糖タンパク質、ならびに成熟ビリオンには存在しない２つの小ペプチドとして翻訳される。よって、本発明のレプリコン、粒子およびベクターは、１つ以上のアルファウイルスの１つ以上のコード配列由来の配列を含み得る。
アルファウイルスのコード領域由来の配列を提供することに加えて、本発明はまた、ポジティブ鎖ＲＮＡ合成、ネガティブ鎖ＲＮＡ合成またはこれらの両方の間の、レプリコンと欠損ヘルパーＲＮＡとの間または２つの欠損ヘルパーＲＮＡ間の鎖間移動（例えば、組換え）の傾向を減少させるために、改変アルファウイルスタンパク質（例えば、改変非構造タンパク質）をコードする配列を含有するアルファウイルスレプリコンベクターを提供する。このような改変としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：例えば、１つのアルファウイルスおよび別のウイルス（例えば、アルファウイルス、トガウイルス、植物ウイルス）からの配列を含むハイブリッド非構造タンパク質全体またはその一部を使用する、ヌクレオチドの変異、欠失、付加、または配列置換。
従って、本発明において種々の配列改変が企図される。例えば、特定の実施形態において、非構造タンパク質遺伝子をコードする配列中に、１つ以上の欠失が存在する。このような欠失は、非構造タンパク質（ｎｓＰ）１、２、３または４において、ならびにｎｓＰ遺伝子の１つより多くからの欠失の組み合わせであり得る。例えば、限定の目的を意図せずに、欠失は、Ｋｉｎｎｅｙら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：１９−３０中の配列に対応して番号付けられたＶＥＥ ｎｓＰ１のアミノ酸残基１０１〜１２０、４５０〜４７０、４６０〜４８０、４７０〜４９０、または４８０〜５００をコードするヌクレオチド配列、および上記のいずれかの中に含まれるより小さな領域を少なくとも含み得る。
別の実施形態において、欠失は、ＶＥＥ ｎｓＰ２のアミノ酸残基９〜２９、６１３〜６３３、６５０〜６７０、または７４０〜７６０をコードする配列、および上記のいずれかの中に含まれるより小さな領域を少なくとも含み得る。別の実施形態において、欠失は、ＶＥＥ ｎｓＰ３のアミノ酸残基３４０〜３７０、３５０〜３８０、３６０〜３９０、３７０〜４００、３８０〜４１０、３９０〜４２０、４００〜４３０、４１０〜４４０、４２０〜４５０、４３０〜４６０、４４０〜４７０、４５０〜４８０、４６０〜４９０、４７０〜５００、４８０〜５１０、４９０〜５２０、５００〜５３０、または４８８〜５２２をコードする配列、および上記のいずれかの中に含まれるより小さな領域を少なくとも含み得る。別の実施形態において、欠失は、ＶＥＥ ｎｓＰ４のアミノ酸残基８〜２８、または５５２〜５７０をコードする配列、および上記のいずれかの中に含まれるより小さな領域を少なくとも含み得る。上記のアミノ酸の範囲はＶＥＥを例として使用して例証されるが、同様の型の欠失が他のアルファウイルスにおいても利用され得る、ということに注意すべきである。
概して、アミノ酸番号付けは、主にポリタンパク質長でのわずかな差異に起因してアルファウイルス間でいくらか異なるが、種々のアルファウイルス由来の配列の間（ａｍｏｎｇｓｔまたはｂｅｔｗｅｅｎ）での整列は、他のアルファウイルスにおける類似の領域を同定する手段を提供する（Ｋｉｎｎｅｙら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：１９−３０中の代表的な整列を参照のこと）。好ましくは、本発明の非構造タンパク質遺伝子欠失は、複数のアルファウイルスの間で保存されていないとみなされるアミノ酸の領域またはストレッチに限られる。さらに、保存された領域はまた、欠失に供され得る。
（２．２．アルファウイルス構造タンパク質）
アルファウイルスレプリコンまたはベクターポリヌクレオチド成分を取り囲む（およびいくつかの場合、それと相互者王する）構造タンパク質は、キャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質の両方を含み得る。ほとんどの例において、ポリヌクレオチド成分は、ヌクレオキャプシドを形成するキャプシドタンパク質によって取り囲まれる。順々に、ヌクレオキャプシドタンパク質は、エンベロープタンパク質を含む脂質エンベロープによって取り囲まれる。キャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質の両方を有することが好ましいが両方ともを必要とはしないことが、理解されるべきである。
アルファウイルスキャプシドタンパク質およびエンベロープタンパク質は、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５８：４９１−５６２に一般的に記載される。キャプシドタンパク質は、アルファウイルス構造ポリタンパク質のＮ末端タンパク質であり、ポリタンパク質からのプロセシングの後に、アルファウイルスＲＮＡおよび他のキャプシドタンパク質モノマーと相互作用してヌクレオキャプシド構造を形成する
。
アルファウイルスエンベロープ糖タンパク質（例えば、Ｅ２、Ｅ１）は、レセプター結合および標的細胞への侵入に機能的に関与する表面「スパイク」としてエンベロープ粒子から突き出る。
これらの構造タンパク質（またはその領域）の一方または両方が、野生型と比較して１つ以上の改変を含み得る。「ハイブリッド」構造タンパク質（例えば、２つ以上のアルファウイルス由来の配列を含むタンパク質）はまた、本発明の実施における用途を見出す。ハイブリッドタンパク質は、種々のアルファウイルス由来の１つ以上の領域を含み得る。これらの領域は、連続であっても非連続であってもよい。好ましくは、構造タンパク質の特定の領域（例えば、機能領域（例えば、エンベロープタンパク質の細胞質テール部分またはキャプシドタンパク質のＲＮＡ結合ドメイン）は、第１のアルファウイルス由来である。タンパク質の「残りの」配列の任意の量（例えば、設計された領域の外側の任意の配列）は、この第１のアルファウイルスとは異なる１つ以上のアルファウイルス由来であり得る。「残りの」部分の約２５％〜１００％（またはこれらの値の間の任意のパーセント）の間、より好ましくは、約３５％〜１００％（またはこれらの値の間の任意のパーセント）の間、さらにより好ましくは、約５０％〜１００％（またはこれらの値の間の任意のパーセント）の間が異なるアルファウイルス由来であることが好ましい。ハイブリッドにおける１つ以上の異なるアルファウイルス由来の配列は、連続であっても非連続であってもよく、換言すれば、１つのアルファウイルス由来の配列は、１つ以上の異なるアルファウイルス由来の配列によって分けられ得る。
（２．３．改変バイオセイフティーレベル−３のアルファウイルスレプリコン）
本明細書中に記載される組成物および方法はまた、ＢＳＬ−３アルファウイルス（例えば、ＶＥＥ）由来のレプリコンベクターまたは真核生物階層ベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）の改変を可能し、そしてこれらは、親ＢＳＬ−３アルファウイルス由来のヌクレオチド配列をゲノム長の１／３より長いが２／３未満の長さに低減させることによって、より低い分類レベル（例えば、ＢＳＬ−２またはＢＳＬ−１）で利用され得る。
従って、以下を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡ配列を含むキメラレプリコンベクター、粒子またはＥＬＶＩＳが、使用され得る：非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、非アルファウイルス異種性配列、非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’配列、および必要に応じて、ポリアデニル化トラクト。ここで、この非構造タンパク質の少なくとも１つをコードする配列は、ＢＳＬ−３ウイルス由来であるが、レプリコンＲＮＡは、親のバイオセイフティーレベル３アルファウイルスのゲノム長の２／３未満を全体で含むこのバイオセイフティーレベル３アルファウイルス由来の配列を含む。
従って、本明細書中に記載されるようなレプリコン配列は、６６．６７％未満の配列がＢＳＬ−３アルファウイルスに対してその全体配列にわたって同一であることを示す。換言すると、ＢＳＬ−３ゲノムと比較して多くの個々の領域の配列同一性が存在し得るが、ＢＳＬ−３のゲノム長全体に対する全体の相同性または同一性パーセントは、６６．６７％未満で３３．３３％を超える。好ましくは、このバイオセイフティーレベル３アルファウイルス由来のレプリコン配列は、親のバイオセイフティーレベル３アルファウイルスのゲノム長の４０％と２／３との間の長さを含む。より好ましくは、このバイオセイフティーレベル３アルファウイルス由来のレプリコン配列は、親のバイオセイフティーレベル３アルファウイルスのゲノム長の５０％と２／３との間の長さを含む。さらにより好ましくは、このバイオセイフティーレベル３アルファウイルス由来のレプリコン配列は、親のバイオセイフティーレベル３アルファウイルスのゲノム長の５５％と２／３との間の長さを含む。最も好ましくは、このバイオセイフティーレベル３アルファウイルス由来のレプリコン配列は、親のバイオセイフティーレベル３アルファウイルスのゲノム長の６０％と２／３との間の長さを含む。
本明細書中で使用される場合、バイオセイフティーレベルの規定（例えば、バイオセイフティーレベル２、３、４）は、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）からのＨＨＳ出版物「Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ」の規定としてみなされる。このような分類に属するものの抜粋は、以下に援用される。
バイオセイフティーレベル１の実施、安全装置、ならびに設備の設計および建造は、学部学生および中等教育での訓練および教育の実験室に適切であり、そして他の実験室について、そこでの研究は、健康なヒト成体に疾患を生じさせることが一貫して知られていない生存可能な生物の規定された株および特徴付けられた株を用いて行われる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｇｒｕｂｒｉ、感染性イヌ肝炎ウイルスおよびＮＩＨ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓの下で隔離された生物は、これらの基準を満たす代表的な微生物である。しかし、ヒトにおける疾患プロセスに通常は関連しない多くの因子は、日和見の病原体であり、そして若い個体、老齢の個体、および免疫不全または免疫抑制の個体において感染を生じ得る。複数のインビボ継代を行ったワクチン株は、これらは単にワクチン株であるので、無毒性であるとみなすべきではない。バイオセイフティーレベル１は、封じ込めの基底レベルを示し、このレベルは、手洗いのためのシンク以外に推奨される特別な一次バリアまたは二次バリアがない標準的な微生物学的実施に依存する。
バイオセイフティーレベル２の実施、装置、ならびに設備の設計および建造は、臨床、診断、教育および他の実験室に適用可能であり、そしてそこでの研究は、その共同体に存在しそして重篤度が変化するヒト疾患に関連する、広いスペクトルである固有の中程度の危険因子を用いて行われる。良好な微生物学的技術を用いて、これらの因子は、スプラッシュまたはエアロゾルを産生する可能性が低い条件で、開放ベンチにて実施される作業において安全に使用され得る。Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、サルモネラおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．は、この封じ込めレベルに割り当てられた代表的な微生物である。バイオセイフティーレベル２は、感染性因子の存在が未知であり得る任意のヒト由来血液、体液、組織またはヒト初代細胞株を用いて作業が行われる場合に、適切である。（ヒト由来材料を用いる研究室職員の作業は、特に必要とされる予防措置について、ＯＳＨＡ Ｂｌｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ ２を参照すべきである。）これらの因子を用いる職員の作業に対する一次的な危険は、偶然の経皮的または経粘膜的な膜曝露、あるいは感染性材料の摂取に関する。夾雑した針または鋭利な装置に対して、かなりの用心をすべきである。バイオセイフティーレベル２で慣用的に操作される生物がエアロゾル経路によって伝染性であることが例え知られていなくても、このような職員の曝露の危険性を増加し得るエアロゾルを用いる手順またはスプラッシュの可能性の高い手順は、基本的な封じ込め装置内、またはＢＳＣもしくは安全遠心分離キャップのようなデバイス内で行われなければならない。他の一次バリア（例えば、スプラッシュシールド、顔面保護、ガウンおよび手袋）が、適切に使用されるべきである。二次バリア（例えば、手洗いシンクおよび消耗性の汚染除去設備）は、潜在的な環境夾雑を低減させるために利用可能でなければならない。
バイオセイフティーレベル３の実施、安全装置、ならびに設備の設計および建造は、臨床、診断、教育、研究または生成の設備に適用可能であり、そこでの作業は、呼吸性伝染の潜在性を有する固有の因子または外来の因子を用いて行われ、これらの因子は、重篤かつ潜在的に致死的な感染を生じ得る。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、セントルイス脳炎ウイルスおよびＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉは、このレベルに割り当てられる代表的な微生物である。これらの因子を用いて作業する職員に対する一次的な危険は、自己接種、経口摂取、および感染性エアロゾルへの曝露に関する。バイオセイフティーレベル３では、連続する領域、共同体および環境内の職員を潜在的感染性エアロゾルに対する曝露から保護するために、一次バリアおよび二次バリアに対してより重点が置かれる。例えば、研究室での操作の全てが、ＢＳＣ内または他の囲まれた器具（例えば、気体の密なエアロゾル生成チャンバ）内で行われるべきである。このレベルに対する二次バリアは、研究室への制御された通行および研究室からの感染性エアロゾルの放出を最小化する換気装置を含む。
本発明の実施において使用され得るＢＳＬ−３アルファウイルスの非限定的例示としては、Ｃａｂａｓｓｏｕウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、Ｔｏｎａｔｅウイルス、Ｂａｂａｎｋｉウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＣ−８３ワクチン株を除く）、ゲタウイルス、チクングニヤウイルス、ミッデルブルグウイルス、サギヤマウイルス、エバーグレイズウイルス、マヤロウイルスおよびムカンボウイルスが挙げられる。
バイオセイフティーレベル４の実施、安全装置、ならびに設備の設計および建造は、生存を脅かす疾患の高い個々の危険性を提示する危険因子および外来因子を用いる作業に適用可能である。これらの因子は、エアロゾル経路を介して伝染され得、そしてこれらの因子に対して適用可能なワクチンおよび治療は存在しない。バイオセイフティーレベル４因子に対する密接または同一の抗原性関連を有する因子はまた、このレベルで操作されなければならない。十分なデータが得られる場合、これらの因子を用いる作業は、このレベルまたはより低いレベルで続け得る。マールブルグウイルスまたはコンゴ−クリミア出欠熱ウイルスのようなウイルスは、バイオセイフティーレベル４で操作される。バイオセイフティーレベル４因子を用いて作業する職員に対する一次的な危険は、感染性エアロゾルへの呼吸性曝露、感染性飛沫への粘膜または怪我をした皮膚の曝露、および自己接種である。潜在的に感染性の診断材料、単離物および天然に感染した動物または実験的に感染した動物の全ての操作は、研究室の職員、共同体および環境に対する曝露および感染の高い危険性を提示する。エアロゾル化した感染性材料からの研究員の完全な隔離は、クラスＩＩＩ ＢＳＣ内での作業または全身性エア供給された陽圧の職員用スーツを着用した作業によって一次的に達成される。バイオセイフティーレベル４設備自体は、一般に、環境に対する生存可能な因子の放出を防ぐための複雑な特別化された換気装置および消耗性処理システムを有する、別々の建物であるかまたは完全に隔離された区域である。
本発明の範囲内で利用される場合、任意のＢＳＬ−３ウイルス（親ウイルスといわれる）由来の元々のゲノム長の配列の１／３より長く２／３未満を含むレプリコンの作製は、種々の方法で達成され得る。例えば、親ウイルスの連続領域または非連続領域が、欠失され得る。あるいは、親ウイルスの連続領域または非連続領域が、利用され得る。あるいは、親ウイルスの領域が切り出され得、そしてＢＳＬ−２骨格またはＢＳＬ−１骨格に連結され得る。
特定の実施形態において、アルファウイルスの５’末端および／または３’末端（非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる配列）は、異種性配列の発現のためのレプリコンに関して十分な機能を維持することが必要とされる最少ヌクレオチド配列に減少されるか、または、同一の機能を実施し得る非アルファウイルス配列によって置換される。他の実施形態において、１つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子は、アルファウイルスの間でまたは他で十分に保存されない特定領域（例えば、ｎｓＰ３非保存領域）内で欠失され得る。あるいは、アルファウイルスサブゲノムプロトコル領域またはサブゲノム５’ＮＴＲ領域は、欠失を含み得る。なおさらなる実施形態において、１つ以上の構造タンパク質遺伝子および上記のいずれかの組み合わせが、欠失され得る。
（３．０．キメラレプリコン粒子の産生方法）
本発明に従うキメラアルファウイルスレプリコン粒子は、種々の公開された方法を使用して産生され得る。このような方法としては、例えば、一過性パッケージングアプローチ（例えば、インビトロ転写されたレプリコンおよび欠損ヘルパーＲＮＡの同時トランスフェクト（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３５６−１３６１，１９９１；Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６，１９９３；Ｆｒｏｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２８１９−２８２９，１９９７；Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１，１９９７；米国特許第５，７８９，２４５号および同第５，８４２，７２３号）またはプラスミドＤＮＡベースのレプリコンおよび欠損ヘルパー構築物（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９，１９９６）ならびに安定なパッケージング細胞株（ＰＣＬ）へのアルファウイルスレプリコンの導入（Ｐｏｌｏら、ＰＮＡＳ ９６：４５９８−４６０３，１９９９；米国特許第５，７８９，２４５号、同第５，８４２，７２３号、同第６，０１５，６９４号；ＷＯ９７／３８０８７、ＷＯ９９／１８２２６、ＷＯ００／６１７７２およびＷＯ００／３９３１８）が挙げられる。
好ましい実施形態において、安定なアルファウイルスパッケージング細胞株は、レプリコン粒子産生に利用される。ＰＣＬは、インビトロ転写されたレプリコンＲＮＡでトランスフェクトされても、プラスミドＤＮＡベースのレプリコン（例えば、ＥＬＶＩＳベクター）でトランスフェクトされても、レプリコン粒子の種ストックで感染されてもよく、次いで、培養上清中に高力価のパッケージングレプリコン粒子を産生させるために十分な条件および時間の下でインキュベートされる。特に好ましい実施形態において、ＰＣＬは、２工程プロセスを利用し、ここで、第１工程として、レプリコン粒子の種ストックがプラスミドＤＮＡベースのレプリコンでＰＣＬをトランスフェクトすることによって産生される。次いで、レプリコン粒子の多量のストックが、第２工程においてＰＣＬの新鮮な培養物を種ストックで感染させることによって産生される。この感染は、種々の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ＭＯＩ）（ＭＯＩ＝０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、３、５または１０を含む）を使用して行われ得る。好ましくは、感染は、低いＭＯＩ（例えば、１未満）で行われる。＞１０８の感染単位（ＩＵ）／ｍｌの力価でさえ、レプリコン粒子は、種ストックで感染させたＰＣＬから自然に回収され得る。さらに、レプリコン粒子は、低い感染多重度を繰り返すことによって、その後ナイーブなＰＣＬのさらに大きな培養物に継代され得、同一の力価を有する商業規模の調製物を生じる。重要なことに、「分裂」構造遺伝子配置のＰＣＬを使用することによって、これらのレプリコン粒子ストックは、検出可能に夾雑するＲＣＶを含むことなく産生され得る。
上記されるように、アルファウイルスレプリコン粒子の大規模産生は、バイオリアクタを使用して行われ得る。好ましくは、バイオリアクタは、外部成分バイオリアクタであり、これは、多量の培養、増殖、および細胞に接着する基材のプロセス制御について統合されたモジュレーターバイオリアクタである。細胞（例えば、アルファウイルスパッケージング細胞）の接着および増殖は、表面処理した組織培養物を有する管（ｖｅｓｓｅｌ）または区画（ｃｈａｍｂｅｒ）で生じ、そしてこの細胞は、細胞生産性を増加させるための新鮮な培地を用いる。モニタリングおよび調整が、気体、温度、ｐＨ、グルコースなどのようなパラメータについて行われ、そして粗製のベクターが、灌流ポンプを使用して回収される。典型的には、Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒの外部成分は、連結されている（すなわち、チューブを介して）外部モジュールを分ける。個々の成分は、ポンプ、リザーバ、酸素供給器、培養モジュール、および他の標準的でない部品であり得る。Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒの代表的な例は、ＣｅｌｌＣｕｂｅＴＭシステム（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ）である。
本明細書中に記載される外部成分バイオリアクタの使用に加えて、より伝統的なＳｔｉｒ Ｔａｎｋ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒもまた、特定の例において、アルファウイルスレプリコン粒子産生のために使用され得る。Ｓｔｉｒ Ｔａｎｋ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒにおいて、アルファウイルスパッケージング細胞は、いずれのマトリクスにも接着され得ない（すなわち、懸濁液中に浮遊する）か、またはマトリクス（例えば、ポリディスク、微小キャリアまたは巨大キャリア、ビーズ）に接着され得る。あるいは、Ｈｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍが使用され得る。
回収後、キメラアルファウイルスレプリコン粒子を含有する粗製培養上清は、その回収物をフィルター（例えば、ポアサイズ０．２μｍ、０．４５μｍ、０．６５μｍ、０．８μｍ）を通過されることによって清澄かされ得る。必要に応じて、この粗製上清は、大きな細胞片を除くために濾過の前に低速遠心分離に供され得る。１つの実施形態において、外因性の核酸を消化するためにエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ，Ｓｉｇｍａ＃Ｅ８２６３）が、クロマトグラフィー精製工程の前または後にアルファウイルスレプリコン粒子の調製物に添加される。さらに、この調製物は、広く知られた方法（例えば、接線濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））のいずれか１つを使用して、精製の前に濃縮され得る。
粗製または清澄化されたアルファウイルスレプリコン粒子は、クロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）によって、濃縮および精製され得る。２つ以上のこのような精製方法を、連続的に実施し得る。好ましい実施形態において、少なくとも１工程のイオン交換クロマトグラフィーが実施され、そしてイオン交換樹脂（例えば、触手状（ｔｅｎｔａｃｌｅ）イオン交換樹脂）を利用し、そして少なくとも１工程のサイズ排除クロマトグラフィーが実施される。簡単にいえば、清澄化されたアルファウイルスレプリコン粒子の濾液が、荷電したイオン交換マトリックスまたは樹脂（例えば、陽イオン交換または陰イオン交換）を含むカラムに充填され得る。このマトリックスまたは樹脂は、種々の物質（架橋したアガロース、架橋したポリスチレン、架橋したスチレン、親水性ポリエーテル樹脂、アクリル樹脂、およびメタクリレートベースの樹脂が挙げられるがこれらに限定されない）からなり得る。イオン交換体成分は、スルホプロピル陽イオン交換体、カルボキシメチル陽イオン交換体、スルホン酸交換体、スルホン酸メチル陽イオン交換体、およびＳＯ３−交換体からなる列挙より選択される陽イオン交換体を含み得るが、これらに限定されない。他の実施形態において、イオン交換体成分は、ＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、およびＤＭＡＥからなる列挙より選択される陰イオン交換体を含み得るが、これらに限定されない。最も好ましくは、イオン交換クロマトグラフィーは、触手状カチオン交換体を使用して実施され、ここで、イオン交換樹脂は、ＳＯ３−陽イオン交換体を有するメタクリレートベースの樹脂（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＤＭ ＳＯ３−）である。
キメラレプリコン粒子は、イオン交換樹脂に結合され、次いで、塩（例えば、２５０ｍＭ以下のＮａＣｌ）を含有する緩衝液で１回以上洗浄され得る。次いで、レプリコン粒子は、増加した塩濃度を有する緩衝液を使用して、精製された形態でカラムから溶出され得る。好ましい実施形態において、塩濃度は、少なくとも３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭである。溶出は、好ましくは、２８０ｎｍで分光光度計によってモニタリングされ得るが、レプリコン力価アッセイ、発現の転移（ＴＯＥ）アッセイ、または引き続くクーマシー染色もしくはウェスタンブロッティングを伴うタンパク質ゲル分析によってもまたモニタリングされ得る。
より高い塩溶出緩衝液は、その後、例えば、適切な水溶液中に希釈することによって、または分子排除カラムに粒子含有溶出液を通すことによって、より望ましい緩衝液に交換され得る。さらに、分子サイズ排除カラムの使用はまた、特定の例において、さらなる精製を提供し得る。例えば、１つの実施形態において、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００またはＳ−４００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーを、緩衝液交換と、イオン交換カラムから溶出したレプリコン粒子を含有する画分をさらに精製するためのとの両方として、使用し得る。この特定の樹脂を使用すると、レプリコン粒子は、一般に、遅い空隙容量に溶出し、そしていくらかの夾雑物は分子量が小さく、カラム中により長く残るので、純度のレベルにおける改善を示す。しかし、異なる組成およびサイズ排除の代替の樹脂もまた、使用され得、これは、類似の結果または改善された結果を生じ得る。これらのストラテジーにおいて、より大きいサイズの樹脂（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００）が組み込まれ得、これは、レプリコン粒子がマトリックスに入ることを可能にし、従って、より長く保持され、分画を可能にする。
本明細書中に記載される方法は、欠損したヘルパーＲＮＡおよびレプリコンベクターが同じウイルス由来の遺伝子を含み、従って、レプリコン粒子アセンブリのプロセスが自然に進行することを可能にして、非構造タンパク質遺伝子に寄与する同じウイルス由来のウイルスキャプシドおよびエンベロープタンパク質にレプリコンがパッケージされた、レプリコン粒子を生じる、広範に実施される方法とは異なる。その結果、このような方法において、パッケージングシグナル（パッケージング配列としてもまた公知）、ＲＮＡ結合ドメイン、糖タンパク質相互作用ドメインおよびエンベロープ糖タンパク質は、全て、同じウイルスに由来する。
対照的に、本明細書中に記載される方法は、アルファウイルスレプリコン粒子の、２つ以上のアルファウイルス由来の配列からの首尾よい効率的な産生を包含する。本明細書中に記載されるように、これらの粒子はより効率的に産生され、そしてさらに、他の利点もまた有する。
アルファウイルスレプリコンＲＮＡをレプリコン粒子にパッケージ（レプリコン粒子を産生）し、そしてパッケージングの間に、複製コンピテントなウイルス（例えば、野生型ウイルス）が発生する可能性を減少させる方法もまた提供され、この方法は、以下の工程を包含する：許容細胞に、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質および異種ポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンＲＮＡを、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上の欠損ヘルパーＲＮＡと共に、導入する工程、ならびにこの細胞を、適切な条件下で、レプリコン粒子の産生を可能にするために十分な時間にわたってインキュベートする工程。これらの実施形態において、レプリコンＲＮＡと欠損ヘルパーＲＮＡとの両方が、コントロールエレメント（特に、非構造タンパク質媒介増幅のための５’配列）、ポリペプチドコード配列を発現する手段（このポリペプチドコード配列はまた、３’隣接遺伝子と称される）（例えば、（１）レプリコンにおける異種タンパク質および（２）欠損ヘルパーＲＮＡにおける構造タンパク質の発現を駆動するプロモーター）、非構造タンパク質媒介増幅のために必要な３’配列、ポリアデニル化路、および必要に応じて、サブゲノム５’−ＮＴＲを含む。さらに、公知の方法とは異なり、これらの制御エレメントの１つ以上は、レプリコンにおけるＲＮＡと、欠損ヘルパーにおけるＲＮＡとの間で異なる（例えば、配列が異なる）。例えば、特定の実施形態において、非構造タンパク質媒介増幅のために必要とされる５’配列は、レプリコンとヘルパーＲＮＡとの間で異なる。他の実施形態において、非構造タンパク質媒介増幅のために必要とされる、ポリペプチドコード配列および／または３’配列を発現させるための手段は、レプリコンとヘルパーＲＮＡとの間で異なる。
許容細胞へのレプリコンＲＮＡの導入は、種々の手段（例えば、ＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ）のトランスフェクションまたはエレクトロポレーション、細胞内でのＤＮＡからのＲＮＡの転写（例えば、真核生物層状ベクター開始系）、あるいはウイルス粒子またはウイルス様粒子（例えば、レプリコン粒子）による送達）によって実施され得ること、ならびに許容細胞への欠損ヘルパーＲＮＡの導入もまた、種々の手段（例えば、ＲＮＡ（例えば、インビトロで転写されたＲＮＡ）のトランスフェクションまたはエレクトロポレーション、または細胞内でのＤＮＡからのＲＮＡの転写（例えば、構造タンパク質発現カセット））によって実施され得ることを、当業者は理解する。
さらに、相同配列を減少させるための改変もまた、例えば、パッケージング細胞の誘導のために使用される真核生物層状ベクター開始系または構造タンパク質発現カセットにおいて、ＤＮＡ骨格レベルで実施され得る。いくつかの改変としては、代替の真核生物プロモーター、ポリアデニル化配列、抗生物質耐性マーカー、細菌の複製起点、および他の非機能的骨格配列が挙げられるが、これらに限定されない。
（４．０ 薬学的組成物）
本発明はまた、本明細書中に記載されるアルファウイルスレプリコン粒子、ベクターおよび／またはレプリコンのいずれかを、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含有する、薬学的組成物を提供する。特定の好ましい実施形態において、十分な量の処方物緩衝液が、精製されたレプリコン粒子に添加されて、水性懸濁物を形成する。好ましい実施形態において、この処方物緩衝液は、水中に糖類および緩衝成分を含有し、そしてまた、１つ以上のアミノ酸または高分子量構造添加剤を含有し得る。この処方物緩衝液は、成分の所望の最終濃度に達するために十分な量で、そしてレプリコン粒子を最小に希釈するように、添加される。次いで、この水性懸濁物は、好ましくは−７０℃で貯蔵され得るか、または即座に乾燥され得る。
この水性懸濁物は、凍結乾燥または周囲温度でのエバポレーションによって乾燥され得る。簡単にいえば、凍結乾燥は、この水性懸濁物の気体転移温度未満または共融点温度未満に、この水性懸濁物を冷却する工程、および昇華によって、この冷却された懸濁物から水を除去し、凍結乾燥されたレプリコン粒子を形成する工程を包含する。１つの実施形態において、処方された組換えウイルスのアリコートが、凍結乾燥機（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ １２Ｋ）に取り付けられたＥｄｗａｒｄｓ Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ Ｃｈａｍｂｅｒ（３棚ＲＣ３Ｓユニット）に入れられる。Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ １８：４１４、１９８１）によって記載されるような多工程凍結乾燥手順を使用して、処方されたレプリコン粒子を、好ましくは、−４０℃〜−４５℃の温度で凍結乾燥する。得られた組成物は、凍結乾燥されたレプリコン粒子の１０重量％未満の水を含有する。一旦、凍結乾燥されると、レプリコン粒子は安定であり、そして以下にさらに詳細に議論されるように、−２０℃〜２５℃で貯蔵され得る。エバポレーションの方法においては、水は、エバポレーションによって、周囲温度で水性懸濁物から除去される。１つの実施形態において、水は、噴霧乾燥プロセスによって除去され、ここで、水性懸濁物は、予熱された気体の流れに送達され、これは通常、懸濁物の液滴から水を急速に蒸発させる。一旦、脱水されると、組換えウイルスは安定であり、そして−２０℃〜２５℃で貯蔵され得る。
処方のために使用される水溶液は、好ましくは、糖類、緩衝成分、および水を含有する。この溶液はまた、１つ以上のアミノ酸および高分子量の構造添加剤を含有し得る。この成分の組合せは、凍結、およびにまた凍結乾燥またはエバポレーションによる乾燥の際にレプリコン粒子の活性を保存するように働く。好ましい糖類は乳糖であるが、他の糖類が使用され得る（例えば、ショ糖、マンニトール、グルコース、トレハロース、イノシトール、フルクトース、マルトース、またはガラクトース）。特に好ましい乳糖の濃度は、３重量％〜４重量％である。
高分子量構造添加剤は、凍結の間、粒子の凝集を防止する際に補助し、そして凍結乾燥状態または乾燥状態での構造的支持を提供する。本発明の文脈において、構造添加剤は、これらが５０００のＭ．Ｗ．である場合に、「高分子量」であるとみなされる。好ましい高分子量構造添加剤は、ヒト血清アルブミンである。しかし、他の物質もまた使用され得る（例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、デキストラン、セルロース、ゼラチン、またはポビドン）。特に好ましいヒト血清アルブミンの濃度は、０．１重量％である。
緩衝成分は、比較的一定のｐＨを維持することによって、溶液を緩衝するように働く。所望のｐＨ範囲（好ましくは、７．０と７．８との間）に依存して、種々の緩衝剤が使用され得る。適切な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤およびクエン酸緩衝剤が挙げられる。さらに、この水溶液が、最終の処方レプリコン粒子を適切な等浸透圧塩濃度に調整するために使用される中性塩を含有することが、好ましい。適切な中性塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または塩化マグネシウムが挙げられる。好ましい塩は、塩化ナトリウムである。本発明の、凍結乾燥または脱水されたレプリコン粒子は、種々の物質を使用して再構成され得るが、好ましくは、水を使用して再構成される。特定の例において、最終処方物を等張性にする希薄塩溶液もまた、使用され得る。
（５．０ 適用）
キメラアルファウイルス粒子は、広範なヌクレオチド配列（例えば、リンホカインまたはサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、プロドラッグ転換酵素（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ、ＶＺＶ−ＴＫ）、免疫応答を刺激する抗原（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、腫瘍抗原）、増殖因子または調節因子のような治療分子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ）、免疫応答を補助または阻害するタンパク質、ならびにリボザイムおよびアンチセンス配列をコードする配列を含む）を送達するために使用され得る。上記ヌクレオチド配列は、以前に参照されたもの（例えば、米国特許第６，０１５，６８６号、ＷＯ ９７３８０８７およびＷＯ ９９１８２２６）を含み、そして貯蔵所から得られ得るか、公開された配列を使用して細胞または他のＲＮＡから容易にクローニングされ得るか、あるいは例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．ＤＮＡ合成機（例えば、ＡＰＢ ＤＮＡ合成機モデル３９２（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で合成され得る。
本発明の目的で、事実上任意のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが使用され得る。抗原は、いくつかの公知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌、ならびに任意の種々の腫瘍抗原または免疫応答が所望される任意の他の抗原由来であり得る。さらに、本発明の目的で「抗原」とは、タンパク質が免疫学的応答を引き起こす能力を維持する限り、ネイティブの配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、保存的な性質））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように故意であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異を介してのように偶然であり得る。
抗原は、単独でか、または任意の組合せで使用される（例えば、細菌抗原の組み合わせの使用を記載するＷＯ ０２／００２４９を参照のこと）。これらの組合せとしては、同じ病原体由来の複数の抗原、異なる病原体由来の複数の抗原、または同じ病原体および異なる病原体由来の複数の抗原が挙げられ得る。従って、細菌、ウイルス、腫瘍および／または他の抗原が、同じ組成物中に含まれる得か、または同じ被験体に別個に投与され得る。免疫応答を引き起こすために使用される抗原の組合せが組み合わせて使用されることが、一般に好ましい。
細菌病原体の非限定的な例としては、以下が挙げられる：例えば、ジフテリア（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９８，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編の第３章（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０）を参照のこと）、ブドウ球菌（例えば、Ｋｕｒｏｄａら（２００１）Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１２２５−１２４０に記載されるようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、コレラ、結核、Ｃ． ｔｅｔａｎｉ（破傷風としてもまた公知）（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９８，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編の第４章を参照のこと、ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０）、Ａ群およびＢ群連鎖球菌（例えば、Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．１９：３３１−３３２；Ｒｕｂｉｎら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．４７：２６９−２８４；Ｊｅｄｒｚｅｊａｓら（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６５：１８７−２０７；Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５３：５１−５６；英国特許出願第００２６３３３．５号；同第００２８７２７．６号；同第０１５６４０．７号； Ｄａｌｅら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３：２２７−１２４３；Ｆｅｒｒｅｔｔｉら（２００１）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９８：４６５８−４６６３に記載されるような、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓが挙げられる）、百日咳（例えば、Ｇｕｓｔｔａｆｓｓｏｎら（１９９６） Ｎ．Ｅｎｇｉ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：３４９−３５５；Ｒａｐｐｕｏｌｉら（１９９１）ＴＩＢＴＥＣＨ ９：２３２−２３８を参照のこと）、髄膜炎、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ （例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ １９ 補遺１：Ｓ１０１−１０７を参照のこと）ならびに他の病理状態（限定されないが、髄膜炎菌（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｙ）、淋菌（例えば、ＷＯ ９９／２４５７８；ＷＯ ９９／３６５４４；およびＷＯ ９９／５７２８０を参照のこと）、ヘリコバクターピロリ（例えば、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ（例えば、ＷＯ ９３／１８１５０；ＷＯ ９９／５３３１０；ＷＯ ９８／０４７０２に記載される）およびインフルエンザ菌、Ｂ型インフルエンザ菌（ＨＩＢ）（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１２５１−１２６３を参照のこと）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｒｏｓｓら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：４１３５−４１３２）ならびにこれらの組合せが挙げられる）。
ウイルス病原体の非限定的な例としては、以下が挙げられる：髄膜炎、ライノウイルス、インフルエンザ（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」、１２７−１６８頁：Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）など。他のウイルス由来の抗原もまた、本発明において用途を見出し、例えば、限定されないが、とりわけ、以下である：ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー由来のタンパク質（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ４７：２８７−３０８；ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＳｐａｎｎ（１９９９）Ａｍ Ｆａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ ５９：１１３−１１８；１２５−１２６に記載されるような、例えば、ポリオウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科（フラビウイルス属（例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルスの血清型、ダニ媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス）；ペスチウイルス属（例えば、古典的なブタ熱ウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、ボーダー病ウイルス）；およびヘパシウイルス（ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）（例えば、米国特許第４，７０２，９０９号；同第５，０１１，９１５号；同第５，６９８，３９０号；同第６，０２７，７２９号；および同第６，２９７，０４８号に記載されるような、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）が挙げられる）；パルボウイルス属（例えば、パルボウイルスＢ１９）；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ラボドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、Ｄｒｅｓｓｅｎら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ １５ 補遺：ｓ２〜６；ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ．１９９８年１月１６日：４７（１）：１２，１９に記載されるような、例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９８，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編の第９章〜第１１章（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０）に記載されるような、例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹、ＲＳウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，１９９８，ＰｌｏｔｋｉｎおよびＭｏｒｔｉｍｅｒ編の第１９章（ＩＳＢＮ ０−７２１６−１９４６−０）に記載されるような、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型のインフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−１１；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ＨＴＩ，Ｒなどとしてもまた公知））であり、単離体ＨＩＶＩｌｌｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ ＬＡＶ、ＨＩＶＩ−ＡＬ、Ｉ−ＩＩＶＭＮ由来の抗原が挙げられるが、これらに限定されない）；ＨＩＶ−Ｉ ＣＭ２３５、ＨＩＶ−Ｉ ＩＪＳ４；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）。さらに、抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｉｌｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，１９９１）を参照のこと。
肝炎科のウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）（例えば、Ｂｅｌｌら（２０００）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．Ｊ．１９：１１８７−１１８８；Ｉｗａｒｓｏｎ（１９９５）ＡＰＭＩＳ １０３：３２１−３２６を参照のこと）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（例えば、Ｇｅｒｌｉｃｈら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ ８ 補遺：Ｓ６３−６８および７９−８０を参照のこと）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる）由来の抗原もまた、本明細書中に記載される技術において、好都合に使用される。例として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法と同様に、公知である。例えば、国際出願公開番号ＷＯ ８９／０４６６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。本発明にはまた、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２４５；ＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７３およびＰＣＴ／ＵＳ９９／３１２７２に記載されるようなポリペプチドの分子改変体が包含される。
腫瘍抗原の非限定的な例としては、ＣＤ８＋リンパ球によって認識される抗原（例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１、チロシナーゼ関連タンパク質−２、メラノサイト刺激ホルモンレセプター）；変異抗原（例えば、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ−４、カスパーゼ−８、ＫＩＡ ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１）；癌−精巣抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＮＹ−ＥＳＯ−１）；および癌において過剰発現される変異されていない共有抗原（例えば、α−フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｇ−２５０、ＭＵＣ−１、癌胎児抗原、ｐ５３、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕ））ならびにＣＤ４＋リンパ球によって認識される抗原（例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ）が挙げられる。ＷＯ ９１／０２０６２、米国特許第６，０１５，５６７号、ＷＯ ０１／０８６３６、ＷＯ ９６／３０５１４、米国特許第５，８４６，５３８号、および米国特許第５，８６９，４４５号をまた参照のこと。
特定の実施形態において、腫瘍抗原が使用され得る。腫瘍抗原は、変異または変更された細胞成分由来である。変更後、それらの細胞成分は、それらの調節機能をもはや果たさず、従って、その細胞は、制御されない増殖を経験し得る。変更された細胞成分の代表的な例としては、ｒａｓ、ｐ５３、Ｒｂ、ウィルムス腫瘍遺伝子によってコードされる変更されたタンパク質、ユビキチン、ムチン、ＤＣＣ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、およびＭＣＣ遺伝子によってコードされるタンパク質、ならびにレセプターまたはレセプター様構造（例えば、ｎｅｕ、甲状腺ホルモンレセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、インスリンレセプター、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）レセプター）が挙げられる。これらおよび他の細胞成分は、例えば、米国特許第５，６９３，５２２号およびそこに引用される参考文献に記載されている。
本発明はまた、これらの選択された異種配列を、ワクチンまたは治療剤として使用するために、温血哺乳動物（例えば、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ラットもしくはマウス）のような哺乳動物）に送達するための方法を提供し、この方法は、哺乳動物に、本明細書中に記載されるようなレプリコン粒子または真核生物層状ベクター開始系（これは、選択された異種配列を発現し得る）を投与する工程を包含する。送達は、種々の経路により得る（例えば、静脈内、筋肉内、真皮内、腹腔内、皮下、経口、眼内、鼻孔内、直腸、腫瘍内）。さらに、レプリコン粒子は、直接投与される（すなわち、インビボ）か、または除去された細胞に投与され（エキソビボ）、引き続いて温血哺乳動物に戻されるかの、いずれかであり得る。
本発明のキメラアルファウイルスレプリコン粒子の生成のために選択される方法は、当該分野において公知の技術を使用して、夾雑レプリコンコンピテントウイルス（ＲＣＶ）を発生する可能性を最小にするべきであることが、注目されるべきである。１つのこのようなストラテジーは、「分裂」構造タンパク質発現カセットを含む、欠損ヘルパーまたはＰＣＬを使用することである（米国特許第５，７８９，２４５号；同第６，２４２，２５９号；同第６，３２９，２０１号を参照のこと）。この文脈において、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子は、別の発現構築物（例えば、糖タンパク質から離れたキャプシド）に隔離され、その結果、構造タンパク質の完全な補体を再生するための組換えが、非常に起こりにくい。本発明はまた、アルファウイルスレプリコン粒子の生成の間に、組換え事象の可能性を、当該分野において公知の従来の方法よりさらに減少させる組成物および方法を提供する。例えば、レプリコンおよび欠損ヘルパーＲＮＡによって共通に共有されるか、または複数の欠損ヘルパーＲＮＡ（真核層状ベクター開始系および構造タンパク質発現カセットもまた）間で共有される、いくつかの機能的エレメント（例えば、制御エレメント）の任意のものが、同じ機能を果たす代替のエレメントで置換され得る。この例において、ＲＮＡ分子間の相同性は、減少または排除される。あるいは、ポリメラーゼテンプレートがＲＮＡ分子間で切り替わる可能性もまた、低下し得る。レプリコンおよび欠損ヘルパーＲＮＡによって共通に共有されるか、または複数の欠損ヘルパーＲＮＡ（および本発明において企図されるような各々についてのいくらかの代替）間で共有される、代表的な機能的エレメントとしては、上記Ｂ節に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために含まれる。さらに、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を提供し、そして本発明の範囲を限定することを意味しない。
（実施例）
（実施例１）
（ＶＥＥ由来のレプリコンベクターの構築）
ＶＥＥ由来のレプリコンベクターおよび欠損ヘルパーパッケージングカセットを、キメラ粒子の生成において使用するために構築するために、最初に、全ＶＥＥゲノムに対応する相補ＤＮＡを合成することが必要であった。以前に刊行された、ＶＥＥの野生型Ｔｒｉｎｉｄａｄ Ｄｏｎｋｅｙ株由来の配列（ＧＥＮＢＡＮＫ、Ｌ０１４４２）（本明細書中以下において、ＶＥＥ−ＴＲＤ）に基づいて、１１，４４７ゲノム全体を合成し、そしてオーバーラップするオリゴヌクレオチドを使用して、複数のフラグメントにクローニングした。非構造タンパク質遺伝子クローンを、レプリコンベクターの組み立てのために使用し、一方で構造タンパク質遺伝子クローンを、欠損ヘルパーパッケージングカセットの組み立てのために使用した。
ＶＥＥ−ＴＲＤ非構造タンパク質遺伝子をコードする配列を、適切な独自の制限切断部位（これは、この領域を実用的な長さのフラグメントに細分し、そして完全なレプリコンベクター構築物の最終の組み立てのために好都合に使用され得る）について分析した。図１に示されるように、合計１３の中間フラグメントが同定され、これらは、３３４〜７２３ヌクレオチド長にわたる。この一連のフラグメントを、オーバーラップするオリゴヌクレオチドおよび分子生物学の分野の当業者によって通常使用される技術を使用して、合成した（例えば、以下を参照のこと）。末端フラグメントに対して、＃１および＃１３を、プラスミドの最終構築物（これは、インビトロおよびインビボで、ＲＮＡレプリコン発現ベクターの転写のために使用され得る）のために必要なさらなる配列に添付した。フラグメント１の一部として、上流を、バクテリオファージＳＰ６プロモーターまたは真核生物ＣＭＶプロモーターのいずれかに配置して、レプリコンＲＮＡの転写を可能にした。フラグメント１３の一部として、下流は、真性に終結したＲＮＡの発生のために、ウイルス３’ＵＴＲ、合成Ａ４０ポリアデニル化路、およびデルタ型肝炎ウイルス抗ゲノムリボザイムを複製した（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９、１９９６；Ｐｏｌｏ，１９９９，同書）。
フラグメントの１つについての遺伝子合成の詳細な実施例として、レプリコンフラグメント番号２についての全長二重鎖ＤＮＡ鎖を、以下に記載されかつ図２（隣接オリゴヌクレオチドが、強調した連結部への影付けを有するかまたは有さないで示される）に示されるような、重複する合成オリゴヌクレオチドから作製した。第一に、全長二重鎖に、中間体クローンニングベクターへの挿入に適切な簡便な制限酵素部位の認識配列を付加した。次いで、各フラグメントを、各々６０ヌクレオチドの平均長を有し、いずれかの末端において平均２０ヌクレオチドが対向する鎖由来のオリゴヌクレオチドと重複する、一連のオリゴヌクレオチドへと再分割する。最初のオリゴヌクレオチドの合成を、業者（例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ；Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）によって実施した。各フラグメントについてのオリゴヌクレオチドを、業者の推奨に従って再構成して、各個々のオリゴの１００ｎＭ溶液を得た。フラグメントを構築するために、１００ｐＭの各オリゴを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、１ｍＭ ｒＡＴＰ、水および１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を含む単一の反応チューブ中で、５００μｌの最終反応容積で混合した。リン酸化反応を、３７℃で３０分間進行させ、この時点で、この反応物にさらに１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを補充し、そしてさらに３０分間反応させ続けた。反応終了時に、この混合物を含むチューブを、酵素およびすでにアニールした可能性のある任意のＤＮＡ鎖を変性させるために、大容量の水を含むビーカー中で、５分間９５℃まで加熱した。次いで、相補的オリゴヌクレオチドが、全長二重鎖ＤＮＡ鎖にアニールするように、このビーカーを熱源から取り出し、そして周囲温度までゆっくりと冷却させた。
冷却した後、０．２ｐｍｏｌの反応物質を１００ｐｍｏｌの予め調製したシャトルベクターＤＮＡと連結させ、そして標準的な方法に従ってコンピテント細菌へと形質転換した。この連結から生じた形質転換体を、適切な末端レプリコン酵素部位の存在について最初に分析し、挿入物の大きさおよび挿入物複製の証拠について分析した。いくつかの陽性形質転換体を無作為に選択し、そして配列確認に供した。任意の検出された配列エラーを、２つ以上の配列サンプル間のフラグメントスワッピングまたは部位特異的変異誘発によって較正し、そして信頼性について再確認した。
全てのフラグメントを得た後、種々のアルファウイルスについて以前に刊行されたもの（Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１、１９８９；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、１９９６、同上；Ｌｉｌｊｉｅｓｔｒｏｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３５６−１３６１、１９９１；Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１）と類似のレプリコンベクターの最終的構築を、各サブフラグメントを、予め選択した末端フラグメント切断部位での連結を介して隣接フラグメントと一緒につなぎ合わせることによって実施した。構築後、全長合成ＶＥＥレプリコンの配列を再確認した。レプリコンＲＮＡがインビトロで転写され得る、得られたＶＥＥベースのアルファウイルスベクター構築物を、ｐＶＣＲと称した。
ＳＰ６プロモーターベースのベクターレプリコン構築物に加えて、ＶＥＥベースの真核生物階層ベクター開始システム（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｌａｙｅｒｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＥＬＶＩＳ、米国特許第５８１４４８２号および同第６０１５６８６号を参照のこと）（これは、真核生物細胞内から機能的ＲＮＡレプリコンを送り出すために、ＣＭＶプロモーターを利用する）もまた、構築した。ＥＬＶＩＳベクターへの転換のためのプラスミドｐＶＣＲの改変を、以下のように達成した。既存のシンドビスウイルス（ＳＩＮ）ベースのＥＬＶＩＳベクターであるｐＳＩＮＣＰを、ＣＭＶプロモーター、カナマイシン耐性遺伝子および複製起点を含む適切な骨格成分についての供与源として使用した。このストラテジーは、ｐＳＩＮＣＰおよびｐＶＣＲの両方が、非構造遺伝子およびウイルスの３’ＵＴＲ領域の下流に同一の配列エレメント（例えば、合成ポリＡ配列、ＨＤＶリボザイム）を共有しているので、可能であった。ｐＶＣＲにおいて、ＨＤＶリボザイムは、独自のＰｍｅＩ部位に隣接するが、一方ｐＳＩＮＣＰにおいては、リボザイムは、ＢｃｌＩ部位に隣接する。ＰｍｅＩ／ＢｃｌＩ融合物は、次いで、ｐＳＩＮＣＰとｐＶＣＲとの間の５’連結部位として作用した。３’連結部位は、ＳＩＮおよびＶＥＥの両方のｎｓＰ１中に存在する偶発的なＢｓｐＥＩ部位であった。骨格のスワッピングを達成するために、ｐＳＩＮＣＰを、Ｄａｍ／Ｄｃｍ−マウスの宿主細菌ＳＣＳ１１０（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中に最初に形質転換して、ＢｃｌＩによって切断可能なＤＮＡを得た。５’末端にＢＧＨｔを含み、そして３’末端にＫａｎ Ｒ遺伝子を含む１２０３塩基対のフラグメントを単離し、そして標準的な方法に従って、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって平滑化した。このフラグメントを、引き続いてＰｓｔＩでさらに消化して、ＢＧＨｔおよびＫａｎ Ｒ遺伝子の５’側２／３を含む、精製された９９９ｂｐのＢａｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントを解放した。
プラスミドｐＳＩＮＣＰは、４つのＢｓｐＥＩ部位を含む。フラグメントの同定をより正確にするため、このプラスミドを、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで同時消化し、そして５１７３ｂｐのフラグメントを単離した。次いで、このフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩでさらに消化して、ここから、Ｋａｎ Ｒ遺伝子の３’側１／３、プラスミドの複製起点、ＣＭＶ ｐｏｌＩＩプロモーターおよび４２０ｂｐのシンドビスｎｓＰ１遺伝子を含む２７３０ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｓｐＥＩフラグメントを精製した。
ＶＣＲレプリコンの５’末端および３’末端の供給源として、初期中間体であるｐＶＣＲ−ＤＨ（以下を参照のこと）を利用した。ｐＣＶＲ−ＤＨは、フラグメント１、フラグメント１３および中間体フラグメントの全ての末端制限部位を含む。このように、このプラスミドは、必要なＢｓｐＥＩ部位および上記の３’特徴の全て（これらは、スワッピングのために必要であるが、ｎｓＰＩの３’末端からｎｓＰ４の５’末端にかけてのコア非構造領域を欠く）を含むＶＥＥ−ＴＲＤ ｎｓＰ１遺伝子の一部を含む。ｐＶＣＲ−ＤＨを、上記のようにＳＣＳ１１０細胞中に形質転換し、そしてＢｓｐＥＩおよびＰｍｅＩで消化して、ｎｓＰ１’〜ｎｓＰ４’、３’ＵＴＲ、Ａ４０領域およびＨＤＶリボザイムを含む１３０２ｂｐのフラグメントを解放した。
ｐＳＩＮＣＰ由来のＢｃｌＩ（平滑）−ＰｓｔＩフラグメントおよびＰｓｔＩ−ＢｓｐＥＩフラグメント、ならびにｐＶＣＲ−ＤＨ由来のＢｓｐＥＩ−ＰｍｅＩフラグメントの３種類の連結を実施した。得られた中間体を、ｐＶＣＲｄｈｉｎｔＳＰと称した。プラスミドｐＶＣＲｄｈｉｎｔＳＰを、ＳａｃＩ（ＣＭＶプロモーターの３’末端の１５ｂｐ前を切断する）およびＢｓｐＥＩ（ｎｓＰ１中のシンドビス配列とＶＥＥ配列との連結部にて）で消化した。この消化のベクターフラグメントを、脱リン酸化し、そしてｐＣＶＲ−ＤＨ由来の３２６ｂｐのＰＣＲ産物と連結して、欠如したＶＥＥ−ＴＲＤ ｎｓＰ１の５’末端を提供した。５’プライマー

は、ＶＥＥ ５’ＵＴＲ配列の開始塩基に対して、ＣＭＶプロモーターの３’末端（転写開始部位まで）の１５ヌクレオチドに並列した。３’プライマーは、列挙した配列

を有した。この中間体を、ｐＶＣＲｄｈｉｎｔｆと称した。構築物を完成するために、ｐＶＣＲｄｈｉｎｔｆをＮｏｔＩおよびＨｐａＩで消化し、そしてこのベクターフラグメントを脱リン酸化して、ｐＶＣＲのＨｐａＩ−ＮｏｔＩフラグメントに連結して、ｐＶＣＰｄｈｉｎｔｆ中間体から欠けた、欠如したコアＶＥＥ非構造配列を提供した。この最終的なＶＥＥベースのＥＬＶＩＳ構築物を、ｐＶＣＲと称した。
（実施例２）
（アルファウイルス欠損性ヘルパー構築物の構築）
ハイブリッド構造タンパク質エレメントおよびキメラアルファウイルス粒子を生成する際に使用するための、本発明の欠損性ヘルパー（ＤＨ）の構築の前に、既存のＳＩＮベースの欠損性ヘルパーパッケージングカセット（Ｐｏｌｏら、１９９９、同上：Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００、同上）を最初に改変した。これらの新たなＳＩＮカセットを生成するために、プラスミドＳＩＮＢＶ−ｎｅｏ（Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９８０２−９８０７、２０００）をＡｐａＩで消化し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してＡｐａＩにより生成された末端を平滑化し、次いでＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。プラスミド骨格、ＳＩＮサブゲノムプロモーター、ＳＩＮ ３’末端、合成ポリＡ領域およびＨＤＶ抗ゲノム（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ）リボザイムを含む４．５ｋｂのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットでゲル精製し、プラスミド４７ｔＲＮＡ ＢＢＣｒｒｖｄｅｌ １３（Ｆｒｏｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：２８１９−２８２９、１９９７）（これは、ＳａｃＩで予め消化されている）から得られたＳＰ６プロモーターおよびＳＩＮ ｔＲＮＡ ５’末端を含む７１４ｂｐのフラグメントと連結させ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＢａｍＨＩで消化し、そしてゲル精製した。陽性のクローンを制限分析によって確認し、この構築物を、以下に記載されるアルファウイルスの糖タンパク質およびキャプシド配列の、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位（これは、既存のＮｅｏ挿入物を除去する）を介した挿入のための基礎として使用した。本明細書中に記載されるこのＳＩＮ欠損性ヘルパーカセット骨格を、ｔＤＨと称する。
（ＶＣＲ−ＤＨ構築物）
ポリリンカー領域を、最初の工程として、ＳＩＮＣＲ−ＧＦＰ（Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００、同上）のベクター骨格にクローニングした。このポリリンカーは、以下の制限部位を含んだ。５’から３’に向けて：

。このポリリンカーを生成するために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：

オリゴヌクレオチドＰＬ１ＦおよびＰＬ１Ｒ、ならびにオリゴヌクレオチドＰＬ２ＦおよびＰＬ２Ｒを、２つの別個の反応において混合し、リン酸化し、変性し、そしてゆっくりとアニーリングした。次いで、２つの反応物を混合し、そしてＡｐａＩおよびＰｍｅＩで予め消化したプラスミドＳＩＮＣＲ−ＧＦＰから生成された２．８ｋｂのフラグメントに連結し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製した。クローンを、ＡｌｗＮＩおよびＮｏｔＩの制限消化を使用して、正しい方向についてスクリーニングした。陽性のクローンを、ポリリンカー中に存在する各々１種の酵素を用いた制限消化によって確認した。この構築物を、ＶＣＲ−ｂａｃｋｂｏｎｅと称した。次に、ＶＥＥ ３’末端を、ポリアデニル化領域およびＨＤＶリボザイムと一緒に、ＶＣＲ ｂａｃｋｂｏｎｅ中に挿入した。このフラグメントを、以下の重複する合成オリゴヌクレオチドを使用して生成した。

順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチドの各対（例えば、ＶＥＥ１ＦおよびＶＥＥ１Ｒ、ＶＥＥ２ＦおよびＶＥＥ２Ｒなど）を混合し、リン酸化し、変性し、そしてゆっくりとアニーリングした。次いで、アニールしたオリゴヌクレオチドの４つの対を一緒に混合し、互いに連結し、酵素ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そして予め同じ酵素で消化したＶＣＲ−ｂａｃｋｂｏｎｅに連結し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理した。このフラグメントについて陽性のクローンを、配列決定によって確認した。この構築物を、ＶＣＲ−３’ｄｒｉｂと称した。
次に、ＶＥＥゲノムの５’側を挿入した。ＶＥＥトリニダードロバ株（ＧＥＮＢＡＮＫ参考、上記を参照のこと）のゲノム領域をヌクレオチド１〜制限部位ＨｐａＩまでカバーするために、このフラグメントを、重複するオリゴヌクレオチドを使用して生成した。ＶＥＥのヌクレオチド１を含むプライマーもまた、上流のＭｌｕＩ部位およびそれに続くＶＥＥのヌクレオチド１の直ぐ５’側のＳＰ６プロモーターを含んだ。全てのオリゴヌクレオチドを、１つの反応中で混合し、リン酸化し、変性し、ゆっくりとアニーリングし、そして連結した。リガーゼを不活化した後、ＤＮＡを、酵素ＭｌｕＩおよびＨｐａＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そして同じ制限酵素で予め消化したＶＣＲ−３’ｄｒｉｂに連結し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを、配列決定によって確認した。この中間体構築物を、ＶＣＲ−Ｆ１−３’ｄｒｉｂと称した。
最終的に、サブゲノムプロモーターを含むＶＥＥの領域を、ＶＣＲ−Ｆ１−３’ｄｒｉｂ中にクローニングした。この領域（フラグメント１３、図１）は、ＶＥＥトリニダードロバ株ゲノムの制限部位ＳｗａＩとヌクレオチド７５６１との間の配列に対応する。このフラグメントを、トリニダードロバ株配列に対応する重複するオリゴヌクレオチド（さらなる制限部位（ＢｂｖＣＩ）を保有するように改変されたフラグメントの３’末端に対応するオリゴヌクレオチドを除く）を使用して生成し、サブゲノムプロモーターの制御下での異種配列の後の挿入を可能にした。全てのオリゴヌクレオチドを１つの反応において混合し、リン酸化し、変性し、ゆっくりとアニーリングし、そして連結した。リガーゼを不活化した後、このＤＮＡを酵素ＳｗａＩおよびＢｂｖＣＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そして同じ制限酵素で予め切断したＶＣＲ ｂａｃｋｂｏｎｅに連結し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを配列決定によって確認し、そして１つのクローン（ＶＦ１３−１４）を、引き続いて、小さい挿入物を欠失することによって修復し、そして配列決定によって再確認した。次に、このクローンをＳｗａＩ−ＮｏｔＩで消化し、６００ｂｐのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そして同じ制限酵素で予め消化したＶＣＲ−Ｆ１−３’ｄｒｉｂに連結し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを確認し、そしてこの構築物をＶＣＲ−ＤＨと称した。
（ｔＤＨ−Ｖｇｌｙ、ｔＤＨ−ＶＥ２−１２０およびｔＤＨ−ＶＮＴＲ−ｇｌｙｄｌ１６０の構築）
ＶＥＥトリニダードロバ株の糖タンパク質遺伝子を、公開されたＧＥＮＢＡＮＫ配列に基づいて設計した重複するオリゴヌクレオチドを使用して生成した。適切なベクターパッケージングカセットからの発現を可能にするために、この糖タンパク質遺伝子のオープンリーディングフレームとインフレームのＡＴＧコドンを、Ｅ３の最初のアミノ酸の直ぐ前に付加し、そしてＸｈｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位を、この糖タンパク質遺伝子配列の５’末端および３’末端にそれぞれ付加した。遺伝子合成を、重複ＰＣＲを使用して実施し、全長糖タンパク質配列にわたる５つの別個のフラグメントを生成した（図３）。これらのフラグメントを、図３に示される制限部位を使用して、ｐＧＥＭ中の単一のフラグメントへと段階的に構築した。ＫａｓＩ部位内の小さいヌクレオチド欠失を、標準的な部位特異的変異誘発によって較正した。最終的なクローンを配列決定によって確認し、そしてｐＧＥＭ−Ｖｇｌｙと称した。次いで、この糖タンパク質遺伝子配列を、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位を使用してｐＧＥＭからｔＤＨへと移入し、そして最終的なクローンをｔＤＨ−Ｖｇｌｙと称した。
ＶＥＥのＴＣ８３ワクチン株中に存在するＥ２のアミノ酸１２０での弱毒化変異も含む、ｔＤＨ−Ｖｇｌｙに類似の構築物を、同様の方法によって構築した。プラスミドｐＧＥＭ−Ｖｇｌｙを、標準的な部位特異的変異誘発に供し、そしてＥ２−１２０変異を配列決定によって確認した。次いで、ＶＥＥ Ｅ２−１２０糖タンパク質配列を、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位を使用してｐＧＥＭからｔＤＨへと移入し、そしてこの構築物を配列決定によって確認し、そしてｔＤＨ−ＶＥ２−１２０と称した。
プラスミドｔＤＨ−ＶＮＴＲ−ｇｌｙｄｌ１６０は、以前に記載された（Ｇａｒｄｎｅｒら、同上）ヒト樹状細胞熱帯株由来のＳＩＮ糖タンパク質配列を含むｔＤＨ欠損性ヘルパー構築物（上記を参照のこと）であり、ここで、ＳＩＮ由来のサブゲノム５’ＮＴＲおよび合成ＸｈｏＩ部位を、以下のＶＥＥサブゲノム５’ＮＴＲ配列

によって置換した。この配列を、糖タンパク質ＡＴＧ開始コドンの直前に来るように挿入した。この構築物はまた、サブゲノム５’非翻訳（ｎｏｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域（ＮＴＲ）（これはまた、非翻訳（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域（ＵＴＲ）とも称される）について、ｔＤＨ−ＶＵＴＲ−ｇｌｙｄｌ１６０と相互交換可能な番号を示すことが知られる。
（ＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｇｌｙ、ＶＣＲ−ＤＨ−ＶＥ２−１２０およびＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｇｌｙｄｌ１６０の構築）
ＡＴＧと制限部位ＮｃｏＩとの間のＶＥＥ糖タンパク質遺伝子配列を、以下のオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって増幅した。

ＰＣＲ増幅後、このフラグメントを、ＢｂｖＣＩおよびＮｃｏＩで消化し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製した。別に、ＮｃｏＩからＮｏｔＩまでのＶＥＥ Ｅ２−１２０糖タンパク質領域を、これらの酵素によってｐＧＥＭ−ＶＥ２−１２０を消化することによって調製し、その後ゲル精製した。これら２つのフラグメントを混合し、そしてＢｂｖＣＩおよびＮｏｔＩで予め消化したＶＣＲ−ＤＨに連結し、ゲル精製し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを配列決定によって確認し、そしてＶＣＲ−ＤＨ−ＶＥ２−１２０と称した。ＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｇｌｙを得るために、ＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＧＥＭ−Ｖｇｌｙから獲得し、そしてＶＣＲ−ＤＨ−ＶＥ２−１２０中の同じフラグメントを置換するために使用した。
ヒトＤＣ＋表現型を有するＳＩＮ糖タンパク質を、Ｇａｒｄｎｅｒら（２０００、同上）（ＰＣＴ ＷＯ ０１／８１６０９）から改変した欠損性ヘルパープラスミドＥ３ｎｄｌ１６０／ｄｌＲＲＶから獲得した。プラスミドＥ３ｎｄｌ１６０／ｄｌＲＲＶを、ＸｈｏＩで消化し、これをクレノウフラグメントで処理して末端を平滑化し、次いでＮｏｔＩで消化した。３ｋｂのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そしてＢｂｖＣＩで予め消化したＶＣＲ−ＤＨに連結し、クレノウフラグメントで処理し、ＮｏｔＩで消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを、ＶＣＲ−ＤＨ Ｓｇｌｙｄｌ１６０と称した。同様に、ＳＩＮ ＬＰ株由来のエンベロープ糖タンパク質を含む欠損性ヘルパー構築物（Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００、同上）を構築した。
（ＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｃａｐ、ＶＣＲ−ＤＨ−ＳｃａｐおよびｔＤＨ−Ｖｃａｐの構築） ＶＥＥキャプシド遺伝子を、ＶＥＥトリニダードロバ株の公開されたＧＥＮＢＡＮＫ配列に基づいてこれもまた設計し、キャプシドＡＴＧに隣接するＸｈｏＩ部位およびＫｏｚａｋコンセンサス配列、ならびに３’末端のＮｏｔＩ部位の付加を有する、重複オリゴヌクレオチドを使用して合成した。このオリゴヌクレオチドを混合し、そして２５サイクルのＰＣＲ増幅反応のために使用した。ＰＣＲにより生成されたフラグメントを、制限部位ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そしてベクターｐＢＳ−ＳＫ＋中にクローニングした。挿入物について陽性のクローンを、配列決定によって確認した。最後に、キャプシド配列を、以下のオリゴヌクレオチドを用いる２５サイクルの反応のＰＣＲ増幅によって、その３’末端に終止コドンを挿入するために、さらに改変した。

この産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで予め調製したｔＤＨベクターの骨格に連結し、ゲル精製し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを配列決定によって確認し、そしてこの構築物をｔＤＨ−Ｖｃａｐと称した。
同じＰＣＲ産物をまた、ＸｈｏＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してＸｈｏＩ部位を平滑化し、ＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そしてＢｂｖＣＩで予め消化したＶＣＲ−ＤＨに連結し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理してＢｂｖＣＩ部位を平滑化し、ＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを配列決定によって確認し、そしてこの構築物をＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｃａｐと称した。
ＳＩＮキャプシド配列を、以前に記載した欠損性ヘルパーから獲得し、そして８００ｂｐのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そしてＢｂｖＣＩで予め消化したＶＣＲ−ＤＨに連結し、クレノウフラグメントで処理し、ＮｏｔＩで消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理した。挿入物について陽性のクローンを、ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｃａｐと称した。
（実施例３）
（ハイブリッドキャプシドタンパク質を有する、アルファウイルスレプリコン粒子キメラの生成）
ＳＩＮおよびＶＥＥの両方から獲得したエレメントを使用するハイブリッドキャプシドタンパク質の場合、ＶＥＥ由来のＳＩＮ由来のアミノ末端（ＲＮＡ結合）部分およびカルボキシ末端（糖タンパク質相互作用）部分を含む一連のハイブリッドキャプシドタンパク質を構築した。反対の部分を含むさらなる構築物もまた誘導した。このような部分が融合した部位は、構築物によって異なり、そして全長のこれら２つのキャプシドタンパク質中の差異（ＳＩＮキャプシドは、２６４アミノ酸であり、ＶＥＥキャプシドは、２７５アミノ酸である）を必然的に考慮した。キャプシドハイブリッドを作製するための融合部位は、以下の表ならびに図４に示される。

各々のハイブリッドキャプシド構築物を、２つの重複するフラグメント（一方は、ＳＩＮまたはＶＥＥ由来のキャプシドタンパク質のアミノ末端をコードし、そして他方は、反対のウイルス（それぞれ、ＶＥＥまたはＳＩＮ）由来のキャプシドタンパク質のカルボキシ末端をコードする）のＰＣＲ増幅によって生成した。
ＳＩＮキャプシド配列を含むフラグメントを、欠損性ヘルパー構築物（Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００、同上）から増幅し、そしてＶＥＥキャプシド配列を含むフラグメントを、構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｃａｐ（上記）から増幅した。以下のオリゴヌクレオチドを使用した：



上に列挙したオリゴヌクレオチドを、３０サイクルのＰＣＲ反応において、０．１μｇの適切なテンプレートプラスミドＤＮＡと共に２μＭの濃度で、Ｐｆｕポリメラーゼを供給業者に示唆されるように用い、１０％のＤＭＳＯを添加して使用した。一般的な増幅プロトコルを以下に例示する。
温度（℃） 時間（分） サイクル数
９４ ２ １
９４ ０．５
６０ ０．５ １０
７２ ２
増幅したフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製し、次いで各フラグメントのアリコート（１／１５）を、第二のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。２つのフラグメントを以下のように混合し、そしてＶｅｎｔ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを供給業者に示唆されるように用い、１０％ ＤＭＳＯを添加して増幅した。

１回のＰＣＲ増幅サイクルを、以下の条件下で実施した：
温度（℃） 時間（分） サイクル数
９４ ２ １
９４ ０．５
４２ １ １
７２ ３
ＳＩＮ ＮＨ２末端／ＶＥＥ ＣＯＯＨ末端の融合物について、ＳＩＮＮｔＦプライマーおよびＴＲＤＣｔＲプライマー（これらは、ＸｈｏＩ制限部位およびＮｏｔＩ制限部位を含む）を、２μＭの濃度で添加し、そして完全ＰＣＲ増幅を、以下のように実施した：
温度（℃） 時間（分） サイクル数
９４ ２ １
９４ ０．５
６０ ０．５ ３０
７２ ２
ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを使用して精製し、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、上記のようにアガロースゲルからゲル精製し、そしてこれもまたＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化されたプラスミドｔＤＨに連結して、既存のキャプシド遺伝子挿入物を除去した。新たに生成されたハイブリッド挿入物を含むクローンを配列決定によって確認し、そしてキメラ粒子の生成に使用するための新たな欠損性ヘルパー構築物を、ｔＤＨＳ１２９Ｖｃａｐ、ｔＤＨＳ１２７Ｖｃａｐ、ｔＤＨＳ１１６Ｖｃａｐ、ｔＤＨＳ１１３ＶｃａｐおよびｔＤＨＳ１０９Ｖｃａｐと称した。
同様に、ＶＥＥ ＮＨ２末端／ＳＩＮ ＣＯＯＨ末端融合物について、ＸｈｏＩ制限部位およびＮｏｔＩ制限部位を含むＴＲＤＮｔＦプライマーおよびＳＩＮＣｔＲプライマーを、２μＭの濃度で添加した。上記と同一の条件を使用してＰＣＲ増幅を行った。次いで、このＰＣＲフラグメントを、ＸｈｏＩで消化し、平滑末端化し、ＮｏｔＩで消化し、そしてプラスミドＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｃａｐ（ＢｂｖＣＩで消化し、平滑末端化しそしてＮｏｔＩで消化してある）に連結した。配列決定によって挿入物を含むクローンを確認し、そして新たな欠損ヘルパー構築物を、ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓ１２９Ｖｃａｐと名付けた。
次いで、適切なアルファウイルスレプリコンベクターおよび糖タンパク質欠損ヘルパーを用いて、キャプシドキメラを、そのレプリコンパッケージング効率について試験した。特に、ＳＩＮ由来ＮＨ２末端およびＶＥＥ由来ＣＯＯＨ末端を有するキメラを、ＶＥＥ糖タンパク質を用いてＳＩＮレプリコンをパッケージングするその能力について試験した。この試験を、以下のように達成した。キメラ（ｔＤＨＳ １２９Ｖｃａｐ、ｔＤＨＳ １２７Ｖｃａｐ、ｔＤＨＳ １１６Ｖｃａｐ、ｔＤＨＳ １１３Ｖｃａｐ、およびｔＤＨＳ １０９Ｖｃａｐ）をコードするプラスミドＤＮＡを、独特な制限部位ＰｍｅＩで線状化し、以前に記載される（Ｐｏｌｏら、１９９９、同書）ようにインビトロ転写に使用した。各転写物を、以前に記載される（Ｐｏｌｏら、１９９９、同書）ようにＶＥＥ糖タンパク質を発現するヘルパーＲＮＡおよびＧＦＰを発現するＳＩＮレプリコンＲＮＡとともにＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃で２４時間インキュベートし、この時点でこの培養上清を回収し、遠心分離によって清浄化し、連続希釈し、そしてナイーブなＢＨＫ−２１細胞を約１４時間感染させるために使用した。ＧＦＰポジティブ細胞の列挙は、インプットしたベクター粒子の定量およびそのベクター粒子ストックを可能にする。以下のデータは、ＳＩＮ／ＶＥＥキメラ粒子をパッケージングする効率が、特にＳ１１３Ｖハイブリッドキャプシドタンパク質を用いて非常に劇的に増加され得ることを示す。

同様に、各キメラ転写物を、以下と一緒にＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした：１）Ｅ２−１２０弱毒化変異体ｔＤＨＶＥ２−１２０とともにＶＥＥ糖タンパク質を発現するヘルパーＲＮＡ、および２）ＧＦＰを発現するＳＩＮレプリコンＲＮＡ。トランスフェクトした細胞を、３４℃で２４時間インキュベートし、この時点でこの培養上清を回収し、遠心分離によって清浄化し、連続希釈し、そしてナイーブなＢＨＫ−２１細胞を約１４時間感染させるために使用した。ＧＦＰポジティブ細胞の列挙は、インプットしたベクター粒子の定量およびそのレプリコンベクター粒子ストックについての力価決定を可能にする。以下のデータは、このハイブリッドキャプシドがＶＥＥ糖タンパク質を含む粒子中でＳＩＮレプリコンのパッケージング効率を劇的に増加し得ることを確認する。

ハイブリッドキャプシドＳ１２９ＶｃａｐおよびＳＩＮ糖タンパク質をコードするＲＮＡヘルパーとともに同時トランスフェクトしたＶＣＲ−ＧＦＰ ＲＮＡを用いる同様の実験によって、ＶＥＥ由来ベクターＲＮＡを効率的にパッケージングするこのハイブリッドタンパク質の能力を実証する、１．６ｅ７ ＩＵ／ｍｌの平均力価を有する粒子を産生した。
キャプシドＲＮＡ相互作用およびキャプシド糖タンパク質相互作用をさらに最大化するために、さらなる構築物を作製し、これによりＳ１１３Ｖハイブリッドキャプシドタンパク質遺伝子を、ＳＩＮの５’末端、３’末端、サブゲノムプロモーターおよび非構造タンパク質遺伝子、ならびにＶＥＥからの糖タンパク質遺伝子を含むキメラアルファウイルスのゲノムに組み込んだ。
このような構築物を作製するために、感染性ＲＮＡがインビトロ転写され得る最初のゲノム長ＳＩＮ ｃＤＮＡクローンを、レプリコンおよび以前に記載されたヒト樹状細胞屈性ＳＩＮ改変体ＳＩＮＤＣｃｈｉｒｏｎ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ−２６４３（１９９９年４月１３日に寄託された））由来の構造遺伝子配列をアセンブリすることによって、作製した。ＳＩＮＤＣｃｈｉｒｏｎウイルス（Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（同書）；ＷＯ００／６１７７２）のゲノム全体を含む、使用したＤＮＡクローンを、標準的な分子生物学的技術および当業者に広範に知られている方法（Ｒｉｃｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，６１：３８０９−３８１９，１９８７；および米国特許第６，０１５，６９４号）を使用してアセンブリした。ゲノムＳＩＮクローンを、ＳＩＮＤＣＳＰ６ｇｅｎと名付けた。
続いて、存在するＳＩＮ構造タンパク質を、以下の様式で、ハイブリッドキャプシドＳ１２９ＶキャプシドおよびＶＥＥ糖タンパク質で置換した。このハイブリッドキャプシドの一部分を含むｔＤＨ−Ｓ１２９Ｖ由来のフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド：


を用いてＰＣＲ増幅によって作製した。
３０サイクルのＰＣＲ反応中０．１μｇの適切なテンプレートプラスミドＤＮＡ、供給業者によって推奨されるＰｆｕポリメラーゼおよび１０％ ＤＭＳＯの添加とともに、このオリゴヌクレオチドを２μＭの濃度で使用した。一般的な増幅プロトコルを、以下に示す。

ＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製した。ＶＥＥ糖タンパク質フラグメントを含む別のフラグメントを、ＳｐｅＩおよびＰｍｅＩでの消化によってｔＤＨＶＥ２−１２０より取得しそしてゲル精製した。２つのフラグメントを混合し、そしてＳｐｅＩおよびＰｍｅＩでの消化によってＳＩＮＤＣＳＰ６ｇｅｎクローンより得られた１１ｋｂフラグメントに連結し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理した。挿入物についてのポジティブクローンを、配列決定によって確認し、この中間体を、ＳｒＳ１２９ＶｃＶｇ−ｉｎｔｅｒｍと名付けた。ゲノムクローンの真の３’末端を回復するために、ＰｓｉＩ−ＰｓｉＩフラグメントを、３０サイクルのＰＣＲ反応中０．１μｇの感染性クローンプラスミドＤＮＡ、供給業者によって推奨されるＶｅｎｔポリメラーゼおよび１０％ ＤＭＳＯの添加とともに、以下のオリゴヌクレオチド：

を２μＭの濃度で用いるＰＣＲによって再生した。一般的な増幅プロトコルを以下に示した。

このフラグメントを、ＰｓｉＩで消化し、ゲル精製し、そしてＳｒＳ１２９ＶｃＶｇ−ｉｎｔｅｒｍ（これもまたＰｓｉＩで消化し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理してある）に連結した。挿入物についてのポジティブクローンを、配列決定によって確認し、そして最終構築物を、ＳｒＳ１２９ＶｃＶｇと名付けた。
ハイブリッドＳ１１３Ｖキャプシドを含む同様の全長ｃＤＮＡクローンを構築するために、そのキャプシド遺伝子の上流のＳＩＮ配列の一部を含むフラグメントおよびａａｌ−１１３をコードするキャプシド遺伝子を、３０サイクルのＰＣＲ反応中０．１μｇのＳＩＮＤＣＳＰ６ｇｅｎ構築物、供給業者によって推奨されるＰｆｕポリメラーゼおよび１０％ ＤＭＳＯの添加とともに、以下のオリゴヌクレオチド：

を２μＭの濃度で用いて作製した。一般的な増幅プロトコルを以下に示した。

このフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そしてこの反応物の１／１０を、フラグメントＶＥＥ（１４１−２７５）と混合した（上記（全てのハイブリッドキャプシド遺伝子の構築）を参照のこと）。１回のＰＣＲ増幅サイクルを、以下の条件下で行った。

次いで、オリゴヌクレオチドＳｉｃ７０８２ＦおよびＴＲＤＣｔＲを、２μＭの濃度で添加し、完全なＰＣＲ増幅を以下：


のように行った。
このＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを使用して精製し、ＢｓｔＺ１７ＩおよびＳａｐＩで消化し、上記のようにアガロースゲルよりゲル精製し、そしてプラスミドＳｒＳ１２９ＶｃＶｇ（これもまたＢｓｔＺ１７ＩおよびＳａｐＩで消化して存在するキャプシド遺伝子挿入物を除去してある）から生成された２つのフラグメントに連結した。新たに作製したハイブリッド挿入物を含むクローンを、配列決定によって確認し、そしてこの新たな構築物を、ＳＩＮ１１３ＣＶｇｌｙと名付けた。
ウイルスを作製するために、ＳＩＮ１１３ＣＶｇｌｙ構築物を、ＰｍｅＩで線状化し、ＳＰ６ポリメラーゼを用いてインビトロ転写し、そしてこのＲＮＡをＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。子孫ウイルスを収集して細胞に継代し、その感染力価は、約１０９ＰＦＵ／ｍＬのレベルに増加した。次いで、ＳＩＮ１１３ＣＶｇｌｙウイルスと名付けられたこのキメラＳＩＮウイルス（２００１年５月３１日にＡＴＣＣに寄託された、ＰＴＡ−３４１７）のプラーク精製していないストックを、標準的分子生物学技術（例えば、上記のもの）によるクローニングおよび配列決定のためのＲＮＡの供給源として使用して、この高レベルのキメラ粒子パッケージングを提供するさらなる遺伝子決定基を同定した。個々の遺伝子決定基は、本明細書中に提供される技術を使用して、本発明のレプリコンおよび欠損ヘルパーパッケージング構築物に容易に組み込みなおされる。
キメラＳＩＮウイルスのプラーク精製されていないストック（ＡＴＣＣ番号を有して寄託される）が本発明の一部と考えられる本明細書中に特定に開示されない多くの遺伝子型および表現型を含み得ることが、理解される。当業者は、プラーク精製技術を使用して個々の表現型および／または遺伝子型を容易に単離し得、そして当業者に公知の手順および本明細書中に開示される手順を使用して単離されたキメラＳＩＮを配列決定し得る。
（実施例４：ハイブリッド糖タンパク質を有するアルファウイルスレプリコン粒子キメラの生成）
ＳＩＮおよびＶＥＥの両方より得たエレメントを使用するハイブリッドエンベロープ糖タンパク質の場合において、ＳＩＮ由来の細胞質テール（例えば、キャプシド結合部分）ならびにＶＥＥ由来の膜貫通部分およびエクトドメイン部分を含むハイブリッドＥ２糖タンパク質を、構築した。逆向き部分を有するさらなる構築物もまた、誘導し得る。いくつかの実施形態において、Ｅ２糖タンパク質およびＥ１糖タンパク質の両方についてのハイブリッドを含むこと、ならびに膜貫通ドメインを含むハイブリッドを含むこともまた、好ましくあり得る。
このような糖タンパク質ハイブリッドを使用するキメラ粒子パッケージングの効率の増加を例証するために、Ｅ２テールをＳＩＮ由来Ｅ２細胞質テールと置換した改変ＶＥＥ由来糖タンパク質を構築した。この融合を、膜貫通ドメインと細胞質テールとの間の境界である（図５）保存されたシステイン残基（ＶＥＥ Ｅ２およびＳＩＮ Ｅ２の両方でアミノ酸残基３９０）で行った。このキメラ構築物を、２つの重複フラグメントのＰＣＲ増幅によって作製した。このうちの１つは、細胞質テールの上流のＶＥＥ Ｅ２糖タンパク質配列の一部およびＳＩＮ Ｅ２細胞質テールの一部を含んだ。第２のフラグメントは、ＳＩＮ Ｅ２細胞質テールおよびＶＥＥ ６Ｋタンパク質の一部を含んだ。
この第１のフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチド：

（ｎｔｓ７〜２７は、ＶＥＥ糖タンパク質に相補的であり、ＮｃｏＩ部位を含む）

（ｎｔｓ１〜５６は、ＳＩＮ Ｅ２細胞質テール配列であり、そしてｎｔｓ．５５〜７７は、ＶＥＥ糖タンパク質配列に相補的である）
を使用して構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｇｌｙより増幅した。
第２のフラグメントを、以下のプライマー：

（ｎｔｓ．１〜６３は、ＳＩＮ Ｅ２細胞質テール配列の一部に対応し、そしてｎｔｓ６４〜８４は、ＶＥＥ糖タンパク質に相補的である）

（糖タンパク質オープンリーディングフレームの下流ＶＣＲ−ＤＨ Ｖｇｌｙに相補的）
を使用して同一のプラスミドより増幅した。
上記に列挙したオリゴヌクレオチドを、３０サイクルのＰＣＲ反応中０．１μｇのテンプレートプラスミドＤＮＡ ＶＣＲ−ＤＨ−Ｖｇｌｙ、供給業者によって推奨されるＰｆｕポリメラーゼおよび１０％ ＤＭＳＯの添加とともに、２μＭの濃度で使用した。増幅プロトコルを以下に示す。

この２つの増幅フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製し、次いで、各フラグメントのアリコート（１／１０）を、第２のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。この２つのフラグメントを、供給業者によって推奨されるようなＰｆｕポリメラーゼおよび１０％ ＤＭＳＯの添加とともに混合した。１回のＰＣＲ増幅サイクルを実施した：

。
次いで、ＶＥ２ＮｔＦプライマーおよびＶＥＥ３’−１Ｒプライマーを２μＭの濃度で添加し、そしてＰＣＲ増幅を以下のように実施した：

。
ＰＣＲ産物を、上記のようにＱＩＡｑｕｉｃｋキットを使用して精製し、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルよりゲル精製し、そしてプラスミドｔＤＨ−Ｖｇｌｙ（これもまたＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、アガロースゲルより精製されている）に連結した。この挿入物を含むクローンを、配列決定により確認し、この構築物を、ｔＤＨ−ＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌと名付けた。
このような糖タンパク質キメラを用いて生成した粒子のパッケージングの増加を実証するために、プラスミドＤＮＡ ｔＤＨ−ＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌを単一の制限酵素ＰｍｅＩで線状化し、インビトロでＲＮＡ転写した。このＲＮＡを、ＳＩＮＣＲ−ＧＦＰレプリコンＲＮＡおよびＳＩＮキャプシドタンパク質をコードする欠損ヘルパーＲＮＡとともに同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃で２４時間インキュベートし、この時点でこの培養上清を回収し、遠心分離によって清浄化し、連続希釈し、そしてナイーブなＢＨＫ−２１細胞を約１４時間感染させるために使用した。フローサイトメトリー分析を使用して、この粒子力価を決定し、２ｅ３ ＩＵ／ｍｌであることを示した。この結果は、いくつかの効率の低い相互作用が糖タンパク質キメラとＳＩＮキャプシドとの間で生じることを示した。
ハイブリッド糖タンパク質を用いてキメラ粒子パッケージングの効率をさらに増加させるために、さらなる構築物を作製した。ＶＥＥ由来の細胞質テールおよびＳＩＮ由来の細胞質テールの整列（図５）は、１０残基（そのうちの４つが保存的変化である）での差異を示す。興味深いことに、３９４位および３９５位での残基は、ＳＩＮ糖タンパク質において荷電されているが、ＶＥＥにおいては疎水性である。このような差異は、Ｅ２の機能性に影響し得る。ＰＣＲ増幅法を使用する部位特異的変異誘発を使用して、構築物ｔＤＨ−ＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌ中の２つの残基を以下のように変化させた。

変異誘発させた構築物を、配列決定によって確認した。これらの新たな糖タンパク質ハイブリッドによってパッケージングを定量するために、プラスミドＤＮＡを単一の制限酵素ＰｍｅＩで線状化し、そしてインビトロ転写した。次いで、各変異ＲＮＡを、ＳＩＮＣＲ−ＧＦＰレプリコンＲＮＡおよびＳＩＮキャプシドをコードする欠損ヘルパーＲＮＡと一緒に同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃で２４時間インキュベートし、この時点でこの培養上清を回収し、遠心分離によって清浄化し、連続希釈し、そしてナイーブなＢＨＫ−２１細胞を力価分析のために約１４時間感染させるために使用した。フローサイトメトリー分析を使用して、この粒子力価を決定し、そしてパッケージング効率がＭ１の約７倍に増加したことを観察した。
あるいは、およびキャプシドアプローチと同様に、ＶＥＥｇｌｙｃｏ−Ｅ２ ＳＩＮｔａｉｌキメラタンパク質を感染性ウイルスが得られ得る全長アルファウイルスｃＤＮＡクローン中に置換し得、そしてさらに増加したパッケージング効率を有する天然に生じるキメラ粒子を選択するためにこのキメラウイルスゲノムを使用し得た。大プラーク表現型は、高力価ウイルスを示し得る。この感染性キメラを、以下のように構築した。ＶＥＥ糖タンパク質配列に対応するその３’末端に付加されたわずかなヌクレオチドを有し、そしてＳｐｅＩ制限部位を含むために、主にＳＩＮキャプシド配列を含むフラグメントを、ＰＣＲによって作製した。このフラグメントを、以下のプライマー：

を使用してヒトＤＣ−屈性ＳＩＮ感染性クローン構築物（Ｇａｒｄｎｅｒら、同書）より増幅した。３０サイクルのＰＣＲ反応中０．１μｇの適切なテンプレートプラスミドＤＮＡ、供給業者によって推奨されるＰｆｕポリメラーゼおよび１０％ ＤＭＳＯの添加とともに、これらのオリゴヌクレオチドを２μＭの濃度で使用した。この増幅プロトコルを、以下に示す。

増幅したフラグメント（４５０ｂｐ）を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して清浄化し、ＡａｔＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キットを使用してゲル精製した。ＶＥＥ糖タンパク質−ＳＩＮ Ｅ２テールおよびＳＩＮ３’ ＵＴＲを含むフラグメント（３．４ｋｂ）を、酵素ＳｐｅＩ−ＰｍｅＩを使用してｔＤＨ−ＶＥ２Ｓｔａｉｌからの制限消化およびＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キットを用いるゲル精製によって作製した。このフラグメントおよびＰＣＲフラグメントを混合し、感染性クローン由来のプラスミドＤＮＡ（これもまたＡａｔＩＩおよびＰｍｅＩで消化し、エビアルカリホスファターゼで処理し、そしてゲル精製してある）と一緒に連結した。挿入物についてのポジティブクローンを、配列決定によって確認した。最終的に、真の全長クローン３’末端を回復するために、このＰｓｉＩ−ＰｓｉＩフラグメントを、ＳｒＳ１２９ＶｃＶｇについて記載されるように再生し、そしてこの新たな構築物を、ＳｒｃＶｇＳＥ２ｔと名付けた。
ＳｒｃＶｇＳＥ２ｔを、単一の制限酵素ＰｍｅＩで線状化し、インビトロ転写した。このＲＮＡを、ＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃で２４時間インキュベートし、この時点でこの培養上清を回収し、遠心分離によって清浄化し、そしてナイーブなＢＨＫ−２１細胞を感染させるために使用した。感染の約２４時間後に、上清を回収し、遠心分離によって清浄化し、そしてナイーブなＢＨＫ−２１細胞を再度感染させるために使用した。感染の２４時間後、わずかなウイルスプラークを観察し、その上清を回収し、清浄化しそしてナイーブＢＨＫの２つのフラスコを感染させるために使用した。一方のフラスコの細胞を、感染の１６時間後に回収し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して総ＲＮＡを抽出した。他方のフラスコでの感染を、さらに８時間続け、多量のウイルスが産生されたことを示す広範な細胞変性効果を、この細胞において観察した。
この感染した細胞から抽出した総ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用してキャプシド（ｃａｐｓｉｄ）配列および糖タンパク質配列を増幅およびクローンニングするために使用した。この逆転写は、ｐｏｌｙｄＴまたは以下の特定のプライマーのいずれかから開始した

。次いで、このｃＤＮＡを、ＸｈｏＩ部位を含むプライマーＳＩＮＮｔＦおよびＮｏｔＩ部位を含むプライマーＳＩＮＣｔＲを用いるキャプシド配列のＰＣＲ増幅ならびにＮｏｔＩ部位を含むプライマーＶｇｌｙＲおよびＸｈｏＩ部位を含む

を用いる糖タンパク質のＰＣＲ増幅のために使用した。両方のフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ増幅キットを使用して清澄化して、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製し、そして、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いてこれ以前に消化したｔＤＨに別個に連結し、ゲル精製し、そしてエビアルカリホスファターゼを用いて処置した。キャプシドフラグメントについての１０個のクローンを、潜在的な適応性（ａｄａｐｔｉｖｅ）変異を同定するために配列決定した。しかし、変異は、キャプシド領域において見出されず、このことは、このような変異が糖タンパク質配列においてのみ生じるということ、またはそのＲＮＡが未精製のプラークに由来するのでこの１０個のクローンが完全な適応性集団を完全に表現していないということのいずれかを示す。
５個の個々のウイルスプラークに由来するＲＮＡについての同じ分析を繰り返しても、キャプシドの適応性変異の同定はされなかった。１個のプラーク（Ｐ３）に由来する糖タンパク質配列は、３８０位（ＶａｌからＧｌｙへ）および３９１位（ＬｙｓからＡｒｇ）での２つのアミノ酸の変異の存在を明らかにした。興味深いことに、このアミノ酸３８０は、Ｓｉｎｄｂｉｓの間、少なくとも３つのＶＥＥ株（ＴＲＤ、ＭＡＣ１０および６１１．９）の間において保存されており、そして、アミノ酸３９１（これは、細胞質性テールの第１の残基である）は、ＳＩＮ糖タンパク質配列ならびにＭＡＣ１０および６１１９においてはＬｙｓであるが、ＴＲＤ株においてはＡｒｇである。これは、これらの残基の位置が、膜貫通型細胞質テール（これは、糖タンパク質とそのキャプシドとの間の相互作用を安定化し得る）の正しいコンフォメーションおける役割を担っていることを示し得、そして、本発明の一部分としてさらに利用され得ることを示し得る。
この２つの変異がパッケージング効率を増大し得るか否かを試験するために、両方の変異を含む９９８ｂｐのフラグメント（ＮｃｏＩ−ＭｆｅＩ）を、ｔＤＨ−ＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌへと交換し、ｔＤＨ−ＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌＰ３を生成した。次いで、プラスミドＤＮＡであるｔＤＨ−ＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌＰ３を単一の制限酵素ＰｍｅＩを使用して線状化し、そしてインビトロでＲＮＡ転写した。このＲＮＡを、ＳＩＮＣＲ−ＧＦＰレプリコンＲＮＡおよびＳＩＮキャプシドタンパク質をコードするその欠損ヘルパーＲＮＡと一緒に同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃にて、２４時間インキュベートし、この時間で、この培養物の上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、連続的に希釈して、未処理（ナイーブ）のＢＨＫ−２１細胞に感染するために約１４時間にわたり使用した。フローサイトメトリー分析の後に、この粒子力価を決定し、そして、パッケージング効率がＶｇｌｙＳＥ２ｔａｉｌに関して５０倍に増大していた。ＳＥ２ｔａｉｌおよびＶＥＥ Ｅ２−１２０弱毒化変異を含むハイブリッドＶＥＥ糖タンパク質（ＶＥ２−１２０／ＳＥ２ｔａｉｌ）の条件において、このＰ３変異は、パッケージング効率を２００倍に増大した。
（実施例５）
ハイブリッドパッケージングシグナルを有するアルファウイルスレプリコン粒子キメラの生成
Ｓｈｉｄｂｉｓウイルス構造タンパク質中のＶＥＥレプリコンについての高効率パッケージング系を生成するために、ＳＩＮに由来する十分に規定されたＲＮＡパッケージングシグナルを、ＶＥＥレプリコンに種々の位置で挿入した。この研究のために、ＳＩＮに由来する１３２ヌクレオチド（ｎｔ．）コアパッケージングシグナルを、実施例１において構築したＶＥＥ−ＴＲＤレプリコン内の３つの異なる部位の各々（図６）に別個に挿入した。４つのキメラレプリコンを生成した。キメラ１Ａ（Ｃｈｉｍｅｒａ−１Ａ）およびキメラ１Ｂ（Ｃｈｉｍｅｒａ−１Ｂ）は、ＳＩＮパッケージングシグナルがＶＥＥ−ＴＲＤｎｓＰ４遺伝子の３’末端（ｎｓＰ４終止コドンの直前）に挿入されている構築物に与えられた名称である。キメラ−２レプリコンは、ｎｓＰ３のＣ末端でのＳＩＮパッケージングシグナルをインフレームで含み、ｎｓＰ３の１０２ｂｐのセグメントの代わりにヌクレオチドレベルで置換した。最後に、このキメラ３レプリコンは、ｎｓＰ３終止コドンの直前である、ｎｓＰ３の末端においてＳＩＮパッケージングシグナルの挿入によって生じた。
本明細書中の教示が、任意のＢＳＬ−３アルファウイルス（例えば、ＶＥＥ）からレプリコンおよび真核生物性重構造ベクター開始系を改変する固有の機会を提供し得、その結果、これらが、ゲノム長の２／３未満まで親ウイルス由来のヌクレオチド配列を減少することよって、ＢＳＬ−２構築物またはＢＳＬ−１構築物として処理されることが本発明者らによって企図される。
Ａ）キメラ１Ａ、キメラ１Ｂ：
これらのキメラを構築するための複雑な因子は、全てのアルファウイルスの部分ゲノムプロモーターは、ｎｓＰ４の最後の約１００ヌクレオチドと重複しているという事実である。異種遺伝子の発現を駆動するためのレプリコンベクター中の機能的な部分ゲノムプロモーターを維持しつつ、ｎｓＰ４の末端にＳＩＮパッケージングシグナルを位置付けるために、ｎｓＰ４の最後の８０ｎｔ（挿入されたＳＩＮ配列の上流）のコドン頻度を変更してレプリカーゼ複合体に結合するそれらの能力を取り除く必要がある。同時に、このＶＥＥ部分ゲノムプロモーター領域を、部分ゲノムプロモーター認識配列の一部分と考えられているｎｓＰ４の３’末端部分のネイティブ配列を二重にすることによってｎｓＰ４終止コドンの下流で再構築した。キメラ１Ａおよびキメラ１Ｂは、機能的部分ゲノムプロモーター（ＣＨＩＭＥＲＡ−１Ａについては−８０まで（図７）、ＣＨＩＭＥＲＡ−１Ｂについては−９８まで（図８））を再製するための追加した再構築されたｎｓＰ４配列の長さの分だけ相違がある。
キメラ１Ａおよびキメラ１Ｂを、ｐＶＣＲ−ＤＨ（これは、（上で）記載したｐＶＣＲ構築物の再アセンブリ相に由来する中間構築物である）をＭｓｃＩおよびＡｓｃＩを用いて切断することによって調製した。上述のように、非ネイティブのコドンを用いて、ｎｓＰ４の最後の８０ｂｐ程度、その後にＳＩＮパッケージングシグナル（インフレーム）およびｎｓＰ４終止コドン、ならびにその後のネイティブｎｓＰ４配列の二重になった末端の８０ｂｐまたは９８ｂｐを含む２つの３部分で構成される合成オリゴヌクレオチドのいずれかを、このベクターに挿入する。このオリゴヌクレオチドを、上述したレプリコン合成と同じ様式で処理される合成完全二重鎖を提供するために設計した。この連結による配列改変クローンを、ＭｓｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、そして、このＳＩＮパッケージシグナルを保持するオリゴフラグメントを、同様に消化したｐＶＣＲのベクターフラグメント中へと置き換えた。各々に対する得られた最終構築物をｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−１ＡおよびｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−１Ｂと呼称した。これらの構築物の機能を評価するために、ＧＦＰ遺伝子を、部分ゲノムプロモーターの下流の固有のＢｂνＣＩ部位およびＮｏｔＩ部位を使用して各々へクローニングして、そしてこれらの構築物をそれぞれＶＣＲ−Ｃｈｉｍ１Ａ−ＧＦＰおよびＶＣＲ−Ｃｈｉｍ１Ｂ−ＧＦＰとしてそれぞれを命名した。
Ｂ）キメラ２：
キメラ２を、ＶＥＥレプリコンアセンブリ中間体である実施例１から得られたｐＣＭＶｋｍ２−（ｄｅｌ ＸｈｏＩ／ＣｅｌＩＩ）−ＶＥＥ９／１０を切断することによって調製した。このｐＣＭＶｋｍ２−（ｄｅｌ ＸｈｏＩ／ＣｅｌＩＩ）−ＶＥＥ９／１０は、このレプリコンのＭａｍＩ部位およびＢｌｎＩ部位と境界を接しているＶＥＥ ｎｓＰ３およびＶＥＥ ｎｓＰ４の一部分をコードする。このベクターのＸｈｏＩ切断によって、ＶＥＥ ｎｓＰ３の１０２ｂｐセグメントが除去される。この切断したベクターに、末端にあるインフレームのＸｈｏＩ部位に隣接したＳＩＮパッケージングシグナルからなるＰＣＲ産物を挿入した（図９）。この増幅のためのテンプレートは、ｐＳＩＮＣＰであり、そしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼは、以下のオリゴヌクレオチドプライマーと共に使用された：

。
得られたクローンを、配列および方向について確認した。１つの陽性クローンを、ＭａｍＩ−ＢｌｎＩ消化してｐＶＣＲのネイティブＭａｍＩ−ＢｌｎＩセグメントに代わって置換するのに使用した。得られたプラスミドを、ｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−２と名付けた。ＧＦＰ遺伝子を、ｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−１ＡおよびｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−１Ｂについての上述したようにこのベクターへクローニングし、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２−ＧＦＰを作製した。ｎｓＰ３における欠損領域を、そのプラスミドＤＮＡ構築物における都合のよい制限エンドヌクレアーゼに基づいて選択したことが理解されるべきである。ｎｓＰ３のより大きい領域を取り除くさらなる欠損がまた、本発明によって企図され、そして、当業者によって容易に実施され得る。
Ｃ）キメラ−３
キメラ３を、ＶＥＥ ｎｓＰ３およびＶＥＥ ｎｓＰ４の接合部の領域をコードする実施例１に由来するレプリコンフラグメント９＋１０の一部分を含むｐＣＲ２−９０５７ｂを改変することによって調製した。ＳＩＮパッケージング部位の挿入を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびｐＣＲ２−９０５７ｂにおける接合部において２つの産物を増幅しそして得られた産物にＳＩＮパッケージングシグナル配列テールを付加した２セットのプライマーを使用するオーバーラップＰＣＲによって達成した。同様に、ＳＩＮパッケージングシグナルを、ｎｓＰ３配列テールおよびｎｓＰ４配列テールをその産物の５’末端および３’末端のそれぞれに付加するｐＳＩＮＣＰから増幅した。プライマー配列を含むこのストラテジーの詳細については図１０および図１１を参照のこと。この３つのＰＣＲ産物を、希釈し、混合し、変性し、再アニーリングし、そして、外部ｎｓＰ３および外部ｎｓＰ４ならびに３’プライマーおよび５’プライマーを使用してＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで伸長し、増幅のためのキメラオーバーラップテンプレートを生成した。この産物を、ＸｂａＩおよびＭｌｕＩを用いて消化して、そして、同様の消化した中間体クローニングベクターであるｐＣＭＶｋｍ２（ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：２６２８，２０００）にクローニングした。ｐＶＣＲとの前後関係においてこのキメラを配置するために、このｐＣＭＶｋｍ２／ＣＨＩＭＥＲＡ−３中間体をＭａｍＩ（５’）およびＳａｃＩ（３’）で消化し、そして、ｐＶＣＲ（ｐＶＣＲのｎｔ．５６２０−６０１６）由来のＳａｃＩ−ＢｌｎＩフラグメントと共に連結してｐＶＣＲのＭａｍＩ／ＢｌｎＩベクターフラグメントとした。この得られた構築物を、ｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−３と命名した。ＧＦＰ遺伝子を、ｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−１Ａ、ｐＶＣＲ／ＣＨＩＭＥＲＡ−１Ｂについて上述したようにこのベクターにクローニングし、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ３−ＧＦＰを生成した。
これらの構築物がＳｉｎｄｂｉｓ構造タンパク質によってパッケージングされる能力を試験するために、プラスミドＶＣＲ−Ｃｈｉｍ１Ａ−ＧＦＰ、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ１ｂ−ＧＦＰ、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２−ＧＦＰ、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ３−ＧＦＰを単一の制限酵素ＰｍｅＩを使用して線状化し、そしてインビトロでＲＮＡ転写した。このＲＮＡを、ＳＩＮキャプシドタンパク質ならびに構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｇｌｙｄｌｌ６０および構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｃａｐに由来する糖タンパク質をコードする、ＰｍｅＩで線状化された欠損ヘルパーＲＮＡで同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃にて、２４時間インキュベートし、この時間で、この培養物の上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、連続的に希釈して、未処理（ナイーブ）のＢＨＫ−２１細胞に感染するために約１４時間にわたり使用した。フローサイトメトリー分析を使用して、この粒子力価を決定した。以下の結果は、３つのキメラがＳＩＮ構造タンパク質によって効率的にパッケージングされ得ることを示した。キメラ１Ａは、ＧＦＰを発現しておらず、そしてこれが部分ゲノム転写における欠損に起因するかまたはＲＮＡ複製における欠損に起因するかを決定しない。

（キメラ２．１の構築）
ｐＶＣＲ−Ｃｈｉｍｅｒａ２レプリコンに存在する親ＶＥＥウイルス配列の量をさらに低減するために、ＶＥＥに由来する３’ＮＴＲ（非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’の配列、すなわち３’ＵＴＲとしてまた公知である）配列をその全体を取り除いて、そして、ＳＩＮ由来の３’ＮＴＲによって置き換えた。プラスミドＳＩＮＣＲ−ＧＦＰ（Ｇａｒｎｅｒら、２０００，前出）を、ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化して、この４６６ｂｐフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用することによってゲル精製して、ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩでこれ以前に消化したｐＶＣＲ−Ｃｈｉｍｅｒａ２およびＶＣＲ Ｃｈｉｍ２−ＧＦＰの両方に連結し、ゲル精製し、そして、エビアルカリホファターゼを使用して処理した。陽性クローンを確認し、そして、これらの構築物を、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１およびＶＣＲ Ｃｈｉｍ２．１−ＧＦＰとして命名した。これらの構築物は、ここでは、複数のＶＥＥ配列（例えば、ｎｓＰ３の領域、構造タンパク質遺伝子、３’ＮＴＲ）を取り除いた分だけ親ＶＥＥウイルスゲノムと相違する。
新たなキメラレプリコンベクターの配置の機能性を試験するために、プラスミドＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ＧＦＰを単一の制限酵素ＰｍｅＩを使用して線状化し、そしてインビトロでＲＮＡ転写した。このＲＮＡを、ＳＩＮキャプシドタンパク質およびＰｍｅＩで線状化した構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｇｌｙｄｌｌ６０および構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｃａｐに由来する糖タンパク質をコードする欠損ヘルパーＲＮＡで同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃にて、２４時間インキュベートし、この時間で、この培養物の上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、連続的に希釈して、未処理（ナイーブ）のＢＨＫ−２１細胞に感染するために約１４時間にわたり使用した。フローサイトメトリー分析を使用して、この粒子力価をＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２−ＧＦＰと同じである力価であることを決定した。このことは、ネイティブの３’ＮＴＲの欠失および異種アルファウイルス性３’ＮＴＲ（例えば、ＳＩＮ３’ＮＴＲ）との置き換えは、ＶＥＥレプリコンにおける機能性を維持することを実証している。
あるいは、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍｅｒａ２におけるＶＥＥ全体に由来の配列を減少する手段として、３’ＮＴＲが１９ｎｔの保存されたＣＳＥを含む最小配列まで減少した。このような改変された３’ＮＴＲを、以下のような重複したオリゴヌクレオチドを使用して生成した：

このような順方向オリゴヌクレオチドおよび逆方向オリゴヌクレオチド（例えば、Ｖｒｅｄ２ＦとＶｒｅｄ２Ｒ、ＶＥＥ２ＦとＶＥＥ２Ｒなど）を、混合し、リン酸化し、変性し、緩やかにアニーリングした。次いで、３対のアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、一緒に混合し、互いに連結し、酵素ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製し、そして、全長３’ＮＴＲを取り除くために同じ酵素でこれ以前に消化したＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２−ＧＦＰに連結し、ゲル精製し、そして、エビアルカリホスファターゼで処理した。このフラグメントについて陽性のクローンを、配列決定によって確認した。この構築物を、ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．２−ＧＦＰと命名した。
このキメラレプリコンベクターの配置の機能性を確認するために、プラスミドＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．２−ＧＦＰを単一の制限酵素ＰｍｅＩを使用して線状化し、そしてインビトロでＲＮＡ転写した。このＲＮＡを、ＳＩＮキャプシドタンパク質およびＰｍｅＩで線状化した構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｇｌｙｄｌｌ６０および構築物ＶＣＲ−ＤＨ−Ｓｃａｐに由来する糖タンパク質をコードする欠損ヘルパーＲＮＡで同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３４℃にて、２４時間インキュベートし、この時間で、この培養物の上清を回収し、遠心分離によって清澄化し、連続的に希釈して、未処理（ナイーブ）のＢＨＫ−２１細胞に感染するために約１４時間にわたり使用した。フローサイトメトリーを使用して、この粒子力価をＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２−ＧＦＰに類似の力価であると決定した。このことは、１１７ｂｐから３７ｂｐに３’ＮＴＲのサイズを減少したことよっても、このレプリコンの機能性は維持されていることを実証している。
ＲＮＡまたはレプリコン粒子としての用途について上記のレプリコンに類似して、真核生物細胞内で直接的に機能するアルファウイルスＤＮＡベースのレプリコン（例えば、真核生物階層ベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ））は、本明細書中に提供される教示を使用して当業者によって誘導され得る。このようなＤＮＡベースのレプリコンは、種々の親ウイルス配列（ｎｓＰ３カルボキシ末端領域に由来する配列、構造タンパク質遺伝子領域、３’ＣＳＥ領域、などが挙げられるがこれらに限定されない）から取り除かれ得る。
（実施例６）
（レプリコンＲＮＡの送達のための異なる構造タンパク質の使用）
ＨＩＶ抗原を、ＳＩＮ構造タンパク質またはＶＥＥ構造タンパク質のいずれかを用いてパッケージングしたＳＩＮレプリコンＲＮＡから、および以下のようなＳＩＮ構造タンパク質またはＶＥＥ構造タンパク質のいずれかを用いてパッケージングしたＶＥＥレプリコンＲＮＡから発現させた。具体的に、プラスミドｐＣＭＶＫｍ２．ＧａｇＭｏｄ．ＳＦ２由来のコドン最適化ＨＩＶｐ５５ｇａｇをコードする異種遺伝子配列を含むフラグメント（ｚｕｒ Ｍｅｇｅｄｅ，Ｊ．Ｖｉｔｏｌ．７４：２６２８，２０００）を、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位のＳＩＮＣＲレプリコンベクター（Ｇａｒｄｎｅｒら、２０００、同書）に、ＢｂνＣＩ−ＮｏｔＩ部位のＶＣＲレプリコンベクターに、そしてＢｂνＣＩ−ＭｆｅＩ部位のＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１ベクターに挿入した。このｐ５５ｇａｇコードレプリコン構造体は、ＳＩＮＣＲ−ｐ５５ｇａｇ、ＶＣＲ−ｐ５５ｇａｇ、およびＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１−ｐ５５ｇａｇをそれぞれ消化した。ＳＩＮ、ＶＥＥおよびｐ５５ｇａｇを発現するキメラレプリコン粒子を産生するために、上記のプラスミドを、単一の制限酵素ＰｍｅＩを用いて直鎖化し、そしてＲＮＡを、インビトロで転写した。このＲＮＡを、以下に示されるように、ＰｍｅＩ直鎖化プラスミドから転写した、適切な構造タンパク質をコードする欠失ヘルパーＲＮＡと一緒に同時トランスフェクトした。

トランスフェクトされた細胞を、３４℃でインキュベートし、上清を、２０時間および３６時間目に回収し、続いて、遠心分離によって分類し、そして上記のようにクロマトフラフィーによって精製した（ＰＣＴ ＷＯ ０１／９２５５２）。
粒子の力価を、精製された粒子沈殿物の一連の希釈物を用いて、１６時間かけて感染させたＢＨＫ２１細胞中で、ｇａｇ発現のために細胞内染色させることによって、決定した。これらの細胞を、最初に、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて透過化処理および固定化させ、次いで、ＨＩＶ−１コア抗原に対するＦＩＴＣ結合体化抗原を用いて、細胞内ｐ５５ｇａｇを染色した（Ｃｏｕｌｔｅｒ）。フローサイトメトリー分析を使用して、ｇａｇ陽性細胞の割合を測定し、そしてこの粒子の力価を計算するために使用した。
げっ歯類モデルにおける免疫原性を、１０６または１０７ＩＵレプリコン粒子用量で、ＨＩＶｐ５５ｇａｇを発現する異なるアルファウイルスレプリコン粒子調製物を用いて免疫した後に決定した（図１２）。各々が、免疫原性であることを見出し、そして１種のキメラ（ＶＥＥｒｅｐ／ＳＩＮｎｅｖ）が、特に強力な免疫原であることが見出された。
それらの構造タンパク質が異なる、アルファウイルスレプリコン粒子（例えば、上記のレプリコン粒子）を用いた、げっ歯類または霊長類の引き続く免疫の実証を、種々の経路（例えば、筋肉内、皮内、皮下、鼻内）を使用し、１０３ＩＵから１０８ＩＵの範囲、またはそれより多くの範囲の投薬量を用いて実施し得る。例えば、霊長類は、最初に、ＰＢＳ希釈物（０．５ｍＬ）内に、ＶＥＥ構造タンパク質を含む１０７のＳＩＮＣＲ−ｐ５５粒子を用いて、皮下経路により免疫する。次いで、同一の物質を、同一の注射経路によって、２回、３０日後に投与する。次いで、約６〜１２ヶ月後、この動物を、ＰＢＳ希釈物（０．５ｍＬ）内に、ＳＩＮ構造タンパク質を含む１０７のＳＩＮＣＲ−ｐ５５粒子を用いて、１回以上、筋肉内経路により免疫する。免疫原性の実証を、標準アッセイを使用して実施し、そして投与時に、単一タイプのレプリコン粒子を受容した対応する動物と比較し得る。
続く例は、２種の異なるアルファウイルス由来の、核酸、非構造タンパク質および構造タンパク質、ならびにそれらの一部を使用する、キメラアルファ粒子を調製するのに適した種々の技術を記載する。しかし、本明細書中で提供される教示を使用する当業者は、過度の実験なく、３種以上のウイルスからキメラアルファウイルス粒子を調製し得る。当業者に一般に利用可能である、他の明らかな技術的な開示の教示（特許、特許出願、科学雑誌、科学論文ならびに標準的な参考文献および教科書を含むが、これらに限定されない）と、本明細書に見出される教示を合わせることは、論理付けされる。
例えば、アルファウイルスキメラ粒子は、ＳＩＮレプリコンベクターおよび少なくとも２種の欠失ヘルパーＲＮＡ分子を使用して作製される。このレプリコンＲＮＡは、ＳＩＮ非構造タンパク質、ＶＥＥパッケージングシグナルおよび目的の異種遺伝子をコードする。この第１の欠失ヘルパーＲＮＡは、ＶＥＥ ＲＮＡ結合ドメインおよびＷＥＥ糖タンパク質相互作用ドメインを有するハイブリッドキャプシドタンパク質をコードする。この第２の欠失ヘルパーＲＮＡは、ＷＥＥ糖タンパク質をコードする。生じたキメラアルファウイルス粒子は、ＶＥＥ／ＷＥＥハイブリッドキャプシドおよびＷＥＥエンベロープ糖タンパク質を含むＳＩＮ由来の核酸を有する。
別の例において、キメラアルファウイルス粒子は、本発明の技術に従って作製され、ここで、ＳＩＮ非構造タンパク質を有するＳＩＮレプリコンおよび目的の異種遺伝子を、２種の欠失ヘルパーＲＮＡ分子と組み合わせる。この第１の欠失ヘルパーＲＮＡは、ＳＩＮ ＲＮＡ結合ドメインおよびＳＦＶ糖タンパク質相互作用ドメインを有する、ハイブリットキャプシドをコードする。この第２の欠失ヘルパーＲＮＡは、ＶＥＥによって提供された糖タンパク質エンベロープの残基と共にＳＦＶ細胞質テールを有するハイブリッド糖タンパク質をコードする。生じたキメラアルファウイルス粒子は、ＳＦＶ／ＶＥＥハイブリッドエンベロープ糖タンパク質と共に、ＳＩＶ／ＳＦＶハイブリッドキャプシド中にキャプシド形成された目的の異種遺伝子を含むＳＩＮ核酸を有し、この糖タンパク質の外部ドメインは、ＶＥＥから誘導される。
なおさらなる別の実施形態において、４種の異なるアルファウイルスを使用して、キメラアルファウイルス粒子を調製する。この例において、ＳＩＮ非構造タンパク質をコードするＳＩＮレプリコンＲＮＡ、ＶＥＥパッケージングシグナル、および目的の異種遺伝子が、提供される。第１の欠失ヘルパーＲＮＡは、ＶＥＥ ＲＮＡ結合ドメインおよびＷＥＥ糖タンパク質相互作用ドメインを有するハイブリッドキャプシドをコードする。この第２の欠失ヘルパーＲＮＡは、ＳＦＶによって提供される糖タンパク質の残基と共に、ＷＥＥ細胞質テールを有するハイブリッド糖タンパク質をコードする。生じたキメラアルファウイルス粒子は、ＳＩＮ ＲＮＡ、および目的の異種遺伝子、ＶＥＥ／ＷＥＥハイブリッドキャプシド、ならびにＷＥＥ／ＳＦＶハイブリッド糖タンパク質を有する、糖タンパク質の外部ドメイン部分は、ＳＦＶから誘導される。
多くの他の組み合わせが、可能であり、そして前記の例は、本発明の巨大な可能性を例示するのに役立つ。従って、これらの非制限例は、本発明の教示に従って作製され得る、莫大なキメラアルファウイルス粒子のうちの２、３種のみを表す。
（実施例７）
（異なる制御エレメントを有するアルファウイルスレプリコンベクターおよび欠損ヘルパーの使用）
異なる制御エレメントを有するベクター（例えば、レプリコンＲＮＡ、真核生物階層ベクター開始システム（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｌａｙｅｒｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）要素およびパッケージング（例えば、欠損ヘルパー、構造タンパク質発現カセット）要素を用いてアルファウイルスレプリコン粒子を生成するために、本発明に従って、広範な種々の組み合わせを使用し得る。例えば、ＳＩＮパッケージング細胞株の構造タンパク質発現カセットに含まれる、非構造タンパク質により媒介される増幅（３’ＣＳＥ）について必要とされる異なる３’配列を含むＳＩＮプラスミドＤＮＡベースのレプリコン（真核生物階層ベクター開始システム）を、構築し得る。より詳細には、ウシ増殖ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを組み込むＳＩＮ３’末端の改変を、以下に記載されるように実施する。従って、得られる配列：

を、ＳＩＮプラスミド構築物へと操作する。この新規の配列を、以下のように、プラスミドｐＳＩＮＣＰ（ＷＯ０１／８１６９０を参照のこと）の既存の３’末端、合成ポリＡトラクト、リボザイム、およびＢＨＧポリＡ部位と置換する。プラスミドｐＳＩＮＣＰ−ｂｇａｌ（ｂｇａｌを発現するｐＳＩＮＣＰ）から、以下のプライマー：

（ＮｏｔＩ部位（１２〜１９ｎｔ）、ＰｍｅＩ部位（３０〜３７ｎｔ）、および上記エレメントの下流のＳＩＮＣＰ−ｂｇａｌ配列に相補的な３８〜６５ｎｔを含み、ＮｏｔＩ部位がそれらの前に存在する）

（ＳｐｈＩ部位を含むプラスミド骨格領域に相補的である）
を用いるＰＣＲによって、上記エレメントを失失させる。増幅した４９２ｂｐフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから精製し、ＮｏｔＩおよびＳｐｈＩで消化し、そしてＮｏｔＩおよびＳｐｈＩで同様に消化したＳＩＮＣＰ−ｂｇａｌに連結して、既存の配列（１１０６ｂｐ）を除去する。新規に生成されたフラグメントを含むクローンを、配列決定により確認し、そしてこの中間構築物をＳＩＮＣＰｔ−ｂｇａｌと呼ぶ。次いで、この新規の３’末端を、重複オリゴヌクレオチドを用いて生成する。

このオリゴヌクレオチドを混合し、リン酸化し、変性し、ゆっくりとアニールさせ、そして連結する。リガーゼを不活性化した後、ＤＮＡを、酵素ＮｏｔＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いてゲル精製し、そして同一の酵素で消化したＳＩＮＣＰｔ−ｂｇａｌに連結し、そしてアルカリホスファターゼで処理する。新規に生成されたフラグメントを含むクローンを、配列決定により確認し、そして最終構築物を、ＳＩＮＣＰ−ｐＡ−ｂｇａｌと呼ぶ。
レプリコン粒子を生成するために、このプラスミドを、同様に改変された３’末端配列を有さない構造タンパク質発現カセットを含むＳＩＮパッケージング細胞株（Ｐｏｌｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：４５９８−６０３）にトランスフェクトする。適切なインキュベーションの後、レプリコン粒子を収集し、そして上記のように精製する。
本明細書中の値の範囲の列挙は、その範囲に含まれる各々別個の値を個々に参照する略記方法として用いられることを意図するのみであり、本明細書中に他にそうでないことが示されない限り、各々の個々の値は、本明細書中で個々に列挙されるように、本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に他にそうでないことが示されないかまたは文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順番で実施され得る。任意のおよび全ての実施例、または本明細書中で提供され得る例示の言語（例えば、「例えば、〜のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」の使用は、本発明をより良く説明することのみを意図し、そして他の方法で主張される本発明の範囲に対する限定を与えない。本発明の実施に必須の任意の非請求要素を示すことを意図する本明細書中の言語は存在しない。
本明細書中に開示される本発明の代替の要素または実施形態の分類は、限定を意図しない。各群のメンバーは、個々にかまたはその群の他のメンバーもしくは本明細書中で見出される他の要素との任意の組み合わせで参照され得、そして請求され得る。群の１つ以上のメンバーが、利便性および／または特許性の理由で、群に含まれ得るかまたは群から除外され得る。任意のこのような包含または除外が生じる場合、本明細書は、改変された群を本明細書中に含むとみなされ、従って添付の特許請求の範囲において用いられるマーカッシュ群の記載された説明を十分に満たす。
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に記載されており、これらは、本発明を実施するための本発明者らの認識している最良の様式を含む。当然、それらの好ましい実施形態におけるバリエーションは、上記の説明を読んだ当業者に明らかである。本発明者らは、当業者が、このようなバリエーションを適切に使用することを考慮しており、そして本発明者らは、本発明が、本明細書中に詳細に記載されたのと別の方法で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用される法律により許容される場合、本明細書中に添付の特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変および等価物を含む。さらに、それらの全ての可能性のあるバリエーションにおける上記エレメントの任意の組み合わせはは、本明細書中にそうでないことが示されるかまたは文脈から明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。

Claims (9)

  1. 哺乳動物において免疫応答を生成するための組成物であって、キメラアルファウイルス粒子を含有し、該キメラアルファウイルス粒子は：
    第１アルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質および該第１アルファウイルスと異なる第２アルファウイルス由来のパッケージングシグナルをコードするＲＮＡであって、ここで、該パッケージングシグナルが、ｎｓＰ３とｎｓＰ４との連結部、ｎｓＰ４のオープンリーディングフレームの３’末端、および非構造タンパク質遺伝子における欠失からなる群より選択される部位に挿入される、ＲＮＡ；
    該第２アルファウイルス由来のキャプシドタンパク質；ならびに
    該第１アルファウイルスと異なるアルファウイルス由来のエンベロープタンパク質、を含む、組成物。
  2. 前記パッケージングシグナルが、非構造タンパク質遺伝子におけるカルボキシ末端欠失に挿入される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記エンベロープタンパク質が、前記第２アルファウイルス由来である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記粒子がレプリコン粒子であり、さらに、前記ＲＮＡが５’から３’への順番で、（ｉ）非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる５’配列、（ｉｉ）アルファウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）異種核酸を発現するための手段、（ｉｖ）該異種核酸配列、（ｖ）非構造タンパク質媒介増幅に必要とされる３’配列、および（ｖｉ）ポリアデニル化トラクト、を含み、該異種核酸配列は、アルファウイルス構造タンパク質遺伝子と置き換わる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
  5. 前記第１アルファウイルスが、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）であり、そして前記第２アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
  6. 前記第１アルファウイルスがＶＥＥであり、前記第２アルファウイルスがＳＩＮである、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
  7. 前記ＲＮＡが、異種核酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
  8. 前記異種核酸が、少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質と置き換わる、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記異種核酸配列が、治療因子または免疫原をコードする、請求項７に記載の組成物。
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