ES2624854T3 - Partículas de replicón de alfavirus quimérico - Google Patents
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Abstract
Un ARN replicón de alfavirus que comprende una secuencia 5' requerida para la amplificación mediada por proteína no estructural, secuencias que codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas, un promotor subgenómico de alfavirus, una secuencia heteróloga que no es de alfavirus, y una secuencia 3' requerida para la amplificación mediada por proteína no estructural, en la que la secuencia que codifica al menos una de dichas proteínas no estructurales deriva del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y en la que la secuencia de dicho ARN del replicón presenta entre el 33,33 % y el 66,67 % de identidad de secuencia con el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) en toda la longitud del genoma del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y en el que el ARN replicón de alfavirus comprende secuencias derivadas del virus Sindbis (SIN), en el que las secuencias derivadas de SIN comprenden una señal de empaquetamiento insertada en un sitio seleccionado de la unión de nsP3 con nsP4, después de la fase abierta de lectura de nsP4, y una deleción en un gen de proteína no estructural.
Description
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DESCRIPCION
Partmulas de replicon de alfavirus quimerico Campo tecnico
La presente invencion se refiere de manera general a partmulas de alfavirus quimerico. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a la preparacion de alfavirus quimericos, como se reivindica, que tienen ARN derivado de al menos un alfavirus y uno o mas elementos estructurales (capside y/o envoltura) derivados de al menos dos alfavirus diferentes. Los alfavirus quimericos de la presente invencion son utiles en la administracion ex vivo e in vivo de genes heterologos que tienen aplicaciones terapeuticas o profilacticas.
Antecedentes
Los alfavirus comprenden un conjunto de virus transmitidos por artropodos, relacionados genetica, estructural y serologicamente de la familia Togaviridae. Se han clasificado veintiseis virus y subtipos de virus conocidos dentro del genero Alphavirus, incluyendo, virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus del no Ross y virus de la encefalitis equina venezolana.
El virus Sindbis es el miembro prototipo del genero Alphavirus de la familia Togaviridae. Su estrategia de replicacion se ha caracterizado bien en diversos cultivos celulares y sirve como modelo para otros alfavirus. Brevemente, el genoma del virus Sindbis (como otros alfavirus) es una molecula de ARN de sentido positivo y monocatenario de 12 kb con casquete y poliadenilada, y contenida en una cubierta proteica, la capside, codificada por el virus. La nucleocapside se rodea ademas de una envoltura lipfdica, derivada del hospedador, dentro de la que hay insertadas dos glucoprotemas espedficas vmcas, E1 y E2, que estan insertadas y ancladas por una cola citoplasmatica a la nucleocapside. Ciertos alfavirus (por ejemplo, sFv) mantienen tambien una protema adicional, E3, que es un producto de escision de la protema precursora de E2, PE2.
Tras la adsorcion de las partmulas vmcas en las celulas diana, la penetracion y el desprendimiento de la nucleocapside para liberar el ARN genomico del virus dentro del citoplasma, el proceso de replicacion tiene lugar a traves de cuatro protemas no estructurales (nsP, del ingles nonstructural proteins), traducidas de los dos tercios del extremo 5' del genoma vmco. A su vez, lasmtesis de un ARN de cadena negativa de longitud completa, proporciona un molde para la smtesis de ARN genomico de cadena positiva adicional y un ARN 26S subgenomico expresado de manera abundante, se inicia internamente en la region de union del promotor. Las protemas estructurales del alfavirus se traducen a partir del ARN 26S subgenomico, que representa el primer tercio del extremo 3' del genoma, y al igual que las nsP, se procesan de manera postraduccional en las protemas individuales.
Se estan desarrollando varios miembros del genero Alphavirus como vectores de expresion "replicones" para su uso como vacunas y compuestos terapeuticos. Los vectores replicones se pueden utilizar en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y partmulas de replicones recombinantes. Tales vectores replicones han derivado de alfavirus que incluyen, por ejemplo, virus Sindbis (Xiong y col. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky y col., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan y col. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo y col. (1999) PNAS 96:4598-4603), virus del bosque Semliki (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund y col. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), virus de la encefalitis equina venezolana.(Pushko y col. (1997) Virology 239:389-401). Una amplia bibliograffa demuestra en la actualidad la eficacia de los vectores replicones de alfavirus en aplicaciones tales como vacunas (vease, por ejemplo, Dubensky y col., ibid; Berglund y col., ibid; Hariharan y col., ibid, Pushko y col., ibid; Polo y col., ibid; Davis y col. (2000) J Virol. 74:371-378; Schlesinger y Dubensky (1999) Curr Opin. Biotechnol. 10:434-439; Berglund y col. (1999) Vaccine 17:497-507). Hablando de manera general, una partmula de "replicon" se refiere a una partmula vmca que contiene un acido nucleico autorreplicante. La propia partmula de replicon se considera de manera general incompetente o "defectuosa" en la replicacion. es decir, que no se dara una progenie de partmulas de replicon cuando se infecte una celula por una partmula de replicon. A traves de los anos, han surgido varias expresiones sinonimas que se usan para describir las partmulas de replicon. Estas expresiones incluyen partmula vmca recombinante, partmula de alfavirus recombinante, partmula de replicon de alfavirus y partmula de replicon. Sin embargo, tal como se usa en el presente documento, todas estas expresiones se refieren a una unidad de tipo virion que contiene un vector replicon de ARN derivado de un virus, espedficamente, un vector replicon de ARN de alfavirus. Ademas, estas expresiones pueden referirse de manera colectiva como vectores, construcciones de vector o vectores de administracion de genes.
En la actualidad, se estan desarrollando varios alfavirus como sistemas de administracion de genes para vacunas y otras aplicaciones terapeuticas. Aunque generalmente son bastante similares en sus caractensticas globales (por ejemplo, estructura, replicacion), cada alfavirus puede presentar alguna propiedad particular (por ejemplo, union al receptor, sensibilidad al interferon y perfil de enfermedad) que es unico. Para aprovechar las propiedades mas deseables de cada virus, se ha desarrollado un enfoque de una partmula de replicon quimerica. Espedficamente, una partmula de replicon de alfavirus quimerico puede tener ARN derivado de un virus y uno o mas componentes estructurales derivados de un virus diferente. Los componentes vmicos derivan generalmente de virus estrechamente relacionados; sin embargo, son posibles las partmulas de virus quimericos creadas a partir de familias de virus divergentes.
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Se demostro previamente que se pueden generar partmulas de replicon de alfavirus quimerico, en las que el vector de ARN deriva de un primer alfavirus y las protemas estructurales de la "cubierta" (por ejemplo, glucoprotemas de la envoltura) derivan de un segundo alfavirus (vease, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos con numero de serie 09/236.140; veanse tambien, las Patentes de Estados Unidos 5.789.245, 5.842.723, 5.789.245, 5.842.723 y 6.015.694; asf como los documentos WO 95/07994, WO 97/38087 y WO 99/18226). Sin embargo, aunque las estrategias descritas anteriormente fueron satisfactorias para crear varias quimeras de alfavirus, tales partmulas quimericas no siempre se producen en rendimientos comercialmente viables, quizas debido a interacciones menos eficaces entre el ARN vmco y las protemas estructurales, dando como resultado una productividad disminuida.
Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad de composiciones que comprendan y de procedimientos que preparen y utilicen partmulas de replicones quimericas y replicones, por ejemplo, para su uso como vehmulos de administracion de genes que tienen un tropismo celular y tisular alterado y/o una antigenicidad superficial frente a protemas estructurales.
Resumen
La invencion proporciona un ARN de replicon de alfavirus que comprende una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, secuencias que codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas, un promotor subgenomico de alfavirus, una secuencia heterologa que no es de alfavirus, y una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural,
en la que la secuencia que codifica al menos una de dichas protemas no estructurales deriva del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y en la que la secuencia de dicho ARN del replicon presenta entre el 33,33 % y el 66,67 % de identidad de secuencia con el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) en toda la longitud del genoma del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y
en la que el ARN del replicon de alfavirus comprende secuencias que derivan del virus Sindbis (SIN), en las que las secuencias derivadas de SIN comprenden una senal de empaquetamiento insertada en un sitio seleccionado de la union de nsP3 con nsP4, despues de la fase abierta de lectura de nsP4, y una delecion en un gen de protema no estructural.
La invencion tambien proporciona un procedimiento para producir partmulas de replicon de alfavirus que comprende la introduccion del ARN del replicon del alfavirus descrito anteriormente y un ARN auxiliar defectuoso que es capaz de amplificarse y expresar una o mas protemas estructurales del alfavirus en una celula hospedadora en condiciones que permitan la formacion de las partmulas.
La invencion tambien proporciona una partmula de replicon de alfavirus que comprende el ARN del replicon de alfavirus descrito anteriormente.
La invencion incluye partmulas de alfavirus quimerico tal como se reivindica, que comprenden (a) ARN que codifica una o mas protemas estructurales que derivan de un primer alfavirus y una senal de empaquetamiento que deriva de un segundo alfavirus diferente de dicho primer alfavirus (una senal de alfavirus insertada en un sitio seleccionado del grupo que consiste en la union de nsP3 con nsP4, despues de la fase abierta de lectura de nsP4, y una delecion en un gen de protema no estructural); (b) una protema de la capside que deriva de dicho segundo alfavirus; y (c) una protema de la envoltura que deriva de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus. En determinadas realizaciones, la protema de la envoltura deriva del segundo alfavirus.
En cualquiera de las partmulas quimericas descritas en el presente documento, el ARN puede comprender, en sentido 5' a 3' (i) una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, (ii) una secuencia de nucleotidos que codifica protemas no estructurales de alfavirus, (iii) un medio para expresar un acido nucleico heterologo (por ejemplo, un promotor de la region de union vmica), (iv) la secuencia de acido nucleico heterologa (por ejemplo, un inmunogeno), (v) una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural y (vi) un tramo de poliadenilato. En determinadas realizaciones, la secuencia de acido nucleico heterologa sustituye un gen de protema estructural de alfavirus. Ademas, en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, las quimeras comprenden secuencias que derivan del virus Sindbis (SIN) y del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), en las que el primer alfavirus es VEE y el segundo alfavirus es SIN.
En otros aspectos, la invencion incluye un ARN del replicon de alfavirus que comprende una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, secuencias que codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas, un promotor subgenomico de alfavirus, una secuencia heterologa que no es de alfavirus, y una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, en la que la secuencia que codifica al menos una de dichas protemas no estructurales deriva de un alfavirus de Nivel de Bioseguridad 3 (NBS-3) y en el que las secuencias de dicho ARN del replicon presenta una identidad de secuencia de al menos un tercio pero no mas de dos tercios de un genoma de un alfavirus NBS-3. En determinadas realizaciones, las copias de ADNc de estos replicones se incluyen como secuencias de vector de acido nucleico en un vector del sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas (ELVIS, del ingles Eukaryotic Layered Vector Initiation System), por ejemplo, un vector de ELVIS que comprende un promotor 5' que es capaz de iniciar en una celula eucariota la smtesis de ARN a partir de ADNc, y la secuencia del vector de acido nucleico que es capaz de
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dirigir su propia replicacion y de expresar una secuencia heterologa. El alfavirus NBS-3 es un virus de la encefalitis equina venezolana (VEE).
En cualquiera de las partmulas quimericas y replicones descritos en el presente documento, el ARN puede comprender adicionalmente secuencias de acido nucleico heterologo, por ejemplo, un agente terapeutico o un inmunogeno (antfgeno). La secuencia de acido nucleico heterologa puede sustituir las secuencias codificantes de la protema estructural. Ademas, la secuencia de nucleotidos heterologa puede codificar, por ejemplo, un antigeno de polipeptido que deriva de un patogeno (por ejemplo, un agente infeccioso tal como un virus, una bacteria, un hongo o un parasito). En realizaciones preferidas, el antfgeno deriva de un virus de inmunodeficiencia humano (VIH) (por ejemplo, gag, gp 120, gp 140, gp 160 pol, rev, tat, y nef), de un virus de hepatitis C (VHC) (por ejemplo, C, E1, E2, NS3, NS4 y NS5), de un virus gripal (por ejemplo, Ha, NA, NP, M), de un paramixovirus, tal como virus paragripal o virus sincicial respiratorio o virus del sarampion (por ejemplo, NP, M, F, HN, H), un herpesvirus (por ejemplo, glucoprotema B, glucoprotema D), un filovirus tal como virus de Marburgo o virus del ebola (por ejemplo, NP, GP), un bunyavirus tal como el virus Hantaan o el virus de la fiebre del valle del Rift (por ejemplo, Gl, G2, N), o un flavivirus tal como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas o el virus del Nilo Occidental (por ejemplo, C, prM, E, NS1, NS3, NS5). En cualquiera de las composiciones o procedimientos descritos en el presente documento, el ARN puede comprender adicionalmente una senal de empaquetamiento de un segundo alfavirus insertada en una region no esencial eliminada de un gen de protema no estructural 3 (gen nsP3).
En otro aspecto, se proporcionan procedimientos, tal como se reivindica, de preparacion (produccion) de partmulas de replicon de alfavirus. Las partmulas se preparan introduciendo cualquiera de los ARN dereplicon y auxiliares defectuosos, descritos en el presente documento, en una celula hospedadora adecuada en condiciones que permitan la formacion de partmulas. En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, los ARN auxiliares defectuosos pueden incluir protemas estructurales quimericas y/o hforidas (o secuencias que codifiquen estas protemas quimericas/hforidas) tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el procedimiento comprende introducir en una celula hospedadora: (a) un ARN de replicon de alfavirus tal como se reivindica, que contiene una o mas secuencias heterologas; y (b) al menos uno o mas ARN auxiliares defectuosos distintos que codifican protemas estructurales ausentes en el ARN de replicon, en el que al menos una de dichas protemas estructurales deriva de dos o mas alfavirus, en el que se producen partmulas de replicon de alfavirus. El replicon de ARN puede derivar de uno o mas alfavirus y las protemas estructurales pueden incluir una o mas protemas hfbridas, por ejemplo, una protema de capside hfbrida que tiene un dominio de union a ARN derivado de un primer alfavirus y un dominio de interaccion de glucoprotema de envoltura que deriva de un segundo alfavirus; y/o una protema de envoltura hfbrida que tiene una porcion de cola citoplasmatica y una porcion permanente, en la que la porcion de cola citoplasmatica deriva de un primer alfavirus y la porcion permanente de dicha glucoprotema de envoltura deriva de uno o mas alfavirus diferentes del primero.
En otro aspecto mas, la invencion proporciona un procedimiento tal como se reivindica para producir partmulas de replicon de alfavirus, que comprende introducir en una celula hospedadora (a) un ARN de replicon de alfavirus tal como se reivindica que codifica una o mas protemas no estructurales de un primer alfavirus, una senal de empaquetamiento que deriva de un segundo alfavirus, (por ejemplo, insertada en un sitio seleccionado del grupo que consiste en la union de nsP3 con nsP4, siguiendo la fase abierta de lectura de nsP4, y una delecion en un gen de protema no estructural) y una o mas secuencias heterologas; y (b) al menos uno o mas ARN auxiliares defectuosos distintos que codifican protemas estructurales ausentes en el ARN de replicon, en el que al menos una de dichas protemas estructurales es una protema de capside derivada de dicho segundo alfavirus, y al menos una de dichas protemas estructurales es una protema de envoltura derivada de un alfavirus diferente de dicho primer alfavirus.
La invencion puede utilizar lmeas celulares de empaquetamiento de alfavirus que comprenden uno o mas casetes de expresion de protema estructural que comprenden secuencias que codifican una o mas protemas estructurales, en las que al menos una de dichas protemas estructurales deriva de dos o mas alfavirus. En determinadas realizaciones, uno o mas casetes de expresion de protema estructural comprende copias de ADNc de un ARN auxiliar defectuoso y, opcionalmente, un promotor subgenomico de alfavirus. Ademas, en cualquiera de estas realizaciones, el ARN auxiliar defectuoso puede dirigir la expresion de una o mas protemas estructurales.
En otro aspecto mas, se proporcionan procedimientos, tal como se reivindica, de produccion de partmulas de replicon vmcas usando lmeas celulares de empaquetamiento. Tfpicamente, los procedimientos
comprendenintroducir, en cualquiera de las lmeas celulares de empaquetamiento de alfavirus descritas en el presente documento, cualquiera de los ARN de replicon de alfavirus descritos en el presente documento, en los que se produce una partmula de alfavirus que comprende una o mas secuencias de ARN heterologo. Por lo tanto, el ARN incluira una insercion de senal de empaquetamiento derivada de un alfavirus diferente. En otras realizaciones, la celula de empaquetamiento comprende tres moleculas de ARN distintas, por ejemplo, una primera molecula de ARN auxiliar defectuoso codifica una o mas protemas estructurales de la capside vmca, una segunda molecula de ARN auxiliar defectuoso codifica una o mas glucoprotemas estructurales de la envoltura vmca y un tercer vector de ARN de replicon, tal como se reivindica, que comprende genes que codifican las protemas de replicasa no estructurales y un gen heterologo de interes sustituido para protemas estructurales vmcas, en las que al menos una de las moleculas de ARN incluye secuencias que derivan de dos o mas alfavirus. Pueden hacerse modificaciones en una cualquiera o mas de las moleculas de acido nucleico distintas introducidas en la celula (por ejemplo, una celula de empaquetamiento) para generar partmulas de replicon de alfavirus quimerico. Por ejemplo, se puede preparar un
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primer ARN auxiliar defectuoso que tenga un gen que codifique una protema de capside hforida tal como se describe en el presente documento. En una realizacion, la protema de capside hforida tiene un dominio de union a ARN que deriva de un primer alfavirus y un dominio de interaccion con glucoprotema de un segundo alfavirus. En otras realizaciones, una construccion de vector replicon de ARN, tal como se reivindica, deriva de un primer alfavirus que tiene una senal de empaquetamiento de un segundo alfavirus, insertada, por ejemplo, en una region genica de la protema estructural que esta eliminada. Los primeros y segundos ARN auxiliares defectuosos tienen genes que codifican la protema de la capside o protemas de la envoltura del segundo alfavirus. En otras realizaciones, se crea una partmula de replicon de alfavirus quimerico usando un primer ARN auxiliar defectuoso que codifica una protema de la capside (que deriva de un primer alfavirus que es el mismo que el virus de la fuente del vector replicon) y un segundo ARN auxiliar defectuoso que tiene un gen que codifica una glucoprotema de la envoltura hforida que tiene un fragmento de cola citoplasmatica del mismo alfavirus que la protema de la capside del primer ARN auxiliar y un "ectodominio" expuesto en la superficie de la glucoprotema derivada de un segundo alfavirus. El fragmento de la cola interacciona con la protema de la capside y da como resultado una partmula de replicon quimerica que tiene ARN y una capside que deriva de un primer virus y una envoltura que deriva principalmente de un segundo virus.
En otro aspecto, la invencion proporciona un procedimiento, tal como se reivindica, para producir partmulas de replicon de alfavirus, que comprende introducir en una celula admisible, (a) cualquiera de los ARN de replicon de alfavirus descritos en el presente documento que comprenden elementos de control y secuencias codificantes de polipeptidos que codifican (i) protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas y (ii) una protema heterologa, y (b) uno o mas ARN auxiliares defectuosos que comprenden elementos de control y secuencias codificantes de polipeptidos que codifican al menos una protema estructural de alfavirus, pudiendo comprender los elementos de control, en sentido 5' a 3', una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protemas no estructurales, un medio para expresar las secuencias codificantes de polipeptidos y una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protemas no estructurales y en el que adicionalmente uno o mas de dichos elementos de control del replicon de ARN son diferentes de dichos elementos de control de ARN auxiliar defectuoso; e incubar dicha celula en condiciones adecuadas durante un tiempo suficiente para permitir la produccion de partmulas de replicon. En determinadas realizaciones, el ARN del replicon y dichos uno o mas ARN auxiliares defectuosos comprenden adicionalmente una NTR 5' subgenomica. En otras realizaciones, la NTR 5' subgenomica del ARN del replicon es diferente de la NTR 5' subgenomica del ARN auxiliar defectuoso; la secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural del ARN del replicon es diferente de la secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural del ARN auxiliar defectuoso; la secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural del ARN del replicon es diferente de la secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural del ARN auxiliar defectuoso; y/o el medio de expresion de dichas secuencias codificantes de polipeptidos del ARN del replicon es diferente del medio de expresion de dichas secuencias codificantes de polipeptidos del ARN auxiliar defectuoso.
Por lo tanto, en cualquiera de las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento, las secuencias derivan de al menos dos alfavirus, incluyendo al menos el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y el virus Sindbis (SIN).
En otros aspectos, se proporcionan procedimientos tal como se reivindica para producir partmulas de replicon de alfavirus y reducir la probabilidad de generar virus de replicacion competente (por ejemplo, virus de tipo silvestre) durante la produccion de dichas partmulas, que comprenden la introduccion, en una celula admisible, de un ARN de replicon de alfavirus tal como se reivindica y uno o mas ARN auxiliares defectuosos que codifican al menos una protema estructural de alfavirus, y la incubacion de dicha celula en condiciones adecuadas durante un tiempo suficiente para permitir la produccion de partmulas de replicon, en los que dicho ARN del replicon comprende una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, secuencias que, cuando se expresan, codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas, un medio para expresar una o mas secuencias heterologas, una secuencia heterologa que es un gen codificante de protema, siendo dicho gen el gen proximo a 3' dentro del replicon, una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, un tramo de poliadenilato y, opcionalmente, una NTR 5' subgenomica; y en el que dicho ARN auxiliar defectuoso comprende una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, un medio para expresar una o mas protemas estructurales de alfavirus, un gen que codifica una protema estructural de alfavirus, siendo dicho gen, el gen proximo a 3' dentro del replicon, una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, un tramo de poliadenilato y, opcionalmente, una NTR 5' subgenomica; y en el que dicho ARN del replicon difiere de al menos un ARN auxiliar defectuoso en al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, un medio para expresar un gen proximo a 3', una NTR 5' subgenomica, y una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural.
Estos y otros aspectos y realizaciones de la invencion resultaran obvios tras la referencia a la siguiente descripcion detallada, a las figuras adjuntas y a diversas referencias expuestas en el presente documento que describen con mas detalle determinados procedimientos o composiciones (por ejemplo, plasmidos, secuencias, etc.).
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 ilustra fragmentos de smtesis de genes del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y sitios de
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restriccion usados para ensamblar un replicon del VEE.
La Figura 2 ilustra la smtesis basada en oligonucleotidos del fragmento 2 de la nsP del VEE.
(SEQ ID NO 51 y SEQ ID NO 52).
La Figura 3 ilustra fragmentos de smtesis de genes del VEE y sitios de restriccion usados para ensamblar genes de protema estructural. La Figura 4 ilustra una protema de capside hforida para la produccion eficaz de partmulas de alfavirus quimericos del virus Sindbis (SIN)/VEE.
La Figura 5 ilustra la glucoprotema E2 hforida para la produccion eficaz de partmulas de alfavirus SIN/VEE quimericos.
La Figura 6 ilustra replicones de VEE con senal de empaquetamiento de SIN heterologa para un empaquetamiento eficaz usando protemas estructurales de SIN.
La Figura 7 ilustra la insercion de senal de empaquetamiento de SIN en nsP4/promotor de la region de union truncada (tal como se usa en la quimera 1A creada de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion).
La Figura 8 ilustra la insercion de la senal de empaquetamiento de SIN en nsP4/promotor de la region de union no truncada (tal como se usa en la quimera 1B creada de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion). La Figura 9 ilustra la insercion de la quimera numero 2 de empaquetamiento de SIN/VEE de la senal de empaquetamiento de SIN en una delecion de un gen de protema no estructural (nsP3).
La Figura 10 representa la insercion de la quimera numero 3 de empaquetamiento de SIN/VEE de la senal de empaquetamiento de SIN en el extremo carboxilo de nsP3.
La Figura 11 representa la modificacion de los extremos de nsP3/nsP4 para la senal de empaquetamiento de SIN.
La Figura 12 es una grafica que muestra la inmunogenicidad de quimeras de partfculas de replicon de alfavirus que expresan un antfgeno de VIH.
Descripcion detallada de la invencion
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de qrnmica, bioqmmica, biologfa molecular, inmunologfa y farmacologfa, dentro de la experiencia de la materia. Tales tecnicas se explican totalmente en las referencias. Vease, por ejemplo, Pharmaceutical Sciences, de Remington, 18a Edicion (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Edicion, 1989); Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997); Short Protocols in Molecular Biology, 4a ed. (Ausubel y col. eds., 1999, John Wiley & Sons); Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream y col., eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2a ed. (Newton y Graham eds., 1997, SpringerVerlag); Peters y Dalrymple, Fields Virology (2a ed), Fields y col. (eds.), B.N. Raven Press, Nueva York, NY.
Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno(a)", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una partmula" incluye una mezcla de dos o mas de tales partmulas.
Antes de exponer la invencion, se exponen las definiciones de ciertos terminos que se usaran en lo sucesivo en el presente documento.
Una molecula de "acido nucleico" puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ARNm eucariota u otro ARN, ADNc de ARNm eucariota u otro ARN, secuencias de ADN genomico de ADN eucariota (por ejemplo, de marnffero) e incluso secuencias de ADN sintetico. La expresion tambien engloba secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de bases de ADN y ARN conocidos e incluye modificaciones tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en la secuencia natural. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, tales como a traves de mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales. Las modificaciones de polinucleotidos pueden tener cualquiera de diversos efectos que incluyen, por ejemplo, facilitar la expresion del producto polipeptfdico en una celula hospedadora.
Los terminos "polipeptido" y "protema" se refieren a un polfmero de restos de aminoacido y no se limitan a una longitud minima del producto. Por lo tanto, peptidos, oligopeptidos, dfmeros, multfmeros y similares, se incluyen dentro de la definicion. En la definicion se engloban tantoprotemas de longitud completa comoragmentos de las mismas. Los terminos tambien incluyen modificaciones posteriores a la expresion del polipeptido, por ejemplo, glucosilacion, acetilacion, fosforilacion y similares. Ademas, para los fines de la presente invencion, un "polipeptido" se refiere a una protema que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en la secuencia natural, siempre que la protema mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, como a traves de mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales, tales como a traves de mutaciones de hospedadores que producen las protemas o errores debidos a la amplificacion por PCR. Ademas, se pueden crear modificaciones que tengan uno o mas de los siguientes efectos: reducir la toxicidad; facilitar el procesamiento celular (por ejemplo, secrecion, presentacion de antfgeno, etc.); y facilitar la presentacion a linfocitos B y/o a linfocitos T.
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"Unido de manera operativa" se refiere a una disposicion de los elementos en la que los componentes as^ descritos se configuran para que realicen su funcion habitual. Por lo tanto, un promotor dado unido de manera operativa a una secuencia codificante es capaz de efectuar la expresion de la secuencia codificante cuando estan presentes las enzimas apropiadas. El promotor no necesita estar contiguo a la secuencia codificante, siempre que funcione para dirigir la expresion de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, entre la secuencia promotora y la secuencia codificante puede haber secuencias intermedias transcritas pero no traducidas, y la secuencia promotora puede considerarse todavfa "unida de manera operativa" a la secuencia codificante.
En la materia se conocen bien tecnicas para determinar la "similitud" de secuencia de aminoacidos. En general, "similitud" significa la comparacion exacta entre aminoacidosde dos o mas polipeptidos en el lugar apropiado, en la que los aminoacidos son identicos o poseen propiedades qmmicas y/o ffsicas similares, tales como carga o hidrofobicidad. El, asf denominado, "porcentaje de similitud" se puede determinar despues entre las secuencias de polipeptidos comparadas. En la materia se conocen tecnicas para determinar la identidad de secuencia de acidos nucleicos y de aminoacidos e incluyen la determinacion de la secuencia de nucleotidos del ARNm para ese gen (normalmente ediante un intermediario de ADNc) y la determinacion de la secuencia de aminoacidos codificada de ese modo, y la comparacion de esta con una segunda secuencia de aminoacidos. En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta entre nucleotidos o aminoacidos de dos secuencias de polinucleotidos o de polipeptidos, respectivamente.
Se pueden comparar dos o mas secuencias de polinucleotidos determinando su "porcentaje de identidad". Del mismo modo, se pueden comparar dos o mas secuencias de aminoacidos determinando su "porcentaje de identidad". El porcentaje de identidad de dos secuencias, tanto de secuencias de acido nucleico como de peptidos, se describe de manera general como el numero de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de la secuencia mas corta y multiplicado por 100. Se proporciona un alineamiento aproximado para secuencias de acido nucleico mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo se puede extender para su uso con secuencias de peptidos usando la matriz de puntuacion desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Se proporciona una implementacion de este algoritmo para las secuencias de acido nucleico y de peptidos por Genetics Computer Group (Madison, WI) en su aplicacion de la herramienta BestFit. Los parametros por defecto para este procedimiento se describen en el manual del programa del paquete de analisis de secuencias de Wisconsin, version 8 (1995) (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI). En la materia se conocen en general otros programas tambien adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias.
Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleotidos particular con una secuencia de referencia usando el algoritmo de homologfa de Smith y Waterman con una tabla de puntuacion por defecto y una penalizacion por hueco de seis posiciones de nucleotidos. Otro procedimiento para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invencion es usar el paquete de programas MPSRCH registrado por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Con este conjunto de paquetes, se puede emplear el algoritmo de Smith- Waterman en el que se usan parametros por defecto para la tabla de puntuacion (por ejemplo, penalizacion por apertura de hueco de 12, penalizacion por extension de hueco de uno, y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor "coincidencia" refleja la "identidad de secuencia". En la materia se conocen generalmente otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias., tal como el programa de alineamiento BLAST, que tambien se puede usar con parametros por defecto. Por ejemplo, BLASTN y BLASTP se pueden usar con los siguientes parametros por defecto: codigo genetico = estandar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenado por = MAYOR PUNTUACION; Bases de datos = no redundantes, GenBank + eMbL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente direccion de internet:
http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Un experto en la materia puede determinar facilmente los parametros de busqueda apropiados para usarlos para una secuencia dada en los programas anteriores. Por ejemplo, los parametros de busqueda pueden variar basandose en el tamano de la secuencia en cuestion. Por lo tanto, por ejemplo, una realizacion representativa de la presente invencion podna incluir un polinucleotido aislado que tiene X nucleotidos contiguos, en el que (i) los X nucleotidos contiguos tienen al menos aproximadamente 50 % de identidad con Y nucleotidos contiguos derivados de cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento, (ii) X es igual a Y y (iii) X es mayor o igual que 6 nucleotidos y hasta 5000 nucleotidos, preferentemente mayor o igual que 8 nucleotidos y hasta 5000 nucleotidos, mas preferentemente 10-12 nucleotidos y hasta 5000 nucleotidos e incluso mas preferentemente 15-20 nucleotidos, hasta el numero de nucleotidos presente en las secuencias de longitud completa descritas en el presente documento (por ejemplo, vease el listado de secuencias y las reivindicaciones), incluyendo todos los valores enteros que estan dentro de los intervalos descritos anteriormente.
Se considera que dos fragmentos de acido nucleico "hibridan de manera selectiva" tal como se describe en el presente documento. El grado de identidad de secuencia entre dos moleculas de acido nucleico afecta a la eficacia y a la fuerza de los eventos de hibridacion entre tales moleculas. Una secuencia de acido nucleico parcialmente
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identica inhibira, al menos parcialmente, la hibridacion de una secuencia completamente identica con una molecula diana. La inhibicion de la hibridacion de la secuencia completamente identica se puede evaluar usando ensayos de hibridacion que son muy conocidos en la materia (por ejemplo, transferencia de Southern, transferencia de Northern, hibridacion en solucion, o similares, vease Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edicion, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Tales ensayos se pueden llevar a cabo usando diversos grados de selectividad, por ejemplo, usando condiciones que vanan desde una baja hasta una alta rigurosidad. Si se emplean condiciones de baja rigurosidad, la ausencia de union no espedfica se puede evaluar usando una sonda secundaria que carezca incluso de un grado parcial de identidad de secuencia (por ejemplo, una sonda que tiene menos de aproximadamente 30 % de identidad de secuencia con la molecula diana), de tal manera que, en ausencia de eventos de union no espedfica, la sonda secundaria no hibridara con la diana.
Cuando se utiliza un sistema de deteccion basado en hibridacion, se elige una sonda de acido nucleico que es complementaria a una secuencia diana de acido nucleico, y despues, mediante la seleccion de condiciones apropiadas, la sonda y la secuencia diana "hibridan de manera selectiva", o se unen entre sf para formar una molecula hfbrida. Una molecula de acido nucleico que es capaz de hibridar de manera selectiva con una secuencia diana en condiciones "moderadamente rigurosas" hibrida tfpicamente en condiciones que permiten la deteccion de una secuencia diana de acido nucleico de al menos aproximadamente 10-14 nucleotidos de longitud, que tiene al menos aproximadamente 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la sonda de acido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridacion rigurosa tfpicamente permiten la deteccion de secuencias de acido nucleico diana de al menos 10-14 nucleotidos de longitud que tienen una identidad de secuencia de aproximadamente mas de 90-95 % con la secuencia de la sonda de acido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridacion utiles para la hibridacion de la sonda/diana en la que la sonda y la diana tienen un grado de identidad de secuencia espedfico, se pueden determinar tal como se conoce en la materia (vease, por ejemplo, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, editores B.D. Hames y S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).
Con respecto a las condiciones de rigurosidad para la hibridacion, es bien conocido en la materia que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para establecer una rigurosidad particular variando, por ejemplo, los siguientes factores: la longitud y la naturaleza de la sonda y de las secuencias diana, la composicion base de las diversas secuencias, las concentraciones de sales y de otros componentes de la solucion de hibridacion, la presencia o ausencia de agentes bloqueantes en las soluciones de hibridacion (por ejemplo, formamida, sulfato de dextrano y polietilenglicol), parametros de temperatura y tiempo de la reaccion de hibridacion, asf como condiciones variables de lavado. La seleccion de un conjunto particular de condiciones de hibridacion se selecciona siguiendo procedimientos convencionales en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edicion, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).
La expresion "deriva de" se usa para identificar la fuente de la molecula de alfavirus (por ejemplo, polinucleotido, polipeptido). Un primer polinucleotido "deriva de" un segundo polinucleotido si tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de pares de bases que una region del segundo polinucleotido, su ADNc, complementos del mismo, o si presenta una identidad de secuencia como se describe anteriormente. Por lo tanto, una secuencia o un polinucleotido de alfavirus "deriva de" un alfavirus particular (por ejemplo, especie) si tiene (i) la misma o sustancialmente la misma secuencia que la secuencia de alfavirus o (ii) presenta una identidad de secuencia con polipeptidos de ese alfavirus como se describe anteriormente.
Un primer polipeptido "deriva de" un segundo polipeptido si (i) esta codificado por un primer polinucleotido que deriva de un segundo polinucleotido, o (ii) presenta identidad de secuencia con los segundos polipeptidos como se describe anteriormente. Por lo tanto, un polipeptido (protema) de alfavirus "deriva de" un alfavirus particular si (i) esta codificado por una fase abierta de lectura de un polinucleotido de ese alfavirus (polinucleotido alfavmco), o (ii) presenta identidad de secuencia, tal como se ha descrito anteriormente, con polipeptidos de ese alfavirus.
Tanto las moleculas de polinucleotidos como las de polipeptidos pueden derivar ffsicamente del alfavirus o se pueden producir de manera recombinante o sintetica, por ejemplo, basandose en secuencias conocidas.
Los "elementos de control" tfpicos, incluyen, pero no se limitan a, promotores de la transcripcion, elementos potenciadores de la transcripcion, senales de terminacion de la transcripcion, secuencias de poliadenilacion (localizadas en 3' con respecto al codon de terminacion de la traduccion), secuencias para la optimizacion de la iniciacion de la traduccion (localizadas en 5' con respecto a la secuencia codificante), secuencias de terminacion de la traduccion, secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, y medio para expresar una o mas secuencias heterologas (por ejemplo, promotor de la region de union subgenomica), vease, por ejemplo, McCaughan y col. (1995) PNAS USA 92:5431-5435; Kochetov y col. (1998) FEBS Letts. 440:351-355. Un "vector replicon de ARN de alfavirus", "vector replicon de ARN", "vector replicon" o "replicon", se refiere a una molecula de ARN que es capaz de dirigir su propia amplificacion o autorreplicacion in vivo, en una celula diana. Para dirigir su propia amplificacion, la molecula de ARN debe codificar la(s) polimerasa(s) necesaria(s) para catalizar la amplificacion de ARN (por ejemplo, las protemas de alfavirus no estructurales nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) y tambien contener secuencias de ARN en cis requeridas para la replicacion que reconocen y utilizan la polimerasa (o polimerasas) codificada. Un vector replicon de ARN debe contener los siguientes elementos ordenados: secuencias 5' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural (tambien puede denominarse CSE 5' o secuencia 5' de replicacion
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en cis, o secuencias 5' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o una secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripcion de un alfavirus), secuencias que, cuando se expresan, codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas (por ejemplo, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) y secuencias 3' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural (tambien puede denominarse CSE 3', o secuencias 3' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus). El vector replicon de ARN de alfavirus tambien debe contener un medio para expresar una o mas secuencias heterologas, tales como, por ejemplo, un IRES (del ingles Internal Ribosome Entry Site, sitio interno de entrada al ribosoma) o un promotor subgenomico vmco (por ejemplo, alfavirus) (por ejemplo, promotor de la region de union) que puede, en ciertas realizaciones, modificarse para aumentar o reducir la transcripcion del fragmento subgenomico vmco, o para disminuir la homologfa con casetes de expresion de protemas estructurales o auxiliares defectuosas,, y expresar una o mas secuencias heterologas. Un replicon tambien puede contener secuencias adicionales, por ejemplo, una o mas secuencia heterologas que codifican uno o mas polipeptidos (por ejemplo, un gen codificante de protema o un gen proximo a 3') y/o un tramo de poliadenilato.
"Partmula de alfavirus recombinante", Una "partmula de replicon de alfavirus" y una "partmula de replicon" se refieren a una unidad de tipo virion que contiene un vector replicon de ARN de alfavirus. Generalmente, la partmula de alfavirus recombinante comprende una o mas protemas estructurales de alfavirus, una envoltura lipfdica y un vector replicon de ARN. Preferentemente, la partmula de alfavirus recombinante contiene una estructura de nucleocapside que esta contenida dentro de la bicapa lipfdica derivada de una celula hospedadora, tal como una membrana plasmatica, en la que una o mas glucoprotemas de envoltura alfavmcas (por ejemplo, E2, E1) estan embebidas. La partmula tambien puede contener otros componentes (por ejemplo, elementos de direccionamiento tales como biotina, otras protemas estructurales vmcas o porciones de la misma, envolturas hnbridas u otros ligandos de union al receptor), que dirijan el tropismo de la partmula de la que derivo el alfavirus. Generalmente, la interaccion entre el ARN del alfavirus y la(s) protema(s) estructural(es) necesaria para formar de manera eficaz una partmula de replicon o nucleocapside, puede ser una interaccion de ARN-protema entre una protema de la capside y una senal de empaquetamiento (o secuencia de empaquetamiento) contenida en el ARN.
"Lmea celular de empaquetamiento de alfavirus" se refiere a una celula que contiene uno o mas casetes de expresion de protema estructural de alfavirus y que produce partmulas de alfavirus recombinante (partmulas de replicon) tras la introduccion de un vector replicon de ARN de alfavirus, un sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas o una partmula de alfavirus recombinante. La celula parental puede ser de origen mamffero o no mairnfero. En realizaciones preferidas, la lmea celular de empaquetamiento se transforma de manera estable con el/los casete(s) de expresion de protema estructural.
Un "ARN auxiliar defectuoso" se refiere a una molecula de ARN que es capaz de amplificarse y expresar una o mas protemas estructurales de alfavirus en una celula eucariota, cuando esa celula tambien contiene protemas "replicasas" no estructurales de alfavirus funcional. Las protemas no estructurales de alfavirus pueden expresarse en la celula mediante un vector replicon de ARN de alfavirus u otros medios. Para permitir la amplificacion y la expresion de una protema estructural, mediada por protemas no estructurales de alfavirus, la molecula de ARN auxiliar defectuosa debena contener las secuencias de ARN de los extremos 5' y 3' requeridas para la amplificacion, que se reconocen y utilizan mediante las protemas no estructurales, asf como un medio para expresar una o mas protemas estructurales del alfavirus. Por lo tanto, un ARN auxiliar defectuoso de alfavirus debena contener los siguientes elementos ordenados: secuencias 5' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion de ARN por protemas no estructurales de alfavirus (tambien denominado en otras partes CSE 5' o secuencia 5' de replicacion en cis, o secuencias 5' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripcion de un alfavirus), un medio para expresar una o mas protemas estructurales de alfavirus, una o mas secuencias genicas, que, cuando se expresan, codifican una o mas protemas estructurales de alfavirus (por ejemplo, C, E2, E1), secuencias 3' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion mediante protemas no estructurales de alfavirus (tambien denominadas CSE 3', o secuencias 3' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus), y preferentemente, un tramo de poliadenilato. Generalmente, el ARN auxiliar defectuoso no debena por sf mismo codificar o expresar en su totalidad las cuatro protemas no estructurales del alfavirus (nsP1, nsP2, nsp3, nsP4), pero puede codificar o expresar un subconjunto de estas protemas o porciones de las mismas, o contener una o mas secuencias derivadasde uno o mas genes de protema no estructural, pero que por la naturaleza de su inclusion en el auxiliar defectuoso no expresan una o mas protemas no estructurales o porciones de las mismas. Como un medio para expresar la protema (o protemas) estructural(es) del alfavirus, el ARN auxiliar defectuoso puede contener un promotor subgenomico vmco (por ejemplo, alfavirus) que puede, en ciertas realizaciones, modificarse para modular la transcripcion del fragmento subgenomico, o para disminuir la homologfa con el ARN del replicon, o, de manera alternativa, otro medio para efectuar la expresion de la protema estructural de alfavirus (por ejemplo, un sitio interno de entrada al ribosoma, un elemento de ultralectura ribosomica). Preferentemente, un gen de protema estructural de alfavirus es el gen proximo a 3' dentro del auxiliar defectuoso. Ademas, tambien es preferente que el ARN auxiliar defectuoso no contenga secuencias que faciliten las interacciones ARN-protema con una o mas protemas estructuralesde alfavirus y el empaquetamiento en nucleocapsides, partmulas de tipo virion o partmulas de replicon de alfavirus. Un ARN auxiliar defectuoso es una representacion espedfica de un casete de expresion de protema estructural de alfavirus.
"Sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresion de una secuencia o gen de interes. El sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas debena
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contener un promotor 5' que es capaz de iniciar in vivo (es dedr, en una celula eucariota) la smtesis de ARN a partir de ADNc y una secuencia de vector de acido nucleico (por ejemplo, vector vmco) que es capaz de dirigir su propia replicacion en una celula eucariota y tambien expresar una secuencia heterologa. Preferentemente, la secuencia de vector de acido nucleico es una secuencia que deriva de alfavirus y que comprende secuencias 5' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural (tambien denominada CSE 5' o secuencia 5' de replicacion en cis, o secuencias 5' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripcion de un alfavirus), asf como secuencias que, cuando se expresan, codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas (por ejemplo, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) y secuencias 3' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural (tambien denominadas CSE 3', o secuencias 3' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus). Ademas, la secuencia del vector puede incluir un medio para expresar una o mas secuenciasheterologas, tales como, por ejemplo, un promotor subgenomico vmco (por ejemplo, alfavirus) (por ejemplo, promotor de la region de union) que puede, en ciertas realizaciones, modificarse para prevenir, aumentar o reducir la transcripcion vmca del fragmento subgenomico, o para disminuir la homologfa con casetes de expresion de auxiliar defectuoso o de protema estructural, y expresar una o mas secuencias heterologas. Preferentemente, la(s) secuencia(s) heterologa(s) comprende(n) un gen codificante de protema y dicho gen es el gen proximo a 3' dentro de la secuencia del vector. El sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas tambien podna contener una secuencia de poliadenilacion, secuencias de reconocimiento de corte y empalme, una secuencia de procesamiento de ribozima catalftica, una senal de exportacion nuclear y una secuencia de terminacion de la transcripcion. En determinadas realizaciones, la smtesis in vivo de la secuencia de acido nucleico del vector a partir de ADNc se puede regular usando un promotor inducible o la expresion subgenomica puede ser inducible usando reguladores de la traduccion o protemas no estructurales modificadas.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "partmula de alfavirus quimerico" y "partmula de replicon de alfavirus quimerico" se refieren a una quimera o a una partmula quimerica, tal como un virus o una partmula de tipo virus, modificada o disenada espedficamente por ingeniena genetica para contener un acido nucleico derivado de un alfavirus distinto del alfavirus del que derivan la capside y/o la glucoprotema de la envoltura (por ejemplo, de un virus diferente). En tal partmula, el acido nucleico derivado de un alfavirus es una molecula de ARN que comprende una de diversas longitudes diferentes, incluyendo, pero sin limitarse, la longitud del genoma (que codifica protemas no estructurales y estructurales) y la longitud del replicon (eliminada de una o mas protemas estructurales). Por ejemplo, y sin pretender que sea una limitacion, las partmulas de replicon quimerico incluyen ARN replicon del virus Sindbis (SIN) dentro de una capside que tiene un dominio de union a ARN del virus Sindbis y un dominio de interaccion con glucoprotema de la envoltura del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), rodeado por una envoltura de glucoprotema del VEE.
La expresion "gen proximo a 3'" se refiere a una secuencia de nucleotidos que codifica una protema, que esta contenida en un vector replicon, un sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas, un ARN auxiliar defectuoso o un casete de expresion de protema estructural, y localizado dentro de una posicion espedfica en relacion con otro elemento. La posicion de este gen proximo a 3' debena determinarse con respecto a la secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural (definida anteriormente), en la que el gen proximo a 3' es la secuencia 5' codificante de protema (aguas arriba) de, e inmediatamente anterior a, este elemento. El gen proximo a 3' generalmente es una secuencia heterologa (por ejemplo, un gen que codifica un antfgeno) cuando se refiere a un vector replicon o a un sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas o, como alternativa, generalmente es un gen de protema estructural (por ejemplo, C, E2, E1 de alfavirus) cuando se refiere a un ARN auxiliar defectuoso o a un casete de expresion de protema estructural.
La expresion "secuencias 5' vmcas o celulares requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural" o "secuencias 5' requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural" se refieren a un elemento funcional que proporciona un sitio de reconocimiento en el que el virus o el vector derivado del virus sintetiza un ARN de cadena positiva. Por lo tanto, es el complemento de la secuencia real contenida en el virus o vector, el que se corresponde con el extremo 3' de la copia de ARN de cadena negativa, que se une mediante el complejo de protemas replicasa no estructurales, y posiblemente factores de celula hospedadora adicionales, a partir del cualse inicia la transcripcion del ARN de cadena positiva. Para esta funcion se puede utilizar una amplia variedad de secuencias. Por ejemplo, la secuencia puede incluir la region no traducida (NTR) del extremo 5' del alfavirus y otras secuencias adyacentes, tales como, por ejemplo, secuencias a traves de los nucleotidos 210, 250, 300, 350, 400 o 450. Como alternativa, se pueden utilizar secuencias que no son de alfavirus u otras secuencias como este elemento, mientras se mantenga una capacidad funcional similar, por ejemplo, en el caso del SIN, los nucleotidos 10-75 para la asparagina del ARNt (Schlesinger y col., Patente de Estados Unidos N.° 5.091.309). La expresion se usa de manera indistinta con las expresiones CSE 5' o secuencias 5' vmcas requeridas en cis para la replicacion, o secuencia 5' que es capaz de iniciar la transcripcion de un alfavirus.
La expresion "promotor subgenomico vmco" se refiere a una secuencia de origen vmco que, junto con la(s) polimerasa(s) vmca(s) y celular(es) y otros factores, permite la transcripcion de una molecula de ARN de una longitud menor a la del genoma. Para un promotor subgenomico de alfavirus (alfavmco) o un promotor de la region de union subgenomica del alfavirus (alfavmca), esta secuencia deriva generalmente de la region entre las fases abiertas de lectura (ORF, del ingles, open reading frames) de protemas no estructurales y estructurales y controla normalmente la transcripcion del ARNm subgenomico. Tfpicamente, el promotor subgenomico de alfavirus consiste
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en una secuencia nucleo que proporciona la mayona de la actividad asociada al promotor, as^ como regiones flanqueantes (por ejemplo, promotor extendido o natural) que mejora adicionalmente la actividad asociada al promotor. Por ejemplo, en el caso del prototipo de alfavirus, virus Sindbis, el promotor de la region de union subgenomica normal comienza tipicamente en aproximadamente el nucleotido numero 7579 y continua hasta al menos el nucleotido numero 7612 (y posiblemente mas alla). Como mmimo, se cree que los nucleotidos 7579 a 7602 sirven como la secuencia nucleo necesaria para la transcripcion del fragmento subgenomico.
Las expresiones "secuencias 3' vfticas o celulares requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural" o "secuencias 3' requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural", se usan de manera indistinta con las expresiones CSE 3', o secuencias 3' de replicacion en cis, o secuencias 3' vfticas requeridas en cis para la replicacion, o una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa de alfavirus. Esta secuencia es un elemento funcional que proporciona un sitio de reconocimiento en el que el virus o el vector derivado del virus, comienza la replicacion (amplificacion) a traves de la smtesis del ARN de cadena negativa. Para esta funcion puede utilizarse una amplia variedad de secuencias. Por ejemplo, la secuencia puede incluir una region no traducida (NTR) completa del extremo 3' del alfavirus, tal como, por ejemplo, con SIN, que incluina los nucleotidos 11.647 a 11.703, o una region truncada de la NTR 3', que aunconserva la funcion como una secuencia de reconocimiento (por ejemplo, los nucleotidos 11.684 a 11.703). Otros ejemplos de secuencias que se pueden utilizar en este contexto incluyen, pero no se limitan a, secuencias que no son de alfavirus u otras secuencias que conservan una capacidad funcional similar para permitir la iniciacion de la smtesis del ARN de cadena negativa(por ejemplo, las secuencias descritas en George y col., (2000) J. Virol. 74:9776-9785).
Un "antfgeno" se refiere a una molecula que contiene uno o mas epftopos (lineales, conformacionales o ambos) que estimularan el sistema inmunitario de un hospedador para generar una respuesta humoral y/o celular espedfica de anftgeno. El termino se usa de manera indistinta con el termino "inmunogeno". Normalmente, un epftopo incluira entre aproximadamente 3-15, de manera general, aproximadamente 5-15 aminoacidos. Normalmente, un epftopo de linfocito B tiene aproximadamente 5 aminoacidos, pero puede ser tan pequeno como de 3-4 aminoacidos. Un epftopo de linfocitos T, tal como un epftopo de CTL, incluira al menos aproximadamente 7-9 aminoacidos, y un epftopo de linfocito Tauxiliar al menos aproximadamente 12-20 aminoacidos. Normalmente, un epftopo incluira entre aproximadamente 7 y 15 aminoacidos, tal como, 9, 10, 12 o 15 aminoacidos. El termino "anftgeno" indica tanto antfgenos subunitarios, (es decir, antfgenos que estan separados y aislado de un organismo completo con el que se asocia el anftgeno en la naturaleza), asf como bacterias, virus, hongos, parasitos u otros microbios, destruidos, atenuados o desactivados, asf como anftgenos tumorales, incluyendo dominios extracelulares de receptores de la superficie celular y porciones intracelulares que pueden contener epftopos de linfocitos T. Los anticuerpos, tales como anticuerpos anti-idiotfpicos o fragmentos de los mismos y los mimotopos de peptidos sinteticos, que pueden imitar a un anftgeno o determinante antigenico, tambien se engloban en la definicion de anftgeno tal como se usa en el presente documento. De forma similar, un oligonucleotido o polinucleotido que expresa in vivo un anftgeno o determinante antigenico, tal como en terapia genica y en aplicaciones de inmunizacion de ADN, tambien se incluye en la definicion de antfgeno del presente documento.
Los epftopos de una protema dada se pueden identificar usando cualquiera de las diversas tecnicas de mapeo epitopico, bien conocidas en la materia. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epftopos lineales se pueden determinar, por ejemplo, sintetizando simultaneamente grandes numeros de peptidos en soportes solidos, correspondiendo los peptidos a porciones de la molecula de protema, y haciendo reaccionar los peptidos con anticuerpos mientras que los peptidos todavfa estan unidos a los soportes. Tales tecnicas son conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n.° 4.708.871; Geysen y col. (1984) Proc. Nat'l Acad Sci. USA 81:3998-4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol 23:709-715.
De forma similar, los epftopos conformacionales se identifican facilmente determinando la conformacion espacial de aminoacidos, tal como, por ejemplo, mediante cristalograffa de rayos x y resonancia magnetica nuclear. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, anteriormente citado.
Para los fines de la presente invencion, los anftgenos pueden derivar de tumores y/o de cualquiera de los diversos virus, bacterias, parasitos y hongos conocidos, tal como se describe de manera mas completa a continuacion. El termino tambien se refiere a cualquiera de los diversos antfgenos tumorales o a cualquier otro antfgeno para el que se desea una respuesta inmunitaria. Ademas, para los fines de la presente invencion, un "anftgeno" se refiere a una protema que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en la secuencia natural, siempre que la protema conserve la capacidad de provocar una respuesta inmunologica, tal como se define en el presente documento. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, como a traves de mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales, tal como a traves de mutaciones de hospedadores que producen los anftgenos.
Una "respuesta inmunologica" a un anftgeno o composicion es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular a un anftgeno presente en la composicion de interes. Para los fines de la presente invencion, una"respuesta inmunitaria humoral" se refiere a una respuesta inmunitaria mediada por moleculas de anticuerpo, incluyendo moleculas secretoras (IgA) o de IgG, mientras que una "respuesta inmunitaria celular" es una mediada por linfocitos T y/u otros globulos blancos. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una
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respuesta espedfica de antigeno mediante linfocitos T citolfticos ("CTL"). Los CTL tienen especificidad por los antigenos del peptido que estan presentes en asociacion con protemas codificadas por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del ingles, major histocompatibility complex) y expresadas en las superficies de las celulas. Los CTL ayudan a inducir y promover la destruccion de microbios intracelulares, o la lisis de celulas infectadas con tales microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta espedfica de antigeno mediante linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T auxiliares actuan para ayudar a estimular la funcion, y se centran en la actividad de, celulas efectoras no espedficas frente a celulas presentadoras de antigenos del peptido en asociacion con moleculas del MHC en su superficie. Una "respuesta inmunitaria celular" tambien se refiere a la produccion de citocinas, quimiocinas y otras moleculas de este tipo, producidas por linfocitos T activados y/u otros globulos blancos, incluyendo aquellos derivados de linfocitos T CD4+ y CD8+. Ademas, se puede inducir una respuesta de quimiocinas mediante varios globulos blancos o celulas endoteliales en respuesta a un antigeno administrado.
Una composicion o vacuna que provoca una respuesta inmunitaria celular puede servir para sensibilizar a un sujeto vertebrado presentando un antigeno asociado con moleculas del MHC en la superficie celular. La respuesta inmunitaria mediada por celulas se dirige a, o cerca de, celulas presentadoras de antfgeno en su superficie. Ademas, se pueden generar linfocitos T espedficos de antigeno para permitir la futura proteccion de un hospedador inmunizado.
La capacidad de un antigeno particular para estimular una respuesta inmunologica mediada por celulas se puede determinar mediante diversos ensayos, tales como mediante ensayos de linfoproliferacion (activacion de linfocitos), ensayos de linfocitos T citotoxicos, CTL, o mediante ensayos de linfocitos T espedficos para el antigeno en un sujeto sensibilizado. Tales ensayos son muy conocidos en la materia. Vease, por ejemplo, Erickson y col., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. Los procedimientos actuales de medicion de respuesta inmunitaria mediada por celulas incluyen la medicion de citocinas intracelulares o la secrecion de citocina porpoblaciones de linfocitos T (por ejemplo, mediante la tecnica de ELISPOT), o midiendo linfocitos T espedficos de epttopo (por ejemplo, mediante la tecnica de tetramero)(revisada por McMichael, A. J. y O'Callaghan, C.A., J. Exp. Med. 187(9):1367-1371,1998; Mcheyzer-Williams, M.G., y col., Immunol. Rev. 150: 5-21,1996; Lalvani, A., y col., J. Exp. Med. 186:859-865, 1997).
Por lo tanto, una respuesta inmunologica tal como se usa en el presente documento puede ser una que estimula los CTL y/o la produccion o activacion de los linfocitos T auxiliares. La produccion de quimiocinas y/o citocinas tambien se puede estimular. El antfgeno de interes tambien puede provocar una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos. De este modo, una respuesta inmunologica puede incluir uno o mas de los siguientes efectos: la produccion de anticuerpos (por ejemplo, IgA o IgG) mediante linfocitos B; y/o la activacion de linfocitos T supresores, citotoxicos o auxiliares y/o (* linfocitos T dirigidos de manera espedfica a un antfgeno o a antfgenos presentes en la composicion o vacuna de interes. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad y/o mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, del ingles, antibody dependent cell cytotoxicity) del complemento o anticuerpos para proporcionar proteccion a un hospedador inmunizado. Tales respuestas se pueden determinar usando inmunoensayos y ensayos de neutralizacion convencionales, bien conocidos en la materia.
Una "composicion inmunogenica" es una composicion que comprende una molecula antigenica (o secuencia de nucleotidos que codifica una molecula antigenica) en la que la administracion de la composicion a un sujeto da como resultado el desarrollo en el sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular y/o mucosa contra la molecula antigenica de interes. La composicion inmunogenica se puede introducir directamente en un sujeto receptor, tal como mediante inyeccion, inhalacion, administracion oral, intranasal o cualquier otra via de administracion parenteral o mucosa (por ejemplo, intrarrectal o intravaginal).
Con "vacuna subunitaria" se pretende indicar una composicion de vacuna que incluye uno o mas antfgenos seleccionados, pero no todos los antfgenos, derivados de u homologos de, un antfgeno de un patogeno de interes tal como un virus, una bacteria, un parasito o un hongo. Tal composicion carece sustancialmente de celulas patogenas intactas o partmulas patogenas o del lisado de tales celulas o partmulas. Por lo tanto, una "vacuna subunitaria" se puede preparar a partir de al menos polipeptidos inmunogenicos al menos parcialmente purificados (preferentemente purificados de manera sustancial) del patogeno, o analogos del mismo. Por tanto, el procedimiento de obtencion de un antfgeno incluido en la vacuna subunitaria puede incluir tecnicas de purificacion, de produccion recombinante, o de produccion sintetica convencionales.
1.0.Introduccion
Se estan desarrollando varios miembros del genero Alphavirus como sistemas de administracion de genes para vacunas y otras aplicaciones terapeuticas (Schlesinger y Dubensky, Curr. Opin. Biotechnol., 10:434-9 1999). La configuracion de "replicon" tfpica de construcciones de vectores de alfavirus, tal como se describe en mas detalle anteriormente y en los documentos US 5789245, 5843723, 5814482, 6015694 y WO 00/61772, comprende una secuencia 5' que inicia la transcripcion de ARN de alfavirus, una secuencia de nucleotidos que codifica protemas no estructurales de alfavirus, un promotor de region de union subgenomica vmca que dirige la expresion de una secuencia de acido nucleico heterologa adyacente, una secuencia de reconocimiento de ARN polimerasa y preferentemente un tramo de poliadenilato. En la materia tambien se conoce otra terminologfa para definir los
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mismos elementos.
A menudo, para vacuna in vivo y aplicaciones terapeuticas, el vector replicon de ARN de alfavirus o el ARN del replicon se empaqueta en primer lugar en una partmula de tipo virus, que comprende las protemas estructurales del alfavirus (por ejemplo, protema de la capside y glucoprotemas de la envoltura). Debido a su configuracion, los vectores replicones no expresan estas protemas estructurales de alfavirus necesarias para el empaquetamiento en partmulas de replicon de alfavirus recombinante. Por lo tanto, para generar partmulas de replicon, las protemas estructurales se deben proporcionar en trans El empaquetamiento se puede lograr mediante una variedad de procedimientos, incluyendo enfoques transitorios tales como la cotransfeccion de replicon transcrito in vitro y ARN auxiliares defectuosos (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361, 1991; Bredenbeek y col., J. Virol. 67:6439-6446, 1993; Frolov y col., J. Virol. 71:2819-2829, 1997; Pushko y col., Virology 239:389-401,1997; las Patentes de Estados Unidos 5.789.245 y 5.842.723) o construcciones de replicones y auxiliares defectuosos basados en ADN del plasmido (Dubensky y col., J. Virol. 70:508-519, 1996), asf como la introduccion de replicones de alfavirus en lmeas celulares de empaquetamiento (PCL, del ingles, packaging cell lines) estables (Polo y col., PNAS 96:4598-4603, 1999; las Patentes de Estados Unidos 5.789.245, 5.842.723, 6.015.694; los documentos WO 9738087 y WO 9918226).
Las metodologfas de empaquetamiento en trans permiten la modificacion de uno o mas genes de protema estructural (por ejemplo, para incorporar secuencias de variantes de alfavirus tales como mutantes atenuados, documentos US 5.789.245, 5.842.723, 6.015.694), seguido de la posterior incorporacion de la protema estructural modificada en las partmulas de replicon finales. Ademas, tal empaquetamiento permite la modificacion global de las partmulas de replicon de alfavirus mediante el empaquetamiento de una construccion de vector o ARN del replicon a partir de un primer alfavirus usando protemas estructurales de un segundo alfavirus diferente del de la construccion del vector (documento WO 95/07994; Polo y col., 1999, ibid; Gardner y col., J. Virol., 74:11849-11857, 2000). Este enfoque proporciona un mecanismo que aprovecha las propiedades deseables de multiples alfavirus en una unica partmula de replicon. Por ejemplo, aunque todos los alfavirus son generalmente bastante similares en sus mecanismos de replicacion y estructura de virion, los diversos miembros del genero Alphavirus pueden mostrar algunas diferencias unicas en sus propiedades biologicas in vivo (por ejemplo, tropismo para celulas linfoides, sensibilidad al interferon, y perfil de enfermedad). Ademas, diversos alfavirus se clasifican como organismos de Nivel de Bioseguridad 3 (NBS-3), lo que essupone un problema para las instalaciones de produccion de las partmulas (por ejemplo, fabricacion)y posible uso humano, mientras que otros se clasifican como Nivel de Bioseguridad 2 (NBS-2). Las quimeras de partmulas de replicon de alfavirus proporcionan un mecanismo para incluir propiedades particulares de un alfavirus de nivel NBS-3 en una partmula de replicon derivada de un virus de nivel NBS-2. Por ejemplo, los elementos del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) linfotropico de NBS-3 se pueden incorporar dentro de un virus linfotropico no natural de NBS-2 (por ejemplo, el virus Sindbis).
Sin embargo, hasta la fecha, ha habido un exito limitado en la produccion eficaz y rutinaria de preparaciones de alto tftulo aceptables de manera comercial de partfculas de alfavirus quimericos. Tales partfculas de alfavirus quimerico son deseables por varias razones que incluyen tropismos espedficos o especificidad tisular, antigenicidad superficial alterada y reconocimiento alterado por el hospedador. En este sentido, el sistema inmunitario de un animal generalmente reconoce antfgenos de superficie del virus, tales como las glucoprotemas de la envoltura, y dirige respuestas celulares y humorales espedficas contra ellos mucho antes de que los antfgenos vmcos internos, tales como las protemas de la capside, se expongan al sistema inmunitario. En consecuencia, si un receptor de partroula de replicon tiene anticuerpos preexistentes dirigidos contra los antfgenos de superficie del vector (un hospedador sensibilizado), la partroula del replicon se puede atacar y destruir antes de que se pueda administrar su carga util terapeutica al tejido diana. Dado que muchas de las partroulas de replicon mas satisfactorias derivan de virus infecciosos de origen natural, es probable que, al menos algunos posibles receptores de partroula de replicon, hayan estado previamente expuestos a, y hayan desarrollado respuestas inmunitarias contra, anrtgenos de superficie que son comunes entre la partroula de replicon y el virus infeccioso natural. La probabilidad de una respuesta inmunitaria adversa tambien aumenta con multiples administraciones. Por lo tanto, con el fin de reducir o eliminar esta posibilidad, se pueden crear partroulas de replicon de administracion de genes posteriores usando partroulas de replicon quimericos de manera que el receptor no vea las mismas protemas estructurales muchas veces.
En el presente documento se describen partroulas de alfavirus quimerico que presentan interacciones estructurales eficaces. Por lo tanto, la presente invencion proporciona composiciones y procedimientos para construir y obtener partroulas de alfavirus quimerico recombinantes con eficacias de empaquetamiento/produccion aumentadas de manera significativa, usando quimeras SIN/VEE tal como se reivindica.
Las ventajas de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, (i) proporcionar partroulas de alfavirus quimerico a niveles comercialmente viables; (ii) la capacidad de reducir la probabilidad de ocurrencia de eventos indeseables, por ejemplo, la recombinancion y/o el empaquetamiento de un gen estructural; (iii) proporcionar vehroulos de administracion de genes con tropismos tisulares y celulares espedficos (por ejemplo, administracion de una celula presentadora de anrtgeno tal como una celula dendntica).
Las ensenanzas proporcionadas en el presente documento permiten a un experto en la materia construir partroulas de alfavirus quimerico derivadas de una amplia variedad de diferentes alfavirus, particularmente cuando las secuencias de tales alfavirus ya se han publicado. Los sistemas eucariotas de iniciacion de vectores en capas
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(ELVIS) tambien se pueden disenar usando estas composiciones quimericas. Optimizando los niveles de empaquetamiento tal como se desvela en el presente documento, se pueden producir partmulas de replicon quimerico para su uso en diversas aplicaciones, incluyendo en aplicaciones para vacunas y terapeuticas.
2.0. 0. Particulas y replicones de alfavirus
Como se ha indicado anteriormente, las partmulas quimericas tal como se describe en el presente documento incluyen una o mas secuencias de polinucleotidos (por ejemplo, ARN). Cuando se encuentran en partmulas, estos polinucleotidos estan rodeados por (e interaccionan con) una o mas protemas estructurales. En el presente documento se describen ejemplos no limitantes de secuencias de polinucleotidos y protemas estructurales que se pueden usar en la practica de la invencion.
2.1.0. Componentes nucleotidicos
Las particulas, los vectores y los replicones descritos en el presente documento incluyen tfpicamente una variedad de secuencias de acido nucleico, tanto secuencias codificantes como no codificantes. Sera evidente que las composiciones quimericas descritas en el presente documento generalmente comprenden menos de un genoma de alfavirus completo (por ejemplo, contienen menos de todas las secuencias codificantes y/o no codificantes contenidas en un genoma de un alfavirus).
Ademas, cabe destacar que, para la ilustracion en la presente memoria de diversos elementos utiles en la presente invencion, se ha considerado que las secuencias de alfavirus de un virus heterologo derivan de un alfavirus diferente del alfavirus que es la fuente de protemas no estructurales usado en el replicon a empaquetar, independientemente de si el elemento que se esta utilizando esta en el replicon o en el ARN auxiliar defectuoso (por ejemplo, durante la produccion de particulas, cuando ambos estan presentes).
2.1.1. Componentes de polinucleotidos no codificantes
Las particulas quimericas y los replicones descritos en el presente documento tfpicamente contienen secuencias que codifican para polipeptidos (por ejemplo, estructurales o no estructurales) asf como secuencias no codificantes, tales como elementos de control. Los ejemplos no limitantes de secuencias no codificantes incluyen secuencias 5' requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural, un medio para expresar un gen proximo a 3', region no traducida subgenomina del extremo 5' de ARNm (NTR 5' subgenomica) y secuencias 3' requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural (Patentes de Estados Unidos 5.843.723; 6.015.694; 5.814.482; Publicaciones PCT WO 97/38087; WO 00/61772). Sera evidente a partir de las ensenanzas del presente documento que una, mas de una o todas las secuencias descritas en el presente documento se pueden incluir en las particulas, vectores y/o replicones descritos en el presente documento y, ademas, que una o mas de estas secuencias se puede modificar o manipular de otro modo de acuerdo con las ensenanzas del presente documento.
Por lo tanto, los polinucleotidos descritos en el presente documento tfpicamente incluyen una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural. Los ejemplos no limitantes de secuencias 5' adecuadas incluyen elementos de control tales como el extremo 5' de un alfavirus natural de un virus homologo, el extremo 5' de un alfavirus natural de un virus heterologo, el extremo 5' de un alfavirus DI no natural de un virus homologo, el extremo 5' de un alfavirus DI no natural de un virus heterologo, la secuencia vmica no derivada de un alfavirus (por ejemplo, togavirus, virus de planta), secuencia derivada de ARN celular (por ejemplo, elemento de ARNt) (por ejemplo, Monroe y col., PNAS 80:3279-3283, 1983), mutaciones/deleciones de cualquiera de las secuencias anteriores para reducir la homologfa (vease, por ejemplo, Niesters y col., J. Virol. 64:4162-4168, 1990; Niesters y col., J. Virol. 64:1639-1647, 1990), y/o secuencia 5' minima en auxiliares (para aproximadamente 200, 250, 300, 350, 400 nucleotidos).
Las secuencias de polinucleotidos tambien incluyen generalmente un medio para expresar un gen proximo a 3' (por ejemplo, una secuencia heterologa, una secuencia que codifica polipeptido). Los ejemplos no limitantes de tales medios incluyen elementos de control tales como promotores y similares, por ejemplo, un promotor subgenomico de alfavirus natural de un virus homologo, un promotor subgenomico de alfavirus natural de un virus heterologo, un promotor subgenomico de alfavirus del nucleo (homologo o heterologo), secuencias mmimas aguas arriba o aguas abajo del promotor subgenomico del nucleo, mutaciones/deleciones/adiciones del promotor subgenomico natural o del nucleo, un promotor subgenomico compatible no derivado de un alfavirus (por ejemplo, virus de planta), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y/o un elemento de ultralectura ribosomica (por ejemplo, BiP).
Las regiones adecuadas no traducidas del extremo 5' de ARNm subgenomico (NTR 5' subgenomico) incluyen, pero no se limitan a, una NTR 5' subgenomica de alfavirus natural de un virus homologo, una NTR 5' subgenomica de alfavirus natural de un virus heterologo, una NTR 5' vmca no derivada de alfavirus (por ejemplo, virus de planta), una NTR 5' derivada de un gen celular (por ejemplo, (p-globina), y/o secuencias que contienen mutaciones, deleciones y/o adiciones a la NTR 5' subgenomica del alfavirus natural.
Los ejemplos no limitantes de secuencias 3' adecuadas requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural incluyen elementos de control tales como un extremo 3' de alfavirus natural de un virus homologo, un extremo 3' de alfavirus natural de un virus heterologo, un extremo 3' de alfavirus DI no nativo de un virus homologo,
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un extremo 3' de alfavirus DI no nativo de un virus heterologo, una secuencia vmca no derivada de alfavirus (por ejemplo, togavirus, virus de planta), una secuencia derivada de ARN celular, secuencias que contienen mutaciones, deleciones o adiciones de secuencias anteriores para reducir la homologfa (vease, por ejemplo, Kuhn y col. (1990) J. Virol. 64:1465-1476), secuencia minima en auxiliares hasta aprox. (20, 30, 50, 100, 200 nucleotidos) y/o secuencias CSE alfavmcas de 3' reparadas en la celula. Tambien se puede incorporar una secuencia de poliadenilacion, por ejemplo, dentro de las secuencias del extremo 3'. (Vease, por ejemplo, George y col. (2000) J. Virol. 74:9776-9785).
2.1.2.Secuencias codificantes
Las composiciones descritas en el presente documento tambien pueden incluir una o mas secuencias que codifican varios polipeptidos de alfavirus, por ejemplo, uno o mas de los polipeptidos no estructurales (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) o estructurales (por ejemplo, capside, envoltura) del alfavirus.
Tal como se describe en Strauss y col. (1984), anteriormente citado, un genoma de SIN de tipo silvestre tiene una longitud de 11.703 nucleotidos, excluyendo el casquete 5' y el tramo poli(A) del extremo 3'. Despues del casquete del extremo 5', hay 59 nucleotidos de acido nucleico en 5' no traducido seguido de una fase de lectura de 7539 nucleotidos que codifica los polipetidos no estructurales y que esta abierta excepto por un solo codon de terminacion opalo. Despues de las 48 bases no traducidas localizadas en la region de union que separa las secuencias que codifican protemas estructurales y no estructurales, hay una fase de lectura abierta de 3735 nucleotidos de longitud que codifica las protemas estructurales. Finalmente, la region no traducida 3' tiene una longitud de 322 nucleotidos. Las protemas no estructurales se traducen a partir del ARN genomico como dos precursores de poliprotema. El primero incluye nsP1, nsP2 y nsP3 y tiene una longitud de 1896 aminoacidos y termina en un codon opalo en la posicion 1897. La cuarta protema no estructural, nsP4, se produce cuando la ultralectura del codon opalo produce un segundo precursor de poliprotema de 2513 aminoacidos de longitud, que despues se escinde de manera postraduccional.
Los lfmites aproximados que definen los genes de protema no estructural a partir de los genomas de tres alfavirus representativos y comunmente usados, SIN, SFV y VEE son los siguientes.
- SIN1 SFV2 VEE3
- nsP1 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 60-1679 86-1696 45-1649
- nsP1 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 1-540 1-537 1-535
- nsP2 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 1680-4100 1697-4090 1650-4031
- nsP2 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 541-1347 538-1335 536-1329
- nsP3 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 4101-5747 4191-5536 4032-5681
- nsP3 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 1348-1896 1336-1817 1330-1879
- nsP4 (lfmites aprox. de nucleotidos)
- 5769-7598 5537-7378 5703-7523
- 1Strauss y col. (1984) Virology 133:92-110 2Takkinen (1986) Nucleic Acids Res. 14:5667-5682 3Kinney y col. (1989) Virology 170:19
Un genoma de alfavirus de tipo silvestre tambien incluye secuencias que codifican protemas estructurales. En SIN, las protemas estructurales se traducen a partir de un mensaje subgenomico que comienza en el nucleotido 7598, es de 4106 nucleotidos de longitud (excluyendo el tramo poli(A)) y es coterminal con el extremo 3' del ARN genomico. Como las protemas no estructurales, las protemas estructurales tambien se traducen como un precursor de poliprotema que se escinde para producir una protema de nucleocapside y dos glucoprotemas integrales de la membrana asf como dos pequenos peptidos no presentes en el virion maduro. Por lo tanto, los replicones, partmulas y vectores de la presente invencion incluyen secuencias derivadas de uno o mas secuencias codificantes de uno o mas alfavirus, tal como se reivindica.
Ademas de proporcionar secuencias derivadas de regiones codificantes de alfavirus, la presente invencion tambien proporciona vectores replicones de alfavirus que contienen secuencias que codifican protemas modificadas de alfavirus, por ejemplo, protemas no estructurales modificadas para reducir su propension a transferirse entre cadenas (por ejemplo, recombinacion) entre el replicon y el ARN auxiliar defectuoso o entre dos ARN auxiliares defectuosos, durante la smtesis de la cadena positiva de ARN, la smtesis de ARN de la cadena negativa, o ambas. Tales modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a mutaciones de nucleotidos, deleciones, adiciones o sustituciones de secuencia, en su totalidad o en parte, tales como por ejemplo el uso de una protema no estructural tnbrida que comprende secuencias de un alfavirus y de otro virus (por ejemplo, alfavirus, togavirus, virus de planta).
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Por lo tanto, se contempla una variedad de modificaciones de secuencia dentro de la presente invencion. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, hay una o mas deleciones en secuencias que codifican gen(es) de protema no estructural. Tales deleciones pueden estar en una protema no estructural (nsP) 1, 2, 3 o 4, asf como combinaciones de deleciones de mas de un gen de nsP. Por ejemplo, y sin pretender que sea a modo de limitacion, una delecion puede abarcar al menos las secuencias de nucleotidos que codifican los restos de aminoacidos 101120, 450-470, 460-480, 470-490 o 480-500 de la nsP1 del VEE, numerados en relacion con la secuencia en Kinney y col., (1989) Virology 170:19-30, asf como regiones mas pequenas incluidas dentro de cualquiera de las anteriores.
En otra realizacion, una delecion puede abarcar al menos las secuencias que codifican los restos de aminoacidos 929, 613-633, 650-670 o 740-760 de la nsP2 del VEE, asf como regiones mas pequenas incluidas dentro de cualquiera de las anteriores. En otra realizacion, una delecion puede abarcar al menos las secuencias que codifican los restos de aminoacidos 340-370, 350-380, 360-390, 370-400, 380-410, 390-420, 400-430, 410-440, 420-450, 430460, 440-470, 450-480, 460-490, 470-500, 480-510, 490-520, 500-530 o 488-522 de la nsP3 del VEE, asf como regiones mas pequenas incluidas dentro de cualquiera de las anteriores. En otra realizacion, la delecion puede abarcar al menos las secuencias que codifican los restos de aminoacidos 8-28 o 552-570 de la nsP4 del VEE, asf como regiones mas pequenas incluidas dentro de cualquiera de las anteriores. Cabe destacar que aunque los intervalos de aminoacidos anteriores se ilustran usando vEe como un ejemplo, se pueden utilizar deleciones de tipo similar en otros alfavirus.
Generalmente, aunque la numeracion de aminoacidos es algo diferente entre los alfavirus, principalmente debido a ligeras diferencias en las longitudes de las poliprotemas, los alineamientos en el interior o entre secuencias de diferentes alfavirus proporciona un medio para identificar regiones similares en otros alfavirus (vease el alineamiento representativo en Kinney y col. (1989) Virology 170:19-30). Preferentemente, las deleciones del gen de protema no estructural estan confinadas a una region o tramo de aminoacidos considerado como no conservado entre los multiples alfavirus. Ademas, las regiones conservadas tambien se pueden someter a delecion.
2.2.Protemas estructurales de alfavirus
Las protemas estructurales que rodean (y en algunos casos, que interaccionan con) el replicon de alfavirus o el(los) componente(s) del vector de polinucleotido puede incluir tanto las protemas de la capside como de la envoltura. En algunos casos, el(los) componente(s) de los polinucleotidos estan rodeados por la(s) protema(s) de la capside, que forman nucleocapsides. A su vez, la protema de la nucleocapside esta rodeada por una envoltura lipfdica que contiene la(s) protema(s) de la envoltura. Debe entenderse que aunque es preferente tener tanto protemas de la capside como de la envoltura, no se requieren ambas.
Las protemas de la capside del alfavirus y las protemas de la envoltura se describen de manera general en Strauss y col. (1994) Microbiol. Rev., 58:491-562. La protema de la capside es la protema N-terminal de la poliprotema estructural del alfavirus y, tras el procesamiento de la poliprotema, interacciona con el ARN del alfavirus y otros monomeros de protema de la capside para formar estructuras de nucleocapside.
Las glucoprotemas de la envoltura de alfavirus (por ejemplo, E2, E1) sobresalen de la partmula envuelta como "puas" superficiales, que funcionalmente estan implicadas en la union del receptor y en la entrada a la celula diana.
Una o ambas de estas protemas estructurales (o regiones de las mismas) pueden incluir una o mas modificaciones en comparacion con el tipo silvestre. Las protemas estructurales "tnbridas" (por ejemplo, las protemas que contienen secuencias derivadas de dos o mas alfavirus) tambien encuentran su uso en la practica de la presente invencion. Las protemas tnbridas pueden incluir una o mas regiones derivadas de diferentes alfavirus. Estas regiones pueden ser contiguas o no contiguas. Preferentemente, una region en particular de la protema estructural (por ejemplo, una region funcional tal como la porcion de la cola citoplasmatica de la protema de la envoltura o el dominio de union a ARN de la protema de la capside) deriva de un primer alfavirus. Cualquier cantidad de las secuencias "restantes" de la protema (por ejemplo, cualquier secuencia fuera de la region designada) puede derivar de uno o mas alfavirus que son diferentes al primero. Es preferente que entre aproximadamente el 25 % al 100 % (o cualquier valor porcentual intermedio) de la porcion "restante" derive de un alfavirus diferente, mas preferentemente entre aproximadamente el 35 % y el 100 % (o cualquier valor porcentual intermedio), incluso mas preferentemente entre aproximadamente el 50 % y el 100 % (o cualquier valor porcentual intermedio). Las secuencias derivadas de los uno o mas alfavirus diferentes en el hnbrido pueden ser contiguas o no contiguas, en otras palabras, las secuencias derivadas de un alfavirus pueden estar separadas mediante secuencias derivadas de uno o mas alfavirus diferentes.
2.3.Replicon modificado de alfavirus de Nivel de Bioseguridad-3
Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento tambien permiten la modificacion de vectores de replicon o de sistemas eucariotas de iniciacion de vectores en capas derivados de un alfavirus de NBS-3 (por ejemplo, VEE), de manera que se pueden utilizar a un nivel de clasificacion inferior (por ejemplo, NBS-2 o NBS- 1) reduciendo la secuencia de nucleotidos derivada del alfavirus parental de NBS-3 en mas de un tercio pero menos de dos tercios de la longitud del genoma.
Por lo tanto, los vectores de replicon quimerico, las partmulas o el ELVIS se pueden usar de manera que incluyan una secuencia de ARN de replicon de alfavirus tal como se reivindica que comprenda una secuencia 5' requerida
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para la amplificacion mediada por protema no estructural, secuencias que codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas, un promotor subgenomico de alfavirus, una secuencia heterologa que no es de alfavirus, una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural y, opcionalmente, un tramo de poliadenilato, en el que la secuencia que codifica al menos una de dichas protemas no estructurales deriva de un virus de NBS-3 (VEE), pero en el que el ARN del replicon contiene secuencias derivadas de dicho alfavirus de Nivel de Bioseguridad 3 que en total comprende menos de dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus parental de Nivel de Bioseguridad 3.
Por lo tanto, las secuencias de replicon tal y como se describen en el presente documento muestran no mas del 66,67 % de identidad de secuencia con un alfavirus de NBS-3 (VEE) a lo largo de toda la secuencia. En otras palabras, puede haber muchas regiones individuales de identidad de secuencia en comparacion con un genoma de NBS-3, pero la homologfa global o el porcentaje de identidad con toda la longitud del genoma de un NBS-3 no es mas del 66,67 % y no menos del 33,33 %. Preferentemente, las secuencias de replicon derivadas de dicho alfavirus de Nivel de Bioseguridad 3 comprenden entre el 40 % y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus parental de Nivel de Bioseguridad 3. Mas preferentemente, las secuencias de replicon derivadas de dicho alfavirus de Nivel de Bioseguridad 3 comprenden entre el 50% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus parental de Nivel de Bioseguridad 3. Incluso mas preferentemente, las secuencias de replicon derivadas de dicho alfavirus de Nivel de Bioseguridad 3 comprenden entre el 55% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus parental de Nivel de Bioseguridad 3. Lo mas preferentemente, las secuencias de replicon derivadas de dicho alfavirus de Nivel de Bioseguridad 3 comprenden entre el 60% y dos tercios de la longitud del genoma del alfavirus parental de Nivel de Bioseguridad 3.
Tal como se usa en el presente documento, las definiciones de Nivel de Bioseguridad (por ejemplo, Nivel de Bioseguridad 2, 3, 4) se considera que son las de la publicacion del HHS "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories", del U.S. Department of Health and Human Services (Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health), cuyos extractos que pertenecen a tales clasificaciones se incluyen a continuacion.
Las practicas, el equipamiento de seguridad y el diseno y la construccion de las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 1 son apropiados para laboratorios de ensenanza y preparacion de educacion universitaria y secundaria y otros laboratorios en los que el trabajo se hace con cepas definidas y caracterizadas de microorganismos que se sabe que no causan sistematicamente enfermedades en seres humanos adultos. Bacillus subtilis, Naegleria grubri, el virus de la hepatitis canina infecciosa y organismos exentos segun las directrices del ADN recombinante del NIH son representativos de microorganismos que cumplen estos criterios. Muchos agentes que no se asocian habitualmente con procesos de enfermedad en seres humanos son, sin embargo, patogenos oportunistas y pueden causar infeccion en individuos jovenes, en ancianos y en personas inmunodeficientes o inmunoinhibidas. Las cepas de vacuna que se han sometido a pases multiples in vivo no debenan considerarse avirulentas simplemente porque sean cepas de vacuna. El Nivel de Bioseguridad 1 representa un nivel basico de contencion que se basa en las practicas microbiologicas sin barreras primarias o secundarias recomendadas, que no sean un fregadero para lavarse las manos.
Las practicas, el equipamiento de seguridad y el diseno y la construccion de las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 2 se aplican a laboratorios clmicos, de diagnostico, de ensenanza y otros laboratorios en los que se trabaja con un amplio espectro de agentes autoctonos de riesgo moderado que estan presentes en la comunidad y se asocian con enfermedades humanas de gravedad variable. Con buenas tecnicas microbiologicas, estos agentes se pueden usar de manera segura en actividades llevadas a cabo en una superficie de trabajo abierta, asegurando que el potencial de produccion de salpicaduras o aerosoles sea bajo. El virus de la hepatitis B, el VIH, la salmonela y el Toxoplasma spp. son ejemplos representativos de microorganismos asignados a este nivel de contencion. El Nivel de Bioseguridad 2 es apropiado cuando se trabaja con cualquier tipo de sangre derivada de seres humanos, fluidos corporales, tejidos o lmeas celulares primarias humanas en las que la presencia de un agente infeccioso puede ser desconocida. (el personal de laboratorio que trabaja con materiales de procedencia humana debena consultar el Bloodborne PathogenStandard 2 de la OSHA, para precauciones espedficas requeridas). Los principales peligros para el personal que trabaja con estos agentes se relacionan con exposiciones accidentales percutaneas o de la membrana mucosa, o con la ingestion de materiales infecciosos. Debe tomarse una extrema precaucion con las agujas o los instrumentos afilados contaminados. Incluso aunque se sepa que los organismos manipulados de manera rutinaria en un Nivel de Bioseguridad 2 no se transmiten por aerosol, los procedimientos con aerosol o con una alta posibilidad de producir salpicaduras que puedan aumentar el riesgo de tal exposicion del personal se deben llevar a cabo con un equipamiento de contencion primaria o en dispositivos tales como un BSC o copas de centrifugacion de seguridad. Otras barreras primarias debenan usarse segun sea apropiado, tales como escudos contra salpicaduras, proteccion facial, batas y guantes. Las barreras secundarias, tales como los fregaderos para el lavado de manos, y las instalaciones de descontaminacion de residuos, pueden estar disponibles para reducir la posible contaminacion ambiental.
Las practicas, el equipamiento de seguridad y el diseno y la construccion de las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 3 se aplican a instalaciones clmicas, de diagnostico, de ensenanza, de investigacion o de produccion en las que se realiza el trabajo con agentes autoctonos o exoticos con una posibilidad de transmision mediante la respiracion, y que pueden causar infeccion grave y posiblemente letal. Mycobacterium tuberculosis, el virus de la
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encefalitis de St. Louis y Coxiella burnetii son ejemplos representativos de los microorganismos asignados a este nivel. Los principales peligros para el personal que trabaja con estos agentes se relacionan con la autoinoculacion, la ingestion y la exposicion a aerosoles infecciosos. A un Nivel de Bioseguridad 3, se pone mas enfasis en poner barreras primarias y secundarias para proteger al personal en areas contiguas, en la comunidad y el ambiente de la exposicion a posibles aerosoles infecciosos. Por ejemplo, todas las manipulaciones del laboratorio se deben realizar en un BSC u otro equipamiento cerrado, tal como una camara de generacion de aerosoles hermetica a gases. Las barreras secundarias para este nivel incluyen el acceso controlado al laboratorio y los requerimientos de ventilacion que minimicen la liberacion de aerosoles infecciosos desde el laboratorio.
El alfavirus de NBS-3 que se usa en la practica de la presente invencion es el virus de la encefalitis equina venezolana (excluyendo la cepa de la vacuna TC-83).
Las practicas, el equipamiento de seguridad y el diseno y la construccion de las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 4 se aplican al trabajo con agentes peligrosos y exoticos que suponen un alto riesgo individual de enfermedad letal, que se puede transmitir por l aerosol y para el cual no hay vacunas disponibles o terapia. Los agentes con una relacion antigenica proxima o identica a los agentes de Nivel de Bioseguridad 4 tambien deben manejarse a este nivel. Cuando se han obtenido suficientes datos, el trabajo con estos agentes puede continuar a este nivel o a un nivel mas bajo. Los virus, tales como el virus Marburg o el virus de la fiebre hemorragica de congo- crimea, se manipulan en un Nivel de Bioseguridad 4. Los principales peligros para el personal que trabaja con agentes de Nivel de Bioseguridad 4 son la exposicion respiratoria a aerosoles infecciosos, exposicion de la membrana mucosa o de lesiones cutaneas a gotas infecciosas, y la autoinoculacion. Todas las manipulaciones de materiales de diagnostico posiblemente infecciosos, los aislados, y los animales infectados de manera natural o experimental, suponen un alto riesgo de exposicion e infeccion para el personal del laboratorio, la comunidad y el ambiente. En un laboratorio, el aislamiento completo del trabajador frente a los materiales infecciosos en aerosol, se realiza principalmente trabajando en un BSC de clase III o en un traje personal de cuerpo entero, con presion positiva y suministro de aire. La propia instalacion de Nivel de Bioseguridad 4 es generalmente un edificio separado o una zona completamente aislada con requerimientos complejos de ventilacion especializada y sistemas de gestion de residuos para impedir la liberacion de agentes viables al ambiente.
Tal como se utiliza dentro del ambito de la presente invencion, la creacion de un replicon que contiene mas de un tercio pero menos de dos tercios de la longitud de la secuencia del genoma original de cualquier virus de NBS-3 (denominado el virus parental) puede realizarse en una variedad de formas. Por ejemplo, las regiones contiguas o no contiguas del virus parental se pueden eliminar. Como alternativa, las regiones contiguas o no contiguas del virus parental se pueden utilizar. Como alternativa, las regiones del virus parental se pueden escindir y ligar en una estructura principal de NBS-2 o NBS-1.
En determinadas realizaciones, los extremos 5' y/o 3' del alfavirus (secuencias requeridas para la amplificacion mediada por protema no estructural) se reducen a la minima secuencia de nucleotidos requerida para mantener la funcion suficiente en el contexto de un replicon para la expresion de secuencias heterologas o como alternativa, se pueden reemplazar con una secuencia que no es de alfavirus capaz de realizar la misma funcion. En otras realizaciones, uno o mas genes de protema no estructural de alfavirus se pueden eliminar dentro de regiones espedficas que no se conservan bien entre los alfavirus (por ejemplo, region no conservada de la nsP3) o de otro lugar. Como alternativa, la region del promotor subgenomico del alfavirus o la region NTR 5' subgenomica puede contener deleciones. En otras realizaciones adicionales mas, uno o mas genes de protema estructural pueden eliminarse, asf como combinaciones de cualquiera de los anteriores.
3.0. Procedimientos de produccion de particulas de replicon quimerico
Las particulas de replicon de alfavirus quimerico de acuerdo con la presente invencion se pueden producir usando una variedad de procedimientos publicados. Tales procedimientos incluyen, por ejemplo, enfoques de empaquetamiento transitorio, tales como la cotransfeccion in vitro de replicon transcrito y ARN auxiliar defectuoso (Liljestrom, Bio/Technology 9:1356-1361,1991; Bredenbeek y col., J. Virol. 67:6439-6446, 1993; Frolov y col., J. Virol. 71:2819-2829, 1997; Pushko y col., Virology 239:389-401, 1997; las Patentes de Estados Unidos 5.789.245 y 5.842.723) o construcciones de replicones y auxiliares defectuosos basados en ADN del plasmido (Dubensky y col., J. Virol. 70:508-519, 1996), asf como la introduccion de replicones de alfavirus dentro de lmeas celulares de empaquetamiento (PCL, del ingles, packaging cell lines) estables (Polo y col., PNAS 96:4598-4603, 1999; las Patentes de Estados Unidos 5.789.245, 5.842.723, 6.015.694; los documentos WO 97/38087, WO 99/18226, WO 00/61772 y WO 00/39318 ).
En realizaciones preferidas, las lmeas celulares de empaquetamiento de alfavirus estable se utiliza para la produccion de partmulas de replicon. Las PCL se puede transfectar con ARN de replicon transcrito in vitro, se puede transfectar con replicon basado en ADN del plasmido (por ejemplo, vector de ELVIS), o infectar con una reserva de inoculos de partmulas de replicon, y despues incubar en condiciones y durante un tiempo suficiente para producir partmulas de replicon empaquetadas de alto tftulo en el sobrenadante del cultivo. En realizaciones particularmente preferidas, las PCL se utilizan en un procedimiento de dos etapas, en el que como primera etapa, una reserva de inoculos de partmulas de replicon se produce transfectando la PCL con un replicon basado en ADN del plasmido. Se produce despues una mayor reserva de partmulas de replicon en la segunda etapa, infectando un cultivo reciente de
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las PCL con la reserva de inoculo. Esta infeccion se puede realizar usando diversas multiplicidades de infeccion (MDI), incluyendo una MDI = 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 3, 5 o 10. Preferentemente la infeccion se realiza a una MDI baja (por ejemplo, menor de 1). Las parffculas de replicon a fftulos incluso >108 unidades infecciosas (UI)/ml se pueden recoger de las PCL infectadas con la reserva de inoculo. Ademas, las parffculas de replicon se pueden pasar posteriormente a cultivos mayores de PCL sin tratar mediante una infeccion de multiplicidad baja repetida, dando como resultado preparaciones a escala comercial con el mismo fftulo elevado. Cabe destacar que, usando las PCL de la configuracion del gen estructural de la "division", esta reserva de parffculas de replicon se puede producir libre de RCV contaminante detectable.
Tal como se describe anteriormente, la produccion a gran escala de parffculas de replicon de alfavirus se puede realizar usando un biorreactor. Preferentemente, el biorreactor es un biorreactor de componente externo, que es un sistema de biorreactor modular integrado para el cultivo en masa, el crecimiento y el control de los procesos de las celulas unidas al sustrato. La union y propagacion de celulas (por ejemplo, celulas de empaquetamiento de alfavirus) tiene lugar en un recipiente o una camara con superficies tratadas de cultivo tisular, y las celulas estan con medio reciente para aumentar la productividad celular. El control y los ajustes se realizan para parametros tales como gases, temperatura, pH, glucosa, etc., y el vector bruto se recoge usando una bomba de perfusion. Tfpicamente, los componentes individuales de un biorreactor externo separan los modulos externos que estan conectados (es decir, mediante tubos). Los componentes externos pueden ser bombas, depositos, oxigenadores, modulos de cultivo y otras partes no convencionales. Un ejemplo representativo de un biorreactor de componente externo es el sistema CellCube™ (Coming, Inc).
Ademas de usar el biorreactor de componente externo descrito en el presente documento, tambien se puede usar un biorreactor de tanque de agitacion mas tradicional, en muchos casos, para la produccion de parffculas de replicon de alfavirus. En un biorreactor de tanque de agitacion, las celulas de empaquetamiento de alfavirus pueden no estar unidas a cualquier matriz (es decir, flotando en suspension) o unidas a una matriz (por ejemplo, polidiscos, micro- o macrovelffculos, perlas). Como alternativa, se puede usar un sistema de cultivo de fibra hueca.
Despues de la recoleccion, los sobrenadantes del cultivo en bruto que contienen las parffculas de replicon de alfavirus quimerico se pueden aclarar pasando lo recogido a traves de un filtro (por ejemplo, de un tamano de poro de 0,2 uM, 0,45 uM, 0,65 uM, 0,8 uM). Opcionalmente, los sobrenadantes crudos se pueden someter a una centrifugacion de baja velocidad antes de la filtracion para eliminar los residuos celulares de gran tamano. En una realizacion, se anade una endonucleasa (por ejemplo, bencenasa, Sigma #E8263) a la preparacion de parffculas de replicon de alfavirus antes o despues de la etapa de purificacion cromatografica para digerir el acido nucleico exogeno. Ademas, se puede concentrar la preparacion antes de la purificacion usando uno de cualquiera de los procedimientos ampliamente conocidos (por ejemplo, filtracion de flujo tangencial).
Las parffculas de replicon de alfavirus crudas o aclaradas se pueden concentrar y purificar mediante tecnicas cromatograficas (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion por tamanos, cromatograffa de interaccion hidrofobica, cromatograffa de afinidad). Se pueden realizar dos o mas de tales procedimientos de purificacion de manera secuencial. En realizaciones preferidas, se realiza al menos una etapa de cromatograffa de intercambio ionico y utiliza una resina de intercambio ionico, tal como una resina de intercambio ionico con tentaculos, y se realiza al menos una etapa de cromatograffa de exclusion por tamanos. Brevemente, los filtrados de parffculas de replicon de alfavirus aclarados se pueden cargar en una columna que contiene una matriz o una resina de intercambio ionico cargada (por ejemplo, intercambio de aniones o de cationes). La matriz o resina puede consistir en una variedad de sustancias, incluyendo pero sin limitacion, agarosa reticulada, poliestireno reticulado, estireno reticulado, resina de polieter hidrofflica, resina acfflica y resina basada en metacrilato. El componente de intercambiador ionico puede comprender, pero sin limitacion, un intercambiador cationico seleccionado de la lista que consiste en intercambiador de cation sulfopropilo, un intercambiador de cation carboximetilo, intercambiador de acido sulfonico, un intercambiador de cation metilsulfonato y un intercambiador de SO3-. En otras realizaciones, el componente intercambiador de iones puede comprender, pero sin limitacion, un intercambiador anionico seleccionado de la lista que consiste en DEAE, TMAE y DMAE. Lo mas preferentemente, la cromatograffa de intercambio ionico se realiza usando un intercambiador cationico con tentaculos, en el que la resina de intercambio ionico es una resina basada en metacrilato con un intercambiador de cation SO3- (por ejemplo, EDM SO3- de Fractogel®).
Las parffculas de replicon quimerico se pueden unir a la resina de intercambio ionico, seguido de uno o mas lavados con tampon que contiene una sal (por ejemplo, NaCl 250 mM o menos). Despues, las parffculas de replicon se pueden eluir de la columna en forma purificada usando un tampon con una elevada concentracion de sal.
En realizaciones preferidas, la concentracion de sal es de al menos 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM o 500 mM. La elucion se puede controlar preferentemente mediante un espectrofotometro a 280 nm, pero tambien mediante ensayo de fftulo de replicon, ensayo de transferencia de la expresion (TOE, del ingles transfer of expression) o analisis de gel proteico con la posterior tincion con Coomassie o mediante transferencia de Western.
Posteriormente, se puede intercambiar el tampon de elucion de mayor salinidad por un tampon mas deseable, por ejemplo, mediante la dilucion en una solucion acuosa adecuada o pasando el eluato que contiene parffculas a traves de una columna de exclusion molecular. Ademas, el uso de una columna de exclusion por tamano molecular
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tambien proporciona, en muchos casos, una purificacion adicional. Por ejemplo, en una realizacion, se puede usar la cromatograffa de Sephacryl S-500 o S-400 (Pharmacia) tanto como un intercambio de tampon as^ como para purificar adicionalmente las fracciones que contienen las partmulas de replicon eluidas de una columna de intercambio ionico. Usando esta resina particular, las partmulas de replicon generalmente se eluyen en el volumen de vado tardm y muestran mejora en el nivel de pureza, ya que algunos de los contaminantes son de menor peso molecular y se retienen en la columna durante mas tiempo. Sin embargo, tambien se podnan usar resinas alternativas de diferentes composiciones asf como de exclusion por tamano que podnan producir resultados similares o mejores. En estas estrategias, las resinas de mayor tamano tales como Sephacryl S-1000 se pueden incorporar de manera que permitan la entrada de las partmulas de replicon en la matriz y, por tanto, se retengan durante mas tiempo, permitiendo el fraccionamiento.
Los procedimientos descritos en el presente documento son procedimientos distintos ampliamente utilizados en los que los ARN auxiliares defectuosos y el vector replicon contiene genes derivados del mismo virus, permitiendo de este modo que el proceso de ensamblaje de partmulas de replicon se de de forma natural y de como resultado una partmula de replicon que tiene un empaquetado de replicon dentro de una capside vmca y protema(s) de la envoltura derivada(s) del mismo virus que aporta los genes de protema no estructural. En consecuencia, en tales procedimientos, la senal de empaquetamiento (tambien conocida como secuencias de empaquetamiento), el dominio de union a ARN, el dominio de interaccion con glucoprotema y las glucoprotemas de la envoltura son todos del mismo virus.
Por el contrario, los procedimientos descritos en el presente documento implican la produccion satisfactoria y eficaz de partmulas de replicon de alfavirus a partir de secuencias derivadas de dos o mas alfavirus. Tal como se describe en el presente documento, las partmulas se producen de una manera mas eficaz y, ademas, tienen tambien otras ventajas.
Tambien se proporcionan procedimientos, tal como se reivindica, para el empaquetamiento de ARN replicon de alfavirus dentro de partmulas de replicon (producir partmulas de replicon) y para reducir la probabilidad de generar virus competentes en la replicacion (por ejemplo, virus de tipo silvestre) durante el empaquetamiento, que comprenden introducir en una celula admisible un ARN replicon de alfavirus que codifica protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas y un polipeptido heterologo, junto con uno o mas ARN auxiliar(es) defectuoso(s) que codifican al menos una protema estructural de alfavirus, e incubar dicha celula en condiciones adecuadas durante un tiempo suficiente para permitir la produccion de partmulas de replicon. En algunas realizaciones, tanto el ARN replicon como el ARN auxiliar defectuoso incluyen elementos de control, particularmente una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, un medio para expresar las secuencias codificantes de polipeptidos (las secuencias codificantes de polipeptidos tambien se denominan el gen proximo a 3'), por ejemplo un promotor que conduce la expresion de (1) la protema heterologa en el replicon y (2) las protemas estructurales en el ARN auxiliar defectuoso, una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, un tramo de poliadenilato y, opcionalmente, una NTR 5' subgenomica. Ademas, a diferencia de los procedimientos conocidos, uno o mas de estos elementos de control son diferentes (por ejemplo, la secuencia es diferente) entre el ARN en el replicon y el ARN en el auxiliar defectuoso. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural es diferente entre el replicon y el ARN auxiliar. En otras realizaciones, el medio para expresar las secuencias codificantes de polipeptidos y/o la secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural es diferente entre el replicon y el ARN auxiliar.
Un experto en la materia entendera facilmente que la introduccion de ARN replicon dentro de celulas admisibles se puede realizar mediante diversos medios, tales como, por ejemplo, transfeccion o electroporacion de ARN (por ejemplo, ARN transcrito in vitro), transcripcion de ARN dentro de la celula a partir de ADN (por ejemplo, sistema eucariota de iniciacion de vectores en capas) o administracion mediante partmulas vmcas o de tipo virus (por ejemplo, partmulas de replicon) y la introduccion de ARN auxiliar defectuoso dentro de celulas admisibles tambien se puede realizar mediante diversos medios, tales como, por ejemplo, transfeccion o electroporacion de ARN (por ejemplo, ARN transcrito in vitro) o transcripcion de ARN dentro de la celula a partir de ADN (por ejemplo, casete de expresion de protema estructural).
Ademas, las modificaciones para reducir secuencias homologas tambien se pueden hacer a nivel de la estructura principal de ADN, tales como, por ejemplo, en un sistema eucariota de iniciacion de vector en capas o casete de expresion de protema estructural usado para la derivacion de celulas de empaquetamiento. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, promotores eucariotasalternativos, secuencias de poliadenilacion, marcadores de resistencia a antibioticos, ongenes de replicacion bacterianos y otras secuencias de estructura principal no funcional.
4.0 Composiciones farmaceuticas
En el presente documento tambien se desvelan composiciones farmaceuticas que comprenden cualquiera de las partmulas de replicon de alfavirus, vectores y/o replicones descritos en el presente documento en combinacion con un vehmulo,, un diluyente o un receptor, farmaceuticamente aceptable. En determinadas realizaciones preferidas, a las partmulas de replicon purificadas se anade una cantidad suficiente de tampon de formulacion para formar una suspension acuosa. En realizaciones preferidas, el tampon de formulacion comprende un sacarido y un componente
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de tamponamiento en agua, y tambien puede contener uno o mas aminoacidos o un aditivo estructural de alto peso molecular. El tampon de formulacion se anade en cantidad suficiente para alcanzar una concentracion final deseada de los constituyentes y para diluir mmimamente las partmulas de replicon. La suspension acuosa se puede conservar despues, preferentemente a -70 °C o secar de manera inmediata.
La suspension acuosa se puede secar mediante liofilizacion o evaporacion a temperatura ambiente. Brevemente, la liofilizacion implica las etapas de enfriar la suspension acuosa por debajo de la temperatura de transicion al estado gaseoso o por debajo de la temperatura del punto eutectico de la suspension acuosa y retirar el agua de la suspension enfriada mediante sublimacion para formar una partmula de replicon liofilizada. En una realizacion, las almuotas del virus recombinante formulado se colocan en una camara refrigerada de Edwards (unidad RC3S de la estantena 3) conectada a un liofilizador (Supermodulyo 12K). Para liofilizar las partmulas de replicon formuladas, se utiliza un procedimiento multietapa de secado en fno, tal como se describe en Phillips y col. (Cryobiology 18:414, 1981), preferentemente a una temperatura de -40 °C a -45 °C. La composicion resultante contiene menos del 10 % de agua por peso de las partmulas de replicon liofilizadas. Una vez liofilizadas, las partmulas de replicon son estables y se pueden conservar de -20 °C a 25 °C, tal como se trata con mas detalle a continuacion. En el procedimiento con evaporacion, el agua se retira de la suspension acuosa a temperatura ambiente mediante evaporacion. En una realizacion, el agua se retira mediante un procedimiento de secado por pulverizacion, en el que la suspension acuosa se administra en un flujo de gas precalentado, que normalmente da como resultado una evaporacion de manera rapida del agua de las gotas de la suspension. Una vez deshidratado, el virus recombinante es estable y se puede conservar de -20 °C a 25 °C.
Las soluciones acuosas usadas para la formulacion preferentemente comprenden un sacarido, un componente de tamponamiento y agua. La solucion tambien puede incluir uno o mas aminoacidos y un aditivo estructural de alto peso molecular. Esta combinacion de componentes actua para preservar la actividad de las partmulas de replicon tras la congelacion y tambien la liofilizacion o el secado a traves de la evaporacion. Aunque un sacarido preferido es lactosa, se pueden usar otros sacaridos, tales como sacarosa, manitol, glucosa, trehalosa, inositol, fructosa, maltosa o galactosa. Una concentracion particularmente preferida de lactosa es 3 % - 4 % en peso.
El aditivo estructural de alto peso molecular ayuda en la prevencion de la agregacion de partmulas durante la congelacion y proporciona un soporte estructural en el estado liofilizado o seco. Se considera que los aditivos estructurales son de "alto peso molecular" si tienen un P.M. mayor de 5000. Un aditivo estructural de alto peso molecular preferido es la albumina de suero humano. Sin embargo, tambien se pueden usar otras sustancias, tales como hidroxietilcelulosa, hidroximetilcelulosa, dextrano, celulosa, gelatina o povidona. Una concentracion particularmente preferida de albumina de suero humano es del 0,1 % en peso.
El componente de tamponamiento actua para tamponar la solucion manteniendo un pH relativamente constante. Se pueden usar diversos tampones, dependiendo del intervalo de pH deseado, preferentemente entre 7,0 y 7,8. Los tampones adecuados incluyen tampon fosfato y tampon citrato. Ademas, es preferible que la solucion acuosa contenga una sal neutra que se usa para ajustar las partmulas de replicon formuladas finales a una concentracion de sal isoosmotica apropiada. Las sales neutras adecuadas incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio o cloruro de magnesio. Una sal preferida es cloruro de sodio. Las partmulas de replicon liofilizadas o deshidratadas se pueden reconstituir usando diversas sustancias, pero se reconstituyen preferentemente usando agua. En algunos casos, tambien se pueden usar soluciones de sal diluida que lleven la formulacion final a la isotonicidad.
5.0 Aplicaciones
Las partmulas de alfavirus quimerico se pueden usar para administrar una amplia variedad de secuencias de nucleotidos que incluyen, por ejemplo, secuencias que codifican linfocinas o citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM- CSF), enzimas convertidoras de profarmacos (por ejemplo, HSV-TK, VZV-TK), antfgenos que estimulan una respuesta inmunitaria (por ejemplo, VIH, VHC, antfgenos tumorales), moleculas terapeuticas, tales como factores de crecimiento o reguladores (por ejemplo, VEGF, FGF, PDGF, BMP), protemas que ayudan o inhiben una respuesta inmunitaria, asf como ribozimas y secuencias antisentido. Las secuencias de nucleotidos anteriores incluyen aquellas citadas previamente (por ejemplo, en los documentos US 6.015.686, WO 9738087 y WO 9918226), y pueden obtenerse a partir de depositos, se pueden clonar facilmente a partir de ARN celular u otro ARN usando secuencias publicadas, o se pueden sintetizar, por ejemplo, en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems Inc. (por ejemplo, sintetizador de AdN de APB modelo 392 (Foster City, CA)).
Para los fines de la presente invencion, se puede usar practicamente cualquier polipeptido o polinucleotido. Los antfgenos pueden derivar de cualquiera de los diversos virus, bacterias, parasitos y hongos conocidos asf como de cualquiera de los diversos antfgenos tumorales o de cualquier otro antfgeno para el que se desea una respuesta inmunitaria. Ademas, para los fines de la presente invencion, un "antfgeno" se refiere a una protema que incluye modificaciones, tales como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas en la naturaleza), en la secuencia natural, siempre que la protema conserve la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria. Estas modificaciones pueden ser intencionadas, como a traves de mutagenesis dirigida, o pueden ser accidentales, tales como a traves de mutaciones de hospedadores que producen los antfgenos.
Los antfgenos se pueden usar solos o en cualquier combinacion. (Vease, por ejemplo, el documento WO 02/00249
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que describe el uso de combinaciones de antigenos bacterianos). Las combinaciones pueden incluir multiples antigenos del mismo patogeno, multiples antigenos de diferentes patogenos o multiples antigenos del mismo y de diferentes patogenos. Por lo tanto, los antigenos bacterianos, vmcos, tumorales y/u otros antigenos se pueden incluir en la misma composicion o se pueden administrar al mismo sujeto por separado. En general, para aumentar una respuesta inmunitaria, se prefiere el uso de combinaciones de antigenos.
Como ejemplos no limitantes de patogenos bacterianos se incluyen, difteria (vease, por ejemplo, el capttulo 3 de Vaccines, 1998, Eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0), estafilococos (por ejemplo, Staphylococcus aureus tal como se describe en Kuroda y col. (2001) Lancet 357:1225-1240), colera, tuberculosis, C. tetani, tambien conocido como tetanos (vease, por ejemplo, el capttulo 4 de Vaccines, 1998, Eds. Plotkin & Mortimer (ISBN 0-72161946-0), estreptococos de los grupos Ay B (incluyendo Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae y Streptococcus pyogenes tal como se describe, por ejemplo, en Watson y col. (2000) Pediatr. Infect. Dis. J. 19:331332; Rubin y col. (2000) Pediatr Clin. North Am. 47:269-284; Jedrzejas y col. (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187207; Schuchat (1999) Lancet 353:51-56; en las solicitudes de patente britanicas 0026333.5; 0028727.6; 015640.7; Dale y col. (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-1243; Ferretti y col. (2001) PNAS USA 98:4658-4663), pertussis (vease, por ejemplo, Gusttafsson y col. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355; Rappuoli y col. (1991) TIBTECH 9:232238), meningitis, Moraxella catarrhalis (vease, por ejemplo, McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl. 1:S101-107) y otros estados patogenicos, incluyendo, sin limitacion, Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae (vease, por ejemplo, los documentos WO 99/24578; l WO 99/36544 y WO 99/57280), Helicobacter pylori (por ejemplo, CagA, VacA, NAP, HopX, HopY y/o ureasa, como se describe, por ejemplo, en los documentos Wo 93/18150, WO 99/53310 y WO 98/04702), y Haemophilus influenza. Hemophilus influenza de tipo B (HIB) (vease, por ejemplo, Costantino y col. (1999) Vaccine 17:1251-1263), Porphyromonas gingivalis (Ross y col. (2001) Vaccine 19:41354132) y combinaciones de los mismos.
Como ejemplos no limitantes de patogenos vmcos se incluyen meningitis, rinovirus, gripe (Kawaoka y col., Virology (1990) 179:759-767; Webster y col., "Antigenic variation among type A influenza viruses," p. 127-168. En: P. Palese y D.W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, Nueva York), virus sincicial respiratorio (RSV), virus paragripal (PIV) y similares. Los antfgenos derivados de otros virus tambien encontraran su uso en la presente invencion, tal como, sin limitacion, protemas de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, etc. como se describe, por ejemplo, en Sutter y col. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308; Zimmerman y Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118; 125-126); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubeola, virus del dengue, etc.); la familia Flaviviridae, incluyendo los generos Flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, serotipos del virus Dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo Occidental); Pestivirus (por ejemplo, virus de la fiebre porcina clasica, virus de la diarrea viral bovina, virus de la enfermedad de la frontera); y Hepacivirus (por ejemplo, hepatitis A, B y C, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 4.702.909; 5.011.915; 5.698.390; 6.027.729; y 6.297.048); Parvovirus (por ejemplo, parvovirus B19); Coronaviridae; Reoviridae; Bimaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc. como se describe, por ejemplo, en Dressen y col. (1997) Vaccine 15 Suppl:s2-6; MmWR Morb Mortal Wkly Rep. Enero de 1998 16:47(1):12, 19); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de las paperas, virus del sarampion, rubeola, virus sincicial respiratorio, etc. como se describe en los capftulos 9 a 11 de Vaccines, 1998, Eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe tipos A, B y C, etc. como se describe en el capftulo 19 de Vaccines, 1998, Eds. Plotkin y Mortimer (ISBN 0-7216-1946-0),.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (por ejemplo, HTLV-1; HTLV-11; HIV-1 (tambien conocido como HTLV-III, LAV, ARV, HTI,R, etc.)), incluyendo pero sin limitarse a antfgenos de los aislados HIVIllb, HIVSF2, HIVLAV, HIVI-AL, I-IIVMN); HIV-I CM235, HIV-I IJS4; HIV-2; virus de la inmunodeficiencia en simios (VIS) entre otros. Ademas, los antfgenos tambien pueden derivar del virus del papiloma humano (VPH) y de los virus de la encefalitis transmitida por garrapatas. Vease, por ejemplo, Virology, 3a Edicion (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2a Edicion (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds, 1991), para una descripcion de estos y otros virus.
Los antfgenos de la familia de virus de la hepatitis, incluyendo el virus de la hepatitis A (VHA) (vease, por ejemplo, Bell y col. (2000) Pediatr Infect Dis. J. 19:1187-1188; Iwarson (1995) APMIS 103:321-326), virus de la hepatitis B (VHB) (vease, por ejemplo, Gerlich y col. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 y 79-80), virus de la hepatitis C (VhC), el virus de la hepatitis delta (VHD), virus de la hepatitis E (VHE) y virus de la hepatitis G (VHG), tambien se pueden usar de manera conveniente en las tecnicas descritas en el presente documento. A modo de ejemplo, la secuencia genomica del virus VHC es conocida, como lo son los procedimientos para obtener la secuencia. Veanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales N.° WO 89/04669, WO 90/11089 y WO 90/14436. Tambien se incluyen en la invencion variantes moleculares de tales polipeptidos, por ejemplo, como se describe en los documentos PCT/US99/31245, PCT/US99/31273 y PCT/US99/31272.
Como ejemplos no limitantes de antfgenos tumorales se incluyen antfgenos reconocidos mediante linfocitos T CD8+ (por ejemplo, antfgenos de diferenciacion de melanocitos de melanoma tales como MART-1, gp100, tirosinasa, protema 1 relacionada con tirosinasa, protema 2 relacionada con tirosinasa, receptor de hormona estimuladora de melanocitos; antfgenos mutados, tales como beta-catenina, MUM-1, CDK-4, caspasa-8, KIA 0205, HLA-A2-R1701; antfgenos de cancer de testmulos tales como MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAgE-12, BAGE, GAGE y NY-ESO-1; y antfgenos compartidos no mutados sobreexpresados en cancer tales como alfa-fetoprotema, protema catalttica de la telomerasa, G-250, MUC-1, antfgeno carcinoembrionario, p53, Her-2-neu) asf como antfgenos reconocidos por los linfocitos T CD4+ (por ejemplo, gp100, MAGE-1, MAGE-3, tirosinasa, NY-EsO-1, triosafosfato isomerasa, CDC-27 y
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LDLR-FUT). Vease, tambien, el documento WO 91/02062, la Patente de EE.UU. n.° 6.015.567, los documentos WO 01/08636, WO 96/30514, la Patente de EE.UU n.° 5.846.538 y la Patente de Estados Unidos n.° 5.869.445.
En determinadas realizaciones, se puede usar uno o mas anrtgenos tumorales. Los anrtgenos tumorales derivan de componentes celulares mutados o alterados. Tras la alteracion, los componentes celulares ya no realizan sus funciones reguladoras y, por lo tanto, la celula puede experimentar un crecimiento descontrolado. Los ejemplos representativos de compontes celulares alterados incluyen ras, p53, Rb, protema alterada codificada por el gen del tumor de Wilms, ubiquitina, mucina, protema codificada por los genes DCC, APC y MCC, asf como receptores o estructuras de tipo receptor tales como neu, el receptor de la hormona tiroidea, el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el receptor de la insulina, el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF) y el receptor del factor estimulador de colonias (CSF). Estos, asf como otros componentes celulares, se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.° 5.693.522 y en las referencias citadas en ese documento.
Estas secuencias heterologas seleccionadas se pueden administrar a un mairnfero de sangre caliente (por ejemplo, un mam^era, tal como un ser humano u otro animal de sangre caliente, tal como un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, un perro, un gato, una rata o un raton) para su uso como una vacuna o compuesto terapeutico, que comprende la etapa de administrar al mai^ero partteulas de replicon o sistemas eucariotas de iniciacion de vectores en capas tal como se describe en el presente documento, que son capaces de expresar la secuencia heterologa seleccionada. La administracion puede realizarse mediante diversas vfas (por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, subcutanea, oral, intraocular, intranasal, rectal, intratumoral). Ademas, las partteulas de replicon pueden administrarse tanto de manera directa (es decir, in vivo) o a celulas que se han extrafdo (ex vivo) y posteriormente devuelto al marnffero de sangre caliente.
Cabe destacar que el procedimiento seleccionado para la produccion de partteulas de replicon de alfavirus quimerico de la presente invencion debena usar tecnicas conocidas en la materia para minimizar la posibilidad de generar virus competentes en la replicacion (VCR) contaminantes. Una de tales estrategias es el uso de auxiliares defectuosos o PCL que contienen una "division" de casetes de expresion de protema estructural (veanse las Patentes de Estados Unidos 5.789.245; 6.242.259; 6.329.201). En este contexto, los genes de protema estructural de alfavirus se segregan en construcciones de expresion distintas (por ejemplo, capside distinta de glucoprotemas) de tal manera que la recombinacion para regenerar un complemento completo de protemas estructurales es muy improbable. En el presente documento se desvelan composiciones y procedimientos para reducir la probabilidad de eventos de recombinacion durante la produccion de partteulas de replicon de alfavirus, ademas de los procedimientos convencionales conocidos en la materia. Por ejemplo, cualquiera de los diversos elementos funcionales (por ejemplo, elementos de control) habitualmente compartidos por el replicon y el ARN auxiliar defectuoso, o compartidos entre los multiples ARN auxiliares defectuosos (tambien sistemas eucariotas de iniciacion de vectores en capas y casetes de expresion de protema estructural) se pueden sustituir con elementos alternativos que realizan la misma funcion. En este caso, la homologfa entre moleculas de ARN disminuye o desaparece. Como alternativa, la probabilidad de que el molde de polimerasa se intercambie entre las moleculas de ARN tambien se puede reducir. Elementos funcionales representativos, compartidos habitualmente por el replicon y el ARN auxiliar defectuoso o compartidos entre multiples ARN auxiliares defectuosos, asf como algunas alternativas para cada uno tal como se contemplan en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a aquellas descritas anteriormente en la Seccion B anterior.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar de una manera mas completa la presente invencion. Ademas, estos ejemplos proporcionan realizaciones preferidas de la invencion y no significa que limiten el ambito de las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1
Construccion de un vector replicon derivado de VEE
Para construir vectores de replicon derivado de VEE y casetes de empaquetamiento de auxiliares defectuosos para su uso en la produccion de partteulas quimericas, fue necesario sintetizar primero ADN complementario correspondiente a todo el genoma del VEE. Basandose en la secuencia anteriormente publicada de la cepa Burro Trinidad de tipo silvestre del VEE (GENBANK, L01442), (en lo sucesivo, en el presente documento, TRD del VEE) se sintetizo todo el genoma de 11.447 y se clono en multiples fragmentos usando oligonucleotidos de solapamiento. Se usaron clones de gen de protema no estructural para el ensamblaje de un vector replicon, mientras que los clones de gen de protema estructural se usaron para el ensamblaje de casetes de empaquetamiento de auxiliar defectuoso.
Las secuencias que codifican genes de protema no estructural del TRD del VEE se analizaron para sitios de escision de restriccion unica adecuados que subdividinan la region en fragmentos de una longitud practica y que pudieran usarse de manera conveniente para el ensamblaje final de la construccion del vector replicon completo. Tal como se muestra en la Figura 1, se identifico un total de 13 fragmentos intermedios, cuya longitud variaba de 334 a 723 nucleotidos. Esta serie de fragmentos se sintetizo usando oligonucleotidos de solapamiento y tecnicas normalmente empleadas por los expertos en la materia de biologfa molecular (vease a continuacion, por ejemplo). Para los
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fragmentos terminales n.° 1 y n.° 13 se anadieron secuencias adicionales necesarias para la construccion final del plasmido que podna usarse para la transcripcion de vectores de expresion replicones de ARN in vivo e in vitro. Aguas arriba, como parte del fragmento 1, se coloco o un promotor del bacteriofago SP6 o un promotor del CMV eucariota para permitir la transcripcion del ARN replicon. Aguas abajo, como parte del fragmento 13, se replico la UTR 3' vmca, un tramo de poliadenilacion de A40 sintetico y la ribozima antigenomica del virus de la hepatitis delta para la generacion de ARN terminados de manera autentica (Dubensky y col., J. Virol. 70:508-519, 1996; Polo, 1999, ibid).
Como un ejemplo detallado de smtesis g'nica para uno de los fragmentos, se generaron cadenas completas de ADN duplex para el fragmento de replicon n.° 2 a partir de oligonucleotidos de solapamiento sinteticos tal como se describe a continuacion y como se muestra en la Figura 2 (los oligonucleotidos adyacentes se muestran con o sin sombreado para destacar las uniones). En primer lugar, la cadena completa duplex se anadio con la secuencia de reconocimiento de sitios de enzimas de restriccion convenientes adecuados para la insercion en vectores de clonacion intermedios. Despues, cada fragmento se subdividio en una serie de oligonucleotidos con una longitud promedio de 60 nucleotidos cada uno, y que solapan con aquellos oligonucleotidos de la cadena opuesta en un promedio de 20 nucleotidos por cada extremo. La smtesis de los oligonucleotidos iniciales la realizo proveedores comerciales (por ejemplo, Integrated DNA Technologies, Coralville, IA; Operon Technologies, Alameda, CA). Se reconstituyeron oligonucleotidos para cada fragmento segun las recomendaciones del proveedor para producir soluciones de 100 nM de cada oligo individual. Para ensamblar el fragmento, se mezclaron 100 pmoles de cada oligo en un solo tubo de reaccion que contema tampon de polinucleotido quinasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA), rATP 1 mM, agua y 10 unidades de enzima polinucleotido quinasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) en un volumen de reaccion final de 500 ul. Se permitio que la reaccion de fosforilacion procediese durante 30 minutos a 37 °C, momento en el cual la reaccion se complemento con 10 unidades mas de polinucleotido quinasa T4 y se permitio que continuase durante 30 minutos mas. Al final de la reaccion, el tubo que contema la mezcla se calento a 95 °C durante 5 minutos en un vaso de precipitados que contema un gran volumen de agua para desnaturalizar la enzima y cualquier cadena de ADN que ya pudiera estar apareada. Despues se retiro el vaso de precipitados de la fuente de calor y se dejo enfriar lentamente a temperatura ambiente, para que los oligonucleotidos complementarios se apareasen en cadenas de ADN duplex completas.
Una vez enfriado, 0,2 pmoles del material que habfa reaccionado, se unieron con 100 pmoles de ADN del vector lanzadera previamente preparado y transformado en bacterias competentes de acuerdo con procedimientos convencionales. En primer lugar, se analizaron los transformantes que surgieron de esta union para determinar la presencia de sitios de enzimas de los replicones terminales apropiados, el tamano de la insercion y evidencias de la duplicacion de la insercion. Se eligieron aleatoriamente varias transformaciones positivas y se sometieron a una confirmacion de secuencia. Cualquier error de secuencia detectado se corrigio mediante el cambio de fragmentos entre dos o mas muestras secuenciadas o mediante mutagenesis dirigida y se volvio a confirmar su autenticidad.
Despues de que se obtuviesen todos los fragmentos, el ensamblaje final de un vector replicon, similar a los publicados anteriormente con una variedad de alfavirus (Xiong y col., Science 243:1188-1191, 1989; Dubensky y col., 1996, ibid; Liljestrom y col., Bio/Technol. 9:1356-1361, 1991; Pushko y col., Virology 239:389-401), se realizo troceando cada subfragmento junto con su fragmento contiguo a traves de la union a los sitios de escision del fragmento terminal previamente seleccionado. Una vez ensamblado, se volvio a confirmar la secuencia de todo el replicon del VEE sintetico. La construccion resultante de vector de alfavirus basada en VEE a partir de la cual se puede transcribir ARN replicon in vitro se denomino pVCR.
Ademas de la construccion del vector replicon basada en el promotor SP6, tambien se construyo un sistema eucariota de iniciacion de vector en capas basado en VEE (ELVlS, veanse los documentos US 5814482 y 6015686) que utilizo un promotor del CMV para lanzar replicones de ARN funcionales desde una celula eucariota. La modificacion del plasmido pVCR para la conversion en un vector de ELVIS se realizo de la siguiente manera. Se uso un vector de ELVIS basado en virus Sindbis (SIN) existente, pSINCP, como una fuente donante para los componentes de la estructura principal apropiados que incluyen el promotor del CMV, el gen de la resistencia a la kanamicina y el origen de replicacion. Esta estrategia fue posible debido a que tanto el pSINCP como el pVCR comparten elementos de secuencia identicos (por ejemplo, secuencia poli(A) sintetica, ribozima del HDV) aguas abajo del gen no estructural y las regiones UTR 3' vmicas. En el pVCR, la ribozima del HDV esta flanqueada por un unico sitio Pmel, mientras que en el pSINCP la ribozima esta flanqueada por un sitio Bcll. La fusion Pmel/Bcll sirve despues como el sitio de union a 5' entre pSINCP y pVCR. El sitio de union a 3' fue un sitio BspEI fortuito presente en la nsP1 tanto de SIN como de VEE. Para realizar el intercambio de estructura principal, primero se transformo el pSINCP en una bacteria hospedadora Dam/Dcmminus, SCS110 (Stratagene, La Jolla, CA) para obtener ADN que se puede escindir por Bcll. Se aislo un fragmento de 1203 pares de bases que contema el BGHt en el extremo 5' y el gen Kan R en el extremo 3' y los extremos se hicieron romos mediante la ADN polimerasa T4 (New England Biolabs, Beverly, MA) siguiendo procedimientos convencionales. Despues, este fragmento se digirioadicionalmente con PstI para liberar un fragmento de Bcll-Pstl de 999 pb que se purifico, que contema el BGHt y los 2/3 de 5' del gen Kan R.
El plasmido pSINCP contiene 4 sitios BspEI. Para hacer una identificacion de fragmento mas precisa, el plasmido se codigirio con Notl, Sail y Eco47III y se aislo el fragmento de 5173 pb. Despues, este fragmento se digirio adicionalmente con PstI y BspEI y a partir de este se purifico un fragmento PstI-BspEI de 2730 pb que contema el 1/3 de 3' del gen Kan R, el origen de replicacion del plasmido, el promotor pol II y 420 pb del gen de la nsP1 del
Sindbis.
Como una fuente del extremo 5' y 3' del replicon VCR, se utilizo un intermedio temprano, pVCR-DH (vease a continuacion). El pVCR-DH contiene el fragmento 1, el fragmento 13 y todos los sitios de restriccion terminal de los fragmented intermedios. Como tal, contiene una porcion del gen de la nsP1 del VEE-TRD que incluye el sitio SspEI 5 necesario y todos los rasgos de 3' descritos anteriormente que fueron necesarios para el intercambio, pero carece de la region no estructural del nucleo desde el extremo 3' de la nsP1 hasta el extremo 5' de la nsP4. El pVCR-DH se transformo en celulas SCS 110 como antes y se digirio con SspEI y Pmel para liberar un fragmento de 1302 pb que contema nsP1'-nsP4', la UTR de 3', el tramo de A40 y la ribozima del HDV.
Se realizo una union de tres vfas de los fragmentos Sc/I(romo)-PstI y PstI-SspEI del pSINCP y el fragmento SspEI- 10 Pmel del pVCR. El intermedio resultante se denomino pVCPdhintSP. El plasmido pVCPdhintSP se digirio con SacI (cortando 15 pb antes del extremo 3' del promotor del CMV) y SspEI en la union de las secuencias del Sinbis y del VEE en nsP1. El fragmento del vector de esta digestion se desfosforilo y se unio con un producto de PCR de 326 pb del pVCR-DH que proporciona el extremo 5' ausente de la nsP1 del VEE-TRD. El cebador 5', [AAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATGGGCGGCGCATG], (SEQ ID NO 1) yuxtapone los 15 nucleotidos del 3' 15 terminal del promotor del CMV (hasta el sitio de inicio de la transcripcion) hasta la base inicial de la secuencia UTR 5' del VEE. El cebador 3' tema la secuencia enumerada [gccctgcgtccagctcatctcgaTCTGTCCGGATCTTCCGC.] (SEQ ID NO 2). Este intermedio se denomino, pVCPdhintf. Para completar la construccion, el pVCPdhintf se digirio con NotI y HpaI y el fragmento del vector se desfosforilo y se unio al fragmento HpaI-NotI del pVCR proporcionando las secuencias no estructurales nucleares del VEE que faltaban a partir del pVCPdhintf intermedio. Esta construccion 20 final de ELVIS basada en VEE se denomino pVCP.
Ejemplo 2
Construccion de construcciones auxiliares defectuosas de alfavirus
Antes de la construccion de auxiliares defectuosos (DH, del ingles, defective he/pers) para su uso en la generacion de elementos de protema estructural hteridos y partteulas de alfavirus quimerico, casetes de empaquetamiento de 25 auxiliares defectuosos basados en SIN previamente existentes (Polo y col., 1999, ibid; Gardner y col., 2000 ibid) se modificaron en primer lugar. Para generar estos nuevos casetes de SIN, el plasmido SINBV-neo (Perri y col., J. Virol. 74:9802-9807, 2000) se digirio con ApaI, se trato con ADN polimerasa T4 para hacer romos los extremos generados con ApaI y despues se digirieron con SgIII y SamHI. El fragmento de 4,5 kb, que contema la estructura principal del plasmido, el promotor subgenomico del SIN, el extremo 3' del SIN, el tramo poli(A) sintetico y la ribozima 30 antigenomica de HDV, se purifico en gel con un kit de extraccion en gel QIAquick y se unio a un fragmento de 714 pb que contema un promotor SP6 y un extremo 5' de ARNt del SIN, obtenido del plasmido 47tRNA BBCrrvdel 13 (Frolov y col., J. Virol., 71:2819-2829, 1997) que previamente se habfa digerido con SacI, se habfa tratado con ADN polimerasa T4, se habfa digerido con SamHI y se habfa purificado con gel. Los clones positivos se verificaron mediante analisis de restriccion. Esta construccion se uso como base para la insercion a traves de los sitios XhoI- 35 NotI (elimina la insercion Neo existente), de las secuencias de glucoprotema y capside de alfavirus descritas a
continuacion. La estructura principal del casete de auxiliar defectuoso del SIN descrita en el presente documento se denomina tDH.
Construccion de VCR-DH
En la estructura principal de SINCR-GFP se clono una region de polienlazador (Gardner y col., 2000, ibid) como una 40 primera etapa. El polienlazador contema los siguientes sitios de restriccion de 5' a 3': ApaI-M/uI-HpaI-Sg/II-Ssu36I- PstI-Ssa-BI-AvrII-SwaI-AspI-SbvCI-AscI-NotI-PmeI. Para generar el polienlazador, se usaron los siguientes oligonucleotidos:
- PL1F
- 5'-cacgcgtactactgttaactcatcaagatctactaggcctaaggcaccacctgcaggtagtagatacacatcataatacc-3 ' (SEQ ID NO 3)
- PL2F
- 5'-tagggcggcgatttaaatgatttagactacgtcagcagccctcagcggcgcgcccacccagcggccgcaggatagttt-3' (SEQ ID NO 4)
- PL1R
- 5'-tatgatgtgtatctactacctgcaggtggtgccttaggcctagtagatcttgatgagttaacagtagtacgcgtgggcc-3' (SEQ ID NO 5)
- PL2R
- 5'-aaactatcctgcggccgctgggtgggcgcgccgctgagggctgctgacgtagtctaaatcatttaaatcgccgccctaggtat-3' (SEQ ID NO 6)
Los oligonucleotidos PL1F y PL1R, y los oligonucleotidos PL2F y PL2R se mezclaron en dos reacciones distintas, se 45 fosforilaron, se desnaturalizaron y se aparearon lentamente. Las dos reacciones se mezclaron despues y se unieron
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
con el fragmento de 2,8 kb generado a partir del plasmido SINCR-GFP que previamente se ha^a digerido con Apal y PmeI y gel purificado usando un kit de extraccion de extraccion en gel QlAquick. Se exploraron los clones para la correcta orientacion usando las digestiones de restriccion A/wNI y Notl. Los clones positivos se verificaron con digestion de restriccion con cada una de las enzimas presentes en el polienlazador. Esta construccion se denomino estructura principal de VCR. A continuacion, el extremo 3' de VEE, junto con un tramo de poliadenilacion y la ribozima del HDV,se insertaron en la estructura principal de VCR. Este fragmento se genero usando los siguientes oligonucleotidos sinteticos de solapamiento.
VEE3'-1F 5'-ggccgcatacagcagcaattggcaagctgcttacatagaactcgcggcgattggcatg-3' (SEQ ID NO 7)
VEE3'-1R 5'-ccaatcgccgcgagttctatgtaagcagcttgccaattgctgctgtatgc-3' (SEQ ID NO 8)
VEE3'-2F 5'-ccgccttaaaatttttattttattttttcttttcttttccgaatcggattttgtttttaat-3' (SEQ ID NO 9)
VEE3'-2R 5'-attaaaaacaaaatccgattcggaaaagaaaagaaaaaataaaataaaaattttaaggcggcatg-3' (SEQ ID NO 10) VEE3'-3F 5'-atttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggtcggcatggcatctccac-ctcctcgcg-3' (SEQ ID NO 11)
VEE3'-3R 5'-gaccgcgaggaggtggagatgccatgccgacccttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgaaat-3' (SEQ ID NO 12)
VEE3'-4F 5'-gtccgacctgggcatccgaaggaggacgcacgtccactcggatggctaagggagagccacgttt-3' (SEQ ID NO 13)
VEE3'-4R 5'-aaacgtggctctcccttagccatccgagtggacgtgcgtcctccttcggatgcccaggtcg-3' (SEQ ID NO 14)
Cada par de oligonucleotidos directo e inverso (por ejemplo, VEE1F con VEE1R, VEE2F con VEE2R, etc) se mezclo, se fosforilo, se desnaturalizo y se apareo lentamente. Despues, los 4 pares de oligonucleotidos apareados se mezclaron conjuntamente, se unieron entre sf, se digirieron con enzimas NotI y PmeI, se purificaron con gel usando un kit de extraccion en gel QIAquick y se unieron a la estructura principal de VCR que se habfa digerido previamente con las mismas enzimas, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para el fragmento se verificaron mediante secuenciacion. Esta construccion se denomino VCR-3'drib.
A continuacion, se inserto el extremo 5' del genoma del VEE. Este fragmento se genero usando oligonucleotidos de solapamiento para cubrir la region del genoma de la cepa burro Trinidad del VEE (vease la referencia al GENBANK anterior) desde el nucleotido 1 hasta el sitio de restriccion HpaI. Los cebadores con nucleotido 1 de VEE tambien conteman un sitio MIuI aguas arriba seguido del promotor SP6 inmediatamente en 5' del nucleotido 1 del VEE. Todos los oligonucleotidos se mezclaron en una reaccion, se fosforilaron, se desnaturalizaron, se alinearon lentamente y se unieron. Tras desactivar la ligasa, el ADN se digirio con las enzimas MIuI y HpaI, se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y se unio a VCR-3'drib que previamente se habfa digerido con las mismas enzimas de restriccion, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion. Esta construccion intermedia se denomino VCR-F1-3'drib.
Finalmente, la region del VEE que contema el promotor subgenomico se clono en VCR-F1-3'drib. Esta region (fragmento 13, Figura 1) se corresponde con la secuencia entre el sitio de restriccion SwaI y el nucleotido 7561 del genoma de la cepa burro Trinidad del VEE. El fragmento se genero usando oligonucleotidos de solapamiento correspondientes a la secuencia de la cepa Burro Trinidad, con la excepcion del oligonucleotido correspondiente al extremo 3' del fragmento que se modifico para llevar unos sitios de restriccion adicionales (BbvCI) para permitir una insercion posterior de secuencias heterologas bajo el control del promotor subgenomico. Todos los oligonucleotidos se mezclaron en una reaccion, se fosforilaron, se desnaturalizaron, se alinearon lentamente y se unieron. Tras desactivar la ligasa, el ADN se digirio con las enzimas SwaI y BbvCI, se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y se unio a la estructura principal de VCR que se habfa digerido previamente con las mismas enzimas de restriccion, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion y un clon, VF13-14, se reparo posteriormente eliminando una pequena insercion y volviendo a confirmar mediante secuenciacion. A continuacion, el clon se digirio cloncon SwaI-NotI, el fragmento de 600 pb se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel y se unio a VCR-F1-3'drib que se habfa digerido previamente con las mismas enzimas de restriccion, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para la insercion se verificaron y la construccion se denomino VCR-DH.
Construccion de tDH-Vgly, tDH-VE2-120 y tDH-VNTR-glydl160
Los genes de glucoprotema de la cepa burro Trinidad del VEE se generaron usando oligonucleotidos de solapamiento que se denominaron basandose en la secuencia de GENBANK publicada. Para permitir la expresion a partir de casetes de empaquetamiento del vector apropiado, se anadio un codon ATG en fase con la fase abierta de lectura delgen de la glucoprotema inmediatamente antes del primer aminoacido de E3, y se anadieron un sitio XhoI y un sitio NotI en los extremos 5' y 3', respectivamente, de las secuencias del gen de la glucoprotema. La smtesis del gen se realizo usando PCR de solapamiento para generar cinco fragmentos distintos que abarcaban toda la secuencia de glucoprotema (Figura 3). Los fragmentos se ensamblaron por etapas en un solo fragmento en pGEM usando los sitios de restriccion indicados en la Figura 3. Se corrigio una pequena delecion de nucleotidos en los sitios KasI mediante mutagenesis dirigida convencional. El clon final se verifico mediante secuenciacion y se denomino pGEM-Vgly. Despues, la secuencia de gen de la glucoprotema se transfirio desde pGEM a tDH usando los sitios XhoI-NotI y el clon final se denomino tDH-Vgly.
De manera analoga, se construyo una construccion similar a tDH-Vgly que tambien contema la mutacion atenuante en el aminoacido 120 de E2 presente en la cepa del VEE de la vacuna TC83. El plasmido pGEM-Vgly se sometio a mutagenesis dirigida convencional y la mutacion 120 de E2 se confirmo mediante secuenciacion. Despues, la secuencia de la glucoprotema E2-120 del VEE se transfirio desde pGEM a tDH usando los sitios XhoI-NotI y la 5 construccion se confirmo mediante secuenciacion y se denomino tDH-VE2-120.
El plasmido tDH-VNTR-glydl160 es una construccion auxiliar defectuosa de tDH (vease lo anterior) que contiene una secuencia de glucoprotema del SIN de la cepa tropica de celulas dendnticas humanas descrita anteriormente (Gardner y col., ibid), en la que la NTR 5' subgenomica derivada del SIN y el sitio Xhol se sustituyeron por la siguiente secuencia NTR 5' subgenomica del VEE (5'-ACTACGACATAGTcTAGTCCGCCAAG) (SEQ ID NO 53). 10 Esta secuencia se inserto de manera que precede inmediatamente al codon de iniciacion ATG de la glucoprotema. La construccion tambien se conoce como tDH-VuTR-glydl160 para reflejar la nomenclatura intercambiable para la region no traducida (NTR, del ingles nontranslated region) 5' subgenomica, tambien denominada region sin traducir (UTR, del ingles untranslated region).
Construccion de VCR-DH-Vgly, VCR-DH-VE2-120 y VCR-DH-Sglydl160
15 La secuencia de gen de glucoprotema del VEE entre el ATG y el sitio de restriccion NcoI se amplifico mediante PCR usando los siguiente oligonucleotidos.
- VGBbvCI
- 5'-atatatatctcgagcctcagcatgtcactagtgaccaccatgt-3' (SEQ ID NO 15)
- VGNcoIR
- 5'-atatataaattccatggtgatggagtcc-3' (SEQ ID NO 16)
Tras la amplificacion por PCR, el fragmento se digirio con BbvCI y NcoI y se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick. Por separado, se preparo la region de glucoprotema E2-120 del VEE desde Ncol hasta 20 NotI digiriendo pGEM-Ve2-120 con estas enzimas seguido de la purificacion en gel. Los dos fragmentos se mezclaron y se unieron a VCR-DH que se habfa digerido previamente con BbvCI y NotI, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion y se denominaron VCR-DH-VE2-120. Para obtener VCR-DH-Vgly, se obtuvo el fragmento Ncol-Xbal a partir de pGEM-Vgly y se uso para sustituir el mismo fragmento en VCR-DH-VE2-120.
25 Se obtuvo una glucoprotema de SIN con el fenotipo DC+ humano a partir de un plasmido E3ndl160/dlR-RV auxiliar defectuoso, modificado de Gardner y col., (2000, ibid) (PCT WO 01/81609). El plasmido E3ndl160/dlRRV se digirio con Xhol, se trato con un fragmento Klenow para hacer romos los extremos, despues se digirio con NotI. El fragmento de 3 kb se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y se unio a VCR-DH que se habfa digerido previamente con BbvCI, se habfa tratado con fragmento Klenow, se habfa digerido con NotI y se habfa 30 tratado con fosfatasa alcalina. Un clon positivo para la insercion se denomino VCR-DH Sglydl160. De forma similar,
se construyo una construccion de auxiliar defectuoso que contema las glucoprotemas de la envoltura derivadas de la cepa LP del SIN (Gardner y col. 2000, ibid).
Construccion de VCR-DH-Vcap, VCR-DH-Scap y tDH-Vcap
El gen de la capside de VEE se sintetizo usando oligonucleotidos de solapamiento, tambien denominados 35 basandose en la secuencia de GENBANK publicada de la cepa de burro Trinidad del VEE, con la adicion de un sitio
XhoI y una secuencia consenso de Kozak adyacente al ATG de la capside y un sitio NotI en el extremo 3'. Los oligonucleotidos se mezclaron y se usaron para una reaccion de amplificacion por PCR de 25 ciclos. El fragmento generado por PCR se digirio con los sitios de restriccion XhoI y NotI, se purifico en gel y se clono dentro del vector pBS-SK+. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion. Finalmente, la secuencia de 40 la capside se modifico adicionalmente para insertar un codon de terminacion en su extremo 3' mediante amplificacion por PCR en una reaccion de 25 ciclos con los siguientes oligonucleotidos.
- TRDCtR
- 5-atatatatgcggccgcttaccattgctcgcagttctccg-3' (SEQ ID NO 17) contiene el codon de terminacion en fase con el ultimo aminoacido de la capside
- TRDCtF
- 5'gagatgtcatcgggcacgcatgtgtggtcggagggaagttattc-3' (SEQ ID NO 18)
El producto se purifico con el kit de purificacion para PCR QIAquick, se digirio con Xhol y NotI y se unio a la estructura principal del vector tDH que se habfa preparado previamente mediante digestion con XhoI y NotI, 45 purificacion con gel y tratamiento con fosfatasa alcalina. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion y la construccion se denomino tDH-Vcap.
El mismo producto de PCR tambien se digirio con XhoI, se trato con ADN polimerasa T4 para hacer romo el sitio
XhoI, se digirio con Notl, se purifico con gel y se unio a VCR-DH que se habfa digerido previamente con BbvCI, se ha^a tratado con ADN polimerasa T4 para hacer romo el sitio BbvCI, se habfa digerido con NotI, se ha^a purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion y la construccion se denomino VCR-DH-Vcap.
5 La secuencia de la capside del SIN se obtuvo a partir de un auxiliar defectuoso descrito previamente y el fragmento de 800 pb se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y se unio a VCR-DH que se habfa digerido previamente con BbvCI, se habfa tratado con fragmento Klenow, se habfa digerido con NotI y se habfa tratado con fosfatasa alcalina. Un clon positivo para la insercion se denomino VCR-DH-Scap.
Ejemplo 3
10 Generacion de quimeras de particula de replicon con protema de la capside hforida
En el caso de protemas de la capside hnbrida que usan elementos obtenidos tanto de SIN como de VEE, se construyo una serie de protemas de la capside hnbrida que conteman la porcion amino-terminal (de union a ARN) del SIN y la porcion carboxi-terminal (de interaccion con glucoprotemas) del VEE. Tambien se obtuvieron construcciones con las porciones opuestas. El sitio al que tales porciones se fusionaron vario segun la construccion y fue
15 necesariamente un factor responsable en las diferencias en la longitud global de estas dos protemas de la capside, teniendo la capside de SIN 264 aminoacidos y la capside de VEE 275 aminoacidos. Los sitios de fusion para generar los hnbridos de la capside se indican a continuacion en la tabla, asf como en la Figura 4.
- Nombre de la quimera de la capside
- Extremo NH2 terminal Extremo COOH terminal
- S113V
- SIN(1-113) VEE(125-275)
- S129V
- SIN(1-129) VEE(141-275)
- S127V
- SIN(1-127) VEE(139-275)
- S116V
- SIN(1-116) VEE(128-275)
- S109V
- SIN(1-109) VEE(121-275)
- V141S
- VEE(1-141) SIN(130-264)
Cada una de las construcciones de la capside hnbrida se genero mediante amplificacion por PCR de dos fragmentos de solapamiento, uno codificante del extremo amino terminal de la protema de la capside del SIN o del VEE, y el otro 20 codificante del extremo carboxi-terminal de la protema de la capside del virus opuesto (VEE o SIN, respectivamente).
Los fragmentos que contienen secuencias de la capsides del SIN se amplificaron a partir de una construccion de auxiliar defectuoso (Gardner y col., 2000, ibid) y los fragmentos que contienen secuencias de la capside del VEE se amplificaron a partir de la construccion VCR-DH-Vcap (anterior). Se usaron los siguientes oligonucleotidos:
- Fragmento
- Oligonucleotido 5' Oligonucleotido 3'
- SIN(1-113)
- SINNtF 5' atatatctcgagccaccatgaatag aggattctttaacatg-3' (SEQ IDNO 19) que contema el sitio de restriccion XhoI (nt. 7-13), la secuencia consenso de Kozak para la traduccion optima de la protema (nt. 14-18 y la secuencia complementaria a la capside del SIN (nts. 19-48) S113R 5' gggaacgtcttgtcggcctccaact taagtg-3' (SEQ ID NO 20) con los nt. 1-10 complementarios a la secuencia de la capside del VEE y los nt. 11-31 a la secuencia de la capside del SIN
- SIN( 1-129)
- SINNtF SINNtR 5' gaataacttccctccgaccacacat gcgtgcccgatgacatctc-3' (SEQ ID NO 21) con los nt. 1-24
(continuacion)
- Fragmento
- Oligonucleotido 5' Oligonucleotido 3'
- complementarios a la secuencia de la capside del VEE y los nt. 25-44 a la secuencia de la capside del SIN
- SIN( 1-127)
- SINNtF S127R 5' ccacacaagcgtacccgatgacat ctccgtcttc-3' (SEQ ID NO 22) con los nt. 1-13 complementarios a la secuencia de la capside del VEE y los nt. 14-34 a la secuencia de la capside del SIN
- SIN (1-116)
- SINNtF S116R 5' catgattgggaacaatctgtcggcc tccaac-3' (SEQ ID NO 23) con los nt. 1-9 complementarios a la secuencia de la capside del VEE y los nt. 10-31 a la secuencia de la capside del SIN
- SIN( 1-109)
- SINNtF S109R 5' gtcagactccaacttaagtgccatgcg-3' (SEQ ID NO 54) con los nt. 1-6 complementarios a la secuencia de la capside del VEE y los nt. 7-27 a la secuencia de la capside del SIN.
- SIN(130-264)
- SINCtF 5 ' gggaagataaacggctacgctctg gccatggaaggaaagg-3 ' (SEQ ID NO 25) con los nt. 1-21 complementarios a la secuencia de la capside del VEE y los nt. 22-40 a la secuencia de la capside del SIN SINCtR 5 ' atatatatgcggccgctcaccactc ttctgtcccttc- 3 ' (SEQ ID NO 26) con el sitio de restriccion NotI (nt. 9-16) y los nt. 17-39 complementarios a la secuencia de la capside del SIN.
- VEE(125-275)
- TRD125F 5 ' gccgacaagacgttcccaatcatg ttggaag-3 ' (SEQ ID NO 27) con los nt. 1-9 complementarios a la secuencia de la capside del SIN y los nt. 10-31 a la secuencia de la capside del VEE TRDCtR 5 ' atatatatgcggccgcttaccattg ctcgcagttctccg-3 ' (SEQ ID NO 28) con el sitio de restriccion NotI (nt. 9-16) y los nt. 17-39 complementarios a la capside del VEE
- VEE(141-275)
- TRDCtF 5 ' gagatgtcatcgggcacgcatgtg tggtcggagggaagttattc-3 ' (SEQ ID NO 29) con los nt. 1-20 complementarios a la secuencia de la capside del SIN y los nt. 21-44 a la secuencia de la capside del VEE TRDCtR
- VEE(139-275)
- TRD139F 5'- tcatcgggtacgcttgtgtggtcg-3 ' (SEQ ID NO 30) con los nt. 1-8 complementarios a la secuencia de la capside del SIN y los nt. 9-24 a la secuencia de la capside del VEE TRDCtR
5
10
(continuacion)
- Fragmento
- Oligonucleotido 5' Oligonucleotido 3'
- VEE(128-275)
- TRD128F 5' gacagattgttcccaatcatgttgg aaggg-3' (SEQ ID NO 31) con los nt. 1-11 complementarios a la secuencia de la capside del SIN y los nt. 12-30 a la secuencia de la capside del VEE TRDCtR
- VEE(121-275)
- TRD121F 5' acttaagttggagtctgacaagacg ttcccaatc-3' (SEQ ID NO 32) con los nt. 1-13 complementarios a la secuencia de la capside del SIN y los nts. 14-34 a la secuencia de la capside del VEE TRDCtR
- VEE(1-141
- TRDNtF 5' atatatctcgagccaccatgttccc gttccagccaatg-3' (SEQ ID NO 33) TRDNtR 5'-cctttccttccatggccag agcgtagccgtttatcttccc-3' (SEQ ID NO 34)
- con el sitio de restriccion XhoI (nt. 7-13), la secuencia consenso de Kozak para la traduccion optima de protema (nt. 14-18) y los nts. 19-48 complementarios a la secuencia de la capside del VEE con los nt. 1-19 complementarios a la secuencia de la capside del SIN y los nt. 20-40 a la secuencia de la capside del VEE
Los oligonucleotidos enumerados anteriormente se usaron a una concentracion de 2 jM con 0,1 |jg del molde apropiado de ADN del plasmido en una reaccion de PCR de 30 ciclos, con la polimerasa de Pfu segun lo sugerido por el proveedor y con la adicion de DMSO al 10 %. El protocolo de amplificacion general se ilustra a continuacion.
Temperatura (°C) Tiempo (Min.)N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 10
- 72
- 2
Los fragmentos amplificados se purificaron con gel de agarosa usando un kit de extraccion en gel QIAquick y despues se uso una alfcuota (1/15) de cada fragmento como molde para una segunda amplificacion por PCR. Los dos fragmentos se mezclaron de la siguiente manera y se amplificaron con polimerasa de Vent tal como sugiere el proveedor, con la adicion de DMSO al 10 %:
SIN(1-129)+VEE(141-275)
SIN(1-127)+VEE(139-275)
SIN(1-116)+VEE(128-275)
SIN(1-113)+VEE(125-275)
SIN(1-109)+VEE(121-275)
VEE(1-141)+SIN(130-264)
Se realizo un ciclo de amplificacion por PCR en las siguientes condiciones:
5
10
15
20
25
30
35
- Temperatura (°C)
- Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 42
- 1 1
- 72
- 3
Para las fusiones del extremo NH2 terminal del SIN con el extremo COOH terminal del VEE, los cebadores SINNtF y TRDCtR, que conteman los sitios de restriccion XhoI y Notl, se anadieron a una concentracion de 2 pM y la amplificacion por PCR completa se realizo de la siguiente manera:
- Temperatura (°C)
- Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
El producto de la PCR se purifico usando el kit QIAquick, se digirio con XhoI y Notl, se purifico en gel a partir de gel de agarosa tal como se describe anteriormente, y se unio al plasmido tDH que tambien se hada digerido con XhoI y NotI para eliminar la insercion del gen de la capside existente. Los clones que contemanlas inserciones dbridas recien generadas se verificaron mediante secuenciacion y las nuevas construcciones de auxiliar defectuoso para su uso en la produccion de partmulas quimericas se denominaron tDHS129Vcap, tDHS127Vcap, tDHS116Vcap, tDHS113Vcap y tDHS109Vcap.
De forma similar, para las fusiones del extremo NH2 terminal del VEE con el extremo COOH terminal del SIN, los cebadores TRDRNtF y SINCtR, que conteman los sitios de restriccion XhoI y NotI, se anadieron a una concentracion de 2 pM. La amplificacion por PCR se realizo usando las mismas condiciones que anteriormente. Despues, este fragmento de la PCR se digirio con Xhol, se hicieron romos sus extremos, se digirio con NotI y se unio al plasmido VCR-DH-Vcap que se hada digerido con BbvCI, y se hadan vuelto romos sus extremos con NotI. Los clones que conteman las inserciones se verificaron mediante secuenciacion y la nueva construccion de auxiliar defectuoso se denomino VCR-DH-S129Vcap.
Despues, se analizo la eficacia de las quimeras de la capside en cuanto al empaquetamiento del replicon con el vector replicon de alfavirus apropiado y el auxiliar defectuoso de la glucoprotema. Espedficamente, las quimeras con el extremo NH2 terminal derivado del SIN y el extremo COOH terminal derivado del VEE se analizaron en cuanto a su capacidad para empaquetar replicones de SIN con glucoprotemas de VEE. Esto se realizo de la siguiente manera. El AdN del plasmido que codifica las quimeras (tDHS129Vcap, tDHS127Vcap, tDHS116Vcap, tDHS113Vcap y tDHS109Vcap) se linealizo con el unico sitio de restriccion PmeI y se uso para la transcripcion in vitro tal como se describe previamente (Polo y col., 1999, ibid). Cada transcrito se contransfecto mediante electroporacion en celulas BHK junto con el ARN auxiliar que expresa las glucoprotemas del VEE y el ARN replicon del SIN que expresa GFP, tal como se describe previamente (Polo y col., 1999, ibid). Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. La enumeracion de las celulas positivas en GFP permitio la cuantificacion de partmulas de vector de entrada y la reserva de partmulas de vector. Los siguientes datos indican que la eficacia de empaquetamiento para una partmula quimerica de SIN/VEE se puede aumentar de manera bastante drastica, particularmente con la protema de la capside dbrida S 113V.
5
10
15
20
25
30
35
- Capside
- Glucoprotema Replicon Tttulo de partmulas
- S129V
- VEE SIN 4e5 UI/ml
- S127V
- VEE SIN 2e4 UI/ml
- S116V
- VEE SIN 1,6e6 UI/ml
- S113V
- VEE SIN 1,1 e7 UI/ml
De forma similar, cada transcrito de quimera se cotransfecto mediante electroporacion en celulas BHK junto con 1) ARN auxiliar que expresa las glucoprotemas con la mutacion atenuante E2-120 de tDHVE2-120 y 2) ARN replicon del SIN que expresa GFP. Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. La enumeracion de las celulas positivas en GFP permitio la cuantificacion de partmulas de vector de entrada y la determinacion del tttulo para la reserva de partmulas de vector replicon. Los siguientes datos confirman que la capside tnbrida puede aumentar de manera espectacular la eficacia de empaquetamiento del replicon del SlN en partmulas que contienen glucoprotemas del VEE.
- Capside
- Glucoprotema Replicon Tttulo de partmulas
- S129V
- VE2-120 SIN 1,6e7 UI/ml
- S127V
- VE2-120 SIN 5,1e5 UI/ml
- S116V
- VE2-120 SIN 4,7e7 UI/ml
- S113V
- VE2-120 SIN 9,3e7 UI/ml
- S
- VE2-120 SIN 1e2 UI/ml
Experimentos similares con el ARN de VCR-GFP, cotransfectado con ARN auxiliares que codifican la capside tnbrida S129Vcap y las glucoprotemas del SIN, produjeron partmulas con tftulos promedio de 1,6e7 Ul/ml lo que demostro la capacidad de esta protema tnbrida para empaquetar ARN de vector derivado del VEE de manera eficaz.
Para maximizar adicionalmente las interacciones del ARN con la capside y de glucoprotemas con la capside, se creo una construccion adicional, en la que el gen de la protema de la capside tnbrida S113V se incorporo en el genoma de un alfavirus quimerico, que comprende el extremo 5', el extremo 3', el promotor subgenomico y los genes de protema no estructural del SIN y los genes de glucoprotema del VEE.
Para generar tal construccion, un ADNc de la longitud del genoma inicial del SIN del que se puede transcribir ARN infeccioso in vitro se genero mediante ensamblaje del replicon y secuencias de gen estructural de la variante del SIN tropica de celula dendntica humana descrita previamente, SINDCchiron (ATCC n.° VR-2643, registrado el 13 de abril de 1999). Los clones de ADN usados que abarcan todo el genoma del virus SINDCchiron (Gardner y col., ibid; WO 00/61772) se ensamblaron usando tecnicas convencionales de biologfa molecular y procedimientos ampliamente conocidos por aquellos expertos en la materia (Rice y col., J. Virol., 61:3809-3819, 1987; y la Patente de Estados Unidos 6015694). El clon genomico del SIN se denomino SINDCSP6gen.
Posteriormente, las protemas estructurales del SIN existentes se sustituyeron con la capside tnbrida S129Vcapsid y las glucoprotemas del VEE de la siguiente manera. Se genero un fragmento de tDH-S129V que contiene parte de la capside tnbrida mediante amplificacion por PCR con los siguientes oligonucleotidos: atatatatggtcactagtgaccattgctcgcagttctccg (SEQ ID NO 54)
ScAatIIF
gccgacagatcgttcgacgtc (SEQ ID NO 55)
Los oligonucleotidos se usaron a una concentracion de 2 jM con 0,1 |jg de molde de ADN del plasmido apropiado en una reaccion de PCR de 30 ciclos, con la polimerasa de Pfu segun lo sugerido por el proveedor y con la adicion de DMSO al 10 %. El protocolo de amplificacion general se ilustra a continuacion.
5
10
15
20
25
30
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
El fragmento de PCR se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick. Se obtuvo otro fragmento que contema el fragmento de glucoprotema del VEE a partir de tDHVE2-120 mediante digestion con SpeI y PmeI y purificacion en gel. Los dos fragmentos se mezclaron y se unieron a un fragmento de 11 kb obtenido a partir del clon de SINDCSP6gen mediante digestion con SpeI y PmeI, purificacion en gel y tratamiento con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para las inserciones se confirmaron mediante secuenciacion y este intermedio se denomino SrS129VcVg-interm. Para restaurar el extremo 3' autentico en el clon genomico, se regenero el fragmento PsiI-PsiI mediante PCR con los siguientes oligonucleotidos
PsiIFdlN
5'ATATATATTTATAATTGGCTTGGTGCTGGCTACTATTGTGGCCATGTACGTGCTGACCAACCAGAAACATAATTG ACCGCTACGCCCCAATGATCC-3'(SEQ.ID. NO. 53)
PsiR
5'-GGCCGAAATCGGCAAAATCCC-3'(SEQ. ID. NO. 54)
a una concentracion de 2 pM con 0,1 pg de ADN de plasmido de clon infeccioso en una reaccion de PCR de 30 ciclos, con polimerasa de Vent tal como sugiere el proveedor y con adicion de DMSO al 10 %. El protocolo de amplificacion general se ilustra a continuacion.
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
El fragmento se digirio con PsiI, se purifico en gel y se unio a SrS129VcVg-interm que tambien se habfa digerido con PsiI, se ha^a purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para la insercion se confirmaron mediante secuenciacion y la construccion final se denomino SrS129VcVg.
Para construir un clon de ADNc de longitud completa similar que contenga la capside hnbrida S113V, se genero un fragmento que contema parte de las secuencias del SIN aguas arriba del gen de la capside y del gen que codifica los aa 1-113 usando los siguientes oligonucleotidos
Sic7082F
5'-CACAGTTTTGAATGTTCGTTATCGC-3'(SEQ. ID. NO. 55)
S113R (vease lo anterior)
a una concentracion de 2 pM con 0,1 pg de la construccion SINDCSP6gen en una reaccion de PCR de 30 ciclos, con la polimerasa de Pfu segun lo sugerido por el proveedor y con la adicion de DMSO al 10%. El protocolo de amplificacion general se ilustra a continuacion.
5
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25
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
El fragmento se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y 1/10 de la reaccion se mezclo con el fragmento VE(141-275) (vease lo anterior, la construccion de todos los genes de capside Idbrida). Se realizo un ciclo de amplificacion por PCR en las siguientes condiciones:
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de
ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 42
- 1 1
- 72
- 3
Despues se anadieron los oligonucleotidos Sic7082F y TRDCtR a una concentracion de 2 pM y la amplificacion por PCR completa se realizo de la siguiente manera:
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
El producto de la PCR se purifico usando el kit QIAquick, se digirio con BstZ17I y SapI, se purifico en gel a partir de gel de agarosa tal como se describe anteriormente y se unio a dos fragmentos generados a partir del plasmido SrS129VcVg que tambien se hadan digerido con BstZ17I y SapI para eliminar la insercion de gen de la capside existente. Los clones que conteman las inserciones dbridas recien generadas se verificaron mediante secuenciacion y la nueva construccion se denomino SIN113CVgly.
Para generar virus, la construccion SIN113CVgly se linealizo con PmeI, se transcribio in vitro usando polimerasa de SP6 y el ARN se transfecto en celulas BHK. La progenie del virus se recogio y se realizaron pases en celulas, aumentando el tftulo infeccioso a niveles que alcanzaron 109 UFP/ml. Una reserva purificada sin placa de este virus SIN quimerico, denominado virus SIN113Cvgly (depositado el 31 de mayo de 2001 en la ATCC, PTA-3417), se uso despues como la fuente de ARN para la clonacion y la secuenciacion mediante tecnicas convencionales de biologfa molecular (por ejemplo, las descritas anteriormente) para identificar determinantes geneticos adicionales que proporcionan este alto nivel de empaquetamiento de partfculas quimericas. Los determinantes geneticos individuales se vuelven a incorporar facilmente en las construcciones de empaquetamiento de replicon y auxiliar defectuoso usando las ensenanzas proporcionadas en el presente documento.
Se entiende que la reserva purificada sin placa de virus SIN quimerico depositada con numero ATCC puede contener numerosos genotipos y fenotipos no desvelados de manera espedfica en el presente documento. Los expertos en la materia podnan aislar facilmente fenotipos y o genotipos individuales usando tecnicas de purificacion de placa y secuenciar el SIN quimerico aislado usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia y desvelados en el presente documento.
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35
Ejemplo 4
Generacion de quimeras de particula de replicon de alfavirus con glucoprotemas hibridas
En el caso de una glucoprotema de la envoltura tnbrida que usa elementos obtenidos tanto del SIN como del VEE, se construyeron glucoprotemas E2 tnbridas que conteman la cola citoplasmatica (por ejemplo, porcion de union a la capside) del SIN y las porciones transmembrana y ectodominio del VEE. Tambien se pueden obtener construcciones adicionales con las porciones opuestas. En algunas realizaciones, tambien puede ser deseable incluir tnbridos tanto de glucoprotemas E2 como de El e incluir tnbridos que abarcan el dominio transmembrana.
Para demostrar un aumento de la eficacia de empaquetamiento de partmulas quimericas usando tales tnbridos de glucoprotema, se construyo una glucoprotema modificada derivada de VEE en la que la cola de E2 se sustituyo con la cola citoplasmatica de E2 derivada del SIN. La fusion se realizo en el resto de cistema conservado (el resto de aminoacido 390, en la E2 tanto del VEE como del SIN) que esta en el lfmite entre el dominio transmembrana y la cola citoplasmatica (Figura 5). La construccion de quimera se genero mediante amplificacion por PCR de dos fragmentos de solapamiento, uno de los cuales inclrna parte de la secuencia de glucoprotema E2 del VEE aguas arriba de la cola citoplasmatica y parte de la cola citoplasmatica de E2 del SIN. El segundo fragmento inclrna parte de la cola citoplasmatica de E2 del SIN y protema 6K del VEE.
El primer fragmento se amplifico a partir de la construccion VCR-DH-Vgly usando los siguientes oligonucleotidos:
VE2F: 5'-atatatcaggggactccatcaccatgg-3' (SEQ ID NO 35) (los nts 7-27 son complementarios a la glucoprotema del VEE e incluyen el sitio NcoI)
VSGE2R: 5'-gggattacggcgtttggggccagggcgtatggcgtcaggcactcacggcgcgcttt gcaaaacagccaggtagacgc-3 ' (SEQ ID NO 36)
(los nts 1-56 son la secuencia de cola citoplasmatica de E2 del SIN, y los nts. 57-77 son complementarios a la secuencia de la glucoprotema del VEE)
El segundo fragmento se amplifico a partir del mismo plasmido, usando los siguientes cebadores:
VSGE3F:
5'gccccaaacgccgtaatcccaacttcgctggcactcttgtgctgcgttaggtcggccaatgctgagaccacctgggagtcctt g-3' (SEQ ID NO 37)
(los nts. 1-63 se corresponden con parte de la secuencia de cola citoplasmatica de E2 del SIN y los nts 64-84 son complementarios a las glucoprotemas del VEE)
VEE3'-1R: 5'-ccaatcgccgcgagttctatgtaagcagcttgccaattgctgctgtatgc-3' (SEQ ID NO 38) (complementario a VCR- DH Vgly aguas abajo de la fase de lectura abierta de la glucoprotema)
Los oligonucleotidos enumerados anteriormente se usaron a una concentracion de 2 jM con 0,1 |jg de molde de ADN del plasmido VCR-DH-Vgly en una reaccion de PCR de 30 ciclos con polimerasa de Pfu tal como sugiere el proveedor, con la adicion de DMSO 10 %. El protocolo de amplificacion se muestra a continuacion.
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
Los dos fragmentos amplificados se purificaron a partir de gel de agarosa usando el kit de extraccion en gel de QIAquick y despues se uso una almuota (1/10) de cada fragmento como moldes para una segunda amplificacion por PCR. Los dos fragmentos se mezclaron con polimerasa de Pfu tal como sugiere el proveedor con la adicion de DMSO al 10 %. Se realizo un ciclo de amplificacion por PCR:
5
10
15
20
25
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
- 42
- 1 1
- 72
- 3
Despues se anadieron los cebadores VE2NtF y VEE3'-1R a concentracion 2 pM u la amplificacion por PCR se realizo de la siguiente manera:
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de ciclos
- 94
- 2 1
- 0,5
- 60
- 0,5 30
- 72
- 2
El producto de la PCR se purifico usando el kit QIAquick, se digirio con NcoI y Notl, se purifico con gel a partir de gel de agarosa tal como se describe anteriormente y se unio al plasmido tDH-Vgly que tambien se habfa digerido con NcoI y Notl y se habfa purificado a partir de gel de agarosa. Los clones que contienen las inserciones se verificaron mediante secuenciacion y la construccion se denomino tDH-VglySE2tail.
Para demostrar el mayor empaquetamiento de partmulas generado con tal quimera de glucoprotema, el plasmido de ADN tDH-VglySE2tail se linealizo con la unica enzima de restriccion Pmel y ARN transcrito in vitro. El ARN se cotransfecto junto con ARN replicon de SINCR-GFP y el ARN auxiliar defectuoso que codifica protema de la capside del SIN. Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogio el sobrenadante del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. Los tftulos de las partmulas se determinaron usando analisis de citometna de flujo y dieron 2e3 Ul/ml. Este resultado demuestra que se estan produciendo alguna interaccion de baja eficacia entre la quimera de la glucoprotema y la capside del SIN.
Para aumentar adicionalmente la eficacia de empaquetamiento de partmulas quimericas con una glucoprotema tnbrida, se generaron construcciones adicionales. Los alineamientos de las colas citoplasmaticas del VEE y del SIN (Figura 5) muestran diferencias en 10 restos, cuatro de los cuales son cambios conservativos. De manera interesante, los restos en las posiciones 394 y 395 estan cargados en la glucoprotema del SIN, mientras que son hidrofobos en el VEE. Tal diferencia puede afectar a la funcionalidad de E2. Se uso mutagenesis dirigida que utiliza un procedimiento de amplificacion por PCR para cambiar los dos restos en la construccion tDH-VglySE2tail de la siguiente manera:
- Nombre
- Cambio de nucleotido Cambio de aminoacido Oligos mutagenicos
- tDH-M1 (SEQ ID NO 39)
- A2151 por C Glu359 por Ala M1R 5'GTATGGCGTCA GGCACGCACGGC GCGCTTTG-3' (SEQ ID NO 39) M1F 5' AGCGCGCCGT GCGTGCCTGACG CCATACGCC-3' (SEQ ID NO 40)
5
10
15
20
25
(continuacion)
- Nombre
- Cambio de nucleotido Cambio de aminoacido Oligos mutagenicos
- tDH-M2 (SEQ ID NO 40)
- C2147 por G y G2148 por T Arg394 por Val M2R 5' ATGGCGTCAG GCACTCAACGCG CGCTTT GC AAAA C-3' (SEQ IDNO 41) M2F
- 5 TTTGC AAAGCG CGCGTTGAGTGC CTGACGCCATAC -3' (SEQ IDNO 42)
- tDH-M3
- A2151 por C, C2147 por G, y G2148 por T Arg394-GLU395 por Val- Ala M3R 5' ATGGCGTCAG GCACGCAACGCG CGCTTT GC AAAA C-3' (SEQ IDNO 43) M3F 5 'TTTGC AAAGCG CGCGTTGCGTGC CTGACGCCATAC -3' (SEQ IDNO 44)
Las construcciones en las que se realizo mutagenesis se verificaron mediante secuenciacion. Para cuantificar el empaquetamiento mediante estos nuevos Imbridos de glucoprotema, los ADN del plasmido se linealizaron con la unica enzima de restriccion Pmel y se transcribieron in vitro. Despues, cada ARN mutante se cotransfecto junto con el ARN replicon de SINCR-GFP y ARN auxiliar defectuoso que codifica la capside del SIN. Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogio el sobrenadante del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas para el analisis de tttulo. Los tttulos de las partfculas se determinaron usando analisis de citometna de flujo y se observo que la eficacia de empaquetamiento aumento aproximadamente 7 veces con M1.
Como alternativa, y de manera similar al enfoque de la capside, fue posible sustituir la quimera de la cola del SIN VEEglyco-E2 en un clon de ADNc de alfavirus de longitud completa a partir del cual se puede obtener el virus infeccioso, y usar el genoma del virus quimerico para seleccionar de manera natural las variantes de partfcula quimerica que surgen con una elevada eficacia de empaquetamiento adicional. Un fenotipo de placa de gran tamano puede ser indicativo de virus de alto tttulo. Esta quimera infecciosa se construyo de la siguiente manera. Mediante PCR, se genero un fragmento que contema principalmente la secuencia de la capside del SIN para tener algunos nucleotidos anadidos a su extremo 3' que se corresponde con la secuencia de glucoprotema del VEE y que contema el sitio de restriccion de SpeI. Este fragmento se amplifico a partir de una construccion de clon infeccioso del SIN tropico del DC humano (Gardner y col., ibid) con los siguientes cebadores:
ScAatIIF: 5'-gccgacagatcgttcgacgtc-3' (SEQ ID NO 45)
ScVglR: 5'-atatatatggtcactagtgaccactcttctgtcccttccg-3' (SEQ ID NO 46)
Estos oligonucleotidos se usaron a una concentracion de 2 jM con 0,1 |jg de molde de ADN del plasmido en una reaccion de PCR de 30 ciclos con polimerasa de Pfu tal como sugiere el proveedor con la adicion de DMSO al 10 %. El protocolo de amplificacion se muestra a continuacion.
Temperatura (°C) Tiempo (Min.) N.° de
ciclos
- 94
- 2 1
- 94
- 0,5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(continuacion)
-r- . N.° de
Temperatura (°C) iempo ( In) ciclos
60 0,5 30
72 2
El fragmento amplificado (450 pb) se aclaro usando el kit de purificacion por PCR QIAquick, se digirio con AatII y SpeI, se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick. Se genero un fragmento (3,4 kb) que contiene la cola de E2 de la glucoprotema del SIN del VEE y la UTR 3' del SIN mediante digestion por restriccion de tDH- VE2Stail usando las enzimas SpeI-PmeI y purificacion en gel con el kit de extraccion en gel QIAquick. Este fragmento y el fragmento de la pCr se mezclaron y se unieron junto con ADN del plasmido del clon infeccioso que tambien se habfa digerido con AatII y PmeI, se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron y se habfa purificado en gel. Los clones positivos para la insercion se verificaron mediante secuenciacion. Finalmente, para restaurar el extremo 3' del clon de longitud completa autentico, se regenero el fragmento PsiI-PsiI tal como se describe para SrS129VcVg y la nueva construccion se denomino SrcVgSE2t.
SrcVgSE2t se linealizo con la unica enzima de restriccion PmeI y se transcribio in vitro. El ARN se transfecto en celulas BHK. Las celulas transfectadas se incubaron a 37°C durante 24 horas, momento en el cual se recogio el sobrenadante del cultivo, se aclaro mediante centrifugacion y se uso para infectar celulas BHK-21 sin tratar. Aproximadamente 24 horas despues de la infeccion se recogio el sobrenadante, se aclaro mediante centrifugacion y se uso para infectar de nuevo celulas BHK-21 sin tratar. A las 24 horas despues de la infeccion se observaron algunas placas de virus, de manera que se recogio el sobrenadante, se aclaro y se uso para infectar dos matraces de BHK sin tratar. Las celulas de un matraz se recogieron 16 horas despues de la infeccion y el ARN total se extrajo usando Trizol (Gibco-BRL). Se permitio que continuase la infeccion n el otro matraz durante otras 8 horas y se observaron efectos citopaticos importantes en las celulas que indicaron que se habfan producido grandes cantidades de virus.
El ARN total extrafdo de las celulas infectadas se uso para amplificar y clonar las secuencias de la capside y de glucoprotema usando RT-PCR. La transcripcion inversa se cebo con poli(dT) o con el cebador espedfico VglyR: 5'-atatatatgcggccgctcaattatgtttctggttggtcag-3' (SEQ ID NO 47) El ADNc se uso despues para la amplificacion por PCR de la secuencia de la capside con los cebadores SINNtF, que contiene un sitio XhoI, y SINctR, que contiene un sitio NotI, y de la secuencia de la glucoprotema con los cebadores VglyR que contienen un sitio NotI y VglyF: 5'-atatatctcgagccgccagccatgtcactagtgaccac-3' (SEQ ID NO 48) que contiene un sitio XhoI. Ambos fragmentos se aclararon usando un kit de purificacion por PCR QIAquick, se digirieron con XhoI y NotI, se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y se unio independientemente a tDH que previamente se habfa digerido con Xhol y NotI, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Se secuenciaron diez clones para el fragmento de la capside para identificar la(s) posible(s) mutacion(es) adaptativa(s). Sin embargo, no se descubrieron mutaciones en la region de la capside que indicasen que tales mutaciones solo se dan en las secuencias de glucoprotema o que, dado que el aRn procedfa de placas sin purificar, los 10 clones no representaron de manera completa toda la poblacion adaptada.
La repeticion del mismo analisis en ARN derivado de 5 placas vmcas individuales aun no condujo a la identificacion de mutaciones adaptativas de la capside. La secuencia de la glucoprotema de una placa (P3) revelo la presencia de dos cambios de aminoacidos en las posiciones 380 (Val por Gly) y 391 (Lys por Arg). De manera interesante, el aminoacido 380 se conserva entre el Sindbis y al menos tres cepas del VEE (TRD, MAC10 y 6119) y el aminoacido 391, que es el primer resto de la cola citoplasmatica, es una Lys en las secuencias de glucoprotema del SIN y MAC 10 y 6119 pero es una Arg en la cepa tRd. Esto podna indicar que la localizacion de estos restos desempena un papel en la correcta conformacion de la transmembrana-cola citoplasmatica, que podna estabilizar las interacciones entre las glucoprotemas y la capside y se podna aprovechar adicionalmente.
Para analizar si esta doble mutacion podna aumentar la eficacia del empaquetamiento, se intercambio un fragmento de 998 pb (NcoI-MfeI) que contiene ambas mutaciones en tDH-VglySE2tail, generando tDH-VglySE2tail-P3. Despues, el ADN del plasmido tDH-VglySE2tail-P3 se linealizo con la unica enzima de restriccion PmeI y ARN transcrito in vitro. El aRn se cotransfecto junto con el ARN replicon de SINCR-GFP y ARN auxiliar defectuoso que codifica la protema de la capside del SIN. Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogio el sobrenadante del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. Los tftulos de las partmulas se determinaron usando analisis de citometna de flujo y la eficacia de empaquetamiento aumento 50 veces con respecto a VglySE2tail. Tambien, en el contexto de una glucoprotema del vEe Idbrida que contiene SE2tail y la mutacion atenuante E2-120 del VEE (VE2-120/SE2tail), las mutaciones P3 aumentaron la eficacia de empaquetamiento 200 veces.
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Ejemplo 5
Generacion de quimeras de particula de replicon de alfavirus con senal de empaquetamiento hibrida
Para generar un sistema de empaquetamiento altamente eficaz para un replicon del VE en las protemas estructurales del virus Sindbis, la senal de empaquetamiento de ARN bien definida del SIN se inserto en diversos puntos en un replicon del VEE. Para esta tarea, la senal de empaquetamiento del nucleo de 132 nucleotidos (nt.) del SIN se inserto independientemente en cada uno de los tres sitios diferentes (Figura 6) en el replicon VEE-TRD construido en el Ejemplo 1. Se generaron cuatro replicones quimericos. Chimera-IA y Chimera-IB fueron los nombres dados a las construcciones en las que se inserto la senal de empaquetamiento del SIN en el extremo 3' del gen de la nsP4 de VEE-TRD, justo antes del codon de terminacion de nsP4. El replicon de Chimera-2 contiene la senal de empaquetamiento del SIN en fase, en el extremo C-terminal de nsP3, sustituyendo al nivel de nucleotido por un segmento de 102 pb de nsP3. Finalmente, el replicon de Chimera-3 resulta de la insercion de la senal de empaquetamiento del SIN al final de nsP3, justo antes del codon de terminacion de nsP3.
Los inventores tambien contemplan que las ensenanzas del presente documento pueden proporcionar una oportunidad unica para modificar replicones y sistemas eucariotas de iniciacion de vectores en capas derivados de cualquier alfavirus de NBS-3 (por ejemplo, vEe), de manera que se puedan tratar como construcciones de NBS-2 o NBS-1 reduciendo la secuencia de nucleotidos derivada del virus parental a menos de dos tercios de la longitud del genoma.
A) Chimera-IA, 1B:
Un factor complicado para la construccion de estas quimeras se basa en el hecho de que el promotor subgenomico de todos los alfavirus se solapa con aproximadamente los ultimos 100 nucleotidos de nsP4. Para colocar la senal de empaquetamiento del SIN al final de la nsP4 mientras se mantiene un promotor subgenomico funcional en el vector replicon para dirigir la expresion del gen heterologo, fue necesario alterar el uso de codones de los ultimos 80 nt. de la nsP4 (aguas arriba de la secuencia del SIN insertada) para eliminar su capacidad de unirse al complejo replicasa. Al mismo tiempo, la region del promotor subgenomico del VEE se reconstituyo aguas abajo del codon de terminacion de nsP4 duplicando la secuencia natural de una porcion del extremo 3' de nsP4 pensada para ser parte de la secuencia de reconocimiento del promotor subgenomico. Chimera-1A y 1B se diferencian en la longitud de la secuencia de nsP4 reconstituida que se volvio a anadir para generar un promotor subgenomico funcional: hasta -80 para CHIMERA-1A (Figura 7), hasta -98 para CHIMERA-1B (Figura 8).
Chimera-1A y 1B se prepararon mediante la escision de pVCR-DH, una construccion intermedia de la fase de reensamblaje de la construccion pVCR descrita (anteriormente), con MscI y ^scI. En este vector se insertaron cualquiera de los dos oligonucleotidos sinteticos tripartitos que codifican, tal como se describe anteriormente, aproximadamente los ultimos 80 pb de nsP4 con el uso de codones no naturales, seguido de la senal de empaquetamiento del SIN (en fase) y el codon de terminacion de nsP4, seguido de los 80 o 98 pb terminales duplicados de la secuencia natural de la nsP4. Los oligonucleotidos se disenaron para proporcionar cadenas duplex completas sinteticas que se trataron de la misma manera que la descrita anteriormente para la smtesis de replicon. Los clones de esta union verificados mediante secuenciacion se digirieron con MscI y ^scI, y el fragmento de oligo que lleva la senal de empaquetamiento del SIN se sustituyo en el fragmento del vector de pVCR, digerido de manera similar. Las construcciones finales resultantes de cada uno se denominaron pVCR/CHIMERA-1A y pVCR/CHIMERA- 1B. Para evaluar la funcionalidad de estas construcciones, el gen de GFP se clono en cada una usando los unicos sitios BbvCI y NotI aguas abajo del promotor subgenomico y las construcciones se denominaron VCR-Chim1A-GFP y VCR-Chim1B-GFP, respectivamente.
B) Chimera 2:
Chimera-2 se preparo mediante escision del ensamblaje intermedio del replicon del VEE, pCMVkm2-(del XhoI/CelII)- VEE 9/10, del ejemplo 1, que codificauna porcion de nsP3 y nsP4 del VEE unida mediante los sitios MamI y BlnI del replicon. La escision de XhoI de este vector elimina un segmento de 102 pb de la nsP3 del VEE. En este vector escindido se inserto un producto de PCR que consiste en la senal de empaquetamiento flanquedada por los sitios XhoI terminales, en fase (Figura 9). El molde para esta amplificacion fue pSINCP y la ADN polimerasa de Pfu se uso con los siguientes cebadores de oligonucleotidos.
5' Pr: 5'-ATATCTCGAGAGGGATCACGGGAGAAAC-3' (SEQ ID NO 49)
3' Pr: 5'-AGAGGAGCTCAAATACCACCGGCCCTAC-3' (SEQ ID NO 50)
Los clones resultantes se validaroncon respecto a su secuencia yorientacion. Un clon positivo se digirio con MamI- BlnI para generar un fragmento usado para sustituir el segmento MamI-BInI de pVCR. El plasmido resultante se denomino pVCR/CHIMERA-2. El gen GFP se clono en este vector tal como se describe anteriormente para pVCR/CHIMERA-1A, -1B, generando VCR-Chim2-GFP. Se debena apreciar que la region de delecion en la nsP3 se selecciono basandose en sitios de endonucleasa de restriccion convenientes en la construccion de ADN del plasmido. En la presente invencion tambien se contemplandeleciones que eliminan regiones mas largas de la nsP3ty un experto en la materia puede realizar facilmente dichas deleciones.
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C) Chimera-3:
Chimera-3 se preparo mediante modificacion de un fragmento de replicon del ejemplo 1, pCR2-9057b, que contema una porcion de fragmentos 9 + 10 de replicon, que codifica la region de la union de la nsP3 y la nsP4 del VEE. La insercion del sitio de empaquetamiento del SIN se realizo mediante PCR de solapamiento usando ADN polimerasa de Pfu y dos conjuntos de cebadores que amplificaron dos productos a traves de la union en pCR2-9057b y que anadieron las colas de la secuencia de senal de empaquetamiento del SIN a los productos resultantes. De manera similar, la senal de empaquetamiento del SIN se amplifico a partir de pSINCP con cebadores que anadieron las colas de secuencia de nsP3 y nsP4, respectivamente, a los extremos 5' y 3' del producto. Veanse las Figuras 10 y 11 para el detalle de esta estrategia que incluye secuencias de cebador. Los tres productos de PCR se diluyeron, se mezclaron, se desnaturalizaron, se volvieron a aparear y se extendieron con ADN polimerasa de Pfu para crear un molde de solapamiento quimerico para la amplificacion utilizando los cebadores externos 5' y 3' de nsP3 y nsP4. Este producto se digirio con Xbal y MIuI y se clono en un vector de clonacion intermedio digerido de manera similar, pCMVkm2 (zur Megede, J. Virol. 74:2628, 2000). Para colocar la quimera en el contexto de pVCR, el intermedio pCMVkm2/CHIMERA-3 se digirio con MamI (5') y SacI (3') y se co-unio con un fragmento SacI -Blnl de pVCR (nt. 5620-6016 de pVCR) en el fragmento del vector MamI/BInI de pVCR. La construccion resultante se denomino pVCR/CHIMERA-3. El gen GFP se clono en este vector tal como se describe anteriormente para pVCR/CHIMERA- 1A, -1B, generando VCR-Chim3-GFP.
Para analizar la capacidad de estas construcciones para empaquetarse mediante protemas estructurales del Sindbis, los plasmidos VCD-Chim1A-GFP, VCR-Chimib-GFP, VCR-Chim2-GFP y VCR-Chim3-GFP se linealizaron con la unica enzima de restriccion PmeI y ARN transcrito in vitro. El ARN se cotransfecto junto con ARN auxiliares defectuosos que codifican la capside y las glucoprotemas del SIN de las construcciones VCR-DH-Sglydl160 y VCR- DH-Scap tambien linealizadas con PmeI. Las celulas transfectadas se incubaron a 34°C durante 24 horas, momento en el cual se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. Los tttulos de las partmulas se determinaron usando analisis de citometna de flujo. Los siguientes resultados muestran que tres quimeras se pueden empaquetar de manera eficaz mediante las protemas estructurales del SIN. Chimera 1A no expreso GFP y no se determino si esto se debfa a un defecto en la transcripcion subgenomica o en la replicacion de ARN.
- Replicon
- Protemas estructurales Tftulos
- VCR-Chimera1A
- SIN 0
- VCR-Chimera1B
- SIN 3,8E7 UI/ml
- VCR- Chimera 2
- SIN 9,6E7 UI/ml
- VCR-Chimera1A
- SIN 3E7 UI/ml
Construccion de Chimera 2.1
Para reducir adicionalmente la cantidad de secuencia de virus VEE parental presente en el replicon pVCR-Chimera2, la secuencia NTR 3' (tambien conocida como secuencia 3’ requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural o UTR 3’) del VEE se elimino por completo y se sustituyo por la NTR 3' del SIN. El plasmido SINCR-GFP (Garner y col., 2000 ) se digirio con NotI y PmeI, el fragmento de 466 pb se purifico en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick y se unio tanto a pVCR-Chimera2 como a VCR-Chim2-GFP que se habfa digerido anteriormente con NotI y PmeI, se habfa purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos se verificaron y las construcciones se denominaron VCR-Chim2.1 y VCR-Chim2.1-GFP. Estas construcciones ahora se diferencian del genoma del virus VEE parental por la delecion de multiples secuencias del VEE (por ejemplo, region de nsP3, genes de proteina estructural, NTR 3').
Para analizar la funcionalidad de la nueva configuracion del vector replicon quimerico, el plasmido VCR-Chim2.1- GFP se linealizo con la unica enzima de restriccion PmeI y ARN transcrito in vitro. El ARN se cotransfecto junto con ARN auxiliares defectuosos que codifican la capside y las glucoprotemas del SIN de las construcciones VCR-DH- Sglydl160 y VCR-DH-Scap tambien linealizadas con PmeI. Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. Los tttulos de las partmulas se determinaron usando analisis de citometna de flujo y fueron los mismos tftulos que VCR-Chim2- GFP, demostrando que la delecion de la NTR 3' natural y la sustitucion con una NTR 3' de alfavirus heterologo (por ejemplo, NTR 3' del SIN) mantiene la funcionalidad en el replicon del VEE.
Como alternativa, como medio para reducir las secuencias globales derivadas del VEE en VCR-Chimera2, se redujo la NTR 3' a la secuencia minima que contiene las CSE conservadas de 19 nt. Tal NTR 3' modificada se genero usando oligonucleotidos de solapamiento:
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- Vred2F
- 5'-ggccgcttttcttttccgaatcggattttgtttttaat-3'
- Vred2R
- 5'-attaaaaacaaaatccgattcggaaaagaaaagc-3'
- VEE3F
- vease la construccion VCR-DH para secuencias de oligonucleotidos
- VEE3R
- VEE4F
- VEE4R
Cada par de oligonucleotidos directo e inverso (por ejemplo, Vred2F con Vred2R, VEE2F con VEE2R, etc) se mezclo, se fosforilo, se desnaturalizo y se apareo lentamente. Despues, los 3 pares de oligonucleotidos apareados se mezclaron conjuntamente, se unieron entre sf, se digirieron con enzimas NotI y Pmel, se purificaron en gel usando un kit de extraccion en gel QIAquick y se unio al VCR-Chim2-GFP que se ha^a digerido previamente con las mismas enzimas para eliminar la NTR 3' de longitud completa, se ha^a purificado en gel y se habfa tratado con fosfatasa alcalina de camaron. Los clones positivos para el fragmento se verificaron mediante secuenciacion. Esta construccion se denomino VCR-Chim2.2-GFP.
Para confirmar la funcionalidad de la configuracion de este vector replicon quimerico, el plasmido VCR-Chim2.2-GFP se linealizo con la unica enzima de restriccion Pmel y ARN transcrito in vitro. El ARN se cotransfecto junto con ARN auxiliares defectuosos que codifican la capside y las glucoprotemas del SIN de las construcciones VCR-DH- Sglydl160 y VCR-DH-Scap tambien linealizadas con Pmel. Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C durante 24 horas, momento en el cual se recogieron los sobrenadantes del cultivo, se aclararon mediante centrifugacion, se diluyeron en serie y se usaron para infectar celulas BHK-21 sin tratar durante aproximadamente 14 horas. Los tttulos de la partmulas se determinaron usando analisis de citometna de flujo y fueron similares a VCR-Chim2.2-GFP, demostrando que la reduccion del tamano de la NTR 3' de 117 pb a 37 pb y la sustitucion mantiene la funcionalidad del replicon.
Similares a los vectores replicon anteriores para su uso como ARN o partmulas de replicon, replicones basados en ADN de alfavirus que funcionan directamente en una celula eucariota (por ejemplo, sistemas eucariotas de iniciacion de vector en capas) los puede obtener un experto en la materia, usando las ensenanzas proporcionadas en el presente documento. Tales replicones basados en ADN se pueden eliminar de diversas secuencias de virus parental, por ejemplo, incluyendo, pero sin limitacion, secuencias de la region carboxi-terminal de la nsP3, region de gen de protema estructural, region de CSE 3' y similares.
Ejemplo 6
Uso de diferentes protemas estructurales para la administracion de ARN replicon
Se expreso un antfgeno de VIH a partir de ARN replicon del SIN empaquetado con protemas estructurales bien del SIN o del VEE, y de ARN replicon del VEE empaquetado con protemas bien del SIN o del VEE de la siguiente manera. Espedficamente, un fragmento que contema la secuencia de gen heterologa que codifica la p55gag del VIH optimizada con codones (zur Megede, J. Virol. 74:2628, 2000) del plasmido pCMVKm2.GagMod.SF2 se inserto en el vector replicon SINCR (Gardner y col., 2000, ibid) en los sitios XhoI-NotI, en el vector replicon VCR en los sitios BbvCI-NotI y en el vector VCR-Chim2.1 en los sitios BbvCI-MfeI. Las construcciones de replicon que codifican la p55gag se denominaron SINCR-p55gag, VCR-p55gag y VCR-Chim2.1-p55gag, respectivamente. Para producir partmulas de replicon del SIN del VEE y quimericas que expresan p55gag, los plasmidos anteriores se linealizaron con la unica enzima de restriccion PmeI y con ARN transcrito in vitro. El ARN se cotransfecto junto con ARN auxiliar defectuoso que codifica las protemas estructurales apropiadas que se transcribieron de los plasmidos linealizados con PmeI como se muestra a continuacion:
- Partmulas
- Replicon Capside Glucoprotemas
- SIN
- SINCR-p55gag SINdl-cap (Polo y col., 1999, ibid) tDH-VuTR-Sglydl160
- VEE
- VCR-p55gag VCR-DH-Vcap VCR-DH-VE2-120
- SINrep/VEEenv
- SINCR-p55gag tDH-S113Vcap tDH-VuTR-Sglydl160
- VEErep/SINenv
- VCR-Chim2.1p55gag VCR-DH-Scap VCR-DH-Vglydl160
Las celulas transfectadas se incubaron a 34 °C, los sobrenadantes se recogieron a las 20 horas y a las 36 horas, seguido de aclarado mediante centrifugacion y una purificacion cromatografica tal como se describe previamente
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(PCT WO 01/92552).
Los tftulos de partmula se determinaron mediante tincion intracelular para la expresion de gag en celulas BHK21 infectadas durante 16 horas con dilucion en serie de preparaciones de partmulas purificadas. En primer lugar, las celulas se impermeabilizaron y se fijaron con el kit Cytofix/Cytoperm (Pharmingen), despues se tineron para p55gag intracelular con anticuerpos conjugados con FITC contra el antigeno del nucleo del VIH-1 (Coulter). El porcentaje de celulas positivas a gag se determino usando analisis de citometna de flujo y se uso para calcular los tftulos de las partmulas.
La inmunogenicidad en modelos de roedor se determino tras la inmunizacion con las diferentes preparaciones de partmulas de replicon de alfavirus que expresan p55gag del VIH, en dosis de 106 o 107 UI de partroulas de replicon (Figura 12). Se descubrio que cada una era inmunogenica, y se descubrio que una quimera, VEErep/SINenv era un inmunogeno particularmente fuerte.
La demostracion de la inmunizacion secuencial de roedores o primates con partroulas de replicon de alfavirus, tales como las partroulas de replicon de alfavirus anteriores, que se diferencian por sus protemas estructurales, se puede realizar usando diversas vfas (por ejemplo, intramuscular, intradermica, subcutanea, intranasal) y con dosificaciones que vanan de 103 UI a 108 UI o mayores. Por ejemplo, los primates se inmunizaron en primer lugar con 107 partroulas de SINCR-p55gag que conternan protemas estructurales del VEE en 0,5 ml de diluyente PBS, mediante una via subcutanea. Los mismos materiales se administran despues una segunda vez 30 dfas mas tarde, mediante la misma via de inyeccion. Aproximadamente 6-12 meses mas tarde, los animales se inmunizan despues una o mas veces con 107 partroulas de SINCR-p55gag que contienen protemas estructurales del SIN en 0,5 ml de diluyente PBS, mediante una via intramuscular. La demostracion de la inmunogenicidad se realiza usando ensayos convencionales y se puede comparar con animales en paralelo que reciben solo un unico tipo de partroulas de replicon en el momento de la administracion.
Los ejemplos anteriores han descrito diversas tecnicas adecuadas para preparar partroulas de alfavirus quimerico usando acidos nucleicos, protemas no estructurales y protemas estructurales, asf como porciones de los mismos, derivados de dos alfavirus diferentes. Sin embargo, un experto habitual en la materia, usando las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, podna preparar partroulas de alfavirus quimerico de tres o mas virus sin excesiva experimentacion. Sena logico combinar las ensenanzas que se encuentran en el presente documento con las ensenanzas de otras divulgaciones tecnicas relevantes disponibles de manera general para aquellos expertos en la materia incluyendo, pero sin limitacion, patentes, solicitudes de patente, revistas cienrtficas, tratados cienrtficos y referencias convencionales y libros de texto.
Por ejemplo, las partroulas de alfavirus quimerico se crean usando vectores replicones del SIN y al menos dos moleculas de ARN auxiliar defectuoso. El ARN replicon codifica protemas no estructurales del SIN, una senal de empaquetamiento del VEE y un gen heterologo de interes. El primer ARN auxiliar defectuoso codifica una protema de la capside hforida que tiene un dominio de union a ARN y un dominio de interaccion con glucoprotemas del WEE. El segundo ARN auxiliar defectuoso codifica glucoprotema del WEE. Las partroulas de alfavirus quimerico resultante tienen acido nucleico derivado del SIN con una capside hforida VEE/WEE y una glucoprotema de la envoltura del WEE.
En otro ejemplo, se crea una partroula de alfavirus quimerica en la que un replicon del SIN que tiene protemas no estructurales del SIN y un gen heterologo de interes se combina con dos moleculas de ARN auxiliar defectuoso. El primer ARN auxiliar defectuoso codifica una capside hforida que tiene un dominio de union a ARN del SIN y un dominio de interaccion con glucoprotemas del SFV. El segundo ARN auxiliar defectuoso codifica una glucoprotema hforida que tiene una cola citoplasmatica del SFV con el resto de la envoltura de glucoprotema proporcionada por el VEE. La partroula de alfavirus quimerica tiene acidos nucleicos del SIN con un gen heterologo de interes encapsulado en una capside hforida de SIN/SFV con una glucoprotema de la envoltura hforida de SFV/VEE, procediendo la porcion de ectodominio mas externa de la glucoprotema del VEE.
En otro ejemplo mas, se usaron cuatro alfavirus diferentes para preparar la partroula de alfavirus quimerico. En este ejemplo, se proporciona un ARN replicon del SIN que codifica protemas no estructurales del SIN, una senal de empaquetamiento del VEE y un gen heterologo de interes. Un primer ARN auxiliar defectuoso codifica una capside hforida que tiene un dominio de union a ARN del VEE y un dominio de interaccion con glucoprotemas del WEE. El segundo ARN auxiliar defectuoso codifica una glucoprotema hforida que tiene una cola citoplasmatica del WEE siendo el resto de glucoprotema proporcionada por el SFV. La partroula de alfavirus quimerica resultante tiene ARN del SIN y un gen heterologo de interes, una capside hforida de VEE/WEE y una glucoprotema hforida de WEE/SFV, siendo la porcion de ectodominio mas externa de la glucoprotema derivada del SFV.
Muchas otras combinaciones son posibles y los ejemplos anteriores sirven para ilustrar la tremenda versatilidad de la presente divulgacion.
Ejemplo 7
Uso de vectores replicones de alfavirus y auxiliares defectuosos con diferentes elementos de control
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Para producir partmulas de replicon de alfavirus usando componentes de vector (por ejemplo, ARN replicon, sistema eucariota de iniciacion de vector en capas) y de empaquetamiento (por ejemplo auxiliar defectuoso, casete de expresion de protema estructural) con diferentes elementos de control, se puede utilizar una amplia variedad de combinaciones. Por ejemplo, se puede construir un replicon basado en ADN del plasmido del SIN (sistema eucariota de iniciacion de vector en capas) que contiene una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural (CSE 3') diferente de la contenida en los casetes de expresion de protema estructural de una imea celular de empaquetamiento. Mas espedficamente, la modificacion del extremo 3' del SIN para incorporar una senal de poliadenilacion derivada del gen de hormona de crecimiento bovino se realiza tal como se describe a continuacion. La secuencia resultante:
GCGGCCGCCGCTACGCCCCAATGATCCGACCAGCAAAACTCGATGTACTTCCG AGG \A( IC. \TGTG( AIA A I (<( A K AGG( T(i(iTA( ATTAGAK (( ( GCTTAC ( G CGGGCAATATAGCAACACTAAAAACTCGATGTACTTCCGAGGAAGCGCAGTG C'ATAATGCTGCGCAGTGTTGC'CACATAACC’ACTATATTAACCATTTATCTAGC GGACGC'CAAAAACTC’AATGT ATTTCTGAGGA AGCGTGGTGCAT AATGCCAC’G CAGC’G TCTGCATAACTTTTAITATTTCTTTTATTA ATC’A A ATAA ATTTTG TTTTT AACATTTCAAAAAAAAAGTAGGIGTC ATTCTATTCTGGGGGGIGGGGIGGGG GTTTAAAC (SEQ ID NO 56)
por lo tanto, se disena por ingeniena genetica en la construccion del plasmido del SIN. Esta nueva secuencia se sustituye por el extremo 3' existente, el tramo poli(A) sintetico, la ribozima y el sitio BHGpolyA del plasmido pSINCP (vease, el documento WO 01/81690) de la siguiente manera. El plasmido pSINCP-bgal (pSINCP que expresa bgal) se elimina de los elementos anteriormente mencionados mediante PCR con los siguientes cebadores: NPSfwd:
5’ACAGACAGACCGCGGCCGCACAGACAGACGTTTAAACGTGGGCGAAGAACT CC’AGCATGAGATCC (SEQ ID NO 57)
que contiene un sitio NotI (12-19 nts.), un sitio PmeI (30-37 nt) y 38-65 nts que son complementarios a secuencias de SINCP-bgal aguas abajo de los elementos anteriormente mencionados, un sitio NotI que los precede.
NPSrev:
5'-TTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGAC (SEQ ID NO 58)
que es complementaria a la region de la estructura principal del plasmido que contiene el sitio SphI. el fragmento de 492 pb amplificado se purifica a partir de gel de agarosa usando el kit de extraccion en gel QIAquick, se digiere con NotI y SphI y se une a SINCP-bgal que tambien se ha digerido con NotI y SphI para eliminar la secuencia existente (1106 pb). Los clones que contienen el fragmento recien generado se verifican mediante secuenciacion y la construccion intermedia se denomina SINCPt-bgal. El nuevo extremo 3' se genera despues usando oligonucleotidos de solapamiento:
- SINpAIF
- 5’-tcgacccgggcggccgccgctacgccccaatgatccgaccagcaaaactcgatgtacttccgaggaactg-3’ (SEQ ID NO 59)
- SINpAIR
- 5’-ggtcggatcattggggcgtagcggcggccgcccgggtcga-3’ (SEQ ID NO 60)
- SINpA2F
- 5’-atgtgcataatgcatcaggctggtacattagatccccgcttaccgcgggcaatatagcaacactaaaaac-3’ (SEQ ID NO 61)
- SINpA2R
- 5’-agcggggatctaatgtaccagcctgatgcattatgcacatcagttcctcggaagtacatcgagttttgct-3’ (SEQ ID NO 62)
- SINpA3F
- 5’-tcgatgtacttccgaggaagcgcagtgcataatgctgcgcagtgttgccacataaccactatattaacca-3’ (SEQ ID NO 63)
- SINpA3R
- 5’-gcgcagcattatgcactgcgcttcctcggaagtacatcgagtttttagtgttgctatattgcccgcggta-3’ (SEQ ID NO 64)
- SINpA4F
- 5’-tttatctagcggacgccaaaaactcaatgtatttctgaggaagcgtggtgcataatgccacgcagcgtct-3’ (SEQ ID NO 65)
- SINpA4R
- 5’-cctcagaaatacattgagtttttggcgtccgctagataaatggttaatatagtggttatgtggcaacact-3’ (SEQ ID NO 66)
- SINpA5F
- 5’-gcataacttttattatttcttttattaatcaaataaattttgtttttaacatttcaaaaaaaaagtaggtg-3’ (SEQ ID NO 67)
- SINpA5R
- 5’-aacaaaatttatttgattaataaaagaaataataaaagttatgcagacgctgcgtggcattatgcaccacgctt-3’ (SEQ ID NO 68)
- SINpA6F
- 5’-tcattctattctggggggtggggtgggggtttaaacatcatgatcg-3’ (SEQ ID NO 69)
- SINpAOR
- 5’-cgatcatgatgtttaaacccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactttttttttgaaatgttaaa-3’(SEQ ID NO 70)
Los oligonucleotidos se mezclan, se fosforilan, se desnaturalizan, se alinean lentamente y se unen.
Tras desactivar la ligasa, el ADN se digiere con las enzimas NotI y PmeI, se purifica en gel usando el kit de
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extraccion en gel QIAquick y se une a SINCPt-bgal digerido con las mismas enzimas y tratado con fosfatasa alcalina. Los clones que contienen el fragmento recien generado se verifican mediante secuenciacion y la construccion final se denomina SINCP-pA-bgal.
Para producir partfculas de replicon se transfecta este plasmido en una lmea celular de empaquetamiento del SIN que contiene casetes de expresion de protema estructural, que no tienen secuencias del extremo 3' modificadas de manera similar (Polo y col., 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 96:4598-603). Tras la incubacion apropiada, las partfculas de replicon se recogieron y se purificaron tal como se describe anteriormente.
La relacion de los intervalos de los valores del presente documento pretende simplemente servir como un procedimiento de referencia abreviado de manera individual para cada valor distinto que este dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se relacionase de manera individual en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o se contradiga otra cosa claramente en el contexto. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos o el lenguaje ejemplar (por ejemplo "tal como") proporcionado en el presente documento pretende simplemente ilustrar mejor la invencion y no supone una limitacion en el ambito de las reivindicaciones. Ningun lenguaje en la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de cualquier elemento no reivindicado esencial para la practica de la invencion.
Los agrupamientos de elementos alternativos o realizaciones de la invencion desvelados en el presente documento no se deben interpretar como limitaciones. Cada miembro del grupo se puede referenciar y reivindicar de manera individual o en cualquier combinacion con otros miembros del grupo u otros elementos que se encuentran en el presente documento. Se espera que uno o mas miembros de un grupo puedan incluirse en, o eliminarse de, un grupo, por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando se produce dicha inclusion o eliminacion, se considera que la memoria descriptiva del presente documento contiene el grupo tal como se ha modificado cumpliendo asf con la descripcion escrita de todos los grupos Markush utilizados en las reivindicaciones adjuntas.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CHIRON CORPORATION
<120> PARTfcULAS DE REPLICON DE ALFAVIRUS QUIMERICO
<130> P054844EP
<150> US 60/295,451 <151> 2001-05-31
<160> 92
<170> PatentIn Ver. 2,0
<210> 1 <211> 39 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: cebador 5' del VEE <400> 1
aagcagagct cgtttagtga accgtatggg cggcgcatg 39
<210> 2 <211> 41 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: cebador 3' del VEE <400> 2
gccctgcgtc cagctcatct cgatctgtcc ggatcttccg c 41
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: PL1F <400> 3
cacgcgtact actgttaact catcaagatc tactaggcct aaggcaccac ctgcaggtag 60 tagatacaca tcataatacc 80
<210>4 <211> 78 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: PL2F <400> 4
tagggcggcg atttaaatga tttagactac gtcagcagcc ctcagcggcg cgcccaccca 60 gcggccgcag gatagttt 78
<210> 5 <211> 79 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: PL1R <400> 5
tatgatgtgt atctactacc tgcaggtggt gccttaggcc tagtagatct tgatgagtta 60 acagtagtac gcgtgggcc 79
<210>6 <211> 83 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: PL2R <400> 6
aaactatcct gcggccgctg ggtgggcgcg ccgctgaggg ctgctgacgt agtctaaatc 60 atttaaatcg ccgccctagg tat 83
<210> 7 <211> 58 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3=-1F <400> 7
ggccgcatac agcagcaatt ggcaagctgc ttacatagaa ctcgcggcga ttggcatg 58
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-1R <400>8
ccaatcgccg cgagttctat gtaagcagct tgccaattgc tgctgtatgc 50
<210>9 <211> 61 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-2F <400> 9
ccgccttaaa atttttattt tattttttct tttcttttcc gaatcggatt ttgtttttaa 60 t 61
<210> 10 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-2R <400> 10
attaaaaaca aaatccgatt cggaaaagaa aagaaaaaat aaaataaaaa ttttaaggcg 60 gcatg 65
<210> 11 <211> 75 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-3F <400> 11
atttcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagggtc ggcatggcat 60 ctccacctcc tcgcg 75
<210> 12 <211> 78 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-3R <400> 12
gaccgcgagg aggtggagat gccatgccga cccttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttgaaat 78
<210> 13 <211> 64 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-4F <400> 13
gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgca cgtccactcg gatggctaag ggagagccac 60 gttt 64
<210> 14 <211> 61 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-4R <400> 14
aaacgtggct ctcecttagc catccgagtg gacgtgcgtc ctccttcgga tgcccaggtc 60 g 61
<210> 15 <211> 43 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VGBbvCI <400> 15
atatatatct cgagcctcag catgtcacta gtgaccacca tgt 43
<210> 1 <211> 28 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VGNcoIR <400> 16
atatataaat tccatggtga tggagtcc 28
<210> 17 <211> 39 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRDCtR <400> 17
atatatatgc ggccgcttac cattgctcgc agttctccg 39
<210> 18 <211> 44 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRDCtF <400> 18
gagatgtcat cgggcacgca tgtgtggtcg gagggaagtt attc
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SINNtF <400> 19
atatatctcg agccaccatg aatagaggat tctttaacat g 41
<210> 20 <211> 31 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: S113R <400> 20
gggaacgtct tgtcggcctc caacttaagt g 31
<210> 21 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SINNtR <400> 21
gaataacttc cctccgacca cacatgcgtg cccgatgaca tctc
<210> 22 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: S127R <400> 22
ccacacaagc gtacccgatg acatctccgt cttc 34
<210> 23 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: S116R <400> 23
catgattggg aacaatctgt cggcctccaa c 31
<210> 24 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: S109R <400> 24
gtcagactcc aacttaagtg ccatgcg 27
<210> 25 <211> 40 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<223> Descripcion de secuencia artificial: SINCtF <400> 25
gggaagataa acggctacgc tctggccatg gaaggaaagg 40
<210> 26 <211> 37 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SINCtR <400> 26
atatatatgc ggccgctcac cactcttctg tcccttc 37
<210> 27 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRD125F <400> 27
gccgacaaga cgttcccaat catgttggaa g 31
<210> 28 <211> 39 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRDCtR <400> 28
atatatatgc ggccgcttac cattgctcgc agttctccg 39
<210> 29 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRDCtF <400> 29
gagatgtcat cgggcacgca tgtgtggtcg gagggaagtt attc
<210> 30 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRD139F <400> 30
tcatcgggta cgcttgtgtg gtcg 24
<210> 31 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRD128F <400> 31
5
10
15
20
25
30
35
40
45
gacagattgt tcccaatcat gttggaaggg 30
<210> 32 <211> 34 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRD121F <400> 32
acttaagttg gagtctgaca agacgttccc aatc 34
<210> 33 <211> 38 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRDNtF <400> 33
atatatctcg agccaccatg ttcccgttcc agccaatg 38
<210> 34 <211> 40 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: TRDNtR <400> 34
cctttccttc catggccaga gcgtagccgt ttatcttccc 40
<210> 35 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VE2F <400> 35
atatatcagg ggactccatc accatgg 27
<210> 36 <211> 77 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VSGE2R
<400> 36
gggattacgg cgtttggggc cagggcgtat ggcgtcaggc actcacggcg cgctttgcaa 60 aacagecagg tagacgc 77
<210> 37 <211> 84 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VSGE3F <400> 37
5
10
15
20
25
30
35
40
45
gccccaaacg ccgtaatccc aacttcgctg gcactcttgt gctgcgttag gtcggccaat 60 gctgagacca cctgggagtc cttg 84
<210> 38 <211> 50 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE3'-1R <400> 38
ccaatcgccg cgagttctat gtaagcagct tgccaattgc tgctgtatgc 50
<210> 39 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: M1R <400> 39
gtatggcgtc aggcacgcac ggcgcgcttt g 31
<210> 40 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: M1F <400> 40
agcgcgccgt gcgtgcctga cgccatacgc c 31
<210> 41 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: M2R <400> 41
atggcgtcag gcactcaacg cgcgctttgc aaaac 35
<210> 42 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: M2F <400> 42
tttgcaaagc gcgcgttgag tgcctgacgc catac 35
<210> 43 <211> 35 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<223> Descripcion de secuencia artificial: M3R <400> 43
atggcgtcag gcacgcaacg cgcgctttgc aaaac 35
<210> 44 <211> 35 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: M3F <400> 44
tttgcaaagc gcgcgttgcg tgcctgacgc catac 35
<210> 45 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: ScAatllF <400> 45
gccgacagat cgttcgacgt c 21
<210> 46 <211> 40 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: ScVg1R <400> 46
atatatatgg tcactagtga ccactcttct gtcccttccg 40
<210> 47 <211> 40 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VglyR <400> 47
atatatatgc ggccgctcaa ttatgtttct ggttggtcag 40
<210> 48 <211> 38 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VglyF <400> 48
atatatctcg agccgccagc catgtcacta gtgaccac 38
<210> 49 <211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: 5' Pr <400> 49
5
10
15
20
25
atatctcgag agggatcacg ggagaaac 28
<210> 50 <211> 28 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: 3' Pr <400> 50
agaggagctc aaataccacc ggccctac 28
<210> 51 <211> 705 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: oligo 1 del fragmento de nsP del VEE
<400> 51
ctagagttaa agagggatgt gttggctcga gtatttcact gacgggtacg tatgctgcta ggggagaggg actggcatac aaccagcgta cttttgcccg gaagatgaaa tttagaaggc
<210> 52 <211>705 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
cggctcgtaa
ccattcttag
ccatctacca
tacgtggcaa
tcgttaaaag
cgatgcaccg
tctcttttcc
tggcaacaga
tagtcgtcaa
tagtggccca
ggccactagg
acaagataac
cataggccta
aaagaagtat
cgagaagagg
gcaaaattac
aatagctatc
cgagggattc
cgtgtgcacg
tgtcagtgcg
cggtcgcacc
ggcatttgct
actacgagat
atctatttat
tgcagctctg
ttgaaaccat
gacttactga
acatgtcggt
agtccaggcc
ttgtgctgca
tatgtgccag
gacgacgcgc
cagagaaaca
aggtgggcaa
agacagttag
aagcgcccgg
acgttatgga
ccaacaatgt
ggagctggca
gtgagactat
tgtatgggaa
aagtgacaga
ctacattgtg
aaaaactgct
ccaataccat
aggaatataa
tcatggggtg
ataca
gcggtcacgt 60 tctattctct 120 ccigccgtct 180 agttagttgc 240 gccttcaggc 300 cacattgaac 360 tgaccaaatg 420 ggttgggctc 480 gaaaaattac 540 ggaagatcaa 600 ttgttgggct 660 705
<220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: oligo 2 del fragmento de nsP del VEE
<400> 52
tcaattgccg agcattgtat ccggatacgt cgagactgca atacctcgcc agtgcatctc 60
cctacaggta agaatctttc ttcataaact ttggtaggtt gttacaagat aagagacaac 120
cgagctggta gatggtgctc ttctccctga atgactcctc gaccgtggac ggcagacata 180
aagtgaatgc accgttcgtt ttaatgtgta cagccacact ctgatatcaa tcaacgctgc 240
ccatgcagca attttcttat cgatagtcag gtccggacat acccttcgga agtccgatac 300
gacgatgcta cgtggcgctc cctaagaaca cgacgtttca ctgtctgtgt aacttgcccc 360
tctcccagag aaaagggcac acgtgcatac acggtcgatg taacacaccg gtttactgac 420
cgtatgaccg ttgtctacag tcacgcctgc tgcgcgtttt Cgacgaccaa cccgagttgg 480
tcgcatatca gcagttgcca gcgtgggtct ctttgtggtt atggtacttt ttaatggaaa 540
acgggcatca ccgggtccgt aaacgatcca cccgtttcct tatattcctt ctagttcttc 600
tactttccgg tgatcctgat gctctatctg tcaatcagta ccccacaaca acccgaaaat 660
cttccgtgtt ctattgtaga taaatattcg cgggcctatg tgcgc 705
<210> 53
<211> 63
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: aminoacido del SINDC
5
10
15
<400> 53
- Lys 1
- Gin Ala Pro Lys 5 Gin Pro Pro Lys Pro 10
- Glu
- Lys Lys Lys 20 Lys Gin Pro Ala Lys 25 Pro
- Arg
- Met Ala 35 Leu Lys Leu Glu Ala 40 Asp
- Arg
- Glu
- Asp 50 Gly Asp Val He Gly 55 His Ala Leu
Lys Lys Pro Lys Thr Gin 15
Lys Pro Gly Lys Arg Gin 30
Ser Phe Asp Val Lys Asn 4 5
Ala Met Glu Gly Lys 60
<210> 54 <211> 63 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: aminoacido del HR del SIN <400> 54
- Lys 1
- Gin Ala Pro Lys 5 Gin Pro Pro Lys
- Glu
- Lys Lys Lys 20 Lys Gin Pro Ala Lys 25
- Arg
- Met Ala 35 Leu Lys Leu Glu Ala 40 Asp
- Glu
- Asp 50 Gly Asp Val lie Gly 55 His Ala
Pro Lys Lys Pro Lys Thr Gin 10 15
Pro Lys Pro Gly Lys Arg Gin 30
Arg Leu Phe Asp Val Lys Asn 45
Leu Ala Met Glu Gly Lys 60
<210> 55 <211> 76 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: aminoacido del TRD <400> 55
- Ser 1
- Gin Lys Gin Lys 5 Gly Gly Gly Gin Gly 10
- Gly
- Lys Lys Lys 20 Ala Lys Thr Gly Pro 25 Pro
- Gly
- Asn Lys 35 Lys Lys Thr Asn Lys 40 Lys Pro
- Val
- Met 50 Lys Leu Glu Ser Asp 55 Lys Thr Phe
- Lys 65
- lie Asn Gly Tyr Ala 70 Cys Val Val Gly
Lys Lys Lys Lys Asn Gin 15
Asn Pro Lys Ala Gin Asn 30
Gly Lys Arg Gin Arg Met 45
Pro lie Met Leu Glu Gly 60
Gly Lys 75
<210> 56 <211> 77
5
10
15
20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: aminoacido 6119 <400> 56
- Ala 1
- Pro Gin Lys Gin 5 Lys Gly Gly Gly
- Gin
- Gly Lys Lys 20 Lys Ala Lys Thr Gly 25
- Ser
- Gly Asn 35 Lys Lys Lys Pro Asn 40 Lys
- Met
- Val 50 Met Lys Leu Glu Ser 55 Asp Lys
- Gly 65
- Lys lie Asn Gly Tyr 70 Ala Cys Val
Gin Gly Lys Lys Lys Lys Asn
10 15
Pro Pro Asn Pro Lys Ala Gin
30
Lys Pro Gly Lys Arg Gin Arg 45
Thr Phe Pro lie Met Leu Glu 60
Val Gly Gly Lys 75
<210> 57 <211> 76 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: aminoacido de MAC10 <400> 57
- Pro 1
- Gin Lys Pro Lys 5 Arg Gly
- Gly
- Lys Lys Lys 20 Ala Lys Thr
- Gly
- Asn Lys 35 Lys Lys Thr Asn
- Val
- Met 50 Lys Leu Glu Ser Asp 55
- Lys 65
- lie Asn Gly Tyr Ala 70 Cys
Ser Gin Gly Lys Arg Lys Lys Asn Gin 10 15
Gly Pro Pro Asn Gin Lys Ala Gin Asn
25 30
Lys Lys Pro Gly Lys Arg Gin Arg Met 40 45
Lys Thr Phe Pro lie Met Leu Glu Gly 60
Val Val Gly Gly Lys 75
<210> 58 <211> 70 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Dominio de union a ARN consenso
<400> 58
5
10
15
Gin
1
Lys
Asn
Asp
- >1
- Pro Lys Gly Gin Gly Lys Lys Lys Lys
- 5 10
- Ala
- Lys Thr Gly Pro Pro Asn Lys Ala Gin
- 20 25
- Lys
- Lys
- Pro Gly Lys Arg Gin Arg Met Val
- 35 40
- Lys
- Thr Phe Pro lie Met Leu Glu Gly
- Lys
- 50
- 55
- Val
- Val
- Gly Gly Lys
Asn Gin Gly Lys Lys 15
Gly Asn Lys Lys Lys 30
Met Lys Leu Glu Ser 45
lie Asn Gly Tyr Ala 60
Cys
65 70
<210> 59 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Glucoprotema E2 de SINDCE2t <400> 59
Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu 1 5
Pro Asn Ala Val lie Pro Thr Ser 20
- Cys
- Leu 10 Thr Pro Tyr Ala
- Leu 25
- Ala Leu Leu Cys Cys 30
Leu Ala 15
Val Arg
Ser Ala Asn Ala 35
<210> 60 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Glucoprotema E2 de SINHRE2t <400> 60
- Cys 1
- Ala Cys Lys Ala 5 Arg Arg Glu Cys Leu 10
- Pro
- Asn Ala Val 20 He Pro Thr Ser Leu 25 Ala
- Ser
- Ala Asn 35 Ala
Thr Pro Tyr Ala Leu Ala 15
Leu Leu Cys Cys Val Arg 30
<210> 61 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Glucoprotema E2 de TRDE2t
<400> 61
5
10
15
20
Leu Phe Cys Arg 1
Pro Asn Ala Arg 20
- Ser 5
- Arg Val Ala Cys Leu 10
- He
- Pro Phe Cys Leu 25 Ala
Thr Pro Tyr Arg Leu Thr 15
Val Leu Cys Cys Ala Arg 30
Thr Ala Arg Ala 35
<210> 62 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Glucoprotema E2 de 6119E2t <400> 62
Leu Phe 1
Pro Asn
Thr Ala
- Cys
- Lys Ser 5 Arg Val Ser Cys Leu 10
- Ala
- Arg 20 Met Pro Phe Cys Leu 25
- Ala
- Arg 35
- Ala
Thr Pro Tyr Arg Leu Thr 15
Val Leu Cys Cys Ala Arg 30
<210> 63 <211> 36 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Glucoprotema E2 de MAC10E2t <400> 63
Leu
1
Pro
Thr
- Phe
- Cys Lys
- Asn
- Ala Arg
- 20
- Ala
- Arg
- Ala
- 35
Ser Arg Val Ser Cys Leu Thr Pro Tyr Gin Leu Thr 5 10 15
Met Pro Phe Cys Leu Ala Val Phe Cys Cys Ala Arg 25 30
<210> 64 <211> 34 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Glucoprotema E2 consenso
<400> 64
5
10
15
20
25
Leu Phe Cys Lys Ser Arg Val Ser Cys Leu Thr Pro Tyr Leu Thr Pro 15 10 15
Asn Ala Arg He Pro Cys Leu Ala Val Leu Cys Cys Ala Arg Thr Ala 20 25 30
Arg Ala
<210> 65 <211> 327 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Chimera-1A <400> 65
tggccatgac caccctggcc tcctccgtga agagcttttc ctatcttcgc ggcgcgccca 60
tcaccttgta tggataaggg atcacgggag aaaccgtggg atacgcggtt acacacaata 120
gcgagggctt cttgctatgc aaagttactg acacagtaaa aggagaacgg gtatcgttcc 180
ctgtgtgcac gtacatcccg gccaccatac catgactact ctagctagca gtgttaaatc 240
attcagctac ctgagagggg cccctataac tctctacggc taacctgaat ggactacgac 300
atagtctagt ccgccaagcc tcagcgg 327
<210> 66 <211> 331 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Complemento de Chimera-1A <400> 66
accggtactg gtgggaccgg aggaggcact tctcgaaaag gatagaagcg ccgcgcgggt 60
agtggaacat acctattccc tagtgccctc tttggcaccc tatgcgccaa tgtgtgttat 120
cgctcccgaa gaacgatacg tttcaatgac tgtgtcattt tcctcttgcc catagcaagg 180
gacacacgtg catgtagggc cggtggtatg gtactgatga gatcgatcgt cacaatttag 240
taagtcgatg gactctcccc ggggatattg agagatgccg attggactta cctgatgctg 300
tatcagatca ggcggttcgg agtcgccgcg c 331
<210> 67 <211> 346 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Chimera 1B <400> 67
tggccatgac caccctggcc tcctccgtga agagcttttc ctatcttcgc ggcgcgccca 60
tcaccttgta tggataaggg atcacgggag aaaccgtggg atacgcggtt acacacaata 120
gcgagggctt cttgctatgc aaagttactg acacagtaaa aggagaacgg gtatcgttcc 180
ctgtgtgcac gtacatcccg gccaccataa cttccatcat agttatggcc atgactactc 240
tagctagcag tgttaaatca ttcagctacc tgagaggggc ccctataact ctctacggct 300
aacctgaatg gactacgaca tagtctagtc cgccaagcct cagcgg 346
<210> 68 <211> 132
5
10
15
20
25
30
35
40
<212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Chimera 2 de empaquetamiento de SIN/VEE <400> 68
gggatcacgg tgcaaagtta ccggccacca
<210> 69 <211> 60 <212>ARN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SINCR-AR339 <400> 69
aggaggacug aauacugacu aaccggggua gguggguaca uauuuucgac ggacacaggc 60
<210> 70 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SINCR-AR339 <220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion <400> 70
Arg Atg Thr Glu Tyr Xaa Leu Thr Gly Val Gly Gly Tyr lie Phe Ser 15 10 15
Thr Asp Thr Gly
20
<210> 71 <211> 60 <212>ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SIN AR86 <400> 71
aggaggaccg aauacugucu aaccggggua gguggguaca uauuuucgac ggacacaggc 60
<210> 72 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: aminoacido del AR86 del SIN <400> 72
gagaaaccgt gggatacgcg gttacacaca atagcgaggg cttcttgcta 60 ctgacacagt aaaaggagaa cgggtatcgt tccctgtgtg cacgtacatc 120
ta
132
5
10
15
20
25
30
35
40
Arg Arg Thr Glu Tyr Cys Leu Thr Gly Val Gly Gly Tyr lie Phe Ser 15 10 15
Thr Asp Thr Gly
20
<210> 73 <211> 60 <212>ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: AURA <400> 73
ggaaacagac aauauugacu aaccggggua gguggguaca uauucucuuc ugauacaggc 60
<210> 74 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido de AURA <220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion <400> 74
Gly Asn Arg Gin Tyr Xaa Leu Thr Gly Val Gly Gly Tyr lie Phe Ser 15 10 15
Ser Asp Thr Gly
20
<210> 75 <211> 60 <212> ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: WEE <400> 75
cgucaacauu ccaacugacg guaugaagcg ggagcguaua uuuucucauc ggaaacaggc 60
<210> 76 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido de AURA <220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion <400> 76
5
10
15
20
25
30
35
40
Arg Gin His Ser Asn Xaa Arg Tyr Glu Ala Gly Ala Tyr He Phe Ser
15 10 15
Ser Glu Thr Gly 20
<210> 77 <211> 60 <212>ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: EEE <400> 77
cggaggcacu cgaauugacg guacgaagcg ggcgcguaca uuuucucauc cgagacggga 60
<210> 78 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido de EEE <220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion <400> 78
Arg Arg His Ser Asn Xaa Arg Tyr Glu Ala Gly Ala Tyr lie Phe Ser
15 10 15
Ser Glu Thr Gly 20
<210> 79 <211> 60 <212> ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: VEE <400> 79
guagcacaac aacaaugacg guuugaugcg ggugcauaca ucuuuuccuc cgacaccggu 60
<210> 80 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido de VEE <220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion <400> 80
5
10
15
20
25
30
35
40
Val Ala Gin Gin Gin Xaa Arq Phe Asp Ala Gly Ala Tyr lie Phe Ser
15 10 15
Ser Asp Thr Gly
20
<210> 81 <211> 60 <212>ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: MID <400> 81
cguuuaacgu cagcaugacu agaccgggcg ggggccuaca uauucucauc ggauacaggc 60
<210> 82 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido MID <220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion <400> 82
Arg Leu Thr Ser Ala Xaa Leu Asp Arq Ala Gly Ala Tyr lie Phe Ser
15 10 15
Ser Asp Thr Gly 20
<210> 83 <211> 60 <212> ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: RR <400> 83
gauuuugacc aauucugacu agggacagcg ggggcguaca ucuucucguc ugauaccgga 60
<210> 84 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido RR
<220>
<221> SITIO <222> (6)
<223> Xaa = SIN p.s. sitio de insercion
<400> 84
<210> 85
Asp Phe Asp Gin Phe Xaa Leu Gly Arg Ala Gly Ala Tyr lie Phe Ser 15 10 15
Ser Asp Thr Gly 20
5
10
15
20
25
30
35
40
<211> 60 <212>ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: SF <400> 85
uucgacgacg uccugcgacu aggccgcgcg ggugcauaua uuuucuccuc ggacacuggc 60
<210> 86 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido SF <400> 86
Phe Asp Asp 1
Ser Asp Thr
<210> 87 <211> 60 <212> ARN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: ONN <400> 87
acagacgaag aguuacgacu agacagagca ggggguuaca uauucuccuc ugacacuggu 60
<210> 88 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Aminoacido ONN <400> 88
Thr Asp Glu 1
Ser Asp Thr
<210> 89 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Cebador 5' de PCR para nsp3 <400> 89
acggccagtg aattgtaata cgactca 27
<210> 90 <211> 170 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
Glu Leu Arg Leu Asp Arg Ala Gly Gly Tyr lie Phe Ser 5 10 15
Gly
20
Val Leu Arg Leu Gly Arg Ala Gly Ala Tyr He Phe Ser h 10 15
Gly
20
10
15
20
<223> Descripcion de secuencia artificial: Cebadores de sitio de empaquetamiento del Sindbis <400> 90
60 120 170
<210> 91 <211> 23 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Cebador 3' de PCR para nsp4 <400> 91
ctagtggatc cgagctcggt acc 23
<210> 92 <211> 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
gttcgtagca caacaacaag ggatcacggg agaaaccgtg ggatacgcgg ttacacacaa tagcgagggc ttcttgctat gcaaagttac tgacacagta aaaggagaac gggtatcgtt ccctgtgtgc acgtacatcc cggccaccat atgacggttt gatgcgggtg
<220>
<223> Descripcion de secuencia artificial: Empaquetamiento de Sindbis. Senal <400> 92
tgacggtttg 10
Claims (6)
- 510152025REIVINDICACIONES1. Un ARN replicon de alfavirus que comprende una secuencia 5' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, secuencias que codifican protemas no estructurales de alfavirus biologicamente activas, un promotor subgenomico de alfavirus, una secuencia heterologa que no es de alfavirus, y una secuencia 3' requerida para la amplificacion mediada por protema no estructural, en la que la secuencia que codifica al menos una de dichas protemas no estructurales deriva del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) y en la que la secuencia de dicho ARN del replicon presenta entre el 33,33 % y el 66,67 % de identidad de secuencia con el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) en toda la longitud del genoma del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) yen el que el ARN replicon de alfavirus comprende secuencias derivadas del virus Sindbis (SIN), en el que las secuencias derivadas de SIN comprenden una senal de empaquetamiento insertada en un sitio seleccionado de la union de nsP3 con nsP4, despues de la fase abierta de lectura de nsP4, y una delecion en un gen de protema no estructural.
- 2. El ARN replicon de alfavirus de la reivindicacion 1, en el que el replicon presenta entre el 40 % y el 66,67 %, entre el 50 % y el 66,67 %, entre el 55 % y el 66,67 % o entre el 60 % y el 66,67 % de identidad de secuencia con el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE).
- 3. El ARN replicon de alfavirus de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la secuencia heterologa que no es de alfavirus codifica un agente terapeutico o un inmunogeno.
- 4. Un procedimiento de produccion de partmulas de replicon alfavmcas que comprende la introduccion de ARN replicon de alfavirus de cualquier reivindicacion precedente y un ARN auxiliar defectuoso que es capaz de amplificarse y de expresar una o mas protemas estructurales de alfavirus en una celula hospedadora en condiciones que permitan la formacion de las partmulas.
- 5. Una partmula de replicon de alfavirus que comprende el ARN replicon de alfavirus de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
- 6. Un sistema eucariota de iniciacion de vector en capas, que comprende un promotor 5' que es capaz de iniciar en una celula eucariota la smtesis de ARN a partir de ADNc, y una secuencia de vector de acido nucleico que es capaz de dirigir su propia replicacion y expresar una secuencia heterologa, en la que dicha secuencia de vector de acido nucleico es una copia de ADNc del replicon de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
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