JP2023508726A - 細胞及び組織への核酸及びタンパク質の温度ベースの一過性送達 - Google Patents

細胞及び組織への核酸及びタンパク質の温度ベースの一過性送達 Download PDF

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Abstract

本開示は、1若しくは複数の細胞において温度感受性作用物質を一過性に活性化する方法であって、例えば、1若しくは複数の細胞を温度感受性作用物質と接触させ、そして、その細胞を、該細胞においてその温度感受性作用物質の活性を誘発するための許容温度にて一過性にインキュベートすることによる、方法に関する。さらに、本開示は、対象の1若しくは複数の細胞を、温度感受性作用物質と接触させ、次に、その細胞において温度感受性作用物質の活性を誘発するために、対象の中核体温を許容温度まで下げる方法に関する。本開示はまた、対象の1若しくは複数の細胞を、温度感受性作用物質と接触させ、その細胞において温度感受性作用物質の活性を誘発するために許容温度にて対象の表面体温を維持する方法にも関する。温度感受性治療用作用物質を用いて対象を治療する方法がさらに開示される。【選択図】図２１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年3月20日に出願された米国特許仮出願第62/992,700号及び2019年12月31日に出願された米国特許仮出願第62/955,801号の利益を請求するものであり、その開示全体を参照により本明細書に援用する。
ASCIIテキストファイルの配列表の提出
ASCIIテキストファイルによる次の提出物の内容の全体を参照により本明細書に援用する：コンピューター読み込み可能形式(CRF)の配列表(ファイル名：699442001240SEQLIST.TXT、記録日：2020年12月27日、サイズ：25KB)。
分野
本開示は、例えば、1若しくは複数の細胞をts作用物質と接触させ、及びその細胞内のts作用物質の活性を誘発する許容温度にてその細胞を一過性にインキュベートすることによって、1若しくは複数の細胞内で温度感受性作用物質(ts作用物質)を一過性に活性化する方法に関する。エクスビボ治療戦略に関して、1若しくは複数の細胞は、許容温度にてエクスビボにおいて治療用ts作用物質を用いて処理され、そしてそれに続いて、その細胞は、非許容温度(例えば、対象の正常な中核体温)にて対象に移植される。インビボ治療戦略に関して、治療用ts作用物質は、対象に送達される、すなわち、許容温度にて維持され、そして、対象の中核体温が正常に戻るか、又は対象の表面体温が上がった(例えば、非許容温度)ときに、その治療用ts作用物質は、ts作用物質が永久に機能停止する前に、限られた期間にわたりインビボで機能することが可能になる。或いは、治療用ts作用物質は、対象に送達され、そしてそれに続いて、対象の細胞内において治療用ts作用物質の活性を誘発する許容温度まで対象の中核体温が下がることによって、そのts作用物質が一過性に活性化する。
背景
ヒト細胞、組織、及び器官への治療用遺伝子産物の送達は、大きな課題となる。(患者の遺伝子の欠陥を補うために遺伝子の連続的な発現を必要とする)従来の遺伝子治療に関して、これは、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを使用することによって達成された。しかしながら、同じく重要な戦略遺伝子治療は、一過性の、短期的な遺伝子発現を伴う。斯かる適用に関して、遺伝子の持続的な発現は必要ではなく、実際には細胞にとって有害にもなり得る。
例えば、CAS9は、DNAを切断する細菌酵素である。それはCRISPR/CAS9ベースの遺伝子編集複合体の重要な成分であり、そしてそれは、遺伝子治療について検討されていた。ガイドRNAとCAS9の両方が一つのセンダイウイルスベクター(Park et al., 2016)上の遺伝子によってコードされ得る。治療的に遺伝子編集システム使用するために、CRISPR-CAS9を含有するベクターが、ヒト細胞又は人体に導入されなければならない。しかしながら、CAS9の連続的な発現はDNA破壊と突然変異の導入を誘発する可能性がある。よって、短期間、例えば、1週間超よりむしろ、数時間又は数日のオーダー、にわたりCAS9が発現されることが望ましい。
遺伝子の短時間発現に関する別の適用は、細胞リプログラミングのためのものである。最近、1組の転写因子の異所性発現が治療的に有効な細胞型へと細胞を変換することが示された。例えば、3種類の転写因子のセットが、膵管細胞をインスリン分泌膵臓β細胞に変換できる(Zhou et al., 2008)。もう1セットの転写因子は、線維芽細胞を心筋細胞に変換できる(Ieda et al., 2010)。人体内へのこれらの転写因子のインビボ送達が、再生医療の一タイプとして使用できると思われる。しかしながら、これらの強力な転写因子の連続的な発現が害を引き起こす可能性があるため、これらの強力な細胞同一性変更転写因子を一過性にだけ発現させることが望ましい。
上記の例が注目されるので、遺伝子の連続的な発現をもたらすウイルスベクターを使用する従来の遺伝子治療は望まれなくなる可能性がある。遺伝子産物の期間限定発現のために、細胞内への合成又はビトロ転写mRNAの送達が使用され始めた(Warren et al., 2010)。しかしながら、これらの方法論に関するいくつかの問題が存在する。例えば、細胞、組織、及び器官に送達されるmRNAの量は限られているので、これにより、タンパク質産物の量は、インビボにおいて生物学的に重要な効果に十分でない可能性がある。
また、通常、最長12時間しか存続しないRNAの速い代謝回転のため(Warren et al., 2010; Goparaju et al., 2017)、合成RNAは細胞内に複数回トランスフェクトされなければならない。胚性幹細胞や誘導多能性幹(iPS)細胞などのヒト多能性幹細胞の強制分化のために、数日の間にわたって一日二回のトランスフェクションが必要である(Akiyama et al., 2016; Goparaju et al. 2017)。ヒト線維芽細胞からiPS細胞を作出するために、合成RNAカクテルの毎日のトランスフェクションが2週間超にわたり継続されなければならない(Warren et al., 2010)。これは面倒なだけではなく、効率が悪い。
iPS細胞の作出のために、この問題は、(たった1回の送達後にも長期間の発現を可能にする)自己複製RNAを使用することによって対処された(Yoshioka et al., 2013)。自己複製RNAは、ウイルス粒子形成に必要とされる構造タンパク質をコードするDNAを取り除くことによって(Petrakova et al., 2005)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、シンドビスウイルス(SINV)、及びセムリキフォレストウイルス(SFV)などのアルファウイルス通常製造される(Jose et al., 2009)一本鎖RNAである。自己複製RNAは、非構造タンパク質(nsPs)をコードし、そしてそれは、自己複製RNA自体を複製するように、及び翻訳のための転写産物を産生するように、RNA依存性RNAポリメラーゼとして機能する。自己複製RNAはまた、着目のタンパク質をコードする着目の遺伝子(GOI)、及びその他の遺伝要素も含み得る。RNAのその正のフィードバック産生のため、自己複製RNAは高レベルにてGOIを発現し得る。自己複製RNAは、裸のRNA(すなわち、合成RNA)として、又はウイルス粒子として、哺乳動物細胞に送達され得、そしてそれは、ヘルパー細胞をパッケージングすることによってウイルス構造タンパク質を補うことによって製造され得る。
自己複製RNAベクターの利点は、それらの自己複製特徴であり、そしてそれは、GOIの発現レベルの向上をもたらす。しかしながら、哺乳動物細胞にRNA/タンパク質を送達するための自己複製RNAベクターの欠点の1つは、それらの持続発現である。通常、RNA依存性RNAポリメラーゼとGOIの正のフィードバック産生が続き、そしてそれは、自己複製RNAの裸のRNA形態でトランスフェクトされるか、又は自己複製RNAのウイルス形態で感染した細胞の死滅をもたらし得る。
よって、遺伝子治療の当該技術分野で必要とされるものは、治療作用物質又は外来抗原(例えば、病原体の抗原)などの着目のタンパク質をコードするGOIの一過性発現のためのツールである。特に、RNAベクターと自己複製RNAの転写と翻訳の制御が望ましい。
概要
着目の遺伝子(GOI)の時間制限のある発現を有することの必要性に基づいて、核酸又はタンパク質が、インビトロ若しくはインビボにおいて、特定の細胞に送達され得るか若しくは特定の細胞で発現され得る、核酸/タンパク質の量が、生物学的に重要な効果を有するのに十分である、及び一過性の発現が、生物学的に重要な効果を達成した後に永久に停止し得る、一過性遺伝子産物送達系が必要である。これら及び他のニーズを満たすために、本開示は、対象(インビボ)又は培養中の細胞(エクスビボ)において、治療用ts作用物質などの温度感受性作用物質(ts作用物質)の活性を一過性に誘発する方法に関する。いくつかの実施形態において、治療用ts作用物質は、軽度の治療用低体温療法と組み合わせて使用される。他の実施形態において、治療用ts作用物質は、軽度の治療用高体温又は加熱の局所的な適用と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態において、ts作用物質は、ts-RNA分子又はts-タンパク質分子である。いくつかの実施形態において、ts作用物質は、温度感受性ウイルスベクターに挿入された異種の核酸又は自己複製RNAによってコードされる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、これだけに限定されるものではないが、センダイウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、自己複製RNAは、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスのレプリコンを含む。いくつかの実施形態において、アルファウイルスは、これだけに限定されるものではないが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから選択される。いくつかの実施形態において、着目の遺伝子産物はZSCAN4ではない。
本開示の上記及び他の課題及び特徴は、添付の図面に関連して続く次の詳細な説明からさあに明らかになる。
図1A～1Dは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)ゲノムの構造と変異領域の位置を示す。図1Aは、野性型VEEVゲノム(TC-83菌株：完全ゲノム11,446bpの直鎖RNA：NCBI登録：L01443.1 GI：323714)の略図を示す。非構造タンパク質(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)の遺伝子は、RNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、及び構造タンパク質の遺伝子は、ウイルスエンベロープタンパク質(C、E1、E2)、5’-UTR(5’-非翻訳領域)及び3’-UTR(3’-非翻訳領域)をコードする。ボールド体のボックスとして表されるnsP2タンパク質の遺伝子は、温度感受性を生じさせるように変異させた。図1Bは、突然変異1(温度感受性突然変異体1：ts1)を伴うnsP2の略図を示す。5つのアミノ酸がアミノ酸439と440の間に挿入された。図1Cは、突然変異2(ts2)を伴うnsP2の略図を示す。5つのアミノ酸がアミノ酸586と587の間に挿入された。図1Dは、突然変異3(ts3)を伴うnsP2の略図を示す。5つのアミノ酸がアミノ酸594と595の間に挿入された。
図2A～2Cは、ts1、ts2、及びts3に変異した領域に対応するVEEV nsP2の部分配列を示す。図2Aは、5つのアミノ酸挿入をもたらす15ヌクレオチド挿入を含む、変異体1(ts1)と比較した野性型配列を示す。図2Bは、5つのアミノ酸挿入をもたらす15ヌクレオチド挿入を含む、変異体2(ts2)と比較した野性型配列を示す。図2Cは、5つのアミノ酸挿入をもたらす15ヌクレオチド挿入を含む、変異体3(ts3)と比較した野性型配列を示す。
図3はそれぞれ、配列番号19及び配列番号20と記載される、野性型のVEEV nsP1(TC-83菌株)及び変異体4(ts4)の部分ヌクレオチド配列を示す。5’-UTRと51-nt CSE(保存配列要素)がボールド体で示されている。ts4の変異ヌクレオチドには下線が引かれている。
図4A及び4Bは、30℃、32℃、及び37℃におけるsrRNA1ts2とsrRNA1ts3の温度感受性の試験を示す。野性型(srRNA1wt-GFP)と変異(srRNA1ts2-GFP、srRNA1ts3-GFP)自己複製RNA(srRNA)ベクターが作出された。インビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞はそれぞれ、30℃、32℃、及び37℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。細胞の画像をそれぞれ、20時間及び48時間に得た。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を検出する蛍光画像を示す。図4Aは、srRNA1wt-GFP、srRNA1ts2-GFP、及びsrRNA1ts3-GFP RNAを用いた細胞のトランスフェクションの結果を示す。図4Bは、GFPをコードする合成mRNA(synRNA-GFP)を用いた細胞のトランスフェクションの結果を示す。
図5は、32℃におけるsrRNA1ts1とsrRNA1ts2の温度感受性の試験を示す。野性型(srRNA1wt-GFP)と変異(srRNA1ts2-GFPとsrRNA1ts1-GFP)自己複製RNA(srRNA)ベクターが作出された。インビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞は32℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。細胞の画像をそれぞれ、24、48、72、96、120、144、168、192、240、288時間に得た。srRNA1ts1-GFPに関して、24時間及び168時間の画像のみが撮影された。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、GFPの発現を検出する蛍光画像を示す。
図6は、32℃、33℃、及び37℃におけるsrRNA1ts2及びsrRNA1ts4の温度感受性の試験を示す。変異体(srRNA1ts2-GFPとsrRNA1ts4-GFP)自己複製RNA(srRNA)ベクターが作出された。インビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞はそれぞれ、32℃、33℃、及び37℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。細胞の画像をそれぞれ、20、48、96時間に得た。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現を検出する蛍光画像を示す。
図7は、32℃における変異体srRNA1ts2-GFPの温度感受性の試験を示す。変異体ベクター(srRNA1ts2-GFP)のインビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞は32℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列直後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含有し、そして、これにより、トランスフェクト細胞がピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)でおこなった。細胞の画像をそれぞれ、24、48、72、96、144、168、192時間に得た。srRNA1ts1-GFPに関して、24時間及び168時間の画像のみが撮影された。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、GFPの発現を検出する蛍光画像を示す。
図8は、24時間における32℃から37℃への温度切り替えを用いた変異体srRNA1ts2-GFPの温度感受性の試験を示す。変異体ベクター(srRNA1ts2-GFP)のインビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞は32℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。24時間に、細胞を37℃に維持されたCO2インキュベーター内に移した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列直後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含有し、そして、これにより、トランスフェクト細胞がピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)でおこなった。細胞の画像をそれぞれ、24、48、72、96、144、168、192時間に得た。srRNA1ts1-GFPに関して、24時間及び168時間の画像のみが撮影された。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、GFPの発現を検出する蛍光画像を示す。
図9は、48時間における32℃から37℃への温度切り替えを用いた変異体srRNA1ts2-GFPの温度感受性の試験を示す。変異体ベクター(srRNA1ts2-GFP)のインビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞は32℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。48時間に、細胞を37℃に維持されたCO2インキュベーター内に移した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列直後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含有し、そして、これにより、トランスフェクト細胞がピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)でおこなった。細胞の画像をそれぞれ、24、48、72、96、144、168、192時間に得た。srRNA1ts1-GFPに関して、24時間及び168時間の画像のみが撮影された。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、GFPの発現を検出する蛍光画像を示す。
図10は、72時間における32℃から37℃への温度切り替えを用いた変異体srRNA1ts2-GFPの温度感受性の試験を示す。変異体ベクター(srRNA1ts2-GFP)のインビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト誘導多能性幹細胞内にトランスフェクトされた(ADSC-iPSC株)。細胞は32℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。72時間に、細胞を37℃に維持されたCO2インキュベーター内に移した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列直後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含有し、そして、これにより、トランスフェクト細胞がピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)でおこなった。細胞の画像をそれぞれ、24、48、72、96、144、168、192時間に得た。srRNA1ts1-GFPに関して、24時間及び168時間の画像のみが撮影された。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、GFPの発現を検出する蛍光画像を示す。
図11A～11Dは、線維芽細胞において変異体srRNA1ts2-GFPの温度感受性の試験を示す。変異体ベクター(srRNA1ts2-GFP)のインビトロ転写によって製造されたRNAは、ヒト新生児皮膚線維芽細胞内にトランスフェクトされた(HDFn株)。細胞は32℃に維持されたCO2インキュベーター内で培養された。細胞の画像を24、48、及び96時間に得た。上側のパネルは、位相差画像を示し、及び下側のパネルは、GFPの発現を検出する蛍光画像を示す。図11A及び11Bは、JetMessenger(Polyplus)を使用して実施されるトランスフェクションを示す。細胞は、標準培地のみ(図11A)又は200ng/mlのB18Rを補った標準培地(図11B)で培養された。図11C及び11Dは、MessengerMax(ThermoFisher)を使用して実施されるトランスフェクションを示す。細胞は、標準培地のみ(図11C)又は200ng/mlのB18Rを補った標準培地(図11D)で培養された。
図12は、様々なアルファウイルスファミリーメンバーのnsP2変異体2(ts2)に対応するアミノ酸配列のアラインメントを示す。左側のパネルは、配列番号21～28と記載される野性型配列のアラインメント(Russo et al., 2006の図1から一部複製)を示すが、右側のパネルは、nsP2の二次構造の「β5」と「β6」(5番目と6番目のβ鎖)の間の5つのアミノ酸の挿入を含む、配列番号29～36と記載される変異体のアラインメントを示す。VEEV(ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、Aura(アウラウイルス)、WEEV(西部ウマ脳炎ウイルス)、BFV(バーマーフォレストウイルス)、ONNV(オニョン-ニョンウイルス)、RRV(ロスリバーウイルス)、SFV(セムリキフォレストウイルス)、及びSINV(シンドビスウイルス)。
図13は、温度感受性作用物質(ts作用物質)を用いた細胞の典型的なエクスビボ処理を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどのts作用物質は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)で機能しない。ts作用物質で処理された標的細胞は、特定の持続期間(例えば、3日間)にわたり許容温度にて培養され、次に、特定の持続期間(例えば、10日間)にわたり非許容温度にて培養され続ける。着目の遺伝子(GOI)のRNA(又はRNAから翻訳されたタンパク質)の予想レベルは許容温度にて増大し、そして、高いレベルに達する。非許容温度に切り替わった後に、転写と翻訳が止まるので、RNA(又はタンパク質)の予想レベルは漸減する。
図14は、例示的なエクスビボ治療手段を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)で機能しない。標的細胞は、患者の体から採取され(自然移植)、特定の持続期間、例えば24時間、にわたり、許容温度、例えば33℃、にてエクスビボにおいてts作用物質とインキュベートされる。次に、ts作用物質を伴った標的細胞が患者に移植される。37℃の非許容温度にて、ts作用物質は、患者の体内で機能しない。
図15は、別の例示的なエクスビボ治療手段を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)で機能しない。標的細胞は、ドナーの体から採取され(同種移植)、特定の持続期間、例えば24時間、にわたり、許容温度、例えば33℃、にてエクスビボにおいてts作用物質とインキュベートされる。次に、ts作用物質を伴った標的細胞が患者に移植される。37℃の非許容温度にて、ts作用物質は、患者の体内で機能しない。
図16は、例示的なセミインビボ治療手段を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)で機能しない。患者は治療用低体温療法の施術を受け、そして、患者の中核体温は、(正常体温(例えば、37℃)より低い)低温(例えば、33℃)で維持される。標的細胞(自己又は同種のいずれか)は、エクスビボにおいてts作用物質で処理され、そして、即時に患者の循環内に注入されるか、又は患者の器官内に注射される。患者がしばらく(例えば、24時間)、低温(例えば、33℃)で維持されている間、ts作用物質は機能的である。それに続いて、患者の中核体温が正常体温(37℃)に戻ると、そのときには、ts作用物質はもう機能しない。
図17は、例示的なセミインビボ治療手段を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)で機能しない。患者は治療用低体温療法の施術を受け、そして、患者の中核体温は、(正常体温(例えば、37℃)より低い)低温(例えば、33℃)で維持される。ts作用物質は、全身的に、又は特定の器官、組織、若しくは細胞型に送達される。患者がしばらく(例えば、24時間)、低温(例えば、33℃)で維持されている間、ts作用物質は機能的である。それに続いて、患者の中核体温が正常体温(37℃)に戻ると、そのときには、ts作用物質はもう機能しない。
図18は、ヒトニューロンへのES/iPS細胞の分化を示す。典型的な実験手順の略図が示されている。ヒトES/iPS細胞は、-1日目に細胞培養ディッシュ上で平板培養された。0日目に、細胞は、srRNA1ts2-NGN3を用いてトランスフェクトされた。細胞は33℃にて72時間培養された。3日目に、細胞は、新しい培養ディッシュ上で再び平板培養され、そして、次に、細胞培養が37℃に移された。3日目に24時間にわたりピューロマイシンが培地に添加された。位相差顕微鏡像は、0(トランスフェクション前)、1、2、3 (継代前)、4(培地交換前)、5、及び6日目に撮影された。6日目の画像の拡大像も示される。細胞は、9日目に固定され、そして、(成熟ニューロンに特異的である)抗TUBB3(β3-チューブリン)(赤色のシグナル)を用いた免疫染色に使用された(10×及び20×対物レンズ)。
図19は、血管内皮細胞へのヒトES/iPS細胞の分化を示す。典型的な実験手順の略図が示されている。ヒトES/iPS細胞は、-1日目に細胞培養ディッシュ上で平板培養された。0日目に、細胞は、srRNA1ts2-ETV2を用いてトランスフェクトされた。細胞は33℃にて72時間培養された。3日目に、細胞培養が37℃に移された。3日目に48時間にわたりピューロマイシンが培地に添加された。(下側のパネル)位相差顕微鏡像は、1、2、3、4、5、6、7、及び8日目に撮影された。細胞は、8日目に固定され、そして、抗CD31を用いた免疫染色に使用された(10×及び20×対物レンズ)。
図20は、例示的なインビボ治療手段を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、31～34℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、>37℃)で機能しない。(約31～34℃である)患者の体表面又はそのすぐ下の温度(表面体温)は、(約37℃である)患者の中核体温より低い。患者の表面体温にて機能的であるts作用物質は、患者への皮内、皮下、又は筋肉内投与によって直接送達される。さらなる活性がないことが必要である。或いは、ts作用物質の機能がもう必要でないとき、ts作用物質は、患者の表面体温を上げることによって、一過性に機能しないようにされる。
図21は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2、2019-nCoVとしても知られている)のスパイクタンパク質(又はその一部)をコードする例示的なsrRNA1ts2ベクターを示す概略図を図示する。SARS-CoV-2は、コロナウイルス疾患2019(COVID-2019)の起因菌である。srRNA1ts2ベクターの非構造タンパク質(nsP1-nsP4)がRNAゲノムの複製と転写に必要であるが、その一方で、着目の遺伝子(GOI)は、スパイクタンパク質又はその断片をコードする。「srRNA1ts2-2019-nCoV-スパイク」は、2019-nCoVの完全長のスパイクタンパク質(配列番号41)をコードする。「srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD1」は、CD5のシグナルペプチド(残基1～24)と2019-nCoVのスパイクタンパク質のRBDとを含む融合タンパク質(配列番号42)をコードする。「srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD2」は、2019-nCoVのシグナルペプチド、RBD、膜貫通ドメイン、及びスパイクタンパク質の細胞質尾部を含む融合がタンパク質(配列番号43)をコードする。2019-nCoVのRBDのアミノ酸配列は、配列番号44として記載される。略語：SP(シグナルペプチド)；RBD(受容体結合ドメイン)；TM(膜貫通ドメイン)；及びCT(細胞質尾部)。
図22は、例示的なインビボ治療手段を示す概略図を図示する。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、31～35℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、>37℃)で機能しない。(鼻腔と上部気管に関して約32℃及び亜区域気管支に関して35℃(McFadden et al., 1985)である)患者の体の気道の温度(気道温度)は、(約37℃である)患者の中核体温より低い。患者の気道温度にて機能的であるts作用物質は、患者への鼻腔内投与(例えば、吹送、吸入又は点滴)によって直接送達される。さらなる活性がないことが必要である。ts作用物質の機能がもう必要でないとき、ts作用物質は、患者の気道温度を上げることによって、一過性に機能しないようにされる。
図23は、非近交系マウスの後脚に、着目の遺伝子(ルシフェラーゼ)をコードするRNAの皮内投与の結果としてのインビボにおける着目の遺伝子発現を図示する。
図24A～24Bは、SARS-CoV-2(srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1)の受容体結合ドメイン(RBD)をコードする温度感受性srRNA1ts2RNA又はプラセボ(バッファーのみ)の皮内注射によって免疫されたマウスから得られた脾細胞のサンプル中のサイトカイン分泌細胞の頻度を示す。図24Aは、インターフェロン-ガンマ(INF-γ)スポット形成細胞(SFC)の頻度を示し、及び図24Bは、ELISpotアッセイによって測定されるSARS-CoV-2抗原の存在及び不存在中で培養された免疫マウスからの脾細胞のインターロイキン-4(IL-4)SFCの頻度を示す。黒色の棒グラフ(刺激)は、24時間にわたりSARS-CoV-2 RBDを覆う53個のペプチド(11アミノ酸オーバラップを有する15mers)のプールによって刺激された脾細胞を表す。灰色の棒グラフ(対照)は、刺激なしの脾細胞を表す。三連サンプルの平均及び標準偏差(エラーバー)が示されている。
図25A～25Cは、SARS-CoV-2(srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1)の受容体結合ドメイン(RBD)をコードする温度感受性srRNA1ts2RNA又はプラセボ(バッファーのみ)の皮内注射によって免疫されたマウスSARS-CoV-2の抗原反応性血清免疫グロブリンG(IgG)のレベルを示す。要するに、0日目と14日目に、マウスには、プラセボ、又はRNアーゼ阻害剤(黒色の三角形)の存在及び不存在下、srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1を与えた。49日目に、すべてのマウスには、遺伝子組み換えRBDタンパク質(白抜きの三角形)を与えた。アスタリスク(*)は、3(OD450)より高いIgGレベルを示す。図25Aは、プラセボ(バッファーのみ)の2種類の用量を受けたマウスの結果を示す。図25Bは、srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1RNAの2種類の用量を受けたマウスの結果を示す。図25Cは、RNアーゼ阻害剤と組み合わせたsrRNA1ts2-2019-CoV-RBD1RNAの2種類の用量を受けたマウスの結果を示す。アスタリスク(*)は、3(OD450)より高いIgGレベルを示す。すべての群においてN=10。
詳細な説明
総説
出願人は、細胞が、温度感受性治療用作用物質の活性を誘発するための許容温度にて培養され得ること、及び活性が細胞内の治療効果につながり得ることを実証した。そのうえ、温度感受性治療用作用物質の活性は、続いて非許容温度にて細胞をインキュベートすることによって、低減されるか、又は阻害され得る。出願人はまた、最初に、インビボにおける温度感受性作用物質(ts作用物質)の使用方法も提供した。インビボで使用される同じタイプのts作用物質は、インビトロにおいて使用され得る。例えば、対象の体幹へのts作用物質の投与後、対象の中核体温は、ts作用物質の活性を誘発するための許容温度に下げられ得る。或いは、対象の表面(表皮、真皮、皮下組織、又は骨格筋)へのts作用物質の投与後、対象の表面体温は、ts作用物質の活性を誘発するための許容温度にて維持される。対象の表面体温は、自然に又は人為的に維持されてもよい。これらの方法は、核酸やポリペプチドなどの治療用作用物質を送達し、そして、一過性に活性化する新しい方法を提供する。特に、本開示は、細胞への核酸とタンパク質の温度感受性送達のためのツールを提供するが、但し、該核酸とタンパク質は、ZSCAN4の核酸とタンパク質でない。
従って、本開示は概して、インビトロにおいて温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の活性を一過性に誘発する方法に関する。いくつかの実施形態において、温度感受性治療用作用物質を含む1若しくは複数の細胞は、該温度感受性治療用作用物質の活性を誘発するための許容温度にて培養される。細胞は、該細胞において治療効果を誘発するために、温度感受性治療用作用物質にとって十分な期間にわたって許容温度にて培養される。次に、細胞は、非許容温度に戻され、ここで、該非許容温度は、温度感受性治療用作用物質の活性を低減するか、又は阻害する。別の実施形態において、1若しくは複数の細胞は、あらかじめ温度感受性治療用作用物質を含んでおらず、かつ、温度感受性治療用作用物質と初めて接触する。いくつかの実施形態において、1若しくは複数の細胞における治療効果を誘発した後に、該細胞がそれを必要としている対象に投与される。いくつかの実施形態において、1若しくは複数の細胞は、治療を必要としている対象から単離され、そして、温度感受性治療用作用物質で処理した後に、その細胞を前記対象に返す。
別の態様において、本開示は、インビボにおいて温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の活性を一過性に誘発する方法に関する。いくつかの実施形態において、対象の1若しくは複数の細胞は、温度感受性治療用作用物質を含み、その対象の体温は、該細胞において治療効果を誘発するために、温度感受性治療用作用物質にとって十分な期間にわたり許容温度まで下げられ、次に、対象の体温は正常体温に戻される。別の実施形態において、温度感受性治療用作用物質は、該対象の体温が許容温度まで下げられる前又は後のいずれかで対象に投与される。
本開示の他の態様は、疾患又は状態に罹患している対象の骨髄細胞を動員することによって疾患又は状態を治療することに関し、その方法は、以下：対象から動員骨髄細胞を単離し、約33℃±0.5℃の温度にて単離骨髄細胞を培養し、前記細胞を、センダイウイルスベクターなどの温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNA(srRNA)と接触させ、ここで、該ウイルスベクター又はsrRNAは異種核酸分子を含む、十分な期間にわたり約33℃±0.5℃にて接触細胞を維持し、ここで、該ウイルスベクター又はsrRNAは33℃±0.5℃にて複製されることができ、かつ、該ウイルスベクター又はsrRNAの複製は異種核酸分子の発現増加につながる、そして、該接触細胞を疾患又は状態を治療する対象に移植すること、を含む。或いは、対象から動員骨髄細胞を単離した後に、その単離骨髄細胞を、センダイウイルスベクターなどの温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性がsrRNAと接触させ、その後、その細胞を、約33℃±0.5℃の温度にて培養する。
別の態様において、本開示は、センダイウイルスベクターなどの温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNA(srRNA)を、それを必要としている対象に投与し、ここで、該ウイルスベクター又はsrRNAは異種核酸を含む、対象の中核体温を約33℃±0.5℃に下げ、十分な期間にわたり対象の中核体温を約33℃±0.5℃に維持し、ここで、該ウイルスベクター又はsrRNAは33℃±0.5℃にて複製されることができ、かつ、ウイルスベクター又はsrRNAの複製は異種核酸分子の発現増加につながる、そして、該対象の中核体温を正常に戻すことによって疾患又は状態を治療することに関する。或いは、対象の中核体温を約33℃±0.5℃に下げることは、センダイウイルスベクターなどの温度感受性ウイルスベクター、又は温度感受性srRNAを投与する前に行われる。
対象に、それらの一般的な及び特定の形態で、ts作用物質、又はts作用物質を含む細胞を投与することによって疾患又は状態を治療する方法に対する参照文献及び請求項は同様に、以下：
a) 疾患又は状態の治療用作用物質の製造のためのts作用物質又はts作用物質を含む細胞の使用；及び
b) 疾患又は状態の治療のための、ts作用物質又はts作用物質を含む細胞を含む医薬組成物、
に関する。
手続き方法の段落のいくつかの実施形態において、異種核酸は、着目(GOI)の遺伝子を含むか、又は着目のタンパク質をコードする。好ましい実施形態において、着目のタンパク質は治療用作用物質である。いくつかの実施形態において、GOIは、GOIのドミナントネガティブ形態、又は人工タンパク質(例えば、異なるタンパク質ドメインを融合することによって作製されたハイブリッドタンパク質)をコードする人工遺伝子である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ノンコーディングRNA、siRNA、又はshRNAを含む。他の実施形態において、異種核酸は、エンドヌクレアーゼ編集システムを含む。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ編集システムは、これだけに限定されるものではないが、ZFNシステム、TALENsシステム、及びCRISPR/CAS9システムから選択される。いくつかの実施形態において、着目のタンパク質は、これだけに限定されるものではないが、ヒトニューロゲニン-3(NGN3)、ヒトETS転座変異体2(ETV2)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、及び神経成長因子(NGF)から選択される。いくつかの実施形態において、着目のタンパク質は、エリスロポイエチン(EPO)又は顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である。他の実施形態において、着目のタンパク質は、酵素補充療法のためのアデノシンデアミナーゼ(ADA)などの酵素である。いくつかの実施形態において、着目のタンパク質は、感染症に対するワクチン接種の目的のための、ウイルス、原生動物、又は細菌などの病原体によってコードされた抗原である。
定義
本明細書及び付属の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、及び「該(the)」は、別段の指示がない限り、複数形を含む。例えば、「ある(a)ポリヌクレオチド」は、1若しくは複数のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される「～を含むこと」という語句は、オープンエンドであり、このような実施形態が、さらなる要素を含みうることを指し示す。これに対し、「～から成る」という語句は、クローズドであり、このような実施形態が、さらなる要素を含まない(微量の不純物を除き)ことを指し示す。「～から本質的になる」という語句は、部分的にクローズドであり、このような実施形態が、このような実施形態の基本的な特徴を実質的に変化させない要素をさらに含みうることを指し示す。本明細書で「～を含むこと」として記載される態様及び実施形態は、「～から成る」実施形態及び「本質的に～から成る」実施形態を含むことが理解される。
温度を除いて、値に言及して本明細書で使用される「約」という用語は、別段指示されない限り、その値の90％～110％を包含する(例えば、約30分とは、27分～33分を指す)。摂氏単位の温度に関して使用するとき、約とは、別段指示されない限り、その値の－1℃～＋1℃を包含する(例えば、約37℃とは、36℃～38℃を指す)。対照的に、それ以外の記載を伴わないプラス及びマイナスの使用は、表示した範囲を線引きする(例えば、33℃±0.5℃とは32.5℃～33.5℃を指す)。
本明細書中に使用される場合、数値範囲は、範囲を定義する数字を含んでいる(例えば、12～18ヌクレオチドとは、12、13、14、15、16、17及び18ヌクレオチドを包含する)。
「単離された」及び「精製された」という用語は、本明細書中で使用される場合、その環境(例えば、細胞培養、生物学的サンプルなど)から取り除かれた(例えば、分離された)目的物(例えば、細胞)を指す。「単離された」目的物は、それらが関連している他の成分を少なくとも50%含まず、好ましくは75%含まず、より好ましくは少なくとも90%含まず、最も好ましくは少なくとも95%(例えば、95%、96%、97%、98%、又は99%)含まない。
「個体」及び「対象」という用語は、哺乳動物を指す。「哺乳動物」としては、これだけに限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長動物(例えば、サル)、家畜、競技動物、齧歯動物(例えば、マウス及びラット)、及び愛玩動物(例えば、イヌ及びネコ)が挙げられる。
医薬組成物に関する「用量」という用語は、本明細書中で使用される場合、どの時点においても、対象(に投与された又は与えられた)によって摂取された組成物の計量部分を指す。
疾患又は状態を「治療する」という用語は、疾患の徴候又は症状を軽減しようとする試みにおいて、1若しくは複数の医薬組成物を個体(ヒト又は他の動物)へと投与することを含み得るプロトコールを実施することを指す。したがって、「治療すること」又は「治療」は、徴候又は症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、個体に対して、緩和効果だけを及ぼすプロトコールを具体的に含む。本明細書で使用される場合、及び当技術分野で十分に理解されているように、「治療」とは、臨床結果を含む、有益な又は所望の結果を得るための手法である。有益又は所望の臨床結果は、これだけに限定されるものではないが、1若しくは複数の症状の軽減又は改善、疾患の程度の縮小、疾患の安定化(すなわち、非増悪)状態、疾患の拡散の防止、疾患の進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解(部分的であれ、完全であれ)を含む。
免疫応答の「刺激」とは、デノボの免疫応答(例えば、初期ワクチン接種レジメンの帰結としての)を誘発すること、又は既存の免疫応答（例えば、追加ワクチン接種レジメンの帰結としての）を増強することから生じうる、免疫応答の増大を意味する。いくつかの実施形態において、免疫応答の刺激としては、これだけに限定されるものではないが、以下：CD4+ヘルパーT細胞増殖を刺激すること；サイトカイン生成を刺激すること；Bリンパ球増殖を刺激すること；刺激抗体産生を刺激すること；CD8+細胞毒性T細胞増殖を刺激すること；及び感染細胞の細胞溶解を刺激すること、から成る群のうちの1若しくは複数が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態において、免疫応答の刺激は、対象の抗原特異的抗体応答を増強することを含む。好ましくは、抗原特異的抗体応答の増強は、投与前レベルより少なくとも2、3又は4倍高い抗原特異的抗体の濃度の増強を含む。いくつかの実施形態において、抗原特異的抗体応答の増強は、最低レベルを上回る、好ましくは、血清防御レベルを上回る抗原特異的抗体の濃度の増強を含む。
温度感受性作用物質
本開示の特定の態様は、1若しくは複数の細胞における温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の活性を一過性に誘発することに関する。温度感受性作用物質の活性は、作用物質の任意の所望の活性化、複製、又は発現増加を指す。本明細書中に使用される場合、「温度感受性作用物質」という用語は、異なる温度にて異なるレベルの機能性を有する任意の核酸又はポリペプチドを指す。例示的な温度感受性作用物質としては、これだけに限定されるものではないが、温度感受性ウイルスベクター、温度感受性自己複製RNA、及び温度感受性ポリペプチドが挙げられる。
本明細書中に使用される場合、「許容温度」という用語は、本開示の温度感受性作用物質の活性が誘発される任意の温度を指す。典型的には、許容温度は、対象の正常体温ではない。ヒト対象の正常体温は、約37℃±0.5℃である。温度感受性作用物質により、許容温度は、対象の正常体温より高い温度であっても、又は低い温度であってもよい。いくつかの態様において、温度感受性作用物質の許容温度は、30℃～36℃の範囲にある。いくつかの実施形態において、許容温度は、約31℃～約35℃、又は32℃～34℃(33℃±1.0℃)である。いくつかの好ましい実施形態において、許容温度は、33℃±0.5℃である。その結果として、いくつかの実施形態において、本開示の温度感受性自己複製RNAの非許容温度は、36℃超である。いくつかの好ましい実施形態において、非許容温度は37℃±0.5℃である。
いくつかの実施形態において、許容温度にて誘発される温度感受性作用物質の活性は、非許容温度にて低減又は阻害される。「非許容温度」という用語は、本明細書中に使用される場合、本開示の温度感受性作用物質の活性が誘発されない任意の温度を指す。温度感受性作用物質の活性が、最適の許容温度における活性レベル低いとも95%低い、少なくとも90%低い、少なくとも85%低い、少なくとも80%低い、少なくとも75%低い、又は少なくとも50%低いときに、温度感受性作用物質は誘発されていない。典型的には、非許容温度は、対象の正常体温である。温度感受性作用物質により、非許容温度はまた、対象の正常体温より高い温度であっても、又は低い温度であってもよい。
温度感受性ウイルスベクター
特定の実施形態において、本開示の温度感受性治療用作用物質は、温度感受性ウイルスベクターを含んでもよい。いくつかの実施形態において、許容温度にて誘発される温度感受性ウイルスベクターの活性としては、ベクターの複製が挙げられ得る。本明細書中に使用される場合、「温度感受性ウイルスベクター」という用語は、異なる温度にて異なるレベルの機能性を有する任意のウイルスベクターを指す。例示的な温度感受性ウイルスベクターとしては、これだけに限定されるものではないが、センダイウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はアルファウイルスベクターが挙げられる。例示的な温度感受性アルファウイルスベクターとしては、これだけに限定されるものではないが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、及びセムリキフォレストウイルスベクターが挙げられる。
本開示のいくつかの実施形態において、温度感受性ウイルスベクターは、異種核酸(例えば、ウイルスベクターと関連した外来核酸)を含む。核酸は、遺伝要素を含んでもよい。本明細書中に使用される場合、「遺伝要素」という用語は、着目のRNA又はポリペプチドをコードする任意の核酸を指す。例示的な遺伝要素としては、これだけに限定されるものではないが、着目の遺伝子(GOI)、着目の遺伝子のドミナントネガティブ形態、異なるタンパク質ドメインを融合することによって作製されたハイブリッドタンパク質などの人工タンパク質、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムをコードする人工遺伝子が挙げられる。いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼ編集システムは、ZFNシステム、TALENsシステム、及びCRISPR/CAS9システムから選択される。いくつかの実施形態において、GOIは、これだけに限定されるものではないが、ヒトニューロゲニン-3(NGN3)、ヒトETS転座変異体2(ETV2)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、及び神経成長因子(NGF)から選択されるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、着目のタンパク質は、エリスロポイエチン(EPO)又は顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である。他の実施形態において、着目のタンパク質は、酵素補充療法のための、アデノシンデアミナーゼ(ADA)などの酵素である。いくつかの実施形態において、着目のタンパク質は、感染症に対するワクチン接種の目的のための、ウイルス、原生動物、又は細菌などの病原体によってコードされる抗原である。
本開示の温度感受性ウイルスベクターの許容温度は、典型的には、30℃～36℃又は38℃～50℃の範囲にある。いくつかの実施形態において、許容温度は、約31℃～約35℃、又は32℃～34℃(33℃±1.0℃)でがある。いくつかの好ましい実施形態において、許容温度は、33℃±0.5℃である。その結果として、いくつかの実施形態において、本開示の温度感受性ウイルスベクターの非許容温度は、36℃超かつ38℃未満である。いくつかの好ましい実施形態において、非許容温度は37℃±0.5℃である。
本明細書中に開示されるように、細胞は、温度感受性作用物質が効果を誘発するのに十分な期間にわたり許容温度にて維持されてもよい。いくつかの実施形態において、温度感受性ウイルスベクターは、遺伝要素を含み、かつ、効果としては、該遺伝要素の発現増加を含み、ここで、該遺伝要素の発現は、細胞で生物学的効果を生じるRNA又はポリペプチドの産生をもたらす。いくつかの好ましい実施形態において、効果とは、治療効果である。
温度感受性自己複製RNA
特定の実施形態において、本開示の温度感受性治療用作用物質は、温度感受性自己複製RNAを含んでもよい。本明細書中に使用される場合、「温度感受性自己複製RNA」という用語は、異なる温度にて異なるレベルの機能性を有する任意の自己複製RNAを指す。
いくつかの実施形態において、温度感受性自己複製RNAは通常、ウイルス粒子形成に必要である構造タンパク質をコードするDNAを取り除くことによって、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、シンドビスウイルス(SINV)、及びセムリキフォレストウイルス(SFV)などのアルファウイルスから作製される一本鎖RNAである自己複製RNAを操作することによって作製される(Petrakova et al., 2005)。いくつかの実施形態において、自己複製RNAは非構造タンパク質(nsPs)をコードし、そしてそれは、自己複製RNA自体を複製し、及び翻訳のための転写産物を産生するRNA依存性RNAポリメラーゼとして機能する。いくつかの実施形態において、自己複製RNAはまた、着目のタンパク質をコードする着目の遺伝子(GOI)、及びその他の遺伝要素も含み得る。いかなる理論にも縛られることを望むものではないが、いくつかの実施形態において、そのRNAの正のフィードバック産生のため、自己複製RNAは高レベルでGOIを発現し得る。いくつかの実施形態において、温度感受性自己複製RNAは、nsPsをコードする遺伝子を変異させることによって作製されてもよい。
いくつかの実施形態において、温度感受性自己複製RNAは、裸のRNA(すなわち、合成RNA)として哺乳動物細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、温度感受性自己複製RNAは、ナノ粒子でカプセル化された裸のRNA(すなわち、合成のRNA)として哺乳動物細胞に送達され得る。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞を標的化するように操作される。いくつかの実施形態において、温度感受性自己複製RNAは、ウイルス粒子として哺乳動物細胞に送達され得、そしてそれは、ヘルパー細胞をパッキングすることによって欠けたウイルス構造タンパク質を補うことによって作出される。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞を標的化するように操作される。
温度感受性作用物質が温度感受性自己複製RNAであるときに、許容温度にて誘発される温度感受性自己複製RNAの活性は、RNAの複製を含んでもよい。
いくつかの態様において、本開示の温度感受性自己複製RNAの許容温度は典型的には、30℃～36℃の範囲にある。いくつかの実施形態において、許容温度は、約31℃～約35℃、又は32℃～34℃(33℃±1.0℃)である。いくつかの好ましい実施形態において、許容温度は、33℃±0.5℃である。その結果として、いくつかの実施形態において、本開示の温度感受性自己複製RNAの非許容温度は、36℃超である。いくつかの好ましい実施形態において、非許容温度は37℃±0.5℃である。
他の態様において、本開示の温度感受性自己複製RNAの許容温度は典型的に、38℃～50℃の範囲にある。その結果として、いくつかの実施形態において、本開示の温度感受性自己複製RNAの非許容温度は、36℃超かつ38℃未満である。いくつかの好ましい実施形態において、非許容温度は、37℃±0.5℃である。
温度感受性ポリペプチド
特定の実施形態において、本開示の温度感受性治療用作用物質は、温度感受性ポリペプチドを含んでもよい。本明細書中に使用される場合、「温度感受性ポリペプチド」という用語は、異なる温度にて異なるレベルの機能性を有する任意の温度感受性ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、温度感受性ポリペプチドは、温度感受性抗体であってもよい。他の実施形態において、温度感受性ポリペプチドは、これだけに限定されるものではないが、転写因子、成長因子、細胞表面マーカー、細胞融合タンパク質、エピジェネティック修飾因子、酵素、及び構造タンパク質、から選択される。
温度感受性作用物質が温度感受性ポリペプチドであるときに、許容温度にて誘発される温度感受性タンパク質の活性は、タンパク質の立体配座変化(例えば、構造又は形状に対する変更)を含んでもよい。
本開示の温度感受性ポリペプチドの許容温度は、典型的には、30℃～36℃又は38℃～50℃の範囲にある。いくつかの実施形態において、許容温度は、約31℃～約35℃、又は32℃～34℃(33℃±1.0℃)でがある。いくつかの好ましい実施形態において、許容温度は、33℃±0.5℃である。その結果として、いくつかの実施形態において、本開示の温度感受性自己複製ポリペプチドの非許容温度は、36℃超かつ38℃未満である。いくつかの好ましい実施形態において、非許容温度は37℃±0.5℃である。
本開示の種々の態様は、実質的に精製されたポリペプチドに関する。実質的に精製されたポリペプチドは、それが自然に関連している他のポリペプチド、脂質、炭水化物又はその他の物質を実質的に含まないポリペプチドを指してもよい。一実施形態において、ポリペプチドは、それが自然に関連している他のポリペプチド、脂質、炭水化物又はその他の物質の少なくとも50%、例えば少なくとも80%を含まない。別の実施形態において、ポリペプチドは、それが自然に関連している他のポリペプチド、脂質、炭水化物又はその他の物質の少なくとも90%を含まない。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、それが自然に関連している他のポリペプチド、脂質、炭水化物又はその他の物質の少なくとも95%を含まない。
核酸とポリペプチド
本開示の特定の態様は、1若しくは複数の細胞において温度感受性治療用作用物質の活性を一過性に誘発することに関し、ここで、該活性は核酸分子の発現増加につながる。いくつかの実施形態において、核酸はポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドはあらゆる長さの核酸配列(例えば、直鎖状配列)を指すことができる。したがって、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドを含み、かつ、染色体中に見出される遺伝子配列も含む。オリゴヌクレオチドは本来のホスホジエステル結合によって結合した複数の連結ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは6ヌクレオチドと300ヌクレオチドの間の長さのポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド類似体はオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、非天然部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチド類似体は非天然部分、変化した糖部分又は糖間結合、例えば、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを含み得る。天然ポリヌクレオチドの機能類似体はRNA又はDNAに結合することができ、かつ、ペプチド核酸(PNA)分子を含む。
特定の実施形態において、核酸分子又はポリヌクレオチドは、遺伝要素をコードする。これらのポリヌクレオチドとしては、(着目の遺伝子をコードする)DNA、cDNA、及びmRNA配列などのRNA配列が挙げられる。コード配列を異種性プロモーターに動作可能に連結してその遺伝要素の直接的な転写をおこなわせることができる。プロモーターは核酸の転写をおこなわせる核酸制御配列を指すことができる。プロモーターは転写開始部位の近傍に必須核酸配列を含む。プロモーターは遠位エンハンサー配列又は遠位リプレッサー配列を含んでもよい。構成的プロモーターは、絶えず活性型であり、かつ、外部シグナル又は外部分子による調節の対象ではないプロモーターである。対照的に、誘導プロモーターの活性は外部シグナル又は外部分子(例えば、転写因子)によって調節される。第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的関係状態で配置されているときにその第1の核酸配列はその第2の核酸配列に動作可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を与える場合にそのプロモーターはそのコード配列に動作可能に連結している。通常、動作可能に連結している核酸配列は連続的であり、2つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には同じリーディングフレームにある。異種性ポリペプチド又は異種性ポリヌクレオチドは異なる起源又は種に由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。プロモーターは転写開始部位の近傍にある必須核酸配列を含み、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合はTATA配列を含む。プロモーターは転写開始部位から数千塩基対もの位置にあり得る遠位エンハンサー配列又は遠位リプレッサー配列を含んでもよい。一例では、前記プロモーターは構成的プロモーター、例えば、CAGプロモーター(Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991)又はホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはテトラサイクリン誘導プロモーター(Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005)などの誘導プロモーターである。遺伝要素の発現をおこなわせるために使用され得る他の例示的なプロモーターにはlacシステム、trpシステム、tacシステム、trcシステム、ラムダファージの主要オペレーター領域及びプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、SV40の初期プロモーター及び後期プロモーター；ポリオーマウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス及びシミアンウイルス由来のプロモーター；3－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、及び酵母α交配因子のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。本開示の遺伝要素は、構成的プロモーター、誘導プロモーター、若しくは本明細書中に記載したその他の好適なプロモーター又は当業者によって容易に認識される他の好適なプロモーターの制御下にあり得る。
いくつかの実施形態において、温度感受性作用物質の活性を誘発ことは、核酸又はポリペプチドの発現増加につながり、そしてそれは、例えば、作用物質と接触させていないヒト細胞におけるポリヌクレオチド又はポリペプチド発現に対して、少なくとも1.5倍、少なくとも1.6倍、少なくとも1.7倍、少なくとも1.8倍、少なくとも1.9倍、少なくとも2.0倍、少なくとも2.1倍、少なくとも2.1倍、少なくとも2.2倍、少なくとも2.3倍、少なくとも2.4倍、少なくとも2.5倍、少なくとも2.6倍、少なくとも2.7倍、少なくとも2.8倍、少なくとも2.9倍、少なくとも3.0倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4.0倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5.0倍、少なくとも5.5倍、少なくとも6.0倍、少なくとも6.5倍、少なくとも7.0倍、少なくとも7.5倍、少なくとも8.0倍、少なくとも8.5倍、少なくとも9.0倍、少なくとも9.5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、少なくとも500倍、少なくとも600倍、少なくとも700倍、少なくとも800倍、少なくとも900倍、少なくとも1,000倍、少なくとも2,000倍、少なくとも3,000倍、少なくとも4,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも6,000倍、少なくとも7,000倍、少なくとも8,000倍、少なくとも9,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも25,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも75,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも125,000倍、少なくとも150,000倍、少なくとも175,000倍に、少なくとも200,000倍、少なくとも225,000倍、少なくとも250,000倍、少なくとも275,000倍、少なくとも300,000倍、少なくとも325,000倍、少なくとも350,000倍、少なくとも375,000倍、少なくとも400,000倍、少なくとも425,000倍、少なくとも450,000倍、少なくとも475,000倍、少なくとも500,000倍、少なくとも750,000倍、又は少なくとも1,000,000倍の発現増加を含み得る。
本開示の種々の態様は、単離された核酸又は合成mRNA分子などの単離された実体に関する。単離された核酸は、
他の核酸配列やその核酸、すなわち、他の染色体性及び染色体外DNA及びRNA、がそこで自然に生じている生物体の細胞から実質的に分離されたか又は精製された。これにより、「単離」という用語は、標準的な核酸精製方法によって精製された核酸を包含する。その用語はまた、宿主細胞における組換発現によって調製された核酸、並びに化学的に合成した核酸も包含する。同様に、単離されたポリペプチドは、タンパク質がそこで自然に生じている、並びに宿主細胞における組換発現によって調製されたポリペプチド及び化学的に合成されたポリペプチドを包含する生物体の細胞の他のポリペプチドから実質的に分離されるか又は精製された。同様に、単離細胞は、他の細胞型から実質的に分離されている。
細胞内に温度感受性作用物質を導入する方法
いくつかの実施形態において、1若しくは複数の細胞を、温度感受性作用物質と接触させる。接触とは、固体及び液体の両方を含めた、直接的な物理的な関連性にある配置を指す。「接触」は、「曝露」と互換的に使用されてもよい。場合によっては、「接触」は、細胞内への核酸分子のトランスフェクトなどの、トランスフェクトを含む。場合によっては、「接触」は、1若しくは複数の細胞内への温度感受性作用物質の導入を含む。
いくつかの実施形態において、温度感受性作用物質はポリヌクレオチド(例えば、自己複製RNA)であり、そして、ポリヌクレオチドは細胞内に導入される。細胞内への核酸分子又はタンパク質の導入は、細胞内への核酸分子又はタンパク質のあらゆる送達手段を包含する。例えば、核酸分子は、細胞内にトランスフェクトされるか、形質導入されるか、又はエレクトポレーション処理され得る。いくつかの実施形態において、温度感受性作用物質は、ポリペプチド(例えば、温度感受性ポリペプチド)であり、そして、ポリペプチドは細胞内に導入される。細胞内へのポリペプチドの送達は、例えば、タンパク質形質導入ドメイン(例えば、HIV-1 Tat)又はポリ-アルギニンペプチドタグ(Fuchs and Raines, Protein Science 14:1538-1544, 2005)、を有するペプチドなどの細胞ペプチドとタンパク質を融合することによって、達成され得る。タンパク質形質導入ドメインは、古典的なエンドサイトーシスから独立した機構によって細胞内へのより大きな分子(タンパク質、核酸分子など)の侵入を容易にする、小さいカチオン性ペプチドを指してもよい。ポリ-アルギニンペプチドタグは、細胞内へのより大きい分子(タンパク質や核酸分子など)の送達を容易にする、アルギニン残基から成る短ペプチド(一般に7～11残基)を指してもよい(例えば、Fuchs and Raines, Protein Science 14:1538-1544, 2005を参照のこと)。
温度感受性作用物質を用いた細胞内への核酸の導入は、温度感受性ウイルスベクター(統合型又は非統合型ウイルスベクターなど)又は温度感受性プラスミドベクターの使用を伴ってもよい。これらの方法のそれぞれは、当該技術分野で記載されており、そのため、当業者の能力の範疇にある。ヒト細胞に対する核酸に使用され得るそれぞれの方法に関する簡単な概要が、本明細書中に提供される。宿主細胞内に導入され、その結果、形質転換宿主細胞を生じる場合、ベクターは核酸分子を指してもよい。ベクターは、複製開始点(DNA合成の開始に関与するDNA配列)など、宿主細胞におけるその複製を可能する核酸配列を含んでもよい。例えば、発現ベクターは、挿入された(単数若しくは複数の)遺伝子の転写及び翻訳を可能にするのに必要な調節配列を含んでいる。ベクターはまた、1若しくは複数の選択マーカー遺伝子及び当該技術分野で知られている他の遺伝要素を含んでもよい。ベクターは、例えばウイルスベクターやプラスミドベクターを含んでもよい。
許容温度
許容温度における1若しくは複数の細胞のインキュベート
本開示の特定の態様は、温度感受性作用物質の活性を誘発するための許容温度にて細胞をインキュベートすることによって1若しくは複数の細胞において温度感受性作用物質の活性を一過性に誘発することに関する。いくつかの実施形態において、許容温度は、標準的な細胞培養温度よりさらに高くても又は低くてもよい。例えば、ヒト及び齧歯動物細胞は典型的に、約37℃の温度にて培養される。従って、いくつかの実施形態において、許容温度は、約36.5℃より低くてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、36℃、35.5℃、35℃、34.5℃、34℃、33.5℃、33℃、32.5℃、32℃、31.5℃、31℃、30.5℃、又は30℃の許容温度にて培養される。いくつかの好ましい実施形態において、許容温度は、30℃～36℃、31℃～35℃、又は32℃～34℃、又は32.5℃～33.5℃である。いくつかの実施形態において、許容温度は、(下限)30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、又は35℃以上、かつ、(上限)36℃、35℃、34℃、33℃、32℃又は31℃以下である。
他の実施形態において、許容温度は、約37.5℃より高い場合がある。例えば、いくつかの実施形態において、細胞は、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃、40.5℃、41℃、41.5℃、42℃、42.5℃、43℃、43.5℃、44℃、44.5℃、45℃、45.5℃、46℃、46.5℃、47℃、47.5℃、48℃、48.5℃、49℃、49.5℃、又は50℃の許容温度にて培養される。
いくつかの実施形態において、許容温度にてインキュベートした後に、1若しくは複数の細胞は、非許容温度にて培養され、ここで、温度感受性作用物質の活性は低減されるか、又は阻害される。例えば、温度感受性ウイルスベクターの複製が阻害され得、温度感受性自己複製RNAの複製が阻害され得、そして、温度感受性ポリペプチドへの立体配座変化が阻害され得る。この温度シフトは、温度感受性作用物質の活性が一過性に誘発され、その後、阻害されることを可能にする。他の実施形態において、1若しくは複数の細胞は、許容温度にて培養された後に、対象に投与される。1若しくは複数の細胞は、許容温度での培養から直接対象に投与され得るか、又は培養中、最初に、許容温度から非許容温度に移し、その後、対象に投与され得る。特定の実施形態において、温度感受性作用物質はそれに続いて、分解される。例えば、非統合型温度感受性ウイルスベクター、RNA、及びポリペプチドは分解される。
対象の中核体温を許容温度に下げる
本開示の特定の態様は、温度感受性作用物質の活性を誘発するために対象の中核体温を許容温度に下げることによって、対象の細胞における温度感受性治療用作用物質の活性を一過性に誘発することに関する。いくつかの実施形態において、対象の中核体温は、目標温度管理(TTM)手順を用いて下げられる。TTM手順は、持続期間にわたり対象の特定の体温を達成し、そして維持するように設計される。斯かる手順は、あらかじめ、心発作や脳卒中などの様々な急性の健康問題から生じるネガティブ効果を低減するために治療的に使用された。それらを使用する装置と一般的方法は、当該技術分野で知られており、本明細書中に記載した方法で使用できる。その手順は、冷却カテーテル、冷却ブランケット、及び体の周りへの氷の適用を含めた多くの方法を使用して実施できる。
対象の中核体温を許容温度に下げた後に、対象の中核体温は、温度感受性作用物質の活性を誘発するのに十分な時間にわたり許容温度で維持される。対象の中核体温は、それに続いて(非許容温度である)正常な中核体温に戻され、ここで、該温度感受性作用物質の活性は低減されるか又は阻害される。特定の実施形態において、温度感受性作用物質は、それに続いて分解される。例えば、非統合型温度感受性ウイルスベクター、RNA、及びポリペプチドは、非許容温度にて分解される。本明細書中に使用される場合、「体温」という用語は、別段関係が明確に示されない限り、「中核体温」を指す。
対象の表面体温を許容温度で維持する
本開示の特定の態様は、対象の体の領域における正常温度差を利用することに関する。例えば、ヒト対象の体の表面又は表面付近の温度(表面体温)は、約31～34℃であり、そしてそれは、(約37℃である)ヒト対象の中核体温より低い。本明細書中に使用される場合、対象の体の「表面」とは、表皮、真皮、皮下組織、又は筋のうちの1若しくは複数を指す。対象の体の「皮膚」とは、表皮及び真皮の一方又は両方を指す。よって、対象の体の表皮、真皮、又は皮下組織への投与の好適な経路としては、皮内及び皮下投与が挙げられる。対象の体の表面付近の筋肉への好適な投与経路は、筋肉内投与である。
例えば、ts作用物質は、対象の皮膚の特定の領域(ワクチン接種の場合)、又は対象の皮膚のより広い領域(皮膚病の治療の場合)に直接送達する。皮膚温度(約31～34℃)は、ts作用物質の許容温度であり、ts作用物質が機能することを許可する。さらなる活性はGOIの長期間発現に必要とされない。ts作用物質の機能の停止が必要とされるか又は所望されるので、治療した皮膚の温度は、加熱の局所的な適用(例えば、加熱パッチ若しくは加熱ブランケット)によって又は軽度の治療用温熱療法(例えば、温浴又は熱サウナ)によって、非許容温度(>37℃)に高められ、そして、一過性に維持される。中核体温は非許容温度(約37℃)なので、この治療手段は、安全である、すなわち、ts作用物質は体の意図した領域でのみ機能する。いくつかの実施形態において、対象の表面体温が正常より高くなければならないなら、表面体温は、ts作用物質の許容温度に合致するように下げられる。
対象の上気道温度を許容温度にて維持する
ヒト対象の表面体温のように、ヒト対象の上気道及び上部気管の温度は、ts作用物質の許容温度であり、そして、ts作用物質が機能することを許可する。すなわち、ヒト対象の鼻腔及び上部気管の温度は約32℃であり、及びヒト対象の亜区域気管支の温度は約35℃である(McFadden et al., 1985)。このように、ヒト患者の上気道(鼻腔、咽頭、及び/又は喉頭)及び/又は上部気管の細胞に鼻腔内投与されたts作用物質は、ヒト患者の中核体温を下げずに、機能的である。鼻腔内投与は、吹送、吸入又は点滴によっておこなわれてもよい。
非許容温度
1若しくは複数の細胞を非許容温度にてインキュベートする
通常、細胞のインビトロ培養は、その細胞を得た対象の正常体温にて実施される。例えば、ヒト細胞やマウス細胞などの哺乳動物細胞は、通常、約37℃にて培養される。本開示の特定の態様は、対象の正常体温にて機能しない(例えば、遺伝子を複製しないか又は発現しない)温度感受性作用物質に関する。よって、対象の正常体温とは、温度感受性作用物質の非許容温度である。いくつかの好ましい実施形態において、非許容温度は37℃±0.5℃である。
対象の正常中核体温
いくつかの実施形態において、温度感受性作用物質、温度感受性作用物質と接触させた細胞、又は温度感受性作用物質を担持する細胞は、正常体温に維持されている対象の体内に導入される。本開示の特定の態様は、その生物体のこの正常体温(非許容温度)にて、機能、例えば、遺伝子の複製又は発現、をしない温度感受性作用物質に関する。この特徴は、対象の生涯を通じて温度感受性作用物質の望ましくない作用又は再活性化を予防する安全機構を提供する。
ヒト細胞
本開示の特定の態様は、これだけに限定されるものではないが、ヒト成体細胞を含めた1若しくは複数のヒト細胞において温度感受性治療用作用物質の活性を一過性に誘発することに関する。特定の実施形態において、1若しくは複数のヒト細胞は、対象における治療用作用物質を用いた治療を必要としている。
様々なヒト細胞が本明細書に記載される方法において有用である。本明細書において開示されるように、「ヒト細胞」という用語は胚発生中及び胚発生後にヒトの身体に見出されるあらゆる細胞、例えば、ヒト胚細胞、幹細胞、多能性細胞、分化細胞、成体細胞、体細胞、及び成体細胞を指す。幾つかの実施形態では本開示のヒト細胞はヒト成体細胞である。本明細書において開示されるように、「ヒト成体細胞」という用語は胚発生後にヒトの身体に見出されるあらゆる細胞(すなわち、非胚細胞)を指す。本開示のヒト細胞には、これだけに限定されるものではないが、精細胞、卵母細胞、受精卵母細胞(すなわち、接合子)、胚細胞、成体細胞、分化細胞、体細胞、始原細胞、胚性幹(ES)細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、及び組織幹細胞が含まれる。成体幹細胞は体性幹細胞又は組織幹細胞としても知られており、胚発生後の身体に見出される未分化細胞を指すことができ、細胞分裂によって増殖して死細胞を補充し、かつ、損傷組織を再生する。始原細胞は特定の種類の細胞又は細胞系譜に分化する少能性細胞又は単能性細胞を指すことができる。始原細胞は幹細胞に類似しているがさらに分化しており、かつ、限られた自己複製を示す。例示的な成体幹細胞、組織幹細胞、及び／又は始原細胞には、これだけに限定されるものではないが、造血幹細胞、間充織幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、腸管幹細胞、皮膚幹細胞、及び生殖細胞(例えば、精細胞及び卵母細胞)が含まれ得る。
ヒト細胞は、これだけに限定されるものではないが、体細胞、成熟細胞、及び分化細胞を含んでもよい。体細胞は、これだけに限定されるものではないが、生殖細胞、組織幹細胞、始原細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、及び分化細胞をはじめとする身体のあらゆる細胞を指すことができる。例示的な体細胞、成熟細胞、及び／又は分化細胞には、これだけに限定されるものではないが、表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓β細胞、角化細胞、赤血球、末梢血液細胞、骨髄細胞、神経細胞、星状細胞、及び生殖細胞が含まれ得る。生殖細胞は有性生殖を行う生物の配偶子(すなわち、卵と精子)を生じる細胞を指すことができる。ある特定の実施形態では生殖細胞には、これだけに限定されるものではないが、卵母細胞及び精細胞が含まれる。幾つかの実施形態では本開示の体細胞、成熟細胞、及び／又は分化細胞は、これだけに限定されるものではないが、着床前胚も含む。
ヒト細胞としてはまた、これだけに限定されるものではないが、臍帯血から得られた細胞、造血幹細胞、CD34+細胞、間充織幹細胞、血管内皮幹細胞、組織幹細胞、顆粒球、リンパ球、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、赤血球、網状赤血球、及び巨核細胞も挙げられ得る。ヒト細胞としてはまた、これだけに限定されるものではないが、癌細胞、腫瘍細胞、悪性細胞、良性細胞、増生細胞、形成不全細胞、異型細胞などのヒト起源の異常細胞も挙げられ得る。ヒト細胞はまた、これだけに限定されるものではないが、二倍体細胞、一倍体細胞、四倍体細胞、倍数細胞、核型異常を伴う細胞、染色体異常を伴う細胞、突然変異遺伝子を有する細胞、異常なテロメア長を有する細胞、短いテロメアを有する細胞、及び長いテロメアを有する細胞も挙げられ得る。ヒト細胞としてはまた、これだけに限定されるものではないが、低メチル化ゲノム領域を有する細胞、高メチル化ゲノム領域を有する細胞、アセチル化やメチル化などの異常なヒストン修飾を有する細胞などのエピジェネティックな異常を有する細胞も挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、本開示の対象は、非ヒト動物である。非ヒト動物は、ヒト以外のすべての動物に言及してもよい。非ヒト動物としては、これだけに限定されるものではないが、非ヒト霊長目動物、ブタ、ウシ、及び家禽などの家畜、競技用動物又はイヌ、ネコ、ウマ、ハムスターなどのペット、マウスなどの齧歯動物、或いはライオン、トラ若しくはクマなどの動物園動物が挙げられる。一実施形態において、非ヒト動物はマウスである。
温度感受性作用物質の治療的使用
本開示の温度感受性作用物質は、これだけに限定されるものではないが、経口投与、舌下投与、口腔内投与、局所投与、直腸投与、吸入法を介して、経皮投与、皮下注射、静脈内(IV)注射、動脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、骨内注射、皮内注射、腹腔内注射、経粘膜投与、膣内投与、硝子体投与、関節内投与、関節周囲投与、局所的投与、皮膚表面投与、又はそのいずれかの組み合わせ、を含めた当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって投与され得る。いくつかの実施形態において、組成物は、皮下注射及び/又は静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、対象の脾臓に注射によって投与される。
いくつかの態様において、本開示の方法は、温度感受性作用物質の治療的有効量の使用を伴う。作用物質の治療的有効量は意図した目的を達成するのに充分な治療薬の量を指すことができる。例えば、疾患又は状態を治療するための温度感受性作用物質の治療的有効量はその疾患又は状態、又はその疾患若しくは状態の1つ以上の症状の軽減に充分な量である。いくつかの例では治療的有効量はその疾患又は状態、又はその疾患若しくは状態の症状を100％治療できなくてもよい。しかしながら、その疾患又は状態のあらゆる公知の特徴又は症状の減少、例えば、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％の減少は治療的であり得る。
所定の治療用作用物質の治療的有効量は、作用物質の性質、投与経路、治療用作用物質を受ける対象の体格及び/又は年齢、並びに投与の目的などの要因より変化する。それぞれの個々の症例における治療的有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って、当業者によって必要以上の実験なしに実験的に決定される。
対象とは、生きた多細胞脊椎生物体、ヒト及び非ヒト哺乳類を含むカテゴリを指してもよい。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。本明細書に提供される方法を用いて治療され得る対象としては、哺乳動物の対象、例えば、獣医学的対象又はヒト対象、を挙げられ得る。対象には、受精卵、接合体、着床前胚、胚、胎児、新生児、乳児、小児及び/又は成体が含まれ得る。いくつかの実施形態において、治療される対象は、例えば、治療、特に、本開示の温度感受性作用物質の投与を含む治療の恩恵を受けるであろう対象を選択することなどで選択される。
本開示の医薬組成物は、治療用ts作用物質などのts作用物質、及び1若しくは複数の追加化合物を含む。本明細書中に使用される場合、「医薬的に許容される担体」及び「医薬的に許容されるビヒクル」という用語は、1若しくは複数の追加化合物(すなわち、ts作用物質以外の化合物)を指す。本開示における使用に好適な医薬的に許容される担体は、従来品である。特に、温度感受性作用物質を含む組成物の医薬的な送達に好適な組成物や製剤は、先に記載したとおりのものである(例えば、Gennaro, A.R. (editor) Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990);及びFelton, L.A. (editor) Remington Essentials of Pharmaceutics, Pharmaceutical Press, London, United Kingdom, 1st edition, (2013)を参照のこと)。
一般に、担体の性質は使用されている特定の投与モードに依存する。例えば、非経口製剤は通常は、水、生理食塩水、平衡塩溶液、ブドウ糖水溶液、グリセロール又は同種のものなどの薬学的及び生理学的に許容可能な液体をビヒクルとして内包する注射可能液体を含む。固形組成物(例えば、粉末形態、丸薬形態、錠剤形態、又はカプセル形態)について、従来の非毒性固形担体は例えば薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は湿潤剤又は乳化剤、保存料、及びpH緩衝剤などのような少量の非毒性補助剤、例えば、酢酸ナトリウム又はソルビタンモノラウレートを含み得る。いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、治療用ts作用物質などのts作用物質、及び(細胞内へのts作用物質の取り込みを容易にする)1若しくは複数の追加化合物を含む。RNAベースのts作用物質の場合では、ts作用物質はナノ粒子内にカプセル化される。場合によっては、ナノ粒子は脂質ベースである(例えば、リポフェクトアミン)。
患者の治療に最も適切な治療用量と治療計画は、治療される疾患又は状態によって、及び患者の体重と他のパラメーターに従って変化する。有効な投与量と治療プロトコールを従来法によって決定することができ、その方法は実験動物において低用量から始まって、後に効果をモニターしながら投与量を増加し、かつ、計画的に投与計画を変更する。所与の対象にとって最適な投与量を決定するとき、医師は多数の要因を考慮に入れることができる。要因には患者の体格、患者の年齢、患者の一般状態、治療中の特定の疾患、疾患の重症度、患者内の他の薬品の存在などが含まれる。試験投与量は動物試験の結果と臨床文献を考慮した後に選択される。
骨髄細胞の動員
いくつかの実施形態において、方法は、(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞を対象の脾臓及び末梢血に動員することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本開示の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の治療的有効量を、脾臓において温度感受性作用物質が(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)1若しくは複数の骨髄細胞に核酸を送達するのに好適な条件下で投与すること、を含む。
本明細書中に開示された方法のいくつかの実施形態において、脾臓及び末梢血への(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞の動員は、治療的有効量のサイトカイン及び/又は化学療法剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、脾臓及び末梢血への(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞の動員は、治療的有効量のサイトカインを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、脾臓及び末梢血への(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞の動員は、治療的有効量の化学療法剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、脾臓及び末梢血への(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞の動員は、治療的有効量のサイトカインと化学療法剤を対象に投与することを含む。サイトカイン及び/又は化学療法剤は、これだけに限定されるものではないが、経口投与、舌下投与、口腔内投与、局所投与、直腸投与、吸入法を介して、経皮投与、皮下注射、静脈内(IV)注射、動脈内注射、筋肉内注射、心臓内注射、骨内注射、皮内注射、腹腔内注射、経粘膜投与、膣内投与、硝子体投与、関節内投与、関節周囲投与、局所的投与、皮膚表面投与、又はそのいずれかの組み合わせ、を含めた当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって投与され得る。いくつかの実施形態において、サイトカイン及び/又はケモカインは、皮下注射及び/又は静脈内注射によって投与される。
いくつかの実施形態において、対象の(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞は、組成物(例えば、本明細書中に記載した任意のナノ粒子組成物)の投与の、少なくとも4週間前、少なくとも3週間前、少なくとも2週間前、少なくとも1週間前、少なくとも6日前、少なくとも5日前、少なくとも4日前、少なくとも3日前、少なくとも2日前、少なくとも1日前、1日未満前、少なくとも18時間前、少なくとも16時間前、少なくとも12時間前、少なくとも8時間前、少なくとも6時間前、又は少なくとも1時間前に動員される。いくつかの実施形態において、対象の(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞は、組成物の投与前、連続した7日間、連続した5日間、連続した4日間、連続した3日間、連続した2日間又は1日にわたって動員される。いくつかの実施形態において、対象の(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞は、組成物の投与と並行して動員される。
当該技術分野で知られている(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞を動員できる、これだけに限定されるものではないが、顆粒球コロニー刺激因子が(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、エリスロポイエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、幹細胞因子(SCF)、副甲状腺ホルモン(PTH)、及びそのいずれかの組み合わせを含めた任意のサイトカインが使用され得る。いくつかの実施形態において、サイトカインはG-CSFである。
いくつかの実施形態において、G-CSFは、約0.1μg/kg～約100μg/kg又は約1.0μg/kg～約10g/kgの濃度にて対象に投与される。いくつかの実施形態において、G-CSFは、約2.5μg/kgの濃度にて対象に投与される。いくつかの実施形態において、G-CSFは、約10μg/kgの濃度にて対象に投与される。
当該技術分野で知られている、(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞を動員できる、これだけに限定されるものではないが、プレリキサホル、シクロホスファミド(CY)、パクリタキセル、エトポシド、POL6326、BKT-140、TG-0054、NOX-A12、SEW2871、BIO5192、ボルテゾミブ、SB-251353、FG-4497、及びそのいずれかの組み合わせを含めた任意の化学療法剤が使用され得る。いくつかの実施形態において、化学療法剤はプレリキサホルである。
いくつかの実施形態において、プレリキサホルは、約1μg/kg～約1000μg/kg又は約75μg/kg～約500μg/kgの濃度にて対象に投与される。いくつかの実施形態において、プレリキサホルは、約150μg/kgの濃度にて対象に投与される。いくつかの実施形態において、プレリキサホルは、約240μg/kgの濃度にて対象に投与される。
いくつかの実施形態において、(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞の脾臓及び末梢血への動員は、治療的有効量のG-CSFと治療的有効量のプレリキサホルを投与することを含む。いくつかの実施形態において、G-CSFとプレリキサホルは、対象に同時投与される。いくつかの実施形態において、G-CSFとプレリキサホルは、1日間、2日間、3日間、4日間又はそれ以上にわたり対象に同時投与される。いくつかの実施形態において、G-CSFは、プレリキサホルの前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、G-CSFは、プレリキサホルの前に、1日間、2日間、3日間、4日間又はそれ以上にわたり対象に投与される。いくつかの実施形態において、G-CSFは、プレリキサホルの1日、2日、3日、4日又はそれ以上前に対象に投与され、次に、G-CSFとプレリキサホルは、1日間、2日間、3日間、4日間又はそれ以上にわたり対象に同時投与される。いくつかの実施形態において、プレリキサホルは、G-CSFの前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、プレリキサホルは、G-CSFの1日、2日、3日、4日又はそれ以上前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、プレリキサホルは、G-CSFの1日、2日、3日、4日又はそれ以上前に対象に投与され、次に、G-CSFとプレリキサホルは、1日間、2日間、3日間、4日間又はそれ以上にわたり対象に同時投与される。
いくつかの実施形態において、1若しくは複数のヒト細胞を、1若しくは複数のヒト細胞に核酸を送達する温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)と接触させる。いくつかの実施形態において、核酸は、着目の遺伝子を含むか、又は着目のタンパク質をコードする。
いくつかの態様において、本開示の方法は、インビトロにおいて又はインビボにおいて対象の細胞に核酸を送達する温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の治療的量の使用を伴う。作用物質の治療的有効量は意図した目的を達成するのに充分な治療薬の量を指すことができる。例えば、疾患又は状態を治療するためのヒト細胞に核酸を送達する温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の治療的有効量はその疾患又は状態、又はその疾患若しくは状態の1つ以上の症状の軽減に充分な量である。いくつかの例では治療的有効量はその疾患又は状態、又はその疾患若しくは状態の症状を100％治療できなくてもよい。しかしながら、その疾患又は状態のあらゆる公知の特徴又は症状の減少、例えば、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％の減少は治療的であり得る。
別の例では、対象において(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)骨髄細胞を動員できるサイトカイン及び/又はケモカインの治療的有効量は、骨髄から(これだけに限定されるものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含めた)1若しくは複数の骨髄細胞の動員を末梢血に誘発するのに十分な量である。
所定の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の治療的有効量は、作用物質の性質、投与経路、治療用作用物質を受ける対象の体格及び/又は年齢、並びに投与の目的などの要因より変化する。それぞれの個々の症例における治療的有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って、当業者によって必要以上の実験なしに実験的に決定される。
対象とは、生きた多細胞脊椎生物体、ヒト及び非ヒト哺乳類を含むカテゴリを指してもよい。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。本明細書に提供される方法を用いて治療され得る対象としては、哺乳動物の対象、例えば、獣医学的対象又はヒト対象、を挙げられ得る。対象には、胎児、新生児、乳児、小児及び/又は成体が含まれ得る。いくつかの実施形態において、治療される対象は、治療の恩恵を受けるであろう対象を選択することなどで選択される。
温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の投与の利益を得ることができる障害又は疾患の例としては、(単数若しくは複数の)遺伝子突然変異、異常なテロメア長、又は(単数若しくは複数の)異常なエピジェネティック修飾に関連する障害又は疾患が挙げられる。温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の投与の利益を得ることができる障害又は疾患に関する更なる例としては、癌、自己免疫疾患、並びに神経学的傷害又は神経変性障害、並びに失明や聴覚障害などの細胞再生が有益である疾患を含む。
癌は異常な細胞増殖又は制御されていない細胞増殖を特徴とする悪性腫瘍を含む。癌は、遺伝子突然変異、及び異常テロメア制御と関連することが多い。ts作用物質を用いた治療から利益を得ることができる例示的な癌としては、これだけに限定されるものではないが、心臓の癌(例えば、肉腫(血管肉腫、繊維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫)、粘液腫、横紋筋腫、繊維腫、脂肪腫及び奇形腫)；肺癌(例えば、気管支原性癌(鱗状細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺胞上皮(細気管支)癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫)；胃腸管癌(例えば、食道(扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫)；胃癌(上皮癌、リンパ腫、平滑筋肉腫)；膵臓癌(膵管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ)；小腸癌(腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、繊維腫)；大腸癌(腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫)；泌尿生殖路癌(例えば、腎臓(腺癌、ウィルムス腫瘍、腎芽腫、リンパ腫、白血病)；膀胱癌及び尿道癌(扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌)；前立腺癌(腺癌、肉腫)；精巣癌(精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、繊維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫)；肝臓癌(例えば、肝癌(肝細胞癌)、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫)；骨癌(例えば、骨原性肉腫(骨肉腫)、繊維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫(細網肉腫)、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫(骨軟骨性外骨症)、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液繊維腫、類骨骨腫及び巨細胞腫)；神経系癌(例えば、頭骨(骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎)、髄膜(髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症)、脳(星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫＞松果体腫！、多形神経膠芽腫、希突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍)、脊髄(神経繊維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫))；婦人科癌(例えば、子宮(子宮内膜癌)、子宮頸部(子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成症)、卵巣(卵巣癌、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜性腫瘍、ブレナー腫瘍、明細胞癌、非分類癌、顆粒膜/莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫)、陰門(扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、繊維肉腫、黒色腫)、膣(明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫、胎児型横紋筋肉腫、卵管(癌))；血液癌(例えば、血液(骨髄性白血病(急性及び慢性)、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群)、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(悪性リンパ腫))；皮膚癌(例えば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、黒子、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬)；及び副腎癌(例えば、神経芽細胞腫)が挙げられる。
自己免疫疾患は、異常免疫応答、例えば、自己抗原又は対象自身の細胞若しくは組織に対して特異的である抗体又は細胞傷害性T細胞の産生を結果としてもたらす。いくつかの例では自己免疫疾患は(例えば、甲状腺炎では)ある特定の器官に限定され、又は様々な場所の特定の組織に影響を及ぼし得る(例えば、グッドパスチャー病)。ts作用物質を用いた治療から利益を得ることができる例示的な自己免疫疾患としては、これだけに限定されるものではないが、リウマチ性関節炎、若年性少関節炎、コラーゲン誘発関節炎、アジュバント誘発関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎)、自己免疫性胃萎縮、尋常性天疱瘡、乾癬、尋常性白斑、1型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑症、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、自己免疫性溶血性貧血、及び悪性貧血が挙げられる。
いくつかの実施形態において、対象は神経損傷を経験したことがある者、又は神経変性障害を患っている者である。神経損傷は神経系に対する(例えば、脳又は脊髄又は特定の神経細胞に対する)外傷であって、損傷を受けた患者の運動及び/又は記憶に悪影響を及ぼす外傷を指すことができる。例えば、そのような患者は構音障害(発話障害)、片側不全麻痺又は片麻痺を患う場合があり得る。神経損傷は、神経系に対する(例えば、脳又は脊髄又は特定の神経細胞に対する)外傷であって、損傷を受けた患者の運動及び/又は記憶に悪影響を及ぼす外傷から生じ得る。そのような外傷は感染性因子(例えば、最近又はウイルス)、毒物、落下又は他の種類の事故に起因する傷害、又は遺伝的障害によって、又は他の不明の理由のために引き起こされ得る。よって、いくつかの実施形態において、神経損傷を患ったことがある患者の神経系の組織幹細胞を修飾し、その神経系の中の組織幹細胞の修飾により神経細胞とグリア細胞を産生し、その結果として神経系の欠陥を修復することによって対象の神経損傷を治療するため、温度感受性である本開示の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)を使用することができる。いくつかの実施形態において、患者は自動車事故又は飛び込み事故などの事故の結果生じた、又は脳卒中の結果生じた脳又は脊髄の傷害などの神経損傷を患ったことがあってよい。
神経変性疾患は脳及び/又は脊髄の細胞が失われる状態である。神経変性疾患は時を経て機能不全及び能力低下を引き起こす神経細胞の劣化又は神経細胞のミエリン鞘の劣化から生じる。結果として生じる状態は運動に関する問題(運動失調症など)及び記憶に関する問題(認知症など)を引き起こし得る。よって、いくつかの実施形態において、神経変性疾患を患う患者の神経系の中の組織幹細胞を修飾し、その神経系の中の組織幹細胞の修飾により神経細胞とグリア細胞を産生し、その結果として神経系の欠陥を修復することによって対象の神経変性疾患を治療するため、本開示の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)を使用することができる。いくつかの実施形態において、前記作用物質が、前記対象の神経系を修飾し、かつ、前記疾患の変性状態を元に戻す。例示的な神経変性疾患としては、これだけに限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー(ALD)、アルコール中毒症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋委縮性側索硬化症(ルー・ゲーリッグ病)、毛細管拡張性運動失調症、バッテン病(シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病としても知られる)、牛海綿状脳症(BSE)、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病(脊髄小脳失調症3型)、多系統委縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマンピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、亜急性連合性脊髄変性症併発性悪性貧血、シュピールマイヤー・フォクト・シェーグレン・バッテン病(バッテン病としても知られる)、脊髄小脳失調症、脊髄性筋委縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、中毒性脳症が挙げられる。
以上より、特定の障害に関連する症状を軽減又は改善するために、温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)を対象に投与する。癌治療の治療エンドポイントは腫瘍のサイズ又は体積の減少、腫瘍に対する血管形成の減少、又は腫瘍転移の減少を含み得る。腫瘍が除去されている場合、別の治療エンドポイントは除去された組織又は器官の再生であり得る。当技術分野における方法、例えば、腫瘍の画像撮影又は腫瘍マーカー若しくは癌の存在についての他の指標の検出を用いて癌治療の有効性を測定することができる。自己免疫疾患治療の治療エンドポイントは自己免疫応答の減少を含み得る。当技術分野における方法、例えば、自己免疫抗体の測定を用いて自己免疫疾患治療の有効性を測定することができ、治療対象におけるそのような抗体の減少はその治療が成功したことを示している。神経変性障害治療の治療エンドポイントは神経変性関連欠陥の減少、例えば、運動欠陥、記憶欠陥、又は行動欠陥が増加することの減少を含み得る。当技術分野における方法を用いて、例えば、認知障害を測定することにより神経変性障害治療の有効性を測定することができ、治療対象におけるそのような障害の減少はその治療が成功したことを示している。神経損傷治療の治療エンドポイントは損傷関連欠陥の減少、例えば、運動欠陥、記憶欠陥、又は行動欠陥が増加することの減少を含み得る。当技術分野における方法を用いて、例えば、運動性及び柔軟性を測定することにより神経損傷治療の有効性を測定することができ、治療対象におけるそのようなものの上昇はその治療が成功したことを示している。治療は100％の有効性を必要としない。例えば作用物質を用いる治療が無いときと比べた前記疾患(又はその症状)の少なくとも約10％、約15％、約25％、約40％、約50％、又はそれより高い割合での軽減が有効と見なされる。
血管内皮細胞に導入/接触し、血管内皮細胞の性質を向上し、それによって対象のアテローム性硬化症及び/又は冠動脈疾患を治療するように、例えば、対象の血流に本開示の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)を投与することによって、本開示の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)を使用して、アテローム性硬化症及び/又は冠動脈疾患の治療を必要とする前記対象においてアテローム性硬化症及び/又は冠動脈疾患を治療することもできる。
本開示の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)はまた、それを必要としている1若しくは複数のヒト細胞及び/又は対象の1若しくは複数の遺伝毒性物質に対する抵抗性を提供するのに使用されてもよい。
温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の投与の利益を得ることができる障害又は疾患の例としては、(単数若しくは複数の)遺伝子突然変異、異常なテロメア長、又は(単数若しくは複数の)異常なエピジェネティック修飾に関連する障害又は疾患が挙げられる。温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)の投与の利益を得ることができる障害又は疾患に関する更なる例としては、癌、自己免疫疾患、及び神経学的傷害又は神経変性障害などの細胞再生が有益である疾患、並びに失明や聴覚障害が挙げられる。
別段説明されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は本開示が属する技術分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。単数形の用語「a」、「an」、及び「the」は文脈が別段明確に指示しない限り複数形の指示物を含む。同様に、「又は」という単語は文脈が別段明確に指示しない限り「及び」を含むものとする。したがって、「A又はBを含む」はA又はBを含むこと、又はA及びBを含むことを意味する。核酸又はポリペプチドについて与えられている全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量値又は分子質量値は近似値であり、かつ、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法と材料を以下に記載する。本明細書において言及された全ての特許出願公開、特許出願、特許、及び他の参照文献は全体が参照により援用される。矛盾がある場合は用語の説明を含み本明細書が優先する。加えて、材料、方法、及び実施例はただの例示であり、それらが限定的なものであることは意図されていない。
例示的な実施形態
1.
温度感受性作用物質の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、以下：
i) 温度感受性活性が1若しくは複数の細胞において効果を生じさせるのに十分な期間にわたり温度感受性活性を誘発するための許容温度にて、温度感受性作用物質を含む1若しくは複数の細胞をインキュベートし；そして
ii) 非許容温度にて1若しくは複数の細胞をインキュベートすること、ここで、該非許容温度は、温度感受性作用物質の温度感受性活性を低減する、
を含み、
ここで、該温度感受性作用物質が治療用作用物質を含み、かつ、該効果が治療効果を含む、方法。
2.
ステップi)の前に、以下：
1若しくは複数の細胞を、温度感受性作用物質と接触させること、
をさらに含む、実施形態1に記載の方法。
3.
前記1若しくは複数の細胞は、温度感受性作用物質と接触させるときに、許容温度である、実施形態2に記載の方法。
4.
1若しくは複数の細胞を、治療効果を必要とする対象に投与することをさらに含む、実施形態1～3のいずれか一項に記載の方法。
5.
前記の1若しくは複数の細胞を非許容温度にてインキュベートすることが、治療効果を必要とする対象に1若しくは複数の細胞を投与することを含む、ここで、該対象の体温が非許容温度である、実施形態1～3のいずれか一項に記載の方法。
6.
前記1若しくは複数の細胞が、該1若しくは複数の細胞を対象に投与する前に、非許容温度にてさらにインキュベートされる、実施形態4又は5に記載の方法。
7.
前記1若しくは複数の細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、実施形態1～6のいずれか一項に記載の方法。
8.
前記治療効果が、前記細胞の所望の細胞型への分化を含む、実施形態7に記載の方法。
9.
所望の細胞型が、ニューロン、膠細胞、及び内皮細胞から成る群から選択される、実施形態8に記載の方法。
10.
前記1若しくは複数の細胞が、温度感受性作用物質と該1若しくは複数の細胞を接触させる前に、対象から単離される、実施形態2～9のいずれか一項に記載の方法。
11.
対象において温度感受性作用物質の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、対象の1若しくは複数の細胞が温度感受性作用物質を含み、ここで、該温度感受性作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、該許容温度が対象の体温より低く、以下：
i) 対象の体温を許容温度まで下げ；
ii) 前記下げた体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり維持し；及び
iii) 対象の体温を正常体温まで上げること、
を含む方法。
12.
対象において温度感受性作用物質の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、該温度感受性作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、該許容温度が対象の体温より低く、以下：
i) 対象の体温を許容温度まで下げ；
ii) 対象の1若しくは複数の細胞に、温度感受性作用物質を投与し；
iii) 前記下げた体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり維持し；及び
iv) 対象の体温を上げて、正常体温まで戻すこと、ここで、ステップ(i)がステップ(ii)の前、後、又はそれと同時に行われる、
を含む方法。
13.
前記温度感受性作用物質が、全身的に投与される、実施形態12に記載の方法。
14.
前記温度感受性作用物質が、静脈内に投与される、実施形態13に記載の方法。
15.
前記温度感受性作用物質が、対象の特定の組織又は器官に投与される、実施形態12に記載の方法。
16.
前記温度感受性作用物質が、硬膜外注射によって脳や脊髄に投与される、実施形態15に記載の方法。
17.
前記温度感受性作用物質が、皮内注射によって標的器官に投与される、実施形態15に記載の方法。
18.
前記温度感受性作用物質が、注射針カテーテルを用いた内視鏡によって標的器官に投与される、実施形態15に記載の方法。
19.
前記温度感受性作用物質が、血管カテーテルによって標的器官に投与される、実施形態15に記載の方法。
20.
前記標的器官が、肝臓、腎臓、骨格筋、心筋、膵臓、脾臓、心臓、脳、脊髄、皮膚、眼、肺、腸、胸腺、骨髄、骨、及び軟骨から成る群から選択される、実施形態17～19のいずれか一項に記載の方法。
21.
前記温度感受性作用物質が、吸入法によって投与される、実施形態12に記載の方法。
22.
前記対象の体温の変更が、目標温度管理(TTM)手順を用いることを含み、ここで、該TTM手順が、冷却カテーテル、冷却ブランケット、及び氷から成る群のうちの1つを、対象に適用することを含む、実施形態11～21のいずれか一項に記載の方法。
23.
前記対象が、哺乳類の対象であり、任意選択でここで、対象がヒトである、実施形態11～22のいずれか一項に記載の方法。
24.
前記温度感受性作用物質が治療用作用物質を含み、かつ、効果が治療効果を含む、実施形態11～23のいずれか一項に記載の方法。
25.
前記治療用作用物質が、温度感受性ウイルスベクターの異種核酸のコード領域によってコードされる、実施形態1～10又は実施形態24のいずれか一項に記載の方法。
26.
前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスから成る群から選択される、実施形態25に記載の方法。
27.
前記温度感受性ウイルスベクターが、アルファウイルスである、実施形態26に記載の方法。
28.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態27に記載の方法。
29.
前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルスである、実施形態26に記載の方法。
30.
前記治療用作用物質が、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムから成る群から選択される、実施形態25～29のいずれか一項に記載の方法。
31.
前記治療用作用物質がタンパク質である、実施形態25～29のいずれか一項に記載の方法。
32.
前記タンパク質が転写因子であり、任意選択でここで、該転写因子が、ヒトニューロゲニン-3(NGN3)、及びヒトETS転座変異体2(ETV2)から成る群から選択される、実施形態31に記載の方法。
33.
前記タンパク質が増殖因子であり、任意選択でここで、該増殖因子が、脳由来神経栄養因子(BDNF)及び神経増殖因子(NGF)から成る群から選択される、実施形態31に記載の方法。
34.
前記温度感受性活性が、温度感受性ウイルスベクターの複製と転写を含む、実施形態25～33のいずれか一項に記載の方法。
35.
前記治療用作用物質が、温度感受性自己複製RNAのコード領域によってコードされている、実施形態1～10又は実施形態24のいずれか一項に記載の方法。
36.
前記自己複製RNAが、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む、実施形態35に記載の方法。
37.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態36に記載の方法。
38.
前記治療用作用物質が、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムから成る群から選択される、実施形態35～37のいずれか一項に記載の方法。
39.
前記治療用作用物質がタンパク質である、実施形態35～37のいずれか一項に記載の方法。
40.
前記タンパク質が転写因子であり、任意選択でここで、該転写因子が、ヒトニューロゲニン-3(NGN3)、及びヒトETS転座変異体2(ETV2)から成る群から選択される、実施形態39に記載の方法。
41.
前記タンパク質が増殖因子であり、任意選択でここで、該増殖因子が、脳由来神経栄養因子(BDNF)及び神経増殖因子(NGF)から成る群から選択される、実施形態39に記載の方法。
42.
前記温度感受性活性が、温度感受性自己複製RNAの複製と転写のうちの一方又は両方を含む、実施形態35～41のいずれか一項に記載の方法。
43.
前記コード領域が、プロモーターに動作可能に連結されている、実施形態25～42のいずれか一項に記載の方法。
44.
前記温度感受性活性が治療効果を生じさせるのに十分な期間が、約12時間～約12週間の範囲にあり、任意選択でここで、該期間が1～7日間である、実施形態1～10のいずれか一項に記載の方法。
45.
前記対象において効果が誘発されるのに十分な期間が、約12時間～約7日間であり、任意選択でここで、該期間が約12時間～約72時間である、実施形態11～43のいずれか一項に記載の方法。
46.
前記許容温度が、30℃～36℃又は38℃～50℃の範囲にある、実施形態1～45のいずれか一項に記載の方法。
47.
前記許容温度が、33℃±0.5℃である、実施形態46に記載の方法。
48.
前記非許容温度が、37℃±0.5℃である、実施形態46又は実施形態47に記載の方法。
49.
前記1若しくは複数の細胞が、ヒト細胞である、実施形態1～48のいずれか一項に記載の方法。
50.
前記1若しくは複数のヒト細胞が、成体幹細胞、組織幹細胞、始原細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、実施形態49に記載の方法。
51.
前記1若しくは複数のヒト細胞が、造血幹細胞、間充織幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、及び生殖幹細胞から成る群から選択される、実施形態50に記載の方法。
52.
前記1若しくは複数のヒト細胞が、体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である、実施形態49に記載の方法。
53.
前記1若しくは複数のヒト細胞が、表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、角化細胞、赤血球、末梢血単核細胞(PBMC)、ニューロン、グリア細胞、神経細胞、星状細胞、生殖細胞、精細胞、及び卵母細胞から成る群から選択される、実施形態52に記載の方法。
54.
前記1若しくは複数のヒト細胞が、ヒト骨髄細胞である、実施形態49に記載の方法。
55.
前記ヒト骨髄細胞が、造血幹細胞、間充織幹細胞、及び内皮幹細胞から成る群から選択される、実施形態54に記載の方法。
56.
前記造血幹細胞がCD34+である、実施形態55に記載の方法。
57.
前記温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNAが、12～18ヌクレオチドの挿入を伴った非構造タンパク質コード領域を含み、ここで、該挿入が、非構造タンパク質2(nsP2=ヘリカーゼプロテイナーゼ)のβシート5とβシート6との間に4～6個の追加アミノ酸を含むnsP2の発現をもたらし、任意選択でここで、該追加アミノ酸が、該ウイルスベクター又は該自己複製RNAの温度感受性をもたらす、実施形態25～56のいずれか一項に記載の方法。
58.
前記追加アミノ酸が、配列番号38(GCGRT)、配列番号39(TGAAA)、及び配列番号40(LRPHP)から成る群から選択される1つの配列を含む、実施形態57に記載の方法。
59.
前記追加アミノ酸が、配列番号39(TGAAA)の配列を含む、実施形態57に記載の方法。
60.
前記NsP2のアミノ酸配列が、配列番号29～36から成る群から選択される1つの配列を含む、実施形態59に記載の方法。
61.
温度感受性作用物質であって、該作用物質が、12～18ヌクレオチドの挿入を伴った非構造タンパク質コード領域を含む温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNAであり、ここで、該挿入が、非構造タンパク質2(nsP2=ヘリカーゼプロテイナーゼ)のβシート5とβシート6との間に4～6個の追加アミノ酸を含むnsP2の発現をもたらし、任意選択でここで、該追加アミノ酸が、該ウイルスベクター又は該自己複製RNAの温度感受性をもたらす、温度感受性作用物質。
62.
前記追加アミノ酸が、配列番号38(GCGRT)、配列番号39(TGAAA)、及び配列番号40(LRPHP)から成る群から選択される1つの配列を含む、実施形態61に記載の温度感受性作用物質。
63.
前記追加アミノ酸が、配列番号39(TGAAA)の配列を含む、実施形態61に記載の温度感受性作用物質。
64.
前記NsP2のアミノ酸配列が、配列番号29～36から成る群から選択される1つの配列を含む、実施形態63に記載の温度感受性作用物質。
65.
前記作用物質が、温度感受性アルファウイルスベクターである、実施形態61～64のいずれか一項に記載の温度感受性作用物質。
66.
前記作用物質が、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む温度感受性自己複製RNAである、実施形態61～64のいずれか一項に記載の温度感受性作用物質。
67.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態65又は実施形態66に記載の温度感受性作用物質。
68.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、実施形態65又は実施形態66に記載の温度感受性作用物質。
69.
対象において温度感受性作用物質(ts作用物質)の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、1若しくは複数の細胞が、対象の体の表面又は表面付近にて、ts作用物質を含み、ここで、ts作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、許容温度が対象の表面体温であり、以下：
i) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり許容温度で維持し；及び
ii) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において停止するのに十分な期間にわたり非許容温度まで上げること、
を含む方法。
70.
対象において温度感受性作用物質(ts作用物質)の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、ts作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、許容温度が対象の表面体温であり、以下：
i) ts作用物質を、対象の体の表面又は表面付近の1若しくは複数の細胞に投与し；及び
ii) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり許容温度で維持すること、
を含む方法。
71.
iii) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において停止するのに十分な期間にわたり非許容温度まで上げること、
をさらにを含む、実施形態70に記載の方法。
72.
前記温度感受性作用物質が、皮内又は皮下に投与される、実施形態70又は実施形態71に記載の方法。
73.
前記温度感受性作用物質が、筋肉内に投与される、実施形態70又は実施形態71に記載の方法。
74.
前記非許容温度が36℃超であり、かつ、前記許容温度が36℃未満であり、任意選択でここで、該許容温度が約31℃～約34℃、又は約33℃±0.5℃であり、かつ、該非許容温度が37℃±0.5℃である、実施形態69～73のいずれか一項に記載の方法。
75.
前記医薬作用物質がts作用物質のコード領域によってコードされるか、又はts作用物質が医薬作用物質を含み、かつ、前記効果が医薬効果を含み、任意選択でここで、該医薬作用物質が治療用作用物質であり、かつ、該医薬効果が治療効果であるか、又はここで、該医薬作用物質が予防用作用物質であり、かつ、該医薬効果が予防効果である、実施形態69～74のいずれか一項に記載の方法。
76.
前記ts作用物質が、温度感受性ウイルスベクターであり、かつ、前記温度感受性活性が、温度感受性ウイルスベクターの複製と転写を含む、実施形態69～75のいずれか一項に記載の方法。
77.
前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスから成る群から選択される、実施形態76に記載の方法。
78.
前記温度感受性ウイルスベクターがアルファウイルスであり、任意選択でここで、該アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態76の方法。
79.
前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルスである、実施形態76に記載の方法。
80.
前記ts作用物質が温度感受性自己複製RNAであり、かつ、前記温度感受性活性が、温度感受性自己複製RNAの複製と転写のうちの一方又は両方を含む、実施形態69～75のいずれか一項に記載の方法。
81.
前記自己複製RNAが、アルファウイルスのウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む、実施形態80に記載の方法。
82.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態81に記載の方法。
83.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、実施形態81に記載の方法。
84.
前記医薬作用物質が、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムから成る群から選択される、実施形態69～83のいずれか一項に記載の方法。
85.
前記医薬作用物質がタンパク質を含む、実施形態69～83のいずれか一項に記載の方法。
86.
前記タンパク質が、病原体の抗原を含む、実施形態85に記載の方法。
87.
前記病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、及び真菌のうちの1つ若しくは複数を含む、実施形態86に記載の方法。
88.
前記抗原が、病原体の表面タンパク質又はその断片を含む、実施形態86又は実施形態87に記載の方法。
89.
前記温度感受性活性が効果を生じさせるのに十分な期間が、約12時間～約12週間の範囲にあり、任意選択で、該期間が1～7日間である、実施形態69～88のいずれか一項に記載の方法。
90.
前記対象において効果を誘発するのに十分な期間が、約12時間～約7日間であり、任意選択でここで、該期間が約12時間～約72時間である、実施形態69～88のいずれか一項に記載の方法。
91.
賦形剤及び温度感受性作用物質(ts作用物質)を含む、対象において病原体に対する免疫応答を刺激するための免疫原性組成物であって、ここで、該ts作用物質が、病原体の抗原をコードする温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNAであり、かつ、ここで、該ts作用物質が、許容温度にて抗原を発現することができるが、非許容温度にて発現することができない、組成物。
92.
前記病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、及び真菌のうちの1つ若しくは複数を含む、実施形態91に記載の組成物。
93.
前記抗原が、病原体の表面タンパク質又はその断片を含む、実施形態91又は実施形態92に記載の組成物。
94.
前記病原体がウイルスであり、かつ、該ウイルスがウイルスベクターと異なる、実施形態93に記載の組成物。
95.
前記ウイルスがコロナウイルスであり、かつ、前記抗原が、コロナウイルスのスパイクタンパク質又はその断片を含む、実施形態94に記載の組成物。
96.
前記コロナウイルスが2019-nCoVであり、かつ、前記抗原が2019-nCoVの受容体結合ドメイン(RBD)を含む、実施形態95に記載の組成物。
97.
前記RBDのアミノ酸配列が、配列番号44、或いは配列番号44に対して少なくとも75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む、実施形態96に記載の組成物。
98.
前記コロナウイルスが2019-nCoVであり、かつ、前記抗原が、配列番号41の第16～1213残基のアミノ酸配列、或いは配列番号41に対して少なくとも75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質の細胞外領域を含む、実施形態95に記載の組成物。
99.
前記非許容温度が36℃超であり、かつ、前記許容温度が36℃未満であり、任意選択でここで、該許容温度が約31℃～約34℃、又は約33℃±0.5℃であり、かつ、該非許容温度が37℃±0.5℃である、実施形態91～98のいずれか一項に記載の組成物。
100.
前記ts作用物質が温度感受性自己複製RNAである、実施形態91～99のいずれか一項に記載の組成物。
101.
前記自己複製RNAが、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む、実施形態100に記載の組成物。
102.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態101に記載の組成物。
103.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、実施形態101に記載の組成物。
104.
前記ts作用物質が、温度感受性ウイルスベクターである、実施形態91～99のいずれか一項に記載の組成物。
105.
前記ウイルスベクターが、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスから成る群から選択される、実施形態104に記載の組成物。
106.
前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、実施形態105に記載の組成物。
107.
前記ウイルスベクターが、センダイウイルスである、実施形態105に記載の組成物。
108.
前記対象が哺乳類の対象であり、任意選択でここで、該対象がヒトである、実施形態69～90のいずれか一項に記載の方法又は実施形態91～107のいずれか一項に記載の組成物。
109.
前記病原体が哺乳類の病原体であり、任意選択でここで、該病原体がヒト病原体である、実施形態91～108のいずれか一項に記載の組成物。
110.
哺乳類の対象において病原体に対する免疫応答を刺激する方法であって、哺乳類の対象において抗原に対する免疫応答を刺激するために、哺乳類の対象に実施形態109に記載の免疫原性組成物を投与することを含み、任意選択でここで、該哺乳類の対象がヒト対象である、方法。
111.
前記免疫原性組成物が：
i) 皮内又は皮下；或いは
ii) 筋肉内、
に投与される、実施形態110に記載の方法。
112.
前記免疫原性組成物が、鼻腔内に投与される、実施形態110に記載の方法。
略語：Aura(アウラウイルス)；BFV(バーマーフォレストウイルス)；GFP(緑色蛍光タンパク質)；GOI(着目の遺伝子)；IRES(内部リボソーム侵入部位)；LUC(ルシフェラーゼ)；OD(光学濃度)；ONNV(オニョン-ニョンウイルス)；RBD(受容体結合ドメイン)；RRV(ロスリバーウイルス)；SeV(センダイウイルス)；SeVt(温度感受性センダイウイルス)；SFV(セムリキフォレストウイルス)；shRNA(短いヘアピンRNA)；SINV(シンドビスウイルス)；srRNA(自己複製RNA)；ts(温度感受性)；ts作用物質(温度感受性作用物質)；VEEV(ベネズエラウマ脳炎ウイルス)；及びWEEV(西部ウマ脳炎ウイルス)。
以下の実施例は、ある特定の特徴及び/又は実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、請求される開示を限定することを意図するものではない。
実施例1：温度感受性作用物質
この実施例は、正常体温より低い又は高い温度にて機能するが、正常体温にて機能しないか又は機能性の低下を示す温度感受性作用物質(ts作用物質)を説明する。ts作用物質は、エクスビボ、セミインビボ、及びインビボ療法における使用に好適である。温度感受性ウイルスベクターと自己複製RNAは、着目の遺伝子(GOI)、短いヘアピンRNA(shRNA)、長いノンコーディングRNA、及び/又は(単数若しくは複数の)他の遺伝要素を発現するように操作される。例えば、温度感受性変異を伴うタンパク質は、より低い温度にて(例えば、30℃にて)機能的であるが、正常体温にて(例えば、37℃にて)機能的でない。別段の定めがない限り、正常体温は、37℃±0.5℃の正常なヒトの体温である。
実施例2：温度感受性センダイウイルスベクター(SeVt)
この実施例は、温度感受性センダイウイルスベクター(SeVt)を説明し、そしてそれは、温度特異的遺伝子発現に使用できる。センダイウイルスベクターは、パラミクソウイルスサブファミリーの一本鎖RNAウイルスであるセンダイウイルスに基づいている。SeV18/TS15ΔFは、温度感受性センダイウイルスベクターであり、そしてそれは、32～35℃に保持されると、ウイルス複製と遺伝子発現が可能である。しかしながら、ウイルス複製は、37℃以上の非許容温度にて停止する(Ban et al., PNAS 2011)。
実施例3：温度感受性自己複製RNA(srRNAs)
この実施例は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)ベクターでコードされたnsP2タンパク質における突然変異が温度感受性を示すという知見を説明する。温度感受性システムは、30℃～33℃にて着目の遺伝子(GOI)の発現を可能にするが、37℃以上で発現を不可能にする。srRNAベクターは、GOIをコードする合成RNAより高いGOIの発現を可能にする。温度が37℃(例えば、非許容温度)に移行するとき、GOIの発現は止まる。以下に記載した特定の温度感受性変異(突然変異2)が、アルファウイルス内のよく保存された領域内にある。センダイウイルスベクター(SeVt)と比較して、srRNAtsが非ウイルスRNA発現系で利用され得るので、srRNAtsは、いくつかの適用にとってより魅力的であり得る。
材料と方法
細胞培養
ヒト脂肪幹細胞由来iPS細胞株(ADSC-iPS細胞)を、System Biosciences(Palo Alto, CA)から購入した。細胞を、標準的なhPSC培養法に従って未分化ヒト多能性幹細胞(hPSC)として規定どおりに維持した。簡単に言えば、細胞を、100ng/mlのFGF2を補ったStemFit basic02(Ajinomoto, Japan)で培養した。さらに、細胞を、ラミニン-511基質(iMatrix-511, Nippi, Japan)でコートした細胞培養ディッシュ上で培養した。
VEEVベクター
VEEVベクタープラスミドを、公的に利用可能な配列情報(T7-VEE-IRES-Puro、本明細書中では以降「srRNA1wt」)に基づく合成DNA断片を使用して組み立てた。Yoshioka et al., 2013によれば、VEEVベクター骨格は、本来、Petrakova et al., 2005のとおり誘導された。挿入突然変異誘発及び大規模並列シークエンシングによって同定された7480の候補配列(Beitzel et al., 2010)を、潜在的な温度感受性突然変異体を誘導するのに使用した。本来の大規模なスクリーンを、VEEVゲノム内への15bpのトランスポゾン媒介挿入によって実施した(図1A)。それに続いて、30℃又は40℃にて増殖できる多くの15bp挿入VEEV変異体を単離した。これらのデータは、更なる調査のための初期変異体を提供したが、これらの配列が、32℃又は33℃における許容性及び37℃における非許容性などの、温度感受性を示すことは知られていなかった。3種類の変異配列－変異体1(ts1、図1B)、変異体2(ts2、図1C)、及び変異体3(ts3、図1D)は、合計7480の候補変異配列から選択される(Data Set S1 from Beitzel et al., 2010)。これらの突然変異DNA断片(図2)を、合成し、及びVEEVベクター内にクローン化し、そして、srRNA1ts1(変異体1)、srRNA1ts2(変異体2)、srRNA1ts3(変異体3)と命名した。変異体4を設計し、そしてそれは、ウイルス配列の5’-領域 (51-nt保存配列エレメント(CSE)を含むことが知られているRNA依存性RNAポリメラーゼの5’-UTR及びN末端タンパク質配列の一部)を含む。この場合、ヌクレオチドを、より少ない熱安定性変異体に系統的に変更し(例えば、G->A)、それと同時に、アミノ酸配列を維持した(図3)。srRNA1ts2内のこの領域の配列を、(すなわち、変異体4と変異体2の両方を含む)srRNA1ts4を作出するために置換した。合成RNAを、Yoshioka et al., 2013に従って、これらのベクターから製造した。
結果
30℃、32℃、及び37℃におけるsrRNA1ts2-GFPとsrRNA1ts3-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、80,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1wt-GFP、srRNA1ts2-GFP、又はsrRNA1ts3-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を、30℃、32℃又は37℃のいずれかにてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。位相差と蛍光画像を20時間と48時間に撮影した。野性型(srRNA1wt-GFP)が37℃にてGFPを強く発現したが、しかし、30℃と32℃の両方で、GFPを弱くしか発現しないことを、図4Aは示す。対照的に、変異体2(srRNA1ts2-GFP)は、30℃と32℃にてGFPを発現したが、しかし、37℃にて発現しなかった。変異体3(srRNA1ts3-GFP)は、30℃と32℃にてGFPを発現したが、しかし、37℃においてもGFPを発現した。これらの結果に基づいて、変異体2がさらなる開発のために選択された。予想されるように、srRNAは、GFPをコードする合成mRNAの単独トランスフェクションによって達成されたGFP発現レベルと比較して、はるかに高いGFP発現を示した(図4B)。
32℃におけるsrRNA1ts1-GFPとsrRNA1ts2-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、50,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1wt-GFP、srRNA1ts2-GFP、又はsrRNA1ts3-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃にてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。位相差と蛍光画像を、24、48、72、96、120、144、168、192、240、及び288時間に撮影した。
図5は結果を示す。野性型(srRNA1wt-GFP)からのGFP発現は、24時間に開始し、(288時間における)観察期間の最後まで続いたが、時間的経過を通じて非常に弱かった。対照的に、変異体2(srRNA1ts2-GFP)からのGFP発現は、時間的経過を通じて非常に強かった。変異体1(srRNA1ts1-GFP)は(24時間及び168時間における観察に基づいて)GFPを全く発現しなかった。これらの結果に基づいて、変異体2がさらなる開発のために選択される。
32℃、33℃、及び37℃におけるsrRNA1ts2-GFPとsrRNA1ts4-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、50,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-GFP、又はsrRNA1ts4-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃、33℃又は37℃のいずれかにてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。位相差と蛍光画像を、20、48、及び96時間に撮影した。
図6は結果を示す。32℃及び33℃にて、変異体2(srRNA1ts2-GFP)からのGFP発現は、早ければ20時間に開始したが、48時間において有意に増強され、そして、96時間にさらに増強された。GFPの発現は、32℃より33℃において強かった。先の実験と一致して、GFPは、37℃にて全く発現されなかった。srRNA1ts4-GFP(変異体2と変異体4の両方を含む)は、srRNA1ts2-GFPと類似の温度プロファイルを示したが、GFP発現は全体的にはるかに弱かった。これらの結果に基づいて、変異体2がさらなる開発のために選択された。
32℃におけるsrRNA1ts2-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、80,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃にてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。培地を毎日交換した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含み、これにより、ピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)下でおこなった。ピューロマイシンを用いた細胞選択のために、ピューロマイシンを48時間と72時間に加えた。位相差と蛍光画像を、24、48、72、96、144、168、192時間に撮影した。
図7は結果を示す。32℃にて、srRNA1ts2-GFPからのGFP発現は、早ければ24時間に開始したが、48時間に有意に増強され、そして、72時間と96時間にピークに達した。GFPの発現は、(192時間の)観察の期間の最後まで続いた。GFPの発現様式は、ピューロマイシンの添加によって変化したように見えなかった。
24時間後に32℃から37℃に切り換えたsrRNA1ts2-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、80,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃にてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。培地を毎日交換した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含み、これにより、ピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)下でおこなった。ピューロマイシンを用いた細胞選択のために、ピューロマイシンを48時間と72時間に加えた。温度シフトの効果を試験するために、細胞培養物を、(トランスフェクションの24時間後)24時間に37℃に維持したCO2インキュベーターに移した。位相差と蛍光画像を、24、48、72、96、144、168、192時間に撮影した。
図8は結果を示す。32℃にて、srRNA1ts2-GFPからのGFP発現は、早ければ24時間に開始したが、24時間における37℃への温度の切り換え後でさえ増加し続けた。GFPの発現は、48時間にピークに達し、そしてその後、減少し始めた。96時間までに、GFP発現は非常に弱くなり、そして、144時間までに、GFP発現はもう検出できなくなった。それに続いて、GFP発現は、192時間の観察期間の最後まで存在しなかった。よって、GOI(ここではGFPと表される)の発現は、温度が33℃(許容温度)から37℃(非許容温度)に移行したとき、急速に停止した。GFPの発現様式は、ピューロマイシンの添加によって変化したように見えなかった。
48時間後に32℃から37℃に切り換えたsrRNA1ts2-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、80,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃にてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。培地を毎日交換した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含み、これにより、ピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)下でおこなった。ピューロマイシンを用いた細胞選択のために、ピューロマイシンを48時間と72時間に加えた。温度シフトの効果を試験するために、細胞培養物を、(トランスフェクションの48時間後)48時間に37℃に維持したCO2インキュベーターに移した。位相差と蛍光画像を、24、48、72、96、144、168、192時間に撮影した。
図9は結果を示す。32℃にて、srRNA1ts2-GFPからのGFP発現は、早ければ24時間に開始し、48時間にてさらに増加した。GFPの発現は、48時間における37℃への温度の切り換え後でさえ96時間まで続いた。しかし、GFP発現は72時間から減少し始め、そして、96時間までに、GFP発現は非常に弱くなった。144時間までに、GFP発現は、ほとんど検出されず、192時間までに完全に機能が停止した。よって、GOI(ここではGFPと表される)の発現は、温度が33℃(許容温度)から37℃(非許容温度)に移行したとき、急速に停止した。GFPの発現様式は、ピューロマイシンの添加によって変化したように見えなかった。
72時間後に32℃から37℃に切り換えたsrRNA1ts2-GFPの温度感受性の評価
ADSC-iPSC細胞を、80,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-GFPを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃にてインキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、培地を交換して、トランスフェクション複合体を取り除いた。培地を毎日交換した。srRNA1ts2-GFPベクターは、「IRES」配列後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含み、これにより、ピューロマイシンを使用して選択できる。実験を、1μg/mlのピューロマイシンの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)下でおこなった。ピューロマイシンを用いた細胞選択のために、ピューロマイシンを48時間と72時間に加えた。温度シフトの効果を試験するために、細胞培養物を、(トランスフェクションの72時間後)72時間に37℃に維持したCO2インキュベーターに移した。位相差と蛍光画像を、24、48、72、96、144、168、192時間に撮影した。
図10は結果を示す。32℃にて、srRNA1ts2-GFPからのGFP発現は、早ければ24時間に開始し、48時間にてさらに増加した。GFPの発現は、48時間における37℃への温度の切り換え後でさえ96時間まで続いた。しかし、GFP発現は72時間から減少し始め、そして、144時間までに、GFP発現は非常に弱くなった。168時間までに、GFP発現は、ほとんど検出されず、192時間までに完全に機能が停止した。よって、GOI(ここではGFPと表される)の発現は、温度が33℃(許容温度)から37℃(非許容温度)に移行したとき、急速に停止した。GFPの発現様式は、ピューロマイシンの添加によって変化したように見えなかった。
線維芽細胞におけるsrRNA1ts2-GFPの温度感受性の評価
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(20代継代のHDFn)を、10,000細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。24時間後に、細胞をsrRNA1wt-GFPを用いてトランスフェクトした。srRNA1wt-GFP(0.5μgの合成RNA)のトランスフェクションを、JetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬又はLipofectamine MessengerMax(Thermo-Fisher)のいずれかを使用することによって実施した。細胞を37℃にてインキュベートした。インターフェロン応答を抑制することが知られているB18Rの効果を見るために、トランスフェクション及び細胞培養を、200ng/mlのB18Rの不存在(上側のパネル)又は存在(下側のパネル)下で実施した。培地を毎日交換した。位相差及び蛍光画像を、0、24、48、及び96時間に撮影した。
図11は結果を示す。B18Rの不存在下、GFPの発現はほとんど検出されなかった。対照的に、B18Rの存在下、srRNA1wt-GFPからのGFP発現は、早ければ24時間に開始し、48時間及び72時間まで続いた。GFPの発現は、GFP+細胞において強かったが、しかし、GFP+細胞の頻度は高くなかった。これはたぶん、ヒト初代線維芽細胞に対するsrRNA1wt-GFPの低いトランスフェクション効率のためであった。
変異体2(ts2)に対応するアルファウイルスファミリーのアミノ酸配列のアライン
図12に示すとおり、アミノ酸レベルにおいてでさえ、アルファウイルスのnsP2タンパク質の構造は、ファミリーメンバー内でよく保存されている。3D構造モデルに基づいて(Russo et al., 2006)、5つのアミノ酸の配列番号39(TGAAA)が変異体2に挿入されているタンパク質領域は、2つのβシート構造の間の分かれ目であり、そしてそれはまた、アルファウイルスファミリーメンバー内でよく保存されている。そのため、変異体2の温度感受性は、Aura(アウラウイルス)、WEEV(西部ウマ脳炎ウイルス)、BFV(バーマーフォレストウイルス)、ONNV(オニョン-ニョンウイルス)、RRV(ロスリバーウイルス)、SFV(セムリキフォレストウイルス)、及びSINV(シンドビスウイルス)を含めた他のアルファウイルスファミリーメンバーに移転可能であるということは、可能性が高い。温度感受性を付与するための様々なアルファウイルスのnsP2内への挿入に好適な位置を、表3-1で列挙する。
Figure 2023508726000002
実施例4：温度感受性抗体
この実施例は、温度感受性抗体を説明する。許容温度(例えば、32℃)にて機能し、かつ、非許容温度(例えば、37℃)にて機能しないか又は低い機能を示す抗体を、アミノ酸配列の挿入又は置換によって設計する。温度感受性抗体は、記載のとおり(Kamihara and Iijima, 2000; Merutka and Stellwagen, 1990)、温度感受性ヘリックス-コイル転移ペプチド(-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-、配列番号37と記載)をコードするリンカーオリゴヌクレオチドを挿入することによって製造できた。このやり方で、許容温度(例えば、32℃)で機能するが、非許容温度(例えば、37℃)では機能しない操作抗体が製造できる。或いは、低温環境の中で自然に生きている動物(例えば、アトランティックサーモンやシュリンプ)の抗体DNA配列が使用できる、なぜなら、これらの抗体が許容温度で(低温で)最適に機能するが、非許容温度(例えば、37℃)で低い機能性を示すからである。
実施例5：温度感受性タンパク質
この実施例は、温度感受性タンパク質を説明する。斯かるタンパク質は、許容温度(例えば、32℃)で機能するが、非許容温度(例えば、37℃)で機能しないか又は低い機能を示す。温度感受性タンパク質は、アミノ酸配列を置換することによって操作される。或いは、低温環境の中で自然に生きている動物(例えば、アトランティックサーモンやシュリンプ)由来の温度感受性タンパク質が使用できる、なぜなら、これらのタンパク質が許容温度で(低温で)最適に機能するが、非許容温度(例えば、37℃)で低い機能性を示すからである(例えば、シュリンプアルカリフォスファターゼ)。
実施例6：温度感受性RNA
この実施例は、温度感受性RNA分子を説明する。RNA分子としては、これだけに限定されるものではないが、mRNA、mRNAの前駆体、ノンコーディングRNA、siRNA、及びshRNAが挙げられる。温度感受性RNAは、許容温度(例えば、32℃)で機能し、かつ、非許容温度(例えば、37℃)で機能しないか又は低い機能を示す。温度感受性RNAを、変異体の熱安定性をより低くするようにRNA分子のヌクレオチドを系統的に変更し(例えば、G->A)、それと同時に、RNAの機能的特性を維持することを確実にするように操作した。さらに、温度のシフトによって誘発されるヌクレオチド対の熱安定性の差は、RNAの二次構造を変化させる。
実施例7：温度感受性作用物質を用いた細胞のエクスビボ処理
この実施例は、エクスビボにおいて細胞にRNA又はタンパク質を一過性に送達する方法を実証する(図13)。温度感受性治療用作用物質は、本明細書中に開示した温度感受性治療用作用物質のいずれかであり得る。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどのts作用物質は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、非許容温度(例えば、37℃)において機能しない。ts作用物質で治療した標的細胞を、特定の持続期間(例えば、3日間)にわたり許容温度にてエクスビボにおいて培養し、次に、特定の持続期間(例えば、10日間)にわたり、非許容温度にて培養する。GOIのRNA(RNAから翻訳されたタンパク質)のレベルは、許容温度にて増大し、そして、高値に達する。非許容温度への切り替え後に、RNAの予想レベルは漸減し、そしてその後、非発現レベルに達した(図13)。
実施例8：温度感受性作用物質のエクスビボにおける治療的使用
この実施例は、エクスビボにおいて細胞にRNA又はタンパク質を一過性に送達する方法を実証する(図14及び図15)。srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどのts作用物質は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、非許容温度(例えば、37℃：人体温度)にて機能しない。典型的に、標的細胞を、患者(自己細胞移植；図14)から採取するが、ドナー(同種異系細胞移植；図15)から単離した標的細胞を使用することもまた可能である。例えば、標的細胞を、抗体コンジュゲート磁性ビーズを使用することによって単離してもよい。標的細胞を、例えば、特定の持続期間、例えば、24時間、にわたり許容温度にて、例えば、33℃にて、エクスビボにおいてts作用物質と共にインキュベートする。GOIのRNA(又はRNAから翻訳されたタンパク質)のレベルは、許容温度にて増大して、高いレベルに達する。治療効果が誘発された後に、患者を治療するために、細胞を患者に移植し戻す。温度感受性治療用作用物質の活性は、対象の正常体温にて誘発されない(すなわち、正常体温は非許容温度である)。温度感受性治療用作用物質の分解は、治療効果が誘発された後に始まり、そして最終的に、温度感受性治療用作用物質は完全に分解される。体温は、患者の生涯を通じて37℃以上に維持され、そしてこれにより、ts作用物質は再活性化されず、そして、標的細胞以外の細胞はts作用物質を用いて治療されない。
ヒト末梢血液細胞の動員
患者から単離したヒト血球、或いはドナーの骨髄又は末梢血を、許容温度にてエクスビボにおいてts作用物質を用いて処理する。G-CSF又は他の動員作用物質の注射後に、ヒト白血球を、アフェレーシス機器(例えば、COBE Spectra)によって末梢血から回収する。動員後に骨髄から回収した白血球は、顆粒球、単球、リンパ球、樹状細胞、間充織幹細胞(MSC)、血管内皮細胞(VEC)、及びCD34+造血/始原細胞を含む。ts作用物質を用いたこれらの細胞の処理を、特定の持続期間(数時間～数週間)にわたり機能的な温度(例えば、33℃)にて、理想的には、Miltenyi製のCliniMacs Prodigyなどの機能的閉鎖型の系を使用して、エクスビボにおいて実施する。それに続いて、処理細胞を、非許容温度(37℃)にて患者に注入する。ts作用物質、ts作用物質を含む細胞、又はts作用物質の生成物は患者の体内で機能しない。
ヒトCD34+造血幹/始原細胞
ヒトCD34+造血幹/始原細胞を、(CD34に対する)抗体コンジュゲート磁性ビーズを使用して動員されたヒト末梢血液細胞又は骨髄細胞から単離し、そして、許容温度にてエクスビボにおいてts作用物質を用いて処理する標的細胞として使用する。ts作用物質で処理した後に、ヒトCD34+細胞を、患者の体内に注入し、及び患者の骨髄内に移植する。これらの細胞は、最終的に、患者の体内ですべての血球細胞を産生するので、これにより、さまざまな疾患の好適な標的である。
組織幹細胞を含めたあらゆるヒト細胞
患者又はドナーから単離され、かつ、標的細胞として使用される、あらゆるヒト細胞を、エクスビボにおいて許容温度にてts作用物質で処理する。斯かる細胞としては、これだけに限定されるものではないが、皮膚線維芽細胞、濾胞細胞、骨格筋細胞、肝細胞、及び神経組織が挙げられる。また、斯かる細胞としては、間充織幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、皮膚幹細胞、及び腸幹細胞などのさまざまな組織の幹細胞も挙げられる。
実施例9：温度感受性作用物質のセミインビボにおける治療的使用
この実施例は、細胞にRNA又はタンパク質を一過性に送達するための、セミインビボにおける方法を説明する(図16)。温度感受性治療用作用物質とは、本明細書中に開示したあらゆる温度感受性治療用作用物質である。ts作用物質は許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)において機能しない。
患者は治療用低体温療法の施術を受ける：患者の中核体温を正常体温より低温度(例えば、33℃)に維持する。標的細胞(任意の細胞－自己又は同種)を、エクスビボにおいてts作用物質で処理し、即座に患者の循環内に注入するか、又は患者の器官内に注射する。
患者を、しばらく、例えば、24時間、にわたり目標温度、例えば、33℃、にて維持している間、ts作用物質はそれらの期待される機能を発揮する。GOIのRNA(該RNAから翻訳されたタンパク質)のレベルは、許容温度にて増大して、高いレベルに達する。それに続いて、患者の体温を、37℃の正常体温に戻す。ts作用物質は、患者の体内の非許容条件である37℃ではもう機能しない。体温は、患者の生涯を通じて37℃以上に維持され、そしてこれにより、ts作用物質は再活性化されず、そして、標的細胞以外の細胞はts作用物質を用いて治療されない。特に、この治療手段は、先に記載したものを含めたあらゆる細胞型に適用できる。
実施例10：温度感受性作用物質のインビボにおける治療的使用
この実施例は、どのように温度感受性ウイルスベクターが対象に投与され、そして、軽度の低体温療法が対象で誘発されたときに、一過性に活性化されるかを実証する(図17)。温度感受性治療用作用物質は、本明細書中に開示した温度感受性治療用作用物質のいずれかであり得る。温度感受性治療用作用物質は、許容温度(例えば、33℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃：人体温度)において機能しない。
対象の中核体温は、目標温度管理(TTM)手順を用いて下げられ、そしてそれは、心臓及び脳損傷を患っている患者のために外来診療所で使用された。TTM手順は、持続期間にわたり対象の特定の体温を達成し、そして維持するように設計される。斯かる手順は、あらかじめ、心発作や脳卒中などの様々な急性の健康問題から生じるネガティブ効果を低減するために治療的に使用された。TTM手順を使用する装置と一般的方法は、当該技術分野で知られており、本明細書中に記載した方法と共に使用できる。TTM手順は、冷却カテーテル、冷却ブランケット、及び体の周りへの氷の適用を含めた多くの方法を使用して実施できる。さまざまな器具を斯かる目的のために使用した。例えば、ArcticSun(商標)は、患者の体温を32℃～38.5℃に下げる又は上げるのに使用できる器具である(Pittl et al., 2013)。その手順は、安全におこなうことができ、そして、この器具によって引き起こされた主要な副作用がないことも報告されている。
患者は、TTM手順を使用した低体温条件下に置かれ、そして、目標体温は、温度感受性治療用作用物質の活性を誘発するために十分な温度である。温度感受性治療用作用物質を、全身経路(例えば、静脈内)又は器官/組織内への直接注入(例えば、カテーテル又は経皮的な針での注射)によって患者に直接送達する(図17)。
患者の温度を、温度感受性治療用作用物質の所望の活性の誘発を可能にするのに十分な時間にわたり許容温度に保つ。温度感受性作用物質の所望の活性は、温度感受性治療用作用物質を含有するか又はそれに晒されている細胞における治療効果につながる。
所望の治療効果が達成された後、次に、患者の体温を正常体温(すなわち、非許容温度)に戻して、温度感受性治療用作用物質の活性が停止させる。このあとに温度感受性治療用作用物質の分解が続く。
循環による全身送達
患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、ts作用物質を、患者の静脈内に直接送達する。そのts作用物質は、この全身経路によって多くの器官や組織に送達される。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、機能する温度にて維持する。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非許容温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。
ts-作用物質は、裸のRNA(すなわち、合成RNA)であってもよい。循環による全身送達は、標的器官特異性の有無にかかわらず、裸のRNAを多くの器官に送達する。或いは、ts作用物質は、ナノ粒子によってカプセル化されたRNA(すなわち、合成RNA)であり、そしてそれを、特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞を標的化するように操作する。よって、循環による全身送達は、ナノ粒子カプセル封入RNAを特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞に送達する。或いは、ts作用物質は、ウイルス粒子内にパッケージされたRNAである。エンベロープタイプと他の特徴に依存して、ウイルス粒子は、特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞を標的化する。よって、循環による全身送達は、ウイルス粒子内にパッケージされたRNAを特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞に送達する。或いは、ts作用物質は、温度感受性ウイルスベクターである。エンベロープタイプと他の特徴に依存して、ウイルス粒子は、特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞を標的化する。よって、循環による全身送達は、温度感受性ウイルスベクターを特定の細胞型、組織、器官、癌、腫瘍、又は異常細胞に送達する。
脳脊髄液を経由した脳及び脊髄への標的送達
患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、ts作用物質を、硬膜外注射によって患者の脳脊髄液に直接送達する。そのts作用物質は、脳及び脊髄に送達される。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、許容温度にて維持し続ける。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非許容温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。
皮内注射による肝臓、腎臓、骨格筋、心筋、膵臓、骨髄、及び他の器官への標的送達
患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、ts作用物質を、超音波又はCTの視覚的誘導を用いた極細針を使用して、肝臓、腎臓、骨格筋、心筋、膵臓、又は他の器官などの器官内に皮膚を経由して(経皮的に)注射する。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、許容温度にて維持する。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非許容温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。
注射針カテーテルを備えた内視鏡による肝臓、腎臓、骨格筋、心筋、膵臓、骨髄、及び他の器官への標的送達
患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、次に、ts作用物質を、内視鏡注射針カテーテルによって特定の器官及び組織に直接送達する。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、許容温度にて維持する。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非許容温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。
血管カテーテルによる肝臓、腎臓、骨格筋、心筋、膵臓、骨髄、及び他の器官への標的送達
患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、次に、ts作用物質を、血管カテーテルによって特定の器官及び組織に直接送達する。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、許容温度にて維持する。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非機能温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。
吸入法による肺及び他の器官への標的送達
患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、次に、ts作用物質を、吸入法によって患者に直接送達する。ts作用物質を、肺を経由した吸入法を介して肺及び他の器官に送達する。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、許容温度にて維持する。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非許容温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。
脾臓に動員された骨髄細胞への標的送達
患者は、対象の脾臓に骨髄細胞(これだけに限定するものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、及び内皮幹細胞を含む)を動員するためにG-CSF、プレリキサホル又は他のサイトカインの注射を受ける。患者を、低体温条件下に(例えば、33℃に)置く。患者の中核体温を目標温度にて安定に維持した時点で、次に、ts作用物質を、先に記載した方法を介して脾臓に送達する。それに続いて、ts作用物質を、脾臓に動員された骨髄細胞に送達する。患者の中核体温を、所望の期間(例えば、24時間)にわたり、許容温度にて維持する。患者の体温が作用物質の許容温度に(例えば、33℃に)に維持されている間、その作用物質は機能している。患者の体温が作用物質の非許容温度である37℃の正常に戻るとき、その作用物質は働きを停止する。例えば、その方法は、脾臓において治療的有効量の温度感受性作用物質(例えば、温度感受性治療用作用物質)を1若しくは複数の骨髄細胞(これだけに限定するものではないが、CD34+細胞、造血幹細胞、間充織幹細胞、内皮幹細胞を含む)に投与することを含み得る。
実施例11：温度感受性作用物質としての自己複製RNAによるヒトES及びiPS細胞の所望の細胞型への分化
この実施例は、ヒト転写因子を発現する温度感受性自己複製RNAが、hPSCをさまざまな分化細胞に分化させ得るという知見を説明する。この実施例に提示される知見は、「ts作用物質を用いたエクスビボにおける細胞の処理」に適用され得る。この方法で作出された分化細胞は、患者由来iPS細胞を使用することによるヒト疾患のインビトロモデリングや薬物スクリーニングなどの多くの有用な適用がある。この実施例に提示した知見は、「ts作用物質のエクスビボにおける治療的使用」に適用され得る。この方法で作出された分化細胞を、患者の欠陥がある器官や組織を修復するために移植できる。例えば、この方法によってエクスビボにおいて作出されたニューロン(より具体的にはドーパミン動作性ニューロン)を、パーキンソン病を治療するために患者の黒質(脳の一部)に移植する。この実施例に提示した知見は、「ts作用物質のセミインビボにおける治療的使用」に適用され得る。ニューロンを誘導するts作用物質を用いて処理した細胞を、ts誘発細胞分化が患者の体内で起こるように治療用低体温療法を受ける患者に移植する。分化細胞が現れた時点で、患者の体温を非許容温度(すなわち、37℃)に戻すことによって、ts作用物質を停止させる。この実施例に提示した知見は、「ts作用物質のインビボにおける治療的使用」に適用され得る。例えば、1セットの転写因子を発現するts作用物質を、患者の膵管細胞がインビボにおいてインスリン分泌ベータ細胞に変換されるように(許容温度における)治療用低体温療法を受けた糖尿病患者の膵臓に直接注射する。所望の細胞が現れた時点で、患者の体温を非許容温度(すなわち、37℃)に戻すことによってts作用物質を停止させる。
材料と方法
細胞培養
ヒト脂肪幹細胞由来iPS細胞株(ADSC-iPS細胞)を、System Biosciences(Palo Alto, CA)から購入した。細胞を、標準的なhPSC培養法に従って未分化多能性細胞として規定どおりに維持した。簡単に言えば、細胞を、100ng/mlのFGF2を補ったStemFit basic02(Ajinomoto, Japan)で培養した。さらに、細胞を、ラミニン-511基質(iMatrix-511, Nippi, Japan)でコートした細胞培養ディッシュ上で培養した。
温度感受性自己複製RNA(srRNA1ts2)
着目(GOI)の遺伝子のオープンリーディングフレームを、GOIの発現が温度感受性様式で制御されるように、srRNA1ts2ベクター内にクローニングした。合成RNAを、Yoshioka et al., 2013に従ってベクターからのインビトロ転写によって作製し、そして、トランスフェクションに使用した。以下のGOIをsrRNA1ts2ベクター内にクローニングした：
srRNA1ts2-NGN3：ヒトニューロゲニン3(NGN3)[NCBI GeneID：50674]；及び
srRNA1ts2-ETV2：ヒトETS変異体2(ETV2)[NCBI GeneID：2116]。
結果
ニューロンの作出
ADSC-iPSC細胞を、1.2×10^5細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。その細胞を平板培養する前に、細胞をRock阻害剤で1時間前処理した。平板培養する24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-NGN3を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を33℃にて72時間インキュベートした。次に、その細胞を継代し、オルニチン/ラミニンコートガラスカバーガラス上で培養した。次に、細胞を37℃にて培養した。培地を毎日交換した。srRNA1ts2-NGN3ベクターは、「IRES」配列後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含み、これにより、ピューロマイシンを使用して選択できる。継代後に、細胞を、1μg/mlのピューロマイシン存在下で24時間培養した。位相差画像を、0、1、2、3、4、5及び6日目に撮影した(図18)。形成された神経突起をより明確に示すために、6日目の拡大写真の画像もまた示す。9日目に、細胞を固定し、そして、チューブリンβIII(TUBB3)－神経マーカーに対する抗体で染色した。2つの異なる倍率(10×、40×)の蛍光顕微鏡画像を示す(図18)。結果は、srRNA1ts2-NGN3が急速かつ効率的にヒトiPS細胞をニューロンに分化させ得ることを示す。
血管内皮細胞の作出
ADSC-iPSC細胞を、1.2×10^5細胞/ウェルの密度にて24ウェルプレート上で平板培養した。その細胞を平板培養する前に、細胞をRock阻害剤で1時間前処理した。平板培養する24時間後に、細胞を、srRNA1ts2-ETV2を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションのために、24ウェルプレートの各ウェルを、50μlの終量にて1μlのJetMessenger(Polyplus)トランスフェクション試薬と混合した0.5μgの合成RNA(srRNA)を用いて処理した。細胞にトランスフェクション複合体を追加した後に、450μlの培地を加えた。細胞を32℃にて3日間インキュベートし、次に、37℃にてさらに5日間(合計8日間)培養した。培地を毎日交換した。srRNA1ts2-ETV2ベクターは、「IRES」配列後に挿入されたピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ(pac)選択遺伝子を含み、これにより、ピューロマイシンを使用して選択できる。33℃から37℃への温度切り替え時点で、1μg/mlのピューロマイシンを培養物に加えた。翌日、培地を、1μg/mlのピューロマイシンを含有する培地に交換した。そのため、細胞を、1μg/mlのピューロマイシン存在下で2日間培養した。位相差画像を、1、2、3、4、5、6、7及び8日目に撮影した(図19)。8日目に、細胞を固定し、そして、CD31(血管内皮細胞のマーカー)に対する抗体で染色した。2つの異なる倍率(10×、20×)の蛍光顕微鏡画像を示す(図19)。結果は、srRNA1ts2-ETV2が急速かつ効率的にヒトiPS細胞を血管内皮細胞に分化させ得ることを示す。
実施例12：ゲノム編集
ゲノム編集は、ヌクレオチド配列を置換、欠失、又は付加することによって生物体のゲノムを変更する遺伝子操作方法である。遺伝子治療のためのゲノム突然変異を補正するためにゲノム編集を使用することを提案した。第1ステップとして、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFNs)、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ(TALENs)、又はクラスター化され、規則的間隔をおいた短い回文の反復(CRISPR)-CAS9システムなどのDNAヌクレアーゼによって、ゲノムDNAを特定位置で切断しなければならない。これらのヌクレアーゼの導入は慎重に制御されなければならないが、なぜなら、これらの酵素によって導入された二本鎖DNAの破壊が、細胞にとって非常に有害だからである。これらのヌクレアーゼの目標とされる発現は、タイミングと持続期間の精密制御を必要とする。ガイドRNAとCAS9の両方が一つのセンダイウイルスベクターでコードされ得、そしてそれが、高効率でのヒト細胞のゲノム編集のためにこれらの成分を送達することを可能にすると報告された(Park et al., Molecular Therapy 2016)。しかしながら、CAS9の連続的な発現は、ヒト細胞に制御不可能なDNA破壊及び変異の導入を誘発する場合がある。よって、遺伝子編集システムを治療的に使用するために、何日ではなく、何時間程度で短期間にわたりCAS9を発現することが望ましい。このために、温度感受性作用物質は、これらの成分、特にヌクレアーゼのデリバリービヒクルとして使用できる。
最初に、報告されていたCRISPR/CAS9システム(Park et al., 2016)に使用するセンダイウイルスベクターを、温度感受性センダイウイルスベクター(SeVts-CAS9-ガイドRNA)によって置換する。一実施形態において、SeVtはSeV18/TS15ΔFである(Ban et al., PNAS 2011)。ヒト初代線維芽細胞を、33℃にてMOI25で温度感受性センダイウイルスベクターに感染させ、そして、24～48時間にわたりCO2インキュベーター内で33℃にて維持する。それに続いて、細胞培養物の温度を、残りの細胞培養のために37℃に移行する。ウイルス複製と増加したCAS9発現は、細胞培養物が33℃にて維持されたときだけ現れ、これにより、CAS9ヌクレアーゼへの細胞の曝露は、この短期間に限定される。細胞を37℃にて培養している間、温度感受性センダイウイルスベクターは、最終的に細胞から失われ、これにより、インビトロ及びインビボにおけるCAS9発現の再活性化に関する心配がなくなる。同様に、srRNA1ts2(srRNA1ts2-CAS9-ガイドRNA)などの温度感受性自己複製RNAは、SeVts-CAS9-ガイドRNAの代わりに使用される可能性がある。
実施例13：CAR T細胞療法
CAR T細胞療法は、患者自身のT細胞内にキメラ抗原受容体(CAR)をコードするベクターの移入、そして、細胞毒性T細胞におけるCARの安定的な発現を使用する(Maus and June 2016)。CAR T細胞療法は、患者の悪性細胞を侵襲するように患者自身のT細胞を再プログラムすることを目指す。例えば、CD19を標的化するCAR T細胞は、B細胞悪性腫瘍に対して首尾よく適用した。しかしながら、CD19はまた、正常B細胞においても発現され、それにより、CARの連続的な発現は、副作用を被る場合があって、それは望ましくない。そのため、最近の臨床試験では、CARの発現が一過性になるように、患者自身のT細胞内にCARをコードする合成mRNAを移入する(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02624258)。しかしながら、短い代謝回転(<12時間)と合成RNAによる比較的低いタンパク質発現レベルは、CARの十分な発現レベルを達成する際に問題を提示する。この問題に対処するために、ts作用物質を、T細胞へのCARのデリバリービヒクルとして使用する。
T細胞にCARを送達するための温度感受性作用物質のエクスビボにおける治療的使用
T細胞を、アフェレーシス機器(COBE Spectra)及び磁気ビーズベース濃縮法(Miltenyi製のCliniMacs Prodigy)を使用して末梢血から回収する。次に、T細胞に、srRNA1ts2-CARをトランスフェクトし、そして、許容温度(33℃)にて24時間(又はそれより長く)、エクスビボにおいて培養する。理想的には、この手順を、Miltenyi製のCliniMacs Prodigyなどの機能的閉鎖型の系で実施する。それに続いて、処理細胞を、患者に注入して戻す。非許容温度(37℃)の患者の体内では、srRNA1ts2-CARはCARの産生を停止するが、十分な量のCARが既にT細胞の表面に存在し、そしてそれが、CARの期待される機能を発揮する。或いは、CAR(SeVts-CAR)をコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-CARの代わりに使用する。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
T細胞にCARを送達するための温度感受性作用物質のセミインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-CARで処理したT細胞を、治療用低体温療法によって許容温度(例えば、33℃)に維持した患者に即座に注入する。許容温度で維持している間、CAR-srRNA1ts2は機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-CARはCARの産生を停止する。或いは、CARS(SeVts-CAR)をコードする温度感受性センダイウイルスベクターを使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
T細胞にCARを送達するための温度感受性作用物質のインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-CARを、許容温度(33℃)で維持された患者の体内へのインビボ送達によってT細胞に直接標的化する。許容温度で維持している間、CAR-srRNA1ts2は機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-CARはCARの産生を停止する。或いは、CARS(SeVts-CAR)をコードする温度感受性センダイウイルスベクターを使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
実施例14：PD1とCTLA4のドミナントネガティブ突然変異体
プログラム死-1(PD1)と細胞傷害性Tリンパ細胞抗原-4(CTLA4)は、免疫チェックポイントとして機能することが知られている。PD1とCTLA4に対する抗体(例えば、ニボルマブとペムブロリズマブ)の全身送達は癌治療法に使用されてきた。しかしながら、これらの治療法を受けた患者の最大20%が、自己免疫などの有害事象を経験した(Roberts et al., 2017)。免疫チェックポイントは自己免疫を予防するように免疫機能の活性化を制限するために本来機能するので、抗体の投与によりこれらの分子の機能を全身的に妨げることで、免疫が癌に対してだけではなく、患者自身の正常細胞に対しても活性化すると考えられる。この問題に対処するために、PD1とCTLA1のドミナントネガティブ突然変異体をT細胞内で特異的に発現させ、その結果、T細胞内でのみPD1とCTLA4の機能を妨げる(Shin et al., 2016)。PD1に関しては、細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含むが、細胞質ドメインを欠いている突然変異体が、ドミナントネガティブ突然変異体(PD1デコイ又はPD1Δ)として機能することが示されている(Shin et al., 2016)。レトロウイルスベクターを、マウス試験における単離T細胞へのPD1デコイを送達するのに使用したが、宿主ゲノム内へのレトロウイルスベクターの組み込みとPD1デコイの持続的発現は、ヒトにとって望ましくなく、免疫チェックポイントの長期阻害の潜在的副作用が考えられる。理想的には、T細胞(又は他の免疫細胞)におけるPD1デコイの発現は、その有益な機能を発揮した後に、永久に停止されなければならない。このために、ts作用物質を、PD1とCTLA4のドミナントネガティブ突然変異体のデリバリービヒクルとして使用する。
ドミナントネガティブPD1突然変異体を送達するための温度感受性作用物質のエクスビボにおける治療的使用
標的細胞(例えば、T細胞)を、アフェレーシス機器(COBE Spectra)及び磁気ビーズベース濃縮法(Miltenyi製のCliniMacs Prodigy)を使用して末梢血から回収する。次に、標的細胞に、srRNA1ts2-PD1Δをトランスフェクトし、そして、許容温度(例えば、33℃)にて所望の時間(例えば、24時間又は1週間)培養する。それに続いて、処理細胞を、患者に注入する。非許容温度(37℃)の患者の体内では、srRNA1ts2-PD1ΔはPD1Δの産生を停止する。しかしながら、PD1Δタンパク質が標的細胞内に存在している限り、PD1機能は妨げられる。或いは、PD1Δをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-PD1Δの代わりに使用する場合がある。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
ドミナントネガティブPD1突然変異体を送達するための温度感受性作用物質のセミインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-PD1Δで処理したT細胞を、治療用低体温療法によって許容温度(例えば、33℃)に維持した患者に即座に注入する。許容温度で維持している間、PD1Δ-srRNA1ts2は機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-PD1ΔはPD1Δの産生を停止する。或いは、PD1Δをコードする温度感受性センダイウイルスベクターをsrRNA1ts2-PD1Δの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
ドミナントネガティブPD1突然変異体を送達するための温度感受性作用物質のインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-PD1Δを、許容温度(33℃)で維持された患者の体内へのインビボ送達によってT細胞に直接標的化する。許容温度で維持している間、PD1Δ-srRNA1ts2は機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-PD1ΔはPD1Δの産生を停止する。或いは、PD1Δをコードする温度感受性センダイウイルスベクターをsrRNA1ts2-PD1Δの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
実施例15：CAR T細胞と、PD1及びCTLA4のドミナントネガティブ突然変異体との併用療法
PD1遮断抗体の全身投与は、CAR T細胞(John et al., 2013)による腫瘍の撲滅を促進する。srRNA1ts2は高い積載容量を有し、かつ、同じベクター内に同義遺伝子を収容できるので、ts作用物質(特にsrRNA1ts2)は、同じT細胞へのPD1遮断機能とCARの両方のデリバリービヒクルを提供する。
T細胞にCARとドミナントネガティブPD1とを送達するための温度感受性作用物質のエクスビボにおける治療的使用
PD1ΔとCARのコード領域を、それらの間のP2Aペプチド(自己開裂ペプチド)の挿入物と融合させる。この融合タンパク質-コード配列を、ここでは、GOIとしてのsrRNA1ts2ベクター内に挿入する。合成RNA(srRNA1ts2-PD1ΔCAR)をsrRNA1ts2-PD1Δ-CARベクターから製造する。T細胞を、アフェレーシス機器(COBE Spectra)及び磁気ビーズベース濃縮法(Miltenyi製のCliniMacs Prodigy)を使用して末梢血から回収する。次に、T細胞に、srRNA1ts2-PD1ΔCARをトランスフェクトし、そして、許容温度(33℃)にて24時間(又はそれより長く)培養する。それに続いて、処理細胞を、患者に注入して戻す。非許容温度(37℃)の患者の体内では、srRNA1ts2-PD1ΔCARはPD1ΔとCARの産生を停止する。しかしながら、十分な量のPD1ΔとCARが既にT細胞の表面に存在する。或いは、PD1Δ-CARをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-PD1ΔCARの代わりに使用し得る。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
T細胞にCARとドミナントネガティブPD1とを送達するための温度感受性作用物質のセミインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-PD1ΔCARで処理したT細胞を、治療用低体温療法によって許容温度(例えば、33℃)に維持した患者に即座に注入する。許容温度で維持している間、srRNA1ts2-PD1ΔCARは機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-PD1ΔCARは、CARとPD1Δの産生を停止する。或いは、PD1Δ-CARをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-PD1ΔCARの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
T細胞にCARとドミナントネガティブPD1とを送達するための温度感受性作用物質のインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-PD1ΔCARを、許容温度(33℃)で維持された患者の体内へのインビボ送達によってT細胞に直接標的化する。許容温度で維持されている間、srRNA1ts2-PD1ΔCARは機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-PD1ΔCARはCARとPD1Δの産生を停止する。或いは、PD1Δ-CARをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-PD1ΔCARの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
実施例16：リボヌクレオタンパク質
リボヌクレオタンパク質は、RNAとの複合体を形成することによって機能する。同じベクターからタンパク質とRNAの両方を発現することが難しいので、リボヌクレオタンパク質の治療適用は難易度が高い。例えば、テロメラーゼの主部分は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)とテロメラーゼRNA(TERC)である。テロメアの異常短縮は疾患を引き起こす。よって、テロメアを伸長するためのテロメラーゼ(TERT+TERC)の送達は、望ましい治療的介入である。しかしながら、永続的なテロメラーゼの存在は、腫瘍形成などの有害事象を誘発する可能性がある。そのため、TERTとTERCの両方の時限送達を有することが望ましい。このために、ts作用物質を、TERTとTERCのデリバリービヒクルとして使用し得る。
TERTとTERCを送達するための温度感受性作用物質のエクスビボにおける治療的使用
srRNA1ts2ベクターを、温度感受性様式でタンパク質TERTを発現するように構築する。そのベクターはまた、TERC、自己開裂リボザイム(例えば、Hammerheadリボザイム)によってサンドイッチされたRNA成分も含んでいる。得られたベクターを、合成RNA(srRNA1ts2-TERT-TERC)を製造するのに使用する。標的細胞(例えば、造血幹細胞)に、srRNA1ts2-TERT-TERCをトランスフェクトする。許容温度(例えば、33℃)にて、srRNA1ts2-TERT-TERCを複製させ、そして、TERT(タンパク質)を産生させる。同時に、一部のRNA分子(srRNA1ts2-TERT-TERC)をリボザイムによって自己切断させ、そして、TERC(RNA)にする。次に、TERTとTERCはテロメラーゼ複合体を形成し、そして、テロメアを伸長する。次に、標的細胞(例えば、造血幹細胞)を患者の循環内に注入する。37℃の非許容温度にて、srRNA1ts2-TERT-TERCは動作を停止する。或いは、TERT-TERCをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-TERT-TERCの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
TERTとTERCを送達するための温度感受性作用物質のセミインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-TERT-TERCで処理した標的細胞を、治療用低体温療法によって許容温度(例えば、33℃)に維持した患者に即座に移植する。許容温度で維持している間、srRNA1ts2-TERT-TERCは機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-TERT-TERCは、TERTとTERCの産生を停止する。或いは、TERT-TERCをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-TERT-TERCの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
TERTとTERCを送達するための温度感受性作用物質のインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2-TERT-TERCを、許容温度(33℃)で維持された患者の体内へのインビボ送達によって細胞に直接標的化する。許容温度にて維持している間、srRNA1ts2-TERT-TERCは機能的である。しかしながら、患者の温度が正常体温(37℃)に切り換えられたとき、srRNA1ts2-TERT-TERCは、TERTとTERCの産生を停止する。或いは、TERT-TERCをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-TERT-TERCの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
実施例17：遺伝子ノックダウン又はサイレンシング
マイクロRNA、siRNA、及びshRNAを含めた、RNAiは、治療目的のための特定の遺伝子の機能をノックダウンするための魅力的な選択肢となった(Kaczmarek et al., 2017)。しかしながら、RNAi技術の欠点は、その非常に短期間の作用であり、そしてそれは、多量のsiRNAsの反復投与を必要とする。その一方、プラスミドとウイルスはPolIIIプロモーターからのshRNAの強力な発現を提供するが、必要なときにその発現を停止するのが難しい。さらに、DNAベースのshRNA発現系は、生物体のゲノム内に組み込まれ、そして、突然変異を引き起こし得る。この場合、温度感受性srRNA又はセンダイウイルスベクターが理想的な解決策を提供し得るが、なぜなら、それらがRNAiの足跡を残さない(生物体のゲノム内への組み込みがない)制御可能かつ長期間の発現を提供するからである。
shRNA。shRNAは、Park et al., 2016に示された自己開裂リボザイムが両側に配置されたガイドRNAと類似した様式で、自己開裂リボザイムが両側に配置されたGOIとしてsrRNAts又はSeVt内に組み込まれる。srRNA1ts2-shRNAを、細胞を標的化するために送達し、そしてそこでは、標的細胞が許容温度にて維持されているとき、標的遺伝子がサイレンシングされる。しかしながら、温度が非許容温度に移行するとき、shRNAの産生は停止し、そして、標的遺伝子はサイレンシングされない。或いは、shRNAをコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-shRNAの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
dsRNA。長い二本鎖RNA(dsRNA)の発現単位は、短いリンカーRNA配列によって(すなわち、ノックダウンされるべき)標的RNAの長いセンス鎖とそのアンチセンス鎖を接続することによって作製される。dsRNAのこの発現単位は、自己開裂リボザイムが両側に配置されたガイドRNAと類似した様式で、自己開裂リボザイムが両側に配置されたGOIとしてsrRNA1ts2ベクター内に挿入する(Park et al., 2016及びShinagawa T1, Ishii S. 2003)。dsRNAからのsiRNAsの形成を容易にするために、srRNA1ts2ベクターはまた、ヒトDICER1(NCBI参照配列：NG_016311.1)も発現する。srRNA1ts2-dsRNA又はsrRNA1ts2-DICER1-dsRNAを、細胞を標的化するために送達し、そしてそこでは、標的細胞が許容温度にて維持されているとき、標的遺伝子がサイレンシングされる。しかしながら、温度が非許容温度に移行するとき、dsRNA(及び存在する場合、DICER1)の産生は停止し、そして、標的遺伝子はサイレンシングされない。或いは、dsRNA又はdsRNA-DICER1をコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-dsRNA又はsrRNA1ts2-dsRNA-DICER1の代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
asRNA。(すなわち、ノックダウンされるべき)標的RNA(asRNA)を、Park et al., 2016及びShinagawa T1, Ishii S. 2003に示された、自己開裂リボザイムが両側に配置されたガイドRNAと類似した様式で、自己開裂リボザイムが両側に配置されたGOIとしてsrRNA1ts2ベクター内に挿入する。dsRNAからのsiRNAsの形成を容易にするために、srRNA1ts2ベクターはまた、ヒトDICER1(NCBI参照配列：NG_016311.1)も発現する。srRNA1ts2-asRNA又はsrRNA1ts2-DICER1-asRNAを、細胞を標的化するために送達し、そしてそこでは、標的細胞が許容温度にて維持されているとき、標的遺伝子がサイレンシングされる。しかしながら、温度が非許容温度に移行するとき、asRNA(及び存在する場合、DICER1)の産生は停止し、そして、標的遺伝子はサイレンシングされない。或いは、asRNA又はasRNA-DICER1をコードする温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1ts2-asRNA又はsrRNA1ts2-asRNA -DICER1の代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
先に詳述した遺伝子ノックダウン又は遺伝子サイレンシング方法を、「ts作用物質を用いた細胞のエクスビボにおける治療」、「ts作用物質を用いたエクスビボにおける治療的使用」、「ts作用物質を用いたセミインビボにおける治療的使用」、又は「ts作用物質を用いたインビボにおける治療的使用」のいずれにも適用する。
実施例18：細胞融合療法
再生医療の分野の戦略の1つは、胚幹(ES)細胞や誘導多能性幹(iPS)細胞などのヒト多能性幹細胞をニューロンや筋肉などの所望の細胞型に分化させ、次に、これらの分化細胞を患者に移植することである。多くの場合、血球細胞又は線維芽細胞などの患者自身の細胞から作製されたiPS細胞を使用することが望ましい。例えば、筋ジストロフィー症を患っている患者を治療するために、ES細胞又はiPS細胞からエクスビボにおいて分化させた骨格筋細胞を患者の骨格筋に移植し得る。技術的課題の1つは、外来筋肉細胞の適切な移植と、患者の欠陥がある筋肉機能の置換又は補足を確実にすることである。この問題に対処するために、融合性タンパク質をコードするRNAを、外来筋肉細胞内に送達することができ、そしてそれは、外来筋肉細胞と患者自身の筋肉細胞の間の細胞間融合を容易にする。
融合性タンパク質を送達するための温度感受性作用物質のセミインビボにおける治療的使用
srRNA1ts2ベクターを、センダイウイルスF及びHNタンパク質などの融合性タンパク質を発現するように構築する。F及びHNを、P2A自己開裂ペプチドを介して単一タンパク質に融合する。srRNA1ts2-F-HNベクターを、合成RNA(srRNA1ts2-F-HN)を産生させるのに使用する。細胞表面のF及びHNタンパク質の存在が、細胞融合を誘発し得ることは確立されている(Rawling et al., 2008)。或いは、それ単独で細胞間融合を誘発できる(Rawling et al., 2008)、ヒト呼吸器合胞体ウイルスFタンパク質を、srRNAベクター内にクローン化して、合成RNA(srRNA1ts2-RSVF)を製造する。融合性タンパク質に関する別の例は、Myomaker(Mymk)と(Myomergerとしても知られている)Myomixer(Mymx)である(Bi et al., 2017)。Myomakerとmyomixerを、P2A自己開裂ペプチドを介して単一タンパク質に融合する。srRNA1ts2-Mymk-Mymxベクターを、使用して、合成RNA(srRNA1ts2-Mymk-Mymx)を製造する。MyomakerとMyomixerの両方の存在は、筋肉だけではなく、同様に線維芽細胞内においても細胞間融合を誘発する(Bi et al., 2017)。ヒトiPS細胞を、先に記載した方法を使用して骨格筋に分化させる。次に、骨格筋に、srRNA1ts2-HN-F、srRNA1ts2-SRVF又はsrRNA1ts2-Mymk-Mymxをトランスフェクトし、直後に、治療用低体温療法の手順によって体温をあらかじめ33℃に下げた患者の骨格筋内に注射する(図15)。患者を24時間にわたり目標温度(33℃)で維持している間、(その後、患者自身の欠陥がある骨格筋細胞に融合する)移植した骨格筋細胞において、融合性タンパク質が発現される。それに続いて、患者の体温を37℃の正常体温に戻す。ts作用物質と融合性タンパク質は、患者の体内側の37℃のこの機能しない条件においてもう機能しない。
ts作用物質のこのセミインビボ使用で治療し得る組織は、骨格筋に限定されない。心筋細胞と肝細胞は通常倍数性であり、そのため、心臓組織と肝臓はこの療法のための好適な標的である。心筋細胞と肝細胞は、ヒトES/iPS細胞から容易に作出できる組織である。さらに、ts作用物質のセミインビボ使用は、脊髄損傷などの神経変性疾患、及びパーキンソン病などの神経学的疾患を治療するのに使用できる。或いは、温度感受性センダイウイルスベクターを、srRNA1tsの代わりに使用することもできる。例えば、SeVtは、SeV18/TS15ΔF(Ban et al., PNAS 2011)であってもよい。
先に詳述した遺伝子ノックダウン又は遺伝子サイレンシング方法を、「ts作用物質を用いた細胞のエクスビボにおける治療」、「ts作用物質を用いたエクスビボにおける治療的使用」、「ts作用物質を用いたセミインビボにおける治療的使用」、又は「ts作用物質を用いたインビボにおける治療的使用」のいずれにも適用し得る。
実施例19：ワクチン
srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)は、許容温度(例えば、31～34℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、>37℃)で機能しない。ヒト対象の中核体温が約37℃であるのに対して、ヒト対象の表面体温は約31～34℃である。よって、ヒト患者の体表面又はその付近の細胞に(例えば、皮内、皮下、又は筋肉内に)投与されたts作用物質は、ヒト患者の中核体温を下げることなく機能的である(図20)。更なる行動を必要としない。
同様に、ヒト対象の鼻腔及び上部気管の温度は約32℃であり、及びヒト対象の亜区域気管支の温度は約35℃である(McFadden et al., 1985)。このように、ヒト患者の上気道(鼻腔、咽頭、及び/又は喉頭)及び/又は上部気管の細胞に鼻腔内投与されたts作用物質は、ヒト患者の中核体温を下げずに、機能的である(図22)。鼻腔内投与は、吹送、吸入又は点滴によっておこなわれてもよい。更なる行動を必要としない。
或いは、ヒト患者の体表面又はその付近の細胞に(例えば、皮内、皮下、又は筋肉内に)投与されたts作用物質は、それに続いて、例えば、患者の皮膚の治療領域に熱パッチ若しくは熱パッドを適用すること、温浴中に浸ること、又は熱いサウナに座ることによって、ヒト患者の表面体温を上げることによって機能しない状態にすることができる。ts作用物質は、意図された領域でのみ機能的であり、かつ、患者の体内の他の領域で機能しないという点で、この治療手段は非常に安全である。同様に、ヒト患者の上気道(鼻腔、咽頭、及び/又は喉頭)及び/又は上部気管の細胞に鼻腔内的に投与されたts-作用物質は、非許容温度(例えば、≧37℃)を有する環境にヒト患者を置くことによって機能しない状態になり得る。
ベクターとしてsrRNA1ts2を用いる免疫原性組成物及びワクチンは、すべてのタイプの病原体に対して免疫応答を誘発するために好適である。例えば、遺伝子組み換えsrRNA1ts2ベクターは、病原体の抗原のコード領域が知られた時点で比較的迅速に構築され得る。さらに、srRNA1ts2ベクターのRNAは、動物又はヒト起源の材料を使用せずに、インビトロにおいて転写する。このように、srRNA1ts2にベクターを用いるワクチンは、現在の製造管理及び品質管理に関する基準を使用した製造に容易に適合している。或いは、病原体の抗原をコードする温度感受性センダイウイルスベクターが利用されてもよい(例えば、SeV18/TS15ΔF)。
srRNA1ts2の構造を、実施例3で先に説明している。要するに、srRNA1ts2は、VEEV構造タンパク質コード領域を欠いているベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)レプリコンを含む。そのVEEVレプリコンは、非構造タンパク質2(nsP2=ヘリカーゼプロテイナーゼ)のβシート5とβシート6との間に5又は6個の追加アミノ酸(配列番号39=TGAAA)を含むnsP2の発現をもたらす、15～18ヌクレオチドの挿入を有するVEEV非構造タンパク質コード領域を含む。追加アミノ酸は、自己複製RNAの温度感受性をもたらす。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス-2(SARS-CoV-2、2019-nCoVとしても知られている)のスパイクタンパク質(又はその一部)をコードする例示的なsrRNA1ts2ベクターのゲノムを図21に示す。関連コロナウイルスのスパイクタンパク質とスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を、ワクチン及び医薬品開発の標的としてあらかじめ同定した(Du et al., Nat Rev Microbiol, 7:226-236, 2009)。2019-nCoVのRNAゲノムの配列は、NCBI受入番号：NC_045512と規定される。3種類の異なる温度感受性srRNA1ts2ベクターを構築した。srRNA1ts2-2019-nCoV-スパイクは、完全長スパイクタンパク質をコードする。srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD1は、スパイクタンパク質のRBDに融合されたCD5シグナルペプチドをコードする。srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD2は、スパイクタンパク質のRBD、膜貫通ドメイン、及び細胞質尾部に融合したスパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードする。スパイクタンパク質又はその断片の発現は、VEEVレプリコンの26Sプロモーターによって駆動される。
全RNAは、T7RNAポリメラーゼを使用してインビトロにおいて転写される。次に、RNAは、対象の真皮組織の細胞内にトランスフェクトされる。トランスフェクションのための適切な方法は、裸のRNAのパッチエレクトロポレーションによるものである。或いは、マイクロニードルが、皮内的にRNAがトランスフェクトするのに使用される。例えば、ヒアルロン酸又はキトサン－ヒアルロン酸複合体で作製される溶解可能なマイクロニードルは、皮内的にRNAをトランスフェクトするのに使用される。いくつかの実施形態において、通常のMantoux手順を使用できる。或いは、皮内注射を容易にするように設計された特別な注入デバイスを使用できる。
srRNA1ts2-2019-nCoV-スパイクのスパイクタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号41：
Figure 2023508726000003
 と規定される。シグナルペプチドは残基1～15に広がり、細胞外領域は残基16～1213に広がり、膜貫通ドメインは残基1214～1236に広がり、及び細胞質領域は残基1237～1273に広がる。
srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD1のスパイクタンパク質断片のアミノ酸配列は、配列番号42：
Figure 2023508726000004
 と規定される。CD5シグナルペプチドは残基1～24に広がり、及びRBDは残基25～192に広がる。
srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD2のスパイクタンパク質断片のアミノ酸配列は、配列番号43：
Figure 2023508726000005
 と規定される。シグナルペプチドは残基1～15に広がり、RBDは残基16～207に広がり、膜貫通ドメインは残基208～230に広がり、及び細胞質領域は残基231～267に広がる。
RBDのアミノ酸配列は、配列番号44：
Figure 2023508726000006
 と規定される。
実施例20：温度感受性srRNAの挿入後のGOIのインビボにおける発現
実施例19に記載され及び図20で示されたとおり、許容温度(例えば、約31～34℃)で機能的であるが、しかし、非許容温度(例えば、37℃)にて機能しない、srRNAs又はセンダイウイルスベクターなどの温度感受性作用物質(ts作用物質)を、着目の遺伝子(GOI)の制御された発現のために人体の表面(例えば、皮膚)に送達する。よって、GOIの発現がts作用物質が送達された局所(許容温度)に限定されるという点で、GOIをコードするts作用物質は持ち前の安全性特徴を有する。すなわち、ts作用物質によるGOIの意図しない発現は、許容温度を上回る又は下回る温度を自然に有していない対象の体の領域では起こらない。この例は、この安全機能がモデル哺乳動物対象、すなわち、マウス、でインビボにおいて機能することを実証する。マウスの皮膚温度はヒトのそれと類似しているので(Mortola2013)、これにより、マウスへのts作用物質の皮内の送達が、ヒトへのts作用物質の皮内の送達を模倣することが予想される。
RNAを、乳酸リンゲル液中に、脂質ナノ粒子又はその他のトランスフェクション試薬を含まない、裸のRNAとして処方した。ルシフェラーゼ(LUC)をコードするRNA(5μg)を、CD-1非近交系マウスの右後脚上の単一部位に皮内に注入した。ルシフェラーゼ活性を、生物発光性画像化システム、AMI HTX(Spectral Instruments Imaging, Tucson, AZ)を使用することによって可視化及び定量した。
図23は、以下：TriLink(San Diego, CA)製の対照synRNA-LUC；又は温度感受性srRNA(srRNA1ts2-LUC)、受容個体の0日目(注射日)から26日目までのインビボにおけるルシフェラーゼ活性の時間的経過を示す。ルシフェラーゼ画像は、ルシフェラーゼをコードする裸のRNAの皮内注射がインビボにおいてルシフェラーゼの発現をもたらしたことを示した。顕著なことには、その自己複製特徴のため、srRNA1ts2-LUCによって駆動されたルシフェラーゼのインビボ発現は、ほぼ1カ月にわたり続いた。対照的に、synRNA-LUCによって駆動されたルシフェラーゼのインビボ発現は、ほんの1週間余りしか続かなかった。さらに、srRNA1ts2-LUCの受容個体におけるルシフェラーゼの発現レベルは、その自己複製特徴のため、synRNA-LUCの受容個体におけるルシフェラーゼの発現レベルより10～100倍高かった。重要なことには、ルシフェラーゼ発現は、受容個体の皮膚の非注入領域において、又は受容個体の内臓の中で観察されなかった。この観察は、温度感受性srRNA1ts2-LUCが非許容条件下でルシフェラーゼを複製及び発現しなかったことを示唆する。
実施例21：温度感受性srRNAワクチンによって引き起こされた細胞性免疫能
この実施例では、SARS CoV-2のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を発現する温度感受性srRNAの皮内投与によって引き起こされたサイトカイン分泌脾細胞を計測した。RNAを、乳酸リンゲル液中に、あらゆる脂質ナノ粒子も、又はその他のトランスフェクション試薬も含まない裸のRNAとして処方した。細胞性免疫能を評価するために、(サイトカイン分泌細胞の数を定量する)酵素結合免疫スポット(ELISpot)アッセイを、プラセボ(バッファーのみ)又は5μg、25μg、若しくは100μgの(実施例19に記載の)srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1RNAの単回投与を受けたCD-1非近交系マウスから得られた脾細胞で実施する。注射後12日で単離した脾細胞を、SARS-CoV-2 RBD(PepMix SARS-CoV-2[S-RBD], Technologies GmbH, JPT Peptide Berlin Germany)を覆う53ペプチド(11アミノ酸オーバラップを有する15mers)のプールで24時間にわたり刺激した。
図24Aに示されているように、皮内注射によって投与されたsrRNA1ts2-2019-nCoV-RBD1は、用量依存的様式でSARS-CoV-2 RBDに対する細胞性免疫能を誘発した。(1型CD4+Tヘルパー細胞(Th1細胞)とCD8+細胞毒性T細胞に特徴的である)IFN-γ分泌細胞(図24A)を、温度感受性SARS-CoV-2 RBD srRNAワクチンによって優先的に増殖させた。対照的に、(2型CD4+Tヘルパー細胞(Th2細胞)に特徴的である)IL4-分泌細胞(図24B)を、温度感受性SARS-CoV-2 RBD srRNAワクチンによって増殖させた。結論として、srRNA1ts2-2019-nCoV-RBD1の皮内投与は、(ウイルス病原体に対して向けられたワクチンの望ましい特徴である)SARS-CoV-2 RBDに対するTh1優位な(Th1>Th2)細胞性免疫反応を引き起こすことを示した。
実施例22：温度感受性srRNAワクチンによって引き起こされた体液免疫
この実施例では、SARS CoV-2のスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン(RBD)を発現する温度感受性srRNAの皮内投与によって引き起こされた抗体を計測した。RNAを、乳酸リンゲル液中に、あらゆる脂質ナノ粒子も、又はその他のトランスフェクション試薬も含まない裸のRNAとして処方した。CD-1非近交系マウス群(N=10)に、0日目及び14日目(黒色の三角形)の皮内注射による3種類の製剤：プラセボ(バッファーのみ)(図25A)、5μgの温度感受性srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1RNA(図25B)、又は5μgの、RNアーゼ阻害剤(3単位のRNasin Plus)と組み合わせた温度感受性srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1RNA(Promega、Madison, WI)(図25C)、のうちの1種類を与えた。すべてのマウスに、49日目の皮内注射による遺伝子組み換えRBDタンパク質(C末端6-Hisタグを有するAla319-Phe541、受入#YP_009724390.1: R&D Systems, Minneapolis, MN)を与えた(白抜きの三角形)。体液免疫を評価するために、3日目、14日目、28日目、46日目、56日目、及び63日目に、注射済マウスから得た血清に対して、((OD450における計測によって表される)遺伝子組み換えRBDタンパク質に対して特異的な免疫グロブリンG(IgG)の量を定量する)酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を実施した。血清中のIgGの量をOD450として示す。
図25A～25Cに示されているように、RBD特異的IgGの増加は、プライム及び第一のブースターのみの後ではいずれの群でも観察されなかった。しかしながら、マウスに遺伝子組み換えRBDタンパク質を含む第二のブースターを与えたとき、srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1を含むプライム及び第一のブースターを与えた群では、RBD特異的IgGの増加を伴った急激な応答があったが(図25B～C)、その一方で、プラセボ群では、RBD特異的IgGの明確な増加を示さなかった(図25A)。遺伝子組み換えRBDタンパク質の注射によるRBD特異的IgGの急激な増加は、srRNA1ts2-2019-CoV-RBD1を含むプライム及び第一のブースターを与えたマウスが、遺伝子組み換えRBDに対する免疫記憶を維持し、そして二次的な液性応答を提示することを示している。

Claims (111)

  1. 賦形剤及び温度感受性作用物質(ts作用物質)を含む、対象において病原体に対する免疫応答を刺激するための免疫原性組成物であって、ここで、該ts作用物質が、病原体の抗原をコードする温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNAであり、かつ、ここで、該ts作用物質が、許容温度にて抗原を発現することができるが、非許容温度にて発現することができない、組成物。
  2. 前記病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、及び真菌のうちの1つ若しくは複数を含む、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記抗原が、病原体の表面タンパク質又はその断片を含む、請求項2に記載の組成物。
  4. 前記病原体がウイルスであり、かつ、該ウイルスがウイルスベクターと異なる、請求項3に記載の組成物。
  5. 前記ウイルスがコロナウイルスであり、かつ、前記抗原が、コロナウイルスのスパイクタンパク質又はその断片を含む、請求項4に記載の組成物。
  6. 前記コロナウイルスが2019-nCoVであり、かつ、前記抗原が2019-nCoVの受容体結合ドメイン(RBD)を含む、請求項5に記載の組成物。
  7. 前記RBDのアミノ酸配列が、配列番号44、或いは配列番号44に対して少なくとも75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の組成物。
  8. 前記コロナウイルスが2019-nCoVであり、かつ、前記抗原が、配列番号41の第16～1213残基のアミノ酸配列、或いは配列番号41に対して少なくとも75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含むスパイクタンパク質の細胞外領域を含む、請求項5に記載の組成物。
  9. 前記許容温度が30℃～36℃、31℃～35℃、32℃～34℃、又は33℃±0.5℃であり、かつ、前記非許容温度が37℃±0.5℃である、請求項1～8のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ts作用物質が温度感受性自己複製RNAである、請求項9に記載の組成物。
  11. 前記自己複製RNAが、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む、請求項10に記載の組成物。
  12. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項11に記載の組成物。
  13. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、請求項11に記載の組成物。
  14. 前記ts作用物質が、温度感受性ウイルスベクターである、請求項9に記載の組成物。
  15. 前記ウイルスベクターが、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスから成る群から選択される、請求項14に記載の組成物。
  16. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項15に記載の組成物。
  17. 前記ウイルスベクターが、センダイウイルスである、請求項15に記載の組成物。
  18. 前記対象がヒトであり、かつ、前記病原体がヒト病原体である、請求項9に記載の組成物。
  19. 哺乳類の対象において病原体に対する免疫応答を刺激する方法であって、哺乳類の対象において抗原に対する免疫応答を刺激するために、哺乳類の対象に請求項18に記載の免疫原性組成物を投与することを含み、ここで、該哺乳類の対象がヒト対象である、方法。
  20. 前記免疫原性組成物が：
    i) 皮内又は皮下；或いは
    ii) 筋肉内、
    に投与される、請求項19に記載の方法。
  21. 前記免疫原性組成物が、鼻腔内に投与される、請求項19に記載の方法。
  22. 温度感受性作用物質であって、ここで、該作用物質が、12～18ヌクレオチドの挿入を伴った非構造タンパク質コード領域を含む温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNAであり、ここで、該挿入が、非構造タンパク質2(nsP2=ヘリカーゼプロテイナーゼ)のβシート5とβシート6との間に4～6個の追加アミノ酸を含むnsP2の発現をもたらし、任意選択でここで、該追加アミノ酸が、該ウイルスベクター又は該自己複製RNAの温度感受性をもたらす、温度感受性作用物質。
  23. 前記追加アミノ酸が、配列番号38(GCGRT)、配列番号39(TGAAA)、及び配列番号40(LRPHP)から成る群から選択される1つの配列を含む、請求項22に記載の温度感受性作用物質。
  24. 前記追加アミノ酸が、配列番号39(TGAAA)の配列を含む、請求項22に記載の温度感受性作用物質。
  25. 前記NsP2のアミノ酸配列が、配列番号29～36から成る群から選択される1つの配列を含む、請求項24に記載の温度感受性作用物質。
  26. 前記作用物質が、温度感受性アルファウイルスベクターである、請求項22に記載の温度感受性作用物質。
  27. 前記作用物質が、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む温度感受性自己複製RNAである、請求項22に記載の温度感受性作用物質。
  28. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項26又は請求項27に記載の温度感受性作用物質。
  29. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、請求項26又は請求項27に記載の温度感受性作用物質。
  30. 対象において温度感受性作用物質(ts作用物質)の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、対象の体の表面又は表面付近の1若しくは複数の細胞が、ts作用物質を含み、ここで、ts作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、許容温度が対象の表面体温であり、以下：
    i) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり許容温度で維持し；及び
    ii) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において停止するのに十分な期間にわたり非許容温度まで上げること、
    を含む方法。
  31. 対象において温度感受性作用物質(ts作用物質)の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、ts作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、許容温度が対象の表面体温であり、以下：
    i) ts作用物質を、対象の体の表面又は表面付近の1若しくは複数の細胞に投与し；及び
    ii) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり許容温度で維持すること、
    を含む方法。
  32. iii) 対象の表面体温を、温度感受性活性が対象において停止するのに十分な期間にわたり非許容温度まで上げること、
    をさらにを含む、請求項31に記載の方法。
  33. 前記温度感受性作用物質が、皮内又は皮下に投与される、請求項31に記載の方法。
  34. 前記温度感受性作用物質が、筋肉内に投与される、請求項31に記載の方法。
  35. 前記許容温度が、30℃～36℃、31℃～35℃、32℃～34℃、又は33℃±0.5℃であり、かつ、前記非許容温度が37℃±0.5℃である、請求項30～34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 医薬作用物質がts作用物質のコード領域によってコードされるか、又は前記ts作用物質が医薬作用物質を含み、かつ、前記効果が医薬効果を含み、任意選択でここで、該医薬作用物質が治療用作用物質であり、かつ、該医薬効果が治療効果であるか、又はここで、該医薬作用物質が予防用作用物質であり、かつ、該医薬効果が予防効果である、請求項35に記載の方法。
  37. 前記ts作用物質が、温度感受性ウイルスベクターであり、かつ、前記温度感受性活性が、温度感受性ウイルスベクターの複製と転写を含む、請求項35に記載の方法。
  38. 前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスから成る群から選択される、請求項37に記載の方法。
  39. 前記温度感受性ウイルスベクターがアルファウイルスであり、ここで、該アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項37の方法。
  40. 前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルスである、請求項37に記載の方法。
  41. 前記ts作用物質が温度感受性自己複製RNAであり、かつ、前記温度感受性活性が、温度感受性自己複製RNAの複製と転写のうちの一方又は両方を含む、請求項35に記載の方法。
  42. 前記自己複製RNAが、アルファウイルスのウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む、請求項41に記載の方法。
  43. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項42に記載の方法。
  44. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルスである、請求項42に記載の方法。
  45. 前記医薬作用物質が、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムから成る群から選択される、請求項36に記載の方法。
  46. 前記医薬作用物質がタンパク質を含む、請求項36に記載の方法。
  47. 前記タンパク質が、病原体の抗原を含む、請求項46に記載の方法。
  48. 前記病原体が、ウイルス、細菌、原生動物、及び真菌のうちの1つ若しくは複数を含む、請求項47に記載の方法。
  49. 前記抗原が、病原体の表面タンパク質又はその断片を含む、請求項47に記載の方法。
  50. 前記温度感受性活性が効果を生じさせるのに十分な期間が、約12時間～約12週間の範囲にあり、任意選択で、該期間が1～7日間である、請求項36に記載の方法。
  51. 前記対象において効果を誘発するのに十分な期間が、約12時間～約7日間であり、任意選択でここで、該期間が約12時間～約72時間である、請求項36に記載の方法。
  52. 温度感受性作用物質の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、以下：
    i) 温度感受性活性が1若しくは複数の細胞において効果を生じさせるのに十分な期間にわたり温度感受性活性を誘発するための許容温度にて、温度感受性作用物質を含む1若しくは複数の細胞をインキュベートし；そして
    ii) 非許容温度にて1若しくは複数の細胞をインキュベートすること、ここで、該非許容温度は、温度感受性作用物質の温度感受性活性を低減する、
    を含み、
    ここで、該温度感受性作用物質が治療用作用物質を含み、かつ、該効果が治療効果を含む、方法。
  53. ステップi)の前に、以下：
    1若しくは複数の細胞を、温度感受性作用物質と接触させること、
    をさらに含む、請求項52に記載の方法。
  54. 前記1若しくは複数の細胞は、温度感受性作用物質と接触させるときに、許容温度である、請求項53に記載の方法。
  55. 1若しくは複数の細胞を、治療効果を必要とする対象に投与することをさらに含む、請求項52に記載の方法。
  56. 前記の1若しくは複数の細胞を非許容温度にてインキュベートすることが、治療効果を必要とする対象に1若しくは複数の細胞を投与することを含み、ここで、該対象の体温が非許容温度である、請求項52に記載の方法。
  57. 前記1若しくは複数の細胞が、該1若しくは複数の細胞を対象に投与する前に、非許容温度にてさらにインキュベートされる、請求項56に記載の方法。
  58. 前記1若しくは複数の細胞が、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞である、請求項52に記載の方法。
  59. 前記治療効果が、前記細胞の所望の細胞型への分化を含む、請求項58に記載の方法。
  60. 所望の細胞型が、ニューロン、膠細胞、及び内皮細胞から成る群から選択される、請求項59に記載の方法。
  61. 前記1若しくは複数の細胞が、温度感受性作用物質と該1若しくは複数の細胞を接触させる前に、対象から単離される、請求項53に記載の方法。
  62. 対象において温度感受性作用物質の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、対象の1若しくは複数の細胞が温度感受性作用物質を含み、ここで、該温度感受性作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、該許容温度が対象の体温より低く、以下：
    i) 対象の体温を許容温度まで下げ；
    ii) 前記下げた体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり維持し；及び
    iii) 対象の体温を正常体温まで上げること、
    を含む方法。
  63. 対象において温度感受性作用物質の温度感受性活性を一過性に誘発する方法であって、ここで、該温度感受性作用物質の温度感受性活性が許容温度にて誘発され、かつ、ここで、該許容温度が対象の体温より低く、以下：
    i) 対象の体温を許容温度まで下げ；
    ii) 対象の1若しくは複数の細胞に、温度感受性作用物質を投与し；
    iii) 前記下げた体温を、温度感受性活性が対象において効果を誘発するのに十分な期間にわたり維持し；及び
    iv) 対象の体温を上げて、正常体温まで戻すこと、ここで、ステップ(i)がステップ(ii)の前、後、又はそれと同時に行われる、
    を含む方法。
  64. 前記温度感受性作用物質が、全身的に投与される、請求項63に記載の方法。
  65. 前記温度感受性作用物質が、静脈内に投与される、請求項64に記載の方法。
  66. 前記温度感受性作用物質が、対象の特定の組織又は器官に投与される、請求項63に記載の方法。
  67. 前記温度感受性作用物質が、硬膜外注射によって脳や脊髄に投与される、請求項66に記載の方法。
  68. 前記温度感受性作用物質が、皮内注射によって標的器官に投与される、請求項66に記載の方法。
  69. 前記温度感受性作用物質が、注射針カテーテルを用いた内視鏡によって標的器官に投与される、請求項66に記載の方法。
  70. 前記温度感受性作用物質が、血管カテーテルによって標的器官に投与される、請求項66に記載の方法。
  71. 前記標的器官が、肝臓、腎臓、骨格筋、心筋、膵臓、脾臓、心臓、脳、脊髄、皮膚、眼、肺、腸、胸腺、骨髄、骨、及び軟骨から成る群から選択される、請求項68に記載の方法。
  72. 前記温度感受性作用物質が、吸入法によって投与される、請求項63に記載の方法。
  73. 前記対象の体温の変更が、目標温度管理(TTM)手順を用いることを含み、ここで、該TTM手順が、冷却カテーテル、冷却ブランケット、及び氷から成る群のうちの1つを、対象に適用することを含む、請求項63に記載の方法。
  74. 前記対象がヒトである、請求項63に記載の方法。
  75. 前記温度感受性作用物質が治療用作用物質を含み、かつ、効果が治療効果を含む、請求項63に記載の方法。
  76. 前記治療用作用物質が、温度感受性ウイルスベクターの異種核酸のコード領域によってコードされる、請求項75に記載の方法。
  77. 前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びアルファウイルスから成る群から選択される、請求項76に記載の方法。
  78. 前記温度感受性ウイルスベクターが、アルファウイルスである、請求項77に記載の方法。
  79. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項78に記載の方法。
  80. 前記温度感受性ウイルスベクターが、センダイウイルスである、請求項77に記載の方法。
  81. 前記治療用作用物質が、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムから成る群から選択される、請求項75に記載の方法。
  82. 前記治療用作用物質がタンパク質である、請求項75に記載の方法。
  83. 前記タンパク質が転写因子であり、任意選択でここで、該転写因子が、ヒトニューロゲニン-3(NGN3)、及びヒトETS転座変異体2(ETV2)から成る群から選択される、請求項82に記載の方法。
  84. 前記タンパク質が増殖因子であり、任意選択でここで、該増殖因子が、脳由来神経栄養因子(BDNF)及び神経増殖因子(NGF)から成る群から選択される、請求項82に記載の方法。
  85. 前記温度感受性活性が、温度感受性ウイルスベクターの複製と転写を含む、請求項76に記載の方法。
  86. 前記治療用作用物質が、温度感受性自己複製RNAのコード領域によってコードされている、請求項75に記載の方法。
  87. 前記自己複製RNAが、ウイルス構造タンパク質コード領域を欠いているアルファウイルスレプリコンを含む、請求項86に記載の方法。
  88. 前記アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、及びセムリキフォレストウイルスから成る群から選択される、請求項87に記載の方法。
  89. 前記治療用作用物質が、ノンコーディングRNA、siRNA、shRNA、及びエンドヌクレアーゼ編集システムから成る群から選択される、請求項86に記載の方法。
  90. 前記治療用作用物質がタンパク質である、請求項86に記載の方法。
  91. 前記タンパク質が転写因子であり、任意選択でここで、該転写因子が、ヒトニューロゲニン-3(NGN3)、及びヒトETS転座変異体2(ETV2)から成る群から選択される、請求項90に記載の方法。
  92. 前記タンパク質が増殖因子であり、任意選択でここで、該増殖因子が、脳由来神経栄養因子(BDNF)及び神経増殖因子(NGF)から成る群から選択される、請求項90に記載の方法。
  93. 前記温度感受性活性が、温度感受性自己複製RNAの複製と転写のうちの一方又は両方を含む、請求項86に記載の方法。
  94. 前記コード領域が、プロモーターに動作可能に連結されている、請求項76に記載の方法。
  95. 前記温度感受性活性が治療効果を生じさせるのに十分な期間が、約12時間～約12週間の範囲にあり、任意選択でここで、該期間が1～7日間である、請求項75に記載の方法。
  96. 前記対象において効果が誘発されるのに十分な期間が、約12時間～約7日間であり、任意選択でここで、該期間が約12時間～約72時間である、請求項75に記載の方法。
  97. 前記許容温度が、30℃～36℃、31℃～35℃、又は32℃～34℃の範囲にある、請求項52～96のいずれか一項に記載の方法。
  98. 前記許容温度が、33℃±0.5℃である、請求項97に記載の方法。
  99. 前記非許容温度が、37℃±0.5℃である、請求項98に記載の方法。
  100. 前記1若しくは複数の細胞が、ヒト細胞である、請求項52に記載の方法。
  101. 前記1若しくは複数のヒト細胞が、成体幹細胞、組織幹細胞、始原細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞である、請求項100に記載の方法。
  102. 前記1若しくは複数のヒト細胞が、造血幹細胞、間充織幹細胞、脂肪幹細胞、神経幹細胞、及び生殖幹細胞から成る群から選択される、請求項101に記載の方法。
  103. 前記1若しくは複数のヒト細胞が、体細胞、成熟細胞、又は分化細胞である、請求項100に記載の方法。
  104. 前記1若しくは複数のヒト細胞が、表皮細胞、線維芽細胞、リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞、膵臓細胞、膵臓β細胞、角化細胞、赤血球、末梢血単核細胞(PBMC)、ニューロン、グリア細胞、神経細胞、星状細胞、生殖細胞、精細胞、及び卵母細胞から成る群から選択される、請求項103に記載の方法。
  105. 前記1若しくは複数のヒト細胞が、ヒト骨髄細胞である、請求項100に記載の方法。
  106. 前記ヒト骨髄細胞が、造血幹細胞、間充織幹細胞、及び内皮幹細胞から成る群から選択される、請求項105に記載の方法。
  107. 前記造血幹細胞がCD34+である、請求項106に記載の方法。
  108. 前記温度感受性ウイルスベクター又は温度感受性自己複製RNAが、12～18ヌクレオチドの挿入を伴った非構造タンパク質コード領域を含み、ここで、該挿入が、非構造タンパク質2(nsP2=ヘリカーゼプロテイナーゼ)のβシート5とβシート6との間に4～6個の追加アミノ酸を含むnsP2の発現をもたらし、任意選択でここで、該追加アミノ酸が、該ウイルスベクター又は該自己複製RNAの温度感受性をもたらす、請求項97に記載の方法。
  109. 前記追加アミノ酸が、配列番号38(GCGRT)、配列番号39(TGAAA)、及び配列番号40(LRPHP)から成る群から選択される1つの配列を含む、請求項108に記載の方法。
  110. 前記追加アミノ酸が、配列番号39(TGAAA)の配列を含む、請求項108に記載の方法。
  111. 前記NsP2のアミノ酸配列が、配列番号29～36から成る群から選択される1つの配列を含む、請求項110に記載の方法。
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