JP7416686B2 - 体細胞を再プログラムするためのrnaレプリコン - Google Patents
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Description
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、本発明の第1の態様によるRNAレプリコンまたは本発明の第2の態様によるRNAレプリコンのセット
を含む系を提供する。好ましくは、RNAレプリコンまたはRNAレプリコンのセットは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードしないことをさらに特徴とする。
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iii)細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、1つ以上のRNAレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
(iv)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物を提供する工程、
(iii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iv)細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、RNA構築物および1つ以上のRNAレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
(v)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。
5'末端 5'--P-NNNNNNN-OH-3' 3'末端
3'-HO-NNNNNNN-P--5'
レプリカーゼ、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼによって複製されることができる核酸構築物は、レプリコンと称される。本発明によれば、「レプリコン」という用語は、RNA依存性RNAポリメラーゼによって複製され、DNA中間体なしで、RNAレプリコンの1つまたは複数の同一または本質的に同一のコピーを生成することができるRNA分子を定義する。「DNA中間体なしで」とは、RNAレプリコンのコピーを形成する過程で、デオキシリボ核酸(DNA)のコピーもしくはレプリコンの相補体が形成されないこと、および/またはRNAレプリコンのコピーもしくはその相補体を形成する過程でデオキシリボ核酸(DNA)分子が鋳型として使用されないことを意味する。レプリカーゼの機能は、典型的には機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって提供される。
本発明は、1つの型の高度に特殊化された体細胞、例えば線維芽細胞またはケラチノサイトを、多能性細胞中間体を介して、別の型、例えば神経細胞に変化させる技術を提供する。
本発明によるRNAレプリコンは、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとして、再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含み、第1の再プログラミング因子と共に再プログラミング因子の機能的セットを形成する1つ以上のさらなる再プログラミング因子などの、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする1つ以上のさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。好ましくは、目的のタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。目的のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子は、同義的に「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」と称される。様々な実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。本発明によれば、「異種」という用語は、核酸配列が天然ではアルファウイルス核酸配列に機能的または構造的に連結されていないという事実を指す。本発明によるレプリコンは、単一のポリペプチド、すなわち再プログラミング因子、または複数の再プログラミング因子もしくは再プログラミング因子と別のポリペプチドなどの複数のポリペプチドをコードし得る。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド(融合ポリペプチド)として、または別々のポリペプチドとしてコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にあるかどうかにかかわらずそれぞれ独立して選択され得る、複数のオープンリーディングフレームを含み得る。あるいは、ポリタンパク質または融合ポリペプチドは、場合により自己触媒性プロテアーゼ切断部位(例えば口蹄疫ウイルス2Aタンパク質)またはインテインによって分離された個々のポリペプチドを含む。
オープンリーディングフレームによってコードされるさらなる適切な目的のタンパク質は、インターフェロン(IFN)シグナル伝達の阻害剤である。RNAが発現のために導入された細胞の生存能力は、特に細胞がRNAで複数回トランスフェクトされた場合、低下し得ることが報告されているが、IFN阻害剤は、RNAが発現されるべき細胞の生存能力を高めることが認められた(国際公開第2014/071963 A1号)。好ましくは、阻害剤はI型IFNシグナル伝達の阻害剤である。細胞外IFNによるIFN受容体の係合を防止することおよび/または細胞における細胞内IFNシグナル伝達を阻害することは、細胞内でのRNAの安定な発現を可能する。あるいはまたはさらに、細胞外IFNによるIFN受容体の係合を防止することおよび/または細胞内IFNシグナル伝達を阻害することは、特に細胞がRNAで繰り返しトランスフェクトされる場合、細胞の生存を増強する。
オープンリーディングフレームによってコードされるさらなる適切な目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語には、糖鎖修飾(グリコシル化など)および脂質修飾形態のアルファウイルス非構造タンパク質を含む、ありとあらゆる同時翻訳または翻訳後修飾形態が含まれる。
RNAレプリコンは、場合によりサブゲノムプロモータの制御下で、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子の発現に適する。様々な実施形態が可能である。それぞれが目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする1つ以上のオープンリーディングフレームがRNAレプリコン上に存在し得る。RNAレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームは、「第1のオープンリーディングフレーム」と称される。いくつかの実施形態では、「第1のオープンリーディングフレーム」は、RNAレプリコンの唯一のオープンリーディングフレームである。場合により、1つ以上のさらなるオープンリーディングフレームが第1のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。第1のオープンリーディングフレームの下流の1つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、それらが第1のオープンリーディングフレームの下流に存在する順序で(5'から3'へ)、「第2のオープンリーディングフレーム」、「第3のオープンリーディングフレーム」などと称され得る。好ましくは、各オープンリーディングフレームは、開始コドン(塩基トリプレット)、典型的にはATG(それぞれのDNA分子中)に対応するAUG(RNA分子中)を含む。
さらなる態様では、本発明は、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、本発明の第1の態様によるRNAレプリコン
を含む系を提供する。
何よりもまず、トランス複製系の多用途性は、レプリコンおよびレプリカーゼ構築物を様々な時点および/または様々な部位で設計および/または調製できることを可能にする。一実施形態では、レプリカーゼ構築物を最初の時点で調製し、レプリコンをより後の時点で調製する。例えば、その調製後、後の時点での使用のためにレプリカーゼ構築物を保存し得る。本発明は、シスレプリコンと比較して高い柔軟性を提供する:本発明の系は、新しい再プログラミング因子をコードする核酸をレプリコンにクローニングすることによって、治療用に設計され得る。事前に調製したレプリカーゼ構築物を保存から復元し得る。言い換えれば、特定のレプリコンとは独立してレプリカーゼ構築物を設計および調製することができる。
本発明によるRNA分子は、場合により、さらなる特徴、例えば5'キャップ、5'-UTR、3'-UTR、ポリ(A)配列、および/またはコドン使用頻度の適合によって特徴付けられ得る。詳細を以下で説明する。
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは5'キャップを含む。
[式中、R1は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され、
R2およびR3は、H、ハロ、OH、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはR2とR3は一緒になってO-X-O[Xは、置換されていてもよいCH2、CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2CH(CH3)、およびC(CH3)2からなる群より選択される]を形成するか、またはR2は、R2が結合している環の4'位の水素原子と結合して-O-CH2-もしくは-CH2-O-を形成し、
R5は、S、Se、およびBH3からなる群より選択され、
R4およびR6は、O、S、Se、およびBH3からなる群より独立して選択され、
nは1、2、または3である]
に従うキャップジヌクレオチドから選択され得る。
「非翻訳領域」または「UTR」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないDNA分子の領域、またはmRNA分子などのRNA分子の対応する領域に関する。非翻訳領域(UTR)は、オープンリーディングフレームの5'側(上流)(5'-UTR)および/またはオープンリーディングフレームの3'側(下流)(3'-UTR)に存在し得る。
(1)5'-UTR、
(2)オープンリーディングフレーム、および
(3)3'-UTR
を含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは3'-ポリ(A)配列を含む。レプリコンが保存された配列エレメント4(CSE 4)を含む場合、レプリコンの3'-ポリ(A)配列は、好ましくはCSE 4の下流に存在し、最も好ましくはCSE 4に直接隣接する。
一般に、遺伝暗号の縮重は、同じコード能力を維持しながら、RNA配列に存在する特定のコドン(アミノ酸をコードする塩基トリプレット)を他のコドン(塩基トリプレット)で置換することを可能にする(置換するコドンは、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする)。本発明のいくつかの実施形態では、RNA分子に含まれるオープンリーディングフレームの少なくとも1つのコドンは、オープンリーディングフレームが由来する種のそれぞれのオープンリーディングフレーム内のそれぞれのコドンとは異なる。その実施形態では、オープンリーディングフレームのコード配列は「適合」または「改変」されていると言われる。レプリコンに含まれるオープンリーディングフレームのコード配列を適合させ得る。代替的または追加的に、レプリカーゼ構築物に含まれる機能性アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列を適合させ得る。
以下の特徴は、単独でまたは任意の適切な組合せで、本発明において好ましい:
さらなる態様では、本発明は、本発明によるRNAレプリコン、RNAレプリコンのセットまたは系をコードする核酸配列を含むDNAを提供する。本発明によれば、例えば細胞のトランスフェクションのためにRNAを使用する代わりに、RNAをコードするDNAを、例えば細胞内でRNAが産生されるように細胞をトランスフェクトするために使用し得る。
本発明による任意のRNA分子は、それが本発明の系の一部であってもなくても、インビトロ転写によって入手可能であり得る。インビトロ転写RNA(IVT-RNA)は、本発明において特に興味深い。IVT-RNAは、核酸分子(特にDNA分子)からの転写によって入手できる。本発明のDNA分子(1つまたは複数)は、特にDNA依存性RNAポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含む場合、そのような目的に適する。
さらなる態様では、本発明は、本発明の1つ以上のRNAレプリコンおよび場合により機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物を体細胞に形質導入することを含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法を提供する。
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、(iii)細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、1つ以上のRNAレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
(iv)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物を提供する工程、
(iii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iv)細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、RNA構築物および1つ以上のRNAレプリコンを体細胞に導入する工程、ならびに
(v)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。
(i)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(ii)1つ以上のRNAレプリコンを被験体に投与する工程、ならびに
(iii)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法も提供する。
(i)機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物を提供する工程、
(ii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iii)RNA構築物および1つ以上のRNAレプリコンを被験体に投与する工程、ならびに
(v)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法を提供する。
本発明はまた、本発明によるRNAレプリコン、本発明によるセット、または本発明による系を含むキットも提供する。
本発明を使用して、適切な因子をコードするRNAレプリコンを、例えばエレクトロポレーションまたはリポフェクションによって1つ以上の体細胞に組み込む。組み込み後、好ましくは脱分化細胞の維持を支持する条件(すなわち幹細胞培養条件)を使用して、細胞を培養する。次いで、脱分化細胞を、例えば細胞療法において被験体に投与することができ、または場合により増殖させ、体細胞に再分化するように誘導して、その後、例えば細胞療法において被験体に投与することができる。したがって、本発明に従って得られる脱分化細胞は、インビトロまたはインビボで1つ以上の所望の体細胞型に分化するように誘導することができる。
本明細書に記載の核酸および細胞などの作用物質および組成物は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
いくつかの実施形態では、保護されていないRNAの不安定性のため、本発明のRNA分子を複合体化形態または封入形態で提供することが有利である。それぞれの医薬組成物が本発明で提供される。特に、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、核酸含有粒子、好ましくはRNA含有粒子を含む。それぞれの医薬組成物は、粒子製剤と称される。本発明による粒子製剤では、粒子は、本発明による核酸と、核酸の送達に適した薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。核酸含有粒子は、例えばタンパク質性粒子の形態または脂質含有粒子の形態であり得る。適切なタンパク質または脂質は、粒子形成剤と称される。タンパク質性粒子および脂質含有粒子は、粒子形態のアルファウイルスRNAの送達に適することが以前に記載されている(例えばStrauss&Strauss,Microbiol.Rev.,1994,vol.58,pp.491-562)。特に、アルファウイルス構造タンパク質(例えばヘルパーウイルスによって提供される)は、タンパク質性粒子の形態でRNAを送達するための適切な担体である。
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの脂質を含む。好ましくは、少なくとも1つの脂質はカチオン性脂質である。前記脂質含有医薬組成物は、本発明による核酸を含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞、例えばリポソーム中に封入されたRNAを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、エマルジョンの形態のRNAを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、カチオン性化合物との複合体中にRNAを含み、それにより、例えばいわゆるリポプレックスまたはポリプレックスを形成する。リポソームなどの小胞内へのRNAの封入は、例えば脂質/RNA複合体とは異なる。脂質/RNA複合体は、例えば、RNAを、例えばあらかじめ形成されたリポソームと混合する場合に得られる。
被験体に投与される能力を考慮して、本発明によるRNAレプリコン、本発明によるセット、本発明による系、本発明によるDNA、本発明による細胞、本発明によるキット、または本発明による医薬組成物の各々は、「薬剤」などと称され得る。本発明は、本発明のRNAレプリコン、セット、系、DNA、細胞、キット、または医薬組成物が薬剤として使用するために提供されることを予測する。
以下、参考形態の例を付記する。
1. 再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームを含むRNAレプリコン。
2. 異なる再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのさらなるオープンリーディングフレームを含む、1.に記載のRNAレプリコン。
3. 前記再プログラミング因子が、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28およびNANOGからなる群より選択される、1.または2.に記載のRNAレプリコン。
4. シスレプリコンまたはトランスレプリコンである、1.から3.のいずれか一つに記載のRNAレプリコン。
5. 機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第1のオープンリーディングフレームを含む、1.から4.のいずれか一つに記載のRNAレプリコン。
6. 5'複製認識配列を含み、前記5'複製認識配列が、天然のアルファウイルス5'複製認識配列と比較して少なくとも1つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする、1.から5.のいずれか一つに記載のRNAレプリコン。
7. 前記第1のオープンリーディングフレームが前記5'複製認識配列と重複しない、5.または6.に記載のRNAレプリコン。
8. 前記第1のオープンリーディングフレームの開始コドンが、前記RNAレプリコンの5'→3'方向で最初の機能的開始コドンである、5.から7.のいずれか一つに記載のRNAレプリコン。
9. RNAレプリコンのセットであって、前記RNAレプリコンの各々が再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含み、および前記RNAレプリコンのセットが再プログラミング因子のセットをコードする、RNAレプリコンのセット。
10. 前記RNAレプリコンの各々が、再プログラミング因子をコードする1つのオープンリーディングフレームを含む、9.に記載のRNAレプリコンのセット。
11. 前記再プログラミング因子のセットが、体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用である、9.または10.に記載のRNAレプリコンのセット。
12. 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4およびSOX2を含む、9.から11.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンのセット。
13. 前記再プログラミング因子のセットが、KLF4および/またはc-MYCをさらに含む、12.に記載のRNAレプリコンのセット。
14. 前記再プログラミング因子のセットが、NANOGおよび/またはLIN28をさらに含む、12.または13.に記載のRNAレプリコンのセット。
15. 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む、9.から13.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンのセット。
16. 前記再プログラミング因子のセットが、LIN28および場合によりNANOGをさらに含む、15.に記載のRNAレプリコンのセット。
17. 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28を含む、9.から12.および14.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンのセット。
18. 前記セットの少なくとも1つのRNAレプリコンが、1.から8.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンである、9.から17.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンのセット。
19. 前記セットの各々のRNAレプリコンが、1.から8.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンである、9.から17.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンのセット。
20. 1.から8.のいずれか一つに記載の1つ以上のRNAレプリコンを体細胞に導入する工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法。
21. 幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iii)前記細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、前記1つ以上のRNAレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに、
(iv)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。
22. 幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物を提供する工程、
(iii)各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iv)前記細胞が、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用な再プログラミング因子のセットを発現するように、前記RNA構築物および前記1つ以上のRNAレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに
(iv)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。
23. 前記1つ以上のRNAレプリコンが再プログラミング因子のセットをコードする、20.から22.に記載の方法。
24. 前記1つ以上のRNAレプリコンの各々が、再プログラミング因子をコードする1つのオープンリーディングフレームを含む、20.から23.のいずれか一つに記載の方法。
25. 前記1つ以上のRNAレプリコンによってコードされる前記再プログラミング因子のセットが、体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに有用である、23.または24.に記載の方法。
26. 前記再プログラミング因子のセットがOCT4およびSOX2を含む、20.から25.のいずれか一つに記載の方法。
27. 前記再プログラミング因子のセットがKLF4および/またはc-MYCをさらに含む、26.に記載の方法。
28. 前記再プログラミング因子のセットがNANOGおよび/またはLIN28をさらに含む、26.または27.に記載の方法。
29. 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む、23.から27.のいずれか一つに記載の方法。
30. 前記再プログラミング因子のセットが、LIN28および場合によりNANOGをさらに含む、29.に記載の方法。
31. 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28を含む、23.から26.および28.のいずれか一つに記載の方法。
32. 前記体細胞の幹細胞特性を有する細胞への再プログラミングを促進するmiRNAを前記体細胞に導入することをさらに含む、20.から31.のいずれか一項に記載の方法。
33. 少なくとも1つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記体細胞を培養することをさらに含む、20.から32.のいずれか一つに記載の方法。
34. 前記少なくとも1つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、33.に記載の方法。
35. 幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする前記工程が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、21.から34.のいずれか一つに記載の方法。
36. 前記幹細胞特性が胚性幹細胞の形態を含む、20.から35.のいずれか一つに記載の方法。
37. 前記幹細胞特性を有する細胞が正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、および/または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する、20.から36.のいずれか一つに記載の方法。
38. 前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、20.から37.のいずれか一つに記載の方法。
39. 前記幹細胞特性を有する細胞が、3つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する、20.から38.のいずれか一つに記載の方法。
40. 前記体細胞が線維芽細胞である、20.から39.のいずれか一つに記載の方法。
41. 前記線維芽細胞が、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または真皮線維芽細胞である、40.に記載の方法。
42. 前記体細胞がヒト細胞である、20.から41.のいずれか一つに記載の方法。
43. 前記1つ以上のRNAレプリコンの少なくとも1つのRNAレプリコンが、1.から8.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンである、21.から42.のいずれか一つに記載の方法。
44. 前記1つ以上のRNAレプリコンの各々のRNAレプリコンが、1.から8.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンである、21.から43.のいずれか一つに記載の方法。
45. 前記1つ以上のRNAレプリコンが、9.から19.のいずれか一つに記載のRNAレプリコンのセットを含む、20.から44.のいずれか一つに記載の方法。
46. 20.から44.のいずれか一つに記載の方法によって生成される、幹細胞特性を有する細胞。
47. (i)20.から45.のいずれか一つに記載の方法を使用して幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および(ii)分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件下で、前記幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、分化細胞型を提供する方法。
材料および方法:
レプリコンおよびトランスレプリコン構築物をコードするDNA:本明細書で使用するベクター系は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV;アクセッション番号L01442)から設計されており、全体的なベクターのデザインは、以前に生成されたセムリキ森林ウイルスベクター系に類似する(図1)。最初の工程では、VEEVに基づく自己複製RNA(シスレプリコン)をコードするプラスミドを、商業的供給者からの遺伝子合成によって入手した。この構築物は、VEEV構造遺伝子を欠くが、複製認識配列(RRS)として働き、T7ファージRNAポリメラーゼプロモータの転写制御下でpST1プラスミド骨格へのウイルス複製を制御する(Holtkamp et al.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)VEEVのすべての保存された配列エレメント(CSE)を含む。VEEV 3'CSEの一番最後のヌクレオチドのすぐ下流に、10個のヌクレオチドのランダム配列(国際公開第2016/005004 A1号)で分離された30および70個のアデニル酸残基(ポリA30-70)からなる、プラスミドにコードされたポリ(A)カセットを付加した。プラスミドの線形化のためのSapI制限部位をポリ(A)カセットのすぐ下流に配置した。さらなる遺伝子合成およびPCRベースのシームレスクローニング/組換え技術を使用して、VEEVレプリカーゼの完全なオープンリーディングフレームをコードするmRNAをpST1プラスミド骨格にインビトロ転写するための鋳型として働くプラスミドを生成した(Holtkamp et al.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。このベクターは、上流にヒトアルファグロビン5'UTR、およびレプリカーゼORFの下流にプラスミドにコードされたポリ(A30-70)カセットを含む。再び、プラスミドの線形化のためにSapI制限部位をポリ(A)カセットのすぐ下流に配置した。インビトロ転写では、得られるmRNAはVEEVの機能的RRSを欠き、複製することができない。トランスで複製するRNA(トランスレプリコン)のインビトロ転写のために、鋳型プラスミドの2つの異なる変異体を生成した。最初の変異体では、WT-RRS(非修飾5'CSE、サブゲノムプロモータ、3'CSE)を有するトランスレプリコンをコードするプラスミドを、シスレプリコンからVEEV-レプリカーゼコード配列の大部分を除去し、機能的RRS(5'-CSEおよびサブゲノムプロモータ)を含むものだけを保持することによって得た。レプリカーゼORFの大部分の除去により、それぞれのプラスミドによってコードされたRNAは、宿主細胞中に存在する場合、シスで複製を駆動することができないが、複製のためにトランスで機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在を必要とする。目的の遺伝子はサブゲノムプロモータの下流に挿入する。
トランスレプリコン技術(WT-RRS)を使用したRNA再プログラミング
初代ヒト皮膚線維芽細胞(HDF、Innoprot)を6ウェル(100,000細胞/ウェル)に播種し、6ウェルにつき6μlのRNAiMAX(Invitrogen)および0.7μgの非修飾合成TR-WT-RRS mRNA混合物を、0.7μgのレプリカーゼmRNAおよびmiRNA 302a-dと367からなる0.4μgのmiRNA混合物(1:1:1:1:1:1)と共に使用して、4時間後にリポフェクションを行った。これにより、TR-WT-RRS mRNA混合物は、再プログラミングTF OSKMNL(1:1:1:1:1:1)をコードする0.4μgの合成mRNAと0.1μgの各EKBで構成された。96時間後(5日目)に、1.7μlのRNAiMAXと0.4μgのレプリカーゼmRNAを使用して、細胞に2回目のリポフェクションを行った。細胞を、10ng/ml bFGF(Invitrogen)および0.5μMチアゾビビン(Stemgent)を添加したヒト胚性幹(hES)細胞培地(NutriStem培地、Stemgent)で培養し、すべてのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。コロニー形成は12日目から観察され、実験手順のスケジュールを表示している(図2A)。図2Bは、1日目から18日目までのコロニー形成の顕微鏡分析を示す。TR-WT-RRS mRNAを使用して得られたiPS細胞コロニーのコロニー形態および成長挙動は、明確なコロニー中に密に詰まった小細胞とはっきりした境界を有するhES細胞様であった。コロニーは、hES細胞表面マーカーTRA-1-81(灰色/緑色)に対して陽性に染色することができた。Stain-Alive TRA-1-81抗体(Stemgent)を製造者の指示に従って使用して、TRA-1-81の生染色を実施した。コロニーの代表的な写真を図2Cに示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞を18日目にペレット化し、全RNAを単離し、hESマーカーOCT4(内因性)、NANOG(内因性)、LIN28(内因性)、TERTおよびREX1のmRNA発現をqRT-PCRによって定量化した。mRNA発現をHPRTの発現に対して正規化し、入力細胞の転写物レベルと比較した誘導倍率として図2Dに示す。分析したすべてのマーカーが、入力細胞と比較して高度に発現され、再プログラム細胞の多能性を示した。
トランスレプリコン技術(Δ5ATG-RRSΔSGP)を使用したRNA再プログラミング
図3Aは、初代ヒト皮膚線維芽細胞(HDF、Innoprot)の再プログラミングのスケジュールを示す。40,000細胞を12ウェルプレートに播種し、12ウェルにつき2.5μlのRNAiMAX(Invitrogen)および再プログラミングTF OSKMNL(1:1:1:1:1:1)をコードする0.33μgの非修飾合成TR-Δ5ATG-RRSΔSGP mRNAと各EKBの0.02μgの合成mRNA(+「EKB」)、またはOSKMNL(1:1:1:1:1:1)をコードする0.25μgの非修飾合成TR-Δ5ATG-RRSΔSGP mRNAと0.04μgのN単独の合成mRNA(「+N」)(トスカーナウイルス由来のウイルスエスケープタンパク質NS(N)はIFN応答の強力な阻害剤であり、RNAベースの再プログラミングを成功させるためにEKBの代わりに使用することができる)のいずれかからなるmRNA混合物を使用して、4時間後にリポフェクションを行った。両方の混合物に、0.3μgのレプリカーゼmRNAおよびmiRNA 302a-dと367からなる0.17μgのmiRNA混合物(1:1:1:1:1:1)を組み合わせた。72時間後(4日目)に、1日目と全く同じ手順と混合物を使用して、細胞に2回目のリポフェクションを行った。実験全体を通して、10ng/ml bFGF(Invitrogen)および0.5μMチアゾビビン(Stemgent)を添加したヒト胚性幹(hES)細胞培地(NutriStem培地、Stemgent)で細胞を培養し、すべてのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。示されているように、15日目以降にコロニー形成を観察することができた。図3Bは、12日目以降のコロニー形成の顕微鏡分析を示す。TR-Δ5ATG-RRSΔSGP mRNAおよびEKB mRNAまたはN mRNAのいずれかを使用して得られたiPS細胞コロニーのコロニー形態および成長挙動は、明確なコロニー中に密に詰まった小細胞およびはっきりした境界を有するhES細胞様であった。コロニーは、hES細胞表面マーカーTRA-1-81(灰色/緑色)に対して陽性に染色することができた。Stain-Alive TRA-1-81抗体(Stemgent)を製造者の指示に従って使用して、TRA-1-81の生染色を実施した。コロニーの代表的な写真を図3Cに示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞を22日目にペレット化し、全RNAを単離し、hESマーカーOCT4(内因性)、NANOG(内因性)、LIN28(内因性)、TERTおよびREX1のmRNA発現をqRT-PCRによって定量化した。mRNA発現をHPRTの発現に対して正規化し、入力細胞の転写物レベルと比較した誘導倍率として図3Dに示す。分析したすべてのマーカーが、入力細胞と比較して、TR-Δ5ATG-RRSΔSGP mRNAおよびEKB mRNAまたはN mRNAのいずれかを使用して得られたiPS細胞コロニーで高度に発現され、再プログラム細胞の多能性を示した。
トランスレプリコン技術(WT-RSS)を使用した1回のトランスフェクションによるRNAベースの再プログラミング
初代ヒト皮膚線維芽細胞(HDF、Innoprot)を6ウェル(100,000細胞/ウェル)に播種し、6ウェルにつき6μlのRNAiMAX(Invitrogen)および0.7μgの非修飾合成TR-WT-RRS mRNA混合物を、0.7μgのレプリカーゼmRNAおよびmiRNA 302a-dと367からなる0.4μgのmiRNA混合物(1:1:1:1:1:1)と共に使用して、4時間後にリポフェクションを行った。これにより、TR-WT-RRS mRNA混合物は、再プログラミングTF OSKMNL(1:1:1:1:1:1)をコードする0.4μgの合成mRNAと0.1μgの各EKBで構成された。細胞を、10ng/ml bFGF(Invitrogen)および0.5μMチアゾビビン(Stemgent)を添加したヒト胚性幹(hES)細胞培地(NutriStem培地、Stemgent)で培養し、すべてのリポフェクションを製造者の指示に従って実施した。コロニー形成は11日目から観察され、実験手順のスケジュールを表示している(図4A)。図4Bは、1日目から14日目までのコロニー形成の顕微鏡分析を示す。TR-WT-RRS mRNAを使用して得られたiPS細胞コロニーのコロニー形態および成長挙動は、明確なコロニー中に密に詰まった小細胞とはっきりした境界を有するhES細胞様であった。コロニーは、hES細胞表面マーカーTRA-1-81(灰色/緑色)に対して陽性に染色することができた。Stain-Alive TRA-1-81抗体(Stemgent)を製造者の指示に従って使用して、TRA-1-81の生染色を実施した。コロニーの代表的な写真を図4Cに示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞を18日目にペレット化し、全RNAを単離し、hESマーカーOCT4(内因性)、NANOG(内因性)、LIN28(内因性)、TERTおよびREX1のmRNA発現をqRT-PCRによって定量化した。mRNA発現をHPRTの発現に対して正規化し、入力細胞の転写物レベルと比較した誘導倍率として図4Dに示す。分析したすべてのマーカーが、入力細胞と比較して高度に発現され、再プログラム細胞の多能性を示した。
Claims (45)
- 再プログラミング因子をコードするオープンリーディングフレームと、5'複製認識配列と、を含むRNAレプリコンであって、
前記5'複製認識配列が、天然のアルファウイルス5'複製認識配列と比較して、いかなる開始コドンも含まないことを特徴とする、前記天然のアルファウイルス5'複製認識配列の機能的変異体である、RNAレプリコン。 - 異なる再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのさらなるオープンリーディングフレームを含む、請求項1に記載のRNAレプリコン。
- 前記再プログラミング因子が、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28およびNANOGからなる群より選択される、請求項1または2に記載のRNAレプリコン。
- シスレプリコンまたはトランスレプリコンである、請求項1から3のいずれか一項に記載のRNAレプリコン。
- 機能性アルファウイルス非構造タンパク質または再プログラミング因子をコードする第1のオープンリーディングフレームを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のRNAレプリコン。
- 前記第1のオープンリーディングフレームが前記5'複製認識配列と重複しない、請求項5に記載のRNAレプリコン。
- 前記第1のオープンリーディングフレームの開始コドンが、前記RNAレプリコンの5'→3'方向で最初の機能的開始コドンである、請求項5または6に記載のRNAレプリコン。
- RNAレプリコンのセットであって、前記RNAレプリコンの各々が再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含み、前記RNAレプリコンのセットが再プログラミング因子のセットをコードし、前記セットの少なくとも1つのRNAレプリコンが、請求項1から7のいずれか一項に記載のRNAレプリコンである、RNAレプリコンのセット。
- RNAレプリコンのセットであって、前記RNAレプリコンの各々が、再プログラミング因子をコードする1つのオープンリーディングフレームを含み、前記RNAレプリコンのセットが再プログラミング因子のセットをコードし、前記セットの少なくとも1つのRNAレプリコンが、請求項1に記載のRNAレプリコンである、RNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、体細胞で発現された場合に、前記体細胞を、幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分である、請求項8または9に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4およびSOX2を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、KLF4および/またはc-MYCをさらに含む、請求項11に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、NANOGおよび/またはLIN28をさらに含む、請求項11または12に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む、請求項8から12のいずれか一項に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、LIN28をさらに含む、請求項14に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、NANOGをさらに含む、請求項15に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28を含む、請求項8から11および13のいずれか一項に記載のRNAレプリコンのセット。
- 前記セットの各々のRNAレプリコンが、請求項1から7のいずれか一項に記載のRNAレプリコンである、請求項8から17のいずれか一項に記載のRNAレプリコンのセット。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の1つ以上のRNAレプリコンを体細胞に導入する工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を生成する方法。
- 幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)1つ以上のRNAレプリコンの少なくとも1つのRNAレプリコンが、請求項1から7のいずれか一項に記載のRNAレプリコンであって、前記1つ以上のRNAレプリコンの各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、前記1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iii)体細胞で発現された場合に、前記体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分な再プログラミング因子のセットを前記体細胞が発現するように、前記1つ以上のRNAレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに、
(iv)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。 - 幹細胞特性を有する細胞を提供する方法であって、
(i)体細胞を含む細胞集団を提供する工程、
(ii)機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのRNA構築物を提供する工程、
(iii)1つ以上のRNAレプリコンの少なくとも1つのRNAレプリコンが、請求項1から7のいずれか一項に記載のRNAレプリコンであって、前記1つ以上のRNAレプリコンの各々が、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製することができ、および再プログラミング因子をコードする少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含む、前記1つ以上のRNAレプリコンを提供する工程、
(iv)体細胞で発現された場合に、前記体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分な再プログラミング因子のセットを前記体細胞が発現するように、前記RNA構築物および前記1つ以上のRNAレプリコンを前記体細胞に導入する工程、ならびに
(v)幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程
を含む方法。 - 幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする前記工程が、胚性幹細胞培養条件下で前記体細胞を培養することを含む、請求項20または21に記載の方法。
- 前記1つ以上のRNAレプリコンの各々のRNAレプリコンが、請求項1から7のいずれか一項に記載のRNAレプリコンである、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のRNAレプリコンが再プログラミング因子のセットをコードする、請求項19から23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のRNAレプリコンによってコードされる前記再プログラミング因子のセットが、体細胞で発現された場合に、前記体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラムするのに十分である、請求項24に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットがOCT4およびSOX2を含む、請求項24または25に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットがKLF4および/またはc-MYCをさらに含む、請求項26に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットがNANOGおよび/またはLIN28をさらに含む、請求項26または27に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットが、LIN28をさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットが、NANOGをさらに含む、請求項29に記載の方法。
- 前記再プログラミング因子のセットが、OCT4、SOX2、NANOGおよびLIN28を含む、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体細胞の幹細胞特性を有する細胞への再プログラミングを促進するmiRNAを前記体細胞に導入することをさらに含む、請求項19から32のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で前記体細胞を培養することをさらに含む、請求項19から33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのヒストンデアセチラーゼ阻害剤がバルプロ酸を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記幹細胞特性が胚性幹細胞の形態を含む、請求項19から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞特性を有する細胞が正常な核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、および/または胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する、請求項19から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞特性を有する細胞が多能性状態を示す、請求項19から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記幹細胞特性を有する細胞が、3つの一次胚葉すべての高度派生物に分化する発生能を有する、請求項19から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項19から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞または真皮線維芽細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記体細胞がヒト細胞である、請求項19から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上のRNAレプリコンが、請求項8から18のいずれか一項に記載のRNAレプリコンのセットを含む、請求項19から42のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載のRNAレプリコンまたは請求項8から18のいずれか一項に記載のRNAレプリコンのセットを含む、細胞。
- (i)請求項19から43のいずれか一項に記載の方法を使用して幹細胞特性を有する細胞を提供する工程、および(ii)分化した細胞型への部分的または完全な分化を誘導または指令する条件下で、前記幹細胞特性を有する細胞を培養する工程を含む、分化細胞型を提供する方法。
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