EA017740B1 - Синтез и применение антиинвертированных фосфоротиоатных аналогов кэп-структуры матричной phk - Google Patents

Abstract

Раскрыты новые аналоги кэп-структуры РНК, содержащие одну или несколько фосфоротиоатных групп. Аналоги также содержат модификации во 2'-О положении 7-метилгуанозина, которые препятствуют их встраиванию в обратной ориентации во время синтеза in vitro мРНК и которые в настоящем описании названы "антиинвертированными аналогами кэп-структуры" (ARCA). Модификации ARCA гарантируют, что расположение атома S будет точно в активных участках кэп-связывающих белков как в трансляционном, так и декэпирующем комплексах. Новые аналоги S-ARCA являются устойчивыми к in vivo декэпирующим ферментам. Некоторые из S-ARCA имеют более высокую аффинность к eIF4E, чем соответствующие аналоги, не содержащие фосфоротиоатную группу. При введении мРНК, содержащих различные S-ARCA, в культивируемые клетки некоторые из них транслируются в пять раз более эффективно, чем мРНК, синтезированные с обычными аналогами mGpppG.

Description

Приоритет по дате подачи предварительной заявки на патент США № 60/944842, поданной 19 июня 2007 г., заявлен согласно статье § 119(е) 35 И.8.С. США и согласно принятым соглашениям и договорам во всех странах.

Разработка настоящего изобретения частично финансировалась грантом № К0ЮМ20818 правительства Соединенных Штатов, выданным Национальному Институту Общих Медицинских Исследований (Νηΐίοηηϊ ЬъШШе οί Оеиега1 Меб1са1 8аеисе8). Правительство Соединенных Штатов обладает определенными правами на данное изобретение.

Разработка настоящего изобретения частично финансировалось грантом № 2 Р04А00628 правительства Польши, выданным Министерству Науки и Высшего образования Польши (Ροϊίδΐι М1Ш8йу οί 8с1еисе апб НщЬег Ебисабои).

Область техники, к которой относится изобретение

Синтезированы новые анти-инвертированные фосфоротиоатные аналоги кэп-структуры матричной РНК и показана их польза в трансляции мРНК.

Область техники

5'-Концы большинства матричных РНК (мРНК) эукариот заблокированы, или кэпированы. Кроме того, существуют и некоторые другие формы РНК, которые также кэпированы, например малые ядерные РНК (мяРНК). Кэп-структура содержит 5'-5' трифосфатную связь между двумя остатками нуклеозида и 7-метильную группу на дистальном гуаниновом кольце. Кэпирование мРНК и мяРНК способствует их нормальному функционированию в клетках.

Способность синтезировать копированные молекулы РНК ίη νίΐτο полезна, поскольку она позволяет получать молекулы РНК, которые при использовании их во множестве биологических применений функционируют должным образом. Такие применения включают как исследования, так и коммерческое производство полипептидов, например, продуцирование в бесклеточной системе трансляции полипептидов, содержащих на определенном участке неприродную аминокислоту, или продуцирование в культивируемых клетках полипептидов, которым для восстановления активности или стабильности необходима пост-трансляционная модификация. В последних системах синтез протекает в течение значительно более длительного времени и, следовательно, производится больше белка.

Наиболее часто используемый для получения копированных РНК ίη νίΐτο способ представляет собой транскрипцию матрицы ДНК с помощью либо бактериальной РНК-полимеразы, либо РНКполимеразы бактериофага, в присутствии всех четырех рибонуклеозид трифосфатов и динуклеотида кэпструктуры, такого как щ⁷О(5')ррр(5')О (далее в описании т⁷ОрррО). Полимераза инициирует транскрипцию путем нуклеофильной атаки α-фосфата следующего включенного в матрицу нуклеозидного трифосфата, используя 3'-ОН остатка Οιιο в т⁷ОрррО, приводя к образованию исходного продукта тХрррСрК В качестве альтернативы ГТФ-инициированный продукт ррр^рN подавляют путем создания в реакционной смеси для транскрипции соотношения т⁷ОрррО к ГТФ, находящегося в пределах от 5 до 10.

Синтетические РНК могут быть синтезированы путем бесклеточной транскрипции ДНК-матриц. См. К. Сοиΐ^е^а8 еΐ а1., 81тр1е, еШаеИ ίη νίΐτο 8νηΐ1κ8ΐ8 οί сарреб ΚΝΑ щейб ίοτ биса схргс88гоп οί с^иеб сика^Ос депе8, №с1. Аабб Кез., νο1. 10, рр. 6353-6362 (1982); 1. ¥18тае11 еΐ а1., δνηΐ1κ8ΐ8 οί 1οη§, сарреб ΐ^аи8С^^рΐ8 ίη νίΐτο Ьу 8Р6 аиб Т7 ΚΝΑ рο1уте^а8е8, рр. 42-50 ίη ЮаЫЬегд еΐ а1. (Ебз.), Ме111. Еиζутο1., νο1.180, рр.42-50 (1989) и Ό. Мс1Юп еΐ а1., ЕШоей ίη νίΐτο 8νηΐ1κ8ΐ8 οί Ью^щсаПу асйте ΚΝΑ аиб ΚΝΑ ЬуЬ^^б^ζаΐ^οи ргаЬез Ггош р1азт1б8 сοиΐа^и^ид а ЬаЛегюрЬаде 8Р6 р^οтοΐе^, №с1. Ас1бз Кез., νοϊ.12, рр.7035-7056 (1984).

Полученные таким образом копированные РНК являются активными в реакциях сплайсинга, выполняемых ίη νίΐτο. См. М. ΚοηηΐΈΐα еΐ а1., ^^βηίΐίοη οί сар 81гис1иге ίη 8рйстд ίη νίΐτο οί тΚNΑ ргесиг8οτ8, Се11, νοί. 38, рр.731-736 (1984); аиб I. Ебегу еΐ а1., Сар-береибеиТ ΚΝΑ 8рйсшд ίη а НеЬа иис1еаг ехйасР', Ргос. Νΐϊ. Αсаб. δα. υδΑ, νοϊ.82, рр.7590-7594 (1985).

По сравнению с некэпированными мРНК копированные мРНК транслируются в бесклеточных системах трансляции более эффективно. См. 8. МиШикп8Ьиаи еΐ а1., 5'-Теттша1 7-теΐЬу1диаиο8^ие ίη еиΙ/ηΐΎοΙκ тΚNΑ 18 гес.|шгеб ίοτ №-11иге. νοί. 255, рр. 33-37 (1975); Ь. СЬи еΐ а1., Ра^абοx^са1 ο68е^νаΐ^οи8 οη Ше 5' ΐе^т^ии8 οί ονηΙΗι.ιιηίη те88еидег τώοη^Κκ ааб, ί. Βίο1 СЬет., νοί. 253, рр. 5228-5231 (1978); Е. Оа12уик1ете^ еΐ а1., β-61οΜη тΚNΑ8 сарреб ινίΐΐι т⁷О, т2²'⁷О οτ т3²'²⁷О б1ГГег ίη 1п1г1П81с 1ган8ϊηΐίοη еШиеису, Ν^ϊ. Α8168 Ке8., νοί. 16, рр. 8953-8962 (1988); аиб Е. Оа^ийете^ еΐ а1., ΙηΙιίΗίΐίοη οί сика^Ос ΐπιη81ηΐίοη Ьу иис1еο8^бе 5'-тοиοрЬο8рЬаΐе аиа1οдие8 οί тΚNΑ 5'-сар: СЬаиде8 ίη N7 8ΐώ8ΐίΐικηΐ айеЛ аиаЦдие асйуйу, ВюсЬет., νοί. 28, рр.4771-4778 (1989).

С точки зрения трансляции 5'-неметилированные мРНК являются менее активными по сравнению с 5'-метилированными мРНК. См. Ο. Βοΐΐι еΐ а1., МеΐЬу1аΐ^οи-береибеиΐ ΐΓηη81ηΐίοη οί νίΓηΙ те88еидег ΚΝΑ8 ίη νίΐτο, Ргос. Νηΐ1. Αсаб. δα. ϋδΑ, νοί. 72, рр. 1189-1193 (1975).

Копированные мРНК, введенные в культивируемые клетки млекопитающих с помощью электропорации, транслируются более эффективно, чем некэпированные мРНК. См. Е. Сг^16/1сп еΐ а1., 'ΌίΠοϊΌηΐίηΙ 1иЬ1Ь1ΐίοη οί тΚNΑ бс^тба^и раШ\\'ау8 Ьу иονе1 сар аиак^, ί. Βίο1. СЬет. νοί. 281, рр. 1857-1867 (2006).

- 1 017740

В статье А. Ракс.|шпе1Н е1 а1., Кеуегке 5' сарк ίη ΡΝΛδ тайе ίη νίίτο Ьу рйаде ΕΝΑ ро1утегакек, ΕΝΑ, νο1. 1. рр. 957-967 (1995), сообщается о том. что для инициации транскрипции полимеразы бактериофагов используется 3'-ОН группа остатка 7-метилгуанозина в т⁷СрррС, что является свидетельством того, что обычно примерно одна треть - половина продуктов РНК, полученных с помощью этих аналогов кэпструктуры, содержит кэп-структуру, имеющую обратную ориентацию, т.е. Срррт⁷Ср№ Такие инвертированно-кэпированные молекулы РНК ведут себя аномально. Те же самые авторы сообщают о том, что при введении инвертированно-кэпированных транскриптов рге-Ш мяРНК в ядра Хепорик 1аег1к они экспортировались более медленно по сравнению с природными транскриптами. Аналогично цитоплазматические инвертированно-кэпированные Ш мяРНК в цитоплазме не были импортированы в ядро должным образом.

Наличие кэп-структуры в мРНК сильно стимулирует трансляцию транскрипта мРНК в белок. В работе Е. Сгий/1еп еί а1, Nονе1 сар апа1одк Гог ίη νίίτο куп1Нек1к оГ ιηΕΝΛκ \\Й11 Ыдй 1гапк1а11опа1 еГГ1С1епсу, ΕΝΑ νο1. 10, рр.1479-1487 (2004) показано, что мРНК, содержащие кэп-структуры, встроенные исключительно в обратной ориентации, транслировались в бесклеточной системе только с 4%-ой эффективностью по сравнению с РНК, содержащими кэп-структуры, встроенные исключительно в нормальной ориентации.

Статья 1. 81ерткк1 е1 а1., 8уп1йек1к апй ргорегйек оГ ιηΕΝΛκ соп1а1шпд Фе ηονе1 'апр-гегегке' сар апа1одиек 7-те1йу1(3'-О-те1йу1)СрррС апй 7-те1йу1(3'-йеоху)СрррС, ΕΝΑ, уо1. 7, рр. 1486-1495 (2001) посвящена синтезу и использованию двух новых аналогов кэп-структуры, т\3'йСрррС и т₂ ^7,3-оСрррС, которые не способны встраиваться в обратной ориентации. мРНК, кэпированные такими антиинвертированными аналогами кэп-структуры (АКСА), транслируются в системе ш уйго более эффективно, чем мРНК, кэпированные обычным аналогом, т⁷СрррС. См. также патент США № 7074596 и заявку на патент США 2003/0194759.

В работе Ζ. Репд е1 а1., 8уп1йек1к апй арр11са(1оп оГ а сйаш-1егттайпд йшис1еоййе тКЫА сар апа1од, Огд. Ьей., уо1.4, рр. 161-164 (2002), описан синтез т₂ ^7,3'^-оСрррС и его использование в транскрипции ш \йго гомогенно кэпированной РНК.

В статье 1. 1ет1е1йу е1 а1., №ус1 'апр-гегегке' сар апа1одиек \\ЙЬ кирепог ίгапк1а11опа1 ргорегЕек, КИА, уо1. 9, рр. 1108-1122 (2003) указано, что замещение во 2'-положении на -ОСН₃ или -Н для получения т₂ ^7,2' ^-оСрррС или т⁷2'йСрррС, соответственно, дает АКСА, обладающие свойствами, эквивалентными или немного более предпочтительными свойствам АКСА, замещенным в 3'-положении, как было измерено с использованием критериев связывания с трансляционным кэп-связывающим белком е1Е4Е, правильного встраивания в мРНК во время транскрипции ш уйго и трансляционной эффективности полученных мРНК в бесклеточной системе.

Количество белка, продуцированного из синтетических мРНК, введенных в культивируемые клетки млекопитающих, ограничено деградацией мРНК, происходящей в результате естественных процессов метаболизма. Основной путь деградации мРНК ш у1уо инициируется удалением кэп-структуры из неповрежденной мРНК специфической фосфатазой, Иср1/Пср2, которая расщепляет связи между а и β фосфатами. Е. Сгий/1еп е1 а1. , О|ПсгепШ11 шЫЬйюп оГ тКЫА йедгайаЕоп ра1Ь\уаук Ьу поуе1 сар апа1одк, 1. Вю1. Сйет., уо1. 281, рр. 1857-1867 (2006) разработали и синтезировали аналог кэп-структуры, в которой атом О между а и β фосфатными группами замещен группой метилена, т₂ ^{7,3 -о}СррСН2РС, причем мРНК, кэпированные этим аналогом, были устойчивы к гидролизу рекомбинантным человеческим Эср2 ш уйго. При введении в культивируемые клетки мРНК кэпированные т2^{7,3 -о} СррСН2РС были более стабильными по сравнению с мРНК, кэпированными т₂ ^7,3' ^-оСрррС.

Существуют два известных декэпирующих фермента: Иср1/Пср2, который воздействует на неповрежденную мРНК, инициируя 5'^3' деградацию; и Эср8, который воздействует на короткие кэпированные олигонуклеотиды, приводя к 3'^5' деградации. Поскольку Эср1/0ср2 или только Эср2 высвобождает п/СЭР из кэпированной мРНК, то, вероятно, расщепление происходит между а и β фосфатами. См. Ζ. XV апд е1 а1., Т1е К0ср2 рго1еш 1к а таттайап тКЫА йесарртд еп/уте, Ргос. №11. Асай. 8ск И.8.А., уо1.99, рр.12663-12668 (2002). Ранее было показано, что нуклеозид 5'-монофосфоротиоаты, а также аналоги трифосфатов, такие как АТФу8, ГТФу8 и ГДФу8, устойчивы к фосфатазам. См. Е. Ескк1ет е1 а1., Сиапокте 5'-О-(2-Шюй1рйокрйа1е). Ап ийпЬйог оГ айепу1а1е сус1аке кЕти1а1юп Ьу диашпе пис1еоййек апй Диог1йе юпк, 1. Вю1. Сйет., уо1. 254, рр. 9829-9834 (1979), и Ό. Сакке1 е1 а1., АсРгаРоп оГ 1игкеу егу1йгосу1е айепу1а1е сус1аке апй Ыосктд оГ 11е са1есйо1атте-кйти1а1ей СТРаке Ьу диапокте 5'-(датта1Ыо) 1прйокрйа1е, Вюсйет Вюрйук Кек Соттип, уо1. 77, рр. 868-873 (1977). Кроме того было обнаружено, что полинуклеотиды, содержащие внутринуклеотидные фосфоротиоатные связи, расщеплялись более медленно по сравнению с их природными вариантами. См. Н. Ма1хига е1 а1., А ро1упЬопис1ео11йе соп1ат1пд а11ета1юп Р=О апй Р=8 йпкадек, Еиг. 1. Вюсйет., уо1. 3, рр. 448-452 (1968). Интересно отметить, что диастереомеры фосфоротиоатов могут проявлять различную чувствительность к нуклеазам. Р1 нуклеаза гидролизует диастереомер 8р быстрее, чем Кр. См. В. Ройег е1 а1., 8упШек1к апй сопйдига1юпа1 апа1укй оГ а йтис1еок1йе рйокрйа1е 1ко1орюа11у сЫга1 а1 рйокрйогик. 81егеосйет1са1 соигке рГ РешсШшт сйгит пис1еаке Р1 геасйоп., ВюсйетШгу, уо1. 22, рр.1369-1377 (1983). Рибонуклеаза Т1 и фосфодиэстераза змеиного яда

- 2 017740 предпочтительнее расщепляют диастереомер Кр, чем 8р. См. Р. Ескккш е! а1., 81егеосЬетк1гу ой П1е Каикеккпйюайои ь!ер ой пЬоиискаке Т1, ВюсБетЫгу. νοί. 11, рр. 3507-3512 (1972), и Р. Вигдега е! а1., ЛЬ8о1и1е СоиВдитаНои ой 1Бе Б1а51егеотег5 ой Абеиокше 5'-О-(1-11ио1пр1ю5р11а1е): Соикедиеисек йог 1Бе йетеосЬетщЦу ой роЕтпепхабоп Ьу ПМЛ-береибеи! ΚΝΑ ро1утега§е йот ЕксйепсЫа сой, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И.8.А., νο1. 75, рр. 4798-4800 (1978).

Хотя мРНК, копированная т₂ ^{7,3 -о}СррСН2рС, более стабильна в культивируемых клетках, она обладает более низкой трансляционной эффективностью, по-видимому, в связи с тем, что т2^{7,3 -о}СррСН2РС по сравнению с т₂ ^7,3' ^-оСрррС связывается с е1Р4Е т тбго со значительно более низкой аффинностью. Таким образом, даже хотя в культивируемых клетках она является более стабильной, это преимущество обесценивается более низкой трансляционной эффективностью.

В работе 1. Котакка е! а1. 8уи1йе818 аиб ргорегйек ой ιηΡΝΑ сар аиа1одк сои1аштд рйо8рйого1Ыоа1е то1е!у ш 5',5'-1прйо8рйа1е скат, №.1с1ео5. №.1с1ео1. №с1. Ас1б§, νο1. 24, рр. 595-600 (2005), описан синтез трех аналогов кэп-структуры, у которых атом 8 заменен атомом О либо в а- и β-, либо в γ-фосфатных группах, например, т⁷Ср8ррС, т⁷Сррр8С и т⁷Срр₈-_СН3рС. Эти синтезированные фосфоротиоатные аналоги кэп-структуры были более стабильными ингибиторами кэп-зависимой трансляции и были устойчивыми по отношению к декэпирующему ферменту Бср8. Однако по сравнению с обычными АКСА эти соединения не смогли бы показать более высокую трансляционную эффективность ни 1и νιΙΐΌ, ни 1и νίνΌ, поскольку они встраивались бы в большой степени в обратной ориентации.

Существует потребность в модификации, при которой достигалась бы как более высокая трансляционная эффективность, так и повышенная устойчивость к деградации как 1и νίνΌ, так и 1и νίΐιο. Уникальные соединения, раскрытые в настоящем документе, обладают и тем и другим.

Раскрытие изобретения

Было обнаружено, что 8-замещение в одном или нескольких фосфатах вместе с 2'-О метилзамещением дает новые аналоги, названные 8-АКСА, обладающие неожиданными свойствами. Новая модификация АКСА гарантирует, что а, β, и γ фосфоротиоатные группы находятся точно в активных участках кэп-связывающих белков как в трансляционном, так и в декэпирующем комплексах. По меньшей мере, некоторые из этих аналогов являются устойчивыми к Бср1/Бср2. Некоторые из 8-АКСА обладают намного более высокой аффинностью к е1Р4Е по сравнению с соответствующими аналогами, у которых отсутствует фосфоротиоатная группа. При введении в культивируемые клетки мРНК, содержащие различные 8-АКСА, некоторые из них транслировались в пять раз более эффективно, чем мРНК, синтезированные с обычным аналогом, т⁷СрррС. Кроме того, время полужизни мРНК, кэпированных некоторыми 8-АКСА, было в три раза длиннее времени полужизни мРНК, синтезированных немодифицированными кэп-структурами. Комбинация более эффективно транслируемой мРНК и более стабильной мРНК привела к более высокому уровню продуцирования белков-репортеров в трансфицированных клетках, чем в случае обычных синтетических мРНК или мРНК, кэпированных прежними АКСА. Возросла стабильность 8-АКСА ш νίνο, и к удивлению увеличилась эффективность трансляции, обусловленная более высокой аффинностью к е1Р4Е, а также устойчивостью по отношению к Бср1/Бср2. Устойчивость к катализируемому Бср2 гидролизу в физиологических условиях неожиданным образом коррелировала с β-фосфоротиоатной группой в трифосфатах, и также предполагалась корреляция с γфосфоротиоатом в тетрафосфатах. Другим преимуществом по сравнению с обычными АКСА является наличие Р-диастереоизомеризации благодаря фосфоротиоатным группам. В каждом случае, когда фосфоротиоатная группа находится точно в α-, β- или γ-положениях, все еще существуют две возможности размещения атома серы (ргоК и рго8), которые дают два различных диастереомера с потенциально различной биологической активностью. Например, имелись существенные различия в аффинностях связывания с е1Р4Е между диастереомерами, представленными вариантами Ό1 и Ό2, а также мРНК, кэпированной т₂ ^{7,2 -о}Срр§рС (Ό1), к тому же указанный Ό1 был намного более восприимчивым к Бср2, чем его вариант Ό2. Следовательно, 8-АКСА, чистые с точки зрения наличия диастереомеров, могут использоваться в качестве Р-хиральных зондов, полезных для изучения с точки зрения стереохимии протекания ферментативных процессов, в которых используется кэп-структура.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 изображен синтез а 8-АКСА, т₂ ^7,2' ^-оСррр_?,С (Ό1 и Ό2).

На фиг. 2 изображен синтез γ 8-АКСА, т₂ ^7,2' ^-оСр_?,ррС (Ό1 и Ό2).

На фиг. 3 изображен синтез β 8-АКСА, т₂ ^7,2' ^-оСрр_?,рС (Ό1 и Ό2).

На фиг. 4 изображен синтез тетрафосфата у 8-АКСА, т₂ ^7,2' ^-о Срр.ррС (Ό1 и Ό2).

На фиг. 5 изображен синтез 8-АКСА с двумя фосфоротиоатными группами в а и β положениях в трифосфатном мостике, т₂ ^7,2' ^-о Срр_?,р_?,С (Ό1, Ό2, Ό3 и Ό4).

На фиг. 6А-6Н представлены результаты анализа с помощью анионообменной ВЭЖХ синтезированных ш νίΐιο олигонуклеотидов, гидрализованных с помощью 11Бср2.

На фиг. 7 представлен распад копированной 8-АКСА мРНК люциферазы в клетках НС11.

На фиг. 8 представлена трансляционная эффективность кэпированных 8-АКСА мРНК в клетках НС11.

- 3 017740

На фиг. 9А-9Е показано распределение копированной δ-АКСА мРНК люциферазы между полисомами в клетках НС 11 в виде седиментации в градиентах сахарозы, наблюдаемой при поглощении при 260 нм (А), и с помощью ПЦР в реальном времени, чтобы показать распределение мРНК люциферазы (В, С и Ό) и мРНК САРИН (Е) .

На фиг. 10 показана временная зависимость экспрессии люциферазы после нуклеопорации клеток НС11, содержащих δ-АКСА-кэпированные мРНК.

Варианты осуществления изобретения Материалы и способы

Пример 1. Общие химические процедуры

Промежуточные нуклеотиды разделяли в виде солей триэтиламмония с помощью ионообменной хроматографии на колонке, заполненной ЭЕАО-сефадексом А-25 (НСО^3- форма), используя линейный градиент бикарбонат триэтиламмония (ТЕАВ) в деионизированной воде, с последующим выпариванием при пониженном давлении с добавлением этанола. Конечные продукты (аналоги кэп-структуры) разделяли либо с помощью аналитической, либо полупрепаративной ВЭЖХ с обращенными фазами (КР НРЬС) и, после повторной сублимации, выделяли в виде солей аммония. Аналитическую ВЭЖХ выполняли на аппарате 8рейта-Рйук1ск 8Р8800, оборудованном колонкой с обращенной фазой 8ире1сокП ЬС-18Т (4,6x250 мм, скорость потока 1,3 мл/мин) с линейным градиентом 0-25% метанола в 0,05М аммоний ацетатном буфере, рН 5,9, используя УФ-детектирование при 260 нм. Полупрепаративную ВЭЖХ выполняли в системе \Уа1егк 600Е Мн111ко1уеп1 Эекуету 8ук1ет, оборудованной колонкой с обращенной фазой \Уа1егк НК-С-18 (19 х300 мм, скорость потока 5,0 м/мин) с линейным градиентом метанола в 0,05 М аммоний ацетатном буфере, рН 5,9, используя УФ-детектирование при 260 нм.

ОМР и СЭР были приобретены у компании 8щта-А1бпсй и преобразованы в соли триэтиламмония с использованием ионообменной смолы Эо\\'ех 50 \УХ 8. Другие нуклеотиды, т.е. щ⁷ОМР, т2^7,2' ^-оОМР, п/СЭР, т2^7,2' ^-оСЭР были приготовлены, как сообщалось ранее в работе 1. 1ет1е1йу е! а1. Ыоуе1 'апбтеуетке' сар апа1одиек \\йй кирепог 1гапк1абопа1 рторетбек, КИА, уо1. 9, рр. 1108-1122 (2003). Соль, тиофосфат триэтиламмония, получали из Ыа₃Р8О₃ путем превращения на ионообменной смоле Эо\уех 50 \УХ 8 (после выпаривания до сухого состояния) и повторного выпаривания, используя 99,8% этанол, и хранили при -20°С. См. 1. Ко\\'а1кка е! а1. А кппр1е апб тар1б куШйекй о£ пис1еоббе апа1одиек соп1ашшд а рйокрйото!йюа1е то1е!у а! 1йе 1еттша1 рокйюп о£ !йе рйокрйа!е сйаш, Те!гайебгоп Ьеб., уо1. 48, рр. 54755479 (2007). 7-метилгуанозин получали описанным ранее способом за исключением того, что вместо ДМА использовали ДМФА (см.; 1. 1опек е! а1., Ритше Ыис1еок1бек. 111. Ме1йу1абоп '81иб1ек о£ Себаш ИаШгаПу Оссштшд Ритше Ыис1еок1бек, 1. Ат. Сйет. 8ос, уо1. 85, рр. 193-201 (1963)). 7,2'-Одиметилгуанозин синтезировали из 2'-О-метилгуанозина, используя аналогичную процедуру. 2'-Ометилгуанозин получали согласно 1. Кикпнегек е! а1., А пе\у гои!е !о 2'(3')-О-а1ку1 ритше пис1еок1бек, ЫисШс Ас1бк Кек. уо1. 1, рр.73-77, 8рес1а1 РиЬИсабоп № 4 (1978).

Структуру и однородность конечных соединений подтверждали с помощью повторной хроматографии, используя ВЭЖХ с обращенными фазами, масс-спектрометрии, используя отрицательную электроспрей-ионизацию (МС Е81-), и ¹Н ЯМР и ³¹Р ЯМР спектроскопии. (Результаты приведены в табл. 1). Запись спектров Ή ЯМР и ³¹Р ЯМР производили при 25°С на спектрометре ИИПУ-рЫк при 399,94 МГц и 161,90 МГц, соответственно. Ή ЯМР химические сдвиги для 3-триметилсилил-[2,2,3,3-О4]-пропионата (Т8Р) в Э2О были записаны в качестве внутреннего стандарта. ³¹Р ЯМР химические сдвиги для 20%-ой фосфорной кислоты в Э2О были записаны в качестве внешнего стандарта. Массовые спектры регистрировали спектрометром Мютотакк ЦТоР 1 М8, используя отрицательную электроспрей ионизацию (Е81-).

Пример 2.

Общая процедура для производных имидазолидов нуклеотидов (СМР-1т, т₂ ^7,2' ^-оСМР-1т, СЭР-1т и т2^7,2' ^-оСЭР-1т) (7, 8 и 12-15) См. Т. Мика1уата, е! а1. Рйокрйогу1абоп Ьу ох1бабоп-гебисбоп сопбепкабоп. Ртератабоп о£ асбуе рйокрйоту1абпд геадейк, М. Ви11. Сйет. 8ос. 1рп, уо1. 44, 2284 (1971). Соответствующий нуклеотид (1 экв. соли ТЕА), имидазол (8 экв. ) и 2,2'-дитиодипиридин (3 экв.) смешивали в ДМФА (примерно 2,5 мл/100 мг нуклеотида). Добавляли триэтиламин (2 экв.) и трифенилфосфин (3 экв.), и смесь перемешивали в течение 6-8 ч. Продукт осаждали из реакционной смеси безводным перхлоратом натрия (1 экв. на один отрицательный заряд), растворяли в сухом ацетоне (примерно 8 мл/1 мл ДМФА). После охлаждения до 4°С преципитат фильтровали, повторно промывали холодным сухим ацетоном и сушили в вакууме над Р4О1₀. Выход составлял 80-100%. В случае т⁷СМР, из-за более низкой растворимости в ДМФА, использовали реактивы в количестве, превышающем двукратный избыток, и время реакции увеличивали до 24 ч.

Пример 3. Общая процедура для нуклеозид 5'-О-фосфоротиоатов (9-11)

Суспензию соответствующих нуклеозидов (1 экв., которую сушили в течение ночи в вакууме над Р₄О1₀) в триметилфосфате (1,5 мл/100 мг нуклеозидов) охлаждали до 0°С в бане со смесью льда и воды. Добавляли 2,6-диметилпиридин (3 экв.) и Р8С1₃ (1/5 экв.). Реакционную смесь оставляли на ночь при температуре 0°С, затем реакцию останавливали с помощью 0,35М ТЕАВ и перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Продукт разделяли хроматографией с ЭЕАЕ-сефадексом, используя линей- 4 017740 ный градиент 0-0,7М ТЕАВ. Выходы: (9) 380 мг (0,67 ммоль), начиная с 257 мг (0,91 ммоль) гуанозина (74%); (10) 57 мг (0,10 ммоль), начиная с 120 мг (0,42 ммоль) 7-метилгуанозина (24%); (11) 75 мг (0,13 ммоль), начиная с 7 0 мг (0,23 ммоль) 7,2'-О-диметилгуанозина (53%).

Пример 4. Синтез нуклеозид 5'-(2-О-тиодифосфатов)

7,2'-О-диметилгуанозин 5 '-О-(2-тиодифосфат) (17). К суспензии 14 (100 мг, 0,21 ммоль) и соли триэтиламмония тиофосфата (220 мг) в 5 мл ДМФА добавляли безводный Ζπί.Ί₂ (190 мг, 1,40 ммоль). Полученный раствор перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением раствора ЭДТА (520 мг, 1,40 ммоль) в 50 мл воды и нейтрализовали твердым №1НСО₃. Продукт выделяли на сефадексе ΌΕΑΕ, используя 0-1,0М градиент ТЕАВ. Выход: 106 мг (0,15 ммоль) (17) в виде соли ΤΕΑ (71%).

7-метилгуанозин 5'-О-(2-тиодифосфат) (16). Это соединение синтезировали описанным выше для (17) способом, начиная с (13) (40 мг, 0,089 ммоль) и соли, триэтиламмония тиофосфат, (100 мг). Выход: 31 мг (0,046 ммоль) (16) в виде соли ΤΕΑ (52%).

Пример 5. Синтез кэп-структуры 8-ЛРСЛ

Ниже приведено описание синтеза различных кэп-структур 8-ЛК.СЛ. Пути синтеза изображены на фиг. 1, 2 и 3. Ссылочные позиции (номера) для соединений указаны согласно нумерации, приведенной на фиг. 1, 2 и 3.

щ⁷Сррр₈С Ό1 и Ό2 (1а, 1Ь).

К суспензии (9) (10 мг, 0,018 ммоль) и 7 (15 мг, 0,027 ммоль) в ДМФА (0,8 мл) добавляли безводный ΖπΟΡ (30 мг, 0,22 ммоль). Реакционную смесь оставляли на 2 дня при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 90 мг ЭДТА в 10 мл воды и нейтрализовали твердым №1НСО₃. Диастереомеры (1а) и (1Ь) разделяли с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенными фазами. Выход: 0,8 мг (1а) и 1,0 мг (1Ь) в виде ΝΗ₄ ⁺ солей. Схематически синтез показан на фиг. 1.

щ⁷Срр₈рС Ό1 и Ό2 (2а, 2Ь).

Это соединение синтезировали вышеописанным для 1 способом, начиная с 16 (20 мг, 0,030 ммоль), 15 (23 мг, 0,053 ммоль), _Ζη(212 (60 мг, 0,44 ммоль) в 2 мл ДМФА. Выход: 2,2 мг (2а) и 1,8 мг (2Ь) в виде ΝΗ₄ ⁺ солей. Схематически синтез показан на фиг. 3.

щ⁷Ср₈ррС Ό1 и Ό2 (3 а, 3Ь).

Это соединение синтезировали вышеописанным для 1 способом, начиная с (10) (58 мг, 0,090 ммоль), (12) (120 мг, 0,22 ммоль),. ΖηΟ₂ (24 9 мг, 1,8 ммоль) в 3,5 мл ДМФА. Выход: 14,7 мг (3а) и 10,1 мг (3Ь) в виде ΝΗ₄ ⁺ солей. Схематически синтез показан на фиг. 2.

Щ2^7,2' ^-°Сррр₈С Ό1 и Ό2 (4а, 4Ь).

Соединения (9) (48 мг, 0,084 ммоль) и (8) (57 мг, 0,10 ммоль) суспендировали в 2 мл ДМФА. Затем добавляли безводный ΖηΟ1₂ (115 мг, 0,84 ммоль). Полученный раствор оставляли на 2 дня при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 350 мг ЭДТА в 30 мл воды и нейтрализовали твердым бикарбонатом натрия. Продукты разделяли с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенными фазами, используя линейный градиент метанола в 0,05М ацетате аммония, рН 5,9, из 0-50% в пределах 45 мин. Выход: 5,2 мг (4а) и 7,4 мг (4Ь) в виде ΝΗ₄ ⁺ солей. Схематически синтез показан на фиг. 1.

Щ2^7,2' ^-°Срр₈рС Ό1 и Ό2 (5а, 5Ь).

Это соединение синтезировали вышеописанным для (4) способом, начиная с (17) (106 мг, 0,16 ммоль), (15) (103 мг, 0,24 ммоль) и ΖπΟΡ (260 мг, 1,9 ммоль) в 5 мл ДМФА. Реакцию останавливали добавлением 800 мг ЭДТА в 100 мл воды и нейтрализовали твердым бикарбонатом натрия. Продукты разделяли полупрепаративной ВЭЖХ с обращенными фазами, используя изократический 0,05М ацетат аммония, рН=5,9. Выход: 10,0 мг (5а) и 12,1 мг (5Ь) в виде ΝΗ₄ ⁺ солей. Схематически синтез показан на фиг. 3.

т₃ ^:Ср,ррС Ό1 и Ό2 (6а, 6Ь).

Это соединение синтезировали вышеописанным для (4) способом, начиная с (11) (70 мг, 0,15 ммоль), (12) (107 мг, 0,20 ммоль) и безводного ΖηΟ₂ (220 мг, 1,6 ммоль) в 3 мл ДМФА. Реакцию останавливали 650 мг ЭДТА в 70 мл воды. Продукты разделяли, полупрепаративной ВЭЖХ с обращенными фазами, используя линейный ингредиент метанола в 0,05М ацетате аммония, рН=5,9, из 0-50% в пределах 45 мин. Выход: 15 мг (6а) и 20 мг (6Ь) в виде ΝΗ₄ ⁺ солей. Схематически синтез показан на фиг. 2.

Структуру и однородность вышеуказанных конечных соединений подтверждали с помощью повторной хроматографии, используя ВЭЖХ с обращенными фазами, масс-спектрометрии, используя отрицательную электроспрей-ионизацию (М8 Ε8Ι-), и Ή ЯМР и ³¹Р ЯМР спектроскопии. Результаты приведены ниже в табл. 1.

- 5 017740

Таблица 1. Ή ЯМР химические сдвиги в частях на миллион (±0,01) против внутреннего 3триметилсилил-[2,2,3,3-²Н4]-пропионата натрия и ³¹Р ЯМР химические сдвиги в частях на миллион (±0,01) против внешнего Н₃РО₄

	1а	1Ь	2а	20	За	ЗЬ
т С <3	йГс о	тТ С	т'С 6	т 6 О	пТа о
Н8	8,22	-* 8,14	9,00“ ЯД4	9,01 “ 7,94	9,11 8,01	9,08“ 8ΛΊ
нг	5,92 5,85	5,91 5,84	5,83 5,74	5,84 5,74	5£>2 5,79	5,90 5,79
Н2*	4,58 4,62	4,58 4,62	4,58 4,71	4,45 4,60	4,58 4,69	4,54 4,67
НЗ’	4,46 4,47	4,46 4,47	4,49 4,54	4,42 е 4,42 е	4,50 4,49	4,49 4,42
Н4*	4,3 5е 4,35 е	4,35е 4,35е	4,27 е 4,36 е	4,36е 4,39 е	4,34е 4,39е	4,36р 4,42е
Н5*	4,38е 4,31е	4,38е 4,31е	4,42 4,27 е	4,39е 4,22е	4,38 е 4,27	4,37е 4,29 е
Н5	4,26г 4,31е	4,26е 4,31е	4,36с 4,27е	4,36е 4,20е	4,33 е 4,26	4,35е 4,29 е
СН,(М7)	4,07 -	4,05 -	4,06 -	4,03	4,07 -	4,07 -
Ра	44,17	44,17	-12.37	12,37	-11,26	-11,26
Ρβ	23,86	-23,86	30,27	30,18	-23,79	-23,79
Ργ	11,29	-11,29	-12,37	12,37	43,66	43,26

	4а	4Ь	5а	51)	6а	6Ь
ш/г ν6ι Ср	1 ί а г +*	тг”“О О		0	О
Н8	8,10	-* 8,07	9,01“ 8,03	9,02 8,01	9/18* 8,01	о/Й' Ш
НГ	5,94 5,81	5,93 5,80	5,97 5,80	5,93 5,78	5,95 5,79	5,93 5,78
Н2*	4,26 4,68	4,21 4,66	4,24 4,68	4,25е 4,68	4,23 4,68	4,18 4,66
НЗ’	4,56 4,50	4,52 4,48е	4,54 4,49	4,54 4,49	4,56 4,50	4,49е 4,49е
Н4'	4,30- 4,37 е	4,33 е 4,35е	4,33р 4,27 е	4ДГ 4,26'	4,33 4,28	4,30е 4,30‘
Н5’	4,39е 4,30й	4,46е 4,28е	4,41 4,30 е	4,41 4,3(У	4,40 4,33е	4,30е 4,30е
Н5”	4,30е 4,30е	4,34 е 4,26е	4,31= 4,27'	4,34 е 4,27 е	4,33е 4,28	4,30е 4,30е
СНЭ (N7)	4,08 -	4,07 -	4,06 4	4,07	4.08 -	4,08 -
СН,(2‘-О)	3,59 -	3,59 -	3,60 -	3,58	3,59 -	3,59 -
Ра	43,61	43,70	-12,10	12,10	-11,25	-11,32
Ρβ	-23,86	-23,80	30,33	30,23	-23,85	-23,72
Ργ	-11,33	11,34	12,10	12,10	43,63	43,13
Э- обмениваемые протоны; & перекрывания сигналов.	обмениваемые, но видимые протоны,с - значение приблизительное вследствие

Пример 6. Синтез тетрафосфатного 8-АКСА

Применимость разработанной стратегии синтеза 8-АКСА, содержащего 5',5'-тетрафосфатный мостик, показана на примере синтеза т₂ ^7,2'^-оСрр8ррС (фиг. 4). Синтез трех других тетрафосфатных 8-АКСА (т.е. т2 ^{2 о}Ср?,рррС. т₂ ^{2 о}Сррр?,рС. т2^7,2'^-оСрррр8С) доступен с использованием аналогичного подхода.

7,2'-О-диметилгуанозин 5'-(тиодифосфат) (20 мг, 0,029 ммоль) и имидазолид гуанозин 5'-дифосфата (30 мг, 0,05 6 ммоль) суспендировали в 2 мл ДМФА. Затем добавляли безводный ΖπΟ1₂ (61 мг, 0,45 ммоль). Полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Реакцию останавливали добавлением ЭДТА (166 мг, 0,4 5 ммоль) в 20 мл воды и нейтрализовали твердым бикарбонатом натрия. Продукты разделяли с помощью ионообменой хроматографии на ПЕАЕ-сефадексе, используя 0-1,2М градиент ТЕАВ. Фракции, содержащие диастереомерную смесь из т₂ ^7,2'^-о Срр8ррС, собирали, сливали вместе и выпаривали при пониженном давлении с повторным добавлением этанола. Заключительную очистку проводили с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенными фазами, используя линейный градиент метанола в 0,05М ацетате аммония, рН=5,9, от 0-25% в пределах 60 мин. Выход: 7 мг т2^7,2' ^-оСрр8ррС (диастереомерная смесь) в виде ΝΗ₄ ⁺ соли.

МС Е81 (-): Вычислено для С₂₂Н₃₀^₀О1₇Р₃8: 897,02; найдено: 879,09

Ό1: Ή ЯМР: δ (м.д.) 9,14 (1Н, с) 8,08 (1Н, с), 5,99 (1Н, д), 5,813 (1Н, д), 4,70 (1Н; т), 4,64 (1Н, т), 4,54 (1Н, т), 4,45 (1Н, м), 4,35 (2Н, м), 4,29 (3Н, м), 4,07 (3Н, с), 3,60 (3Н, с);

³¹Р ЯМР: δ 30,2 (1Р, т, Ру), -11,1 (1Р, дд, Рδ), -11,9 (1Р, дд, Ра), -23,8 (1Р, д, Ρβ).

Ό2: Ή ЯМР: δ (м.д.) 9,16 (1Н, с) 8,08 (1Н, с), 6,03 (1Н, д), 5,83 (1Н, д), 4,70 (1Н; т), 4,60 (1Н, т), 4,54 (1Н, т), 4,45 (1Н, м), 4,35 (2Н, м), 4,29 (3Н, м), 4,07 (3Н, с), 3,58 (3Н, с);

³¹Р ЯМР: δ 30,2 (1Р, т, Ру), -11,1 (1Р, дд, Рδ) , -11,9 (1Р, дд, Ра), -23,8 (1Р, д, Рβ).

- 6 017740

Пример 7. Синтез 8-АВСА с двумя фосфоротиоатными группами

Разработанная стратегия также предлагает способ синтеза соединений, содержащих множество фосфоротиоатных групп в 5',5'-полифосфатном мостике, которые могут быть получены по схеме синтеза, предложенной на фиг. 5 на примере соединения т₂ ^7,2'^-0 Срр_кр_кС. Производное имидазолида гуанозин 5'-Отиофосфата получали аналогично согласно процедуре, описанной выше для производного имидазолида аденозин 5'-О-тиофосфата [М. δΐιίιηαζιι е! а1. Редю- апб к1егеосоп1го11еб купШекй оГ 2'-5'-1шкеб р1окрйото1Ыоа!е о11доабепу1а!ек Ьу игапу1 юп са1а1ук1 ίη ациеоик ко1и!юп, 1. С1ет. 8ос, Регкш Тгапк. 1, 2002, 1778-1785], и очищали на колонке, заполненной ΌΕΑΕ-сефадексом А-25, с линейным градиентом бикарбоната триэтиламмония (0-0,5М ТЕАВ в деионизированной воде). Схема синтеза приведена на фиг. 5.

Гуанозин 5 '-О-(1,2-дитиодифосфат).

Производное имидазолида гуанозин 5'-О-монотиофосфата (соль триэтиламмония, 53 мг, 0,1 ммоль) смешивали с солью, триэтиламмония фосфоротиоат, (320 мг, примерно 1,2 ммоль) и полученную смесь суспендировали в 3,5 мл ДМФА. Затем добавляли безводный хлорид цинка (55 мг, 0,4 ммоль) и хлорид марганца (50 мг, 0,4 ммоль). Реакцию останавливали добавлением раствора ЭДТА (270 мг, 0,8 ммоль в 35 мл воды) и, используя бикарбонат натрия, доводили рН до 7.

Хроматографическое выделение выполняли на колонке, заполненной ΌΕΑΕ-сефадексом А-25, с линейным градиентом бикарбоната триэтиламмония (0-0,9 М ТЕАВ в деионизированной воде). Фракции, содержащие гуанозин 5'-О-(1,2-дитиодифосфат), собирали и выпаривали при пониженном давлении с добавлением этанола, и полученное твердое вещество сушили в вакууме над Р4О10.

т2^7,2' ^-оСрр₈р₈С.

Производное имидазолида 7,2'-О-диметилгуанозин 5'-О-монофосфата (натриевая соль, 23 мг, 0,05 ммоль) смешивали с гуанозин 5'-О-(1,2-дитиодифосфатом) (триэтиламмониевая соль, 39 мг, 0,05 ммоль), и полученную смесь суспендировали в 1,5 мл ДМФА. Затем добавляли безводный хлорид цинка (55 мг, 0,4 ммоль). Реакцию останавливали добавлением раствора ЭДТА (135 мг, 0,4 ммоль в 20 мл воды) и, используя бикарбонат натрия, доводили рН до 7. Хроматографическое выделение и разделение диастереомеров т₂ ^7,2' ^-оСрр_кр_кС (Ό1, Ό2, Ό3, Ό4) выполняли с помощью полупрепаративной ВЭЖХ с обращенными фазами.

Пример 8. Клеточная культура

Эпителиальные клетки молочной железы НС11 получали путем клонирования мышиных клеток молочной железы линии СОММА-ГО. См. К. ЭашеЕоп е! а1. Εрййе1^а1 тоике таттагу се11 1ше ехЫЬйшд погта1 тогрйодепекй ίη у1уо апб Гипсбопа1 бИГегепбабоп ίη уйто, Ргос. №111. Асаб. 8ск И.8.А., уо1.81, рр.3756-3760 (1984). Клетки выращивали в среде ВРМ1 1640, содержащей 10%-ую фетальную телячью сыворотку (НуС1опе), 5 мкг/мл бычьего инсулина (81дта) и 10 нг/мл рекомбинантного ΕΟΕ (ΒΌ Вюкстепсек).

Пример 9. Синтез мРНК ш уйто

Копированные РНК синтезировали транскрипцией ш уйто с помощью полимеразы Т7 в присутствии кодирующей люциферазу плазмиды (р1ис-А₆₀) при наличии всех четырех нуклеозид трифосфатов и различных динуклеотидов кэп-структуры. См. 1. 1ет1е1йу е! а1. Ыоуе1 'апб-теуетке' сар апа1одиек \\Й11 киретют !тапк1а!юпа1 рторетбек, ΡΝΑ. уо1. 9, рр. 1108-1122 (2003). Обычная реакционная смесь для транскрипции содержала 40 мМ Трис-НС1, рН 7,9, 6 мМ МдС1₂, 2 мМ спермидина, 10 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл Β8Α, 1 ед/мкл РМакш (Рготеда), 0,5 мМ АТФ, 0,5 мМ ЦТФ, 0,5 мМ УТФ, 0,1 мМ ГТФ, 1 мМ аналог кэпструктуры, 15 мкг/мл ДНК и 1 ед/мкл полимеразы Т7 (Рготеда). Содержащий полную последовательность, кодирующую люциферазу светлячка, р1ис-А₆₀ в рСΕМ4 (Рготеда) и 3'-терминальный 60-п! поли(А) участок (см. Е. Сшбζ^еп е! а1., Э1ГГегепба1 шЫЬйюп оГ ιηΒΝΑ бедтабабоп раПмаук Ьу поуе1 сар апа1одк, 1. Вю1. С1ет., уо1. 281, рр. 1857-1867 (2006)) расщепляли с помощью Нра1 для синтеза мРНК люциферазы и с помощью №о1 для синтеза копированных олигонуклеотидов.

Короткие РНК (копированные олигонуклеотиды, состоящие примерно из 48 нуклеотидов) синтезировали в присутствии 10 мкКи/мкл [ а-³²Р]ГТФ(1СЦ) в 50-мкл реакционных смесей, инкубированных в течение 45 мин при 37°С. Реакционные смеси экстрагировали фенолом и хлороформом, и затем отделяли РНК от невстроившихся нуклеотидов, используя спин-колонки (АтЫоп) согласно протоколу изготовителя. Концентрации мРНК определяли с помощью счетчика Черенкова (Сетепкоу), в котором удельную радиоактивность [а-³²Р]ГТФ в конечной реакционной смеси для транскрипции использовали для преобразования счета распадов в пмоль.

мРНК синтезировали в 200 мкл реакционных смесей, инкубированных в течение 45 мин при 37°С. После инкубации 200 мкл реакционных смесей обрабатывали 3 единицами ДНКазы ВЦ1 (Рготеда) в течение 20 мин при 37°С, и РНК очищали с помощью мини-набора РНКаз (Цхадеп), используя протокол изготовителя. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически.

Пример 10. Анализ ш уйто декапирования РНК

Активность Эср2 измеряли, используя в качестве субстратов копированные 48-п! олигонуклеотиды, укороченная форма мРНК люциферазы (48 нуклеотидов). С8Т-1ГОср2 экспрессировали в Εксйе^^сЫа сой и очищали способом, описанным у Ζ. \Уапд е! а1., Т1е Юср2 рто!еш 1к а ташшайап ιηΚ,ΝΑ бесарршд

- 7 017740 епхуте, Ргос. №11. Асаб. 8с1. и.8А., νοί. 99, рр. 12663-12668 (2002). Копированные олигонуклеотиды сначала подвергали катализированному О8Т-йОср2 расщеплению при 37°С в течение 2 ч в буфере для декапирования (10 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 100 мМ ацетат калия, 2 мМ ацетат магния, 0,5 мМ МпС1₂, 2 мМ дитиотриэтол и 0,1 мМ спермин). См. С. Рюсш11о е! а1., Рипс1юпа1 с11агас1епха1юп оГ 1бе таттаНап 111Κ.ΝΑ бесарршд епхуте НЭср2. Κ.ΝΑ. νο1. 9, рр. 1138-1147 (2003). Затем реакционную смесь экстрагировали один раз равным объемом фенола и два раза хлороформом и осаждали РНК этанолом. Затем продукты реакции декапирования расщепляли коктейлем рибонуклеаз (К1Ьо8йтеббет; ЕрюепЦе) при 37°С в течение 1 ч. Продукты разделяли анионообменной ВЭЖХ на 4,6x250 мм колонке Ратйзб 108АХ/25 (\У11а1тап). Градиент состоял из воды в течение 1 мин, линейного градиента 112 мМ КН₂РО₄, рН 4,5, в течение 20 мин, линейного градиента 112-450 мМ КН₂РО₄ в течение 15 мин, линейного градиента 450 мМ-1,5М КН2РО4 в течение 15 мин и изократической элюции в 1,5М КН2РО4 в течение 9 мин, все проводили при скорости потока 1 мл/мин.

Пример 11. Измерение трансляционной эффективности и разрушения мРНК в клетках НС 11

Для доставки РНК в клетки использовали два способа, электропорацию и нуклеопорацию. В случае электропорации 5 мкг РНК вводили в 10⁷ клеток НС 11 в среде КРМ1 1640 с уменьшенным количеством сыворотки, общий объем среды составлял 400 мкл, в кювете Сепе Рикет (4-мм щель) на Вю-Каб беперикег™, установив 0,22 кВ и 960 мкФ. После разрядки клетки промывали два раза РВ8, центрифугировали в течение 2 мин при 300хд при комнатной температуре, ресуспендировали в предварительно нагретой полной среде и выдерживали при 37°С. Нуклеопорацию выполняли, используя Атаха Νυс1еоГес!ог II (Атаха Вю8у81етз) согласно рекомендациям изготовителя. Один микрограмм РНК вводили в 10⁶ клеток НС11, используя №с1еоГес1ог 8о1и1юи V и установки согласно рекомендуемым режимам (программа Т-024).

Для измерения трансляционной эффективности клетки разделяли в несколько пробирок ЕррепбогГ, помещали в водяную баню при 37°С и встряхивали. Для измерения стабильности мРНК клетки распределяли в 35-мм чашки для клеточных культур и выдерживали при 37°С в увлажненной атмосфере 5% СО₂. Клетки отбирали в различные моменты времени и дважды промывали РВ8.

Для экстракции цитоплазматической РНК 2 х10⁵ клеток лизировали в 175 мкл лизирующего буфера (50 мм Трис-НС1, рН 8,0, 140 мМ №С1, 1,5 мМ МдС1₂, 0,5% (об/об) 1дера1 (81дта) и 1 мМ дитиотриэтол). Затем РНК очищали, используя мининабор РНКаз. Для экстракции белка 2х10⁵ клеток лизировали в 200 мкл реагента для лизиса Ьисйстазе Се11 Си11ите Ьу818 Кеадеп! (Рготеда). Активность люциферазы клеточных экстрактов измеряли согласно протоколу изготовителя (Рготеда).

Пример 12. Приготовление полисом

Для разделения рибосомальных субъединиц и комплексов инициации 4х 10⁶ НС11 клеток обрабатывали в течение 2 мин ледяным РВ8, содержащим 0,1 мг/мл циклогексимида, дважды промывали той же самой средой и лизировали в 600 мкл буфера, содержащего: 0,3М №С1, 15 мМ Трис-НС1 (рН 7,6), 15 мМ МдС12, 1% Тритон Х-100, 1 мг/мл гепарина и 0/1 мг/мл циклогексимида. После центрифугирования при 14000хд в течение 10 мин супернатант наслаивали на 15-45% градиент сахарозы в том же самом буфере, но без Тритона Х-100, и центрифугировали в роторе Весктап 8^41 Т1 при 38000 об/мин при 4°С в течение 2 ч. Градиенты фракционировали, непрерывно отслеживая поглощение при 260 нм. РНК из каждой фракции (1 мл) выделяли и анализировали с помощью ПЦР в реальном времени.

Пример 13. ПЦР в реальном времени

Для измерения стабильности мРНК примерно 2 мкг каждого образца общей РНК, выделенной из клеток НС 11 и очищенной с помощью мини-набора РНКаз (О|адеп), обрабатывали 3 ед. ДНКазы РО1 (Рготеда) в течение 20 мин при 37°С. Обратную транскрипцию выполняли с 400 нг РНК в 20 мкл реакционных смесей, содержащих 5,5 мМ МдС1₂, 500 мкМ каждого б№ГР, 2,5 мкМ случайных гексамеров, 0,2 ед. ингибитора РНКазы и 0,8 ед. обратной транскриптазы Ми1И8спЬе (Аррйеб Вю8у81етз). Реакционные смеси инкубировали при 25°С в течение 10 мин, при 48°С в течение 30 мин и при 95°С в течение 5 мин.

Количественную ПЦР в реальном времени выполняли, используя специфические праймеры, разработанные для каждой мРНК с помощью Веасоп ^е8^дие^ (Вю-Каб). Для детектирования последовательностей на 5'-конце мРНК люциферазы праймеры представляли собой 5'-С0ТТС66ТТ66СА6АА0СТА3' (8ЕО ГО N0:1) и 5'-АСТ6ТТОА6СААТТСАСОТТСАТТ-3' (8ЕО ГО N0:2). мРНК люциферазы из кэпструктуры в начале 3'-терминального гомополимерного участка состояла из 1714 нуклеотидов. Эти праймеры амплифицировали нуклеотиды 226-398. Уровни мышиных мРНК САРЭН измеряли тем же самым способом и в тех же самых образцах РНК, используя праймеры 5'СААТ6Т0ТСС6ТС6Т60АТСТ-3' (8ЕО ГО N0:3) и 5'-6АА6А6Т666А6ТТ6СТ6ТТ0А-3' (8ЕО ГО N0:4).

Амплификацию и детектирование выполняли с помощью системы детектирования методом ПЦР в реальном времени 1Сус1ег 10 в 25 мкл реакционных смесей, содержащих 5 мкл реакционной смеси для транскрипции (50 нг кДНК), 12,5 мкл 10 8УВКдгееп 8иретт1х и 0,3 мМ праймеров (Вю-Каб). Условия инкубации были следующими: 3 мин при 95°С для активации полимеразы и 40 циклов по 15 с при 95°С и

- 8 017740 мин при 60°С.

Уровни мРНК люциферазы вычисляли, используя метод абсолютной стандартной кривой, как описано в бюллетене для пользователей № 2 (Икет Ви11е1ш № 2) для системы детектирования последовательностей ΑΒΙ Рпкт 7700. После вычисления количества мРНК люциферазы на основе стандартной кривой, полученную величину нормализовали на количество мышиной мРНК САРИН в каждом образце. Количество мРНК люциферазы для каждой временной точки преобразовывали в процент от РНК, присутствовавшей в нулевой момент времени, и для определения времени полужизни результаты отображали на графике зависимости 1од₁₀([РНК]) от времени. Для анализа РНК из полисомных градиентов к каждой фракции перед выделением РНК в качестве внутреннего стандарта добавляли синтезированную ίη νίίτο мРНК СВР для контроля за изменением выхода РНК. Уровень мРНК СВР использовали для нормализации уровней люциферазы и мРНК САРИН.

Пример 14. Аффинность связывания с е1В4Е

Аффинность связывания аналогов 8 с мышиными е1В4Е определяли подавлением флуоресценции. Титрометрическое измерение флуоресценции выполняли на спектрофлуорометре Ь8-50В (Реткш Е1тег Со.) в реакционной смеси, содержащей: 50 мМ НЕРЕ8/КОН (рН 7,2), 100 мМ КС1, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, при 20,0±0,2°С. Аликвоты объемом 1 мкл с увеличивающейся концентрацией растворов аналогов кэп-структуры добавляли к 1,4 мл 0,1 растворов белка. Интенсивность флуоресценции (возбуждение при 280 нм с 2,5-нм полосой пропускания и детектирование при 337 нм с 4-нм полосой пропускания и 290-нм фильтром с ограниченной полосой пропускания) корректировали, учитывая растворение образца и эффект внутренней фильтрации. Равновесную константу ассоциации (К_А8) определяли путем подгонки теоретической зависимости интенсивности флуоресценции от общей концентрации аналогов кэп-структуры к точкам полученных экспериментальных данных, согласно ранее описанному уравнению (см. А. №ейх\\зеска еί а1., Вюрйукюа1 кШй1ек о! е1В4Е сар-Ьшйшд рго1еш: тесодпйюп о! тВИА 5' сар йгиеШге апй куп111ейс ГгадтегИк о! е1В4С апй 4Е-ВР1 рго1ешк. 1. Мо1. Вю1, νο1. 319, рр. 615-635 (2002)). Концентрацию белка подбирали в виде свободного параметра равновесного уравнения, показывающего количество активного белка. Конечную К_А8 вычисляли в виде взвешенного среднего для трех-десяти независимых титрований с весами, взятыми в виде обратных величин стандартных квадратичных отклонений, полученных численным методом. Численный нелинейный регрессионный анализ методом наименьших квадратов выполняли, используя программу ОВС1И 6.0 (М1сгоса1 8ой\таге 1пс, И8А). Свободную энергию связывания Гиббса вычисляли из величины К_Ь8 согласно стандартному уравнению ДС° = -ВТ1пК_А8.

Пример 15. Ферментативный гидролиз с помощью человеческого Иср8 и Иср8 С. е1едапк

Человеческий Иср8 и Иср8 нематоды экспрессировали в ЕксйейсЫа сой согласно процедурам, описанным ранее (Ь.8. Сойеп еί а1., ИетаЮйе т7СрррС апй т3(2,2,7)СрррС йесарршд: асйуШек ш Аксапк етЬгуок апй с11агас1епха1юп о! С е1едапк ксаνеηде^ Иср8, ВИА, νο1. 10, рр. 1609-1624 (2004)). Оба белка хранили при -80°С в 20 мМ Трис-буфере, рН 7,5, содержащем 50 мМ КС1, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,5 мМ РМ8В и 20% глицерин. Соответствующий аналог кэп-структуры с концентрацией 1 мМ обрабатывали 5,0 или 7,0 мкл Иср8 (человека или С. е1едапк, соответственно) в 500 мкл 50 мМ ТРИС-буфера, рН=7,9, содержащего 20 мМ МдС1₂ и 60 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, при 37°С в течение 60-90 мин. Каждые 15-20 мин из реакционной смеси отбирали по 100 мкл образца и дезактивировали инкубацией при 90°С в течение 3 мин. Собранные образцы анализировали без дополнительной обработки с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенными фазами, используя линейный градиент метанола в 0,1М КН₂РО₄, рН=6,0, от 050% в пределах 15 мин, и УФ-детектированием при 260 нм.

Пример 16. Подавление кэп-зависимой трансляции

Для трансляции ш νίίΐΌ использовали лизат ретикулоцитов кролика, обработанный нуклеазой микрококка (А. Са1 еί а1., ОнапШайуе аккекктегИ о! тВИА сар апа1одиек ак шЫЬйогк о! ш νίίΐΌ капк1айоп, Вюсйет1кйу, νο1.38, рр.8538-8547 (1999)). Оптимальную кэп-зависимую трансляцию получали в 100 мМ ацетате калия и 1,4 мМ хлориде магния. Для определения подавления трансляции различными аналогами кэп-структуры природную мРНК глобина кролика добавляли к лизату при концентрации 5 мкг/мл, и синтез белка измеряли встраиванием [³Н]Ьеи. Нормализацию данных К₁ проводили ранее описанным способом (Са1 еί а1., 1999). Концентрацию растворов динуклеотидных аналогов кэп-структуры измеряли УФпоглощением при рН 7,0, используя λ=255 нм и е_М=22,6х10^-3 М.

Результаты

Пример 17. Синтез аналогов кэп-структуры

Способы синтеза, дающие аналоги, содержащие фосфоротиоатную группу в α,γ и β положениях трифосфатной цепи, изображены на фиг. 1, 2 и 3, соответственно.

Синтезировали серию из шести аналогов кэп-структуры, несущих одну фосфоротиоатную группу либо в α, β, либо в γ положении 5',5'-трифосфатной цепи (см. ниже). В виду наличия стереогенного Рцентра каждый 8-аналог получали в виде смеси двух диастереомеров, обозначенных, как Ό1 и Ό2 согласно порядку их элюции при проведении ВЭЖХ с, обращенными фазами. Каждый 8-аналог успешно разделяли с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами, получив двенадцать соединений, которые затем были охарактеризованы биофизическими и биохимическими параметрами. Шесть из 8-аналогов содер

- 9 017740 жали модификацию АКСА, 2'-О-метильную группу в остатке т⁷Сио, и названия в настоящем описании 8-АКСА. Введение фосфоротиоатной группы в β-положение привело к устойчивости по отношению к Эср2. увеличило время полужизни и улучшило трансляционную эффективность.

Соединение	Обозначение	X	Υ	Ζ	П	Конфигурация
1а	т7Оррр$6 (01)	9	0	о	Н
1Ь	тпт6ррр$£ (02)	&	0	о	н	Яр
2а	т7Срр4рС (01)	0	9	0	н	не определено
2Ь	т7Срр5рС (02}	Ог	3	о	н	не определено
За	т 7С р8ррС (01)	0	о	8	н	не определено
зь	тТ£рзрр6 (02)	0	0	8	и	не определено
4а	П, а> ?'-ис ррр5с (01)	5	о	0	он,
4»	тг гг-обррр5а (02}	€	0	О	сн3
5а	тг’г’°Срр8рС (01)	0	$	0	СН,	не определено
5Ь	т/ г'°СррарС (02)	О	8	0	сн3	не определено
6а	4τί'°6ρ3ρρθ (01)	0	0	8	снэ	не определено
вь	т 2’ 2‘ °0 р,р р<* (02)	0	0	8	СН,	не определено

Химический синтез 8-АКСА представлял собой модификацию синтеза. первоначально разработанного для аналогов кэп-структуры с немодифицированными 5'.5'-полифосфатными мостиками. См. М. Кабокига е! а1.. ЕГПасгИ 5уп111С515 οί у-те!йу1-сарреб диаиокте 5'-1прйо5рйа1е ак а 5'-!егтта1 ипк|ис 51гис!иге оГ иб ΒΝΛ у1а а пе\у 1прйо5рйа1е Ьоиб Гогтабои туокшд асбуабои оГ те!йу1 р1то5р1юп1шба/о1|ба1е И81пд ΖπΟ₂ ак а са!а1ук! ίη ΌΜΡ иибег аийубгоик соибйюик. Тебайебтои Ьеб. уо1.38. рр.8359-83б2 (1997); 1. ЗЮрбМб е! а1.. 8уи!йе515 аиб рторетбек оГ тККАк согИабшщ !йе иоуе1 аибгеуегае сар аиа1одие8 7те!йу1(3'-О-те!йу1)СрррС аиб 7-те!йу1(3'-беоху)СрррС. КNА. уо1. 7. рр.148б-1495 (2001). и 1. 1ет1е1йу е! а1.. №ус1 'аибгеуегае' сар аиа1одие8 тейй щрепог !гаи§1абоиа1 рторетбек. ККА. уо1.9. рр.1108-1122 (2003). В ДМФ соединены два вида мононуклеотидов. один из которых быстрее превращается в реактивное производное имидазолида. Протекание реакции облегчали 8-кратным избытком ΖиС1₂. который значительно улучшает растворимость реагентов в органических средах. препятствует гидролизу производных имидазолида и ускоряет реакцию. Важной стадией в синтезе является присоединение соответствующего производного имидазолида к нуклеозид 5'-фосфоротиоату или 5'-(2-тиодифосфату) в ДМФА в присутствии ΖиС1₂. Промежуточные нуклеозид 5'-(2-тиодифосфаты) эффективно получали с помощью аналогичной. недавно разработанной реакции. в которой в качестве нуклеофила используется анион тиофосфата (Р8О₃ ^3-). См. 1. КотаПка е! а1.. А 5ипр1е аиб гар1б 8уи!йе8щ оГ иис1еоббе аиа1одие8 согИабппд а рйо8рйото!йюа!е то1е1у а! 1йе !егтша1 роыбои оГ 1йе рйокрйа!е сйат. Тебайебгои Ьеб уо1. 48. 2007. 5475-5479. Стратегия разработанной авторами изобретения реакции позволяет вводить фосфоротиоатную группу в выбранные положения полифосфатной цепи. а также получать промежуточные нуклеозид 5'-(2-тиодифосфаты).

Как показано выше и как используется в формуле изобретения. фосфатная группа. которая называется а. представляет собой фосфатную группу. наиболее удаленную от 7-метилгуанозинового остатка. Положение. называемое β. представляет собой следующий фосфат в направлении к 7метилгуанозиновому остатку. и положение. называемое γ. представляет собой следующий фосфат в направлении к 7-метилгуанозиновому остатку. В трифосфате АКСА. как показано выше. γ представляет собой наиболее близко расположенный к 7-метилгуанозиновому остатку фосфат. В тетрафосфате АКСА γ отделен от 7-метилгуанозинового остатка δ фосфатом. (Очевидно. что в отношении АКСА без 7-метилгуанозинового остатка вышеприведенное определение должно быть модифицировано. чтобы ссылка соответствовала остатку с тем положением. который является аналогичным положению 7метилгуанозинового остатка в приведенных здесь примерах).

Способ синтеза. дающий аналоги 1 и 4. модифицированные в а-положении 5'.5'-трифосфатного мостика (т.е. ш⁷Сррр8С и т/.²'^ СррркС). изображен на фиг. 1. В обеих заключительных реакциях присоединения использовали 1.5-2-кратный избыток фосфороимидазолида с тем. чтобы гарантировать полный расход нуклеозид 5'-тиофосфата. Присоединение протекало устойчиво. приводя почти к полному расходу субстрата за 1-2 дня. Синтез аналогов 3 и б. модифицированных в γ положении (т.е. ш⁷Ср8ррС и т₂ ^:-оСр,ррС). который изображен на фиг. 2. аналогичен вышеописанному синтезу. В каждом случае

- 10 017740 образование двух диастереомеров определяли с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами, как показано на фиг. 2. Промежуточные нуклеозид 5'-тиофосфаты 9, 10 и 11 синтезировали через тиофосфорилирование соответствующих нуклеозидов, используя Р8С1₃ в триметилфосфате в присутствии 2,6диметилпиридина, при 0°С, аналогично ранее описанным процедурам (ТР. Могап е! а1., А ртасбса1 епζνιηαΐίο куййекк о! (8[Р])-абепо5ше 5'-О-(Ийюбтрйо8рйа1е) ((8[Р])-АТР-а-8), 1. Огд. Сйет., νοί. 49, рр. 704-706 (1984)). В случае соединений 10 и 11 метилирование в N7 положении необходимо выполнять на стадии нуклеозида до стадии тиофосфорилирования, поскольку, в ином случае, метилйодид предпочтительно будет алкилировать атом серы (неопубликованные результаты). Превращение нуклеозид 5'дифосфатов в производные имидазолида (7, 8 и 12-15) легко протекает через реакцию с имидазолом, в которой используется система активации 2,2'-дитиодипиридин/трифенилфосфин (Т. Мика1уата е! а1., Рйо§рйогу1абоп Ьу ох1бабоп-гебисбоп сопбепкабоп. Ртератабоп о! асйме рйо§рйогу1абпд теадепк, Ви11. Сйет. 8ос. 1рп., νο1. 44, р. 2284 (1971)). Аналоги, модифицированные в Р-положении, т.е. т⁷Срр8рС (2) и т2^7,2'^-оСрр8рС (5), синтезировали согласно изображенной на фиг. 3 схеме. Анализ ВЭЖХ заключительного присоединения выявил образование двух Р-диастереоизомеров. Однако их времена задержки были очень схожими. Для получения промежуточных нуклеозид 5'-О-(2-тиодифосфатов) 16 и 17 была использована недавно разработанная реакция присоединения к нуклеозид 5'-монофосфат имидазолиду соли, триэтиламмония тиофосфат (Р8О₃ ^3-), в виде нуклеофила (1. Котакка е! а1., А отпр1е апб гар1б куШйекк о! пис1еоббе апа1одие§ соШайипд а рйо^рйогобиоНе то1е1у а! 1йе 1егтта1 ройбоп о! 1йе рйокрйа1е сйат, Те!гайебгоп Ьеб, νο1. 48, 2007, 5475-5479).

Во всех реакциях, дающих аналоги 1-6 кэп-структуры, анализ ВЭЖХ выявил, что желаемые соединения были образованы в виде главных продуктов только с умеренным количеством побочных продуктов. Тем не менее, препаративный выход был значительно ниже выхода, указываемого ВЭЖХ, и в целом составлял 10-20%. Вероятно, это происходит из-за больших потерь материала во время длительного разделения диастереомеров методом ВЭЖХ с обращенными фазами, который во многих случаях для получения чистых с точки зрения диастереоизомеров образцов выполняли неоднократно.

Пример 18. Реакция декапирования ш νίΙΐΌ

Проводили тестирование олигонуклеотидов, копированных любым 8-АК.СА, на гидролиз рекомбинантным Юср2, с целью проверки, будет ли мРНК, кэпированная различными диастереомерами т₂ ^2-оСррр5С и т2^7,2'^-о6рр8рО, отличаться по чувствительности к расщеплению Эср1/Оср2. См., в основном, Ζ. ^аид е! а1., Тйе Юср2 рто1еш к а таттайап тРУА бесарртд еηζуте, Ргос. №111. Асаб. 8сй И.8.А., νο1. 99, рр. 1266312668 (2002), и Ζ. \Уапд е! а1., Ап ιηΡΝΛ 81аЬбйу Сотр1ех Еипсбопк \\йй Ро1у(А)-Втбтд Рто1еш То 81аЫШе тРУА ш νίΡΌ, Мо1. Се11. Вю1., νο1. 19, рр. 4552-4560 (1999). Использованные аналоги кэпструктуры сначала были немаркированными, поэтому с тем, чтобы отслеживать продукты реакции расщепления, синтезировали котированные олигонуклеотиды в присутствии [а-³²Р]ГТФ и матрицы ДНК, в которой Г был первым рибонуклеотидом, определенным после промотора. Олигонуклеотиды, котированные любым 8-АВСА, расщепляли с помощью Эср2 ш νίΙΐΌ, после чего продукты дополнительно расщепляли с помощью коктейля рибонуклеаз (К1Ьо8йтеббег от Ерюейет). Любой нуклеотид приобретал на 5'-конце остатка Г ³²Р-меченную З'-фосфатную группу после расщепления рибонуклеазами путем переноса ближайшего соседа. Затем использовали анионообменную хроматографию для отделения меченых З'-нуклеозид монофосфатов (З'-УМР*), имеющих внутренние положения в РНК, от меченых 5'терминальных продуктов (фиг. 6). Последние, соответственно, содержат р3Ср*, полученные из некэпированных транскриптов и т2 ^2-оСр3Ср* (если использовали т₂ ^7,2-оСр3С), или рСр*, получающийся из кэпированной РНК, устойчивой или неустойчивой к ферментативному расщеплению. Все использованные аналоги кэп-структуры представляли собой АРСА, что гарантировало их встраивание в РНК исключительно в правильной ориентации. Это также гарантировало обнаружение после обработки рибонуклеазами только 5'-терминального продукта (т2 ^2-оСр3Ср*). Некэпированная РНК не является субстратом для Оср2, что объясняет обнаружение продукта р₃Ср* после расщепления с помощью Эср2.

Для определения того, какие аналоги кэп-структуры защищают мРНК от расщепления с помощью йОср2, котированную ³²Р-меченную короткую РНК расщепляли с помощью рекомбинантной йОср2 в условиях, при которых (ί) олигонуклеотид, копированный ш^²^ Ср3С был полностью расщеплен с помощью йОср2 (фиг. 6А), и (б) олигонуклеотид, копированный т2^7,3-оСррСН2рС, был устойчивым (фиг. 6В). Ранее было показано, что т₂ ^7,3'^-о6рр_СН2р6 защищает мРНК от деградации йОср2. См. Е. Сп.^1еп е! а1., О1!!етепба1 1пй1Ь1боп о! тРУА бедтабабоп ра1й\тау5 Ьу пονе1 сар апа1од§, 1. Вю1. Сйет., νο1. 281, рр. 1857-1867 (2006). Авторами изобретения было обнаружено, что только изомер Ό2 ш₂ ^7,2' ^-оСрр,рС стабилизировал РНК от гидролиза йОср2 (фиг. 6Е).

Олигонуклеотиды, копированные изомерами т₂ ^:-оСррр?,С и Ш2^7,2‘^о Ср8ррС, не показывали увеличения стабильности по отношению к йОср2 (фиг. 6С, 6Ό, 6С и 6Н).

Пример 19. 5'-Деградация мРНК, котированных фосфоротиоатными аналогами кэп-структуры

Поскольку короткие РНК, копированные 1п₂ ^2-оСрр5рС (Ό2), были устойчивыми к гидролизу йОср2, авторами изобретения была предсказана возможность влияния присутствия этого аналога кэпструктуры в клетках на стабильность мРНК. Для введения синтетической мРНК люциферазы в эпителиальные клетки молочной железы мыши НС11 была использована либо нуклеопорация, либо электропо

- 11 017740 рация. Эти способы позволяют измерять уровень синтеза люциферазы и уровни мРНК люциферазы в клетках практически сразу после разрядки. Электропорацию проводили в оптимизированных ранее условиях. См. Е. Οπιάζίοη с1 а1., 'ΌίΓΓοΓοηΙίαΙ ίηΗίόίΙίοη οΓ ιηΡΝΛ йедгайайоп ра111\уау5 Ьу поус1 сар αηαίοβδ. I. Βίο1. Сйет., νο1.281, рр.1857-1867 (2006). Нуклеопорацию проводили в условиях, рекомендованных Лтаха Вюкуйетк (см. раздел Материалы и способы). Поскольку протокол Лтаха давал самую высокую эффективность трансфекции, а также самую высокую жизнеспособность клеток, его использовали в большинстве раскрытых в настоящем описании экспериментов.

Синтезировали ίη νίίτο мРНК люциферазы, содержащую различные 5'-терминальные кэп-структуры и 3'терминальный 60-ηί поли(А) участок (Ъис-Аб₀). После нуклеопорации клетки отбирали либо с интервалами до 90 мин для измерения трансляционной эффективности, используя скорость увеличения активности люциферазы; либо до 8 ч для измерения стабильности мРНК люциферазы с помощью ПЦР в реальном времени. Определение трансляционной эффективности и стабильности мРНК могло бы быть ошибочным, если бы мРНК были получены из клеток, содержащих как транслируемые, так и нетранслируемые мРНК. Для решения этой проблемы была определена скорость деградации общей цитоплазматической мРНК относительно полисомной мРНК. мРНК люциферазы, кэпированную т^^ОрЮ, подвергали нуклеопорации в клетках ИС11, которые затем лизировали через различные промежутки времени и наслаивали на градиент сахарозы для отделения полисом от комплексов инициации. Полисомные фракции объединяли и РНК очищали. Для последующей цитоплазматической деградации мРНК использовали мРНК, выделенную из общих клеточных экстрактов. В обоих случаях количественное определение мРНК люциферазы проводили с помощью ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров, направленных противоположно 5'концу мРНК люциферазы.

Транскрипты, ассоциированные с полисомами, разрушались примерно с той же скоростью, что и общая цитоплазматическая мРНК (данные не показаны). Это предполагает, что, даже при наличии в любой момент времени как транслируемых, так и нетранслируемых пулов мРНК люциферазы, между ними происходит свободный обмен мРНК. Это наблюдение подтверждает измерения трансляционной эффективности и скорость деградации.

После нуклеопорации в клетках ИС11 определяли стабильность Ьис-А₆₀, кэпированного различными 8-ЛК.СЛ. Остававшуюся мРНК определяли с помощью ПЦР в реальном времени через различные промежутки времени. Ьис-А₆₀, кэпированный пъ^’Орр.рО (Ό2), был более стабильным (ί_1/2=257 мин) по сравнению с мРНК, кэпированной любой природной кэп-структурой, т⁷Ор3О (ί1/2=86 мин), или родительского соединения, ш^’^ОрЮ (ί1/2=155 мин) (фиг. 7 и табл. 2). Это предполагает, что увеличение стабильности мРНК является результатом устойчивости к гидролизу Эср1/0ср2. Ни т2^{7,2 -,}°Сррр?,С (Ό1) (ί_1/2=169 мин), ни пъ^’Орр.рО (Ό1) (ί_1/2=185 мин) не придавала значительно большей стабильности, чем т₂ ^7,2' ^-Юр3О (ί1/2= 155 мин) (табл. 2). Примечательно то, что аффинность к е1Р4Е, как у т^'^ОрррЦ (Ό1), так и у пъ^’Орр.рО (Ό1), была в 3 раза выше, чем у т2^{7,2 -}Юр3О. Если бы гипотеза о конкуренции между Эср1/0ср2 за е1Р4Е была бы верной, то можно было бы ожидать, что мРНК, копированная этими аналогами, была бы более стабильной. См. Е. Оги^сп еί а1., ^^ΓΓе^еηί^а1 ίηΐιίόίΐίοη οΓ тКУЛ άед^аάаί^οη ра(11\тау5 Ьу ηονе1 сар аηа1οд8, I. Βίο1. Сйет., νο1. 281, рр.1857-1867 (2006). У мРНК, копированной этими аналогами, не наблюдалось увеличения ни стабильности, ни трансляционной эффективности (см. ниже). Это может указывать на то, что, хотя пъ^’ОрррЮ (Ό1) и пъ^’ОррцэО (Ό1) связываются с е1Р4Е более сильно, существует верхний предел, после которого высокая аффинность к е1Р4Е не ускоряет трансляцию в целом. Согласно этой интерпретации, когда скорость связывания кэп-структуры становится достаточно высокой, какая-то другая стадия в инициации синтеза белка становится ограничивающей скорость.

Пример 20. Трансляционная эффективность кэпированной 8-ЛКСЛ мРНК люциферазы в клетках НС11

Для кэпированной с 8-ЛКСЛ мРНК люциферазы также определяли трансляционную эффективность в культивируемых клетках. Такое определение включало два измерения, которые проводились через различные промежутки времени после нуклеопорации - активность люциферазы измеряли с помощью люминометрии в очищенных клеточных лизатах, а уровни Ьис-А₆₀ измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Активность люциферазы нормализовали с помощью количества мРНК люциферазы, которая была доставлена в клетки. Для определения количества находящейся в клетках РНК сразу после нуклеопорации, т. е. до того как произойдет какое-либо разрушение, клетки отбирали через различные промежутки времени в пределах от 2 до 8 ч после нуклеопорации и экстрагировали цитоплазматическую РНК. Количество мРНК люциферазы измеряли с помощью ПЦР в реальном времени, используя праймеры, которые амплифицировали последовательности около 5'-конца. Для определения, ΐ'/₂ мРНК люциферазы количество ее, определенное для каждой временной точки, отображали на графике зависимости ^дюЦРНК]) от времени. Кривую экстраполировали к 0 ч и вычисляли количество доставленной в клетки РНК. Определяли условия, при которых накопление люциферазы находилось в линейной зависимости от времени, после начального ~30-минутного периода задержки поступления мРНК к рибосомам, заканчивавшим первую полипептидную цепь, и выхода люциферазы в цитозоль.

мРНК Рис-Л^,, кэпированная пъ^Юрр^.О (Ό1) и т^^'^Орр^рО (Ό2), транслировалась в 2,8- и 5,1

- 12 017740 раз, соответственно, более эффективно, чем т^7Ср3С-кэпированная мРНК (фиг. 8 и табл. 2). Что касается бесклеточной трансляции в системе лизата ретикулоцитов кролика, мРНК Ьис-А®, копированные т2^2-оСр]э,рС (01) и т2^2оСррр,С (02) транслировались только в 2,3-раза более эффективно, чем мРНК Ьис-А60, кэпированная т⁷Ср3С (данные не показаны). Такое различие предполагает, что увеличение трансляционной эффективности в культивируемых клетках связано с более высокой стабильностью мРНК (что не является фактором для систем бесклеточной трансляции), поскольку только мРНК, кэпированная устойчивыми к Юср2 аналогами, транслировалась более эффективно.

Таблица 2. Трансляционная эффективность и стабильность мРНК люциферазы с фосфоротиоатными аналогами кэп-структуры в клетках НС 11

№	Тип кэп-структуры в мРНК люциферазы	[М-4]’ для кэп -е№4Е	восприимчивость*1 Вср2	Время полужизни иРНК(мин)с	Относительная трансляционная эффективность1*
1	т70р3С	9,4 ± 0,8	ΝΟ	86± 1*	1,00
2	т2 7'2’-°Ср3С	10,8 ±0,3	100	155 + 9	2,1 ±0,2
3	т2 7,2’°ОрррзС (О1)	34,3 ± 1,3	96	169+19	2,5 ±0,8
4	т2 7·2 οΟρρρ8Ο (02)	12,9 ±0,9	98	164+1	1,8 ±0,4
5	т,7’2’’<?Орр3рС (О1)	42,1 ± 1,6	71	185 ±22	2,8 ±0,3
6	тг’^'ЦэррзрС (02)	18,3 ±3,4	6 1	257 ±4*	5,1 ±0,5
7	Ш27,2'^СрвррО ,(О1)	19,3 ± 1,8	'84’	149 ±9	2,0 ±0,1
8	т2 7'2’°Ор8ррС (02)	15,4 ± 0,5	91	139 + 6	1,9 ±0,1

^аРавновесные константы ассоциации для взаимодействия мышиной е1Р4Е (аминокислоты 28-217) с различными аналогами кэп-структуры при 20°С. Мышиную е1Е4Е (остатки 28-217) экспрессировали в Е. со11, и титрование синхронизированной по времени флуоресценции выполняли, как описано в 1. 2иЬетек е! а1., Р1ю5р1югу1а1юп оГ е1Е4Е а11еииа1е5 ίΐδ тТетасбои νίΐΐι тКЫА сар аиа1о§5 Ьу е1ес1гоЧа11с гершюи: 1и1е1и-теб1а1еб ргоТеш йдабои Чга1еду Ю оЫаш р1ю5р1югу1а1еб ртоТет, ΚΝΑ, уо1. 9, рр. 52-61 (2003) и А. №ебх\т1еска е! а1., Вюрйу81са1 йиФез оГ е1Е4Е сар-Ьшбтд ргоТет: гесодпйюи оГ ιηΡΝΑ 5' сар ЧгисШге апб 5уп111ебс Ггадтеи15 оГ е1Е4С аиб 4Е-ВР1 ргоТетз, 1. Мо1. Вю1., уо1. 319, рр. 615-635 (2002).

^Ь Данные, приведенные на фиг. 4, использовали для оценки восприимчивости олигонуклеотидов, кэпированных различными аналогами, к гидролизу с помощью Юср2. Радиоактивности в пиках элюции через 44 мин (нерасщепленная кэп-структура) и 38 мин (рСр*) корректировали относительно фоновой радиоактивности и суммировали для получения полной радиоактивности в кэп-структуре. Восприимчивость к Эср2 получена из радиоактивности в рСр*, выраженной в процентах от общего значения. (N0) Не определено.

^сДеградацию 5'-терминальных последовательностей в мРНК Еис-А₆₀, кэпированных указанными аналогами, определяли с помощью ПЦР в реальном времени, используя праймеры, направленные противоположно 5'-концу мРНК люциферазы.

^б Показана трансляционная эффективность мРНК Ьис-А₆₀, кэпированных указанными аналогами кэп-структуры, в клетках НС11. Активность люциферазы нормализована количеством РНК люциферазы в клетках. Относительную трансляционную эффективность вычисляли, как описано у 1. 1ет1е1йу е! а1., №ме1 'аибтеуегае' сар аиа1одие8 νί(Η щрепог 1гаи81а1юиа1 рторетйек ΒΝΑ, уо1. 9, рр. 1108-1122 (2003).

*Указано время полужизни, которое значимо отличается (р<0,05) от времени полужизни мРНК, кэпированной т₂ ^7,2'-оСр₃С.

Пример 21.

Кэпированная 8-АКСА мРНК люциферазы более эффективно поступала в полисомы в клетках НС11.

Для доказательства наблюдения того, что т₂ ^2-оСрр_?,рС-кэпированные мРНК транслируются более эффективно, был использован независимый способ, а именно их полисомное распределение (фиг. 9А9Е). Увеличение скорости инициации относительно элонгации или терминации приводит к перемещению мРНК от более легких к более тяжелым полисомам. См. Н. ЬобЦИ, Мобе1 Гог 111е гещбабоп оГ т^А ЦшМабоп аррПеб 1о НаетоЦоЬт куиШекЦ, №1иге, уо1. 251, рр. 385-388 (1974). Не ожидалось, что тип структуры кэпа повлияет на скорость удлинения. Таким образом, перемещение к более тяжелым полисо

- 13 017740 мам указывает на более быструю инициацию.

мРНК Ьис-Лбо, копированная т₂ ⁷Ср3С, т2^7,2'^-оСр3С или т₂ ⁷’²'^_о Срр8рС (Ό2), была подвергнута электропорации в клетки НС11. Эти клетки лизировали через 4 ч после электропорации и очищенные супернатанты наслаивали на градиент сахарозы для отделения полисом от комплексов инициации. мРНК люциферазы преобладала в полисомах (фиг. 9А и 9В, фракция 6-11), хотя некоторое количество находилось также и в области комплексов инициации (фракция 3-5). Небольшое количество мРНК люциферазы присутствовало в пуле комплексов нетранслируемых матричных рибонуклеопротеинов (мРНП) (фиг. 9А и 9В, фракция 1-2). мРНК, копированная стандартным АКСА, т2^7,2'^-оСр3С, переместилась к более тяжелым полисомам (фиг. 9С). Однако мРНК, копированная т₂ ^7,2'^-0 Срр,рС (Ό2), переместилась к еще более тяжелым полисомам и одновременно с этим пропала из области мРНП (фиг. 9В). В таких же экспериментальных условиях эндогенная мРНК СЛРЭН транслировалась эффективно (фиг. 9Е), хотя некоторое количество также осело в области комплексов инициации. В целом, согласно данным результатам можно предположить, что наличие ш₂ ^:-оСрр,рС (Ό2) на 5'-конце транскриптов люциферазы увеличивает их скорость инициации, что подтверждает результаты, основанные на накоплении активности люциферазы.

Пример 22. Комбинация более высокой стабильности и более высокой трансляционной эффективности 8-АКСА-кэпированной мРНК люциферазы обеспечивает более полную экспрессию белка в клетках НС11

Также определяли общее накопление люциферазы по измерению по ферментативной активности в виде функции от времени для мРНК, кэпированной т₂ ^7,2'^-оОр3О, т2^2оСрр,рС (Ό1) и т2 ^{2 о}Срр?,рС (Ό2). Клетки НС11 подвергли нуклеопорации и затем лизировали в различные моменты времени вплоть до 10 ч. Измеренную в супернатанте активность люциферазы нормализовали на количество Ьис-А60, доставленной в клетки. Как показано на фиг. 10, активность люциферазы в клетках НС11 достигла максимального уровня через 3 ч, а затем в целом за 10 ч уменьшилась в 10. Кинетики экспрессии согласуются с временем полужизни белка люциферазы, которое составляет примерно 180 мин (см. 1. ТНотрюп с1 а1., Моби1айоп оГ йгейу 1ис|Гсга5С 8(аЫ1йу апб 1трас1 оп йиЛек оГ депе гедц1айоп, Оепе, уо1. 103, рр. 171-177 (1991)), и временем полужизни различных мРНК люциферазы, которое составляет 155, 185 и 257 мин, соответственно. Максимальное накопление люциферазы наблюдали для Ьис-А60, кэпированной т2^2оСрр?,рС (Ό2), которая обладала как самой высокой трансляционной эффективностью, так и самой высокой стабильностью. Теоретически ожидается, что увеличение в общей экспрессии белка от мРНК, кэпированной этим аналогом, будет еще большим для белков, имеющих более длительное время полужизни.

Пример 23. Аффинность связывания с е1Е4Е

Значения К_А8 и свободной энергии связывания ( ΔΟ°) для 8-аналогов приведены в табл. 3 вместе с аналогичными данными для их немодифицированных родительских соединений. Необычным является то, что наличие фосфоротиоатной группы не только не снижает аффинность связывания с е1Е4Е, но в некоторых случаях аффинность значительно увеличивается. Значения К_А8 находятся в сильной зависимости как от положения фосфоротиоатной модификации, так и от абсолютной конфигурации вокруг асимметричного Р-центра. Интересен тот факт, что в каждой паре диастереомеров элемент Ό1 связывается с е1Е4Е с аффинностью, которая в 2,3-4,5 раз выше аффинности элемента Ό2 или родительского аналога. Например, в случае т₂ ^7,2'^-оСр8ррС, КА8 для изомера Ό1 в 3 раза выше, чем для Ό2 или т2^7,2'^-оОрррО. Аналогично, в случае т2^7,2'^-оСрр₈рС, К_А8 для изомера Ό1 в 2 раза выше, чем для Ό2, и в 4,5 раза выше, чем для т₂ ^7,2'^-оОрррО. Самые большие различия в аффинностях связывания между диастереомерами Ό1/Ο2 наблюдали для γмодифицированных аналогов. С другой стороны, самые большие различия между модифицированными и немодифицированными парами наблюдали для β-замещенных аналогов.

- 14 017740

Таблица 3. Равновесная константа ассоциации (КА8) и свободная энергия связывания ( ΔΟ°) для связывания мышиного е1Б4Е (28-217) с фосфоротиоатными аналогами кэп-структуры, как определено путем подавления флуоресценции

Аналог кэп-структуры Δ<7° ' ккал/моль

	тОрррб	9,4 ±0,4	-9,35 ±0,02
1а	т’ОрррзС (01)	23,6 ±0,8	-9,88 ±0,02
1Ъ	т7Оррр3О (02)	13,1 ±0,8	-9,54 ± 0,03
2а	т’Оррзрб (Ц1)	45,0 ± 1,1	-10,26 ±0,01
2Ъ	т7Срркр<3 (Р2)	23,0 ± 0,4	-9,87 ±
За	т7Ср5рр6 (В1)	30,8 ±0,5	-10,04 ±
зь	т СфзРрС! (02)	10,0 ±0,2	-9,39 ±0,01
	т7,2 °СрррС	10,8 ± 0,3	-9,43 ±
4а	т’м<Эррр80 (О1)	19,2 ± 0,8	-9,76 ±
4Ъ	т7,2'°СрРр8С (02)	15,0 ±0,6	-9,62 ±
5а	т’·2’ °Срр8рО '01)	43,1 ± 1,4	-10,23 ±0,02
5Ь	т’·2 °Срр8рС (02)	19,3 ±2,2	-9,77 ±
6а	т7,3’°Ор8РрО (ϋ 1)	35,2± 1,1	-10,12 ±
6Ъ	т7'2 '°СрзРрС (02)	12,9 ±0,4	-9,53 ±
	т72’°6ррррС	99,8 ± 6.0	-

**Определено для смеси диастереомеров.

Пример 24. Восприимчивость к ферментативному гидролизу, проводимому с помощью Эср8 человека и С. е1едапк

Новые виды 8-аналогов были подвергнуты ферментативному гидролизу ш νίΙΐΌ, катализируемому Эср8 как человека, так и нематоды С. е1едапк. Во всех экспериментах соответствующий немодифицированный аналог кэп-структуры использовали в качестве положительного контроля, т.е. т⁷СрррС для неАКСА 8-аналогов и т₂ ^7,2' ^-оСрррС для 8-АКСА. Количество фермента Эср8 оптимизировали для обеспечения полной деградации контрольного субстрата в течение 40-90 мин. Образцы, отобранные из реакционных смесей через различные промежутки времени, анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами (как описано в разделе Материалы и способы).

В табл. 4 аналоги кэп-структуры с концентрацией 4 мкМ были подвергнуты ферментативному расщеплению, катализируемому Эср8, в условиях, приводящих к полной деградации немодифицированного родительского соединения (т.е. т⁷СрррС для не-АКСА 8-аналогов и т₂ ^7,2'^-оСрррС для АКСА) в течение 40-90 мин. Образцы, отобранные из реакционных смесей в различные моменты времени, анализировали с помощью ВЭЖХ с обращенными фазами с использованием УФ-детектирования при 260 нм, как описано в разделе Материалы и способы. В табл. 4 аналоги, обозначенные как устойчивые, в применявшихся условиях оставались полностью нерасщепленными, тогда как аналоги, обозначенные как гидролизованные, были гидролизованы Эср8 с эффективностью, сравнимой с соответствующим немодифицированным родительским соединением. Было обнаружено, что 8-аналоги, модифицированные в γ-положении, были устойчивыми к гидролизу независимо от абсолютной конфигурации Р-центра (табл. 4). Результат не изменился даже при увеличении времени реакции до 24 ч, при этом использовали различное количество фермента и модифицировали состав реакционного буфера. Все другие 8-аналоги были гидролизованы 11Эср8 с эффективностью, сравнимой с эффективностью немодифицированного родительского аналога. Что касается гидролиза 8-аналогов, катализируемого Эср8 человека и нематоды С е1едап8, никаких существенных отличий не наблюдалось.

Анализ продуктов катализируемой Эср8 деградации модифицированных в α-положении аналогов позволил определить их абсолютную конфигурацию в области асимметричных Р-центров. Было обнаружено, что катализируемый Эср8 гидролиз либо т⁷Сррр8С (01), либо т⁷Сррр8С (02) приводит к т⁷СМР и либо Ό1, либо Ό2 изомеру гуанозин 5'-О-(1-тиодифосфату) (СОРа8), тогда как гидролиз либо т2^7,2'^-оСррр8С (01), либо т₂ ^7,2'^-о6ррр₈6 (Ό2) приводит к т₂ ^7,2'^-оСМР и либо к Ό1, либо Ό2 изомеру СОР а8 (данные не показаны).

- 15 017740

Таблица 4. Восприимчивость 8-аналогов к ферментативному гидролизу, катализируемому Бср8 (человека и С.екдаик) ш νίΙΐΌ

Устойчивость к ферментативному гидролизу, катализируемому бсрЗ (человека и С.е1едапз)

Аналог кэп-структуры Аналог кэп-структуры

	пт7<ЗрррС	гидролизованный,;	т2 7,2’ ·°ΟρρρΟ	гидролизованный
1а	т 'Сррр8й (01)	гидролиза ванный	4а	т2 7-2'°6рррзС (ϋΐ)	гидролизованный
1Ь	т’Сррр^О (02)	гидролизе ванный	4Ь	т,7 'о6ррр8О (02)	гидролизованный
2а	т7Срр8р6 (01)	гидролиза ванный	5а	т2 7’2'°Орр3рС (О1)	гидро л изо ванный
2Ь	т7СррзрО (02)	гидролизе ванный	5Ь	т2 7'2’°Орр8рС (Ώ2)	гидролизованный
За	т'Ср8ррС (ϋ 1)	устойчивый	ба	т27'2ОСр8ррО (О1)	устойчивый
ЗЬ	т'СркррО (02)	устойчивый 1	6Ы	т2’-'°<±р8рр0 (02)	устойчивый

Пример 25. Аналоги кэп-структуры как ингибиторы кэп-зависимой трансляции

Способность новых 8-аналогов ингибировать кэп-зависимую трансляцию оценивали в системе лизата. ретикулоцитов кролика, настроенной на природную мРНК глобина кролика. Из 12-ти 8-аналогов выбрали два, модифицированные в γ-положении, т⁷Ср8ррС (Ό1) и т⁷Ср8ррС (Ό2), поскольку было обнаружено, что они являются устойчивыми к Бср8 и более стабильными ш νί\Ό. Данные по ингибированию трансляции фитировали теоретической кривой, которая описывает кап-зависимую трансляцию в виде функции зависимости связывания мРНК от ингибитора (Са1 е! а1. 1999). Это позволило определять Κι, концентрацию аналога кэп-структуры, при которой кэп-зависимая трансляция подавляется на 50% (табл. 5). Было обнаружено, что оба 8-аналога ингибировали кэп-зависимую трансляцию лучше, чем т⁷СрррС, что является дополнительным свидетельством того, что фосфоротиоатная группа в целом стабилизирует взаимодействие кэп-е1Р4Е. Кроме того, т⁷Ср₈ррС (Ό1) оказался значительно более сильным ингибитором, чем его вариант Ό2 (Κ_Σ=4,1 ±0,2 мкМ против К|=12,1 ±3,2 мкМ), что соответствует его более высокой аффинности связывания с е1Р4Е (К_А8=30,8 ± 0,5 против К_А8=10,0 ± 0,2).

Таблица 5. Константа ингибирования (К|) для ингибирования кэп-зависимой трансляции с помощью γмодифицированных 8-аналогов в системе трансляции в лизате ретикулоцитов кролика

	Аналог кэп-структуры	мкМ л
	ιτιΰρρρΟ	17,1 ±2,5
За	т 'ОрйррС (О1)	>4,1 ±0,2
ЗЬ	т7ОрзррО (02)	12,1 ±3,2

Пример 26. Копированные 8-АКСА фрагменты мРНК в качестве 1и тй'о ингибиторов кэпзависимой трансляции

В будущем 8-АКСА, особенно трифосфаты, у которых фосфоротиоатная модификация происходит в γ-положении, такие как соединения 6а и 6Ь в примере 17, могли бы использоваться в качестве ингибиторов кэп-зависимой трансляции. Документально подтверждено, что кэп-зависимая трансляция активирована в раковых клетках и подавление е1Р4Е приводит к реверсии злокачественного фенотипа. Фрагменты, получающиеся в результате 3'^5' деградации кэпированных мРНК, вероятно, теряют кэпструктуру при достижении длины менее 25 нуклеотидов до того, как произойдет их полная деградация до нуклеотидов.

Предполагается, что такие фрагменты, копированные трифосфатными 8-АКСА, содержащими фосфоротиоатную модификацию в γ-положении, являются устойчивыми к Иср8, аналогично тому, что было показано для самих динуклеотидов кэп-структуры (см. табл. 4 выше). Таким образом, предполагается, что они накапливаются в клетке и конкурируют с нормальными мРНК за участие в механизме трансляции. Авторами изобретения предлагается ввести в культивируемые клетки мРНК или фрагменты мРНК, кэпированные трифосфатными. 8-АКСА, замещенными в γ-положении (соединения 6а и 6Ь в примере 17). Затем предлагается сравнить кэп-зависимую трансляцию с кэп-независимой трансляцией, используя репортерные конструкции. В результате ожидается, что предпочтительно ингибируемым бу

- 16 017740 дет первый тип трансляции. Необходимо отметить, что необходима модификация АВСА для правильной ориентации этих 8-АВСА при встраивании в мРНК, поскольку в ином случае фосфоротиоатная группа не будет находиться в правильном положении, требуемом для придания фрагменту мРНК устойчивости к Иср8.

Аналогичным образом предлагается проанализировать тетрафосфатные 8-АВСА, в качестве потенциальных ингибиторов кэп-зависимой трансляции. Предполагается, что тетрафосфатные 8-АВСА, в особенности содержащие δ-фосфоротиоатную группу, не будут подвергаться катализируемому Иср8 гидролизу в физиологических условиях и будут ингибировать кэп-зависимую трансляцию.

Пример 27.

В формуле изобретения определены все комбинации фосфоротиоатной модификации динуклеотидов трифосфатных и тетрафосфатных аналогов кэп-структуры, аналогичных перечисленным ниже. Модификация остатка рибозы у т⁷Сио представляет собой 2'-дезокси, 3'-дезокси, арабинозу, 2'-О-этил и 3'О-этил. Модификация 7-заместителей Г представляет собой метил, этил, пропил, бутил, бензил, замещенный бензил, нафтилметил, замещенный нафтилметил и другие замещенные или незамещенные С1С10 алифатические или ароматические группы.

Модификация остатка гуанина заключается в использовании аденина, уридина, цитозина или т⁷С. Эти различные модификации могут быть синтезированы, как раскрыто в настоящей заявке, и заимствованы из способов, известных в данной области техники, например публикации заявки на патент США 2003/0194759.

η Соединение

Л т₂''^кС_РзРРС т/^л(фр₃рС т₂ ^7ЛСр₃ррС пц^СраррзС т₂ ^7ЛСрр₅р₃С т₂ ^7КСр₃ррзО т;^7К0р_зрхр.,0 т₂ ^7[1Ср₃рррО т₂ ^7ЯСр₃ррр0 т₂ ⁷’^кСр₈ррр(3 т₂ ^7АСр₃рррС т₂ ^7,кСр₃р₃ррО т₂ ⁷’^кОр₃рр_5рО т₂ ^7,кСрзрррзС т₂ ^7ЛОрр₃р₅рС тг’ЩррзррзС т₂ ⁷’^кСрррзрзО т₂ ⁷'^кС_Рз_Рз_РзрС т₂ ^7КСр₃р_дрр₃С

1П₁ ^/7''С_РЯРРяр_яС1 т₂ ^7,к<3_РРзр_зРзО тг’^СрзрзРзРкО

Υι γ₂ γ₃ Υ4 ~5 δδ ρ 8 Ο0 0 88 088 8 00 888 8 88 0 00

8 00

0 80

Ο '0 Ο8

8 00

0 80

0 08

0· 8 8Ο

8 08

0 88

8 80

8 08

0 88

8 88

8 88

Все процитированные в настоящем описании документы полностью включены в него посредством ссылок. Также посредством ссылки полностью включены приведенные ниже публикации работ самих авторов изобретения, которые не являются предшествующим уровнем техники по отношению к настоящей заявке: I. Ко^а1кка еί а1., 8уп(Нек1к апй скагаЛеп/акоп, о! тВИА сар апа1одк согИайппд р1окр1юго11ноа1е кыЬкШыПопк 11а1 Ыпй 11дЬ(1у !о е1В4Е апй аге гек1к(ап1 !о (Не йесарршд ругор1юкр11а1аке Иср8, ВИА, νο1. 14, рр. 1119-1131 (2008); Е. Сгий/1еп-Иода1кка еί а1., Р1юкр1юго11ноа1е сар апа1одк к1аЬ1Нхе тВИА апй шсгеаке 1гапк1а(1опа1 е!йс1епсу ш таттаНап се11к, ВИА, νο1. 13, рр. 1745-1755 (2007) и Е. Иаг/упк1е^1с/ еί а1., МеШу1епе апй ркοкркο^οίк^οаίе сар ййшс1еокйек: ике!и1 1оо1к !о йнйу йесарршд апй капк1акоп, реферат и постер, представленные на ВИА Меекпд, 8еай1е, ^акЫпдоп, кше 20-25, 2006. Однако в случае возникновения любого конфликта и противоречий следует руководствоваться настоящим описанием.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, имеющее общую структуру

   К2 К1 где каждый Υ выбирают из группы, состоящей из О и δ;

   разные Υ могут быть одинаковыми или различающимися и по меньшей мере один Υ представляет собой δ;

   К1 выбирают из группы, состоящей из Н, ОН, ОСН₃ и ОСН₂СН₃;

   К2 выбирают из группы, состоящей из Н, ОН, ОСН₃ и ОСН₂СН₃;

   п равно 3 или 4 и, если К1 представляет собой ОН, то К2 не является ОН;

   В выбирают из группы, состоящей из гуанина, аденина, уридина, цитозина; и

   X выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, бензила, замещенного бензила, нафтилметила, замещенного нафтилметила и других замещенных или незамещенных С1-С10 алифа тических или ароматических групп, при этом указанное соединение характеризуется следующими свойствами:

   если указанное соединение включено в молекулу РНК на 5'-конце, причем молекула РНК содержит открытую рамку считывания, и если молекула РНК введена в клетки в условиях, способствующих трансляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания, то получаемая экспрессия белка ίπ у1уо выше, чем экспрессия белка ίπ у1уо, которую можно было бы получить любым другим аналогичным способом, в котором каждый Υ представляет собой атом кислорода и в котором ни один из Υ не является атомом серы.
2. 2. Соединение, имеющее общую структуру

   К2 где каждый Υ выбирают из группы, состоящей из О и δ;

   разные Υ могут быть одинаковыми или различающимися и по меньшей мере один Υ представляет собой δ;

   К1 выбирают из группы, состоящей из Н, ОН, ОСН₃ и ОСН₂СН₃;

   К2 выбирают из группы, состоящей из Н, ОН, ОСН₃ и ОСН₂СН₃;

   п равно 3 или 4 и, если К1 представляет собой ОН, то К2 не является ОН;

   В выбирают из группы, состоящей из при этом указанное соединение характеризуется следующими свойствами:

   если указанное соединение включено в молекулу РНК на 5'-конце, причем молекула РНК содержит открытую рамку считывания, и если молекула РНК введена в клетки в условиях, способствующих трансляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания, то получаемая экспрессия белка ш у1уо выше, чем экспрессия белка ш у1уо, которую можно было бы получить любым другим аналогичным способом, в котором каждый Υ представляет собой атом кислорода и в котором ни один из Υ не является атомом серы.
3. 3. Соединение, имеющее общую структуру

   - 18 017740 где каждый Υ выбирают из группы, состоящей из О и δ;

   разные Υ могут быть одинаковыми или различающимися и по меньшей мере один Υ представляет собой δ;

   К1 выбирают из группы, состоящей из Н, ОН, ОСН3 и ОСН2СН3;

   К2 выбирают из группы, состоящей из Н, ОН, ОСН3 и ОСН2СН3;

   η равно 3 или 4 и, если К1 представляет собой ОН, то К2 не является ОН.
4. 4. Соединение, имеющее общую структуру где каждый Υ выбирают из группы, состоящей из О и δ;

   разные Υ могут быть одинаковыми или различающимися и по меньшей мере один Υ представляет собой δ;

   η равно 3 или 4 и

   В выбирают из группы, состоящей из гуанина, аденина, уридина, цитозина;

   X выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, бензила, замещенного бензила, нафтилметила, замещенного нафтилметила и других замещенных или незамещенных С1-С10 алифатических или ароматических групп, при этом указанное соединение характеризуется следующими свойствами:

   если указанное соединение включено в молекулу РНК на 5'-конце, причем молекула РНК содержит открытую рамку считывания, и если молекула РНК введена в клетки в условиях, способствующих трансляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания, то получаемая экспрессия белка ίη νίνο выше, чем экспрессия белка ίη νίνο, которую можно было бы получить любым другим аналогичным способом, в котором каждый Υ представляет собой атом кислорода и в котором ни один из Υ не является атомом серы.
5. 5. Соединение, имеющее общую структуру где каждый Υ выбирают из группы, состоящей из О и δ;

   разные Υ могут быть одинаковыми или различающимися и по меньшей мере один Υ представляет собой δ;

   и равно 3 или 4;

   X выбирают из группы, состоящей из метила, этила, пропила, бутила, бензила, замещенного бензила, нафтилметила, замещенного нафтилметила и других замещенных или незамещенных С1-С10 алифатических или ароматических групп, где разные X могут быть одинаковыми или различающимися, при этом указанное соединение характеризуется следующими свойствами:

   если указанное соединение включено в молекулу РНК на 5'-конце, причем молекула РНК содержит открытую рамку считывания, и если молекула РНК введена в клетки в условиях, способствующих транс

   - 19 017740 ляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания, то получаемая экспрессия белка 1п у1уо выше, чем экспрессия белка 1п у1уо, которую можно было бы получить любым другим аналогичным способом, в котором каждый Υ представляет собой атом кислорода и в котором ни один из Υ не является атомом серы.
6. 6. Соединение, имеющее общую структуру где каждый Υ выбирают из группы, состоящей из О и 8;

   разные Υ могут быть одинаковыми или различающимися и по меньшей мере один Υ представляет собой 8;

   п равно 3 или 4.
7. 7. Соединение, выбранное из группы, состоящей из т₂ ^7,2'^-оСрркрС; т2^7,3'^-оСрркрС; т₂ ^7,2'^-оСррркрС; т2^7,3'^оСррркрС; т2^7,2'^-оСрркррС; т2^7,3'^-оСрркррС; т2^7,2'^-оСркркрС; т2^7,3'^-оСркркрС; т2^7,2'^-оСрркркС; т2^7,3'^-оСрркркС; Ьп⁷т²'^-оСрркрС; Ьп⁷т³'^-оСрркрС; Ьп⁷т²'^-оСррркрС; Ьп⁷т³'^-оСррркрС; Ьп⁷т²'^-оСрркррС; Ьп⁷т³'^-оСрркррС; Ьп⁷т²'^-оСркр_крС; Ьп⁷т³'^-оСркркрС; Ьп⁷т²'^-оСрркр_кС и Ьп⁷т³'^-оСрр_кр_кС.
8. 8. Соединение по любому из предшествующих пунктов, где указанное соединение представляет собой, по существу, один стереоизомер.
9. 9. Соединение по любому из пп.1-7, где указанное соединение представляет собой смесь по меньшей мере двух диастереомеров, первого диастереомера и второго диастереомера, причем указанные первый и второй диастереомеры являются идентичными за исключением того, что указанные первый и второй диастереомеры имеют разные стереохимические конфигурации у хирального атома фосфора, при этом указанный хиральный атом фосфора представляет собой атом фосфора, который связан с атомом серы.
10. 10. Молекула РНК, 5'-конец которой включает соединение по любому из пп.1-7.
11. 11. Способ синтеза 1п уйто молекулы РНК по п.10, где указанный способ включает проведение реакции между АТФ, ЦТФ, УТФ, ГТФ, указанным соединением и полинуклеотидной матрицей в присутствии РНК-полимеразы, в условиях, способствующих транскрипции с помощью указанной РНКполимеразы полинуклеотидной матрицы в РНК-копию, посредством чего некоторые копии РНК могут включать указанное соединение для получения указанной молекулы РНК.
12. 12. Способ синтеза 1п уйто белка или пептида, где указанный способ включает трансляцию молекулы РНК, определенной в п.10, в бесклеточной системе синтеза белка, причем молекула РНК содержит открытую рамку считывания, в условиях, способствующих трансляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания.
13. 13. Способ синтеза 1п у1уо белка или пептида, где указанный способ включает введение в клетки молекулы РНК по п.10, где молекула РНК содержит открытую рамку считывания, в условиях, способствующих трансляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания.
14. 14. Соединение по любому из пп.1-7, где п равно 3 и указанное соединение содержит βфосфоротиоатную группу или где п равно 4 и указанное соединение содержит γ-фосфоротиоатную группу, и где указанное соединение не гидролизуется с помощью Эср2 в физиологических условиях.
15. 15. Соединение по любому из пп.1-7, где п равно 3 и указанное соединение содержит γфосфоротиоатную группу или где п равно 4 и указанное соединение содержит 5-фосфоротиоатную группу, и где указанное соединение не гидролизуется с помощью Эср2 в физиологических условиях и указанное соединение ингибирует кэп-зависимую трансляцию.
16. 16. Способ синтеза ш у1уо белка или пептида, где указанный способ включает введение в клетки молекулы РНК, 5'-конец которой включает соединение по п.14, причем молекула РНК содержит открытую рамку считывания, в условиях, способствующих трансляции открытой рамки считывания молекулы РНК в белок или пептид, кодируемый открытой рамкой считывания, где скорость трансляции 1п у1уо по меньшей мере в два раза выше скорости трансляции 1п у1уо, которую можно было бы получить любым другим аналогичным способом, в котором каждый Υ представляет собой атом кислорода и в котором ни один из Υ не является атомом серы.