CN117999355A - 体外转录技术 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于体外转录反应，特别是用于生产药物级RNA，并且在一些实施方案中用于大规模生产的技术。

Description

体外转录技术
背景技术
特别是考虑到其作为治疗方式的日益增加的重要性，用于制造RNA的技术非常重要且很有价值。
发明内容
本公开提供了与用于制造RNA、特别是治疗性RNA(例如，治疗性mRNA)的技术相关的某些见解。在一些实施方案中，当用于例如治疗级RNA的大规模生产时，所提供的技术特别有用，和/或提供令人惊讶的益处和/或优点。
例如，本公开提供了关于体外转录(IVT)反应混合物中特别有用的胞苷三磷酸(CTP)和/或腺苷三磷酸(ATP)浓度的见解(例如，在初始反应混合物中，本领域技术人员应理解，NTP在反应过程中被利用，因此它们的浓度随着时间的推移而降低，除非补充)。
在一些实施方案中，本公开提供了改善RNA产率、RNA完整性、RNA加帽水平和/或效率中的一个或多个的技术；可替代地或另外地，在一些实施方案中，本公开提供了降低一种或多种污染物或异常产物(例如，dsRNA)的水平的技术。
在一些实施方案中，本公开提供了独立于反应中产生的RNA转录物的序列而有用的IVT反应条件(例如，反应混合物中的核苷酸浓度)。
本公开涵盖了对通过IVT产生RNA的问题的认识，特别是在大规模(例如，商业规模)上。除其他之外，本公开确定，以高产率和/或完整性和/或低异常产物(例如，双链RNA(dsRNA))水平产生体外转录的RNA可能具有挑战性。本公开特别认识到，在产生治疗性(例如，用于施用于动物，特别是人)RNA(例如，mRNA)时，尤其是在商业规模上(例如，0.1-10g、10-500g、500g-1kg、750g-1.5kg；本领域技术人员将认识到，不同的产品可以不同的规模制造，例如，取决于患者群体大小)和/或以药品质量(这通常可能更难以实现，例如，在较大规模上，例如因为污染物和/或完整性问题在此类规模上可能更加明显)，此类挑战可能特别严峻。
在一些实施方案中，所提供的技术在应用于产生具有相对高的C和/或A含量(例如，相对于转录物中的G和/或U含量)的转录物时可以是有用的。然而，在一些实施方案中，本公开提供了令人惊讶的见解，即所提供的反应条件(例如，反应混合物中的CTP和/或ATP[或其类似物]水平[例如，绝对和/或相对水平])可以是独立于转录序列而有用的。
在一些实施方案中，如本文所述的升高的CTP和/或ATP改善产率和/或完整性和/或加帽，和/或减少一种或多种异常产物(例如，dsRNA)的产生；在一些实施方案中，独立于所产生的RNA中的核苷酸的百分比和/或摩尔比(例如，核苷酸含量)。
在一些实施方案中，本文提供的技术对于以商业质量和/或商业规模制造RNA特别有用。本领域技术人员将意识到，不同的治疗性RNA以迥然不同的规模使用。例如，受试者特异性RNA已有所描述并用于个体化的癌症疫苗中(参见，例如RO7198457)；这些RNA的制造规模只需足以治疗相关个体即可。相比之下，出于其他目的，例如作为一般癌症疫苗、作为感染原疫苗、作为用于表达抗体、酶、细胞因子等的载体开发的RNA通常可大规模制造。治疗性RNA已被证明在最近的SARS-CoV-2大流行中特别有价值，需要以前所未有的规模进行制造。在各种实施方案中，本文提供的技术可在这些规模中的每一个上使用。因此，例如在一些实施方案中，本文所述的技术可用于产生在约0.01g/h RNA至约1g/h RNA、1g/h RNA至约100g/hRNA、约1g RNA/h至约20g RNA/h、或约100g RNA/h至约10,000g RNA/h)的RNA(如，以制造规模)。在一些实施方案中，在每批次产生数十或数百毫克至数十或数百克(或更多)RNA的反应中利用本文所述的技术。阅读本公开的本领域技术人员将认识到，所实现的某些益处(例如，改善的完整性和/或产率)在药物级制造的背景下和/或特别是在如本文所述的大规模上可以是特别有利的。
在一些实施方案中，可以并行地利用本文所述的技术，例如以进一步改善通量容量。
在一些特定实施方案中，所提供的技术可用于制造批量大小为至少0.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.5g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g RNA(包括，例如，至少15g RNA、至少20g RNA、至少25g RNA、至少30g RNA、至少35gRNA、至少40g RNA、至少45g RNA、至少50g RNA、至少55g RNA、至少60g RNA、至少70g RNA、至少80g RNA、至少90g RNA、至少100g RNA、至少150g RNA、至少200g RNA、至少300g RNA、至少400g RNA、至少500g RNA、至少750g、至少1kg、至少1.1kg、至少1.2kg、至少1.3kg、至少1.4kg、至少1.5kg或更多)的RNA制剂(例如，RNA药物物质)。在一些实施方案中，本文提供的技术可以用于产生在约0.01g g至约500g RNA、约0.01g至约10g RNA、约1g至约10g RNA、约10g至约500g RNA、约10g至约300g RNA、约10g至约200g RNA或约30g至约60g RNA范围内的批量大小。
在一些实施方案中，本文提供的技术可用于产生至少1.5RNA/h(包括，例如，至少2g RNA/h、至少2.5g RNA/h、至少3g RNA/h、至少3.5g RNA/h、至少4g RNA/h、至少4.5gRNA/h、至少5g RNA/h、至少5.5g RNA/h、至少6g RNA/h、至少6.5g RNA/h、至少7g RNA/h、至少7.5g RNA/h、至少8g RNA/h、至少8.5g RNA/h、至少9g RNA/h、至少10g RNA/h或更高)的质量通量(mass throughput)的大规模制造。在一些实施方案中，本文所述的大规模制造方法可以达到15g RNA/h至20g RNA/h(例如，约17g/小时)的容量。
事实上，在一些实施方案中，所提供的技术提供了令人惊讶的优点，即它们可用于各种规模和/或特别是非常大的制造规模(例如，超过约数十或甚至数百克/批)，和/或是基本上独立于RNA序列而有用的(例如，即使在如此大的规模下)(例如，以用于产生具有各种C和/或A含量的RNA)。
在一些方面，本公开提供了通过体外转录产生核糖核酸(RNA)分子的方法，所述方法包括在反应条件下产生反应混合物以形成RNA分子，反应混合物包含核酸聚合酶、核酸模板，以及：总胞苷三磷酸(CTP)和/或一种或多种功能性CTP类似物与总鸟苷三磷酸(GTP)和/或一种或多种功能性GTP类似物的摩尔比a；和/或总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物与总尿苷三磷酸(UTP)和/或一种或多种功能性UTP类似物的摩尔比b；和/或总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物与总腺苷三磷酸(ATP)和/或一种或多种功能性ATP类似物的摩尔比c，其中RNA分子包含：总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比x；和/或总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比y；和/或总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物的摩尔比z，并且其中：a为至少1.25，和/或a是x的至少约1.10倍；和/或b为至少1.25，和/或b是y的至少约1.10倍；和/或c为至少1.10，和/或c是z的至少约1.10倍。
在一些实施方案中，a为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。在一些实施方案中，a为至少1.5。在一些实施方案中，a是x的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。在一些实施方案中，a是x的至少约1.15倍。在一些实施方案中，a是x的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，b为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。在一些实施方案中，b为至少1.5。在一些实施方案中，b是y的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。在一些实施方案中，b是y的至少约1.15倍。在一些实施方案中，b是y的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，c为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些实施方案中，c为至少1.25。在一些实施方案中，c是z的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。在一些实施方案中，c是z的至少约1.15倍。在一些实施方案中，c是z的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，本公开提供的方法还包括将以下合并到反应混合物中：总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物与总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的摩尔比d；和/或总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物与总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的摩尔比e，其中RNA分子还包含：总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比v；和/或总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比w，并且其中：d为至少1.10，和/或d是v的至少约1.05倍；和/或e为至少1.10，和/或e是w的至少约1.05倍。在一些此类实施方案中，d为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些此类实施方案中，d为至少1.20。在一些此类实施方案中，d是v的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。在一些此类实施方案中，d是v的至少约1.10倍。在一些此类实施方案中，d是v的至少约1.20倍。在一些此类实施方案中，e为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些此类实施方案中，e为至少1.20。在一些此类实施方案中，e是w的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。在一些此类实施方案中，e是w的至少约1.10倍。在一些此类实施方案中，e是w的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的其余部分添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的其余部分添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的其余部分添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的其余部分添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，RNA分子是单链的。在一些实施方案中，RNA分子是线性RNA、信使RNA和/或核苷修饰的信使RNA。
在一些实施方案中，核酸模板是DNA模板。在一些实施方案中，模板是线性模板(例如，线性DNA模板)。在一些实施方案中，模板是质粒(例如，DNA质粒)。在一些实施方案中，模板是扩增子(例如，如通过聚合酶链式反应产生的)。
在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.01-2μg/μL的核酸模板。
在一些实施方案中，核酸聚合酶是RNA聚合酶。在一些实施方案中，核酸聚合酶是T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、N4病毒体RNA聚合酶，或其变体或功能结构域。
在一些实施方案中，反应混合物包含(例如，还包含)反应缓冲液、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶、一种或多种盐、还原剂和亚精胺中的一种或多种。在一些实施方案中，反应缓冲液包含HEPES、Tris-HCl或PBS。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为20-60mM或100-150mM的反应缓冲液。在一些实施方案中，反应缓冲液的pH为7-9。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.01-0.1U/μL的RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，一个单位(U)的RNA酶抑制剂将5ng的RNA酶A的活性抑制至少50％。在一些实施方案中，焦磷酸酶是无机焦磷酸酶。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.01-0.2mU/μL的焦磷酸酶。在一些实施方案中，反应混合物中包含的一种或多种盐包括一种或多种镁盐和/或一种或多种钙盐。在一些实施方案中，一种或多种镁盐包括乙酸镁或氯化镁。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为20-60mM的一种或多种盐。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为100-150mM的一种或多种盐。在一些实施方案中，还原剂包括二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为5-15mM的还原剂。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.5-3mM的亚精胺。
在一些实施方案中，体外转录进行至少20-180分钟。在一些实施方案中，体外转录在25-55℃的温度下进行。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在RNA分子的体外转录后消化核酸模板。在一些此类实施方案中，通过DNA酶消化核酸模板。在一些此类实施方案中，DNA酶包括DNA酶I。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括(例如，还包括)在体外转录以产生RNA分子后消化IVT反应混合物的多肽(例如，核酸聚合酶、焦磷酸酶、DNA酶诸如DNA酶I、RNA酶抑制剂)。在一些此类实施方案中，通过蛋白酶消化核酸聚合酶。在一些此类实施方案中，蛋白酶是或包括蛋白酶K。
在一些实施方案中，本公开提供的技术包括(例如，还包括)进行体外转录反应和/或由此产生的RNA的一项或多项评估(例如，一个或多个质量控制参数的评估)。在一些此类实施方案中，一个或多个质量控制参数选自由转录期间和/或之后RNA分子的RNA完整性、RNA浓度、残余双链RNA(dsRNA)和/或加帽组成的组。在一些此类实施方案中，使用琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。在一些此类实施方案中，使用毛细管凝胶电泳评估RNA完整性。在一些此类实施方案中，通过该方法产生的RNA分子的RNA完整性为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.05倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍，和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，RNA完整性增加至少约5％。在一些此类实施方案中，RNA完整性增加至少约8％。
在一些实施方案中，使用UV吸收分光光度法评估RNA浓度。在本公开的一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的相关样品或制剂(例如，在IVT溶液中)中的RNA分子的浓度为至少约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14、mg/mL或15mg/mL。在一些此类实施方案中，RNA分子的浓度(例如，在相关样品或制剂中，诸如在IVT溶液中)相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些此类实施方案中，RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25、b不为至少1.25、c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25、b不为至少1.25、c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25、b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用，其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些实施方案中，RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，RNA分子的浓度增加至少约20％。
在一些实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)、吸光度、荧光染料和/或凝胶电泳评估残余dsRNA。在一些实施方案中，使用定量PCR评估残余dsRNA(例如，在IVT溶液中)。在一些此类实施方案中，RNA分子转录期间和/或之后的残余dsRNA为至少约25pg dsRNA/μgRNA、50pg dsRNA/μg RNA、75pg dsRNA/μg RNA、100pg dsRNA/μg RNA、125pg dsRNA/μgRNA、150pg dsRNA/μg RNA、175pg dsRNA/μg RNA、200pg dsRNA/μg RNA、225pg dsRNA/μgRNA、250pg dsRNA/μg RNA、275pg dsRNA/μg RNA、或300pg dsRNA/μgRNA。在一些此类实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25，b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。在一些实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不是x是至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。在一些此类实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，残余dsRNA浓度降低至少约70％。
在一些实施方案中，RNA分子的加帽通过以下方式评估：(a)评估功能性加帽RNA的翻译；(b)进行生物活性测试以确认RNA分子被翻译成正确大小的多肽(例如，蛋白质)；(c)进行基于核酸酶的测定；和/或(d)进行基于催化性核酸的测定。在一些此类实施方案中，基于核酸酶的测定包括基于RNA酶的测定，例如其中基于RNA酶的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)使大量RNA分子与一种或多种结合RNA分子的探针退火形成RNA-探针复合物；(b)用RNA酶消化RNA-探针复合物，以产生包含RNA分子的5’末端的片段；(c)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合纯化片段；(d)对纯化的片段进行质谱法(MS)；(e)基于观察到的MS值鉴定加帽和未加帽片段；和/或(f)比较加帽和未加帽片段的量以计算加帽RNA的百分比。在一些此类实施方案中，RNA酶包括RNA酶H。在一些此类实施方案中，基于核酸酶的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)使大量RNA分子和与RNA分子的5’非翻译区中与RNA的5'RNA帽或未加帽的倒数第二个碱基相邻的序列互补的一种或多种DNA寡核苷酸接触；(b)使一种或多种DNA寡核苷酸与RNA分子的5'非翻译区中的序列退火形成DNA/RNA杂合复合物；(c)用一种或多种核酸酶降解DNA/RNA杂合复合物和/或未退火的RNA分子，以产生加帽和未加帽的5’末端RNA片段和3’RNA片段；(d)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合将加帽和未加帽的5’末端RNA片段与3’RNA片段分离；和/或(e)比较加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量以计算加帽RNA的百分比。在一些此类实施方案中，基于催化性核酸的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)用催化性核酸分子将大量RNA分子切割成5’末端RNA片段和至少一个3’RNA片段，其中RNA分子具有催化性核酸分子的切割位点；(b)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合分离5’末端RNA片段和3’RNA片段；(c)使用光谱法、定量质谱法、测序或其组合测量加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量；和/或(d)比较加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量以计算加帽RNA的百分比。在一些此类实施方案中，催化性核酸分子包括DNA核酶或核酶。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％是加帽的。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的加帽相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不为至少1.25，b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
在一些实施方案中，转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的加帽相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不是x的至少约1.10倍、b不是y的至少约1.10倍和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的一种或多种RNA分子的加帽增加至少约5％。
附图说明
图1提供了示例性的IVT反应混合物组分和条件。
图2示出了使用两种不同构建体进行示例性的大规模IVT反应(36.7L)后的残余核苷酸三磷酸(NTP)。构建体1是BNT162b1并且构建体2是BNT162b2。
图3示出由示例性IVT反应产生的RNA的RNA完整性和加帽百分比，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含-10％、+10％、+20％或+50％ CTP体积的IVT反应混合物。这些反应显示，与使用对照IVT反应混合物产生的RNA相比，增加CTP体积在+20％ CTP体积和+50％ CTP体积下导致RNA完整性和加帽增加，但在+/-10％ CTP起始浓度下相对稳定。
图4示出由示例性IVT反应产生的RNA的PolyA完整性和RNA完整性，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含-10％、+10％、+20％或+50％ CTP体积的IVT反应混合物。相对于对照，增加CTP导致所产生的RNA的Poly(A)和RNA完整性增加。
图5示出来自示例性IVT反应的残余NTP和加帽水平以及产率，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含-10％、+10％、+20％或+50％ CTP体积的IVT反应混合物。随着CTP浓度增加，观察到产率增加。增加CTP体积至对照以上导致CTP浓度维持在定量限以上。较高的CTP浓度导致ATP浓度低于定量限。
图6示出另外的示例性研究，其展示了来自示例性IVT反应的RNA完整性和加帽百分比以及产率和残余CTP水平，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含-10％、+10％、+20％或+50％ CTP体积的IVT反应混合物。浅粉色标记表示利用本研究测定的先前实验的对照。
图7示出来自利用图1中汇总的条件的示例性IVT反应的产率(上)、RNA完整性(中)和残余双链RNA(下)。示例性IVT反应比较了相对于对照(+0％ CTP)包含+10％、+20％或+50％ CTP的反应混合物。将GTP/m1ΨTP的起始浓度降低至起始浓度的0.5mM(1/18*9mM)，并且在转录反应过程中分11次添加进料，直到达到最终浓度。
图8示出由示例性IVT反应产生的RNA的RNA完整性和加帽百分比，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含+40％、+50％或+60％ CTP体积的IVT反应混合物。
图9示出由示例性IVT反应产生的RNA的PolyA完整性和RNA完整性，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含+40％、+50％或+60％ CTP体积的IVT反应混合物。
图10示出来自示例性IVT反应的残余NTP和加帽水平以及产率，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含+40％、+50％或+60％ CTP体积的IVT反应混合物。
图11示出另外的示例性研究，其展示了来自示例性IVT反应的RNA完整性和加帽百分比以及产率和残余CTP水平，所述示例性IVT反应使用相对于包含+0％ CTP体积的对照(例如，标准)IVT反应混合物包含+40％、+50％或+60％ CTP体积的IVT反应混合物。CTP增加至+40％、+50％和+60％ CTP体积将ATP耗竭至定量限以下，产率增加至10mg/mL并且完整性(FA)从73.4％增加至83.4％。
图12示出由示例性IVT反应产生的RNA的RNA完整性和加帽百分比，所述示例性IVT反应使用相对于包含+50％ CTP体积和+0％ATP体积的对照IVT反应包含+50％ CTP体积和+10％ ATP体积或+50％ CTP体积和+20％ ATP体积的IVT反应混合物。
图13示出由示例性IVT反应产生的RNA的PolyA完整性和RNA完整性，所述示例性IVT反应使用相对于包含+50％ CTP体积和+0％ATP体积的对照IVT反应混合物包含+50％CTP体积和+10％ ATP体积或+50％ CTP体积和+20％ ATP体积的IVT反应混合物。
图14示出另外的示例性研究，其展示了来自示例性IVT反应的RNA完整性和加帽百分比以及产率和残余NTP水平，所述示例性IVT反应使用相对于包含+50％ CTP体积和+0％ATP体积的对照IVT反应混合物包含+50％ CTP体积和+10％ ATP体积或+50％ CTP体积和+20％ ATP体积的IVT反应混合物。
图15示出另外的示例性研究，其展示了来自示例性IVT反应的RNA完整性和加帽百分比以及产率和残余CTP水平，所述示例性IVT反应使用相对于包含+50％ CTP体积和+0％ATP体积的对照IVT反应混合物包含+50％ CTP体积和+10％ ATP体积或+50％ CTP体积和+20％ ATP体积的IVT反应混合物。当CTP为+50％时，ATP增加至+10％增加产率和完整性，但ATP仍然耗竭或接近耗竭。当CTP为+50％时，ATP增加至+20％进一步增加产率，但未观察到完整性的显著改善，并且GTP变得耗竭。
图16示出具有不同CTP水平(相对于+0％ CTP，+10％ CTP、+20％CTP、+50％ CTP)的IVT反应混合物的另外的示例性评估，以及产率、RNA完整性、dsRNA含量和残余DNA含量的表征。
图17示出产率(上)、RNA完整性(中)和dsRNA(下)的另外的示例性研究。示例性IVT反应使用相对于对照反应混合物(+0％ CTP体积、+0％ ATP体积)包含+50％ CTP体积、+50％ ATP体积或+50％ CTP体积和+50％ ATP体积的IVT反应混合物。
图18示出具有不同NTP水平(相对于对照，+50％ CTP和+20％ATP、+50％ CTP、+20％ ATP)的IVT反应混合物的另外的示例性评估。对产率、完整性、dsRNA含量和残余DNA含量进行表征。
图19示出使用包含+50％ CTP和+20％ ATP的反应混合物(过程2b)或标准/对照(例如，1:1:1:1，例如各9mM)反应混合物(过程2a)的示例性IVT反应的产率、残余NTP和完整性的示例性评估。
图20示出示例性IVT反应的产率、完整性和残余dsRNA含量的示例性评估，所述示例性IVT反应使用相对于包含10.8mM ATP、13.5mM CTP、9mM GTP和9mM UTP的反应混合物包含+25％ ATP和+7％ CTP、-21％ ATP和-37％ CTP、+25％ ATP或+7％ CTP的反应混合物。
定义
约：在本文中用于提及一个值时，术语“约”是指在上下文中与所提及的值相似的值。一般来讲，熟悉上下文的本领域技术人员将理解该上下文中“约”所涵盖的相关差异程度。例如，在一些实施方案中，术语“约”可涵盖在参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的值范围。
施用：如本文所用，术语“施用”通常是指向受试者或系统施用组合物。本领域普通技术人员将了解在适当的情况下可用于施用于受试者(例如人)的多种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是眼部、口服、肠胃外、外用(topical)施用等。在一些特定实施方案中，施用可以是支气管(例如，通过支气管滴注)、经颊、真皮(其可以是或包括例如真皮外用、真皮内(intradermal)、皮内(interdermal)、透皮等中的一种或多种)、肠内、动脉内、真皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、心室内、特定器官内(例如，肝内)、粘膜、鼻、口、直肠、皮下、舌下、外用、气管(例如，通过气管内滴注)、阴道、玻璃体施用等。在一些实施方案中，施用可涉及为间歇性(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或周期性(例如，分开共同时间段的各个剂量)给药的给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。
剂：通常，如本文所用，术语“剂”用于指实体(例如，脂质、金属、核酸、多肽、多糖、小分子等，或其复合物、组合、混合物或系统[例如，细胞、组织、生物体])，或现象(例如，热、电流或电场、磁力或磁场等)。在适当的情况下，如本领域技术人员从上下文中将清楚，该术语可用于指是或包含细胞或生物体或者它们的级分、提取物或组分的实体。可替代地或另外地，如上下文将清楚，该术语可用于指在自然中发现和/或从自然中获得的天然产物。在一些情况下，同样如将从上下文清楚的，该术语可用于指一个或多个人造实体，因为它是通过人的手的动作来设计、工程化和/或产生的，并且/或者在自然界中找不到。在一些实施方案中，剂可以以分离的或纯的形式使用；在一些实施方案中，剂可以以粗制的形式使用。在一些实施方案中，潜在剂可作为集合或库提供，例如可对这些集合或库进行筛选以鉴定或表征其中的活性剂。在一些情况下，术语“剂”可指是或包含聚合物的化合物或实体；在一些情况下，该术语可指包含一个或多个聚合物部分的化合物或实体。在一些实施方案中，术语“剂”可指不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物和/或一种或多种特定聚合物部分的化合物或实体。在一些实施方案中，该术语可指缺少或基本上不含任何聚合物部分的化合物或实体。
等位基因：如本文所用，术语“等位基因”是指特定多态性基因组基因座的两种或更多种现有遗传变体之一。
氨基酸：在其最宽泛的意义上，如本文所用，术语“氨基酸”是指可以掺入、被掺入或已经掺入多肽链中的化合物和/或物质，例如，通过形成一个或多个肽键。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是非天然氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常存在于天然存在的肽中的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是得自天然来源的。在一些实施方案中，氨基酸，包括多肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，与上述通用结构相比可以含有结构修饰。例如，在一些实施方案中，与通用结构相比，氨基酸可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、聚乙二醇化、糖基化、磷酸化和/或取代(例如氨基基团、羧酸基团、一个或多个质子和/或羟基基团的取代)而修饰。在一些实施方案中，与含有在其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰可以例如改变含有修饰氨基酸的多肽的循环半衰期。在一些实施方案中，与含有在其他方面相同的未修饰氨基酸的多肽相比，此类修饰不显著改变含有修饰氨基酸的多肽的相关活性。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，术语“氨基酸”可用于指游离氨基酸；在一些实施方案中，它可用于指多肽的氨基酸残基。
类似物：如本文所用，术语“类似物”是指与参考物质共享一种或多种特定的结构特征、元素、组分或部分的物质。通常，“类似物”显示出与参考物质的显著结构相似性，例如共享核心或共有结构，但也以某些离散方式有所不同。在一些实施方案中，类似物是可以例如通过化学操纵参考物质而由参考物质生成的物质。在一些实施方案中，类似物是可通过进行与产生参考物质的合成方法基本相似(例如，与其共享多个步骤)的合成方法而产生的物质。在一些实施方案中，类似物通过或可以通过进行不同于用于产生参考物质的合成方法的合成方法来产生。
动物：如本文所用，是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任一性别且处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、遗传工程化动物和/或克隆。
抗原：如本文所用，术语“抗原”是指引发免疫响应的剂；和/或(ii)与T细胞受体结合(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体结合的剂。在一些实施方案中，抗原引发体液响应(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；在一些实施方案中，引发细胞响应(例如，涉及受体与抗原特异性相互作用的T细胞)。在一些实施方案中，抗原与抗体结合并且可诱导或可不诱导生物体中的特定生理响应。一般来讲，抗原可以是或包括任何化学实体，诸如例如小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施方案中，除生物聚合物以外[例如，除核酸或氨基酸聚合物以外])等。在一些实施方案中，抗原是或包含多肽。在一些实施方案中，抗原是或包含聚糖。本领域普通技术人员将理解，一般而言，抗原可以以经分离的或纯的形式提供，或者替代地可以以粗制的形式提供(例如，与其他材料一起，例如在含抗原来源的提取物诸如细胞提取物或其他相对粗制的制备物中)。在一些实施方案中，根据本发明使用的抗原以粗制的形式提供。在一些实施方案中，抗原是重组抗原。
结合：应当理解，如本文所用，术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一个或多个中间实体的物理接触进行物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合通常可以在多种情况中的任一种中评估，包括单独或在更复杂系统的环境中研究相互作用的实体或部分(例如，当与载剂实体共价缔合或以其他方式缔合时和/或在生物系统或细胞中)。如果在所评估的条件下，相关实体比与其他可用的结合配偶体更有可能相互缔合，则两个实体之间的结合可被视为“特异性的”。
特征序列元件：如本文所用，短语“特征序列元件”是指聚合物(例如，多肽或核酸)中发现的代表所述聚合物的特征部分的序列元件。在一些实施方案中，特征序列元件的存在与聚合物的特定活性或特性的存在或水平相关。在一些实施方案中，特征序列元件的存在(或不存在)将特定聚合物定义为此类聚合物的特定家族或组的成员(或不是其成员)。特征序列元件典型地包含至少两个单体(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个单体(例如，连续连接的单体)。在一些实施方案中，特征序列元件包括至少第一和第二段连续单体，所述单体被一个或多个间隔子区隔开，所述间隔子区的长度可以或可以不随共享该序列元件的聚合物而变化。
可比较的：如本文所用，术语“可比较的”是指两种或更多种剂、实体、情况、条件组等，它们可能彼此不同但足够相似以允许在它们之间进行比较，使得本领域技术人员将理解，可以基于观察到的差异或相似性合理地得出结论。在一些实施方案中，可比较的条件组、环境、个体或群体的特征在于多个基本相同的特征和一个或少量不同特征。本领域的普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定情况下，对于两种或更多种此类剂、实体、情况、条件组等需要怎样的一致性程度才被认为是可比较的。例如，本领域普通技术人员将理解，当通过足够数量和类型的基本上相同的特征表征时，环境、个体或群体组彼此是可比较的，以保证合理结论，即在不同的环境、个体或群体组的情况下获得的结果或观察到的现象的差异是由那些变化的特征的变化引起或指示的。
组合物：本领域技术人员将理解，如本文所用，术语“组合物”可用于指包含一种或多种指定组分的离散物理实体。通常，除非另有说明，否则组合物可以是任何形式的——例如，气体、凝胶、液体、固体等。
包含：本文描述为“包含”一个或多个指定要素或步骤的组合物或方法是开放式的，意味着指定要素或步骤是必需的，但可在组合物或方法的范围内添加其他要素或步骤。为避免冗长，还应理解，被描述为“包含”(或“包括”)一个或多个指定元素或步骤的任何组合物或方法还描述了“基本上由相同的指定元素或步骤组成的”(或“基本上由其组成的”)相应的、更有限的组合物或方法，意味着该组合物或方法包括指定的基本元素或步骤，并且还可包括不实质影响组合物或方法的基本和新颖特征的附加元素或步骤。还应当理解，本文中描述为“包含一个或多个指定元素或步骤”或“基本上由一个或多个指定元素或步骤组成”的任何组合物或方法还描述了“由指定元素或步骤组成的”(或“由其组成的”)相应的、更有限的且封闭式的组合物或方法，排除任何其他未指定的元素或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何指定的基本元素或步骤的已知或公开的等同物可替代所述元素或步骤。
经设计的：如本文所用，术语“经设计的”是指这样的剂：(i)其结构是或已通过人工选择；(ii)通过需要人工的过程产生；和/或(iii)不同于天然物质和其他已知的剂。
结构域：如本文所用，术语“结构域”是指实体的区段或部分。在一些实施方案中，“结构域”与实体的特定结构特征和/或功能特征相关联，使得当结构域与其亲本实体的其余部分物理分离时，所述结构域基本上或完全保留特定结构特征和/或功能特征。可替代地或另外地，结构域可以是或包括实体的一部分，当与(亲本)实体分离并与不同的(接受者)实体连接时，所述结构域基本上保留和/或赋予接受者实体其在亲本实体中表征的一个或多个结构特征和/或功能特征。在一些实施方案中，结构域是分子的区段或部分(例如，小分子、碳水化合物、脂质、核酸或多肽)。在一些实施方案中，结构域是多肽的区段；在一些此类实施方案中，结构域的特征在于特定的结构元件(例如，特定的氨基酸序列或序列基序、α螺旋特征、β折叠特征、卷曲螺旋特征、随机螺旋特征等)和/或在于特定的功能特征(例如，结合活性、酶活性、折叠活性、信号传导活性等)。
工程化的：通常，术语“工程化的”是指已由人工操纵的方面。例如，当两个或更多个在自然界中不直接连接在一起的序列被人工操纵以在工程化的多核苷酸中按该顺序彼此连接时，和/或当多核苷酸中的特定残基是非天然存在的和/或通过人工的作用导致与在自然界中不与其连接的实体或部分连接时，多核苷酸被认为是“工程化的”。例如，在本发明的一些实施方案中，工程化的多核苷酸包含在自然界中发现的与第一编码序列可操作缔合但不与第二编码序列可操作缔合的调节序列，所述调节序列通过人工连接以使其与第二编码序列可操作地缔合。类似地，如果细胞或生物体经过操纵，使得其遗传、表观遗传和/或表型特性相对于适当的参考细胞(诸如未被如此操纵过的在其他方面相同的细胞)发生了改变，则所述细胞或生物体被认为是“工程化的”。在一些实施方案中，操纵是或包括遗传操纵，使得其遗传信息发生改变(例如，先前不存在的新遗传物质已经例如通过转化、配对、体细胞杂交、转染、转导或其他机制引入，或先前存在的遗传物质例如通过取代或缺失突变或通过配对方案改变或去除)。在一些实施方案中，工程化的细胞是已被操纵，使得其相对于这样的适当的参考细胞以改变的量和/或根据改变的定时含有和/或表达特定的感兴趣的剂(例如，多肽(例如，蛋白质)、核酸和/或其特定形式)的细胞。按照惯例并且被本领域技术人员理解，工程化的多核苷酸或细胞的后代典型地仍被称为“工程化的”，即使实际操纵是在先前实体上进行的。
表位：如本文所用，术语“表位”是指由免疫球蛋白(例如，抗体或受体)结合组分特异性识别的部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施方案中，当抗原采用相关的三维构象时，此类化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采用这样的构象时，此类化学原子或基团彼此在空间上物理靠近。在一些实施方案中，当抗原采用替代构象(例如，线性化)时，至少一些此类化学原子或基团在物理上彼此分离。
表达：如本文所用，术语核酸序列的“表达”是指从核酸序列产生任何基因产物。在一些实施方案中，基因产物可以是转录物。在一些实施方案中，基因产物可以是多肽。在一些实施方案中，核酸序列的表达涉及以下各项中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑等)；(3)将RNA翻译成多肽(例如，蛋白质)；和/或(4)多肽(例如，蛋白质)的翻译后修饰。
片段：如本文所述的材料或实体的“片段”具有包括整体的离散部分但缺少在整体中发现的一个或多个部分的结构。在一些实施方案中，片段由此种离散部分组成。在一些实施方案中，片段由在整体中发现的特征结构元件或部分组成或者包含在整体中发现的特征结构元件或部分。在一些实施方案中，聚合物片段包含如在整个聚合物中发现的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多个单体单元(例如，残基)或由其组成。在一些实施方案中，聚合物片段包含在整个聚合物中发现的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、25％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的单体单元(例如，残基)或由其组成。在一些实施方案中，整个材料或实体可被称为片段的“亲本”。
基因：如本文所用，术语“基因”是指染色体中编码产物(例如，RNA产物和/或多肽产物)的DNA序列。在一些实施方案中，基因包括编码序列(即，编码特定产物的序列)；在一些实施方案中，基因包括非编码序列。在一些特定实施方案中，基因可包括编码(例如，外显子)序列和非编码(例如，内含子)序列。在一些实施方案中，基因可包括一个或多个调控元件，所述调控元件例如可控制或影响基因表达的一个或多个方面(例如，细胞类型特异性表达、诱导型表达等)。
宿主：术语“宿主”在本文用于指其中存在感兴趣的多肽的系统(例如，细胞、生物体等)。在一些实施方案中，宿主是易受特定感染原感染的系统。在一些实施方案中，宿主是表达特定的感兴趣的多肽的系统。
宿主细胞：如本文所用，是指已将外源核酸(重组或其他方式)引入其中的细胞。技术人员在阅读本公开后将理解，此类术语不仅指特定的受试细胞，而且指这种细胞的后代。在接续传代中由于突变或环境影响而可能发生某些修饰，因此此类后代可能实际上并不等同于亲代细胞，但其仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适合表达外源DNA(例如，重组核酸序列)的任何生命界的原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物的细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物(例如，杂交瘤或四重杂交瘤)。在一些实施方案中，细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞，诸如：CHO(例如，CHO Kl、DXB-1 1CHO、Veggie-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞尔托利氏细胞、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞以及衍生自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，细胞包含一种或多种病毒基因。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一，则认为所述聚合物分子彼此“基本上同一”。例如两个核酸或多肽序列的同一性百分比的计算可出于最佳比较目的通过比对两个序列来进行(例如，可在第一和第二序列中的一者或两者中引入空位以实现最佳比对，并且出于比较目的可忽略不同一的序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。然后比较相应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的残基(例如，核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在所述位置处是同一的。考虑到空位的数量和每个空位的长度(需要引入这些空位以对两个序列进行最佳比对)，两个序列之间的同一性百分比是这些序列共有的相同位置的数量的函数。两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。例如，可使用Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，所述算法已结合到ALIGN程序(2.0版)中。在一些示例性实施方案中，利用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。或者，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵确定。
“改善”、“增加”或“减少”：如本文所用，这些术语或在语法上可比较的比较术语表示相对于可比较的参考测量的值。例如，在一些实施方案中，用感兴趣的剂获得的评估值可相对于用可比较的参考剂获得的评估值“改善”。可替代地或另外地，在一些实施方案中，在感兴趣的受试者或系统中获得的评估值可相对于在相同受试者或系统中在不同条件下(例如，在诸如施用感兴趣的剂的事件之前或之后)或者在不同的可比较的受试者中(例如，在与感兴趣的受试者或系统不同的可比较的受试者或系统中在存在感兴趣的特定疾病、病症或病状的一种或多种指示物的情况下，或在先前暴露于病状或剂等)获得的评估值“改善”。在一些实施方案中，比较术语是指统计上相关的差异(例如，其流行率和/或量级足以达到统计上的相关性)。在给定的上下文中，本领域技术人员将意识到或将能够容易地确定对于实现这种统计显著性所需或足够的差异的程度和/或流行率。
体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在多细胞生物体内发生的事件。
接头：如本文所用，用于指多元件剂中将不同元件彼此连接的部分。例如，本领域普通技术人员理解，其结构包括两个或更多个功能或组织结构域的多肽通常在此类结构域之间包括将它们彼此连接的氨基酸链段。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有一般形式S1-L-S2的总体结构，其中S1和S2可以是相同或不同的并且代表通过接头彼此关联的两个结构域。在一些实施方案中，多肽接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其往往不采用刚性三维结构，而是为多肽提供柔性。当对多肽(例如，融合多肽)进行工程化时可以适当使用的多种不同的接头元件是本领域中已知的(参见例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2:1 121-1123)。
部分：本领域技术人员将认识到，“部分”是具有如本文所述的特定结构和/或活性的限定的化学基团或实体。
核酸：如本文所用，在其最宽泛的意义上，是指被掺入或可以被掺入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键联被掺入或可以被掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文中将清楚，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包括RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包括DNA。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包含所述残基，或由所述残基组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物，包含所述类似物，或由所述类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”，包含所述肽核酸，或由所述肽核酸组成，所述肽核酸是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被认为在本发明的范围内。可替代地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-N-亚磷酰胺键联而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)，包括一个或多个天然核苷或由一个或多个天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基尿苷、C5-丙炔基胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入型碱基以及它们的组合)，包括一个或多个核苷类似物或者由一个或多个核苷类似物组成。在一些实施方案中，与天然核酸中的糖相比，核酸包含一个或多个经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能基因产物诸如RNA或多肽(例如，蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸通过以下方式中的一者或多者来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合(体内或体外)进行的酶促合成、在重组细胞或系统中的复制以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中，核酸部分或全部是单链的；在一些实施方案中，核酸部分或全部是双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或是编码多肽的序列的互补序列。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载剂一起配制的活性剂。在一些实施方案中，活性剂以适于在对相关群体施用时表现出实现预定治疗作用的统计显著概率的治疗方案中施用的单位给药量存在。在一些实施方案中，药物组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适用于以下的那些：口服施用，例如，灌服(水性或非水性溶液剂或混悬剂)、片剂(例如，靶向颊、舌下和全身吸收的那些)、丸剂、粉剂、颗粒剂、用于应用至舌的糊剂；肠胃外施用，以例如无菌溶液或悬浮液或持续释放配制品形式例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；局部应用，例如以乳膏、软膏或控释贴剂或喷雾剂形式应用至皮肤、肺或口腔；阴道内或直肠内，例如以阴道药栓、乳膏或泡沫形式；舌下；眼部；经皮；或鼻、肺和应用至其他粘膜表面。
多肽：如本文所用，是指聚合的氨基酸链。在一些实施方案中，多肽具有天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有非天然存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有被工程化的氨基酸序列，因为它是通过人工的作用设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸或两者，或由其组成。在一些实施方案中，多肽可包含仅天然氨基酸或仅非天然氨基酸，或由其组成。在一些实施方案中，多肽可包含D-氨基酸、L-氨基酸或两者。在一些实施方案中，多肽可仅包含D-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可仅包含L-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可包括一个或多个侧基或其他修饰，例如，在多肽的N末端、在多肽的C末端或其任何组合处修饰或附接于一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可选自由乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等(包括它们的组合)组成的组。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的，和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是线性的。在一些实施方案中，多肽可以是或可包括钉合多肽。在一些实施方案中，术语“多肽”可以附加到参考多肽、活性或结构的名称；在这种情况下，它在本文中用于指如下多肽，所述多肽共享相关活性或结构，因此可被认为是多肽的同一类别或家族的成员。对于每个这样的类别，本说明书提供和/或本领域技术人员将知晓所述类别内的示例性多肽，其氨基酸序列和/或功能是已知的；在一些实施方案中，此类示例性多肽是针对多肽类别或家族的参考多肽。在一些实施方案中，多肽类别或家族的成员显示出与所述类别的参考多肽(在一些实施方案中，与所述类别内的所有多肽)显著的序列同源性或同一性，与其共享共同的序列基序(例如，特征序列元件)，和/或与其共享共同的活性(在一些实施方案中，在可比较的水平上或在指定的范围内)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示出至少约30％-40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的与参考多肽的总体序列同源性或同一性程度，和/或包括至少一个显示出很高序列同一性，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的区域(例如，在一些实施方案中可以是或可包含特征序列元件的保守区域)。这样的保守区域通常涵盖至少3-4个且通常最多至20或更多个氨基酸；在一些实施方案中，保守区域涵盖至少一个具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸的链段。在一些实施方案中，相关多肽可包含亲本多肽的片段或由其组成。在一些实施方案中，有用的多肽可包含多个片段或由其组成，每个片段在同一亲本多肽中以与在感兴趣的多肽中发现的不同的相对于彼此的空间排列被发现(例如，在亲本中直接连接的片段可在感兴趣的多肽中被空间分离，反之亦然，并且/或者片段可在感兴趣的多肽中以与在亲本中不同的顺序存在)，使得感兴趣的多肽是其亲本多肽的衍生物。
预定：预定是指有意选择的，例如与随机发生或实现相反。
预防(prevent或prevention)：如本文所用，当与疾病、病症和/或病状的发生结合使用时，是指降低发展疾病、病症和/或病状的风险和/或延迟疾病、病症或病状的一种或多种特征或症状的发作。当疾病、病症或病状的发作已经延迟预定的时间段时，可认为预防是完全的。
纯的：如本文所用，如果剂或实体基本上不含其他组分，则其为“纯的”。例如，含有超过约90％特定剂或实体的制剂通常被认为是纯制剂。在一些实施方案中，剂或实体为至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％纯的。
参考：如本文所用，描述了与之进行比较的标准或对照。例如，在一些实施方案中，将感兴趣的剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，与感兴趣的测试或确定基本上同时测试和/或确定参考或对照。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。通常，如本领域技术人员将理解的，在与评估条件或情况可比较的条件或情况下确定或表征参考或对照。本领域技术人员将理解，何时存在足够相似性以证明依赖于特定可能的参考或对照和/或与特定可能的参考或对照比较为合理的。
样品：如本文所用，术语“样品”通常是指从如本文所述的感兴趣的来源获得或衍生的材料的等分试样。在一些实施方案中，感兴趣的来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，感兴趣的来源可以是或包括细胞或生物体，诸如微生物、植物或动物(例如，人)。在一些实施方案中，感兴趣的来源是或包括生物组织或流体。在一些实施方案中，生物组织或流体可以是或包括羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耵聍、乳糜、食糜(chime)、射精液、内淋巴、渗出物、粪便、胃酸、胃液、淋巴液、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、胸腔积液、脓液、发炎性分泌物、唾液、皮脂、精液、血清、阴垢、痰、滑膜液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物，和/或其组合或一种或多种组分。在一些实施方案中，生物流体可以是或包括细胞内流体、细胞外流体、血管内流体(血浆)、间质流体、淋巴流体和/或跨细胞流体。在一些实施方案中，生物流体可以是或包括植物渗出物。在一些实施方案中，生物组织或样品可通过例如抽吸、活检(例如，细针或组织活检)、拭子(例如，口腔、鼻、皮肤或阴道拭子)、刮擦、手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻、眼、口腔、子宫、阴道或其他洗涤或灌洗)获得。在一些实施方案中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的方式直接从感兴趣的来源获得的“原始样品”。在一些实施方案中，如从上下文将清楚，术语“样品”是指通过处理原始样品(例如，通过除去其中的一种或多种组分和/或通过向其中添加一种或多种剂)获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这种“经处理的样品”可包括，例如，从样品中提取或者通过使原始样品经受一种或多种技术(诸如核酸的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化等)而获得的核酸或多肽(例如，蛋白质)。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括产前人类形式)。在一些实施方案中，受试者患有相关疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病状的任何症状或特征。在一些实施方案中，受试者是具有以疾病、病症或病状的易患性或风险为特征的一个或多个特征的人。在一些实施方案中，受试者为患者。在一些实施方案中，受试者是被施用和/或已被施用诊断和/或疗法的个体。
治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”通常是指当施用于生物体时引起所需药理学效应的任何剂。在一些实施方案中，如果剂在整个适当的群体中表现出统计学显著的效应，则所述剂被认为是治疗剂。在一些实施方案中，适当的群体可以是模式生物体群体。在一些实施方案中，适当的群体可以根据各种标准定义，诸如某个年龄组、性别、遗传背景、先前存在的临床状况等。在一些实施方案中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在可上市用于施用于人之前已经或需要由政府机构批准的剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是需要医学处方才能施用于人的剂。
治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征和/或病因、延迟其发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的疗法的施用。在一些实施方案中，此类治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或针对仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者。可替代地或另外地，此类治疗可以针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种已确定迹象的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已被诊断为罹患相关疾病、病症或病状的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有在统计学上与相关疾病、病症和/或病状的发展的风险增加相关的一种或多种易感因素的受试者。因此，在一些实施方案中，治疗可以是预防性的；在一些实施方案中，治疗可以是治疗性的。
疫苗接种：如本文所用，术语“疫苗接种”是指施用旨在产生免疫响应的组合物，例如对疾病相关(例如，致病)剂的免疫响应。在一些实施方案中，疫苗接种可在暴露于疾病相关剂之前、期间和/或之后施用，并且在某些实施方案中，在暴露于所述剂之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施方案中，疫苗接种包括疫苗接种组合物在时间上适当间隔的多次施用。
变体：如本文在分子例如核酸、多肽(例如，蛋白质)或小分子的上下文中所用，术语“变体”是指显示出与参考分子的显著结构同一性但与参考实体相比例如在一个或多个化学部分的存在或不存在或水平上与参考分子在结构上不同的分子。在一些实施方案中，变体在功能上也与其参考分子不同。通常，是否将特定分子适当地认为是参考分子的“变体”是基于所述特定分子与参考分子的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解的，任何生物学或化学参考分子都具有某些特征结构元件。根据定义，变体是一种独特的分子，其与参考分子共享一个或多个此类特征结构元件，但在至少一个方面与其不同。仅举几个例子，多肽可以具有由多个具有在线性或三维空间中相对于彼此指定的位置和/或贡献于特定结构基序和/或生物学功能的氨基酸构成的特征序列元件；核酸可以具有由多个具有在线性或三维空间中相对于彼此指定的位置的核苷酸残基构成的特征序列元件。在一些实施方案中，由于氨基酸或核苷酸序列中的一种或多种差异和/或为多肽或核酸的共价组分(例如，附接到多肽或核酸主链)的化学部分(例如，碳水化合物、脂质、磷酸基团)中的一种或多种差异，变体多肽或核酸可能与参考多肽或核酸不同。在一些实施方案中，变体多肽或核酸与参考多肽或核酸显示出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的总体序列同一性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸不与参考多肽或核酸共享至少一个特征序列元件。在一些实施方案中，参考多肽或核酸具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽或核酸共享参考多肽或核酸的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽或核酸缺乏参考多肽或核酸的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽或核酸显示出相比于参考多肽或核酸降低的一种或多种生物活性水平。在一些实施方案中，如果除了特定位置的少量序列改变之外，感兴趣的多肽或核酸具有与参考的氨基酸或核苷酸序列相同的氨基酸或核苷酸序列，则所述多肽或核酸被认为是参考多肽或核酸的“变体”。通常，与参考相比，变体中少于约20％、约15％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％或约2％的残基被取代、插入或缺失。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包含约10个、约9个、约8个、约7个、约6个、约5个、约4个、约3个、约2个或约1个取代残基。通常，相对于参考，变体多肽或核酸包含极少量(例如，少于约5个、约4个、约3个、约2个或约1个)的取代、插入或缺失的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包含不超过约5个、约4个、约3个、约2个或约1个添加或缺失，并且在一些实施方案中，不包含添加或缺失。在一些实施方案中，与参考相比，变体多肽或核酸包含少于约25个、约20个、约19个、约18个、约17个、约16个、约15个、约14个、约13个、约10个、约9个、约8个、约7个、约6个且通常少于约5个、约4个、约3个或约2个添加或缺失。在一些实施方案中，参考多肽或核酸是在自然界中发现的多肽或核酸。在一些实施方案中，参考多肽或核酸是人多肽或核酸。
载体：如本文所用，是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述来进行。前述技术和程序通常可根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其出于任何目的以引用的方式并入本文。
野生型：如本文所用，术语“野生型”具有其本领域所理解的含义，是指具有在自然界中发现的结构和/或活性的处于“正常”(与突变的、病变的、改变的等相对比)状态或情况的实体。本领域普通技术人员将理解，野生型基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。
具体实施方式
RNA疗法最近已成为一类相对较新且有前途的疗法，用于治疗和/或预防各种疾病，诸如癌症、感染性疾病和/或与某些多肽(例如，蛋白质)的缺陷相关的疾病或病症。特别是考虑到这些技术的前景及其对广泛多种临床状况的适应性，包括极大规模(例如，全球范围内的疫苗接种和/或治疗，例如针对传染病，例如流感、冠状病毒[例如，SARS、MERS等])，制造技术(尤其是适用于大规模生产的那些技术)的改进尤为有价值。
本文提供的技术尤其可用于例如在商业规模上和/或在商业条件下实现包含RNA的组合物和/或制剂的特别有效和/或高效的生产。例如，在各种实施方案中，所提供的技术允许和/或促进药物级(和/或规模)生产所特有的要求(例如，批量大小和/或生产速率和/或预定的质量控制参数)的实现。
本公开尤其提供了通过IVT制造RNA(例如，治疗性RNA，诸如治疗性mRNA)和/或包含所述RNA的组合物的技术。在一些实施方案中，所提供的技术可用于制造药物级RNA和/或RNA治疗剂。在一些实施方案中，所提供的技术可用于RNA治疗剂，例如药物级RNA治疗剂的大规模制造。
例如，在一些此类实施方案中，本文提供的技术可用于产生至少1,000小瓶RNA治疗剂(包括，例如，至少2,000小瓶、至少5,000小瓶、至少10,000小瓶、至少20,000小瓶、至少30,000小瓶、至少40,000小瓶、至少50,000小瓶、至少60,000小瓶、至少70,000小瓶、至少80,000小瓶、至少90,000小瓶、至少100,000小瓶、至少200,000小瓶、至少300,000小瓶、至少400,000小瓶、至少500,000小瓶、600,000小瓶、700,000小瓶、800,000小瓶、900,000小瓶、1,000,000小瓶或更多)的批次通量(例如，药物级批次通量)。
例如，在一些此类实施方案中，本文提供的技术可以用于产生至少50L的RNA治疗剂(包括例如至少50L、至少60L、至少70L、至少80L、至少100L、至少110L、至少120L、至少130L、至少140L、至少150L或更多)的批次通量(例如，药物级批次通量)。在一些实施方案中，每个小瓶可包含0.01mg至5mg(例如，0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg)的量的RNA。
除其他之外，本公开提供了这样的见解：升高的胞苷三磷酸(CTP)和/或腺苷三磷酸(ATP)浓度可以在IVT反应中提供某些益处，包括用于产生药物级RNA组合物和/或制剂，并且特别是用于大规模生产，而与所产生的RNA中核苷酸的百分比和/或摩尔比(例如，核苷酸含量)无关。
本文所述的技术可以用于制造RNA组合物(例如RNA，诸如mRNA和包含所述RNA的组合物)。在一些实施方案中，本文所述的技术可以用于制造用于治疗和/或预防疾病、病症或病状(例如，癌症、感染性疾病、与多肽(例如，蛋白质)缺陷相关的疾病等)的mRNA组合物。在一些实施方案中，本文所述的技术可以用于制造编码多肽和/或多种多肽的mRNA组合物。
组合物
在一些实施方案中，本公开尤其提供了通过体外转录(IVT)制造包含RNA的组合物和/或制剂的方法。在一些实施方案中，组合物和/或制剂包含治疗性RNA(例如，mRNA)。在一些实施方案中，本公开的制造组合物和/或制剂的方法是在商业规模上，例如，以至少.01g、0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.5g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g RNA(包括，例如，至少15g RNA、至少20g RNA、至少25g RNA、至少30g RNA、至少35g RNA、至少40g RNA、至少45g RNA、至少50g RNA、至少55g RNA、至少60g RNA、至少70gRNA、至少80g RNA、至少90g RNA、至少100g RNA、至少150g RNA、至少200g RNA、至少300gRNA、至少400g RNA、至少500g RNA或更多)的质量批次通量。在一些实施方案中，本文所述的这种方法可以用于产生约0.01g至约500g RNA、约0.01g至约10g RNA、约1g至约10g RNA、约10g至约500g RNA、约10g至约300gRNA、约10g至约200g RNA或约30g至约60g RNA的质量批次通量。在一些实施方案中，本文所述的这种方法可用于产生至少1.5gRNA/h(包括，例如，至少2g RNA/h、至少2.5g RNA/h、至少3gRNA/h、至少3.5g RNA/h、至少4g RNA/h、至少4.5g RNA/h、至少5g RNA/h、至少5.5g RNA/h、至少6g RNA/h、至少6.5g RNA/h、至少7gRNA/h、至少7.5g RNA/h、至少8g RNA/h、至少8.5g RNA/h、至少9g RNA/h、至少10g RNA/h或更高)的质量批次通量的大规模制造。在一些实施方案中，本文所述的大规模制造方法可以达到15gRNA/h至20g RNA/h(例如，约17g/小时)的容量。
RNA
在一些实施方案中，适用于本文所述的技术的RNA是单链RNA。在一些实施方案中，如本文所公开的RNA是线性RNA。在一些实施方案中，单链RNA是非编码RNA，因为其核苷酸序列不包括开放阅读框(或其互补序列)。在一些实施方案中，单链RNA具有编码本公开的一种或多种多肽(例如，表位)(或是编码所述多肽的序列的互补序列)的核苷酸序列。
在许多实施方案中，相关RNA是mRNA。
在一些实施方案中，RNA包括未修饰的尿苷残基；仅包括未修饰的尿苷残基的RNA可以称为“uRNA”。在一些实施方案中，RNA包括一个或多个修饰的尿苷残基；在一些实施方案中，这样的RNA(例如，包括完全修饰的尿苷残基的RNA)被称为“modRNA”。在一些实施方案中，RNA可以是自扩增RNA(saRNA)。在一些实施方案中，RNA可以是反式扩增RNA(参见，例如，WO2017/162461)。
在一些实施方案中，本文所述的技术特别可用于产生具有至少500个核糖核苷酸(诸如至少600个核糖核苷酸、至少700个核糖核苷酸、至少800个核糖核苷酸、至少900个核糖核苷酸、至少1000个核糖核苷酸、至少1250个核糖核苷酸、至少1500个核糖核苷酸、至少1750个核糖核苷酸、至少2000个核糖核苷酸、至少2500个核糖核苷酸、至少3000个核糖核苷酸、至少3500个核糖核苷酸、至少4000个核糖核苷酸、至少4500个核糖核苷酸、至少5000个核糖核苷酸或更长)的长度的RNA(例如，单链RNA)。在一些实施方案中，本文所述的技术特别可用于合成具有约800个核糖核苷酸至5000个核糖核苷酸的长度的单链RNA。
在一些实施方案中，相关RNA包括一个或多个多肽编码部分。在一些特定实施方案中，这样的一个或多个部分可以编码一种或多种多肽，所述多肽是或包含抗原(或其表位)、细胞因子、酶等。在一些实施方案中，一种或多种所编码的多肽可以是或包括一种或多种与肿瘤相关的新抗原或新表位。在一些实施方案中，一种或多种所编码的多肽可以是或包括感染原(例如，细菌、真菌、病毒等)的一种或多种抗原(或其表位)。在某些实施方案中，所编码的多肽可以是野生型多肽的变体。
在一些实施方案中，单链RNA(例如，mRNA)可包含分泌信号编码区(例如，允许一种或多种所编码的靶实体在被细胞翻译后分泌的分泌信号编码区)。在一些实施方案中，这种分泌信号编码区可以是或包含非人分泌信号。在一些实施方案中，这种分泌信号编码区可以是或包含人分泌信号。
在一些实施方案中，单链RNA(例如，mRNA)可包含至少一个非编码序列元件(例如，以提高RNA稳定性和/或翻译效率)。非编码序列元件的实例包括但不限于3'非翻译区(UTR)、5'UTR、用于mRNA的共转录加帽的帽结构、聚腺嘌呤(polyA)尾和它们的任何组合。
形式
已经开发了至少四种可用于RNA药物组合物(例如，免疫原性组合物或疫苗)的形式，即含未修饰尿苷的mRNA(uRNA)、核苷修饰的mRNA(modRNA)、自扩增mRNA(saRNA)和反式扩增RNA。
未修饰尿苷平台的特征可以包括，例如，内在佐剂效应、良好的耐受性和安全性以及强抗体和T细胞响应中的一种或多种。
修饰尿苷(例如，假尿苷)平台的特征可包括降低的佐剂效应、减弱的免疫先天免疫传感器激活能力以及因此增强的抗原表达、良好的耐受性和安全性，以及强抗体和CD4-T细胞响应。如本文所指出的，本公开提供了这样的见解：这种强抗体和CD4 T细胞响应可对疫苗接种特别有用。
自扩增平台的特征可以包括，例如，多肽(例如，蛋白质)表达的持续时间长、良好的耐受性和安全性、以非常低的疫苗剂量获得功效的可能性较高。
在一些实施方案中，自扩增平台(例如，RNA)包含两种核酸分子，其中一种核酸分子编码复制酶(例如，病毒复制酶)，而另一种核酸分子能够通过所述复制酶反式(反式复制系统)复制(例如，复制子)。在一些实施方案中，自扩增平台(例如，RNA)包含多种核酸分子，其中所述核酸编码多种复制酶和/或复制子。
在一些实施方案中，反式复制系统包含在单个宿主细胞中存在两种核酸分子。
在一些此类实施方案中，编码复制酶(例如，病毒复制酶)的核酸不能在靶细胞和/或靶生物体中自我复制。在一些此类实施方案中，编码复制酶(例如，病毒复制酶)的核酸缺乏至少一种对于基于(+)链模板的(-)链合成和/或对于基于(-)链模板的(+)链合成重要的保守序列元件。
在一些实施方案中，自扩增RNA包含5’帽。不希望受任何一种理论的束缚，已发现5’帽对于感兴趣的基因的反式高水平表达是重要的。在一些实施方案中，5’帽驱动复制酶的表达。
在一些实施方案中，自扩增RNA不包含内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些此类实施方案中，感兴趣的基因和/或复制酶的翻译不是由IRES元件驱动的。在一些实施方案中，IRES元件被5’帽取代。在一些此类实施方案中，5’帽的取代不影响由RNA编码的多肽的序列。
在一些实施方案中，自扩增平台不需要病毒颗粒的繁殖(例如，与不期望的病毒颗粒形成无关)。在一些实施方案中，自扩增平台不能形成病毒颗粒。
5’帽
在一些实施方案中，根据本公开使用的多核苷酸(例如，RNA)包含5’帽。RNA加帽已有充分研究并描述于例如Decroly E等人(2012)Nature Reviews 10:51-65；和RamanathanA.等人,(2016)Nucleic Acids Res；44(16):7511-7526中，其中的每一个的全部内容均据此通过引用并入。在一些实施方案中，在本发明的上下文中可以合适的5’帽结构是cap0(第一核碱基的甲基化，例如m7GpppN)、cap1(m7GpppN的相邻核苷酸的核糖的另外甲基化)、cap2(m7GpppN下游第2个核苷酸的核糖的另外甲基化)、cap3(m7GpppN下游第3个核苷酸的核糖的另外甲基化)、cap4(m7GpppN下游第4个核苷酸的核糖的另外甲基化)、ARCA(抗反向帽类似物)、修饰的ARCA(例如硫代磷酸酯修饰的ARCA，例如，β-S-ARCA)、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在一些实施方案中，所用的5’帽是Cap-0(在本文中也称为“Cap0”)、Cap-1(在本文中也称为“Cap1”)或Cap-2(在本文中也称为“Cap2”)。参见，例如，Ramanathan A等人的图1和Decroly E等人的图1。
如本文所用的术语“5'帽”是指在RNA(例如，mRNA)的5'末端上发现的结构，并且通常包括通过5'-至5'-三磷酸键联(也称为Gppp或G(5')ppp(5'))连接至RNA(例如，mRNA)的鸟苷核苷酸。在一些实施方案中，5’帽中包含的鸟苷核苷可以被修饰，例如，通过碱基(鸟嘌呤)上的一个或多个位置(例如，在7位)处的甲基化，和/或通过核糖的一个或多个位置处的甲基化。在一些实施方案中，5'帽中包含的鸟苷核苷包含核糖处的3'O甲基化(3’OMeG)。在一些实施方案中，5’帽中包含的鸟苷核苷包含鸟嘌呤的7位处的甲基化(m7G)。在一些实施方案中，5’帽中包含的鸟苷核苷包含鸟嘌呤的7位处的甲基化和核糖处的3’O甲基化(m7(3’OMeG))。
在一些实施方案中，提供具有本文公开的5'帽或5'帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中5'帽共转录表达成RNA链，或可以使用加帽酶在转录后附接至RNA。在一些实施方案中，与使用适当的参考比较物的共转录加帽相比，使用本文公开的帽(例如，使用cap1或cap1类似物)的共转录加帽改善RNA的加帽效率。在一些实施方案中，改善加帽效率可增加RNA的翻译效率和/或翻译速率，和/或增加所编码的多肽的表达。
在一些实施方案中，本文所述的RNA包含5’帽或5’帽类似物，例如Cap0、Cap1或Cap2。在一些实施方案中，所提供的RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一些实施方案中，RNA可以用5'帽类似物加帽。在一些实施方案中，本文所述的RNA包含Cap0。在一些实施方案中，本文所述的RNA包含Cap1，例如，如本文所述。在一些实施方案中，本文所述的RNA包含Cap2。在一些实施方案中，对多核苷酸的改变产生不可水解的帽结构，其可例如防止脱帽并增加RNA半衰期。
在一些实施方案中，Cap0结构包含在鸟嘌呤的7位甲基化的鸟苷核苷(m7G)。在一些实施方案中，Cap0结构经由5'-至5'-三磷酸键联连接至RNA并且在本文中也称为m7Gppp或m7G(5')ppp(5')。
在一些实施方案中，Cap1结构包含在鸟嘌呤的7位甲基化的鸟苷核苷(m7G或7mG)和RNA中的2'O甲基化的第一核苷酸(2'OMeN1或N12'OMe或N1 2'OMe)。在一些实施方案中，Cap1结构通过5'-至5'-三磷酸键联连接至RNA；在一些实施方案中，Cap1结构可表示为m7Gppp(N1 2'OMe)或m7G(5')ppp(5')(N1 2'OMe)或7mG(5')ppp(5')N1 2'-OMe)。在一些实施方案中，N1选自A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C。在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。
本领域技术人员将理解，帽结构中的一个或多个位置的甲基化可影响或反映掺入方式(例如，共转录相对于转录后)，因为甲基(例如，2'OMe基团)在某些位置(例如，N1)的存在可能干扰例如通过特定聚合酶(例如，T7)实现的延伸，这是ARCA技术的基础。
在一些实施方案中，m7G(5')ppp(5')(N1 2'OMe)Cap1结构包含第二核苷酸N2，其为位置+2处的帽近端A、G、C或U。在一些实施方案中，此类Cap1结构表示为(m7G(5')ppp(5')(N1 2'OMe)pN2)。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，Cap1结构是或包含m7G(5')ppp(5')(A1 2'OMe)pG2，其中A1是位置+1处的帽近端A并且G2是位置+2处的帽近端G，并且具有以下结构：
在一些实施方案中，Cap1结构是或包含m7G(5')ppp(5')(A1 2'OMe)pU2，其中A1是位置+1处的帽近端A并且U2是位置+2处的帽近端U，并且具有以下结构：
在一些实施方案中，Cap1结构是或包含m7G(5')ppp(5')(G1 2'OMe)pG2，其中G1是位置+1处的帽近端G并且G2是位置+2处的帽近端G，并且具有以下结构：
在一些实施方案中，Cap1结构包含在鸟嘌呤的7位甲基化的鸟苷核苷(m7G)和一个或多个另外的修饰，例如核糖上的甲基化和RNA中的2'O甲基化的第一核苷酸。在一些实施方案中，Cap1结构包含在鸟嘌呤7位甲基化的鸟苷核苷和核糖处的3'O甲基化(m7G3'OMe)或7mG3'OMe)；以及RNA中的2'O甲基化的第一核苷酸(N1 2'OMe)。在一些实施方案中，Cap1结构经由5'-至5'-三磷酸键联连接至RNA并且在本文还称为(m7G3'OMe)ppp(2'OMeN1)或(m7G3'OMe)(5')ppp(5')(2'OMeN1)。在一些实施方案中，N1选自A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C。在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。
在一些实施方案中，(m7G3’OMe)(5')ppp(5')(N1 2'OMe)Cap1结构包含第二核苷酸N2，其是位置2处的帽近端核苷酸并且选自A、G、C或U(m7G3’OMe)(5')ppp(5')(N1 2'OMe)pN2)。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，Cap1结构是或包含(m7G3'OMe)(5')ppp(5')(A1 2'OMe)pG2，其中A1是位置+1处的帽近端A并且G2是位置+2处的帽近端G，并且具有以下结构：
在一些实施方案中，Cap1结构是或包含(m7G3'OMe)(5')ppp(5')(G1 2'OMe)pG2，其中G1是位置+1处的帽近端G并且G2是位置+2处的帽近端G，并且具有以下结构：
在一些实施方案中，Cap1结构中的第二核苷酸可包含一个或多个修饰，例如甲基化。在一些实施方案中，包含含有2'O甲基化的第二核苷酸的Cap1结构是Cap2结构。
在一些实施方案中，相对于适当的参考比较物，包含Cap1结构的RNA多核苷酸具有增加的翻译效率、增加的翻译速率和/或增加的所编码的有效负载表达。在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含具有(m7G3'OMe)(5')ppp(5')(A1 2'OMe)pG2的Cap1结构，其中A1是位置+1处的帽近端核苷酸并且G2是位置+2处的帽近端核苷酸，相对于包含具有(m7G3'OMe)(5')ppp(5')(G1 2'OMe)pG2的Cap1结构的RNA多核苷酸具有增加的翻译效率，其中G1是位置1处的帽近端核苷酸并且G2是位置2处的帽近端核苷酸。在一些实施方案中，在将RNA多核苷酸施用于细胞或生物体后评估增加的翻译效率。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸中使用的帽类似物是m7G3'OMeGppp(m12’-OMe)ApG(有时也称为m27,3'-OMeG(5’)ppp(5’)m2’-Ome ApG或(m7G3'OMe)(5')ppp(5')(A2'OMe)pG)，其具有以下结构：
下面是一种示例性的Cap1 RNA，其包含RNA和m27,3`OMeG(5’)ppp(5’)m2’-OMeApG：
下面是另一种示例性的Cap1 RNA：
下面是一种示例性的ARCA：
5’-UTR和近端序列
在一些实施方案中，根据本公开使用的核酸(例如，DNA、RNA)包含5'-UTR。在一些实施方案中，5’-UTR可以包含多个不同的序列元件；在一些实施方案中，此类多个可以是或包含一个或多个特定序列元件的多个拷贝(例如，如可以来自特定来源或又称为功能或特征序列元件)。在一些实施方案中，5’UTR包含多个不同的序列元件。
术语“非翻译区”或“UTR”在本领域中通常用于指DNA分子中转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或指RNA多核苷酸(诸如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。5'-UTR(如果存在)位于5'末端，在多肽(例如，蛋白质)编码区的起始密码子的上游。5'-UTR位于5'帽(如果存在)的下游，例如，与5'帽紧邻。
在本公开的一些实施方案中，5'UTR是异源5’UTR，即，是在自然界中发现的与不同ORF相关联的5’UTR。在另一个实施方案中，5'UTR是合成的5’UTR，即，在自然界中不存在。在一些实施方案中，可以利用合成的5’UTR，诸如其序列相对于亲本参考5’UTR已经改变的5’UTR。本领域技术人员将认识到各种5’UTR序列改变，例如，所述改变可能已被报道增加与变体5’UTR相关的ORF的表达。
仅举几个例子，在一些实施方案中，所用的5'UTR可以是或包含来自诸如以下基因的5’UTR：α-球蛋白或β-球蛋白，诸如非洲爪蟾(Xenopus)或人α-球蛋白、β-球蛋白或oc-球蛋白(例如，如美国专利8278063和/或美国专利9012219中所述)基因、人细胞色素b-245a多肽、羟基类固醇(17b)脱氢酶、烟草蚀纹病毒(例如，如例如美国专利8278063和/或美国专利9012219中所述)。CMV立即早期1(IE1)基因(例如，如例如US2014/0206753、W02013/185069中所述)；HSD17B4、RPL32、ASAH1、ATP5A1、MP68、NDUFA4、NOSIP、RPL31、SLC7A3、TUBB4B、UBQLN2、PSMB3、RPS9、CASP1、COX6B1、NDUFA1、Rpl31、GNAS、ALB7。在一些实施方案中，5’UTR是或包含来自α-球蛋白基因或其变体的5’UTR。
在一些实施方案中，所利用的5'UTR的实施方案是TOP基因的5’UTR，例如缺少5'TOP基序(寡嘧啶束(oligopyrimidine tract))的TOP基因的5'UTR(例如，如例如WO/2015/101414、WO2015/101415、WO/2015/062738、WO2015/024667、WO2015/024667中所述)；核糖体蛋白大32(L32)基因的5'UTR元件(例如，如例如WO/2015/101414、WO2015/101415、WO/2015/062738中所述)、羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR元件(例如，如例如WO2015/024667中所述)，或ATP5Al的5'UTR元件(例如，如例如WO2015/024667中所述)可以使用。
在一些实施方案中，代替5'UTR或除了5'UTR之外，使用内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实施方案中，根据本公开使用的5'UTR是或包含以下序列：gggaaauaagagagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag accccggcgc cgccacc。在一些实施方案中，根据本公开使用的5'UTR是或包含以下序列：gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaagagccacc。在一些实施方案中，5’UTR可以是或包含序列GGGAUCCUACC(参见，例如，WO2014/144196)。在一些实施方案中，5’UTR可以是或包含如WO2021/156267的SEQ ID NO:231-252或22848-22875中的一个中所示的序列，或前述任一者的片段或变体。在一些实施方案中，5’UTR可以是或包含如WO2019/077001A1的权利要求9和/或SEQ ID NO:1-20中的一个或多个中所示的序列，或前述任一者的片段或变体。在一些实施方案中，5’UTR可以是或包含WO2013/143700中所示的一个，例如WO2013/143700的SEQ ID NO:1 -1363、SEQ ID NO:1395、SEQ ID NO:1421和SEQ ID NO:1422中的一个或多个，或前述任一者的片段或变体。在一些实施方案中，5’-UTR是或包含如WO2016/107877中，例如在WO2016/107877的SEQ IDNO:25-30或319-382中所述的5’UTR，或前述任一者的片段或变体。在一些实施方案中，5’-UTR是或包含如WO2017/036580中，例如在WO2017/036580的SEQ ID NO:1-151中所述的5’UTR，或前述任一者的片段或变体。在一些实施方案中，5’UTR是或包含如WO2016/022914中，例如在WO2016/022914的SEQ ID NO:3-19中所述的5’-UTR，或前述任一者的片段或变体。在一些实施方案中，5'UTR可包含来自该来源和/或来自不同来源的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段(参见，例如，美国专利申请公布号2010/0293625和PCT/US2014/069155中所述的5'UTR)。在一些实施方案中，根据本公开使用的5’UTR包含帽近端序列，例如，如本文所公开的。在一些实施方案中，帽近端序列包括与5’帽相邻的序列。在一些实施方案中，帽近端序列包括RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和/或+5位处的核苷酸。
在一些实施方案中，Cap结构包含帽近端序列的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1(N1)。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+2(N2)。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1和+2(N1和N2)。
阅读本公开的本领域技术人员将认识到，在一些实施方案中，帽近端序列的一个或多个残基(例如，残基+1、+2、+3、+4和/或+5中的一个或多个)可由于已被包含在帽实体(例如，Cap1结构等)中而被包含在RNA中；或者，在一些实施方案中，帽近端序列中的至少一些残基可以酶促添加(例如，通过聚合酶诸如T7聚合酶)。例如，在其中使用m27,3’-OGppp(m12’-O)ApG帽的某些示例性实施方案中，+1和+2是帽的(m12’-O)A和G残基，并且+3、+4和+5通过聚合酶(例如，T7聚合酶)添加。
在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N1和N2，其中N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，N1是A并且N2是A。在一些实施方案中，N1是A并且N2是C。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N1是A并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是C并且N2是A。在一些实施方案中，N1是C并且N2是C。在一些实施方案中，N1是C并且N2是G。在一些实施方案中，N1是C并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是G并且N2是A。在一些实施方案中，N1是G并且N2是C。在一些实施方案中，N1是G并且N2是G。在一些实施方案中，N1是G并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是U并且N2是A。在一些实施方案中，N1是U并且N2是C。在一些实施方案中，N1是U并且N2是G。在一些实施方案中，N1是U并且N2是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包含Cap结构的N1和N2以及N3、N4和N5，其中N1至N5对应于RNA多核苷酸的位置+1、+2、+3、+4和/或+5。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是A。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是C。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是G。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是A。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是G。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是C。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是A。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是C。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是G。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，N1、N2、N3、N4或N5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N3是U。在一些实施方案中，N4是U。在一些实施方案中，N5是U。
在一些实施方案中，本文公开的5’UTR包含帽近端序列，例如，如本文所公开的。在一些实施方案中，帽近端序列包括与5’帽相邻的序列。在一些实施方案中，帽近端序列包括RNA多核苷酸的+1、+2、+3、+4和/或+5位处的核苷酸。
在一些实施方案中，Cap结构包含帽近端序列的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1(N1)。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+2(N2)。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1和+2(N1和N2)。
在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C。在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C。在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，N1是A并且N2是A。在一些实施方案中，N1是A并且N2是C。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N1是A并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是C并且N2是A。在一些实施方案中，N1是C并且N2是C。在一些实施方案中，N1是C并且N2是G。在一些实施方案中，N1是C并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是G并且N2是A。在一些实施方案中，N1是G并且N2是C。在一些实施方案中，N1是G并且N2是G。在一些实施方案中，N1是G并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是U并且N2是A。在一些实施方案中，N1是U并且N2是C。在一些实施方案中，N1是U并且N2是G。在一些实施方案中，N1是U并且N2是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含以下的序列：A3A4X5。在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X5选自A、C、G或U。在一些实施方案中，X5是A。在一些实施方案中，X5是C。在一些实施方案中，X5是G。在一些实施方案中，X5是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含以下的序列：C3A4X5。在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X5选自A、C、G或U。在一些实施方案中，X5是A。在一些实施方案中，X5是C。在一些实施方案中，X5是G。在一些实施方案中，X5是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含X3Y4X5的序列。在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X3和X5各自独立地选自A、C、G或U。在一些实施方案中，X3和/或X5是A。在一些实施方案中，X3和/或X5是C。在一些实施方案中，X3和/或X5是G。在一些实施方案中，X3和/或X5是U。在一些实施方案中，Y4不是C。在一些实施方案中，Y4是A。在一些实施方案中，Y4是G。在一些实施方案中，Y4是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含X3Y4X5的序列。在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X3和X5各自独立地选自A、C、G或U。在一些实施方案中，X3和/或X5是A。在一些实施方案中，X3和/或X5是C。在一些实施方案中，X3和/或X5是G。在一些实施方案中，X3和/或X5是U。在一些实施方案中，Y4不是G。在一些实施方案中，Y4是A。在一些实施方案中，Y4是C。在一些实施方案中，Y4是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含A3C4A5的序列。在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含A3U4G5的序列。在一些实施方案中，N1和N2各自独立地选自：A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。
在一些实施方案中，Cap结构包含帽近端序列的一个或多个多核苷酸。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1(N1)。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+2(N2)。在一些实施方案中，Cap结构包含RNA多核苷酸的m7鸟苷帽和核苷酸+1和+2(N1和N2)。
在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C。在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A。在一些实施方案中，N1是C。在一些实施方案中，N1是G。在一些实施方案中，N1是U。在一些实施方案中，N2是A。在一些实施方案中，N2是C。在一些实施方案中，N2是G。在一些实施方案中，N2是U。
在一些实施方案中，N1是A并且N2是A。在一些实施方案中，N1是A并且N2是C。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，N1是A并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是C并且N2是A。在一些实施方案中，N1是C并且N2是C。在一些实施方案中，N1是C并且N2是G。在一些实施方案中，N1是C并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是G并且N2是A。在一些实施方案中，N1是G并且N2是C。在一些实施方案中，N1是G并且N2是G。在一些实施方案中，N1是G并且N2是U。
在一些实施方案中，N1是U并且N2是A。在一些实施方案中，N1是U并且N2是C。在一些实施方案中，N1是U并且N2是G。在一些实施方案中，N1是U并且N2是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含以下的序列：A3A4X5。在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X5选自A、C、G或U。在一些实施方案中，X5是A。在一些实施方案中，X5是C。在一些实施方案中，X5是G。在一些实施方案中，X5是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含以下的序列：C3A4X5。在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，X5是A。在一些实施方案中，X5是C。在一些实施方案中，X5是G。在一些实施方案中，X5是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含X3Y4X5的序列。在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X3和X5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，X3和/或X5是A。在一些实施方案中，X3和/或X5是C。在一些实施方案中，X3和/或X5是G。在一些实施方案中，X3和/或X5是U。在一些实施方案中，Y4不是C。在一些实施方案中，Y4是A。在一些实施方案中，Y4是G。在一些实施方案中，Y4是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含X3Y4X5的序列。在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。在一些实施方案中，X3和X5是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，X3和/或X5是A。在一些实施方案中，X3和/或X5是C。在一些实施方案中，X3和/或X5是G。在一些实施方案中，X3和/或X5是U。在一些实施方案中，Y4不是G。在一些实施方案中，Y4是A。在一些实施方案中，Y4是C。在一些实施方案中，Y4是U。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含A3C4A5的序列。在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。
在一些实施方案中，帽近端序列包括Cap结构的N1和N2，以及包含A3U4G5的序列。在一些实施方案中，N1和N2是任何核苷酸，例如A、C、G或U。在一些实施方案中，N1是A并且N2是G。
示例性的5’UTR包括人α球蛋白(hAg)5’UTR或其片段、TEV 5’UTR或其片段、HSP705’UTR或其片段、或c-Jun 5’UTR或其片段。
在一些实施方案中，本文公开的RNA包含hAg 5’UTR或其片段。
3’UTR
在一些实施方案中，如本文所述的RNA包含3'-UTR。“3’-非翻译区”或“3’-UTR”或“3’-UTR元件”将被本领域普通技术人员识别和理解。如本领域中已知的，3’UTR通常是位于编码序列3’(即下游)的核酸分子的一部分并且不被翻译成蛋白质。在一些实施方案中，3’-UTR可以位于编码序列与(任选的)末端poly(A)序列之间。在一些实施方案中，3’-UTR可包含用于控制基因表达的元件，诸如可称为调控元件的元件。此类调控元件可以是或包含例如核糖体结合位点、miRNA结合位点等。
3'-UTR(如果存在)位于3'末端，在多肽(例如，蛋白质)编码区的终止密码子的下游，但术语“3'-UTR”优选不包括poly(A)序列。因此，3'-UTR在poly(A)序列(如果存在)的上游，例如紧邻poly(A)序列。
在一些实施方案中，本文公开的RNA包含含有F元件和/或I元件的3’UTR。在一些实施方案中，3’UTR或其近端序列包含限制性位点。在一些实施方案中，限制性位点是BamHI位点。在一些实施方案中，限制性位点是XhoI位点。
在一些实施方案中，RNA构建体包含F元件。在一些实施方案中，F元件序列是氨基末端分裂增强子(amino-terminal enhancer of split，AES)的3’-UTR。
在一些实施方案中，本文公开的RNA包含与具有包含以下的序列的3’UTR具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的3’UTR：CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUG CCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，本文公开的RNA包含SEQ ID NO:60中提供的3’UTR。
在一些实施方案中，3’UTR是如WO2017/060314中所述的FI元件。
仅举几个例子，在一些实施方案中，所利用的3’UTR可以是或包含来自基因的3’UTR，诸如球蛋白UTR，包括非洲爪蟾β-球蛋白UTR和人β-球蛋白UTR，这是本领域中已知的(参见，例如，8278063、9012219、US201l/0086907)。在一些实施方案中，可以利用在一些细胞类型中具有增强的稳定性的修饰的β-球蛋白构建体；据报道，这种构建体是通过头尾相连地克隆两个连续的人β-球蛋白3'UTR而制备的(US2012/0195936、WO2014/071963)。此外，α2-球蛋白、αl-球蛋白、UTR及其变体也是本领域中已知的(WO2015/101415、WO2015/024667)。非专利文献中的mRNA构建体中描述的示例性3'UTR包括来自CYBA(Ferizi等人,2015)和白蛋白(Thess等人,2015)的那些。在一些实施方案中，示例性的3'UTR包括牛或人生长激素(野生型或修饰的)的3'UTR(WO2013/185069、US2014/0206753、WO2014152774)，兔β球蛋白和乙型肝炎病毒(HBV)的3'UTR、α-球蛋白3'UTR和病毒VEEV 3'UTR序列也是本领域已知的。在一些实施方案中，使用序列UUUGAAUU(W02014/144196)。在一些实施方案中，使用人和/或小鼠核糖体蛋白的3'UTR。在一些实施方案中，实例包括rps9 3'UTR(W02015/101414)、FIG4(W02015/101415)和人白蛋白7(WO2015/101415)。在一些实施方案中，核酸包含至少一个异源3’-UTR，其中至少一个异源3’-UTR包含衍生自选自PSMB3、ALB7、α-球蛋白(称为“muag”)、CASP1、COX6B1、GNAS、NDUFA1和RPS9的基因的或来自这些基因中的任一种的同源物、片段或变体的3'-UTR的核酸序列。
在一些实施方案中，所利用的3’UTR可以如例如公布的PCT申请WO2019/077001A1、特别是WO2019/077001A1的权利要求9中所例示。在一些实施方案中，3’UTR可以是或包含WO2019/077001A1的SEQ ID NO:23-34中的一个或其片段或变体)。在一些实施方案中，根据本公开使用的3’UTR包含序列：ugauaauagg cuggagccuc gguggccuag cuucuugccccuugggccuc cccccagccc cuccuccccu uccugcaccc guacccccgu ggucuuugaa uaaagucugagugggcggc。在一些实施方案中，本公开的3’UTR包含序列：ugauaauagg cuggagccucgguggccaug cuucuugccc cuugggccuc cccccagccc cuccuccccu uccugcaccc guacccccguggucuuugaa uaaagucuga gugggcggc。在一些实施方案中，核酸可以包含如WO2016/107877中所述的3’-UTR。在一些实施方案中，合适的3’-UTR是WO2016/107877的SEQ ID NO:1-24和SEQ ID NO:49-318，或这些序列的片段或变体。在一些实施方案中，可以利用如WO2017/036580中所述的3’-UTR。在一些实施方案中，合适的3’-UTR是WO2017/036580的SEQ ID NO:152-204，或这些序列的片段或变体。在一些实施方案中，使用如WO2016/022914中所述的3’-UTR。在一些实施方案中，3’-UTR是或包含根据WO2016/022914的SEQ ID NO:20-36的序列，或这些序列的片段或变体。
PolyA
在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸(例如，DNA、RNA)包含例如如本文所述的聚腺苷酸(PolyA)序列。在一些实施方案中，PolyA序列位于3'-UTR下游，例如与3'-UTR相邻。
如本文所用，术语“poly(A)序列”或“poly-A尾”是指通常位于RNA多核苷酸的3'末端的腺苷酸残基的不间断或间断序列。Poly(A)序列是本领域技术人员已知的并且可以位于本文所述的RNA中的3’-UTR之后。不间断的poly(A)序列的特征是连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly(A)序列是典型的。在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸包含不间断的Poly(A)序列。在一些实施方案中，本文公开的多核苷酸包含间断的Poly(A)序列。在一些实施方案中，本文公开的RNA可具有在转录后通过不依赖模板的RNA聚合酶附接至RNA的游离3'末端的poly(A)序列，或由DNA编码并通过模板依赖性RNA聚合酶转录的poly(A)序列。
已经证明约120个A核苷酸的poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及对从存在于poly(A)序列上游(5')的开放阅读框翻译的多肽(例如，蛋白质)的水平具有有益影响(Holtkamp等人,2006,Blood,第108卷,第4009-4017页)。
在一些实施方案中，根据本公开的poly(A)序列不限于特定长度；在一些实施方案中，poly(A)序列是任何长度。在一些实施方案中，poly(A)序列包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个且最多至1000个、最多至500个、最多至400个、最多至300个、最多至200个或最多至150个A核苷酸，并且特别是约120个A核苷酸，基本上由其组成或由其组成。在此上下文中，“基本上由……组成”意指poly(A)序列中的大多数核苷酸(按poly(A)序列中核苷酸的数量计通常至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％)是A核苷酸，但允许其余核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，诸如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在此上下文中，“由……组成”意指poly(A)序列中的所有核苷酸(即，按poly(A)序列中核苷酸的数量计100％)是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录过程中，例如在制备体外转录的RNA的过程中，附接poly(A)序列。编码poly(A)序列的DNA序列(编码链)称为poly(A)盒。
在一些实施方案中，DNA编码链中存在的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被四种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50、10至30、或10至20个核苷酸。这样的盒公开于WO 2016/005324 A1中，其据此通过引用并入。根据本公开可以使用WO 2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒。基本上由dA核苷酸组成但被具有四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)的均等分布且具有例如5至50个核苷酸的长度的随机序列中断的poly(A)盒显示出，在DNA水平上，质粒DNA在大肠杆菌中的不断增殖，并且在RNA水平上仍然与支持RNA稳定性和翻译效率方面的有益特性相关。在一些实施方案中，本文所述的RNA多核苷酸中包含的poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但被四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50、10至30、或10至20个核苷酸。
在一些实施方案中，poly(A)序列在其3'末端侧翼没有除A核苷酸以外的核苷酸，即，poly(A)序列在其3'末端未被除A以外的核苷酸掩蔽或跟随。
在一些实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个且最多至500个、最多至400个、最多至300个、最多至200个或最多至150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列可以基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个且最多至500个、最多至400个、最多至300个、最多至200个或最多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列可以由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个且最多至500个、最多至400个、最多至300个、最多至200个或最多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约120个核苷酸。
在一些实施方案中，poly A尾包含特定数量的腺苷，诸如约50个或更多、约60个或更多、约70个或更多、约80个或更多、约90个或更多、约100个或更多、约120个、或约150个或约200个。在一些实施方案中，串构建体的poly A尾可以包含200个或更少的A残基。在一些实施方案中，串构建体的poly A尾可以包含约200个A残基。在一些实施方案中，串构建体的poly A尾可以包含180个或更少的A残基。在一些实施方案中，串构建体的poly A尾可以包含约180个A残基。在一些实施方案中，poly A尾可以包含150个或更少的残基。
在一些实施方案中，poly(A)序列可以包含约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸、或约40至约150个腺苷核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列的长度可以是至少约或甚至多于约10、50、64、75、100、200、300、400或500个腺苷核苷酸。
在一些实施方案中，核酸包含至少一个包含约30至约200个腺苷核苷酸的poly(A)序列。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约64个腺苷核苷酸(A64)。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约100个腺苷核苷酸(A100)。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约150个腺苷核苷酸。
在一些实施方案中，核酸包含至少一个包含约100个腺苷核苷酸的poly(A)序列，其中poly(A)序列被非腺苷核苷酸、优选地被10个非腺苷核苷酸中断(A30-N10-A70)。
开放阅读框
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA包含开放阅读框(ORF)，例如，编码感兴趣的多肽或编码多种感兴趣的多肽。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA包含多个ORF(例如，编码多种多肽)。在一些实施方案中，根据本文的技术产生的RNA包含单个编码多种多肽的ORF。在一些此类实施方案中，多肽是或包含抗原或其表位(例如，相关抗原)。
仅举一些例子，在一些实施方案中，所编码的多肽可以是或包含抗原或其表位，使得当在被施用所提供的RNA的受试者中表达时，产生免疫响应(例如，其特征在于特异性地针对抗原或其一个或多个表位的抗体和/或T细胞)；在一些此类实施方案中，所编码的多肽可以是多表位的，例如包括多个多肽元件，每个多肽元件包括至少一个表位，彼此连接并且任选地通过接头分开。如本领域所理解的，在一些实施方案中，多表位构建体可以包括在自然界的同一蛋白质的不同部分中发现的单独表位。可替代地或另外地，在一些实施方案中，多表位构建体可以包括在自然界的不同蛋白质中发现的单独表位。本领域技术人员将意识到与根据本公开可用的期望的多表位构建体和/或包含在其中的抗原和/或表位的选择相关的多种考虑因素(参见，例如，WO2014082729、WO2012159754、WO2017173321、WO2014180659、WO20161283762、WO2017194610、WO2011143656、WO2015103037、Nielsen JS等人J Immunol Methods.2010年8月31日；360(1-2):149-56.,“Polyepitope VaccineTechnology.”Polyepitope Vaccine Technology-Creative Biolabs,www.creative-biolabs.com/vaccine/polyepitope-vaccine-technology.htm.、Li,L.等人GenomeMed13,56(2021).、Cafri G.等人Journal of Clinical Investigation 130,5976-5988(2020)、Khairkhah N.等人(2020)PLOS ONE 15(10):e0240577.)。
在一些实施方案中，相关抗原可以是或包含感染性抗原(即，与感染原诸如感染性病毒、细菌、真菌等相关的抗原)和/或癌抗原(例如，与一类肿瘤或特定肿瘤相关的抗原；在一些实施方案中，癌症相关抗原可以是或包含新抗原或新表位)或其表位。
可替代地或另外地，在一些实施方案中，ORF可以编码例如抗体或其部分(例如，抗原结合部分)、酶、细胞因子、治疗性蛋白质等(参见，例如，WO2017186928、WO2017191274、US10669322、Dammes等人Trens Pharmacol Sci 4:755,2020-10-01、Wang等人NatureReviews Drug Discovery 19,441-442(2020)、Damase等人Front.Bioeng.Biotechnol.,2021年3月18日)。
在一些实施方案中，根据本公开使用的ORF编码包括信号序列的多肽，例如，在哺乳动物细胞中具有功能的信号序列。
在一些实施方案中，所利用的信号序列是“内在的”，因为其本质上与所编码的多肽相关(例如，连接)。
在一些实施方案中，所利用的信号序列与所编码的多肽是异源的——例如，不是序列包括在所编码的多肽中的多肽(例如，蛋白质)的天然部分。
在一些实施方案中，信号肽是通常以约15至30个氨基酸的长度为特征的序列。
在许多实施方案中，信号肽位于如本文所述的所编码的多肽的N末端，但不限于此。在一些实施方案中，信号肽优选允许将与它们相关的由本公开的RNA编码的多肽转运到限定的细胞区室中，优选细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶体区室。
在一些实施方案中，信号序列选自S1S2信号肽(aa 1-19)、免疫球蛋白分泌信号肽(aa 1-22)、HSV-1gD信号肽(MGGAAARLGAVILF VVIVGLHGVRSKY)、HSV-2gD信号肽(MGRLTSGVGTAALLVVA VGLRVVCA)；人SPARC信号肽、人胰岛素同工型1信号肽、人白蛋白信号肽等。本领域技术人员将意识到其他分泌信号肽，例如，如WO2017/081082(例如，SEQ IDNO:1-1115和1728或其片段或变体)和WO2019008001中所公开的。
在一些实施方案中，RNA序列编码表位，所述表位可以包含或以其他方式连接至信号序列(例如，分泌序列)，诸如表1中列出的那些序列，或至少与其相比具有1、2、3、4或5个氨基酸差异的序列。在一些实施方案中，利用信号序列诸如MFVFLVLLPLVSSQCVNLT，或至少与其相比具有1、2、3、4或至多5个氨基酸差异的序列。在一些实施方案中，利用诸如MFVFLVLLPLVSSQCVNLT的序列，或与其相比具有1、2、3、4或至多5个氨基酸差异的序列。
在一些实施方案中，信号序列选自下表1中所包括的那些和/或由下表2中的序列编码的那些：
表1：示例性信号序列
表2：编码信号序列的示例性核苷酸序列
在一些实施方案中，如本文所述利用的RNA编码多聚化元件(例如，异源多聚化元件)。在一些实施方案中，异源多聚化元件包括二聚化、三聚化或四聚化元件。
在一些实施方案中，多聚化元件是WO2017/081082中描述的元件(例如，SEQ IDNO:1116-1167或其片段或变体)。
示例性的三聚化和四聚化元件包括但不限于工程化的亮氨酸拉链、来自肠杆菌噬菌体T4的纤维蛋白foldon结构域、GCN4pll、GCN4-pll和p53。
在一些实施方案中，所提供的所编码的多肽能够形成三聚复合物。例如，所使用的编码多肽可以包含允许形成多聚复合物的结构域，例如特别是包含如本文所述的编码多肽的氨基酸序列的三聚复合物。在一些实施方案中，允许形成多聚复合物的结构域包含三聚化结构域，例如，如本文所述的三聚化结构域。
在一些实施方案中，可以通过添加T4-纤维蛋白衍生的“foldon”三聚化结构域来修饰编码多肽，例如以增加其免疫原性。
在一些实施方案中，如本文所述的RNA编码膜缔合元件(例如，异源膜缔合元件)，诸如跨膜结构域。
跨膜结构域可以位于编码多肽的N末端、C末端或内部。跨膜元件的编码序列通常位于与其连接的序列(例如，编码多肽的序列)的框中(即，在同一阅读框中)、5'、3'或编码序列内部。
在一些实施方案中，跨膜结构域包含或是流感病毒的血凝素(HA)、HIV-1的Env、马传染性贫血病毒(EIAV)、鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺肿瘤病毒、水疱性口炎病毒(VSV)的G蛋白、狂犬病病毒或七跨膜结构域受体的跨膜结构域。
密码子优化
在一些实施方案中，编码本公开的多肽的ORF是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的ORF可以是密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可以用于匹配目标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏向GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base runs)最小化；定制转录和翻译控制区域；插入或移除多肽运输序列；移除/添加编码多肽中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、移除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制性位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以允许多肽的各个结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的——非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)的服务和/或专有方法。在一些实施方案中，使用优化算法来优化开放阅读框(ORF)序列。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列ORF(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有小于75％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有介于65％与85％之间(例如，介于约67％与约85％之间或介于约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码多肽的天然存在的或野生型的mRNA序列)具有介于65％与75％之间或约80％的序列同一性。
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码多肽(例如，抗原)，所述多肽与由非密码子优化的序列编码的多肽具有相同的免疫原性，或具有比其更高的免疫原性(例如，多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、或至少200％)。
在一些实施方案中，当转染到哺乳动物宿主细胞中时，修饰的mRNA具有介于12-18小时之间或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施方案中，密码子优化的RNA可以是其中G/C水平增强和/或A/U水平增强的RNA。在一些实施方案中，核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA可以在功能上比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。作为一个实例，WO02/098443公开了一种包含因翻译区域中的序列修饰而稳定的mRNA的药物组合物。在一些实施方案中，由于遗传密码的简并性，修饰通过用那些促进例如更大的RNA稳定性而不改变所得的氨基酸的密码子取代现有密码子而起作用。在一些实施方案中，该方法局限于RNA的编码区域。
核苷酸含量
在一些实施方案中，如本文所述的RNA和/或ORF包含核苷酸三磷酸的特定组成；在一些实施方案中，如本文所述的RNA和/或ORF不限于包含核苷酸三磷酸的任何特定组成。
在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比x。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比y。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物的摩尔比z。在一些此类实施方案中，摩尔比x为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些此类实施方案中，摩尔比y为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些此类实施方案中，摩尔比y为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些此类实施方案中，摩尔比z为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在一些实施方案中，RNA和/或ORF中的相关摩尔比不同于反应混合物中的相应比率。
在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多的ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的核苷酸含量。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多的CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的核苷酸含量。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多的GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的核苷酸含量。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多的UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的核苷酸含量。
在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比v。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比w。在一些实施方案中，ORF和/或RNA分子包含总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物的摩尔比q。在一些此类实施方案中，摩尔比v为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些此类实施方案中，摩尔比w为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。在一些此类实施方案中，摩尔比q为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4.1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
生产
在一些实施方案中，本公开提供的技术通过例如在生物反应器中通过IVT合成RNA来实现RNA组合物和/或制剂(例如，药物级RNA制剂，包括大批量制剂)的生产。在一些实施方案中，包含所产生的RNA的组合物和/或制剂包含至少1mg/mL(包括，例如，至少1.5mg/mL、至少2mg/mL、至少2.5mg/mL、至少3mg/mL、至少3.5mg/mL、至少4mg/mL、至少4.5mg/mL、至少5mg/mL、至少6mg/mL或更高)的特定浓度的RNA。在一些实施方案中，所产生的RNA可以以1.5mg/mL至5mg/mL或2mg/mL至4mg/mL的浓度存在。在一些实施方案中，RNA(例如，治疗性mRNA)例如在生物反应器中通过IVT由DNA模板合成，例如，在包含例如至少一种RNA聚合酶和适当的核苷酸三磷酸或其变体(例如，修饰的核糖核苷酸三磷酸)的存在下。在一些实施方案中，可用于IVT的生物反应器对于至少1升(包括，例如，至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7,5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50升或更多)的IVT反应体积来说足够大。在一些实施方案中，对于商业规模IVT特别有用的生物反应器对于至少20升(包括，例如，至少25、30、40、45、50升或更多)的IVT反应体积来说足够大。
示例性起始物质
DNA模板
本领域普通技术人员将理解，核酸模板(例如，DNA模板)用于指导RNA(例如，单链RNA，例如，治疗性RNA)的合成。在一些实施方案中，DNA模板是线性DNA分子。在一些实施方案中，DNA模板是环状DNA分子。DNA可以使用本领域已知的方法(包括例如基因合成、重组DNA技术或其组合)获得或生成。在一些实施方案中，DNA模板包含编码感兴趣的转录区域(例如，编码本文所述的RNA)的核苷酸序列以及被选择用于IVT的RNA聚合酶识别的启动子序列。在一些实施方案中，DNA模板包含编码多个感兴趣的转录区域的核苷酸序列以及一个或多个被选择用于IVT的RNA聚合酶识别的启动子序列。各种RNA聚合酶是本领域已知的，包括例如DNA依赖性RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、N4病毒体RNA聚合酶或其变体或功能结构域)。本领域普通技术人员将容易理解，本文所用的RNA聚合酶可以是重组RNA聚合酶和/或纯化的RNA聚合酶，即，不是作为细胞提取物(其含有除RNA聚合酶以外的其他组分)的一部分，和/或可以是野生聚合酶的变体(例如，与此类野生型聚合酶共享一个或多个特征序列元件——例如，足以赋予聚合活性，和/或与此类野生型聚合酶具有至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％<96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性)。在一些实施方案中，所使用的聚合酶是可商购获得的聚合酶(例如，来自诸如ThermoFisher、New England Biolabs的来源)。本领域普通技术人员将认识到用于所选RNA聚合酶的适当的启动子序列。在一些实施方案中，DNA模板包含T7 RNA聚合酶的启动子序列。
在一些实施方案中，DNA模板包含编码本文所述的RNA的核苷酸序列(例如，包含编码感兴趣的多肽的核苷酸序列并且任选地包含编码本文所述的RNA的特征元件(包括例如polyA尾、3’UTR和/或5’UTR等)的一个或多个核苷酸序列)。在一些实施方案中，可以通过基因合成来产生这样的编码序列。在一些实施方案中，可以通过本领域已知的任何适当的克隆方法(例如，冷融合克隆、吉布森组装(Gibson assembly)等)将这样的编码序列插入载体中。
在一些实施方案中，DNA模板还可包含适当的限制性内切核酸酶(例如，用于线性化)的识别序列、适当的抗性基因和/或适当的复制起点中的一种或多种。在一些实施方案中，DNA模板还可包含适当的限制性内切核酸酶(例如，用于线性化，诸如但不限于II类限制性内切核酸酶)的识别序列、适当的抗性基因(例如但不限于卡那霉素抗性基因)和适当的复制起点。
在一些实施方案中，可以通过聚合酶链式反应(PCR)从质粒DNA扩增DNA模板。在一些实施方案中，质粒DNA可以例如从细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))获得，然后进行无内毒素且无动物产物的质粒分离程序。
在一些实施方案中，DNA模板可以是在不存在基于PCR的扩增的情况下的线性化的质粒DNA(pDNA)模板。在一些此类实施方案中，可以建立感兴趣的pDNA(例如，如本文所述)的细胞库或细胞储液。例如，在一些实施方案中，这样的细胞库或细胞储液可以包含细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞，诸如DH10B大肠杆菌细胞)的冷冻储液，所述细胞被基因工程化以包含具有预定规格的感兴趣的pDNA模板(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，pDNA含有启动子序列(例如T7RNA聚合酶)。在一些实施方案中，pDNA含有核酸内切酶的识别序列(例如，用于线性化)。在一些实施方案中，pDNA含有抗性基因。在一些实施方案中，pDNA含有复制起点。在一些实施方案中，pDNA含有启动子序列、核酸内切酶的识别序列、抗性基因和/或复制起点中的一个或多个。
在一些实施方案中，DNA模板(例如，线性DNA模板)浓度(g/LIVT起始体积)为至少约0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15g/L。在一些实施方案中，DNA模板(例如，线性DNA模板)起始浓度为约0.01-0.15、0.02-0.14、0.03-0.13、0.04-0.12、0.05-0.11、0.06-0.11、0.07-0.11、0.08-0.11-0.09-0.11g/L。
核糖核苷酸
用于体外转录的核糖核苷酸可包括至少两种或更多种(例如，至少三种或更多种、至少四种或更多种、至少五种或更多种、至少六种或更多种)不同类型的核糖核苷酸，每种类型具有不同的核苷。用于体外转录的核糖核苷酸可以包括未修饰和/或修饰的核糖核苷酸。未修饰的核糖核苷酸包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在一些实施方案中，所有四种类型的未修饰的核糖核苷酸都可用于体外转录。
在一些实施方案中，体外转录中包括的至少一种类型的核糖核苷酸是修饰的核糖核苷酸。修饰的核糖核苷酸可包括一个或多个修饰，包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5'端修饰(例如，磷酸化、去磷酸化、缀合、反向键联等)、3'端修饰(例如，缀合、反向键联等)，(b)碱基修饰，例如用修饰的碱基、稳定碱基、去稳定碱基或与扩增的配偶体所有组成成分碱基配对的碱基或者缀合的碱基替换，(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置处)或糖的替换，以及(d)核苷间键联修饰，包括磷酸二酯键联的修饰或替换。就此类修饰干扰翻译的程度而言(例如，相对于不存在修饰，导致翻译减少50％或更多—例如，如使用兔网织红细胞体外翻译测定所表征的)，此类修饰的核糖核苷酸在一些实施方案不适合用于本文所述的系统和方法。
在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸可具有至少一个核苷(“碱基”)修饰或取代。各种核苷修饰或取代是本领域已知的；本领域技术人员将理解，修饰的核苷包括例如但不限于合成和天然核碱基，诸如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素(nubularine)、异鸟苷、杀结核菌素(tubercidine)、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2-(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2-(氨基丙基)腺嘌呤、2-(甲基硫基)-N6-(异戊烯基)腺嘌呤、6-(烷基)腺嘌呤、6-(甲基)腺嘌呤、7-(脱氮)腺嘌呤、8-(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8-(炔基)腺嘌呤、8-(氨基)腺嘌呤、8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8-(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6-(甲基)腺嘌呤、N6,N6-(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2-(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6-(甲基)鸟嘌呤、7-(烷基)鸟嘌呤、7-(甲基)鸟嘌呤、7-(脱氮)鸟嘌呤、8-(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8-(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8-(卤代)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8-(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N-(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3-(脱氮)-5-(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3-(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5-(卤代)胞嘧啶、5-(甲基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(丙炔基)胞嘧啶、5-(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮基)胞嘧啶、N4-(乙酰基)胞嘧啶、3-(3氨基-3羧丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5-(甲基)-2,4-(二硫代)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5-(氨基烯丙基)尿嘧啶、5-(氨基烷基)尿嘧啶、5-(胍基烷基)尿嘧啶、5-(1,3-二唑-l烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5-(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸、5-(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5-(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(丙炔基)尿嘧啶、5-(三氟甲基)尿嘧啶、6-(偶氮基)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3-(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2-(硫代)假尿嘧啶、4-(硫代)假尿嘧啶、2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶、1-取代的假尿嘧啶(例如，1-甲基-假尿苷)、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、1-取代的-2(硫代)-假尿嘧啶、1-取代的4(硫代)假尿嘧啶、1-取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙基烯基)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙基烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙基烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基羰基乙基烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基乙基烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙基烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基乙基烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1-(氨基烷基氨基羰基乙基烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-苯噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-苯噁嗪-1-基、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-苯噁嗪-1基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-苯噁嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-苯噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-苯噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-苯噁嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-苯噁嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、水粉蕈素、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-脱氮肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、稠五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮基)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2,6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、取代的1,2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻位-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或者它们的任何O-烷基化或N烷基化衍生物。
在一些实施方案中，本文所述的IVT系统和/或方法中使用的修饰的核苷酸可破坏RNA与一种或多种哺乳动物(例如，人)内源性RNA传感器(例如，先天免疫RNA传感器)(包括例如但不限于toll样受体(TLR)3、TLR7、TLR8、视黄酸诱导型基因I(RIG-I)、黑素瘤分化相关基因5(MDA5)、蛋白激酶R(PKR)、2'-5'寡腺苷酸合成酶(OAS)以及遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2)以及它们的组合)的结合。在一些实施方案中，此类修饰的核糖核苷酸可包括如US 9,334,328(其内容出于本文所述的目的整体以引用方式并入本文)中所述的修饰。通常期望修饰的核苷在宿主细胞中是可翻译的(例如，修饰的核苷的存在不会阻止RNA序列翻译成相应的多肽序列)。修饰的核苷酸对翻译的影响可以由本领域普通技术人员使用例如兔网织红细胞裂解物翻译测定来测定。
在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸可包括修饰的核苷间键联。各种此类修饰的核苷间键联是本领域已知的；本领域技术人员将理解，可用于本文提供的技术中的修饰的核苷间键联的非限制性实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键联的硼烷磷酸酯、这些的2'-5'连接的类似物以及其中相邻的核苷单元对按3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接的具有反向极性的那些。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。其中不包括磷原子的修饰的核苷间键联可具有由短链烷基或环烷基核苷间键联、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键联或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键联形成的核苷间键联。这些包括具有吗啉代键联(部分由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他。
在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸可包括一个或多个取代的糖部分。各种此类修饰的糖部分是本领域已知的；本领域技术人员将理解，在一些实施方案中，核糖核苷酸的糖部分可在2'位置处包含以下项中的一种：H(脱氧核糖)；OH(核糖)；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的。在一些实施方案中，核糖核苷酸的糖部分可以包括2'甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)、2'-二甲基氨基氧基乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE)和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)(即2'-O-CH2-OCH2-N(CH2)2)、2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。还可以在其他位置(例如，在3'末端核苷酸上或在2'-5'连接的核苷酸中的糖的3'位置以及5'末端核苷酸的5'位置)进行类似的修饰。
在一些实施方案中，可用于体外转录反应的核糖核苷酸的混合物可以包含ATP、CTP、GTP和N1-甲基假尿苷-5'三磷酸(m1ΨTP)。
本领域技术人员知道，许多标准体外转录反应利用其中核糖核苷酸(即，ATP、CTP、GTP和UTP)以1:1:1:1的比率使用的反应混合物(即，其中ATP或ATP类似物(一起考虑)的摩尔量等于反应混合物中CTP或CTP类似物(一起考虑)的摩尔量，等等)。在一些实施方案中，标准或对照IVT反应利用其中每种核糖核苷酸(例如，ATP、CTP、GTP和UTP)以9mM的浓度存在的反应混合物。
在一些实施方案中，对用于IVT反应的反应混合物中的ATP、CTP、GTP、UTP(包括一种或多种NTP类似物)的比率进行优化，以改善产率和/或完整性和/或减少异常产物(例如，dsRNA)的产生。在一些实施方案中，总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物与总GTP和/或一种或多种功能类似物的摩尔比a为0.5、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高。在一些实施方案中，a为至少1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90或更大。在一些实施方案中，a为至少1.5。在一些实施方案中，a是x的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍，其中x是总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比。在一些实施方案中，a是x的至少约1.15倍。在一些实施方案中，a是x的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，总CTP和/或一种或多种功能类似物与总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的摩尔比b为0.5、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高。在一些实施方案中，b为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75、1.80、1.85、1.90或更大。在一些实施方案中，b为至少1.5。在一些实施方案中，b是y的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍，其中y是总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比。在一些实施方案中，b是y的至少约1.15倍。在一些实施方案中，b是y的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，总CTP和/或一种或多种功能类似物与总腺苷三磷酸(ATP)和/或一种或多种功能性ATP类似物的摩尔比c为0.5、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高。在一些实施方案中，c为至少1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。在一些实施方案中，c为至少1.25。在一些实施方案中，c是z的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍，其中z是总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物的摩尔比。在一些实施方案中，c是z的至少约1.15倍。在一些实施方案中，c是z的至少约1.20倍。
在一些实施方案中，a为至少1.25和/或a是x的至少约1.10倍。在一些实施方案中，b为至少1.25和/或b是y的至少约1.10倍。在一些实施方案中，c为至少1.10和/或c是z的至少约1.10倍。
在一些实施方案中，起始CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物体积(ml/L起始IVT体积)为至少约85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150ml/L或更高。在一些实施方案中，起始CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物体积为约80-150、85-145或90-140ml/L。
在一些实施方案中，起始ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物体积(ml/L起始IVT体积)为至少约85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150ml/L或更高。在一些实施方案中，起始ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物体积为约80-150、85-145、85-140或85-135ml/L。
在一些实施方案中，起始GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物体积(ml/L起始IVT体积)为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml/L或更高。在一些实施方案中，起始GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物体积为约1-10、2-9、3-8、4-7、4-6或4-5ml/L。
在一些实施方案中，起始UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物体积(ml/L起始IVT体积)为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ml/L或更高。在一些实施方案中，起始UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物体积为约1-10、2-9、3-8、4-7、4-6或4-5ml/L。
在一些实施方案中，根据本公开用于体外转录的反应混合物中ATP、CTP、GTP和m1ΨTP的比率独立于正在生成的转录物中存在的比率。
5’帽
在一些实施方案中，通过本文所述技术产生的RNA可在其5’末端包含帽。本领域技术人员将理解，向RNA(例如，mRNA)添加5'帽可以促进RNA识别和附接到核糖体以启动翻译并增强翻译效率。本领域技术人员还将理解，5'帽还可以保护RNA产物免受5'外切核酸酶介导的降解，并因此增加半衰期。用于加帽的方法是本领域已知的；本领域普通技术人员将理解，在一些实施方案中，加帽可在体外转录后在加帽系统(例如，基于酶的加帽系统，诸如牛痘病毒的加帽酶)的存在下进行。在一些实施方案中，加帽的RNA可通过用加帽酶系统(包括例如但不限于牛痘加帽酶系统或酿酒酵母加帽酶系统)对具有5'三磷酸基团的RNA或具有5'二磷酸基团的RNA进行体外加帽来获得。在一些实施方案中，可将加帽剂连同多个核糖核苷酸一起引入体外转录反应混合物(例如，如本文所述的体外转录反应混合物)中，使得在转录(也称为共转录加帽)过程中将帽掺入RNA中。虽然在一些实施方案中可能期望在RNA中包括5'帽，但是在一些实施方案中，RNA可不具有5'帽。
在一些实施方案中，可以将5'加帽剂添加到体外转录反应混合物中。在一些实施方案中，5'加帽剂可包含修饰的核苷酸，例如修饰的鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，5’加帽剂可包含例如一个或多个甲基、甘油基、反向脱氧无碱基部分、4’5’亚甲基核苷酸、l-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4’硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α核苷酸、修饰的碱基核苷酸、苏式-呋喃戊糖基核苷酸、无环3',4'-断核苷酸、无环3,4-二羟丁基核苷酸、无环3,5二羟戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向无碱基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或者桥连或非桥连甲基膦酸酯部分、肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7’脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷。在一些实施方案中，5’加帽剂可以是或包含二核苷酸帽类似物(包括例如m7GpppG帽类似物或N7-甲基、2'-O-甲基-GpppG抗反向帽类似物(ARCA)帽类似物或N7-甲基、3'-O-甲基-GpppG ARCA帽类似物)。在一些实施方案中，5’加帽剂包含5'N7-甲基-3'-O-甲基鸟苷结构，例如试剂(Trilink BioTechnologies)。在一些实施方案中，将5'-加帽剂过量添加到一种或多种特定核糖核苷酸(例如，GTP、ATP、UTP、CTP或其修饰型式)中，以能够将5'帽作为第一次添加掺入RNA转录物中。
聚合酶
适合于转录反应的各种RNA聚合酶是本领域已知的，包括但不限于RNA聚合酶。在一些实施方案中，RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、N4病毒体RNA聚合酶，或其变体或功能结构域)。天然催化的RNA依赖性RNA聚合酶通常由除逆转录病毒外的所有RNA病毒编码。编码RNA依赖性RNA聚合酶的病毒的典型代表是甲病毒。技术人员将理解，本文使用的RNA聚合酶可以是重组RNA聚合酶和/或纯化的RNA聚合酶，即不作为细胞提取物的一部分，细胞提取物除了含有RNA聚合酶之外还含有其他组分。在一些实施方案中，可用于商业规模转录的RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。在一些实施方案中，可添加无机焦磷酸酶以提高转录反应的产率(例如，在一些实施方案中，由T7 RNA聚合酶催化)。
示例性体外转录反应
本领域普通技术人员将意识到通常包括在IVT反应混合物中的组分。例如，IVT反应混合物通常包括核酸模板(例如，DNA模板，例如如本文所述)、核糖核苷酸(例如，如本文所述)、RNA聚合酶(例如，DNA依赖性RNA聚合酶)。
在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为0.05-2μg/μL(包括，例如，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0μg/μL)的核酸模板。在一些实施方案中，反应混合物包含约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90ml/L的RNA聚合酶体积(ml/L起始IVT体积)。在一些实施方案中，反应混合物包含约70-90、72-88、72-90或70-88ml/L的RNA聚合酶体积。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还包含反应缓冲液、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶、一种或多种盐、还原剂和/或亚精胺中的一种或多种。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还包含反应缓冲液。在一些实施方案中，反应缓冲液包括HEPES、Tris-HCl或PBS。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为20-60mM的反应缓冲液。在一些实施方案中，反应缓冲液的pH为7-9(包括，例如7.0 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9和9.0)。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还可包含RNA酶抑制剂。在一些此类实施方案中，RNA酶抑制剂的浓度为0.01-0.1U/μL(包括，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.10U/μL)。在一些实施方案中，一个单位(U)的RNA酶抑制剂将5ng的RNA酶(例如，RNA酶A)的活性抑制至少50％(包括，例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少99％或更多)。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还可包含焦磷酸酶(例如，无机焦磷酸酶)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含浓度为0.01-0.2mU/μL的焦磷酸酶(例如，无机焦磷酸酶)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含浓度为0.01、0.05、0.1、0.15或0.20mU/μL的焦磷酸酶(例如，无机焦磷酸酶)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含约0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.10ml/L的焦磷酸酶体积(ml/L起始IVT体积)。在一些实施方案中，IVT反应混合物包含0.80-1.10、0.80-1.05、0.85-1.10、0.85-1.05、0.90-1.10、0.90-1.05、0.95-1.10或0.95-1.05ml/L的焦磷酸酶体积。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还可包含一种或多种盐(例如，一价盐和/或二价盐)。在一些实施方案中，反应混合物包含浓度为20-60mM的一种或多种盐。在一些实施方案中，一种或多种盐包括一种或多种镁盐和/或一种或多种钙盐。在一些实施方案中，一种或多种镁盐包括乙酸镁或氯化镁。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还可包含还原剂(例如，二硫苏糖醇、2-巯基乙醇等)。在一些此类实施方案中，反应混合物包含浓度为5-15mM的还原剂。
在一些实施方案中，IVT反应混合物还可包含亚精胺。在一些此类实施方案中，反应混合物包含浓度为0.5-3mM的亚精胺。
在一些实施方案中，某些反应混合物组分以特定顺序添加。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的其余部分添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的其余部分添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的其余部分添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的其余部分添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将全部多种核苷酸(例如，ATP、CTP、GTP和/或UTP和/或一种或多种其功能类似物)的一部分添加到反应混合物中，并且在转录开始后将其余部分添加到反应混合物中。在一些实施方案中，在转录开始之前和/或在转录开始时将全部多种核苷酸(例如，ATP、CTP、GTP和/或UTP和/或一种或多种其功能类似物)添加到反应混合物中。
在一些实施方案中，GTP和/或UTP和/或一种或多种其功能类似物在IVT反应期间是有限的(例如，维持在足够低的浓度下)。在一些此类实施方案中，通过使用例如补料分批方法将GTP和/或UTP和/或一种或多种其功能类似物保持在足够低的浓度下。不希望受任何一种理论的束缚，帽类似物可以与GTP直接竞争作为初始核苷酸(起始核苷酸)掺入，并且与任何其他核苷酸一样容易掺入(WO2006/004648)。为了有利于帽类似物的掺入，通常使用相对于GTP摩尔过量的帽类似物(例如以4:1的比率)，并且与其他核糖核苷三磷酸(例如，ATP、CTP和/或UTP或其类似物)相比，GTP浓度降低。在这些条件下，GTP通常成为RNA分子合成的限制因素。因此，很大一部分的其他NTP(通常在40％至70％之间)没有用于RNA合成而是被浪费了。通过这种方法，RNA产率通常限制在约1mg/ml(WO2006/004648)。
为了补偿由低GTP浓度导致的有限产率，通过用竞争性核苷酸(GTP或ATP，在使用A帽的情况下)补充反应来提高加帽RNA的产率，其方式使得维持介于1:1与1:50之间的GTP与帽类似物比率。据报道，通过这种方法，每个反应产生的加帽RNA的量可以加倍(WO2006/004648)。
不希望受任何一种理论的束缚，在线性化DNA模板的延续转录(run-offtranscription)期间由T7RNA聚合酶合成的RNA分子可比编码的RNA更长(Triana-Alonso等人,1995,JBC；270(11):6298-6307)。离开DNA模板后，如果3'末端不是稳定二级结构的一部分(自身互补的3'延伸)，RNA聚合酶可以将转录物结合至模板位点，并将转录物的3'末端结合至产物位点并使其延伸。这种效应似乎对UTP浓度特别敏感，并且仅降低UTP浓度导致忠实的转录。然而，降低UTP浓度也可影响RNA产率。特别是在RNA含有poly(A)尾的情况下，这在诸如mRNA的RNA中很常见，转录反应中过量未掺入的UTP可导致与poly-A序列相反的尿苷核苷酸的RNA模板依赖性掺入，从而导致双链RNA分子，其可以激活先天免疫响应并减少多肽合成(Kariko等人,2011,Nucleic Acids Res.；39(21):e142)。
在一些实施方案中，体外转录反应作为分批反应进行，其中将所有组分合并，然后孵育以允许合成RNA分子，直到反应终止。开发了补料分批反应以提高体外转录反应的效率(Kern等人,1997.Biotechnol.Prog.13,747-756；Kern等人,1999.Biotechnol.Prog.15,174-184)。在一些实施方案中，在补料分批系统中，将所有组分合并，但随后随着时间的推移添加额外量的一些试剂(例如，NTP和镁)以维持恒定的反应条件。
在一些实施方案中，在整个IVT反应持续期间将总GTP和/或一种或多种其功能类似物添加到IVT反应混合物中(例如，通过补料分批)。在一些此类实施方案中，以约150、155、160、165、170、175、180、185或190ml/L添加总GTP和/或一种或多种其功能类似物推注体积(ml/L起始IVT体积)。在一些此类实施方案中，以约150、155、160、165、170、175、180、185或190ml/L添加总GTP和/或一种或多种其功能类似物推注体积(ml/L起始IVT体积)。在一些此类实施方案中，以约140-200、145-195或150-190ml/L的范围添加总GTP和/或一种或多种其功能类似物推注体积。
在一些实施方案中，在整个IVT反应持续期间将总UTP和/或一种或多种其功能类似物添加到IVT反应混合物中(例如，通过补料分批)。在一些此类实施方案中，以约150、155、160、165、170、175、180、185或190ml/L添加总UTP和/或一种或多种其功能类似物推注体积(ml/L起始IVT体积)。在一些此类实施方案中，以约150、155、160、165、170、175、180、185或190ml/L添加总UTP和/或一种或多种其功能类似物推注体积(ml/L起始IVT体积)。在一些此类实施方案中，以约140-200、145-195或150-190ml/L的范围添加总UTP和/或一种或多种其功能类似物推注体积。在一些实施方案中，GTP和/或UTP是有限的，并且CTP和/或ATP中的任一者或两者在初始IVT反应混合物中和/或在IVT反应期间的一个或多个时间点升高(例如，如本文其他地方所讨论的)。
示例性体外转录反应条件
在一些实施方案中，IVT反应例如在本文所述的生物反应器(针对例如如本文所述的一定的IVT反应体积选择)中进行一段时间。在一些实施方案中，该段时间为至少20分钟，包括例如至少25分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少55分钟、至少60分钟、至少75分钟、至少90分钟、至少105分钟、至少120分钟、至少135分钟、至少150分钟、至少165分钟或至少180分钟。在一些实施方案中，该段时间为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180分钟。在一些实施方案中，该时间段为约1.5-3小时。在一些实施方案中，该时间段为约25-30分钟。
在一些实施方案中，IVT反应例如在本文所述的生物反应器中在所选RNA聚合酶具有功能活性的温度下进行一段时间(例如，如本文所述)。虽然进行IVT反应的典型噬菌体RNA聚合酶(例如，T7聚合酶)在升高的温度(例如，高于45℃)下通常不具有活性，但热稳定的RNA聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶的热稳定变体，诸如US10519431(其内容出于本文所述的目的以引用方式并入)中所述的热稳定变体)可以在升高的温度下显示增加的稳定性。在一些实施方案中，IVT反应在约25℃或更高(包括，例如26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃)的温度下进行。在一些实施方案中，体外转录在约45℃或更高(包括，例如，46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃或更高)的温度下进行。
在一些实施方案中，IVT反应例如在本文所述的生物反应器中在约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9的pH下进行。在一些实施方案中，适用于体外转录的pH可为约7.0-9.0。
在一些实施方案中，根据本公开进行的体外转录反应(例如，在如本文所述的生物反应器中)可作为连续进料反应进行；在一些实施方案中，它们可作为补料分批反应进行。在一些实施方案中，可将一种或多种核苷酸以逐步方式(例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次推注进料)添加到体外转录反应中。在一些实施方案中，选择搅拌速率，使得实现特定的共混时间以能够快速混合推注添加物，从而确保修饰的核苷酸溶液和一种或多种其他核苷酸溶液在RNA合成期间的最佳可用性。
生物反应器
在一些实施方案中，IVT反应在本文所述的生物反应器中(即，使用所述生物反应器)进行。
如本文所用的术语“生物反应器”或“转录反应器”是指诸如室或试管或柱的容器，其中转录反应在诸如本文所述的具体条件下进行。用于转录的生物反应器是本领域已知的(参见WO 1995/08626和EP 3155 129)。生物反应器通常被配置成使得反应组分通过进料管线被递送到反应器核心，并且RNA产物通过穿过超滤膜(参见EP 3 155 129和van deMerbel,(1999),J.Chromatogr.A 856(1-2):55-82)到达出口流而被移出。在本发明的方法中有用的生物反应器可包括用于进行转录反应的反应模块、用于暂时捕获转录的RNA分子的捕获模块以及用于控制将反应混合物的组分进料到反应模块中的控制模块，其中反应模块可包括用于从反应混合物中分离核苷酸的过滤膜，并且通过控制模块控制反应混合物的组分的进料可基于分离的核苷酸的测量浓度进行。可对生物反应器进行热调节以准确地保持特定温度，例如本文所述的转录反应的温度，例如，通常介于4℃与40℃之间。生物反应器可包括流入脚和出口。生物反应器可允许在转录反应期间例如以可变的搅拌速率搅拌反应混合物。搅拌可以是连续的或不连续的，诸如间歇的。
用于根据本发明使用的生物反应器的大小可以为，例如0.2升或更大，诸如0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50升或更大，或其间的任何体积。生物反应器的内部条件(包括但不限于pH和温度)通常在如本文所述的转录反应期间控制。生物反应器可以由适于在如本文所述的条件下进行体外转录的任何材料(包括玻璃、塑料或金属)构成。
在一些实施方案中，生物反应器可配备有用于补充反应混合物的泵。在一些实施方案中，可编程泵可用于补充。在一些实施方案中，可使用可编程注射器泵来例如自动进行一种或多种反应混合物组分的逐步添加。可替代地或另外地，在一些实施方案中，可利用监测器(例如，传感器)来检测一种或多种组分的水平；在一些此类实施方案中，监测器可自动与泵通信，例如，以便在检测到此类组分的量减少时可释放额外的进料。
控制核苷酸水平的方法
在一些实施方案中，根据本公开进行的体外转录反应(例如，在如本文所述的生物反应器中)可作为连续进料反应进行；在一些实施方案中，它们可作为补料分批反应进行。在一些实施方案中，可将一种或多种核苷酸以逐步方式(例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次推注进料)添加到体外转录反应中。在一些实施方案中，选择搅拌速率，使得实现特定的共混时间以能够快速混合推注添加物，从而确保修饰的核苷酸溶液和一种或多种其他核苷酸溶液在RNA合成期间的最佳可用性。
示例性处理
在一些实施方案中，对通过如本文所述的IVT产生的RNA进行一个或多个处理步骤(例如，纯化)。
本文所述的核酸的纯化可包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。可通过本领域已知的方法进行净化，诸如但不限于通过例如蛋白酶K和DNA酶I进行残余蛋白质消化和/或DNA消化、珠粒(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、poly-T珠粒、LNATM oligo-T捕获探针(/>Inc,Vedbaek,Denmark)或基于HPLC的纯化方法，诸如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。当关于核酸使用时，术语“纯化的”，诸如“纯化的核酸”，是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一物质变得不合格、不纯或劣质的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以不同于在自然界中发现所述核酸的形式或环境存在，或者以不同于对其进行处理或纯化方法之前存在的形式或环境存在。
表征
在一些实施方案中，可以通过一个或多个质量控制参数评估RNA。在一些实施方案中，可在RNA和/或包含所述RNA的组合物的生产过程期间的任何时间评估和/或监测质量控制参数。例如，在一些实施方案中，可在RNA制造工艺的每个或某些步骤期间和/或之后，例如，在IVT和/或每个纯化步骤之后，评估和/或监测RNA质量控制参数，包括RNA完整性、RNA浓度、残余dsRNA和/或加帽中的一个或多个。
在一些实施方案中，可在RNA的制造或其他制备或使用期间利用一个或多个质量控制参数(例如，作为释放测试)。
在一些实施方案中，可对一个或多个质量控制参数进行评估，以确定本文所述的RNA是否满足或超过接受标准(例如，对于后续配制和/或释放以进行分配)。在一些实施方案中，此类质量控制参数可包括但不限于RNA完整性、RNA浓度、残余dsRNA和/或加帽。
用于评估RNA质量的某些方法是本领域已知的；例如，本领域技术人员将认识到，在一些实施方案中，一种或多种分析测试可以用于RNA质量评估。此类某些分析测试的实例可包括但不限于凝胶电泳(例如，琼脂糖凝胶电泳、毛细管凝胶电泳)、UV吸收和/或PCR测定。
RNA完整性
在一些实施方案中，评估和/或监测RNA完整性(例如，随时间在一个或多个点确定)。在一些实施方案中，可以通过琼脂糖凝胶电泳评估和/或监测RNA完整性。在一些实施方案中，可以通过毛细管凝胶电泳评估和/或监测RNA完整性。在一些实施方案中，可以使用毛细管电泳定量确定RNA完整性。在一些实施方案中，RNA溶液必须在与标准阶梯的保留时间相比与预期长度一致的预期保留时间处产生单峰。在一些实施方案中，RNA主峰的定量是相对于可检测到降解产物的电泳图中的信号强度计算的。
在一些实施方案中，相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应)，根据本文提供的技术产生的RNA分子的RNA完整性为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25、b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％)。在一些实施方案中，根据本公开产生的RNA分子的RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的RNA完整性相对于适当的比较物(例如，通过不是在本文公开的IVT反应产生的RNA)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，根据本公开产生的RNA分子的RNA完整性相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
在一些实施方案中，RNA完整性相对于适当的比较物增加至少约5％。在一些实施方案中，RNA完整性相对于适当的比较物增加至少约8％。
RNA浓度
在一些实施方案中，评估和/或监测RNA浓度(例如，根据本文提供的技术产生的RNA分子)(例如，随时间在一个或多个点确定，例如在IVT反应中或之后确定)。在一些实施方案中，使用UV吸收分光光度法确定RNA浓度。在一些实施方案中，根据Ph.Eur.2.2.25中描述的方法确定RNA浓度。在一些实施方案中，以特定的批次规模实现期望的特定RNA浓度。在一些特定实施方案中，在大规模制造过程中实现高RNA浓度。
在一些实施方案中，达到的RNA浓度(例如，通过如本文所述的IVT反应产生的RNA的浓度)可为至少1mg/mL(包括，例如，至少1.5mg/mL、至少2mg/mL、至少2.5mg/mL、至少3mg/mL、至少3.5mg/mL、至少4mg/mL、至少4.5mg/mL、至少5mg/mL、至少6mg/mL或更高)。在一些实施方案中，RNA浓度可为1.5mg/mL至5mg/mL或2mg/mL至4mg/mL或2.0-2.5mg/mL。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术(例如，在如本文所述的IVT反应中)产生的RNA分子的浓度为至少约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL或15mg/mL。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25，b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)为至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些实施方案中，根据本公开的技术产生的RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的浓度相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的浓度相对于适当的比较物增加至少约20％(包括，例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或更多)。
残余双链RNA
本公开尤其提供了所提供的技术可提供某些益处(诸如例如降低的dsRNA水平)的见解。在一些实施方案中，低dsRNA水平在治疗性RNA的制备中特别有用。可替代地或另外地，减少dsRNA的能力在大规模(例如，如本文所述的商业规模)RNA制造中可特别有益。
在一些实施方案中，可以使用例如聚合酶链式反应(PCR)、吸光度、荧光染料和/或凝胶电泳评估和/或监测残余dsRNA(dsRNA)。在一些实施方案中，使用定量PCR评估和/或监测dsRNA。
在一些特定实施方案中，例如，通过评价固定在带正电荷的尼龙膜上，并与dsRNA特异性单克隆抗体一起孵育的RNA样品和dsRNA参考(2000pg dsRNA/μg RNA、1500pgdsRNA/μg RNA、1000pg dsRNA/μg RNA、500pg dsRNA/μg RNA或更低，代表可接受的残余dsRNA含量的上限)来评估和/或监测dsRNA。与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗一起孵育后，将增强化学发光(ECL)底物添加到膜上，并通过生物成像系统检测化学发光。通过密度测定法对信号强度进行量化，并将RNA样品的值与dsRNA参考的信号强度相比较。报告的结果符合指定上限。在一些实施方案中，dsRNA特异性单克隆抗体是小鼠IgG克隆J2。在一些实施方案中，HRP缀合的二抗是抗小鼠IgG二抗。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA为至少约25pg dsRNA/μg RNA、50pg dsRNA/μg RNA、75pg dsRNA/μg RNA、100pgdsRNA/μg RNA、125pg dsRNA/μg RNA、150pg dsRNA/μg RNA、175pg dsRNA/μg RNA、200pgdsRNA/μg RNA、225pg dsRNA/μg RNA、250pg dsRNA/μgRNA、275pg dsRNA/μg RNA、或300pgdsRNA/μg RNA。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物)减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些此类实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，残余dsRNA浓度降低至少约70％，包括例如至少约60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少)。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的一个或多个RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中：d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10，和/或e不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如利用其中：d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
本公开尤其记载了本文提供的技术可以实现IVT反应中dsRNA水平的降低。在一些实施方案中，利用包含升高的ATP水平的反应混合物的IVT反应导致dsRNA的水平降低(例如，相对于适当的比较物，例如利用如本文所述的标准反应混合物的IVT反应)。在一些实施方案中，利用包含升高的CTP水平的反应混合物的IVT反应导致dsRNA的水平降低(例如，相对于适当的比较物，例如利用如本文所述的标准反应混合物的IVT反应)。在一些实施方案中，利用包含升高的CTP和/或ATP水平的反应混合物的IVT反应导致dsRNA的水平降低(例如，相对于适当的比较物，例如利用如本文所述的标准反应混合物的IVT反应)。
在特定实施方案中，本公开记载了所提供的技术(例如，升高的CTP和/或ATP水平，并且特别是反应混合物中升高的ATP水平)可以实现降低的dsRNA水平。此外，本公开记载了此类益处可以在具有不同的C和/或A含量的各种RNA转录物的产生中实现。因此，在一些此类实施方案中，本文提供的技术实现了IVT反应中dsRNA水平的降低，而与所产生的RNA的核苷酸含量无关；在一些此类实施方案中，对所产生的RNA的核苷酸含量进行评估，不包括任何poly(A)尾。
加帽
在一些实施方案中，评估和/或监测RNA分子(例如，通过本公开的技术产生)的加帽(例如，随时间在一个或多个点确定)。在一些实施方案中，体外转录的RNA的加帽可以例如通过评估翻译(其通常需要功能帽的存在)来验证。在一些实施方案中，例如可在动物试验材料的过程表征期间进行的生物活性测试证实了RNA被翻译成正确大小的多肽(例如，蛋白质)。在一些实施方案中，通过进行基于核酸酶的测定来评估体外转录的RNA的加帽。在一些实施方案中，通过进行基于催化性核酸的测定来评估体外转录的RNA的加帽。可替代地或另外地，在一些实施方案中，进行非临床研究以证明各种不同的mRNA批次的加帽。
在一些实施方案中，RNA分子(例如，如通过本文公开的技术产生)的加帽通过以下方式评估：(a)评估功能性加帽RNA的翻译；(b)进行生物活性测试以确认RNA分子被翻译成正确大小的多肽(例如，蛋白质)；(c)进行基于核酸酶的测定；和/或(d)进行基于催化性核酸的测定。
在一些此类实施方案中，基于核酸酶的测定包括基于RNA酶的测定。在一些此类实施方案中，基于RNA酶的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)使大量RNA分子与一种或多种结合RNA分子的探针退火形成RNA-探针复合物；(b)用RNA酶消化RNA-探针复合物，以产生包含RNA分子的5’末端的片段；(c)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合纯化片段；(d)对纯化的片段进行质谱法(MS)；(e)基于观察到的MS值鉴定加帽和未加帽片段；和/或(f)比较加帽和未加帽片段的量以计算加帽RNA的百分比。在一些实施方案中，RNA酶包括RNA酶H。
在一些实施方案中，基于核酸酶的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)使大量RNA分子和与RNA分子的5’非翻译区中与RNA的5'RNA帽或未加帽的倒数第二个碱基相邻的序列互补的一种或多种DNA寡核苷酸接触；(b)使一种或多种DNA寡核苷酸与RNA分子的5'非翻译区中的序列退火形成DNA/RNA杂合复合物；(c)用一种或多种核酸酶降解DNA/RNA杂合复合物和/或未退火的RNA分子，以产生加帽和未加帽的5’末端RNA片段和3’RNA片段；(d)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合将加帽和未加帽的5’末端RNA片段与3’RNA片段分离；和/或(e)比较加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量以计算加帽RNA的百分比。
在一些实施方案中，基于催化性核酸的测定包括以下各项中的一个或多个：(a)用催化性核酸分子将大量RNA分子切割成5’末端RNA片段和至少一个3’RNA片段，其中RNA分子具有催化性核酸分子的切割位点；(b)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合分离5’末端RNA片段和3’RNA片段；(c)使用光谱法、定量质谱法、测序或其组合测量加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量；和/或(d)比较加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量以计算加帽RNA的百分比。在一些此类实施方案中，催化性核酸分子包括DNA核酶或核酶。
在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％是加帽的。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的加帽相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不为至少1.25，b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的加帽相对于适当的比较物(例如，其他方面可比较的体外转录反应，例如，利用其中a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物)增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。在一些实施方案中，根据本文提供的技术产生的RNA分子的加帽相对于适当的比较物增加至少约5％。
产率
在一些实施方案中，评估通过本公开的技术产生的RNA分子的产率。在一些实施方案中，产率确定为g/L起始IVT体积。在一些实施方案中，产率通过测量IVT反应中产生的RNA的总量相对于所计算的将通过IVT反应产生的RNA的理论值来确定。在一些实施方案中，产率根据以下等式确定：
估计的RNA产率(例如，mg/mL)＝(D)x(W)x(Z)/(X)＝(Y)；
其中(D)、(W)(例如，mg/mL)、Z(例如，mL)、X(例如，mL)和Y(例如，mg/mL)分别代表：用于重悬沉淀的稀释因子(例如，在水中，例如，无RNA酶水)、RNA浓度(例如，通过ARD测量)、蛋白酶K消化步骤后的理论总反应体积、IVT过程的初始体积，以及产率。
在一些实施方案中，产率为理论值的至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％或更高。在一些实施方案中，产率为约70-125％、75-125％、80-125％、85-125％、70-120％、75-120％、80-120％或85-120％。在一些实施方案中，产率(g/L起始IVT体积)大于或等于3.30、3.31、3.32、3.33、3.34、3.35、3.36、3.37、3.38、3.39、3.40、3.50、3.60、3.70、3.80、3.90、4.0或更大。
用途
在一些实施方案中，通过本公开的技术产生的RNA(例如，治疗性RNA，例如mRNA)具有产率、完整性和/或加帽的增加，和/或异常产物和/或污染物(例如，dsRNA)的形成减少。在一些实施方案中，所产生的RNA是药物级RNA。在一些实施方案中，通过本公开的技术产生的RNA可以用作治疗剂以治疗或预防感染(例如，细菌、病毒)和/或疾病和/或病症。在一些实施方案中，如本文所述的RNA可以用作治疗剂以治疗和/或预防与感染和/或疾病和/或病症相关的病状。
在一些实施方案中，通过本公开的技术产生的RNA可用于检测和/或表征免疫响应的一种或多种特征(例如，通过检测来自患有感染/或疾病和/或病症的受试者的血清与所提供的抗原的结合)。
在一些实施方案中，通过本公开的技术产生的RNA可用于产生针对本文所包括的一种或多种表位的抗体；此类抗体本身可用于例如检测和/或治疗感染和/或疾病和/或病症。
在一些实施方案中，本公开提供了RNA用于产生所编码的抗原的用途和/或DNA构建体用于产生RNA的用途。
例示
实施例1：示例性参考体外转录(IVT)反应
本实施例提供了示例性参考IVT反应。
在一些实施方案中，参考(例如，对照或标准)IVT反应在终浓度各为9mM的DNA模板(线性化质粒)、用于共转录加帽的m27,3’-OGppp(m2’-O)ApG(CC413)帽类似物(1.5mM)和核苷三磷酸(GTP、ATP和m1ΨTP)的存在下进行。将GTP/m1ΨTP的起始浓度降低至起始浓度的0.5mM(1/18*9mM)，并且在转录反应过程中分11次添加进料，直到达到最终浓度。反应在T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂(Ribolock)和无机焦磷酸酶(0.0001U/μl)的存在下利用含有乙酸镁(MgAc，40mM)、二硫苏糖醇和亚精胺的HEPES缓冲液(40mM，pH 8.3)在37℃下进行105分钟。在IVT后，经由DNA酶消化去除DNA模板并且使用用于固定的磁珠纯化RNA(参见，例如，Berensmeier,S.Magnetic particles for the separation and purification ofnucleic acids.Appl.Microbiol.Biotechnol.73,495-504；10.1007/s00253-006-0675-0(2006))。将RNA在水中洗脱。
所使用的构建体是BNT162b1或BNT162b2(参见，例如，Shoura等人Assemblies ofputative SARS-CoV-2-spike-encoding mRNA sequences for vaccines BNT-162b2 andmRNA-1273,PCT/EP21/59947,US17/233,396)。
实施例2：通过体外转录(IVT)产生RNA的示例性方法
本实施例展示了利用如本文所述的策略通过IVT产生RNA的示例性方法。
使用N1-甲基-假尿苷(m1ψTP)补料分批进行IVT反应。IVT反应混合物组分和条件汇总于图1中。本领域技术人员在阅读本公开(例如，参考图7和/或17)后将认识到，在一些实施方案中，当使用升高的C时、当使用升高的A时，和/或当使用升高的C和升高的A两者时，dsRNA可能较低。在一些实施方案中，当相对于如本文所述的适当的比较物，C以例如+10％至+50％范围内的浓度使用时，dsRNA可减少(例如，减少在约25至约50pg dsRNA/μg RNA范围内的量)。在一些实施方案中，当相对于如本文所述的适当的比较物，A以例如+20％至+50％范围内的浓度使用时，dsRNA可减少(例如，减少的量在约0-10pg dsRNA/μg RNA范围内)。在一些实施方案中，当相对于如本文所述的适当的比较物，C以例如+10％至+50％范围内的浓度使用并且A以例如+20至+50％范围内的浓度使用时，dsRNA可减少(例如，减少的量在约0至约10pg dsRNA/μg RNA范围内)。
在示例性的大规模IVT生产(37.6L)后，对两种构建体的残余核苷酸三磷酸(NTP)进行分析(图2)。
实施例3：具有增加的CTP和/或ATP的示例性IVT反应混合物
本实施例提供了示例性IVT反应，其中反应混合物中ATP和/或CTP的起始体积根据如实施例1所述的对照反应进行调整(命名“+0％”CTP和/或ATP用于指示对照条件)。使用IVT从DNA模板合成示例性RNA，并且另外通过包括DNA酶I消化(例如，以去除DNA模板)和蛋白酶K消化(例如，以有利于通过超滤/渗滤去除蛋白质，例如聚合酶)的步骤进行处理。在蛋白酶K消化步骤后获取反应样品并对其纯化以用于分析。根据汇总于表2.1中的条件在微生物反应器(例如，)中进行IVT。
表2.1：示例性模型方法的汇总
分析所产生的RNA样品的RNA浓度、RNA完整性、5’加帽、残余NTP和poly(A)尾完整性。不希望受任何一种理论的束缚，选择这些特征进行分析是因为它们受到CTP浓度变化的潜在影响。为了计算每种规模的RNA产率，使用以下等式：
估计的RNA产率(mg/mL)＝(D)x(W)x(Z)/(X)＝(Y)
其中(D)、W(mg/mL)、Z(mL)、X(mL)和Y(mg/mL)分别代表用于将RNA重悬于水中的稀释因子、蛋白酶K消化步骤后的理论总反应体积、IVT过程的初始体积和产率。为了最大限度地减少采样对小规模下的产率的影响，使用理论总反应体积来估计在IVT过程中产生的RNA的总量。
用于残余NTP分析的样品是在蛋白酶K消化后获取的。在残余NTP分析后，确定CTP低于定量限(表2.2)。
表2.2：两个示例性制造运行(manufacturing run)在蛋白酶K消化后的核苷酸结果。
参数 运行1 运行2
ATP浓度(μM) 1324.6 1215.0
CTP浓度(μM) NMT 125.0 NMT 125.0
GTP浓度(μM) 903.7 838.2
modUTP浓度(μM) 2544.7 2357.2
为了根据观察到的CTP耗竭改善所产生的RNA，对IVT反应混合物中的CTP浓度进行了评价，从相对于对照/标准(+0％ CTP)减少10％的CTP体积到增加50％的CTP体积(表2.3)。
表2.3：在示例性CTP研究中评估的示例性条件
然后评估从表2.3的不同示例条件产生的RNA的RNA完整性和加帽。增加CTP体积展示了在+20％ CTP体积和+50％ CTP体积下完整性和加帽增加，但在+/-10％ CTP起始浓度下相对稳定(图3)。此外，通过数字液滴聚合酶链式反应(ddPCR)评估所产生的RNA的Poly(A)完整性和RNA完整性。增加CTP导致所产生的RNA的Poly(A)和RNA完整性增加(图4)。随着CTP浓度增加，还观察到产率增加(图5)。增加CTP体积至对照(+0％)以上还导致CTP浓度维持在定量限以上(图5)。然而，较高的CTP浓度(例如，从对照+50％)导致ATP浓度低于定量限(图5)。
另外的研究进一步证明，示例性IVT反应混合物中CTP起始浓度的增加(相对于对照，+10％ CTP、+20％ CTP、+50％ CTP)导致完整性和加帽增加。还对产率进行了评价，并进一步证实增加CTP起始浓度导致产率增加(图6)。
另外的示例性IVT反应在终浓度各为9mM的DNA模板(线性化质粒)、用于共转录加帽的m27,3’-OGppp(m2’-O)ApG(CC413)帽类似物(1.5mM)和核苷三磷酸(GTP、ATP和m1ΨTP)的存在下进行。起始CTP浓度为9mM(标准/对照)、9.9mM(+10％)、10.8mM(+20％)和13.5mM(+50％)。将GTP/m1ΨTP的起始浓度降低至起始浓度的0.5mM(1/18*9mM)，并且在转录反应过程中分11次添加进料，直到达到最终浓度；不希望受任何特定理论的束缚，我们提出这样的方法可提高加帽效率和/或减少dsRNA。反应在T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂(Ribolock)和无机焦磷酸酶(0.0001U/μl)的存在下利用含有乙酸镁(MgAc，40mM)、二硫苏糖醇和亚精胺的HEPES缓冲液(40mM，pH 8.3)在37℃下进行105分钟。在IVT后，经由DNA酶消化去除DNA模板并且使用用于固定的磁珠纯化RNA(参见，例如，Berensmeier,S.Magnetic particles forthe separation and purification of nucleic acids.Appl.Microbiol.Biotechnol.73,495-504；10.1007/s00253-006-0675-0(2006))。将RNA在水中洗脱。通过UV(Nanodrop)测量RNA浓度，并计算IVT的产率(所产生的RNAμg/IVT反应体积μl)。将RNA完整性在AgilentBioanalyzer上分析。为此，将在50％甲酰胺中的250ng RNA在70℃下变性10分钟并用Agilent RNA 6000Nano Kit(5067-1511,Agilent)进一步处理。稍后通过主峰积分与完整电泳图积分的关系来计算完整性。为了确定dsRNA的量，将1μg RNA以5μl等分试样点样到尼龙印迹膜(Nytran SuPerCharge(SPC)Nylon Blotting Membrane)(GE Healthcare LifeSciences,目录号10416216)上。然后将膜在含有5％(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液(20mMTRIS pH 7.4，137mM NaCl，0.1％(v/v)TWEEN-20)中封闭1h。为了检测dsRNA，将膜与在含有1％(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中按1:10,000稀释的J2 dsRNA特异性小鼠单克隆抗体(English&Scientific Consulting,Szirák,Hungary)一起孵育1h。用TBS-T洗涤后，将膜与在含有1％(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液中按1:10,000稀释的HRP缀合的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,目录号715-035-150)一起孵育1h，用TBS-T洗涤，并使用Amersham ECL Prime Western Blotting检测试剂(Fisher Scientific,目录号RPN2232)和ChemiDoc MP成像系统(BIO-RAD)显影。
示例性IVT反应混合物中CTP水平的富集提高了所产生的RNA产率(图7A)。不希望受任何一种理论的束缚，这表明IVT反应期间CTP的减少达到可以产生较少RNA的程度。增加CTP起始浓度可以避免这种效应。对于完整性也可以看到相同的效应。在这里，限制CTP水平降低完整性，最大可能是通过未完成的RNA转录物实现的。同样，这种效应可以通过提高CTP水平来挽救(图7B)。作为另外的积极效应，增加CTP起始浓度减少dsRNA的形成(图7C)。本公开提供的一个见解是，如本文所述，使用升高的CTP和/或ATP可提供某些优点，甚至与耗竭无关。因此，在一些实施方案中，本公开提供了这样的见解：所提供的反应条件可独立于构建体序列使用(例如，在一些实施方案中，当C和/或A以比在反应混合物中较低的水平和/或相关比率[如本文所述]存在于转录物中时)除其他之外，这种见解提供了对于商业级和/或规模生产具有特定的优势和效率的标准化IVT生产技术，如本文所述。例如，利用可比较的条件和/或组分进行各种多重生产(例如，不同RNA转录产物)的能力可以显著促进和/或改善此类商业级和/或规模生产的再现性、可行性和/或可靠性。
增加CTP浓度不仅提高完整性，而且还提高产率并降低dsRNA含量。
评价了包含增加的CTP浓度的另外IVT反应混合物。所有属性均在蛋白酶K消化后测量。
表2.4：所测试的条件
通过在蛋白酶K消化后测量的CTP体积来评估从表2.4的不同示例性条件产生的RNA的完整性和加帽(图8)。此外，通过数字液滴聚合酶链式反应(ddPCR)评估所产生的RNA的Poly(A)完整性和RNA完整性。增加CTP导致所产生的RNA的Poly(A)和RNA完整性增加(图9)。虽然包含+40％至+60％ CTP的IVT反应混合物在完整性(通过片段分析仪)、5’帽、poly(A)尾和完整性(通过ddPCR)方面在这些条件之间表现出非常小的差异，但这些条件确实表现出相比于对照IVT反应混合物(+0％ IVT)的改善。图10显示+40％至+60％ IVT反应混合物的产率较对照有所增加，但在+40％至+60％范围内是一致的。残余核苷酸分析显示，所有条件都继续耗竭ATP(图10)。
其他研究进一步证明，示例性IVT反应混合物中起始CTP浓度的增加(相对于对照，+40％ CTP、+50％ CTP、+60％ CTP)导致产率和残余CTP增加，而ATP在该反应中则成为限制性NTP。有趣的是，在这些具有超过+40％ CTP的反应混合物中未观察到进一步的产率或完整性改善。随着起始CTP浓度的增加，通过IVT反应混合物产生的RNA的完整性和加帽相对于对照有所增加(图11)。
为了评价通过具有增加的CTP和ATP的IVT产生的示例性RNA，在反应混合物中以+50％ CTP体积和增加的ATP体积进行IVT反应。不希望受任何一种理论的束缚，除其他原因外，ATP对于Poly(A)尾的合成可能特别重要。用于评价另外增加ATP体积的效果的所测试的条件汇总于表2.5中。
表2.5：在增加ATP体积的情况下所测试的示例性条件
然后通过在蛋白酶K消化后测量的CTP体积来评估从表2.5的不同示例性条件产生的RNA的完整性和加帽(图12)。此外，通过数字液滴聚合酶链式反应(ddPCR)评估所产生的RNA的Poly(A)完整性和RNA完整性。增加CTP导致所产生的RNA的Poly(A)和RNA完整性增加(图13)。图14示出包含+10％和+20％ ATP的IVT反应混合物相对于对照的产率增加以及来自包含+10和+20％ ATP的IVT反应混合物的增加。ATP水平高于包含+20％ ATP的IVT反应混合物的定量限，而ATP水平等于或低于对照和包含+10％ ATP的IVT反应混合物的定量限(图14)。
其他研究进一步证明，在示例性IVT反应混合物中，除了增加起始CTP浓度(相对于对照+50％ CTP)之外，起始ATP浓度的增加(相对于对照，+10％ ATP、+20％ ATP)也导致在+10％ ATP下产率、完整性和加帽的增加，但ATP仍然耗竭或接近耗竭。+20％ ATP IVT反应混合物表现出产率的进一步增加，但完整性或加帽没有显著改善，并且GTP变得耗竭(图15)。
实施例4：IVT反应混合物的另外示例性评估
本实施例展示了IVT反应混合物的另外示例性评估。图16汇总了所评估的示例性IVT反应混合物以及当IVT反应混合物中的CTP增加时所产生的RNA的示例性表征。RNA产率和完整性均随着更高的CTP起始浓度而增加，而dsRNA含量则随着更高的CTP浓度而降低。残余DNA随着更高的CTP起始浓度而增加(图16)。不希望受任何一种理论的束缚，由于DNA酶I的活性因例如较低的游离镁阳离子水平而降低，残余DNA可能随着更高的CTP起始浓度而增加。
额外CTP的一种或多种积极效应不可仅通过规避其局限性来实现。其他NTP水平(例如，ATP)的升高可以进一步提高IVT性能。不希望受任何一种理论的束缚，额外ATP可以减少“游离”Mg2+离子并有利于polyA尾的转录，从而导致转录终止改善”，这可能进一步减少dsRNA的形成。在具有40mM MgAc的IVT反应混合物中富集CTP和/或ATP只可能达到这个程度，因为我们进料GTP和UTP，并且在保持总体NTP浓度足够低的情况下，ATP和CTP的富集不损害IVT性能。
示例性IVT在终浓度各为9mM的DNA模板(线性化质粒)、用于共转录加帽的m27,3’- OGppp(m2’-O)ApG(CC413)帽类似物(1,5mM)和核苷三磷酸GTP和m1ΨTP的存在下进行。起始CTP和ATP浓度为9mM(标准/对照)和13.5mM(+50％)。单独和组合测试升高的CTP和ATP浓度。
如实施例2中所述，对RNA进行体外转录、纯化和分析。
IVT反应混合物中CTP水平的富集提高了所产生的RNA产率(图17A)。不希望受任何一种理论的束缚，我们提出，在这些反应中，随着反应的进行，CTP的减少达到可以产生更少RNA的程度。增加CTP起始浓度避免了这种效应。对于完整性也观察到类似效应。在这里，限制CTP水平降低完整性，最大可能是通过未完成的RNA转录物实现的。同样，通过CTP水平升高挽救这种效应(图17B)。作为另外的积极效应，增加CTP起始浓度减少了dsRNA形成(图17C)。
除其他之外，本公开提供了这样的见解：增加CTP起始浓度可以是有益的，与所产生的转录物中的CTP表现无关。例如，不希望受任何特定理论的束缚，已提出，可独立于转录物中的CTP水平观察到dsRNA形成减少。可替代地或另外地，在一些实施方案中，升高的CTP可独立于所产生的转录物中的CTP表现而改善完整性。无论如何，本公开教导，在许多实施方案中，将CTP增加至高于其在所产生的转录物中所呈现的水平不对体外转录反应造成损害，因此，除其他之外，在一些实施方案中，本公开提供了可一般性地或甚至普遍地应用来产生多种转录物——例如不同长度和/或不同核苷酸组成的转录物——的IVT反应条件(例如，在其中有用的反应混合物NTP浓度)。
图18汇总了所评估的示例性IVT反应混合物以及当IVT反应混合物中的CTP和/或ATP增加时所产生的RNA的示例性表征。进一步证实，IVT反应混合物在+50％ CTP和+20％ATP下产生更高的RNA产率和更高的RNA完整性(图18和19)。随着ATP体积增加，产率、完整性和残余NTP稳定。ATP、CTP、GTP和modUTP的水平高于定量限，并且随着ATP量增加而高于稳定值(图19)。
图20示出了使用相对于对照包含+25％ ATP和+7％ CTP、-21％ATP和-37％ CTP、+25％ ATP或+7％ CTP的反应混合物的示例性IVT反应的产率、完整性和残余dsRNA含量的示例性评估。
使用不同的核苷酸含量评估其他转录物(例如，非BNT162b1和BNT162b2)。在示例性IVT反应中，将另外的ATP和/或CTP添加到反应混合物中以产生转录物。相对于包含13.5mM、10.8mM ATP、9mM GTP和9mM UTP的对照反应混合物，使用+50％ ATP或+50％ATP和+20％ CTP。另外的转录物的核苷酸含量和示例性反应混合物在表4.1中示出。
表4.1：用于产生具有不同核苷酸含量的转录物的示例性反应混合物。
等效方案
本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或者能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围并不意图限于上述描述，而是如以下权利要求中所述：

Claims (101)

1.一种通过体外转录产生核糖核酸(RNA)分子的方法，所述方法包括在反应条件下产生反应混合物以形成所述RNA分子，所述反应混合物包含核酸聚合酶、核酸模板，以及：
总胞苷三磷酸(CTP)和/或一种或多种功能性CTP类似物与总鸟苷三磷酸(GTP)和/或一种或多种功能性GTP类似物的摩尔比a；和/或
总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物与总尿苷三磷酸(UTP)和/或一种或多种功能性UTP类似物的摩尔比b；和/或
总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物与总腺苷三磷酸(ATP)和/或一种或多种功能性ATP类似物的摩尔比c，
其中所述RNA分子包含：
总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比x；和/或
总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比y；和/或
总胞苷和/或一种或多种功能性胞苷类似物与总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物的摩尔比z，并且
其中：
a为至少1.25，和/或a是x的至少约1.10倍；和/或
b为至少1.25，和/或b是y的至少约1.10倍；和/或
c为至少1.10，和/或c是z的至少约1.10倍。
2.如权利要求1所述的方法，其中a为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中a为至少1.5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.15倍。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中a是x的至少约1.20倍。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中b为至少1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.65、1.70、1.75或1.8。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中b为至少1.5。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.15倍。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中b是y的至少约1.20倍。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中c为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中c为至少1.25。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍、1.50倍、1.55倍、1.60倍、1.65倍、1.70倍或1.75倍。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.15倍。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中c是z的至少约1.20倍。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括将以下各项合并到所述反应混合物中：
总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物与总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的摩尔比d；和/或
总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物与总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的摩尔比e，
其中所述RNA分子还包含：
总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总鸟苷和/或一种或多种功能性鸟苷类似物的摩尔比v；和/或
总腺苷和/或一种或多种功能性腺苷类似物与总尿苷和/或一种或多种功能性尿苷类似物的摩尔比w，并且
其中：
d为至少1.10，和/或d是v的至少约1.05倍；和/或
e为至少1.10，和/或e是w的至少约1.05倍。
18.如权利要求17所述的方法，其中d为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中d为至少1.20。
20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。
21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.10倍。
22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中d是v的至少约1.20倍。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中e为至少1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45或1.50。
24.如权利要求17-23中任一项所述的方法，其中e为至少1.20。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.10倍、1.15倍、1.20倍、1.25倍、1.30倍、1.35倍、1.40倍、1.45倍或1.50倍。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.10倍。
27.如权利要求17-26中任一项所述的方法，其中e是w的至少约1.20倍。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总CTP和/或一种或多种功能性CTP类似物添加到所述反应混合物中。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总GTP和/或一种或多种功能性GTP类似物添加到所述反应混合物中。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总UTP和/或一种或多种功能性UTP类似物添加到所述反应混合物中。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所述总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的一部分添加到所述反应混合物中，并且在转录开始后将所述总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物的其余部分添加到所述反应混合物中。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中在转录开始之前和/或在转录开始时将所有的所述总ATP和/或一种或多种功能性ATP类似物添加到所述反应混合物中。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述RNA分子是单链的。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述RNA分子是线性RNA、信使RNA和/或核苷修饰的信使RNA。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述核酸模板是DNA模板。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.05-2μg/μL的所述核酸模板。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是RNA聚合酶。
41.如权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述核酸聚合酶是T7 RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶、N4病毒体RNA聚合酶或其变体或功能结构域。
42.如权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述反应混合物还包含反应缓冲液、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶、一种或多种盐、还原剂和亚精胺中的一种或多种。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述反应缓冲液包含HEPES、Tris-HCl或PBS。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为20-60mM的所述反应缓冲液。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述反应缓冲液的pH为7-9。
46.如权利要求42-45中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.01-0.1U/μL的所述RNA酶抑制剂。
47.如权利要求46所述的方法，其中一个单位(U)的所述RNA酶抑制剂将5ng的RNA酶A的活性抑制至少50％。
48.如权利要求42-47中任一项所述的方法，其中所述焦磷酸酶是无机焦磷酸酶。
49.如权利要求42-48中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.01-0.2mU/μL的所述焦磷酸酶。
50.如权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述一种或多种盐包括一种或多种镁盐和/或一种或多种钙盐。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述一种或多种镁盐包括乙酸镁或氯化镁。
52.如权利要求42-51中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为20-60mM的所述一种或多种盐。
53.如权利要求42-52中任一项所述的方法，其中所述还原剂包括二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。
54.如权利要求42-53中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为5-15mM的所述还原剂。
55.如权利要求42-54中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含浓度为0.5-3mM的所述亚精胺。
56.如权利要求1-55中任一项所述的方法，其中体外转录进行至少20-180分钟。
57.如权利要求1-56中任一项所述的方法，其中体外转录在25-55℃的温度下进行。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其还包括在所述RNA分子的体外转录后消化所述核酸模板。
59.如权利要求58所述的方法，其中通过DNA酶消化所述核酸模板。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述DNA酶包括DNA酶I。
61.如权利要求1-59中任一项所述的方法，其还包括在所述RNA分子的体外转录后消化所述核酸聚合酶。
62.如权利要求61所述的方法，其中通过蛋白酶消化所述核酸聚合酶。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述蛋白酶包括蛋白酶K。
64.如权利要求1-63中任一项所述的方法，其还包括评估用于所述RNA分子的体外转录的一个或多个质量控制参数。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述用于体外转录的一个或多个质量控制参数包括转录期间和/或之后所述RNA分子的RNA完整性、RNA浓度、残余双链RNA(dsRNA)和/或加帽。
66.如权利要求65所述的方法，其中使用琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。
67.如权利要求65所述的方法，其中使用毛细管凝胶电泳评估RNA完整性。
68.如权利要求1-67中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的RNA分子的RNA完整性为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
69.如权利要求1-68中任一项所述的方法，其中与其中a不为至少1.25、b不为至少1.25，和/或c不为至少1.10的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的RNA完整性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
70.如权利要求17-69中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的RNA完整性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或
a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10。
71.如权利要求1-70中任一项所述的方法，其中与其中a不是x的至少约1.10倍、b不是y的至少约1.10倍，和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的RNA完整性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
72.如权利要求17-71中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的RNA完整性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x是至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或
a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍。
73.如权利要求69-72中任一项所述的方法，其中RNA完整性增加至少约5％。
74.如权利要求71或72中任一项所述的方法，其中RNA完整性增加至少约8％。
75.如权利要求65-74中任一项所述的方法，其中使用UV吸收分光光度法评估RNA浓度。
76.如权利要求1-75中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的RNA分子的浓度为至少约1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL或15mg/mL。
77.如权利要求1-76中任一项所述的方法，其中与其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的浓度增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
78.如权利要求17-77中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的浓度增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或
a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10。
79.如权利要求1-78中任一项所述的方法，其中与其中a不是x的至少约1.10倍、b不是y的至少约1.10倍和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的浓度增加至少约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％或30％。
80.如权利要求17-79中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的浓度增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或
a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍。
81.如权利要求77-80中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的RNA分子的浓度增加至少约20％。
82.如权利要求65-81中任一项所述的方法，其中使用聚合酶链式反应(PCR)、吸光度、荧光染料和/或凝胶电泳评估残余dsRNA。
83.如权利要求65-81中任一项所述的方法，其中使用定量PCR评估残余dsRNA。
84.如权利要求1-83中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA为至少约25pg dsRNA/μg RNA、50pg dsRNA/μg RNA、75pg dsRNA/μg RNA、100pg dsRNA/μg RNA、125pg dsRNA/μg RNA、150pg dsRNA/μg RNA、175pg dsRNA/μg RNA、200pg dsRNA/μg RNA、225pg dsRNA/μg RNA、250pg dsRNA/μg RNA、275pg dsRNA/μgRNA、或300pg dsRNA/μgRNA。
85.如权利要求1-84中任一项所述的方法，其中与其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。
86.如权利要求17-85中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或
a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10。
87.如权利要求1-86中任一项所述的方法，其中与其中a不是x的至少约1.10倍、b不是y的至少约1.10倍和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA减少至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％。
88.如权利要求17-87中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或
a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍。
89.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述残余dsRNA浓度降低至少约70％。
90.如权利要求65-89中任一项所述的方法，其中通过以下方式评估所述RNA分子的加帽：
(a)评估功能性加帽RNA的翻译；
(b)进行生物活性测试以确认所述RNA分子被翻译成正确大小的蛋白质；
(c)进行基于核酸酶的测定；和/或
(d)进行基于催化性核酸的测定。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述基于核酸酶的测定包括基于RNA酶的测定，并且其中所述基于RNA酶的测定包括以下各项中的一个或多个：
(a)使大量RNA分子与一种或多种结合所述RNA分子的探针退火以形成RNA-探针复合物；
(b)用RNA酶消化所述RNA-探针复合物，以产生包含所述RNA分子的5’末端的片段；
(c)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合纯化所述片段；
(d)对所纯化的片段进行质谱法(MS)；
(e)基于观察到的MS值鉴定加帽和未加帽片段；和/或
(f)比较加帽和未加帽片段的量以计算加帽RNA的百分比。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述RNA酶包括RNA酶H。
93.如权利要求90所述的方法，其中所述基于核酸酶的测定包括以下各项中的一个或多个：
(a)使大量所述RNA分子和与所述RNA分子的5’非翻译区中与所述RNA的5'RNA帽或未加帽的倒数第二个碱基相邻的序列互补的一种或多种DNA寡核苷酸接触；
(b)使所述一种或多种DNA寡核苷酸与所述RNA分子的5'非翻译区中的所述序列退火以形成DNA/RNA杂合复合物；
(c)用一种或多种核酸酶降解所述DNA/RNA杂合复合物和/或未退火的RNA分子，以产生加帽和未加帽的5’末端RNA片段和3’RNA片段；
(d)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合将所述加帽和未加帽的5’末端RNA片段与所述3’RNA片段分离；和/或
(e)比较加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量以计算加帽RNA的百分比。
94.如权利要求90所述的方法，其中基于催化性核酸的测定包括以下各项中的一个或多个：
(a)用催化性核酸分子将大量RNA分子切割成5’末端RNA片段和至少一个3’RNA片段，其中所述RNA分子具有催化性核酸分子的切割位点；
(b)使用基于亲和力的纯化、基于色谱的纯化或其组合分离所述5’末端RNA片段和3’RNA片段；
(c)使用光谱法、定量质谱法、测序或其组合测量加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量；和/或
(d)比较加帽和未加帽的5’末端RNA片段的量以计算加帽RNA的百分比。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述催化性核酸分子包括DNA核酶或核酶。
96.如权利要求1-95中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的所述RNA分子的至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％是加帽的。
97.如权利要求1-96中任一项所述的方法，其中与其中a不为至少1.25、b不为至少1.25和/或c不为至少1.10的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的所述RNA分子的加帽增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
98.如权利要求17-97中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10；
a不为至少1.25，b不为至少1.25，c不为至少1.10，和/或d为至少1.10和/或e为至少1.10；和/或
a为至少1.25，b为至少1.25，和/或c为至少1.10，和/或d不为至少1.10和/或e不为至少1.10。
99.如权利要求1-98中任一项所述的方法，其中与其中a不是x的至少约1.10倍、b不是y的至少约1.10倍和/或c不是z的至少约1.10倍的反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的所述RNA分子的加帽增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
100.如权利要求17-99中任一项所述的方法，其中与以下反应混合物中的体外转录相比，通过所述方法产生的RNA分子的转录期间和/或之后的残余dsRNA增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％，在所述反应混合物中：
d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍；
a不是x的至少约1.10倍，b不是y的至少约1.10倍，c不是z的至少约1.10倍，和/或d是v的至少约1.05倍和/或e是w的至少约1.05倍；和/或
a是x的至少约1.10倍，b是y的至少约1.10倍，和/或c是z的至少约1.10倍，和/或d不是v的至少约1.05倍和/或e不是w的至少约1.05倍。
101.如权利要求97-100中任一项所述的方法，其中通过所述方法产生的所述RNA分子的加帽增加至少约5％。
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