JP2021504335A - フェニルケトン尿症の治療用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

フェニルケトン尿症の治療用のフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Abstract

本開示は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）等の高フェニルアラニン血症の治療用のｍＲＮＡ治療薬に関する。本発明で用いるｍＲＮＡは、インビボで投与された場合、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、その機能的断片（例えば、触媒ドメインを含む、または触媒ドメインと４量体化ドメインを含むもの）、ならびにＰＡＨを含む融合タンパク質をコードする。本発明のｍＲＮＡは、好ましくは、対象において、これに投与された場合に細胞及び／または組織への効率的な送達をもたらすように脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入される。本発明のｍＲＮＡ治療は、対象において不足したＰＡＨの発現及び／または活性レベルを増加及び／または回復させる。本発明のｍＲＮＡ治療は、さらに、対象において不足したＰＡＨ活性と関連する、フェニルアラニンの異常蓄積を減少させる。【選択図】図４Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月２２日に出願された米国仮出願第６２／５９０，１２８号、及び２０１８年６月１日に出願された米国仮出願第６２／６７９，０８１号の優先権を主張する。これら先行出願の内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の欠乏に起因する代謝の常染色体劣性先天異常である。この疾患は、すべての民族に見られ、その発生率は、世界中で大きく異なり、北欧で最も発生率が高い。ＰＫＵは、主に、触媒活性を低下させて、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の異化経路に影響を与えるＰＡＨ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＰＡＨ酵素は、Ｐｈｅをチロシン（Ｔｙｒ）に変換するために補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の活性を必要とする。ＰＡＨまたはその補因子のいずれかが欠乏すると、過剰なフェニルアラニンが蓄積する。これを治療せずに放置すると、重度の不可逆的な知的障害につながる可能性がある。未治療のＰＫＵに関連する他の臨床的特徴としては、自閉症的行動、運動障害、湿疹性皮疹、及び発作が挙げられる。精神障害だけでなく、行動障害が一般に年齢とともに明らかになる。
現在、ＰＫＵの治療法はない。一般的な治療は、主に、特別に設計された医療食品を補充した、正常な成長に最低限必要なＰｈｅの食事制限によるものである。しかしながら、現在の食事療法には、少なくとも４つの大きな問題がある：（ｉ）食事が口に合わないことに起因する食事療法のコンプライアンス、（ｉｉ）早期介入にもかかわらず持続的な神経学的または心理社会的な問題及び生活の質の悪さ、（ｉｉｉ）食事制限に起因する潜在的な栄養欠乏、ならびに（ｉｖ）特別な医療食品及び栄養補助食品のコストのための経済的負担。
補因子ＢＨ４の突然変異を有する高フェニルアラニン血症の患者のあるサブセットについては、サプロプテリンと呼ばれるＢＨ４の合成アナログが一般的に治療に使用される。ＰＡＨの欠陥によって生じるＰＫＵと、ＢＨ４の欠陥によって生じるＰＫＵは、ＢＨ４負荷試験によって区別することができる。合成ビオプテリン化合物またはサプロプテリンによる治療は、ＢＨ４反応性ＰＫＵ患者で一般に成功しているが、新生児検診によって検出される患者の約５０〜８０％を構成する古典的ＰＫＵ患者（ＰＡＨｄｂ；ｐａｈｄｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ）の約９０％に関しては、ＢＨ４療法には有益な効果がない。
アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスベクターを含めたウイルスベクターを用いた肝臓への機能的組み換えＰＡＨ遺伝子の標的化による遺伝子治療が、マウスモデルにおけるＰＫＵの修正能力、またはこれらマウスモデル由来の培養肝細胞を修正する能力について試験されている。１週間以内に、血清フェニルアラニンレベルの完全な正常化が、ＰＫＵマウスで達成されたが、しかしながら、このアデノウイルスベクターの治療効果は数週間後に停止し、反復投与は、免疫応答の発達によって元の結果を再現しなかった。別の研究では、門脈注射で肝臓に送達されたマウスＰＡＨ ｃＤＮＡを有する組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、ＰＫＵマウスで血中Ｐｈｅレベルを低下させたが、しかしながら、この低下は雄のＰＫＵマウスでのみ認められたことを示した。雄のマウスで見られたものと同等の血清Ｐｈｅレベルの低下を達成するためには、雌のＰＫＵマウスでは３倍のベクターが必要であった。さらに、修正は４０週間を超えて持続せず、血中Ｐｈｅは処理前のレベルに戻った。
ＰＫＵを治療するための別のアプローチは、ＰＡＨ系の融合タンパク質を使用して、肝臓にＰＡＨを特異的に標的化することによる酵素療法を使用することである。ＰＡＨ系融合タンパク質で処理したマウスにおいて、静脈内投与後数時間の血漿Ｐｈｅレベルの減少が認められた。しかしながら、複数の頻回な注射が必要となる可能性があり、臨床的観点からこのアプローチの実用性は低い。
ＰＫＵを治療するためのさらに別のアプローチは、ＰＡＬ（Ｅ．Ｃ．４．３．１．５）を用いた酵素補充治療によるものである。ＰＡＬは、Ｐｈｅのトランスケイ皮酸と微量のアンモニアへの変換を触媒する高等植物及び酵母で見られる酵素である。哺乳類酵素（ＰＡＨ）とは異なり、ＰＡＬはモノマーであり、補因子を必要としない。ＰＡＬ製剤が第ＩＩＩ相臨床試験へ進出したにもかかわらず、前臨床試験では、最長１年間、ＰＫＵマウスにおけるＰｈｅレベルの顕著な減少を維持するために、毎週の注射が必要であることが示されている。また、ＰＡＬ投与レジメンへの応答は、ゲノム標的化ＰＡＨ遺伝子治療を受けたマウスで認められたことと同様、マウスモデルでは性依存的であった。ＰＡＬ療法はマウスにおいてＰｈｅレベルを低下させ、ＰＫＵ誘導性低色素沈着を逆転したが、この薬剤の反復注射は、患者とその家族にとって侵襲的であり、かつ負担が大きい。実際、有害な免疫反応の報告がある。さらに、生理的ストレス、痛み、不便さ、費用、及び感染のリスクが反復注射と関連している。
既存のＰＫＵの治療に関連した重大な問題を考慮すると、ＰＫＵの治療の改善に対して当技術分野で満たされていないニーズが存在する。
本開示は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬を提供する。本発明のｍＲＮＡ治療薬は、この技術が、ＰＡＨ（またはＰＡＨの触媒及び４量体化ドメインを含むその切断型）をコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、その後の標的細胞内での機能的ＰＡＨタンパク質のデノボ合成をもたらすため、ＰＫＵの治療に特に適切である。本発明は、治療用ｍＲＮＡ内に修飾ヌクレオチドを組み込み、（１）望ましくない免疫活性化（例えば、外来核酸のインビボ導入に関連した自然免疫応答）を最小限に抑えること及び（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化することを特徴とする。本開示の例示的な態様は、自然免疫応答を低減するためのヌクレオチド修飾と、特に、ＰＡＨ（またはＰＡＨの触媒ドメインを含むその切断型）をコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で、タンパク質発現を高めるための配列最適化の組み合わせを特徴とする。
さらなる実施形態では、本開示のｍＲＮＡ治療技術はまた、ＰＡＨ（またはＰＡＨの触媒ドメインを含むその切断型）をコードするｍＲＮＡの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムを介した送達を特徴とする。本開示は、イオン性脂質系のＬＮＰを特徴とし、これは、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡと組み合わせてインビボで投与する場合に改善された特性、例えば、細胞内取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有する。本開示のＬＮＰ製剤はまた、ＬＮＰのインビボ投与に関連する免疫原性の減少を実証する。
ある特定の態様では、本開示は、ＰＡＨをコードするポリヌクレオチド、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡを含む組成物及び送達製剤、ならびにそれを投与することによる、ＰＫＵの治療のための、それを必要とするヒト対象における方法に関する。
本開示は、ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を含む医薬組成物であって、ＰＫＵの治療を必要とするヒト対象への投与に適した該組成物を提供する。
本開示はさらに、（ａ）（ｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む該ＯＲＦ、及び（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むｍＲＮＡ、ならびに（ｂ）送達剤を含む医薬組成物であり、ＰＫＵの治療を必要とするヒト対象への投与に適した該医薬組成物を提供する。
１つの態様において、本開示は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物を特徴とする。該組成物がそれを必要とするヒト対象に対して単回静脈内投与として施された場合、十分に、
（ｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、肝臓組織におけるＰＡＨの活性レベルを、正常なＰＡＨの活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％以内に増加させ、
（ｉｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、肝臓組織におけるＰＡＨの活性レベルを、該ヒト対象のベースラインのＰＡＨの活性レベルもしくはフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を有するヒト対象における参照のＰＡＨの活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍に増加させ、
（ｉｉｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の肝臓レベルを、該ヒト対象のベースラインの肝臓のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有するヒト対象における参照の肝臓のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下させ、
（ｉｖ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルを、該ヒト対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下させ、
（ｖ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの肝臓レベルを、該ヒト対象のベースラインの肝臓のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照の肝臓のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低下させ、
（ｖｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルを、該ヒト対象のベースラインの血漿、血清、及び／または尿のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照の血漿、血清、及び／または尿のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低下させ、及び／または
（ｖｉｉ）投与後少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血漿レベルを、１，１１０μＭ未満、１，１００μＭ未満、１，０００μＭ未満、９５０μＭ未満、９００μＭ未満、８５０μＭ未満、８００μＭ未満、７５０μＭ未満、７００μＭ未満、６５０μＭ未満、６００μＭ未満、５５０μＭ未満、５００μＭ未満、４５０μＭ未満、４００μＭ未満、３５０μＭ未満、３００μＭ未満、２５０μＭ未満、２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１００μＭ未満、もしくは９５μＭ未満に低下させる。
本態様のいくつかの実施形態では、該医薬組成物は、送達剤を含む。ある場合には、該送達剤は、（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ、または（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉを含む脂質ナノ粒子を含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１または配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ＯＲＦは、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。ある特定の例では、該マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞で発現されるか、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現される。ある場合には、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である。ある特定の例では、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である。一例として、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位である。ある場合には、該マイクロＲＮＡ結合部位は、該ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号４または１５０の３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号１７５、１７７、または１７８の３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７の３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号３または８８の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む５’ＵＴＲを含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む５’ＵＴＲを含む。
本態様のいくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、５’末端キャップを含む。ある特定の例では、該５’末端キャップは、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログを含む。
いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、ポリＡ領域を含む。ある特定の例では、該ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである。ある場合には、該ポリＡ領域は、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する。
いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の例では、該少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基は、プソイドウラシル（ψ）、Ｎ１メチルプソイドウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルプソイドウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある場合には、該ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、Ｎ１−メチルプソイドウラシルに化学的に修飾される。
いくつかの実施形態では、該ヒト対象は、ＰＫＵを有する。ある特定の例では、該ヒト対象は、Ｐｈｅ制限食中である。他の例では、該ヒト対象は、Ｐｈｅ制限食中ではない。
別の態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、（ｉｉｉ）終止コドン、及び（ｉｖ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。いくつかの実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２１のアミノ酸配列からなる。
別の態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される核酸配列を含む該ＯＲＦ、（ｉｉｉ）終止コドン、及び（ｉｖ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
１つの態様では、本開示は、（ｉ）５’ＵＴＲ、（ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチド（例えば、配列番号２１）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３１を含む該ＯＲＦ、及び（ｉｉｉ）３’ＵＴＲを含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞で発現されるか、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現される。ある特定の例では、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である。ある場合には、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である。一例として、該マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位である。ある特定の例では、該マイクロＲＮＡ結合部位は、該ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。
いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号４または１５０の３’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１７５、１７７、または１７８の３’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７の３’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、配列番号３または８８の５’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５の５’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、５’末端キャップを含む。ある特定の例では、該５’末端キャップは、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログを含む。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ポリＡ領域を含む。ある特定の例では、該ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである。他の例では、該ポリＡ領域は、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する。
ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある場合には、該少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基は、プソイドウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルプソイドウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。ある場合には、該ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、Ｎ１−メチルプソイドウラシルに化学的に修飾される。
ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４５〜８４または２０１〜２０３からなる群から選択される核酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、（ｉ）５’末端キャップ、（ｉｉ）配列番号３の核酸配列を含む５’ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される配列を含む該ＯＲＦ、（ｉｖ）配列番号４、１７５、１７７、または１７８の核酸配列を含む３’ＵＴＲ、ならびに（ｖｉ）ポリＡ領域を含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
別の態様では、本開示は、（ｉ）５’末端キャップ、（ｉｉ）配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５の核酸配列を含む５’ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される配列を含む該ＯＲＦ、（ｉｖ）配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７の核酸配列を含む３’ＵＴＲ、ならびに（ｖｉ）ポリＡ領域を含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
いくつかの実施形態では、該５’末端キャップは、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログを含む。
いくつかの実施形態では、該ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである。ある特定の例では、該ポリＡ領域は、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する。
ある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある場合には、該少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基は、プソイドウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルプソイドウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号４５〜８４または２０１〜２０３からなる群から選択される核酸配列を含む。ある特定の例では、該５’末端キャップは、キャップ１を含み、該ポリヌクレオチドのウラシルのすべてがＮ１−メチルプソイドウラシルである。ある特定の例では、該ポリＡ領域は、１００ヌクレオチドの長さである。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び送達剤を含む医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、該送達剤は、（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ、または（ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉを含む脂質ナノ粒子を含む。
別の態様では、本開示は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドを、それを必要とするヒト対象において発現する方法を特徴とする。該方法は、該対象に対して、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、ＰＫＵの治療、予防、または発症及び／または進行の遅延の、それを必要とするヒト対象における方法を特徴とする。該方法は、該対象に対して、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む。
別の態様では、本開示は、血中フェニルアラニンレベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法を特徴とする。該方法は、該対象に対して、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む。ある特定の実施形態では、該方法は、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドの単回静脈内投与後、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血中または血漿レベルを、１，１５０μＭ未満（例えば、１，１１０μＭ未満、１，１００μＭ未満、１０００μＭ未満、９５０μＭ未満、９００μＭ未満、８５０μＭ未満、８００μＭ未満、７５０μＭ未満、７００μＭ未満、６５０μＭ未満、６００μＭ未満、５５０μＭ未満、５００μＭ未満、４５０μＭ未満、４００μＭ未満、３５０μＭ未満、３００μＭ未満、２５０μＭ未満、２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１００μＭ未満、または９５μＭ未満）に低下させる。
上記方法のある特定の実施形態では：
（ｉ）該Ｐｈｅの血中及び／または肝臓レベルは、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、もしくは１２日間、該対象のベースラインのＰｈｅの血中及び／または肝臓レベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照のＰｈｅの血中及び／または肝臓レベルと比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下し、
（ｉｉ）該Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルは、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、もしくは１２日間、該対象のベースラインのＰｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照のＰｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルと比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下し、
（ｉｉｉ）該Ｐｈｅの血中及び／または肝臓レベルは、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間以内に、正常なＰｈｅの血中及び／または肝臓レベルと比較して、少なくとも１０倍以内、少なくとも５倍以内、少なくとも２倍以内、もしくは少なくとも１．５倍以内に低下し、及び／または
（ｉｖ）該Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルは、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、正常なＰｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルと比較して、少なくとも１０倍以内、少なくとも５倍以内、少なくとも２倍以内、もしくは少なくとも１．５倍以内に低下する。
別の態様では、本開示は、ＰＡＨ活性の増加の、それを必要とするヒト対象における方法を提供する。該方法は、該対象に対して、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む。
本方法のある特定の実施形態では：
（ｉ）該対象におけるＰＡＨの活性レベルは、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、ＰＫＵを有する対象における参照のＰＡＨの活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍に増加し、及び／または
（ｉｉ）該医薬組成物もしくはポリヌクレオチドの単回投与が該対象に施された１２時間後、該対象におけるＰＡＨ活性は、該対象のベースラインのＰＡＨ活性と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、もしくは少なくとも６００％増加する。
ある特定の実施形態では、該ＰＡＨ活性は、当該対象の肝臓または血中で増加する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の塩、またはそのアナログの塩が、該ヒト対象に対して、該医薬組成物またはポリヌクレオチドと組み合わせて共投与される（例えば、経口）。いくつかの実施形態では、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）アナログまたはその塩は、サプロプテリン、６−ヒドロキシメチルプテリン（ＨＭＰ）、６−アセチル−７，７−ジメチル−７，８−ジヒドロプテリン（ＡＤＤＰ）、またはその塩である。テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の塩、またはそのアナログの塩は、該医薬組成物もしくはポリヌクレオチドの投与と同時に、または該医薬組成物もしくはポリヌクレオチドの投与の前もしくは後に投与することができる。
いくつかの実施形態では、該対象への投与は、約１週間に１回、約２週間に１回、または約１ヶ月に１回である。
ある特定の実施形態では、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、静脈内投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
ある特定の実施形態では、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、皮下投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ある場合には、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
ある特定の実施形態では、該医薬組成物またはポリヌクレオチドは、静脈内及び皮下に投与される。ある場合には、該方法は、該医薬組成物またはポリヌクレオチドの１回以上の静脈内投与に続いて、該医薬組成物またはポリヌクレオチドの１回以上の皮下投与を含む。
フェニルアラニンの代謝経路を示す。主経路（中央の長方形）は、補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の存在下で、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）によるフェニルアラニンのチロシンへの触媒変換をもたらす。フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）では、ＰＡＨ酵素の欠乏が、代替経路（左のボックス）によるフェニルケトンの産生をもたらす。第三の経路（右のボックス）は、酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）を含む植物及び酵母で利用される。 ＰＡＨのドメイン構成及び構造のリボン図と概略図を示す。 トランスフェクションの２４時間後のＳＮＵ−４２３細胞におけるヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）構築物の発現を示すウェスタンブロット、ならびにこれら酵素の活性を含む。ＧＡＰＤＨはローディング対照として使用した。 トランスフェクションの２４、４８、及び７２時間後のＳＮＵ−４２３細胞におけるヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）構築物の発現を示すウェスタンブロットを示す。ＥＲＰ７２はローディング対照として使用した。 トランスフェクションの２４、２４、及び７２時間後の図４Ａに示すヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）酵素の発現レベルの定量化を示す棒グラフである。 図４Ａに示す酵素の個々の活性を示す棒グラフである。 図５Ａに示すヒトＰＡＨ酵素の平均活性及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）酵素の平均活性を示す棒グラフである。 トランスフェクションの２４、４８、及び７２時間後の、補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）を細胞に添加したもしくは添加しないＳＮＵ−４２３細胞における切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤもしくはΔｒｄＰＡＨ）構築物、または対照ｅＧＦＰ構築物の発現を示すウェスタンブロットを示す。ＥＲＰ７２はローディング対照として使用した。 トランスフェクションの２４、２４、及び７２時間後の、補因子ＢＨ４を含む及び含まない図４Ａに示す切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）酵素の発現レベルの定量化を示す棒グラフである。 補因子ＢＨ４を含む及び含まない図６Ａ及び図６Ｂに示す酵素、ならびにｅＧＦＰ対照の活性を示す棒グラフである。 Ａ〜Ｂは、送達経路にかかわらず、アスパルテーム投与後、ラットでは６０〜９０分間（図７Ａ）及びマウスでは４０分未満（図７Ｂ）、フェニルアラニンの全身曝露を認めることができることを示すグラフである。 経時的な血中フェニルアラニンレベルで測定した、ｍＲＮＡの単回投与注射後のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおけるヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）の活性を示すグラフである。 ｍＲＮＡを注射したホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス由来の肝細胞におけるヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）をコードするｍＲＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションからのＨスコアを示す棒グラフである。 経時的な血中フェニルアラニンレベルで測定した、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡの単回投与注射後のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおけるヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）の活性を、ＰＢＳを注射した対照動物の活性と比較して示すグラフである。 ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおけるヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）に関する曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す棒グラフである。 ｍＲＮＡの注射の１、２、３、及び４日後、血中フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルで測定した、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、もしくは５．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの単回投与、または補因子ＢＨ４とともに５．０ｍｇ／ｋｇの単回投与注射後のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）の活性を、ｍＲＮＡまたはＰＢＳ対照（ベースライン）の注射前のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける血中Ｐｈｅレベルと比較して示す棒グラフである。 ＰＡＨをコードするｍＲＮＡの複数回投与注射後のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス、ヘテロ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス、または野生型マウスにおけるヒトＰＡＨ、切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）、またはルシフェラーゼ対照の活性を、各ｍＲＮＡ注射の１、３、及び７日後の血中フェニルアラニンレベルで測定して示すグラフである。 血中フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルで測定した、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡの０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または２．０ｍｇ／ｋｇの複数回投与注射後（０、３、６、９、１２、及び１５日目）のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）の活性を、注射前（ベースライン）のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスの投与前血中Ｐｈｅレベルと比較して示す棒グラフである。 血中Ｔｙｒレベルで測定した、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡの０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または２．０ｍｇ／ｋｇの複数回投与注射後（０、３、６、９、１２、及び１５日目）のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）の活性を、注射前（ベースライン）のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスの投与前血中Ｔｙｒレベルと比較して示す棒グラフである。 経時的な血中フェニルアラニンレベルで測定した、ＰＡＨをコードする異なるｍｉＲ結合部位を有するｍＲＮＡの異なる用量の注射後のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）の活性を示す棒グラフである。 ３つのｍｉＲ１４２結合部位を有する（３ＸｍｉＲ１４２）、ｍｉＲ１２６結合部位を有する（ｍｉＲ１２６）、またはｍｉＲ結合部位を有さない（ｍｉＲｌｅｓｓ）、ＰＡＨ−ΔＲＤをコードするｍＲＮＡ構築物を注射した野生型ラットにおけるアスパルテームの投与後の切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）の活性を示すグラフである。 ｍＲＮＡの注射の６、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後の野生型ラットの腎臓における切断型ヒトｍＲＮＡ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）のレベル（Ｈスコア）を示す棒グラフである。 ｍＲＮＡの注射の６、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後の野生型ラットの心臓における切断型ヒトｍＲＮＡ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）のレベル（Ｈスコア）を示す棒グラフである。 ｍＲＮＡの注射の６、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後の野生型ラットの肝臓における切断型ヒトｍＲＮＡ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）のレベル（Ｈスコア）を示す棒グラフである。 ｍＲＮＡの注射の６、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後の野生型ラットの脾臓における切断型ヒトｍＲＮＡ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）のレベル（Ｈスコア）を示す棒グラフである。 インサイチュハイブリダイゼーションを用いた、ｍＲＮＡの注射後の様々な時点での腎臓におけるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの分布を示す。 インサイチュハイブリダイゼーションを用いた、ｍＲＮＡの注射後の様々な時点での心臓におけるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの分布を示す。図１６Ｆ及び１６Ｇの上部パネルは、これらの図の下部パネルの低倍率画像である。 インサイチュハイブリダイゼーションを用いた、ｍＲＮＡの注射後の様々な時点での肝臓におけるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの分布を示す。図１６Ｆ及び１６Ｇの上部パネルは、これらの図の下部パネルの低倍率画像である。 インサイチュハイブリダイゼーションを用いた、ｍＲＮＡの注射後の様々な時点での脾臓におけるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの分布を示す。 ｂＤＮＡアッセイを用いた、切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）をコードするｍＲＮＡの注射後の野生型ラットにおける２４時間にわたるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの血漿濃度を示すグラフである。 ＰＡＨΔＲＤタンパク質をコードするｍＲＮＡの注射の６時間後の野生型ラットの脾臓及び肝臓における切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）の発現を示すウェスタンブロットである。ＥＲＰ７２はローディング対照として使用した。 ＰＡＨΔＲＤタンパク質をコードするｍＲＮＡの注射の６、２４、４８、及び７２時間後の野生型ラットの肝臓における切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤまたはΔｒｄＰＡＨ）の発現の定量化を示す棒グラフである。 切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤもしくはΔｒｄＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡの０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、もしくは２．０ｍｇ／ｋｇの単回投与、切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤもしくはΔｒｄＰＡＨ）をコードするｍＲＮＡの２．０ｍｇ／ｋｇの２回投与（０日目及び１日目に注射）、または対照としてのＰＢＳの皮下注射後のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける血中Ｐｈｅレベルを、ｍＲＮＡまたはＰＢＳ対照（ベースラインレベル）の注射前のマウスにおける血中Ｐｈｅレベルと比較して示すグラフである。 ＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡの複数回投与（投与１〜５）で注射し、ｍＲＮＡの注射の８時間後にフェニルアラニンを投与したカニクイザルにおける血中フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルを、Ｐｈｅ投与の前後の様々な時点で示すグラフである。ｍＲＮＡの注射の８時間後にＰｈｅが投与される前（接種前）及び投与の２、１０、３０、４５、６０、１２０、１８０、及び２４０分後の血中Ｐｈｅレベルを示す。 ＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡの複数回投与（投与１〜５）で注射し、ｍＲＮＡの注射の４８時間後にフェニルアラニンを投与したカニクイザルにおける血中フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルを、Ｐｈｅ投与の前後の様々な時点で示すグラフである。ｍＲＮＡの注射の４８時間後にＰｈｅが投与される前（接種前）及び投与の２、１０、３０、４５、６０、１２０、１８０、及び２４０分後の血中Ｐｈｅレベルを示す。 図１９Ａ〜Ｂの実験結果の曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。 図１９Ａ〜Ｂの実験結果の曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。
本開示は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療するためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。ＰＫＵは、フェニルアラニンの代謝能力に影響を与える常染色体劣性先天異常の代謝障害である。ＰＫＵは、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするＰＡＨ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＰＡＨなしでは、フェニルアラニンの異化は正常に機能せず、異常なフェニルアラニンの蓄積をもたらす。ｍＲＮＡ治療薬は、該技術がＰＡＨをコードするｍＲＮＡの細胞内送達と、その後の標的細胞内での機能的ＰＡＨタンパク質のデノボ合成を提供するため、ＰＫＵの治療に特に適切である。該標的細胞へのｍＲＮＡの送達後、該細胞独自の翻訳機構によって所望のＰＡＨタンパク質が発現されるため、完全に機能するＰＡＨタンパク質が、欠陥または欠損タンパク質を置き換える。
核酸系治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）のインビボ送達に関連する１つの課題は、体内の免疫系が外来核酸に遭遇した際に起こり得る自然免疫応答に由来する。外来ｍＲＮＡは、トール様受容体（ＴＬＲ）、特に、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）によって活性化されるＴＬＲ７／８による認識を介して免疫系を活性化することができる。非免疫細胞では、外来ｍＲＮＡの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）を介して生じ得る。外来ｍＲＮＡの免疫認識は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）生産、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）分布及び強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）応答を含めた望ましくないサイトカイン効果をもたらし得る。本開示は、免疫活性化を最小限にし、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するため、治療用ｍＲＮＡ内への異なる修飾ヌクレオチドの組み込みを特徴とする。特定の態様は、自然免疫応答を低減するためのヌクレオチド修飾と、特に、ＰＡＨをコードする治療用ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内で、タンパク質発現を高めるための配列最適化の組み合わせを特徴とする。
本開示のｍＲＮＡ治療技術のある特定の実施形態はまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達システムを介したＰＡＨをコードするｍＲＮＡの送達を特徴とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡの標的細胞への安全かつ効果的な送達のための理想的なプラットフォームである。ＬＮＰは、細胞取り込み、細胞内輸送及びエンドソーム放出またはエンドソーム脱出を含む機序によって核酸を送達する独自の能力を有する。本発明は、ＰＡＨをコードするｍＲＮＡと組み合わせたイオン性脂質系のＬＮＰを特徴とし、これは、インビボで投与する場合に改善された特性を有する。理論に拘束されるものではないが、本発明のイオン性脂質系のＬＮＰ製剤は、改善された特性、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出を有すると考えられる。例えば、初回投与で、全身経路（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）によって投与されたＬＮＰは、例えば、さらなる投与で、その後に注入されるＬＮＰのクリアランスを促進する可能性がある。この現象は、加速血液クリアランス（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）（ＡＢＣ）として知られており、特に、治療状況で欠乏酵素（例えば、ＰＡＨ）を置き換える際に重要な課題である。これは、ｍＲＮＡ治療薬の反復投与がほとんどの場合、対象（例えば、ＰＫＵに罹患した対象）の標的組織における酵素の必要レベルを維持するために不可欠であるためである。反復投与の課題は、複数のレベルで対処することができる。ｍＲＮＡ工学及び／またはＬＮＰによる効率的な送達は、初回投与後に発現されるタンパク質（例えば、ＰＡＨ）のレベルの増加及びまたは持続時間の延長をもたらすことができ、その結果、初回投与と後続投与の間隔を伸ばすことができる。ＡＢＣ現象は、少なくとも部分的には、本質的に一過性であり、ＡＢＣの基礎にある免疫応答は、全身投与後の十分な時間の後に解消することが知られている。従って、１つの態様では、本開示のｍＲＮＡ治療薬の全身送達後、タンパク質の発現及び／または活性の持続時間を延長させることでＡＢＣ現象に対抗する。さらに、ＬＮＰは、免疫検知及び／または認識を回避するように操作することができ、ひいては、さらに後続または反復投与時のＡＢＣを回避することができる。本開示の例示的な態様は、ＡＢＣが低下するように操作されたＬＮＰを特徴とする。
１．フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ、ＥＣ１．１４．１６．１）は、当該芳香族側鎖のパラ−ヒドロキシル化によるＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）のＬ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）への変換を触媒する（図１参照）。哺乳類では、このテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）依存性反応は、食品タンパク質由来の過剰なＬ−Ｐｈｅの分解における最初の律速段階であり、ここでは、Ｌ−Ｔｙｒは、さらにクエン酸回路に入る産物まで分解される。ＰＡＨは、食事及び生理的条件下でのタンパク質異化から提供されるフェニルアラニン投入の約７５％を使う。
ＰＡＨは、主に肝臓に存在し、ここでは、過剰なＬ−Ｐｈｅの除去により、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）の神経毒性作用が予防される。しかしながら、Ｌ−Ｐｈｅはまた、必須のタンパク質構成アミノ酸でもあるため、完全に異化されないことが重要である。Ｌ−Ｐｈｅを保存し、さらに過剰のＬ−Ｐｈｅを効果的に除去するこの二重の役割を達成するため、哺乳類のＰＡＨは、いくつかの調節機構を発達させてきた。
哺乳動物のＰＡＨは、５０ｋＤａのサブユニットのホモ４量体酵素である。各ＰＡＨサブユニットは、Ｎ末端の調節ドメイン（残基１〜１１０）、中央の触媒ドメイン（残基１１１〜４１０）、及びＣ末端のオリゴマー化ドメイン（残基４１１〜４５２）から構成される（図２参照）。該Ｎ末端の調節ドメインは、ヒンジ領域（Ａｒｇ１１１〜Ｔｈｒ１１７）を介して該触媒ドメインに柔軟に結合される。該調節ドメインは、調節特性、例えば、Ｌ−Ｐｈｅによる活性化の発現に必要であり、また、それがＬ−Ｐｈｅのアロステリック結合部位を含むかどうかについては議論が続いている。該触媒ドメインは、鉄、補因子、及び基質の結合部位を含む。その活性部位では、鉄が２つのヒスチジン（ｈＰＡＨのＨｉｓ２８５及びＨｉｓ２９０）ならびにグルタミン酸（ｈＰＡＨのＧｌｕ３３０）に結合する。該オリゴマー化ドメインは、２量体化に関与する逆平行シート（残基４１１〜４１４、４２１〜４２４）で始まり、４０Å長のらせん（４２８〜４５２）がそれに続き、これが、他のモノマーとのドメインスワッピング及び逆平行コイルドコイル形成を介した４量体化を媒介する。
ヒトでは、ＰＡＨ遺伝子の突然変異がフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）をもたらし、また、ほとんどの突然変異は、主にＰＡＨのミスフォールディング及び不安定性と関連している。５００を超える病因性突然変異が存在する（ｐａｈｄｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ及びｂｉｏｐｋｕ．ｏｒｇ）。機能不全のＰＡＨは、Ｌ−Ｐｈｅの血中濃度の増加と、Ｌ−Ｐｈｅのフェニルピルビン酸へのアミノ基転移から生じる代謝産物の出現を尿中にもたらす。これは、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）の特徴であり、その中で、古典的なフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、血漿Ｌ−Ｐｈｅレベルが１，２００μＭを超える最も重症な形態である。Ｌ−Ｐｈｅの蓄積及びそれに続く脳内神経伝達物質の障害は、精神遅滞、無目的の動き、及びうつ病を含めた神経症状をもたらす。Ｌ−Ｐｈｅの食事摂取量はそれ故、ＰＫＵ患者では厳密に制御される必要がある。
ヒトＰＡＨのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤタンパク質、ＰＡＨΔＲＤタンパク質、またはΔｒｄＰＡＨタンパク質と呼ばれる）のアミノ酸配列は、配列番号２１に示される。この切断型は、３３６個のアミノ酸長であり、ＰＡＨの触媒ドメインを含む。かなりの数のヒトＰＡＨ突然変異がこの触媒ドメインで発見されている。
ある特定の態様では、本開示は、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドは、野生型完全長ヒトＰＡＨタンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドは、野生型ＰＡＨ配列に対して、置換、ならびに挿入及び／または付加、欠失及び／または共有結合的修飾を含むバリアント、ペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドは、切断型ヒトＰＡＨタンパク質（例えば、配列番号２１のタンパク質）である。いくつかの実施形態では、配列タグまたはアミノ酸を、例えば、局在化のために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列に付加することができる（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基を任意に削除し、断片を提供することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ、２つ、３つ、または３つを超える置換を含むことができるヒトＰＡＨ配列の置換バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、該置換バリアントは、１つ以上の保存アミノ酸の置換を含むことができる。他の実施形態では、該バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、該バリアントは、欠失バリアントである。
ＰＡＨタンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、及び相同タンパク質（オルソログ）もまた、本開示のＰＡＨポリペプチドの範囲内である。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例は、配列番号１及び配列番号２１に示される。
本開示で提示されるある特定の組成物及び方法は、野生型ヒトＰＡＨのタンパク質またはポリヌクレオチド配列を指す。かかる開示は、配列番号２１に記載の切断型（触媒ドメイン及び４量体化ドメインを含むＰＡＨ）等の当技術分野で既知の他のＰＡＨバリアントにも同様に適用可能である。
２．ポリヌクレオチド及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本発明は、ＰＫＵ等の高フェニルアラニン血症の治療または予防に使用するｍＲＮＡを特徴とする。本発明での使用を特徴とするｍＲＮＡは、対象に投与され、インビボでヒトＰＡＨタンパク質をコードする。従って、本発明は、ヒトＰＡＨ（配列番号１）、その機能的断片（配列番号２１）、及びＰＡＨを含む融合タンパク質をコードする連結ヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、該オープンリーディングフレームは、配列最適化される。特定の実施形態では、本発明は、ヒトＰＡＨのポリペプチド配列をコードするヌクレオチドを含む配列最適化ポリヌクレオチド、またはそれらの配列最適化ポリヌクレオチドと高い配列同一性を有する配列を提供する。
ある特定の態様では、本発明は、１つ以上のＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコードされたＰＡＨポリペプチドは、以下から選択され得る：
（ｉ）完全長ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型ＰＡＨと同じまたは本質的に同じ長さを有する、例えば、野生型ヒトＰＡＨ）、
（ｉｉ）本明細書に記載のＰＡＨの機能的断片（例えば、ＰＡＨより短い切断型（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列であるが、ＰＡＨの酵素活性をなお保持する）、例えば、ヒトＰＡＨの触媒ドメイン及び４量体化ドメインを含むＰＡＨ、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、完全長もしくは１つ以上のアミノ酸が置き換えられた切断型ＰＡＨタンパク質、例えば、参照タンパク質（例えば、当技術分野で既知の任意の天然もしくは人工バリアント）に対して該ポリペプチドのＰＡＨ活性のすべてもしくはほとんどを保持するバリアント）、または
（ｉｖ）（ｉ）完全長ＰＡＨタンパク質（例えば、配列番号１）、その機能的断片（例えば、配列番号２１）もしくはバリアント、及び（ｉｉ）異種タンパク質を含む融合タンパク質。
ある特定の実施形態では、該コードされたＰＡＨポリペプチドは、哺乳類ＰＡＨポリペプチド、例えば、ヒトＰＡＨポリペプチド、その機能的断片またはバリアントである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞のＰＡＨタンパク質の発現レベル及び／または検出可能なＰＡＨ酵素活性レベルをそれらの細胞に導入された際に、例えば、本発明のポリヌクレオチドの投与前の該細胞のＰＡＨタンパク質の発現レベル及び／または検出可能なＰＡＨ酵素活性レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加させる。ＰＡＨタンパク質の発現レベル及び／またはＰＡＨ酵素活性は、当技術分野で既知の方法に従って測定することができる。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、インビトロで当該細胞に導入される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、インビボで当該細胞に導入される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＰＡＨ、例えば、（配列番号１）または切断型ヒトＰＡＨ（配列番号２１）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、ここで、該コドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、野生型ＰＡＨ配列（例えば、野生型ヒトＰＡＨ）に由来する。例えば、ＰＡＨをコードする配列最適化ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドの場合、対応する野生型配列は、天然ヒトＰＡＨである。同様に、ヒトＰＡＨの機能的断片をコードする配列最適化ｍＲＮＡの場合、対応する野生型配列は、ヒトＰＡＨ由来の対応する断片である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＰＡＨの完全長配列を有するＰＡＨをコードするヌクレオチド配列を含む（すなわち、イニシエータメチオニンを含む、アミノ酸１〜４５２）。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異型ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、当該ＰＡＨのアミノ酸配列に少なくとも１つの点突然変異を含み、かつＰＡＨ酵素活性を保持するＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、該変異型ＰＡＨポリペプチドは、ＰＡＨ活性を有し、これは、対応する野生型ＰＡＨ（すなわち、同じＰＡＨポリペプチドであるが、変異（複数可）を含まない）のＰＡＨ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。いくつかの実施形態では、変異型ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨ酵素活性を変化させない変異を備えたＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。かかる変異型ＰＡＨポリペプチドは、機能中性と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、１つ以上の機能中性点突然変異を含む変異型ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
いくつかの実施形態では、該変異型ＰＡＨポリペプチドは、対応する野生型ＰＡＨよりも高いＰＡＨ酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、該変異型ＰＡＨポリペプチドは、ＰＡＨ活性を有し、これは、対応する野生型ＰＡＨ（すなわち、同じＰＡＨタンパク質であるが、変異（複数可）を含まない）の活性より、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、機能的ＰＡＨ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、例えば、１つ以上の断片は、野生型ＰＡＨポリペプチドのポリペプチド部分列に相当し、ＰＡＨ酵素活性を保持する。いくつかの実施形態では、該ＰＡＨ断片は、ＰＡＨ活性を有し、これは、対応する完全長ＰＡＨのＰＡＨ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である。いくつかの実施形態では、機能的ＰＡＨ断片をコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する完全長ＰＡＨよりも高いＰＡＨ酵素活性を有するＰＡＨ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。従って、いくつかの実施形態では、該ＰＡＨ断片は、ＰＡＨ活性を有し、これは、対応する完全長ＰＡＨのＰＡＨ活性より少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＰＡＨより少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＰＡＨ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、５〜２０、または２２〜３８の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、５〜２０、または２２〜３８からなる群から選択される配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、５〜２０、または２２〜３８からなる群から選択される配列に対して、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするＯＲＦを含み、該ポリヌクレオチドは、配列番号８、９、１０、２８、３０、または３１からなる群から選択される配列に対して、７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該ヌクレオチド配列は、配列番号２、５〜２０、または２２〜３８の配列と７０％〜９０％同一、７５％〜８５％同一、７６％〜８４％同一、７７％〜８３％同一、７７％〜８２％同一、または７８％〜８１％同一である。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００〜約１００，０００個のヌクレオチドを含む（例えば、９００〜１，０００、９００〜１，１００、９００〜１，２００、９００〜１，３００、９００〜１，４００、９００〜１，５００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，２００、１，０００〜１，３００、１，０００〜１，４００、１，０００〜１，５００、１，１８７〜１，２００、１，１８７〜１，４００、１，１８７〜１，６００、１，１８７〜１，８００、１，１８７〜２，０００、１，１８７〜３，０００、１，１８７〜５，０００、１，１８７〜７，０００、１，１８７〜１０，０００、１，１８７〜２５，０００、１，１８７〜５０，０００、１，１８７〜７０，０００、または１，１８７〜１００，０００個）。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチドの長さである（例えば、少なくとも約５００、６００、７００、８０、９００、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１８７、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００もしくは１００，０００を含むそれ以下、またはそれを超えるヌクレオチド）。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、さらに、少なくとも１つの非コード核酸配列、例えば、マイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、さらに、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号３、８８〜１０２、もしくは１６５〜１６７の配列から選択される、または配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、もしくは配列番号２０５の配列から選択される）、及び３’ＵＴＲ（例えば、配列番号４、１０４〜１１２、もしくは１５０の配列から選択される、または配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、もしくは配列番号２０７の配列から選択される）。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’末端キャップ（例えば、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログ）及びポリＡ領域（例えば、約１００ヌクレオチドの長さ）を含む。さらなる実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４、１１１、もしくは１１２またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、もしくは配列番号２０７またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号１１１の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号１５０の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号１７５の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号１７７の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号１７８の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号２０６の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号２０７の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、配列番号４の核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、ポリＡテールを含む。ある場合には、該ポリＡテールは、５０〜１５０、７５〜１５０、８５〜１５０、９０〜１５０、９０〜１２０、９０〜１３０、または９０〜１５０ヌクレオチドの長さである。ある場合には、該ポリＡテールは、１００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、一本鎖または二本鎖である。
いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであるか、またはｍＲＮＡとして機能する。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該コードされたＰＡＨポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボで産生するように翻訳され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８参照）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、Ｎ１−メチルプソイドウラシルまたは５−メトキシウラシルを含む。ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルはＮ１−メチルプソイドウラシルである。他の実施形態では、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルは５−メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤とともに製剤化される。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約５０：１０：３８．５：１．５で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約３０〜約６０ｍｏｌ％の化合物ＩＩもしくはＶＩ（または関連する適切なアミノ脂質）（例えば、３０〜４０、４０〜５０、４５〜５０、５０〜５５または５５〜６０ｍｏｌ％の化合物ＩＩもしくはＶＩ（または関連する適切なアミノ脂質））、約５〜約２０ｍｏｌ％のリン脂質（または関連する適切なリン脂質もしくは「ヘルパー脂質」）（例えば、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０ｍｏｌ％のリン脂質（または関連する適切なリン脂質もしくは「ヘルパー脂質」）、約２０〜約５０ｍｏｌ％のコレステロール（または関連するステロールもしくは「非カチオン性」脂質）（例えば、約２０〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または４５〜５０ｍｏｌ％のコレステロール（または関連するステロールもしくは「非カチオン性」脂質））及び約０．０５〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質）（例えば、０．０５〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜７、または７〜１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質））の範囲のモル比で含む。例示的な送達剤は、例えば、モル比４７．５：１０．５：３９．０：３．０または５０：１０：３８．５：１．５から構成され得る。ある特定の例では、例示的な送達剤は、例えば、モル比４７．５：１０．５：３９．０：３、４７．５：１０：３９．５：３、４７．５：１１：３９．５：２、４７．５：１０．５：３９．５：２．５、４７．５：１１：３９：２．５、４８．５：１０：３８．５：３、４８．５：１０．５：３９：２、４８．５：１０．５：３８．５：２．５、４８．５：１０．５：３９．５：１．５、４８．５：１０．５：３８．０：３、４７：１０．５：３９．５：３、４７：１０：４０．５：２．５、４７：１１：４０：２、４７：１０．５：３９．５：３、４８：１０．５：３８．５：３、４８：１０：３９．５：２．５、４８：１１：３９：２、または４８：１０．５：３８．５：３から構成され得る。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約５０：１０：３８．５：１．５で含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり、これは、５’末端キャップ（例えば、キャップ１）、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号３）、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択されるＯＲＦ配列、３’ＵＴＲ（例えば、配列番号４、１７５、１７７、または１７８）、ならびにポリＡテール（例えば、約１００ｎｔの長さ）を含み、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルは、Ｎ１−メチルプソイドウラシルである。いくつかの実施形態では、該送達剤は、イオン性脂質として化合物ＩＩまたは化合物ＶＩを含み、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ−ＤＭＧまたは化合物Ｉを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり、これは、５’末端キャップ（例えば、キャップ１）、５’ＵＴＲ（例えば、配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５）、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択されるＯＲＦ配列、３’ＵＴＲ（例えば、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７）、ならびにポリＡテール（例えば、約１００ｎｔの長さ）を含み、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルは、Ｎ１−メチルプソイドウラシルである。いくつかの実施形態では、該送達剤は、イオン性脂質として化合物ＩＩまたは化合物ＶＩを含み、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ−ＤＭＧまたは化合物Ｉを含む。
３．シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はまた、コードされたポリペプチドの治療関連部位への輸送を容易にするさらなる特徴をコードするヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送を支援する１つのかかる特徴は、シグナル配列、または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含めた様々な名称で知られている。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載のＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
いくつかの実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり、約３０〜２１０、例えば、約４５〜８０または１５〜６０ヌクレオチド（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、または７０アミノ酸）の長さであり、任意に、コード領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）でそれぞれ組み込まれる。これらの配列の追加により、該コードされたポリペプチドが所望の部位、例えば、小胞体またはミトコンドリアに、１つ以上の標的化経路を介して輸送される。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質から、例えば、シグナルペプチダーゼによって、当該タンパク質が所望の部位に輸送された後、切断される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列はさらに、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列を含む。
４．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードする複数の核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＡＨポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、複数のＯＲＦ、例えば、ＰＡＨポリペプチド（第一の目的のポリペプチド）をコードする第一のＯＲＦ、機能的断片、またはそのバリアント、及び第二の目的のポリペプチドを発現する第二のＯＲＦを含み得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の目的のポリペプチドは、遺伝子的に融合させることができ、すなわち、２つ以上のポリペプチドは、同一のＯＲＦによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の目的のポリペプチド間のリンカー（例えば、Ｇ４Ｓ（配列番号８６）ペプチドリンカーまたは当技術分野で既知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、各々目的のポリペプチドを発現する２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＯＲＦを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチドをコードする第一の核酸配列（例えば、第一のＯＲＦ）及び第二の目的のポリペプチドをコードする第二の核酸配列（例えば、第二のＯＲＦ）を含み得る。
リンカー及び切断可能なペプチド
ある特定の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、複数のＰＡＨドメイン（例えば、ＰＡＨの触媒ドメイン、ＰＡＨの４量体化ドメイン）または異種ドメインをコードし、本明細書では多量体構築物と呼ばれる。該多量体構築物のある特定の実施形態では、該ｍＲＮＡはさらに、各ドメイン間に位置するリンカーをコードする。該リンカーは、例えば、切断可能なリンカーまたはプロテアーゼ感受性リンカーであり得る。ある特定の実施形態では、該リンカーは、Ｆ２Ａリンカー、Ｐ２Ａリンカー、Ｔ２Ａリンカー、Ｅ２Ａリンカー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。２Ａペプチドと呼ばれるこの自己切断型ペプチドリンカーのファミリーは、当技術分野において記載されている（例えば、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１１） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１８５５６参照）。ある特定の実施形態では、該リンカーは、Ｆ２Ａリンカーである。ある特定の実施形態では、該リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号８６）リンカーである。ある特定の実施形態では、該リンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９０）リンカーであり、ここで、ｎ＝２、３、４、または５である。ある特定の実施形態では、該多量体構築物は、ドメイン−リンカー−ドメイン−リンカー−ドメイン、例えば、ＰＡＨドメイン−リンカー−ＰＡＨドメインの構造を有する介在リンカーを備えた３つのドメインを含む。
１つの実施形態では、該切断可能なリンカーは、Ｆ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８６）を有する）である。他の実施形態では、該切断可能なリンカーは、Ｔ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８７）を有する）、Ｐ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８８）を有する）またはＥ２Ａリンカー（例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１８９）を有する）である。当業者には、当技術分野で認められている他のリンカーが本発明の構築物（例えば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる）での使用に適し得ることが認識されよう。当業者には、同様に、他の多シストロン性構築物が、本発明での使用に適し得ることが認識されよう。例示的な実施形態では、該構築物の設計は、本発明の構築物によってコードされる細胞内抗体及び／またはそのドメインのほぼ等モル量をもたらす。
１つの実施形態では、該自己切断型ペプチドは、２Ａペプチドであり得るが、これに限定されない。様々な２Ａペプチドが当技術分野で知られており、利用可能であり、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド、及びブタテッショウウイルス−１ ２Ａペプチド等が使用され得る。２Ａペプチドは、いくつかのウイルスによって使用され、リボソームスキッピングによって１つの転写物から２つのタンパク質を生成し、その結果、正常なペプチド結合が当該２Ａペプチド配列において損なわれ、１つの翻訳事象から２つの不連続なタンパク質が産生される。非限定的な例として、該２Ａペプチドは、配列番号１８８のタンパク質配列、その断片またはバリアントを有し得る。１つの実施形態では、該２Ａペプチドは、最後のグリシン及び最後のプロリン間を切断する。別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１８８の断片またはバリアントのタンパク質配列を有する２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の一例は、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＵＡＣＵＡＡＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＣＵＧＡＡＧＣＡＧＧＣＵＧＧＡＧＡＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＵＧＧＡＣＣＵ（配列番号１９１）である。１つの例示的な実施形態では、２Ａペプチドは、以下の配列によってコードされる：５’−ＵＣＣＧＧＡＣＵＣＡＧＡＵＣＣＧＧＧＧＡＵＣＵＣＡＡＡＡＵＵＧＵＣＧＣＵＣＣＵＧＵＣＡＡＡＣＡＡＡＣＵＣＵＵＡＡＣＵＵＵＧＡＵＵＵＡＣＵＣＡＡＡＣＵＧＧＣＴＧＧＧＧＡＵＧＵＡＧＡＡＡＧＣＡＡＵＣＣＡＧＧＴＣＣＡＣＵＣ−３’（配列番号１９２）。該２Ａペプチドのポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載の方法及び／または当技術分野で既知の方法によって修飾されても、コドン最適化されてもよい。
１つの実施形態では、この配列を用いて、２つ以上の目的のポリペプチドのコード領域を分離してもよい。非限定的な例として、該Ｆ２Ａペプチドをコードする配列は、第一のコード領域Ａと第二のコード領域Ｂ間であり得る（Ａ−Ｆ２Ａｐｅｐ−Ｂ）。該Ｆ２Ａペプチドの存在により、１つの長いタンパク質が当該Ｆ２Ａペプチド配列の末端のグリシンとプロリンの間で切断される（ＮＰＧＰが切断されてＮＰＧとＰを生じる）ため、独立したタンパク質Ａ（ＮＰＧで終わる結合されたＦ２Ａペプチドの２１アミノ酸を含む）及び独立したタンパク質Ｂ（結合されたＦ２Ａペプチドの１つのアミノ酸Ｐを含む）を生成する。同様に、他の２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ及びＥ２Ａ）の場合、長いタンパク質における該ペプチドの存在により、該２Ａペプチド配列の末端のグリシンとプロリンの間が切断される（ＮＰＧＰが切断されてＮＰＧとＰを生じる）。タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂは、同じまたは異なる目的のペプチドもしくはポリペプチドであり得る（例えば、ＰＡＨポリペプチド、例えば、完全長ヒトＰＡＨまたはＰＡＨの触媒及び４量体化ドメインを含むその切断型）。特定の実施形態では、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂは、いずれかの順序でＰＡＨの触媒ドメイン、及びＰＡＨの４量体化ドメインである。ある特定の実施形態では、該第一のコード領域及び該第二のコード領域は、ＰＡＨの触媒ドメイン及びＢのＰＡＨの４量体化ドメインをいずれかの順序でコードする。
５．ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、任意に、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、任意に少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ、任意に、リンカー、ポリＡテール、またはそれらの任意の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、該ＯＲＦ（複数可）は配列最適化される。
配列最適化ヌクレオチド配列、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするコドン最適化ｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列）に対して、少なくとも１つの同義核酸塩基置換を含む配列である。
配列最適化ヌクレオチド配列は、該参照配列と部分的にまたは完全に配列が異なり得る。例えば、ＵＣＵコドンによって均一にコードされるポリセリンをコードする参照配列は、ＡＧＣコドンによって均一にコードされるポリセリンをコードする配列を生じるようにその核酸塩基の１００％を置換することによって配列最適化され得る（各コドンに関して、１位のＵをＡで置き換え、２位のＣをＧで置き換え、３位のＵをＣで置き換える）。該参照ポリセリンの核酸配列と該配列最適化ポリセリンの核酸配列の間のグローバルペアワイズアラインメントから得られる配列同一性のパーセンテージは０％である。しかしながら、両方の配列由来のタンパク質産物は１００％同一である。
いくつかの配列最適化（コドン最適化とも呼ばれる場合がある）方法は、当技術分野で既知であり（及び以下でより詳細に論じる）、１つ以上の所望の結果を達成するために有用であり得る。これらの結果としては、例えば、適切なフォールディングを確保するためのある特定の組織標的及び／または宿主生物でのコドン頻度の照合、ｍＲＮＡの安定性を高めるため、もしくは二次構造を減少させるためにＧ／Ｃ含量にバイアスをかけること、遺伝子の構築もしくは発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンもしくはベースランを最小限にすること、転写及び翻訳制御領域のカスタマイズ、タンパク質輸送配列の挿入もしくは除去、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）の除去／追加、タンパク質ドメインの追加、除去、もしくはシャフリング、制限酵素認識部位の挿入もしくは削除、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位の修飾、当該タンパク質の様々なドメインを適切にフォールドさせるための翻訳速度の調節、及び／または当該ポリヌクレオチド内の問題のある二次構造の低減もしくは排除を挙げることができる。配列最適化のツール、アルゴリズム及びサービスは、当技術分野で既知であり、非限定的な例として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）及び／または独自方法によるサービスが挙げられる。
各アミノ酸のコドン選択肢を表１に示す。
表１．コドン選択肢

いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、該配列最適化ヌクレオチド配列によってコードされるＰＡＨポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントは、改善された特性（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされるＰＡＨポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントと比較して）、例えば、インビボ投与後の発現効率に関連する改善された特性を有する。かかる特性としては、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織における翻訳効率の向上、発現される切断型タンパク質数の低減、発現されるタンパク質のフォールディングの改善またはミスフォールディングの防止、発現される産物の毒性の低減、発現される産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増大及び／または減少が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）は、ヒト対象での発現に対してコドン最適化され、当技術分野における１つ以上の問題を回避する構造的及び／または化学的特徴、例えば、構造的及び機能的完全性を保持しつつ核酸系治療薬の製剤化及び送達を最適化するために有用な特徴を有し、発現の閾値を克服し、発現率を改善し、半減期及び／またはタンパク質濃度、タンパク質局在を最適化し、免疫応答及び／または分解経路等の有害な生物学的応答を回避する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えばＯＲＦ）、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ結合部位、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらの任意の組み合わせ）を含み、これは、以下を含む方法に従って配列最適化される：
（ｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦ）の少なくとも１つのコドンを、ウリジン含量を増加もしくは減少させる代替コドンで置換し、ウリジン修飾配列を生成すること、
（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦ）の少なくとも１つのコドンを、同義コドンセットにてコドン頻度がより高い代替コドンで置換すること、
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦ）の少なくとも１つのコドンを、Ｇ／Ｃ含量を増加させる代替コドンで置換すること、または
（ｉｖ）それらの組み合わせ。
いくつかの実施形態では、該配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、該参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの改善された特性を有する。
いくつかの実施形態では、該配列最適化方法は、マルチパラメトリックであり、本明細書に開示の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の方法及び／または当技術分野で既知の他の最適化方法を含む。
本発明のいくつかの実施形態において有益と考えることができる特徴は、該ポリヌクレオチドの領域によって、またはその領域内でコードされる場合があり、かかる領域は、該ＰＡＨポリペプチドをコードする領域の上流（５’）、下流（３’）、またはその領域内であり得る。これらの領域は、該タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前及び／または後に該ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。かかる特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡテール、及び検出可能なタグが挙げられるがこれらに限定されず、ＸｂａＩ認識が可能な複数のクローニング部位を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／またはマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含み、これらは同じ配列でも異なる配列でもよい。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含み、これらは同じ配列でも異なる配列でもよい。該５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはマイクロＲＮＡ結合部位の任意の部分は、ない場合もあるが、配列最適化することができ、独立して、配列最適化の前及び／または後に、１つ以上の異なる構造的または化学的修飾を含むことができる。
いくつかの実施形態では、最適化後、該ポリヌクレオチドは、再構成され、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体等であるがこれらに限定されないベクターに形質転換される。例えば、該最適化ポリヌクレオチドは、再構成され、化学的に適格なＥ．ｃｏｌｉ、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエ等に形質転換され、ここで、本明細書に記載の方法によって高コピープラスミド様または染色体構造が生じる。
６．ＰＡＨポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＰＡＨポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、該ＯＲＦは配列最適化されている。
ヒト完全長ＰＡＨをコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号２及び５〜２０（それぞれ、ＰＡＨ＿００１（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００２（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００３（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００４（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００５（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００６（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００７（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００８（Ｇ５）、ＰＡＨ＿００９（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０１０（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０１１（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０１２（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０１３（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０１４（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０１５（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０１６（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０１７（Ｇ６）、ＰＡＨ＿００８（Ｇ６）、ＰＡＨ＿００９（Ｇ６）、及びＰＡＨ＿０１０（Ｇ６））として示される。いくつかの実施形態では、該配列最適化ＰＡＨ配列、断片、及びそのバリアントは、本明細書に開示の方法を実施するために使用される。
ヒト切断型ＰＡＨをコードする例示的な配列最適化ヌクレオチド配列（ＰＡＨの触媒ドメイン及び４量体化ドメインを含む）は、配列番号２２〜３８（それぞれ、ＰＡＨ＿０１８（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０１９（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２０（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２１（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２２（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２３（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２４（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２５（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２６（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２７（Ｇ５）、ＰＡＨ＿０２８（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０２９（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０３０（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０３１（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０３２（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０３３（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０３４（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０２５（Ｇ６）、ＰＡＨ＿０２６（Ｇ６）、及びＰＡＨ＿０２７（Ｇ６））として示される。いくつかの実施形態では、該配列最適化ＰＡＨ切断型配列、断片、及びそのバリアントは、本明細書に開示の方法を実施するために使用される。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端に以下を含む：
（ｉ）本明細書に示す５’キャップ、例えば、キャップ１、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号３、
（ｉｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号２、５〜２０及び２２〜３８に示すＰＡＨをコードする配列最適化核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン（存在しない場合、３’ＵＴＲの５’末端）、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号４、１７５、１７７、または１７８、ならびに
（ｖｉ）上記のポリＡテール。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端に以下を含む：
（ｉ）本明細書に示す５’キャップ、例えば、キャップ１、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５、
（ｉｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号２、５〜２０及び２２〜３８に示すＰＡＨをコードする配列最適化核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン（存在しない場合、３’ＵＴＲの５’末端）、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば、本明細書に示す配列、例えば、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７、ならびに
（ｖｉ）上記のポリＡテール。
ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルはＮ１−メチルプソイドウラシル（Ｇ５）である。ある特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドのすべてのウラシルは５−メトキシウラシル（Ｇ６）である。
本明細書に開示の配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列及び他の既知の配列最適化ヌクレオチド配列とは異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、独自の組成特性を有する。
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＰＡＨポリペプチド、機能的断片、またはそのバリアントをコードする）のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージは、参照野生型ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージに対して変更される（例えば、低減される）。かかる配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と呼ばれる。ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン含量のパーセンテージは、配列内のウラシルまたはチミン数をヌクレオチドの総数で除し、１００を掛けることにより特定され得る。いくつかの実施形態では、該配列最適化ヌクレオチド配列は、参照野生型配列のウラシルまたはチミン含量より低いウラシルまたはチミン含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列のウラシルまたはチミン含量は、参照野生型配列のウラシルまたはチミン含量より高いが、それでもなお、有益な効果、例えば、参照野生型配列と比較した場合に発現の増加及び／またはトール様受容体（ＴＬＲ）応答の低下を維持する。
コドン使用頻度を最適化する方法は、当技術分野では既知である。例えば、本明細書に示す配列の任意の１つ以上のＯＲＦは、コドン最適化され得る。コドン最適化は、いくつかの実施形態では、適切なフォールディングを確保するための標的及び宿主生物でのコドン頻度を照合するため、ｍＲＮＡの安定性を高めるため、もしくは二次構造を減少させるためにＧ／Ｃ含量にバイアスをかけるため、遺伝子の構築もしくは発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンもしくはベースランを最小限にするため、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするため、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去するため、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／追加するため、タンパク質ドメインを追加、除去もしくはシャフリングするため、制限酵素認識部位を挿入もしくは削除するため、リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するため、当該タンパク質の様々なドメインを適切にフォールドさせるための翻訳速度を調節するため、または当該ポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を低減もしくは排除するために使用され得る。コドン最適化のツール、アルゴリズム及びサービスは、当該技術分野で既知であり、非限定的な例として、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）及び／または独自方法によるサービスが挙げられる。いくつかの実施形態では、該オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。
７．配列最適化核酸の特性評価
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つの核酸配列の特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露された際の安定性）または発現特性が、非配列最適化核酸に対して改善されたかどうかを特定するために試験され得る。
本明細書で使用される、「発現特性」とは、核酸配列のインビボでの特性（例えば、合成ｍＲＮＡがそれを必要とする対象に投与された後の翻訳効率）またはインビトロでの特性（例えば、合成ｍＲＮＡのインビトロモデル系で試験される翻訳効率）のいずれかを指す。発現特性としては、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって投与後に産生されるタンパク質の量、及び産生される可溶性または他の機能的タンパク質の量が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の配列最適化核酸は、本明細書に開示のＰＡＨポリペプチドをコードする配列最適化核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存率に従って評価され得る。
特定の実施形態では、非最適化参照核酸配列に対してコドン置換を含む本明細書に開示の複数の配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を機能的に特徴づけ、目的の特性、例えば、インビトロモデル系、または標的組織もしくは細胞におけるインビボでの発現特性を測定することができる。
ａ．核酸配列固有特性の最適化
本発明のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの所望の特性は、該核酸配列の固有特性である。例えば、該ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビボまたはインビトロ安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、該ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞における発現のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、該核酸配列は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによる分解を防ぐことによって、その血漿半減期を延長するように配列最適化される。
他の実施形態では、該核酸配列は、溶液中での耐加水分解性を高めるように配列最適化され、例えば、該配列最適化核酸または該配列最適化核酸を含む医薬組成物を水性条件下、最小限の分解で保存することができる時間を延長する。
他の実施形態では、該配列最適化核酸は、乾燥貯蔵条件での耐加水分解性を高めるように最適化され、例えば、該配列最適化核酸を凍結乾燥後、最小限の分解で保存することができる時間を延長することができる。
ｂ．タンパク質発現用に最適化された核酸配列
本発明のいくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドの所望の特性は、本明細書に開示の配列最適化配列によってコードされるＰＡＨポリペプチドの発現レベルである。タンパク質発現レベルは、１つ以上の発現系を用いて測定することができる。いくつかの実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞で測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物から調製したインビトロ発現系、または精製された個々の成分の集合により調製したインビトロ発現系を用いて測定され得る。他の実施形態では、該タンパク質発現は、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サル等で測定される。
いくつかの実施形態では、溶液形態でのタンパク質発現が望ましい場合がある。従って、いくつかの実施形態では、参照配列は、可溶形態での発現タンパク質の最適化レベルを有する配列最適化核酸配列を生じるように配列最適化され得る。タンパク質発現のレベルならびに他の特性、例えば、溶解性、凝集のレベル、及び切断産物（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または翻訳欠陥に起因する断片）の存在は、当技術分野で既知の方法に従って、例えば、電気泳動（例えば、未変性もしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー等）を用いて測定することができる。
ｃ．標的組織または標的細胞の生存率の最適化
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、当該標的組織または細胞に有害な影響を与える可能性があり、タンパク質収量を低減し、もしくは発現産物の質を低下させ（例えば、タンパク質断片の存在もしくは発現タンパク質の封入体での沈殿に起因して）、または毒性を生じる。
従って、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸配列、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列の配列最適化は、当該配列最適化核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を高めるために使用され得る。
異種タンパク質の発現はまた、自己または異種移植用の核酸配列でトランスフェクトされた細胞に有害である場合もある。従って、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸配列の配列最適化は、当該配列最適化核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存率を高めるために使用され得る。細胞または組織の生存率、毒性、及び他の生理学的反応の変化は、当技術分野で既知の方法に従って測定され得る。
ｄ．免疫及び／または炎症反応の減少
場合によっては、ＰＡＨポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列最適化核酸の投与は、免疫応答を誘発する可能性があり、これは、（ｉ）治療薬（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）かかる治療薬の発現産物（例えば、該ｍＲＮＡによってコードされるＰＡＨポリペプチド）、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって引き起こされ得る。従って、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化は、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはかかる核酸がコードするＰＡＨの発現産物によって誘発される免疫もしくは炎症反応を減少させるために使用され得る。
いくつかの態様では、炎症反応は、当技術分野で既知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、１つ以上の炎症性サイトカインのレベルの増加を検出することによって測定され得る。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症反応において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、ＧＲＯαとしても知られる、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語にはまた、当技術分野で既知の炎症反応に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）等も含まれる。
８．ＰＡＨポリペプチドをコードする修飾ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、化学的に修飾されたウラシル、例えば、プソイドウラシル、Ｎ１−メチルプソイドウラシル、５−メトキシウラシル等を含む。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列であり、該ｍＲＮＡは、化学的に修飾された核酸塩基、例えば、化学的に修飾されたウラシル、例えば、プソイドウラシル、Ｎ１−メチルプソイドウラシル、または５−メトキシウラシルを含む。
本発明のある特定の態様では、該修飾ウラシル塩基が、ポリヌクレオチドのようにリボース糖に接続される場合、得られる修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、修飾ウリジンと呼ばれる。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドのウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％修飾されたウラシルである。１つの実施形態では、該ポリヌクレオチドのウラシルは、少なくとも９５％修飾されたウラシルである。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドのウラシルは、１００％修飾されたウラシルである。
該ポリヌクレオチドのウラシルが少なくとも９５％修飾されたウラシルである実施形態では、総ウラシル含量は、ｍＲＮＡが適切なタンパク質発現レベルを与える一方で免疫応答をほとんどまたは全く誘導しないように調節され得る。いくつかの実施形態では、該ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦの理論最小ウラシル含量（％ＵＴＭ）の約１００％〜約１５０％、約１００％〜約１１０％、約１０５％〜約１１５％、約１１０％〜約１２０％、約１１５％〜約１２５％、約１２０％〜約１３０％、約１２５％〜約１３５％、約１３０％〜約１４０％、約１３５％〜約１４５％、約１４０％〜約１５０％である。他の実施形態では、該ＯＲＦのウラシル含量は、％ＵＴＭの約１２１％〜約１３６％、または１２３％〜１３４％である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含量は、％ＵＴＭの約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、または約１５０％である。この状況では、「ウラシル」という用語は、修飾ウラシル及び／または天然に存在するウラシルを指すことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおけるウラシル含量は、該ＯＲＦの総核酸塩基含量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、または約１０％未満である。いくつかの実施形態では、該ＯＲＦのウラシル含量は、該ＯＲＦの総核酸塩基含量の約１０％〜約２０％である。他の実施形態では、該ＯＲＦのウラシル含量は、該ＯＲＦの総核酸塩基含量の約１０％〜約２５％である。１つの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおけるウラシル含量は、該オープンリーディングフレームの総核酸塩基含量の約２０％未満である。この状況では、「ウラシル」という用語は、修飾ウラシル及び／または天然に存在するウラシルを指すことができる。
さらなる実施形態では、修飾ウラシル及び調節ウラシル含量を有するＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）含量（絶対または相対）が増加している。いくつかの実施形態では、該ＯＲＦの全体としてのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の増加は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対または相対）に対して、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。いくつかの実施形態では、該ＯＲＦのＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、対応する該ＰＡＨポリペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列の理論最大Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量（％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸ）の約１００％未満、約９０％未満、約８５％未満、または約８０％未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＧ及び／またはＣ含量（絶対または相対）の増加は、低Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量の同義コドンをより高いＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義コドンで置き換えることによって実施され得る。他の実施形態では、Ｇ及び／またはＣ含量（絶対または相対）の増加は、Ｕで終わるコドンをＧまたはＣで終わる同義コドンで置き換えることによって実施される。
さらなる実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、修飾ウラシルを含み、該ＰＡＨポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列より少ないウラシル対（ＵＵ）及び／または三連ウラシル（ＵＵＵ）及び／または四連ウラシル（ＵＵＵＵ）を含む調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシル対及び／または三連ウラシル及び／または四連ウラシルを含まない。いくつかの実施形態では、ウラシル対及び／または三連ウラシル及び／または四連ウラシルは、該ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおいて、ある特定の閾値未満に、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０未満の出現に低減される。特定の実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の非フェニルアラニンウラシル対及び／または三連ウラシルを含む。別の実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシル対及び／または三連ウラシルを含まない。
さらなる実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、修飾ウラシルを含み、該ＰＡＨポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列より少ないウラシルリッチクラスターを含む調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、該ＰＡＨポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列における対応するウラシルリッチクラスターより長さが短いウラシルリッチクラスターを含む。
さらなる実施形態では、より低頻度の代替コドンが使用される。該修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、代替コドンで置換され、各代替コドンは、同義コドンセットにおいて置換されるコドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する。該ＯＲＦはまた、上記の通り調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦの少なくとも１つのコドンが、同義コドンセットにおいて置換されるコドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する代替コドンで置換される。
いくつかの実施形態では、ウラシル含量が調節されると、ＰＡＨポリペプチドをコードする該修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＯＲＦは、哺乳類細胞に投与された場合に、対応する野生型ｍＲＮＡ由来のＰＡＨの発現レベルより高いＰＡＨの発現レベルを示す。いくつかの実施形態では、該哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、該哺乳類細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、該ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨは、該ｍＲＮＡが哺乳類細胞にインビボで投与された場合に、対応する野生型ｍＲＮＡ由来のＰＡＨの発現レベルより高いレベルを発現する。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、マウス、ウサギ、ラット、サル、またはヒトに投与される。１つの実施形態では、マウスはヌルマウスである。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、静脈内または筋肉内に投与される。他の実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドは、該ｍＲＮＡが哺乳類細胞にインビトロで投与された場合に発現する。いくつかの実施形態では、該発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍に増加する。他の実施形態では、該発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加する。
いくつかの実施形態では、ウラシル含量が調節されると、該修飾ウラシル含有ｍＲＮＡのＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦは、安定性の向上を示す。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、対応する野生型ｍＲＮＡの安定性に対して同じ条件下で向上した細胞での安定性を示す。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性、熱安定性、及び／または二次構造の安定性の向上を含めた安定性の向上を示す。いくつかの実施形態では、該ｍＲＮＡが示す安定性の向上は、該ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、血清、細胞、または組織サンプル中）を特定することによって、及び／または該ｍＲＮＡによる経時的な（例えば、インビトロまたはインビボでの）タンパク質発現の曲線下面積（ＡＵＣ）値を特定することによって測定される。ｍＲＮＡは、半減期及び／またはＡＵＣが、同じ条件下での対応する野生型ｍＲＮＡの半減期及び／またはＡＵＣより大きい場合に安定性が向上したと特定される。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、同じ条件下での対応する野生型ｍＲＮＡによって誘導される免疫応答に対して、検出可能に低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘導する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下でＰＡＨポリペプチドをコードするが、修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答に対して、または、同じ条件下でＰＡＨポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、調節されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡによって誘導される免疫応答に対して、検出可能に低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘導する。該自然免疫応答は、炎症性サイトカインの発現の増加、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５等）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の停止もしくは低下によって明らかにされ得る。いくつかの実施形態では、自然免疫応答の低下は、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−ζ）の発現もしくは活性レベルによって、またはインターフェロン調節遺伝子、例えば、トール様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９８）の発現によって、及び／または本発明のｍＲＮＡの１回以上の細胞内への投与後の細胞死の減少によって測定され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡに応答した哺乳類細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＰＡＨポリペプチドをコードするが修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＰＡＨポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、調節されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超低減される。いくつかの実施形態では、該インターフェロンは、ＩＦＮ−βである。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡの哺乳類細胞への投与によって生じる細胞死の頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、ＰＡＨポリペプチドをコードするが修飾ウラシルを含まないｍＲＮＡ、またはＰＡＨポリペプチドをコードし、修飾ウラシルを含むが、調節されたウラシル含量を有さないｍＲＮＡで認められる細胞死頻度より、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超低い。いくつかの実施形態では、該哺乳類細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、該哺乳類細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態では、該哺乳類細胞は、マウスまたはラット細胞である。他の実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。１つの実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが導入される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。
９．ポリヌクレオチドの修飾方法
本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ）を含む修飾ポリヌクレオチドを含む。該修飾ポリヌクレオチドは、化学的に修飾、及び／または構造的に修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドが、化学的及び／または構造的に修飾される場合、該ポリヌクレオチドは、「修飾ポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。
本開示は、ＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。ポリヌクレオチドは、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含むことができる。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。該結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含む。
本明細書に開示の修飾ポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、該修飾ポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、１つ以上の望ましい特性、例えば、未修飾ポリヌクレオチドと比較して、タンパク質発現の改善、免疫原性の低下、または細胞での分解の減少を示し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾される。本明細書で使用される、「構造的」修飾とは、２つ以上の連結されたヌクレオシドが、ポリヌクレオチドにおいて該ヌクレオチド自体には大幅な化学的修飾をすることなく挿入、削除、複製、反転またはランダム化される修飾である。構造的修飾を行うためには化学結合は必然的に破壊及び再形成されるため、構造的修飾は、化学的性質のものであり、従って、化学的修飾である。しかしながら、構造的修飾により、異なる配列のヌクレオチドが生じる。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学的に修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾され得る。ここでは、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、結果として該ポリヌクレオチドに構造的修飾が生じる。
本開示の治療用組成物は、いくつかの実施形態では、ＰＡＨをコードするオープンリーディングフレーム（例えば、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８）を有する少なくとも１つの核酸（例えば、ＲＮＡ）を含み、該核酸は、標準（未修飾）でも当技術分野で知られるように修飾されてもよいヌクレオチド及び／またはヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。かかる修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドは、天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドでもよいし、天然に存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドでもよい。かかる修飾は、当技術分野で認識されるように、当該ヌクレオチド及び／またはヌクレオシドの糖、骨格、もしくは核酸塩基部分での修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在する修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドは、当技術分野で一般に知られるまたは認識されるものである。かかる天然に存在する修飾ヌクレオチド及びヌクレオチドの非限定的な例は、とりわけ、広く認識されているＭＯＤＯＭＩＣＳデータベースに見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の天然に存在しない修飾ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、当技術分野で一般に知られるまたは認識されるものである。かかる天然に存在しない修飾ヌクレオチド及びヌクレオシドの非限定的な例は、とりわけ、公開米国出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５８５１９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７５１７７号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９７号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５８８９１号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７０４１３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７３号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７５９号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／３６７７１号、または第ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５１３６７号に見出すことができる。これらのすべては、参照することにより本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１つのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、化学的に修飾されず、アデノシン、グアノシン、シトシン及びウリジンからなる標準的なリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、転写ＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）に存在するもの等の標準的なヌクレオシド残基を含む。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド及びヌクレオシドは、ＤＮＡ（例えば、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、またはｄＴ）に存在するもの等の標準的なデオキシリボヌクレオシドを含む。
従って、本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
本開示の核酸（例えば、ＤＮＡ核酸及びＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、様々な（複数の）異なる種類の標準的な及び／または修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、特定の領域の核酸は、１つ、２つまたはそれ以上の（任意に異なる）種類の標準的な及び／または修飾されたヌクレオチド及びヌクレオシドを含む。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む未修飾核酸に対して、それぞれ、当該細胞または生物において分解の低下を示す。
いくつかの実施形態では、細胞または生物に導入された修飾ＲＮＡ核酸（例えば、修飾ｍＲＮＡ核酸）は、標準的なヌクレオチド及びヌクレオシドを含む未修飾核酸に対して、それぞれ、当該細胞または生物において免疫原性の低下（例えば、自然応答の低下）を示し得る。
核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、いくつかの実施形態では、該核酸の合成の過程で、または合成後に導入される非天然の修飾ヌクレオチドを含んで所望の機能または特性を達成する。該修飾は、ヌクレオチド間結合、プリンまたはピリミジン塩基、または糖に存在し得る。該修飾は、鎖の末端または鎖の他の場所で、化学合成またはポリメラーゼ酵素により導入され得る。核酸の領域のいずれかは、化学的に修飾され得る。
本開示は、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」とは、糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて含む化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つ以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、任意の有用な方法で、例えば、化学的に、酵素的に、または組み換え的に合成され得る。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（複数可）を含むことができる。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。該結合は、標準的なホスホジエステル結合であってよく、この場合、該核酸は、ヌクレオチドの領域を含む。
修飾ヌクレオチドの塩基対合は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対だけでなく、非標準または修飾塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体と水素結合受容体の配置により、非標準塩基と標準塩基間、または２つの相補的非標準塩基構造、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有するそれらの核酸の間の水素結合が可能になる。かかる非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンとアデニン、シトシンまたはウラシル間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示の核酸に組み込まれ得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−プソイドウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはプソイドウリジン（ψ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、５−メトキシメチルウリジン、５−メチルチオウリジン、１−メトキシメチルプソイドウリジン、５−メチルシチジン、及び／または５−メトキシシチジンを含む。いくつかの実施形態では、該ポリリボヌクレオチドは、化学修飾が挙げられるがこれに限定されない上記修飾核酸塩基のいずれか少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にＮ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にＮ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）置換を含み、当該核酸の１つ以上またはすべてのシチジンの位置に５−メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にプソイドウリジン（ψ）置換を含み、当該核酸の１つ以上またはすべてのシチジンの位置に５−メチルシチジン置換を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、当該核酸の１つ以上またはすべてのウリジンの位置にウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＲＮＡ核酸、例えば、ｍＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、すなわち、全配列を通して修飾される）。例えば、核酸は、Ｎ１−メチル−プソイドウリジンで均一に修飾され得る。つまり、当該ｍＲＮＡ配列のすべてのウリジン残基がＮ１−メチル−プソイドウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、上記のような修飾残基で置き換えることにより、当該配列に存在する任意の種類のヌクレオシド残基に関して均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、当該分子の全長にわたって部分的にも完全にも修飾され得る。例えば、１つ以上もしくはすべてまたは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃの任意の１つ以上もしくはすべて）が本開示の核酸において、またはその所定の配列領域において（例えば、ポリＡテールを含めたもしくは除いたｍＲＮＡにおいて）均一に修飾され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸における（またはその配列領域における）すべてのヌクレオチドＸは修飾ヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つまたはＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣもしくはＡ＋Ｇ＋Ｃの組み合わせのいずれか１つであり得る。
該核酸は、約１％〜約１００％修飾されたヌクレオチド（総ヌクレオチド含量に関して、もしくはヌクレオチドの種類の１つ以上に関して、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのいずれか１つ以上に関して）、またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）を含み得る。残りのパーセンテージは未修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在から構成されることが理解されよう。
該核酸は、最低１％及び最大１００％の修飾ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含み得る。例えば、該核酸は、修飾ピリミジン、例えば、修飾ウラシルまたはシトシンを含み得る。いくつかの実施形態では、当該核酸のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が修飾ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）で置き換えられる。該修飾ウラシルは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。いくつかの実施形態では、当該核酸のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が修飾シトシン（例えば、５−置換シトシン）で置き換えられる。該修飾シトシンは、単一の独自構造を有する化合物で置き換えられる場合もあれば、異なる構造を有する複数の化合物（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の独自の構造）で置き換えられる場合もある。
１０．非翻訳領域（ＵＴＲ）
ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの翻訳は、様々なシス作用性核酸構造によって提供される様々な機序によって制御及び調節され得る。例えば、ヘアピンまたは他の高次（例えば、偽結節）分子内ｍＲＮＡ二次構造を形成する天然に存在するシス作用性ＲＮＡ要素は、ポリヌクレオチドに翻訳調節活性を提供することができ、該ＲＮＡ要素は、特に該ＲＮＡ要素が５’キャップ構造に近い５’ＵＴＲに位置する場合にポリヌクレオチドの翻訳開始に影響を与え、またはこれを調節する（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４０（３）：５１５−５２６、Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８３：２８５０−２８５４）。
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、開始コドンの前（５’ＵＴＲ）及び終止コドンの後（３’ＵＴＲ）のポリヌクレオチドの核酸部分であり、翻訳されない。いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））はさらに、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの組み合わせ）を含む。
シス作用性ＲＮＡ要素はまた、翻訳延長に影響を与え、数多くのフレームシフト事象に関与し得る（Ｎａｍｙ ｅｔ ａｌ．，（２００４） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １３（２）：１５７−１６８）。配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）は、通常５’ＵＴＲに位置する別の種類のシス作用性ＲＮＡ要素を表すが、天然に存在するｍＲＮＡのコード領域内にも見られることが報告されている（Ｈｏｌｃｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １６（１０）：４６９−４７３）。細胞ｍＲＮＡでは、ＩＲＥＳは、多くの場合、５’キャップ構造とともに存在し、キャップ依存性の翻訳が損なわれた条件下で、翻訳される機能的能力をｍＲＮＡに提供する（Ｇｅｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ４（７）：ａ０１２２４５）。別の種類の天然に存在するシス作用性ＲＮＡ要素は、上流のオープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含む。天然に存在するｕＯＲＦは、多くのｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に単独で、または複数生じ、下流の主なＯＲＦの翻訳に、通常は負の方向に影響を与える（明らかな例外は、酵母のＧＣＮ４ ｍＲＮＡ及び哺乳類のＡＴＦ４ ｍＲＮＡであり、ここでは、ｕＯＲＦは、ｅＩＦ２のリン酸化が増加した条件下で下流の主なＯＲＦの翻訳を促進する働きをする）（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ（２００５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５９：４０７−４５０））。ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む構成要素、構造、要素、モチーフ、及び／または特定の配列によって提供されるさらなる例示的な翻訳調節活性としては、ｍＲＮＡ安定化または不安定化（Ｂａｋｅｒ＆Ｐａｒｋｅｒ（２００４）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １６（３）：２９３−２９９）、翻訳活性化（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２−４５７）、及び翻訳抑制（Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１０（１−２）：９７−１１２）が挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在するシス作用性ＲＮＡ要素は、異種ポリヌクレオチドへの組み込みによって修飾するために使用された場合にそれぞれの機能を付与することができることが研究で示されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（１６）：１３６３５−１３６４０）。
機能的ＲＮＡ要素を含む修飾ポリヌクレオチド
本開示は、修飾を含む合成ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ要素）を提供し、該修飾は、所望の翻訳調節活性を与える。いくつかの実施形態では、本開示は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、開始コドン、ポリペプチドをコードする完全オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及び少なくとも１つの修飾を含むポリヌクレオチドを提供し、該少なくとも１つの修飾は、所望の翻訳調節活性、例えば、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を推進及び／または向上させる修飾を与える。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、シス作用性調節活性である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、開始コドンでの、または開始コドンの近位の４３Ｓ転写開始前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの滞留時間の延長である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、開始コドンでの、または開始コドンからのポリペプチド合成の開始の増加である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該完全なオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチド量の増加である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドン解読の忠実度の増加である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドンスキャンニング漏れの阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該ＰＩＣまたはリボソームによる開始コドンの解読速度の低下である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、開始コドン以外のｍＲＮＡ内の任意のコドンでのポリペプチド合成開始の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、該完全なオープンリーディングフレーム以外のｍＲＮＡ内の任意のオープンリーディングフレームから翻訳されるポリペプチドの量の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、異常な翻訳産物の産生の阻害または低減である。いくつかの実施形態では、該所望の翻訳調節活性は、上述の翻訳調節活性の１つ以上の組み合わせである。
従って、本開示は、本明細書に記載の所望の翻訳調節活性を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡ要素を含むポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを提供する。いくつかの態様では、該ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳の翻訳忠実度を推進及び／または向上する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡ要素を含む。いくつかの態様では、該ｍＲＮＡは、所望の翻訳調節活性、例えば、開始コドンスキャンニング漏れの阻害及び／または低減を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含むＲＮＡ要素を含む。いくつかの態様では、本開示は、開始コドンスキャンニング漏れを阻害及び／または低減する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含み、それにより当該ｍＲＮＡの翻訳忠実度を推進するＲＮＡ要素を含むｍＲＮＡを提供する。
いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ要素は、天然の及び／または修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ要素は、連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含み、これが本明細書に記載の所望の翻訳調節活性を提供する。いくつかの実施形態では、該ＲＮＡ要素は、連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含み、これが安定したＲＮＡ二次構造を形成し、またはこれを折りたたんで安定したＲＮＡ二次構造になり、該ＲＮＡ二次構造が本明細書に記載の所望の翻訳調節活性を提供する。ＲＮＡ要素は、該要素の一次配列（例えば、ＧＣリッチ要素）に基づいて、該要素によって形成されるＲＮＡ二次構造（例えば、ステムループ）によって、該ＲＮＡ分子内の該要素の位置（例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内に配置）によって、該要素の生物学的機能及び／または活性（例えば、「翻訳エンハンサー要素」）によって、及びそれらの任意の組み合わせによって特定及び／または特徴づけられ得る。
いくつかの態様では、本開示は、開始コドンのスキャンニング漏れを阻害する及び／またはｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を推進する１つ以上の構造的修飾を有するｍＲＮＡを提供し、該構造的修飾の少なくとも１つは、ＧＣリッチＲＮＡ要素である。いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、当該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先行する連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素である。１つの実施形態では、ＧＣリッチＲＮＡ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、コザックコンセンサス配列の１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結される３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６または約３個のヌクレオチド、その誘導体またはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素を提供し、該配列の組成は、７０〜８０％のシトシン、６０〜７０％のシトシン、５０％〜６０％のシトシン、４０〜５０％のシトシン、３０〜４０％のシトシン塩基である。前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結される３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０、約２０、約１５、約１２、約１０、約７、約６または約３個のヌクレオチド、その誘導体またはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素を提供し、該配列の組成は、約８０％のシトシン、約７０％のシトシン、約６０％のシトシン、約５０％のシトシン、約４０％のシトシン、または約３０％のシトシンである。
前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結される２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、もしくは３個のヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素を提供し、該配列の組成は、７０〜８０％のシトシン、６０〜７０％のシトシン、５０％〜６０％のシトシン、４０〜５０％のシトシン、または３０〜４０％のシトシンである。前述のまたは関連する態様のいずれかにおいて、本開示は、任意の順序で連結される２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、もしくは３個のヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素を提供し、該配列の組成は、約８０％のシトシン、約７０％のシトシン、約６０％のシトシン、約５０％のシトシン、約４０％のシトシン、または約３０％のシトシンである。
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先行する連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置し、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、任意の順序で連結される３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個のヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含み、該配列の組成は、＞５０％のシトシンである。いくつかの実施形態では、該配列の組成は、＞５５％シトシン、＞６０％シトシン、＞６５％シトシン、＞７０％シトシン、＞７５％シトシン、＞８０％シトシン、＞８５％シトシン、または＞９０％シトシンである。
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先立つ連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置し、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、約３〜３０、５〜２５、１０〜２０、１５〜２０もしくは約２０、約１５、約１２、約１０、約６もしくは約３ヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含み、該配列は反復ＧＣモチーフを含み、該反復ＧＣモチーフは［ＣＣＧ］ｎであり、ここでは、ｎ＝１〜１０、ｎ＝２〜８、ｎ＝３〜６、またはｎ＝４〜５である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝１、２、３、４または５である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝１、２、または３である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝１である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝２である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝３である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝４である。いくつかの実施形態では、該配列は反復ＧＣモチーフ［ＣＣＧ］ｎを含み、ここでは、ｎ＝５である。
別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先立つ連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、表２に示す配列のいずれか１つを含む。１つの実施形態では、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５、約４、約３、約２、または約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、コザックコンセンサス配列の約１５〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１０〜１５、または５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該ＧＣリッチＲＮＡ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に直接隣接して位置する。
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先行する表２に示す配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号４３）］、またはその誘導体もしくはアナログを含むＧＣリッチＲＮＡ要素である。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に直接隣接してその上流に位置する表２に示す配列Ｖ１を含む。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に示す配列Ｖ１を含む。他の実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に示す配列Ｖ１を含む。
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先行する表２に示す配列Ｖ２［ＣＣＣＣＧＧＣ（配列番号４４）］、またはその誘導体もしくはアナログを含むＧＣリッチＲＮＡ要素である。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に直接隣接してその上流に位置する表２に示す配列Ｖ２を含む。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に示す配列Ｖ２を含む。他の実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に示す配列Ｖ２を含む。
他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先行する表２に示す配列ＥＫ［ＧＣＣＧＣＣ（配列番号４２）］、またはその誘導体もしくはアナログを含むＧＣリッチＲＮＡ要素である。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に直接隣接してその上流に位置する表２に示す配列ＥＫを含む。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に示す配列ＥＫを含む。他の実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に示す配列ＥＫを含む。
さらに他の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列に先行する表２に示す配列Ｖ１［ＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣ（配列番号４３）］、またはその誘導体もしくはアナログを含むＧＣリッチＲＮＡ要素であり、該５’ＵＴＲは、表２に示す以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡ（配列番号８５）。当業者には、当然ながら、本明細書に記載のＲＮＡ配列のすべてのＵは、対応する鋳型ＤＮＡ配列、例えば、本開示のｍＲＮＡが、例えば、ＩＶＴによって転写されるＤＮＡ鋳型または構築物においてはＴであることが認識されよう。
いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、表２に示す５’ＵＴＲ配列のコザックコンセンサス配列に直接隣接してその上流に位置する表２に示す配列Ｖ１を含む。いくつかの実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基上流に位置する表２に示す配列Ｖ１を含み、該５’ＵＴＲは、表２に示す以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡ（配列番号８５）。
他の実施形態では、該ＧＣリッチ要素は、該ｍＲＮＡの５’ＵＴＲのコザックコンセンサス配列の１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１２、または１２〜１５塩基上流に位置する表２に示す配列Ｖ１を含み、該５’ＵＴＲは、表２に示す以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡ（配列番号８５）。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、表２に示す以下の配列を含む：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号３９）
表２

別の態様では、本開示は、少なくとも１つの修飾を含む修飾ｍＲＮＡを提供し、ここで、少なくとも１つの修飾は、ヘアピンまたはステムループを形成する順序で連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの配列を含む安定なＲＮＡ二次構造を含むＧＣリッチＲＮＡ要素である。１つの実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、コザックコンセンサス配列の上流にある。別の実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、該コザックコンセンサス配列の約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、該コザックコンセンサス配列の約２０、約１５、約１０または約５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、該コザックコンセンサス配列の約５、約４、約３、約２、約１ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、該コザックコンセンサス配列の約１５〜３０、約１５〜２０、約１５〜２５、約１０〜１５、または約５〜１０ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、該コザックコンセンサス配列の１２〜１５ヌクレオチド上流に位置する。別の実施形態では、該安定なＲＮＡ二次構造は、デルタＧ約−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０〜−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０〜−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、約−５〜−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌを有する。
別の実施形態では、該修飾は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結され、該修飾及び該オープンリーディングフレームは異種である。
別の実施形態では、該ＧＣリッチＲＮＡ要素の配列は、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）核酸塩基のみからなる。
本明細書に記載の所望の翻訳調節活性を与えるＲＮＡ要素は、リボソームプロファイリング等の既知の技術を用いて特定及び特徴づけることができる。リボソームプロファイリングは、ｍＲＮＡに結合したＰＩＣ及び／またはリボソームの位置を決定することができる技術である（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれるＩｎｇｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２４）：２１８−２３参照）。該技術は、該ＰＩＣ及び／またはリボソームによってｍＲＮＡの領域またはセグメントをヌクレアーゼ消化から保護することに基づいている。保護により、「フットプリント」と呼ばれる３０ｂｐのＲＮＡ断片が生じる。ＲＮＡフットプリントの配列及び頻度は当技術分野で既知の方法（例えば、ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって分析することができる。該フットプリントは当該リボソームのＡサイトのほぼ中央に位置する。該ＰＩＣまたはリボソームがｍＲＮＡに沿って特定の位置または区域にある場合、これらの位置で生成されるフットプリントは比較的一般的である。該ＰＩＣ及び／またはリボソームが処理能力の低下を示す位置でより多くのフットプリントが生成され、該ＰＩＣ及び／またはリボソームが処理能力の増加を示す場合により少ないフットプリントが生成されることが研究で示されている（Ｇａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ｅＬｉｆｅ ３：ｅ０３７３５）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ要素のいずれか１つ以上を含むポリヌクレオチドに沿った別個の位置または区域での該ＰＩＣまたはリボソームの滞留時間または占有時間は、リボソームプロファイリングによって特定される。
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドのコード領域と同種でも異種でもよい。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦと同種である。いくつかの実施形態では、該ＵＴＲは、該ＰＡＨポリペプチドをコードするＯＲＦと異種である。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、Ｎ１−メチルプソイドウラシルまたは５−メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、調節的な役割、例えば、安定性、局在化及び／または翻訳効率の向上もしくは低下を与える特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または生物に投与することができ、１つ以上の調節機能は常法を用いて測定され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ、完全長の５’または３’ＵＴＲの１つ以上の調節機能を含む。
天然の５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす機能を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られるコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号８７）を有し、ここで、Ｒは、後ろに別の「Ｇ」が続く開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）である。５’ＵＴＲはまた、延長因子の結合に関与する二次構造を形成することでも知られている。
特定の標的臓器の豊富に発現される遺伝子に通常見られる特徴を操作することにより、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を高めることができる。例えば、肝臓で発現するｍＲＮＡ、例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子の５’ＵＴＲの導入で、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲの使用で、その組織での発現を改善することは、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）で可能である。
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、そのタンパク質が共通の機能、構造、特徴または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞、組織または発達の過程のある時点で発現されるタンパク質のファミリー（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在、起源、または発現パターンを共有する）に属することができる。該遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに由来するＵＴＲを同じまたは異なるタンパク質ファミリーの任意の他のＵＴＲと交換して新たなポリヌクレオチドを生成することができる。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは異種であり得る。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、該３’ＵＴＲと異なる種由来であり得る。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、該５’ＵＴＲと異なる種由来であり得る。
共有国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）は、ＯＲＦの隣接領域として本発明のポリヌクレオチドに使用され得る例示的なＵＴＲのリストを提供している。
本出願の例示的なＵＴＲとしては、グロビン、例えば、α−またはβ−グロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）、強力なコザック翻訳開始シグナル、ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ−２４５αポリペプチド）、アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）、ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ）、ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）、熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）、翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）、グルコーストランスポーター（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコーストランスポーター１））、アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）、ＧＡＰＤＨ、チュブリン、ヒストン、クエン酸回路酵素、トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（オリゴピリミジントラクト））、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）、リボソームタンパク質（例えば、ｒｐｓ９等のヒトまたはマウスリボソームタンパク質）、ＡＴＰシンターゼ（例えば、ＡＴＰ５Ａ１またはミトコンドリアＨ＋−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット）、成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））、延長因子（例えば、延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１））、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）、筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）、β−Ｆ１−ＡＴＰアーゼ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））、リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）、カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）、カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）、プロコラーゲンリジン、２−オキソグルタル酸５−ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）、及びヌクレオビンディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、β−グロビンの５’ＵＴＲ、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ、シトクロムｂ−２４５αポリペプチド（ＣＹＢＡ）の５’ＵＴＲ、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の５’ＵＴＲ、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）の５’ＵＴＲ、非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム、デング熱ウイルス（ＤＥＮ）の５’ＵＴＲ、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の５’ＵＴＲ、ｅｌＦ４Ｇの５’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１の５’ＵＴＲ、それらの機能的断片及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、β−グロビンの３’ＵＴＲ、ＣＹＢＡの３’ＵＴＲ、アルブミンの３’ＵＴＲ、成長ホルモン（ＧＨ）の３’ＵＴＲ、ＶＥＥＶの３’ＵＴＲ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の３’ＵＴＲ、α−グロビンの３’ＵＴＲ、ＤＥＮの３’ＵＴＲ、ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）の３’ＵＴＲ、延長因子１α１（ＥＥＦ１Ａ１）の３’ＵＴＲ、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）の３’ＵＴＲ、ミトコンドリアＨ（＋）−ＡＴＰシンターゼのβサブユニット（β−ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ、ＧＬＵＴ１の３’ＵＴＲ、ＭＥＦ２Ａの３’ＵＴＲ、β−Ｆ１−ＡＴＰアーゼの３’ＵＴＲ、それらの機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡ由来の野生型ＵＴＲが本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、例えば、ＯＲＦに対する該ＵＴＲの向きもしくは位置を変更することによって、またはさらなるヌクレオチドを含めること、ヌクレオチドの削除、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、バリアントＵＴＲを産生するように野生型または天然のＵＴＲに対して変更され得る。いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つ以上のヌクレオチドが当該ＵＴＲの末端に追加されたまたは当該ＵＴＲの末端から除去されたバリアントが使用され得る。
さらに、１つ以上の合成ＵＴＲが１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用され得る。例えば、参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＭａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８−８２を参照されたい。
ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択された転写物と同じ向きに配置することもできれば、向きまたは位置を変更することもできる。従って、５’及び／または３’ＵＴＲは、反転すること、短縮すること、延長すること、または１つ以上の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、もしくは四重の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーを直列または実質的に直列に含む。例えば、二重ベータ−グロビンの３’ＵＴＲを使用することができる（参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０１２９８７７参照）。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示のＵＴＲのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、以下を含む：
５’ＵＴＲ−００１（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３）、
５’ＵＴＲ−００２（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８９）、
５’ＵＴＲ−００３（上流ＵＴＲ）（ＷＯ２０１６／１００８１２参照）、
５’ＵＴＲ−００４（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９０）、
５’ＵＴＲ−００５（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８９）、
５’ＵＴＲ−００６（上流ＵＴＲ）（ＷＯ２０１６／１００８１２参照）、
５’ＵＴＲ−００７（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９０）、
５’ＵＴＲ−００８（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９３）、
５’ＵＴＲ−００９（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９４）、
５’ＵＴＲ−０１０、上流
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９５）、
５’ＵＴＲ−０１１（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９６）、
５’ＵＴＲ−０１２（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＵＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９７）、
５’ＵＴＲ−０１３（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９８）、
５’ＵＴＲ−０１４（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号９９）、
５’ＵＴＲ−０１５（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１００）、
５’ＵＴＲ−０１６（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１０１）、
５’ＵＴＲ−０１７（上流ＵＴＲ）、または
（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号１０２）、
５’ＵＴＲ−０１８（上流ＵＴＲ）５’ＵＴＲ
（ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号８８）。
いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、以下を含む：
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０４）、
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０５）、または
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０６）、
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０７）、
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０８）、
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１０９）。
１４２−３ｐ ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位を含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１０）、
３’ＵＴＲ−０１８（配列番号１５０参照）、
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２とｍｉＲ１２６結合部位のバリアント１）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１１）
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２とｍｉＲ１２６結合部位のバリアント２）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号１１２）、または
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位のバリアント３）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４）。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３、８８〜１０２、もしくは１６５〜１６７のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号４、１０４〜１１２、もしくは１５０のいずれかを含む３’ＵＴＲ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、もしくは配列番号２０５のいずれかを含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、もしくは配列番号２０７のいずれかを含む３’ＵＴＲ、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５）を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７）を含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号３、配列番号３９、配列番号２０４、または配列番号２０５）を含み、該３’ＵＴＲは、表４Ｂに示すアミノ酸配列（配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、または配列番号２０７）を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含むことができる。例えば、該ＯＲＦは、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールの鋳型化付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲによって隣接され得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲ由来の第一のポリヌクレオチド断片及び第二のポリヌクレオチド断片を含むことができる（例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０２９３６２５参照）。
他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内の領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部が、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列を組み込むことが、タンパク質産生及びポリヌクレオチドの発現レベルを向上し得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりに、またはそれに加えて配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９−１９３参照。参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスのカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、合成５’ＵＴＲを非合成３’ＵＴＲと組み合わせて含む。
いくつかの実施形態では、該ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、または翻訳エンハンサー要素（複数可）（総称して「ＴＥＥ」、これは、ポリペプチドの量またはポリペプチドから生じるタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す）も含み得る。非限定的な例として、該ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に配置され得る。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲはＴＥＥを含む。
１つの態様では、ＴＥＥは、キャップ依存性またはキャップ非依存性翻訳等であるがこれに限定されない核酸の翻訳活性を促進することができるＵＴＲ内の保存要素である。
１１．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節要素、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子の擬似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態では、かかる調節要素を含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むと言われる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みは、天然に存在するｍｉＲＮＡの組織特異的及び／または細胞型特異的発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチド、ひいては、それからコードされるポリペプチドの調節をもたらす。
本発明はまた、上記ポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、さらに送達剤を含む。
いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列に対して大幅な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲ結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡは、ポリヌクレオチドに結合する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡであり、該ポリヌクレオチドの安定性を低下させること、またはその翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８の領域の配列を含む。ｍｉＲＮＡのシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８または２〜７を含み得る。
マイクロＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（前駆体−ｍｉＲＮＡ）としばしば呼ばれる短いヘアピン構造を形成するように自身で折り返すＲＮＡ転写物の領域から酵素的に生じる。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは通常、その３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する。この前駆体−ｍＲＮＡは、核内でプロセシングされ、続いて細胞質に輸送され、そこでＤＩＣＥＲ（ＲＮａｓｅＩＩＩ酵素）によってさらにプロセシングされ、約２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。該成熟マイクロＲＮＡは、その後、リボ核粒子に組み込まれ、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体、ＲＩＳＣを形成する。当該技術分野において承認されている成熟ｍｉＲＮＡの命名法は、通常、該成熟ｍｉＲＮＡが生じるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのアームを指定する。すなわち、「５ｐ」は、該マイクロＲＮＡが該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピンの５プライムアームに由来することを意味し、「３ｐ」は、該マイクロＲＮＡが該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピンの３プライム末端に由来することを意味する。本明細書において番号で言及されるｍｉＲは、同じｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向するアームに由来する２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれか（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）を指すことができる。本明細書で言及されるすべてのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐの指定により特に指定されない限り、３ｐ及び５ｐアーム／配列の両方を含むことが意図される。
本明細書で使用される、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ポリヌクレオチド内、例えば、ＤＮＡ内または５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含めたＲＮＡ転写物内の配列を指し、ｍｉＲＮＡのすべてまたは領域に対して、該ｍｉＲＮＡと相互作用し、会合し、または結合するのに十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドは、さらに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。例示的な実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲは１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介調節、例えば、該ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介翻訳抑制または分解を促進するのに十分な相補性度を指す。本発明の例示的な態様では、該ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、該ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ媒介分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ誘導ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を促進するのに十分な相補性度を指す。該ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチド長のｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部のみ、例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分、または天然に存在するｍｉＲＮＡ配列より短い１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分に対して相補的であり得る。所望の調節がｍＲＮＡ分解の場合、十分なまたは完全な相補性（例えば、天然に存在するｍｉＲＮＡの長さのすべてまたはかなりの部分にわたって十分な相補性または完全な相補性）が好ましい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡのシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡのシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ、２つ、または３つのヌクレオチド置換、末端付加、及び／または切断を別にすればｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡより５’末端、３’末端、またはその両方で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド短い。さらに他の実施形態では、該マイクロＲＮＡ結合部位は、対応するマイクロＲＮＡより５’末端、３’末端、またはその両方で２ヌクレオチド短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位はそれでもなお、１つ以上の該ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込んだｍＲＮＡを分解することや、該ｍＲＮＡの翻訳を妨げることが可能である。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、Ｄｉｃｅｒを含む活性ＲＩＳＣの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへ該ｍｉＲＮＡ結合部位が結合することで、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡが分解され、または該ｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断する。他の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドに不安定性を誘導する。別の実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、不完全な相補性を有するため、該ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体は、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のミスマッチを有する。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドに対して相補的な、それぞれ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１個の連続したヌクレオチドを有する。
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチドに組み込むことによって、問題のｍｉＲＮＡが利用可能であれば、該ポリヌクレオチドを分解のための、または翻訳の低減のための標的とすることができる。これにより、該ポリヌクレオチドの送達に際するオフターゲット効果が低減され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドが、組織または細胞に送達されることを意図していないが、当該組織または細胞に行き着く場合、該組織または細胞に豊富なｍｉＲＮＡは、該ｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が該ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作導入されれば、目的の遺伝子の発現を阻害することができる。従って、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むことで、核酸分子の送達に際するオフターゲット効果の危険が低下する場合があり、及び／または該ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の組織特異的調節が可能になる場合がある。さらに他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むことで、インビボでの核酸送達に際する免疫応答を調節することができる。さらなる実施形態では、本開示のｍＲＮＡに１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むことで、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物の加速血液クリアランス（ＡＢＣ）を調節することができる。
逆に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織でのタンパク質発現を高めるためにそれらが天然に存在するポリヌクレオチド配列から除去される場合がある。例えば、特定のｍｉＲＮＡの結合部位を、該ｍｉＲＮＡを含む組織または細胞でのタンパク質発現を改善するためにポリヌクレオチドから除去することができる。
複数の組織での発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去によって達成され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するか挿入するかの決定は、発達中及び／または疾患における組織及び／または細胞でのｍｉＲＮＡの発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいてなされ得る。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、及びそれらの発現パターンならびに生物学における役割の特定が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４−４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１−１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３−４０３、及びそれらの中のすべての参考文献、参照することによりその各々が全体として本明細書に組み込まれる）。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ、ひいてはタンパク質発現を調節することが既知の組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられるがこれらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等で差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの特徴を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は免疫細胞でのみ発現し、特に骨髄樹状細胞で豊富である。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、該ポリヌクレオチドの３’ＵＴＲにｍｉＲ−１４２結合部位を付加することで遮断することができ、組織及び細胞へのより安定した遺伝子導入を可能にすることが実証されている。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９， １１４， ５１５２−５１６１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６， １２（５），５８５−５９１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７， １１０（１３）：４１４４−４１５２、参照することによりその各々が全体として本明細書に組み込まれる）。
抗原媒介性免疫応答とは、生物に入った場合に抗原提示細胞によってプロセシングされ、該抗原提示細胞の表面で提示される外来抗原によって誘発される免疫応答を指すことができる。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、該抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
ｍｉＲ−１４２結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲへ導入することで、ｍｉＲ−１４２媒介性の分解を介して抗原提示細胞での遺伝子発現を選択的に抑制し、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それにより、該ポリヌクレオチドの送達後に抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。該ポリヌクレオチドは、次いで、細胞傷害性排除を誘発することなく標的組織または細胞で安定に発現される。
１つの実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現されることが既知のｍｉＲＮＡの結合部位を本発明のポリヌクレオチドに操作導入し、ｍｉＲＮＡ媒介性のＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞でのポリヌクレオチドの発現を抑制し、該抗原媒介性の免疫応答を抑えることができる。該ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞で維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を防ぐために、任意のｍｉＲ−１２２結合部位を除去することができ、ｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに操作導入することができる。
ＡＰＣ及びマクロファージの選択的分解ならびに抑制をさらに促進するために、本発明のポリヌクレオチドは、当該５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負調節要素を単独で、またはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位と組み合わせて含むことができる。非限定的な例として、該さらなる負調節要素は、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡとしては、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ，ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、新規なｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析により免疫細胞で特定され得る（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０， １１６：ｅ１１８−ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０， １１，２８８、参照することによりその各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
肝臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の肝臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、肝臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肝臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
肺で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の肺特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、肺における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。肺臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
心臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の心臓特異的マイクロＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、心臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。心臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
神経系で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ，ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。神経系で豊富なｍｉＲＮＡとしてはさらに、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２が挙げられるがこれらに限定されないニューロンで特異的に発現されるもの、ならびにｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７が挙げられるがこれらに限定されないグリア細胞で特異的に発現されるものが挙げられる。任意のＣＮＳ特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、神経系における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。神経系特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
膵臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が挙げられるがこれらに限定されない。任意の膵臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、膵臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
腎臓で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が挙げられるがこれらに限定されない。任意の腎臓特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、腎臓における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。腎臓特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
筋肉で発現されることが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。任意の筋肉特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、筋肉における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。筋肉特異的ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに単独で操作導入することも、さらに免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）のｍｉＲＮＡ結合部位と組み合わせて操作導入することもできる。
ｍｉＲＮＡはまた、異なる細胞型、例えば、これらに限定されないが、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞でも差次的に発現される。
内皮細胞で発現することが既知のｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。内皮細胞において多くの新規なｍｉＲＮＡがディープシーケンシング解析から発見される（例えば、Ｖｏｅｌｌｅｎｋｌｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２， １８， ４７２−４８４、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。任意の内皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、内皮細胞における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
上皮細胞で発現することが既知のｍｉＲＮＡとしては、呼吸器線毛上皮細胞で特異的なｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、肺上皮細胞で特異的なｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１２６、腎上皮細胞で特異的なｍｉＲ−３８２−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ならびに角膜上皮細胞で特異的なｍｉＲ−７６２が挙げられるがこれらに限定されない。任意の上皮細胞特異的ｍｉＲＮＡ由来のｍｉＲＮＡ結合部位を、本発明のポリヌクレオチドに導入し、またはそこから除去し、上皮細胞における該ポリヌクレオチドの発現を調節することができる。
さらに、ｍｉＲＮＡの大集団が胚性幹細胞に濃縮され、幹細胞の自己再生ならびに様々な細胞系統、例えば、神経細胞、心臓、造血細胞、皮膚細胞、骨形成細胞及び筋細胞の発生及び／または分化を制御している（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ ＫＴ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ，２０１３， １３（５）， ７５７−７６４、Ｖｉｄｉｇａｌ ＪＡ ａｎｄ Ｖｅｎｔｕｒａ Ａ，Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１２， ２２（５−６），４２８−４３６、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９， ４：ｅ７１９２、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８， ６１０−６２１、Ｙｏｏ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．２０１２， ２１（１１），２０４９−２０５７、参照することによりその各々が全体として本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞に豊富なｍｉＲＮＡとしては、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ，ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１，ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが挙げられるがこれらに限定されない。多くの予測新規ｍｉＲＮＡが、ヒト胚性幹細胞のディープシーケンシングで発見される（例えば、Ｍｏｒｉｎ ＲＤ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ，２００８，１８， ６１０−６２１、Ｇｏｆｆ ＬＡ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００９， ４：ｅ７１９２、Ｂａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ２００８， ２６， ２４９６−２５０５、参照することによりこれらの各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、造血系の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ならびにＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、及び／またはサイトカインを分泌することができることが知られる細胞、例えば、内皮細胞及び血小板での発現ならびに存在量に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡのセットは、従って、これらの細胞の免疫原性に部分的に関与し得るｍｉＲを含み、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）への対応するｍｉＲ部位の組み込みが、該特定の細胞型における該ｍＲＮＡの不安定化、及び／またはこれらのｍＲＮＡからの翻訳の抑制につながり得る。非限定的な代表的な例としては、造血細胞の多くに特異的なｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−２２３、Ｂ細胞で発現されるｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２２３、造血前駆細胞で発現されるｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、ならびに形質細胞様樹状細胞、血小板及び内皮細胞で発現されるｍｉＲ−１２６が挙げられる。さらなるｍｉＲの組織発現についての議論は、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ−Ｍｏｎｔｏｙａ、Ｒ． ｅｔ ａｌ．（２０１４） ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ１０２２５９、Ｌａｎｄｇｒａｆ、Ｐ． ｅｔ ａｌ．（２００７） Ｃｅｌｌ １２９：１４０１−１４１４、Ｂｉｓｓｅｌｓ、Ｕ． ｅｔ ａｌ． （２００９） ＲＮＡ １５：２３７５−２３８４を参照されたい。任意の１つのｍｉＲ部位の３’ＵＴＲ及び／または５’ＵＴＲへの組み込みは、複数の目的の細胞型においてかかる効果を媒介し得る（例えば、ｍｉＲ−１４２は、Ｂ細胞及び樹状細胞の両方で豊富である）。
いくつかの実施形態では、同じ細胞型を複数のｍｉＲで標的化すること、ならびに３ｐ及び５ｐのそれぞれのアームに対する結合部位を、両方が豊富にある（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ１４２−５ｐが両方とも造血幹細胞で豊富である）場合に組み込むことが有益であり得る。従って、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５及びｍｉＲ−２２３からなる群（これらは多くの造血細胞で発現される）、または（ｉｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２２３からなる群（これらはＢ細胞で発現される）、もしくはｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６からなる群（これらは造血前駆細胞で発現される）から、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つもしくはそれ以上）のｍｉＲ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、複数の目的の細胞型が同時に標的化されるように様々なｍｉＲ（例えば、造血系及び内皮細胞の多くの細胞を標的とするｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６）を組み合わせることもまた有益であり得る。従って、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）のｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで、（ｉ）少なくとも１つのｍｉＲは、造血系の細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５もしくはｍｉＲ−２２３）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ−１２６）か、または（ｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲはＢ細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６もしくはｍｉＲ−２２３）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ−１２６）か、または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｍｉＲは、造血前駆細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａもしくはｍｉＲ−１６）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ−１２６）か、または（ｉｖ）少なくとも１つのｍｉＲは、造血系の細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５もしくはｍｉＲ−２２３）、少なくとも１つのｍｉＲは、Ｂ細胞を標的とし（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６もしくはｍｉＲ−２２３）、かつ少なくとも１つのｍｉＲは、形質細胞様樹状細胞、血小板もしくは内皮細胞を標的とする（例えば、ｍｉＲ−１２６）か、あるいは上記の４つのクラスのｍｉＲ結合部位（すなわち、造血系を標的とするもの、Ｂ細胞を標的とするもの、造血前駆細胞を標的とするもの及び／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的とするもの）の任意の他の可能な組み合わせを標的とする。
１つの実施形態では、免疫応答を調節するため、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲに結合する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含むことができる。従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みは、免疫細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞活性化、活性化Ｂ細胞の頻度で測定される）及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦαの産生）を低減または阻害することが分かっている。さらに、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みは、該ｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）反応を低減または阻害することができる。
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物で送達されるポリヌクレオチドの加速血液クリアランスを調節するため、本発明のポリヌクレオチドは、従来の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する任意の細胞で（例えば、末梢リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞で）発現される１つ以上のｍｉＲＮＡに結合する１つ以上のｍｉＲ結合配列を含むことができる。１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みにより、該ｍＲＮＡの送達に使用される脂質含有化合物または組成物の加速血液クリアランス（ＡＢＣ）が低減または阻害されることが分かっている。さらに、１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みにより、該ｍＲＮＡを含む脂質含有化合物または組成物の投与後、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルが低下し（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭのＢ細胞による急性産生が低減または阻害され）、及び／または形質細胞様樹状細胞の増殖及び／または活性化が低減または阻害されることが分かっている。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列は、米国公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号及び米国公開第ＵＳ２００５／００５９００５号に教示されるものが挙げられるがこれらに限定されない免疫細胞で発現される任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。これら公開の内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。免疫細胞で発現されるｍｉＲの非限定的な例としては、脾臓細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／またはマクロファージで発現されるものが挙げられる。例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４及びｍｉＲ−２７は骨髄細胞で発現され、ｍｉＲ−１５５は、樹状細胞、Ｂ細胞及びＴ細胞で発現され、ｍｉＲ−１４６は、ＴＬＲ刺激によりマクロファージにおいて上方制御され、ｍｉＲ−１２６は形質細胞様樹状細胞で発現される。ある特定の実施形態では、該ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現される。例えば、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１２６−５ｐ）、ｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）ならびにｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐ及び／またはｍｉＲ１５５−５ｐ）は、免疫細胞で豊富に発現される。これらのマイクロＲＮＡ配列は、当該技術分野で既知であり、従って、当業者は、ワトソン・クリックの相補性に基づいてこれらマイクロＲＮＡが結合する結合配列または標的配列を容易に設計することができる。
従って、様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４及びｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲの少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、該ｍＲＮＡは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの１〜４個、すなわち、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのものであり得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現される同じｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピー、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲＮＡ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを使用することで、単一のｍｉＲＮＡ結合部位を使用することに比べて有利な特性を示すことができる。３つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１５５（３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）及び配列番号１５７（３つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位）に示される。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現される少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位の２つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ）のコピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位を含む３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１１１（１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）、配列番号１５８（２つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）、ならびに配列番号１６１（２つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）に示される。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ−１４２−３ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐもしくはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３もしくはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐもしくはｍｉＲ−１２６−５ｐ）の結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ−１２６−３ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐもしくはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐもしくはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐもしくはｍｉＲ−１４２−５ｐ）の結合部位を含む。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ−１４２−５ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐもしくはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３もしくはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐもしくはｍｉＲ−１２６−５ｐ）の結合部位を含む。
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞で発現されるマイクロＲＮＡの少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、該ｍｉＲ結合部位の１つはｍｉＲ−１５５−５ｐのものである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐもしくはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３もしくはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐもしくはｍｉＲ−１２６−５ｐ）の結合部位を含む。
ｍｉＲＮＡはまた、複雑な生物学的プロセス、例えば、血管新生を調節することもできる（例えば、ｍｉＲ−１３２）（Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１−１７６）。本発明のポリヌクレオチドでは、かかるプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位を除去または導入し、該ポリヌクレオチドの発現を生物学的に関連した細胞型または関連した生物学的プロセスに合わせることができる。この状況では、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドと定義される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、該ｍｉＲＮＡ結合部位の配列の任意の１つ以上の１つ以上のコピーを含め、表３から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、さらに、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の表３から選択される同一または異なるｍｉＲＮＡ結合部位をそれらの任意の組み合わせを含めて含む。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合するか、またはｍｉＲ−１４２に相補的である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４２は、配列番号１１４を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号１１６を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位は、配列番号１１８を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１１６または配列番号１１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に結合するか、またはｍｉＲ−１２６に相補的である。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６は、配列番号１１９を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位は、配列番号１２１を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６−５ｐ結合部位は、配列番号１２３を含む。いくつかの実施形態では、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１または配列番号１２３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
１つの実施形態では、該３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ここで、第一のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合し、第二のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に結合する。特定の実施形態では、該３’ＵＴＲのｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６への結合は、配列番号９８または１０５の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
表３．ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、ならびにｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６結合部位

いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドに、該ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で挿入される。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲ及び該３’ＵＴＲがｍｉＲＮＡ結合部位を含む。該ポリヌクレオチドの挿入部位は、該ｍｉＲＮＡ結合部位の該ポリヌクレオチドへの挿入が、対応するｍｉＲＮＡの非存在下での機能的ポリペプチドの翻訳を妨害しない限り、また、該ｍｉＲＮＡの存在下では、該ｍｉＲＮＡ結合部位の該ポリヌクレオチドへの挿入及び該ｍｉＲＮＡ結合部位の対応するｍｉＲＮＡへの結合が、該ポリヌクレオチドを分解することまたは該ポリヌクレオチドの翻訳を妨げることが可能な限り、該ポリヌクレオチド内のどこであってもよい。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、当該ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチドにおけるＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおけるＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドにおけるＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ内のコード領域の終止コドンの直後の３’ＵＴＲ内に挿入される。いくつかの実施形態では、当該構築物に終止コドンの複数のコピーが存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最後の終止コドンの直後に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、当該終止コドンのさらに下流に挿入され、この場合、該終止コドンと該ｍｉＲ結合部位（複数可）の間には３’ＵＴＲ塩基が存在する。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲのｍｉＲに対して可能な挿入部位の３つの非限定的な例が配列番号１０４、１０５、及び１６４に示され、これらは、該３’ＵＴＲ内にそれぞれ、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに挿入されたｍｉＲ−１４２−３ｐ部位を備えた３’ＵＴＲ配列を示す。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、該５’ＵＴＲ内の１つ以上の可能な挿入部位に配置され得る。例えば、５’ＵＴＲのｍｉＲに対して可能な挿入部位の３つの非限定的な例が配列番号１６５、１６６、または１６７に示され、これらは、該５’ＵＴＲ内にそれぞれ、３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つに挿入されたｍｉＲ−１４２−３ｐ部位を備えた５’ＵＴＲ配列を示す。
１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は該終止コドン後の３’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチド内に配置される。１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該終止コドン後の３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチド内に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該終止コドン後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、終止コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該終止コドン直後の３’ＵＴＲ内、または、該終止コドン後の３’ＵＴＲの１５〜２０ヌクレオチド内もしくは該終止コドン後の３’ＵＴＲの７０〜８０ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、該３’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２〜４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にはスペーサー領域（例えば、１０〜１００、２０〜７０または３０〜５０ヌクレオチドの長さ）が存在し得る。別の実施形態では、該３’ＵＴＲは、該ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の終わりと該ポリＡテールヌクレオチドの間にスペーサー領域を含む。例えば、１０〜１００、２０〜７０または３０〜５０ヌクレオチドの長さのスペーサー領域は、該ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の終わりと該ポリＡテールの始まりの間に位置し得る。
１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は該開始コドン前（上流）の５’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチド内に配置される。１つの実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該開始コドン前（上流）の５’ＵＴＲの１０〜５０ヌクレオチド内に配置される。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該開始コドン前（上流）の５’ＵＴＲの少なくとも２５ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞で発現されるｍｉＲの該少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、該開始コドン直前の５’ＵＴＲ内、または、該開始コドン前の５’ＵＴＲの１５〜２０ヌクレオチド内もしくは該開始コドン前の５’ＵＴＲの７０〜８０ヌクレオチド内に配置される。他の実施形態では、該５’ＵＴＲは、複数のｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２〜４個のｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位間にはスペーサー領域（例えば、１０〜１００、２０〜７０または３０〜５０ヌクレオチド長）が存在し得る。
１つの実施形態では、該３’ＵＴＲは、複数の終止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、該終止コドンの下流に配置される。例えば、３’ＵＴＲは、１、２、または３つの終止コドンを含み得る。使用され得る３重終止コドンの非限定的な例としては、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ（配列番号１２４）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ（配列番号１２５）、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ（配列番号１２６）、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号１２７）、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号１２８）、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１２９）、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ（配列番号１３０）、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ（配列番号１３１）、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ（配列番号１３２）、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧ（配列番号１３３）が挙げられる。３’ＵＴＲ内で、例えば、１、２、３または４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、該終止コドン（複数可）と直接隣接して、または最後の終止コドンの下流の任意のヌクレオチド数の箇所に配置され得る。該３’ＵＴＲが複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む場合、これらの結合部位は、該構築物において互いに直接隣接して（すなわち、交互に）配置され得るか、または、代替的に、スペーサーヌクレオチドが各結合部位間に配置される。
１つの実施形態では、該３’ＵＴＲは、３つの終止コドンを含み、３番目の終止コドンの下流に単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位が配置される。３つの終止コドン、及び最後の終止コドンの下流に配置された単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号１０９、１０４、１０５、及び１６４に示される。
表４Ａ．５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ｍｉＲ配列、及びｍｉＲ結合部位








終止コドン＝太字
ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位＝下線
ｍｉＲ１２６−３ｐ結合部位＝太字下線
ｍｉＲ１５５−５ｐ結合部位＝網掛
ｍｉＲ１４２−５ｐ結合部位＝網掛及び太字下線
表４Ｂ．例示的な好ましいＵＴＲ


１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞で発現されるｍｉＲの少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び連結されたヌクレオシドの３’テーリング領域を含む。様々な実施形態では、該３’ＵＴＲは、免疫細胞で発現される、好ましくは免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現されるｍｉＲの１〜４個、少なくとも２個、１、２、３または４個のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
１つの実施形態では、免疫細胞で発現される該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。１つの実施形態では、該ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１１６に示される配列を含む。１つの実施形態では、該ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１３４に示される配列を含む。
１つの実施形態では、免疫細胞で発現される該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。１つの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位である。１つの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号１２１に示される配列を含む。１つの実施形態では、該ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１４９に示される配列を含む。
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲの非限定的な例示的な配列としては、以下が挙げられる：ｍｉＲ−１４２−３ｐ（配列番号１１５）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列番号１１７）、ｍｉＲ−１４６−３ｐ（配列番号１３５）、ｍｉＲ−１４６−５ｐ（配列番号１３６）、ｍｉＲ−１５５−３ｐ（配列番号１３７）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ（配列番号１３８）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号１２０）、ｍｉＲ−１２６−５ｐ（配列番号１２２）、ｍｉＲ−１６−３ｐ（配列番号１３９）、ｍｉＲ−１６−５ｐ（配列番号１４０）、ｍｉＲ−２１−３ｐ（配列番号１４１）、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号１４２）、ｍｉＲ−２２３−３ｐ（配列番号１４３）、ｍｉＲ−２２３−５ｐ（配列番号１４４）、ｍｉＲ−２４−３ｐ（配列番号１４５）、ｍｉＲ−２４−５ｐ（配列番号１４６）、ｍｉＲ−２７−３ｐ（配列番号１４７）及びｍｉＲ−２７−５ｐ（配列番号１４８）。免疫細胞で発現される（例えば、免疫細胞で豊富にまたは優先的に発現される）他の適切なｍｉＲ配列は、当技術分野で既知でありまた、例えば、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭａｎｃｈｅｓｔｅｒのマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅにて入手可能である。上述したｍｉＲのいずれかに結合する部位は、該ｍｉＲに対するワトソン・クリック相補性、通常は該ｍｉＲに対する１００％の相補性に基づいて設計することができ、本明細書に記載の本開示のｍＲＮＡ構築物に挿入され得る。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びｍＲＮＡ、例えば、その３’ＵＴＲ）は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、それにより、例えば、ＩｇＭ、例えば、ＰＥＧに対するものの、Ｂ細胞による産生を低減もしくは阻害することによって、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を低減もしくは阻害することによって、加速血液クリアランスを低減または阻害することができ、また、コードされた目的のタンパク質の組織発現を調節するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。
ｍｉＲＮＡ遺伝子の調節は、該ｍｉＲＮＡの周囲の配列、例えば、これらに限定されないが、該周囲の配列の種、配列のタイプ（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、該周囲の配列の調節因子及び／または該周囲の配列の構造要素に影響を受ける可能性がある。該ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに影響を受ける可能性がある。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列タイプのヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対する該ｍｉＲＮＡ配列の調節効果を高め得る。
１つの実施形態では、該５’ＵＴＲの他の調節要素及び／または構造要素は、ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子調節に影響を与え得る。調節要素及び／または構造要素の１つの例は、該５’ＵＴＲの構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）であり、これは、タンパク質の翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である。該５’ＵＴＲのこの二次的構造化要素へのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３， ３４０， ８２−８５、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。本発明のポリヌクレオチドはさらに、マイクロＲＮＡ媒介性の遺伝子調節を高めるためにこの構造化５’ＵＴＲを含むことができる。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作導入され得る。この状況では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作導入され得る。例えば、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２、または１個のｍｉＲＮＡ結合部位が本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作導入され得る。１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じｍｉＲＮＡ部位でも異なるｍｉＲＮＡ部位でもよい。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかの複数のコピーが組み込まれる組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とすることができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲにおける組織特異的、細胞型特異的、または疾患特異的なｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、特定の細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞等）における発現度が低減され得る。
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの５’末端付近、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間、及び／または３’ＵＴＲの３’末端付近で操作導入することができる。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３’ＵＴＲの５’末端付近及び該３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で操作導入することができる。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３’ＵＴＲの３’末端付近及び該３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で操作導入することができる。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該３’ＵＴＲの５’末端付近及び該３’ＵＴＲの３’末端付近で操作導入することができる。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含むことができる。該ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡのシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、該ポリヌクレオチドに少なくとも１つのセンサー配列を組み込むこと及び該ポリヌクレオチドを投与用に製剤化することによって制御され得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むこと及び該ポリヌクレオチドを、本明細書に記載の脂質のいずれかを含めたイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子に製剤化することによって、組織または細胞を標的とすることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件におけるｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞型、または生物学的条件でさらに標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞で、または生物学的条件の観点から最適なタンパク質発現のために設計され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡのシード配列に対して１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡのシード配列に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡのシード配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むように設計され得る。該ｍｉＲＮＡのシード配列は、ｍｉＲＮＡの結合親和性が低下するように、従って、該ポリヌクレオチドの抑制的調節の低下をもたらすように部分的に変異させることができる。本質的に、該ｍｉＲＮＡ結合部位と該ｍｉＲＮＡのシード間のマッチまたはミスマッチの程度は、該ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を調節する能力をより細かく調整するためのレオスタットの機能を果たし得る。さらに、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域における変異もまた、ｍｉＲＮＡがタンパク質発現を調節する能力に影響を与え得る。
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込むことができる。
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡのシード配列は、ステムループのループに組み込むことができ、ｍｉＲＮＡ結合部位は、該ステムループの５’または３’ステムに組み込むことができる。
１つの実施形態では、該５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を用いて、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定化することができる。
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列を用いて、開始翻訳部位、例えば、限定されないが、開始コドンのアクセシビリティを低下させることができる。例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０ １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたい。これは、開始コドンの周り（−４〜＋３７、ここでは、ＡＵＧコドンのＡが＋１）にアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）を使用し、最初の開始コドン（ＡＵＧ）へのアクセシビリティを低下させた。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドンの周りの配列をＬＮＡまたはＥＪＣで変更することが、ポリヌクレオチドの効率、長さ及び構造安定性に影響を与えることを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位付近にｍｉＲＮＡ配列を含んで、翻訳開始部位へのアクセシビリティを低下させることができる。翻訳開始部位は、該ｍｉＲＮＡ配列の前、後、またはその中にある場合がある。非限定的な例として、翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列内、例えば、シード配列または結合部位に配置され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を減弱するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。該ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列でも、該ｍｉＲＮＡのシード配列でも、シードを含まない該ｍｉＲＮＡ配列でも、それらの組み合わせでもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を減弱するために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞でのコードされたポリペプチドの発現を減弱するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。本発明のポリヌクレオチドの非限定的な例としては、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードを含まないｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列及び／またはシード配列を含まないｍｉＲ−１４６結合部位を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞でｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を３’ＵＴＲに含んで、治療薬の送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制することができる。非限定的な例として、該ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドを、抗原提示細胞内でより不安定にすることができる。これらｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−１４６−３ｐが挙げられる。
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができるポリヌクレオチドの領域に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）ならびに（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
１２．３’ＵＴＲ
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド)は、さらに３’ＵＴＲを含む。
３’−ＵＴＲは、翻訳終止コドンの直後であり、多くの場合、転写後に遺伝子発現に影響を与える調節領域を含むｍＲＮＡのセクションである。該３’−ＵＴＲ内の調節領域は、該ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響を与え得る。１つの実施形態では、本発明に有用な３’−ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡの結合部位を含む。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、配列番号４及び１０４〜１１３、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、もしくは配列番号２０７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１１１、１１２、もしくは１１３またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１１１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１１２の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１１３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１１１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１５０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１７５の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１７７の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号１７８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号２０６の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、配列番号２０７の核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号４及び１０４〜１１３、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲは、配列番号４、配列番号１１１、配列番号１５０、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号２０６、もしくは配列番号２０７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
１３．５’キャップを有する領域
本開示はまた、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外移行に関与し、ｍＲＮＡの安定性を高め、該ｍＲＮＡのキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、細胞のｍＲＮＡの安定性と翻訳能力に、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して関与し、成熟サイクリックｍＲＮＡ種を形成する。該キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの過程で５’近位イントロンの除去を助ける。
内因性ｍＲＮＡ分子は、該ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチド間で５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を生成するように５’末端キャップされ得る。この５’−グアニル酸キャップはその後メチル化され、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。該ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意に２’−Ｏ−メチル化もされ得る。該グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断を介した５’−デキャッピングで、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子を分解の標的とすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、非加水分解性キャップ構造を含み、デキャッピングを防止し、ひいてはｍＲＮＡの半減期を延長する。キャップ構造の加水分解には、５’−ｐｐｐ−５’−ホスホロジエステル結合の切断が必要なため、修飾ヌクレオチドがキャッピング反応の過程で使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）製ワクシニアキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）を、製造業者の指示に従い、α−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用し、該５’−ｐｐｐ−５’キャップにホスホロチオエート結合を生成することができる。さらなる修飾グアノシンヌクレオチド、例えば、α−メチル−ホスホネート及びセレノ−リン酸ヌクレオチドが使用され得る。
さらなる修飾としては、該ポリヌクレオチド（上記）の５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の糖環の２’−ヒドロキシル基における２’−Ｏ−メチル化が挙げられるがこれに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を用いて、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチドの５’キャップを生成することができる。キャップアナログは、本明細書では合成キャップアナログ、化学キャップ、化学キャップアナログ、または構造的もしくは機能的キャップアナログとも呼ばれるが、天然の（すなわち、内因性、野生型または生理的）５’キャップとはそれらの化学構造において異なるが、キャップ機能は保持する。キャップアナログは、化学的に（すなわち、非酵素的に）もしくは酵素的に合成することができ、及び／または本発明のポリヌクレオチドに結合することができる。
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−三リン酸基で連結された２つのグアニンを含み、１つのグアニンがＮ７メチル基及び３’−Ｏ−メチル基を含む（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、これは、同等に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定され得る）。他の未修飾グアニンの３’−Ｏ原子は、該キャップされたポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結する。該Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアニンは、該キャップされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと同様であるが、グアノシンに２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
いくつかの実施形態では、該キャップは、ジヌクレオチドキャップアナログである。非限定的な例として、該ジヌクレオチドキャップアナログ、例えば、参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載のジヌクレオチドキャップアナログは、異なるリン酸位置で、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾され得る。
別の実施形態では、該キャップは、キャップアナログであり、当技術分野で既知の及び／または本明細書に記載のキャップアナログのＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である。キャップアナログのＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップアナログが挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０−４５７４に記載の様々なキャップアナログ及びキャップアナログの合成方法を参照されたい。参照することによりその内容は全体として本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、本発明のキャップアナログは、４−クロロ／ブロモフェノキシエチルアナログである。
キャップアナログは、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時キャッピングを可能にするが、インビトロ転写反応では、転写物の最大２０％がキャップされないままの可能性がある。これは、内因性の細胞転写機構によって産生される核酸の内因性５’キャップ構造由来のキャップアナログの構造上の違いと同様、翻訳能力の低下及び細胞安定性の低下につながり得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、より信頼できる５’キャップ構造を生成するために、製造後（ＩＶＴまたは化学合成にかかわらず）、酵素を用いてキャップすることもできる。本明細書で使用される、「より信頼できる」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型の特徴をしっかりと反映もしくは模倣する特徴を指す。すなわち、「より信頼できる」特徴は、従来技術の合成の特徴またはアナログ等と比較して、内因性、野生型、天然もしくは生理的細胞機能及び／または構造をよく表すか、または、対応する内因性、野生型、天然もしくは生理的特徴を１つ以上の点で上回る。本発明のより信頼できる５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然もしくは生理的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合が向上したもの、半減期が延長したもの、５’エンドヌクレアーゼに対する感受性が低下したもの及び／または５’デキャッピングが減少したものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチド間で標準的な５’−５’−三リン酸結合を形成することができ、該キャップグアニンはＮ７メチル化を含み、該ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含む。かかる構造は、キャップ１構造と呼ばれる。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の５’キャップアナログ構造と比較して、高い翻訳能力及び細胞安定性ならびに低い細胞の炎症性サイトカインの活性化をもたらす。キャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ、ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が挙げられるがこれらに限定されない。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャッピングは、より効率的であり、当該キメラポリヌクレオチドのほぼ１００％をキャップすることができる。これは、キャップアナログがインビトロ転写反応の過程でキメラポリヌクレオチドに連結された場合の約８０％と対照的である。
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性のキャップを含むこともキャップアナログを含むこともできる。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニンアナログを含むことができる。有用なグアニンアナログとしては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが挙げられるがこれらに限定されない。
１４．ポリＡテール
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はさらに、ポリＡテールを含む。さらなる実施形態では、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡテールは、デス−３’ヒドロキシルテールを含む。
ＲＮＡプロセシングの過程で、長鎖アデニンヌクレオチド（ポリＡテール）をポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子に付加し、安定性を高めることができる。転写直後、転写物の３’末端を切断し、３’ヒドロキシルを遊離させることができる。次いで、ポリＡポリメラーゼが当該ＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれる該プロセスは、例えば、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０残基長を含めた約８０〜約２５０残基長であり得るポリＡテールを付加する。１つの実施形態では、該ポリＡテールは１００ヌクレオチドの長さである。
ポリＡテールは、当該構築物が核から移行された後に付加することもできる。
本発明によれば、安定化のため、該ポリＡテールの末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス−３’ヒドロキシルテールを含むことができる。それらは、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５， １５０１−１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３， ２００５、参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）によって教示された構造部分または２’−Ｏメチル修飾を含むことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含めた代替ポリＡテール構造を備えた転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡにて検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害後の潜在的に毒性のあるヒストン蓄積の防止に重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テールの欠如によって区別され、その機能として、代わりに安定なステムループ構造及びその同族ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって仮定され、後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡのＰＡＢＰのものと同じ機能を果たす」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
独自のポリＡテールの長さが、本発明のポリヌクレオチドにある特定の利点を与える。一般に、存在する場合、ポリＡテールの長さは、３０ヌクレオチドより長い。別の実施形態では、該ポリＡテールは、３５ヌクレオチドよりも長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドまたはそれより長い）。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、及び２，５００〜３，０００）を含む。
いくつかの実施形態では、該ポリＡテールは、ポリヌクレオチドの全長またはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴または領域の長さを基にすることも、当該ポリヌクレオチドから発現される最終的な産物の長さを基にすることもできる。
これに関連して、該ポリＡテールは、当該ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長い場合がある。該ポリＡテールはまた、それが属するポリヌクレオチドの一部として設計することもできる。これに関連して、該ポリＡテールは、当該構築物の全長、構築物の領域または当該構築物の全長から該ポリＡテールを引いた長さの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％またはそれ以上であり得る。さらに、操作導入された結合部位及びポリＡ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドの結合が発現を向上させ得る。
さらに、複数の異なるポリヌクレオチドは、ＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して、３’末端を通じ、当該ポリＡテールの３’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて互いに連結され得る。トランスフェクション実験は、関連する細胞株で行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクションの１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び７日後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテット領域を含むように設計される。該Ｇカルテットは、４つのグアニンヌクレオチドの環状の水素結合された配置であり、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧリッチ配列によって形成され得る。本実施形態では、該Ｇカルテットは、ポリＡテールの末端に組み込まれる。得られるポリヌクレオチドは、安定性、タンパク質産生及び様々な時点での半減期を含めた他のパラメータについてアッセイされる。該ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡテール単独を用いて見られるものの少なくとも７５％に相当するｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが分かっている。
１５．開始コドン領域
本発明は、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域と類似の、または開始コドン領域のように機能する領域を有し得る。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始することができる。該ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドン、例えば、これらに限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧで開始することができる（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５ （２００３） １６９−１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１参照。参照することによりその各々の内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＡＣＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＣＴＧまたはＣＵＧで始まる。さらに別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替的な開始コドンであるＧＴＧまたはＧＵＧで始まる。
翻訳を開始するコドン、例えば、これらに限定されないが、開始コドンまたは代替的な開始コドンに隣接するヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／または構造に影響を与えることが知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１参照。参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかのマスキングを用いて、ポリヌクレオチドの翻訳開始位置、翻訳効率、長さ及び／または構造を変更することができる。
いくつかの実施形態では、マスキング剤を開始コドンまたは代替的な開始コドンの近傍で使用して該コドンをマスクまたは隠し、マスクされた開始コドンまたは代替的な開始コドンでの翻訳開始の確率を低下させることができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソンジャンクション複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤ＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣを記載しているＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）参照。参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用してポリヌクレオチドの開始コドンをマスクし、翻訳が代替的な開始コドンで開始される可能性を高めることができる。いくつかの実施形態では、マスキング剤を使用して第一の開始コドンまたは代替的な開始コドンをマスクし、マスクされた開始コドンまたは代替的な開始コドンの下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで翻訳が開始される可能性を高めることができる。
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体内に配置され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体はマスキング剤と同様、当該ポリヌクレオチドの翻訳、長さ及び／または構造の制御に役立つ。非限定的な例として、該開始コドンまたは代替的な開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補体の中央に配置され得る。該開始コドンまたは代替的な開始コドンは、最初のヌクレオチド、２番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド、６番目のヌクレオチド、７番目のヌクレオチド、８番目のヌクレオチド、９番目のヌクレオチド、１０番目のヌクレオチド、１１番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド、１６番目のヌクレオチド、１７番目のヌクレオチド、１８番目のヌクレオチド、１９番目のヌクレオチド、２０番目のヌクレオチドまたは２１番目のヌクレオチドの後に配置され得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンを当該ポリヌクレオチド配列から除去し、開始コドンではないコドンで該ポリヌクレオチドの翻訳を開始させることができる。該ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンに続くコドンもしくは下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで始まり得る。非限定的な例では、開始コドンであるＡＴＧまたはＡＵＧを当該ポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去し、下流の開始コドンまたは代替的な開始コドンで翻訳を開始させる。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列はさらに、下流の開始コドン及び／または代替的な開始コドンのマスキング剤の少なくとも１つを含んで翻訳の開始、当該ポリヌクレオチドの長さ及び／または該ポリヌクレオチドの構造を制御することまたは制御を試みることができる。
１６．終止コドン領域
本発明は、終止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。該終止コドンは、ＤＮＡの場合にはＴＧＡ、ＴＡＡ及びＴＡＧから、ＲＮＡの場合にはＵＧＡ、ＵＡＡ及びＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合には終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合には終止コドンＵＧＡ、さらに１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、該追加の終止コドンは、ＴＡＡでもＵＡＡでもよい。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続した終止コドン、４つの終止コドン、またはそれ以上を含む。
１７．ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端に以下を含む：
（ｉ）上記の５’キャップ、
（ｉｉ）５’ＵＴＲ、例えば、上記の配列、
（ｉｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示のＰＡＨをコードする配列最適化核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの終止コドン、
（ｖ）３’ＵＴＲ、例えば、上記の配列、及び
（ｖｉ）上記のポリＡテール。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該５’ＵＴＲは、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該３’ＵＴＲは、該ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ヒトＰＡＨ（配列番号１）またはその切断型（例えば、配列番号２１）のタンパク質配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記５’キャップ、例えば、キャップ１、（２）５’ＵＴＲ、（３）配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択されるヌクレオチド配列ＯＲＦ、（３）終止コドン、（４）３’ＵＴＲ、ならびに（５）上記のポリＡテール、例えば、約１００残基のポリＡテールを含む。
例示的なＰＡＨヌクレオチド構築物を以下に示す：
配列番号４５は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４６は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号５のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４７は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号６のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４８は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号７のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号４９は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号８のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５０は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号９のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５１は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１０のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５２は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５３は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１２のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５４は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１３のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５５は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１４のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５６は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１５のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５７は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１６のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５８は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１７のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号５９は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１８のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６０は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１９のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６１は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２０のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６２は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６３は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１２のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６４は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号１３のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６５は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２２のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６６は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２３のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６７は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２４のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６８は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２５のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号６９は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２６のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７０は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２７のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７１は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２８のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７２は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２９のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７３は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３０のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７４は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７５は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３２のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７６は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３３のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７７は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３４のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７８は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３５のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号７９は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３６のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号８０は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３７のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号８１は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３８のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号８２は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号２９のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号８３は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３０のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号８４は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号４の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２０１は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号１７８の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２０２は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号１７７の３’ＵＴＲからなる。
配列番号２０３は、５’から３’末端にかけて：配列番号３の５’ＵＴＲ、配列番号３１のＰＡＨヌクレオチドのＯＲＦ、及び配列番号１７５の３’ＵＴＲからなる。
ある特定の実施形態では、配列番号４５〜５４、６５〜７４、及び２０１〜２０３を備えた構築物において、そのすべてのウラシルは、Ｎ１−メチルプソイドウラシルで置き換えられる。ある特定の実施形態では、配列番号５５〜６４及び７５〜８４を備えた構築物において、そのすべてのウラシルは、５−メトキシウラシルで置き換えられる。
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記５’キャップ、例えば、キャップ１、（２）配列番号４５〜８４または２０１〜２０３からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに（３）上記のポリＡテール、例えば、約１００残基のポリＡテールを含む。ある特定の実施形態では、配列番号４５〜５４、６５〜７４、及び２０１〜２０３を備えた構築物において、そのすべてのウラシルは、Ｎ１−メチルプソイドウラシルで置き換えられる。ある特定の実施形態では、配列番号５５〜６４及び７５〜８４を備えた構築物において、そのすべてのウラシルは、５−メトキシウラシルで置き換えられる。
表５−ヒトＰＡＨまたはその切断型をコードするＯＲＦを含む修飾ｍＲＮＡ構築物（構築物１〜４３の各々は、キャップ１の５’末端キャップ及び３’末端のポリＡ領域を含む）



１８．ポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）またはその相補体の作製方法も提供する。
いくつかの態様では、本明細書に開示の、及びＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて構築され得る。他の態様では、本明細書に開示の、及びＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いた化学合成によって構築され得る。
他の態様では、本明細書に開示の、及びＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を用いて作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示の、及びＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞による発現、または当技術分野で既知の任意の他の方法の１つ以上の組み合わせによって作製される。
天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列に存在するヌクレオシドを完全にまたは部分的に自然に置き換えることができ、ＰＡＨポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。得られるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、その後、タンパク質の産生能力及び／または治療結果を生み出す能力について試験され得る。
ａ． インビトロ転写／酵素合成
本明細書に開示の本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを用いて転写され得る。該システムは、通常、転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリメラーゼを含む。該ＮＴＰは、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含めた本明細書に記載のものから選択され得るが、これらに限定されない。該ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ及び変異型ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、本明細書に開示のポリヌクレオチドを組み込むことが可能なポリメラーゼから選択され得るがこれらに限定されない。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたい。
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用され得る。ＲＮＡポリメラーゼは、当該ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または削除することによって修飾され得る。非限定的な例として、該ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾のＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’修飾ヌクレオチド三リン酸を組み込む能力の向上を示すように修飾され得る（国際公開第ＷＯ２００８０７８１８０及び米国特許第８，１０１，３８５号参照。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化させることによって、該ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸及び／または核酸配列を最適化することによって、及び／または当技術分野で既知の他の方法を用いて得ることができる。非限定的な例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ４７２：４９９−５０３（２０１１）、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）によって設定された連続指向進化システムを用いて進化させることができ、ここでは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのクローンが、例えば、９３位のリジンがスレオニンに置き換わった（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１ＮまたはＬ８６４Ｆ等であるがこれらに限定されない少なくとも１つの変異をコードすることができる。別の非限定的な例として、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼバリアントは、少なくとも米国公開第２０１００１２００２４号及び第２００７０１１７１１２号に記載の変異をコードすることができる。該公開は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントとしてはまた、置換バリアント、保存アミノ酸の置換、挿入バリアント、及び／または欠失バリアントを挙げることもできるがこれらに限定されない。
１つの態様では、該ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。その際に、該ポリヌクレオチドを修飾し、該野生型または親キメラポリヌクレオチドからの配列変化の部位または領域を含めることができる。
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用した酵素法によって行われ得る。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖のヌクレオチド間ホスホジエステル結合の生成を触媒する。現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列比較及び結晶構造解析に基づいて、異なるファミリーに分類することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌＩ）または、Ｅ．ｃｏｌｉのクレノウ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７ ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを含めたＡポリメラーゼファミリーは、これらファミリーの中で最もよく研究されている。別の大きなファミリーは、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌα）またはＢポリメラーゼファミリーであり、すべての真核生物の複製型ＤＮＡポリメラーゼならびにファージＴ４及びＲＢ６９のポリメラーゼを含む。これらは同様の触媒機構を採用するものの、これらのポリメラーゼファミリーは、基質特異性、基質アナログの組み込み効率、プライマー伸長の程度及び速度、ＤＮＡ合成様式、エキソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感受性が異なる。
ＤＮＡポリメラーゼはまた、必要な最適反応条件、例えば、反応温度、ｐＨ、ならびに鋳型及びプライマー濃度に基づいて選択される。所望のＤＮＡ断片のサイズ及び合成効率を達成するために複数のＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが使用されることがある。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、ｐＨを上昇させ、グリセロール及びジメチルスルホキシドを加え、変性時間を短縮し、伸長時間を延長し、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する第二の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、クローニングした挿入物及びヒトゲノムＤＮＡから長い標的を効率的に増幅している（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：５６９５−５６９９（１９９４）、参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼが広く生化学的及び生物物理学的研究用のＲＮＡを調製するために使用されている。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属国際公開第ＷＯ２０１４／０２８４２９号に開示されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
１つの態様では、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用され得るＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼである（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。該Ｓｙｎ５ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｚｈｕらによって、最近海洋シアノファージＳｙｎ５から特徴づけられ、彼らはそのプロモーター配列も特定した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３参照、その内容は参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、広い範囲の温度及び塩分にわたってＲＮＡ合成を触媒することを見出した。さらに、該プロモーターでの開始ヌクレオチドの要件は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼではあまり厳しくないことが見出され、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼをＲＮＡ合成に関して期待できるものにしている。
１つの態様では、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの合成に使用することができる。非限定的な例として、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成に使用され得る。
１つの態様では、Ｓｙｎ５プロモーターは、該ポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例として、該Ｓｙｎ５プロモーターは、５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号１８５、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）によって記載されている）であり得る。
１つの態様では、Ｓｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載の及び／または当技術分野で既知の少なくとも１つの化学修飾を含むポリヌクレオチドの合成に使用することができる（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３に記載のプソイド−ＵＴＰ及び５Ｍｅ−ＣＴＰの組み込み参照）。
１つの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３）に記載の修飾かつ改善された精製手順を使用して精製されたＳｙｎ５ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成することができる。
遺伝子工学の様々なツールは、鋳型として働く標的遺伝子の酵素増幅に基づいている。個々の遺伝子または目的の特定の領域の配列の研究及び他の研究ニーズのため、ポリヌクレオチドまたは核酸の小さなサンプルから、標的遺伝子の複数のコピーを生成することが必要である。かかる方法は、本発明のポリヌクレオチドの製造に適用され得る。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写増幅法（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び／またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上の領域の製造に利用され得る。リガーゼによってポリヌクレオチドまたは核酸を組み立てることも広く使用されている。
ｂ．化学合成
単離された目的のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列、例えば、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を合成するために標準的な方法を適用することができる。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーを合成することができる。他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いでライゲートすることができる。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、通常、相補的アセンブリーのために５’または３’オーバーハングを含む。
本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当技術分野で既知の化学合成法及び潜在的核酸塩基置換を使用して化学的に合成され得る。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、第ＷＯ２０１３０５２５２３号、第ＷＯ２０１３０３９８５７号、第ＷＯ２０１２１３５８０５号、第ＷＯ２０１３１５１６７１号、米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号、または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号もしくは第ＵＳ８７１０２００号を参照されたい。これらのすべては、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
ｃ．ＰＡＨをコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、ポリヌクレオチドのクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、当技術分野で既知の方法、例えば、これらに限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴＴ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）またはＨＰＬＣ系の精製方法、例えば、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって行われ得る。
「精製されたポリヌクレオチド」のように、ポリヌクレオチドに関連して使用される場合の「精製された」という用語は、少なくとも1つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書で使用される、「汚染物質」は、別の物質を不適当、不純または劣るものにする任意の物質である。従って、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で存在するか、またはそれを処理または精製法に供する前に存在したものとは異なる形態もしくは設定で存在する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製で不純物を除去し、これにより、望ましくない免疫応答を低減または除去すること、例えば、サイトカイン活性を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、投与前にカラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を用いて精製される。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を用いて精製された本発明のポリヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド配列ＰＡＨポリペプチドを含むポリヌクレオチド）は、コードされたＰＡＨタンパク質の発現の、異なる精製法で精製された本開示の同じポリヌクレオチドで得た発現レベルと比較した増加を示す。
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の点突然変異の１つ以上を含むＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製されたポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入された際に、細胞におけるＰＡＨタンパク質の発現レベルを、該ＲＰ−ＨＰＬＣで精製されたポリヌクレオチドが該細胞に導入される前、またはＲＰ−ＨＰＬＣで精製されていないポリヌクレオチドが該細胞に導入された後の該細胞におけるＰＡＨタンパク質の発現レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製されたポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入された際に、細胞における機能的ＰＡＨタンパク質の発現レベルを、該ＲＰ−ＨＰＬＣで精製されたポリヌクレオチドが該細胞に導入される前、またはＲＰ−ＨＰＬＣで精製されていないポリヌクレオチドが該細胞に導入された後の該細胞におけるＰＡＨタンパク質の機能発現レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製されたポリヌクレオチドの使用は、細胞に導入された際に、細胞における検出可能なＰＡＨ活性を、該ＲＰ−ＨＰＬＣで精製されたポリヌクレオチドが該細胞に導入される前、またはＲＰ−ＨＰＬＣで精製されていないポリヌクレオチドが該細胞に導入された後の該細胞における機能的ＰＡＨの活性レベルに対して、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、該精製されたポリヌクレオチドは少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
品質保証及び／または品質管理検査は、例えば、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析用ＨＰＬＣであるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。別の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、逆転写ＰＣＲが挙げられるがこれに限定されない方法によって配列決定され得る。
ｄ．発現されたＰＡＨをコードするポリヌクレオチドの定量
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現産物、ならびに分解産物及び代謝産物は、当技術分野で既知の方法に従って定量され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、エキソソーム中で、または１つ以上の体液から得た場合に定量され得る。本明細書で使用される、「体液」としては、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、糞便物質、毛、涙、嚢胞液、胸膜及び腹膜液、心膜液、リンパ、消化粥、乳び、胆汁、間質液、月経、膿、皮脂、嘔吐、膣分泌物、粘膜分泌物、糞便水、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、ならびに臍帯血が挙げられる。代替的に、エキソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
エキソソーム定量法では、２ｍＬ以下のサンプルを対象から採取し、エキソソームをサイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせにより単離する。該分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、切断または変更であり得る。該レベルを１つ以上の臨床像またはヒト疾患のバイオマーカーアッセイと関連付けることが有利である。
該アッセイは、構築物に特異的なプローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはそれらの組み合わせを用いて行うことができ、該エキソソームは、免疫組織化学的方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用いて単離され得る。エキソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心法、分画遠心法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、アフィニティー精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによっても単離され得る。
これらの方法は、研究者に、残余のまたは送達されたポリヌクレオチドのレベルをリアルタイムで観察する能力を提供する。これは、本発明のポリヌクレオチドが構造的または化学的修飾に起因して、内因性形態とは異なるために可能である。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、例えば、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）であるがこれに限定されない方法を用いて定量され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量されたポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが適切なサイズであり得るかどうかを特定するため、すなわち、該ポリヌクレオチドの分解が起こっていないことを検査するために分析され得る。該ポリヌクレオチドの分解は、これらに限定されないが、アガロースゲル電気泳動、ＨＰＬＣ系の精製方法、例えば、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）等の方法によって検査され得る。
１９．医薬組成物及び製剤
本開示は、上記のポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、さらに送達剤を含む。
いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、ＰＡＨポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、ＰＡＨポリペプチドをコードする本明細書に開示の配列最適化核酸配列に対して、大幅な配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドはさらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７及びｍｉＲ−２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
医薬組成物または製剤は、任意に、１つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療及び／または予防効果のある活性物質を含み得る。本発明の医薬組成物または製剤は、無菌及び／またはパイロジェンフリーであり得る。該製剤の概論及び／または医薬品製造の概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）に見出され得る。いくつかの実施形態では、組成物はヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のため、「活性成分」という句は、一般に、本明細書に記載の通りに送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書に記載の製剤及び医薬組成物は、薬理学の分野で既知のまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法は、該活性成分と賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分を関連付けるステップと、その後、必要及び／または所望に応じて、該生成物を分割、成形及び／または包装して所望の単回または複数回投与単位にすることを含む。
本開示の医薬組成物または製剤は、大量に、単一の単位用量として、及び／または単一の単位用量の複数として調製、包装、及び／または販売され得る。本明細書で使用される、「単位用量」とは、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。該活性成分の量は、一般に、対象に投与される該活性成分の投与量及び／またはかかる投与量の便宜的な部分、例えば、かかる投与量の半分または３分の１に等しい。
本開示の医薬組成物における活性成分、医薬的に許容される賦形剤、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／または状態によって、さらに該組成物が投与される経路によって変化し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び製剤は、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、該組成物または製剤は、１、２、３、４、または５つの本発明のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または製剤は、複数のタイプのポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、線状または環状形態のポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、該組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド及びインビトロ転写（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、該組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド及び環状ポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書に提供する医薬組成物及び製剤の説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物及び製剤に関するが、当業者には、かかる組成物が、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類への投与に適することが理解されよう。
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、（１）安定性を高めるための、（２）細胞のトランスフェクションを増加させるための、（３）持続放出または遅延放出（例えば、該ポリヌクレオチドのデポー製剤から）させるための、（４）生体内分布を変化させる（例えば、特定の組織または細胞型に該ポリヌクレオチドを標的化する）ための、（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させるための、及び／または（６）該コードされたタンパク質のインビボでの放出プロファイルを変化させるための１つ以上の賦形剤を用いて製剤化され得る。いくつかの実施形態では、該医薬製剤は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約５０：１０：３８．５：１．５で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約５０：１０：３８．５：１．５で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０で含む。
本明細書で使用される、医薬的に許容される賦形剤としては、所望の特定の剤形に適した、ありとあらゆる溶媒、分散媒、または他の液体媒体、分散もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒及び／または分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤もしくは抗真菌剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート剤、抗凍結剤（ｃｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、及び／または増量剤が挙げられるがこれらに限定されない。医薬組成物の製剤化のための様々な賦形剤及び該組成物を調製するための技術は、当技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６参照。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。
例示的な希釈剤としては、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール等、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な造粒及び／または分散剤としては、デンプン、アルファ化デンプン、もしくは微結晶デンプン、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ（ビニル−ピロリドン）、（プロビドン（ｐｒｏｖｉｄｏｎｅ））、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム等、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な界面活性剤及び／または乳化剤としては、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、ｃｈｏｎｄｒｕｘ、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８等、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
酸化は、ｍＲＮＡ、特に液体のｍＲＮＡ製剤にとって潜在的な分解経路である。酸化を防止するため、酸化防止剤を製剤に添加することができる。例示的な酸化防止剤としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ベンジルアルコール、ブチル化ヒドロキシアニソール、ｍ−クレゾール、メチオニン、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウムまたはカリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム等、及びそれらの組み合わが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウム等、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な抗菌剤または抗真菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたはナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸等、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的な防腐剤としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）等、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、安定性を向上させるためにｐＨ５〜ｐＨ８の間に維持される。ｐＨを調整するための例示的な緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（またはヒスチジン−ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等、及び／またはそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
例示的な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、モルト、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはマグネシウム等、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結中に本明細書に記載のポリヌクレオチドを安定化させるための抗凍結剤を含み得る。例示的な抗凍結剤としては、マンニトール、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース等、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結乾燥ポリヌクレオチド製剤中に増量剤を含んで、「医薬的にエレガントな」ケーキを得ること、すなわち、長期（例えば、３６ヶ月）保存の間、該凍結乾燥ポリヌクレオチドを安定化させることができる。例示的な本発明の増量剤としては、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該医薬組成物または製剤は、さらに送達剤を含む。本開示の送達剤としては、リポソーム、脂質ナノ粒子、リピドイド、ポリマー、リポプレックス、微小小胞、エキソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
２０．送達剤
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載の脂質組成物は、治療薬及び／または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを哺乳類の細胞または器官へ送達するための脂質ナノ粒子組成物に有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、ほとんどまたは全く免疫原性を有さない。例えば、本明細書に開示の脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較して免疫原性が低い。例えば、本明細書に開示の脂質及び治療薬または予防薬、例えば、ｍＲＮＡを含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療薬または予防薬を含む対応する製剤と比較して、治療指数が高い。
ある特定の実施形態では、本出願は、
（ａ）ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｂ）送達剤
を含む医薬組成物を提供する。
脂質ナノ粒子製剤
いくつかの実施形態では、本発明の核酸（例えば、ＰＡＨ ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に製剤化される。脂質ナノ粒子は、通常、イオン性カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール及びＰＥＧ脂質成分と目的の核酸のカーゴを含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当技術分野で一般に知られている成分、組成物、及び方法を用いて生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１を参照されたい。これらのすべては、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
本開示の核酸（例えば、ＰＡＨ ｍＲＮＡ）は、通常、脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのイオン性カチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、少なくとも１つのステロール、及び／または少なくとも１つのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０〜６０％のイオン性カチオン性脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比２０〜５０％、２０〜４０％、２０〜３０％、３０〜６０％、３０〜５０％、３０〜４０％、４０〜６０％、４０〜５０％、または５０〜６０％のイオン性カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のイオン性カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比５〜２５％の非カチオン性脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比５〜２０％、５〜１５％、５〜１０％、１０〜２５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２５％、１５〜２０％、または２０〜２５％の非カチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の非カチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２５〜５５％のステロールを含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比２５〜５０％、２５〜４５％、２５〜４０％、２５〜３５％、２５〜３０％、３０〜５５％、３０〜５０％、３０〜４５％、３０〜４０％、３０〜３５％、３５〜５５％、３５〜５０％、３５〜４５％、３５〜４０％、４０〜５５％、４０〜５０％、４０〜４５％、４５〜５５％、４５〜５０％、または５０〜５５％のステロールを含み得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％のステロールを含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。例えば、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５〜１０％、０．５〜５％、１〜１５％、１〜１０％、１〜５％、２〜１５％、２〜１０％、２〜５％、５〜１５％、５〜１０％、または１０〜１５％を構成し得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、モル比２０〜６０％のイオン性カチオン性脂質、５〜２５％の非カチオン性脂質、２５〜５５％のステロール、及び０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質を含む。
イオン性脂質
いくつかの態様では、本開示のイオン性脂質は、式（Ｉ）の化合物：
（Ｉ）、
もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のうちの１つ以上でよく、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、ヘテロ環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、水素、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、ここで、Ｑは、炭素環、ヘテロ環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは、独立して、１、２、３、４及び５から選択され、
各Ｒ５は、独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、ここで、Ｍ”は、結合、Ｃ１−１３アルキルまたはＣ２−１３アルケニルであり、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及びヘテロ環からなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３−１５アルキル及びＣ３−１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は、独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは、独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択され、ここで、Ｒ４が、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２の場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５の場合に−Ｎ（Ｒ）２ではなく、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２の場合に５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）：
（ＩＡ）、
もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＢ）：
（ＩＢ）、もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、すべての可変要素は本明細書に定義する通りである。例えば、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、ここで、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）；
（ＩＩ）、もしくはそのＮ−オキシド、またはその塩もしくは異性体のものを含み、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱ、であり、ここで、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
１つの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）、
（ＩＩａ）、
もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）、
（ＩＩｂ）、
もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）：
（ＩＩｃ）または
（ＩＩｅ）、
もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載の通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｆ）：
（ＩＩｆ）もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、Ｍは−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−であり、Ｍ”は、Ｃ１−６アルキルまたはＣ２−６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択される。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）、
（ＩＩｄ）、
もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２〜Ｒ６は、本明細書に記載の通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は、独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から選択され得る。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｇ）、
（ＩＩｇ）、もしくはそれらのＮ−オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体のものであり、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｍ及びＭ’は、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−Ｍ”−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、Ｍ”は、Ｃ１−６アルキル（例えば、Ｃ１−４アルキル）またはＣ２−６アルケニル（例えば、Ｃ２−４アルケニル）である。例えば、Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１号、第６２／２５２，３１６号、第６２／２５３，４３３号、第６２／２６６，４６０号、第６２／３３３，５５７号、第６２／３８２，７４０号、第６２／３９３，９４０号、第６２／４７１，９３７号、第６２／４７１，９４９号、第６２／４７５，１４０号、及び第６２／４７５，１６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載の化合物の１つ以上である。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、米国出願第６２／４７５，１６６号に記載の化合物１〜２８０から選択される。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、
（化合物ＩＩ）、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、
（化合物ＩＩＩ）、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、
（化合物ＩＶ）、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、
（化合物Ｖ）、またはその塩である。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、または（ＩＩｇ）の脂質の中央のアミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。従って、脂質は、生理的ｐＨでは正電荷または部分正電荷を有し得る。かかる脂質は、カチオン性またはイオン性（アミノ）脂質と呼ばれ得る。脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
いくつかの態様では、本開示のイオン性脂質は、式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは異性体の１つ以上でよく、式中、
Ｗは、
または
であり、
環Ａは、
または
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は、各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２であるかまたは存在せず、ここで、ＺがＣＨ２の場合、破線（１）及び（２）は、各々単結合を表し、Ｚが存在しない場合、破線（１）及び（２）は、両方とも存在せず、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
ＲＸ１及びＲＸ２は、各々独立して、ＨまたはＣ１−３アルキルであり、
各Ｍは、独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｍ＊はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２は、各々独立して、−Ｏ−及び−Ｎ（Ｒ６）−からなる群から選択され、
各Ｒ６は、独立して、Ｈ及びＣ１−５アルキルからなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は、独立して、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは、独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは、独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は、独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は、独立して、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ３−１２アルケニル及び−Ｒ＊ＭＲ’からなる群から選択され、
ｎは、１〜６の整数であり、
環Ａが、
の場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。
いくつかの実施形態では、該化合物は、式（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ８）のいずれかである：
（ＩＩＩａ１）、
（ＩＩＩａ２）、
（ＩＩＩａ３）、
（ＩＩＩａ４）、
（ＩＩＩａ５’）、
（ＩＩＩａ６）、
（ＩＩＩａ７）、または
（ＩＩＩａ８）。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、米国出願第６２／２７１，１４６号、第６２／３３８，４７４号、第６２／４１３，３４５号、及び第６２／５１９，８２６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００号に記載の化合物の１つ以上である。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載の化合物１〜１５６から選択される。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、米国出願第６２／５１９，８２６号に記載の化合物１〜１６、４２〜６６、６８〜７６、及び７８〜１５６から選択される。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、
（化合物ＶＩ）、またはその塩である。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、（化合物ＶＩＩ）、またはその塩である。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）の脂質の中央のアミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。従って、脂質は、生理的ｐＨでは正電荷または部分正電荷を有し得る。かかる脂質は、カチオン性またはイオン性（アミノ）脂質と呼ばれ得る。脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であり得る。
リン脂質
本明細書に開示の脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リソホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸（ｐｈｙｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アラキン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の負に荷電した１つ以上のリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合で、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療薬）が膜を通過することを可能にすることができ、例えば、該１つ以上の要素を標的組織に送達することを可能にする。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含めた修飾ならびに置換を備えた天然種を含む非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられたアルケニル基）で官能化することも、それに対して架橋することもできる。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドへの曝露時に銅が触媒する付加環化を経ることがある。かかる反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して、膜透過または細胞認識を容易にすること、またはナノ粒子組成物を有用な成分、例えば、標的化または画像化部分（例えば、染料）にコンジュゲートすることにおいて有用であり得る。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されない。リン脂質としてはまた、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ）、１−オレオイル−２コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣのアナログまたはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物：
（ＩＶ）、
またはその塩であり、式中、
各Ｒ１は、独立して、任意に置換されるアルキルであるか、または、任意に、２つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される単環式カルボシクリルもしくは任意に置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または、任意に、３つのＲ１が介在原子と一緒になって、任意に置換される二環式カルボシクリルもしくは任意に置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
または
のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１−６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で任意に置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１−３０アルキル、任意に置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１−３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
ｐは１または２であり、
ただし、該化合物は、下記式のものではない：
式中、Ｒ２の各例は、独立して、非置換のアルキル、非置換のアルケニル、または非置換のアルキニルである。
いくつかの実施形態では、該リン脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号に記載のリン脂質の１つ以上でよい。
ｉ）リン脂質の頭部修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部（例えば、修飾されたコリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を備えたリン脂質は、修飾された４級アミンを備えたＤＳＰＣ、またはそのアナログである。例えば、式（ＩＶ）の実施形態では、少なくとも１つのＲ１はメチルではない。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＲ１は、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、下記式のうちの１つ：
、
、
、
、
、
またはその塩のものであり、式中、
各ｔは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは、独立して、１、２、または３である。
ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ａ）：
（ＩＶ−ａ）、
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を備えたＤＳＰＣ、またはそのアナログである。ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ｂ）：
（ＩＶ−ｂ）、
またはその塩のものである。
（ｉｉ）リン脂質の尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾された尾部を備えたＤＳＰＣ、またはそのアナログである。本明細書に記載の「修飾された尾部」とは、短縮されたまたは延長された脂肪族鎖を有する尾部、分岐が導入された脂肪族鎖を有する尾部、置換が導入された脂肪族鎖を有する尾部、１つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基で置き換えられた脂肪族鎖を有する尾部、またはそれらの任意の組み合わせを有する尾部であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ａ）、またはその塩のものであり、ここで、Ｒ２の少なくとも１つの例は、Ｒ２の各例は、任意に置換されるＣ１−３０アルキルであり、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられる。
ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、式（ＩＶ−ｃ）：
（ＩＶ−ｃ）、
またはその塩のものであり、式中、
各ｘは、独立して、０と３０を含めた０〜３０の整数であり、
Ｇの各例は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏからなる群から選択される。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。従って、ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物であり、ここで、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、下記式：
、
、
のうちの１つまたはその塩のものである。
別の脂質
ある特定の実施形態では、本発明に有用なまたは潜在的に有用なリン脂質は、修飾されたホスホコリン部分を含み、ここで、４級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖は、エチレンではない（例えば、ｎは２ではない）。従って、ある特定の実施形態では、有用なリン脂質。
ある特定の実施形態では、本開示のリン脂質の代わりに別の脂質が使用される。
ある特定の実施形態では、本発明の別の脂質はオレイン酸である。
ある特定の実施形態では、該別の脂質は、下記のうちの１つである：
、
、
、
、
、
、及び
。
構造脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用される、「構造脂質」という用語は、ステロールを指し、また、ステロール部分を含む脂質も指す。
該脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、該粒子での他の脂質の凝集を緩和するのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。いくつかの実施形態では、該構造脂質はステロールである。本明細書で定義される、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、該構造脂質はステロイドである。ある特定の実施形態では、該構造脂質はコレステロールである。ある特定の実施形態では、該構造脂質はコレステロールのアナログである。ある特定の実施形態では、該構造脂質はアルファ−トコフェロールである。
いくつかの実施形態では、該構造脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号に記載の構造脂質の１つ以上でよい。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書で使用される、「ＰＥＧ−脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂質を指す。ＰＥＧ−脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン及びＰＥＧで修飾された１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。かかる脂質はＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ−脂質としては、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステアリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃａｍｉｄｅ）（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。
１つの実施形態では、該ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧで修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧで修飾されたセラミド、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧで修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧで修飾されたジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ−脂質の脂質部分としては、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは、約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えば、ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。１つの実施形態では、該ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ−脂質、例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４Ａ２号に記載のものは当技術分野では既知である。
一般に、本明細書に記載の様々な式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のいくつかは、参照することにより全体として組み込まれる、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号、出願日２０１６年１２月１０日、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」に記載の通りに合成され得る。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質を含む１つ以上の分子を含み得る。かかる種は、ＰＥＧ化脂質と呼ばれることもある。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧで修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧで修飾されたセラミド、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧで修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧで修飾されたジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧで修飾された脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ−ＤＭＧは、以下の構造を有する：
１つの実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、参照することによりその内容が全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載のＰＥＧ化脂質であり得る。本明細書に記載のこれら例示的なＰＥＧ脂質のいずれかを修飾して、該ＰＥＧ鎖にヒドロキシル基を含めてもよい。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義される、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書では、「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも呼ばれる）は、当該脂質に１つ以上のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、該ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、当該ＰＥＧ鎖に１つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、当該ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。各々の可能性は、本発明の別々の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（Ｖ）の化合物：
（Ｖ）、
またはその塩であって、式中、
Ｒ３は−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１と１００を含めた１〜１００の整数であり、
Ｌ１は、任意に置換されるＣ１−１０アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、−ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分であるか、または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、式：
または
のものであり、
Ｌ２の各例は、独立して、結合または任意に置換されるＣ１−６アルキレンであり、ここで、該任意に置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は、任意に、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｒ２の各例は、独立して、任意に置換されるＣ１−３０アルキル、任意に置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意に置換されるＣ１−３０アルキニルであり、任意に、ここで、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は、独立して、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、−Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意に置換されるカルボシクリル、任意に置換されるヘテロシクリル、任意に置換されるアリール、または任意に置換されるヘテロアリールであり、
ｐは１または２である。
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は−ＯＲＯであり、ＲＯは水素である）。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ−ＯＨ）：
（Ｖ−ＯＨ）、
またはその塩のものである。
ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明に有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書に提供するのは、式（ＶＩ）の化合物：
（ＶＩ）、
またはその塩であって、式中、
Ｒ３は−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意に置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１と１００を含めた１〜１００の整数であり、
Ｒ５は、任意に置換されるＣ１０−４０アルキル、任意に置換されるＣ１０−４０アルケニル、または任意に置換されるＣ１０−４０アルキニルであり、任意に、Ｒ５の１つ以上のメチレン基は、任意に置換されるカルボシクリレン、任意に置換されるヘテロシクリレン、任意に置換されるアリーレン、任意に置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各例は、独立して、水素、任意に置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ−ＯＨ）：
（ＶＩ−ＯＨ）
またはその塩のものである。いくつかの実施形態では、ｒは４５である。
さらに他の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は：
またはその塩である。
１つの実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、
（化合物Ｉ）である。
いくつかの態様では、本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ−脂質を含まない。
いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ−脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号に記載のＰＥＧ脂質の１つ以上でよい。
いくつかの実施形態では、本発明のＰＥＧ脂質は、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧで修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧで修飾されたセラミド、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧで修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧで修飾されたジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、該ＰＥＧで修飾された脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（ＰＥＧ−ＤＯＭＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ−ＤＳＧ及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧである。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかのイオン性カチオン性脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ−ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかのイオン性カチオン性脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのイオン性カチオン性脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのイオン性カチオン性脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのイオン性カチオン性脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、イオン性カチオン性脂質である
、
及び式ＶＩを含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、イオン性カチオン性脂質である
、
及びオレイン酸を含む別の脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、イオン性カチオン性脂質である
、
オレイン酸を含む別の脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、イオン性カチオン性脂質である
、
ＤＯＰＥを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、イオン性カチオン性脂質である
、
ＤＯＰＥを含むリン脂質、コレステロールを含む構造脂質、及び式ＶＩＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約２：１〜約３０：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約６：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、Ｎ：Ｐ比約３：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該イオン性カチオン性脂質成分の該ＲＮＡに対するｗｔ／ｗｔ比約１０：１〜約１００：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該イオン性カチオン性脂質成分の該ＲＮＡに対するｗｔ／ｗｔ比約２０：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、該イオン性カチオン性脂質成分の該ＲＮＡに対するｗｔ／ｗｔ比約１０：１を構成する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、平均径約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍを有する。
いくつかの実施形態では、本発明のＬＮＰは、平均径約７０ｎｍ〜約１２０ｎｍを有する。
本明細書で使用される、「アルキル」、「アルキル基」、または「アルキレン」という用語は、１つ以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）を含む、任意に置換される直鎖または分岐飽和炭化水素を意味する。「Ｃ１−１４アルキル」という表記は、１ １４個の炭素原子を含む任意に置換される直鎖または分岐飽和炭化水素を意味する。特に明記しない限り、本明細書に記載のアルキル基は、非置換及び置換アルキル基の両方を指す。
本明細書で使用される、「アルケニル」、「アルケニル基」、または「アルケニレン」という用語は、２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む、任意に置換される直鎖または分岐炭化水素を意味する。「Ｃ２−１４アルケニル」という表記は、２ １４個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素間二重結合を含む任意に置換される直鎖または分岐炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４、またはそれ以上の炭素間二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。特に指定しない限り、本明細書に記載のアルケニル基は、非置換及び置換アルケニル基の両方を指す。
本明細書で使用される、「アルキニル」、「アルキニル基」、または「アルキニレン」という用語は、２つ以上の炭素原子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の炭素原子）及び少なくとも１つの炭素間三重結合を含む、任意に置換される直鎖または分岐炭化水素を意味する。「Ｃ２−１４アルキニル」という表記は、２ １４個の炭素原子及び少なくとも１つの炭素間三重結合を含む任意に置換される直鎖または分岐炭化水素を意味する。アルキニル基は、１、２、３、４、またはそれ以上の炭素間三重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルキニルは、１つ以上の炭素間三重結合を含み得る。特に指定しない限り、本明細書に記載のアルキニル基は、非置換及び置換アルキニル基の両方を指す。
本明細書で使用される、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、１つ以上の炭素原子の環を含む任意に置換される単環式または多環式系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０員環であり得る。「Ｃ３−６炭素環」という表記は、３〜６個の炭素原子を有する単一の環を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の炭素間二重結合または三重結合を含んでもよく、非芳香族でも芳香族でもよい（例えば、シクロアルキル基でもアリール基でもよい）。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２−ジヒドロナフチル基が挙げられる。本明細書で使用される、「シクロアルキル」という用語は、非芳香族炭素環を意味し、二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に指定しない限り、本明細書に記載の炭素環は、非置換及び置換炭素環基の両方、すなわち、任意に置換される炭素環を指す。
本明細書で使用される、「ヘテロ環」または「ヘテロ環式基」という用語は、１つ以上の環を含む任意に置換される単環式または多環式系であって、少なくとも１つの環が少なくとも１つのヘテロ原子を含む系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子でよい。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４員環であり得る。ヘテロ環は、１つ以上の二重結合または三重結合を含んでもよく、非芳香族でも芳香族でもよい（例えば、ヘテロシクロアルキル基でもヘテロアリール基でもよい）。ヘテロ環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソオキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。本明細書で使用される「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族ヘテロ環を意味し、二重結合または三重結合を含んでも含まなくてもよい。特に指定しない限り、本明細書に記載のヘテロ環は、非置換及び置換ヘテロ環基の両方、すなわち、任意に置換されるヘテロ環を指す。
本明細書で使用される、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、または「ヘテロアルキニル」という用語は、それぞれ、本明細書に定義するアルキル、アルケニル、アルキニル基であって、さらに１つ以上（例えば、１、２、３、または４つ）のヘテロ原子（例えば、酸素、硫黄、窒素、ホウ素、ケイ素、リン）を含み、該１つ以上のヘテロ原子が、親炭素鎖内の隣接する炭素原子間に挿入され、及び／または１つ以上のヘテロ原子が、炭素原子と親分子間、すなわち、結合点の間に挿入される基を指す。特に指定しない限り、本明細書に記載のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルは、非置換及び置換の両方のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニル、すなわち、任意に置換されるヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、またはヘテロアルキニルを指す。
本明細書で使用される、「生分解性基」とは、哺乳類実体において脂質のより速い代謝を促進し得る基である。生分解性基は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。本明細書で使用される、「アリール基」は、１つ以上の芳香環を含む任意に置換される炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル及びナフチル基が挙げられる。本明細書で使用される、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香環を含む任意に置換されるヘテロ環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基は両方とも、任意に置換され得る。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意に置換されるフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書の式では、Ｍ及びＭ’は、上記の生分解性基のリストから独立して選択され得る。特に指定しない限り、本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール基は、非置換の基及び置換された基の両方、すなわち、任意に置換されるアリールまたはヘテロアリール基を指す。
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、特に指定しない限り、任意に置換され得る。任意の置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、ＯＨ）、エステル（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｒ、代替的にＣ＝Ｏで表される）、ハロゲン化アシル（例えば、Ｃ（Ｏ）Ｘ、ここで、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である）、カーボネート（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、ＯＲ）、アセタール（例えば、Ｃ（ＯＲ）２Ｒ””、ここで、各ＯＲは同じでも異なってもよいアルコキシ基であり、Ｒ””は、アルキルまたはアルケニル基である）、ホスフェート（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、ＳＨ）、スルホキシド（例えば、Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（例えば、Ｃ（Ｓ）Ｈ）、スルフェート（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、Ｓ（Ｏ）２）、アミド（例えば、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、またはＮ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、Ｎ３）、ニトロ（例えば、ＮＯ２）、シアノ（例えば、ＣＮ）、イソシアノ（例えば、ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、ＮＲ２、ＮＲＨ、またはＮＨ２）、カルバモイル（例えば、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、またはＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、またはＮ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。前述のいずれかにおいて、Ｒは、本明細書で定義するアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、該置換基自体は、さらに、例えば、１、２、３、４、５、または６つの本明細書で定義する置換基で置換されてもよい。例えば、Ｃ１ ６アルキル基は、さらに、１、２、３、４、５、または６つの本明細書に記載の置換基で置換されてもよい。
窒素を含む本開示の化合物を、酸化剤（例えば、３−クロロペルオキシ安息香酸（ｍＣＰＢＡ）及び／または過酸化水素）で処理することによってＮ−オキシドに変換し、本開示の他の化合物を得ることができる。従って、示される及び請求項にかかる含窒素化合物はすべて、原子価及び構造が許す場合、示される化合物及びそのＮ−オキシド誘導体（これは、Ｎ□ＯまたはＮ＋−Ｏ−と指定することができる）の両方を含むと見なされる。さらに、他の例では、本開示の化合物の窒素は、Ｎ−ヒドロキシまたはＮ−アルコキシ化合物に変換され得る。例えば、Ｎ−ヒドロキシ化合物は、当該親アミンをｍＣＰＢＡ等の酸化剤で酸化することによって調製され得る。すべての示される、及び請求項にかかる含窒素化合物はまた、原子価及び構造が許す場合、示される化合物及びそのＮ−ヒドロキシ（すなわち、Ｎ−ＯＨ）及びＮ−アルコキシ（すなわち、Ｎ−ＯＲ、ここで、Ｒは、置換または非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、３〜１４員の炭素環または３〜１４員のヘテロ環）誘導体の両方を含むと見なされる。
（ｖｉ）他の脂質組成物成分
本明細書に開示の医薬組成物の脂質組成物は、上記のものに加えて１つ以上の成分を含み得る。例えば、該脂質組成物は、１つ以上の透過性促進分子、炭水化物、ポリマー、表面変質剤（例えば、界面活性剤）、または他の成分を含み得る。例えば、透過性促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載の分子であり得る。炭水化物としては、単糖（例えば、グルコース）及び多糖（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及びアナログ）を挙げることができる。
本明細書に開示の医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態での医薬組成物）には、ポリマーが含まれる場合があり、及び／または本明細書に開示の医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態での医薬組成物）を封入または部分的に封入するためにポリマーが使用される場合がある。ポリマーは生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
該脂質組成物と該ポリヌクレオチド範囲の比は、約１０：１〜約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。
いくつかの実施形態では、該脂質組成物と該ポリヌクレオチドの比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。いくつかの実施形態では、該脂質組成物と治療薬をコードする該ポリヌクレオチドのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、複数のポリペプチドを含み得る。例えば、本明細書に開示の医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含み得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、脂質：ポリヌクレオチドの重量比５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１で、または、これらの比の範囲もしくはそのいずれか、例えば、これらに限定されないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１または約１５：１〜約７０：１で含み得る。
１つの実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、該ポリヌクレオチドを、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、これらに限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含み得る。
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。従って、本開示は、（ｉ）本明細書に記載の化合物等の送達剤を含む脂質組成物、及び（ｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物もまた提供する。かかるナノ粒子組成物では、本明細書に開示の脂質組成物は、ＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入し得る。
ナノ粒子組成物は、通常、およそマイクロメーター以下のサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性のコンパートメントで分離された２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化及び／または互いに架橋され得る。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャンネルを含み得る。
１つの実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧで修飾された脂質、ステロール及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、モル比約２０〜６０％のイオン性脂質、約５〜２５％の構造脂質、約２５〜５５％のステロール、及び約０．５〜１５％のＰＥＧで修飾された脂質を有する。
いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、多分散性値０．４未満を有する。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、中性ｐＨで正味の中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、平均径５０〜１５０ｎｍを有する。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、平均径８０〜１００ｎｍを有する。
本明細書で一般に定義される、「脂質」という用語は、疎水性または両親媒性の特性を有する小分子を指す。脂質は、天然に存在するものでも合成のものでもよい。脂質のクラスの例としては、脂肪、ワックス、ステロール含有代謝産物、ビタミン、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、及びポリケチド、ならびにプレノール脂質が挙げられるがこれらに限定されない。ある場合には、一部の脂質の両親媒性の特性は、水性媒体中でのそれらのリポソーム、小胞、または膜の形成につながる。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、イオン性脂質を含み得る。本明細書で使用される、「イオン性脂質」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、１つ以上の荷電部分を含む脂質を指す場合がある。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、正電荷を有することも負電荷を有することもある。イオン性脂質は、正電荷を有することがあり、この場合、これを「カチオン性脂質」と呼ぶことができる。ある特定の実施形態では、イオン性脂質分子は、アミン基を含む場合があり、これをイオン性アミノ脂質と呼ぶことができる。本明細書で使用される、「荷電部分」とは、形式電子電荷、例えば、一価（＋１、または−１）、二価（＋２、または−２）、三価（＋３、または−３）等を有する化学部分である。該荷電部分は、アニオン性（すなわち、負電荷を有する）でもカチオン性（すなわち、正電荷を有する）でもよい。正電荷を有する部分の例としては、アミン基（例えば、１級、２級、及び／または３級アミン）、アンモニウム基、ピリジニウム基、グアニジン基、及びイミジゾリウム基が挙げられる。特定の実施形態では、該荷電部分はアミン基を含む。負電荷を有する基またはその前駆体の例としては、カルボキシレート基、スルホネート基、スルフェート基、ホスホネート基、ホスフェート基、ヒドロキシル基等が挙げられる。荷電部分の電荷は、場合によっては、環境条件によって変化する場合があり、例えば、ｐＨの変化は、該部分の電荷を変化させる場合、及び／または該部分を荷電または非荷電にする場合がある。一般に、該分子の電荷密度は、所望に応じて選択され得る。
「荷電」または「荷電部分」という用語は、分子の「部分負電荷」または「部分正電荷」を指さないことを理解されたい。「部分負電荷」または「部分正電荷」という用語には、当技術分野におけるその通常の意味が与えられる。「部分負電荷」は、官能基が、電子密度が当該結合の１つの原子に向かって引き寄せられ、当該原子上に部分負電荷を形成するように分極される結合を含む場合に生じ得る。当業者には、一般に、このように分極され得る結合が認識されよう。
いくつかの実施形態では、該イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、当技術分野では「イオン性カチオン性脂質」と呼ばれる場合がある。１つの実施形態では、該イオン性アミノ脂質は、リンカー構造を介して接続された、正電荷を有する親水性頭部及び疎水性尾部を有し得る。
これらに加えて、イオン性脂質は、環状アミン基を含む脂質でもよい。
１つの実施形態では、該イオン性脂質は、国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号及び第ＷＯ２０１３１１６１２号に記載のイオン性脂質から選択され得るがこれらに限定されない。これら公開の各々の内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
さらに別の実施形態では、該イオン性脂質は、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号の式ＣＬＩ−ＣＬＸＸＸＸＩＩから選択され得るがこれらに限定されない。
１つの実施形態では、該脂質は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２１７０８８９号に記載のもの等の切断可能な脂質でよい。１つの実施形態では、該脂質は、当技術分野で既知の方法及び／またはその各々の内容が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３０８６３５４号に記載の方法で合成され得る。
ナノ粒子組成物は、様々な方法で特徴づけられ得る。例えば、顕微鏡検査（例えば、透過電子顕微鏡法または走査電子顕微鏡法）を使用して、ナノ粒子組成物の形態及びサイズ分布を調べることができる。動的光散乱または電位差測定法（例えば、電位差滴定）を使用して、ゼータ電位を測定することができる。動的光散乱は、粒径を特定するためにも使用され得る。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）等の機器を使用して、ナノ粒子組成物の複数の特性、例えば、粒径、多分散性指数、及びゼータ電位を測定することもできる。
該ナノ粒子のサイズは、炎症等であるがこれに限定されない生物反応に対抗するのに役立つ場合もあれば、該ポリヌクレオチドの生物学的効果を高める場合もある。
本明細書で使用される、ナノ粒子組成物との関連での「サイズ」または「平均サイズ」とは、ナノ粒子組成物の平均径を指す。
１つの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、直径約１０〜約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍを有する脂質ナノ粒子に製剤化される。
１つの実施形態では、該ナノ粒子は、直径約１０〜５００ｎｍを有する。１つの実施形態では、該ナノ粒子は、直径１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超を有する。
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物の最大の寸法は、１μｍ以下（例えば、１μｍ、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、またはそれ以下）である。
ナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。多分散性指数を使用して、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、該ナノ粒子組成物の粒径分布を示すことができる。小さい（例えば、０．３未満の）多分散性指数は通常、狭い粒径分布を示す。ナノ粒子組成物は、多分散性指数約０〜約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、または０．２５を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物の多分散性指数は、約０．１０〜約０．２０であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位を使用して、該組成物の運動電位を示すことができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子組成物の表面電荷を表すことができる。比較的低い正または負の電荷を有するナノ粒子組成物が一般に望ましく、より高い電荷を有する種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と不必要に相互作用する可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約１０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約１０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約１０ｍＶ〜約２０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約２０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約２０ｍＶ〜約３０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約３０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約６０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約３０ｍＶ〜約４０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約１００ｍＶ、約４０ｍＶ〜約９０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約８０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約７０ｍＶ、約４０ｍＶ〜約６０ｍＶ、及び約４０ｍＶ〜約５０ｍＶであり得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ〜約５０ｍＶ、約１５ｍＶ〜約４５ｍＶ、約２０ｍＶ〜約４０ｍＶ、及び約２５ｍＶ〜約３５ｍＶであり得る。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子のゼータ電位は、約１０ｍＶ、約２０ｍＶ、約３０ｍＶ、約４０ｍＶ、約５０ｍＶ、約６０ｍＶ、約７０ｍＶ、約８０ｍＶ、約９０ｍＶ、及び約１００ｍＶであり得る。
ポリヌクレオチドの「封入効率」という用語は、調製後にナノ粒子組成物に封入されたまたはこれと会合したポリヌクレオチドの量を最初に提供された量と比較して表す。本明細書で使用される、「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な包囲、閉じ込め、取り囲み、または覆いを指すことができる。
封入効率は、高い（例えば、１００％に近い）ことが望ましい。封入効率は、例えば、該ナノ粒子組成物を含む溶液における該ポリヌクレオチド量を、１つ以上の有機溶媒または界面活性剤での該ナノ粒子組成物の破壊前後で比較することによって測定され得る。
蛍光を使用して、溶液中の遊離のポリヌクレオチド量を測定することができる。本明細書に記載のナノ粒子組成物に関して、ポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、該封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある特定の実施形態では、該封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
本明細書に開示の医薬組成物に含まれるポリヌクレオチド量は、複数の要因、例えば、該ポリヌクレオチドのサイズ、所望の標的及び／または用途、または該ナノ粒子組成物の他の特性、ならびに該ポリヌクレオチドの特性に依存し得る。
例えば、ナノ粒子組成物に有用なｍＲＮＡの量は、該ｍＲＮＡのサイズ（長さ、または分子量として表される）、配列、及び他の特性に依存し得る。ナノ粒子組成物における相対的なポリヌクレオチド量もまた変化し得る。
本開示の脂質ナノ粒子組成物に含まれる脂質組成物及びポリヌクレオチドの相対量は、効力及び忍容性を考慮して最適化され得る。ポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡを含む組成物に関しては、Ｎ：Ｐ比が有用な測定基準としての機能を果たし得る。
ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、発現及び忍容性の両方を制御し、Ｎ：Ｐ比が低く発現が強いナノ粒子組成物が望ましい。Ｎ：Ｐ比は、ナノ粒子組成物における脂質とＲＮＡの比に応じて変化する。
一般に、Ｎ：Ｐ比は低い方が好ましい。１つ以上のＲＮＡ、脂質、及びそれらの量を選択して、Ｎ：Ｐ比約２：１〜約３０：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、または３０：１を提供することができる。ある特定の実施形態では、該Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約８：１であり得る。他の実施形態では、該Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。ある特定の実施形態では、該Ｎ：Ｐ比は、５：１〜６：１である。１つの特定の態様では、該Ｎ：Ｐ比は、約５．６７：１である。
ナノ粒子組成物を提供することに加えて、本開示は、ポリヌクレオチドを封入することを含む脂質ナノ粒子の製造方法もまた提供する。かかる方法は、本明細書に開示の医薬組成物のいずれかを使用すること及び当技術分野で既知の脂質ナノ粒子の製造方法に従って脂質ナノ粒子を製造することを含む。例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．８７：６８−８０、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｐａｒｔ Ｉ：Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９４０−９５４、Ｎａｓｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｓｏｌｉｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５：３０５−１３、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２９１−３０２、及びそれらの中の引用文献を参照されたい。
２１．他の送達剤
ａ．リポソーム、リポプレックス、及び脂質ナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化され得る。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、該ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを高めることができ、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができるため、ポリヌクレオチド指向タンパク質産生の効力を高めるために使用され得る。該リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、該ポリヌクレオチドの安定性を高めるためにも使用され得る。
リポソームは、人工的に調製される小胞であり、主に脂質二重層から構成され得るとともに、医薬製剤の投与用の送達媒体として使用され得る。リポソームは、異なるサイズのものであり得る。多重膜小胞（ＭＬＶ）は、直径数百ナノメーターであり得るとともに、狭い水性コンパートメントで分離された一連の同心二重層を含み得る。小単層小胞（ＳＵＶ）は、直径５０ｎｍ未満であり得るとともに、大単層小胞（ＬＵＶ）は、直径５０〜５００ｎｍであり得る。リポソームの設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するための、またはエンドサイトーシス等であるがこれに限定されない事象を活性化するためのオプソニンまたはリガンドを含み得るがこれに限定されない。リポソームは、該医薬製剤の送達を改善するために低いｐＨ値または高いｐＨ値を含み得る。
リポソームの形成は、取り込まれる医薬製剤ならびに該リポソームの成分、該脂質小胞が分散される媒体の性質、取り込まれる物質の有効濃度及びその潜在的な毒性、該小胞の適用及び／または送達の過程で関与する任意の追加のプロセス、意図される用途のための該小胞の最適なサイズ、多分散性及び保存可能期間、ならびに安全かつ効率的なリポソーム製品のバッチ間の再現性及びスケールアップ生産等に依存し得る。
非限定的な例として、合成膜小胞等のリポソームは、米国公開第ＵＳ２０１３０１７７６３８号、第ＵＳ２０１３０１７７６３７号、第ＵＳ２０１３０１７７６３６号、第ＵＳ２０１３０１７７６３５号、第ＵＳ２０１３０１７７６３４号、第ＵＳ２０１３０１７７６３３号、第ＵＳ２０１３０１８３３７５号、第ＵＳ２０１３０１８３３７３号、及び第ＵＳ２０１３０１８３３７２号に記載の方法、器具及び装置によって調製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、例えば、国際公開第ＷＯ２０１２０３１０４６号、第ＷＯ２０１２０３１０４３号、第ＷＯ２０１２０３０９０１号、第ＷＯ２０１２００６３７８号、及び第ＷＯ２０１３０８６５２６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１８９３５１号、第ＵＳ２０１３０１９５９６９号及び第ＵＳ２０１３０２０２６８４号に記載のリボソームに封入することができ、及び／またはそれを水性コアに含め、その後、該リポソームに封入することができる。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、カチオン性水中油エマルションに製剤化される場合があり、該エマルション粒子は、油のコアとカチオン性脂質を含み、これが該ポリヌクレオチドと相互作用し、該エマルション粒子に該分子を固定し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、親水性相が分散された連続疎水性相を含む油中水エマルションに製剤化される場合がある。例示的なエマルションは、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２００６３８０号及び第ＷＯ２０１０８７７９１号に記載の方法で作製することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、脂質−ポリカチオン複合体に製剤化され得る。該脂質−ポリカチオン複合体の形成は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０１７８７０２号に記載の方法で達成され得る。非限定的な例として、該ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド、例えば、これらに限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び／またはポリアルギニンならびに国際公開第ＷＯ２０１２０１３３２６号または米国公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号に記載のカチオン性ペプチドを含み得る。これらの参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１２３５２３号、第ＷＯ２０１２１７０９３０号、第ＷＯ２０１１１２７２５５号及び第ＷＯ２００８１０３２７６号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１６４６号に記載のものに製剤化され得る。
脂質ナノ粒子製剤は、通常、１つ以上の脂質を含む。いくつかの実施形態では、該脂質は、イオン性脂質（例えば、イオン性アミノ脂質）であり、当技術分野では、「イオン性カチオン性脂質」と呼ばれることがある。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤はさらに、リン脂質、構造脂質、及び粒子の凝集を低減することが可能な分子、例えば、ＰＥＧまたはＰＥＧで修飾された脂質を含めた他の成分を含む。
例示的なイオン性脂質としては、本明細書に開示の化合物１〜３４２のいずれか１つ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ４−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｃ２Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＰ−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ、ＤＬｉｎ−ＤＡＣ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ、ＫＬ１０、ＫＬ２２、ＫＬ２５、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。他の例示的なイオン性脂質としては、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−９−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ５Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−８−アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルドコサ−１３，１６−ジエン−５−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−４−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−６−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−７−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−１０−アミン、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラコサ−１５，１８−ジエン−５−アミン、（１４Ｚ，１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリコサ−１４，１７−ジエン−４−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ，２１Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８，２１−ジエン−８−アミン、（１７Ｚ，２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７，２０−ジエン−７−アミン、（１６Ｚ，１９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６，１９−ジエン−６−アミン、（２２Ｚ，２５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２，２５−ジエン−１０−アミン、（２１Ｚ，２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリアコンタ−２１，２４−ジエン−９−アミン、（１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１８−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘキサコサ−１７−エン−９−アミン、（１９Ｚ，２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタコサ−１９，２２−ジエン−７−アミン、Ν，Ν−ジメチルヘプタコサン−１０−アミン、（２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ−エチル−Ｎ−メチルノナコサ−２０，２３−ジエン−１０−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−１−ノニルイコサ−１１，１４−ジエン−１−イル］ピロリジン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−２０−エン−１０−アミン、（１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘプタコサ−１５−エン−１０−アミン、（１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１４−エン−１０−アミン、（１７Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１７−エン−１０−アミン、（２４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリトリアコンタ−２４−エン−１０−アミン、（２０Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−２０−エン−１０−アミン、（２２Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルヘントリアコンタ−２２−エン−１０−アミン、（１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタコサ−１６−エン−８−アミン、（１２Ｚ，１５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−ノニルヘンイコサ−１２，１５−ジエン−１−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン−８−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−ヘキシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘンイコサン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン−１０−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン−８−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−｛７−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］へプチル｝ドデカン−１−アミン、１−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−へプチルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデカン−９−アミン、１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−デシルシクロプロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタデカン−６−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−オクチルシクロプロピル］ペンタデカン−８−アミン、Ｒ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、Ｓ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝ピロリジン、（２Ｓ）−Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−［（５Ｚ）−オクタ−５−エン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、１−｛２−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−１−［（オクチルオキシ）メチル］エチル｝アゼチジン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（へプチルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（ノニルオキシ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−［（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−６，９，１２−トリエン−１−イルオキシ］−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（ペンチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−（ヘキシルオキシ）−３−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１１Ｚ，１４Ｚ）−イコサ−１１，１４−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ，１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ、１６Ｚ）−ドコサ−１３，１６−ジエン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、（２Ｓ）−１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−３−（ヘキシルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−２−アミン、１−［（１３Ｚ）−ドコサ−１３−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、１−［（９Ｚ）−ヘキサデカ−９−エン−１−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｈ（１−メチルオクチル）オキシ］−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、（２Ｒ）−１−［（３，７−ジメチルオクチル）オキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−（オクチルオキシ）−３−（｛８−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−｛［（１Ｒ，２Ｒ）−２−ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］オクチル｝オキシ）プロパン−２−アミン、Ν，Ν−ジメチル−１−｛［８−（２−オクチルシクロプロピル）オクチル］オキシ｝−３−（オクチルオキシ）プロパン−２−アミン、及び（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルノナコサ−１１，２０，２−トリエン−１０−アミン、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
リン脂質としては、グリセロリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸が挙げられるがこれらに限定されない。リン脂質には、リンスフィンゴ脂質、例えば、スフィンゴミエリンも含まれる。いくつかの実施形態では、該リン脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＵＰＣ、１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ、ＤＬｎＰＣ、ＤＡＰＣ、ＤＨＡＰＣ、ＤＯＰＥ、４ＭＥ １６：０ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＬＰＥ、ＤＬｎＰＥ、ＤＡＰＥ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、該リン脂質は、ＭＰＰＣ、ＭＳＰＣ、ＰＭＰＣ、ＰＳＰＣ、ＳＭＰＣ、ＳＰＰＣ、ＤＨＡＰＥ、ＤＯＰＧ、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、該脂質組成物におけるリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）の量は、約１ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％に及ぶ。
該構造脂質としては、ステロール及びステロール部分を含む脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、該構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、該構造脂質はコレステロールである。いくつかの実施形態では、該脂質組成物における該構造脂質（例えば、コレステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％に及ぶ。
該ＰＥＧで修飾された脂質としては、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン及びＰＥＧで修飾された１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。かかる脂質はＰＥＧ化脂質とも呼ばれる。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ−脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステアリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル（ｄｉｐａｌｍｅｔｏｌｅｙｌ）、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃａｍｉｄｅ）（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、該ＰＥＧ部分は、サイズ約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンを有する。いくつかの実施形態では、該脂質組成物におけるＰＥＧ−脂質の量は、約０ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％に及ぶ。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ製剤は、さらに透過性促進分子を含み得る。非限定的な透過性促進分子は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２００５０２２２０６４号に記載されている。
該ＬＮＰ製剤はさらに、リン酸コンジュゲートを含み得る。該リン酸コンジュゲートは、インビボでの循環時間を延長する場合及び／または該ナノ粒子の標的化送達を増加させる場合がある。リン酸コンジュゲートは、例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０３３４３８号または米国公開第ＵＳ２０１３０１９６９４８号に記載の方法で作製され得る。該ＬＮＰ製剤は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３００５９３６０号、第ＵＳ２０１３０１９６９４８号、及び第ＵＳ２０１３００７２７０９号に記載のポリマーコンジュゲート（例えば、水溶性コンジュゲート）も含み得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
該ＬＮＰ製剤は、対象において本発明のナノ粒子の送達を促進するためのコンジュゲートを含み得る。さらに、該コンジュゲートは、対象において該ナノ粒子の食作用クリアランスを阻害し得る。いくつかの実施形態では、該コンジュゲートは、ヒト膜タンパク質ＣＤ４７から設計される「自己」ペプチド（例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ ３３９， ９７１−９７５による記載の「自己」粒子）であり得る。Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらが示す自己ペプチドは、マクロファージが媒介するナノ粒子のクリアランスを遅らせ、該ナノ粒子の送達を促進した。
該ＬＮＰ製剤は、炭水化物担体を含み得る。非限定的な例として、該炭水化物担体は、アルデヒドで修飾されたフィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンベータ−デキストリン、無水物で修飾されたフィトグリコーゲンベータ−デキストリン（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１０９１２１号、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）を含み得るがこれらに限定されない。
該ＬＮＰ製剤を界面活性剤またはポリマーで被覆して、該粒子の送達を改善することができる。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、親水性コーティング、例えば、これらに限定されないが、ＰＥＧコーティング及び／または参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１８３２４４号に記載の中性表面電荷を有するコーティングで被覆され得る。
該ＬＮＰ製剤は、該脂質ナノ粒子が、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４１，６７０号または国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に記載の通り粘膜バリアを透過することができるように、粒子の表面特性を変更するように操作され得る。
粘液に浸透するように操作されたＬＮＰは、ポリマー材料（すなわち、ポリマーコア）及び／またはポリマー・ビタミンコンジュゲート及び／またはトリブロックコポリマーを含み得る。該ポリマー材料としては、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリ（スチレン）、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートを挙げることができるがこれらに限定されない。
粘液に浸透するように操作されたＬＮＰはまた、表面変質剤、例えば、これらに限定されないが、ポリヌクレオチド、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール及びポロキサマー）、粘液溶解薬（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、エルドステイン）及びｒｈＤＮａｓｅを含めた様々なＤＮａｓｅも含み得る。
いくつかの実施形態では、該粘液浸透性ＬＮＰは、粘膜透過促進コーティングを含む低張製剤であり得る。該製剤は、それが送達される上皮に対して低張であり得る。低張製剤の非限定的な例は、例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１１００２８号に見出すことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、リポプレックス、例えば、限定されないが、Ｓｉｌｅｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）製ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム及び他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）製ＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、ならびにポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミン系の標的化及び非標的化核酸送達（Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ ６８：９７８８−９７９８、Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１２ ５０：７６−７８、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１２２２−１２３４、Ｓａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６ １３：１３６０−１３７０、Ｇｕｔｂｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０ ２３：３３４−３４４、Ｋａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２０１０ ８０：２８６−２９３Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ ３２：４９８−５０７、Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８ ３１：１８０−１８８、Ｐａｓｃｏｌｏ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４、Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：１−１５、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５， ２３：７０９−７１７、Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００７ ６，１０４：４０９５−４１００、ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ １９：１２５−１３２、参照することによりこれらのすべてが全体として本明細書に組み込まれる）として製剤化される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、平均径が１０〜１０００ｎｍの球状であり得る固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）として製剤化される。ＳＬＮは、固体脂質コアマトリクスを有し、これは、親油性分子を可溶化することが可能でありかつ界面活性剤及び／または乳化剤で安定化され得る。例示的なＳＬＮは、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１３１０５１０１号に記載のものであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、制御放出及び／または標的化送達用に製剤化され得る。本明細書で使用される、「制御放出」とは、治療結果をもたらすための特定の放出パターンに従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。１つの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、制御放出及び／または標的化送達のため、本明細書に記載の、及び／または当技術分野で既知の送達剤に封入され得る。本明細書で使用される、「封入する」という用語は、包囲する、取り囲む、または包むことを意味する。本発明の化合物の製剤に関連する封入は、実質的である場合も、完全である場合も、部分的である場合もある。「実質的に封入される」という用語は、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％より多く、もしくは９９％超より多くが、該送達剤に包囲され、取り囲まれ、または包まれ得ることを意味する。「部分的封入」は、本発明の医薬組成物または化合物の１０未満、１０、２０、３０、４０ ５０またはそれ未満が、該送達剤に包囲され、取り囲まれ、または包まれ得ることを意味する。
有利には、封入は、本発明の医薬組成物または化合物の脱出または活性を、蛍光及び／または電子顕微鏡写真を用いて測定することによって特定され得る。例えば、本発明の医薬組成物または化合物の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、または９９％超が該送達剤に封入される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、治療用ナノ粒子に封入される場合があり、本明細書では「治療用ナノ粒子ポリヌクレオチド」と呼ばれる。治療用ナノ粒子は、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１０００５７４０号、第ＷＯ２０１００３０７６３号、第ＷＯ２０１０００５７２１号、第ＷＯ２０１０００５７２３号、及び第ＷＯ２０１２０５４９２３号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１１０２６２４９１号、第ＵＳ２０１００１０４６４５号、第ＵＳ２０１０００８７３３７号、第ＵＳ２０１０００６８２８５号、第ＵＳ２０１１０２７４７５９号、第ＵＳ２０１０００６８２８６号、第ＵＳ２０１２０２８８５４１号、第ＵＳ２０１２０１４０７９０号、第ＵＳ２０１３０１２３３５１号及び第ＵＳ２０１３０２３０５６７号、ならびに米国特許第８，２０６，７４７号、第８，２９３，２７６号、第８，３１８，２０８号及び第８，３１８，２１１号に記載の方法で製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、該治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、持続放出用に製剤化され得る。本明細書で使用される、「持続放出」とは、特定の期間にわたってある放出率に従う医薬組成物または化合物を指す。該期間としては、数時間、数日、数週間、数ヶ月、及び数年を挙げることができるがこれらに限定されない。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの持続放出ナノ粒子は、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１００７５０７２号及び米国公開第ＵＳ２０１００２１６８０４号、第ＵＳ２０１１０２１７３７７号、第ＵＳ２０１２０２０１８５９号及び第ＵＳ２０１３０１５０２９５号に開示の通りに製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、該治療用ナノ粒子ポリヌクレオチドは、標的特異的に、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２００８１２１９４９号、第ＷＯ２０１０００５７２６号、第ＷＯ２０１０００５７２５号、第ＷＯ２０１１０８４５２１号及び第ＷＯ２０１１０８４５１８号、ならびに米国公開第ＵＳ２０１０００６９４２６号、第ＵＳ２０１２０００４２９３号及び第ＵＳ２０１００１０４６５５号に記載のものに製剤化され得る。
該ＬＮＰは、マイクロ流体ミキサーまたはマイクロミキサーを用いて調製され得る。例示的なマイクロ流体ミキサーとしては、Ｍｉｃｒｏｉｎｎｏｖａ（Ａｌｌｅｒｈｅｉｌｉｇｅｎ ｂｅｉ Ｗｉｌｄｏｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）製のものが挙げられるがこれらに限定されないスリットインターデジタルマイクロミキサー及び／またはスタガードヘリンボーンマイクロミキサー（ＳＨＭ）（Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔ ａｌ．，“Ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｍｉｔ ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｃｏｒｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２８：３６３３−４０（２０１２）、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｌｉｍｉｔ−ｓｉｚｅ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１：ｅ３７（２０１２）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｓｉＲＮＡ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｅｎａｂｌｅｄ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３４（１６）：６９４８−５１（２０１２）参照。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）を挙げることができるがこれらに限定されない。例示的なマイクロミキサーとしては、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ Ｍａｉｎｚ ＧｍｂＨ，Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ製Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍｉｘｅｒ（ＳＩＭＭ−Ｖ２）またはＳｔａｎｄａｒｄ Ｓｌｉｔ Ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｍｉｘｅｒ（ＳＳＩＭＭ）またはＣａｔｅｒｐｉｌｌａｒ（ＣＰＭＭ）またはＩｍｐｉｎｇｉｎｇ−ｊｅｔ（ＩＪＭＭ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＨＭを用いたＬＮＰの作製方法はさらに、少なくとも２つの投入された流れを混合することを含み、ここでは、混合は、微細構造が誘導するカオス的移流（ＭＩＣＡ）によって生じる。本方法によれば、流体の流れは、ヘリンボーンパターンに存在する流路を介して流れ、これが旋回流を引き起こし、互いの周りに流体を保持する。本方法は、流体混合用の表面を含むこともでき、該表面は、流体の循環の間に向きを変える。ＳＨＭを用いたＬＮＰの生成方法としては、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２００４０２６２２２３号及び第ＵＳ２０１２０２７６２０９号に記載のものが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マイクロ流体技術を用いて脂質ナノ粒子に製剤化され得る（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ４４２：３６８−３７３（２００６）、及びＡｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｒ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：６４７−６５１（２００２）参照。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）またはＤｏｌｏｍｉｔｅ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，ＵＫ）製のもの等であるがこれらに限定されないマイクロミキサーチップを用いて脂質ナノ粒子に製剤化され得る。マイクロミキサーチップは、分割及び再結合機構による２つ以上の流体の流れの急速混合に使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば、これらに限定されないが、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約９０ｎｍ、約５ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約１０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２０ｎｍ、約５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約５ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜約４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ 約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、約７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍを有する脂質ナノ粒子に製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、直径約１０〜５００ｎｍを有し得る。１つの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、直径１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超を有し得る。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、より小さいＬＮＰを用いて送達され得る。かかる粒子は、直径０．１μｍ未満から１００ｎｍまで、例えば、限定されないが、０．１μｍ未満、１．０μｍ未満、５μｍ未満、１０μｍ未満、１５ｕｍ未満、２０ｕｍ未満、２５ｕｍ未満、３０ｕｍ未満、３５ｕｍ未満、４０ｕｍ未満、５０ｕｍ未満、５５ｕｍ未満、６０ｕｍ未満、６５ｕｍ未満、７０ｕｍ未満、７５ｕｍ未満、８０ｕｍ未満、８５ｕｍ未満、９０ｕｍ未満、９５ｕｍ未満、１００ｕｍ未満、１２５ｕｍ未満、１５０ｕｍ未満、１７５ｕｍ未満、２００ｕｍ未満、２２５ｕｍ未満、２５０ｕｍ未満、２７５ｕｍ未満、３００ｕｍ未満、３２５ｕｍ未満、３５０ｕｍ未満、３７５ｕｍ未満、４００ｕｍ未満、４２５ｕｍ未満、４５０ｕｍ未満、４７５ｕｍ未満、５００ｕｍ未満、５２５ｕｍ未満、５５０ｕｍ未満、５７５ｕｍ未満、６００ｕｍ未満、６２５ｕｍ未満、６５０ｕｍ未満、６７５ｕｍ未満、７００ｕｍ未満、７２５ｕｍ未満、７５０ｕｍ未満、７７５ｕｍ未満、８００ｕｍ未満、８２５ｕｍ未満、８５０ｕｍ未満、８７５ｕｍ未満、９００ｕｍ未満、９２５ｕｍ未満、９５０ｕｍ未満、または９７５ｕｍ未満で構成され得る。
本明細書に記載のナノ粒子及びマイクロ粒子は、マクロファージ及び／または免疫応答を調節するように幾何学的に操作され得る。該幾何学的に操作された粒子は、様々な形状、サイズ及び／または表面電荷を有して本明細書に記載のポリヌクレオチドを標的化送達、例えば、これに限定されないが、肺送達用に組み込むことができる（例えば、国際公開第ＷＯ２０１３０８２１１１号参照。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。該幾何学的に操作された粒子の他の物理的特徴としては、開窓、角度がついたアーム、非対称性及び表面粗さ、細胞及び組織との相互作用を変化させ得る電荷を挙げることができるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、ステルスナノ粒子または標的特異的ステルスナノ粒子であり、例えば、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国公開第ＵＳ２０１３０１７２４０６号に記載のものであるがこれらに限定されない。該ステルスまたは標的特異的ステルスナノ粒子は、ポリマーマトリクスを含むことができ、該ポリマーマトリクスは、２つ以上のポリマー、例えば、これらに限定されないが、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリエステル、ポリ無水物、ポリエーテル、ポリウレタン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
ｂ．リピドイド
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、送達剤、例えば、リピドイドを含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、リピドイドとともに製剤化され得る。これらリピドイドを含めて複合体、ミセル、リポソームまたは粒子を調製するため、局所及び／または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注射後に、コードされたタンパク質の産生によって判断される該ポリヌクレオチドの効率的な送達を達成することができる。ポリヌクレオチドのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路が挙げられるがこれらに限定されない様々な手段で投与され得る。
リピドイドの合成は、文献に記載されている（Ｍａｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０ ２１：１４４８−１４５４、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０ ２６７：９−２１、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８ ２６：５６１−５６９、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ １０７：１８６４−１８６９、Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ １０８：１２９９６−３００１参照。これらのすべては全体として本明細書に組み込まれる）。
ペンタ［３−（１−ラウリルアミノプロピオニル）］−トリエチレンテトラミン塩酸塩（ＴＥＴＡ−５ＬＡＰ、別名９８Ｎ１２−５、Ｍｕｒｕｇａｉａｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０１：６１（２０１０）参照）、Ｃ１２−２００（誘導体及びバリアントを含む）、ならびにＭＤ１が挙げられるがこれらに限定されない異なるリピドイドとの製剤のインビボ活性を調べることができる。リピドイド「９８Ｎ１２−５」は、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００９ １７：８７２−８７９に開示されている。リピドイド「Ｃ１２−２００」は、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ １０７：１８６４−１８６９及びＬｉｕ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１０ ６６９−６７０で開示されている。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
１つの実施形態では、本明細書に記載のポリポリヌクレオチドは、アミノアルコールリピドイドに製剤化され得る。アミノアルコールリピドイドは、米国特許第８，４５０，２９８号（参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）に記載の方法で調製され得る。
該リピドイド製剤は、ポリヌクレオチドに加えて３成分もしくは４成分またはそれ以上を含む粒子を含み得る。リピドイド及びリピドイドを含むポリヌクレオチド製剤は、国際公開第ＷＯ２０１５０５１２１４号（参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｃ．ヒアルロニダーゼ
いくつかの実施形態における、注射（例えば、筋肉内または皮下注射）用の本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）及びヒアルロニダーゼ。ヒアルロニダーゼは、間質バリアの成分であるヒアルロナンの加水分解を触媒する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を下げ、それにより、組織透過性を上げる（Ｆｒｏｓｔ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．（２００７）４：４２７−４４０）。代替的に、該ヒアルロニダーゼは、筋肉内または皮下投与されたポリヌクレオチドに曝露される細胞数を増加させるために使用され得る。
ｄ．ナノ粒子模倣体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ナノ粒子模倣体内に封入及び／またはナノ粒子模倣体に吸収される。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、プリオン及び細胞等であるがこれらに限定されない生物または粒子の送達機能を模倣し得る。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ウイルスの送達機能を模倣し得る非バイロン粒子に封入され得る（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２００６３７６号ならびに米国公開第ＵＳ２０１３０１７１２４１号及び第ＵＳ２０１３０１９５９６８号参照。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。
ｅ．自己組織化ナノ粒子、または自己組織化高分子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を、送達用の自己組織化ナノ粒子、または両親媒性高分子（ＡＭ）中に含む。ＡＭは、ポリ（エチレングリコール）に共有結合したアルキル化糖骨格を有する生体適合性両親媒性ポリマーを含む。水溶液中、該ＡＭは自己組織化してミセルを形成する。核酸の自己組織化ナノ粒子は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７号に記載されており、ＡＭ及びＡＭの形成方法は、米国公開第ＵＳ２０１３０２１７７５３号に記載されている。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
ｆ．カチオン及びアニオン
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）及びカチオンまたはアニオン、例えば、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋及びそれらの組み合わせを含む。例示的な製剤は、ポリマー及び、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，２６５，３８９号及び第６，５５５，５２５号に記載の金属カチオンと複合化したポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性ナノ粒子は、二価及び一価カチオンの組み合わせを含み得る。カチオン性ナノ粒子中またはカチオン性ナノ粒子を含む１つ以上のデポー中のポリヌクレオチドを送達することで、長時間作用型デポーとして作用すること及び／またはヌクレアーゼによる分解速度を低下させることにより、ポリヌクレオチドのバイオアベイラビリティを改善することができる。
ｇ．アミノ酸脂質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、アミノ酸脂質との製剤である本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む。アミノ酸脂質は、アミノ酸残基及び１つ以上の親油性尾部を含む親油性化合物である。アミノ酸脂質及びアミノ酸脂質の作製方法の非限定的な例は、米国特許第８，５０１，８２４号に記載されている。該アミノ酸脂質製剤は、当該ポリヌクレオチドに結合しかつこれを放出するアミノ酸脂質を含む放出可能な形態でポリヌクレオチドを送達することができる。非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドの放出は、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，０９８，０３２号、第６，８９７，１９６号、第６，４２６，０８６号、第７，１３８，３８２号、第５，５６３，２５０号、及び第５，５０５，９３１号に記載の酸に不安定なリンカーによってもたらされ得る。
ｈ．高分子電解質間複合体
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を高分子電解質間複合体に含む。高分子電解質間複合体は、電荷動的ポリマーが１つ以上のアニオン性分子と複合化された場合に形成される。電荷動的ポリマー及び高分子電解質間複合体ならびに高分子電解質間複合体の作製方法の非限定的な例は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，５２４，３６８号に記載されている。
ｉ．結晶性ポリマー系
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を結晶性ポリマー系に含む。結晶性ポリマー系は、結晶性部分及び／または結晶性部分を含む末端単位を備えたポリマーである。例示的なポリマーは、米国特許第８，５２４，２５９号（参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｊ．ポリマー、生分解性ナノ粒子、及びコアシェルナノ粒子
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）ならびに天然及び／または合成ポリマーを含む。該ポリマーとしては、ポリエテン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）、ＰＥＧグラフトＰＬＬ、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、架橋分岐ポリ（アルキレンイミン）、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、弾性生分解性ポリマー、生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、マルチブロックコポリマー、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルソエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリウレア、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リジン）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
例示的なポリマーとしては、ＭＩＲＵＳ（登録商標）Ｂｉｏ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及びＲｏｃｈｅ Ｍａｄｉｓｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）製ＤＹＮＡＭＩＣ ＰＯＬＹＣＯＮＪＵＧＡＴＥ（登録商標）（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）製剤、ＰＨＡＳＥＲＸ（商標）ポリマー製剤、例えば、限定されないが、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、ＤＭＲＩ／ＤＯＰＥ、ポロキサマー、Ｖｉｃａｌ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製ＶＡＸＦＥＣＴＩＮ（登録商標）アジュバント、キトサン、Ｃａｌａｎｄｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）製シクロデキストリン、デンドリマー及びポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ポリマー、ＲＯＮＤＥＬ（商標）（ＲＮＡｉ／オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（Ａｒｒｏｗｈｅａｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）及びｐＨ応答性コブロックポリマー、例えば、ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標）（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）が挙げられる。
該ポリマー製剤は、該ポリヌクレオチドの持続放出または遅延放出を可能にする（例えば、筋肉内または皮下注射後）。該ポリヌクレオチド用に変更された放出プロファイルは、例えば、長期間にわたってコードされたタンパク質の翻訳をもたらし得る。該ポリマー製剤は、該ポリヌクレオチドの安定性を高めるためにも使用され得る。持続放出製剤としては、ＰＬＧＡマイクロスフェア、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡｃ）、ポロキサマー、ＧＥＬＳＩＴＥ（登録商標）（Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ａｌａｃｈｕａ，ＦＬ）、ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）（Ｈａｌｏｚｙｍｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）、手術用シーラント、例えば、フィブリノーゲンポリマー（Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ． Ｃｏｒｎｅｌｉａ，ＧＡ）、ＴＩＳＳＥＬＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＰＥＧ系シーラント、及びＣＯＳＥＡＬ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を挙げることができるがこれらに限定されない。
非限定的な例として、修飾ｍＲＮＡは、調節可能な放出速度（例えば、数日及び数週間）のＰＬＧＡマイクロスフェアを調製し、当該封入プロセス中に該修飾ｍＲＮＡの完全性を維持しながら、該修飾ｍＲＮＡを該ＰＬＧＡマイクロスフェアに封入することにより、ＰＬＧＡマイクロスフェアに製剤化され得る。ＥＶＡｃは、非生分解性の生体適合性ポリマーであり、広く前臨床持続放出インプラント用途（例えば、緑内障用のピロカルピン眼科用挿入物である徐放性製剤Ｏｃｕｓｅｒｔ、または持続放出プロゲステロン子宮内器具であるｐｒｏｇｅｓｔａｓｅｒｔ、経皮的送達システムであるＴｅｓｔｏｄｅｒｍ、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ及びＳｅｌｅｇｉｌｉｎｅ、カテーテル）に使用されている。ポロキサマーＦ−４０７ＮＦは、親水性のノニオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレントリブロックコポリマーであり、５℃未満の温度で低粘度を有し、１５℃より高い温度で個体ゲルを形成する。
非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国特許第６，１７７，２７４号に記載のポリマー化合物であるＰＬＬグラフトＰＥＧとともに製剤化され得る。別の非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ブロックコポリマー、例えば、ＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（例えば、米国公開第ＵＳ２０１２０００４２９３号ならびに米国特許第８，２３６，３３０号及び第８，２４６，９６８号参照）、またはＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡブロックコポリマー（例えば、米国特許第６，００４，５７３号参照）とともに製剤化され得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのアミン含有ポリマー、例えば、これらに限定されないが、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（アミン−ｃｏ−エステル）またはそれらの組み合わせとともに製剤化され得る。例示的なポリアミンポリマー及びそれらの送達剤としての使用は、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，４６０，６９６号、第８，２３６，２８０号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、例えば、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９６，０３８号、第６，５１７，８６９号、第６，２６７，９８７号、第６，２１７，９１２号、第６，６５２，８８６号、第８，０５７，８２１号、及び第８，４４４，９９２号、米国公開第ＵＳ２００３００７３６１９号、第ＵＳ２００４０１４２４７４号、第ＵＳ２０１００００４３１５号、第ＵＳ２０１２００９１４５及び第ＵＳ２０１３０１９５９２０号、ならびに国際公開第ＷＯ２００６０６３２４９号及び第ＷＯ２０１３０８６３２２号に記載の生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性コポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、線状生分解性コポリマー、ＰＡＧＡ、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーまたはそれらの組み合わせに製剤化され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１８４４５３号に記載の少なくとも１つのシクロデキストリンポリマーに、またはこれとともに製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、国際公開第ＷＯ２０１３１０６０７２号、第ＷＯ２０１３１０６０７３号及び第ＷＯ２０１３１０６０８６号に記載の少なくとも１つの架橋カチオン結合性ポリマーに、またはこれとともに製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０２３１２８７号に記載の少なくともＰＥＧ化アルブミンポリマーに、またはこれとともに製剤化され得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチドは、ポリマー、脂質、及び／または他の生分解性薬剤、例えば、限定されないが、リン酸カルシウムの組み合わせを使用してナノ粒子として製剤化され得る。該ナノ粒子の送達のための微調整を可能にするため、成分を、コアシェル、ハイブリッド、及び／または多層構造で組み合わせることができる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ．２００６ ５：７９１−７９６、Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００８ ２９：１５２６−１５３２、ＤｅＫｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１１ ６３：７４８−７６１、Ｅｎｄｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１ ３２：７７２１−７７３１、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ． ２０１１ Ｊｕｎ ６、８（３）：７７４−８７、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。非限定的な例として、該ナノ粒子は、複数のポリマー、例えば、これらに限定されないが、親水性・疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ−ＰＬＧＡ）、疎水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）及び／または親水性ポリマー（国際公開第ＷＯ２０１２０２２５１２９号、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）を含み得る。
コアシェルナノ粒子の使用はさらに、カチオン性架橋ナノゲルコア及び様々なシェルを合成するハイスループットアプローチに焦点を合わせている（Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ １０８：１２９９６−１３００１、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。該ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、及び内在化は、該ナノ粒子のコア成分及びシェル成分の両方の化学組成を変更することで正確に制御され得る。例えば、該コアシェルナノ粒子は、コレステロールを該ナノ粒子に共有結合させた後、マウスの肝細胞にｓｉＲＮＡを効率的に送達することができる。
いくつかの実施形態では、中間のＰＬＧＡ層及び外側のＰＥＧを含む中性脂質層を含む中空脂質コアを使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドを送達することができる。いくつかの実施形態では、該脂質ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチドのコア、及び該コアの該ポリヌクレオチドを保護するために使用されるポリマーシェルを含むことができる。該ポリマーシェルは、本明細書に記載の及び当技術分野で既知のポリマーのいずれかであり得る。該ポリマーシェルは、該コアの該ポリヌクレオチドを保護するために使用され得る。
本明細書に記載のポリヌクレオチドとともに使用するためのコアシェルナノ粒子は、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１３，７７７号または国際公開第ＷＯ２０１３１２４８６７号に記載されている。
ｋ．ペプチド及びタンパク質
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含み、該ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを増加させるための、及び／または該ポリヌクレオチドの生体内分布を変更（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的化することによって）するための、及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させるためのペプチド及び／またはタンパク質とともに製剤化される（例えば、国際公開第ＷＯ２０１２１１０６３６号及び第ＷＯ２０１３１２３２９８号）。いくつかの実施形態では、該ペプチドは、米国公開第ＵＳ２０１３０１２９７２６号、第ＵＳ２０１３０１３７６４４号及び第ＵＳ２０１３０１６４２１９号に記載のものであり得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
ｌ．コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本開示の組成物または製剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含み、該ポリヌクレオチドは、コンジュゲートとして、担体もしくは標的化基に共有結合しているか、または、融合タンパク質（例えば、標的化基及び治療用タンパク質もしくはペプチドを有する）を一緒に産生する２つのコード領域を含む。該コンジュゲートは、該ナノ粒子を組織もしくは生物のニューロンに選択的に誘導するか、または血液脳関門の通過を支援するペプチドであり得る。
該コンジュゲートは、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）、または脂質を含む。該リガンドはまた、組み換え分子でも合成分子でも、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）でもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファゼンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩、またはアルファヘリックスペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、該コンジュゲートは、本明細書に開示のポリヌクレオチド用の担体として機能し得る。該コンジュゲートは、カチオン性ポリマー、例えば、これらに限定されないが、ポリ（エチレングリコール）がグラフトされ得るポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、及びポリエチレンイミンを含むことができる。例示的なコンジュゲート及びそれらの調製は、各々が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８６，５２４号及び米国公開第ＵＳ２０１３０２１１２４９号に記載されている。
該コンジュゲートは、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎臓細胞等の特定の細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体またはアプタマーであり得る。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特定の親和性を有する分子、または抗体、例えば、内皮細胞もしくは骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基はまた、ホルモン及びホルモン受容体も含み得る。それらはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フルコース（ｆｒｕｃｏｓｅ）、またはアプタマーも含み得る。該リガンドは、例えば、リポポリ多糖、またはｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子であり得る。
該標的化基は、特定の受容体を標的化することが可能な任意のリガンドであり得る。例としては、葉酸、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース６Ｐ、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬ、及びＨＤＬリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、該標的化基は、アプタマーである。該アプタマーは、未修飾であっても本明細書に開示の任意の修飾の組み合わせを有してもよい。非限定的な例として、該標的化基は、例えば、米国公開第ＵＳ２０１３０２１６６１０１２号（参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）に記載の血液中枢神経系関門を通過する標的化送達のためのグルタチオン受容体（ＧＲ）結合コンジュゲートであり得る。
いくつかの実施形態では、該コンジュゲートは、より大きな治療効果をもたらすために長時間作用型連続的放出系を含む相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートであり得る。該相乗的生体分子−ポリマーコンジュゲートは、米国公開第ＵＳ２０１３０１９５７９９号に記載のものであり得る。いくつかの実施形態では、該コンジュゲートは、国際特許公開第ＷＯ２０１２０４０５２４号に記載のアプタマーコンジュゲートであり得る。いくつかの実施形態では、該コンジュゲートは、米国特許第８，５０７，６５３号に記載のアミン含有ポリマーコンジュゲートであり得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ＳＭＡＲＴＴ ＰＯＬＹＭＥＲ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（登録商標）（ＰＨＡＳＥＲＸ（登録商標），Ｉｎｃ．Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、共有結合的に細胞透過性ポリペプチドにコンジュゲートされ、該ポリペプチドは、シグナル配列または標的化配列を含み得る。該コンジュゲートは、増加した安定性、及び／または増加した細胞のトランスフェクション、及び／または変更された生体内分布を有するように設計（例えば、特定の組織または細胞型に標的化）され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、送達を促進するための薬剤にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、該薬剤は、モノマーまたはポリマー、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１０６２９６５号に記載の標的化モノマーまたは標的化ブロックを有するポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、該薬剤は、例えば、米国特許第６，８３５．３９３号及び第７，３７４，７７８号に記載のポリヌクレオチドに共有結合した輸送剤であり得る。いくつかの実施形態では、該薬剤は、米国特許第７，７３７，１０８号及び第８，００３，１２９号に記載のもの等の膜バリア輸送促進剤であり得る。これら参考文献の各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
２２．加速血液クリアランス
本開示は、反復投与された生物活性剤等の活性薬剤に対するＡＢＣの影響を低減するための化合物、組成物及びそれらの使用方法を提供する。容易に分かるように、投与された活性薬剤に対するＡＢＣの影響を低減または完全に除去することで、その半減期を延長し、ひいてはその有効性を高める。
いくつかの実施形態では、ＡＢＣを低減することという用語は、陽性参照対照のＡＢＣ誘導性ＬＮＰ、例えば、ＭＣ３ ＬＮＰと比較した、ＡＢＣの何らかの低下を指す。ＡＢＣ誘導性ＬＮＰは、活性薬剤の血中レベルを、所与の期間内の２回目以降の投与後に低下させる。従って、ＡＢＣの低下とは、２回目以降の薬剤の投与後に、血中薬剤のクリアランスが基準のＬＮＰに対して低いことを指す。該低下は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、該低下は、１０〜１００％、１０〜５０％、２０〜１００％、２０〜５０％、３０〜１００％、３０〜５０％、４０％〜１００％、４０〜８０％、５０〜９０％、または５０〜１００％である。代替的に、該ＡＢＣの低下は、２回目以降の投与後の血中薬剤の少なくとも検出可能なレベルと特徴づけられる場合もあれば、基準のＬＮＰの投与後の血中薬剤と比較して、血中薬剤の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍の増加と特徴づけられる場合もある。いくつかの実施形態では、該低下は、２〜１００倍、２〜５０倍、３〜１００倍、３〜５０倍、３〜２０倍、４〜１００倍、４〜５０倍、４〜４０倍、４〜３０倍、４〜２５倍、４〜２０倍、４〜１５倍、４〜１０倍、４〜５倍、５〜１００倍、５〜５０倍、５〜４０倍、５〜３０倍、５〜２５倍、５〜２０倍、５〜１５倍、５〜１０倍、６〜１００倍、６〜５０倍、６〜４０倍、６〜３０倍、６〜２５倍、６〜２０倍、６〜１５倍、６〜１０倍、８〜１００倍、８〜５０倍、８〜４０倍、８〜３０倍、８〜２５倍、８〜２０倍、８〜１５倍、８〜１０倍、１０〜１００倍、１０〜５０倍、１０〜４０倍、１０〜３０倍、１０〜２５倍、１０〜２０倍、１０〜１５倍、２０〜１００倍、２０〜５０倍、２０〜４０倍、２０〜３０倍、または２０〜２５倍である。
本開示は、クリアランスに左右されず、ひいてはより長いインビボ半減期を有する脂質含有化合物及び組成物を提供する。これは特に、該組成物が、長期投与を含めた反復投与を意図されている場合であり、さらにいっそう具体的には、かかる反復投与が数日または数週間以内に行われる場合である。
重要なことには、これらの組成物は、観察される加速血液クリアランス（ＡＢＣ）の現象に左右されないか、または完全にこれを回避する。ＡＢＣは、体外から投与されたある特定の薬剤が、２回目以降の投与後に血中から急速に除去される現象である。この現象は、一部には、脂質化薬剤、リポソームまたは他の脂質系送達媒体、及び脂質封入薬剤が挙げられるがこれらに限定されない様々な脂質含有組成物に関して認められている。これまで、ＡＢＣの原理はほとんど理解されておらず、場合によっては、液性免疫応答によるものと見なされていたため、その影響をインビボで、特に臨床の場で制限するための戦略は分かりにくいままである。
本開示は、ＡＢＣに対して感受性があったとしても左右されない化合物及び組成物を提供する。いくつかの重要な態様では、かかる化合物及び組成物は、脂質含有化合物または組成物である。本開示の脂質含有化合物または組成物は、驚くべきことに、２回目以降のインビボ投与後にＡＢＣを経験しない。ＡＢＣに対するこの耐性は、これらの化合物または組成物を特に、数日または１〜２週間等の短期間内での反復使用を含めたインビボでの反復使用に適したものにする。この向上した安定性及び／または半減期は、一部には、これらの組成物がＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞及び／または従来のＢ細胞、ｐＤＣ及び／または血小板を活性化することができないことに起因する。
本開示は従って、加速血液クリアランス（ＡＢＣ）の基礎にある機序を解明する。本開示及び本明細書に提供する本発明によれば、少なくとも脂質及び脂質ナノ粒子に関するＡＢＣ現象は、少なくとも一部には、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、ｐＤＣ及び／または血小板に関与する先天性免疫応答が媒介することが分かった。Ｂ１ａ細胞は、通常、自然抗体を血中ＩｇＭの形態で分泌することに関与している。このＩｇＭは、多反応性であり、つまり、各々に対して比較的低い親和性ではあるが、様々な抗原に結合することができる。
本発明によれば、インビボ投与された脂質ナノ粒子等のいくつかの脂質化薬剤または脂質含有製剤が引き金となり、ＡＢＣの対象となることが分かった。本発明によれば、該ＬＮＰの最初の用量の投与後、先天性免疫応答の生成に関与する１つ以上の細胞（本明細書ではセンサーと呼ぶ）がかかる薬剤に結合し、活性化され、その後、ＡＢＣ及び毒性を促進する免疫因子（本明細書ではエフェクターと呼ぶ）のカスケードを開始することが現在分かっている。例えば、Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰに結合し、活性化し（単独で、または他のｐＤＣ等のセンサー及び／またはＩＬ６等のエフェクターの存在下）、該ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭを分泌し得る。対象の既存の天然のＩｇＭもまた該ＬＮＰを認識し、これに結合する場合があり、それにより補体結合を引き起こす。１回目の投与を施した後、天然のＩｇＭの産生は、該ＬＮＰの投与から１〜２時間以内に始まる。通常、約２〜３週間までに、該天然のＩｇＭは、ＩｇＭの自然の半減期によって該系から除去される。天然のＩｇＧは、該ＬＮＰの投与後約９６時間から産生される。ナイーブな設定で投与された場合、該薬剤は、該Ｂ１ａ細胞もしくはＢ１ｂ細胞の後活性化によって生じる天然のＩｇＭまたは天然のＩｇＧによって比較的妨げられることなくその生物学的効果を発揮することができる。該天然のＩｇＭ及び天然のＩｇＧは、非特異的であるため、抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧとは異なる。
出願者は、機序に拘束されるものではないが、ＬＮＰは、以下の機序を介してＡＢＣ及び／または毒性を引き起こすことが提示される。ＬＮＰが対象に投与された場合、該ＬＮＰは、急速に血液を介して脾臓に輸送されると考えられている。該ＬＮＰは、血中及び／または脾臓中で免疫細胞と遭遇し得る。血中及び／または脾臓中のＬＮＰの存在に応答して、急速な先天性免疫応答が引き起こされる。出願者は、本明細書において、ＬＮＰの投与から数時間以内に、いくつかの免疫センサーが該ＬＮＰの存在に対して反応したことを示している。これらのセンサーとしては、免疫応答の生成に関与する免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、ｐＤＣ、及び血小板が挙げられるがこれらに限定されない。該センサーは、脾臓内、例えば、脾臓の辺縁帯内及び／または血中に存在し得る。該ＬＮＰは、他のセンサーと相互作用し得る１つ以上のセンサーと物理的に相互作用し得る。かかる場合には、該ＬＮＰは、直接または間接的に該センサーと相互作用する。該センサーは、該ＬＮＰの認識に応答して、互いに直接相互作用し得る。例えば、多くのセンサーが脾臓に位置し、互いに容易に相互作用し得る。代替的に、該センサーの１つ以上は、血中でＬＮＰと相互作用し活性化し得る。該活性化センサーは、その後他のセンサーと直接または間接的に（例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ６等のメッセンジャーの刺激または産生を介して）相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、以下のセンサーの各々と直接相互作用し活性化し得る：ｐＤＣ、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、及び血小板。これらの細胞は、その後互いに直接または間接的に相互作用して、ＬＮＰの反復投与と関連したＡＢＣ及び／または毒性に最終的につながるエフェクターの産生を開始し得る。例えば、出願者は、ＬＮＰの投与がｐＤＣ活性化、血小板凝集及び活性化ならびにＢ細胞活性化につながることを示している。ＬＮＰに応答して、血小板もまた凝集し、活性化され、Ｂ細胞とともに凝集する。ｐＤＣ細胞は活性化される。ＬＮＰは、血小板及びＢ細胞の表面と比較的急速に相互作用することが分かった。ＬＮＰに応答するこれらセンサーの任意の１つまたは組み合わせの活性化を遮断することは、通常生じる免疫応答の減弱に有用である。この免疫応答の減弱は、ＡＢＣ及び／または毒性の回避につながる。
該センサーは、活性化されるとエフェクターを産生する。本明細書で使用される、エフェクターとは、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞が産生する免疫分子である。エフェクターとしては、免疫グロブリン、例えば、天然のＩｇＭ及び天然のＩｇＧならびにサイトカイン、例えば、ＩＬ６が挙げられるがこれらに限定されない。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞は、ＬＮＰの投与後２〜６時間以内に天然のＩｇＭ産生を刺激する。天然のＩｇＧは、９６時間以内に検出され得る。ＩＬ６レベルは、数時間以内に増加する。該天然のＩｇＭ及びＩｇＧは、数日から数週間、体内を循環する。この期間に、循環しているエフェクターは、新たに投与されるＬＮＰと相互作用する可能性があり、体内でのこれらＬＮＰのクリアランスを引き起こす。例えば、あるエフェクターは、ＬＮＰを認識し、これに結合し得る。該エフェクターのＦｃ領域は、マクロファージによって認識され、修飾されたＬＮＰの取り込みを引き起こし得る。該マクロファージはその後脾臓に輸送される。免疫センサーによるエフェクターの産生は、ＡＢＣで観察されるタイミングと相関する過渡応答である。
該投与量が２回目以降の投与であり、かかる２回目以降の投与が、すでに誘導された天然のＩｇＭ及び／またはＩｇＧが該系から除去される前に施された場合（例えば、２〜３ウィンドウ期間の前）、かかる２回目以降の投与は、別の補体経路の活性化を引き起こしてそれ自体が急速に除去される血中の天然のＩｇＭ及び／または天然のＩｇＧまたはＦｃによって標的とされる。該エフェクターが体内から除去された後、またはその数が減少した後にＬＮＰが投与された場合、ＡＢＣは認められない。
従って、本発明の態様によれば、ＬＮＰと１つ以上のセンサーの相互作用を阻害することが、ＬＮＰによる1つ以上のセンサーの活性化を阻害（直接もしくは間接的に）するのに、１つ以上のエフェクターの産生を阻害するのに、及び／または１つ以上のエフェクターの活性を阻害するのに有用である。いくつかの実施形態では、該ＬＮＰは、該ＬＮＰとセンサーの相互作用を制限または遮断するように設計される。例えば、該ＬＮＰは、センサーとの相互作用を防ぐように変更されたＰＣ及び／またはＰＥＧを有し得る。代替的に、またはさらに、ＬＮＰが誘導する免疫応答を阻害する薬剤を用いて、これらの効果のいずれか１つ以上を達成してもよい。
従来のＢ細胞も同様にＡＢＣに関与していることもまた究明された。具体的には、ある薬剤の１回目の投与後、本明細書ではＣＤ１９（＋）と呼ばれる従来のＢ細胞は、該薬剤に結合し、これに対して反応する。Ｂ１ａ及びＢ１ｂ細胞とは異なり、しかしながら、従来のＢ細胞は、最初にＩｇＭ応答（該ＬＮＰの投与後約９６時間で始まる）を開始することができ、その後、ＩｇＧ応答（該ＬＮＰの投与後約１４日で始まる）と同時にメモリー応答を開始することができる。従って、従来のＢ細胞は、投与された薬剤に対して反応し、ＡＢＣを媒介するＩｇＭ（及び最終的にＩｇＧ）に寄与する。該ＩｇＭ及びＩｇＧは、通常、抗ＰＥＧ ＩｇＭ及び抗ＰＥＧ ＩｇＧである。
ある場合には、ＡＢＣ応答の大部分は、Ｂ１ａ細胞及びＢ１ａが媒介する免疫応答を介して媒介されることが企図される。さらに、ある場合には、該ＡＢＣ応答は、ＩｇＭ及びＩｇＧの両方によって媒介され、従来のＢ細胞及びＢ１ａ細胞の両方がかかる効果を媒介することが企図される。さらに他の場合には、該ＡＢＣ応答は、天然のＩｇＭ分子によって媒介され、それらのいくつかは、活性化されたＢ１ａ細胞によって産生され得る天然のＩｇＭに結合することが可能である。該天然のＩｇＭは、該ＬＮＰの１つ以上の成分に結合し得る。例えば、該ＬＮＰのリン脂質成分に結合（例えば、該リン脂質のＰＣ部分に結合）及び／または該ＬＮＰのＰＥＧ−脂質成分に結合（例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧに結合、特に、ＰＥＧ−ＤＭＧのＰＥＧ部分に結合）し得る。Ｂ１ａはホスファチジルコリンがリガンドであるＤ３６を発現するため、該ＣＤ３６の受容体が、Ｂ１ａ細胞の活性化、ひいては天然のＩｇＭの産生を媒介し得ることが企図される。さらに他の場合には、該ＡＢＣ応答は、従来のＢ細胞によって主に媒介される。
本発明によれば、該ＡＢＣ現象は、少なくとも一部、Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物（例えば、薬剤、送達媒体、及び製剤）の使用を通して低減または無効にすることができることが分かった。Ｂ１ａ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、本明細書ではＢ１ａ不活性化合物及び組成物と呼ばれ得る。さらに、本発明によれば、該ＡＢＣ現象は、少なくとも一部、従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物の使用を通して低減または無効にすることができることが分かった。従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、いくつかの実施形態において、本明細書ではＣＤ１９不活性化合物及び組成物と呼ばれ得る。従って、本明細書に提供するいくつかの実施形態では、該化合物及び組成物は、Ｂ１ａ細胞を活性化せず、また、それらは従来のＢ細胞を活性化しない。Ｂ１ａ細胞及び従来のＢ細胞を活性化しない化合物及び組成物は、いくつかの実施形態において、本明細書ではＢ１ａ／ＣＤ１９不活性化合物及び組成物と呼ばれ得る。
これらの基本的機序は、これまで理解されておらず、また、この現象におけるＢ１ａ及びＢ１ｂ細胞の役割ならびにそれらの従来のＢ細胞との相互作用もまた理解されていなかった。
従って、本開示は、ＡＢＣを促進しない化合物及び組成物を提供する。これらはさらに、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞、血小板及び／またはｐＤＣ、ならびに任意に従来のＢ細胞も同様に活性化することができないことを特徴とし得る。これらの化合物（例えば、生物活性剤、例えば、予防薬、治療薬及び診断薬を含めた薬剤、リポソーム、脂質ナノ粒子、及び他の脂質系封入構造を含めた送達媒体等）ならびに組成物（例えば、製剤等）は、反復投与を要する用途にとって、特に、短期間内（例えば、１〜２週間以内）に行われる反復投与に特に望ましい。これは、例えば、該薬剤が、規則的な短い間隔で対象に提供される核酸系治療薬の場合である。本明細書で提供する知見は、同様に投与される、及び／またはＡＢＣにさらされるこれら及び他の薬剤に適用され得る。
特に重要なのは、脂質含有化合物、脂質含有粒子、及び脂質含有組成物であり、これらはＡＢＣの影響を受けやすいことが知られている。かかる脂質含有化合物、粒子、及び組成物は、生物活性剤またはかかる薬剤の送達媒体として広く使用されている。従って、かかる薬剤の有効性を改善する能力は、ＡＢＣが該薬剤自体に与える影響を低減することによるか、その送達媒体に与える影響を低減することによるかにかかわらず、多種多様な活性薬剤にとって有益である。
本明細書では、１つ以上の生物活性剤の反復投与と関連する急性期反応（ＡＲＰ）を刺激も増強もしない組成物も提供する。
該組成物は、ある場合には、天然のＩｇＭが挙げられるがこれに限定されないＩｇＭに結合しない場合がある。
該組成物は、ある場合には、Ｃ反応性タンパク質等であるがこれに限定されない急性期タンパク質に結合しない場合がある。
該組成物は、ある場合には、ＣＤ５（＋）が媒介する免疫応答を引き起こさない場合がある。本明細書で使用される、ＣＤ５（＋）が媒介する免疫応答とは、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞が媒介する免疫応答である。かかる応答には、ＡＢＣ応答、急性期反応、天然のＩｇＭ及び／またはＩｇＧの誘導等が含まれ得る。
該組成物は、ある場合には、ＣＤ１９（＋）が媒介する免疫応答を引き起こさない場合がある。本明細書で使用される、ＣＤ１９（＋）が媒介する免疫応答とは、従来のＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（−）Ｂ細胞が媒介する免疫応答である。かかる応答には、ＩｇＭの誘導、ＩｇＧの誘導、記憶Ｂ細胞の誘導、ＡＢＣ応答、タンパク質がＬＮＰ内に封入され得る抗タンパク質応答を含めた抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答等が含まれ得る。
Ｂ１ａ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞のサブセットである。これらの細胞は、血中ＩｇＭの原料であり、天然の抗体または天然の血清抗体と呼ばれる。天然のＩｇＭ抗体は、多くの抗原に対して弱い親和性を有することを特徴とし、それ故、「多特異性」または「多反応性」と呼ばれ、２つ以上の抗原に結合するそれらの能力を示している。Ｂ１ａ細胞は、ＩｇＧを産生することができない。さらに、それらは記憶細胞にならないため、適応免疫応答に寄与しない。しかしながら、それらは活性化されるとＩｇＭを分泌することができる。分泌されたＩｇＭは、通常、約２〜３週間以内に除去され、その時点で該免疫系は、すでに投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原がこの期間の後（例えば、最初の曝露後約３週間）に提示された場合、該抗原は急速には除去されない。しかしながら、重要なことには、該抗原がその期間内（例えば、２週間以内、１週間以内、または数日以内等）に提示された場合、該抗原は急速に除去される。この連続投与間の先延ばしが、ある特定の脂質含有治療薬または診断薬を使用に適さなくしている。
ヒトでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ２０（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４３（＋）、ＣＤ７０（−）及びＣＤ５（＋）である。マウスでは、Ｂ１ａ細胞は、ＣＤ１９（＋）、ＣＤ５（＋）、及びＣＤ４５Ｂ細胞アイソフォームＢ２２０（＋）である。通常、Ｂ１ａ細胞を他の従来のＢ細胞と区別するのはＣＤ５の発現である。Ｂ１ａ細胞は、高レベルのＣＤ５を発現する場合があり、これを基にして、低レベルまたは検出できないレベルのＣＤ５を発現するＢ−１ｂ細胞等の他のＢ−１細胞と区別され得る。ＣＤ５は、汎Ｔ細胞表面糖タンパク質である。Ｂ１ａ細胞は、脂肪酸トランスロカーゼとしても知られるＣＤ３６も発現する。ＣＤ３６は、クラスＢスカベンジャー受容体ファミリーの成員である。ＣＤ３６は、酸化低密度リポタンパク質、天然のリポタンパク質、酸化リン脂質、及び長鎖脂肪酸を含めた多くのリガンドに結合することができる。
Ｂ１ｂ細胞は、自然免疫に関与するＢ細胞の別のサブセットである。これらの細胞は、血中の天然のＩｇＭの別の供給源である。ＰＳを含めたいくつかの抗原は、Ｂ１ｂの活性化を通してＴ細胞とは無関係の免疫を誘導することが可能である。ＣＤ２７は、通常、抗原活性化に応答してＢ１ｂ細胞で上方制御される。Ｂ１ａ細胞と同様、Ｂ１ｂ細胞は、通常、脾臓や腹腔等の特定の体の部位にあり、血中にはごく少量である。該Ｂ１ｂが分泌した天然のＩｇＭは通常、約２〜３週間で除去され、その時点で該免疫系は、すでに投与された抗原に対して比較的ナイーブになる。同じ抗原がこの期間の後（例えば、最初の曝露後約３週間）に提示された場合、該抗原は急速には除去されない。しかしながら、重要なことには、該抗原がその期間内（例えば、２週間以内、１週間以内、または数日以内等）に提示された場合、該抗原は急速に除去される。この連続投与間の先延ばしが、ある特定の脂質含有治療薬または診断薬を使用に適さなくしている。
いくつかの実施形態では、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞の活性化を遮断することが望ましい。Ｂ１ａ細胞及び／またはＢ１ｂ細胞の活性化を遮断するための１つの方法は、脂質ナノ粒子のどの成分がＢ細胞の活性化を促進するかを特定し、それらの成分を中和することを含む。本明細書では、少なくともＰＥＧ及びホスファチジルコリン（ＰＣ）がＢ１ａ及びＢ１ｂ細胞の他の細胞との相互作用及び／または活性化に寄与することが分かった。ＰＥＧは、Ｂ１細胞及び血小板の間の凝集の促進に関与する可能性があり、これが活性化につながり得る。ＰＣ（ＬＮＰのヘルパー脂質）もまた、おそらくＢ細胞表面のＣＤ３６受容体との相互作用を介したＢ１細胞の活性化に関与している。多くの粒子がＰＥＧ−脂質代替物を有し、ＰＥＧレス、及び／またはＰＣ置換脂質（例えば、オレイン酸またはそのアナログ）が設計及び試験されている。出願者は、反復投与に際してＡＢＣを促進するＬＮＰ内のこれら成分の１つ以上を置換することが、天然のＩｇＭの産生及び／またはＢ細胞の活性化を低減させることによるＡＢＣの防止に有用であることを確証した。従って、本発明は、Ｂ細胞の誘因の包含を排除する設計の結果として、ＡＢＣが減少したＬＮＰを包含する。
Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞の活性化を遮断する別の方法は、ＬＮＰが誘導する免疫応答を阻害する薬剤の使用を含む。これらのタイプの薬剤を以下に詳細に論じる。いくつかの実施形態では、これらの薬剤は、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ細胞と該ＬＮＰまたは血小板またはｐＤＣ間の相互作用を遮断する。例えば、該薬剤は、該相互作用を物理的に遮断する抗体または他の結合剤であり得る。これの例は、ＣＤ３６またはＣＤ６に結合する抗体である。該薬剤は、活性化後または活性化前にＢ１ａ／Ｂ１ｂ細胞のシグナル伝達を防止または無効にする化合物でもあり得る。例えば、Ｂ細胞とＬＮＰまたは他の免疫細胞との相互作用の結果であるＢ１ａ／Ｂ１ｂシグナル伝達カスケードにおける１つ以上の成分を遮断することが可能である。他の実施形態では、該薬剤は、活性化後のＢ１ａ／Ｂ１ｂ細胞によって産生される１つ以上のエフェクターに作用し得る。これらのエフェクターとしては、例えば、天然のＩｇＭ及びサイトカインが挙げられる。
本発明の態様によれば、ｐＤＣ細胞の活性化が遮断された場合、ＬＮＰに応答したＢ細胞活性化は低下することが証明されている。従って、ＡＢＣ及び／または毒性を回避するためには、ｐＤＣの活性化を防止することが望ましい場合がある。上記の方法と同様、ｐＤＣ細胞の活性化は、ｐＤＣとＬＮＰ及び／またはＢ細胞／血小板間の相互作用を妨げる薬剤によって遮断され得る。代替的に、ｐＤＣに対して、活性化される能力を遮断するように作用する、またはそのエフェクターに作用する薬剤を該ＬＮＰとともに使用してＡＢＣを回避することができる。
血小板もまた、ＡＢＣ及び毒性に重要な役割を果たし得る。ＬＮＰの初回用量が対象に投与された後、極めて迅速に血小板は該ＬＮＰと会合し、凝集し、活性化される。いくつかの実施形態では、血小板の凝集及び／または活性化を遮断することが望ましい。血小板の凝集及び／または活性化を遮断するための１つの方法は、脂質ナノ粒子のどの成分が血小板の凝集及び／または活性化を促進するかを特定し、それらの成分を中和することを含む。本明細書では、少なくともＰＥＧが血小板の凝集、活性化及び／または他の細胞との相互作用に寄与することが発見された。多くの粒子がＰＥＧ−脂質代替物を有し、ＰＥＧレスが設計及び試験されている。出願者は、反復投与に際してＡＢＣを促進するＬＮＰ内のこれら成分の１つ以上を置換することが、天然のＩｇＭの産生及び／または血小板凝集を低減させることによるＡＢＣの防止に有用であることを確証した。従って、本発明は、血小板の誘因の包含を排除する設計の結果として、ＡＢＣが減少したＬＮＰを包含する。代替的に、血小板に対して、活性化された後にその活性を遮断するように作用する、またはそのエフェクターに作用する薬剤を該ＬＮＰとともに使用してＡＢＣを回避することができる。
（ｉ）ＡＢＣ活性及び関連する活性の測定
ＬＮＰを含めた本明細書に提供する様々な化合物及び組成物は、インビボ投与に際してＡＢＣ活性を促進しない。これらのＬＮＰは、多くのアッセイ、例えば、これらに限定されないが、下記のもののいずれか、及び実施例の方法のサブセクションを含めた実施例のセクションに開示のアッセイのいずれかを通して特徴づけられ及び／または特定され得る。
いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＢＣを促進する免疫応答を生じることなくＬＮＰを投与することを含む。ＡＢＣを促進する免疫応答には、１つ以上のセンサー、例えば、Ｂ１細胞、ｐＤＣ、または血小板、及び１つ以上のエフェクター、例えば、天然のＩｇＭ、天然のＩｇＧまたはサイトカイン、例えば、ＩＬ６の活性化が含まれる。従って、ＡＢＣを促進する免疫応答を生じることのないＬＮＰの投与は、最低でも、１つ以上のセンサーの有意な活性化、及び１つ以上のエフェクターの有意な産生のないＬＮＰの投与を含む。この状況で使用される有意なとは、ＡＢＣを引き起こすＬＮＰの２回目の投与で予想される血液クリアランスのレベルと比較して、２回目の投与のすべてまたは一部の加速血液クリアランスの生理学的影響につながる量を指す。例えば、該免疫応答は、２回目の用量の後に認められるＡＢＣが、ＡＢＣを引き起こすＬＮＰで予想されていたものより低いように、減弱されるべきである。
（ｉｉ）Ｂ１ａまたはＢ１ｂ活性化アッセイ
本開示で提供するある特定の組成物は、Ｂ細胞、例えば、Ｂ１ａもしくはＢ１ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５＋）及び／または従来のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ５−）を活性化しない。Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、多くの方法で測定される場合があり、そのいくつかを以下に示す。Ｂ細胞集団は、脾細胞または末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）の分画Ｂ細胞集団または未分画集団として提供され得る。後者の場合、該細胞集団を、最適なＬＮＰと一定期間インキュベートし、その後、さらなる分析用に採取してもよい。代替的に、上清を採取して分析してもよい。
（ｉｉｉ）活性化マーカーの細胞表面発現の上方制御
Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞、または従来のＢ細胞の活性化は、ＣＤ８６等の後期活性化マーカーを含めたＢ細胞活性化マーカーの発現の増加として示され得る。例示的な非限定的なアッセイでは、未分画Ｂ細胞は、脾細胞集団として、またはＰＢＭＣ集団として提供され、最適なＬＮＰとともに特定の期間インキュベートされ、その後基準のＢ細胞マーカー、例えば、ＣＤ１９について、及び活性化マーカー、例えば、ＣＤ８６について染色され、例えば、フローサイトメトリーを用いて分析される。適切な陰性対照は、同じ集団を培地とともにインキュベートし、その後同じ染色及び可視化ステップを行うことを含む。該陰性対照と比較した試験集団のＣＤ８６発現の増加は、Ｂ細胞の活性化を示す。
（ｉｖ）炎症性サイトカインの放出
Ｂ細胞活性化は、サイトカイン放出アッセイでも評価され得る。例えば、活性化は、目的のＬＮＰによる曝露後の、ＩＬ−６及び／またはＴＮＦ−アルファ等のサイトカインの産生及び／または分泌を通して評価され得る。
かかるアッセイは、当技術分野で周知の所定のサイトカイン分泌アッセイを用いて行われ得る。サイトカイン分泌の増加は、Ｂ細胞活性化を示す。
（ｖ）ＬＮＰのＢ細胞との結合／会合及び／またはＢ細胞による取り込み
目的のＬＮＰを評価するため、及びさらにかかるＬＮＰを特徴づけるため、ＬＮＰのＢ細胞との会合または結合を用いてもよい。会合／結合及び／または取り込み／内在化は、検出可能に標識化された、例えば、蛍光標識されたＬＮＰを用い、様々なインキュベーション時間の後にＢ細胞内またはＢ細胞上のかかるＬＮＰの位置を追跡することによって評価され得る。
本発明はさらに、本明細書に提供する組成物が、下流のＡＢＣのメディエーター、例えば、血中ＩｇＭ及び／または急性期反応メディエーター、例えば、急性期タンパク質（例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ））による認識または検出及び任意に結合を回避することが可能であり得ることを企図する。
（ｖｉ）ＡＢＣを低減するための使用方法
本明細書では、治療薬等の薬剤を封入し得るＬＮＰを、ＡＢＣを促進することなく対象に送達する方法も提供する。
いくつかの実施形態では、該方法は、ＡＢＣを促進しない、例えば、該ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭの産生を誘導しない、Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しない、本明細書に記載のＬＮＰのいずれかを投与することを含む。本明細書で使用される、「ＡＢＣを促進しない」ＬＮＰとは、実質的なＡＢＣを引き起こす免疫応答を誘導しないＬＮＰまたは、実質的なＡＢＣを引き起こすのに十分でない実質的に低レベルの免疫応答を誘導するＬＮＰを指す。当該ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭの産生を誘導しないＬＮＰとは、該ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭを誘導しないＬＮＰまたは実質的なＡＢＣを引き起こすには不十分な実質的に低レベルの天然のＩｇＭ分子を誘導するＬＮＰのいずれかを指す。Ｂ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞を活性化しないＬＮＰとは、該ＬＮＰに結合する天然のＩｇＭを産生するためのＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ細胞の応答を誘導しないＬＮＰまたは実質的なＡＢＣを引き起こすには不十分な実質的に低レベルのＢ１ａ及び／またはＢ１ｂ応答を誘導するＬＮＰを指す。
いくつかの実施形態では、活性化しない及び産生を誘導しないという用語は、基準値または状態に対する相対的な低下である。いくつかの実施形態では、該基準値または状態は、標準的なＬＮＰ、例えば、ＭＣ３ ＬＮＰによるＩｇＭ等の分子の活性化またはその産生の誘導の量である。いくつかの実施形態では、該相対的な低下は、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の低下である。他の実施形態では、Ｂ細胞等の細胞を活性化しない及びＩｇＭ等のタンパク質の産生を誘導しないという用語は、該活性細胞または該特定のタンパク質の検出できない量を指す場合がある。
（ｖｉｉ）血小板効果及び毒性
本発明はさらに、ＬＮＰの投与と関連する用量制限毒性の基礎にある機序の解明に部分的に基づいている。かかる毒性には、急性か慢性にかかわらず、凝固障害、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ、消費性凝固障害とも呼ばれる）、及び／または血管内血栓が含まれ得る。ある場合には、ＬＮＰと関連する用量制限毒性は、急性期反応（ＡＰＲ）または補体活性化関連の仮性アレルギー（ＣＡＲＰＡ）である。
本明細書で使用される、凝固障害とは、インビボでの凝固（凝血）の増加を指す。本開示で報告する知見は、かかる凝固の増加と一致し、基礎にある機序の洞察を有意に提供する。凝固とは、多くの異なる要因及び細胞型に関与するプロセスであり、これまで、ＬＮＰと血小板の関係及び相互作用はこれに関して理解されていなかった。本開示は、かかる相互作用の証拠を提供し、また、血小板の会合の減少、血小板の凝集の減少、及び／または血小板の凝集の減少を含めた血小板効果の減少を有するように修飾された化合物及び組成物も提供する。かかる血小板効果を、好ましくは下方調節することを含む調節能力は、ＬＮＰ投与後の凝固障害の発生率及び／または重症度を低下し得る。これは次に、かかるＬＮＰに関係する毒性を低下させ、それにより、ＬＮＰの用量の増加及び、重要なことには、必要とする患者に投与されるそれらのカーゴの用量の増加を可能にする。
ＣＡＲＰＡは、ナノ医療薬及び生物学的製剤が引き起こし得る過敏症反応（ＨＳＲ）で現れる急性免疫毒性の一種である。アレルギー反応とは異なり、ＣＡＲＰＡは通常、ＩｇＥに関与しないが、身体が病原体を除去する能力を高める自然免疫系の一部である補体系の活性化の結果として生じる。以下の経路の１つ以上、すなわち、古典的補体経路（ＣＰ）、第二経路（ＡＰ）、及びレクチン経路（ＬＰ）は、ＣＡＲＰＡに関与している可能性がある。Ｓｚｅｂｅｎｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６１：１６３−１７３（２０１４）。
該古典的経路は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、またはＣ１ｑｒ２ｓ２を含むＣ１複合体の活性化によって引き起こされる。Ｃ１複合体の活性化は、Ｃ１ｑがＩｇＭまたはＩｇＧと抗原の複合体に結合した場合、またはＣ１ｑが病原体の表面に直接結合した場合に生じる。かかる結合は、Ｃ１ｑ分子の立体配座の変化を引き起こし、これがＣ１ｒの活性化を引き起こし、これが次にＣ１ｓを切断する。該Ｃ１ｒ２ｓ２成分が今度はＣ４及びその後Ｃ２を分割し、Ｃ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ、及びＣ２ｂを産生する。Ｃ４ｂ及びＣ２ｂは、結合して古典的経路Ｃ３コンベルターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ複合体）を形成し、これがＣ３のＣ３ａ及びＣ３ｂへの切断を促進する。Ｃ３ｂはその後Ｃ３コンベルターゼに結合し、Ｃ５コンベルターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ３ｂ複合体）を形成する。該第二経路は、自発的なＣ３加水分解の結果として継続的に活性化される。Ｐ因子（プロパージン）は、第二経路の正の調節因子である。プロパージンのオリゴマー化でＣ３コンベルターゼが安定化され、これがその後より多くのＣ３を切断し得る。該Ｃ３分子は、表面に結合し、より多くのＢ、Ｄ、及びＰ活性を動員し、補体活性化の増幅を引き起こし得る。
急性期反応（ＡＰＲ）は、感染を防ぎ、潜在的な病原体を除去するための複雑な全身自然免疫応答である。多くのタンパク質が、ＡＰＲに関与し、Ｃ反応性タンパク質は、よく特徴づけられたものである。
本発明によれば、ある特定のＬＮＰは、インビボ投与のほぼ直後に血小板と物理的に会合することが可能であるが、他のＬＮＰは、血小板と全く会合しないか、またはバックグラウンドレベルでしか会合しないことが分かった。重要なことには、血小板と会合するＬＮＰはまた、その後形成される血小板凝集体を明らかに安定化もする。該血小板と、ある特定のＬＮＰとの物理的接触は、投与後にかかる血小板が凝集されたままである能力または長時間継続して凝集体を形成する能力と相関する。かかる凝集体は、活性化された血小板、ならびに自然免疫細胞、例えば、マクロファージ及びＢ細胞を含む。
２３．使用方法
本明細書に記載のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、ＰＡＨ関連の疾患、障害または状態の治療及び／または予防のための調製、製造及び治療的使用に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物及び製剤は、高フェニルアラニン血症の治療及び／または予防に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、組成物及び製剤は、フェニルケトン尿症を治療及び／または予防するために使用される。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、フェニルアラニンのレベルの低下の、それを必要とする対象における方法に使用される。例えば、本発明の１つの態様は、対象におけるＰＫＵの症状を緩和する方法を提供し、該方法は、ＰＡＨをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）を含む組成物または製剤をその対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、フェニルアラニンのレベルを低下させるために使用され、該方法は、該対象に対して、ＰＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与により、フェニルアラニンのレベルが、１，２００μＭ未満（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５μＭ）に、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与後短期間で（例えば、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約１６時間以内、約２０時間以内、または約２４時間以内に）低下する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の有効量の投与で、ＰＫＵのバイオマーカーのレベルが低下する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与により、１つ以上のＰＫＵのバイオマーカーのレベルが、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与後短期間で（例えば、約６時間以内、約８時間以内、約１２時間以内、約１６時間以内、約２０時間以内、または約２４時間以内に）低下する。
補充療法は、ＰＫＵの潜在的な治療法である。従って、本発明のある特定の態様では、本明細書に開示のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ＰＫＵに対する遺伝子置換療法に使用するのに適したＰＡＨポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＰＡＨまたはＰＡＨ活性の欠如、またはＰＡＨ活性の低下もしくは異常を、ポリヌクレオチド、例えば、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、該対象に提供することによって治療する。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列最適化される。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＰＡＨポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、ここで、例えば、そのＧ／Ｃ、ウリジン、またはチミジン含量を修飾することによって、該核酸は、配列最適化され、及び／または該ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲＮＡ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤を含む組成物または製剤の対象への投与により、血中／血漿中のフェニルアラニンが、該組成物または製剤の投与前に認められるレベルより、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％低いレベルに低下する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与により、当該対象の細胞においてＰＡＨが発現する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与により、当該対象におけるＰＡＨの発現及び／または酵素活性が増加する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤の対象への投与方法に使用され、該方法により、対象の少なくとも一部の細胞におけるＰＡＨの発現及び／または酵素活性が増加する。
いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物または製剤の対象への投与により、対象の細胞におけるＰＡＨの発現及び／または酵素活性が、正常な対象、例えば、ＰＫＵに罹患していないヒトにおいて予想される発現及び／または活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％またはそれ以上のレベルまで増加する。
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物または製剤の投与により、対象の細胞の少なくとも一部においてＰＡＨタンパク質が発現し、これは、有意なフェニルアラニン代謝を生じさせるのに十分な時間持続する。
いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドの発現は増加する。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、細胞におけるＰＡＨの発現及び／または酵素活性のレベルを、これら細胞に導入された際に、例えば、該ポリペプチドが該細胞に導入される前の該細胞におけるＰＡＨの発現及び／または酵素活性のレベルに対して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％増加させる。
いくつかの実施形態では、該方法または使用は、配列番号２及び５〜２０の群から選択されるポリヌクレオチドに対して配列類似性を有するヌクレオチド配列、または配列番号２２〜３８の群から選択されるポリヌクレオチドであって、ＰＡＨポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む。
本開示の他の態様は、ポリヌクレオチドを含む細胞の哺乳類対象への移植に関する。哺乳類対象への細胞の投与は、当業者には既知であり、これに含まれるのは、局所移植（例えば、局所投与または皮下投与）、器官送達または全身注入（例えば、静脈内注射または吸入）、及び医薬的に許容される担体中での細胞の製剤であるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、医薬組成物及び製剤は、本明細書に開示のＰＡＨポリペプチドをコードするウラシル修飾配列、ならびに本明細書に開示のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、該ＰＡＨポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、Ｎ１−メチルプソイドウラシルまたは５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＰＡＨポリペプチドをコードするウラシル修飾配列における核酸塩基（例えば、ウラシル）のタイプの少なくとも９５％は、修飾された核酸塩基である。いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるウラシルの少なくとも９５％は、１−Ｎ−メチルプソイドウリジンまたは５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤とともに製剤化される。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０または約５０：１０：３８．５：１．５で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、約３０〜約６０ｍｏｌ％の化合物ＩＩもしくはＶＩ（または関連する適切なアミノ脂質）（例えば、３０〜４０、４０〜５０、４５〜５０、５０〜５５または５５〜６０ｍｏｌ％の化合物ＩＩもしくはＶＩ（または関連する適切なアミノ脂質））、約５〜約２０ｍｏｌ％のリン脂質（または関連する適切なリン脂質もしくは「ヘルパー脂質」）（例えば、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０ｍｏｌ％のリン脂質（または関連する適切なリン脂質もしくは「ヘルパー脂質」）、約２０〜約５０ｍｏｌ％のコレステロール（または関連するステロールもしくは「非カチオン性」脂質）（例えば、約２０〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、もしくは４５〜５０ｍｏｌ％のコレステロール（または関連するステロールもしくは「非カチオン性」脂質））及び約０．０５〜約１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質）（例えば、０．０５〜１、１〜２、２〜３、３〜４、４〜５、５〜７、もしくは７〜１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質（または他の適切なＰＥＧ脂質））の範囲のモル比で含む。例示的な送達剤は、例えば、モル比４７．５：１０．５：３９．０：３．０または５０：１０：３８．５：１．５からなり得る。ある特定の例では、例示的な送達剤は、例えば、モル比４７．５：１０．５：３９．０：３、４７．５：１０：３９．５：３、４７．５：１１：３９．５：２、４７．５：１０．５：３９．５：２．５、４７．５：１１：３９：２．５、４８．５：１０：３８．５：３、４８．５：１０．５：３９：２、４８．５：１０．５：３８．５：２．５、４８．５：１０．５：３９．５：１．５、４８．５：１０．５：３８．０：３、４７：１０．５：３９．５：３、４７：１０：４０．５：２．５、４７：１１：４０：２、４７：１０．５：３９．５：３、４８：１０．５：３８．５：３、４８：１０：３９．５：２．５、４８：１１：３９：２、または４８：１０．５：３８．５：３から構成され得る。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩまたはＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０または約５０：１０：３８．５：１．５で含む。
当業者には、本発明の薬物または治療の治療有効性は、対象から（例えば、前臨床試験対象（げっ歯類、霊長類等）または臨床対象（ヒト）から）採取したサンプル（複数可）におけるコードされたタンパク質（例えば、酵素）の発現レベルを測定することによって特徴づけられる場合も特定される場合もあることが理解されよう。同様に、本発明の薬物または治療の治療有効性は、対象から（例えば、前臨床試験対象（げっ歯類、霊長類等）または臨床対象（ヒト）から）採取したサンプル（複数可）におけるコードされたタンパク質（例えば、酵素）の活性レベルを測定することによって特徴づけられる場合も特定される場合もある。さらに、本発明の薬物または治療の治療有効性は、対象から採取したサンプル（複数可）における適切なバイオマーカーのレベルを測定することによって特徴づけられる場合も特定される場合もある。タンパク質及び／またはバイオマーカーのレベルは、本発明のｍＲＮＡ治療薬の単回投与後に特定される場合もあれば、単回投与後のいくつかの時点で特定及び／または観察される場合も、治療、例えば、複数回投与治療の全期間にわたって、特定及び／または観察される場合もある。
ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換する能力の低下と関連している。従って、ＰＫＵ患者は通常、高レベルの血中フェニルアラニンを示す。
ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換する能力がないことを特徴とする常染色体劣性先天性アミノ酸代謝障害である。従って、ＰＫＵ患者は、該障害の無症候性キャリアである場合もあれば、該疾患に関連する様々な症状に苦しむ場合もある。ＰＫＵ患者は通常、血漿、血清、尿、及び／または組織（例えば、肝臓）中で高レベルのフェニルケトン（フェニルアラニン代謝が低下した場合に第二経路を介して産生される）を示す。特に指定しない限り、本明細書に開示のＰＫＵ患者またはヒト対象の治療方法には、無症候性キャリア及び異常なレベルのバイオマーカーを有する個体の両方の治療が含まれる。
ＰＡＨタンパク質の発現レベル
本発明のある特定の態様は、対象、例えば、動物（例えば、げっ歯類、霊長類等）またはヒト対象におけるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質の発現レベル（複数可）の測定、特定及び／または観察を特徴とする。動物としては、正常、健康または野生型動物、ならびにＰＫＵの理解及びその治療に使用するための動物モデルが挙げられる。例示的な動物モデルとしては、げっ歯類モデル、例えば、ＰＡＨマウスとも呼ばれるＰＡＨ欠損マウスが挙げられる。
ＰＡＨタンパク質の発現レベルは、例えば、血液サンプルまたは針生検由来の生体サンプル中のタンパク質レベルを特定するための当技術分野で承認されている任意の方法で測定または特定され得る。本明細書で使用される、「レベル」または「タンパク質レベル」という用語は、好ましくは、サンプルまたは対象中のタンパク質の重量、質量または濃度を意味する。当業者には、ある特定の実施形態において、該サンプルが、例えば、以下のいずれか、すなわち、精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離及び／またはＨＰＬＣに供され、続いて、例えば、質量分析及び／または分光分析を用いた該タンパク質のレベルの特定に供され得ることが理解されよう。例示的な実施形態では、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてタンパク質の発現レベルを特定することができる。他の例示的な実施形態では、タンパク質精製、分離及びＬＣ−ＭＳを、本発明のタンパク質のレベルを特定するための手段として使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療（例えば、単回静脈内投与）により、当該対象の肝臓組織におけるＰＡＨタンパク質の発現レベルが、該ｍＲＮＡ治療の単回投与後、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間の間増加する（例えば、正常なレベルの２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍の増加及び／または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも１００％まで増加する）。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療（例えば、単回静脈内投与）により、当該対象の血液、血漿、または肝臓組織におけるフェニルアラニンの発現レベルが、該ｍＲＮＡ治療の単回投与後、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも８４時間、少なくとも９６時間、少なくとも１０８時間、少なくとも１２２時間の間低下する（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、１０２５、１０５０、１０７５、１１００、１１２５、１１５０、１１７５または１，２００μＭ未満）。
ＰＡＨタンパク質活性
ＰＫＵ患者では、ＰＡＨ酵素活性が、正常な生理的活性レベルと比較して低下している。本発明のさらなる態様は、対象、例えば、動物（例えば、げっ歯類、霊長類等）またはヒト対象におけるＰＡＨタンパク質の活性レベル（複数可）（すなわち、酵素活性レベル（複数可））の測定、特定及び／または観察を特徴とする。活性レベルは、生体サンプル中の酵素活性レベルを特定するための当技術分野で承認されている任意の方法で測定または特定され得る。本明細書で使用される、「活性レベル」または「酵素活性レベル」という用語は、好ましくは、サンプルの体積、質量もしくは重量、またはサンプル中の総タンパク質当たりの酵素活性を意味する。例示的な実施形態では、該「活性レベル」または「酵素活性レベル」は、液体（例えば、体液、例えば、血清、血漿、尿等）の１ミリリットル当たりの単位を単位として記載されるか、または、サンプル中の組織の重量当たりの単位もしくはタンパク質（例えば、総タンパク質）の重量当たりの単位を単位として記載される。酵素活性の単位（「Ｕ」）は、単位時間当たりに加水分解される基質の重量または質量を単位として記載され得る。本発明のある特定の実施形態では、Ｕ／ｍｌ血漿またはＵ／ｍｇタンパク質（組織）を単位として記載されるＰＡＨ活性を特徴とし、ここで、単位（「Ｕ」）は、１時間当たりに加水分解されるｎｍｏｌの基質（すなわち、ｎｍｏｌ／時間）を単位として記載される。
ある特定の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療は、投与後６〜１２時間、または１２〜２４時間、２４〜４８時間、または４８〜７２時間で（例えば、投与後４８または７２時間で）、組織（例えば、肝臓）において、少なくとも５Ｕ／ｍｇ、少なくとも１０Ｕ／ｍｇ、少なくとも２０Ｕ／ｍｇ、少なくとも３０Ｕ／ｍｇ、少なくとも４０Ｕ／ｍｇ、少なくとも５０Ｕ／ｍｇ、少なくとも６０Ｕ／ｍｇ、少なくとも７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも８０Ｕ／ｍｇ、少なくとも９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも１５０Ｕ／ｍｇのＰＡＨ活性をもたらすのに有効なｍＲＮＡの用量を含む医薬組成物を特徴とする。
例示的な実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療は、上記の活性レベルをもたらすｍＲＮＡの単回静脈内投与量を含む医薬組成物を特徴とする。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療は、上記の活性レベルを維持する複数のｍＲＮＡの単回単位静脈内投与量で投与され得る医薬組成物を特徴とする。
ＰＡＨのバイオマーカー
本発明のさらなる態様は、あるサンプルにおいて特定されるバイオマーカーのレベル（複数可）を、例えば、同じ患者由来、別の患者由来、対照由来及び／または同じもしくは異なる時点由来の別のサンプルにおける同じもしくは別のバイオマーカーのレベル（例えば、参照レベル）と比較して、及び／または生理的レベル、及び／またはレベルの上昇、及び／または超生理学的なレベル、及び／または対照のレベルと比較して特定することを特徴とする。当業者であれば、バイオマーカーの生理的レベル、例えば、正常もしくは野生型動物、正常もしくは健常な対象等におけるレベル、特に、健康及び／または正常に機能する対象に特有のレベル（複数可）に詳しいであろう。本明細書で使用される、「レベルの上昇」という句は、正常もしくは野生型の前臨床動物において、または正常もしくは健常な対象、例えば、ヒト対象において通常見られるより多い量を意味する。本明細書で使用される、「超生理学的」という用語は、正常もしくは野生型の前臨床動物において、または正常もしくは健常な対象、例えば、ヒト対象において通常見られるより多い量を意味し、任意に、有意に上昇した生理反応を生成する。本明細書で使用される、「比較して（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）」または「比較して（ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ）」という用語は、好ましくは、例えば、バイオマーカー（複数可）のレベルの２つ以上の値の数学的比較を意味する。従って、当業者には、少なくとも２つのかかる値を互いに比較した場合、該値の１つが別の値または値の群より高いか、低いか、または同一であるかどうかが容易に分かるであろう。例えば、対照値と比較するという観点から、比較して（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）または比較して（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ）は、例えば、投与前の当該対象（例えば、ＰＫＵの患者）または正常もしくは健常な対象における参照の血液、血清、血漿、及び／または組織（例えば、肝臓）のフェニルアラニンレベルと比較してであり得る。例えば、対照値と比較するという観点から、比較して（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）または比較して（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ）はまた、例えば、投与前の当該対象（例えば、ＰＫＵの患者）または正常もしくは健常な対象における参照の血液、血清、血漿、及び／または組織（例えば、肝臓）のＰｈｅレベルと比較してでもあり得る。
本明細書で使用される、「対照」とは、好ましくは、対象由来のサンプルであって、当該対象のＰＫＵ状態が既知であるサンプルである。１つの実施形態では、対照は、健常な患者のサンプルである。別の実施形態では、該対照は、既知のＰＫＵ状態を有する少なくとも１つの対象、例えば、重度、軽度、または健常なＰＫＵ状態、例えば、対照患者由来のサンプルである。別の実施形態では、該対照は、ＰＫＵの治療を受けていない対象由来のサンプルである。さらなる実施形態では、該対照は、単一の対象由来のサンプル、または異なる対象由来のサンプルのプール及び／または異なる時点で対象（複数可）から採取したサンプルである。
本明細書で使用される、「レベル」または「バイオマーカーのレベル」という用語は、好ましくは、サンプルまたは対象内の本発明のバイオマーカーの質量、重量または濃度を意味する。当業者には、ある特定の実施形態において、該サンプルが、例えば、以下の１つ以上、すなわち、物質の精製、沈殿、分離、例えば、遠心分離及び／またはＨＰＬＣに供され、続いて、例えば、質量分光分析を用いた該バイオマーカーのレベルの特定に供され得ることが理解されよう。ある特定の実施形態では、ＬＣ−ＭＳを、本発明のバイオマーカーのレベルを特定するための手段として使用することができる。
本明細書で使用される、バイオマーカーの「レベルを特定すること」という用語は、対象由来のサンプル、例えば、該対象由来の体液（例えば、血清、血漿、尿、リンパ等）または該対象の組織（例えば、肝臓等）における少なくとも１つの物質の量を定量することを含む方法を意味し得る。
本明細書で使用される、「参照レベル」という用語は、本発明のｍＲＮＡ治療の投与の前の対象における（例えば、ＰＫＵの患者における）、または正常もしくは健常な対象におけるレベル（例えば、バイオマーカーの）を指すことができる。
本明細書で使用される、「正常な対象」または「健常な対象」という用語は、ＰＫＵに関連する症状がない対象を指す。さらに、対象は、ＰＡＨ遺伝子の機能部分もしくはドメインの変異を有さない、及び／または、酵素ＰＡＨもしくはその活性の低下もしくは欠損を引き起こし、ＰＫＵに関連する症状をもたらすＰＡＨ遺伝子の変異を有さない場合に、正常（または健常）と見なされる。当該変異は、当該対象由来のサンプルを、かかるＰＡＨの変異に関する遺伝子検査に供した場合に検出される。本発明のある特定の実施形態では、健常な対象由来のサンプルは、対照サンプルとして使用されるか、または、健常もしくは正常な対象のサンプルのバイオマーカーのレベルに関して既知の値もしくは標準値が、対照として使用される。
いくつかの実施形態では、ＰＫＵの治療を必要とする対象、またはＰＫＵの治療を受けている対象由来のサンプルにおけるバイオマーカーのレベルを、該バイオマーカーの対照レベルと比較することは、該対象（ＰＫＵの治療を必要とする、または治療を受けている）由来のサンプルにおけるバイオマーカーのレベルを、ベースラインまたは参照レベルと比較することを含み、該対象（ＰＫＵの治療を必要とする、または治療を受けている）由来のサンプルにおけるバイオマーカーのレベルが、ベースラインまたは参照レベルと比較して上昇している、増加している、または高い場合、該対象がＰＫＵに罹患している及び／または治療を必要とすることを示し、及び／または該対象（ＰＫＵの治療を必要とする、または治療を受けている）由来のサンプルにおけるバイオマーカーのレベルが、該ベースラインのレベルと比較して減少しているまたは低い場合、該対象がＰＫＵに罹患していない、ＰＫＵの治療に成功している、またはＰＫＵの治療を必要としていないことを示す。ある特定の期間内に、例えば、６時間以内、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間以内に、及び／またはある特定の期間の間、例えば、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月等の間、バイオマーカーのレベルの低下が強いほど（例えば、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍の低下及び／または少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％の低下）、治療、例えば、本発明のｍＲＮＡ治療（例えば、単回投与または複数レジメン）はさらに成功する。
投与後１、２、３、４、５、６日、またはそれ以上の日数以内での、特に、対象の体液（例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿沈渣）または組織（複数可）（例えば、肝臓）における少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも１００％、またはそれ以上のバイオマーカーのレベルの低下は、ＰＫＵの治療の成功に適した投与を示し、ここで、本明細書で使用される低下とは、好ましくは、特定の期間の終わり（例えば、投与後、例えば、単回静脈内投与後）に特定したバイオマーカーのレベルが、当該期間の始め（例えば、該投与の前）に特定した同じバイオマーカーのレベルと比較されることを意味する。例示的な期間としては、投与後１２、２４、４８、７２、９６、１２０または１４４時間、特に投与後２４、４８、７２または９６時間が挙げられる。
基質のレベル（例えば、バイオマーカー）の持続的な低下は、特に、ＰＫＵの治療に成功しているｍＲＮＡ治療薬の投薬及び／または投与レジメンを示す。かかる持続的な低下は、本明細書では、効果の「持続」と呼ばれ得る。例示的な実施形態では、投与後１、２、３、４、５、６、７、８日またはそれ以上の日数以内での、特に、対象の体液（例えば、血漿、血清、尿、例えば、尿沈渣）または組織（複数可）（例えば、肝臓）における少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、またはそれ以上のバイオマーカーのレベルの低下は、治療的アプローチの成功を示す。例示的な実施形態では、１つ以上のサンプル（例えば、液体及び／または組織）における基質（例えば、バイオマーカー）のレベルの持続的な低下が好ましい。例えば、バイオマーカーの持続的な減少を、任意に当該バイオマーカーの少なくとも１つの組織、好ましくは２、３、４、５、またはそれ以上の組織における持続的な減少と組み合わせてもたらすｍＲＮＡ治療は、治療の成功を示す。
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療の単回用量は、約０．２〜約０．８ｍｐｋ、約０．３〜約０．７ｍｐｋ、約０．４〜約０．８ｍｐｋ、または約０．５ｍｐｋである。別の実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療の単回用量は、１．５ｍｐｋ未満、１．２５ｍｐｋ未満、１ｍｐｋ未満、または０．７５ｍｐｋ未満である。
２４．使用のための組成物及び製剤
本発明のある特定の態様は、上記に開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物または製剤に関する。
いくつかの実施形態では、該組成物または製剤は、以下を含む：
（ｉ）ＰＡＨポリペプチド（例えば、野生型配列、機能的断片、またはそのバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）であって、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、例えば、Ｎ１−メチルプソイドウラシルまたは５−メトキシウラシルを含み（例えば、該ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％はＮ１−メチルプソイドウラシルまたは５−メトキシウラシルである）、さらに、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位）及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ結合部位）を含む該ポリヌクレオチド、ならびに
（ｉｉ）例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のいずれか、例えば、化合物ＩＩ、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のいずれか、例えば、化合物ＶＩ、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のいずれか、例えば、化合物Ｉ、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、化合物ＶＩ、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約５０：１０：３８．５：１．５で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＩＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約５０：１０：３８．５：１．５で含む。いくつかの実施形態では、該送達剤は、化合物ＶＩ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物ＩまたはＰＥＧ−ＤＭＧを、例えば、モル比約４７．５：１０．５：３９．０：３．０で含む。
いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論最小ウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）に対する該ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量は、約１００％〜約１５０％である。
いくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド、組成物または製剤は、ＰＡＨ関連の疾患、障害または状態、例えば、ＰＫＵの治療及び／または予防に使用される。
２５．投与形態
上記の本発明のポリヌクレオチド、医薬組成物及び製剤は、治療効果のある結果をもたらす任意の経路で投与され得る。これらとしては、経腸（腸へ）、胃腸、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜へ）、経口（口腔を介して）、経皮、硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ）、脳内（大脳へ）、脳室内（脳室へ）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内、（皮膚自体に）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈へ）、静脈内ボーラス、静脈点滴、動脈内（動脈へ）、筋肉内（筋肉へ）、心臓内（心臓へ）、骨内注入（骨髄へ）、髄腔内（脊髄へ）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（目を通して）、海綿体内注射（病的腔へ）腔内（陰茎の基部へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身への分布のための無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、吹送（吸引）、舌下、唇下、浣腸、点眼薬（結膜上）、点耳薬、耳介（耳の中または耳を介して）、頬側（頬に向けて）、結膜、皮膚、歯科（歯（複数可）へ）、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、体外、血液透析、浸透、間質内、腹腔内、羊水内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨の中）、尾内（馬尾内）、大槽内（大槽の中）、角膜内（角膜の中）、歯の歯冠内、冠動脈内（冠状動脈の中）、海綿体内（陰茎海綿体の拡張可能な空間内）、椎間板内（椎間板の中）、導管内（腺管の中）、十二指腸内（十二指腸の中）、硬膜内（硬膜の中または下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃の中）、歯肉内（歯肉の中）、回腸内（小腸の遠位部の中）、病変内（局所病変の中または局所病変に直接導入される）、管腔内（管の内腔の中）、リンパ内（リンパの中）、髄内（骨の髄腔の中）、髄膜内（髄膜の中）、眼内（眼の中）、卵巣内（卵巣の中）、心膜内（心膜の中）、胸膜内（胸膜の中）、前立腺内（前立腺の中）、肺内（肺またはその気管支の中）、洞内（副鼻腔または眼窩周囲洞の中）、脊髄内（脊柱の中）、滑膜内（関節の滑液腔の中）、腱内（腱の中）、精巣内（精巣の中）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルの脳脊髄液の中）、胸腔内（胸部の中）、管内（器官の細管の中）、鼓室内（中耳の中）、血管内（血管（複数可）の中）、心室内（心室の中）、イオン導入（可溶性塩のイオンが体の組織に移動する電流による）、洗浄法（開放創または体腔を浸すまたは洗い流すこと）、喉頭（喉頭に直接）、経鼻胃（鼻を通して胃の中）、閉鎖包帯法（局所経路投与後、当該領域を閉塞する包帯で覆う）、眼科（外眼部へ）、口腔咽頭（口腔及び咽頭へ直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的または全身的効果のために経口または経鼻で吸入することによる気道の中）、眼球後方（橋後方または眼球後方）、心筋内（心筋に入る）、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を介してまたは横断して）、経気管（気管の壁を介して）、鼓室内（鼓室を横切ってまたは介して）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁かん流、心臓かん流、フォトフェレシスまたは脊柱が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、組成物は、それらが血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過できるように投与され得る。いくつかの実施形態では、投与経路用の製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、裸で細胞に送達され得る。本明細書で使用される、「裸」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。裸のポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の及び本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達され得る。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＰＡＨポリペプチドまたはその機能的断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、本明細書に記載の方法を用いて製剤化され得る。該製剤は、修飾されている及び／または未修飾であり得るポリヌクレオチドを含み得る。該製剤はさらに、これらに限定されないが、細胞浸透剤、医薬的に許容される担体、送達剤、生体分解可能なまたは生体適合性ポリマー、溶媒、及び持続放出送達デポーを含み得る。製剤化されたポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の及び本明細書に記載の投与経路を用いて細胞に送達され得る。
非経口投与用の医薬組成物は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、使用される不活性成分のいずれかが承認されている場合もあれば、いずれも承認されていない場合もある。非経口投与用の医薬組成物に使用する不活性成分の包括的でないリストには、塩酸、マンニトール、窒素、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び水酸化ナトリウムが含まれる。
注射用製剤、例えば、無菌注射剤の水性または油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／懸濁剤を用い、既知の技術に従って製剤化され得る。無菌注射用製剤は、無毒の非経口的に許容される希釈剤及び／または溶媒の無菌注射用溶液、懸濁液、及び／エマルション、例えば、１，３−ブタンジオール溶液であり得る。使用され得る許容される媒体及び溶媒の中には、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌の不揮発性油は、従来から溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のため、合成モノまたはジグリセリドを含め、任意の無刺激不揮発性油が使用され得る。オレイン酸等の脂肪酸は、注射剤の調製に使用され得る。該無菌製剤は、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、防腐剤及び緩衝剤も含み得る。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過により、及び／または滅菌水もしくは他の無菌注射用媒体に使用前に溶解もしくは分散させることができる、無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌され得る。
注射用製剤は、組織、器官及び／または対象の領域への直接注射用であり得る。非限定的な例として、組織、器官及び／または対象は、虚血領域への心筋内注射によって製剤を直接投与され得る（例えば、Ｚａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３参照、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。
活性成分の効果を延長するため、多くの場合、皮下または筋肉内注射からの該活性成分の吸収を遅延させることが望ましい。これは、難水溶性の結晶性または非晶質材料の液体懸濁液を使用することで達成され得る。次に、当該薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これは次に、結晶のサイズ及び結晶形態に依存し得る。代替的に、非経口的に投与された薬物形態の吸収の遅延は、当該薬物を油媒体に溶解または懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中で該薬物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することにより作製される。薬物対ポリマー比及び使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルソエステル）及びポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、当該薬物を体内組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルションに取り込むことによって調製される。
２６．キット及び装置
ａ．キット
本発明は、特許請求にかかる本発明のヌクレオチドを都合よく及び／または効果的に使用するための様々なキットを提供する。通常、キットは、使用者が、対象（複数可）の複数の処置を実施できるようにするのに十分な、及び／または複数の実験を実施できるようにするのに十分な量及び／または数の成分を含む。
１つの態様では、本発明は、本発明の分子（ポリヌクレオチド）を含むキットを提供する。
当該キットは、タンパク質産生用のものであってよく、翻訳可能な領域を含む第一のポリヌクレオチドを含む。該キットはさらに、製剤組成物を形成するための包装材料及び使用説明書及び／または送達剤を含むことができる。該送達剤は、生理食塩水、緩衝液、リピドイドまたは本明細書に開示の任意の送達剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、該緩衝液は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸及び／またはＥＤＴＡを含み得る。別の実施形態では、該緩衝液は、生理食塩水、２ｍＭのカルシウムを含む生理食塩水、５％スクロース、２ｍＭのカルシウムを含む５％スクロース、５％マンニトール、２ｍＭのカルシウムを含む５％マンニトール、乳酸リンゲル液、塩化ナトリウム、２ｍＭのカルシウムを含む塩化ナトリウム及びマンノースを含み得るがこれらに限定されない（例えば、米国公開第２０１２０２５８０４６号参照。参照することにより全体として本明細書に組み込まれる）。さらなる実施形態では、該緩衝液は、沈殿させることもできれば、凍結乾燥することもできる。各成分の量を変化させ、一貫した、再現性のある高濃度の食塩水または単純緩衝製剤を可能にすることができる。該成分は、ある期間にわたって、及び／または様々な条件下で、該緩衝液における修飾ＲＮＡの安定性を高めるために変化させることもできる。１つの態様では、本発明は、タンパク質産生のための以下を含むキットを提供する：標的細胞に導入された際に当該翻訳可能領域によってコードされるタンパク質の所望量を産生するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、当該細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、抑制性核酸を含む第二のポリヌクレオチド、ならびに包装材料及び使用説明書。
１つの態様では、本発明は、タンパク質産生のためのキットを提供し、該キットは、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドであって、細胞のヌクレアーゼによる分解の低下を示す該ポリヌクレオチド、ならびに包装材料及び使用説明書を含む。
１つの態様では、本発明は、タンパク質産生のためのキットを提供し、該キットは、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチドであって、細胞のヌクレアーゼによる分解の低下を示す該ポリヌクレオチド、及び該第一の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適した動物細胞を含む。
ｂ．装置
本発明は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込むことができる装置を提供する。これらの装置は、それを必要とする対象、例えば、ヒト患者に対して、即座に送達することが可能な製剤にポリヌクレオチドを合成するための試薬を安定な製剤で含む。
投与用の装置を使用して、本発明のポリヌクレオチドを、本明細書に教示の単回、複数回、または分割投与レジメンに従って送達することができる。かかる装置は、例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に教示されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
細胞、器官及び組織への複数回投与のための当技術分野で既知の方法及び装置は、本発明の実施形態として本明細書に開示の方法及び組成物とともに使用することが企図される。これらとしては、例えば、複数の針を有する方法及び装置、例えば、ルーメンまたはカテーテルを使用するハイブリッド装置、及び熱、電流または放射線駆動機構を利用する装置が挙げられる。
本発明によれば、これらの複数回投与装置は、本明細書で企図される単回、複数回または分割用量を送達するために利用され得る。かかる装置は、例えば、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に教示されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、皮下または筋肉内に、少なくとも３本の針を介して、３つの異なる、任意に隣接した部位に、同時に、または６０分以内に（例えば、４、５、６、７、８、９、または１０箇所に、同時にまたは６０分以内に）投与される。
ｃ．カテーテル及び／またはルーメンを利用する方法及び装置
カテーテル及びルーメンを用いる方法及び装置を使用して、本発明のポリヌクレオチドを、単回、複数回、または分割投与スケジュールで投与することができる。かかる方法及び装置は、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
ｄ．電流を利用する方法及び装置
電流を利用する方法及び装置を使用して、本発明のポリヌクレオチドを、本明細書に教示の単回、複数回、または分割投与レジメンに従って送達することができる。かかる方法及び装置は、国際出願公開第ＷＯ２０１３１５１６６６号に記載されており、その内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
２７．併用療法
本明細書に記載の医薬組成物及びポリヌクレオチドは、ＰＫＵ治療においてさらなる薬剤との併用療法に使用することができる。テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）は、フェニルアラニンの分解におけるＰＡＨの補因子である。テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、またはテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）もしくはそのアナログの塩が、ヒト対象に対して、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチドでの治療と同時に、それに先立って、またはその後に投与され得る。例示的なテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）アナログとしては、サプロプテリン（ＫＵＶＡＮ（登録商標）、サプロプテリン二塩酸塩）、６−ヒドロキシメチルプテリン（ＨＭＰ）、及び６−アセチル−７，７−ジメチル−７，８−ジヒドロプテリン（ＡＤＤＰ）が挙げられる。テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、またはテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）もしくはそのアナログの塩は、本明細書に記載の医薬組成物もしくはポリヌクレオチドと同じ投与経路で投与される場合もあれば、異なる投与経路で投与される場合もある。例えば、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、またはテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）もしくはそのアナログの塩を経口投与することができるとともに、該医薬組成物またはポリヌクレオチドを静脈内投与することができる。別の例では、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、またはテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）もしくはそのアナログの塩を経口投与することができるとともに、該医薬組成物またはポリヌクレオチドを皮下投与することができる。
２８．定義
本開示をさらに容易に理解できるようにするため、ある特定の用語を最初に定義する。本出願で使用される場合、本明細書で別段の定めのない限り、以下の用語の各々は、以下に示す意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願を通して示される。
本発明は、群の正確に１つの成員が所定の生成物またはプロセスに存在する、使用される、さもなければ関連する実施形態を含む。本発明は、群の２つ以上の成員、または群の成員のすべてが所定の生成物またはプロセスに存在する、使用される、さもなければ関連する実施形態を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義で使用され得る。ある特定の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「単一」を意味する。他の態様では、「ａ」または「ａｎ」という用語は、「２つ以上」または「複数」を含む。
さらに、本明細書で使用される、「及び／または」は、２つの特定の特徴または成分の各々の特定の開示が、他方を伴うまたは伴わないととらえられる。従って、本明細書において、「Ａ及び／またはＢ」等の句で使用される、「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の句で使用される「及び／または」という用語は、以下の態様の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびにＣ（単独）。
特に定義しない限り、本明細書で使用される、すべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者に本開示に使用される用語の多くの一般的な辞書を提供する。
本明細書において、「含む」という用語で態様が記載される場合は常に、「〜からなる」及び／または「〜から本質的になる」の観点から記載される他の類似の態様もまた提供される。
単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）が認める形で示される。数値範囲は、該範囲を画定する数値を含む。値の範囲が列挙されている場合、列挙されたその範囲の上限及び下限間の各介在整数値、及びその各分数もまた、かかる値間の部分的な範囲の各々とともに具体的に開示されることを理解されたい。任意の範囲の上限及び下限は、独立して、該範囲に含まれる場合も該範囲から除外される場合もあり、上下限のいずれかが含まれる場合、いずれも含まれない場合、または両方とも含まれる場合の各範囲もまた、本発明に包含される。値が明示的に列挙される場合、該列挙された値とほぼ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）の値もまた、本発明の範囲に含まれることが理解される。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素の部分的な組み合わせの各々もまた、具体的に開示され、本発明の範囲に含まれる。反対に、異なる要素または要素の群が個別に開示される場合、その組み合わせもまた開示される。ある発明の任意の要素が複数の選択肢を有して開示される場合、各選択肢が単独で、または他の選択肢と任意の組み合わせで除外されるその発明の例もまた、本明細書に開示される。ある発明の複数の要素がかかる除外を有する場合があり、かかる除外を有する要素のすべての組み合わせが本明細書に開示される。
ヌクレオチドは、一般に認められているそれらの１文字コードによって言及される。特に明記しない限り、核酸は、左から右に、５’から３’の向きで表される。核酸塩基は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名法委員会が推奨する一般に知られるそれらの１文字記号で言及される。従って、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。
アミノ酸は、本明細書では、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの生化学命名法委員会が推奨する一般に知られるそれらの３文字記号または１文字記号のいずれかで言及される。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、左から右へ、アミノからカルボキシの向きで表される。
約：本明細書及び特許請求の範囲を通して数値に関連して使用される「約」という用語は、当業者に良く知られており、受け入れられている精度の区間を示し、かかる精度の区間は±１０％である。
範囲が指定されている場合は端点が含まれる。さらに、特に明記しない限り、または文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲で表される値は、本発明の異なる実施形態において規定される範囲内の任意の特定の値または部分的な範囲を、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、該範囲の下限の単位の１０分の１までと見なすことができる。
組み合わせて投与される：本明細書で使用される、「組み合わせて投与される」または「併用投与」という用語は、対象に対して、２つ以上の薬剤が、該患者に対する各薬剤の効果が重複し得るように、同時にまたはある間隔内に投与されることを意味する。いくつかの実施形態では、それらは、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。いくつかの実施形態では、該薬剤の投与は、組み合わせ（例えば、相乗的）効果が達成されるように十分に接近した間隔である。
アミノ酸置換：「アミノ酸置換」という用語は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＰＡＨ配列）に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。アミノ酸は、親配列または参照配列（例えば、野生型ＰＡＨポリペプチド配列）で、例えば、当技術分野で既知の化学的ペプチド合成により、または組み換え法により、置換され得る。従って、「Ｘ位での置換」への言及は、Ｘ位に存在するアミノ酸を代替的なアミノ酸残基で置換することを指す。いくつかの態様では、置換パターンは、スキーマＡｎＹで記載される場合があり、ここで、Ａはｎ位に天然にまたはもともと存在するアミノ酸に対応する１文字コードであり、Ｙは、置換アミノ酸残基である。他の態様では、置換パターンは、スキーマＡｎ（ＹＺ）で記載される場合があり、ここで、ＡはＸ位に天然にまたはもともと存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する１文字コードであり、Ｙ及びＺは、代替的な置換アミノ酸残基である。
本開示の観点から、置換（アミノ酸置換と呼ばれる場合でも）は、核酸レベルで行われる。すなわち、あるアミノ酸残基の代替的なアミノ酸残基での置換は、第一のアミノ酸をコードするコドンを第二のアミノ酸をコードするコドンで置換することにより行われる。
動物：本明細書で使用される、「動物」という用語は、動物界の任意の成員を指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、該非ヒト動物は、哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、及び蠕虫が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組み換え動物、またはクローンである。
およそ：本明細書で使用される、１つ以上の目的の値に適用される「およそ」という用語は、規定された参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、規定された参照値のいずれかの（高いまたは低い）方向の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または１％以下に入る値の範囲を指す（かかる値が可能値の１００％を超える場合を除く）。
〜と関連する：疾患に関して本明細書で使用される、「〜と関連する」という用語は、問題の症状、測定、特徴、または状況が、その疾患の診断、発症、存在、または進行と関係していることを意味する。関連は、原因として当該疾患と関係し得るが、必ずしもそうではない。例えば、ＰＫＵの患者の生活の質の低下を引き起こす症状、後遺症、または任意の影響は、ＰＫＵと関連すると見なされ、本発明のいくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することによって治療、緩和、または予防され得る。
２つ以上の部分に関して使用される、「〜と会合する」、「コンジュゲートされる」、「連結される」、「結合される」、及び「つながれる」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、該部分が互いに直接もしくは連結剤として働く１つ以上のさらなる部分を介してのいずれかで物理的に関連または接続して構造を形成し、これが十分に安定であり、そのため、該構造が使用される条件、例えば、生理的条件下で該部分が物理的に関連したままであることを意味する。「会合」は、厳密に直接の共有化学結合を介する必要はない。これは、イオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーション系の接続性が、「会合した」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定であることもまた示唆し得る。
二機能性：本明細書で使用される、「二機能性」とは、少なくとも２つの機能が可能な、またはこれを維持する任意の物質、分子または部分を指す。該機能は、同じ結果に影響を及ぼす場合もあれば、異なる結果に影響を及ぼす場合もある。該機能を生じる構造は、同じであっても異なっていてもよい。例えば、二機能性の本発明の修飾ＲＮＡは、ＰＡＨペプチドをコードすることができる（第一の機能）と同時に、該コードＲＮＡを含むヌクレオチドは、それら自体、該ＲＮＡの半減期を延長することが可能である（第二の機能）。この例では、タンパク質欠乏症に罹患した対象に対して該機能性修飾ＲＮＡを送達することにより、疾患または状態を改善または治療することができるペプチドまたはタンパク質分子が生じるだけでなく、長期間にわたって該対象に含まれる集団修飾ＲＮＡが維持される。他の態様では、二機能性修飾ｍＲＮＡは、キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃまたはｑｕｉｍｅｒｉｃ）分子である場合があり、例えば、ＰＡＨペプチドをコードするＲＮＡ（第一の機能）及び第一のタンパク質に融合されるか、または第一のタンパク質と共発現される第二のタンパク質を含む。
生体適合性：本明細書で使用される、「生体適合性」という用語は、生細胞、組織、器官または系と適合し、損傷、毒性または免疫系による拒絶をほとんどもたらさないことを意味する。
生分解性：本明細書で使用される、「生分解性」という用語は、生物の作用によって無害の産物に分解され得ることを意味する。
生物学的に活性な：本明細書で使用される、「生物学的に活性な」という句は、生物系及び／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与された場合に、その生物に対して生物学的効果を及ぼす物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドの一部が生物学的に活性または生体関連と見なされる活性を模倣する場合であっても、生物学的に活性と見なすことができる。
キメラ：本明細書で使用される、「キメラ」とは、２つ以上の調和しないまたは異種の部分もしくは領域を有する実体である。例えば、キメラ分子は、ＰＡＨポリペプチドを含む第一の部分、及び第二の治療用タンパク質（例えば、異なる酵素活性を有するタンパク質、抗原結合部分、またはＰＡＨの血漿半減期を延長することが可能な部分、例えば、抗体のＦｃ領域）を含む第二の部分（例えば、該第一の部分に遺伝子的に融合された）を含むことができる。
配列最適化：「配列最適化」という用語は、参照核酸配列の核酸塩基が、代替的な核酸塩基で置き換えられ、特性が改善された、例えば、タンパク質発現が改善された、または免疫原性が低下した核酸配列をもたらすプロセスまたは一連のプロセスを指す。
一般に、配列最適化の目的は、参照ヌクレオチド配列によってコードされる同じポリペプチド配列をコードする同義ヌクレオチド配列を産生することである。従って、参照ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに関しては、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにアミノ酸置換（コドン最適化の結果としての）はない。
コドン置換：配列最適化の観点から、「コドン置換」または「コドン置き換え」という用語は、参照核酸配列に存在するコドンを別のコドンで置き換えることを指す。コドンは、参照核酸配列において、例えば、当技術分野で既知の化学的ペプチド合成により、または組み換え法により、置換され得る。従って、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のある特定の位置での、または核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のある特定の領域もしくは部分列内での「置換」または「置き換え」は、かかる位置または領域でのコドンを代替的なコドンで置換することを指す。
本明細書で使用される、「コード領域」及び「〜をコードする領域」という用語、ならびにそれらの文法上の異形は、発現時にポリペプチドまたはタンパク質を生じるポリヌクレオチドにおけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を指す。
化合物：本明細書で使用される、「化合物」という用語は、示される構造のすべての立体異性体及び同位体を含むことを意図する。本明細書で使用される、「立体異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体（例えば、シス−及びトランス−異性体）、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体異性体的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびにエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ化合物を含めた、本明細書に記載の化合物のありとあらゆる立体異性体を包含する。化合物のエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物ならびにそれらをそれらの成分のエナンチオマー及び立体異性体に分割する手段は周知である。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが、原子核中の異なる中性子数に起因して異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウム及びジュウテリウムが含まれる。さらに、本開示の化合物、塩または複合体を、常法により溶媒または水分子と組み合わせて調製し、溶媒和物及び水和物を生成することができる。
接触させる：本明細書で使用される、「接触させる」という用語は、２つ以上の実体間の物理的な接続を確立することを意味する。例えば、哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させるとは、該哺乳類細胞及びナノ粒子が物理的接続を共有させられることを意味する。インビボ及びエキソビボの両方で細胞と外部実体を接触させる方法は、生物学の分野では周知である。例えば、ナノ粒子組成物と哺乳類内に配置された哺乳類細胞を接触させることは、多様な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）により実施することができ、多様な量のナノ粒子組成物を取り込むことができる。さらに、複数の哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させることができる。
保存的アミノ酸置換：「保存的アミノ酸置換」は、タンパク質配列のアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、またはシステイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはヒスチジン）を含む。従って、ポリペプチドにおけるアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸で置き換えられる場合、該アミノ酸置換は、保存的であると見なされる。別の態様では、アミノ酸の鎖は、側鎖ファミリーの成員の順序及び／または組成が異なる構造的に同様の鎖で保存的に置き換えられ得る。
非保存的アミノ酸置換：非保存的アミノ酸置換には、（ｉ）電気的に正の側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）が電気的に負の残基（例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）で、もしくはそれにより置換される、（ｉｉ）親水性残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＶａｌ）で、もしくはそれにより置換される、（ｉｉｉ）システインまたはプロリンが任意の他の残基で、もしくはそれにより置換される、あるいは（ｉｖ）嵩高い疎水性または芳香族側鎖（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、ＩｌｅもしくはＴｒｐ）を有する残基がより小さい側鎖を有する（例えば、ＡｌａもしくはＳｅｒ）または側鎖のないもの（例えば、Ｇｌｙ）で、もしくはそれにより置換されるものを含む。
他のアミノ酸置換は、当業者によって容易に特定され得る。例えば、アミノ酸アラニンについては、置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、ベータ−アラニン、Ｌ−システイン及びＤ−システインのいずれか１つから選ぶことができる。リジンについては、置き換えは、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、またはＤ−オルニチンのいずれか１つであり得る。一般に、単離されたポリペプチドの特性に変化を誘導することが期待され得る機能的に重要な領域の置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリンまたはスレオニンが疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、またはアラニンで（もしくはそれによって）置換される、（ｉｉ）システイン残基が任意の他の残基で（もしくはそれによって）置換される、（ｉｉｉ）電気的に正の側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンが電気的に負の側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸で（もしくはそれによって）置換される、あるいは（ｉｖ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンがかかる側鎖を有さないもの、例えば、グリシンで（またはそれによって）置換されるものである。上記の非保存的置換の１つが該タンパク質の機能特性を変更し得る可能性は、該タンパク質の機能的に重要な領域に関する置換の位置にも相関し、一部の非保存的置換は、従って、生物学的特性にほとんどまたは全く影響を与えない場合がある。
保存された：本明細書で使用される、「保存された」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸残基であって、比較される２つ以上の配列の同じ位置に変更なく生じる該ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。比較的保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸とは、当該配列の他の場所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連性の高い配列の間で保存されているものである。
いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合に「完全に保存された」と言える。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に「高度に保存された」と言える。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合に「高度に保存された」と言える。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合に「保存された」と言える。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合に「保存された」と言える。配列の保存は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用される場合もあれば、その部分、領域、または特徴に適用される場合もある。
制御放出：本明細書で使用される、「制御放出」という用語は、特定の放出パターンに従って治療結果をもたらす医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
環状または環化：本明細書で使用される、「環状」という用語は、連続した輪の存在を指す。環状分子は、切れ目のないサブユニットの鎖を形成するようにつながっているだけで、円形である必要はない。本発明の操作されたＲＮＡまたはｍＲＮＡ等の環状分子は、単一の単位であっても、多量体であってもよく、複合体またはより高次構造の１つ以上の成分を含んでもよい。
細胞毒性：本明細書で使用される、「細胞毒性」とは、細胞（例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生生物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組み合わせを殺傷すること、またはそれらに対する有害な、有毒な、もしくは致命的な影響を引き起こすことを指す。
送達すること：本明細書で使用される、「送達すること」という用語は、目的地に実体を提供することを意味する。例えば、対象にポリヌクレオチドを送達することには、該ポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を該対象に投与する（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路で）ことが含まれ得る。哺乳類または哺乳類細胞へのナノ粒子組成物の投与には、１つ以上の細胞を該ナノ粒子組成物に接触させることが含まれ得る。
送達剤：本明細書で使用される、「送達剤」とは、標的細胞へのポリヌクレオチドのインビボ、インビトロ、またはエキソビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
不安定化：本明細書で使用される、「不安定」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の開始の、野生型のまたは天然の形態より安定性が低い領域または分子を意味する。
ジアステレオマー：本明細書で使用される、「ジアステレオマー」という用語は、互いに鏡像ではなく、かつ互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。
消化する：本明細書で使用される、「消化する」という用語は、より小さい断片または成分に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化によりペプチドが生じる。
遠位：本明細書で使用される、「遠位」という用語は、中心から遠くに位置するまたは目的の点もしくは領域から遠くに位置することを意味する。
ドメイン：ポリペプチドに言及する場合に本明細書で使用される、「ドメイン」という用語は、１つ以上の識別可能な構造的もしくは機能的特徴または特性（例えば、結合能、タンパク質間相互作用のための部位としての機能を果たす）を有するポリペプチドのモチーフを指す。
投与レジメン：本明細書で使用される、「投与レジメン」または「投与レジメン」は、投与のスケジュールまたは医師が決めた治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンである。
有効量：本明細書で使用される、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、従って、「有効量」は、それが適用される状況に依存する。例えば、タンパク質欠乏症（例えば、ＰＡＨ欠乏症）を治療する薬剤を投与する状況において、薬剤の有効量は、例えば、該ＰＡＨ欠乏症と関連する症状を、該薬剤を投与することなく観察される該症状の重症度と比較して、改善、低減、排除、または予防するのに十分なＰＡＨを発現するｍＲＮＡの量である。「有効量」という用語は、「有効用量」、「治療有効量」、または「治療有効用量」と同義で使用され得る。
エナンチオマー：本明細書で使用される、「エナンチオマー」という用語は、光学純度またはエナンチオマー過剰率（当技術分野で標準的な方法で測定して）少なくとも８０％（すなわち、１つのエナンチオマーが少なくとも９０％と他のエナンチオマーが多くても１０％）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％を有する本発明の化合物の個々の光学活性形を意味する。
封入する：本明細書で使用される、「封入する」という用語は、包囲する、取り囲む、または包むことを意味する。
封入効率：本明細書で使用される、「封入効率」とは、ナノ粒子組成物の調製に使用されるポリヌクレオチドの最初の総量に対して、ナノ粒子組成物の一部になるポリヌクレオチドの量を指す。例えば、当該組成物に最初に提供されたポリヌクレオチド合計１００ｍｇのうち、９７ｍｇのポリヌクレオチドがナノ粒子組成物に封入された場合、該封入効率は９７％で与えることができる。本明細書で使用される、「封入」とは、完全な、実質的な、または部分的な包囲、閉じ込め、取り囲み、または覆いを指すことができる。
コードされたタンパク質の切断シグナル：本明細書で使用される、「コードされたタンパク質の切断シグナル」とは、タンパク質の切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作される：本明細書で使用される場合、本発明の実施形態は、構造的であるか化学的であるかにかかわらず、開始点、野生型または天然の分子とは異なる特徴または特性を有するように設計される場合に、「操作される」。
送達の向上：本明細書で使用される、「送達の向上」という用語は、目的の標的組織への対照ナノ粒子（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）によるポリヌクレオチドの送達レベルと比較して、目的の標的組織（例えば、哺乳類の肝臓）へのナノ粒子によるポリヌクレオチドのより多くの（例えば、少なくとも１．５倍多くの、少なくとも２倍多くの、少なくとも３倍多くの、少なくとも４倍多くの、少なくとも５倍多くの、少なくとも６倍多くの、少なくとも７倍多くの、少なくとも８倍多くの、少なくとも９倍多くの、少なくとも１０倍多くの）送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達レベルは、組織で生じるタンパク質の量と該組織の重量を比較すること、組織におけるポリヌクレオチドの量と該組織の重量を比較すること、組織で生じるタンパク質の量と該組織の総タンパク質量を比較すること、または組織におけるポリヌクレオチドの量と該組織における総ポリヌクレオチド量を比較することによって測定され得る。標的組織へのナノ粒子の送達の向上は、治療される対象で測定する必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）等の代理のもので測定することができることが理解されよう。
エキソソーム：本明細書で使用される、「エキソソーム」は、哺乳類細胞によって分泌される小胞またはＲＮＡ分解に関与する複合体である。
発現：本明細書で使用される、核酸配列の「発現」とは、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのｍＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ｍＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）、（３）ｍＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エキソビボ：本明細書で使用される、「エキソビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはそれらの細胞もしくは組織）の外部で生じる事象を指す。エキソビボの事象は、天然の（例えば、インビボ）環境からの変更が最小限の環境で行われ得る。
特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）：本明細書で使用される、「特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）」とは、特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）、特性、または際立った要素を指す。ポリペプチドに言及する場合、「特徴」は、はっきりと異なるアミノ酸配列に基づく分子の構成要素として定義される。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特徴としては、表面発現、局所的な立体配座の形状、折り畳み、ループ、ハーフループ、ドメイン、ハーフドメイン、部位、末端またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
製剤：本明細書で使用される、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドならびに担体、賦形剤、及び送達剤のうちの１つ以上を含む。
断片：本明細書で使用される、「断片」とは、部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することにより得られるポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、断片は、Ｎ末端、及び／またはＣ末端、及び／または内部の部分列が削除された完全長タンパク質（例えば、ＰＡＨ）の部分列である。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質の断片は、機能的断片である。
機能的：本明細書で使用される、「機能的」生体分子とは、それが特徴づけられる特性及び／または活性を示す形態の生体分子である。従って、本発明のポリヌクレオチドの機能的断片は、機能的ＰＡＨ断片を発現することが可能なポリヌクレオチドである。本明細書で使用される、ＰＡＨの機能的断片とは、野生型ＰＡＨの断片（すなわち、その天然に存在するアイソフォームのいずれかの断片）、またはその変異体もしくはバリアントを指し、ここで、該断片は、対応する完全長タンパク質の生体活性の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を保持する。
ＰＡＨ関連疾患：本明細書で使用される、「ＰＡＨ関連疾患」または「ＰＡＨ関連障害」という用語は、異常なＰＡＨ活性（例えば、活性の低下または活性の増加）に起因する疾患または障害をそれぞれ指す。非限定的な例として、ＰＫＵは、ＰＡＨ関連疾患である。
「ＰＡＨ酵素活性」及び「ＰＡＨ活性」という用語は、本開示では同義で使用され、フェニルアラニンをチロシンへと変換するＰＡＨの能力を指す。従って、ＰＡＨ酵素活性またはＰＡＨ活性を保持するもしくは有する断片またはバリアントとは、フェニルアラニンのチロシンへの変換の触媒作用における測定可能な酵素活性を有する断片またはバリアントを指す。
ヘルパー脂質：本明細書で使用される、「ヘルパー脂質」という用語は、脂質部分（脂質層、例えば、脂質二重層への挿入用）及び極性部分（該脂質層の表面での生理溶液との相互作用用）を含む化合物または分子を指す。通常、ヘルパー脂質はリン脂質である。ヘルパー脂質の機能は、アミノ脂質を「補完する」ことならびに該二重層の膜融合性を高めること及び／または、例えば、細胞に送達される核酸のエンドソーム脱出の促進を助けることである。ヘルパー脂質はまた、ＬＮＰの表面の重要な構造要素であると考えられている。
相同性：本明細書で使用される、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／または、ポリペプチド分子間の全般的な近縁性を指す。一般に、「相同性」という用語は、２分子間の進化的関係の意味を含む。従って、相同な２分子は、共通の進化上の祖先を有する。本発明の観点から、相同性という用語は、同一性及び類似性の両方を包含する。
いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、当該分子のモノマーの少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％が同一（厳密に同じモノマー）または類似（保存的置換）である場合に互いに「相同」と見なされる。「相同」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。
同一性：本明細書で使用される、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間、及び／または、ポリペプチド分子間の全般的なモノマー保存を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適比較目的で該２つの配列を整列させることによって行われ得る（例えば、最適アラインメントのために第一及び第二の核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、同一でない配列を比較目的のため無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的で整列させる配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを次いで比較する。第一の配列のある位置に、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドがある場合、これら分子はその位置で同一である。該２つの配列間の同一性パーセントは、これらの配列が共有する同一位置の数と、ギャップの数を考慮に入れた、該２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要がある各ギャップの長さの関数である。２つの配列間の配列比較及び同一性パーセントの特定は、数学アルゴリズムを用いて達成され得る。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は、同等と見なされ得る。
適切なソフトウェアプログラムは、様々な供給源から入手可能であり、タンパク質及びヌクレオチドの両配列に対して利用可能である。配列同一性パーセントを特定するのに適切なプログラムの１つは、ｂｌ２ｓｅｑであり、これは、米国政府の全米バイオテクノロジー情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴスイートのプログラムの一部である。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰのいずれかのアルゴリズムを用いて２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。他の適切なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒ、すなわち、ＥＭＢＯＳＳスイートのバイオインフォマティクスプログラムの一部であり、同様に、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）より、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａにて入手可能である。
配列アラインメントは、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＸまたはＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）、ＭＵＳＣＬＥ等の当技術分野で既知の方法を用いて行うことができる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド参照配列と並ぶ単一のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的配列内の異なる領域は、各々それら独自の配列同一性パーセントを有することができる。該配列同一性パーセント値は、小数第２位で四捨五入されることが留意される。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は、８０．１に切り捨てられ、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は、８０．２に切り上げられる。長さの値は常に整数であることもまた留意される。
ある特定の態様では、第一のアミノ酸配列（または核酸配列）の第二のアミノ酸配列（または核酸配列）に対する同一性パーセント「％ＩＤ」は、％ＩＤ＝１００×（Ｙ／Ｚ）で計算され、ここで、Ｙは、第一及び第二の配列のアラインメント（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによって整列されたもの）において完全な一致として採点されたアミノ酸残基（または核酸塩基）の数であり、Ｚは、第二の配列における残基の合計数である。第一の配列の長さが第二の配列より長い場合、該第一の配列の該第二の配列に対する同一性パーセントは、該第二の配列の該第一の配列に対する同一性パーセントより高い。
当業者には、配列同一性パーセントの計算のための配列アラインメントの生成は、一次配列データによって排他的に駆動される配列間のバイナリ比較に限定されないことが理解されよう。配列アラインメントは、構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能的データ（例えば、突然変異位置）、または系統発生学的データ等の異種情報源からのデータと配列データを統合することによって生成され得ることも理解されよう。異種のデータを統合して複数の配列アラインメントを生成する適切なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であり、代替的に、例えば、ＥＢＩからも入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅである。配列同一性パーセントを計算するために使用される最終的なアラインメントは、自動的にキュレートされる場合もあれば、手動でキュレートされる場合もあることも理解されよう。
免疫応答：「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、ならびに上記の細胞または肝臓が産生する可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を指し、これにより、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がん性細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織への、選択的障害、これらの選択的破壊、またはヒトの体内からのこれらの排除がもたらされる。場合によっては、脂質成分及び封入された治療薬を含むナノ粒子の投与は、免疫応答を引き起こす可能性があり、これは、（ｉ）封入された治療薬（例えば、ｍＲＮＡ）、（ｉｉ）かかる封入された治療薬の発現産物（例えば、該ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチド）、（ｉｉｉ）該ナノ粒子の脂質成分、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって引き起こされ得る。
炎症反応：「炎症反応」とは、特異的及び非特異的防御システムに関与する免疫応答を指す。特異的な防御システムの反応は、抗原に対して特異的な免疫系の反応である。特異的な防御システムの反応の例としては、抗体反応が挙げられる。非特異的防御システムの反応は、免疫記憶が通常できない白血球、例えば、マクロファージ、好酸球及び好中球が媒介する炎症反応である。いくつかの態様では、免疫応答としては、炎症性サイトカインレベルの上昇をもたらす炎症性サイトカインの分泌が挙げられる。
炎症性サイトカイン：「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症反応において上昇するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、別名ＧＲＯα、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ誘導タンパク質１０（ＩＰ−１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。炎症性サイトカインという用語には、当技術分野で既知の炎症反応に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）等も含まれる。
インビトロ：本明細書で使用される、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内でではなく、人工的な環境で、例えば、試験管または反応容器で、細胞培養で、ペトリ皿等で生じる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用される、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物またはその細胞もしくは組織）内で生じる事象を指す。
挿入及び欠失バリアント：ポリペプチドに言及する場合の「挿入バリアント」とは、天然または開始配列の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入される１つ以上のアミノ酸を備えたものである。アミノ酸に「直接隣接して」とは、該アミノ酸のアルファ−カルボキシまたはアルファ−アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。ポリペプチドに言及する場合の「欠失バリアント」とは、天然または開始アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失バリアントは、当該分子の特定の領域で１つ以上のアミノ酸が削除されている。
インタクト：ポリペプチドとの関連で、本明細書で使用される、「インタクト」という用語は、野生型タンパク質に対応するアミノ酸を保持すること、例えば、野生型アミノ酸を変異させることも置換することもないことを意味する。逆に、核酸との関連で、「インタクト」という用語は、野生型核酸に対応する核酸塩基を保持すること、例えば、野生型核酸塩基を変異させることも置換することもないことを意味する。
イオン性アミノ脂質：「イオン性アミノ脂質」という用語には、１、２、３、またはそれ以上の脂肪酸もしくは脂肪アルキル鎖及びｐＨ滴定可能なアミノ頭部基（例えば、アルキルアミノまたはジアルキルアミノ頭部基）を有する脂質が含まれる。イオン性アミノ脂質は、通常、アミノ頭部基のｐＫａ未満のｐＨでプロトン化し（すなわち、正電荷を有し）、該ｐＫａより高いｐＨでは実質的に電荷を有さない。かかるイオン性アミノ脂質としては、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）及び（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）が挙げられるがこれらに限定されない。
単離された：本明細書で使用される、「単離された」という用語は、会合していた（天然にまたは実験的設定においてにかかわらず）成分の少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）は、それらが単離された物質に関して異なる純度レベルを有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離される可能性がある。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％を超えて、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、実質的に他の成分を含まない場合、「純粋」である。
実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、当該化合物が形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的な分離としては、例えば、本開示の化合物が濃縮された組成物を挙げることができる。実質的な分離としては、本開示の化合物またはその塩を少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％含む組成物を挙げることができる。
「単離された」本明細書に開示のポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または任意の組成物は、天然に見られない形態であるポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、細胞、または組成物である。単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物としては、それらがもはや天然にみられる形態ではない程度まで精製されたものが挙げられる。いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチド、ベクター、ポリペプチド、または組成物は、実質的に純粋である。
異性体：本明細書で使用される、「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、エナンチオマー、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心及び／または、二重結合を有する場合があり、それ故、立体異性体、例えば二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、エナンチオマー（すなわち、（＋）もしくは（−））またはシス／トランス異性体）として存在することが認められる。本発明によれば、本明細書に示す化学構造、ひいては本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、すなわち、立体異性体的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、エナンチオマー的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびにエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物、例えば、ラセミ化合物の両方を包含する。本発明の化合物のエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物は、通常、それらの成分エナンチオマーまたは立体異性体に、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、該化合物のキラル塩複合体としての結晶化、またはキラル溶媒での該化合物の結晶化によって分割され得る。エナンチオマー及び立体異性体は、立体異性体的またはエナンチオマー的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から、周知の不斉合成法により得ることもできる。
リンカー：本明細書で使用される、「リンカー」とは、原子団、例えば、１０〜１，０００原子を指し、該原子または基、例えば、これらに限定されないが、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンからなり得る。該リンカーは、第一の末端で核酸塩基または糖部分の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに結合することができ、第二の末端でペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療薬に結合することができる。該リンカーは、核酸配列への組み込みを妨げないように十分な長さのものでよい。該リンカーは、任意の有用な目的のため、例えば、ポリヌクレオチド多量体（例えば、２つ以上のキメラポリヌクレオチド分子もしくはＩＶＴポリヌクレオチドの結合を介して）またはポリヌクレオチドコンジュゲートを形成するため、及び本明細書に記載のペイロードを投与するために使用することができる。該リンカーに組み込まれ得る化学基の例としては、本明細書に記載の通り、各々が任意に置換される場合があるアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるがこれらに限定されない。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、ならびにデキストランポリマー及びその誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。他の例としては、該リンカー内の切断可能な部分、例えば、還元剤または光分解を用いて切断され得るジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）が挙げられるがこれらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤、及び／または光分解を用いて切断され得るアミド結合、ならびに、例えば、酸または塩基性加水分解によって切断され得るエステル結合が挙げられる。
投与方法：本明細書で使用される、「投与方法」としては、組成物を対象に送達する静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または他の方法が含まれ得る。投与方法は、送達を体内の特定の領域またはシステムへ標的化する（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。
修飾された：本明細書で使用される、「修飾された」とは、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的に、構造的に、及び機能的に等の多くの方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然のリボヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣについて非天然のヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入によって修飾される。非標準的ヌクレオチド、例えば、キャップ構造は、それらがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造と異なってはいるが、「修飾された」とは見なさない。
粘液：本明細書で使用される、「粘液」とは、粘稠であり、ムチン糖タンパク質を含む天然物質を指す。
ナノ粒子組成物：本明細書で使用される、「ナノ粒子組成物」は、１つ以上の脂質を含む組成物である。ナノ粒子組成物は、通常、マイクロメーター以下のオーダーのサイズであり、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、径が５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
天然に存在する：本明細書で使用される、「天然に存在する」とは、人工的な支援なしに天然に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書で使用される、「非ヒト脊椎動物」には、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ以外のすべての脊椎動物が含まれ、野生種及び家畜化された種が含まれる。非ヒト脊椎動物の例としては、哺乳類、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、及びヤクが挙げられるがこれらに限定されない。
核酸配列：「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」という用語は、同義で使用され、連続した核酸配列を指す。該配列は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡでもＲＮＡでもよく、例えば、ｍＲＮＡであり得る。
「核酸」という用語には、広い意味で、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質が含まれる。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと呼ばれる。例示的な本発明の核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ構成を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ構成を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、またはそれらのハイブリッドもしくは組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
「〜をコードするヌクレオチド配列」という句は、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）のコード配列を指す。該コード配列は、さらに、該核酸が投与される個体または哺乳類の細胞における発現を指示することが可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に連結された開始及び終止シグナルを含み得る。該コード配列は、さらに、シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。
オフターゲット：本明細書で使用される、「オフターゲット」とは、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない効果を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレームに終止コドンを含まない配列を指す。
作動可能に連結される：本明細書で使用される、「作動可能に連結される」という句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的接続を指す。
任意に置換される：本明細書において、「任意に置換されるＸ」（例えば、任意に置換されるアルキル）の形の句は、「Ｘ、ここで、Ｘは任意に置換される」（例えば、「アルキル、ここで、該アルキルは任意に置換される」）と同等であることが意図される。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意であることを意味することは意図していない。
部分：本明細書で使用される、ポリヌクレオチドの「部分」または「領域」は、該ポリヌクレオチドの全長より短いポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。
患者：本明細書で使用される、「患者」とは、治療を求めている場合もあれば、治療を必要とする場合もある対象、治療が必要な対象、治療を受けている対象、治療を受ける予定の対象、または教育を受けた専門家によって特定の疾患もしくは状態の医療を受けている対象を指す。いくつかの実施形態では、該治療は、急性疾患の発症のリスクを予防もしくは低下させるために必要であるか、必須であるか、または与えられるもの、すなわち、予防的治療である。
医薬的に許容される：「医薬的に許容される」という句は、本明細書では、健全な医薬的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なくヒト及び動物の組織と接触する用途に適した、合理的なリスク・ベネフィット比に見合った化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために使用される。
医薬的に許容される賦形剤：本明細書で使用される、「医薬的に許容される賦形剤」という句は、本明細書に記載の化合物を除いた任意の成分（例えば、該活性化合物を懸濁または溶解することが可能な媒体）であるとともに、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性の特性を有する成分を指す。賦形剤としては、例えば、接着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、造膜剤またはコーティング、香味料、香料、流動促進剤（流動向上剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁または分散剤、甘味料、及び水和水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられるがこれらに限定されない。
医薬的に許容される塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容される塩も含む。本明細書で使用される、「医薬的に許容される塩」とは、本開示の化合物の誘導体を指し、この場合、該親化合物は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に転換することにより（例えば、遊離の塩基基を適切な有機酸と反応させることにより）修飾されている。医薬的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコへプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等が挙げられるがこれらに限定されない非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。本開示の医薬的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本開示の医薬的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含む親化合物から従来の化学的手法で合成され得る。一般に、かかる塩は、これら化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適切な塩基または酸と水中もしくは有機溶媒中またはこれら２つの混合物中で反応させることによって調製され得る。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水媒体が使用される。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６， １−１９（１９７７）に見出される。これらの各々は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
医薬的に許容される溶媒和物：本明細書で使用される、「医薬的に許容される溶媒和物」という用語は、適切な溶媒分子が結晶格子に組み込まれた本発明の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される用量で生理学的に許容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶、または沈殿により調製され得る。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ、Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ、Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジル等である。水が溶媒である場合、該溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
薬物動態：本明細書で使用される、「薬物動態」とは、生体に投与された物質の運命の特定に関する分子または化合物の任意の１つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝及び排せつの程度ならびに速度を含むいくつかの領域に分類される。これは、一般にＡＤＭＥと呼ばれ、ここで、（Ａ）吸収は、血液循環に入る物質の過程であり、（Ｄ）分布は、体内の液体及び組織全体にわたる物質の分散または播種であり、（Ｍ）代謝（または生体内変化）は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的変換であり、（Ｅ）排せつ（または排除）は、体内からの該物質の排除を指す。まれに、いくつかの薬物は体内組織に不可逆的に蓄積する。
物理化学的：本明細書で使用される、「物理化学的」とは、物理的及び／または化学的性質のもの、またはそれに関することを意味する。
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含めた任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、該分子の一次構造を指す。従って、この用語には、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）が含まれる。これには、例えば、ポリヌクレオチドのアルキル化による、及び／またはキャッピングによる修飾された形態、ならびに非修飾形態も含まれる。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語には、スプライシングされているかいないかにかかわらず、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｍＲＮＡを含めたポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンもしくはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド（ｎｏｒｍｕｃｌｅｏｔｉｄｉｃ）骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」））及びポリモルホリノポリマー、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマーであって、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対合及び塩基のスタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含む該ポリマーが含まれる。特定の態様では、該ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡを含む。他の態様では、該ｍＲＮＡは合成ｍＲＮＡである。いくつかの態様では、該合成ｍＲＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様では、ある特定のクラスのすべての核酸塩基は、非天然核酸塩基で置き換えられている（例えば、本明細書に開示のポリヌクレオチドのすべてのウリジンは、非天然核酸塩基、例えば、５−メトキシウリジンで置き換えられ得る）。いくつかの態様では、該ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、天然の核酸塩基のみを含み、すなわち、合成ＤＮＡの場合は、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、Ｃ（シチジン）、及びＴ（チミジン）、合成ＲＮＡの場合は、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＵ（ウリジン）のみを含む。
当業者には、本明細書に開示のコドンマップのＴ塩基はＤＮＡに存在し、対応するＲＮＡでは該Ｔ塩基がＵ塩基で置き換えられることが理解されよう。例えば、ＤＮＡ形態での本明細書に開示のコドンヌクレオチド配列、例えば、ベクターまたはインビトロ翻訳（ＩＶＴ）鋳型は、そのＴ塩基が、対応する転写されたｍＲＮＡにおいてはＵ塩基として転写される。この点において、コドン最適化ＤＮＡ配列（Ｔを含む）及び対応するｍＲＮＡ配列（Ｕを含む）は両方とも、本発明のコドン最適化ヌクレオチド配列と見なされる。当業者には、同等のコドンマップが、非天然塩基で置き換えられた１つ以上の塩基によって生成され得ることも理解されよう。従って、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これは次に、ψψＣコドン（Ｕがプソイドウリジンで置き換えられたＲＮＡマップ）に対応する。
標準的なＡ−Ｔ及びＧ−Ｃ塩基対は、チミジンのＮ３−Ｈ及びＣ４−オキシと、それぞれ、アデノシンのＮ１及びＣ６−ＮＨ２の間の水素結合、ならびにシチジンのＣ２−オキシ、Ｎ３及びＣ４−ＮＨ２と、それぞれ、グアノシンのＣ２−ＮＨ２，Ｎ’−Ｈ及びＣ６−オキシの間の水素結合の形成が可能な条件下で生じる。従って、例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）は、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成するように修飾され得る。かかる修飾により、シトシンと標準的な塩基対を効率的に形成しないヌクレオシド塩基となる。しかしながら、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）のイソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン−）を形成する修飾により、グアノシンと効率的に塩基対合しないが、イソグアノシンとは塩基対を形成する修飾ヌクレオチドとなる（米国特許第５，６８１，７０２号、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．）。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）から入手可能であり、イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：１０４８９−１０４９６及びそこで引用されている参考文献に記載の方法により調製することができ、２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンは、Ｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１−４４６７及びそこで引用されている参考文献の方法により調製することができ、イソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，上記、及びＭａｎｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１に記載の方法を用いて、または、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，７８０，６１０号に記載の方法により調製することができる。他の非天然塩基対は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３−３７に記載の方法により、２，６−ジアミノピリミジン及びその相補体（１−メチルピラゾロ−［４，３］ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオンの合成について合成することができる。独自の塩基対を形成する他のかかる修飾ヌクレオチド単位、例えば、Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３及びＳｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記、に記載のものが知られている。
ポリペプチド：「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では同義で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。該ポリマーは、修飾アミノ酸を含む場合がある。該用語は、自然にまたは介入、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。同様に該定義に含まれるのは、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、例えば、ホモシステイン、オルニチン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、Ｄ−アミノ酸、及びクレアチン等）、ならびに当技術分野で既知の他の修飾を含むポリペプチドである。
該用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドとしては、コードされたポリヌクレオチド産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片及びその他の同等のもの、バリアント、ならびに上記のもののアナログが挙げられる。ポリペプチドは、モノマーの場合もあれば、多分子複合体、例えば、ダイマー、トリマーまたはテトラマーの場合もある。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドを含み得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。いくつかの実施形態では、「ペプチド」は、５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長である。
ポリペプチドバリアント：本明細書で使用される、「ポリペプチドバリアント」という用語は、天然または参照配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。該アミノ酸配列バリアントは、天然または参照配列と比較して、置換、欠失、及び／または挿入を該アミノ酸配列内のある特定の位置に有し得る。通常、バリアントは、天然または参照配列に対して、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、それらは、天然または参照配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％同一である。
単位薬物当たりのポリペプチド（ＰＵＤ）：本明細書で使用される、ＰＵＤまたは単位薬物当たりの生成物とは、体液または組織で測定される生成物（ポリペプチド等）の１日当たりの総量、通常は１ｍｇ、ｐｇ、ｋｇ等の分割部分として定義され、通常、該体液での測定値で除した濃度、例えば、ｐｍｏｌ／ｍＬ、ｍｍｏｌ／ｍＬ等で定義される。
予防すること：本明細書で使用される、「予防すること」という用語は、感染症、疾患、障害及び／または状態の発症を部分的にまたは完全に遅延させること、特定の感染症、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、または臨床症状の発現を部分的にまたは完全に遅延させること、特定の感染症、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状、特徴、または兆候の発現を部分的にまたは完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害及び／または状態からの進行を部分的にまたは完全に遅延させること、及び／または該感染、該疾患、障害、及び／または状態と関連する病理の発症のリスクを減少させることを指す。
増殖する：本明細書で使用される、「増殖する」という用語は、急速に成長、拡大もしくは増加すること、または成長、拡大または増加を引き起こすことを意味する。「増殖性の」とは、増殖能力を有することを意味する。「抗増殖性の」とは、増殖性とは逆のまたはこれに適さない特性を有することを意味する。
予防の：本明細書で使用される、「予防の」とは、疾患の拡大を防止するために使用される治療または一連の作用を指す。
予防：本明細書で使用される、「予防」とは、健康を維持し、疾患の拡大を防ぐためにとられる措置を指す。「免疫予防」とは、疾患の拡大を防ぐための能動免疫または受動免疫を引き起こす措置を指す。
タンパク質切断部位：本明細書で使用される、「タンパク質切断部位」とは、アミノ酸鎖の制御された切断が、化学的、酵素的または光化学的手段によって達成され得る部位を指す。
タンパク質切断シグナル：本明細書で使用される、「タンパク質切断シグナル」とは、切断用のポリペプチドにフラグを立てるか、またはマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書で使用される、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語には、本明細書に提供するものならびにその断片、変異体、バリアント、及び改変が含まれる。
近位：本明細書で使用される、「近位」という用語は、目的の中央または点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
プソイドウリジン：本明細書で使用される、プソイドウリジン（ψ）とは、ヌクレオシドウリジンのＣ−グリコシド異性体を指す。「プソイドウリジンアナログ」は、プソイドウリジンの任意の修飾、バリアント、アイソフォームまたは誘導体である。例えば、プソイドウリジンアナログとしては、１−カルボキシメチル−１−プソイドウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１ψ）（別名Ｎ１−メチル−プソイドウリジン）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ψ）、及び２’−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。
精製された：本明細書で使用される、「精製する」、「精製された」、「精製」とは、不要な成分、材料汚染、混合、または不完全から実質的に純粋または清浄にすることを意味する。
参照核酸配列：「参照核酸配列」または「参照核酸」または「参照ヌクレオチド配列」または「参照配列」という用語は、配列最適化され得る開始核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ配列）を指す。いくつかの実施形態では、該参照核酸配列は、野生型核酸配列、断片またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、該参照核酸配列は、以前に配列最適化された核酸配列である。
塩：いくつかの態様では、本明細書に開示の送達用医薬組成物は、それらの脂質成分のいくつかの塩を含む。「塩」という用語は、任意のアニオン性及びカチオン性複合体を含む。アニオンの非限定的な例としては、無機及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）、リン酸、ホスホン酸、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸、重炭酸、硝酸、亜硝酸、窒化物、重亜硫酸、硫化物、亜硫酸、重硫酸、硫酸、チオ硫酸、硫酸水素、ホウ酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、アクリル酸、ポリアクリル酸、フマル酸、マレイン酸、イタコン酸、グリコール酸、グルコン酸、リンゴ酸、マンデル酸、チグリン酸、アスコルビン酸、サリチル酸、ポリメタクリル酸、過塩素酸、塩素酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、臭素酸、次亜臭素酸、ヨウ素酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、ヒ酸、亜ヒ酸、クロム酸、重クロム酸、シアン化物、シアン酸、チオシアン酸、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸、及びそれらの混合物が挙げられる。
サンプル：本明細書で使用される、「サンプル」または「生体サンプル」という用語は、その組織、細胞または構成部分の一部（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜帯液、尿、膣液及び精液が挙げられるがこれらに限定されない体液）を指す。サンプルとしてはさらに、生物全体あるいはその組織、細胞もしくは構成部分の一部、またはその画分もしくは部分、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の外側部分、気道、腸管、及び尿生殖器、涙液、唾液、母乳、血球、腫瘍、器官等から調製されるホモジネート、溶解物または抽出物を挙げることができる。サンプルはさらに、培地、例えば、ＮＢ培地またはゲルを指し、これは細胞成分、例えば、タンパク質または核酸分子を含むことができる。
シグナル配列：本明細書で使用される、「シグナル配列」、「シグナルペプチド」、及び「輸送ペプチド」という句は、同義で使用され、タンパク質の輸送または局在をある特定のオルガネラ、細胞コンパートメント、または細胞外輸送に向けることができる配列を指す。該用語は、シグナル配列のポリペプチド及び該シグナル配列をコードする核酸配列の両方を包含する。従って、核酸の観点からのシグナル配列への言及は、実際には、該シグナル配列のポリペプチドをコードする核酸配列を指す。
シグナル伝達経路：「シグナル伝達経路」とは、細胞の１つの部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。本明細書で使用される、「細胞表面受容体」という句は、例えば、シグナルを受信することならびにかかるシグナルの細胞の原形質膜を通した伝達が可能な分子及び分子の複合体を含む。
類似性：本明細書で使用される、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全般的な近縁性を指す。ポリマー分子相互の類似性パーセントの計算は、類似性パーセントの計算が、当技術分野で理解されている保存的置換を考慮に入れること以外は、同一性パーセントの計算と同じ方法で行うことができる。
単回単位用量：本明細書で使用される、「単回単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち、単回投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
分割用量：本明細書で使用される、「分割用量」は、単回単位用量または1日当たりの総量の２用量以上への分割である。
特異的送達：本明細書で使用される、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、ナノ粒子によって、目的の標的組織（例えば、哺乳類の肝臓）への、オフターゲット組織（例えば、哺乳類の脾臓）より多く（例えば、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多く）のポリペプチドの送達を意味する。特定の組織へのナノ粒子の送達のレベルは、組織で産生されるタンパク質の量を当該組織の重量と比較すること、組織のポリヌクレオチド量を当該組織の重量と比較すること、組織で産生されるタンパク質の量を当該組織の総タンパク質量と比較すること、または組織のポリヌクレオチド量を当該組織の総ポリヌクレオチド量と比較することにより測定され得る。例えば、腎血管の標的化の場合、当該ポリヌクレオチドの全身投与後、肝臓及び脾臓に送達されるものと比較して、組織１ｇ当たり、１．５、２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、または２０倍多くのポリヌクレオチドが腎臓に送達された場合に、ポリヌクレオチドは、肝臓及び脾臓と比較して、哺乳類の腎臓に特異的に提供される。標的組織へのナノ粒子の特異的送達能力は、治療される対象で特定する必要はなく、動物モデル（例えば、ラットモデル）等の代理のもので測定することができることが理解されよう。
安定な：本明細書で使用される、「安定な」とは、反応混合物からの有用な純度までの単離に耐えるのに十分堅牢であり、場合によっては、有効な治療薬への製剤化が可能な化合物を指す。
安定化された：本明細書で使用される、「安定化する」、「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にすることまたは安定することを意味する。
立体異性体：本明細書で使用される、「立体異性体」という用語は、化合物が有し得るすべての可能な異なる異性体及び立体配座形態（例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物）、特に、基本分子構造のすべての可能な立体化学的及び立体配座的異性体、すべてのジアステレオマー、エナンチオマー及び／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性型で存在する場合があり、後者のすべてが本発明の範囲に含まれる。
対象：「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象としては、ヒト、家畜動物、農場の動物、動物園の動物、競技動物、愛玩動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛、霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジー、イヌ科動物、例えば、イヌ及びオオカミ、ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、及びトラ、ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、及びシマウマ、クマ、食用動物、例えば、ウシ、ブタ、及びヒツジ、有蹄動物、例えば、シカ及びキリン、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモット等が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、該哺乳類はヒト対象である。他の実施形態では、対象はヒト患者である。特定の実施形態では、対象は治療を必要とするヒト患者である。
実質的に：本明細書で使用される、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全面的もしくはほぼ全面的な範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物学の分野における当業者には、生物学的及び化学的性質が、完成まで進むこと及び／または完全性へと進むことまたは絶対的な結果を達成することもしくは回避することがめったにないことが理解されよう。「実質的に」という用語は、従って、本明細書では、多くの生物学的及び化学的特徴に内在する完全性の潜在的な欠如を捕えるために使用される。
実質的に等しい：本明細書で使用され、投与間の時間差に関連する場合、該用語はプラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時：本明細書で使用され、複数の投与に関連する場合、該用語は２秒以内を意味する。
〜に罹患している：疾患、障害、及び／または状態「に罹患している」個体は、該疾患、障害、及び／または状態であると診断されているか、またはその１つ以上の症状を示す。
〜の影響を受けやすい：疾患、障害、及び／または状態「の影響を受けやすい」個体は、該疾患、障害、及び／または状態であると診断されていない、及び／またはその症状を示すことができないが、疾患またはその症状を発現する傾向がある。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態（例えば、ＰＫＵ）の影響を受けやすい個体は、以下の１つ以上を特徴とし得る：（１）該疾患、障害、及び／または状態の発症と関連する遺伝子突然変異、（２）該疾患、障害、及び／または状態の発症と関連する遺伝的多型、（３）該疾患、障害、及び／または状態と関連するタンパク質及び／または核酸の発現及び／または活性の増加及び／または減少、（４）該疾患、障害、及び／または状態の発症と関連する習慣及び／または生活様式、（５）該疾患、障害、及び／または状態の家族歴、ならびに（６）該疾患、障害、及び／または状態の発症と関連する微生物への曝露及び／またはそれによる感染。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、該疾患、障害、及び／または状態を発症する。いくつかの実施形態では、疾患、障害、及び／または状態の影響を受けやすい個体は、該疾患、障害、及び／または状態を発症しない。
持続放出：本明細書で使用される、「持続放出」という用語は、特定の期間にわたり、ある放出速度に従う医薬組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
合成の：「合成の」という用語は、人の手によって産生される、調製される、及び／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
標的細胞：本明細書で使用される、「標的細胞」とは、任意の１つ以上の目的の細胞を指す。該細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュまたは生物の組織もしくは器官に見出され得る。該生物は、動物、例えば、哺乳類、ヒト、対象または患者であり得る。
標的組織：本明細書で使用される、「標的組織」とは、ポリヌクレオチドの送達により、所望の生物学的及び／または薬理学的効果がもたらされる任意の１つ以上の目的の組織型を指す。目的の標的細胞の例としては、特定の組織、器官、及びその系または群が挙げられる。特定の用途では、標的組織は、肝臓、腎臓、肺、脾臓、または血管（例えば、冠動脈内または大腿内）の血管内皮であり得る。「オフターゲット組織」とは、コードされたタンパク質の発現が、所望の生物学的及び／または薬理学的効果をもたらさない任意の１つ以上の細胞型を指す。
オフターゲット組織における治療薬の存在は、（ｉ）投与部位から周辺組織もしくは遠隔オフターゲット組織への拡散もしくは血流を介したポリヌクレオチドの漏出（例えば、ある特定の組織でポリペプチドを発現することを意図したポリヌクレオチドが、該オフターゲット組織に到達し、該ポリペプチドは、該オフターゲット組織で発現される）、または（ｉｉ）かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与後の周辺組織もしくは遠隔オフターゲット組織への拡散もしくは血流を介したポリペプチドの漏出（例えば、ポリヌクレオチドは、該標的組織でポリペプチドを発現し、該ポリペプチドが周辺組織に拡散する）の結果であり得る。
標的化配列：本明細書で使用される、「標的化配列」という句は、タンパク質またはポリペプチドの輸送または局在を指示することができる配列を指す。
末端：本明細書で使用される、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。かかる末端は、該ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位だけに限定されず、該末端領域のさらなるアミノ酸を含むことができる。本発明のポリペプチド系分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終わる）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終わる）の両方を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、場合によっては、ジスルフィド結合により、または非共有結合力により一緒にされた複数のポリペプチド鎖で構成されている（多量体、オリゴマー）。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ及びＣ末端を有する。代替的に、該ポリペプチドの末端は、それらが、場合によっては、非ポリペプチド系の部分、例えば、有機コンジュゲートで始まるまたは終わるように修飾され得る。
治療薬：「治療薬」という用語は、対象に投与された場合に、治療的、診断的、及び／または予防的効果を有する、及び／または所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する薬剤を指す。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＨポリペプチドをコードするｍＲＮＡは治療薬になり得る。
治療有効量：本明細書で使用される、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているまたはその影響を受けやすい対象に投与した場合に、該感染症、疾患、障害、及び／または状態を治療、その症状を改善、診断、予防、及び／またはその発症を遅延させるのに十分な、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療薬、診断薬、予防薬等）の量を意味する。
治療上効果的な結果：本明細書で使用される、「治療上効果的な結果」という用語は、感染症、疾患、障害、及び／または状態に罹患しているまたはその影響を受けやすい対象において、該感染症、疾患、障害、及び／または状態を治療、その症状を改善、診断、予防、及び／またはその発症を遅延させるのに十分な結果を意味する。
１日当たりの総量：本明細書で使用される、「１日当たりの総量」とは、２４時間で投与されるまたは処方される量である。該１日当たりの総量は、単一単位用量として投与される場合もあれば、分割用量として投与される場合もある。
転写因子：本明細書で使用される、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＤＮＡのＲＮＡへの転写を調節するＤＮＡ結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、単独で転写の調節に影響を及ぼすが、他の転写因子は他のタンパク質と協調して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下では、転写の活性化及び抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域における特定のコンセンサス配列と高度に類似した特定の標的配列（複数可）に結合する。転写因子は、単独でまたは他の分子との複合体で標的遺伝子の転写を調節することができる。
転写：本明細書で使用される、「転写」という用語は、ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ鋳型または配列）からｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ配列または鋳型）を産生する方法を指す。
トランスフェクション：本明細書で使用される、「トランスフェクション」とは、ポリヌクレオチド（例えば、外因性核酸）の細胞への導入を指し、該細胞内で該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現する（例えば、ｍＲＮＡ）か、または該ポリペプチドが細胞機能を調節する（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）。本明細書で使用される、核酸配列の「発現」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のポリペプチドもしくはタンパク質への翻訳及び／またはポリペプチドもしくはタンパク質の翻訳後修飾を指す。トランスフェクションの方法としては、化学的方法、物理的処理及びカチオン性脂質または混合物が挙げられるがこれらに限定されない。
治療すること、治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、治療（ｔｈｅｒａｐｙ）：本明細書で使用される、「治療すること」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、疾患、例えば、高フェニルアラニン血症、ＰＫＵを部分的にまたは完全に緩和すること、改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善すること（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻害すること、その重症度を低下させること、及び／またはその１つ以上の症状もしくは特徴の発生率を低下させることを指す。例えば、ＰＫＵを「治療すること」とは、該疾患と関連する症状を軽減すること、患者の寿命を延ばす（生存率を向上させる）こと、該疾患の重症度を低下させること、該疾患の発症を予防することまたは遅延させること等を指すことができる。治療は、疾患、障害、及び／または状態の兆候を示していない対象に対して、及び／または疾患、障害、及び／または状態の初期症状を示しているのみの対象に対して、該疾患、障害、及び／または状態と関連する病態の発症のリスクを低下させる目的で施される場合がある。
未修飾の：本明細書で使用される、「未修飾の」とは、何らかの方法で変更される前の任意の物質、化合物または分子を指す。未修飾のとは、必ずではないが、生体分子の野生型または天然型を指す場合がある。分子は、各修飾分子が後続の修飾に対して「未修飾の」出発分子としての役割を果たす一連の修飾を受ける場合がある。
ウラシル：ウラシルは、核酸ＲＮＡの４つの核酸塩基のうちの１つであり、Ｕの文字で表される。ウラシルは、リボース環、より具体的には、β−Ｎ１−グリコシド結合を介してリボフラノースに結合し、ヌクレオシドウリジンを生じ得る。ヌクレオシドウリジンもまた、通常、その核酸塩基の１文字コード、すなわち、Ｕで短縮される。従って、本開示の観点から、ポリヌクレオチド配列のモノマーがＵの場合、かかるＵは、「ウラシル」または「ウリジン」として区別しないで示される。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は、同義であり、ある特定の核酸配列に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（該配列中のウリジンもしくはウラシルの総数）または相対値（該核酸配列中の核酸塩基の総数に対するウリジンもしくはウラシルのパーセンテージ）として表すことができる。
ウリジン修飾配列：「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含量及び／またはウリジンパターンと比較して、異なる全体的なまたは局所的なウリジン含量（高いもしくは低いウリジン含量）あるいは異なるウリジンパターン（例えば、傾斜分布またはクラスタリング）を備えた配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の観点から、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同等及び同義であると見なされる。
「高ウリジンコドン」とは、２つまたは３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「ウリジンなしのコドン」は、ウリジンを含まないコドンである。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンでの置換、高ウリジンコドンのウリジンなしのコドンでの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンでの置換、低ウリジンコドンのウリジンなしのコドンでの置換、ウリジンなしのコドンの低ウリジンコドンでの置換、ウリジンなしのコドンの高ウリジンコドンでの置換、及びそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、ウリジンなしのコドンは、別のウリジンなしのコドンで置き換えることができる。ウリジン修飾配列は、ウリジンが濃縮される場合もあれば、ウリジンが希薄にされる場合もある。
ウリジンが濃縮される：本明細書で使用される、「ウリジンが濃縮される」という用語及び文法上の異形は、対応する候補核酸配列のウリジン含量と比較した、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）におけるウリジン含量（絶対値またはパーセンテージの値で表される）の増加を指す。ウリジン濃縮は、候補核酸配列におけるコドンをウリジン核酸塩基が少ない同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン濃縮は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）の場合もあれば、局所的（すなわち、候補核酸配列の部分列または領域に対する）の場合もある。
ウリジンが希薄にされる：本明細書で使用される、「ウリジンが希薄にされる」という用語及び文法上の異形は、対応する候補核酸配列のウリジン含量と比較した、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）におけるウリジン含量（絶対値またはパーセンテージの値で表される）の低下を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列におけるコドンをウリジン核酸塩基が少ない同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対する）の場合もあれば、局所的（すなわち、候補核酸配列の部分列または領域に対する）の場合もある。
バリアント：本開示で使用される、バリアントという用語は、天然バリアント（例えば、多型、アイソフォーム等）及び、人工的バリアントの両方を指し、そこでは、天然のまたは出発配列（例えば、野生型配列）における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されている。これらのバリアントは、「置換バリアント」と呼ぶことができる。該置換は、単一、すなわち、分子中の１つのアミノ酸のみが置換されている場合もあれば、複数、すなわち、同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換されている場合もある。アミノ酸が挿入または削除される場合、得られるバリアントは、それぞれ、「挿入バリアント」または「欠失バリアント」である。
開始コドン：本明細書で使用される、「開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）」という用語は、「開始コドン（ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）」という用語と同義で使用され、オープンリーディングフレームの最初のコドンを指し、リボソームによって翻訳され、連結されたアデニン−ウラシル−グアニン核酸塩基のトリプレットからなる。該開始コドンは、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、及びグアニン（Ｇ）の最初の文字コードで示され、多くの場合、単に「ＡＵＧ」と表記される。天然のｍＲＮＡは、開始コドンとしてＡＵＧ以外のコドンを使用する場合があるが、本明細書ではこれを「代替開始コドン」と呼び、本明細書に記載のポリヌクレオチドの開始コドンは、ＡＵＧコドンを使用する。翻訳開始のプロセスで、該開始コドンを含む配列は、リボソームが結合した開始ｔＲＮＡ（Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔ）のアンチコドンへの相補的塩基対合を介して認識される。オープンリーディングフレームは、複数のＡＵＧ開始コドンを含む場合があり、これらは本明細書では、「代替開始コドン」と呼ばれる。
該開始コドンは、翻訳開始において重要な役割を果たす。該開始コドンは、リボソームによって翻訳されるオープンリーディングフレームの最初のコドンである。通常、該開始コドンは、ヌクレオチドトリプレットＡＵＧを含むが、ある場合には、翻訳の開始は、異なるヌクレオチドから構成される他のコドンで生じる場合がある。真核生物での翻訳の開始は、多段階の生化学的プロセスであり、これは、メッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）、４０Ｓリボソームサブユニット、該翻訳機構の他の成分（例えば、真核生物の開始因子、ｅＩＦ）間の多くのタンパク質−タンパク質、タンパク質−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を含む。現在のｍＲＮＡの翻訳開始モデルは、転写開始前複合体（または「４３Ｓ転写開始前複合体」、「ＰＩＣ」と略される）が、特定の翻訳促進ヌクレオチド構成（コザック配列）内に存在する最初のＡＵＧコドンに遭遇するまで、ヌクレオチドを５’から３’の方向にスキャンニングすることにより、ｍＲＮＡの動員部位（通常は５’キャップ）から開始コドンへと移動することを前提としている（Ｋｏｚａｋ（１９８９）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０８：２２９−２４１）。ＰＩＣによるスキャンニングは、開始Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ ＭｅｔトランスファーＲＮＡのアンチコドンを含むヌクレオチドと、ｍＲＮＡの開始コドンを含むヌクレオチド間の相補的塩基対合で終了する。該ＡＵＧコドンと該Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔアンチコドン間の生産的な塩基対合は、大６０ＳリボソームサブユニットのＰＩＣへの結合に至って翻訳延長に適任の活性リボソームを形成する一連の構造的及び生化学的事象を誘発する。
コザック配列：「コザック配列」（「コザックコンセンサス配列」とも呼ばれる）という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を向上させる翻訳開始エンハンサー要素を指し、真核生物では、５’ＵＴＲに位置する。該コザックコンセンサス配列は、元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳における開始コドン（ＡＵＧ）周囲の単一突然変異の影響の分析に従い、ＧＣＣＲＣＣ、ただし、Ｒ＝プリン、の配列として定義された（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４：２８３−２９２）。本明細書に開示のポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは修飾を含む。（翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＡｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８０７，７０７号、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＣｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙの米国特許第５，７２３，３３２号、参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＷｉｌｓｏｎの米国特許第５，８９１，６６５号を参照されたい）。
修飾された：本明細書で使用される、「修飾された」または「修飾」とは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成もしくは構造の変化した状態または変化を指す。ポリヌクレオチドは、化学的に、構造的に、及び／または機能的に等の様々な方法で修飾され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ要素の組み込みによって構造的に修飾されてもよく、この場合、該ＲＮＡ要素は、１つ以上の機能（例えば、翻訳調節活性）を提供する配列及び／またはＲＮＡの二次構造（複数可）を含む。従って、本開示のポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾から構成され得る（例えば、１つ以上の化学的、構造的、または機能的修飾をそれらの任意の組み合わせを含めて含み得る）。
核酸塩基：本明細書で使用される、「核酸塩基」（または「ヌクレオチド塩基」もしくは「窒素塩基」）という用語は、核酸に見出されるプリンまたはピリミジンヘテロ環式化合物を指し、核酸またはその部分もしくはセグメントに改善された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与する天然に存在するプリン及びピリミジンの任意の誘導体またはアナログを含む。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルが、天然の核酸に主に見られる核酸塩基である。当技術分野で既知の、及び／または本明細書に記載の他の天然、非天然、及び／または合成核酸塩基を核酸に組み込むことができる。
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用される、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）、またはその誘導体もしくはアナログ（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）に共有結合した糖分子（例えば、ＲＮＡのリボースもしくはＤＮＡのデオキシリボース）、またはその誘導体もしくはアナログを含むが、ヌクレオシド間の連結基（例えば、リン酸基）を欠く化合物を指す。本明細書で使用される、「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）に共有結合したヌクレオシド、あるいは核酸またはその部分もしくはセグメントに改善された化学的及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与するその任意の誘導体、アナログ、または修飾を指す。
核酸：本明細書で使用される、「核酸」という用語は、その最も広い意味で使用され、ヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。これらのポリマーは、多くの場合、「ポリヌクレオチド」と呼ばれる。従って、本明細書で使用される、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、同等であり、同義で使用される。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ、β−Ｄ−リボ構成を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ構成を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ等）またはそれらのハイブリッドが挙げられるがこれらに限定されない。
核酸構造：本明細書で使用される、「核酸構造」（「ポリヌクレオチド構造」と同義で使用される）という用語は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む連結したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学成分、要素、モチーフ、及び／または配列の配置または組織を指す。該用語はまた、２次元または３次元状態の核酸も指す。従って、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む連結したヌクレオチド、またはその誘導体もしくはアナログの原子、化学成分、要素、モチーフ、及び／または配列の配置または組織を指し、及び／または２次元及び／または３次元状態のＲＮＡ分子を指す。核酸構造は、さらに、本明細書では、組織的な複雑性の増加に基づいて「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と呼ばれる４つの組織的なカテゴリーに区分され得る。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用される、「ＯＲＦ」と略される「オープンリーディングフレーム」という用語は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。該ＯＲＦは、開始コドンで始まり、終止コドンで終わる一続きの非重複、インフレームコドンを含み、リボソームによって翻訳される。
転写開始前複合体（ＰＩＣ）：本明細書で使用される、「転写開始前複合体」（または「４３Ｓ転写開始前複合体」、「ＰＩＣ」と略される）は、４０Ｓリボソームサブユニット、真核生物の開始因子（ｅＩＦ１、ｅＩＦ１Ａ、ｅＩＦ３、ｅＩＦ５）、及びｅＩＦ２−ＧＴＰ−Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉ Ｍｅｔ三重複合体を含むリボ核タンパク質複合体を指し、これは、本質的にｍＲＮＡ分子の５’キャップへの結合が可能であり、結合後、該５’ＵＴＲのリボソームスキャンニングを実施することが可能である。
ＲＮＡ要素：本明細書で使用される、「ＲＮＡ要素」という用語は、生物学的機能を与え、及び／または生物活性（例えば、翻訳調節活性）を有するＲＮＡ分子の部分、断片、またはセグメントを指す。１つ以上のＲＮＡ要素、例えば、本明細書に記載のものの組み込みによるポリヌクレオチドの修飾は、当該修飾ポリヌクレオチドに１つ以上の所望の機能特性を与える。本明細書に記載のＲＮＡ要素は、天然に存在する場合、非天然に存在する場合、合成の場合、操作されている場合、またはそれらの任意の組み合わせの場合がある。例えば、調節活性を与える天然に存在するＲＮＡ要素としては、ウイルス、原核生物及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトーム全体に見出される要素が挙げられる。特定の真核生物のｍＲＮＡ及び翻訳されたウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡ要素は、細胞の多くの機能を媒介することに関与していることが示された。例示的な天然のＲＮＡ要素としては、翻訳開始要素（例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ ７（２）：１９４−２０６参照）、翻訳エンハンサー要素（例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡ翻訳エンハンサー要素、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１０）：６４２１−６４３１参照）、ｍＲＮＡ安定性要素（例えば、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（２）：１１３−１２６参照）、翻訳抑制要素（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１０（１−２）：９７−１１２参照）、タンパク質結合ＲＮＡ要素（例えば、鉄応答要素、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５（１８）：３３０１−３３１０参照）、細胞質ポリアデニル化要素（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２−４５７）、及び触媒ＲＮＡ要素（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９） Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９（９−１０）：６３４−６４１参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
滞留時間：本明細書で使用される、「滞留時間」という用語は、ｍＲＮＡ分子に沿った個別の位置または場所での転写開始前複合体（ＰＩＣ）またはリボソームの占有時間を指す。
翻訳調節活性：本明細書で使用される、「翻訳調節活性」（「翻訳調節機能」と同義で使用される）という用語は、翻訳装置の活性、すなわち、該ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性等を調節する（例えば、調整する、影響を与える、制御する、変化させる）生物学的機能、機序、またはプロセスを指す。いくつかの態様では、所望の翻訳調節活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実度を促進及び／または強化する。いくつかの態様では、所望の翻訳調節活性は、開始コドンスキャンニング漏れを低減及び／または抑制する。
２９．均等物及び範囲
当業者は、日常の実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明に従う特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の冠詞は、それとは反対の指示がない限り、または文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、１つまたは複数を意味することができる。群の１つ以上の成員間に「または」を含む請求項または説明は、それとは反対の指示がない限り、または文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、該群の成員の１つ、複数、またはすべてが、所与の生成物もしくはプロセスに存在し、使用され、または関連する場合に満たされていると見なされる。本発明は、該群の正確に１つの成員が所与の生成物もしくはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。本発明は、該群の複数の、またはすべての成員が所与の生成物もしくはプロセスに存在し、使用され、または関連する実施形態を含む。
「含む」という用語は、オープンであることを意図しており、さらなる要素またはステップの含有を許容するが、必要とはしないこともまた留意される。「含む」という用語が本明細書で使用される場合、「〜からなる」という用語もまた、従って、包含され開示される。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、特に明記しない限り、または文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲で表される値は、本発明の異なる実施形態において規定される範囲内の任意の特定の値または部分的な範囲を、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、該範囲の下限の単位の１０分の１までと見なすことができることが理解される。
さらに、先行技術の範囲に入る本発明の任意の特定の実施形態は、任意の１つ以上の請求項から明示的に除外され得ることが理解される。かかる実施形態は当業者に既知であると見なされるため、該除外が本明細書で明示的に記載されていない場合でも、それらを除外することができる。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質、任意の産生方法、任意の使用方法等）は、先行技術の存在に関連しているか否かにかかわらず、何らかの理由により、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。
本明細書で引用されているすべての出典、例えば、参考文献、出版物、データベース、データベース・エントリ、及び技術は、該引用で明示的に述べられていない場合であっても、参照することにより本出願に組み込まれる。引用された出典と本出願の記述が矛盾する場合は、本出願の記述が優先するものとする。
セクション及び表の見出しは、限定することを意図しない。
構築物の配列
「Ｇ５」は、当該ｍＲＮＡにおけるすべてのウラシル（Ｕ）がＮ１−メチルプソイドウラシルで置き換えられることを意味する。
「Ｇ６」は、当該ｍＲＮＡにおけるすべてのウラシル（Ｕ）が５−メトキシウラシルで置き換えられることを意味する。


























































































































実施例１：キメラポリヌクレオチドの合成
Ａ．三リン酸経路
キメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分は、三リン酸化学種を用いて結合または連結することができる。本方法によれば、１００ヌクレオチド以下の第一の領域または部分は、５’一リン酸及び末端３’ｄｅｓＯＨまたはブロックされたＯＨで化学的に合成することができる。該領域が８０ヌクレオチドを超える場合、結合用に２本の鎖として合成することができる。
該第一の領域または部分を、インビトロ転写（ＩＶＴ）を用いて非位置的に修飾された領域または部分として合成する場合、５’一リン酸の変換とそれに続く３’末端のキャッピングを続けることができる。一リン酸の保護基は、当業者に既知のもののいずれかから選択することができる。
該キメラポリヌクレオチドの第二の領域または部分は、化学合成またはＩＶＴ法のいずれかを用いて合成することができる。ＩＶＴ法は、ＲＮＡポリメラーゼを含むことができ、その場合、修飾されたキャップを有するプライマーを利用することができる。別の方法として、８０ヌクレオチドまでのキャップを化学的に合成し、該ＩＶＴ領域または部分に連結することができる。
ライゲーション法の場合、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼによるライゲーションの後のＤＮＡｓｅでの処理により、連鎖が容易に回避されるはずであることが留意される。
キメラポリヌクレオチド全体をリン酸−糖骨格で製造する必要はない。該領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、かかる領域または部分が、リン酸−糖骨格を含むことができる。
ライゲーションは、その後、任意の既知のクリックケミストリー、オルソクリックケミストリー、ソルリンク、または当業者に既知の他のバイオコンジュゲートケミストリーを用いて行うことができる。
Ｂ．合成経路
該キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作製することができる。かかるセグメントは以下のものを含む：
（ａ）通常の３’ＯＨを含む、キャップされ、保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含むことができ、通常の３’ＯＨを含む５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含むか、または３’ＯＨを含まないキメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、テール）用の５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）。
合成（化学的またはＩＶＴ）後、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコルジセピンで、次いでピロホスファターゼで処理し、５’一リン酸を作り出すことができる。
セグメント２（ＳＥＧ．２）を次にＲＮＡリガーゼを用いてＳＥＧ．３にライゲーションすることができる。このライゲーションされたポリヌクレオチドをその後精製し、ピロホスファターゼで処理して二リン酸を切断することができる。この処理されたＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を次に精製し、ＳＥＧ．１を５’末端にライゲーションさせる。このキメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを行うことができる。
このキメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、ライゲーションまたは結合されたセグメントは、次のように表すことができる：５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）。
各ステップの収率は、９０〜９５％になり得る。
実施例２：ｃＤＮＡ産生用のＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製用のＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）製２ｘＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて行うことができる。このシステムは、２ｘＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．７５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ−１００ｎｇ、及びｄＨ２Ｏ希釈２５．０μｌまでを含む。このＰＣＲ反応条件は次の通りであり得る：９５℃で５分間及び９８℃で２０秒間を２５サイクル、その後５８℃で１５秒間、その後７２℃で４５秒間、その後７２℃で５分間、次に４℃で終了まで。
本発明のリバースプライマーは、ｍＲＮＡのポリＡ１２０に対してポリＴ１２０を組み込むことができる。より長いまたは短いポリ（Ｔ）トラクトを備えた他のリバースプライマーを用いて、ポリヌクレオチドｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの長さを調節することができる。
この反応は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用い、製造業者の指示に従ってクリーンアップすることができる（５μｇまで）。より大きな反応では、より大容量の製品を用いてクリーンアップする必要がある。クリーンアップ後、ｃＤＮＡを、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を用いて定量し、アガロースゲル電気泳動を用いて分析し、そのｃＤＮＡが予想されたサイズであることを確認することができる。このｃＤＮＡを次に配列解析に供し、その後インビトロ転写反応に進めることができる。
実施例３：インビトロ転写（ＩＶＴ）
インビトロ転写反応では、均一に修飾されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを生成することができる。かかる均一に修飾されたポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの領域または部分を含み得る。投入するヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）ミックスは、天然及び非天然のＮＴＰを用いて作製することができる。
通常のインビトロ転写反応は、以下を含むことができる：
１ 鋳型ｃＤＮＡ−１．０μｇ
２ １０×転写緩衝液（４００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭスペルミジン）−２．０μｌ
３ カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）−７．２μｌ
４ ＲＮａｓｅ阻害剤−２０Ｕ
５ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ−３０００Ｕ
６ ｄＨ２Ｏ−２０μｌまで。及び
７ ３７℃で３時間〜５時間インキュベーション。
この粗製ＩＶＴミックスを４℃で一夜保存して翌日クリーンアップすることができる。次に、ＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅの１Ｕを用いて元の鋳型を消化することができる。３７℃で１５分間インキュベートした後、このｍＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて製造業者の指示に従って精製することができる。このキットは、５００μｇまでのＲＮＡを精製することができる。クリーンアップ後、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いてこのＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析し、このＲＮＡが適切なサイズであること及びこのＲＮＡの分解が生じていないことを確認することができる。
実施例４：酵素的キャッピング
ポリヌクレオチドのキャッピングは、ＩＶＴ ＲＮＡ６０μｇ〜１８０μｇ及びｄＨ２Ｏ ７２μｌまでを含む混合物を用いて行うことができる。この混合物を６５℃で５分間インキュベートしてＲＮＡを変性することができ、その後ただちに氷に移すことができる。
このプロトコルは次に、１０ｘキャッピング緩衝液（０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）、２０ｍＭ ＧＴＰ（５．０μｌ）、２０ｍＭ Ｓ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）、ワクシニアキャッピング酵素（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）、ｄＨ２Ｏ（２８μｌまで）を混合すること、及び６０μｇのＲＮＡについては３７℃で３０分間、１８０μｇのＲＮＡついては２時間までのインキュベーションを含むことができる。
このポリヌクレオチドを次に、ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて製造業者の指示に従って精製することができる。クリーンアップ後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてこのＲＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動により分析し、このＲＮＡが適切なサイズであること及びこのＲＮＡの分解が生じていないことを確認することができる。このＲＮＡ生成物はまた、配列決定用のｃＤＮＡを生成する逆転写ＰＣＲを実行して配列決定することができる。
実施例５：ポリＡテール付加反応
ｃＤＮＡにポリＴがない場合、最終産物のクリーンアップ前にポリＡテール付加を実施する必要がある。これは、キャップされたＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）、１０ｘテール付加緩衝液（０．５Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）、２０ｍＭ ＡＴＰ（６．０μｌ）、ポリＡポリメラーゼ（２０Ｕ）、ｄＨ２Ｏを１２３．５μｌまでを混合すること、及び３７℃で３０分間インキュベートすることにより行うことができる。ポリＡテールがすでに転写物にある場合、このテール付加反応を省略して直接ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）キット（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）でのクリーンアップに進むことができる（５００μｇまで）。ポリＡポリメラーゼは、場合によっては、酵母で発現される組み換え酵素である。
ポリＡテール付加反応の処理能力または完全性は、必ずしも正確なサイズのポリＡテールをもたらすとは限らないことを理解されたい。従って、およそ４０〜２００ヌクレオチド、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５ヌクレオチドのポリＡテールが本発明の範囲に含まれる。
実施例６：天然の５’キャップ及び５’キャップアナログ
ポリヌクレオチドの５’−キャッピングは、５’−グアノシンキャップ構造を生成する以下の化学的ＲＮＡキャップアナログを用いて、製造者のプロトコルに従い、インビトロ転写反応の過程で同時に完了することができる：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ［ＡＲＣＡキャップ］、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）。修飾ＲＮＡの５’−キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて、転写後に「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を生成して完了することができる。キャップ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を用いて生成することができる。キャップ２構造は、キャップ１構造から、５’末端から３番目のヌクレオチドを２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて２’−Ｏ−メチル化することにより生成することができる。キャップ３構造は、キャップ２構造から、５’末端から３番目のヌクレオチドを２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて２’−Ｏ−メチル化することにより生成することができる。酵素は組み換え供給源から得ることができる。
哺乳類細胞にトランスフェクトされた場合、該修飾ｍＲＮＡは、１２〜１８時間または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、または７２時間を超える安定性を有することができる。
実施例７：キャッピングアッセイ
Ａ．タンパク質発現アッセイ
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、等しい濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの６、１２、２４、及び３６時間後、培地に分泌されたタンパク質の量をＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。より高レベルのタンパク質を培地に分泌する合成ポリヌクレオチドは、翻訳的に能力がより高いキャップ構造の合成ポリヌクレオチドに相当する。
Ｂ．純度分析合成
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析を用いて純度を比較することができる。電気泳動による単一の統合されたバンドを有するポリヌクレオチドは、複数のバンドまたは筋状のバンドを有するポリヌクレオチドと比較して高純度の生成物に相当する。単一のＨＰＬＣピークを有する合成ポリヌクレオチドもまた、より高純度の生成物に相当する。より高効率のキャッピング反応により、より高純度のポリヌクレオチド集団が提供される。
Ｃ．サイトカイン分析
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、複数の濃度で細胞にトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの６、１２、２４、及び３６時間後、培地に分泌された炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−アルファ及びＩＮＦ−ベータの量をＥＬＩＳＡでアッセイすることができる。より高レベルの炎症性サイトカインを培地に分泌するポリヌクレオチドは、免疫を活性化するキャップ構造を含むポリヌクレオチドに相当する。
Ｄ．キャッピング反応効率
本明細書に教示のキャップのいずれかを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ処理の後、ＬＣ−ＭＳによってキャッピング反応効率を分析することができる。キャップされたポリヌクレオチドのヌクレアーゼ処理により、遊離のヌクレオチド及びＬＣ−ＭＳで検出可能なキャップされた５’−５−三リン酸キャップ構造の混合物が得られる。ＬＣ−ＭＳスペクトルでのキャップされた生成物の量は、該反応物の合計ポリヌクレオチドのパーセントとして表すことができ、キャッピング反応効率に相当する。キャッピング反応効率がより高いキャップ構造は、ＬＣ−ＭＳに従うより多量のキャップされた生成物を有する。
実施例８：修飾ＲＮＡまたはＲＴ ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個々のポリヌクレオチド（２００〜４００ｎｇ、体積２０μｌ中）または逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）を、非変性１．２％アガロースＥ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のウェルにロードし、１２〜１５分間、製造業者のプロトコルに従って実行することができる。
実施例９：Ｎａｎｏｄｒｏｐ修飾ＲＮＡの定量及びＵＶスペクトルデータ
修飾ポリヌクレオチドを含むＴＥ緩衝液（１μｌ）をＮａｎｏｄｒｏｐのＵＶ吸光度の読み取りに使用し、化学合成またはインビトロ転写反応からの各ポリヌクレオチドの収量を定量することができる。
実施例１０：リピドイドを用いた修飾ｍＲＮＡの製剤化
ポリヌクレオチドは、細胞への添加の前、インビトロ実験用に、ポリヌクレオチドをリピドイドと設定された比で混合することにより製剤化することができる。インビボ製剤は、全身の循環を促進するために追加の成分を加えることが必要な場合がある。これらリピドイドがインビボでの作用に適した粒子を形成する能力を調べるため、ｓｉＲＮＡ−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを出発点として使用することができる。粒子の生成後、ポリヌクレオチドを加え、複合体と一体化させることができる。封入効率は、標準的な色素排除アッセイを用いて測定することができる。
実施例１１：タンパク質発現のスクリーニング法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体サンプルを調製し、１、２、３、または４つの質量分析装置を用いたエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）用の製造業者のプロトコルに従って分析することができる。生体サンプルは、タンデム型ＥＳＩ質量分析システムを用いて分析することもできる。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンを所与のタンパク質に関して既知の対照と比較することができ、同一性を比較により特定することができる。
Ｂ．マトリクス支援レーザー脱離／イオン化
対象に投与される１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体サンプルを調製し、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）用の製造業者のプロトコルに従って分析することができる。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンを所与のタンパク質に関して既知の対照と比較することができ、同一性を比較により特定することができる。
Ｃ．液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析
１つ以上のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を含み得る生体サンプルをトリプシン酵素で処理し、その中に含まれるタンパク質を消化することができる。得られたペプチドを液体クロマトグラフィー−質量分析−質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分析することができる。これらのペプチドを質量分析計で断片化して診断パターンを得ることができ、これをコンピュータアルゴリズムによりタンパク質配列データベースに一致させることができる。消化サンプルを希釈し、所与のタンパク質について１ｎｇ以下の出発物質を得ることができる。単純緩衝液のバックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を含む生体サンプルは、直接の溶液中消化に適しており、より複雑なバックグラウンド（例えば、界面活性剤、非揮発性塩、グリセロール）は、サンプルの分析を容易にするためにさらなるクリーンアップステップを必要とする。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンを所与のタンパク質に関して既知の対照と比較することができ、同一性を比較により特定することができる。
実施例１２：ＰＡＨをコードするｍＲＮＡの合成
ＰＡＨポリペプチドコードする配列最適化ポリヌクレオチドを実施例１〜１１に記載の通りに合成し、特徴づけた。ヒトＰＡＨならびにこのＰＡＨの触媒ドメイン及び４量体化ドメインを含むその切断型の両方をコードするｍＲＮＡを、以下に記載の実施例用に調製し、実施例１〜１１に記載の通りに合成し、特徴づけた。
ヒトＰＡＨまたはその切断型をコードするｍＲＮＡは、例えば、それぞれ、配列番号１または２１に示すＯＲＦ配列（アミノ酸）を用いて構築することができる。このｍＲＮＡ配列は、ＯＲＦ配列（ヌクレオチド）に隣接する５’及び３’ＵＴＲ領域の両方を含む。例示的な構築物では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３及び配列番号４である（構築物の配列表参照）。
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号４）
別の例示的な構築物では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３及び１７５である（下記参照）：
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１７５）
別の例示的な構築物では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３及び１７７である（下記参照）：
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１７７）
別の例示的な構築物では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号３及び１７８である（下記参照）：
５’ＵＴＲ：
ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号３）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１７８）
別の例示的な構築物では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列は、それぞれ、配列番号８８及び１５０である（下記参照）：
５’ＵＴＲ：
ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号８８）
３’ＵＴＲ：
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１５０）
このＰＡＨ ｍＲＮＡ配列は、修飾ｍＲＮＡとして調製する。具体的には、インビトロ転写の過程で、修飾ｍＲＮＡをＮ１−メチルプソイドウリジン−５’−三リン酸を用いて生成し、このｍＲＮＡが確実にウリジンの代わりに１００％のＮ１−メチルプソイドウリジンを含むようにすることができる。さらに、ＰＡＨ−ｍＲＮＡは、ポリＡテールを導入するプライマーで合成することができ、キャップ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素及び２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いて両方のｍＲＮＡに生成される。
実施例１３：インビトロでの内因性ＰＡＨ発現の検出
ＰＡＨの発現を、マウス及びヒト供給源の両方に由来する様々な細胞株で特徴づける。細胞を標準的な条件で培養し、その細胞を溶解緩衝液に入れることにより細胞抽出物を得る。比較のため、適切な対照も調製する。ＰＡＨの発現を分析するため、溶解物サンプルをこの試験細胞から調製し、ドデシル硫酸リチウムのサンプルローディング緩衝液と混合し、標準的なウェスタンブロット分析に供する。ＰＡＨの検出に使用する抗体は、市販の抗ＰＡＨ抗体である。ロード対照の検出に使用する抗体は、抗グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）抗体である。
内因性のＰＡＨ発現は、ＰＡＨをコードする核酸を含むｍＲＮＡによるトランスフェクションから生じるＰＡＨ発現の変化を特定するためのベースラインとして使用することができる。
実施例１４：ＳＮＵ−４２３細胞でのＰＡＨのインビトロ発現
ヒト肝細胞株でのヒトＰＡＨまたは切断型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）のインビトロ発現を測定するため、ＳＮＵ−４２３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ２２３８（商標））を６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）に、トランスフェクションの１日前に播種した。野生型ＰＡＨ（Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含む）、配列最適化ヒト完全長ＰＡＨ、配列最適化切断型ＰＡＨ（ＰＡＨ−ΔＲＤ）、またはＧＦＰ対照をコードするｍＲＮＡ製剤を、ウェル当たり２μｇのｍＲＮＡ及び６μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ２５０μＬを用いて細胞にトランスフェクトし、インキュベートした。これらの配列最適化完全長ＰＡＨ ｍＲＮＡ構築物は、ＰＡＨ−００１（配列番号４５）、ＰＡＨ−００２（配列番号４６）、ＰＡＨ−００３（配列番号４７）、ＰＡＨ−００４（配列番号４８）、ＰＡＨ−００５（配列番号４９）、ＰＡＨ−００６（配列番号５０）、ＰＡＨ−００７（配列番号５１）、ＰＡＨ−００８（配列番号５２）、及びＰＡＨ−０１０（配列番号５４）を含んでいた。これらの配列最適化切断型ＰＡＨ ｍＲＮＡ構築物は、ＰＡＨ−０１８（配列番号４５６５）、ＰＡＨ−０２０（配列番号６７）、ＰＡＨ−０２１（配列番号６８）、ＰＡＨ−０２２（配列番号６９）、ＰＡＨ−０２３（配列番号７０）、ＰＡＨ−０２４（配列番号７１）、ＰＡＨ−０２６（配列番号７３）、及びＰＡＨ−０２７（配列番号７４）を含んでいた。これらの実験で用いたＰＡＨ構築物の配列は、構築物の配列表に示されている。
２４時間後、各ウェルの細胞を一定量の溶解緩衝液を用いて溶解した。各タンパク質濃度を特定した。ＰＡＨの発現を分析するため、等ロードの各溶解物（２０μｇ）をローディング緩衝液に調製し、標準的なウェスタンブロット分析に供した。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。ＰＡＨ及びＧＡＰＤＨの検出のため、市販の抗体［ＰＡＨ検出用のＦＬＡＧエピトープに対するマウスモノクローナル抗体−Ｓｉｇｍａ Ｆ３１６５、及びＧＡＰＤＨに対するウサギモノクローナル抗体−Ａｂｃａｍ ａｂ９４８５］を製造業者の指示通りに使用した。
図３の上のパネルは、完全長ヒトＰＡＨ及び切断型ヒトＰＡＨタンパク質の発現レベルを示す。
実施例１５：ＳＮＵ−４２３細胞でのインビトロＰＡＨ活性
インビトロＰＡＨ活性のアッセイを、ＰＡＨ配列を含むｍＲＮＡの導入後に外因的に発現されるＰＡＨが活性であるかどうかを特定するために行った。
Ａ．発現アッセイ
ＳＮＵ−４２３細胞を、ヒトＰＡＨ、切断型ヒトＰＡＨ、またはＧＦＰ対照を含むｍＲＮＡ製剤でトランスフェクトした。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００でトランスフェクトし、上記の実施例１４に記載の通りに溶解した。
Ｂ．活性アッセイ
図３の上のパネルに示す外因性ＰＡＨが機能することができるかどうかを評価するため、インビトロ活性アッセイを、トランスフェクトしたＳＮＵ−４２３細胞溶解物を酵素活性の供給源として使用して行った。酵素アッセイは、４ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのフェニルアラニン（ＰＡＨ基質）、及び１ｍＬ当たり３，２００単位のカタラーゼを含む５０μｌの溶液で行った。このアッセイ混合物を２５℃で３分間インキュベートし、その後溶解物を加えた。２分後、１５０μＭのテトラヒドロビオプテリンを加えて反応を開始した。チロシンの生成は、ＨＰＬＣを用い、４０℃にて３０４ｎｍのチロシン蛍光を記録することにより観察した。
これらのＰＡＨ活性アッセイの結果を図３の下のパネルに示す（トランスフェクションの２４時間後の溶解物を使用）。
実施例１４に示した発現及び活性の実験を選択したｍＲＮＡ構築物を用いて繰り返し、完全長及び切断型ＰＡＨをコードするｍＲＮＡがインビトロで機能的ＰＡＨタンパク質を発現することができるかどうかをさらに特定した。ＳＮＵ−４２３ヒト肝細胞癌細胞（０．５×１０６）に、実施例１４に記載の野生型完全長ＰＡＨをコードするｍＲＮＡ構築物（ＰＡＨ−００５、ＰＡＨ−００６、もしくはＰＡＨ−００７、それぞれ、配列番号４９〜５１）または切断型ＰＡＨ（調節ドメインが削除されている（ΔｒｄＰＡＨ））をコードするｍＲＮＡ構築物（ＰＡＨ−０２４、ＰＡＨ−０２６、もしくはＰＡＨ−０２７、それぞれ、配列番号７１、７３、及び７４）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を用いたリポフェクションによりトランスフェクトした。対照の細胞は、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。２μｇのｍＲＮＡをトランスフェクションに用いた。細胞をトランスフェクションの２４、４８、及び７２時間後に溶解し、タンパク質を抽出し、ＰＡＨタンパク質の濃度及び酵素活性に関して評価した。トランスフェクトした細胞の溶解物をウェスタンブロット分析によって評価し、タンパク質発現を示した。これらの発現レベルを定量化し、小胞体タンパク質７２（ＥＲＰ７２）のレベルに対して正規化した。ＰＡＨ及び補因子ＢＨ４の存在下でのフェニルアラニンからのチロシンの生成（Ｔｙｒ活性）を検出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを用いて活性を特定した。
図４Ａは、ウェスタンブロットの結果を示しており、これらｍＲＮＡ構築物からの完全長及び切断型ＰＡＨタンパク質の発現は、トランスフェクションの２４時間後には検出可能であったが、トランスフェクション後７２時間の間、溶解物中で検出することができたのは、ｍＲＮＡによって発現された切断型タンパク質のみであった。対照的に、完全長ＰＡＨは、トランスフェクション後４８時間及び７２時間では検出できなかった。図４Ｂは、図４Ａに示すｍＲＮＡ構築物のトランスフェクション後２４、４８、及び７２時間での定量化された発現レベルを示す。切断型ＰＡＨ ｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞の発現レベルは、ＥＲＰ７２に対して正規化した場合、完全長ＰＡＨ ｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞の発現レベルのおよそ２倍であった。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示す。
図５Ａは、トランスフェクション後４８時間及び７２時間での完全長及び切断型構築物の各々の活性レベルを示す。図５Ｂは、図５Ａに示す完全長及び切断型ＰＡＨ酵素のトランスフェクション後２４、４８、及び７２時間での平均活性を示す。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示す。この活性データは、完全長及び切断型ｍＲＮＡによって発現されたタンパク質の両方が活性を有するが、酵素活性は、トランスフェクション後に評価したすべての時点で、切断型ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした細胞の方が高いことを示す。総合すれば、図４Ａ〜Ｂ及び図５Ａ〜Ｂの結果は、欠損ヒト上皮細胞（ＳＮＵ−４２３細胞）において、切断型ヒトＰＡＨΔＲＤ（ＰＡＨ＿０２４、ＰＡＨ＿０２６、ＰＡＨ＿０２７）は、野生型ヒトＰＡＨ（ＰＡＨ＿００５、ＰＡＨ＿００６、ＰＡＨ＿００７）より安定かつ活性が高いことを示す。
実施例１６：ＳＮＵ−４２３細胞においてＰＡＨ活性に対するＰＡＨ補因子の添加の評価
ＰＡＨ酵素は、Ｐｈｅをチロシン（Ｔｙｒ）に変換するために補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の活性を必要とする。ＢＨ４の添加が、ｍＲＮＡによって発現されるヒト切断型ＰＡＨ（ＰＡＨΔＲＤ）のヒト肝細胞癌細胞における発現及び活性を改善することができるかどうかを調べるため、ＳＮＵ−４２３細胞を、６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）に播種し（３．７５×１０５）、翌日、ｍＲＮＡ構築物ＰＡＨ−０２７（配列番号２０２）またはｅＧＦＰをコードする対照ｍＲＮＡでトランスフェクトした。細胞は、実施例１４に記載の通り、２μｇのｍＲＮＡを用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（ＬＭＲＮＡ０１５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ［Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ］）を用いたリポフェクションにより、１００μＭのＢＨ４を用いてまたは用いずにトランスフェクトした。ＢＨ４は、トランスフェクション時、ならびにトランスフェクション後１６、２４、及び４８時間で再度添加した。細胞をトランスフェクションの１８、２４、４８、及び７２時間後に溶解し、タンパク質を抽出し、ＰＡＨタンパク質の濃度及び酵素活性について評価した。トランスフェクトした細胞の溶解物をウェスタンブロット分析によって評価し、タンパク質発現を示した。これらの発現レベルを定量化し、小胞体タンパク質７２（ＥＲＰ７２）のレベルに対して正規化した。ＰＡＨ及び補因子ＢＨ４の存在下でのフェニルアラニンからのチロシンの生成（Ｔｙｒ活性）を検出する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイを用いて活性を特定した。
図６Ａは、ウェスタンブロットの結果を示しており、ｍＲＮＡが、ＢＨ４の有無にかかわらず、ｍＲＮＡのトランスフェクション後１８、２４、４８、及び７２時間でＰＡＨΔＲＤタンパク質を発現することを示している。ｅＧＦＰ ｍＲＮＡを投与した対照細胞では発現は検出されなかった。ｅＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、超生理学的なＰＡＨタンパク質のレベルを示し、これは、７２時間まで持続した。ヒトＰＡＨタンパク質のレベルは、ＢＨ４の存在下でも非存在下でもＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞と同様であった。図６Ｂは、ＢＨ４が投与されているかどうかにかかわらず、各時点でＰＡＨΔＲＤタンパク質の発現レベルが同様であったことを示す。図６Ｃは、ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＳＮＵ−４２３細胞において、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＳＮＵ−４２３細胞と比較して、Ｔｙｒ産生が有意に増加したことを示す。さらに、ＢＨ４の存在下でＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＳＮＵ４２３細胞において、ＢＨ４を補足しないでＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、Ｔｙｒ産生が有意にかつ持続して増加した。全体として、本試験におけるこれらの結果は、ＢＨ４の有無にかかわらず、ＳＮＵ−４２３細胞のＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡでのトランスフェクションにより、機能的ヒトＰＡＨ酵素が発現したが、トランスフェクトした細胞へのＢＨ４の添加によってＰＡＨ酵素活性が向上したことを示している。
実施例１７：ヒトＰＡＨ変異体及びキメラ構築物
本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＡＨまたはヒトＰＡＨΔＲＤをコードする連結されたヌクレオシドの少なくとも第一の領域を含むことができ、これは、上記実施例に従って構築、発現、及び特徴づけすることができる。同様に、このポリヌクレオチド配列は、活性が増加または低下したヒトＰＡＨまたはヒトＰＡＨΔＲＤの発現をもたらす１つ以上の突然変異を含み得る。さらに、ＰＡＨをコードするこのポリヌクレオチド配列は、キメラ融合タンパク質をコードする構築物の一部であり得る。
実施例１８：ナノ粒子組成物の製造
Ａ．ナノ粒子組成物の製造
ナノ粒子は、混合プロセス、例えば、一方がポリヌクレオチドを含み、他方が脂質成分を有する２つの流体流のマイクロ流体工学及びＴ字形接合部での混合で作製することができる。
脂質組成物は、本明細書に開示のイオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の脂質、例えば、化合物ＩＩまたは式（ＩＩＩ）の脂質、例えば、化合物ＶＩ、リン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能）、ＰＥＧ脂質（例えば、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール、別名ＰＥＧ−ＤＭＧ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能）、ならびに構造脂質（例えば、コレステロール、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能、もしくはコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン）、またはそれらの組み合わせ）を濃度約５０ｍＭにてエタノール中で混合することによって調製する。溶液は、保存のため、例えば−２０℃で冷蔵するべきである。脂質を混合して所望のモル比を得、水とエタノールで最終脂質濃度約５．５ｍＭ〜約２５ｍＭに希釈する。
ポリヌクレオチド及び脂質組成物を含むナノ粒子組成物は、この脂質溶液を、脂質組成物対ポリヌクレオチドの重量：重量比約５：１〜約５０：１でポリヌクレオチドを含む溶液と混合することによって調製する。この脂質溶液を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体ベースシステムを用い、流量約１０ｍｌ／分〜約１８ｍｌ／分で、ポリヌクレオチド溶液に急速に注入し、水対エタノール比約１：１〜約４：１の懸濁液を製造する。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、このＲＮＡの濃度０．１ｍｇ／ｍｌの脱イオン水溶液をｐＨ３〜４の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液で希釈し、原液を形成する。
ナノ粒子組成物を透析で処理することにより、エタノールを除去し、緩衝液交換を行うことができる。製剤を、分子量カットオフが１０ｋＤのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用い、一次生成物の２００倍の体積のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して、２回透析する。１回目の透析は、室温にて３時間行う。この製剤を次に４℃で一夜透析する。得られたナノ粒子懸濁液を０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してガラスバイアルに濾過し、圧着クロージャーで密閉する。０．０１ｍｇ／ｍｌ〜０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が通常得られる。
上記の方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。Ｔ字形接合部及び直接注入が挙げられるがこれらに限定されない代替的なプロセスを用いて同じナノ沈殿を達成することができる。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特性評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を用いて、ナノ粒子組成物の粒径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位を、粒径の特定においては１×ＰＢＳ、及びゼータ電位の特定においては１５ｍＭのＰＢＳで特定することができる。
紫外可視分光法を用いて、ナノ粒子組成物のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）濃度を特定することができる。１×ＰＢＳで希釈した１００μＬの製剤を４：１（ｖ／ｖ）のメタノールとクロロホルムの混合物９００μＬに加える。混合した後、その溶液の吸収スペクトルを、例えば、ＤＵ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）にて２３０ｎｍ〜３３０ｎｍで記録する。ナノ粒子組成物のポリヌクレオチド濃度は、その組成物に使用されているポリヌクレオチドの吸光係数及び波長、例えば、２６０ｎｍでの吸光度と、波長、例えば、３３０ｎｍでのベースライン値の差に基づいて計算することができる。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物については、ＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ナノ粒子組成物によるＲＮＡの封入を評価することができる。サンプルをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）で希釈し、濃度約５μｇ／ｍＬにする。この希釈サンプル５０μＬをポリスチレン製の９６ウェルプレートに移し、ＴＥ緩衝液５０μＬまたは２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液５０μＬのいずれかをこのウェルに加える。このプレートを温度３７℃で１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液で１：１００に希釈し、この溶液１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、励起波長、例えば、約４８０ｎｍ及び発光波長、例えば、約５２０ｎｍにて測定することができる。試薬ブランクの蛍光値をサンプルの各値から引き、遊離のＲＮＡのパーセンテージを、インタクトなサンプル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加しない）の蛍光強度を破壊サンプル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加によって生じる）の蛍光値で除することで特定する。
ナノ粒子組成物の例示的な製剤を下記表６に示す。「化合物」という用語は、ＭＣ３、化合物ＩＩ、または化合物ＶＩ等のイオン性脂質を指す。「リン脂質」は、ＤＳＰＣの場合もＤＯＰＥの場合もある。「ＰＥＧ−脂質」は、ＰＥＧ−ＤＭＧの場合も化合物Ｉの場合もある。
表６．ナノ粒子の例示的な製剤



実施例１９：動物モデルにおけるインビボＰＡＨ発現
ＰＡＨをコードするｍＲＮＡがインビボでＰＡＨ発現を促進する能力を評価するため、ヒトＰＡＨまたはその切断型をコードするｍＲＮＡをＰＫＵの動物モデルに導入する。
よく使用されるＰＫＵの遺伝マウスモデルは、ＢＴＢＲ−ＰＡＨｅｎｕ２マウスである（Ｓｈｅｄｌｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０５−１２１０， １９９３）。生殖細胞系列のエチルニトロソウレア（ＥＮＵ）突然変異生成によって作製されるＰＡＨｅｎｕ２マウスは、ＰＡＨ活性の低下、正常な同腹仔の１０〜２０倍のフェニルアラニン血漿レベル及び生体アミンの欠損を特徴とする未治療のヒトＰＫＵとよく似た生化学的表現型を特徴とする。ホモ接合変異体マウスは、重度の高フェニルアラニン血症を示し、これらマウスは、神経学的機能不全、及びカテコールアミン作動性欠陥を示す。それらは、低フェニルアラニン食で維持されない限り低色素性である。血中フェニルアラニンの減少により、この変異体マウスが色素を産生する能力が高まる。これにより、治療的遺伝子発現レベルを示す、容易に目に見える毛色の測定基準がもたらされる。
高フェニルアラニン血症度の差をモデル化するため、次のものを使用することができる：軽度の高フェニルアラニン血症に関して：ヘテロ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス、軽度のＰＫＵに関して：フェニルアラニンを含まない食餌で維持し、フェニルアラニンを含む飲水（例えば、１リットル当たり２グラム）を投与したホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス、またはＢＴＢＲ−ＰＡＨｅｎｕ１、もしくはＢＴＢＲ−ＰＡＨｅｎｕ２／ＢＴＢＲ−ＰＡＨｅｎｕ１複合ヘテロ接合体、及び古典的ＰＫＵに関して：ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，６９：１８８−１９４ （２０００）、Ｐａｓｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，８（１２）：Ｅ８４６９７ （２０１３））。
これらのモデルマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの対照ｍＲＮＡ（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ）またはヒトＰＡＨ ｍＲＮＡのいずれかを静脈内注射する。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子に製剤化する。マウスを２４時間または４８時間後に屠殺し、肝臓溶解物のＰＡＨタンパク質レベルをキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって特定する。ＧＡＰＤＨの発現は、ロード対照として使用するために調べる。対照のＧＦＰ注射に関しては、各時点で４匹のマウスを調べる。ヒトＰＡＨ ｍＲＮＡの注射に関しては、各時点で６匹のマウスを調べる。ＰＡＨをコードするｍＲＮＡでの処理により、ＰＡＨの発現が確実に誘導されることが予想される。血中フェニルアラニンレベルをＰＤマーカーとして測定する。
実施例２０：ＰＡＨを評価するための代理システムとしての野生型ラットまたはマウス
野生型の動物（マウス／ラット）を使用してＰＡＨ活性を評価することができるかどうかを特定するため、フェニルアラニンまたはアスパルテーム（フェニルアラニンジペプチド）の腹腔内（ＩＰ）または経口（ＰＯ）のいずれかの投与後のベースラインのフェニルアラニン曝露を特定するための試験を行った。
野生型のラット及びマウス等の動物は、通常、フェニルアラニンレベルを１００μＭ未満に維持している。従って、これら動物において、例えば、本明細書に開示のｍＲＮＡを介したＰＡＨの過剰発現が、ベースラインのフェニルアラニンレベルを変化させる可能性は低い。従って、本明細書に記載のｍＲＮＡを介してこれらの動物でフェニルアラニンレベルを高めること及びＰＡＨを過剰発現させることならびにその有効性を調べることを計画した。
この考えを試すため、これらの動物のベースラインのフェニルアラニンレベルが、それらにフェニルアラニンまたはアスパルテームを投与すること及び投与後の異なる時点でフェニルアラニンレベルを測定することにより増加し得るかどうかを最初に評価した。図７Ａ〜Ｂは、送達経路に関係なく、アスパルテームの投与後、ラットでは６０〜９０分間（図７Ａ）及びマウスでは４０分未満（図７Ｂ）、フェニルアラニンの全身曝露が認められたことを示す。従って、これらのデータは、ＰＡＨの有効性を評価することができる４０分間のウィンドウがマウスで、及び６０〜９０分間のウィンドウがラットで存在することを示す。
従って、これらの野生型の動物モデルは、ＰＡＨ−ｍＲＮＡ構築物の投与後のフェニルアラニン曝露の変化を測定するために使用することができる。
実施例２１：野生型ラットにおけるＰＡＨの評価
ラットに、０．５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨ．Ｗｔ、ＰＡＨΔＲＤ、及び対照（ｅＧＦＰ）ｍＲＮＡをｉ．ｖ．投与する。投与の８時間後、これらのラットに、１０００ｍｇ／ｋｇのアスパルテームを強制経口投与により接種する。接種後０分、２０分、４０分、６０分、９０分、及び１２０分で採血する。血中フェニルアラニンレベルを測定する。これらの動物を最後の採血後に屠殺し、肝臓のＰＡＨタンパク質の発現を特定する。
実施例２２：ＰＫＵマウスモデルにおけるＰＡＨ活性の持続期間及び用量反応の評価−単回投与試験
１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡ構築物がインビボでＰＡＨを発現する能力を調べるため、及びｍＲＮＡによって発現されたＰＡＨの活性を評価するため、単回の０．５ｍｇ／ｋｇの用量のヒトＰＡＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号１９９）またはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２００）を、ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス（構築物当たりｎ＝５〜６）に対して尾静脈注射を介してＩＶ投与した。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ）に製剤化した。ｍＲＮＡ注射の前（０時間）ならびにｍＲＮＡの注射後６時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、及び７日目にマウスから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血中フェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて乾燥血液スポット（ＤＢＳ）で測定した。図８は、血中フェニルアラニンレベルの大幅な低下が示すように、ヒトＰＡＨまたはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ構築物の注射後６時間でＰＡＨ活性が増加したことを示す。ＰＫＵマウスにおける血中フェニルアラニンレベルは、単回ｍＲＮＡ投与後６時間で正常（野生型）レベルまで低下した。フェニルアラニンレベルは注射後７日間で上昇したが、それでもｍＲＮＡの注射前のフェニルアラニンレベルよりは低かった。
ヒトＰＡＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号１９９）またはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２０２）のインビボ投与後のＰＡＨ活性の持続期間をさらに調べるため、ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスに対して単回の０．５ｍｇ／ｋｇの用量のｍＲＮＡを、尾静脈注射を介して注射した。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ）に製剤化した。対照マウスにはＰＢＳを注射した。ｍＲＮＡ注射の前（処理前血）ならびにｍＲＮＡの注射後６時間、１日、２日、３日、４日、及び５日目にマウスから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血漿中のフェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。ＰＡＨ ｍＲＮＡ、タンパク質、及びタンパク質活性のレベルを各時点で採取した組織（肝臓、脾臓、及び脳）でアッセイした（データは示さず）。インサイチュハイブリダイゼーションを用いてＰＡＨ ｍＲＮＡのレベル及び局在をアッセイした。図９は、完全長ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡよりも多くのＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡが肝細胞に取り込まれたことを示す。図１０Ａは、処理前血のフェニルアラニンレベルに対して、ヒトＰＡＨまたはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡの単回注射後に血漿のフェニルアラニンレベルが低下したことを示しており、ＰＢＳを注射した対照マウスと比較したＰＡＨ活性の増加を示している。血漿のフェニルアラニンレベルは、ｍＲＮＡの注射後、約３日でほぼ処理前血のレベルまで徐々に上昇した。図１０Ｂは、ヒトＰＡＨもしくはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡを注射したマウスまたはＰＢＳを注射したマウスにおける血漿フェニルアラニンに関する曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。血漿のフェニルアラニン濃度は、ヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡを注射したマウスのほうが低かった。
ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおけるヒトＰＡＨをコードするｍＲＮＡの用量反応及び作用の持続時間を調べるための別の実験では、８群のこれらホモ接合変異体マウス（１群当たりｎ＝５）に、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのヒトＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡ（配列番号２０２）を、尾静脈ＩＶ注射で投与した。さらに、ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスの１つの群には、５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡ（配列番号２０２）を投与し、本試験の継続期間中、１日２回、２０ｍｇ／ｋｇのＢＨ４（ＰＡＨ活性に必要な補因子）を投与した。このｍＲＮＡは、注射前に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。ｍＲＮＡの投与前（処理前血）及び投与後１、２、３、及び４日目にマウスから血液サンプルを採取し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて血中Ｐｈｅ濃度を乾燥血液スポットにて分析した。血中Ｔｙｒレベルもまた、ＰＡＨ及び補因子ＢＨ４の存在下でフェニルアラニンからのチロシン生成（Ｔｙｒ活性）を検出するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより乾燥血液スポットにて特定した。
図１１は、ｍＲＮＡの投与後４日間にわたるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの各投与レベルでのホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスの血中Ｐｈｅレベルを、ＰＢＳを投与した対照ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける４日間にわたるＰｈｅレベルと比較して、及びｍＲＮＡまたはＰＢＳ対照の注射前のマウスにおけるＰｈｅレベル（ベースライン）と比較して示す。血中Ｐｈｅレベルの有意な低下は、１．０ｍｇ／ｋｇ以上のＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを投与したマウスにおいて、静脈内投与の２４時間後に認められた。血中Ｐｈｅの低下の大きさは、用量依存的であり、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ及び≧３ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを投与したマウスでは、それぞれ、ベースラインからおよそ５０％、８０％、及び９０％の低下が達成された（表７参照）。さらに、ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの注射後の血中Ｐｈｅレベルの低下の持続時間もまた用量依存的であった。１．０ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを投与したＰＡＨｅｎｕ２マウスは、ｍＲＮＡの注射後２日目に血中ベースラインＰｈｅレベルの９５％まで戻ったが、２．０ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡのいずれかを投与した変異体マウスは、ｍＲＮＡの投与後２日目にベースラインのＰｈｅ値のそれぞれ、およそ７８％及び７６％に戻った。作用の持続時間がより長いことの効果は、４ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを投与した動物において認められ、ｍＲＮＡの投与後２日目でベースラインのＰｈｅレベルの４８％及び５５％を達成した。全投与群における循環血中のＰｈｅレベルは、ｍＲＮＡ後４日でベースラインレベルを超えた（図１１及び表１参照）。
表１．ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの投与（単回注射）後の経時的なベースラインのＰｈｅレベルの割合

図１１はまた、ｍＲＮＡの注射の１日後の血中Ｐｈｅレベルの量が、ＢＨ４及び５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを投与したホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスならびに５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを単独（すなわち、ＢＨ４なし）で投与したホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおいて同様であったことも示している（ベースラインのＰｈｅレベルのそれぞれ、１２％と１３％）。しかしながら、ＢＨ４とｍＲＮＡの共投与は、ｍＲＮＡの作用の持続時間に効果があった。５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤとの２０ｍｇ／ｋｇのＢＨ４（１日２回）の投与により、５ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡ単独の投与（注射の２日後及び３日後で、ベースラインの対照Ｐｈｅレベルのそれぞれ、５５％及び６９％）と比較して、ｍＲＮＡの注射の２日後及び３日後の血中Ｐｈｅレベルが低くなった（ベースラインの対照Ｐｈｅレベルの２０％及び５０％）。
表８は、血中Ｔｙｒレベルで特定されたｍＲＮＡによって発現されたＰＡＨ酵素の活性が、注射前のレベル（ベースライン）のレベルに対してｍＲＮＡの注射後数日間増加したことを示す。ＰＡＨの酵素活性レベルは、１．０〜５．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの注射後１日目及び２日目に特に増加した。５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡでのＢＨの添加で活性が増加した。
表８．ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの投与（単回注射）後の経時的なベースラインのＴｙｒレベルの割合

これらのデータは、切断型ＰＡＨ酵素をコードするｍＲＮＡの投与により、用量依存的に血中Ｐｈｅレベルが低下し、酵素活性が増加することを示している。ＢＨ４の投与は、５ｍｇ／ｋｇの用量のＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの効果持続期間を、等用量のｍＲＮＡ単独と比較して改善すると思われる。
実施例２３：ＰＫＵマウスモデルにおけるＰＡＨ活性の持続期間及び用量反応の評価−複数回投与試験
ヒトＰＡＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号１９９）またはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２００）の複数回投与に反応する経時的なＰＡＨ活性の持続期間をインビボで調べるため、ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスに対して、６回の単回用量０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを、尾静脈注射を介して注射した。これらの投与は、７日に一度（０、７、１４、２１、２８、及び３５日目）実施した。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／ＤＭＧ）に製剤化した。対照マウスにはルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを注射した。ヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ及びルシフェラーゼをコードする対照ｍＲＮＡは、ヘテロ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウス及び野生型マウスにも投与した。１回目のｍＲＮＡ注射の前（処理前血）ならびにｍＲＮＡ注射後１、３、及び７日目にマウスから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血漿中のフェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。血中Ｐｈｅレベルのデータ分析は、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用し、ダネット多重比較検定でベースラインレベルに対して行った。血中Ｐｈｅレベルの変化は、投与前のサンプル（２日目、ベースライン測定）における濃度から、処理後のすべてのその後のサンプル（１、３、及び７日目）における濃度を差し引いて計算した。血中Ｐｈｅの統計的に有意な低下は、調整されたｐ値≦０．０５を適格とした。忍容性は、最後のｍＲＮＡ投与後のマウスにおける臨床化学（ＡＳＴ及びＡＬＴレベル）を測定することによって評価した。
図１２は、ヒト完全長ＰＡＨまたはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡがホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスに投与されるたびに（ならびにこれらマウスの処理前血またはベースラインレベルと比較して、及びルシフェラーゼｍＲＮＡを投与した対照マウスと比較して）血漿のフェニルアラニンレベルが実質的に低下することを示しており、すなわち、ｍＲＮＡの注射ごとに反応して迅速にＰＡＨ活性が増加したことを示している。０．５ｍｇ／ｋｇの用量の完全長ＰＡＨまたはヒトＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを毎週投与したホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスにおける平均血中Ｐｈｅレベルは、ベースラインレベルと比較して、各投与の２４時間後（１日目）に有意に低下し、野生型及びヘテロ接合マウスで測定されたレベルと同様であった。平均血中Ｐｈｅレベルの最大の低下は、ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを投与したホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスで認められ、ここでは、１回目の投与後、１日目の平均血中Ｐｈｅレベルは、ベースラインレベルの１２％まで低下した。反復投与後、１日目の平均血中Ｐｈｅレベルは、２回目、３回目、及び４回目の投与後、それぞれ、ベースラインレベルの８％、７％、及び４％まで着実に低下した。完全長（ＷＴ）ＰＡＨ ｍＲＮＡを投与した動物では、平均血中Ｐｈｅレベルの最大の低下は、２回目の投与後１日目で認められ、３回目、４回目、及び６回目の投与後の１日目ではわずかに増加した。平均血中Ｐｈｅは、完全長ＰＡＨまたはＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの各投与後３日目と７日目の間にベースラインレベルまで戻った。予想通り、ｍＲＮＡを注射した野生型マウス及びヘテロ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスは、一貫して低レベルの血漿フェニルアラニンを示した。全体として、これらの結果は、完全長（ＷＴ）ＰＡＨまたはＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡのホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスへの投与により、各投与の２４時間後に有意に低下した平均血中Ｐｈｅレベルからも明らかなように、機能的ＰＡＨタンパク質が産生され、野生型マウスで認められるレベルと同様のレベルに達することを示す。しかしながら、この効果は比較的長続きせず、血中Ｐｈｅレベルは各投与後３日目と７日目の間に投与前のレベルに戻る。
ヒトＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの複数回投与がホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスに施された場合の作用の持続時間をより良く理解するために、及び用量反応作用が存在するかどうかを特定するために、様々なｍＲＮＡの用量を使用した反復投与試験を行った。ＰＡＨｅｎｕ２マウスに対して６回の０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、もしくは２ｍｇ／ｋｇの単回用量のヒトＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡ（配列番号２０２）、またはＰＢＳを対照として、尾静脈注射を介して投与した（１群当たりｎ＝８匹）。投与は、３日ごと（０日目、３日目、６日目、９日目、１２日目、及び１５日目）に行った。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。１回目のｍＲＮＡ注射の前（処理前血）及びｍＲＮＡの各投与の２４時間後、その後最後の６回目の投与の２４、７２、及び１２０時間後にマウスから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血漿中のフェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。血中Ｔｙｒレベルもまた、ＰＡＨ及び補因子ＢＨ４の存在下でフェニルアラニンからのチロシン（Ｔｙｒ活性）を検出するＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて乾燥血液スポットにて特定した。
図１３Ａ及び表９は、ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを注射したマウスの血漿Ｐｈｅレベルの、ベースラインの血漿Ｐｈｅレベルに対する各注射後の結果を示す。用量の大きさにかかわらず、ｍＲＮＡの各注射後、Ｐｈｅレベルはベースラインレベルと比較して実質的に低下した。しかしながら、用量効果が認められ、１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを投与した場合、Ｐｈｅレベルは本試験を通してより大きく低下し、２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの注射により、ほとんどの時点でＰｈｅレベルが最も大きく低下した。
表９．ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの投与（複数回注射）後の経時的なベースラインのＰｈｅレベルの割合

図１３Ｂ及び表１０は、ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡを注射したマウスのＴｙｒレベルの、ベースラインの血漿Ｔｙｒレベルに対する各注射後の結果を示す。ｍＲＮＡによって発現されたＰＡＨΔＲＤタンパク質は、活性を示し、Ｔｙｒレベルは、本試験の１６日間を通してマウスにおいて、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、及び２．０ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの注射後、ベースラインのＴｙｒレベルと比較して高かった。用量効果があると思われ、１ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの投与により、比較的高いＴｙｒレベルとなった。
表１０．ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの投与（複数回注射）後の経時的なベースラインのＴｙｒレベルの割合

実施例２４：ＰＫＵマウスモデルにおけるＰＡＨ活性に対する用量範囲及びｍｉＲ結合部位の影響の評価
異なるｍＲＮＡのｍｉＲ結合部位が、ｍＲＮＡによって発現されたＰＡＨの活性に影響を与え得るかどうかを特定するため、ｍｉＲ１２６結合部位を有するヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２０２）、３つのｍｉＲ１４２結合部位を有するヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２０１）、またはｍｉＲ結合部位を有さないヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２０３、ｍｉＲｌｅｓｓ ｍＲＮＡ）の単回投与をホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスに尾静脈注射を介して注射した。異なる用量を各ｍＲＮＡについて調べた（１．０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、または０．２ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ１２６もしくはｍｉＲ１４２結合部位を有するｍＲＮＡ、１．０ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ結合部位を含まないｍＲＮＡ）。これらのｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。対照のＰＡＨｅｎｕ２マウスには、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＦＰをコードするｍＲＮＡを注射した。１回目のｍＲＮＡ注射の前（処理前血）ならびにｍＲＮＡの各注射後６時間、１日、２日、３日、及び７日目にマウスから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血漿中のフェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。
図１４は、ヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ構築物の各々の単回投与により、これらマウスの処理前血のフェニルアラニンレベル及びＧＦＰ ｍＲＮＡを投与した対照マウスのフェニルアラニンレベルに対して、血漿フェニルアラニンレベルが低下し、特に注射後６時間及び１日で明らかであることを示す。フェニルアラニンレベルの低下は、ｍＲＮＡ構築物がｍｉＲ１２６結合部位を有していること、３つのｍｉＲ１４２結合部位を有していること、またはｍｉＲ結合部位を有していないことに関係なく認められた。ｍＲＮＡが高用量であるほど、血漿フェニルアラニンレベルの低下が大きくなるような、ヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡの各々の単回投与と関連する用量依存効果は、ｍｉＲ結合部位の存在や同一性にかかわらず、特に注射後６時間及び１日で認められた。
実施例２５：野生型マウスにおけるＰＡＨタンパク質発現の持続期間の評価
１−メチル−プソイドウリジン修飾ｍＲＮＡ構築物がインビボでＰＡＨを発現する能力を調べるため、単回の０．５ｍｇ／ｋｇのヒトＰＡＨをコードするｍＲＮＡ（配列番号１９９）またはヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２００）を、野生型ＣＤ−１マウスに対して尾静脈注射を介してＩＶ投与した。これらｍＲＮＡ構築物は、ＰＡＨに融合したＦＬＡＧタグをコードし、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてこのタンパク質の検出を可能にする。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ）に製剤化した。対照マウスは未処理のままとした。注射後３時間、６時間、１日、２日、３日、４日、及び７日で動物を屠殺し、約１００ｍｇの肝臓を採取した。ＰＡＨの発現を採取した肝臓サンプルのタンパク質ブロットにより特定した。
完全長ＰＡＨは９６時間を通して検出可能であったが、その発現レベルは時間とともに低下した（データは示さず）。ＰＡＨΔＲＤタンパク質は、２４時間を通して強く検出することが可能であり、その発現は時間とともに減少した（データは示さず）。ＰＡＨ−００６（完全長ＰＡＨ）及びＰＡＨ−０２７（ＰＡＨΔＲＤ）ｍＲＮＡ構築物から発現されたタンパク質をローディング対照として用い、完全長及び切断型ＰＡＨタンパク質のサイズを決めた。
実施例２６：疾患用の野生型ラット代理システムにおけるＰＡＨ活性の評価
ｍＲＮＡによって発現されたＰＡＨの活性がＰＫＵ疾患用の野生型ラット代理システムで評価することができるかどうかを調べるため、実施例２０に記載の通り、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに対して、単回の０．５ｍｇ／ｋｇの用量のヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡを、ＩＶ尾静脈注射で投与した。このｍＲＮＡは、ｍｉＲ１２６結合部位を有する（配列番号２０２）、３つのｍｉＲ１４２結合部位を有する（配列番号２０１）、またはｍｉＲ結合部位を有さない（配列番号２０３）。ラットにはその後、ｍＲＮＡ注射の８時間及び２４時間後に１ｇ／ｋｇ体重のアスパルテームを接種した。これらのｍＲＮＡは、ラットへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。対照のラットには、ＰＢＳを注射した。１回目のｍＲＮＡ注射の前（処理前血）ならびにアスパルテームの投与後２０、４０、６０、９０、及び１２０分でラットから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血漿中のフェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。図１５は、野生型ラットに１ｍｇ／ｋｇのアスパルテームを投与することにより、血漿フェニルアラニンレベルが一時的に上昇したことを示す。ｍｉＲ１４２結合部位またはｍｉＲ１２６結合部位を有するまたはｍｉＲ結合部位を有さないｍＲＮＡ構築物のいずれかの投与により、ＰＢＳを投与した対照ラットと比較して血漿フェニルアラニンレベルが低下した。
実施例２７：野生型ラットにおけるＰＡＨ発現の評価
ＰＡＨのｍＲＮＡレベル及び分布を、１ｍｇ／ｋｇの１−メチル−プソイドウリジンで修飾されたヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ（配列番号２０２）、または１ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを対照として、単回ＩＶ尾静脈注射によって投与した野生型Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの血漿ならびに組織（肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓）で特定した。このｍＲＮＡは、ラットへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。ｍＲＮＡの注射後６時間、ならびに１、２、３、４、５、及び６日でラットを屠殺し（時点当たりｎ＝６匹）、組織を採取した。インサイチュハイブリダイゼーションを用いてｍＲＮＡの注射後の各時点での組織におけるｍＲＮＡの量を検出し、これら組織内のｍＲＮＡの局在を検出した。インサイチュハイブリダイゼーションについては、組織を採取し、トリミングし、１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）で４８時間固定した。サンプルをその後ＰＢＳに移し、群間で固定時間を一定に維持した。サンプルを通常のパラフィン処理、包埋、及び薄片化した。組織切片は５ｕｍで切断した。インサイチュハイブリダイゼーションは、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸオートステイナー（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を用いて行い、切片をベーキングし、機器で脱パラフィン処理し、その後、ＲＮＡｓｃｏｐｅ２．５ ＬＳ試薬キット−ブラウン（ｃａｔ＃３２２１００）を用いたＲＮＡｓｃｏｐｅ２．５ ＬＳｘ ＤＡＢ ＩＳＨプロトコルにより、標的プローブシグナルを発色性ジアミノベンジジンによって可視化した。このＩＳＨプローブは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＬＳ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｏｂｅ ＲｎＰＰＩＢ（ｃａｔ＃３１３９２８）、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ ＬＳ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｏｂｅ＿ｄａｐＢ（ｃａｔ＃３１２０３８）、及びＰＡＨ構築物に対するプローブを含んでいた。すべての画像は、Ｐａｎｏｒａｍｉｃ ２５０ Ｆｌａｓｈ ＩＩ（３ＤＨＩＳＴＥＣＨ，Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）デジタルスライドスキャナーで取り込んだ。すべての画像（低倍率２倍、高倍率１６倍）は、ＨＡＬＯソフトウェアを用いて撮影し、画像解析は、ＨＡＬＯソフトウェアを介したアルゴリズムを使用して行った。細胞の総数を考慮しながら、細胞当たり同程度の陽性点を有する細胞数に基づいて、サンプルにＨ−スコアを割り当てた。すべての解析結果をｇｒａｐｈ ｐａｄ ｐｒｉｓｍを用いて編集及びグラフ化した。
ＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡの血清レベルは、ラットの注射後１５分ならびに１、２、４、６、８、１２、及び２４時間でｂＤＮＡアッセイ（参照することにより全体として本明細書に組み込まれるＣｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１７， ２１：３５４８−５８に記載の通り）を用いてアッセイした。ウェスタンブロット及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いて、注射後の各時点での組織におけるヒトＰＡＨΔＲＤタンパク質発現のレベルを検出した（肝臓用の抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＮ７５４）、ならびに脾臓、腎臓、及び心臓用の抗体（それぞれに対して、Ｇｅｎｅｔｅｘ、ＧＴＸ５４５６３）を用いて）。ＣＥによるタンパク質発現の結果に関しては、肝臓用のローディング対照としてＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ、ａｂ８２４５抗体）を用い、脾臓及び肝臓のウェスタンブロット用のローディング対照としてＥＲＰ７２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄ７０Ｄ１２抗体）を用い、腎臓及び心臓のローディング対照としてはＶｉｎｃｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ抗体）を用いた。
図１６Ａ〜１６Ｄは、腎臓、心臓、肝臓、及び脾臓におけるｍＲＮＡレベルをＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの注射後の各時点で示す。このｍＲＮＡは、腎臓では約３日間（７２時間）、心臓では約１日（２４時間）、肝臓では３日間（７２時間）、及び脾臓では６日間（１４４時間）にわたって検出され、その後検出が比較的困難なレベルまで低下した。肝臓に存在したｍＲＮＡは、肝臓では６時間及び２４時間で極めて高く、その後急激に減少したが、脾臓では、このｍＲＮＡは、６日間にわたって比較的一貫して存在した。図１６Ｅ〜１６Ｈは、それぞれ、腎臓、心臓、肝臓、及び脾臓におけるＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの分布をｍＲＮＡの注射後の様々な時点で示す。
図１７は、ｍＲＮＡの注射後の経時的なＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの血漿濃度を検出するｂＤＮＡアッセイの結果を示す。ラットへのｍＲＮＡ投与後にｍＲＮＡ濃度は減少し、注射後２４時間でおよそ５００ｎｇ／ｍＬの濃度まで低下した。
図１８Ａは、ラットへのｍＲＮＡ注射の６時間後の脾臓及び肝臓におけるＰＡＨΔＲＤタンパク質の発現のウェスタンブロットの結果を示す。ＰＡＨΔＲＤタンパク質のレベルは、注射後６時間で肝臓では容易に検出されたが、脾臓ではより低いレベルで検出された。ＰＡＨΔＲＤタンパク質の発現は、腎臓及び心臓では検出できなかった（データは示さず）。図１８Ｂは、ｍＲＮＡの投与後７２時間の肝臓でのタンパク質の発現の結果を示す棒グラフである。タンパク質の発現レベルは、ｍＲＮＡの注射直後（６時間）に最も高く、検出可能ではあるが、注射後４８時間までにかなり低下した。
実施例２８ ｍＲＮＡの皮下投与の評価
ＰＡＨタンパク質をコードするｍＲＮＡの皮下注射の有効性及び用量反応をインビボで調べるため、単回投与の０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または２ｍｇ．ｋｇの１−メチル−プソイドウリジンで修飾されたＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ構築物（配列番号２０２）を、ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスの皮下に施した（１群当たりｎ＝５匹）。ホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスの別の群では、２．０ｍｇ／ｋｇのＰＡＨΔＲＤをコードするこの修飾ｍＲＮＡ構築物（配列番号２０２）を、これらのマウスに２回、すなわち、初回（０日目）に続いて１日後（１日目）に２回目を皮下注射した。このｍＲＮＡは、マウスへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。対照のホモ接合ＰＡＨｅｎｕ２マウスには、ＰＢＳを皮下注射した。マウスから、ｍＲＮＡの単回皮下投与後１日目、２日目、３日目、及び４日目に、またはｍＲＮＡを２回投与したマウスからはｍＲＮＡの初回皮下投与後１日目、２日目、３日目、及び４日目に採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血中フェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて乾燥血液スポット（ＤＢＳ）で測定した。
図１９は、単回の１ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｋｇの用量のヒトＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ構築物の皮下注射後に、ＰＢＳを注射した対照マウスにおけるベースラインのＰｈｅレベルに対してほとんどの時点でＰｈｅレベルの低下が認められたことから、ＰＡＨ活性が増加したことを示す。ベースラインレベルからＰｈｅレベルの有意な差（ｐ＜０．０５）が認められたが、Ｐｈｅの減少は、ＰＢＳサンプルの範囲（平均±ＳＤ）を外れてはいなかった。この効果は、いくらかの用量依存性を示し、単回の０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡの用量では、マウスのＰｈｅレベルは低下しなかった。２回の２ｍｇ／ｋｇの用量のｍＲＮＡの皮下注射では、単回の２ｍｇ／ｋｇの用量のｍＲＮＡの注射と比較して、本試験を通してＰｈｅレベルがさらに低下した。表１１でも本試験の結果を要約する。
表１１．ＰＡＨΔＲＤ ｍＲＮＡの皮下投与（単回及び複数回注射）後の経時的なベースラインのＰｈｅレベルの割合

実施例２９ 疾患用の野生型非ヒト霊長類代理システムにおけるＰＡＨ活性の評価
ｍＲＮＡによって発現されたＰＡＨの活性がＰＫＵ疾患用の野生型非ヒト霊長類代理システムで評価することができるかどうかを調べるため、カニクイザルに対して、０．５ｍｇ／ｋｇの用量の１−メチル−プソイドウリジンで修飾されたＰＡＨΔＲＤをコードするｍＲＮＡ構築物を、毎週、合計５週間（合計５回、１、８、１５、２２、及び２９日目に投与）ＩＶ投与（６０分間注入）した。３種の異なるｍＲＮＡ構築物を各サルで調べた：ｍｉＲ１２６結合部位を有するｍＲＮＡ構築物（配列番号２０２）、３つのｍｉＲ１４２結合部位を有するｍＲＮＡ構築物（配列番号２０１）、及びｍｉＲ結合部位を有さないｍＲＮＡ構築物（配列番号２０３）（１群当たりｎ＝５匹）。サルにはその後、０．５ｍｍｏｌ／ｋｇのフェニルアラニンをＩＶボーラスにより接種し（０時間で）、次いでｍＲＮＡ注射の８時間または４８時間後に接種した。これらのｍＲＮＡは、サルへの送達用に脂質ナノ粒子（化合物ＩＩ／化合物Ｉ）に製剤化した。各Ｐｈｅ接種の実施前（すなわち、ｍＲＮＡ注射の８時間及び４８時間後のＰｈｅ接種前）ならびに各Ｐｈｅ接種の実施後２、１０、３０、４５、６０、１２０、１８０、及び２４０分でサルから採血した。ＰＡＨ活性のマーカーとして、血漿中のフェニルアラニンレベルを各時点でＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて測定した。
図２０Ａ及び２０Ｂは、ｍＲＮＡの各投与後の、ならびにｍＲＮＡ投与の８時間後のＰｈｅ接種後（図２０Ａ）及びｍＲＮＡ投与の４８時間後のＰｈｅ接種後（図２０Ｂ）の平均血漿Ｐｈｅレベルを示す。Ｐｈｅ接種の実施後、血中Ｐｈｅレベルは、２分間で１桁分上昇し、２４０分までにベースラインに戻った。ベースラインと比較した血中Ｐｈｅの有意な低下は、すべての投与群において、８、１５、２２、及び２９日目（２、３、４、及び５回目）のｍＲＮＡの投与後８時間でのＰｈｅ接種の２分後に認められた（二元配置分散分析、ダネット多重比較、アルファ０．０５）。４８時間での接種では、１、１５、２２、及び２９日目（１、３、４、及び５回目）の投与後のＰｈｅ接種の２分後に血中Ｐｈｅの有意な減少が認められた。図２０Ｃ及び２０Ｄは、図２０Ａ〜Ｂの実験結果に関する曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。
発明の概要及び要約のセクションではなく、発明を実施するための形態のセクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されていることを理解されたい。発明の概要及び要約のセクションは、本発明者（複数可）が企図する本発明の例示的な実施形態のすべてではなく１つ以上を記載し得るものであり、従って、本発明及び添付の特許請求の範囲を決して限定するものではない。
本発明を、特定の機能及びそれらの関係の実施を示す機能的な構成要素を用いて上記で説明してきた。これらの機能的な構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書で任意に定義した。該特定の機能及びそれらの関係が適切に行われる限り、別の境界が定義される場合もある。
該特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにすることから、当業者の知識を適用することにより、必要以上の実験をすることなく、本発明の一般概念から逸脱することなく、かかる特定の実施形態を容易に修正すること、及び／または様々な用途に適合させることができる。従って、かかる適合及び修正は、本明細書に含まれる教示及び手引きに基づいて、本開示の実施形態の意義及び均等物の範囲内であることが意図される。本明細書における表現または専門用語は、本明細書の専門用語または表現が、該教示及び手引きに照らして当業者に解釈されるように、限定ではなく説明を目的とするものであることを理解されたい。
本発明の広がり及び範囲は、上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきでなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ定義されるべきである。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先する。

Claims (70)

  1. フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む医薬組成物であって、それを必要とするヒト対象に対して単回静脈内投与として施された場合、十分に、
    （ｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、肝臓組織におけるＰＡＨの活性レベルを、正常なＰＡＨの活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％以内に増加させ、
    （ｉｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、肝臓組織におけるＰＡＨの活性レベルを、前記ヒト対象のベースラインのＰＡＨの活性レベルもしくはフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を有するヒト対象における参照のＰＡＨの活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍に増加させ、
    （ｉｉｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の肝臓レベルを、前記ヒト対象のベースラインの肝臓のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有するヒト対象における参照の肝臓のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下させ、
    （ｉｖ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルを、前記ヒト対象のベースラインの血漿、血清、もしくは尿のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有するヒト対象における参照の血漿、血清、もしくは尿のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下させ、
    （ｖ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの肝臓レベルを、前記ヒト対象のベースラインの肝臓のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照の肝臓のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低下させ、
    （ｖｉ）投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルを、前記ヒト対象のベースラインの血漿、血清、及び／または尿のＰｈｅレベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照の血漿、血清、及び／または尿のＰｈｅレベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍もしくは少なくとも５０倍低下させ、及び／または
    （ｖｉｉ）投与後少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、Ｐｈｅの血漿レベルを、ＰＫＵを有する患者において、１，１１０μＭ未満、１，１００μＭ未満、１，０００μＭ未満、９５０μＭ未満、９００μＭ未満、８５０μＭ未満、８００μＭ未満、７５０μＭ未満、７００μＭ未満、６５０μＭ未満、６００μＭ未満、５５０μＭ未満、５００μＭ未満、４５０μＭ未満、４００μＭ未満、３５０μＭ未満、３００μＭ未満、２５０μＭ未満、２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１００μＭ未満、もしくは９５μＭ未満に低下させる、前記医薬組成物。
  2. さらに、送達剤を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記送達剤が脂質ナノ粒子を含み、前記脂質ナノ粒子が、
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ、または
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記ＰＡＨポリペプチドが、配列番号１または配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  5. 前記ＯＲＦが、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  6. 前記ｍＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  7. 前記マイクロＲＮＡが、造血系の免疫細胞で発現されるか、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現される、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である、請求項６に記載の医薬組成物。
  10. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位である、請求項６に記載の医薬組成物。
  11. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記ｍＲＮＡが、配列番号４、１７５、１７７、または１７８の３’ＵＴＲ配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  13. 前記ｍＲＮＡが、配列番号３の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む５’ＵＴＲを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  14. 前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記ｍＲＮＡが、ポリＡ領域を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 前記ポリＡ領域が、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記ポリＡ領域が、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１６に記載の医薬組成物。
  19. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  20. 前記少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基が、プソイドウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルプソイドウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、Ｎ１−メチルプソイドウラシルに化学的に修飾される、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記ヒト対象が、ＰＫＵを有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  23. 前記ヒト対象が、Ｐｈｅ制限食中である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  24. 前記ヒト対象が、Ｐｈｅ制限食中でない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  25. （ｉ）５’ＵＴＲ、
    （ｉｉ）ヒトＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する前記ＯＲＦ、
    （ｉｉｉ）終止コドン、ならびに
    （ｉｖ）３’ＵＴＲ
    を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むポリヌクレオチド。
  26. 前記ＯＲＦが、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記ＰＡＨポリペプチドが、配列番号１または配列番号２１のアミノ酸からなる、請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記ｍＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記マイクロＲＮＡが、造血系の免疫細胞で発現されるか、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現しかつ炎症性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞で発現される、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡ用である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位である、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記マイクロＲＮＡ結合部位が、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  34. 前記３’ＵＴＲが、配列番号４、１７５、１７７、または１７８の３’ＵＴＲと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、請求項２５〜３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 前記５’ＵＴＲが、配列番号３の５’ＵＴＲ配列と、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、請求項２５〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記ｍＲＮＡが、５’末端キャップを含む、請求項２５〜３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログを含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記ｍＲＮＡが、ポリＡ領域を含む、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記ポリＡ領域が、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記ポリＡ領域が、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５〜４０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基が、プソイドウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルプソイドウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
  43. 前記ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、Ｎ１−メチルプソイドウラシルに化学的に修飾される、請求項４１または４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 配列番号４５〜８４または２０１〜２０３からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  45. （ｉ）５’末端キャップ、
    （ｉｉ）配列番号３の核酸配列を含む５’ＵＴＲ、
    （ｉｉｉ）ＰＡＨポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号２、５〜２０、及び２２〜３８からなる群から選択される配列を含む前記ＯＲＦ、
    （ｉｖ）配列番号４、１７５、１７７、または１７８の核酸配列を含む３’ＵＴＲ、ならびに
    （ｖｉ）ポリＡ領域
    を含むｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド。
  46. 前記５’末端キャップが、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそのアナログを含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
  47. 前記ポリＡ領域が、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０ヌクレオチドの長さ、または少なくとも約１００ヌクレオチドの長さである、請求項４５または４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記ポリＡ領域が、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項４５または４６に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記少なくとも１つの化学的に修飾された核酸塩基が、プソイドウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルプソイドウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルプソイドウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４９に記載のポリヌクレオチド。
  51. 配列番号４５〜８４または２０１〜２０３からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記５’末端キャップが、キャップ１を含み、前記ポリヌクレオチドのウラシルのすべてがＮ１−メチルプソイドウラシルである、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記ポリＡ領域が、１００ヌクレオチドの長さである、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
  54. 請求項２５〜５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び送達剤を含む、医薬組成物。
  55. 前記送達剤が脂質ナノ粒子を含み、前記脂質ナノ粒子が、
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＶＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）ＰＥＧ−ＤＭＧもしくは化合物Ｉ、
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）コレステロール、及び（ｉｉｉ）化合物Ｉ、または
    （ｉ）化合物ＩＩ、（ｉｉ）ＤＳＰＣもしくはＤＯＰＥ、（ｉｉｉ）コレステロール、及び（ｉｖ）化合物Ｉを含む、請求項５４に記載の医薬組成物。
  56. フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドを、それを必要とするヒト対象において発現する方法であって、前記対象に対して、請求項１〜２４、５４、もしくは５５のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２５〜５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
  57. ＰＫＵの治療、予防、または発症及び／または進行の遅延の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項１〜２４、５４、もしくは５５のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２５〜５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
  58. 血中フェニルアラニンレベルの低下の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項１〜２４、５４、もしくは５５のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２５〜５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
  59. 請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の方法であって、
    （ｉ）前記Ｐｈｅの血中及び／または肝臓レベルが、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、もしくは１２日間、前記対象のベースラインのＰｈｅの血中及び／または肝臓レベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照のＰｈｅの血中及び／または肝臓レベルと比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下し、
    （ｉｉ）前記Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルが、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、もしくは１２日間、前記対象のベースラインのＰｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルもしくはＰＫＵを有する患者における参照のＰｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルと比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％低下し、
    （ｉｉｉ）前記Ｐｈｅの血中及び／または肝臓レベルが、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間以内に、正常なＰｈｅの血中及び／または肝臓レベルと比較して、少なくとも１０倍以内、少なくとも５倍以内、少なくとも２倍以内、もしくは少なくとも１．５倍以内に低下し、
    （ｉｖ）前記Ｐｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルが、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、正常なＰｈｅの血漿、血清、及び／または尿レベルと比較して、少なくとも１０倍以内、少なくとも５倍以内、少なくとも２倍以内、もしくは少なくとも１．５倍以内に低下、及び／または
    （ｖ）前記Ｐｈｅの血漿レベルが、投与後少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、前記対象において、１，１１０μＭ未満、１，１００μＭ未満、１，０００μＭ未満、９５０μＭ未満、９００μＭ未満、８５０μＭ未満、８００μＭ未満、７５０μＭ未満、７００μＭ未満、６５０μＭ未満、６００μＭ未満、５５０μＭ未満、５００μＭ未満、４５０μＭ未満、４００μＭ未満、３５０μＭ未満、３００μＭ未満、２５０μＭ未満、２００μＭ未満、１５０μＭ未満、１００μＭ未満、もしくは９５μＭ未満に低下する、前記方法。
  60. ＰＡＨ活性の増加の、それを必要とするヒト対象における方法であって、前記対象に対して、請求項１〜２４、５４、もしくは５５のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２５〜５３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの有効量を投与することを含む、前記方法。
  61. 請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法であって、
    （ｉ）前記対象におけるＰＡＨ活性レベルが、単回投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、もしくは少なくとも１２０時間、ＰＫＵを有する対象における参照ＰＡＨ活性レベルと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍に増加し、及び／または
    （ｉｉ）前記医薬組成物もしくはポリヌクレオチドの単回投与が前記対象に施された１２時間後、前記対象におけるＰＡＨ活性が、前記対象のベースラインのＰＡＨ活性と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、もしくは少なくとも６００％増加する、前記方法。
  62. 前記ＰＡＨ活性が、前記対象の肝臓または血中で増加する、請求項６０または６１に記載の方法。
  63. 前記ヒト対象に対して、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の塩、またはそのアナログの塩を共投与することを含む、請求項５６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記テトラヒドロビオプテリンのアナログまたはその塩が、サプロプテリン、６−ヒドロキシメチルプテリン（ＨＭＰ）、６−アセチル−７，７−ジメチル−７，８−ジヒドロプテリン（ＡＤＤＰ）、またはその塩である、請求項６３に記載の方法。
  65. テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）、そのアナログ、テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）の塩、またはそのアナログの塩が、経口投与される、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記対象への前記投与が、約１週間に１回、約２週間に１回、または約１ヶ月に１回である、請求項５６〜６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが、静脈内投与される、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが、皮下投与される、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが、静脈内及び皮下に投与される、請求項５６〜６６のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記医薬組成物またはポリヌクレオチドの１回以上の静脈内投与に続いて、前記医薬組成物またはポリヌクレオチドの１回以上の皮下投与を含む、請求項６９に記載の方法。
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