KR20190100318A - 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 유전자 치료 - Google Patents

Abstract

페닐케톤뇨증을 치료하는 데 유용한 조성물 및 섭생이 제공된다. 상기 조성물은 인간 페닐알라닌 수산화효소의 발현을 추진시키는 트란스타이레틴 인핸서 및 촉진자를 갖는 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV)를 포함한다.

Description

페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 유전자 치료

전자 형태로 제출된 자료의 참고에 의한 포함

출원인은 본 명세서로부터 전자 형태로 제출된 서열 목록 자료를 참고로 본 명세서에 포함시킨다. 이 파일은 "UPN-16-7939PCT_ST25.txt"로 표지된다.

1. 도입

본 출원은 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 유전자 치료에 유용한 실시형태에 관한 것이다.

대사의 가장 흔한 선천성 결손 중 하나로서, 페닐케톤뇨증(phenylketonuria: PKU)은 미국에서 10,000명 내지 15,000명의 신생아 중 1명에서 발생한다. 현재의 치료 접근법은 이환된 개체가 전 생애 동안 출생 시부터 입에 안 맞고 비싼 식이 제한을 고수하고/하거나, 페닐알라닌 암모니아 분해효소에 의한 효소 치환을 취할 것을 요한다.

PKU의 가장 흔한 원인은 PAH 유전자에서의 열성으로 유전된 돌연변이로 인한 페닐알라닌 수산화효소(phenylalanine hydroxylase: PAH)의 결핍증이다. PAH는 타이로신으로의 페닐알라닌의 가역적인 수산화를 촉매화하는 간에서 주로 발현된다. 따라서, PAH의 결핍증은 페닐알라닌의 이화 경로에 영향을 미쳐서, 페닐알라닌을 축적시킨다. 높은 혈장 페닐알라닌 수준은 뇌에서의 페닐알라닌의 축적을 발생시키고, 뇌 발육 및 기능에 영향을 미칠 수 있어서, 지적 장애 및 발작을 발생시킨다. 더욱이, 식이 제한 및 효소 치환을 통한 혈장 페닐알라닌의 감소는 비싸고, 불편하고, 다양한 불리한 합병증, 예컨대 지속적인 경증 인지 결손과 연결된다.

PAH의 지속적인 치료학적 수준을 달성하는 대안적인 접근법은 세포 지향된 아데노 연관된 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 또는 다른 바이러스 또는 비바이러스 벡터에 의해 매개되는 유전자 전달을 사용한 간세포에서의 네이티브 효소의 지속적인 생체내 생성을 통해서이다. 벡터 매개된 PAH 발현의 여러 시도는 마우스 연구에서 예비 시험되었다. 예를 들어, 문헌[Harding et al, Complete correction of hyperphenylalaninemia following liver-directed, recombinant AAV2/8 vector mediated gene therapy in murine phenylketonuria Gene Ther. 2006 Mar; 13(5):457-6 및 Viecelli et al, Treatment of phenylketonuria Using Minicircle-Based Naked-DNA Gene Transfer to Murine Liver Hepatology. 2014 Sep; 60(3): 1035-1043](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 그러나, 전달 효율, 면역 자극, 장기간 발현 안정성 및 안전성의 평가는 결여되거나 최적이 아니다. 따라서, 더 효율적인 AAV.hPAH 벡터가 PKU 치료에 필요하다.

본 명세서에 기재된 실시형태는, 과페닐알라닌뇨증의 임상적으로 의미 있는 수정을 장기간, 아마도 10년 이상 발생시키는, 벡터의 정맥내 투여 이후에 이를 필요로 하는 대상체에게 정상 인간 인간 페닐알라닌 수산화효소(PAH)를 전달하기 위한 AAV 유전자 치료 벡터에 관한 것이다. 대상체 환자 집단은 PKU, 가변적 PKU 또는 비-PKU 과페닐알라닌뇨증을 갖는 환자를 포함하여 중등도 내지 중증의 과페닐알라닌뇨증을 갖는 환자이다. 의도된 벡터 용량은 야생형과 비교하여 "중등도" PKU 환자에 보고된 수준인 대략 15% 이상의 PAH 혈액 수준을 전달하도록 의도된다. 문헌[Kaufman, S., PNAS, 96:3160-4 (1999)](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 의도된 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 25% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 일 실시형태에서, AAV 벡터 치료의 목표는 중증 PKU 환자를 중등도 또는 경증 PKU로 전환시켜서, 심하게 제한된 페닐알라닌 식이와 연관된 부담을 줄인다.

일 양태에서, 본 출원은 PKU로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 인간 페닐알라닌 수산화효소(human phenylalanine hydroxylase: PAH) 유전자를 전달하기 위한 복제 결핍 아데노 연관된 바이러스(AAV)의 용도를 제공한다. hPAH 유전자("rAAV.hPAH")를 전달하기 위해 사용된 재조합 AAV 벡터(rAAV)는 간에 대한 지향성(tropism)(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV)을 가져야 하고, hPAH 전이유전자는 간 특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 일 실시형태에서, 발현 제어 요소는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 인핸서; 촉진자; 인트론; WPRE; 및 polyA 신호. 이러한 요소는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.

일 실시형태에서, hPAH 암호화 서열은 서열 번호 1에 기재되어 있다. 일 실시형태에서, PAH 단백질 서열은 서열 번호 2에 기재되어 있다. hPAH에 대한 암호화 서열은, 일 실시형태에서, 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 이러한 서열은 네이티브 hPAH 암호화 서열(서열 번호 3)과 80% 미만의 동일성을 공유할 수 있다. 일 실시형태에서, hPAH 암호화 서열은 서열 번호 1에 기재된 것이다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 rAAV를 포함하는, PKU 환자에게 투여하기에 적합한, 수성 현탁액이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 현탁액은 수성 현탁 액체 및 약 1x10¹² 내지 약 1x10¹⁴의 rAAV의 게놈 카피(GC)/㎖를 포함한다. 현탁액은, 일 실시형태에서, 정맥내 주사에 적합하다. 다른 실시형태에서, 현탁액은 수성 현탁 액체 중에 용해된 계면활성제, 보존제, 및/또는 완충제를 추가로 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바대로 rAAV에 의해 PKU를 갖는 환자를 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시형태에서, 약 1x10¹¹ 내지 약 3x10¹³의 rAAV의 게놈 카피(GC)/환자 체중(㎏)은 수성 현탁액 중에 환자에 전달된다.

도 1은 pAAV.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH 시스 플라스미드의 도식적 표시이다.
도 2a는 실시예 1에 기재된 바와 같이 PAH_KO_A 마우스 모델(백색으로 표시) 및 야생형(검정으로 표시) 또는 이형접합성(회색으로 표시) 한배 새끼에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 막대 그래프이다. 이 결과는 도 2d에 요약되어 있다.
도 2b는 대조군으로서 제공된 이형접합성(회색으로 표시) 및 야생형(검정으로 표시) 한배 새끼를 갖는 PAH_KO_A 마우스 모델(백색으로 표시)에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 선 그래프이다. 마우스에 실시예 3에 기재된 바와 같이 자연사 연구의 56일에 1x10¹³ GC/㎏ 또는 1x10¹² GC/㎏의 AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH가 주사되었다. 실험은 자연사 연구로부터 7마리의 수컷 및 3마리의 암컷 PAH_KO_A 마우스에서 수행되었다.
도 2c는 실시예 3에 기재된 바와 같이 1x10¹³ GC/㎏ 또는 1x10¹² GC/㎏의 AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH가 주사된 PAH_KO_A 마우스에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 선 그래프이다. 주사 일은 0일이었다.
도 2d는 도 2a에서 연구된 마우스에 대한 평균 Phe 수준을 보여주는 선 그래프이다. 값은 ±SEM으로 표시된다.
도 3a는 실시예 1에 기재된 바와 같이 PAH_KO_B 마우스 모델(백색으로 표시) 및 야생형(검정으로 표시) 또는 이형접합성(회색으로 표시) 한배 새끼에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 막대 그래프이다. 이 결과는 도 3d에 요약되어 있다.
도 3b는 대조군으로서 제공된 이형접합성(회색으로 표시) 및 야생형(검정으로 표시) 한배 새끼를 갖는 PAH_KO_B 마우스 모델(백색으로 표시)에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 선 그래프이다. 실험은 자연사 연구로부터 3마리의 암컷 PAH_KO_B 마우스에서 수행되었다.
도 3c는 실시예 3에 기재된 바와 같이 1x10¹² GC/㎏의 AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH가 주사된 PAH_KO_B 마우스에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 선 그래프이다. 마우스 식별 번호 1691, 1695 및 1696은 0일에 1x10¹² GC/㎏가 주사된 암컷이었다.
도 3d는 도 3a에서 연구된 마우스에 대한 평균 Phe 수준을 보여주는 선 그래프이다. 값은 ±SEM으로 표시된다.
도 4a는 실시예 1에 기재된 바와 같이 PAH_KO_C 마우스 모델(백색으로 표시) 및 야생형(검정으로 표시) 또는 이형접합성(회색으로 표시) 한배 새끼에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 선 그래프이다. 이 결과는 도 4c에 요약되어 있다.
도 4b는 대조군으로서 제공된 이형접합성(회색으로 표시) 및 야생형(검정으로 표시) 한배 새끼를 갖는 PAH_KO_C 마우스 모델(백색으로 표시)에서의 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 선 그래프이다. 실험은 자연사 연구로부터 2마리의 수컷 PAH_KO_C 마우스에서 수행되었다.
도 4c는 도 4a에서 연구된 마우스에 대한 평균 Phe 수준을 보여주는 선 그래프이다. 값은 ±SEM으로 표시된다.
도 5는 도 2a, 도 3a 및 도 4a의 결과를 요약한 막대 그래프이다. 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준은 6주령 내지 8주령으로부터 PAH_KO_A, PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스로부터의 데이터를 통해 검출되었다. 혈장을 단리하고, Phe 농도에 대해 분석하였다. 야생형 한배 새끼는 음성 대조군으로서 제공되었다.
도 6a 내지 도 6c는 AAV8.TBG.hPAHco가 PKU_KO_B 마우스에서 페닐알라닌 수준을 구조한다는 것을 나타낸다. 17주령 내지 22주령의 PKU B 마우스에 치료전 페닐알라닌 수준이 확립된 후 10¹² GC/㎏의 AAV8.TBG.hPAHco.bGH(원) 또는 AAV8.TBG.hPAHco.WPRE.bGH(정사각형)가 주어졌다. PBS 치료는 삼각형으로 표시된다. 이후, 마우스를 주마다 사혈시키고, 혈장을 단리하고, 페닐알라닌 농도를 결정하였다(a). 연구의 종결 시, 간은 수집되고, 게놈 카피 분석(b) 및 면역조직화학(c)이 수행되었다. 값은 ±SEM으로 표시된다.
도 7은 AAV 유전자 치료가 PKU_KO_A 마우스에서 혈장 Phe 농도를 낮춘다는 것을 나타내는 선 그래프이다. WT(삼각형), 이형접합성(원) 및 PKU_KO_A(KO) 마우스에 기준치 페닐알라닌 수준이 확립된 후 10¹¹ GC/㎏의 AAV8.TBG.hPAHco를 정맥내 주사하였다. 이후, 마우스를 주마다 사혈시키고, 혈장을 단리하고, Phe 농도에 대해 분석하였다. 값은 ±SEM으로 표시된다. 혈장에서의 Phe 수준은 AAV8.TBG.hPAHco의 정맥내 투여 이후에 71% 감소하였다.
도 8a 내지 도 8c는 고용량 AAV9.TBG.hPAHco가 PKU_KO_B 마우스에서 페닐알라닌 수준을 구조한다는 것을 나타낸다. PKU_KO_B 마우스에 기준치 페닐알라닌 수준이 확립된 후 10¹² GC/㎏, 3x10¹¹ GC/㎏ 또는 10¹¹ GC/㎏의 AAV8.TBG.hPAHco가 주어졌다. 이후, 마우스를 주마다 사혈시키고, 혈장을 단리하고, Phe 농도(a)에 대해 분석하였다. 값은 ±SEM으로 표시된다. 연구의 종결 시, 간은 수집되고, 게놈 카피 분석(b) 및 면역조직화학(c)이 수행되었다. 단백질 발현 및 Phe 수준의 감소는 10¹² GC/㎏의 용량에서 보였다.
도 9는 야생형(WT)(서열 번호 26), PAH_KO_A(균주 A)(서열 번호 27), PAH_KO_B(균주 B)(서열 번호 28), PAH_KO_C(균주 C)(서열 번호 29), PAH_KO_D(균주 D)(서열 번호 30) 및 공통(서열 번호 31)에 대한 PAH 서열의 일부의 정렬을 보여준다.

본 출원에 기재된 실시형태는 페닐케톤뇨증(PKU)으로 진단된 환자(인간 대상체)의 간 세포에 인간 페닐알라닌 수산화효소(PAH) 유전자를 전달하기 위한 복제 결핍 아데노 연관된 바이러스(AAV)의 용도에 관한 것이다. hPAH 유전자("rAAV.hPAH")를 전달하기 위해 사용된 재조합 AAV 벡터(rAAV)는 간에 대한 지향성(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV)을 가져야 하고, hPAH 전이유전자는 간 특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 일 실시형태에서, 발현 제어 요소는 하기 중 하나 이상을 포함한다: 인핸서; 촉진자; 인트론; WPRE; 및 polyA 신호. 이러한 요소는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.

본 명세서에 사용된 바대로, "AAV8 캡시드"는 GenBank, 수탁번호: YP_077180.1, 서열 번호 19(본 명세서에 참고로 포함됨)의 아미노산 서열을 갖는 AAV8 캡시드를 의미한다. 이 암호화된 서열로부터의 약간의 변동이 허용되고, 이는 YP_077180.1 및 WO 제2003/052051호(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 기준 아미노산 서열과 약 99% 동일성을 갖는 서열(즉, 기준 서열로부터 약 1% 미만의 변동)을 포함할 수 있다. 캡시드를 생성하는 방법, 이에 대한 암호화 서열 및 rAAV 바이러스 벡터를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)] 및 US 제2015/0315612호를 참조한다.

본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "NAb 역가"는 이의 표적화된 에피토프(예를 들어, AAV)의 생리학적 효과를 중화시키는 중화 항체(예를 들어, 항-AAV Nab)가 얼마나 많이 생성되는지의 측정치이다. 항-AAV NAb 역가는 예를 들어 문헌[Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 측정될 수 있다.

아미노산 서열의 맥락에서 용어 "동일성 백분율(%)", "서열 동일성", "서열 동일성 백분율" 또는 "동일 백분율"은 관련성에 대해 정렬될 때 동일한 2개의 서열에서의 잔기를 의미한다. 동일성 백분율은 단백질의 전장, 폴리펩타이드, 약 32개의 아미노산, 약 330개의 아미노산, 또는 이의 펩타이드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 암호화 시퀀서에 대해 아미노산 서열에 대해 용이하게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 적어도 약 8개의 아미노산 길이일 수 있고, 약 700개 이하의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열 사이의 "동일성 ", "상동성" 또는 "유사성"을 언급할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열을 참조하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은 기준 서열과 비교하여 미싱 또는 추가적인 염기 또는 아미노산에 대한 수정을 대개 함유하는 다수의 핵산 서열 또는 단백질(아미노산) 서열을 의미한다. 정렬은 임의의 다양한 공공으로 또는 상업적으로 이용 가능한 Multiple Sequence Alignment Programs를 이용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램, 예를 들어 "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" 및 "Match-Box" 프로그램은 아미노산 서열에 이용 가능하다. 일반적으로, 임의의 이들 프로그램은 디폴트 설정에서 사용되지만, 당업자는 필요한 바대로 이 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 언급된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공된 것과 적어도 동일성 또는 정렬의 수준을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)]을 참조한다.

본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 관심 대상의 유전자와 인접한 발현 제어 서열 및 관심 대상의 유전자를 제어하도록 트랜스로 또는 일정한 거리에서 작용하는 발현 제어 서열 둘 다를 의미한다.

"복제 결핍 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 대상의 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프에 패키징된 합성 또는 인공 바이러스 입자를 의미하고, 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프 내에 또한 패키징된 임의의 바이러스 게놈 서열은 복제 결핍이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만, 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유한다. 일 실시형태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제하는 데 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 포함하지 않지만(게놈은 "무장(gutless)"이도록 조작될 수 있다 - 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 필요한 신호에 의해 측접된 관심 대상의 전이유전자를 오직 함유), 이들 유전자는 제조 동안 공급될 수 있다. 따라서, 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 복제에 필요한 바이러스 효소의 존재 하에를 제외하고 생길 수 없으므로, 이것은 유전자 치료에서 사용하기에 안전하다고 간주된다.

용어 "일" 또는 "하나"는 하나 이상을 의미한다는 것이 주목되어야 한다. 그러므로, 용어 "일"(또는 "하나"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다.

단어 "포함한다", "포함" 및 "포함하는"은 배타적이기보다는 포함적으로 해석되어야 한다. 단어 "이루어진다", "이루어지는" 및 이의 변형어는 포함적이기보다는 배타적으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 다양한 실시형태가 "포함하는" 언어를 사용하여 제시되어 있지만, 다른 상황 하에, 관련된 실시형태는 "이루어진' 또는 "본질적으로 이루어진' 언어를 사용하여 해석되고 기재되는 것으로 또한 의도된다.

본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "약"은, 달리 기재되지 않는 한, 주어진 기준으로부터 10%의 변동을 의미한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술 및 과학 용어는 본 출원에 사용된 많은 용어에 일반 가이드를 제공하는 공개 텍스트에 참고로 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

5.1 유전자 치료 벡터

일 양태에서, 인간 PAH 유전자를 보유하는 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV) 벡터는 유전자 치료에서 사용하기 위해 제공된다. rAAV.hPAH 벡터는 간에 대한 지향성(예를 들어, AAV8 캡시드를 보유하는 rAAV)을 가져야 하고, hPAH 전이유전자는 간 특이적 발현 제어 요소에 의해 제어되어야 한다. 벡터는 인간 대상체에 대한 점적주사에 적합한 완충제/캐리어에서 제제화된다. 완충제/캐리어는 rAAV가 점적주사 배관에 점착하는 것을 막지만 생체내 rAAV 결합 활성을 방해하지 않는 성분을 포함해야 한다.

5.1.1. rAAV.hPAH 벡터

5.1.1.1. hPAH 서열

페닐케톤뇨증은 페닐알라닌 수산화효소(PAH) 유전자의 돌연변이에 의해 주로 생기는 대사의 유전적 결손이다. PAH 유전자에서의 돌연변이는 페닐알라닌(Phe)의 이화 경로에 영향을 미치는 촉매 활성을 감소시킨다. PAH는 Phe를 타이로신(Tyr)으로 전환시키는 보인자 테트라하이드로바이옵테린(BH₄)을 필요로 하는 간 효소이다. PAH 또는 이의 보인자 BH₄의 결핍증은 과도한 페닐알라닌을 축적시키고, 이의 독성 효과는 치료되지 않는 경우 중증의 비가역적인 지적 장애 및 다른 장애를 발생시킬 수 있다. 문헌[Havid and Cristodoulou, Transl Pediatr, 2015 Oct, 4(4):304-17](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.

PAH 유전자의 550개 초과의 돌연변이가 기재되어 있고, 이의 대부분은 결핍 효소 활성을 발생시킨다. http://www.pahdb.mcgill.ca/에서 접근 가능한 Phenylalanine Hydroxylase Locus Knowledgebase(본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다. 많은 수의 공지된 PKU 돌연변이 및 질환의 상염색체 열성 성질로 인해, 질환 중증도의 넓은 범위가 보인다. 질환의 중증도는 일반적으로 혈액 페닐알라닌 수준에 의해 분류되고, 이는 때때로 전통적인 PKU, 중등도의 또는 가변적 PKU, 경증의 PKU 또는 과페닐알라닌뇨증으로 분류된다. 진단 시 혈액 Phe 수준에 기초하여, PKU 중증도의 4개의 수준이 있다.

일반 범위보다 약간 높은 Phe 수준을 갖는 과페닐알라닌뇨증: 120 내지 600μ㏖/ℓ(2 내지 10㎎/㎗)

가장 낮은 혈액 Phe 수준을 갖는 경증: 600 내지 900μ㏖/ℓ(10 내지 15㎎/㎗)

중간 어딘가의 혈액 Phe 수준을 갖는 중등도 또는 가변적: 900 내지 1200μ㏖/ℓ(15 내지 20㎎/㎗)

극도로 높은 혈액 Phe 수준을 갖는 중증 또는 "전통적인" PKU: 1200μ㏖/ℓ(20㎎/㎗) 초과

본 명세서에 기재된 치료의 목표는 120 내지 600μ㏖/ℓ 범위의 Phe 수준, 예를 들어 혈장 Phe 수준의 25% 이상의 감소를 발생시키는 기능적 PAH 효소를 제공할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 25% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 30% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 35% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 40% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 45% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 50% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 60% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 70% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 75% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다.

일 실시형태에서, "대상체" 또는 "환자"는 상기 기재된 바와 같은 PKU를 갖는 포유류 대상체이다. 임의의 중증도의 PKU를 갖는 환자가 의도된 대상체인 것으로 의도된다.

일 실시형태에서, hPAH 유전자는 서열 번호 2에 기재된 hPAH 단백질을 암호화한다. 따라서, 일 실시형태에서, hPAH 전이유전자는 첨부된 서열 목록(본 명세서에 참고로 포함됨)에 제공된 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 의해 제공된 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 서열 번호 3은 네이티브 인간 PAH에 대한 cDNA를 제공한다. 서열 번호 1은 인간에서의 발현에 코돈 최적화된 인간 PAH에 대한 조직된 cDNA(때때로 본 명세서에 hPAHco라 칭해짐)를 제공한다. 본 명세서에서 hPAH에 대한 언급은, 몇몇 실시형태에서, hPAH 네이티브 또는 코돈 최적화된 서열을 의미할 수 있다고 이해되어야 한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 웹 기반 또는 상업적으로 구입 가능한 컴퓨터 프로그램, 및 서비스 기반 회사는 RNA 및/또는 cDNA 둘 다를 포함하는 핵산 암호화 서열로 아미노산 서열을 다시 번역하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, EMBOSS에 의한 backtranseq, www.ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity (www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html); ExPasy(www.expasy.org/tools/)를 참조한다. (예를 들어, 코돈 최적화에 의해) 원하는 표적 대상체에서의 발현에 최적화된 핵산 서열을 포함하는, 기재된 hPAH 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 모든 핵산이 포함되는 것으로 의도된다.

일 실시형태에서, hPAH를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3의 네이티브 hPAH 암호화 서열과 적어도 95%의 동일성을 공유한다. 또 다른 실시형태에서, hPAH를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3의 네이티브 hPAH 암호화 서열과 적어도 90%, 85%, 80%, 75%, 70% 또는 65%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, hPAH를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3의 네이티브 hPAH 암호화 서열과 약 78%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, hPAH를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 1이다.

일 실시형태에서, PAH 암호화 서열은 표적 대상체에서의 발현을 위해 최적화된다. 코돈 최적화된 암호화 영역은 다양한 상이한 방법에 의해 설계될 수 있다. 이 최적화는 온라인으로 이용 가능한 방법(예를 들어, GeneArt), 공개된 방법 또는 예를 들어 DNA2.0(캘리포니아주 멜론 파크)으로서 코돈 최적화 서비스를 제공하는 회사를 사용하여 수행될 수 있다. 하나의 코돈 최적화 접근법은 예를 들어 국제 특허 공보 WO 제2015/012924호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 미국 특허 공보 제2014/0032186호 및 미국 특허 공보 제2006/0136184호를 참조한다. 적합하게, 생성물에 대한 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF)의 전체 길이는 변형된다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 오직 ORF의 단편이 변경될 수 있다. 이들 방법 중 하나를 사용함으로써, 임의의 소정의 폴리펩타이드 서열에 빈도수를 적용하고, 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈 최적화된 암호화 영역의 핵산 단편을 생성할 수 있다.

코돈에 실제 변형을 수행하거나 또는 본 명세서에 기재된 바대로 설계된 코돈 최적화된 암호화 영역을 합성하기 위한 다수의 옵션이 이용 가능하다. 이러한 변형 또는 합성은 당업자에게 널리 공지된 표준 및 일상적 분자 생물학적 조작을 이용하여 수행될 수 있다. 하나의 접근법에서, 각각 원하는 서열의 길이의 및 이 길이에 이르는 80개 내지 90개의 뉴클레오타이드의 일련의 상보성 올리고뉴클레오타이드 쌍은 표준 방법에 의해 합성된다. 이 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링 시 이들이 응집성 말단을 함유하는 80개 내지 90개의 염기쌍의 이중 표준 단편을 형성하도록 합성되고, 예를 들어 쌍에서의 각각의 올리고뉴클레오타이드는 쌍에서의 다른 올리고뉴클레오타이드에 상보성인 영역을 넘어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 이것 초과의 염기를 확장하도록 합성된다. 올리고뉴클레오타이드의 각각의 쌍의 단일 가닥 말단은 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 쌍의 단일 가닥 말단과 어닐링하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드 쌍은 어닐링하도록 허용되고, 이들 이중 가닥 단편의 대략 5개 내지 6개는 이후 응집성 단일 가닥 말단을 통해 함께 어닐링하도록 허용되고, 이후 이들은 함께 결찰되고, 표준 박테리아 클로닝 벡터, 예를 들어 Thermo Fisher Scientific Inc.로부터 구입 가능한 TOPO(등록상표) 벡터로 클로닝된다. 작제물은 이후 표준 방법에 의해 서열분석된다. 함께 결찰되는 80개 내지 90개의 염기쌍 단편의 5개 내지 6개의 단편, 즉 약 500개의 염기쌍의 단편으로 이루어진 이들 작제물 중 몇몇은 제조되어서, 전체 원하는 서열은 일련의 플라스미드 작제물에서 표시된다. 이들 플라스미드의 인서트는 이후 적절한 제한 효소에 의해 절단되고 함께 결찰되어 최종 작제물을 형성한다. 최종 작제물은 이후 표준 박테리아 클로닝 벡터로 클로닝되고 서열분석된다. 추가적인 방법은 당업자에게 즉시 명확할 것이다. 또한, 유전자 합성은 용이하게 상업적으로 이용 가능하다.

5.1.1.2. rAAV 벡터

PAH가 간에서 자연적으로 발현되므로, 간에 대한 지향성을 나타내는 AAV를 사용하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, 캡시드를 공급하는 AAV는 AAV8이다. 또 다른 실시형태에서, 캡시드를 공급하는 AAV는 AAVrh.10이다. 더욱 또 다른 실시형태에서, 캡시드를 공급하는 AAV는 계통군 E AAV이다. 이러한 AAV는 rh.2; rh.10; rh.25; bb.1, bb.2, pi.1, pi.2, pi.3, rh.38, rh.40, rh.43, rh.49, rh.50, rh.51, rh.52, rh.53, rh.57, rh.58, rh.61, rh.64, hu.6, hu.17, hu.37, hu.39, hu.40, hu.41, hu.42, hu.66 및 hu.67을 포함한다. 이 계통군은 변형된 rh.2; 변형된 rh.58; 및 변형된 rh.64를 추가로 포함한다. WO 제2005/033321호(본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다. 그러나, 간 지향성을 갖는 임의의 다수의 rAAV 벡터를 사용할 수 있다.

하기에, 실시예에 기재된 구체적인 실시형태에서, 유전자 치료 벡터는 AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH라 칭해지는 타이록신 결합 글로불린(TBG) 촉진자의 제어 하에 hPAH 전이유전자를 발현하는 AAV8 벡터이다. 이러한 벡터에 대한 벡터 게놈은 서열 번호 20에 기재되어 있다. 또 다른 실시형태에서, WPRE는 생략되고, 즉 AAV8.TBGPI.hPAHco.bGH이다. 이러한 벡터에 대한 벡터 게놈은 서열 번호 21에 기재되어 있다. 외부 AAV 벡터 성분은 혈청형 8이다, T = 1, 1:1:10의 비율로 VP1, VP2 및 VP3인 3개의 AAV 바이러스 단백질의 60개의 카피로 이루어진 20면체 캡시드. 캡시드는 단일 가닥 DNA rAAV 벡터 게놈을 함유한다.

일 실시형태에서, rAAV.hPAH 게놈은 2개의 AAV 역위 말단 반복(ITR)에 의해 측접된 hPAH 전이유전자를 함유한다. 일 실시형태에서, hPAH 전이유전자는 인핸서, 촉진자, 인트론, 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사 후 조절 요소(WPRE)(예를 들어, 서열 번호 15), hPAH 암호화 서열 및 폴리아데닐화(polyA) 신호 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, hPAH 전이유전자는 인핸서, 촉진자, 인트론, hPAH 암호화 서열 및 폴리아데닐화(polyA) 신호 중 하나 이상을 포함한다. 이 제어 서열은 hPAH 유전자 서열에 "작동 가능하게 연결"된다. 이 서열을 함유하는 발현 카세트는 바이러스 벡터의 제조에 사용된 플라스미드로 조작될 수 있다.

ITR은 벡터 제조 동안 게놈의 복제 및 패키징을 담당하는 유전 요소이고, rAAV를 생성하기 위해 필요한 유일한 바이러스 cis 요소이다. AAV 바이러스 입자로 발현 카세트를 패키징하기 위해 필요한 최소 서열은 캡시드와 동일한 AAV 기원이거나, (AAV 위형을 제조하기 위한) 상이한 AAV 기원일 수 있는 AAV 5' 및 3' ITR이다. 일 실시형태에서, AAV2로부터의 ITR 서열, 또는 이의 결실된 버전(ΔITR)을 사용한다. 그러나, 다른 AAV 소스로부터의 ITR을 선택할 수 있다. ITR의 소스가 AAV2 유래이고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 소스 유래일 때, 생성된 벡터는 위형이라 칭해질 수 있다. 통상적으로, AAV 벡터에 대한 발현 카세트는 AAV 5' ITR, hPAH 암호화 서열 및 임의의 조절 서열 및 AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이 요소의 다른 구성이 적합할 수 있다. D-서열 및 말단 분해 부위(trs)가 결실된, ΔITR이라 칭해지는, 5' ITR의 짧아진 버전이 기재되어 있다. 다른 실시형태에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR을 사용한다. 일 실시형태에서, 5' ITR은 서열 번호 16에 기재된 것이다. 일 실시형태에서, 3' ITR은 서열 번호 17에 기재된 것이다.

일 실시형태에서, 발현 제어 서열은 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 일 실시형태에서, 서열 번호 4에 기재된 En34 인핸서(인간 아포리포단백질 간 제어 영역으로부터의 34bp 코어 인핸서)가 포함된다. 또 다른 실시형태에서, EnTTR(트란스타이레틴으로부터의 100bp 인핸서 서열)이 포함된다. 이러한 서열은 서열 번호 5에 기재되어 있다. 문헌[Wu et al, Molecular Therapy, 16(2):280-289, Feb. 2008](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 더욱 또 다른 실시형태에서, α1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체 인핸서가 포함된다. 더욱 또 다른 실시형태에서, ABPS(α1-마이크로글로불린/비쿠닌 전구체[ABP]로부터 42bp로 100bp 원위 인핸서의 짧아진 버전) 인핸서가 포함된다. 이러한 서열은 서열 번호 6에 기재되어 있다. 더욱 또 다른 실시형태에서, ApoE 인핸서가 포함된다. 이러한 서열은 서열 번호 7에 기재되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 하나 초과의 인핸서가 존재한다. 이러한 조합은 본 명세서에 기재된 임의의 인핸서의 하나 초과의 카피, 및/또는 인핸서의 하나 초과의 유형을 포함할 수 있다.

hPAH 암호화 서열의 발현은 간 특이적 촉진자로부터 추진된다. 본 명세서에 기재된 예시적인 플라스미드 및 벡터는 타이록신 결합 글로불린(TBG) 촉진자(서열 번호 9), 또는 이의 변형된 버전을 사용한다. TBG 촉진자의 하나의 변형된 버전은 TBG-S1이라 칭하는 짧아진 버전이다. 변형된 타이록신 결합 글로불린(TBG-S1) 촉진자 서열은 서열 번호 8에 기재되어 있다. 대안적으로, 다른 간 특이적 촉진자, 예컨대 트란스타이레틴 촉진자를 사용할 수 있다. 또 다른 적합한 촉진자는 알파 1 항-트립신(AlAT), 또는 이의 변형된 버전(이의 서열은 서열 번호 10에 기재됨)이다. 또 다른 적합한 촉진자는 TTR 촉진자(서열 번호 11)이다. 다른 적합한 촉진자는 인간 알부민(Miyatake et al., J. Virol., 71:5124 32 (1997)), humAlb; 간 특이적 촉진자(LSP) 및 B형 간염 바이러스 코어 촉진자(Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996))를 포함한다. 예를 들어, 문헌[The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPDrulai.schl.edu/LSPD](참고로 포함됨)을 참조한다. 덜 바람직하지만, 다른 촉진자, 예컨대 바이러스 촉진자, 구성적 촉진자, 조절 가능한 촉진자[예를 들어, WO 제2011/126808호 및 WO 제2013/04943호 참조], 또는 생리학적 신호에 반응하는 촉진자는 본 명세서에 기재된 벡터에서 사용될 수 있다.

촉진자 이외에, 발현 카세트 및/또는 벡터는 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열 및 효율적인 RNA 처리 신호를 함유할 수 있다. 이러한 서열은 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호; 발현을 증대시키는 조절 요소(예를 들어, WPRE(서열 번호 15)); 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증대시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 증대시키는 서열; 및 원할 때, 암호화된 생성물의 분비를 증대시키는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리아데닐화(polyA) 신호는 hPAH mRNA 전사체의 종결을 매개하도록 포함된다. 다른 적합한 polyA 서열의 예는 무엇보다도 예를 들어 소 성장 호르몬(서열 번호 12), SV40, 토끼 베타 글로빈 및 TK polyA를 포함한다.

일 실시형태에서, 조절 서열은 전체 rAAV 벡터 게놈이 약 2.0 내지 약 5.5 킬로염기 크기이도록 선택된다. 일 실시형태에서, 조절 서열은 전체 rAAV 벡터 게놈이 약 3.4kb, 약 2.9kb, 약 3.3kb, 약 2.2kb 또는 약 2.5kb 크기이도록 선택된다. 일 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈이 네이티브 AAV 게놈의 크기에 근접한 것이 바람직하다. 따라서, 일 실시형태에서, 조절 서열은 전체 rAAV 벡터 게놈이 약 4.7kb 크기이도록 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 전체 rAAV 벡터 게놈은 5.2kb 크기 미만이다. 벡터 게놈의 크기는 촉진자, 인핸서, 인트론, polyA 등을 포함하는 조절 서열의 크기에 기초하여 조작될 수 있다. 문헌[Wu et al, Mol Ther, Jan 2010 18(1): 80-6](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.

따라서, 일 실시형태에서, 인트론은 벡터에 포함된다. 적합한 인트론은 인간 베타 글로빈 IVS2(서열 번호 13)를 포함한다. 문헌[Kelly et al, Nucleic Acids Research, 43(9):4721-32 (2015)](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다. 또 다른 적합한 촉진자는 때때로 "PI"라 칭하는 Promega 키메라 인트론(서열 번호 14)을 포함한다. Almond, B. and Schenborn, E. T. A Comparison of pCI-neo Vector and pcDNA4/HisMax Vector [인터넷] 2000(본 명세서에 참고로 포함됨)를 참조한다. www.promega.com/resources/pubhub/enotes/a-comparison-of-pcineo-vector-and-pcdna4hismax-vector/로부터 이용 가능. 또 다른 적합한 인트론은 hFIX 인트론(서열 번호 18)을 포함한다. 본 명세서에서 적합한 다양한 인트론은 당해 분야에 공지되어 있고, 제한 없이, http://bpg.utoledo.edu/~afedorov/lab/eid.html(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 발견되는 것을 포함한다. 또한, 문헌[Shepelev V., Fedorov A. Advances in Exon-Intron Database. Briefings in Bioinformatics 2006, 7: 178-185](본 명세서에 참고로 포함됨)을 참조한다.

일 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25를 포함한다.

5.1.2. 조성물

일 실시형태에서, rAAV.hPAH 바이러스는 수성 담체, 부형제, 희석제 또는 완충제를 포함하는 약제학적 조성물에 제공된다. 일 실시형태에서, 완충제는 PBS이다. 구체적인 실시형태에서, rAAV.hPAH 제제는 TMN200(200mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘, 20mM Tris(pH 8.0)) 중에 0.001% Pluronic F-68을 함유하는 수성 용액 중에 현탁된 유효량의 rAAV.hPAH 벡터를 함유하는 현탁액이다. 그러나, 완충 식염수, 계면활성제 및 약 100mM 염화나트륨(NaCl) 내지 약 250mM 염화나트륨에 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 상용성인 염 또는 염의 혼합물, 또는 동등한 이온 농도로 조정된 생리학적으로 상용성인 염 중 하나 이상을 포함하는 것을 포함하는, 다양한 적합한 용액이 공지되어 있다.

예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 현탁액은 NaCl 및 KCl 둘 다를 함유할 수 있다. pH는 6.5 내지 8.5, 또는 7 내지 8.5, 또는 7.5 내지 8의 범위일 수 있다. 적합한 계면활성제, 또는 계면활성제의 조합은 폴록사머, 즉 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 사슬에 의해 측접된 폴리옥시프로필렌(폴리프로필렌 옥사이드)의 중앙 소수성 사슬로 이루어진 비이온성 삼중블록 공중합체, SOLUTOL HS 15(마크로골-15 하이드록시스테아레이트), LABRASOL(폴리옥시 카프릴릭 글라이세라이드), 폴리옥시 10 올레일 에터, TWEEN(폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터), 에탄올 및 폴리에틸렌 글라이콜 중에서 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 제제는 폴록사머를 함유한다. 이 공중합체는 흔히 철자 "P"(폴록사머에 대해), 이어서 3개의 숫자에 의해 명명된다: 처음의 2개의 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 근사 분자 질량을 주고, 마지막 숫자 x 10은 백분율 폴리옥시에틸렌 함량을 준다. 일 실시형태에서, 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 약 0.0005% 내지 약 0.001% 이하의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 벡터는 180mM 염화나트륨, 10mM 인산나트륨, 0.001% 폴록사머 188(pH 7.3)을 함유하는 수성 용액 중에 현탁된다.

일 실시형태에서, 제제는 인간 대상체에서 사용하기에 적합하고, 정맥내 투여된다. 일 실시형태에서, 제제는 볼루스 주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 10분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 20분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 30분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 60분(±5분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 일 실시형태에서, 제제는 약 90분(±10분)에 걸쳐 점적주사에 의해 말초 정맥을 통해 전달된다. 그러나, 이 시간은 필요한 바대로 또는 원하는 바대로 조정될 수 있다. 임의의 적합한 방법 또는 경로는 본 명세서에 기재된 바대로 AAV 함유 조성물을 투여하고, 선택적으로, 본 명세서에 기재된 hPAH의 AAV 매개된 전달과 함께 다른 활성 약물 또는 치료제를 동시투여하도록 사용될 수 있다. 투여의 경로는 예를 들어 전신, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 동맥내, 눈내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내 및 투여의 다른 비경구 경로를 포함한다.

일 실시형태에서, 제제는 예를 들어 문헌[M. Lock et al, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같은 oqPCR 또는 디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR)에 측정될 때 예를 들어 환자 체중의 1킬로그램당 약 1.0x10¹¹ 게놈 카피(GC/㎏) 내지 약 1x10¹⁵ GC/㎏, 환자 체중의 1킬로그램당 약 5x10¹¹ 게놈 카피(GC/㎏) 내지 약 3x10¹³ GC/㎏, 또는 약 1x10^{12 내지} 약 1x10¹⁴ GC/㎏를 함유할 수 있다. 일 실시형태에서, rAAV.hPAH 제제는 예를 들어 상기 M. Lock 등의 문헌에 기재된 바와 같은 oqPCR 또는 디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR)에 측정될 때 적어도 1x10¹³ 게놈 카피(GC)/㎖, 또는 이것 초과를 함유하는 현탁액이다.

빈 캡시드가 환자에게 투여되는 AAV.hPAH의 용량으로부터 제거되도록 보장하도록, 빈 캡시드는 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 벡터 정제 공정 동안 벡터 입자로부터 분리된다. 일 실시형태에서, 패키징된 게놈을 함유하는 벡터 입자는 발명의 명칭이 "Scalable Purification Method for AAV8"인 2016년 4월 13일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/322,098호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 공정을 이용하여 빈 캡시드로부터 정제된다. 간단히, rAAV 제조 세포 배양의 청징된 농축 상청액으로부터 게놈 함유 rAAV 벡터 입자를 선택적으로 포획하고 단리시키는, 2단계 정제 계획이 기재되어 있다. 상기 공정은 실질적으로 rAAV 중간체가 없는 rAAV 벡터 입자를 제공하도록 고염 농도에서 수행된 친화도 포획 방법, 이어서 높은 pH에서 수행된 음이온 교환 수지 방법을 이용한다. 유사한 정제 방법은 다른 캡시드를 갖는 벡터에 사용될 수 있다.

임의의 종래의 제조 공정을 사용할 수 있지만, 본 명세서(및 미국 특허 출원 제62/322,098호)에 기재된 공정은 입자의 50% 내지 70%가 벡터 게놈을 갖는(즉, 50 내지 70% 충전 입자) 벡터 제제를 생성한다. 따라서, 1.6x10¹² GC/㎏의 예시적인 용량에 대해, 전체 입자 용량은 2.3x10¹² 내지 3x10¹² 입자일 것이다. 또 다른 실시형태에서, 제안된 용량은 로그의 반 초과 또는 5x10¹² GC/㎏이고, 전체 입자 용량은 7.6x10¹² 내지 1.1x10¹³ 입자일 것이다. 일 실시형태에서, 제제는 1 이하, 바람직하게는 0.75 미만, 더 바람직하게는, 0.5, 바람직하게는 0.3 미만의 "빈" 대 "충전"의 비율을 갖는 rAAV 스톡을 특징으로 한다.

rAAV8 입자(패키징된 게놈)의 스톡 또는 제제는, 스톡 중의 rAAV8 입자가 스톡 중에 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 99%의 rAAV8이거나, "빈 캡시드"가 스톡 또는 제제 중에 약 1% 미만, 약 5% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만의 rAAV8일 때, AAV 빈 캡시드(및 다른 중간체)가 "실질적으로 없다".

일반적으로, 패키징된 게놈을 갖는 빈 캡시드 및 AAV 벡터 입자를 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330; Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128]을 참조한다. 변성된 캡시드를 시험하기 위해, 상기 방법은 처리된 AAV 스톡을 3개의 캡시드 단백질을 분리시킬 수 있는 임의의 겔로 이루어진 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 예를 들어 완충제 중에 3% 내지 8% Tris-아세테이트를 함유하는 구배 겔로 처리하고, 이후 샘플 재료가 분리될 때까지 겔을 흐르게 하고, 겔을 나일론 또는 나이트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론으로 블로팅하는 것을 포함한다. 항-AAV 캡시드 항체는 이후 변성된 캡시드 단백질, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단일클론 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단일클론 항체에 결합하는 1차 항체로서 사용된다(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 이후, 1차 항체에 결합하는 것인 2차 항체를 사용하고, 1차 항체, 더 바람직하게는 이것에 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 겨자무 과산화효소에 공유 연결된 양 항-마우스 IgG 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단을 함유한다. 결합을 검출하기 위한 방법, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 방사선 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트는 1차 항체와 2차 항체 사이의 결합을 반정량적으로 결정하도록 사용된다. 예를 들어, SDS-PAGE에 대해, 칼럼 분획으로부터의 샘플을 환원제(예를 들어, DTE)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충제 중에 취해지고 가열될 수 있고, 캡시드 단백질은 프리 캐스팅된 구배 폴리 아크릴아마이드 겔(예를 들어, Novex)에서 해상되었다. 은 염색은 제조사의 지시에 따라 SilverXpress(Invitrogen(캘리포니아주))를 사용하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 칼럼 분획에서의 AAV 벡터 게놈(vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플은 희석되고, 외인성 DNA를 제거하도록 DNase I(또는 또 다른 적합한 뉴클레아제)에 의해 분해된다. 뉴클레아제의 불활화 후, 샘플은 추가로 희석되고, 프라이머 및 프라이머 사이의 DNA 서열에 특이적인 TaqMan(상표명) 형광원 프로브를 사용하여 증폭된다. 한정된 형광 수준에 도달하는 데 필요한 사이클의 횟수(한계치 사이클, Ct)는 Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System에서 각각의 샘플에 대해 측정된다. AAV 벡터에 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA는 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성하도록 사용된다. 샘플로부터 얻은 사이클 한계치(Ct) 값은 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값에 이것을 정규화함으로써 벡터 게놈을 결정하도록 사용된다. 디지털 PCR에 기초한 종점 검정을 또한 사용할 수 있다.

일 양태에서, 광범위 세린 프로테아제, 예를 들어 단백분해효소 K(예컨대, Qiagen으로부터 상업적으로 구입 가능)를 사용하는 최적화된 q-PCR 방법이 본 명세서에 제공된다. 더 특히, 최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은, DNase I 분해 후, 샘플이 단백분해효소 K 완충제에 의해 희석되고 단백분해효소 K에 의해 처리된 후 열 불활화된다는 것을 제외하고는, 표준 검정과 유사하다. 적합하게, 샘플은 샘플 크기와 동일한 양으로 단백분해효소 K 완충제에 의해 희석된다. 단백분해효소 K 완충제는 2배 이상으로 농축될 수 있다. 통상적으로, 단백분해효소 K 처리는 약 0.2㎎/㎖이지만, 0.1㎎/㎖ 내지 약 1㎎/㎖로 변할 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 15분 동안 약 55℃에서 수행되지만, 더 긴 시간 기간(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분)에 걸쳐 더 낮은 온도(예를 들어, 약 37℃ 내지 약 50℃)에서 또는 더 짧은 시간 기간(예를 들어, 약 5 내지 10분) 동안 더 높은 온도(예를 들어. 약 60℃ 이하)에서 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활화는 일반적으로 약 15분 동안 약 95℃에 있지만, 온도는 낮아지고(예를 들어, 약 70 내지 약 90℃), 시간 연장(예를 들어, 약 20분 내지 약 30분)이 될 수 있다. 샘플은 이후 희석(예를 들어, 1000배)되고, 표준 검정에 기재된 바대로 TaqMan 분석으로 처리될 수 있다.

추가적으로, 또는 대안적으로, 디지털 드롭플렛 PCR(ddPCR)을 사용할 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의해 단일 가닥 및 자가 상보성 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하기 위한 방법은 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2): 115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14]을 참조한다.

5.2. 환자 집단

상기 기재된 바대로, 임의의 중증도의 PKU를 갖는 대상체는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 의도된 수혜자이다.

대상체는 이의 보호 의사의 결정에 의해 유전자 치료제 치료 전에 및 이와 동시에 이의 관리 표준 치료(들)(예를 들어, 저 Phe 식이; 사프롭테린 다이하이드로클로라이드에 의한 치료)를 계속하도록 허용될 수 있다. 대안에서, 의사는 유전자 치료제 치료를 투여하기 전에 관리 표준 치료를 중단하는 것을 선호하고, 선택적으로, 유전자 치료의 투여 후 동시치료로서 관리 표준 치료를 재개할 수 있다.

유전자 치료 섭생의 원하는 종점이 120 내지 360μ㏖/ℓ의 Phe 수준을 생성시키는 PAH 활성의 증가이다. 또 다른 실시형태에서, 벡터 용량은 혈장 페닐알라닌 수준을 25% 이상 감소시키도록 PAH를 전달하도록 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 원하는 종점은 "중증" 표현형으로부터 "중등도" 표현형으로 대상체를 취하도록 감소하는 혈장 Phe 수준이다. 페닐알라닌 수준을 측정하는 방법은 예를 들어 문헌[Gregory et al, Blood phenylalaine monitoring for dietary compliance among patients with phenylketonuria: comparison of methods, Genetics in Medicine (November 2007) 9, 761-765](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다. 일 실시형태에서, 환자는 단독의 및/또는 보조 치료의 사용과 조합된 rAAV.hPAH에 의한 치료 후 원하는 순환 PAH 수준을 달성한다.

5.3. 투약 및 투여의 경로

일 실시형태에서, rAAV.hPAH 벡터는 환자마다 단일 용량으로 전달된다. 일 실시형태에서, 대상체는 (본 명세서에서 실시예에 기재된 전임상 연구에 의해 결정된 바대로) 최소 유효 용량(minimal effective dose: MED)이 전달된다. 본 명세서에 사용된 바대로, MED는 120 내지 360μ㏖/ℓ의 Phe 수준을 생성시키는 PAH 활성을 달성하는 데 필요한 rAAV.hPAH 용량을 의미한다.

종래처럼, 벡터 역가는 벡터 제제의 DNA 함량에 기초하여 결정된다. 일 실시형태에서, 실시예에 기재된 바와 같은 정량적 PCR 또는 최적화된 정량적 PCR은 rAAV.hPAH 벡터 제제의 DNA 함량을 결정하도록 사용된다. 일 실시형태에서, 실시예에 기재된 바와 같은 디지털 드롭플렛 PCR은 rAAV.hPAH 벡터 제제의 DNA 함량을 결정하도록 사용된다. 일 실시형태에서, 투약량은 종점을 포함하여 약 1x10¹¹ 게놈 카피(GC)/㎏(체중) 내지 약 1x10¹³ GC/㎏이다. 일 실시형태에서, 투약량은 5x10¹¹ GC/㎏이다. 또 다른 실시형태에서, 투약량은 5x10¹² GC/㎏이다. 구체적인 실시형태에서, 환자에게 투여되는 rAAV.hPAH의 용량은 적어도 5x10¹¹ GC/㎏, 1x10¹² GC/㎏, 1.5x10¹² GC/㎏, 2.0x10¹² GC/㎏, 2.5x10¹² GC/㎏, 3.0x10¹² GC/㎏, 3.5x10¹² GC/㎏, 4.0x10¹² GC/㎏, 4.5x10¹² GC/㎏, 5.0x10¹² GC/㎏, 5.5x10¹² GC/㎏, 6.0x10¹² GC/㎏, 6.5x10¹² GC/㎏, 7.0x10¹² GC/㎏, 또는 7.5x10¹² GC/㎏이다. 또한, 복제 결핍 바이러스 조성물은 약 1.0x10⁹ GC 내지 약 1.0x10¹⁵ GC의 범위인 복제 결핍 바이러스의 양을 함유하도록 투약량 단위에서 제제화될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바대로, 용어 "투약량"은 치료 과정에서 대상체에게 전달되는 전체 투약량, 또는 단일(또는 복수) 투여에서 전달되는 양을 의미할 수 있다.

일 실시형태에서, 투약량은 환자에서 혈장 Phe 수준을 25% 이상 감소시키기에 충분하다.

몇몇 실시형태에서, rAAV.hPAH는 PKU의 치료를 위한 하나 이상의 치료, 예컨대 저 Phe 식이 또는 사프롭테린 다이하이드로클로라이드의 투여와 조합되어 투여된다.

5.4. 임상 목적의 측정

치료의 효율의 측정은 혈장 Phe 수준 및/또는 PAH 활성에 의해 결정된 바대로 전이유전자 발현 및 활성에 의해 측정될 수 있다. 효율의 추가의 평가는 식이 Phe 내약성의 임상 평가에 의해 결정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바대로, 본 명세서에서 rAAV.hPAH 벡터는, 환자가 120 내지 360μ㏖/ℓ의 Phe 수준을 발생시키는 PAH 활성을 달성하도록 충분한 수준의 PAH를 발현할 때 활성 PAH에 의해 환자 결핍 PAH를 "기능적으로 대체한다" 또는 "기능적으로 보충한다".

하기 실시예는 오직 예시적이고 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예

하기 실시예는 오직 예시적이고 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.

실시예 1: 페닐케톤뇨증( PKU )의 마우스 모델

PAH^-/- 마우스를 Jackson Labs에서 CRISPR/Cas9 기술에 의해 생성하였다. 야생형 C57BL/6 마우스에 직접적으로 마우스 접합자로 PAH 유전자의 제2 암호화 엑손을 표적화하는 2개의 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cas9 mRNA를 주사하였다. 이 배아로부터 발생된 마우스를 서열분석하여 돌연변이(들)를 결정하고, 이후 C57BL/6J 마우스와 교배하여, 대립유전자를 전달하고 생식선 전달을 확인한다.

4개의 상이한 돌연변이를 생성하고, 마우스 균주는 PAH_KO_A, PAH_KO_B, PAH_KO_C 및 PAH_KO_D로서 설계되었다. PAH_KO_A 마우스는 3bp 치환, 이어서 무스 무스칼루스(Mus musculus) PAH 유전자[NC_000076.6]의 6534번 nt로부터 6600번 nt로의 64bp 결실을 나타냈다. PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스는 각각 6589번 nt 및 6539번 nt 후 단일 염기 쌍 삽입을 나타냈다. PAH_KO_D는 6535번 nt로부터 6540번 nt로의 6bp 결실을 나타냈다. 도 9는 야생형, PAH_KO_A, PAH_KO_B, PAH_KO_C, PAH_KO_D 및 공통에 대한 PAH 서열의 일부의 정렬을 보여준다. 이 마우스의 자연사 연구를 수행하였다. 혈액 샘플을 눈뒤 또는 하악하 출혈을 통해 수집하였다. 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준은 LC/MS/MS를 통해 검출되고, PAH_KO_A, PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스로부터의 데이터는 획득되고, 각각 도 2a, 도 3a 및 도 4a에 제시되고, 도 5a에 요약되어 있다. 이형접합성 및 야생형 한배 새끼는 음성 대조군으로서 제공되었다. 대조군과 비교하여, PAH_KO_A, PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스에서의 혈장 페닐알라닌 수준은 유의미하게 더 높아서, 이 마우스에서 기능적으로 결핍인 PAH를 나타낸다. 이는 PAH_KO_A, PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스가 인간에서 페닐케톤뇨증(PKU)에 대한 마우스 모델로서 작용한다는 것을 제안한다.

그러나, PAH_KO_D인 제4 넉아웃 마우스는 증가된 혈장 페닐알라닌 수준을 나타내지 않고, 따라서 추가의 분석으로부터 배제되었다.

실시예 2: hPAH-AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH를 함유하는 AAV 벡터

유전자 치료 벡터 AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH는 인간 갑상선 호르몬 결합 글로불린 촉진자 및 마이크로글로빈/비쿠닌 인핸서에 기초한 하이브리드 촉진자인 TBG의 제어 하에 코돈 최적화된 인간 PAH cDNA를 보유하는 AAV8 벡터에 의해 작제되었다(도 1). PAH 발현 카세트는 AAV2 유래 역위 말단 반복(ITR)에 의해 측접되고, 발현은 인핸서로서 TBG 인핸서/촉진자 및 우드척 간염 바이러스(WHP) 전사 후 조절 요소(WPRE)의 하이브리드에 의해 추진되었다. 전이유전자는 Promega SV40 misc 인트론(PI) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGH)를 또한 포함하였다. 벡터 게놈 서열은 서열 번호 20에 기재되어 있다.

예를 들어, 문헌[Mizukami, Hiroaki, et al. A Protocol for AAV vector production and purification. Diss. Division of Genetic Therapeutics, Center for MolecularMedicine, 1998](본 명세서에 참고로 포함됨)에 의해 기재된 바대로 293 세포에서 종래의 삼중 형질주입 기법을 이용하여 벡터를 제조하였다. 모든 벡터는 이전에 기재된 바대로[Lock, M., et al, Hum Gene Ther, 21: 1259-1271 (2010)] 펜실베니아 대학교(University of Pennsylvania)에서의 벡터 Core에 의해 제조되었다.

실시예 3: PKU의 모델에서의 AAV8.hPAH 벡터

모든 동물 절차는 펜실베니아 대학교의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.

20마리의 PAH_KO_A 마우스를 생성하였다. 7마리의 수컷 및 3마리의 암컷을 자연사 연구에서 평가하였다. 자연사 연구의 56일에, 식별 번호 1531, 1532 및 1533을 갖는 3마리의 수컷 마우스에 1x10¹³ GC/㎏의 AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH 벡터를 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 식별 번호 1538, 1539, 1554 및 1564를 갖는 4마리의 수컷 마우스에 1x10¹² GC/㎏의 벡터를 주사하였다. 식별 번호 1507, 1536 및 1537을 갖는 3마리의 암컷 마우스에 1x10¹² GC/㎏의 벡터를 주사하였다. 혈액 샘플을 주마다 수집하여 혈장 페닐알라닌 농도를 평가하였다(도 2b). 더 높은 수준의 페닐알라닌이 한배 새끼 대조군과 비교하여 주사 전 PAH_KO_A 마우스에서 검출되어서, PAH_KO_A 마우스에서의 결핍 PAH를 나타낸다. 벡터 주사 후 7일에, PAH_KO_A 마우스의 혈장 페닐알라닌 수준은 감소한 한편, 대조군은 안정하게 있었다. 이 결과는 PAH_KO_A 마우스로의 AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH의 단일 주사가 결핍 PAH를 구제하고, 혈액에서의 페닐알라닌의 병리학적 축적을 감소시킨다는 것을 나타낸다.

성별 차이 및 AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH 벡터의 2개의 용량의 효과는 PAH_KO_A 마우스에서 추가로 평가되었다(도 2c). 혈장 페닐알라닌 수준은 예를 들어 문헌[Gregory et al, Blood phenylalanine monitoring for dietary compliance among patients with phenylketonuria: comparison of methods, Genetics in Medicine (November 2007) 9, 761-765](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바대로 11주 동안 주마다 관찰되었다. 3마리 중 2마리의 암컷 마우스는 1x10¹² GC/㎏의 벡터를 받고, 1x10¹² GC/㎏ 및 1x10¹³ GC/㎏에서의 용량 둘 다를 갖는 모든 7마리의 수컷 마우스는 혈장에서 감소된 페닐알라닌 농도를 나타냈다. 7마리의 수컷 마우스의 페닐알라닌은 11주 관찰 기간 동안 동등하게 낮은 수준에서 유지된 한편, 모든 3마리의 암컷 마우스는 느린 혈장 페닐알라닌 수준 증가를 나타냈다.

3마리의 암컷 PAH_KO_B 마우스가 생성되고, 자연사 연구에서 죽었다. 페닐알라닌 수준에 대한 주마다의 사혈을 수행하고, 결과는 건강한 한배 새끼 대조군과 비교하여 혈액에서의 페닐알라닌의 비정상 축적을 확인시켰다. 1x10¹² GC/㎏의 AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH의 정맥내 주사 시, 감소된 페닐알라닌 수준은 모든 3마리의 암컷에서 관찰되고, 낮은 수준은 주사 후 8주 관찰 기간 동안 유지되었다.

2마리의 수컷 PAH_KO_C 마우스가 이 연구를 위해 생성되고, 자연사 연구에서 사용되었다. 혈액 샘플의 주마다의 수집을 수행하고, 페닐알라닌 농도를 평가하였다. 데이터는 9주 관찰 동안 PAH_KO_C 마우스 및 이형접합성/야생형 한배 새끼 둘 다가 혈장 페닐알라닌의 동등하게 안정한 농도를 유지시키는 한편, 넉아웃 마우스가 유의미하게 더 높은 수준을 나타낸다는 것을 보여주었다.

주사된 PAH^-/- 마우스에서의 PAH의 발현 및 효소 활성의 추가의 연구를 수행하였다. 간은 벡터 또는 PBS 단독이 주사된 PAH_KO_A, PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스, 및 건강한 한배 새끼 대조군으로부터 수집되었다. mRNA는 간으로부터 추출되고, 인간 PAH의 발현은 RT-PCR을 통해 평가되었다. PAH의 단백질 발현을 결정하기 위해, 간 분해효소는 웨스턴 블롯에 의해 검출을 위해 제조되는 한편, 간 절편은 면역조직화학을 위해 제조되었다. 실험은 벡터, 및 대조군에 의해 치료된 PAH^-/- 마우스의 PAH 효소 활성을 평가하도록 또한 수행되었다.

모든 3마리의 PAH^-/- 마우스에서의 성별 차이를 완전히 평가하기 위해, PAH_KO_A, PAH_KO_B 및 PAH_KO_C 마우스를 교배하여 AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH의 주사 전에 및 후에 혈장 페닐알라닌 농도, mRNA 및 단백질 수준 둘 다에 대한 PAH의 발현 및 PAH의 효소 활성을 평가하였다.

AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH의 용량 의존적 발현 및 최고 용량의 가능한 독성을 결정하기 위해, AAV8.TBG.PI.hPAHco.WPRE.bGH의 다양한 용량을 PAH^-/- 마우스로 주사하고, 페닐알라닌 축적 및 PAH 발현/활성의 추가의 평가를 수행하였다.

유사한 실험을 AAV8.TBG.hPAHco.bGH에 의해 수행하였다. 17주령 내지 22주령의 PKU B 마우스에 치료전 페닐알라닌 수준이 확립된 후 10¹² GC/㎏의 AAV8.TBG.hPAHco.bGH 또는 AAV8.TBG.hPAHco.WPRE.bGH(또는 대조군에 대해 PBS)가 주어졌다. 이후, 마우스를 주마다 사혈시키고, 혈장을 단리하고, 페닐알라닌 농도를 결정하였다(도 6a). 연구의 종결 시, 간은 수집되고, 게놈 카피 분석(도 6b) 및 면역조직화학(도 6c)이 수행되었다. 페닐알라닌 수준은 AAV8.TBG.hPAHco.bGH 및 AAV8.TBG.hPAHco.WPRE.bGH 치료된 마우스 둘 다에서 감소하였다.

추가의 연구를 AAV8.TBG.hPAHco.bGH 벡터에 의해 수행하였다. 야생형, 이형접합성(원) 및 PKU_KO_A(KO) 마우스에 기준치 페닐알라닌 수준이 확립된 후 10¹¹ GC/㎏의 AAV8.TBG.hPAHco에 의해 정맥내 주사하였다. 이후, 마우스를 주마다 사혈시키고, 혈장을 단리하고, Phe 농도에 대해 분석하였다. 혈장에서의 Phe 수준은 AAV8.TBG.hPAHco의 정맥내 투여 이후에 71% 감소하였다(도 7).

PKU_KO_B 마우스에 기준치 페닐알라닌 수준이 확립된 후 10¹² GC/㎏, 3x10¹¹ GC/㎏ 또는 10¹¹ GC/㎏의 AAV8.TBG.hPAHco가 주어졌다. 이후, 마우스를 주마다 사혈시키고, 혈장을 단리하고, Phe 농도에 대해 분석하였다. 연구의 종결 시, 간은 수집되고, 게놈 카피 분석 및 면역조직화학이 수행되었다. 단백질 발현 및 Phe 수준의 감소는 10¹² GC/㎏의 용량에서 보였다.

한편, 10¹² GC/㎏의 AAV8.TBG.PI.hPAHco.bGH, AAV8.LSP.IVS2.hPAHco.bGH, AAV8.AlAT.hPAHco.BGH, AAV8.TTR.hPAHco.BGH, AAV8.TBG.PI.hPAH네이티브서열.bGH, AAV8.ABPS.TBG.hFIX인트론.hPAHco.BGH, AAV8.ABPS.TBG-S1.hFIX인트론.hPAHco.BGH, AAV8.ApoE.AlAT.hFIX인트론.hPAHco.BGH의 각각의 벡터의 투여는 또한 수행되고, 비교로서 제공되었다.

마지막으로, AAV8.TBGPI.hPAHco.WPRE.bGH 벡터의 단일 주사는 3마리의 PAH 결핍 마우스에서 정맥내 투여될 때 실질적인 혈장 페닐알라닌 감소 및 동반하는 기능 보정을 발생시켰다.

실시예 4: 페닐케톤뇨증에 대한 AAV 유전자 치료

페닐케톤뇨증(PKU)은 페닐알라닌-4-수산화효소(PAH) 활성의 약화에 의해 생긴 상염색체 열성 유전 장애이어서, 조직 및 혈액에서의 페닐알라닌의 축적을 발생시킨다. 혈류에서의 페닐알라닌의 높은 수준은 혈액 뇌 장벽에 걸쳐 다른 큰 천연 아미노산의 운반을 저해하여서, 뇌 발생에 영향을 미치고 지적 장애 및 발작을 발생시킨다고 생각된다. PKU에 대한 치료는 현재 엄격한 페닐알라닌 제한 식이 및 잔류 PAH를 안정화시키는 데 지향된 생성물의 유지에 제한된다. 본 명세서에 기재된 간 표적화된 AAV 유전자 치료 접근법은 현재의 표준 관리를 개선하는 것이다.

PKU에 대한 유전자 치료의 개발을 조사하기 위해, 4마리의 고유한 마우스 균주를 본 명세서에 기재된 바대로 CRISPR/Cas9 기술에 의해 PAH 유전자의 엑손 1에서의 상이한 돌연변이를 유도함으로써 생성되었다. 자연사 연구는 질환의 진행을 결정하고 인간 PKU 표현형을 가장 모사한 균주를 확인하기 위해 이들 균주 각각에서 수행되었다. B 및 C라 칭하는 PKU 콜로니 둘 다는 엑손 1에서의 상이한 위치에서 단일 염기 쌍(bp) 결실을 함유하고, 70μM의 정상 수준과 비교하여, 각각 2049μM 및 1705μM의 평균 페닐알라닌 수준을 유지시켰다. PKU 콜로니 A는, PAH 유전자의 엑손 1에서의 64bp 결실 및 3bp 삽입을 갖더라도, 477μM의 보통의 더 높은 평균 페닐알라닌 수준을 가졌다. 6bp 결실을 갖는 PKU 콜로니 D는 야생형 한배 새끼와 동등한 페닐알라닌 수준을 가졌다. PKU B 마우스 콜로니에 대한 PAH의 인간 코돈 최적화된 버전의 발현을 위해 1x10¹² GC/㎏의 용량에서의 AAV8 벡터 투여 이후에, 혈장 페닐알라닌 수준은 222μM로 87% 감소하였다. 이 혈장 페닐알라닌 수준의 감소는 자손을 생산하는 수컷의 능력을 복원시켰다. 이 결과는 PKU에 대한 AAV 기반 치료의 개발을 나타낸다.

본 명세서에 인용된 모든 공보, 및 미국 특허 가출원 제62/440,651호, 제62/469,898호 및 제62/505,373호는 본 명세서에 참고로 포함된다. 유사하게, 본 명세서에 언급되고 첨부된 서열 목록에 보이는 서열 번호는 참고로 포함된다. 본 발명이 특정한 실시형태와 관련하여 기재되어 있지만, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당하도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> GENE THERAPY FOR TREATING PHENYLKETONURIA <130> WO2018/126112 <140> PCT/US2017/068897 <141> 2017-12-29 <150> US 62/440,651 <151> 2016-12-30 <150> US 62/469,898 <151> 2017-03-10 <150> US 62/505,373 <151> 2017-05-12 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 1 atgtctaccg ccgtgctgga aaatcccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 60 gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 120 ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 180 aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 240 acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300 gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360 ttcccccgga ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc 420 gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480 tttgccgata 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ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300 gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360 ttcccccgga ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc 420 gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480 tttgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tcccccgggt ggagtatatg 540 gaagaggaaa agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 600 cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctgg aaaagtactg cggcttccac 660 gaggacaata tcccccagct ggaagacgtg tcccagttcc tgcagacctg caccggcttc 720 agactgaggc ctgtggccgg actgctgagc agcagagatt ttctgggcgg actggccttc 780 cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccccgag 840 cccgatatct gccacgagct gctgggacac gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 900 cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggagccc ccgacgagta tatcgagaag 960 ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1020 aaggcctacg gcgctggcct gctgtccagc tttggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1080 aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca 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ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg agaagtaaca gggtacacat 1080 attgaccaaa tcagggtaat tttgcatttg taattttaaa aaatgctttc ttcttttaat 1140 atactttttt gtttatctta tttctaatac tttccctaat ctctttcttt cagggcaata 1200 atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc attctaaaga ataacagtga taatttctgg 1260 gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata aatatttctg catataaatt gtaactgatg 1320 taagaggttt catattgcta atagcagcta caatccagct accattctgc ttttatttta 1380 tggttgggat aaggctggat tattctgagt ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc 1440 atacctctta tcttcctccc acagctcctg ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat 1500 cactttggca aagaattgat ctcgaggccg ccaccatgtc taccgccgtg ctggaaaatc 1560 ccggcctggg cagaaagctg agcgacttcg gccaggaaac cagctacatc gaggacaact 1620 gcaaccagaa cggcgccatc agcctgatct tcagcctgaa agaagaagtg ggcgccctgg 1680 ccaaggtgct gcggctgttc gaagagaacg acgtgaacct gacccacatc gagagccggc 1740 ccagcagact gaagaaggac gagtacgagt tcttcaccca cctggacaag cggagcctgc 1800 ccgccctgac caacatcatc aagatcctgc ggcacgacat cggcgccacc gtgcacgagc 1860 tgagccggga caagaaaaag gacaccgtgc cctggttccc ccggaccatc caggaactgg 1920 acagattcgc caaccagatc ctgagctacg gcgccgagct ggacgccgat caccccggct 1980 ttaaggaccc cgtgtaccgg gccagacgga agcagtttgc cgatatcgcc tacaactacc 2040 ggcacggcca gcccatcccc cgggtggagt atatggaaga ggaaaagaaa acctggggca 2100 ccgtgttcaa gaccctgaag tccctgtaca agacccacgc ctgctacgag tacaaccaca 2160 tcttcccact gctggaaaag tactgcggct tccacgagga caatatcccc cagctggaag 2220 acgtgtccca gttcctgcag acctgcaccg gcttcagact gaggcctgtg gccggactgc 2280 tgagcagcag agattttctg ggcggactgg ccttccgggt gttccactgc acccagtaca 2340 tcagacacgg cagcaagccc atgtacaccc ccgagcccga tatctgccac gagctgctgg 2400 gacacgtgcc cctgttcagc gacagaagct tcgcccagtt cagccaggaa atcggcctgg 2460 cctctctggg agcccccgac gagtatatcg agaagctggc caccatctac tggttcaccg 2520 tggaattcgg cctgtgcaag cagggcgaca gcatcaaggc ctacggcgct ggcctgctgt 2580 ccagctttgg cgagctgcag tactgtctga gcgagaagcc caagctgctg cccctggaac 2640 tggaaaagac cgccatccag aactacaccg tgaccgagtt ccagcccctg tactacgtgg 2700 ccgagagctt 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actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 2100 gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 2160 taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 2220 ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggac 2280 tcgagttaag ggcgaattcc cgattaggat cttcctagag catggctacg tagataagta 2340 gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 2400 tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 2460 tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcag 2496 <210> 25 <211> 2241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed sequence <400> 25 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctactta agctacctcg 180 tgatcgcccg gcccctgttc aaacatgtcc taatactctg tctctgcaag ggtcatcagt 240 agttttccat cttactcaac atcctcccag tggaattcat ttcatagaac gaatgttccg 300 atgctctaat ctctctagac aaggttcata tttgtatggg ttacttattc tctctttgtt 360 gactaagtca ataatcagaa tcagcaggtt tgcagtcaga ttggcaggga taagcagcct 420 agctcaggag aagtgagtat aaaagcccca ggctgggagc agccatcagc ggccgccacc 480 atgtctaccg ccgtgctgga aaatcccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 540 gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 600 ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 660 aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 720 acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 780 gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 840 ttcccccgga ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgag ctacggcgcc 900 gagctggacg ccgatcaccc cggctttaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 960 tttgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tcccccgggt ggagtatatg 1020 gaagaggaaa agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 1080 cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctgg aaaagtactg cggcttccac 1140 gaggacaata tcccccagct ggaagacgtg tcccagttcc tgcagacctg 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Claims (23)

1. 페닐케톤뇨증(phenylketonuria: PKU)에 대한 간 지향된 치료제로서 유용한 재조합 아데노 연관된 바이러스(recombinant adeno-associated virus: rAAV)로서, 상기 rAAV는 AAV 캡시드 및 내부에 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은,
   (a) AAV 5' 역위 말단 반복(inverted terminal repeat: ITR) 서열;
   (b) 촉진자;
   (c) 인간 페닐알라닌 수산화효소(phenylalanine hydroxylase: PAH)를 암호화하는 암호화 서열;
   (d) AAV 3' ITR을 포함하는, rAAV.
2. 제1항에 있어서, 상기 (c)의 암호화 서열은 서열 번호 1인, rAAV.
3. 제1항에 있어서, 상기 rAAV 캡시드는 AAV8 캡시드인, rAAV.
4. 제1항에 있어서, 상기 촉진자는 TBG 촉진자 또는 TBG-S1 촉진자인, rAAV.
5. 제1항에 있어서, 상기 촉진자는 A1AT 촉진자인, rAAV.
6. 제1항에 있어서, 상기 촉진자는 LSP 촉진자인, rAAV.
7. 제1항에 있어서, 상기 촉진자는 TTR 촉진자인, rAAV.
8. 제1항에 있어서, 상기 AAV 5' ITR 및/또는 AAV 3' ITR은 AAV2 유래인, rAAV.
9. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 polyA를 추가로 포함하는, rAAV.
10. 제1항에 있어서, 상기 polyA는 bGH 유래인, rAAV.
11. 제1항에 있어서, WPRE를 추가로 포함하는, rAAV.
12. 제1항에 있어서, 인트론을 추가로 포함하는, rAAV.
13. 제12항에 있어서, 상기 인트론은 인간 베타 글로빈 IVS2 또는 SV40 유래인, rAAV.
14. 제1항에 있어서, 인핸서를 추가로 포함하는, rAAV.
15. 제14항에 있어서, 상기 인핸서는 APB 인핸서, ABPS 인핸서, 알파 mic/bik 인핸서, TTR 인핸서, en34 또는 ApoE 인핸서인, rAAV.
16. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 약 3 킬로염기 내지 약 5.5 킬로염기 크기인, rAAV.
17. 페닐케톤뇨증 환자에 대한 투여에 적합한 수성 현탁액으로서, 상기 현탁액은 수성 현탁 액체 및 페닐케톤뇨증에 대한 간 지향된 치료제로서 유용한 약 1x10¹² GC/㎖ 내지 약 1x10¹⁴ GC/㎖의 재조합 아데노 연관된 바이러스(rAAV)를 포함하고, 상기 rAAV는 AAV 캡시드를 갖고, 그리고
    (a) AAV 5' 역위 말단 반복(ITR) 서열;
    (b) 촉진자;
    (c) 인간 페닐알라닌 수산화효소(PAH)를 암호화하는 암호화 서열; 및
    (d) AAV 3' ITR
    을 포함하는 벡터 게놈이 내부에 패키징된, 현탁액.
18. 제17항에 있어서, 상기 현탁액은 정맥내 주사에 적합한, 현탁액.
19. 제17항에 있어서, 상기 현탁액은 상기 수성 현탁 액체 중에 용해된 계면활성제, 보존제, 및/또는 완충제를 추가로 포함하는, 현탁액.
20. 제1항에 따른 rAAV에 의해 페닐케톤뇨증을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 rAAV는 수성 현탁액 중에 약 1x10¹⁰ 내지 약 1x10¹⁵ 게놈 카피(GC)/㎏ 전달되고, 상기 GC는 oqPCR 또는 ddPCR에 기초하여 결정된 바대로 계산되는, 페닐케톤뇨증을 갖는 환자를 치료하는 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 벡터 게놈은 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24 또는 서열 번호 25를 포함하는, rAAV.
22. 제17항에 있어서, 상기 rAAV 캡시드는 AAV8 캡시드인, 현탁액.
23. PKU의 치료를 필요로 하는 대상체에서 PKU를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 rAAV의 용도.

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