JP2020504619A - フェニルケトン尿症を処置するための遺伝子療法 - Google Patents

Abstract

フェニルケトン尿症を処置する際に有用な組成物及びレジメンを提示する。この組成物は、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼの発現を駆動するトランスサイレチンエンハンサー及びプロモーターを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む。【選択図】なし

Description

電子形態で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、本明細書と共に電子形態で提出された配列表資料を参照することにより本明細書に組み込む。このファイルは「ＵＰＮ−１６−７９３９ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称である。

１．導入
本出願は、フェニルケトン尿症を処置するための遺伝子療法で有用な実施形態に関する。

２．背景
最も一般的な先天性代謝異常のうちの１つとして、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、米国における新生児１０，０００〜１５，０００人中１人に生じる。現在の処置アプローチでは、罹患した個体が出生時からその生涯にわたって不味かつ高価な食事制限を常に遵守し、かつ／またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼでの酵素置換を受けることが必要である。

ＰＫＵの最も一般的な原因は、ＰＡＨ遺伝子の劣性遺伝性突然変異に起因するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の欠損である。ＰＡＨは、フェニルアラニンのチロシンへの不可逆的な水酸化を触媒する肝臓において主に発現する。したがって、ＰＡＨの欠損は、フェニルアラニンの異化経路に影響を及ぼし、フェニルアラニンの蓄積をもたらす。高い血漿フェニルアラニンレベルは、脳内のフェニルアラニンを増加させ、脳の発達及び機能に影響を及ぼし、知的障害及び癲癇をもたらし得る。更に、食事制限及び酵素置換による血漿フェニルアラニンの低減は高価で不便であり、かつ、持続性軽度認知障害といった種々の有害な合併症と関連付けられている。

ＰＡＨの治療レベルの持続を達成するための代替的なアプローチは、細胞指向性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）または他のウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターにより媒介される遺伝子移入を使用した、肝細胞における天然酵素の連続的なインビボ産生による。ベクター媒介性ＰＡＨ発現のいくつかの試みが、マウス研究において予備的に試験されてきた。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｈａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ２／８ ｖｅｃｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００６
Ｍａｒ；１３（５）：４５７−６、及びＶｉｅｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ Ｕｓｉｎｇ Ｍｉｎｉｃｉｒｃｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｎａｋｅｄ−ＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｉｖｅｒ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４ Ｓｅｐ；６０（３）：１０３５−１０４３を参照されたい。しかしながら、送達効率、免疫刺激、長期発現安定性及び安全性の評価は、不足しているか、または最適でないかのいずれかである。したがって、より効率的なＡＡＶ．ｈＰＡＨベクターがＰＫＵ処置のために必要とされている。

本明細書に記述される実施形態は、ベクターの静脈内投与後、長期間、ことによると１０年以上にわたり、高フェニルアラニン血症の臨床的に意義のある是正をもたらす、それ
を必要とする対象に正常なヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を送達するためのＡＡＶ遺伝子療法ベクターに関する。対象患者集団は、中等度から重度の高フェニルアラニン血症を有する患者であり、ＰＫＵ、異型ＰＫＵ、または非ＰＫＵ高フェニルアラニン血症を有するものを含む。意図されるベクター用量は、野生型と比較しておよそ１５％以上のＰＡＨ血中レベルを送達するよう意図される。これは、「中等度」ＰＫＵ患者について報告されているレベルである。参照により本明細書に組み込まれている、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｓ．，ＰＮＡＳ，９６：３１６０−４（１９９９）を参照されたい。別の実施形態では、意図されるベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを２５％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。一実施形態では、ＡＡＶベクター処置の目標は、重度のＰＫＵ患者を中等度あるいは軽度のＰＫＵに転換させることにより、厳しく制限されたフェニルアラニン食に関連する負荷を軽減することである。

一態様において、本出願は、ＰＫＵと診断された患者（ヒト対象）の肝臓細胞にヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用を提示する。ｈＰＡＨ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨ」）は、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＰＡＨ導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。一実施形態において、発現制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。このようなエレメントについては、本明細書において更に記述する。

一実施形態において、ｈＰＡＨコーディング配列は配列番号１に示されている。一実施形態において、ＰＡＨタンパク質配列は配列番号２に示されている。ｈＰＡＨのコーディング配列は、一実施形態では、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。このような配列は、天然のｈＰＡＨコーディング配列（配列番号３）と８０％未満の同一性を共有し得る。一実施形態において、ｈＰＡＨコーディング配列は、配列番号１に示されているものである。

別の態様において、本明細書では、ＰＫＵ患者への投与に好適な、本明細書に記述されるｒＡＡＶを含む水性サスペンションが提示される。一部の実施形態では、サスペンションは、水性懸濁液と、１ｍＬあたり約１×１０^１２〜約１×１０^１４ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶとを含む。サスペンションは、一実施形態では静脈内注射に好適である。他の実施形態では、サスペンションは、水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、保存剤、及び／またはバッファーを更に含む。

別の実施形態において、本明細書では、ＰＫＵを有する患者を本明細書に記述されるｒＡＡＶで処置する方法が提示される。一実施形態では、水性サスペンションにおいて、患者の体重１ｋｇあたり約１×１０^１１〜約３×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）のｒＡＡＶ／ｋｇが患者に送達される。

３．図面の簡単な説明

図１は、ｐＡＡＶ．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨシスプラスミドの概略表現である。 図２Ａは、実施例１に記述した、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスモデル（白色で示す）及び野生型同腹仔（黒色で示す）またはヘテロ接合性同腹仔（灰色で示す）における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの棒グラフである。これらの結果は図２Ｄに要約してある。図２Ｂは、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウス（白色で示す）と、対照として用意したヘテロ接合性同腹仔（灰色で示す）及び野生型同腹仔（黒色で示す）における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの線グラフである。実施例３に記述するように、自然史研究の５６日目に１×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨをマウスに注射した。自然史研究のＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウス雄７匹及び雌３匹に対して実験を行った。図２Ｃは、実施例３に記述した、１×１０^１３ＧＣ／ｋｇまたは１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを注射したＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスモデルにおける血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの線グラフである。注射日は０日目であった。図２Ｄは、図２Ａにおいて研究したマウスの平均Ｐｈｅレベルを示す線グラフである。値は平均＋／−ＳＥＭとして表してある。 図３Ａは、実施例１に記述した、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂマウスモデル（白色で示す）及び野生型同腹仔（黒色で示す）またはヘテロ接合性同腹仔（灰色で示す）における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの棒グラフである。これらの結果は図３Ｄに要約してある。図３Ｂは、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂマウス（白色で示す）と、対照として用意したヘテロ接合性同腹仔（灰色で示す）及び野生型同腹仔（黒色で示す）における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの線グラフである。自然史研究のＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂマウス雌３匹に対して実験を行った。図３Ｃは、実施例３に記述した、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを注射したＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂマウスモデルにおける血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの線グラフである。マウス識別番号１６９１、１６９５、及び１６９６は、０日目に１×１０^１２ＧＣ／ｋｇを注射した雌であった。図３Ｄは、図３Ａにおいて研究したマウスの平均Ｐｈｅレベルを示す線グラフである。値は平均＋／−ＳＥＭとして表してある。 図４Ａは、実施例１に記述した、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスモデル（白色で示す）及び野生型同腹仔（黒色で示す）またはヘテロ接合性同腹仔（灰色で示す）における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの線グラフである。これらの結果は図４Ｃに要約してある。図４Ｂは、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウス（白色で示す）と、対照として用意したヘテロ接合性同腹仔（灰色で示す）及び野生型同腹仔（黒色で示す）における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの線グラフである。自然史研究のＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウス雄２匹に対して実験を行った。図４Ｃは、図４Ａにおいて研究したマウスの平均Ｐｈｅレベルを示す線グラフである。値は平均＋／−ＳＥＭとして表してある。 図５は、図２Ａ、３Ａ、及び４Ａの結果を要約した棒グラフである。血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルはＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって検出したものであり、データは、６〜８週齢から採血したＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスのものである。血漿を単離し、Ｐｈｅ濃度について解析した。野生型同腹仔を陰性対照として用意した。 図６Ａ〜６Ｃは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏがＰＫＵ＿ＫＯ＿Ｂマウスにおけるフェニルアラニンレベルをレスキューすることを示す。処置前のフェニルアラニンレベルが確立された後、１７〜２２週齢のＰＫＵ Ｂマウスに、１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨ（円形）またはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ（正方形）のいずれかを与えた。ＰＢＳ処置は三角形で示した。その後、マウスを毎週採血し、血漿を単離し、フェニルアラニン濃度を決定した（Ａ）。研究終了時に肝臓を収集し、ゲノムコピー解析（Ｂ）及び免疫組織化学的検査（Ｃ）を行った。値は平均±ＳＥＭとして表してある。 図７は、ＡＡＶ遺伝子療法がＰＫＵ＿ＫＯ＿Ａマウスにおける血漿Ｐｈｅ濃度を低下させることを示す線グラフである。ベースラインのフェニルアラニンレベルが確立された後、ＷＴ（三角形）、ヘテロ接合性（円形）、及びＰＫＵ＿ＫＯ＿Ａ（ＫＯ）マウスに、１０^１１ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏを静脈内注射した。その後、マウスを毎週採血し、血漿を単離し、Ｐｈｅ濃度について解析した。値は平均＋／−ＳＥＭとして表してある。血漿中のＰｈｅレベルは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏの静脈内投与後に７１％低下した。 図８Ａ〜８Ｃは、高用量のＡＡＶ９．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏがＰＫＵ＿ＫＯ＿Ｂマウスにおけるフェニルアラニンレベルをレスキューすることを示す。ベースラインのフェニルアラニンレベルが確立された後、ＰＫＵ＿ＫＯ＿Ｂマウスに、１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、または１０^１１ＧＣ／ｋｇのいずれかのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏを与えた。その後、マウスを毎週採血し、血漿を単離し、Ｐｈｅ濃度について解析した（Ａ）。値は平均＋／−ＳＥＭとして表してある。研究終了時に肝臓を収集し、ゲノムコピー解析（Ｂ）及び免疫組織化学的検査（Ｃ）を行った。タンパク質発現及びＰｈｅレベルの低下が１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量において見られた。 図９は、野生型（ＷＴ）（配列番号２６）、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ（系統Ａ）（配列番号２７）、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ（系統Ｂ）（配列番号２８）、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃ（系統Ｃ）（配列番号２９）、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｄ（系統Ｄ）（配列番号３０）、及びコンセンサス（配列番号３１）に対するＰＡＨ配列の一部分のアライメントを示す。

４．詳細な説明
本出願に記述される実施形態は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）と診断された患者（ヒト対象）の肝臓細胞にヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関する。ｈＰＡＨ遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨ」）は、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＰＡＨ導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。一実施形態において、発現制御エレメントは、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＷＰＲＥ、及びポリＡシグナルのうちの１つ以上を含む。このようなエレメントについては、本明細書において更に記述する。

本明細書において使用される場合、「ＡＡＶ８カプシド」とは、参照により本明細書に組み込まれているＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０．１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＡＡＶ８カプシドを指す。このコードされる配列からのある程度の差異が許容され、これには、ＹＰ＿０７７１８０．１及びＷＯ２００３／０５２０５１（これは参照により本明細書に組み込まれている）における参照アミノ酸配列と約９９％の同一性（すなわち、参照配列からの約１％未満の差異）を有する配列が含まれ得る。カプシドひいてはコーディング配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法については記述されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１−６０８６（２００３）及びＵＳ２０１５／０３１５６１２を参照されたい。

本明細書において使用される場合、「ＮＡｂ力価」とは、標的となるエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理的効果を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ Ｎａｂ）がどれだけ産生されるかの測定値である。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えば、参照により本明細書に組み込まれているＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１−３９０に記述されているように測定することができる。

アミノ酸配列との関連における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」、または「パーセント同一」という用語は、２つの配列のうち、対応するようにアラインされたときに同じである残基を指す。同一性パーセントは、タンパク質の完全長にわたるアミノ酸配列、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそれらのペプチド断片、または対応する核酸配列コーディングシーケンサーにつ
いて容易に決定され得る。好適なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸長であってよく、最長約７００アミノ酸であり得る。概して、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を参照するとき、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「アラインされた」配列に関して決定されたものである。「アラインされた」配列または「アライメント」とは、多くの場合、参照配列と比較した塩基またはアミノ酸の欠失または付加に対する補正を含む、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、公的または商業的に利用可能な様々なＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムのいずれかを使用して行われる。アミノ酸配列には、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムといった配列アライメントプログラムが利用可能である。概して、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、当業者は、必要に応じてこれらの設定を変更することができる。代替的には、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるレベルの同一性またはアライメントを少なくとも提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用してもよい。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。

本明細書において使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、目的の遺伝子と連続している発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するようにトランスに、すなわち離れて作用する発現制御配列との両方を指す。

「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含有する発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされている合成または人工のウイルス粒子で、同様にウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされているあらゆるウイルスゲノム配列が複製欠損である、すなわち子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を保持するものを指す。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製するのに必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが（このゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに挟まれた目的の導入遺伝子のみを含有する「ガットレス」であるように工学操作されていてよい）、これらの遺伝子は産生中に供給されてもよい。したがって、これは遺伝子療法に使用するのに安全であるとみなされる。子孫ビリオンによる複製及び感染は、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いては起こり得ないためである。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、排他的ではなく包括的に解釈されるものとする。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という言葉、及びその変化形は、包括的ではなく排他的に解釈されるものとする。本明細書における種々の実施形態は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言を使用して提示されるが、他の状況下では、関連する実施形態が「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という文言を使用して解釈され、かつ記述されていることも意図される。

本明細書において使用される場合、「約」という用語は、別途指定しない限り、与えられている基準から１０％の変動を意味する。

本明細書において別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者が一般的に理解し、また本出願において使用される用語の多くに関する一般的指針を当業者に提供する公開文献の参照により理解されるものと同じ意味を有する。

５．１ 遺伝子療法ベクター
一態様では、遺伝子療法において使用するためのヒトＰＡＨ遺伝子を搭載した組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが提示される。ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクターは、肝臓への指向性を有するべきであり（例えば、ＡＡＶ８カプシドを有するｒＡＡＶ）、ｈＰＡＨ導入遺伝子は、肝臓特異的な発現制御エレメントによって制御されるべきである。ベクターは、ヒト対象への注入に好適なバッファー／担体において製剤化される。バッファー／担体には、ｒＡＡＶが注入チューブに固着することを防止するが、インビボでｒＡＡＶ結合活性に干渉しない成分が含まれているべきである。

５．１．１．ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクター
５．１．１．１．ｈＰＡＨ配列
フェニルケトン尿症は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）遺伝子の突然変異によって主に引き起こされる遺伝性代謝異常である。ＰＡＨ遺伝子の突然変異は、触媒活性の減少をもたらし、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）の異化経路に影響を及ぼす。ＰＡＨは、Ｐｈｅをチロシン（Ｔｙｒ）に転換させるために補因子テトラヒドロビオプテリン（ＢＨ_４）を必要とする肝酵素である。ＰＡＨまたはその補因子ＢＨ_４の欠損は、過剰なフェニルアラニンの蓄積をもたらし、処置しなければ、フェニルアラニンの毒性効果により、重度かつ不可逆的な知的障害及び他の障害が生じ得る。参照により本明細書に組み込まれている、Ｈａｖｉｄ ａｎｄ Ｃｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ，Ｔｒａｎｓｌ Ｐｅｄｉａｔｒ，２０１５ Ｏｃｔ，４（４）：３０４−１７を参照されたい。

５５０種を超えるＰＡＨ遺伝子の突然変異が記述されており、その大部分が酵素活性の欠損をもたらす。参照により本明細書に組み込まれている、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｈｄｂ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／にてアクセスされるＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ Ｌｏｃｕｓ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅを参照されたい。既知のＰＫＵ突然変異が多数あり、疾患の性質が常染色体劣性であることから、広範な疾患重症度が見られる。疾患の重症度は概して血中フェニルアラニンレベルによって分類され、場合により古典型ＰＫＵ、中等度もしくは異型ＰＫＵ、軽度ＰＫＵ、または高フェニルアラニン血症に分類される。診断時の血中Ｐｈｅレベルに基づいて、ＰＫＵの重症度には４つのレベルがある。
・高フェニルアラニン血症、正常範囲をわずかに超えるＰｈｅレベル：１２０〜６００μｍｏｌ／Ｌ（２〜１０ｍｇ／ｄＬ）
・軽度、最も低い血中Ｐｈｅレベル：６００〜９００μｍｏｌ／Ｌ（１０〜１５ｍｇ／ｄＬ）
・中等度または異型、中間あたりの血中Ｐｈｅレベル：９００〜１２００μｍｏｌ／Ｌ（１５〜２０ｍｇ／ｄＬ）
・重度または「古典型」ＰＫＵ、極めて高い血中Ｐｈｅレベル：＞１２００μｍｏｌ／Ｌ（２０ｍｇ／ｄＬ）

本明細書に記述される療法の目標は、１２０〜６００μｍｏｌ／Ｌの範囲のＰｈｅレベルをもたらす（例えば、血漿Ｐｈｅレベルを２５％以上低下させる）機能的なＰＡＨ酵素をもたらすことである。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを２５％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを３０％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを３５％以
上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを４０％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを４５％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを５０％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを６０％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを７０％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを７５％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。

一実施形態において、「対象」または「患者」は、上述のようにＰＫＵを有する哺乳動物対象である。いかなる重症度のＰＫＵを有する患者も、意図される対象であることが意図される。

一実施形態では、ｈＰＡＨ遺伝子は、配列番号２に示されるｈＰＡＨタンパク質をコードする。したがって、一実施形態において、ｈＰＡＨ導入遺伝子は、参照により本明細書に組み込まれている添付の配列表に提示されている配列番号１または配列番号３により提示される配列を含み得るが、これらに限定されない。配列番号３は、天然のヒトＰＡＨのｃＤＮＡを提示する。配列番号１は、ヒトにおける発現のためにコドン最適化された、工学操作されたヒトＰＡＨのｃＤＮＡ（本明細書では場合によりｈＰＡＨｃｏと呼ばれる）を提示する。本明細書におけるｈＰＡＨへの言及は、一部の実施形態では、ｈＰＡＨの天然配列またはコドン最適化配列を指し得ることを理解されたい。代替的には、または更に、ウェブベースまたは商業的に利用可能なコンピュータプログラム、ならびにサービスベースの企業を利用して、両ＲＮＡ及び／またはｃＤＮＡを含む核酸コーディング配列にアミノ酸配列を逆翻訳してもよい。例えば、ＥＭＢＯＳＳによるｂａｃｋｔｒａｎｓｅｑ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ−／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）、ＥｘＰａｓｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／）を参照されたい。所望の標的対象における発現のために（例えば、コドン最適化によって）最適化されている核酸配列を含め、記述されるｈＰＡＨポリペプチド配列をコードする全ての核酸が包含されることが意図される。

一実施形態では、ｈＰＡＨをコードする核酸配列は、配列番号３の天然ｈＰＡＨコーディング配列と、少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、ｈＰＡＨをコードする核酸配列は、配列番号３の天然ｈＰＡＨコーディング配列と、少なくとも９０、８５、８０、７５、７０、または６５％の同一性を共有する。一実施形態では、ｈＰＡＨをコードする核酸配列は、配列番号３の天然ｈＰＡＨコーディング配列と、約７８％の同一性を共有する。一実施形態において、ｈＰＡＨをコードする核酸配列は配列番号１である。

一実施形態では、ＰＡＨコーディング配列は、標的対象における発現のために最適化されている。コドン最適化されたコーディング領域は、種々の異なる方法によってデザインすることができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、または例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）のようなコドン最適化サービスを提供する企業を利用して行ってもよい。コドン最適化アプローチの１つは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記述されている。例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適には、産
物のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長が改変される。しかしながら一部の実施形態では、ＯＲＦの断片のみを変更してもよい。これらの方法のうちの１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、このポリペプチドをコードするコドン最適化されたコーディング領域の核酸断片を産生することができる。

コドンの実際の変更を行うため、または本明細書に記述されるようにデザインされたコドン最適化コーディング領域を合成するためには、いくつかの選択肢が利用可能である。このような改変または合成は、当業者に周知の標準的かつルーチン的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各々８０〜９０ヌクレオチド長であり所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチド対を、標準的方法によって合成する。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニールすると、付着末端を含有する８０〜９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成される。例えば、対における各オリゴヌクレオチドは、対における他方のオリゴヌクレオチドに対して相補的である領域を、塩基３個分、４個分、５個分、６個分、７個分、８個分、９個分、１０個分、またはそれ以上超えて伸びるように合成される。各オリゴヌクレオチド対の一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチド対の一本鎖末端とアニールするようにデザインする。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次に、一本鎖の付着末端を介してこれらの二本鎖断片のうちおよそ５〜６つを一緒にアニールさせてから、それらを一緒にライゲートし、標準的な細菌クローニングベクター、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次に、この構築物を標準的方法によってシーケンシングする。８０〜９０塩基対の断片が５〜６つ一緒にライゲートされた断片（すなわち約５００塩基対の断片）からなる、こうした構築物をいくつか調製することで、一連のプラスミド構築物において所望の配列全体が表されるようにする。次に、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲートして、最終構築物を形成する。次に、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、シーケンシングする。更なる方法は、当業者にはすぐに明らかになるであろう。加えて、遺伝子合成は商業的に容易に利用可能である。

５．１．１．２．ｒＡＡＶベクター
ＰＡＨは肝臓で天然に発現するため、肝臓への指向性を示すＡＡＶを使用することが望ましい。一実施形態において、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶ８である。別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、ＡＡＶｒｈ．１０である。更に別の実施形態では、カプシドを供給するＡＡＶは、クレードＥのＡＡＶである。このようなＡＡＶには、ｒｈ．２；ｒｈ．１０；ｒｈ．２５；ｂｂ．１、ｂｂ．２、ｐｉ．１、ｐｉ．２、ｐｉ．３、ｒｈ．３８、ｒｈ．４０、ｒｈ．４３、ｒｈ．４９、ｒｈ．５０、ｒｈ．５１、ｒｈ．５２、ｒｈ．５３、ｒｈ．５７、ｒｈ．５８、ｒｈ．６１、ｒｈ．６４、ｈｕ．６、ｈｕ．１７、ｈｕ．３７、ｈｕ．３９、ｈｕ．４０、ｈｕ．４１、ｈｕ．４２、ｈｕ．６６、及びｈｕ．６７が含まれる。このクレードは、改変されたｒｈ．２、改変されたｒｈ．５８、及び改変されたｒｈ．６４を更に含む。参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。しかしながら、肝臓指向性のあるいくつかのｒＡＡＶベクターのうち、いずれを使用してもよい。

下記の実施例に記述される特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨと呼ばれるチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターの制御下でｈＰＡＨ導入遺伝子を発現するＡＡＶ８ベクターである。そのようなベクターのベクターゲノムは、配列番号２０に示されている。別の実施形態では、ＷＰＲＥが省略され、すなわち、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨである。そのようなベクターのベクターゲノムは、配列番号２１に示されている。外部のＡＡＶベクター成分は、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３種のＡＡＶウイルスタンパク質の１：１：１０の比における６０個のコピーからなる、血清型８、Ｔ＝１の正二十面体
カプシドである。このカプシドは、一本鎖ＤＮＡ ｒＡＡＶベクターゲノムを含有する。

一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨゲノムは、２つのＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれたｈＰＡＨ導入遺伝子を含有する。一実施形態において、ｈＰＡＨ導入遺伝子は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号１５）、ｈＰＡＨコーディング配列、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのうちの１つ以上を含む。別の実施形態では、ｈＰＡＨ導入遺伝子は、エンハンサー、プロモーター、イントロン、ｈＰＡＨコーディング配列、及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのうちの１つ以上を含む。これらの制御配列は、ｈＰＡＨ遺伝子配列に「作動可能に連結している」。これらの配列を含有する発現カセットは、ウイルスベクターの産生に使用されるプラスミドに、工学操作によって載せてもよい。

ＩＴＲは、ベクター産生中のゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝子エレメントであり、ｒＡＡＶを生成するために必要な唯一のウイルスシスエレメントである。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするために必要な最小限の配列はＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲであり、これらは、カプシドと同じＡＡＶ起源をもっていてもよいし、異なるＡＡＶ起源をもっていてもよい（ＡＡＶシュードタイプを産生するため）。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源に由来するＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源に由来する場合、結果として生じるベクターは、シュードタイプ型と呼ばれる場合がある。典型的には、ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ｈＰＡＨコーディング配列及び任意の調節配列、及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成が好適な場合がある。Ｄ配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮バージョンが記述されている。他の実施形態では、完全長のＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲが使用される。一実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号１６に示されているものである。一実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号１７に示されているものである。

一実施形態において、発現制御配列は、１つ以上のエンハンサーを含む。一実施形態では、配列番号４に示されているＥｎ３４エンハンサー（ヒトアポリポタンパク質肝臓制御領域の３４ｂｐコアエンハンサー）が含まれる。別の実施形態では、ＥｎＴＴＲ（トランスサイレチンの１００ｂｐエンハンサー配列）が含まれる。このような配列は、配列番号５に示されている。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１６（２）：２８０−２８９，Ｆｅｂ．２００８を参照されたい。更に別の実施形態では、α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体エンハンサーが含まれる。更に別の実施形態では、ＡＢＰＳ（α１ミクログロブリン／ビクニン前駆体［ＡＢＰ］の１００ｂｐの遠位エンハンサーが４２ｂｐに短縮されたバージョン）エンハンサーが含まれる。このような配列は、配列番号６に示されている。更に別の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサーが含まれる。このような配列は、配列番号７に示されている。別の実施形態では、２つ以上のエンハンサーが存在する。このような組み合わせは、本明細書に記述されるエンハンサーのうちのいずれかの２つ以上のコピー、及び／または２つ以上のタイプのエンハンサーを含み得る。

ｈＰＡＨコーディング配列の発現は、肝臓特異的プロモーターから駆動される。本明細書に記述される、説明に役立つプラスミド及びベクターは、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（配列番号９）、またはその改変バージョンを使用する。ＴＢＧプロモーターの改変バージョンの１つは、ＴＢＧ−Ｓ１と呼ばれる短縮バージョンである。改変されたチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ−Ｓ１）プロモーター配列は、配列番号８
に示されている。代替的には、他の肝臓特異的プロモーター、例えばトランスサイレチンプロモーターを使用してもよい。別の好適なプロモーターは、アルファ１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーター、またはその改変バージョン（この配列は配列番号１０に示されている）である。別の好適なプロモーターはＴＴＲプロモーター（配列番号１１）である。他の好適なプロモーターとしては、ヒトアルブミン（Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４ ３２（１９９７））、ｈｕｍＡｌｂ；肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター（Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２ ９（１９９６）が挙げられる。例えば、参照により組み込まれているＴｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤを参照されたい。さほど望ましくはないが、他のプロモーター、例えばウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、または生理学的合図に応答するプロモーターを使用してもよく、本明細書に記述されるベクターにおいて利用してもよい。

発現カセット及び／またはベクターは、プロモーターに加えて、他の適切な転写開始配列、終止配列、エンハンサー配列、及び効率的なＲＮＡプロセシングシグナルを含有してもよい。このような配列には、スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、発現を増強する調節エレメント（例えばＷＰＲＥ（配列番号１５））、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を増強する配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列、そして所望であれば、コードされる産物の分泌を増強する配列が含まれる。一実施形態では、ｈＰＡＨ ｍＲＮＡ転写物の終止を媒介するため、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルが含まれる。他の好適なポリＡ配列の例としては、例えば、とりわけウシ成長ホルモン（配列番号１２）、ＳＶ４０、ウサギベータグロビン、及びＴＫポリＡが挙げられる。

一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約２．０〜約５．５キロベースのサイズになるように選択される。一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約３．４ｋｂ、約２．９ｋｂ、約３．３ｋｂ、約２．２ｋｂ、または約２．５ｋｂのサイズになるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムが天然ＡＡＶゲノムのサイズに近似することが望ましい。したがって、一実施形態において、調節配列は、ｒＡＡＶベクターゲノム全体が約４．７ｋｂのサイズになるように選択される。別の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノム全体は、約５．２ｋｂ未満のサイズである。ベクターゲノムのサイズは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡなどを含む調節配列のサイズに基づいて操作され得る。参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，Ｊａｎ ２０１０ １８（１）：８０−６を参照されたい。

したがって、一実施形態では、イントロンがベクターに含まれる。好適なイントロンとしては、ヒトベータグロビンＩＶＳ２（配列番号１３）が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれている、Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（９）：４７２１−３２（２０１５）を参照されたい。別の好適なプロモーターとしては、Ｐｒｏｍｅｇａのキメライントロン（配列番号１４、場合により「ＰＩ」と呼ばれる）が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれている、Ａｌｍｏｎｄ，Ｂ．ａｎｄ Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ，Ｅ．Ｔ．Ａ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐＣＩ−ｎｅｏ Ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ Ｖｅｃｔｏｒ．［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］２０００を参照されたい。ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｈｕｂ／ｅｎｏｔｅｓ／ａ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ−ｏｆ−ｐｃｉｎｅｏ−ｖｅｃｔｏｒ−ａｎｄ−ｐｃｄｎａ４ｈｉｓｍａｘ−ｖｅｃｔｏｒ／から利用可能で
ある。別の好適なイントロンとしては、ｈＦＩＸイントロン（配列番号１８）が挙げられる。本明細書において好適な種々のイントロンは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、参照により本明細書に組み込まれているｈｔｔｐ：／／ｂｐｇ．ｕｔｏｌｅｄｏ．ｅｄｕ／〜ａｆｅｄｏｒｏｖ／ｌａｂ／ｅｉｄ．ｈｔｍｌにて見られるものを含む。参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈｅｐｅｌｅｖ Ｖ．，Ｆｅｄｏｒｏｖ
Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｏｎ−Ｉｎｔｒｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６，７：１７８−１８５も参照されたい。

一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５を含む。

５．１．２．組成物
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨウイルスは、水性担体、賦形剤、希釈剤、またはバッファーを含む医薬組成物で提供される。一実施形態において、バッファーはＰＢＳである。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨ製剤は、ＴＭＮ２００（２００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）中に０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を含有する水溶液に懸濁した、有効量のｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクターを含有するサスペンションである。しかしながら、緩衝食塩水、界面活性剤、及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）約１００ｍＭ〜塩化ナトリウム約２５０ｍＭと同等のイオン強度に調整した生理的に適合性がある塩もしくは塩の混合物、または同等のイオン濃度に調整した生理的に適合性がある塩のうちの１つ以上を含むものをはじめとする、種々の好適な溶液が公知である。

例えば、本明細書において提示されるサスペンションは、ＮａＣｌ及びＫＣｌの両方を含有し得る。ｐＨは、６．５〜８．５、または７〜８．５、または７．５〜８の範囲内であり得る。好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、中央にある疎水性のポリオキシプロピレン鎖（ポリ（プロピレンオキシド））が２つの親水性のポリオキシエチレン鎖（ポリ（エチレンオキシド））に挟まれた構成をしている非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールの中から選択され得る。一実施形態において、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、「Ｐ」の文字（ポロキサマーを表す）の後に３つの数字が続く名称を与えられる。最初の２つの数字に１００をかけると、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量が求められ、最後の数字に１０をかけると、ポリオキシエチレン含有率が求められる。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、サスペンションの最大約０．０００５％〜約０．００１％の量で存在してよい。別の実施形態では、ベクターは、１８０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．００１％ポロキサマー１８８を含有する水溶液（ｐＨ７．３）に懸濁される。

一実施形態において、製剤は、ヒト対象に使用するのに好適であり、静脈内投与される。一実施形態において、製剤は、ボーラス注射により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約１０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約２０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約３０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約６０分（±５分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。一実施形態において、製剤は、約９０分（±１０分）にわたる注入により、末梢静脈を介して送達される。しかしなが
ら、必要または所望であれば、この時間を調整してよい。任意の好適な方法またはルートを使用して、本明細書に記述されるＡＡＶ含有組成物を投与し、場合によっては、本明細書に記述されるｈＰＡＨのＡＡＶ媒介性送達と併せて、他の活性薬または療法薬を共投与することができる。投与ルートとしては、例えば、全身、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与ルートが挙げられる。

一実施形態において、製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４に記述されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、例えば、約１．０×１０^１１ＧＣ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー）〜約１×１０^１５ＧＣ／ｋｇ、約５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ（患者の体重１キログラムあたりのゲノムコピー）〜約３×１０^１３ＧＣ／ｋｇ、または約１×１０^１２〜約１×１０^１４ＧＣ／ｋｇを含有し得る。一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨ製剤は、例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ（上記）に記述されているように、ｏｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定した場合、少なくとも１×１０^１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬまたはそれ以上を含有するサスペンションである。

患者に投与されるＡＡＶ．ｈＰＡＨの用量から空のカプシドが除去されることを確実にするために、空のカプシドは、ベクター精製プロセス中に、例えば、本明細書において詳解される方法を使用して、ベクター粒子から分離される。一実施形態において、パッケージングされたゲノムを含有するベクター粒子は、参照により本明細書に組み込まれている「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ８」と題する２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号に記述されているプロセスを使用して、空のカプシドから精製される。簡潔に述べると、清澄化され濃縮されたｒＡＡＶ産生細胞培養物の上清から、ゲノムを含有するｒＡＡＶベクター粒子を選択的に捕捉して単離する、２ステップの精製スキームが記述されている。このプロセスでは、高い塩濃度で行われる親和性捕捉法の後に、高いｐＨで行われるアニオン交換樹脂法を利用して、ｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子をもたらす。他のカプシドを有するベクターのために同様の精製法を使用してもよい。

いかなる従来の製造プロセスを利用してもよいが、本明細書（及び米国特許出願第６２／３２２，０９８号）に記述されるプロセスは、５０〜７０％の粒子がベクターゲノムを有する、すなわち、完全粒子５０〜７０％のベクター調製物をもたらす。したがって、１．６×１０^１２ＧＣ／ｋｇの例示的な用量では、総粒子用量は２．３×１０^１２〜３×１０^１２の粒子となる。別の実施形態では、提唱される用量は、１／２対数高いか、または５×１０^１２ＧＣ／ｋｇであり、総粒子用量は７．６×１０^１２〜１．１×１０^１３の粒子となる。一実施形態において、製剤は、「空」対「完全」比が１以下、好ましくは０．７５未満、より好ましくは０．５、好ましくは０．３未満のｒＡＡＶストックを特徴とする。

ｒＡＡＶ８粒子（パッケージングされたゲノム）のストックまたは調製物は、ストック中のｒＡＡＶ８粒子が、ストック中のｒＡＡＶ８の少なくとも約７５％〜約１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも９９％であり、「空のカプシド」が、ストックまたは調製物中のｒＡＡＶ８の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満であるとき、空のＡＡＶカプシド（及び他の中間体）を「実質的に含まない」。

概して、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子につ
いてアッセイするための方法は、当技術分野において知られてきた。例えば、Ｇｒｉｍｍ
ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照されたい。変性カプシドについて試験するには、その方法は、３つのカプシドタンパク質を分離させることができる任意のゲル、例えば、バッファー中に３〜８％トリス−アセテートを含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に、処置済みＡＡＶストックを供し、次に、試料物質が分離されるまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロース膜、好ましくはナイロンにゲルをブロッティングすることを含む。次に、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。次に、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体、より好ましくはそれに共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合によって連結したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性同位体の放出、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは化学発光検出キットを使用する。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、カラム画分から試料を取り、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で加熱してもよい。カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）で分解した。製造元の説明に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用し、銀染色を行ってもよい。一実施形態において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化して、外来性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの失活後、試料を更に希釈し、複数のプライマーと、これらのプライマー間のＤＮＡ配列に対して特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブとを使用して増幅した。各試料について、規定の蛍光レベルに達するために必要なサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで測定する。ＡＡＶベクターに含まれるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用い、Ｑ−ＰＣＲ反応の標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）を使用して、ベクターゲノム力価をプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対して正規化することにより、これを決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイを使用することもできる。

一態様において、広域スペクトルセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（例えばＱｉａｇｅｎから市販されているもの）を利用する、最適化されたｑ−ＰＣＲ法が本明細書において提示される。より特定すると、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化後に試料をプロテイナーゼＫバッファーで希釈し、プロテイナーゼＫで処置してから熱失活することを除いては、標準的アッセイと同様である。好適には、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫバッファーで試料を希釈する。プロテイナーゼＫバッファーは、２倍以上に濃縮してよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処置は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬまで様々であり得る。処置ステップは約５５℃で約１５分間にわたって実施されるのが一般的だが、より低い温度（例えば、約３７℃〜約５０℃）でより長い期間（例えば、約２０分間〜約３０分間）にわたって、またはより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短い期間（例えば、約５〜１０分間）にわたって行ってもよい。同様に、熱失活は約９５℃で約１５分間にわたるのが一般的だが、温度を低下させ（例えば、約７０〜約９０℃）、時間を延長してもよい（例えば、約２０分間〜約３０分間）。次に、標準的アッセイにおいて説明されるように、試料を希釈し（例えば１０００倍）、ＴａｑＭａｎ解析に供する。

更に、または代替的には、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。例えば、一本鎖及び自己相補的なＡＡＶベクターゲノムの力価をｄｄＰＣＲによって決定するための方法が記述されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

５．２ 患者集団
上記で詳解したように、いかなる重症度のＰＫＵを有する対象も、本明細書に記述される組成物及び方法の意図されるレシピエントである。

対象は、各自の担当医の裁量にて、遺伝子療法処置の前及びそれと同時に、各自の標準治療処置（複数可）（例えば、Ｐｈｅの少ない食事；サプロプテリン二塩酸塩での処置）の継続が許容され得る。代替策では、医師が、遺伝子療法処置を供与する前に標準治療療法を停止し、場合により、遺伝子療法を供与した後に併用療法として標準治療処置を再開することを選ぶ場合がある。

遺伝子療法レジメンの望ましいエンドポイントは、１２０〜３６０μｍｏｌ／ＬのＰｈｅレベルをもたらすＰＡＨ活性の増加である。別の実施形態では、ベクター用量は、血漿フェニルアラニンレベルを２５％以上低下させるＰＡＨを送達するよう意図される。別の実施形態では、望ましいエンドポイントは、対象を「重度」表現型から「中等度」表現型にするように血漿Ｐｈｅレベルを低下させることである。フェニルアラニンレベルの測定のための方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００７）９，７６１−７６５に記述されているように、当技術分野で公知である。一実施形態において、患者は、単独かつ／または補助的処置の使用と組み合わせたｒＡＡＶ．ｈＰＡＨを用いた処置の後に、所望の循環ＰＡＨレベルを達成する。

５．３．投薬及び投与ルート
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクターは、患者ごとに単回用量として送達される。一実施形態において、対象には、最小有効量（ＭＥＤ）（本明細書の実施例に記述される前臨床研究によって決定される）が送達される。本明細書において使用される場合、ＭＥＤとは、１２０〜３６０μｍｏｌ／ＬのＰｈｅレベルをもたらすＰＡＨ活性を達成するために必要なｒＡＡＶ．ｈＰＡＨの用量を指す。

従来通り、ベクター力価は、ベクター調製物のＤＮＡ含有量に基づいて決定される。一実施形態では、実施例に記述される定量的ＰＣＲまたは最適化された定量的ＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクター調製物のＤＮＡ含有量を決定する。一実施形態では、実施例に記述されるデジタルドロップレットＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクター調製物のＤＮＡ含有量を決定する。一実施形態において、投与量は、約１×１０^１１ゲノムコピー（ＧＣ）／体重１ｋｇ〜約１×１０^１３ＧＣ／ｋｇ（両終点を含む）である。一実施形態において、投与量は５×１０^１１ＧＣ／ｋｇである。別の実施形態では、投与量は５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。特定の実施形態では、患者に投与されるｒＡＡＶ．ｈＰＡＨの用量は、少なくとも５×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、１．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、２．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、４．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、５．５×１０^１２Ｇ
Ｃ／ｋｇ、６．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、６．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、７．０×１０^１２ＧＣ／ｋｇ、または７．５×１０^１２ＧＣ／ｋｇである。また、複製欠損ウイルス組成物は、約１．０×１０^９ＧＣ〜約１．０×１０^１５ＧＣの範囲内の量の複製欠損ウイルスを含有するような投与量単位で製剤化され得る。本明細書において使用される場合、「投与量」という用語は、処置の過程において対象に送達される総投与量、または（複数のうちの）単一の投与において送達される量を指す場合がある。

一実施形態では、この投与量は、患者の血漿Ｐｈｅレベルを２５％以上低下させるのに十分である。

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＡＨは、低Ｐｈｅ食またはサプロプテリン二塩酸塩の投与といった、ＰＫＵを処置するための１つ以上の療法と組み合わせて投与される。

５．４．臨床的目標の測定
処置の効力の測定値は、血漿Ｐｈｅレベル及び／またはＰＡＨ活性によって決定される導入遺伝子の発現及び活性によって測定することができる。効力の更なる評価は、食事性のＰｈｅに対する耐性の臨床的評価によって決定することができる。

本明細書において使用される場合、本明細書におけるｒＡＡＶ．ｈＰＡＨベクターは、１２０〜３６０μｍｏｌ／ＬのＰｈｅレベルをもたらすＰＡＨ活性を達成するのに十分なレベルのＰＡＨを患者が発現する場合、患者の欠損したＰＡＨを活性ＰＡＨで「機能的に置き換える」または「機能的に補う」。

以下の実施例は単なる説明であり、本発明を限定することを意図するものではない。

以下の実施例は単なる説明であり、本発明を限定することを意図するものではない。

実施例１：フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のマウスモデル
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓにて、ＰＡＨ^−／−マウスをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって生成した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのマウス接合体に、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＰＡＨ遺伝子の第２のコーディングエクソンを標的にする２つのガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を直接注射した。これらの胚から発生したマウスをシーケンシングして突然変異（複数可）を特定し、次にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて対立遺伝子を伝達させ、生殖系列伝達を確認した。

４つの異なる突然変異を生成し、これらのマウス系統をＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｄと名付けた。ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスは、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＰＡＨ遺伝子［ＮＣ＿００００７６．６］の３ｂｐ置換に続いて６５３４ｎｔから６６００ｎｔへの６４ｂｐ欠失を示した。ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスは、それぞれ６５８９ｎｔ及び６５３９ｎｔの後の単一塩基対挿入を示した。ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｄは、６５３５ｎｔから６５４０ｎｔへの６ｂｐ欠失を示した。図９は、野生型、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｄ、及びコンセンサスに対するＰＡＨ配列の一部分のアライメントを示す。これらのマウスの自然史研究を行った。後眼窩採血または顎下採血によって血液試料を収集した。血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって検出し、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスからデータを取得し、それぞれ図２Ａ、３Ａ、及び４Ａに提示し、図５Ａに要約した。ヘテロ接合性同腹仔及び野生型同腹仔を陰性対照として用意した。対照と比較して、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスにおける血漿フェニルアラニンレベルは著しく高く
、これらのマウスにおけるＰＡＨの機能欠損を示した。また、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスが、ヒトにおけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のマウスモデルになり得ることも示唆された。

しかしながら、第４のノックアウトマウスであるＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｄは高い血漿フェニルアラニンレベルを呈さなかったため、更なる解析から除外した。

実施例２：ｈＰＡＨを含有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ）
ヒト甲状腺ホルモン結合グロビンプロモーター及びミクログロビン／ビクニンエンハンサーに基づくハイブリッドプロモーターであるＴＢＧ（図１）の制御下にあるコドン最適化されたヒトＰＡＨ ｃＤＮＡを有するＡＡＶ８ベクターにより、遺伝子療法ベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを構築した。ＰＡＨ発現カセットは、ＡＡＶ２由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）に挟まれ、その発現は、エンハンサーとしてのＴＢＧエンハンサー／プロモーター及びウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のハイブリッドによって駆動された。導入遺伝子は、Ｐｒｏｍｅｇａ ＳＶ４０ ｍｉｓｃイントロン（ＰＩ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ）も含んだ。ベクターゲノム配列は、配列番号２０に示されている。

このベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｄｉｓｓ．Ｄｉ−ｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８に記述されている、２９３細胞における従来のトリプルトランスフェクション技術を使用して調製した。全てのベクターは、これまでに記述されているように［Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２１：１２５９−１２７１（２０１０）］、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにてＶｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって産生された。

実施例３：ＰＫＵのモデルにおけるＡＡＶ８．ｈＰＡＨベクター
動物手技は全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）により認可されたプロトコールに従って行った。

２０匹のＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスを生成した。７匹の雄及び３匹の雌を自然史研究において評価した。自然史研究の５６日目に、識別番号１５３１、１５３２、及び１５３３の３匹の雄マウスには、尾静脈を介し、１×１０^１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターを静脈内注射した。識別番号１５３８、１５３９、１５５４、及び１５６４の４匹の雄マウスには、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのベクターを注射した。識別番号１５０７、１５３６、及び１５３７の３匹の雌マウスには、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのベクターを注射した。血液試料を毎週収集して、血漿フェニルアラニン濃度を評価した（図２Ｂ）。ＰＡＨ＿ＫＯ＿ＡマウスにおけるＰＡＨの欠損を示す、同腹仔対照と比較して高いレベルのフェニルアラニンが、注射前のＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスにおいて検出された。ベクター注射の７日後、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスの血漿フェニルアラニンレベルは低下したが、対照は安定した状態を保った。この結果は、ＰＡＨ＿ＫＯ＿ＡマウスへのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨの単回注射が、欠損したＰＡＨをレスキューし、血液中のフェニルアラニンの病理学的蓄積を低減させ得ることを示した。

性差及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターの２回の投薬の効果をＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａマウスにおいて更に評価した（図２Ｃ）。血漿フェニルアラニンレベルは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｆｏｒ ｄｉｅｔａｒｙ ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００７）９，７６１−７６５に記述されているように、１１週間にわたって毎週観察した。３匹中２匹の雌マウスには１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのベクターを与え、７匹の雄は全て、１×１０^１２ＧＣ／ｋｇ及び１×１０^１３ＧＣ／ｋｇの両方の用量において血漿中のフェニルアラニン濃度の低下を示した。７匹の雄マウスのフェニルアラニンは１１週間の観察期間にわたって比較的低いレベルを維持したが、３匹の雌は全て、血漿フェニルアラニンレベルの緩やかな上昇を示した。

３匹の雌ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂマウスを生成し、自然史研究において検査した。フェニルアラニンレベルのために毎週採血を行い、その結果、健常な同腹仔対照と比較して血液中のフェニルアラニンの異常な蓄積が確認された。１×１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨを静脈内注射したところ、３匹の雌全てにおいてフェニルアラニンレベルの低下が確認され、この低いレベルは、注射後８週間の観察期間を通して維持された。

２匹の雄ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスをこの研究のために生成し、自然史研究に利用した。血液試料の収集を毎週行い、フェニルアラニン濃度を評価した。９週間の観察中、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウス及びヘテロ接合性／野生型同腹仔の両方が比較的安定な血漿フェニルアラニン濃度を維持した一方で、ノックアウトマウスは著しく高いレベルを示したことがデータにより示された。

注射後のＰＡＨ^−／−マウスにおけるＰＡＨの発現及び酵素活性の更なる研究を行った。ベクターまたはＰＢＳのみを注射したＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウス、ならびに健常な同腹仔対照から肝臓を収集した。肝臓からｍＲＮＡを抽出し、ヒトＰＡＨの発現をＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＰＡＨのタンパク質発現量を決定するため、ウェスタンブロットによる検出のために肝臓ライセートを調製し、免疫組織化学的検査のために肝臓切片を調製した。ベクターで処置したＰＡＨ^−／−マウス及び対照のＰＡＨ酵素活性を評価するための実験も行った。

３種全てのＰＡＨ^−／−マウスにおける性差を詳しく評価するため、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ａ、ＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｂ、及びＰＡＨ＿ＫＯ＿Ｃマウスを飼育し、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨの注射前及び後の血漿フェニルアラニン濃度、ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとの両方におけるＰＡＨの発現、及びＰＡＨの酵素活性を評価した。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨの用量依存性発現、及び最も高い用量の潜在的毒性を決定するため、種々の用量のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨをＰＡＨ^−／−マウスに注射し、フェニルアラニンの蓄積及びＰＡＨ発現／活性の更なる評価を行った。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨを用いて同様の実験を行った。処置前のフェニルアラニンレベルが確立された後、１７〜２２週齢のＰＫＵ Ｂマウスに、１０^１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨまたはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨのいずれか（または対照にはＰＢＳ）を与えた。その後、マウス
を毎週採血し、血漿を単離し、フェニルアラニン濃度を決定した（図６Ａ）。研究終了時に肝臓を収集し、ゲノムコピー解析（図６Ｂ）及び免疫組織化学的検査（図６Ｃ）を行った。フェニルアラニンレベルは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨ処置マウス及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨ処置マウスの両方において低下した。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨベクターを用いて更なる研究を行った。ベースラインのフェニルアラニンレベルが確立された後、野生型、ヘテロ接合性（円形）、及びＰＫＵ＿ＫＯ＿Ａ（ＫＯ）マウスに、１０^１１ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏを静脈内注射した。その後、マウスを毎週採血し、血漿を単離し、Ｐｈｅ濃度について解析した。血漿中のＰｈｅレベルは、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏの静脈内投与後に７１％低下した。図７。

ベースラインのフェニルアラニンレベルが確立された後、ＰＫＵ＿ＫＯ＿Ｂマウスに、１０^１２ＧＣ／ｋｇ、３×１０^１１ＧＣ／ｋｇ、または１０^１１ＧＣ／ｋｇのいずれかのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＰＡＨｃｏを与えた。その後、マウスを毎週採血し、血漿を単離し、Ｐｈｅ濃度について解析した。研究終了時に肝臓を収集し、ゲノムコピー解析及び免疫組織化学的検査を行った。タンパク質発現及びＰｈｅレベルの低下が１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量において見られた。

一方で、次のベクター、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨ、ＡＡＶ８．ＬＳＰ．ＩＶＳ２．ｈＰＡＨｃｏ．ｂＧＨ、ＡＡＶ８．Ａ１ＡＴ．ｈＰＡＨｃｏ．ＢＧＨ、ＡＡＶ８．ＴＴＲ．ｈＰＡＨｃｏ．ＢＧＨ、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｎａｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｂＧＨ、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ．ｈＦＩＸｉｎｔｒｏｎ．ｈＰＡＨｃｏ．ＢＧＨ、ＡＡＶ８．ＡＢＰＳ．ＴＢＧ−Ｓ１．ｈＦＩＸｉｎｔｒｏｎ．ｈＰＡＨｃｏ．ＢＧＨ、ＡＡＶ８．ＡｐｏＥ．Ａ１ＡＴ．ｈＦＩＸｉｎｔｒｏｎ．ｈＰＡＨｃｏ．ＢＧＨの各々の１０^１２ＧＣ／ｋｇでの投与も行い、比較対象とした。

まとめると、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ＰＩ．ｈＰＡＨｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨベクターの単回注射は、３匹のＰＡＨ欠損マウスに静脈内投与したとき、実質的な血漿フェニルアラニンの低減及び付随する機能の是正をもたらした。

実施例４：フェニルケトン尿症のためのＡＡＶ遺伝子療法
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、フェニルアラニン−４−ヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）活性の減弱によって引き起こされ、組織及び血液中のフェニルアラニンの蓄積をもたらす常染色体劣性の遺伝性障害である。血流中の高レベルのフェニルアラニンは、血液脳関門を通る他の大きな中性アミノ酸の輸送を阻害し、脳の発達に影響を及ぼし、知的障害及び癲癇をもたらすと考えられている。ＰＫＵの処置は現在、厳しいフェニルアラニン制限食の維持、及び残留ＰＡＨを安定化させることを目的とする製品に限定されている。本明細書に記述した肝臓を標的とするＡＡＶ遺伝子療法アプローチは、現在の標準治療を改善するものである。

ＰＫＵのための遺伝子療法の発展について調査するため、本明細書に記述したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によってＰＡＨ遺伝子のエクソン１における異なる突然変異を誘導することにより、４種の独特のマウス系統を作出した。疾患の進行を決定し、ヒトＰＫＵ表現型を最も良好に再現した系統を特定するため、これらの系統の各々に対して自然史研究を行った。Ｂ及びＣと名付けたＰＫＵコロニーは、いずれもエクソン１内の異なる位置に単一塩基対（ｂｐ）欠失を含有し、７０μＭの正常レベルと比較して、それぞれ２０４９μＭ及び１７０５μＭの平均フェニルアラニンレベルを維持した。ＰＫＵコロニーＡは、ＰＡＨ遺伝子のエクソン１に６４ｂｐ欠失及び３ｂｐ挿入を有するにもかかわらず、中程
度に高い４７７μＭの平均フェニルアラニンレベルを有した。６ｂｐ欠失を有したＰＫＵコロニーＤは、野生型同腹仔と同等のフェニルアラニンレベルを有した。ヒトのコドン最適化バージョンのＰＡＨの発現のための１×１０^１２ＧＣ／ｋｇの用量におけるＡＡＶ８ベクターをＰＫＵ Ｂマウスコロニーに投与した後、血漿フェニルアラニンレベルは、２２２μＭまで８７％低下した。この血漿フェニルアラニンレベルの低下は、子孫を作る雄の能力を回復させた。これらの結果は、ＰＫＵのためのＡＡＶに基づく治療薬の開発を表す。

本明細書に引用される全ての公開文献、ならびに米国仮特許出願第６２／４４０，６５１号、同第６２／４６９，８９８号、及び同第６２／５０５，３７３号は、参照により本明細書に組み込まれている。同様に、本明細書において参照され、添付の配列表に記載される配列番号は、参照により組み込まれている。特定の実施形態を参照しながら本発明について記述したが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を行ってよいことは理解されよう。このような改変は、添付の特許請求の範囲に含まれるよう意図される。

配列表フリーテキスト：

Claims (23)

1. フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のための肝臓指向性治療薬として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含み、前記ベクターゲノムが、
   （ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列と、
   （ｂ）プロモーターと、
   （ｃ）ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするコドン最適化された配列と、
   （ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲと
   を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス。
2. 前記（ｃ）のコーディング配列が配列番号１である、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記ｒＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記プロモーターが、ＴＢＧプロモーターまたはＴＢＧ−Ｓ１プロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記プロモーターがＡ１ＡＴプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記プロモーターがＬＳＰプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記プロモーターがＴＴＲプロモーターである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２に由来する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
9. 前記ベクターゲノムがポリＡを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
10. 前記ポリＡがｂＧＨに由来する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
11. ＷＰＲＥを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
12. イントロンを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
13. 前記イントロンが、ヒトベータグロビンＩＶＳ２またはＳＶ４０に由来する、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
14. エンハンサーを更に含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
15. 前記エンハンサーが、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、またはＡｐｏＥエンハンサーである、請求項１４に記載のｒＡＡＶ。
16. 前記ベクターゲノムが、約３キロベース〜約５．５キロベースのサイズである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
17. フェニルケトン尿症患者への投与に好適な水性サスペンションであって、前記サスペンションが、水性懸濁液と、フェニルケトン尿症のための肝臓指向性治療薬として有用な約
    １×１０^１２ＧＣ／ｍＬ〜約１×１０^１４ＧＣ／ｍＬの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）とを含み、前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶカプシドを有し、かつその中に、
    （ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列と、
    （ｂ）プロモーターと、
    （ｃ）ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするコーディング配列と、
    （ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲと
    を含むベクターゲノムがパッケージングされている、
    前記水性サスペンション。
18. 前記サスペンションが静脈内注射に好適である、請求項１７に記載のサスペンション。
19. 前記サスペンションが、前記水性懸濁液中に溶解した界面活性剤、保存剤、及び／またはバッファーを更に含む、請求項１７に記載のサスペンション。
20. フェニルケトン尿症を有する患者を請求項１に記載のｒＡＡＶで処置する方法であって、前記ｒＡＡＶが、水性サスペンション中約１×１０^１０〜約１×１０^１５ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇで送達され、前記ＧＣがｏｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲに基づいて決定され計算される、前記方法。
21. 前記ベクターゲノムが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
22. 前記ｒＡＡＶカプシドがＡＡＶ８カプシドである、請求項１７に記載のサスペンション。
23. ＰＫＵの処置を、それを必要とする対象において行うための、請求項１〜１６のいずれかに記載のｒＡＡＶの使用。