JP2023510392A - フェニルケトン尿症に対するアデノ随伴ウイルスベースの遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
本開示は、とりわけ、ＡＡＶ８カプシドと、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素をコードするコドン最適化配列と、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。本開示はまた、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を有する対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＡＡＶ８カプシドと、ＰＡＨをコードする核酸配列に作用可能に結合したプロモーターと、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、投与することによって対象におけるフェニルアラニンレベルの低下をもたらす、方法を提供する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
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本出願は、２０２０年１月１６日に出願された米国特許出願第６２／９６２，０１１号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１月１６日に出願された米国特許出願第６２／９６２，０１１号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は本明細書に組み込まれる。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、肝酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の遺伝子における突然変異によって特徴づけられる常染色体劣性の遺伝性代謝疾患であり、その遺伝子を非機能性にする。ＰＡＨは、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアミノ酸チロシンに代謝するために必要である。ＰＡＨ活性が低下すると、フェニルアラニンが蓄積し、フェニルピルビン酸（フェニルケトンとしても既知である）に変換される。未治療のままでは、ＰＫＵは、精神遅滞、発作、及び他の深刻な医学的問題を引き起こす可能性がある。現在、この疾患の治療法はなく、標準治療は、大量のタンパク質を含む食品を最小限に抑えるように食事を管理することである。
インビボで治療用タンパク質を産生するベクターの使用は、疾患の治療のために望ましいが、インビボでの所望の治療用タンパク質の産生が不十分であることを含む様々な要因によって制限される。
本発明は、とりわけ、遺伝子治療を使用したＰＫＵの有効な治療のための方法及び組成物を提供する。本発明は、コドン最適化ヒトＰＡＨを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを使用した疾患の動物モデルにおける、ＰＫＵの治療の成功という驚くべき発見に一部基づいている。例えば、後述の実施例の節でより詳細に記載するように、ＰＡＨをコードするｒＡＡＶベクターの投与は、効率的なタンパク質発現をもたらした。さらに、ＡＡＶ８カプシド及びコドン最適化ヒトＰＡＨをコードするｒＡＡＶベクターは、ＰＫＵマウスの血漿及び脳の両方において、フェニルアラニンレベルを低下させ、チロシン及びトリプトファンレベルを増加させるのに特に効果的であった。したがって、本発明者らは、本明細書に記載される遺伝子治療アプローチが、ＰＫＵの治療において非常に効果的であり得ることを実証した。
一態様において、本発明は、ヒトＰＡＨをコードするコドン最適化配列を含むｒＡＡＶを提供し、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７０％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、コドン最適化配列は、配列番号１１～２７のうちの１つと同一である。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８カプシドをコードする。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ８カプシドは、野生型ＡＡＶ８カプシドと比較して改善された肝臓トロピズムを有する修飾ＡＡＶ８カプシドである。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８カプシドは、野生型ＡＡＶカプシドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列をさらに含む。
いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥ配列は、天然に存在するＷＰＲＥ配列である。
いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥ配列は、修飾ＷＰＲＥ配列である。いくつかの実施形態において、ＷＰＲＥ配列は、野生型ＷＰＲＥ、ＷＰＲＥ３、またはＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧから選択される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、肝臓特異的プロモーターをさらに含む。
いくつかの実施形態において、肝臓特異的プロモーターは、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）である。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）を含む。
いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＣＲＭリピートを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＲＭは、ＣＲＭ８である。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＰＡＨ配列の上流にイントロンをさらに含む。
いくつかの実施形態において、イントロンは、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンである。
一態様において、本発明は、ＰＫＵを治療する方法であって、治療を必要とする対象に、ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするコドン最適化配列であって、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７０％の同一性を有するコドン最適化配列、を含むｒＡＡＶを投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＡＨをコードするコドン最適化配列は４０％及び８０％のＧＣ含有率を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＡＨをコードするコドン最適化配列は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％のＧＣ含有率を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＨをコードするコドン最適化配列は、１０個以下のＣｐＧアイランド配列を含む。例えば、いくつかの実施形態において、ＰＡＨをコードするコドン最適化配列は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０個のＣｐＧアイランド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＨをコードするコドン最適化配列は、６個未満のＣｐＧアイランド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶを投与することは、対照と比較して、対象における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの低下をもたらす。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶを投与することは、対照と比較して、対象における血漿チロシンレベルの増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶを投与することは、対照と比較して、対象における血漿トリプトファンレベルの増加をもたらす。
いくつかの実施形態において、対照は、対象における血漿Ｐｈｅ、血漿チロシン、及び／または血漿トリプトファンの治療前レベルである。
いくつかの実施形態において、対照は、履歴データに基づく血漿Ｐｈｅ、血漿チロシン、及び／または血漿トリプトファンの参照レベルである。例えば、履歴データ（例えば、組織試料の測定値、タンパク質またはｍＲＮＡの測定値）は、他の患者、同じ患者（例えば、治療前）、または健康な個体から取得することができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、全身投与される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、静脈内投与される。
定義
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」または組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）という用語には、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１－６３８８（２００４）；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３０：３７５－３８３（２００４）を参照されたい）。典型的には、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外状態で存在することができる。ＡＡＶベクターは、遺伝子治療に一般的に使用される。ＡＡＶはまた、コドン最適化ＡＡＶを含む。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」または組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）という用語には、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１－６３８８（２００４）；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３０：３７５－３８３（２００４）を参照されたい）。典型的には、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外状態で存在することができる。ＡＡＶベクターは、遺伝子治療に一般的に使用される。ＡＡＶはまた、コドン最適化ＡＡＶを含む。
投与：本明細書で使用される場合、「投与すること」、「送達すること」または「導入すること」という用語は、ｒＡＡＶベクターの効率的な送達をもたらす方法または経路によって、ＰＡＨをコードするｒＡＡＶベクターを対象に送達することとの関連において同義的に使用される。例えば、静脈内、皮下、または経皮を含む、ｒＡＡＶベクターを投与するための様々な方法が、当該技術分野において既知である。ｒＡＡＶベクターの経皮投与は、「遺伝子銃」または微粒子銃送達システムの使用によって行うことができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、非ウイルス性脂質ナノ粒子を介して投与される。
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発生の任意の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発生の任意の段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／または蠕虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、及び／またはクローンであり得る。
およそまたは約：本明細書で使用される、関心の１つ以上の値に適用される、「およそ」または「約」という用語は、記述される参照値と類似する値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限り、または別様に前後関係から明白な場合を除いて、表示された参照値（を上回るかまたは下回る）のいずれかの２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の範囲内に含まれる値域を指す（この数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
活性な：本明細書で使用される場合、「活性な」という句は、生物系、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されたときに、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、活性または生物学的に活性であるとみなされる。特定の実施形態において、ペプチドが活性または生物学的に活性である場合、そのペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するペプチドの一部は、典型的には「活性な」部分と称される。
機能的等価物または誘導体：本明細書で使用される場合、「機能的等価物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体との関連において、元の配列と実質的に同様の生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体または等価物は、天然の誘導体であり得るか、または合成的に調製される。例示的な機能的誘導体には、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が含まれるが、但し、タンパク質の生物学的活性が保存されるものとする。置換するアミノ酸は、望ましくは、置換されるアミノ酸と同様の化学物理的特性を有する。望ましい同様の化学物理的特性としては、電荷、かさ高さ、疎水性、親水性等が挙げられる。
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境において、例えば、試験管または反応容器内において、細胞培養において起こる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物等の多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞ベースの系との関連において、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生細胞内で起こる事象を指すために使用され得る。
ＩＲＥＳ：本明細書で使用される場合、「ＩＲＥＳ」という用語は、任意の好適な内部リボソームエントリー部位配列を指す。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）最初に生成されたときに関連していた構成成分のうちの少なくともいくつかから分離された（天然環境において、及び／または実験環境においてに関わらず）、及び／または（２）人間の手によって生成、調製、及び／または製造された物質及び／または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に関連していた他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％から分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超える、実質的に１００％、または１００％純度である。本明細書で使用される場合、物質が実質的に他の構成成分を含まない場合、それは「純粋」である。本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物に含まれない細胞を指す。
ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合を介して一緒に連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者には、この用語が、長い鎖に限定されないことと、ペプチド結合を介して連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すこともあることとが理解されよう。当業者に既知のように、ポリペプチドは加工されていても及び／または修飾されていてもよい。
タンパク質：本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、個別の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが、個別の機能単位であり、個別の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され得る。個別の機能単位が、互いに物理的に会合する１つより多くのポリペプチドからなる場合、「タンパク質」という用語は、物理的に結合され、かつ個別の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
調節エレメント：本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、転写制御エレメントを指し、具体的には、遺伝子の転写を調節及び／または制御することができる、非コードシス作用性転写制御エレメントを指す。調節エレメントは、少なくとも１つの転写因子結合部位、例えば、組織特異的転写因子のための少なくとも１つの結合部位を含む。本明細書に記載される実施形態において、調節エレメントは、肝臓特異的転写因子のための少なくとも１つの結合部位を有する。典型的には、調節エレメントは、調節エレメントなしでプロモーター単独からの遺伝子の転写と比較した場合、プロモーターによって駆動される遺伝子発現を増加させるかまたは増強する。したがって、調節エレメントは、特にエンハンサー配列を含むが、転写を増強する調節エレメントは、典型的な遙か上流のエンハンサー配列に限定されず、それらが調節する遺伝子の任意の距離に存在し得ることを理解されたい。当該技術分野で理解されているように、転写を調節する配列は、インビボで調節される遺伝子の上流（例えば、プロモーター領域内）または下流（例えば、３’ＵＴＲ内）のいずれかに位置し得、かつ、遺伝子のすぐ近くに、またはより遠くに位置し得る。調節エレメントは、天然に存在する配列、そのような調節エレメント（の一部）の組み合わせ、または調節エレメントのいくつかのコピー、例えば、天然に存在しない配列のいずれかを含むことができる。したがって、調節エレメントは、天然に存在する調節エレメント、及び所望の発現レベルを達成するように最適化または操作された調節エレメントを含む。
対象：本明細書で使用される、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態において、対象はヒトである。対象は、患者であり得、患者は、疾患の診断または治療のために医療提供者を訪れるヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に苦しんでいる可能性があるかまたはそれらにかかり易いが、疾患または障害の症状を表してもまたは表さなくてもよい。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、対象とする特徴もしくは性質のすべてまたはほぼすべての範囲もしくは程度を表す定性的状態を指す。生物学分野における当業者には、生物学的及び化学的な現象が、あるとしてもめったに完全にまで至らないか及び／または完全性まで進まないかあるいは確かな結果に達しないまたは近づかないものと理解されよう。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的及び化学的な現象に内在する潜在的な完全性の欠如を表現するために使用される。
実質的な相同性：「実質的な相同性」という句は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者には理解されるように、２つの配列が、対応する位置に相同な残基を含む場合、それらは一般に「実質的に相同である」とみなされる。相同な残基は、同一の残基であり得る。代替的に、相同な残基は、非同一の残基であってもよく、適切に類似した構造的及び／または機能的特徴を有する。例えば、当業者には周知であるように、ある特定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」もしくは「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」もしくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。あるアミノ酸を同じ種類の別のアミノ酸に置換することは、しばしば「相同」置換とみなされ得る。
当該技術分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、及びアミノ酸配列用のＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ等の市販のコンピュータープログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較することができる。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同な配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、相同性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態において、２つの配列の対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、関連する残基のストレッチにわたって相同である場合、それらの配列は実質的に相同であるとみなされる。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは完全な配列である。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれ以上の残基である。
実質的な同一性：「実質的な同一性」という句は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指すために本明細書で使用される。当業者には理解されるように、２つの配列が、対応する位置に同一の残基を含む場合、それらは一般に「実質的に同一である」とみなされる。当該技術分野で周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、及びアミノ酸配列用のＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ等の市販のコンピュータープログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較することができる。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態において、２つの配列の対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上が、関連する残基のストレッチにわたって同一である場合、それらの配列は実質的に同一であるとみなされる。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは完全な配列である。いくつかの実施形態において、関連するストレッチは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、またはそれ以上の残基である。
罹患している：疾患、障害、及び／または状態に「罹患している」個体は、その疾患、障害、及び／または状態であると診断されているか、またはそれらの１つ以上の症状を示す。
治療的有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療的有効量」という用語は、疾患、障害及び／または状態に苦しんでいるかまたはそれらにかかり易い対象へ投与するときに、疾患、障害及び／または状態の症状（複数可）の発現を治療、診断、予防及び／または遅延させるために十分な量を意味する。治療的有効量は典型的に、少なくとも１回用量を含む投与計画によって投与されるものであることが当業者には分かるであろう。
治療：本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」または「治療すること」という用語は、特定の疾患、傷害及び／または状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に軽減、改善、緩和、阻害もしくは予防するために、それらの開始を遅らせるために、その重症度を軽減するために、及び／またはそれらの発生率を低下させるために用いられる任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病状の発症リスクを低下させる目的で、疾患の兆候を示さない及び／または疾患の初期兆候のみを示す対象へも施されてよい。
本明細書における終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に含まれるすべての数及び分画を含む（例えば、１～５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９、４、及び５を含む）。また、すべての数及びその分画は、「約」という用語によって修飾されると推測されることも理解されたい。
本発明の様々な態様は、以下の節において詳細に記載される。節の使用は、本発明を限定するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、単数及び複数の両方の指示対象を含む。
本発明はとりわけ、野生型またはコドン最適化フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするｒＡＡＶベクターを使用してＰＫＵを治療するための方法及び組成物を提供する。具体的には、本発明は、ＰＫＵの少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重症度、または頻度において低減されるように、ヒトＰＡＨをコードする、野生型またはコドン最適化配列を含むｒＡＡＶを有効用量で投与することによって、ＰＫＵを治療する方法を提供する。本明細書に記載される遺伝子治療法は、フェニルアラニンレベルの正常化に特に有効であった。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）
本発明は、ＰＫＵに罹患しているか、またはＰＫＵにかかり易い対象を治療するために使用され得る。ＰＫＵは、肝酵素ＰＡＨの遺伝子における突然変異によって特徴づけられる常染色体劣性の遺伝性代謝疾患であり、その遺伝子を非機能性にする。ＰＡＨは、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアミノ酸チロシンに代謝するために必要である。ＰＡＨ活性が低下すると、フェニルアラニンが蓄積し、尿中で検出可能なフェニルピルビン酸（フェニルケトンとしても既知である）に変換される。
本発明は、ＰＫＵに罹患しているか、またはＰＫＵにかかり易い対象を治療するために使用され得る。ＰＫＵは、肝酵素ＰＡＨの遺伝子における突然変異によって特徴づけられる常染色体劣性の遺伝性代謝疾患であり、その遺伝子を非機能性にする。ＰＡＨは、アミノ酸フェニルアラニン（Ｐｈｅ）をアミノ酸チロシンに代謝するために必要である。ＰＡＨ活性が低下すると、フェニルアラニンが蓄積し、尿中で検出可能なフェニルピルビン酸（フェニルケトンとしても既知である）に変換される。
フェニルアラニンは、大型の中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）である。ＬＮＡＡは、大型中性アミノ酸輸送体（ＬＮＡＡＴ）を介した血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する輸送について競合する。血中の過剰なＰｈｅは、輸送体を飽和させ、脳内の他のＬＮＡＡのレベルを低下させる傾向がある。これらの他のアミノ酸のうちのいくつかは、タンパク質及び神経伝達物質の合成に必要であるため、Ｐｈｅの蓄積は、脳の発達を妨げ、精神遅滞を引き起こす可能性がある。
脳の発達の妨げに加えて、この疾患は、発作、白皮症、多動、発育不全、皮膚発疹（湿疹）、小頭症、及び／または罹患する乳児の汗及び尿の「かび臭い」臭気（産生されるケトンの１つであるフェニル酢酸に起因する）を含む様々な症状を臨床的に呈し得る。未治療の小児は、典型的には、出生時は正常であるが、精神的及び社会的スキルが遅れ、頭部サイズが正常より著しく小さく、多くの場合、進行性の脳機能障害を示す。子供が成長及び発達するにつれて、多動、腕または脚の痙攣運動、脳波異常、皮膚発疹、振戦、発作、及び重度の学習障害を含む追加の症状が発現する傾向がある。ＰＫＵは、典型的には生後２～７日で実施されるほとんどの国の日常的な新生児スクリーニングパネルに一般的に含まれている。
ＰＫＵが十分に早期に診断された場合、発症した新生児は、比較的正常な脳の発達とともに成長することができるが、食事によって、または食事と薬物の組み合わせによって、Ｐｈｅレベルを管理及び制御することによってのみ、それが可能である。すべてのＰＫＵ患者は、最適な脳の発達のために、Ｐｈｅの少ない特別な食事を忠実に守らなければならない。食事は、肉、鶏肉、魚、卵、ナッツ、チーズ、豆類、牛乳及び他の乳製品等の、Ｐｈｅの多い食品を厳しく制限または排除する必要がある。ジャガイモ、パン、パスタ、及びトウモロコシ等のデンプン質の食品は監視されなければならない。乳幼児は、母乳の利点のすべてを受けるために依然として母乳で育てられてもよいが、その量も監視されなければならず、不足している栄養素の補充が必要となるであろう。多くのダイエット食品及びソフトドリンク中に存在する甘味料であるアスパルテームも、アスパルテームにはフェニルアラニンが含まれているため、避ける必要がある。
生涯を通して、患者は、補足的な処方食、丸薬、または特別に処方された食品を使用して、さもなければ低フェニルアラニン食に不足したであろうアミノ酸及び他の必要な栄養素を獲得することができる。いくつかのＰｈｅは、多くのタンパク質の合成に必要であり、適切な成長のために必要であるが、ＰＫＵ患者ではＰｈｅのレベルは厳密に制御されなければならない。さらに、ＰＫＵ患者は、通常フェニルアラニンに由来するチロシンの栄養補助剤を服用しなければならない。他の栄養補助剤としては、標準的なＰｈｅを含まない食事に欠けている長鎖脂肪酸の代わりとなり、神経発達を改善するための魚油、及び鉄またはカルニチンが挙げられ得る。
ＰＫＵの別の潜在的治療法は、特定の患者においてＰｈｅの血中レベルを低下させることができる、Ｐｈｅの酸化の補因子であるテトラヒドロビオプテリン（ＢＨ４）である。ＢＨ４療法に応答する患者は、食べることができる天然タンパク質の量を増加させることができる場合もある。しかしながら、ＢＨ４療法はＰＡＨ欠乏の根本的な問題を処理するものではなく、ＰＫＵ患者の１０％にのみ好適である。したがって、現在、免疫抑制を誘発しない、安全性の向上及び用量の減少を伴うＰＫＵの有効な治療が不足している。
ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターの設計
いくつかの態様において、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書に提供される。本開示の例示的なｒＡＡＶベクターを示す概略図を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、いくつかの実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーター、５’及び３’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）、及びイントロンを含む。
いくつかの態様において、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書に提供される。本開示の例示的なｒＡＡＶベクターを示す概略図を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、いくつかの実施形態において、本開示のｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーター、５’及び３’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）、及びイントロンを含む。
ベクターのＰＡＨ配列は、野生型またはコドン最適化変異体であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、野生型ＰＡＨヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、コドン最適化ＰＡＨ配列を含む。
本発明に好適なＰＡＨは、天然に存在するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質の少なくとも部分的な活性を置き換えることができる、またはＰＡＨ欠乏に関連する１つ以上の表現型もしくは症状を救出することができる、任意のタンパク質またはタンパク質の一部である。
いくつかの実施形態において、本発明に好適なＰＡＨヌクレオチド配列は、ｗｔ ｈＰＡＨタンパク質をコードするＰＡＨ配列を含む（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ４９８９７、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、本発明に好適なＰＡＨヌクレオチド配列は、野生型ヒトＰＡＨタンパク質をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。天然に存在するヒトＰＡＨアミノ酸配列を表１に示す：
様々な種類のプロモーターを、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターに使用することができる。これらには、例えば、遍在性、組織特異的、及び調節可能（例えば、誘導性または抑制性）プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態において、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。肝臓特異的プロモーターの例は、当該技術分野で既知であり、例えば、ヒトトランスサイレチンプロモーター（ｈＴＴＲ）、α－アンチトリプシンプロモーター、ヒト第ＩＸ因子ｐｒｏ／肝転写因子応答性オリゴマー、ＬＳＰ、及び塩基性アルブミンプロモーターが挙げられる。肝臓特異的プロモーターは、例えば、Ｚｈｉｊｉａｎ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ １６，ｎｏ ２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００８に記載され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは遍在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターはニワトリβアクチンプロモーターである。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ｍＲＮＡの転写及び／または翻訳を促進するための追加のエンハンサーまたは調節エレメント（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳ等）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、５’及び３’末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上のエンハンサーエレメントを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ポリ（Ａ）テールを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、イントロン等の１つ以上の小さなエレメントを含む。様々なイントロンが当該技術分野で既知である。本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターに好適なイントロンとしては、例えば、ＭＶＭイントロン、切断Ｆ．ＩＸイントロン、キメラβグロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖ＳＡイントロン、ＳＶ４０及び／またはαグロビン第１イントロンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＭＶＭイントロンを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＳＶ４０イントロンを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。ＷＰＲＥの様々な最適化形態または変異形態が当該技術分野で既知であり、とりわけＷＰＲＥ３、ＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧが挙げられる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）を含む。様々な種類のＣＲＭが本明細書に記載されるベクターでの使用に好適であり、例えば、肝臓特異的ＣＲＭ、神経細胞特異的ＣＲＭ及び／またはＣＲＭ８が挙げられる。いくつかの実施形態において、ベクターは、１つより多くのＣＲＭを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ベクターは、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＲＭを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、３つのＣＲＭ、例えば、３つのＣＲＭ８を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、転写安定性を増加させるため、より効率的な翻訳のため、及び／または免疫原性を低減するために、配列最適化される。いくつかの実施形態において、ＰＡＨは配列最適化される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶ１１ベクターである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ１である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ２である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ３である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ４である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ５である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ６である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ７である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ９である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ１０である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターはＡＡＶ１１である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは配列最適化される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶカプシドは修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ８カプシドが修飾される。
例示的なエレメント配列を下の表２に示す。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、表２に示されるベクターエレメント配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターエレメントを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、表２に示されるベクターエレメントヌクレオチド配列と同一のベクターエレメントヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７０％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７５％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも８０％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも８５％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも９５％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも９９％の同一性を有するコドン最適化ＰＡＨヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、配列番号１１～２７のうちの１つと同一のコドン最適化ＰＡＨヌクレオチド配列を含む。
疾患の治療のためのＰＡＨをコードするｒＡＡＶベクターの使用
本明細書に記載されるのは、ＰＡＨ酵素の欠乏に関連する疾患を治療する方法である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）等のＰＡＨ欠乏を有する対象を治療するのに好適である。治療の方法は、それを必要とする対象に本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含む。
本明細書に記載されるのは、ＰＡＨ酵素の欠乏に関連する疾患を治療する方法である。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）等のＰＡＨ欠乏を有する対象を治療するのに好適である。治療の方法は、それを必要とする対象に本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含む。
本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを使用して、ＰＡＨの欠乏に関連する任意の疾患または障害を治療することができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、それを必要とする対象への投与後もエピソームのままである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、それを必要とする対象への投与後にエピソームのままではない。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、対象のゲノムに組み込まれる。そのような組込みは、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮＳ）、ＡＲＣＵＳゲノム編集、及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム等の様々な遺伝子編集技術を使用することによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターを含む薬学的組成物は、それを必要とする対象を治療するために使用される。本発明のｒＡＡＶベクターを含む薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含む。好適な薬学的担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば油／水エマルション、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液等を含む。そのような担体は、従来の方法によって配合することができ、治療的有効量で対象に投与される。
ｒＡＡＶベクターは、好適な経路を介して、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、静脈内、腹腔内、皮下、または皮内投与によって投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは静脈内投与される。いくつかの実施形態において、皮内投与は、「遺伝子銃」または微粒子銃送達システムの使用による投与を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、非ウイルス性脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、ｒＡＡＶベクターを含む組成物は、１つ以上の希釈剤、緩衝液、リポソーム、脂質、脂質複合体を含み得る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、微粒子またはナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子内に含まれる。
いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨが対象において検出される。様々なＰＡＨの検出方法を使用することができ、例えば、組織サンプリング（生検を含む）及びＰＡＨの存在についてのスクリーニングを含むことができる。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約２～６週間に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約２週間に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約３週間に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約４週間に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約５週間に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約６週間に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後約２～６週間に対象の肝細胞において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後７週間超、対象の肝細胞において検出可能である。
いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも３ヶ月後、６ヶ月後、１２ヶ月後、２年後、３年後、４年後、５年後、６年後、７年後、８年後、９年後、または１０年後に、対象において検出可能である。したがって、いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも３ヶ月後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも６ヶ月後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも１２ヶ月後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも２年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも３年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも４年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも５年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも６年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも７年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも８年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも９年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与の少なくとも１０年後に対象において検出可能である。いくつかの実施形態において、機能的ＰＡＨは、ｒＡＡＶベクターの投与後、対象の残りの生涯にわたって対象において検出可能である。
いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、治療的有効量の活性ＰＡＨの産生をもたらす。
いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅの低下は、対象の血漿において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅの低下は、中枢神経系（ＣＮＳ）において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅの低下は、対象の脳組織において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅの低下は、対象の肝臓組織において検出される。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、ＰＡＨを含むｒＡＡＶを投与する前の対象のベースラインＰｈｅレベルと比較して、対象におけるＰｈｅを約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または約１０％低下させる。したがって、いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約９５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約９０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約８５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約８０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約７５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約７０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約６５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約６０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約５５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約５０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約４５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約４０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約３５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約３０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約２５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約２０％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約１５％低下させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＰｈｅを約１０％低下させる。
いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象においてＰｈｅ以外の大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）の増加をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、様々な作用様式が、例えば、ＬＮＡＡの産生の増加、ＬＮＡＡの輸送または運搬の増加、及び／またはＬＮＡＡの安定性の増加を含む、対象におけるＬＮＡＡの増加をもたらし得る。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡの増加は、対象の血漿において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡの増加は、中枢神経系（ＣＮＳ）において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡの増加は、対象の脳組織において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡの増加は、対象の肝臓組織において検出される。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはチロシンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはトリプトファンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはバリンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはイソロイシンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはメチオニンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはスレオニンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはロイシンである。いくつかの実施形態において、Ｐｈｅ以外のＬＮＡＡはヒスチジンである。
いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるチロシン（Ｔｙｒ）の増加をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、様々な作用様式が、例えば、Ｔｙｒの産生の増加、Ｔｙｒの輸送または運搬の増加、及び／またはＴｙｒの安定性の増加を含む、対象におけるＴｙｒの増加をもたらし得る。いくつかの実施形態において、Ｔｙｒの増加は、対象の血漿において検出される。いくつかの実施形態において、Ｔｙｒの増加は、対象の脳組織において検出される。いくつかの実施形態において、Ｔｙｒの増加は、対象の肝臓組織において検出される。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、ＰＡＨを含むｒＡＡＶを投与する前の対象のベースラインＴｙｒレベルと比較して、対象におけるＴｙｒを約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または約１０％増加させる。したがって、いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約９５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約９０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約８５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約８０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約７５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約７０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約６５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約６０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約５５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約５０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約４５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約４０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約３５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約３０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約２５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約２０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約１５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｙｒを約１０％増加させる。
いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるトリプトファン（Ｔｒｐ）の増加をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、様々な作用様式が、例えば、Ｔｒｐの産生の増加、Ｔｒｐの輸送または運搬の増加、及び／またはＴｒｐの安定性の増加を含む、対象におけるＴｒｐの増加をもたらし得る。いくつかの実施形態において、Ｔｒｐの増加は、対象の血漿において検出される。いくつかの実施形態において、Ｔｒｐの増加は、対象の脳組織において検出される。いくつかの実施形態において、Ｔｒｐの増加は、対象の肝臓組織において検出される。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、ＰＡＨを含むｒＡＡＶを投与する前の対象のベースラインＴｒｐレベルと比較して、対象におけるＴｒｐを約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または約１０％増加させる。したがって、いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約９５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約９０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約８５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約８０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約７５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約７０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約６５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約６０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約５５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約５０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約４５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約４０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約３５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約３０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約２５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約２０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約１５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象におけるＴｒｐを約１０％増加させる。
いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における神経伝達物質の増加をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、様々な作用様式が、例えば、神経伝達物質の産生の増加、神経伝達物質の輸送または運搬の増加、及び／または神経伝達物質の安定性の増加を含む、対象における神経伝達物質の増加をもたらし得る。いくつかの実施形態において、神経伝達物質の増加は、対象の脳組織において検出される。いくつかの実施形態において、神経伝達物質の増加は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）において検出される。いくつかの実施形態において、神経伝達物質は、セロトニン、ドーパミン、ノルアドレナリン、エピネフリン、またはノルエピネフリンである。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、ＰＡＨを含むｒＡＡＶを投与する前の対象の神経伝達物質のベースラインレベルと比較して、対象における１つ以上の神経伝達物質を約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または約１０％増加させる。したがって、いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約９５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約９０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約８５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約８０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約７５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約７０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約６５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約６０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約５５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約５０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約４５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約４０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約３５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約３０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約２５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約２０％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約１５％増加させる。いくつかの実施形態において、投与されるＰＡＨを含むｒＡＡＶは、対象における１つ以上の神経伝達物質を約１０％増加させる。
いくつかの実施形態において、対象にＡＡＶベクターを投与した後、対象において検出可能な機能的ＰＡＨのレベルは、ＰＡＨを含むｒＡＡＶの投与前に対象において検出可能な機能的ＰＡＨの量の約２～１０倍である。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを対象に投与した後、検出可能な機能的ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルを満たすか、または上回る。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターの投与後の機能的ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約２～３５倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約２倍である。いくつかの実施形態において、投与後の機能的ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約３倍である。いくつかの実施形態において、投与後の機能的ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約４倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約５倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約６倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約６倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約７倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約８倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約９倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約１０倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約１５倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約２０倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約２５倍である。いくつかの実施形態において、投与後の活性ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約３０倍である。いくつかの実施形態において、投与後の機能的ＰＡＨのレベルは、ヒト治療レベルの約３５倍である。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクターは、対象ごとに単回用量として送達される。いくつかの実施形態において、対象に、最小有効用量（ＭＥＤ）が送達される。本明細書で使用される場合、ＭＥＤは、ＰＡＨ活性を達成するために必要なｒＡＡＶ ＰＡＨベクター用量を指し、対象におけるＰｈｅレベルの低下をもたらす。
ベクター力価は、ベクター調製物のＤＮＡ含有量に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、定量ＰＣＲまたは最適化された定量ＰＣＲを使用して、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクター調製物のＤＮＡ含有量を決定する。最適化された定量ＰＣＲの例としては、二重液滴ＰＣＲが挙げられる。一実施形態において、投与量は、終点を含む、約１×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇ体重～約１×１０１３ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態において、投与量は１×１０ｎｖｇ／ｋｇである。別の実施形態において、投与量は１×１０１２ｖｇ／ｋｇである。特定の実施形態において、対象に投与されるｒＡＡＶ．ｈＰＡＨの用量は、少なくとも１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、５×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×ｌ０１１ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、２．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、４．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、４．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、６．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、６．５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、７．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、８．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、９．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨベクター組成物は、約１．０×１０９ｖｇ～約１．０×１０１５ｖｇの範囲の複製欠陥ウイルスの量を含むような投薬単位で配合され得る。本明細書で使用される場合、「投与量」という用語は、治療の過程で対象に送達される総投与量、または複数回の投与を含む治療の過程において、単回の投与で送達される量を指すことができる。
いくつかの実施形態において、投与量は、患者の血漿Ｐｈｅレベルを２５％以上低下させるのに十分である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、ＰＫＵの治療のための１つ以上の治療法と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、ＰＫＵ食と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、低タンパク質食と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、ＰＫＵ栄養補給食品もしくは栄養補助食品、または栄養処方食と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、中性アミノ酸療法と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、薬理学的薬物と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、サプロプテリン二塩酸塩とともに投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、Ｋｕｖａｎ（登録商標）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、ＰＫＵ代謝酵素と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨは、ペグバリアーゼと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ ＰＡＨはＰａｌｙｎｚｉｑ（登録商標）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶの投与は、他のＰＫＵ療法に先行するか、他のＰＫＵ療法と同時であるか、または他のＰＫＵ療法の投与後に送達される。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の実施例において明らかである。しかしながら、実施例は、本発明の実施形態を示す一方で、限定ではなく単なる例示として与えられることを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更及び修正は、実施例から当業者に明白になるであろう。
実施例１．ベクターの設計
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）配列及びその変異体を含む代表的なｒＡＡＶ発現構築物（ｒＡＡＶベクター）を作製する例示的な方法及び設計を、本実施例に提供する。
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）配列及びその変異体を含む代表的なｒＡＡＶ発現構築物（ｒＡＡＶベクター）を作製する例示的な方法及び設計を、本実施例に提供する。
この試験では、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ８）を使用した。ｒＡＡＶベクターの基本設計は、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲに隣接する発現カセットを含む。これらのＩＴＲは、ベクター産生細胞におけるＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ及び関連因子によるベクターゲノムの複製及びパッケージングを媒介する。典型的には、図１Ａ及び図１Ｂに示すように、発現カセットは、プロモーター、コード配列、ポリＡテール及び／またはタグを含む。ｈＰＡＨをコードする例示的な発現構築物を設計し、標準的な分子生物学的技法を用いて調製した。ｈＰＡＨのコード配列を、プロモーターｈＴＴＲ（ヒトトランスサイレチンプロモーター）の下流に挿入した。さらに、肝臓特異的シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）をプロモーターの上流に挿入し、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列をプロモーターの下流に挿入した。この調節及びプロモーターの組み合わせを試験して、以下の実施例に示すように、形質導入レベルを評価した。その後、発現構築物をＡＡＶベクターにライゲーションし、配列決定によって検証した。
コドン最適化
ｈＰＡＨのコード配列を、ＣｐＧ部位数、ＧＣ含有量、回文配列、反復塩基配列、ならびに制限部位及びスプライス部位の排除等の複数のパラメータに基づいてコドン最適化した。免疫応答を誘発し得るＣｐＧアイランド配列の数を６未満に減少させた。ＧＣ含有量は、約５７％（±３％）に維持した。１０ｂｐ以上であった反復塩基も除去した。
ｈＰＡＨのコード配列を、ＣｐＧ部位数、ＧＣ含有量、回文配列、反復塩基配列、ならびに制限部位及びスプライス部位の排除等の複数のパラメータに基づいてコドン最適化した。免疫応答を誘発し得るＣｐＧアイランド配列の数を６未満に減少させた。ＧＣ含有量は、約５７％（±３％）に維持した。１０ｂｐ以上であった反復塩基も除去した。
ＰＡＨを含む例示的な構築物の概略図を、図１Ａ～図１Ｄに示す。上記の構築物の任意の数の変形を行うことができる。例えば、１つより多くのプロモーターを使用してもよく、及び／またはＷＰＲＥ配列を導入してもよい。さらに、調節領域、プロモーター、及びイントロンの異なる組み合わせが企図される。
実施例２．コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むｒＡＡＶ８ベクターのインビトロ発現
本実施例は、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むｒＡＡＶ８ベクターが、インビトロでのｈＰＡＨの発現の誘導に有効であることを示す。
本実施例は、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むｒＡＡＶ８ベクターが、インビトロでのｈＰＡＨの発現の誘導に有効であることを示す。
野生型ｈＰＡＨ配列またはコドン最適化ｈＰＡＨ配列のいずれかを含むｒＡＡＶベクターによって、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌細胞株）細胞を感染させた。細胞溶解物中のＰＡＨ発現レベルを、ＰＡＨに対する抗体を用いたウエスタンブロットを使用して測定した。図２に示すように、コドン最適化ｈＰＡＨ配列（Ｓ０１）を含むｒＡＡＶ８は、野生型ｈＰＡＨ（Ｔ０１）を含むｒＡＡＶ８と比較して、ｈＰＡＨのより高い発現をもたらした。
実施例３．コドン最適化ｈＰＡＨ配列を有するｒＡＡＶ８ベクターのインビボ有効性
本実施例は、ＰＡＨノックアウト（ＰＡＨ－ＫＯ）マウスにおけるＰｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの血漿レベルを正常化する際の、コドン最適化ｒＡＡＶ８ ｈＰＡＨ構築物のインビボ有効性を示す。
本実施例は、ＰＡＨノックアウト（ＰＡＨ－ＫＯ）マウスにおけるＰｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒの血漿レベルを正常化する際の、コドン最適化ｒＡＡＶ８ ｈＰＡＨ構築物のインビボ有効性を示す。
ＰＡＨ－ＫＯマウスに、野生型ｈＰＡＨ配列（Ａ群、Ｔ０１）、またはコドン最適化ｈＰＡＨ配列（Ｂ群及びＣ群、Ｓ０１及びＳ０３）を含むｒＡＡＶベクターを注射した。ｒＡＡＶベクター構築物を、図１Ａ及び図１Ｂに示す。マウスに１×１０１３ｖｇ／ｋｇのベクターを投与し、ｒＡＡＶの投与前、ならびに注射後１週目、２週目、３週目、４週目、及び５週目に血漿試料を収集した。５週目にマウスを屠殺し、組織試料を採取した。さらに、マウスの毛色をモニタリングした。野生型マウス群及び未処置ＰＡＨ－ＫＯマウス群を、それぞれ陽性対照及び陰性対照として用いた。実験設計を下の表３に要約する。
ベクター媒介性のＰＡＨ発現の有効性を、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｒｙ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ）の血漿レベルをモニタリングすることにより決定した。ＰＡＨ酵素は、フェニルアラニンのプロセシングの最初のステップを担い、Ｔｙｒ及びＴｒｐの生合成に関与する。その結果を図３Ａに示す。コドン最適化構築物Ｓ０１（群Ｂ）及びＳ０３（群Ｃ）を投与したマウスは、未処置マウスまたは対照ベクターＴ０１（群Ａ）を投与したマウスと比較して、血漿中のＰｈｅ濃度が有意に低下したことを示した。投与の２週間後、Ｂ群及びＣ群のマウスにおけるＰｈｅのレベルは、野生型マウス（Ｄ群）のレベルと同様であった。さらに、Ｐｈｅレベルの低下は、単回用量投与の５週間後に維持されていた。Ｂ群及びＣ群のマウスにおけるＴｙｒ及びＴｒｐのレベルも、Ａ群または未処置ＫＯマウス（Ｅ群）のレベルと比較して増加した。
さらに、コドン最適化ヒトＰＡＨを含むｒＡＡＶ８の転写効率を、野生型ヒトＰＡＨを含むｒＡＡＶ８の転写効率と比較した。その結果を図３Ｂに示すが、ｒＡＡＶ８を含むコドン最適化ヒトＰＡＨとｒＡＡＶ８を含む野生型ヒトＰＡＨとの間には同等の形質導入があったが、コドン最適化ｈＰＡＨのより優れた転写があったことが示される。
マウスの毛色もモニタリングした。驚くべきことに、図４に示すように、コドン最適化ＰＡＨを有するｒＡＡＶ８の投与後３週目に毛色が補正された。
実施例４．コドン最適化ｈＰＡＨを含むｒＡＡＶ８ベクターを使用した遺伝子治療は、ＰＫＵバイオマーカーを用量依存的様式で正常化する。
本実施例は、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むｒＡＡＶ８ベクターを使用した遺伝子治療が、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの血漿レベルならびに毛色を用量依存的様式で正常化することを示す。
本実施例は、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むｒＡＡＶ８ベクターを使用した遺伝子治療が、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの血漿レベルならびに毛色を用量依存的様式で正常化することを示す。
ＰＡＨ－ＫＯマウスに、低用量（１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）または高用量（１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）の、コドン最適化ｈＰＡＨベクターを発現するｒＡＡＶ８ベクターを注射した。ｒＡＡＶの投与前、ならびに注射後１週目、２週目、３週目、４週目、及び５週目に血漿試料を収集し、各時点でＰｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐのレベルを測定した。さらに、マウスの毛色をモニタリングした。未処置ＰＡＨ－ＫＯマウス群を陰性対照として使用した。実験設計を下の表４に要約する。
その結果を図５に示す。コドン最適化ｈＰＡＨを投与したマウスでは、用量依存的様式で血漿Ｐｈｅレベルが有意に低下した。高用量のＳ０１を投与したマウスは、３週間後に１００％の毛色の変換を示した。高用量よりも１０倍低い低用量は、遅延動態による臨床的利益を示す。さらに、ＰＡＨ－ＫＯマウスの血漿中のチロシン及びトリプトファンを、Ｓ０１の低用量投与後に正常化した。
実施例５．コドン最適化ｈＰＡＨを含むＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子治療による、ＰＡＨ－ＫＯマウスの脳内における中性アミノ酸及び神経伝達物質レベルの正常化
本実施例は、ＰＡＨノックアウト（ＰＡＨ－ＫＯ）マウスの脳におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒのレベルを正常化する際の、コドン最適化ｒＡＡＶ８ ｈＰＡＨ構築物のインビボ有効性を示す。さらに、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子治療によって処置したＰＡＨ－ＫＯマウスにおいて、脳内のドーパミン及びセロトニンのレベルが回復した。
最初に、野生型（ｗｔ）及びＰＡＨ－ＫＯマウスの脳内のフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンのレベルを評価するために試験を行った。すべての大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）の中で、フェニルアラニンは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断してＬＮＡＡを輸送する大型中性アミノ酸輸送体（ＬＮＡＡＴ）に対して最も高い親和性を有する。Ｐｈｅが血中で過剰である場合、輸送体を飽和させ、したがって、脳内のＰｈｅ以外のＬＮＡＡのレベルを低下させる。これらのアミノ酸は、タンパク質及び神経伝達物質の合成に必要であるため、Ｐｈｅの蓄積は、脳の発達及び機能を妨げる。実際に、図６に示すように、ＷＴ及びＰＡＨ－ＫＯマウスの表現型決定により、ＬＮＡＡ（Ｐｈｅ、Ｔｒｙ及びＴｒｐ）及び神経伝達物質（ドーパミン、セロトニン、及びノルアドレナリン）がＰＡＨ－ＫＯマウスの脳において調節不全であることが確認された。表４に示すマウス群から５週目に抽出した脳組織において、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度を測定した。その結果を図７Ａに示す。脳におけるＰｈｅのレベルは、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を有するＡＡＶ８を用いた遺伝子治療によって処置されたＰＡＨ－ＫＯマウスにおいて、用量依存的様式で有意に低下した。一貫して、Ｔｙｒ及びＴｒｐの両方のレベルは、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むＡＡＶ８を用いた遺伝子治療によって処置されたＰＡＨ－ＫＯマウスの脳において、用量依存的様式で増加した。さらに、図７Ｂに示すように、処置したＰＡＨ－ＫＯマウスの脳において、セロトニン及びノルアドレナリンレベルの両方が、用量依存的様式で回復した。
本実施例は、ＰＡＨノックアウト（ＰＡＨ－ＫＯ）マウスの脳におけるＰｈｅ、Ｔｒｐ及びＴｙｒのレベルを正常化する際の、コドン最適化ｒＡＡＶ８ ｈＰＡＨ構築物のインビボ有効性を示す。さらに、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子治療によって処置したＰＡＨ－ＫＯマウスにおいて、脳内のドーパミン及びセロトニンのレベルが回復した。
最初に、野生型（ｗｔ）及びＰＡＨ－ＫＯマウスの脳内のフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンのレベルを評価するために試験を行った。すべての大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）の中で、フェニルアラニンは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断してＬＮＡＡを輸送する大型中性アミノ酸輸送体（ＬＮＡＡＴ）に対して最も高い親和性を有する。Ｐｈｅが血中で過剰である場合、輸送体を飽和させ、したがって、脳内のＰｈｅ以外のＬＮＡＡのレベルを低下させる。これらのアミノ酸は、タンパク質及び神経伝達物質の合成に必要であるため、Ｐｈｅの蓄積は、脳の発達及び機能を妨げる。実際に、図６に示すように、ＷＴ及びＰＡＨ－ＫＯマウスの表現型決定により、ＬＮＡＡ（Ｐｈｅ、Ｔｒｙ及びＴｒｐ）及び神経伝達物質（ドーパミン、セロトニン、及びノルアドレナリン）がＰＡＨ－ＫＯマウスの脳において調節不全であることが確認された。表４に示すマウス群から５週目に抽出した脳組織において、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐの濃度を測定した。その結果を図７Ａに示す。脳におけるＰｈｅのレベルは、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を有するＡＡＶ８を用いた遺伝子治療によって処置されたＰＡＨ－ＫＯマウスにおいて、用量依存的様式で有意に低下した。一貫して、Ｔｙｒ及びＴｒｐの両方のレベルは、コドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むＡＡＶ８を用いた遺伝子治療によって処置されたＰＡＨ－ＫＯマウスの脳において、用量依存的様式で増加した。さらに、図７Ｂに示すように、処置したＰＡＨ－ＫＯマウスの脳において、セロトニン及びノルアドレナリンレベルの両方が、用量依存的様式で回復した。
実施例６．コドン最適化ｈＰＡＨを含むＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子治療による、ＰＡＨ－ＫＯマウスにおけるＰｈｅレベルの長期安定化
本実施例は、ＰＡＨ－ＫＯマウスにおけるコドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子治療の長期インビボ有効性を示す（図８）。
本実施例は、ＰＡＨ－ＫＯマウスにおけるコドン最適化ｈＰＡＨ配列を含むＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子治療の長期インビボ有効性を示す（図８）。
ＰＡＨノックアウト（ＰＡＨ－ＫＯ）マウスに、低用量（１×１０１２ｖｇ／ｋｇ）、中間用量または高用量（１×１０１３ｖｇ／ｋｇ）の、コドン最適化ｒＡＡＶ８ ｈＰＡＨ構築物を注射した。ｒＡＡＶ８の投与前、ならびに注射後７日、１４日、３５日、５６日、９８日、１４０日及び１８２日に血漿試料を収集した。フェニルアラニンのレベルを血漿中で測定し、対照（Ｃ２２）で処置したＰＡＨ－ＫＯマウス及び対照Ｃ２２で処置したｗｔマウスにおけるＰｈｅのレベルと比較した。その結果を図８に示す。
Ｐｈｅのレベルは、対照Ｃ２２で処置したＰＡＨ－ＫＯマウスと比較して、コドン最適化ｒＡＡＶ８ ｈＰＡＨ構築物で処置したＰＡＨ－ＫＯマウスにおいて有意に低下した。ｈＰＡＨ処置を受けたマウスにおけるＰｈｅレベルは、Ｃ２２対照で処置したｗｔマウスにおけるＰｈｅレベルと同等であった。
１×１０１３ｖｇ／ｋｇの高用量では、血漿Ｐｈｅレベルは、ベースラインレベルと同様の低レベルで維持され、投与後７日、１４日、３５日、５６日、９８日、１４０日、及び１８２日のｗｔマウスにおけるＰｈｅレベルと同等であり、ＰＡＨ－ＫＯマウスにおけるＡＡＶ８コドン最適化ｈＰＡＨを用いた遺伝子治療の長期的有効性を実証した。
等価物及び範囲
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に記載されるものである。
当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に記載されるものである。
Claims (40)
- ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするコドン最適化配列を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）であって、前記コドン最適化配列が、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７０％の同一性を有する、前記組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）。
- 前記コドン最適化配列が、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
- 前記コドン最適化配列が、配列番号１１～２７のうちの１つと同一である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８カプシドをコードする、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶ８カプシドが、野生型ＡＡＶ８カプシドと比較して改善された肝臓トロピズムを有する修飾ＡＡＶ８カプシドである、請求項４に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＡＡＶ８カプシドが、前記野生型ＡＡＶ８カプシドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ｒＡＡＶが、ＷＰＲＥ配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＷＰＲＥ配列が、天然に存在するＷＰＲＥ配列である、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＷＰＲＥ配列が、修飾ＷＰＲＥ配列である、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ｒＡＡＶが、肝臓特異的プロモーターをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記肝臓特異的プロモーターが、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）である、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ｒＡＡＶが、シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ベクターが、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＣＲＭリピートを含む、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ＣＲＭが、ＣＲＭ８である、請求項１２または１３に記載のｒＡＡＶ。
- 前記ｒＡＡＶが、前記ＰＡＨ配列の上流にイントロンをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
- 前記イントロンが、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンである、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
- フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、
ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をコードするコドン最適化配列であって、配列番号１１～２７のうちの１つと少なくとも７０％の同一性を有する前記コドン最適化配列、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与することを含む、前記方法。 - 前記ｒＡＡＶを投与することが、対照と比較して、前記対象における血漿フェニルアラニン（Ｐｈｅ）レベルの低下をもたらす、請求項１７に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶを投与することが、対照と比較して、前記対象における血漿チロシンレベルの増加をもたらす、請求項１７または１８に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶを投与することが、対照と比較して、前記対象における血漿トリプトファンレベルの増加をもたらす、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対照が、前記対象における治療前レベルである、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対照が、履歴データに基づく参照レベルである、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記コドン最適化配列が、配列番号１１～２７のうちの１つと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記コドン最適化配列が、配列番号１１～２７のうちの１つと同一である、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ８カプシドをコードする、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＡＡＶ８カプシドが、野生型ＡＡＶ８カプシドと比較して改善された肝臓トロピズムを有する修飾ＡＡＶ８カプシドである、請求項２５に記載の方法。
- 前記ＡＡＶ８カプシドが、前記野生型ＡＡＶカプシドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する、請求項２５に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、ＷＰＲＥ配列をさらに含む、請求項１７～２７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＷＰＲＥ配列が、天然に存在するＷＰＲＥ配列である、請求項２８に記載の方法。
- 前記ＷＰＲＥ配列が、修飾ＷＰＲＥ配列である、請求項２８に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、肝臓特異的プロモーターをさらに含む、請求項１７～３０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記肝臓特異的プロモーターが、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）である、請求項３１に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、シス作用調節モジュール（ＣＲＭ）を含む、請求項１７～３２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ベクターが、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＣＲＭリピートを含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記ＣＲＭが、ＣＲＭ８である、請求項３３または３４に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、前記ＰＡＨ配列の上流にイントロンをさらに含む、請求項１７～３５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記イントロンが、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンである、請求項３６に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが、約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１７～３７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが全身投与される、請求項１７～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶが静脈内投与される、請求項１７～３８のいずれか１項に記載の方法。
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