JP2023505851A

JP2023505851A - ハンター病治療用のアデノ随伴ウイルスベクター

Info

Publication number: JP2023505851A
Application number: JP2022535258A
Authority: JP
Inventors: チェ、ヴィヴィアン; リ、シン
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-02-13
Also published as: TW202136515A; CO2022009604A2; CA3164189A1; WO2021119053A1; IL293684A; US20210332383A1; AU2020401116A1; AR120709A1; KR20220112283A; US11981912B2; MX2022007135A; BR112022011332A2; EP4072595A1

Abstract

本開示はとりわけ、ＡＡＶ８キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドと、ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードするコドン最適化配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。本開示は、ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）である対象の治療方法であって、その治療が必要な対象に、ＡＡＶ８キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドと、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）をコードする核酸配列に機能可能に連結したプロモーターとを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、その投与により、その対象におけるＩ２Ｓ酵素活性を向上させる方法も提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１２月１０日に出願した米国特許出願第６２／９４５，９２０号に基づく利益及び優先権を主張するものであり、その特許出願の内容は、本明細書に援用される。

ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）としても知られている）は、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）という酵素の欠損または欠如を原因とするライソゾーム蓄積病である。イズロン酸－２－スルファターゼは、グリコサミノグリカンまたはＧＡＧとしても知られる所定のムコ多糖の分解及びリサイクルに関与する。そのため、ハンター症候群では、ＧＡＧが全身の細胞に蓄積し、それにより、体内で様々な細胞及び器官の正常な機能が妨げられ、その結果、相当数の重篤な症状が生じる。ハンター症候群の症例の多くでは、罹患している個体のニューロン及び髄膜にＧＡＧが大量に蓄積することで、様々な形態の中枢神経系（ＣＮＳ）症状、認識能障害及び発達遅延が生じる。

ハンター症候群の管理では、酵素補充療法（ＥＲＴ）を含む様々な治療選択肢が用いられている。ＥＲＴによる認可済みの治療処置としては、組み換えＩ２Ｓ酵素の静脈内投与が挙げられる。しかしながら、静脈内投与されるＩ２Ｓ酵素には、ＣＮＳの細胞及び組織への分布が悪いこと、ならびに心臓、肺及び骨のような深部の体細胞組織の細胞への分布が悪いことを含め、様々な制限がある。ハンター症候群の治療は依然として難問である。

疾患の治療には、治療用タンパク質をｉｎｖｉｖｏで産生させるベクターを用いるのが望ましいが、所望される治療用タンパク質のｉｎｖｉｖｏでの産生不良を含む様々な要因によって制限されている。

本発明は、Ｉ２Ｓ（本願全体を通じて、Ｉ２ＳまたはＩＤＳという）をコードする効率的かつロバストな組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。本発明は部分的には、Ｉ２Ｓ配列を含む最適化済みのｒＡＡＶベクターが、ｉｎｖｉｖｏでＩ２Ｓをロバストに発現させるという驚くべき発見に基づいている。

いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＶ８キャプシドと、ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードする配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。

いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＶ９キャプシドと、ヒトイズロン酸－２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードする配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶは、コドン最適化されたヒトＩ２Ｓ酵素をコードする。いくつかの実施形態では、そのコドン最適化されたヒトＩ２Ｓは、配列番号１１または１２から選択したヌクレオチド配列を有する。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列は、配列番号６との同一性が少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％である配列を含む。いくつかの実施形態では、そのヒトＩ２Ｓ酵素は、配列番号６との同一性が少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのヒトＩ２Ｓ酵素は、配列番号６のヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素のアミノ酸配列は、配列番号１と同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素のアミノ酸配列は、配列番号１と同一の配列である。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素のアミノ酸配列は、配列番号２との同一性が少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％である配列を含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列は、配列番号２と同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素のアミノ酸配列は、配列番号２と同一の配列である。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするコドン最適化配列は、配列番号１１または１２との同一性が少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％である配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするコドン最適化配列は、配列番号１１または１２と同一の配列を含む。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、肝臓特異的プロモーターをさらに含む。

いくつかの実施形態では、その肝臓特異的プロモーターは、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）である。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲ、Ｉ２Ｓ配列の上流のイントロン、ならびにシス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、ユビキタスプロモーターをさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、５’逆位末端反復配列及び３’逆位末端反復配列、Ｉ２Ｓ配列の上流のイントロン、ならびにシス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）を含む。

いくつかの実施形態では、そのＳＵＭＦ１の前には、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）がある。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、ＷＰＲＥ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、そのＷＰＲＥ配列は、バリアントＷＰＲＥ配列または最適化ＷＰＲＥ配列である。いくつかの実施形態では、そのＷＰＲＥ配列は、配列番号７との同一性が少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％であるヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、そのＷＰＲＥ配列は、配列番号７を有するヌクレオチド配列によってコードされる。

いくつかの実施形態では、そのイントロンは、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）またはＳＶ４０のイントロンである。いくつかの実施形態では、そのイントロンは、β－グロビン／ＩｇＧキメライントロンである。

いくつかの実施形態では、そのＣＲＭは、肝臓特異的ＣＲＭである。

いくつかの実施形態では、そのＣＲＭは、ニューロン特異的ＣＲＭである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＭは、筋肉特異的ＣＲＭである。

いくつかの実施形態では、そのＣＲＭは、ＣＲＭ８である。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、ＣＲＭを少なくとも３つ含む。

いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＶ８キャプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、ｒＡＡＶベクターを提供し、該ベクターは、ａ）５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、ｂ．）シス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）、ｃ．）肝臓特異的プロモーター、ｄ）マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ｅ．ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードする配列、ｆ．）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びｇ．）３’ＩＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列は、野生型配列またはコドン最適化配列である。

いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６との同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である配列である。いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６と同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１または１２との同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である配列である。いくつかの実施形態では、ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１または１２と同一の配列である。

いくつかの実施形態では、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）をコードする配列及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

いくつかの態様では、本発明は、ＡＡＶ９キャプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、ｒＡＡＶベクターを提供し、該ベクターは、ａ．）５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、ｂ．）シス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）、ｃ）ユビキタスプロモーター、ｄ．）マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ｅ．）ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードする配列、ｆ．）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びｇ．）３’ＩＴＲを含む。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡｐｏＢを含まない。

ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）である対象の治療方法であって、その治療が必要な対象に、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することを含む方法。

ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）である対象の治療方法であって、その治療が必要な対象に、ＡＡＶ８キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドと、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）をコードする核酸配列に機能可能に連結したプロモーターとを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、その投与により、その対象において、Ｉ２Ｓ酵素活性を向上させる方法。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、その対象の血清において検出される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、その対象の肝臓において検出される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性は、中枢神経系（ＣＮＳ）において検出される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、その対象の脳において検出される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、脳の海馬、視床、脳梁、皮質、小脳または線条体において検出される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、対象の腎臓などにおいて検出される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、対象の心臓において検出される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、対象の肺において検出される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、対象の骨髄において検出される。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、対象の腎臓において検出される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性の向上は、１回投与してから少なくとも３０日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日またはそれを上回る日数、維持される。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性レベルは、ヘパリン硫酸アッセイによって測定する。

いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ活性レベルは、デルマタン硫酸アッセイによって測定する。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の血清におけるＧＡＧのレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の肝臓におけるＧＡＧのレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の腎臓などにおけるＧＡＧのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の心臓におけるＧＡＧのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の肺におけるＧＡＧのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の骨髄におけるＧＡＧのレベルを低下させる。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の腎臓におけるＧＡＧのレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象のＣＮＳにおけるＧＡＧのレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、その対象の脳におけるＧＡＧのレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶを投与することにより、脳の海馬、視床、脳梁、皮質、小脳または線条体におけるＧＡＧのレベルを低下させる。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶは、静脈内投与する。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶは、髄腔内投与する。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶは、約５×１０^９ｖｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶを投与しても、免疫応答を誘発しない。

本発明の様々な態様を、以下の節に詳細に記載する。節の使用は、本発明を限定するものではない。それぞれの節は、本発明のいずれの態様にも適用できる。本願では、「または」の使用は、別段の記載のない限り、「及び／または」を意味する。本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の付された単数形には、単数の指示対象及び複数の指示対象の両方が含まれる。

図１Ａは、ｈＩＤＳ発現ベクターのための発現コンストラクトの概略図である。図１Ｂは、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥの最適化済み発現コンストラクトを示す一連の概略図である。ＩＴＲは、逆位末端反復配列であり、ｐＴＢＧは、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターであり、ｈＴＴＲは、ヒトトランスサイレチンプロモーターであり、ＣＲＭは、シス作動性調節モジュールであり、ＭＶＭイントロンは、マウス微小ウイルスイントロンであり、ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメントであり、ＢＧＨｐＡは、ウシ成長ホルモンターミネーター＋ポリＡであり、ＣＯＯＬｏｐｔは、ＣＯＯＬ（ＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＯｎｌｉｎｅ）プラットフォームによってコドン最適化したことであり、ＡＵＳｏｐｔは、内部のコドン使用頻度表によってコドン最適化したことである。図２は、ｈＩＤＳ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１の最適化済み発現コンストラクトを示す一連の概略図である。ＩＴＲは、逆位末端反復配列であり、ｐＴＢＧは、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーターであり、ｈＴＴＲは、ヒトトランスサイレチンプロモーターであり、ＣＲＭは、シス作動性調節モジュールであり、ＭＶＭイントロンは、マウス微小ウイルスイントロンであり、ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＨＷＰ）転写後調節エレメントであり、ＢＧＨｐＡは、ウシ成長ホルモンターミネーター＋ポリＡであり、ＣＯＯＬｏｐｔは、ＣＯＯＬ（ＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＯｎｌｉｎｅ）プラットフォームによってコドン最適化したことであり、ＡＵＳｏｐｔは、内部のコドン使用頻度表によってコドン最適化したことである。図３は、指定のｒＡＡＶベクターの注射から０日後、２日後、７日後、２１日後、８週間後及び１２週間後のマウス血清中のＩ２Ｓの総濃度を示すグラフである。そのｈＩ２Ｓ濃度は、ＥＬＩＳＡによって求めた。図４Ａは、指定のｒＡＡＶベクターの注射から０日後、２日後、７日後、２１日後、８週間後及び１２週間後のマウス血清中のＩ２Ｓ活性を示すグラフである。図４Ｂは、マウス組織中のＩ２Ｓ濃度を示すグラフである。図４Ｃは、マウス組織中のＩ２Ｓ活性を示すグラフである。図４Ｄは、ｈＩＤＳ発現ベクターを投与された動物における相対的なＩ２Ｓ活性を野生型の場合と比較した結果を示すグラフである。図５Ａは、マウスの脳におけるＧＡＧレベルを示すグラフである。図５Ｂは、マウスの肝臓におけるＧＡＧレベルを示すグラフである。図５Ｃは、指定のｒＡＡＶベクターの注射から１２週目のマウスの腎臓におけるＧＡＧレベルを示すグラフである。図６Ａは、指定のｒＡＡＶベクターの注射から１２週目のマウスの肝臓及び腎臓などにおけるヘパラン硫酸（ＨＳ）ＧＡＧ及びデルマタン硫酸（ＤＳ）ＧＡＧのレベルを示すグラフである。ダネットの方法を用いた多重比較とともに、一元ＡＮＯＶＡを未処置のノックアウト動物に対して行った。＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。図６Ｂは、指定のｒＡＡＶベクターの注射から１２週目に、肝臓及び腎臓などにおけるヘパラン硫酸（ＨＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）のレベルが、コントロール動物と比べて低下した割合（％）を示すグラフである。図７Ａは、肝臓におけるＬＡＭＰ１レベルを、ＬＡＭＰ１の免疫組織化学染色（ライソゾーム蓄積区画の縮小を検出するバイオマーカーとして機能する）によって求めたものを示すグラフである。ダネットの方法を用いた多重比較とともに、一元ＡＮＯＶＡを未処置のノックアウト動物に対して行った。＊＊＊によって、Ｐ＜０．００１であることを示した。図７Ｂは、脳におけるＬＡＭＰ１レベルを、ＬＡＭＰ１の免疫組織化学染色（ライソゾーム蓄積区画の縮小を検出するバイオマーカーとして機能する）によって求めたものを示すグラフである。ダネットの方法を用いた多重比較とともに、一元ＡＮＯＶＡを未処置のノックアウト動物に対して行った。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。図８は、ｈＩ２Ｓ及びＳＵＭＦ１を発現するベクターを注射してから２日後、７日後及び２１日後のマウスの血清における総ｈＩ２Ｓ濃度を示すグラフである。図９は、指定のｒＡＡＶベクターの注射から０日後、２日後、７日後及び２１日後のマウスの血清におけるｈＩ２Ｓの活性を示すグラフである。図１０は、注射から３６４日後までのＩ２Ｓ濃度を示すグラフである。図１１は、注射から３６４日後までのＩ２Ｓ濃度を示すグラフである。図１２Ａは、ｈＩ２Ｓを投与したマウスにおけるＩ２Ｓ濃度を血清及び組織において、１２カ月にわたって、ＥＬＩＳＡによって測定した場合のグラフである。図１２Ｂは、血清及びマウスの組織におけるＩ２Ｓ活性のグラフである。図１２Ｃは、マウスの組織におけるＧＡＧレベルのグラフである。図１２Ｄは、マウスの組織におけるＧＡＧレベルの低下率（％）のグラフである。図１２Ｅは、ライソゾーム蓄積区画のバイオマーカーであるＬＡＭＰ１染色のグラフである。ダネットの方法を用いた多重比較とともに、未処置のノックアウト動物に対して一元ＡＮＯＶＡを用いて、統計処理を行った。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１であり、ｎｓは、有意差なしである。図１３Ａは、Ｉ２Ｓを投与したマウスにおいて、上腕骨における骨の体積をｍｉｃｒｏＣＴによって測定したものをコントロール動物と比較したグラフを示しており、図１３Ｂは、頬骨弓における骨の体積をｍｉｃｒｏＣＴによって測定したものをコントロール動物と比較したもののグラフを示している。図１４Ａは、低用量のｈＩ２Ｓを投与したマウスにおけるＩ２Ｓ濃度を、ＥＬＩＳＡによって血清において９０日にわたって測定したもののグラフを示している。図１４Ｂは、血清におけるＩ２Ｓ活性のグラフである。図１４Ｃは、マウスの組織におけるＩ２Ｓ濃度のグラフである。図１４Ｄは、マウスの組織におけるＩ２Ｓ活性のグラフである。図１４Ｅは、低用量のｈＩ２Ｓを投与した動物における相対的なＩ２Ｓ活性を野生型動物の場合と比べたグラフである。図１４Ｆは、ｈＩ２Ｓを投与したマウスにおける体細胞組織（肝臓、脾臓、心臓及び腎臓を含む）でのＬＡＭＰ１染色レベルを示すグラフである。図１４Ｇは、その脳におけるＬＡＭＰ１染色レベルを示すグラフである。図１５Ａは、低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物におけるＩ２Ｓ血清中濃度を示すグラフである。図１５Ｂは、低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物におけるＩ２Ｓ血清中活性を示すグラフである。図１５Ｃは、高用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物におけるＩ２Ｓ血清中濃度を示すグラフである。図１５Ｄは、高用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物におけるＩ２Ｓ血清中活性を示すグラフである。図１６は、個々の非ヒト霊長類動物におけるＩ２Ｓの濃度及び酵素活性のプロファイル、ならびに同じ動物における抗Ｉ２ＳＡＤＡ活性のプロファイルを示している。図１７Ａは、低用量のｈＩ２Ｓを投与した個々の非ヒト霊長類動物の肝臓におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。図１７Ｂは、高用量のｈＩ２Ｓを投与した個々の非ヒト霊長類動物の肝臓におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。図１８Ａは、高用量及び低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物の腎臓におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。図１８Ｂは、高用量及び低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物の脾臓におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。図１８Ｃは、高用量及び低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物の肺におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。図１８Ｄは、高用量及び低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物の心臓におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。図１８Ｅは、高用量及び低用量のＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物の骨髄におけるｈＩ２Ｓ濃度を示している。

定義
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：本明細書で使用する場合、「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶ」または「組み換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）」という用語には、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ならびにヒツジＡＡＶが含まれるが、これらに限らない（例えば、Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ２，ｃｈａｐｔｅｒ６９（４ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７８：６３８１－６３８８（２００４）、Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３３０：３７５－３８３（２００４）を参照されたい）。典型的には、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することができ、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、染色体外の状態で存在できる。ＡＡＶベクターは、遺伝子療法で一般的に使用されている。

投与：本明細書で使用する場合、「投与」または「導入」という用語は、ｒＡＡＶベクターを効率的に送達させる方法または経路によって、Ｉ２ＳをコードするｒＡＡＶベクターを対象に送達する文脈において、同義的に使用する。ｒＡＡＶベクターの投与（例えば、静脈内投与、皮下投与または経皮投与を含む）のための様々な方法が、当該技術分野において知られている。ｒＡＡＶベクターの経皮投与は、「遺伝子銃」またはバイオリスティック粒子送達システムを用いることによって行うことができる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のような非ウイルス化学粒子、エクソソームのような非ウイルス生体分子及び／または細胞外ベシクルを介して、ｒＡＡＶベクター及び／または導入遺伝子発現カセット及び／または最適化されたＩＤＳ導入遺伝子配列及び／またはその遺伝子発現カセットのいずれかの組成物を投与する。

動物：本明細書で使用する場合、「動物」という用語は、動物界の一員のいずれかを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、あらゆる発育段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、あらゆる発育段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類及び／または蠕虫類が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物及び／またはクローンであってよい。

認識されている免疫グロブリンポリペプチドとしては、κ軽鎖及びλ軽鎖、ならびにα重鎖、γ重鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ重鎖、ε重鎖及びμ重鎖、または他の種における同等物が挙げられる。完全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端における約１１０アミノ酸の可変領域と、ＣＯＯＨ末端におけるκ定常領域またはλ定常領域を含む。完全長免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）は同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）と、上記の重鎖定常領域のうちの１つ、例えばγ定常領域（約３３０アミノ酸）を含む。

およそまたは約：本明細書で使用する場合、対象となる１つ以上の値に付されているような「およそ」または「約」という用語は、示されている基準値と同程度である値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載のない限り、または文脈から明らかにそうでない場合を除き、いずれかの方向（プラス方向またはマイナス方向）において、示されている基準値から２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれを下回る割合に収まる値の範囲を指す（ただし、このような数は、考え得る値の１００％を上回らない）。

生物活性がある：本明細書で使用する場合、「生物活性がある」という語句は、生物システム及び特に生物において活性を有するいずれかの薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与したときに、その生物に対して生体作用を及ぼす薬剤は、生物活性があるとみなす。ペプチドが、生物活性のあるものである特定の実施形態では、そのペプチドの部分のうち、そのペプチドの生物活性の少なくとも１つを有する部分は典型的には、「生物活性」部分という。

機能的等価物または機能的誘導体：本明細書で使用する場合、「機能的等価物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の関連では、元の配列の生物活性と実質的に同様である生物活性（機能または構造のいずれか）を保持する分子を示す。機能的誘導体または機能的等価物は、天然の誘導体であってもよいし、または合成によって調製したものであってもよい。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物活性が保存されていることを条件として、１つ以上のアミノ酸が置換、欠失または付加されているアミノ酸配列が挙げられる。その置換するアミノ酸は望ましくは、置換されたアミノ酸の物理化学的特性と同様である物理化学的特性を有する。望ましい同様の物理化学的特性としては、同様の電荷、嵩、疎水性、親水性などが挙げられる。

Ｉｎｖｉｔｒｏ：本明細書で使用する場合、「ｉｎｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的な環境、例えば、試験管、反応容器、細胞培養液などにおいて生じる事象を指す。

Ｉｎｖｉｖｏ：本明細書で使用する場合、「ｉｎｖｉｖｏ」という用語は、ヒト及びヒト以外の動物のような多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系との関連では、この用語を用いて、（例えばｉｎｖｉｔｒｏ系とは対照的に、）生細胞内で生じる事象を指してもよい。

ＩＲＥＳ：本明細書で使用する場合、「ＩＲＥＳ」という用語は、いずれかの適切な内部リボソーム侵入部位配列を指す。

単離：本明細書で使用する場合、「単離」という用語は、（１）最初に産生されたときに（天然及び／または実験設定におけるかは問わない）付随していた構成成分の少なくとも一部から分離されているか、及び／または（２）人間の手によって生成、調製及び／または製造された物質及び／または実体を指す。単離した物質及び／または実体は、最初にその物質及び／または実体に付随していた他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％または１００％から分離されていてよい。いくつかの実施形態では、単離した薬剤の純度は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、実質的に１００％または１００％である。本明細書で使用する場合、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合には、「純粋」である。本明細書で使用する場合、「単離細胞」という用語は、多細胞生物内に含まれていない細胞を指す。

ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用する場合、アミノ酸がペプチド結合によって連なった連続的な鎖を指す。この用語は、いずれかの長さのアミノ酸鎖を指す目的で使用されるが、この用語が、長い鎖に限定されず、ペプチド結合によって結合された２つのアミノ酸を含む最短の鎖も指すことができることを当業者は理解するであろう。当業者に知られているように、ポリペプチドは、プロセシング及び／または修飾されていることもある。

タンパク質：「タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、別個の単位として機能する１つ以上のポリペプチドを指す。１つのポリペプチドが、別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成する目的で、他のポリペプチドと永続的または一時的に物理的結合をする必要がない場合には、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同義的に使用し得る。別個の機能単位が、物理的に結合し合う２つ以上のポリペプチドで構成されている場合には、「タンパク質」という用語は、物理的に結合し、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。

調節エレメント：本明細書で使用する場合、「調節エレメント」という用語は、転写制御エレメント、特に、遺伝子の転写を調節及び／または制御できる非コードのシス作動性転写制御エレメントを指す。調節エレメントは、転写因子結合部位を少なくとも１つ、例えば、組織特異的転写因子に対する結合部位を少なくとも１つ含む。本明細書に記載されている実施形態では、調節エレメントは、肝臓特異的転写因子に対する結合部位を少なくとも１つ有する。典型的には、調節エレメントのない状態で、プロモーターのみから遺伝子を転写する場合と比べて、調節エレメントは、プロモーターによって駆動される遺伝子発現を増加または増強させる。すなわち、調節エレメントは特に、エンハンサー配列を含むが、転写を増強する調節エレメントは、はるかに上流にある典型的なエンハンサー配列に限定されず、そのエレメントが調節する遺伝子からの距離がいずれでも、調節エレメントは存在し得ることを理解されたい。当該技術分野で理解されているように、転写を調節する配列は、ｉｎｖｉｖｏで調節される遺伝子の上流（例えばプロモーター領域）または下流（例えば３’ＵＴＲ）のいずれかにあってもよく、その遺伝子のすぐ近くまたはその遺伝子から遠く離れた位置にあってもよい。調節エレメントは、天然の配列、そのような調節エレメントまたは調節エレメントのいくつかのコピー、例えば非天然の配列（の一部）を組み合わせたもののいずれかを含むことができる。したがって、調節エレメントは、所望の発現レベルを実現するために、天然の調節エレメントと、最適化または操作された調節エレメント含む。

対象：本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたはいずれかのヒト以外の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類動物）を指す。ヒトには、出生前の形態と出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は、患者であることができ、患者とは、疾患の診断または治療のために、医療提供者を受診しているヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と同義的に使用されている。対象は、疾患もしくは障害に罹患していることができ、または疾患もしくは障害に罹患しやすいが、その疾患もしくは障害の症状を発現していてもしていなくてもよい。

実質的に：本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、該当する特徴または特性が完全またはほぼ完全な程度または度合いである定性的状態を指す。生物現象及び化学現象では、完結したり及び／または完全な状態まで進行したり、あるいは、疑いの余地のない結果が達成されたりまたは回避されたりすることは、あってもまれであることを生物分野における当業者は理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物現象及び化学現象につきものである、完全性の潜在的欠如を示す目的で使用する。

実質的な相同性：「実質的な相同性」という語句は、本明細書では、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較結果を指す目的で使用する。当業者には明らかであるように、２つの配列は概して、対応する位置に相同な残基を含む場合に、「実質的に相同」であるとみなす。相同な残基は、同一な残基であってもよい。あるいは、相同な残基は、適宜、同様の構造的及び／または機能的特徴を有する非同一な残基であってもよい。例えば、当業者には周知であるように、ある特定のアミノ酸は典型的には、「疎水性」アミノ酸もしくは「親水性」アミノ酸、及び／または「極性」側鎖を有するアミノ酸、もしくは「非極性」側鎖を有するアミノ酸として分類される。１つのアミノ酸を、同じタイプの別のアミノ酸に置換することは、「相同な」置換とみなせる場合が多い。

当該技術分野において周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴのような市販のコンピュータープログラムで利用できるアルゴリズムを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較し得る。このようなプログラムの例示的なものは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，“ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒａｍｓ”，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。上記のプログラムは典型的には、相同な配列を特定するのに加えて、相同性の程度の尺度を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、関連する残基領域にわたって、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを上回る割合が相同である場合に、実質的に相同とみなす。いくつかの実施形態では、その関連する領域は、完全配列である。いくつかの実施形態では、その関連する領域は、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個またはそれを上回る数の残基である。

実質的な同一性：「実質的な同一性」という語句は、本明細書では、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較結果を指す目的で使用する。当業者には明らかであるように、２つの配列は概して、対応する位置に同一な残基を含む場合に、「実質的に同一」であるとみなす。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、ならびにアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴのような市販のコンピュータープログラムで利用できるアルゴリズムを含む様々なアルゴリズムのいずれかを用いて比較し得る。このようなプログラムの例示的なものは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－４１０，１９９０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７、Ｂａｘｅｖａｎｉｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏｔｈｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８及びＭｉｓｅｎｅｒ，ｅｔａｌ．，（ｅｄｓ．），ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。上記のプログラムは典型的には、同一の配列を特定するのに加えて、同一性の程度の尺度を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、関連する残基領域にわたって、それらの対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを上回る割合が同一である場合に、実質的に同一とみなす。いくつかの実施形態では、その関連する領域は、完全配列である。いくつかの実施形態では、その関連する領域は、少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１２５個、１５０個、１７５個、２００個、２２５個、２５０個、２７５個、３００個、３２５個、３５０個、３７５個、４００個、４２５個、４５０個、４７５個、５００個またはそれを上回る数の残基である。

～に罹患している：疾患、障害及び／または状態「に罹患している」個体は、その疾患、障害及び／または状態と診断されているか、あるいはその疾患、障害及び／または状態の症状の１つ以上を示している。

治療有効量：本明細書で使用する場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害及び／または状態に罹患しているか、あるいは疾患、障害及び／または状態に罹患しやすい対象に投与したときに、その疾患、障害及び／または状態の症状（複数可）を治療、診断、予防し、及び／またはその発現を遅延するのに十分である量を意味する。治療有効量は典型的には、少なくとも１単位用量を含む投与レジメンによって投与することは、当業者には明らかであろう。

治療：本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害及び／または状態の症状または特徴の１つ以上を部分的または完全に緩和、改善、軽減、阻害、予防し、その発現を遅延し、その重症度を低減し、及び／またはその発症を低減する目的で使用するいずれかの方法を指す。治療は、疾患の徴候が見られないか、及び／またはその疾患の初期徴候しか見られない対象に、その疾患と関連する病態が発現するリスクを低下させる目的で行ってよい。

本明細書で、端点値によって数値範囲が示されている場合には、その範囲に含まれるあらゆる数及び分数が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９、４及び５が含まれる）。そのすべての数及び分数は、「約」という用語によって修飾されると推定されることも理解されたい。

本発明の様々な態様を、以下の節に詳細に記載する。節の使用は、本発明を限定するものではない。それぞれの節は、本発明のいずれの態様にも適用できる。本願では、「または」の使用は、別段の記載のない限り、「及び／または」を意味する。

本開示は、Ｉ２Ｓの欠損と関連する疾患（ハンター症候群など）の治療のために、Ｉ２Ｓをｉｎｖｉｖｏで産生させるための効率的かつロバストな組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターについて説明する。

ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群）は、酵素であるイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の欠損に起因するＸ染色体連鎖劣性ライソゾーム蓄積障害である。Ｉ２Ｓは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸から、末端の２－Ｏ－硫酸部分を切断する。ハンター症候群患者では、Ｉ２Ｓ酵素の欠如または欠損により、ＧＡＧが、様々な種類の細胞のライソゾームに進行性に蓄積して、細胞の膨張、臓器の肥大、組織の破壊及び器官系の機能障害が生じる。

概して、ハンター症候群の人々における物理的な発現症状には、身体症状及び神経症状の両方が含まれる。例えば、ハンター症候群の症例のいくつかでは、中枢神経系（ＣＮＳ）の病変により、発達遅延及び神経系の問題が生じる。神経変性及び精神遅滞のような症状は、小児期に現れ、神経への影響をきたしたハンター症候群患者は、脳器官障害により、若齢で死亡する場合が多い。同様に、ＧＡＧの蓄積は、体の器官系に悪影響を及ぼすことがある。初期には、心臓、肺及び気道の壁の肥厚、ならびに肝臓、脾臓及び腎臓の異常な肥大として顕在化し、これらの重大な変化は最終的には、広範な破局的臓器不全に至ることがある。その結果、ハンター症候群は常に、重篤で進行性の致死的疾患である。

酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）の治療用として認可済みの療法であり、外因性の補充用Ｉ２Ｓ酵素をハンター症候群患者に投与することを伴うものである。しかしながら、ＥＲＴには、様々な欠点が伴い、それらの欠点の中でも、例えば、Ｉ２Ｓの様々な標的器官への分布が限定的であることが挙げられる。

本明細書に記載されているベクターは、例えば、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺及び中枢神経系を含む様々な器官で、Ｉ２Ｓをロバストに発現させる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを肝臓で発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを腎臓で発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを脾臓で発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを心臓で発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを肺で発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを中枢神経系で発現させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、Ｉ２Ｓを血漿で発現させる。

ｒＡＡＶＩ２Ｓベクターのデザイン
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。本開示の例示的なｒＡＡＶベクターを示す概略図が、図１Ｂに示されている。図１Ｂに示されているように、いくつかの実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、肝臓特異的プロモーター、５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲ、シス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）、イントロン及びＷＰＲＥ配列を含む。

いくつかの実施形態では、そのベクターは、スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ）遺伝子も含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。

そのベクターのイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）は、野生型またはコドン最適化したバリアントであることができる。したがって、いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、野生型Ｉ２Ｓヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、コドン最適化したＩ２Ｓ配列を含む。

本発明に適するＩ２Ｓは、天然のイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の少なくとも部分的な活性を代替できるか、またはＩ２Ｓ欠損と関連する表現型もしくは症状の１つ以上を救済できるいずれかのタンパク質またはタンパク質部分である。本明細書で使用する場合、「Ｉ２Ｓ酵素」及び「Ｉ２Ｓタンパク質」という用語、ならびに文法的に同等の用語は、同義的に用いられている。

典型的には、ヒトＩ２Ｓタンパク質は、前駆体形態として産生される。ヒトＩ２Ｓの前駆体形態は、シグナルペプチド（その完全長前駆体の１～２５番目のアミノ酸残基）、プロペプチド（その完全長前駆体の２６～３３番目のアミノ酸残基）、ならびにさらにプロセシングされて、４２ｋＤａの鎖（その完全長前駆体の３４～４５５番目の残基）及び１４ｋＤａの鎖（その完全長前駆体の４４６～５５０番目の残基）となり得る鎖（その完全長前駆体の３４～５５０番目の残基）を含む。典型的には、その前駆体形態は、完全長前駆体または完全長Ｉ２Ｓタンパク質ともいい、５５０個のアミノ酸を含む。典型的な野生型、すなわち天然のヒトＩ２Ｓタンパク質のシグナルペプチドが除去された成熟形態（配列番号１）と、完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列が、表１に示されている。シグナルペプチドには、下線が付されている。

本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターでは、様々な種類のプロモーターを使用できる。それらのプロモーターとしては、例えば、ユビキタスプロモーター、組織特異的プロモーター及び調節性（例えば、誘導性または抑制性）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。肝臓特異的プロモーターの例は、当該技術分野において知られており、そのプロモーターとしては例えば、ヒトトランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、α－アンチトリプシンプロモーター、ヒト前駆体型第ＩＸ因子／肝臓転写因子応答性オリゴマー、ＬＳＰ及び塩基性アルブミンプロモーターが挙げられる。肝臓特異的プロモーターは例えば、ＺｈｉｊｉａｎＷｕｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙｖｏｌ１６，ｎｏ２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２００８に記載されており、その内容は、参照により、本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、ユビキタスプロモーターである。いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、ニワトリβアクチンプロモーターである。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、そのｍＲＮＡの転写及び／または翻訳を促すための追加のエンハンサーまたは調節エレメント（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列、ＩＲＥＳなど）を含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、エンハンサーエレメントを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ポリ（Ａ）テールを含む。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、イントロンのような小エレメントを１つ以上含む。当該技術分野において、様々なイントロンが知られている。本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターに適するイントロンとしては例えば、ＭＶＭイントロン、トランケート型Ｆ．ＩＸイントロン、キメラβグロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖ＳＡイントロン、ＳＶ４０及び／またはαグロビンの第１イントロンが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＭＶＭイントロンを含む。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＳＶ４０イントロンを含む。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。当該技術分野では、ＷＰＲＥの様々な最適化形態またはバリアント形態が知られており、その形態としては、とりわけ、ＷＰＲＥ３、ＷＰＲＥｍｕｔ６ｄｅｌＡＴＧが挙げられる。他のバリアントＷＰＲＥ形態としては例えば、ＷＰＲＥ２、ＷＰＲＥ＿ｗｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４５１４）、ＷＰＲＥ＿ｗｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２４４２）及びＷＰＲＥｍｕｔ６が挙げられる。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、シス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）を含む。様々な種類のＣＲＭが、本明細書に記載されているベクターでの使用に適しており、そのＣＲＭとしては例えば、肝臓特異的ＣＲＭ、ニューロン特異的ＣＲＭが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているベクターは、肝細胞特異的ＣＲＭ、例えばＣＲＭ８を含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ＣＲＭを２個以上含む。例えば、いくつかの実施形態では、そのベクターは、ＣＲＭを２個、３個、４個、５個または６個含む。いくつかの実施形態では、そのベクターは、ＣＲＭを３個、例えば、ＣＲＭ８を３個含む。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、翻訳効率の向上のために、転写産物の安定性を向上させるとともに、免疫原性を低下させるように、配列を最適化されている。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓが、配列を最適化されている。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１ベクター、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ３ベクター、ＡＡＶ４ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ６ベクター、ＡＡＶ７ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ１０ベクターまたはＡＡＶ１１ベクターである。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ３である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ４である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ６である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ７である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１０である。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１１である。

例示的なエレメントの配列は、下記の表２に示されている。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、表２に示されているベクターエレメント配列との同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターエレメントを含む。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、表２に示されているベクターエレメントヌクレオチド配列と同一のベクターエレメントヌクレオチド配列を含む。表では、Ｘｎ（６０－１００）は、ヌクレオチドを６０～１００個含むＤＮＡ力価測定タグを意味する。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶＩ２Ｓベクターは、下記の表３に示されているヌクレオチド配列との同一性が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶＩ２Ｓベクターは、下記の表３に示されているヌクレオチド配列と同一の配列を含む。

疾患の治療に、Ｉ２ＳをコードするｒＡＡＶベクターを使用すること
本明細書に記載されているのは、Ｉ２Ｓ酵素の欠損と関連する疾患の治療方法である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターは、ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）のように、Ｉ２Ｓが欠損している対象の治療に適する。その治療方法は、その治療が必要な対象に、本明細書に記載されているような組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含む。

本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターを用いて、Ｉ２Ｓ欠損と関連するいずれかの疾患または障害を治療できる。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、その治療が必要な対象に投与した後、エピソーマルな状態を保つ。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、その治療が必要な対象に投与した後、エピソーマルな状態を保たない。例えば、いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、その対象のゲノムに組み込まれる。このような組み込みは例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＡＲＣＵＳゲノム編集及び／またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのような様々な遺伝子編集技術を用いることによって行うことができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物を用いて、治療が必要な対象を治療する。本発明のｒＡＡＶベクターまたは粒子を含む医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む。適切な医薬用担体の例は、当該技術分野において周知であり、その担体としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳剤のような乳剤、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体は、従来の方法によって調合でき、対象に、治療有効量で投与する。

本発明のｒＡＡＶベクターは、治療が必要な対象に、適切な経路を介して投与する。実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与または皮内投与によって投与する。実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、静脈内投与する。実施形態では、その皮内投与は、「遺伝子銃」またはバイオリスティック粒子送達システムを使用することによって投与することを含む。いくつかの実施形態では、本発明のｒＡＡＶベクターは、非ウイルス脂質ナノ粒子を介して投与する。例えば、そのｒＡＡＶベクターを含む組成物は、１つ以上の希釈剤、緩衝剤、リポソーム、脂質、脂質複合体を含んでよい。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターは、マイクロスフェア内、または脂質ナノ粒子のようなナノ粒子内に含まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子のような非ウイルス化学粒子、エクソソームのような非ウイルス生体分子、及び／または細胞外ベシクルを介して、そのｒＡＡＶベクター及び／または導入遺伝子発現カセット及び／または最適化されたＩＤＳ導入遺伝子配列及び／またはその遺伝子発現カセットのいずれかの組成物を投与する。

いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から約２～６週間後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、約２週間目に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、約３週間目に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、約４週間目に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、約５週間目に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、約６週間目に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から約２～６週間後に、その対象の肝細胞において検出可能である。

いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも３カ月後、６カ月後、１２カ月後、２年後、３年後、４年後、５年後、６年後、７年後、８年後、９年後または１０年後に、その対象の血漿において検出可能である。したがって、いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも３カ月後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも６カ月後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも１２カ月後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも２年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも３年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも４年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも５年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも６年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも７年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも８年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも９年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターの投与から少なくとも１０年後に、その対象の血漿または血清において検出可能である。いくつかの実施形態では、機能的なＩ２Ｓは、そのｒＡＡＶベクターを投与してから、その対象の残りの寿命にわたって、その対象の血漿または血清において検出可能である。

いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、精製Ｉ２Ｓタンパク質の静脈内投与後に見られるのと同程度に、活性Ｉ２Ｓが産生される。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、精製Ｉ２Ｓタンパク質を静脈内投与した場合よりも多い量の活性Ｉ２Ｓが産生される。

いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、Ｉ２Ｓを含むｒＡＡＶを投与する前のその対象のベースラインＧＡＧレベルと比べて、その対象におけるＧＡＧが約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％または約１０％減少する。したがって、いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約９５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約９０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約８５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約８０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約７５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約７０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約６５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約６０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約５５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約５０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約４５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約４０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約３５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約３０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約２５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約２０％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約１５％減少する。いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが約１０％減少する。

いくつかの実施形態では、そのＩ２Ｓを含むｒＡＡＶの投与により、その対象におけるＧＡＧが、少なくとも約２週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、１２カ月、１年、２年、３年、４年、５年または５年超減少する。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶベクターをその対象に投与した後、循環血液において検出可能な機能的なＩ２Ｓのレベルは、Ｉ２Ｓを含むｒＡＡＶを投与する前のその対象において検出可能な機能的なＩ２Ｓの量の約２～１０倍高い。

いくつかの実施形態では、そのＡＡＶベクターをその対象に投与した後、検出可能である活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルを満たすかまたは上回る。いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶベクターの投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約２～３５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約２倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約３倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約４倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約６倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約６倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約７倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約８倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約９倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約１０倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約１５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約２０倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約２５倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約３０倍である。いくつかの実施形態では、投与後の活性Ｉ２Ｓのレベルは、ヒト治療レベルの約３５倍である。

すなわち、Ｉ２Ｓを含むｒＡＡＶベクターの投与により、精製Ｉ２Ｓを、必要な対象に１回投与するのと比べて、ロバストな発現が持続する。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶＩ２Ｓベクターは、対象１人につき１回用量として送達する。いくつかの実施形態では、その対象に、最小有効用量（ＭＥＤ）を送達する。本明細書で使用する場合、ＭＥＤとは、対象におけるＧＡＧレベルを低下させるＩ２Ｓ活性をもたらすのに必要な、ｒＡＡＶＩ２Ｓベクターの用量を指す。

ベクター力価は、そのベクター調製物のＤＮＡ含有量に基づいて求める。いくつかの実施形態では、定量ＰＣＲまたは最適化した定量ＰＣＲを用いて、ｒＡＡＶＩ２Ｓベクター調製物のＤＮＡ含有量を求める。一実施形態では、その投与量は、体重１ｋｇ当たり約１×１０^１１ベクターゲノム（ｖｇ）～約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ（端点値を含む）である。

一実施形態では、その投与量は、１×１０^９ｖｇ／ｋｇ～３×１０^１５ｖｇ／ｋｇの範囲で選択する（例えば、１×１０^９ｖｇ／ｋｇ、３×１０^９ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ）。いくつかの実施形態では、その投与量は、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇである。別の実施形態では、その投与量は、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。具体的な実施形態では、対象に投与するｒＡＡＶの用量は、少なくとも５×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、２．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、２．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、４．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、４．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、６．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、６．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７．０×１０^１２ｖｇ／ｋｇまたは７．５×１０^１２ｖｇ／ｋｇである。

いくつかの実施形態では、そのｒＡＡＶＩ２Ｓベクター組成物は、投与量単位で調合して、約１．０×１０^９ｖｇ～約１．０×１０^１５ｖｇの範囲である量の複製欠損ウイルスを含むようにできる。本明細書で使用する場合、「投与量」という用語は、治療過程で対象に送達する総投与量、または（複数回投与のうちの）１回の投与で送達する量を指すことができる。

いくつかの実施形態では、その投与量は、患者において、血漿中ＧＡＧレベルを２５％以上低下させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶＩ２Ｓは、ハンター症候群を治療するための１つ以上の療法と組み合わせて投与する。

ｒＡＡＶウイルスベクターの作製
対象に送達するのに適するＡＡＶウイルスベクターを生成及び単離する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第７７９０４４９号、米国特許第７２８２１９９号、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。ある１つのシステムでは、プロデューサー細胞株に、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子をコードするコンストラクトと、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするコンストラクト（複数可）を一過性にトランスフェクションする。第２のシステムでは、ｒｅｐ及びｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲに挟まれた導入遺伝子をコードするコンストラクトを一過性にトランスフェクションする。これらのシステムのそれぞれでは、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルパーヘルペスウイルスへの感染に応答して、ＡＡＶビリオンが産生され、そのｒＡＡＶを混入ウイルスから分離する必要がある。最近になって、ヘルパーウイルスに感染させて、ＡＡＶを回収する必要がないシステムが開発され、すなわち、そのシステムは、アデノウイルスＥｌ、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼもトランスで供給する。これらの新しいシステムでは、そのヘルパー機能は、細胞に、必要なヘルパー機能をコードするコンストラクトを一過性にトラスフェクションすることによって供給でき、または細胞を操作して、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定的に含むようにでき、その発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御できる。

いくつかの実施形態では、バキュロウイルスベースのベクターへの感染によって、ＩＴＲに挟まれた発現カセットと、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を所望の細胞または細胞株に導入する。

いくつかの実施形態では、バキュロウイルスベースのベクターへの感染によって、ＩＴＲに挟まれた発現カセットと、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を昆虫細胞に導入する。これらの産生システムの論評については、概して、例えば、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｈｙｂｒｉｄｆｏｒｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２０：９２２－９２９（その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。また、上記及び他のＡＡＶ産生システムを作製及び使用する方法は、米国特許５，１３９，９４１号、同第５，７４１，６８３号、同第６，０５７，１５２号、同第６，２０４，０５９号、同第６，２６８，２１３号、同第６，４９１，９０７号、同第６，６６０，５１４号、同第６，９５１，７５３号、同第７，０９４，６０４号、同第７，１７２，８９３号、同第７，２０１，８９８号、同第７，２２９，８２３号及び同第７，４３９，０６５号（それぞれの内容は、参照により、全体が本明細書に援用される）に記載されている。概して、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓａｓａｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇｅｔａｌ，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．ＧｅｎｅＭｅｄ１０：７１７－７３３及び下に引用されている参照文献（それぞれ、参照により、全体が本明細書に援用される）を参照されたい。

本発明の実施形態のいずれかを構築するのに使用する方法は、核酸操作における知識を有する者には既知であり、その方法には、遺伝子工学、組み換え工学及び合成技法が含まれる。例えば、ＧｒｅｅｎａｎｄＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、適切な方法の選択は、本発明を制限するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

本発明に従って使用できる多くのプラスミド、ならびにその他のクローニングベクター及び発現ベクターは、当業者に周知であり、当業者は、それらを容易に利用可能である。さらに、当業者は、本発明での使用に適するいずれの数の他のプラスミドも容易に構築し得る。本発明におけるこのようなプラスミド及びその他のベクターの特性、構築及び使用法は、当業者には、本開示から容易に明らかとなるであろう。

一実施形態では、その産生プラスミドは、本明細書に記載されているか、またはＷＯ２０１２／１５８７５７（参照により、本明細書に援用される）に記載されているようなものである。当該技術分野では、ｒＡＡＶベクターの作製に用いるものとして、様々なプラスミドが知られており、本発明において有用である。その産生プラスミドを宿主細胞内で培養して、その細胞が、ＡＡＶのｃａｐタンパク質及び／またはｒｅｐタンパク質を発現する。宿主細胞内で、各ｒＡＡＶゲノムをレスキューして、そのキャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質にパッケージングして、感染性ウイルス粒子を形成する。

特定の実施形態では、そのｒＡＡＶ発現カセット、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、ウイルス（ｒＡＡＶなど）、産生プラスミドは、ＡＡＶ逆位末端反復配列、ＩＤＳ及び／またはＳＵＭＦ－１をコードするコドン最適化核酸配列、ならびに宿主細胞において、コードされるタンパク質の発現を誘導する発現制御配列を含む。別の実施形態では、そのｒＡＡＶ発現カセット、ウイルス、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、産生プラスミドは、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ、転写後調節エレメントなどのうちの１つ以上をさらに含む。一実施形態では、その転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。

当該技術分野では、ＡＡＶベクターの産生及び精製に関して、様々な方法が知られている。例えば、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔａｌ．ＡＰｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒＡＡＶｖｅｃｔｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、米国特許出願公開第２００７００１５２３８号及び同第２０１２０３２２８６１号を参照されたい。例えば、当該遺伝子を含むプラスミドは、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードする遺伝子）と、ｃａｐ遺伝子（本明細書に記載されているような改変ＶＰ２領域を含め、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする遺伝子）とを含む１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせ、組み換え細胞にトランスフェクションして、そのｒＡＡＶをパッケージングし、後で精製できるようにしてよい。

いくつかの実施形態では、そのパッケージングは、哺乳動物細胞または昆虫細胞のようなヘルパー細胞またはプロデューサー細胞で行う。例示的な哺乳動物細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限らない（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５１（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１０（商標）またはＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標）を参照されたい）。例示的な昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞が挙げられるが、これに限らない（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標）を参照されたい）。そのヘルパー細胞は、本明細書に記載されている方法で用いるＲｅｐタンパク質及び／またはＣａｐタンパク質をコードするｒｅｐ遺伝子及び／またはｃａｐ遺伝子を含んでよい。いくつかの実施形態では、そのパッケージングは、ｉｎｖｉｔｒｏで行う。

いくつかの実施形態では、当該遺伝子を含むプラスミドは、例えば、第１のセロタイプのｒｅｐ遺伝子と、同じセロタイプまたは異なるセロタイプのｃａｐ遺伝子とを含む１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせ、ヘルパー細胞にトランスフェクションして、そのｒＡＡＶがパッケージングされるようにする。

いくつかの実施形態では、その１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子とを含む第１のヘルパープラスミドと、Ｅｌａ遺伝子、Ｅｌｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子及びＶＡ遺伝子というヘルパー遺伝子のうちの１つ以上を含む第２のヘルパープラスミドを含む。明瞭化のために述べると、ヘルパー遺伝子は、ヘルパータンパク質Ｅｌａ、Ｅｌｂ、Ｅ４、Ｅ２ａ及びＶＡをコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、そのｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１タンパク質、ＶＰ２タンパク質及びＶＰ３タンパク質のうちの１つ以上が発現されないように改変されている。いくつかの実施形態では、そのｃａｐ遺伝子は、ＶＰ２が発現されないように改変されている。このような改変を行う方法は、当該技術分野において知られている（Ｌｕｘｅｔａｌ．（２００５），ＪＶｉｒｏｌｏｇｙ，７９：１１７７６－８７）。

ヘルパープラスミド、及びヘルパープラスミドの作製方法は概して、当該技術分野において知られており、概して、市販されている（例えば、ＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ（Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のｐＤＦ６、ｐＲｅｐ、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰｌｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）及びｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド、ＶｅｃｔｏｒＢｉｏｌａｂｓ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）、Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＳａｎｔａＣｌａｒａ，Ｃａ）及びＡｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手可能な他の製品及びサービス、ｐｘｘ６、Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．（１９９８），ＮｏｖｅｌＴｏｏｌｓｆｏｒＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＡｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．９，２７４５－２７６０、Ｋｅｍ，Ａ．ｅｔａｌ．（２００３），ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＨｅｐａｒｉｎ－ＢｉｎｄｉｎｇＭｏｔｉｆｏｎＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＴｙｐｅ２Ｃａｐｓｉｄｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７７，１１０７２－１１０８１．、Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．（２００３），ＨｅｌｐｅｒＶｉｒｕｓ－Ｆｒｅｅ，ＯｐｔｉｃａｌｌｙＣｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ，ａｎｄＴｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ－ＢａｓｅｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＡｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓｏｆＳｅｒｏｔｙｐｅｓ１ｔｏ６，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．７，８３９－８５０、Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．（２００５）を参照されたい）。

本発明の他の特徴、目的及び利点は、下記の実施例で明らかである。しかしながら、実施例は、本発明の実施形態を示すものの、例示として示されているに過ぎず、限定するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内での様々な変更及び修正は、当業者には、実施例から明らかになるであろう。

実施例１．ベクターのデザイン
この実施例では、ヒトイズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳまたはＩ２Ｓ）のコード配列を含むｒＡＡＶ発現コンストラクト（ｒＡＡＶベクター）及びその変形形態を作製する例示的な方法及びその例示的なデザインが示されている。この試験では、組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ８）を使用した。ｒＡＡＶベクターの基本的デザインは、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、すなわち５’－ＩＴＲ及び３’－ＩＴＲに挟まれた発現カセットを含む。これらのＩＴＲは、ベクタープロデューサー細胞内で、ＡＡＶ複製タンパク質Ｒｅｐ及び関連因子による、ベクターゲノムの複製及びパッケージングを媒介する。典型的には、図１Ａに示されているように、発現カセットは、プロモーター、コード配列、ポリＡテール及び／またはタグを含む。ヒトＩＤＳ（ｈＩＤＳ）をコードする発現コンストラクトは、標準的な分子生物学技法を用いて、設計及び調製した。ｈＩＤＳのコード配列は、プロモーターであるｈＴＴＲ（ヒトトランスサイレチンプロモーター）の下流に挿入した。加えて、肝臓特異的なシス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）をそのプロモーターの上流に挿入し、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列をそのプロモーターの下流に挿入した。下記の実施例に示されているように、この調節モジュールとプロモーターの組み合わせにおいて、高いトランスダクションレベルについて試験した。さらに、ＷＰＲＥ配列をコード領域の下流に挿入した。理論に束縛されることを望まないが、このエレメントは、ｍＲＮＡの安定性を向上させる三次構造を作る。ＷＰＲＥについては、例えば、転写終結の増進、及びｍＲＮＡの核外輸送の促進を含め、他の機能メカニズムが説明されている。図１Ｂは、上記の発現コンストラクトの概略図を示している。続いて、その発現コンストラクトをＡＡＶプラスミド骨格にクローニングし、シーケンシングによって確認した。ベクターをウイルス粒子にパッケージングし、保存した。

上記スキームの変形形態をいずれかの数行うことができる。代替的なコンストラクトは、図２に示されているように、ＷＰＲＥ配列を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の前に位置するＳＵＭＦ１（スルファターゼ修飾因子１）コード配列に置き換えることによって得ることができる。公開されているデータ（ＦｒａｌｄｉＡｅｔａｌ．２００７．ＢｉｏｃｈｅｍＪ．４０３：３０５－３１２）によると、細胞ベースのｉｎｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験した場合、ＳＵＭＦ１の存在により、Ｉ２Ｓ活性が向上する。同じ研究で公にされた追加のｉｎｖｉｖｏデータにより、ＳＵＭＦ１の存在下で、スルファミダーゼ（ＳＧＳＨ）活性が、さらに有意に向上したことが示された。小胞体において、ＳＵＭＦ１の基質（ＩＤＳを含む）のホルミルグリシン触媒残基を活性化させるには、ＳＵＭＦ１が必要であるとすると、ＩＤＳ及びＳＵＭＦ１を同じベクターから共発現させると、細胞レベルで、ＳＵＭＦ１の量が増えて、処理されるＩＤＳの量が増加するように図ることができるので、活性化ＩＤＳが、ライソゾームへの輸送前に処理される可能性が向上したり、またはその細胞から出て、アップデートのために、他の細胞に移動したりする。

コドン最適化
加えて、ＩＤＳまたはＳＵＭＦ１のコード配列は、コドン適応指標（ＣＡＩ）、ＣｐＧ部位数、ＧＣ含有率及び繰り返し塩基配列のような複数のパラメーターに基づき、コドン最適化した。より使用頻度の高いコドンを使用し、ベクターからの導入遺伝子産物の発現レベルを潜在的に上昇させるには、高いＣＡＩが好ましかった。免疫応答を誘発し得るＣｐＧ部位を減少させた。繰り返し塩基も除去した。この目的においては、合成遺伝子デザインのためのウェブベースの多目的最適化プラットフォーム（ＣＯＯＬ（ＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＯｎｌｉｎｅ）という）と、内部のコドン使用頻度表を使用した。加えて、潜在的なスプライシング部位を手動で除去した。最適化したｈＩＤＳコード配列及びＳＵＭＦ１コード配列の特徴は、表４にまとめられており、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥの代表的なコンストラクトの概略図は図１Ｂに、ｈＩＤＳ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１の代表的なコンストラクトの概略図は図２に示されている。上記スキームの変形形態をいずれかの数行うことができる。例えば、２個以上のプロモーターを使用してもよく、及び／またはＩＲＥＳ配列をコード領域の上流に導入してもよい。加えて、異なる組み合わせの調節領域、プロモーター及びイントロンも企図できる。

実施例２．ｒＡＡＶの駆動による、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥのｉｎｖｉｖｏ発現
この実施例には、最適化コンストラクトにおいて、ｒＡＡＶの駆動によってＩＤＳがｉｎｖｉｖｏで発現される効力について例示されている。マウスに、コントロールベクター（ｒＡＡＶ－ＸＬ０３２）（群Ａ）、または図１Ａ及び図１Ｂに示されているような試験試料のｒＡＡＶ－ＸＬ０２４（ｈＩＤＳｗｔ－ＷＰＲＥ）コンストラクト（群Ｂ）もしくはｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（ｈＩＤＳ－ＡＵＳｏｐｔ－ＷＰＲＥ）コンストラクト（群Ｃ）を注射した。６週齢のマウスに、ベクターを２００μｌの体積中５×１０^９ｖｇで、尾静脈から投与し、注射から２日後、７日後、２１日後、８週間後及び１２週間後に、血清試料を採取した。マウスを１２週間目に殺処分し、その組織試料を摘出した。週齢を適合させた野生型マウスの群をポジティブコントロールとし、週齢を適合させた未処置のＩＤＳ－ＫＯマウスの群をネガティブコントロールとして使用した。その実験デザインは、下記の表５にまとめられている。

Ｂ８５抗体を用いたＥＬＩＳＡによって、ベクターの媒介による発現量を求めた。結果は、図３に示されている。最適化したコンストラクトｒＡＡＶ－ＸＬ０２４（群Ｂ）及びｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｃ）のｒＡＡＶベクターを注射したマウスでは、コントロールベクターｒＡＡＶ－ＸＬ０３２（ＣｐＧ部位を減少させない異なるアルゴリズム、及び野生型ＷＰＲＥ配列の短縮型によって、コドン最適化ｈＩＤＳをコードするベクターである）（群Ａ）を注射したマウスと比べて、血清中のｈＩＤＳ濃度が高かった。ベクター（群Ａ～Ｃ）を注射したすべての群において、２１日目まで、ｈＩＤＳ濃度が上昇し、１回注射後、最長で１２週間（８４日）、ｈＩＤＳレベルが維持された。すべてのＷＴ群及びＩＤＳ－ＫＯ群においては、ヒトＩＤＳを発現しないので、ｈＩＤＳは検出されなかった。

図４Ａに示されているように、ｈＩＤＳ活性のレベルを試験したところ、同様の結果が得られた。ベクター（群Ａ～Ｃ）を注射したすべての群において、２１日目まで、その活性レベルが上昇した。その発現結果と同様に、最適化したコンストラクト（群Ｂ及び群Ｃ）のｒＡＡＶベクターを注射したマウス群におけるｈＩＤＳ活性は、コントロールベクターｒＡＡＶ－ＸＬ０３２（群Ａ）のマウス群よりも高かった。ＷＴマウス群のｈＩＤＳ活性レベルは、試験期間にわたって比較的安定していた。この実施例で用いたｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ８であった。

図４Ｂに示されているように、ＥＬＩＳＡを用いて、組織において、ｈＩ２Ｓを測定した。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２４（群Ｂ）では、ｈＩ２Ｓは、肝臓及び腎臓において検出可能であったが、脳では検出不能であった。この群では、心臓及び脾臓は解析しなかった。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｃ）では、ｈＩ２Ｓは、肝臓、腎臓、心臓、脾臓及び脳において検出可能であった。ｒＡＡＶ－ＸＬ０３２（群Ａ）では、ｈＩ２Ｓは、肝臓、腎臓及び脳において検出可能であった。この群では、心臓及び脾臓は解析しなかった。

図４Ｃに示されているように、活性を用いて、組織において、ｈＩ２Ｓを測定した。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２４（群Ｂ）では、ｈＩ２Ｓ活性は、肝臓、腎臓及び脳において検出可能であった。この群では、心臓及び脾臓は解析しなかった。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｃ）では、ｈＩ２Ｓは、肝臓、腎臓、心臓、脾臓及び脳において検出可能であった。ｒＡＡＶ－ＸＬ０３２（群Ａ）では、ｈＩ２Ｓは、肝臓、腎臓及び脳において検出可能であった。この群では、心臓及び脾臓は解析しなかった。図４Ｄに示されているように、酵素活性レベルをＷＴ群と比較した。血清及び体細胞組織において、すべてのベクター投与群で、ＷＴよりも高い活性レベルが見られた。脳では、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６及びｒＡＡＶ－ＸＬ０３２のレベルは、ＷＴよりも低かった。

実施例３．ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥコンストラクトを用いた遺伝子療法によるＧＡＧクリアランス
酵素であるイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸から硫酸基を除去するものであり、その欠如または不活性により、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）、すなわち、ライソゾーム蓄積障害であるハンター症候群を発症する。そこで、ＧＡＧクリアランスを測定して、最適化したｒＡＡＶコンストラクトによって発現したｈＩＤＳの効力を評価した。１２週目に、表５に示されているマウス群から、脳、肝臓及び腎臓の組織を摘出し、各組織中のＧＡＧレベルを測定した。

図５Ａに示されているように、脳では、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｃ）及びｒＡＡＶ－ＸＬ０３２（群Ａ）の場合に、未処置のＩＤＳ－ＫＯマウスと比べて、ＧＡＧレベルが多少低下した。図５Ｂ及び図５Ｃに示されているように、マウスに、ｈＩＤＳをコードするｒＡＡＶベクターを注射したところ、ＧＡＧレベルは、肝臓及び腎臓で有意に低下した。そのＧＡＧレベルは、未処置のＷＴマウスで見られたＧＡＧレベルと同程度であった。

実施例４．ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥコンストラクトを用いる遺伝子療法による、ヘパリン硫酸（ＨＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）の低減
この実施例には、マウスにおいて、ｈＩＤＳを発現させることによって、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のレベルが低下することが例示されている。酵素であるイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸から硫酸基を除去するものであり、その欠如または不活性により、ＧＡＧが蓄積し、その結果、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）、すなわち、ライソゾーム蓄積障害であるハンター症候群を発症する。

最適化したｒＡＡＶコンストラクトによって発現したｈＩ２Ｓの効力を評価するために、ＧＡＧクリアランスを測定した。

ヘパラン硫酸（ＨＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）を検出できる液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）アッセイを用いて、表５に示されているマウス群から、１２週目に摘出した肝臓、腎臓、心臓、脾臓及び脳の組織において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を測定した。その結果は、図６Ａ～Ｂに示されている。

ｒＡＡＶ－ＸＬ０２４（群Ｂ）では、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧは、肝臓及び腎臓において、未処置のＫＯ（群Ｅ）と比べて減少し、脳でも、これらほどではないものの、減少した。この群では、心臓及び脾臓は解析しなかった。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｃ）では、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧは、肝臓、腎臓、心臓、脾臓において未処置のＫＯ（群Ｅ）と比べて減少し、脳でも、これらほどではないものの、減少した。ｒＡＡＶ－ＸＬ０３２（群Ａ）では、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧは、肝臓及び腎臓において、未処置のＫＯ（群Ｅ）と比べて減少し、脳でも、これらほどではないものの、減少した。

図６Ｂに示されているように、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧのレベルは、未処置のＩＫＯを低下率０％、ＷＴを低下率１００％として正規化した。

総合すると、すべてのベクター投与群で、体細胞組織におけるＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧの割合の低下と、脳におけるＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧの割合の低下が見られた。それらの結果から、Ｉ２Ｓの発現により、マウスの組織において、ＧＡＧレベルが低下したことが示された。

実施例５．マウスにおける、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥコンストラクトを用いた遺伝子療法による、ライソゾーム蓄積区画の縮小
この実施例では、マウスにおいて、例えば、ムコ多糖症（ＭＰＳＩＩ）の治療の際に、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥコンストラクトを用いた酵素補充療法により、ライソゾーム蓄積区画が、ＬＡＭＰ１染色によって検出した場合に、縮小することが例示されている。

簡潔に述べると、ＬＡＭＰ１染色を用いて、マウスにおけるライソゾーム蓄積区画を測定した。肝臓、ならびに脳の海馬、視床、脳梁、皮質、小脳及び線条体のような様々な組織を染色した。この実施例では、コントロールマウス群には、Ｉ２Ｓ酵素を実験期間中に５回、０日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に、髄腔内（ＩＴ）投与した（表５の群Ｆ）。ＬＡＭＰ１染色の減少により、基質の減少、ＫＯマウスの病態の改善が示される。

それらの結果は、図７Ａ及び図７Ｂに示されている。図７Ａで見られるように、ベクターを注射したマウスの肝臓組織において、ＬＡＭＰ１の有意な減少が観察された。肝臓での作用は、ＷＴマウス、及びＥＲＴで処置したマウス群に匹敵していた。

脳は、図７Ｂに示されている。未処置のＫＯ（群Ｅ）と比べて、ＬＡＭＰ１染色陽性率の低下は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６での海馬、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２４及びｒＡＡＶ－ＸＬ０２６での脳梁、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２４及びｒＡＡＶ－ＸＬ０２６での視床で、統計的に有意となった。

総合すると、それらの結果から、マウスの肝臓及び脳の組織で、ＩＤＳの投与により、ライソゾーム蓄積区画が、ＬＡＭＰ１染色によって測定した場合に、縮小したことが示された。

実施例６．ｒＡＡＶの駆動による、ｈＩＤＳ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１のｉｎｖｉｖｏ発現
この実施例では、マウスにおいて、ｈＩＤＳ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１ベクターを投与した場合のｈＩＤＳのｉｎｖｉｖｏ発現及び活性が、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥベクターの場合と比較されている。

ＩＤＳのＦＧｌｙ触媒残基を活性化させるには、ＳＵＭＦ１が必要となるので、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥを発現するベクターに対して、ｈＩＤＳ及びＳＵＭＦ１を発現するベクターを用いて、比較を行った。

マウスに、ｈＩＤＳＡＵＳｏｐｔ－ＷＰＲＥコンストラクト（ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６、群Ｃ）、ｈＩＤＳ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１コンストラクト（群ＧはｒＡＡＶ－ＸＬ０２７、群ＨはＸＬ０２９）、またはネガティブコントロールとしてのＳＵＭＦ１コンストラクト（ｒＡＡＶ－ＸＬ０３０、群Ｉ）を発現するｒＡＡＶベクターを注射した。これらのコンストラクトの概略図は、図１Ｂ及び図２に示されている。

６週齢のマウスに、ベクターを２００μｌの体積中５×１０^９ｖｇで、尾静脈から投与し、注射から２日後、７日後及び２１日後に、血清試料を採取した。週齢を適合させた野生型マウスの群をそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして使用した。例示的なｉｎｖｉｖｏ試験は、表６にまとめられている。

血清におけるＩＤＳの発現レベルをＥＬＩＳＡによって定量した。結果は、図８に示されている。予想外にも、ｈＩＤＳ及びＳＵＭＦ１の両方を発現するｒＡＡＶ－ＸＬ０２７及びｒＡＡＶ－ＸＬ０２９を注射したマウスでは、２１日目の時点に、血清中のｈＩ２Ｓ濃度が、ｈＩＤＳのみを発現するｒＡＡＶ－ＸＬ０２６ベクター（群Ｃ）を注射したマウスよりも低かった。

図９に示されているように、ｈＩ２Ｓの活性レベルを試験したところ、同様の結果が得られた。ｈＩＤＳ及びＳＵＭＦ１の両方を発現するベクターを注射したすべての群（群Ｇ～Ｈ）で、その活性レベルは、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥを発現するベクターを注射した群（群Ｃ）よりも低かった。特定の理論に束縛されることを望まないが、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６ベクターにおけるＷＰＲＥエレメントが、ｍＲＮＡの安定性を向上させる三次構造をもたらし、その後、タンパク質の発現を増加させるので、活性が高まると考えられる。ＷＰＲＥについては、例えば、転写終結の増進、及びｍＲＮＡの核外輸送の促進を含め、他の機能メカニズムが説明されている。一方、ＳＵＭＦ１は、さらに活性な形態のｈＩＤＳをもたらすが、ＷＰＲＥエレメントにより発現するｈＩＤＳの量の方が有意に高い。この実施例で使用したｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ８である。

それらの結果から、ＩＤＳ酵素のレベル及び活性は、ｈＩＤＳ－ＩＲＥＳ－ＳＵＭＦ１ベクターよりも、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥベクターでの発現の方が高いことが示された。

実施例７．マウスの血清及び組織における、ｒＡＡＶの駆動による、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥの長期的なｉｎｖｉｖｏ発現
この実施例では、３つの用量のｈＩＤＳ－ＷＰＲＥのうちの１つを投与したマウスにおいて、ｈＩＤＳのｉｎｖｉｖｏでの発現及び活性が比較されている。血清及び組織において、約１２～１３カ月にわたり、発現レベル及び活性を評価した。

マウスに、ｈＩＤＳＡＵＳｏｐｔ－ＷＰＲＥコンストラクト（ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６）を発現するｒＡＡＶベクターを５×１０^９ｖｇ（群Ｄ）、２．５×１０^１０ｖｇ（群Ｅ）、１．２５×１０^１１ｖｇ（群Ｆ）の用量で注射し、ネガティブコントロールとして、ヌルベクターコンストラクトｒＡＡＶ－ＭＹ０１１を１．２５×１０^１１ｖｇの用量で注射した（群Ｇ）。これらのコンストラクトの概略図は、図１Ｂ及び図２に示されている。

５～７週齢のマウスに、ベクターを２００μｌの体積で、尾静脈から注射し、注射から７日後、１４日後、２８日後、５６日後、８４日後、１１２日後、１４０日後、１６８日後、１９６日後、２２４日後、２５２日後、２８０日後、３０８日後、３３６日後及び３６４日後に、血清試料を採取した。週齢を適合させた野生型マウスの群をポジティブコントロールとして、週齢を適合させた未処置のＩＤＳ－ＫＯマウスの群をネガティブコントロールとして使用した。例示的なｉｎｖｉｖｏ試験が、表７に示されている。

血清中ｈＩ２Ｓのレベル及び活性：血清中ｈＩ２Ｓの発現レベルをＥＬＩＳＡによって求めた。結果は、図１０に示されている。ｈＩ２Ｓの濃度は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６ベクター（群Ｄ、Ｅ、Ｆ）の用量が多いほど上昇したとともに、ｈＩ２Ｓは、注射から３６４日後という最後の時点まで、検出可能な状態が維持された。この実施例で使用したｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ８である。

図１１に示されているように、ｈＩ２Ｓ活性のレベルを試験したところ、同様の結果が観察された。ｈＩ２Ｓ活性の濃度は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６ベクター（群Ｄ、Ｅ、Ｆ）の用量が多いほど上昇したとともに、ｈＩ２Ｓ活性は、注射から３６４日後という最後の時点まで、検出可能な状態が維持された。

組織中ｈＩ２Ｓのレベル及び活性：組織において、図１２Ａに示されているように、ＥＬＩＳＡを用いてｈＩ２Ｓを測定した。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｄ、Ｅ、Ｆ）では、ｈＩ２Ｓは、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺及び脳において検出可能であったとともに、用量が多いほど増加した。

組織では、ｈＩ２Ｓの活性は、図１２Ｂに示されているように測定された。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｄ、Ｅ、Ｆ）では、ｈＩ２Ｓの活性は、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺及び脳において検出可能であったとともに、用量が多いほど上昇した。

ヘパラン硫酸（ＨＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）を検出できる液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）アッセイを用いて、表７に示されているマウス群から、３６４日目に摘出した肝臓、腎臓、心臓、脾臓、肺及び脳の組織において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を測定した。その結果は、図１２Ｃに示されている。

それらの体細胞組織では、あらゆる用量（群Ｄ、Ｅ、Ｆ）のｒＡＡＶ－ＸＬ０２６で、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧのレベルが大きく低下した。図１２Ｄに示されているように、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧのレベルは、未処置のＩＫＯを低下率０％、ＷＴを低下率１００％として正規化した。３つのすべての用量のｒＡＡＶ－ＸＬ０２６（群Ｄ、Ｅ、Ｆ）で、体細胞組織におけるＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧの低下率が１００％であった。脳では、ＨＳＧＡＧは、低下率が、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄで１７％、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅで３８％、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｆで５０％であった。

肝臓、ならびに脳の海馬、視床、白質、皮質、小脳及び線条体のような様々な組織をＬＡＭＰ１染色した。脳は、図１２Ｅに示されている。未処置のＫＯ（群Ｈ）と比べて、ＬＡＭＰ１染色陽性率の低下は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄ、群Ｅ及び群Ｆでの海馬、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅ及び群Ｆでの線条体、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅ及び群Ｆでの白質、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅ及び群Ｆでの視床、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅ及び群Ｆでの皮質、ならびにｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅ及び群Ｆでの小脳において、統計的に有意となった。

骨の体積：マイクロコンピューター断層撮影（ｍｉｃｒｏ－ＣＴ）を用いて、体の構造を調べた。図１３Ａ及び図１３Ｂに示されているように、ｍｉｃｒｏ－ＣＴを用いて、７カ月齢、９カ月齢、１１カ月齢及び１３カ月齢のマウスで、骨の体積を経時的に測定した。

図１３Ａ及び図１３Ｂでは、線Ａは、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄに対応し、線Ｂは、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｅに対応し、線Ｃは、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｆに対応し、線Ｄは、ｒＡＡＶ－ＭＹ０１１の群Ｇ（ネガティブコントロール）に対応し、線Ｅは、未処置のＩＤＳ－ＫＯ群Ｈ（ネガティブコントロール）に対応し、線Ｆは、未処置の野生型群Ｉ（ポジティブコントロール）に対応する。

上腕骨（図１３Ａ）では、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄ、群Ｅ及び群Ｆにおける骨の体積測定値は、ポジティブコントロールである野生型群Ｉを上回っており、これらの群における体積は、ネガティブコントロールであるｒＡＡＶ－ＭＹ０１１の群Ｇ及び未処置のＩＤＳ－ＫＯ群Ｈよりも小さい。

１３カ月時点における頭蓋の頬骨弓（図１３Ｂ）では、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄ、群Ｅ及び群Ｆにおける骨の体積測定値は、ポジティブコントロールである野生型群Ｉを上回っており、これらの群における体積は、ネガティブコントロールであるｒＡＡＶ－ＭＹ０１１の群Ｇ及び未処置のＩＤＳ－ＫＯ群Ｈよりも小さい。

これらの結果から、Ｉ２Ｓを発現させた場合の上腕骨及び頬骨弓の骨の体積の方が小さく、それが、１３カ月にわたって維持されたことが示された。

総合すると、それらの結果から、血清及び組織でのＩ２Ｓの発現及び活性のレベル、ならびにその結果、骨の体積に及んだ作用が、約１２～１３カ月にわたって維持されたことが示された。

実施例８．マウスにおいて、低用量で投与してから３カ月間、ｒＡＡＶの駆動による、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥのｉｎｖｉｖｏ発現をモニタリングした結果
この実施例では、３カ月にわたって、ｈＩ２Ｓを５×１０^６～５×１０^９ｖｇの用量で投与したマウスにおけるｈＩ２Ｓのｉｎｖｉｖｏ発現及び活性が例示されている。

マウスに、ｈＩＤＳＡＵＳｏｐｔ－ＷＰＲＥコンストラクト（ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６）を発現するｒＡＡＶベクターを５×１０^６ｖｇ（群Ｃ）、５×１０^７ｖｇ（群Ｄ）、５×１０^８ｖｇ（群Ｅ）、５×１０^９ｖｇ（群Ｆ）の用量で注射し、ネガティブコントロールとして、ヌルベクターコンストラクトｒＡＡＶ－ＭＹ０１１を５×１０^９ｖｇの用量で注射した（群Ｂ）。

５～７週齢のマウスに、２００μｌのベクターを尾静脈から投与し、注射から１４日後、２８日後、５６日後及び８４日後に、血清試料を採取した。週齢を適合させた野生型マウスの群をポジティブコントロールとして、週齢を適合させた未処置のＩＤＳ－ＫＯマウスの群をネガティブコントロールとして使用した。例示的なｉｎｖｉｖｏ試験が、表８にまとめられている。

血清中ＩＤＳのレベル及び活性：低用量のｈＩＤＳ－ＷＰＲＥベクターを投与したマウスの血清におけるｈＩＤＳの発現レベルをＥＬＩＳＡによって求め、図１４Ａに示した。ｈＩ２Ｓの濃度は、群Ｄ、Ｅ、Ｆにおいて、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６ベクターの用量が少ないほど低下し、ｈＩ２Ｓは、群Ｃでは検出不能であった。この実施例で用いたｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ８である。

血清中Ｉ２Ｓの活性レベルは、図１４Ｂにおけるように測定された。ｈＩ２Ｓの濃度は、群Ｄ、Ｅ、Ｆにおいて、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６ベクターの用量が少ないほど低下し、ｈＩ２Ｓは、群Ｃでは検出不能であった。

総合すると、５×１０^８ｖｇの用量を投与した群Ｄ、及び５×１０^９ｖｇの用量を投与した群Ｅでは、Ｉ２Ｓの発現及び活性が、未処置のマウスよりも高く、Ｉ２Ｓのレベル及び活性は、８４日または３カ月にわたって維持された。

組織中Ｉ２Ｓのレベル及び活性：肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、骨髄、大腿四頭筋及び脳で、ＥＬＩＳＡによって測定したところ、未処置のＫＯ（群Ａ）及び未処置のＷＴ（群Ｊ）、ならびにネガティブコントロールｒＡＡＶ－ＭＹ０１１（群Ｂ）の群は、検出可能なヒトＩ２Ｓ（ｈＩ２Ｓ）タンパク質を含んでいなかった（図１４Ｃ）。５×１０^７ｖｇ～５×１０^９ｖｇでは、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄ、Ｅ及びＦは、用量が増えるほど、組織中に、高い濃度のｈＩ２Ｓを含んでいた。

図１４Ｄに示されているように、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、骨髄、大腿四頭筋及び脳において、Ｉ２Ｓ活性を測定した。ｒＡＡＶ－ＭＹ０１１（群Ｂ）では、すべての組織において、未処置のＫＯ（群Ａ）と同程度のＩ２Ｓ活性が見られた。５×１０^７ｖｇ～５×１０^９ｖｇでは、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の群Ｄ、Ｅ及びＦは、用量が増えるほど、組織中に、高い濃度のＩ２Ｓ活性を含んでいた。図１４Ｅに示されているように、投与したＫＯマウスの各組織におけるＩ２Ｓ活性レベルは、未処置のＷＴレベルに匹敵し得る。

ｈＩ２Ｓ－ＷＰＲＥを含むｒＡＡＶベクターを低用量投与したマウスでは、Ｉ２Ｓの組織中のレベル及び活性は、用量依存的に上昇した。

組織ＧＡＧレベル：ヘパラン硫酸（ＨＳ）及びデルマタン硫酸（ＤＳ）を検出できる液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）アッセイを用いて、表８に示されているマウス群から、８４日目に摘出した肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、骨髄、大腿四頭筋、皮膚及び脳の組織において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を測定した。表９及び表１０に示されているように、ＨＳＧＡＧ及びＤＳＧＡＧのレベルは、未処置のＩＫＯを低下率０％、ＷＴを低下率１００％として正規化した。

５×１０^８ｖｇのｒＡＡＶ－ＸＬ０２６群Ｅでは、測定したすべての体細胞組織において、ＨＳ及びＧＡＧのレベルが９０％超低下した。脳においては、５×１０^８ｖｇのｒＡＡＶ－ＸＬ０２６群Ｅでは、脳内のＨＳのレベルが８．８％低下し、ＧＡＧのレベルが４１％低下した。５×１０^９ｖｇのｒＡＡＶ－ＸＬ０２６群Ｆでは、測定したすべての体細胞組織において、ＨＳ及びＧＡＧのレベルが９５％超低下した。脳においては、５×１０^９ｖｇのｒＡＡＶ－ＸＬ０２６群Ｆでは、脳内のＨＳのレベルが３９％低下し、ＧＡＧのレベルが７８％低下した。

ＨＳ及びＧＡＧのレベルは、体細胞組織及び脳において、ＩＤＳ－ＷＰＲＥを含むｒＡＡＶを５×１０^７、５×１０^８または５×１０^９ｖｇ投与した時に低下した。

ライソゾーム蓄積：肝臓、脾臓、腎臓、心臓、ならびに脳の海馬、視床、白質、皮質、小脳及び線条体のような様々な組織をＬＡＭＰ１染色した。体細胞組織は、図１４Ｆに示されている。肝臓、脾臓及び心臓を含む体細胞組織では、ＬＡＭＰ１ＩＨＣ染色陽性率は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の用量５×１０^７ｖｇの群Ｄ、用量５×１０^８ｖｇの群Ｅ及び用量５×１０^９ｖｇの群Ｆにおいて、ナイーブなＫＯコントロールと比べて有意に低かった。腎臓では、ＬＡＭＰ１染色陽性率は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の用量５×１０^８ｖｇの群Ｅ及び用量５×１０^９ｖｇの群Ｆにおいて、ナイーブなＫＯコントロールと比べて有意に低かった。

脳領域におけるＬＡＭＰ１ＩＨＣ染色は、図１４Ｇに示されている。脳では、ＬＡＭＰ１染色陽性率は、海馬、線条体、視床、白質、皮質及び小脳において測定した。これらの領域のいずれでも、ＬＡＭＰ１染色陽性率は、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６用量群Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦでは、未処置のＫＯコントロール群Ａとの有意差がなかった。

それらの結果から、低用量のＩＤＳ－ＷＰＲＥを投与すると、ライソゾーム蓄積が、体細胞組織では軽減されるが、脳では、有意には軽減されないことが示された。

総合すると、これらの結果から、マウスにおいて、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥを含むｒＡＡＶを低用量投与すると、血清及び組織でのＩ２Ｓの発現及び活性が、約３カ月にわたって維持され、ＬＡＭＰによって求めたところ、ライソゾーム蓄積が、体細胞組織において軽減されることが示された。

実施例９．非ヒト霊長類動物（ＮＨＰ）における、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の血清中発現レベル
この実施例では、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物を投与した非ヒト霊長類動物における例示的なＰＫ／分布試験が例示されている。

雄の非ヒト霊長類動物（約１．８～２年齢）に、ｈＩ２Ｓ産物を静注によって投与した。低用量コホートの動物には、１．２５×１０^１２ｖｇ／ｋｇという低用量のｈＩ２Ｓを投与し（ｎ＝３）、高用量コホートの動物には、６．２５×１０^１２ｖｇ／ｋｇというさらに高い用量のｈＩ２Ｓを投与した（ｎ＝６）。コントロール動物には、処方緩衝液のみを投与した。

血清試料を様々な時点に採取した（投与前から開始して、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子の投与前に採取した後、２０日おきに２４０日目まで採取した）。３カ月目に、低用量コホート及び高用量コホートからそれぞれ３匹の動物を殺処分した。

図１５Ａには、ＮＨＰの血清において、投与から１日後～３カ月後の剖検で、低用量コホートから得られた、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の血清濃度が示されている。１．２５×１２ｖｇ／ｋｇ（低用量）において、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度が維持されたことが観察された。

これに対して、図１５Ｂでは、血清におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の酵素活性のレベルが、最長で３カ月維持されたことが示された。３カ月時点には、処方緩衝液のみを投与したコントロール動物で測定したＮＨＰの内因性Ｉ２Ｓの活性レベルと比べて、約５倍高いレベルのＩ２Ｓ酵素活性が観察された。

図１５Ｃには、３匹のＮＨＰでは、投与から１日後～約９０日後、すなわち３カ月後の剖検において、残りの高用量動物では、投与から１日後～約２４０日後、すなわち８カ月後において、高用量コホートのｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の血清中濃度が示されている。

その個々の動物から、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物プロファイルにばらつきがあることが示され、そのばらつきは、得られた初期の最高血清中濃度レベルで観察された。３カ月時点の剖検まで追跡した動物においては、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の血清中濃度の急激な低下が観察された。対応する血清中ｈＩ２Ｓ酵素活性は、向上した後、２１日目以降、約５２００～７５００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍＬのプラトーレベルまで低下したことから（図１５Ｄ）、３カ月時点に殺処分した３匹の動物では、Ｉ２Ｓ導入遺伝子産物濃度が低下したものの、血清中のｈＩ２Ｓ酵素活性は維持されたことが示された。

血清中のｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度及び血清中のＩ２Ｓ活性を約２４０日まで（８カ月）追跡した動物では、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度プロファイルにばらつきが見られた。２匹の動物では、約８カ月目までに、Ｉ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度が約１００ｎｇ／ｍＬ以下に低下した。このことは、約８カ月目までに、ｈＩ２Ｓ酵素活性が、ほぼ内因性レベル（処方緩衝液の場合）まで低下したことが観察されたこととも関連付けられた。この試験における動物のうちの１匹では、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度及び酵素活性が約８カ月まで維持された。

総合すると、これらのデータによって、非ヒト霊長類動物において、免疫抑制剤の非存在下でも、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の発現が持続したことが示された。

実施例１０．低用量及び高用量の場合の非ヒト霊長類動物におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の血清中濃度及びＩ２Ｓ酵素活性と、抗導入遺伝子産物抗体（別名、抗ｈＩ２ＳＡＤＡ（抗薬物抗体））及び抗ＡＡＶ８ＡＤＡ滴定値との比較
この実施例では、個々の非ヒト霊長類動物から得た抗ｈＩ２ＳＡＤＡと抗ＡＡＶ８ＡＤＡのデータを、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度及び酵素活性についてプロットしたものの比較結果が例示されている。

個々の動物から得た、抗ｈＩ２ＳＡＤＡ及び抗ＡＡＶ８ＡＤＡのデータを、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度及び酵素活性に対してプロットした（図１６）。これらのグラフでは、３カ月までのＡＤＡデータのみを示した。抗ｈＩ２ＳＡＤＡの非存在下では、一部の動物（２００１、３００２、４００３、４００１及び４００２）では、ｈＩ２Ｓレベルの初期低下が１カ月以内に観察された。ｈＩ２Ｓレベルの低下は、用量依存的ではなかった。ＮＨＰ血清中のｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度の初期低下（１カ月以内）は、動物ごとに異なっていた（１０％～８０％）。

高用量のｈＩ２Ｓを投与したコホートにおいて、平衡状態後の血清中のｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の減少は、抗ｈＩ２ＳＡＤＡの存在と相関していた。「平衡状態」または「再構築状態」とは、Ｉ２Ｓ酵素またはＩ２Ｓ酵素活性の「定常状態」またはプラトーレベルを指す。一部の動物（３００２及び４００１）では、抗ＡＡＶ８ＡＤＡの存在により、再投与を回避し得る。低用量コホートにおけるいずれの動物でも、血清中に抗ｈＩ２ＳＡＤＡの存在は見られなかった。

それらの結果から、ｈＩＤＳ－ＷＰＲＥを含む高用量のｒＡＡＶ－ＸＬ０２６を投与した非ヒト霊長類動物において、血清中Ｉ２Ｓレベルの低下が、抗ｈＩ２ＳＡＤＡの存在と相関することが示された。

実施例１１．個々の非ヒト霊長類動物の肝臓中ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度プロファイル
この実施例では、非ヒト霊長類動物の肝臓におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度プロファイルが例示されている。

１カ月目及び２カ月目に、低用量（図１７Ａ）及び高用量（図１７Ｂ）の両方の動物から、肝臓生検を行い、３カ月目に、殺処分時の肝臓試料を採取した。１２カ月時点での剖検を想定した高用量コホート動物３匹では、生検を３カ月及び６カ月の時点に行った。

各生検標本は、左葉及び右葉から採取した。低用量コホートに由来する肝臓における左葉及び右葉のｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物濃度の平均は、１カ月及び３カ月の平均が３８．２ｎｇ／ｍＬ～４２．５ｎｇ／ｍＬの範囲であった。

高用量コホートに由来する肝臓におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度は、１カ月目において、１７５．１ｎｇ／ｍＬ～３６７．６ｎｇ／ｍＬの範囲であった。これらの動物のうちの１匹（動物３００１）では、左葉（１０１．８ｎｇ／ｍＬ）と右葉（５２８．３ｎｇ／ｍＬ）との差が大きかった。

２カ月目には、２匹の動物（動物３００１及び動物３００２）で、肝臓中のｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度が、１カ月目から２カ月目までに大きく低下した。動物３００３を含む他の動物でも、２カ月目から６カ月目までに低下したが、低下の度合いは上記よりも小さかった。

総合すると、これらの結果から、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の投与から１カ月後から３カ月後の非ヒト霊長類動物の組織におけるＩ２Ｓ導入遺伝子産物の個々の濃度プロファイルが示された。

実施例１２．非ヒト霊長類動物の組織におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の相対的な濃度プロファイル
この実施例では、非ヒト霊長類動物の組織におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の相対的な濃度プロファイルが例示されている。

３カ月目に、低用量コホートの動物と、高用量コホートの動物３匹で、組織剖検を行った。

ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度は、ＥＬＩＳＡによって、腎臓、脾臓、肺、心臓及び骨髄を含む様々な器官に由来する組織ホモジネートで測定した。３カ月目の高用量コホートの血清におけるｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度では、抗ｈＩ２ＳＡＤＡの存在下において、低用量コホートの濃度（６４０ｎｇ／ｍＬ超）と比べて、有意に低いレベルが見られたが（２５０ｎｇ／ｍＬ未満）、腎臓（図１８Ａ）及び脾臓（図１８Ｂ）におけるｈＩ２Ｓ濃度の平均は、高用量コホートでは、低用量の場合よりもレベルが高かった。

抗ｈＩ２ＳＡＤＡの存在下において、高用量コホートの動物３匹は、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物の濃度が、肺（図１８Ｃ）及び心臓（図１８Ｄ）において低かったが、骨髄（図１８Ｅ）では、ｈＩ２Ｓの組織中濃度は、高用量コホート及び低用量コホートの動物間で同程度であった。例えば処方緩衝液群では、組織が健常なＮＨＰのものであったため、肺において、内因性Ｉ２Ｓが検出される。

これらの結果から、ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６の処置後、様々な非ヒト霊長類動物組織において、相対的なＩ２Ｓ濃度プロファイルが見られた。

実施例１３．非ヒト霊長類動物における、ＩＤＳノックアウトマウスに対する相対的なｈＩ２Ｓの組織暴露量
この実施例では、非ヒト霊長類動物とＩＤＳＫＯマウスとの間で、様々な標的組織における相対的なＩ２Ｓ濃度及び酵素活性が例示されている。

ＩＤＳＫＯマウスにおける、２．５ｘ１０^１１ｖｇ／ｋｇ及び２．５ｘ１０^１０ｖｇ／ｋｇの場合の組織中のｈＩ２Ｓ酵素活性と、対応するＨＳＧＡＧ低下率（％）が表１１に示されている。

マウスでは、約２．５ｘ１０^１０ｖｇ／ｋｇの用量において、腎臓を除く大半の組織で、ＨＳＧＡＧの９５％超の低下が観察され、腎臓では、約９１％の低下が観察された。心臓及び骨髄では、低用量コホートの非ヒト霊長類動物から得られたデータから、ｈＩ２Ｓの組織中濃度及び酵素活性が、２．５ｘ１０^１０ｖｇ／ｋｇにおいて、ＩＤＳＫＯマウスの場合よりも高いことが示された。

肺組織においては、ＩＤＳＫＯマウスでは、ＷＴＩ２Ｓ酵素活性の３０％に過ぎなかったが、このレベルでは、ＨＳＧＡＧの低下率は９７％であった。低用量のｈＩ２Ｓを投与した非ヒト霊長類動物では、肺における酵素活性は、ＷＴｈＩ２Ｓ酵素活性に対する割合がさらに高く、４０％であった。ｒＡＡＶ－ＸＬ０２６をＩＶ注入によって、１．２５×１０^１２ｖｇ／ｋｇでＮＨＰに投与することによって、肺において、ｈＩ２Ｓ導入遺伝子産物に十分に暴露され、その結果、疾患モデルにおいてＨＳＧＡＧの低下率が９５％以上となり得る。

均等物及び範囲
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記説明に限定されるようには意図されておらず、むしろ、添付の特許請求の範囲で定められているとおりである。

Claims

ＡＡＶ８キャプシドと、ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードするコドン最適化配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
ＡＡＶ９キャプシドと、ヒトイズロン酸－２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードするコドン最適化配列とを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
前記ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするコドン最適化配列が、配列番号６との同一性が少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約９９％である配列を含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。
前記ヒトＩ２Ｓ酵素をコードするコドン最適化配列が、配列番号１１または１２と同一の配列を含む、請求項３に記載のｒＡＡＶベクター。
肝臓特異的プロモーターをさらに含む、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
前記肝臓特異的プロモーターが、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）である、請求項５に記載のｒＡＡＶベクター。
５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲ、前記Ｉ２Ｓ配列の上流のイントロン、ならびにシス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む、請求項５または６に記載のｒＡＡＶベクター。
ユビキタスプロモーターをさらに含む、請求項２に記載のｒＡＡＶベクター。
５’逆位末端反復配列及び３’逆位末端反復配列、前記Ｉ２Ｓ配列の上流のイントロン、ならびにシス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）をさらに含む、請求項８に記載のｒＡＡＶベクター。
スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
前記ＳＵＭＦ１の前に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）がある、請求項１０に記載のｒＡＡＶベクター。
ＷＰＲＥ配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
前記イントロンが、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）またはＳＶ４０のイントロンである、請求項７または９に記載のｒＡＡＶベクター。
前記ＣＲＭが、肝臓特異的ＣＲＭである、請求項７または９に記載のｒＡＡＶベクター。
前記ＣＲＭが、ニューロン特異的ＣＲＭである、請求項７または９に記載のｒＡＡＶベクター。
前記ＣＲＭが、ＣＲＭ８である、請求項７または９に記載のｒＡＡＶベクター。
ＣＲＭを少なくとも３つ含む、請求項７または９に記載のｒＡＡＶベクター。
ＡＡＶ８キャプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、ｒＡＡＶベクターであって、前記ベクターが、
ａ．５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と、
ｂ．シス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）と、
ｃ．肝臓特異的プロモーターと、
ｄ．マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）と、
ｅ．ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードする配列と、
ｆ．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｇ．３’ＩＴＲと、
を含む前記ｒＡＡＶ及び前記ベクター。
前記ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列が、野生型配列またはコドン最適化配列である、請求項１８に記載のｒＡＡＶ。
前記ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列が、配列番号６との同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であるコドン最適化配列である、請求項１９に記載のｒＡＡＶ。
スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）をコードする配列と、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１８に記載のｒＡＡＶ。
ＡＡＶ９キャプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、ｒＡＡＶベクターであって、前記ベクターが、
ａ．５’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と、
ｂ．シス作動性調節モジュール（ＣＲＭ）と、
ｃ．ユビキタスプロモーターと、
ｄ．マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）と、
ｅ．ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をコードする配列と、
ｆ．ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、
ｇ．３’ＩＴＲと、
を含む前記ｒＡＡＶ及び前記ベクター。
前記ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列が、野生型配列またはコドン最適化配列である、請求項２２に記載のｒＡＡＶ。
前記ヒトＩ２Ｓ酵素をコードする配列が、配列番号６との同一性が少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％であるコドン最適化配列である、請求項２３に記載のｒＡＡＶ。
スルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）をコードする配列と、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項２２に記載のｒＡＡＶ。
前記ｒＡＡＶベクターが、ＡｐｏＢを含まない、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）である対象の治療方法であって、治療が必要な前記対象に、先行請求項のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを投与することを含む前記方法。
ハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）である対象の治療方法であって、治療が必要な前記対象に、ＡＡＶ８キャプシドまたはＡＡＶ９キャプシドと、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）をコードする核酸配列に機能可能に連結したプロモーターとを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを投与することを含み、前記投与により、前記対象におけるＩ２Ｓ酵素活性を向上させる前記方法。
前記Ｉ２Ｓ活性の向上が、前記対象の血清において検出される、請求項２８に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性の向上が、前記対象の肝臓において検出される、請求項２８～２９のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性が、中枢神経系（ＣＮＳ）において検出される、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性の向上が、前記対象の脳において検出される、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性の向上が、前記脳の海馬、視床、脳梁、皮質、小脳または線条体において検出される、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性の向上が、前記対象の腎臓において検出される、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性の向上が、１回投与してから少なくとも３０日、６０日、９０日、１２０日、１５０日、１８０日またはそれを上回る日数維持される、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性のレベルをヘパリン硫酸アッセイによって測定する、請求項２８～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｉ２Ｓ活性のレベルをデルマタン硫酸アッセイによって測定する、請求項２８～３５のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記対象におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のレベルを低下させる、請求項２８～３７のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記対象の血清におけるＧＡＧのレベルを低下させる、請求項３８に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記対象の肝臓におけるＧＡＧのレベルを低下させる、請求項３８～３９のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記対象の腎臓におけるＧＡＧのレベルを低下させる、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記対象のＣＮＳにおけるＧＡＧのレベルを低下させる、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記対象の脳におけるＧＡＧのレベルを低下させる、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを投与することにより、前記脳の海馬、視床、脳梁、皮質、小脳または線条体におけるＧＡＧのレベルを低下させる、請求項４３に記載の方法。
前記ＡＡＶを静脈内投与する、請求項２８～４４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを髄腔内投与する、請求項３０～４４のいずれか１項に記載の方法。
前記ＡＡＶを約５×１０^９ｖｇの用量で投与する、請求項４５または４６に記載の方法。
前記ｒＡＡＶを投与しても、免疫応答が誘発されない、請求項３０～４７のいずれか１項に記載の方法。