CN104936606A - 糖原贮积病的基因疗法 - Google Patents
糖原贮积病的基因疗法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104936606A CN104936606A CN201380054477.1A CN201380054477A CN104936606A CN 104936606 A CN104936606 A CN 104936606A CN 201380054477 A CN201380054477 A CN 201380054477A CN 104936606 A CN104936606 A CN 104936606A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- disease
- methods
- tfeb
- gsd
- muscle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000007345 glycogen storage disease Diseases 0.000 title claims abstract description 58
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 title description 11
- 101710162524 Transcription factor EB Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 102100028502 Transcription factor EB Human genes 0.000 claims abstract description 74
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 109
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 72
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 claims description 71
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 claims description 71
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 60
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 59
- 101150062178 Tfeb gene Proteins 0.000 claims description 47
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 45
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 42
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 18
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 18
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 claims description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 16
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 15
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 14
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 claims description 12
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 11
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 11
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 claims description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000039 congener Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 claims description 9
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 8
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 claims description 8
- 208000032008 Glycogen storage disease due to glycogen debranching enzyme deficiency Diseases 0.000 claims description 8
- 206010053250 Glycogen storage disease type III Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 8
- 201000004543 glycogen storage disease III Diseases 0.000 claims description 8
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 7
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 claims description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 6
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 claims description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 5
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 claims description 4
- 206010053249 Glycogen Storage Disease Type IV Diseases 0.000 claims description 4
- 208000011123 Glycogen storage disease due to glycogen branching enzyme deficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018462 Glycogen storage disease type V Diseases 0.000 claims description 4
- 206010053240 Glycogen storage disease type VI Diseases 0.000 claims description 4
- 101100463018 Mus musculus Pck1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000004510 glycogen storage disease VI Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 abstract description 10
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000001500 Glycogen Storage Disease Type IIb Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000011518 Danon disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000035148 Glycogen storage disease due to LAMP-2 deficiency Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 22
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 22
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 21
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 9
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 9
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 8
- 210000004957 autophagosome Anatomy 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 7
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 7
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 6
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 6
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 4
- 108010059343 MM Form Creatine Kinase Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 4
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 244000309464 bull Species 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 4
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 4
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 4
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150117895 LAMP2 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100038225 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 Human genes 0.000 description 3
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 description 3
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- 206010011469 Crying Diseases 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 101710116771 Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 2
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 2
- 208000000149 Multiple Sulfatase Deficiency Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035032 Multiple sulfatase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 101100536763 Mus musculus Tfeb gene Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000004929 autophagosome-lysosome fusion Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 2
- 238000007431 microscopic evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 1
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 108700021053 Basic Helix-Loop-Helix Leucine Zipper Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000043895 Basic helix-loop-helix leucine zipper transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 description 1
- 206010051093 Cardiopulmonary failure Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000316907 Eucalymnatus tessellatus Species 0.000 description 1
- 101150115151 GAA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004859 Gamochaeta purpurea Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000803527 Homo sapiens Vacuolar ATPase assembly integral membrane protein VMA21 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010062018 Inborn error of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010009491 Lysosomal-Associated Membrane Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000940612 Medina Species 0.000 description 1
- 208000010428 Muscle Weakness Diseases 0.000 description 1
- 206010056677 Nerve degeneration Diseases 0.000 description 1
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000033240 Progressive symmetric erythrokeratodermia Diseases 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000037340 Rare genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010042434 Sudden death Diseases 0.000 description 1
- 108091085011 TFE family Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035048 Vacuolar ATPase assembly integral membrane protein VMA21 Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000008683 X-linked myopathy with excessive autophagy Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 102000016679 alpha-Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- 208000025341 autosomal recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 206010020871 hypertrophic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000001964 muscle biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000004965 peroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 230000009325 pulmonary function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N tribromoethanol Chemical compound OCC(Br)(Br)Br YFDSDPIBEUFTMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004616 tribromoethanol Drugs 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/025—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a parvovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Endocrinology (AREA)
Abstract
本发明涉及转录因子EB(TFEB)蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段；包含TFEB蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的嵌合分子；编码所述蛋白质或其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；经遗传工程改造的表达所述多肽的宿主细胞或者用于治疗或/和预防糖原贮积病的药物组合物。优选庞帕病或达农(Danon)病。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年10月17日提交的美国临时申请第61/715,187号的权益，其内容通过引用全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及转录因子EB(TFEB)蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段；包含TFEB蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的嵌合分子；编码所述蛋白质或其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；经遗传工程改造的表达所述多肽的宿主细胞或者用于治疗或/和预防糖原贮积病的药物组合物。优选庞帕病或达农(Danon)病。
技术背景
已经基于不同的策略和理论探索了用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的多种治疗方法。这些包括造血干细胞移植(HSCT)、酶替代疗法(ERT)、减少底物疗法(SRT)、药理学伴护疗法(PCT)和基因疗法(GT)。
一般而言，这些方法可分为两个大类：目标在于增加失去的酶的残留活性的那些(如HSCT、ERT、PCT和GT)以及旨在减少积累底物的合成的那些(SRT)。通常，这些疗法的目标是恢复所谓的“贮积方程”的平衡，其为底物合成和分解之间的平衡。
然而，这些方法各自通常仅指示特定疾病，并且它们中的许多不能完全治愈多系统疾病(如LSD)的各个方面。
庞帕病是溶酶体贮积病，也属于糖原贮积病类，其由溶酶体水解酶酸α-葡糖苷酶(GAA)，一种糖原降解性溶酶体酶的缺陷或功能障碍所致。GAA的缺陷导致在庞帕病患者的许多组织中的溶酶体糖原的积累，其心脏和骨骼肌组织受到最严重的影响。所有形式的庞帕病合计发生率估计为1∶40,000，并且该疾病影响所有的群体而没有种族倾向。估计大约三分之一的庞帕病患者具有快速发展的、致命的婴儿发病型的病症，而大多数的患者存在较缓慢发展的、青少年或晚发性的病症。
现在，仅有的批准用于庞帕病的治疗，酶替代疗法，已经显示出严重局限(Schoser等.(2008)“Therapeutic approaches in glycogen storage diseasetype II/Pompe Disease(在II型糖原贮积病/庞帕病中的治疗方法)”Neurotherapeutics 5：569-7)。例如，虽然经过治疗，但是一些患者只获得有限的临床益处，尤其是在骨骼肌中，或者显示出疾病发展的迹象。
达农病也是由溶酶体酶，尤其是LAMP2基因中的突变造成的糖原贮积病，该基因编码溶酶体膜的基本组分并且似乎在自噬体-溶酶体融合中起到作用。达农病的特征在于严重的心肌病和不同程度的肌无力，经常与智力缺陷相关联。还没有针对这种疾病的特定治疗。
庞帕病和达农病属于糖原贮积病(GSD，也称为糖原病和糖原贮积症)。GSD归因于在糖原合成或在肌肉、肝脏和其他细胞类型中降解的过程中的缺陷。GSD有两类原因：遗传性和获得性。遗传性GSD是由这些过程中涉及的代谢(遗传上有缺陷的酶)的任何先天性障碍造成的。总之，根据在英属哥伦比亚中的一项研究，每100000个新生儿中大约有2.3位儿童(四万三千分之一)患有某种形式的糖原贮积病。在美国，估计在每20000-25000个新生儿中出现1例。荷兰研究估计为四万分之一。
发明内容
本发明提供了糖原贮积病，尤其是庞帕病或达农病的改善疗法。本发明部分基于如下发现：可使用基因疗法将转录因子EB(TEEB)(碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子MiTF/TFE家族成员)有效递送至骨骼肌以诱导溶酶体胞吐并将积累的贮积材料排到胞外空间中，导致有效清除肌肉中的糖原贮积并缓解肌肉病变。因此，本发明首次证明通过清除主要患病组织(如骨骼肌中)TFEB过表达诱导的积累底物，可治愈糖原贮积病，尤其是庞帕病或达农病的临床表现。
因此，本发明的目的是选自下组的化合物：
a)转录因子EB(TFEB)蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段；
b)包含TFEB蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的嵌合分子；
c)编码所述蛋白质或其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的多核苷酸；
d)包含所述多核苷酸的载体；
e)经遗传工程改造的表达所述多肽的宿主细胞
其用于治疗或/和预防糖原贮积病。
优选地，糖原贮积病的特征在于糖原在肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统中的积累。
更优选的，糖原贮积病选自下组：Ia型GSD(肝糖原累积症)、I非a型GSD(各种亚型)、II型GSD(庞帕病)、IIb型GSD(达农病)、III型GSD(科里病或福布斯病)、IV型GSD(安德森病)、V型GSD(麦卡德尔综合征)、VI型GSD(赫斯病)、VII型GSD(他瑞(Tarui)病)、IX型GSD、XI型GSD(范科尼-彼克(Fanconi-Bickel)综合征)、XII型GSD(红细胞醛缩酶缺陷)、XIII型GSD和0型GSD。
而优选的糖原贮积病是庞帕病或达农病。
优选地，将该化合物递送至含积累糖原的目标组织。优选地，目标组织选自肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统。优选地，目标组织是肌肉和/或肝脏。更优选地，该肌肉是骨骼肌、心肌和/或隔膜。优选地，通过全身性给药递送该化合物。优选地，全身性给药是静脉内给药。
在一个优选的实施方式中，通过局部给药递送该化合物。优选地，局部给药是肌肉内给药。在优选的实施方式中，TFEB蛋白包含与SEQ IDNO：2至少80％相同的氨基酸序列。
优选地，TFEB蛋白包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。更优选地，TFEB蛋白包含由SEQ ID NO：2组成的氨基酸序列。
在一个优选的实施方式中，多核苷酸包含控制TFEB蛋白表达的组织特异性启动子序列。
优选地，该组织特异性启动子序列是肌肉特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：3组成的MCK启动子序列：
CTAGCAATTAGCTAGCTGGGAAAGGGCTGGGCCCCATGTAAATATTTCTAAAGCACCCCTCTCCCCTCCCCCCTCAGATCAGGAGTCTGAGGGAGAGGCACAGAGGCTCCCTTTCTCTAAGCCAGTCCTCACCTGCCTAAGAAGATGTGAAGGAGACCCAGGAGACCCTGGGATAGGGAGGAACTCAGAGGGAAGGGACATTCTTTTCTTCGTCGCAATCCTGGGAGCTCCCTGGAGGAGGAGACCCGATCAGCCTGCAATCCTGGCGCGTCCCAGGAGGAGAAAGCGGCTTCCTCTATACTGTACTCTCCTCCACAGAACCCCCCTCTCAGCCCTGGAAGTCCTTGCTCACAGCCGAGGCGCCGAGAGCGCTTGCTCTGCCCAGATCTGCGCGAGTCTGGCGCCCGCGCTCTGAACGGCGTCGCTGCCCAGCCCCCTTCCCCGGGAGGTGGGAGCGGCCACCCAGGGCCCCGTGGCTGCCCTTGTAAGGAGGCGAGGCCCGAGGACACCCGAGACGCCCGGTTATAATTAACCAGGACACGTGGCGAACCCCCCTCCAACACCTGCCCCCGAACCCCCCCATACCCAGCGCCTCGGGTCTCGGCCTTTGCGGCAGAGGAGACAGCAAAGCGCCCTCTAAAAATAACTCCTTTCCCGGCGACCGAGACCCTCCCTGTCCCCCGCACAGCGGAAATCTCCCAGTGGCACCGAGGGGGCGAGGGTTAAGTGGGGGGGAGGGTGACCACCGCCTCCCACCCTTGCCCTGAGTTTGAATCTCTCCAACTCAGCCAGCCTCAGTTTCCCCTCCACTCAGTCCCTAGGAGGAAGGGGCGCCCAAGCGCGGGTTTCTGGGGTTAGACTGCCCTCCATTGCAATTGGTCCTTCTCCCGGCCTCTGCTTCCTCCAGCTCACAGGGTATCTGCTCCTCCTGGAGCCACACCTTGGTTCCCCGAGGTGCCGCTGGGACTCGGGTAGGGGTGAGGGCCCAGGGGGCACAGGGGGAGCCGAGGGCCACAGGAAGGGCTGGTGGCTGAAGGAGACTCAGGGGCCAGGGGACGGTGGCTTCTACGTGCTTGGGACGTTCCCAGCCACCGTCCCATGTTCCCGGCGGGGGGCCAGCTGTCCCCACCGCCAGCCCAACTCAGCACTTGGTCAGGGTATCAGCTTGGTGGGGGGGCGTGAGCCCAGCCCCTGGGGCGGCTCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCGCAAAGCATGCCTGGGTTCAGGGTGGGTATGGTGCGGGAGCAGGGAGGTGAGAGGCTCAGCTGCCCTCCAGAACTCCTCCCTGGGGACAACCCCTCCCAGCCAATAGCACAGCCTAGGTCCCCCTATATAAGGCCACGGCTGCTGGCCCTTCCTTTGGGTCAGTGTCACCTCGGCCGCC(来自Tessitore A.等，Mol Ther，2007)
优选地，该组织特异性启动子序列是肝脏特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：4组成的PEPCK启动子序列：
CTTTGGGGAGTCCTAAGAGGGCAGCTGGCAATGGACACCTAGCAGTCCCTTTGAGACTTATTTCAGATGGAGCTGTAGAAAGATGCCATGGCTCACAGTGCCTCCCTGGGAAGGGGGCAGAGGGCTGCCCAGTGAGGCCTCTTGCGAGCAGGAAATCACCAGAGACAAGGAAAGACCAGACCCCAGGATGACCTCAGTTAGGCCTTGCCCGACTGTCCTCAGAGTCCCATTCTCTGTGTCCTGGTTCTTTTAGAAGATCATGGACCTCCAGGTCATTTCGTAACCGGAATCTGCCTGCGGGGGGTTTTGACAAGCTATGGTATAGTGTATGTGGGGGTACTGACGAATTGGAAGATCATGGAGACCCCTTCTCCTCCTCCATCATTGGTCTGCCACATCCCTCCCAGGCGACTCACAGCAGAGAGACCTTGGATGTATGTAGGGTGCTTTAAAACTCCAGCTGAGTTACAGTCTCTCCTTTCTGTTTTCACCTTAACCTTCCAGGGATGCAAACCCACGACAGGTTTAGCAGCAGAGTGGAGGCTGGCCATGAATCTCAGAGAAAGTGCTCACTGGAAAGGCTGGTTTAGCCCAGGCCTGATGTGGAGGCACTGAGCTGGACGTTCTAGCGGGGTTGACACCCAACAGTTTACATAGGGGGAGGCCACCCCTCCTGAGCAGTCTCGGTGACTTGAAGAGGAAGCCGCTTCTTCTGTACCAACACAGAAGCTCCAGCGAACCCCCAGAATGCTGGCAGTGTGGGTGCTATGTAAAAGTATTTACATAGCTTTGTAGAGTGAGCCAAGCCCAGTCTGTTTGGGATGACTCTTCACAGTGCCTCGAATCTGTCACACGTCTTAGTAAGCAGAGTCACAGAGTTTCTGTCACATCATCCTCCTGCCTACAGGGAAGTAGGCCATGTCCCTGCCCCCTACTCTGAGCCCAGCTGTGGGAGCCAGCCCTGCCCAATGGGCTCTCTCTGATTGGCTTCTCACTCACTTCTAAACTCCAGTGAGCAACTTCTCTCGGCTCGTTCAATTGGCGTGAAGGTCTGTGTCTTGCAGAGAAGGTTCTTCACAACTGGGATAAAGGTCTCGCTGCTCAAGTGTAGCCCAGTAGAACTGCCAAGCCCCTTCCCCTCCTCTCCCTAGACTCTTGGATGCAAGAAGAATCCAGGCAGCTCCAAGGGTGATTGTGTCCAACCTAGAATGTCTTGAAAAAGACATTAAGGGGACTAGAGAAGACAGGGGATCCAACGGTTCTCTGCAGCCCAGCCTGACTGACATGTAACTCTTCTGGTTCTCACCAGCCAGCTGGACCTGCTTAGTATTCTTTCTGCCTCAGTTTCCCAGCCTGTACCCAGGGCTGTCATAGTTCCATTTCAGGCAGTAGTAATGAATGAGCTGACATAAAACATTTAGAGCAGGGGTCAGTATGTATATAGAGTGATTATTCTATATCAGGCATTGCCTCCTCGGAATGAAGCTTACAATCACCCCTCCCTCTGCAGTTCATCTTGGGGTGGCCAGAGGATCCAGCAGACACCTAGTGGGGTAACACACCCCAGCCAACTCGGCTGTTGCAGACTTTGTCTAGAAGTTTCACGTCTCAGAGCTGAATTCCCTTCTCATGACCTTTGGCCGTGGGAGTGACACCTCACAGCTGTGGTGTTTTGACAACCAGCAGCCACTGGCACACAAAATGTGCAGCCAGCAGCATATGAAGTCCAAGAGGCGTCCCGGCCAGCCCTGTCCTTGACCCCCACCTGACAATTAAGGCAAGAGCCTATAGTTTGCATCAGCAACAGTCACGGTCAAAGTTTAGTCAATCAAACGTTGTGTAAGGACTCAACTATGGCTGACACGGGGGCCTGAGGCCTCCCAACATTCATTAACAACAGCAAGTTCAATCATTATCTCCCCAAAGTTTATTGTGTTAGGTCAGTTCCAAACCGTGCTGACCATGGCTATGATCCAAAGGCCGGCCCCTTACGTCAGAGGCGAGCCTCCAGGTCCAGCTGAGGGGCAGGGCTGTCCTCCCTTCTGTATACTATTTAAAGCGAGGAGGGCTAGCTACCAAGCACGGTTGGCCTTCCCTCTGGGAACACACCCTTGGCCAACAGGGGAAATCCGGCGAGACGCTCTGAG
在优选的实施方式中，多核苷酸包含与SEQ ID NO：1至少60％相同的核苷酸序列。优选地，多核苷酸包含与SEQ ID NO：1至少80％相同的核苷酸序列。更优选地，多核苷酸包含由SEQ ID NO：1组成的核苷酸序列。
在优选的实施方式中，载体是选自下组的表达载体：病毒载体、质粒、病毒颗粒和噬菌体。
优选地，该病毒载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关载体(AAV)和裸质粒DNA载体。
优选地，该AAV载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其组合。
更优选地，该AAV载体是AAV1、AAV2或AAV9载体。
更优选地，AAV载体是嵌合和/或假型载体。
优选地，所述分子的递送导致在肌肉和/或肝脏中糖原贮积的减少。优选地，该肌肉是骨骼肌。
更优选地，所述分子的递送导致在肌肉和/或肝脏中糖原贮积的强度、严重程度或频率降低或延迟发生。
本发明的另一个目的是用于治疗和/或预防糖原贮积病的药物组合物，该组合物包含药学上可接受的赋形剂和前述权利要求中任一项所定义的化合物。
本发明的另一个目的是治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要治疗的对象递送编码转录因子EB(TFEB)基因的核酸的步骤。
在该方法中，优选地，将编码TFEB基因的核酸递送至含积累糖原的目标组织。更优选地，目标组织选自肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统。更优选地，目标组织是肌肉和/或肝脏。更优选地，该肌肉是骨骼肌、心肌和/或隔膜。在该方法中，优选地，通过全身性给药递送核酸。优选地，全身性给药是静脉内给药。优选地，通过局部给药递送核酸。更优选地，局部给药是肌肉内给药。更优选地，核酸是病毒载体。优选地，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
更优选地，该AAV载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其组合。优选地，该AAV载体是AAV1、AAV2或AAV9载体。更优选地，AAV载体是嵌合和/或假型载体。
在一个优选的实施方式中，该核酸还包含控制TFEB基因表达的组织特异性启动子序列。
优选地，该组织特异性启动子序列是肌肉特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：3组成的MCK启动子序列。
优选地，该组织特异性启动子序列是肝脏特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：4组成的PEPCK启动子序列。
在该方法中，优选地，TFEB基因包含与SEQ ID NO：1至少60％相同的核苷酸序列。优选地，TFEB基因包含与SEQ ID NO：1至少80％相同的核苷酸序列。更优选地，TFEB基因包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。优选地，TFEB基因包含编码与SEQ ID NO：2至少80％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
在优选的实施方式中，TFEB基因包含编码与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选地，TFEB基因包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选地，所述编码TFEB基因的核酸的递送导致肌肉和/或肝脏中糖原贮积的减少。更优选地，所述编码TFEB基因的核酸的递送导致骨骼肌中糖原贮积的减少。
本发明的另一个目的是治疗糖原贮积病的方法，该方法包括向需要治疗的对象给予编码转录因子EB(TFEB)基因的核酸的步骤，使得肌肉和/或肝脏中的糖原贮积的强度、严重程度或频率降低或者延迟发生。
优选地，全身性给予编码TFEB基因的核酸。优选地，静脉内给予TFEB基因。
在一个优选的实施方式中，肌肉内给予编码TFEB基因的核酸。
更优选地，核酸是选自下组的表达载体：病毒载体、质粒、病毒颗粒和噬菌体。
优选地，该病毒载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关载体(AAV)和裸质粒DNA载体。
优选地，该AAV载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其组合。
更优选地，该AAV载体是AAV1、AAV2或AAV9载体。
在具体的实施方式中，该目标组织是肌肉(例如，骨骼肌、心肌和/或隔膜)。
在本发明中，蛋白质的重组、合成或生物技术功能衍生物、等位基因变体，蛋白质的肽片段，包含TFEB蛋白的嵌合分子，其合成或生物技术功能衍生物被定义为能够维持TFEB的治疗(即糖原贮积病，尤其是庞帕病或达农病的治疗)效果的分子。
在下组中选择衍生物：具有与SEQ ID NO.2至少45％，优选至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％或95％的相同性百分比的蛋白质或其同源物。
片段是指具有至少50个氨基酸、优选至少100个氨基酸、更优选至少150个氨基酸长度的蛋白质。
本发明的多核苷酸选自RNA或DNA，优选所述多核苷酸是DNA。
在本发明中，宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞，所述宿主细胞优选是动物细胞。
药物组合物用于全身、口服或局部给药。
在本发明中，病毒载体可选自下组：腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、假型AAV载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。假型AAV载体是在第二AAV血清型的衣壳中含有一种AAV血清型的基因组的载体；例如，AAV2/8载体含AAV8衣壳和AAV2基因组(Auricchio等.Hum.Mol.Genet.10(26)：3075-81(2001))。这类载体也称为嵌合载体。可使用本领域已知的裸质粒DNA载体和其他载体来递送本发明的TFEB基因36。递送系统的其他示例包括离体递送系统，其包括但不限于DNA转染方法，如电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、收缩的DNA介导的转染。一般而言，病毒载体可容纳转基因(即，本文所述的TFEB基因)和调节元件。
可使用各种方法来将编码本文所述的TFEB基因的病毒载体递送到需要治疗的对象中。例如，病毒载体可通过静脉内或血管内注射递送。全身性递送的其他途径包括，但不限于，动脉内、心脏内、腹膜内和皮下途径，或者通过局部给药，如肌肉注射或肌肉内给药。
可以1x1010病毒颗粒(vp)/kg至1x1013vp/kg的剂量范围注射本发明的载体，尤其是AAV载体，尤其是AAV2/1或AAV2/9载体。
1x1011至1x1012vp/kg的剂量范围更可能在人中有效，因为预期这些剂量在肌肉(心肌和骨骼肌)和肝脏中导致高转导效率。
可以1x1011载体基因组(vg)/kg至1x1013vg/kg的剂量注射本发明的载体，尤其是AAV载体，预期提供高肌肉和肝脏转导(Nathwani，A.C.等.N Engl J Med365，2357-2365(2011))。
腺病毒载体基因组没有整合到转导的细胞的基因组中并且载体基因组因此在主动分裂的细胞中缺失37。如果TFEB表达随着时间下降，为了维持表型正确，可能再次给予具有不同血清型的载体以克服由第一次给药引发的中和抗-Ad抗体(Kim等.Proc Natl Acad Sci USA 98：13282-13287(2001)；Morral等.Proc Natl Acad Sci USA.1999；96：12816-12821)(1999))。
本发明提供药物组合物，其包含：a)本文所述的有效量的载体或本文所述的有效量的转化的宿主细胞，和b)药学上可接受的运载体，其可以是惰性的或有生理活性。
如本文所用，“药学上可接受的运载体或赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包被、抗细菌剂和抗真菌剂等。合适的运载体、稀释剂和/或赋形剂的示例包括以下的一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲的盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，组合物中优选包含等张剂，例如糖、多元醇或氯化钠。具体地，合适的运载体的相关示例包括：(1)达氏磷酸盐缓冲盐水，pH为约7.4，含或不含约1mg/ml至25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠(NaCl))，和(3)5％(w/v)右旋糖；并且也可含有抗氧化剂，如色胺和稳定剂，如吐温20。
本发明包含的药物组合物也可含有用于治疗糖原贮积病(尤其是庞帕病或达农病)的其他治疗剂。
本发明的组合物可以是各种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体，但是优选的形式取决于给药和治疗应用的预期模式。一般优选的组合物是可注射或不熔性溶液的形式。优选的给药模式是胃肠外(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)。在优选的实施方式中，通过推注或在一段时间内连续输注静脉内给予本发明的组合物。在另一个优选的实施方式中，通过肌肉内、皮下、关节内、滑膜内、肿瘤内、肿瘤周围、病灶内、病灶周围的途径注射以发挥局部以及全身性治疗效果。
可通过将所需量的本发明所述的载体或宿主细胞纳入合适的溶剂中，之后通过微滤灭菌来制备肠胃外给药的无菌组合物。作为溶剂或载剂，可以使用水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、乙醇等，及其组合。在许多情况下，组合物中优选包含等张剂，例如糖、多元醇或氯化钠。这些组合物也可含有辅料，尤其是湿润剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。也可以无菌固体组合物的形式制备用于胃肠外给药的无菌组合物，其可在使用时溶解于无菌水或任何其他可注射的无菌介质中。
可以使用药学上可接受的溶液、悬浮液、乳液、混悬剂和酏剂，其可含有惰性稀释剂，如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油。这些组合物可包含稀释剂以外的物质，用于例如，对产品进行润湿、增甜、增稠、调味或稳定化。
该剂量依赖于所需的效果、治疗的持续时间和使用的给药途径，并且可易于由本领域技术人员使用已知的技术确定。
如医学领域所熟知，用于任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、给予的特定化合物、患者性别、给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。
本申请所用术语“约”和“大约”可以等同使用。该申请中使用的带有或不带约/大约的任何数字覆盖由相关领域普通技术人员所接受的任何正常波动。
本发明的其他特征、目的和优势在以下的详细描述中显而易见。然而，应理解，虽然显示了本发明的实施方式，以说明性而非限制性的方式给予详细的说明。通过详细的说明，落在本发明范围内的不同变化和修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面的附图一起组成附图部分，仅用于说明而非限制目的。
图1显示了含鼠Tcfeb编码序列(mTFEB)的AAV2.1-巨细胞病毒(CMV)质粒的示意图。
图2说明了显示在用AAV2/1-CMV-mTFEB肌肉内注射的α-葡糖苷酶(GAA)-/-小鼠中的促进庞帕病(PD)病变衰减和糖原去除的示例性结果。(A)在TFEB-注射的腓肠肌中和对侧未处理的肌肉中进行的糖原测试显示了与未处理的肌肉相比，在TFEB-注射的肌肉中糖原水平的显著降低。(B)与未处理的肌肉相比，对TFEB-处理的腓肠肌的过碘酸希夫(PAS)染色显示对应于溶酶体糖原储存的点状染色减少。(C)对TFEB-注射的腓肠肌和对侧未处理的肌肉的溶酶体相关膜蛋白(LAMP1)染色显示与未处理的肌肉相比，TFEB处理的肌肉中LAMP1载剂的数量和尺寸的减少。
图3显示了TFEB-注射对GAA-/-小鼠的肌肉纤维超微结构的影响的示例性电子显微(EM)分析。(A，B)在肌肉纤维的低倍放大图中的星号(*)显示了含糖原的溶酶体样细胞器。(C，D)在5μm2面积的肌肉纤维切片中溶酶体的测量长度(平均值±SE；n＝100个溶酶体结构)及其数量(平均值±SE；n＝50视野)。(E，F)在溶酶体样细胞器的高倍放大图像中的星号(*)显示了TFEB过表达后其腔内较松散的糖原图案。黑色箭头表示自噬体概况；白色箭头显示吞入溶酶体内部的线粒体残余物。(G)侧接含糖原的溶酶体样结构的自噬体的数量测量(平均值±SD；n＝100个溶酶体)。图C、D和G中的“***”表示根据t-检验p＜0.001的统计学显著差异。比例尺：A和B中为1500nm；E和F中为450nm。
图4显示了野生型小鼠、GAA-/-未处理的敲除小鼠和GAA-/-AAV2/9-CMV-mTFEB-处理的动物中进行的行为测试(线悬挂、钢悬挂和转杆)。与野生型动物相比，GAA-/-未处理的和GAA-/-TFEB-处理的小鼠都显示出在悬挂线(A)、悬挂钢(B)和转杆(C)测试中的行为表现障碍。然而，在所有测试中，与未处理的动物相比，TFEB-处理的动物显示出改善的行为表现。
图5显示了在AAV2/9-CMV-mTFEB-处理的小鼠的肝脏(A)和腓肠肌(B)中通过实时PCR分析的TFEB表达水平。与其相关对照相比，在经处理的动物中，分析显示在肝脏中大约4倍的增加以及在腓肠肌中大约2倍的增加。
图6显示了来自未处理的和AAV2/9-CMV-mTFEB-处理的GAA-/-小鼠(Gaa-/-)的腓肠肌中的糖原水平。与未处理的动物相比，在TFEB-处理的动物中，糖原水平较低。
具体实施方式
基于使用基因疗法的方法使转录因子EB(TFEB)基因在目标组织(如肌肉)中过表达，本发明提供了用于治疗糖原贮积病(尤其是庞帕病或达农病)的方法和组合物、核酸分子、载体。具体地，本发明提供了通过向需要治疗的对象中递送编码TFEB基因的核酸来治疗庞帕病的方法。在一些实施方式中，通过全身性给药(例如，静脉内给药)递送编码TFEB基因的核酸。在一些实施方式中，通过病毒载体，如腺相关病毒(AAV)载体递送合适的TFEB基因。
在以下部分详细描述了本发明的各个方面。所用部分并不表示限制本发明。各部分可应用于本发明的任何方面。在该申请中，除非另有说明，使用“或”表示“和/或”。
糖原贮积病
糖原贮积病(GSD，也称为糖原病和糖原贮积症)是在肌肉、肝脏和其他细胞类型中糖原合成或降解过程中的缺陷所致。GSD可以是遗传性或获得性的，并且特征在于肝脏、肌肉和大脑中遗传异常的糖原代谢。遗传性GSD由代谢的先天性障碍造成并且涉及遗传上有缺陷的酶。其大部分以常染色体隐性疾病遗传并且导致糖原合成或代谢的缺陷。GSD的总体发生率估计为每20000-40000个新生儿中1个病例。糖原降解的紊乱可能主要影响肝脏、肌肉或两者。存在超过12种类型并且基于酶缺陷和受影响的组织对它们进行分类。(Mingyi Chen，Glycogen Storage Diseases(《糖原贮积病》)，Molecular Pathology Library，第5卷，2011，第677-681页)
GSD包括以下的类型和相关的亚型：
庞帕病是一种由酸α-葡糖苷酶(GAA)中的缺陷造成的罕见遗传疾病，需要该酶来降解糖原，糖原是一种用于能量的糖储存形式。庞帕病也称为糖原贮积病II型、GSD II、II型糖原贮积病、II型糖原病、酸麦芽糖酶缺陷、α-1，4-葡糖苷酶缺陷、糖原储积性心肥大和心脏形式的全身糖原病。糖原的累积导致全身的进行性肌无力(肌病)并且影响各种身体组织，尤其是心脏、骨骼肌、肝脏、呼吸和神经系统。
庞帕病所表现出的临床表现根据疾病发生的年龄和残留的GAA活性有很大不同。残留的GAA活性与糖原积累的量和组织分布以及疾病的严重程度相关。婴儿发病型庞帕病(不到正常GAA活性的1％)是最严重的形式，并且特征是在心脏和其他肌肉组织中的张力衰退、全身性肌无力和肥大性心肌病以及大量糖原积累。死亡通常由于心肺功能衰竭而发生在出生后一年内(Hirschhorn等.(2001)“Glycogen Storage Disease Type II：AcidAlpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency(II型糖原贮积病：酸α-葡糖苷酶(酸麦芽糖酶)缺陷)”，于Scriver等编的《遗传疾病的代谢和分子基础》(The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease)，第8版纽约：麦格劳-希尔教育出版集团(McGraw-Hill)，3389-3420)。青少年发病型(正常GAA活性的1-10％)和成年发病型(正常GAA活性的10-40％)庞帕病是临床上更不均匀的，其在发病年龄、临床表现和疾病进展中变化更大。青少年发病型和成年发病型庞帕病的一般特征是并不严重连及心脏、发病年龄较晚以及疾病进展较为缓慢，但是最终呼吸道或肢体肌肉的受累导致显著的发病率和死亡率。虽然预期寿命可能变化，但是死亡通常是由于呼吸衰竭(Hirschhorn等.(2001)“Glycogen Storage Disease Type II：AcidAlpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency(II型糖原贮积病：酸α-葡糖苷酶(酸麦芽糖酶)缺陷)”，于Scriver等编的《遗传疾病的代谢和分子基础》(The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease)，第8版纽约：麦格劳-希尔教育出版集团(McGraw-Hill)，3389-3420)。
达农病(IIb型糖原贮积病或具有正常酸麦芽糖酶的糖原贮积病)是通常由达农等描述的代谢疾病，其临床特征在于严重的心肌病和不同程度的肌无力，通常与智力缺陷相关。该疾病的病理特点是在骨骼和心脏肌肉细胞中含自噬性物质和糖原的胞质内液泡。该疾病在超过10岁的男性中有临床表现。临床现象可能在两个性别中都严重，但是通常在女性中较晚发病。该疾病以X-连锁隐性性状遗传并且由位于Xq24的LAMP2基因中的突变造成。LAMP2蛋白是溶酶体膜的基本组分并且似乎在自噬体-溶酶体融合中起到作用。生物诊断围绕证明正常或高酸麦芽糖酶活性与显示大液泡(填有糖原和胞质降解的产物)的肌肉活检和免疫组化分析上的LAMP-2蛋白的缺失。该诊断可通过对LAMP2基因进行分子分析来确定。差异诊断应该包括具有过度自体消瘦的X-连锁肌病(XMEA)和庞帕病。还没有针对这种疾病的特定治疗。需要对于心脏表现进行对症治疗并且患者可能需要心脏移植。患者由于在成人期早期的心律失常而具有猝死的风险。(Nishino I，Fu J，Tanji K，Yamada T，Shimojo S，Koori T，Mora M，Riggs JE，Oh SJ，KogaY，Sue CM，Yamamoto A，Murakami N，Shanske S，Byrne E，Bonilla E，Nonaka I，DiMauro S，Hirano M.Primary LAMP-2deficiency causes X-linkedvacuolar cardiomyopathy and myopathy(Danon disease)(初级LAMP-2缺陷导致X-连锁的液泡心肌病和肌病(达农病)).Nature.2000年8月24日；406(6798)：906-10；Sugie K，Yamamoto A，Murayama K，Oh SJ，TakahashiM，Mora M，Riggs JE，Colomer J，Iturriaga C，Meloni A，Lamperti C，Saitoh S，Byrne E，DiMauro S，Nonaka I，Hirano M，Nishino I.Clinicopathologicalfeatures of genetically confirmed Danon disease(遗传上确诊的达农病的心肌病特征).Neurology.2002年6月25日；58(12)：1773-8)。
转录因子EB
转录因子EB(TFEB)是一种bHLH-亮氨酸拉链转录因子。TFEB是溶酶体生物发生中涉及的一组基因的主要调节物[协同溶酶体表达和调节(CLEAR)网络](Sardiello等.(2009)“A gene network regulating lysosomalbiogenesis and function(调节溶酶体生物合成和功能的基因网络)”，Science325(5939)：473-7；Palmieri等.(2011)“Characterization ofthe CLEAR networkreveals an integrated control of cellular clearance pathway(CLEAR网络的表征揭示了对细胞清除通路的整体控制)”，Hum Mol Genet.20(19)：3852-66)。另外，TFEB通过控制多重基因的表达和自噬性通路调节了自噬的生物发生(Settembre和Ballabio(2011)“TFEB regulates autophagy：an integratedcoordination of cellular degradation and recycling processes(TFEB调节自噬：细胞降解和循环过程的整体协同)”，Autophagy 7(11)：1379-81；Settembre等.(2011)“TFEB links autophagy to lysosomal biogenesis(TFEB使自噬与溶酶体生物发生连锁)”，Science 332(6036)：1429-33)。
在一些实施方式中，适用于本发明的TFEB基因包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列
人类TFEB，NCBI基因ID＝7942；nt＝NM_007162.2，蛋白质＝NP_009093.1(aa.1-476)
ATGGCGTCACGCATAGGGTTGCGCATGCAGCTCATGCGGGAGCAGGCGCAGCAGGAGGAGCAGCGGGAGCGCATGCAGCAACAGGCTGTCATGCATTACATGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCTCGGAGGGCCGCCCACCCCGGCCATCAATACCCCCGTCCACTTCCAGTCGCCACCACCTGTGCCTGGGGAGGTGTTGAAGGTGCAGTCCTACCTGGAGAATCCCACATCCTACCATCTGCAGCAGTCGCAGCATCAGAAGGTGCGGGAGTACCTGTCCGAGACCTATGGGAACAAGTTTGCTGCCCACATCAGCCCAGCCCAGGGCTCTCCGAAACCCCCACCAGCCGCCTCCCCAGGGGTGCGAGCTGGACACGTGCTGTCCTCCTCCGCTGGCAACAGTGCTCCCAATAGCCCCATGGCCATGCTGCACATTGGCTCCAACCCTGAGAGGGAGTTGGATGATGTCATTGACAACATTATGCGTCTGGACGATGTCCTTGGCTACATCAATCCTGAAATGCAGATGCCCAACACGCTACCCCTGTCCAGCAGCCACCTGAATGTGTACAGCAGCGACCCCCAGGTCACAGCCTCCCTGGTGGGCGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCGGACCTGACCCAGAAGCGAGAGCTCACAGATGCTGAGAGCAGGGCCCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAGACAATCACAACTTAATTGAAAGGAGACGAAGGTTCAACATCAATGACCGCATCAAGGAGTTGGGAATGCTGATCCCCAAGGCCAATGACCTGGACGTGCGCTGGAACAAGGGCACCATCCTCAAGGCCTCTGTGGATTACATCCGGAGGATGCAGAAGGACCTGCAAAAGTCCAGGGAGCTGGAGAACCACTCTCGCCGCCTGGAGATGACCAACAAGCAGCTCTGGCTCCGTATCCAGGAGCTGGAGATGCAGGCTCGAGTGCACGGCCTCCCTACCACCTCCCCGTCCGGCATGAACATGGCTGAGCTGGCCCAGCAGGTGGTGAAGCAGGAGCTGCCTAGCGAAGAGGGCCCAGGGGAGGCCCTGATGCTGGGGGCTGAGGTCCCTGACCCTGAGCCACTGCCAGCTCTGCCCCCGCAAGCCCCGCTGCCCCTGCCCACCCAGCCACCATCCCCATTCCATCACCTGGACTTCAGCCACAGCCTGAGCTTTGGGGGCAGGGAGGACGAGGGTCCCCCGGGCTACCCCGAACCCCTGGCGCCGGGGCATGGCTCCCCATTCCCCAGCCTGTCCAAGAAGGATCTGGACCTCATGCTCCTGGACGACTCACTGCTACCGCTGGCCTCTGATCCACTTCTGTCCACCATGTCCCCCGAGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGGGCGATGTGCTGTGAGAATTC(SEQ ID NO：1)
在一些实施方式中，适用于本发明的TFEB基因包含与SEQ ID NO：1基本相同的核苷酸序列。例如，合适的TFEB基因可具有与SEQ ID NO：1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，适用于本发明的TFEB基因包含编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
MASRIGLRMQLMREQAQQEEQRERMQQQAVMHYMQQQQQQQQQQLGGPPTPAINTPVHFQSPPPVPGEVLKVQSYLENPTSYHLQQSQHQKVREYLSETYGNKFAAHISPAQGSPKPPPAASPGVRAGHVLSSSAGNSAPNSPMAMLHIGSNPERELDDVIDNIMRLDDVLGYINPEMQMPNTLPLSSSHLNVYSSDPQVTASLVGVTSSSCPADLTQKRELTDAESRALAKERQKKDNHNLIERRRRFNINDRIKELGMLIPKANDLDVRWNKGTILKASVDYIRRMQKDLQKSRELENHSRRLEMTNKQLWLRIQELEMQARVHGLPTTSPSGMNMAELAQQVVKQELPSEEGPGEALMLGAEVPDPEPLPALPPQAPLPLPTQPPSPFHHLDFSHSLSFGGREDEGPPGYPEPLAPGHGSPFPSLSKKDLDLMLLDDSLLPLASDPLLSTMSPEASKASSRRSSFSMEEGDVL(SEQ ID NO：2)
在一些实施方式中，适用于本发明的TFEB基因包含编码与SEQ IDNO：2基本同源或相同的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，合适的TFEB基因可包含编码与SEQ ID NO：2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性或相同性的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方式中，合适的TFEB基因可包含编码含氨基酸取代、缺失和/或插入的TFEB蛋白的核苷酸序列。例如，合适的TFEB基因可包含编码在对应于人野生型TFEB蛋白的S142和/或S211位置上含突变的TFEB蛋白的核苷酸序列。具体地，合适的TFEB基因可包含编码含S142A和/或S211A取代的TFEB蛋白的核苷酸序列。
对于本文鉴定的核苷酸或氨基酸序列的“核酸或氨基酸序列相同性百分比(％)”被定义为在比对序列并在需要时插入缺口以实现最大百分比的序列相同性之后，在候选序列中与参考序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。如本领域所熟知，可使用多种算法中的任何一种来比较氨基酸或核酸序列，包括商业计算机程序中使用的那些，如对核苷酸序列而言的BLASTN以及对氨基酸序列而言的BLASTP、缺口BLAST和PSI-BLAST。这类示例性程序见述于Altschul等.(1990)“Basic localalignment search tool(局部比对搜索基本工具)”，J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Altschul等，Methods in Enzymology(酶学方法)；Altschul等.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Baxevanis等.(1998)Bioinformatics：APractical Guide to the Analysis of Genes and Proteins(生物信息学：对基因和蛋白分析的实践指导)，威利出版公司(Wiley)；和Misener等.(编)，Bioinformatics Methods and Protocols(生物信息学方法和方案)(Methodsin Molecular Biology(分子生物学方法)，第132卷)，胡马纳出版公司(Humana Press)，1999。除了鉴定相同序列以外，上述的程序通常提供对于相同程度的指示。
可以按照改变本领域普通技术人员已知的多肽序列的方法制备TFEB蛋白的同原物或类似物，如在汇编这类方法的参考文献中所发现。在一些实施方式中，氨基酸的保守取代包括在一些组内的氨基酸之间的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。在一些实施方式中，“保守氨基酸取代”是指并不改变发生氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸取代。
基因疗法
可使用各种基因疗法载体来实践本发明。
在一些实施方式中，可使用任何血清型的腺相关病毒(AAV)。在本发明的某些实施方式中使用的病毒载体的血清型选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9(参见，例如Gao等.(2002)PNAS，99：11854-11859；和Viral Vectors for Gene Therapy：Methodsand Protocols(用于基因疗法的病毒载体：方法和方案)，Machida编，胡马纳出版公司，2003)。可以除使用本文所列以外的其他血清型。此外，也可在本文所述的方法中使用假型AAV载体。假型AAV载体是在第二AAV血清型的衣壳中含一种AAV血清型的基因组的那些载体；例如，含AAV2衣壳和AAV1基因组的AAV载体或含AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio等.(2001)Hum.Mol.Genet.10(26)：3075-81)。其他示例性AAV载体是重组假型AAV2/1、AAV2/2、AAV2/5、AAV2/7、AAV2/8和AAV2/9血清型载体。这类载体也称为嵌合载体。例如，AAV2/1载体具有衣壳AAV1和反向末端重复(ITR)AAV2。在Medina等.(2011)“Transcriptional activation of lyso somalexocytosis promotes cellular clearance(溶酶体胞外分泌的转录活性提高细胞清除)”，Dev.Cell 21(3)：421-30中描述了示例性AAV2/9载体，其通过引用纳入本文。
AAV载体一般衍生自单链(ss)DNA细小病毒，其对于哺乳动物是非病原性的(见Muzyscka(1992)Curr.Top.Microb.Immunol.，158：97-129综述)。简而言之，重组AAV-基载体具有rep和cap病毒基因，其占去除的病毒基因组的96％，剩余两个侧接的145个碱基对(bp)的反向末端重复(ITR)，其用于启动病毒DNA复制、包装和整合。
AAV载体一般可容纳长达约4.5kb的调控元件和转基因(即，本文所述的TFEB基因)。在一些实施方式中，转基因(即，TFEB基因)处于调控元件(如组织特异性或遍在启动子)的控制之下。在一些实施方式中，使用遍在启动子(如CMV启动子)来控制TFEB基因的表达。在一些实施方式中，使用组织特异性启动子(如肌肉或肝特异性启动子)来控制TFEB基因的表达。合适的肌肉特异性启动子的非限制性示例是人肌肉肌酸激酶(MCK)启动子，而合适的肝特异性启动子是烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(PEPCK)启动子。
另外，可使用腺病毒载体、逆转录病毒载体、SV40、裸质粒DNA载体和其他本领域已知的载体来递送本发明的TFEB基因。
可使用各种方法来将编码本文所述的TFEB基因的病毒载体递送到需要治疗的对象中。具体地，适用于本发明的递送方法向多种目标组织递送编码TFEB基因的病毒载体，这些目标组织包括但不限于肌肉(例如，骨骼肌、心肌、隔膜肌等)、肝脏、心脏和神经系统。在一些实施方式中，通过全身性给药递送编码TFEB基因的病毒载体。例如，病毒载体可通过静脉内或血管内注射递送。全身性给药的其他途径包括，但不限于，动脉内、心脏内、腹膜内和皮下。在一些实施方式中，可通过局部给药(如肌肉注射或肌肉内给药)来递送病毒载体。
庞帕病的治疗
本发明的方法有效治疗受糖原贮积病影响的个体，尤其是受到婴儿发病型、青少年发病型或成年发病型庞帕病影响的个体。本文使用的术语“治疗”或“处理”是指与该疾病相关的一种或多种症状的缓解、预防或延缓该疾病的一种或多种症状的发生，和/或降低该疾病的一种或多种症状的严重程度或频率。例如，治疗可以指在多种受影响的组织中减少或清除糖原贮积，这些组织包括但不限于肌肉(例如，骨骼肌或心肌)、肝脏、心脏、神经系统；肌肉病变的缓解；心脏状态的改善(例如，增加舒张末期和/或收缩末期的体积，或者减少、缓解或预防通常在庞帕病中发现的进行性心肌病)或者肺功能的改善(例如，在基线肺活量上增加啼哭肺活量，和/或在啼哭期间增加去氧饱和的标准化)；神经发育和/或运动机能的改善(例如，增加AIMS评分)；或者这些效果的任何组合。在一些实施方式中，治疗包括糖原清除的改善，尤其是对庞帕病相关肌肉病变和/或心肌病的逆转、减少或预防。本文所用术语“改善”、“增加”或“减少”表示相对于基线测量的值，如在开始本文所述的治疗之前在相同个体中的测量值，或者在缺少本文所述的治疗的一个(或多个)对照个体中的测量值。“对照个体”是与接受治疗的个体患有相同形式的庞帕病(婴儿发病型、青少年发病型或成年发病型)的个体，该个体与接受治疗的个体的年龄大致相同(以确保受治疗的个体和对照个体中疾病的阶段相当)。
接受治疗的个体(也称为“患者”或“对象”)是患有庞帕病(即、婴儿发病型、青少年发病型或成年发病型庞帕病)或具有发生庞帕病倾向的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人)。
实施例
结合以下的实施例会更好地理解本发明。然而，应理解这些实施例仅用于说明的目的，并不用来构成对本发明范围的限制。对于所公开的实施方式的多种变化和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，包括但不限于可对与本发明的方法和/或制剂做出而不偏离本发明的精神和所附权利要求的范围的那些变化和修饰。
实施例1腺相关病毒(AAV)载体的克隆和产生
该实施例中的实验显示了含转录因子EB基因的AAV载体的克隆和开发(图1)。
通过EGFP序列(NotI-HindIII)的取代来将鼠转录因子EB，Tcfeb或TFEB的克隆序列克隆到pAAV2.1-CMV-EGFP质粒中并与含3x FLAG标签的框融合。
mTFEB序列(SEQ ID NO：5)：
ATGGCTCAGCTCGCTCAGTGGTCTTGGGCAAATCCCTTCTGCCCGGACTCAGTTTCTCCTTGTGCACAATGGGAGCAACCATACTTATGCCAGCCTGTGCTTAAAGACTACGAAGATGATGAATACTTCATGGGCCTGTCTCCCCTCGACTACAGGGAGCCCGAACCAACAGCTGCCATGGCGTCACGCATCGGGCTGCGCATGCAGCTCATGCGGGAGCAGGCCCAGCAGGAGGAGCAGCGAGAGCGCATGCAGCAGCAGGCTGTCATGCATTATATGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTGGGTGGGCCCCCCACCCCAGCCATCAACACCCCTGTCCACTTCCAGTCGCCCCCGCCTGTGCCCGGGGAGGTGCTGAAGGTGCAGTCCTACCTGGAGAACCCCACCTCCTACCACCTGCAACAGTCCCAGCATCAGAAGGTTCGGGAGTATCTGTCTGAGACCTATGGGAACAAGTTTGCTGCCCACGTGAGCCCAGCCCAAGGTTCCCCGAAGCCTGCCCCAGCAGCATCCCCAGGGGTGCGGGCTGGACACGTACTGTCCACCTCGGCCGGCAACAGTGCTCCCAACAGTCCCATGGCCATGCTACATATCAGCTCCAACCCCGAGAAAGAGTTTGATGATGTCATTGACAACATTATGCGCCTGGACAGCGTGCTGGGCTACATCAACCCTGAGATGCAGATGCCTAACACGCTGCCCCTGTCTAGCAGCCACCTGAACGTGTACAGCGGTGACCCCCAGGTCACAGCCTCCATGGTGGGTGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCCGACCTGACTCAGAAGCGAGAGCTAACAGATGCTGAGAGCAGAGCCCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAGACAATCACAACCTAATTGAGAGAAGACGCAGGTTCAACATCAATGACCGGATCAAGGAGCTGGGAATGCTGATCCCCAAGGCCAACGACCTGGACGTGCGCTGGAACAAAGGCACCATCCTCAAGGCCTCTGTGGATTACATCCGGAGGATGCAGAAGGACCTGCAGAAGTCCCGGGAGCTGGAGAACCACTCCCGGCGCCTGGAGATGACTAACAAGCAGCTCTGGCTCCGCATCCAGGAGCTGGAGATGCAGGCACGCGTGCACGGCCTCCCCACCACCTCGCCGTCGGGTGTGAATATGGCCGAGCTGGCCCAGCAGGTGGTGAAGCAAGAGTTGCCCAGTGAGGATGGCCCAGGGGAGGCGCTGATGCTGGGGCCTGAGGTCCCTGAGCCTGAGCAAATGCCGGCTCTTCCTCCCCAGGCTCCGCTGCCCTCGGCCGCCCAGCCACAGTCTCCGTTCCATCACCTGGACTTCAGCCATGGCCTGAGCTTTGGGGGTGGGGGCGACGAGGGGCCCACAGGTTACCCCGATACCCTGGGGACAGAGCACGGCTCCCCATTCCCCAACCTGTCCAAGAAGGATCTGGACTTAATGCTCCTAGATGACTCCCTGCTCCCCCTGGCCTCTGACCCCCTCTTTTCTACCATGTCTCCTGAGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGGGTGATGTTCT
pAAV2.1CMV-mTFEB质粒的序列(SEQ ID NO：6)：
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGCGGCCGCATGGCTCAGCTCGCTCAGTGGTCTTGGGCAAATCCCTTCTGCCCGGACTCAGTTTCTCCTTGTGCACAATGGGAGCAACCATACTTATGCCAGCCTGTGCTTAAAGACTACGAAGATGATGAATACTTCATGGGCCTGTCTCCCCTCGACTACAGGGAGCCCGAACCAACAGCTGCCATGGCGTCACGCATCGGGCTGCGCATGCAGCTCATGCGGGAGCAGGCCCAGCAGGAGGAGCAGCGAGAGCGCATGCAGCAGCAGGCTGTCATGCATTATATGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTGGGTGGGCCCCCCACCCCAGCCATCAACACCCCTGTCCACTTCCAGTCGCCCCCGCCTGTGCCCGGGGAGGTGCTGAAGGTGCAGTCCTACCTGGAGAACCCCACCTCCTACCACCTGCAACAGTCCCAGCATCAGAAGGTTCGGGAGTATCTGTCTGAGACCTATGGGAACAAGTTTGCTGCCCACGTGAGCCCAGCCCAAGGTTCCCCGAAGCCTGCCCCAGCAGCATCCCCAGGGGTGCGGGCTGGACACGTACTGTCCACCTCGGCCGGCAACAGTGCTCCCAACAGTCCCATGGCCATGCTACATATCAGCTCCAACCCCGAGAAAGAGTTTGATGATGTCATTGACAACATTATGCGCCTGGACAGCGTGCTGGGCTACATCAACCCTGAGATGCAGATGCCTAACACGCTGCCCCTGTCTAGCAGCCACCTGAACGTGTACAGCGGTGACCCCCAGGTCACAGCCTCCATGGTGGGTGTCACCAGCAGCTCCTGCCCTGCCGACCTGACTCAGAAGCGAGAGCTAACAGATGCTGAGAGCAGAGCCCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAGACAATCACAACCTAATTGAGAGAAGACGCAGGTTCAACATCAATGACCGGATCAAGGAGCTGGGAATGCTGATCCCCAAGGCCAACGACCTGGACGTGCGCTGGAACAAAGGCACCATCCTCAAGGCCTCTGTGGATTACATCCGGAGGATGCAGAAGGACCTGCAGAAGTCCCGGGAGCTGGAGAACCACTCCCGGCGCCTGGAGATGACTAACAAGCAGCTCTGGCTCCGCATCCAGGAGCTGGAGATGCAGGCACGCGTGCACGGCCTCCCCACCACCTCGCCGTCGGGTGTGAATATGGCCGAGCTGGCCCAGCAGGTGGTGAAGCAAGAGTTGCCCAGTGAGGATGGCCCAGGGGAGGCGCTGATGCTGGGGCCTGAGGTCCCTGAGCCTGAGCAAATGCCGGCTCTTCCTCCCCAGGCTCCGCTGCCCTCGGCCGCCCAGCCACAGTCTCCGTTCCATCACCTGGACTTCAGCCATGGCCTGAGCTTTGGGGGTGGGGGCGACGAGGGGCCCACAGGTTACCCCGATACCCTGGGGACAGAGCACGGCTCCCCATTCCCCAACCTGTCCAAGAAGGATCTGGACTTAATGCTCCTAGATGACTCCCTGCTCCCCCTGGCCTCTGACCCCCTCTTTTCTACCATGTCTCCTGAGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGGGTGATGTTCTGGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAGTGAAAGCTTGGATCCAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCCGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGCTGGAGTTCACGTTCCTCAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTTCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTATAATTTCAGGTGGCATCTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAATAGTGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGTAATGGTAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGCGGTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG
然后将所得的pAAV2.1-CMV-mTFEB-FLAG与pAd-Helper和pack2/1或pack2/9包被质粒三重转染到亚融合293细胞中(Gao G.等.J Virol.2004，78(12)：6381-8)。通过两轮的CsCl来纯化重组AAV2/1或AAV2/9载体。
通过使用TaqMan(Gao，G 2000)(Perkin-Elmer，马萨诸塞州沃森姆的生命和分析科学公司)的PCR定量和点印迹分析来评价表达为基因组拷贝(GC/mL)的载体滴度，如Auricchio等.(2001)Hum.Mol.Genet.10(26)：3075-81所述。
在本发明中，AAV2.1代表编码TFEB的质粒而AAV2/1或AAV2/9代表含有带血清型1或9衣壳的TFEB构建体的病毒。
实施例2TFEB过表达和PD病变的缓解
该实施例中的实验证明通过肌肉内注射AAV2/1-CMV-mTFEB来过表达TFEB导致庞帕病模型中糖原贮积的清除和肌肉病变的缓解。
从3’ITR至5’ITR的pAAV2.1CMV-mTFEB质粒的序列(SEQ ID NO：7)：
TGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAATTCGCCCTTAAGCTAGC CAGATCCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAG[GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG]GTGTCCAGGCGGCCGCATGGCTCAGCTCGCTCAGTGGTCTTGGG CAAATCCCTTCTGCCCGGACTCAGTTTCTCCTTGTGCACAATGGGAGCAA CCATACTTATGCCAGCCTGTGCTTAAAGACTACGAAGATGATGAATACT TCATGGGCCTGTCTCCCCTCGACTACAGGGAGCCCGAACCAACAGCTGC CATGGCGTCACGCATCGGGCTGCGCATGCAGCTCATGCGGGAGCAGGCC CAGCAGGAGGAGCAGCGAGAGCGCATGCAGCAGCAGGCTGTCATGCAT TATATGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCTGGGTGGGCCCCCC ACCCCAGCCATCAACACCCCTGTCCACTTCCAGTCGCCCCCGCCTGTGCC CGGGGAGGTGCTGAAGGTGCAGTCCTACCTGGAGAACCCCACCTCCTAC CACCTGCAACAGTCCCAGCATCAGAAGGTTCGGGAGTATCTGTCTGAGA CCTATGGGAACAAGTTTGCTGCCCACGTGAGCCCAGCCCAAGGTTCCCC GAAGCCTGCCCCAGCAGCATCCCCAGGGGTGCGGGCTGGACACGTACTG TCCACCTCGGCCGGCAACAGTGCTCCCAACAGTCCCATGGCCATGCTAC ATATCAGCTCCAACCCCGAGAAAGAGTTTGATGATGTCATTGACAACAT TATGCGCCTGGACAGCGTGCTGGGCTACATCAACCCTGAGATGCAGATG CCTAACACGCTGCCCCTGTCTAGCAGCCACCTGAACGTGTACAGCGGTG ACCCCCAGGTCACAGCCTCCATGGTGGGTGTCACCAGCAGCTCCTGCCC TGCCGACCTGACTCAGAAGCGAGAGCTAACAGATGCTGAGAGCAGAGC CCTGGCCAAGGAGCGGCAGAAGAAAGACAATCACAACCTAATTGAGAG AAGACGCAGGTTCAACATCAATGACCGGATCAAGGAGCTGGGAATGCT GATCCCCAAGGCCAACGACCTGGACGTGCGCTGGAACAAAGGCACCAT CCTCAAGGCCTCTGTGGATTACATCCGGAGGATGCAGAAGGACCTGCAG AAGTCCCGGGAGCTGGAGAACCACTCCCGGCGCCTGGAGATGACTAAC AAGCAGCTCTGGCTCCGCATCCAGGAGCTGGAGATGCAGGCACGCGTGC ACGGCCTCCCCACCACCTCGCCGTCGGGTGTGAATATGGCCGAGCTGGC CCAGCAGGTGGTGAAGCAAGAGTTGCCCAGTGAGGATGGCCCAGGGGA GGCGCTGATGCTGGGGCCTGAGGTCCCTGAGCCTGAGCAAATGCCGGCT CTTCCTCCCCAGGCTCCGCTGCCCTCGGCCGCCCAGCCACAGTCTCCGTT CCATCACCTGGACTTCAGCCATGGCCTGAGCTTTGGGGGTGGGGGCGAC GAGGGGCCCACAGGTTACCCCGATACCCTGGGGACAGAGCACGGCTCC CCATTCCCCAACCTGTCCAAGAAGGATCTGGACTTAATGCTCCTAGATG ACTCCCTGCTCCCCCTGGCCTCTGACCCCCTCTTTTCTACCATGTCTCCTG AGGCCTCCAAGGCCAGCAGCCGCCGGAGCAGCTTCAGCATGGAGGAGG GTGA(TGTTCTGGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAG)TGAAAGCTTGGATCC AGATCT CTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATTAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA
粗体核苷酸：3’ITR和5’ITR序列
斜体核苷酸：CMV启动子序列
方括号[..]中的核苷酸：SV40内含子序列
下划线核苷酸：mTFEB序列
圆括号(..)中的核苷酸：FLAG序列
粗下划线核苷酸：序列
双下划线核苷酸：序列
一月龄的GAA-/-小鼠在单块肌肉(即，右腓肠肌)的三个位点上接受AAV2/1-CMV-mTFEB载体的肌肉内直接注射。作为对照，小鼠接受向对侧肌肉注射，单独注射AAV2/1-EGFP载体或载剂PBS(磷酸盐缓冲盐水)。在注射后45天处死动物，使载体表达最大化并维持，并且分析它们的肌肉。
在AAV2/1-CMV-mTFEB-注射的肌肉中由实时(RT)-PCR分析的TFEB表达的平均水平是对照的10倍。与野生型小鼠中的糖原水平相比(2.01±0.70μg糖原/mg蛋白质)，用对照处理的小鼠的肌肉中的糖原水平(15.48±1.80μg糖原/mg蛋白质)上升。相反，在用TFEB处理的小鼠的腓肠肌中糖原水平显著降低(2.8±0.88μg糖原/mg蛋白质，p＝0.0001)，这表明病理性糖原贮积接近完全去除。示例性结果见图2A。
TFEB的过表达也导致PD肌肉的常规病变的衰减。对TFEB注射的肌肉的PAS染色显示，如图2B所示相对于溶酶体糖原评分(糖原颗粒)的点状染色减少，并且图2C显示LAMP1载剂减少。
从对经治疗的和未治疗的腓肠肌进行的EM分析证明了由TFEB过表达诱导的超结构变化。在未治疗的肌肉中，超结构分析显示PD的典型异常，由于存在由如图3A中星号标记的糖原致密填充的多处大溶酶体样结构，收缩器存在大量破坏。
TFEB过表达导致肌肉纤维超结构的显著改善。如图3B所示，观察到在薄切片中检测到的含糖原溶酶体的尺寸和数量明显减少，这得到如图3C和3D所示的形态测定分析的支持。如图3E中的星号所标记，在未处理的纤维中看到用电子致密的糖原颗粒包装的大溶酶体样细胞器如图3F中的星号所标记在TFEB-处理的肌肉内部中显示明显更松散的糖原组织。
如图3F中的黑色箭头所示，在接近含糖原的细胞器中观察到增加数量的自噬体。重要的是，一些自噬体也含有糖原颗粒，其最有可能直接衍生自细胞溶质。另外，如图3F中的白色箭头所示，溶酶体结构常在其腔中含有其他胞内细胞器的残留物，表明它们与相邻的自噬体融合。如图3G所示，通过形态测定分析确认侧接TFEB处理的肌肉中溶酶体结构的自噬体的数量增加。因此，超结构分析表明自噬的激活和自噬体与溶酶体的融合的刺激介导了含糖原的溶酶体的数量和尺寸的减少以及糖原贮积的减少。
总之，该实施例中的数据表明，通过肌肉内注射的TFEB过表达能够显著拯救糖原贮积和形态异常。
实施例3AAV2/9-CMV-mTFEB的全身性注射导致糖原贮积降低
作者已经在PD(Gaa-/-)小鼠中测试了mTFEB全身性递送的效果。通过眼球后注射给药用1x1012gc/小鼠的AAV2/9-CMV-mTFEB载体注射6只一月龄的Gaa-/-小鼠。
在2.5个月大时，用行为学测试(悬挂线、悬挂钢、转杆)来检测动物，并且处死动物以测量肌肉(腓肠肌)中的TFEB表达水平和糖原含量。
在所有的行为测试中，与野生型动物相比，AAV2/9-CMV-mTFEB-处理的动物和未处理的动物都显示出行为表现障碍(图4)。然而，与未处理的动物相比，TFEB-处理的动物显示出改善行为表现的趋势，这表明TFEB过表达对小鼠运动活性存在有益影响。
在经处理的小鼠的肝脏和腓肠肌中通过实时PCR分析评估TFEB的表达水平。该分析显示与它们相应的对照相比，在TFEB-注射的小鼠中，肝脏中显示4倍增长(3,97+0,27)并且腓肠肌中2倍增长(1,72+0,32)(图5)。
与未处理的动物相比，在TFEB-处理的动物的腓肠肌中，作者观察到降低的糖原水平(图6)。这些结果表明，如在用肌肉内注射处理的动物中所观察到的，在AAV2/9-CMV-mTFEB的全身性递送后的TFEB过表达导致底物贮积清除的改善。
材料和方法
动物
通过将neo插入GAA基因外显子6[Raben等，1998]得到的GAA-/-小鼠(KO PD小鼠模型)购自马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington，MA)的查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)。根据关于保护实验目的的动物的欧盟指令86/609进行动物研究。对小鼠进行的各过程都旨在确保不适、痛苦、疼痛和损伤是最小的。在阿佛丁麻醉后，通过颈脱位法处死小鼠。
AAV-TFEB的肌肉内注射
使用100-μl的汉密尔顿注射器在右腓肠肌肉的3个不同位点中向6只一月龄的GAA-/-小鼠注射总剂量为1011GC/小鼠的AAV2/1-CMV-mTFEB载体制剂。向对侧肌肉中注射等剂量的AAV2/1CMV-EGFP或等体积的PBS用于比较。在注射后45天处死动物，用PBS灌注，并且收集它们的肌肉并进行分析。分离腓肠肌并且得到用于生化分析、光学和免疫荧光显微分析以及电子显微分析(EM)的样品。通过RT-PCR测试TFEB的表达水平。
AAV-TFEB的全身性感染
通过眼球后注射给药用1x1012GC/小鼠AAV2/9-CMV-mTFEB载体注射6只一月龄的Gaa-/-小鼠。全身性单独注射等剂量的AAV2/9CMV-eGFP或等体积的PBS作为对照。在注射后45天处死动物，用PBS灌注，并且收集它们器官。得到用于生化分析、光学和免疫荧光显微分析以及电子显微分析(EM)的样品。通过RT-PCR测试TFEB的表达水平。
肌肉中的糖原试验
如Raben等.(2003)Molecular Genetics and Metabolism，第80卷，第1-2期：159-169所述或通过使用商业试剂盒(美国加利福尼亚州米尔皮塔斯市的BV公司(BioVision))，通过测量用黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶消化后从煮沸的组织匀浆中释放的葡萄糖的量来测定肌肉中的糖原浓度。
通过组织在H2O中的匀浆制备的组织裂解物在99℃下加热变形10分钟并且在4℃下离心10分钟。在37℃下，上清液一式两份与或不与10μL的800U/mL淀粉葡萄糖苷酶孵育1小时。通过在99℃下加热灭活10分钟来停止反应。使用在相同条件下水解的来自牛肝的糖原(美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))来生成标准曲线。对样品进行离心并且按照生产商的说明使用葡萄糖测定试剂(西格玛奥德里奇公司)测定上清液中的葡萄糖水平。
按照生产商的说明使用伯乐蛋白测定试剂盒在裂解物中测量蛋白质水平(变性前)。数据表示为微克糖原/毫克蛋白质(mg糖原/mg蛋白质)。
肌肉的过碘酸希夫(PAS)染色和LAMP1的免疫荧光分析
组织在10％福尔马林中固定并在石蜡中包埋。得到低温切片并且通过标准方法用过碘酸希夫(PAS)和HE染色。对于LAMP1的免疫荧光分析，在4℃下将组织在4％PFA中固定24小时，在石蜡(西格玛奥德里奇公司)中包埋，用70-100％乙醇梯度脱水并得到连续的7mm切片。先前如Settembre等.(2007)“Systemic inflammation and neurodegeneration in a mouse model of multiplesulfatase deficiency(在多种硫酸酯酶缺乏症的小鼠模型中全身性炎症和神经退化)”，PNAS 104：4506-11所述进行免疫荧光分析。
用二甲苯处理连续切片以去除石蜡、再水合并在微波炉中用0.05mol/L甘氨酸-HCl(pH 3.5)处理15分钟来修复抗原。在用特异性一抗过夜孵育之前，用封闭溶液(PBS，0.2％吐温-20)和10％山羊正常血清(西格玛奥德里奇公司)孵育试样1小时。使用的抗体是LAMP1(兔多克隆1∶300；西格玛)和FLAGM2(小鼠单克隆1∶300，西格玛)。在洗涤之后，用二抗孵育切片40分钟，该二抗购自分子探针公司(美国加利福尼亚州的英杰公司(Invitrogen))。随后用含DAPI的Vectashield(美国加利福尼亚州的载体实验室公司(VectorLaboratories))固定经染色的切片。通过使用整合了AxioCam MR照相机的荧光显微镜蔡司(Thornwood，NY)Axioplan 2来拍摄图像。
电子显微术
从用AAV-TFEB(图3B和3F)或对照AAV-EGFP(图3A和3E)注射的GAA-/-小鼠中解剖肌肉组织的小块样品，在含1％戊二醛的0.2M HEPES缓冲液中固定，在乙酸铀酰和OsO4中后固定。在通过梯度乙醇和环氧丙烷(propilenoxide)脱水之后，将细胞包埋在环氧树脂(Epon 812，美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)中并在60℃下聚合72小时。对于各样品，用Leica EM UC6超微切片机(奥地利维也纳的徕卡显微系统公司(LeicaMycosystems))切割薄切片。使用装配了VELETTA CCD数码照相机(德国明斯特的软图像系统公司(Soft Imaging Systems GmbH))的FEI Tecnai-12电子显微镜(荷兰艾恩德霍芬的FEI公司)从薄切片中获取EM图像。使用iTEM软件(德国明斯特的软图像系统公司)在50个在含不同显微的薄切片中随机分布的视野(5μm2尺寸)中进行对溶酶体样细胞器的数量及其尺寸和自噬体的数量的定量。
使用Wilcoxon秩和检验来比较中值。对于所有的统计学分析，在Excel中计算斯氏t检验和95％置信区间(误差条；1.96*SE)。差异在p＜0.05时被认为显著。
通过实时(RT)-PCR分析的TFEB表达
为了评价组织中的TFEB表达水平，按照生产商的说明使用凯杰Rneasy试剂盒(德国希尔敦)来提取总RNA。使用1□g的RNA通过SuperScript II第一链合成系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)来制备相关cDNA。使用LightCycler 480设备(瑞士巴塞尔的罗氏公司(Roche))上的SYBR-greenPCR主混合物(美国加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(AppliedBiosystems))进行实时PCR并且数据表示为DDCt。TFEB Fw引物：5’-gcagaagaaagacaatcacaacc-3’(SEQ ID NO：8)；TFEB Rv引物：5’-gccttggggatcagcatt-3’(SEQ ID NO：9)。
行为分析
对于行为过程，经处理的和未处理的小鼠经过以下测试：悬挂线、悬挂钢和转杆，测试按照公开的过程(Raben N.等，J Biol Chem.1998，273(30)：19086-92.；Sidman RL等，J Neuropathol Exp Neurol.2008，67(8)：803-18)进行。
参考文献的引用
本申请所引用的所有出版物和专利文献都通过引用全文纳入本文，就好像每个单独出版物或专利文献的内容都纳入本文。
Claims (72)
1.一种选自下组的化合物：
a)转录因子EB(TFEB)蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段；
b)包含TFEB蛋白，其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的嵌合分子；
c)编码所述蛋白质或其同源物、重组或合成或生物技术功能衍生物，其等位基因变体及其片段的多核苷酸；
d)包含所述多核苷酸的载体；
e)经遗传工程改造表达所述多肽的宿主细胞
所述化合物用于治疗或/和预防糖原贮积病。
2.如权利要求1所述的化合物，所述化合物用于治疗糖原贮积病，所述糖原贮积病的特征是肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统中的糖原积累。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述糖原贮积病选自下组：Ia型GSD(肝糖原累积症)、I非a型GSD(各种亚型)、II型GSD(庞帕病)、IIb型GSD(达农病)、III型GSD(科里病或福布斯病)、IV型GSD(安德森病)、V型GSD(麦卡德尔综合征)、VI型GSD(赫斯病)、VII型GSD(他瑞(Tarui)病)、IX型GSD、XI型GSD(范科尼-彼克(Fanconi-Bickel)综合征)、XII型GSD(红细胞醛缩酶缺陷)、XIII型GSD和0型GSD。
4.如权利要求1、2或3所述的化合物，其特征在于，所述糖原贮积病是庞帕病。
5.如权利要求1、2或3所述的化合物，其特征在于，所述糖原贮积病是达农病。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，该化合物被递送至含积累的糖原的目标组织。
7.如权利要求6所述的化合物，其特征在于，所述目标组织选自肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统。
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，所述目标组织是肌肉和/或肝脏。
9.如权利要求8所述的化合物，其特征在于，所述肌肉是骨骼肌、心肌和/或隔膜肌。
10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，通过全身性给药递送所述化合物。
11.如权利要求10所述的化合物，所述全身性给药是静脉内给药。
12.如权利要求1-9中任一项所述的化合物，通过局部给药递送所述化合物。
13.如权利要求12所述的化合物，所述局部给药是肌肉内给药。
14.如前述权利要求中任一项所述的化合物，所述TFEB蛋白包含与SEQ ID NO：2至少80％相同的氨基酸序列。
15.如前述权利要求中任一项所述的化合物，所述TFEB蛋白包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列。
16.如前述权利要求中任一项所述的化合物，所述TFEB蛋白包含由SEQ ID NO：2组成的氨基酸序列。
17.如前述权利要求中任一项所述的化合物，所述多核苷酸包含组织特异性启动子序列，所述启动子序列控制TFEB蛋白的表达。
18.如权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述组织特异性启动子序列是肌肉特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：3组成的MCK启动子序列。
19.如权利要求17所述的化合物，其特征在于，所述组织特异性启动子序列是肝脏特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：4组成的PEPCK启动子序列。
20.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1至少60％相同的核苷酸序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1至少80％相同的核苷酸序列。
22.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述多核苷酸包含由SEQ ID NO：1组成的核苷酸序列。
23.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述载体是选自下组的表达载体：病毒载体、质粒、病毒颗粒和噬菌体。
24.如权利要求23所述的化合物，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关载体(AAV)和裸质粒DNA载体。
25.如权利要求24所述的化合物，其特征在于，所述AAV载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其组合。
26.如权利要求25所述的化合物，其特征在于，所述AAV载体是AAV1、AAV2或AAV9载体。
27.如权利要求24-26中任一项所述的化合物，其特征在于，所述AAV载体是嵌合和/或假型载体。
28.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述分子的递送导致肌肉和/或肝脏中糖原贮积减少。
29.如权利要求28所述的化合物，其特征在于，所述肌肉是骨骼肌。
30.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其特征在于，所述分子的递送导致肌肉和/或肝脏中糖原贮积的强度、严重程度或频率降低或延迟发生。
31.一种用于治疗和/或预防糖原贮积病的药物组合物，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和前述权利要求中任一项所定义的化合物。
32.一种治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要治疗的对象递送编码转录因子EB(TFEB)基因的核酸的步骤。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病的特征是肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统中的糖原积累。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病选自下组：Ia型GSD(肝糖原累积症)、I非a型GSD(各种亚型)、II型GSD(庞帕病)、IIb型GSD(达农病)、III型GSD(科里病或福布斯病)、IV型GSD(安德森病)、V型GSD(麦卡德尔综合征)、VI型GSD(赫斯病)、VII型GSD(他瑞病)、IX型GSD、XI型GSD(范科尼-彼克综合征)、XII型GSD(红细胞醛缩酶缺陷)、XIII型GSD和0型GSD。
35.如权利要求32、33或34所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病是庞帕病。
36.如权利要求32、33或34所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病是达农病。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将所述编码TFEB基因的核酸递送至含积累的糖原的目标组织。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述目标组织选自肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述目标组织是肌肉和/或肝脏。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述肌肉是骨骼肌、心肌和/或隔膜肌。
41.如权利要求32-40所述的方法，其特征在于，通过全身性给药递送所述核酸。
42.如权利要求41所述的方法，所述全身性给药是静脉内给药。
43.如权利要求32-40所述的方法，其特征在于，通过局部给药递送所述核酸。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述局部给药是肌肉内给药。
45.如权利要求32-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸是病毒载体。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述AAV载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其组合。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述AAV载体是AAV1、AAV2或AAV9载体。
49.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述AAV载体是嵌合和/或假型载体。
50.如权利要求32-49所述的方法，其特征在于，所述核酸还包含控制所述TFEB基因表达的组织特异性启动子序列。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述组织特异性启动子序列是肌肉特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：3组成的MCK启动子序列。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述组织特异性启动子序列是肝脏特异性启动子序列，优选地，其为由SEQ ID NO：4组成的PEPCK启动子序列。
53.如权利要求32-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述TFEB基因包含与SEQ ID NO：1至少60％相同的核苷酸序列。
54.如权利要求32-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述TFEB基因包含与SEQ ID NO：1至少80％相同的核苷酸序列。
55.如权利要求32-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述TFEB基因包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
56.如权利要求32-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述TFEB基因包含编码与SEQ ID NO：2至少80％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
57.如权利要求32-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述TFEB基因包含编码与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
58.如权利要求32-57中任一项所述的方法，其特征在于，所述TFEB基因包含编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列。
59.如权利要求32-58中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码TFEB基因的核酸的递送导致肌肉和/或肝脏中的糖原贮积减少。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述编码TFEB基因的核酸的递送导致骨骼肌中的糖原贮积减少。
61.一种治疗糖原贮积病的方法，所述方法包括向需要治疗的对象给予编码转录因子EB(TFEB)基因的核酸，使得肌肉和/或肝脏中的糖原贮积的强度、严重程度或频率降低或者延迟发生。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病的特征是肌肉、肝脏、心脏和/或神经系统中的糖原积累。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病选自下组：Ia型GSD(肝糖原累积症)、I非a型GSD(各种亚型)、II型GSD(庞帕病)、IIb型GSD(达农病)、III型GSD(科里病或福布斯病)、IV型GSD(安德森病)、V型GSD(麦卡德尔综合征)、VI型GSD(赫斯病)、VII型GSD(他瑞病)、IX型GSD、XI型GSD(范科尼-彼克综合征)、XII型GSD(红细胞醛缩酶缺陷)、XIII型GSD和0型GSD。
64.如权利要求61、62或63所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病是庞帕病。
65.如权利要求61、62或63所述的方法，其特征在于，所述糖原贮积病是达农病。
66.如权利要求61-65中任一项所述的方法，全身性给予所述编码TFEB基因的核酸。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，静脉内给予所述TFEB基因。
68.如权利要求61-65所述的方法，其特征在于，肌肉内给予所述编码TFEB基因的核酸。
69.如权利要求61-68中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸是选自下组的表达载体：病毒载体、质粒、病毒颗粒和噬菌体。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述病毒载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关载体(AAV)和裸质粒DNA载体。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述AAV载体选自下组：AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9及其组合。
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述AAV载体是AAV1、AAV2或AAV9载体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261715187P | 2012-10-17 | 2012-10-17 | |
| US61/715,187 | 2012-10-17 | ||
| PCT/EP2013/003131 WO2014060109A1 (en) | 2012-10-17 | 2013-10-17 | Gene therapy for glycogen storage diseases |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104936606A true CN104936606A (zh) | 2015-09-23 |
Family
ID=49958407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380054477.1A Pending CN104936606A (zh) | 2012-10-17 | 2013-10-17 | 糖原贮积病的基因疗法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20150273016A1 (zh) |
| EP (1) | EP2908842A1 (zh) |
| JP (1) | JP2015533368A (zh) |
| KR (1) | KR20150081434A (zh) |
| CN (1) | CN104936606A (zh) |
| AU (1) | AU2013332061A1 (zh) |
| BR (1) | BR112015008673A2 (zh) |
| CA (1) | CA2888356A1 (zh) |
| WO (1) | WO2014060109A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110724203A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-24 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用 |
| CN110914419A (zh) * | 2017-03-10 | 2020-03-24 | 吉尼松公司 | 糖原贮积病iii的治疗 |
| CN113058041A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-07-02 | 华东师范大学 | 一种用于治疗庞贝氏病的产品 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109069671B (zh) * | 2016-01-19 | 2022-10-18 | 加利福尼亚大学董事会 | Danon病和其它自噬障碍的治疗方法 |
| EP3594346A4 (en) | 2017-03-10 | 2020-12-16 | National Center For Child Health And Development | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF GLYCOGEN STORAGE DISEASE TYPE IA |
| CN111511915A (zh) | 2018-03-09 | 2020-08-07 | 第一三共株式会社 | 糖原病Ia型治疗药 |
| SG11202100022SA (en) | 2018-07-12 | 2021-01-28 | Rocket Pharmaceuticals Ltd | Gene therapy vectors for treatment of danon disease |
| US20200385756A1 (en) * | 2019-06-07 | 2020-12-10 | Stc.Unm | Optogenetic gene expression systems and methods |
| KR20220112283A (ko) | 2019-12-10 | 2022-08-10 | 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 | Hunter 질환 치료용 아데노-연합된 바이러스 벡터 |
| JP2023510784A (ja) | 2020-01-10 | 2023-03-15 | ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド | 脳腫瘍を処置するための血液脳関門を横断する免疫療法剤を送達するための方法および組成物 |
| EP4359519A2 (en) * | 2021-06-21 | 2024-05-01 | The Brigham and Women's Hospital Inc. | Adeno-associated viral (aav) vectors for tissue-targeted expression of therapeutic genes |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014511391A (ja) * | 2011-03-07 | 2014-05-15 | フォンダッツィオーネ・テレソン | Ｔｆｅｂリン酸化阻害剤およびその使用 |
-
2013
- 2013-10-17 JP JP2015537168A patent/JP2015533368A/ja active Pending
- 2013-10-17 WO PCT/EP2013/003131 patent/WO2014060109A1/en active Application Filing
- 2013-10-17 CA CA2888356A patent/CA2888356A1/en not_active Abandoned
- 2013-10-17 BR BR112015008673A patent/BR112015008673A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-10-17 AU AU2013332061A patent/AU2013332061A1/en not_active Abandoned
- 2013-10-17 US US14/436,161 patent/US20150273016A1/en not_active Abandoned
- 2013-10-17 KR KR1020157012952A patent/KR20150081434A/ko not_active Application Discontinuation
- 2013-10-17 EP EP13821445.7A patent/EP2908842A1/en not_active Withdrawn
- 2013-10-17 CN CN201380054477.1A patent/CN104936606A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110914419A (zh) * | 2017-03-10 | 2020-03-24 | 吉尼松公司 | 糖原贮积病iii的治疗 |
| CN110724203A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-24 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用 |
| CN110724203B (zh) * | 2019-11-08 | 2021-04-30 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种促进tfeb核转位的短肽及基于其的线性短肽和其减轻脑缺血损伤的应用 |
| CN113058041A (zh) * | 2020-08-27 | 2021-07-02 | 华东师范大学 | 一种用于治疗庞贝氏病的产品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20150273016A1 (en) | 2015-10-01 |
| KR20150081434A (ko) | 2015-07-14 |
| EP2908842A1 (en) | 2015-08-26 |
| JP2015533368A (ja) | 2015-11-24 |
| AU2013332061A1 (en) | 2015-05-07 |
| BR112015008673A2 (pt) | 2017-09-26 |
| CA2888356A1 (en) | 2014-04-24 |
| WO2014060109A1 (en) | 2014-04-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104936606A (zh) | 糖原贮积病的基因疗法 | |
| AU2017214283B2 (en) | Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid | |
| Yue et al. | Microdystrophin gene therapy of cardiomyopathy restores dystrophin-glycoprotein complex and improves sarcolemma integrity in the mdx mouse heart | |
| CA2901328C (en) | Compositions and methods for treating mps1 | |
| TWI701332B (zh) | 用於治療溶酶體貯積病之腺相關病毒載體 | |
| KR20170110718A (ko) | 선조체 및 피질로의 바이러스 입자의 향상된 전달 | |
| CN109121395A (zh) | 腺相关病毒载体递送β-肌聚糖和微RNA-29以及肌营养不良症的治疗 | |
| Rafi et al. | Intravenous injection of AAVrh10-GALC after the neonatal period in twitcher mice results in significant expression in the central and peripheral nervous systems and improvement of clinical features | |
| JP2019528793A (ja) | ムコ多糖症の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター | |
| US20200239908A1 (en) | Gene therapy for ceroid lipofuscinoses | |
| US20230321164A1 (en) | Intrathecal Delivery of Recombinant Adeno-Associated Virus Encoding Methyl-CPG Binding Protein 2 | |
| JP2022523766A (ja) | Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス | |
| TW202227633A (zh) | 用於治療grn相關的成年發病神經退化之重組腺相關病毒 | |
| US20220211737A1 (en) | Compositions and methods for treatment of friedreichs ataxia | |
| Pagès et al. | Intrathecal AAVrh10 corrects biochemical and histological hallmarks of mucopolysaccharidosis VII mice and improves behavior and survival | |
| CA3189657A1 (en) | Methods and compositions for treatment of fragile x syndrome | |
| AU2018265531B2 (en) | Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses | |
| JP2024505257A (ja) | 神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療 | |
| Massaro | Intravenously administered gene therapy for neuronopathic Gaucher disease | |
| McCall | Correction of Autophagic Accumulation in Skeletal Muscle of a Pompe Disease Mouse Model Following Gene Therapy Administration | |
| AU2021271635A1 (en) | Compositions useful in treatment of krabbe disease | |
| Gilkes | Optimizing neonatal gene transfer in the MPS IIIB model | |
| NZ735290B2 (en) | Enhanced delivery of viral particles to the striatum and cortex |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150923 |