JP2024505257A - 神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療 - Google Patents

神経セロイドリポフスチン症の遺伝子治療 Download PDF

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Abstract

本明細書において、ＣＬＮ２疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。そのような組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ＡＡＶキャプシドを含む前記ｒＡＡＶ、及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。また、本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に複数の経路で投与することを含む、ＣＬＮ２疾患の治療方法を提供する。本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物及びＣＬＮ２疾患を治療する関連する方法も本明細書に提供する。【選択図】図１

Description

１．優先権
本出願は、２０２１年２月１日に出願された米国出願第６３／１４４，２５２号及び２０２１年１０月６日に出願された米国出願第６３／２５２，７４６号に対する優先権の利益を主張するものであり、両出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
２．電子的に提出した配列表の参照
本出願では、２０２２年１月３１日に作成したファイル名「１２６５６－１５３－２２８＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、ファイルサイズ３６，８０７バイトのテキストファイルとして本出願と共に提出された配列表は、参照により援用される。
３．背景技術
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、希少・遺伝性の神経変性疾患の一群である。それらは、患者に認められるセロイド及びリポフスチンに類似した自家蛍光リポ色素の蓄積を伴う、神経遺伝性蓄積症の最も一般的な疾患と考えられている。ＮＣＬは、筋肉の緊張または痙攣の異常な増加、失明または視力障害、認知症、筋肉協調運動の障害、知的障害、運動障害、発作、及び不安定歩行を含む、多様であるが進行性の症状に関連している。この疾患の発症率は、およそ１２，５００人に１人である。ＮＣＬには主に３つの型がある：成人型（クーフス病またはパリー病）、若年型及び乳児期遅発型（ヤンスキー・ビールショウスキー病）。神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、もともと発症年齢と臨床症状（本明細書に記載）によって定義されていた。しかしながら、その後、新しい分子所見に基づいて再分類され、臨床表現型によって以前に示唆されていたよりも、様々な遺伝的バリアントに対してはるかに多くの重複のエビデンスが提供された。
ＮＣＬに関連する少なくとも２０種の遺伝子が同定されている。ＣＬＮ２変異を有するＮＣＬ患者は、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）と呼ばれるペプスタチン非感受性リソソームペプチダーゼを欠損している。ＴＰＰ１は、ポリペプチドのＮ末端からトリペプチドを除去する。ＣＬＮ２遺伝子の１３個のエクソンすべてで変異が報告されている。いくつかの変異は、経過をより長引かせる結果をもたらす。発症は通常、乳児期後期であるが、より後期での発症が報告されている。ＣＬＮ２では、５８を超える変異が記載されている。
ＣＬＮ２疾患の一種であるＣＬＮ２疾患は、まれなリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）であり、発症率は、出生１０万人あたり０．０７～０．５１と推定されている（Ａｕｇｅｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｌａｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｎａｔｉｏｎａｌ ＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ；Ｐｏｕｐｅｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓａｎｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２疾患は、染色体１１ｑ１５に位置し、可溶性リソソーム酵素トリペプチジル－ペプチダーゼ－１（ＴＰＰ１）をコードするＣＬＮ２遺伝子の変異によって引き起こされる、致死性の常染色体劣性神経変性ＬＳＤである。ＣＬＮ２遺伝子の変異、及びそれに続くＴＰＰ１酵素活性の欠損は、貯蔵物質のリソソーム蓄積と脳及び網膜の神経変性をもたらす（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗｌｏｄａｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＬＮ２疾患は、２～４歳での早期発症を特徴とし、初期の特徴として、通常、再発性発作（てんかん）及び運動の調整困難（運動失調）が挙げられる。この疾患はまた、以前に習得したスキルの喪失（発達の退行）をもたらす。てんかんは多くの場合、医学的治療に抵抗性であり、精神運動機能の全般的な衰退が、満３歳～満５歳の間に急速かつ一様に起こり（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、その後、小児期半ばまでに早期に死亡する（Ｎｉｃｋｅｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗｏｒｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
組換えＴＰＰ１（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）セリポナーゼα、ＢｉｏＭａｒｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）による酵素補充療法（ＥＲＴ）は、ＣＬＮ２疾患の治療のために米国（ＵＳ）及び欧州連合（ＥＵ）において最近承認され、これは、永続的な埋込型デバイスを介して側脳室への隔週注入として投与される。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の臨床的有用性は、ＦＤＡによって運動機能の安定化に限定するように指定されたが、一方、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）は、言語スキルにもプラスの影響があると判断した（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＦＤＡ医薬品承認審査概要；Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）欧州公開医薬品審査報告書［ＥＰＡＲ］；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）は、脳に直接ポートを移植するための専門的な専門知識を必要とし、脳室内（ＩＣＶ）投与に精通し、訓練を受けた専門家が、医療現場で２週間ごとに４時間の注入中に投与する必要がある。ＣＳＦ及びリソソームでのＢｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）の半減期は短く、それぞれ７時間及び１１．５日と推定されていることが主な原因で、これらを繰り返し注入する必要がある（Ｂｒｉｎｅｕｒａ（登録商標）、ＥＰＡＲ）。したがって、ＥＲＴの反復投与に伴う重い負担や高い罹患率を患者に強いることなく、ＣＬＮ２疾患患者の中枢神経系（ＣＮＳ）において耐久性のある長期ＴＰＰ１酵素活性を提供することができる新規治療法に対する未だ満たされていない大きなニーズが残されている。したがって、ＣＬＮ２疾患の治療を必要とする対象にＴＰＰ１を送達し、発現させるのに有用な組成物が必要である。イヌＴＰＰ１（ｒＡＡＶ２．ｃａＴＰＰ１）を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の単回投与は、主に上衣細胞でのＴＰＰ１の高発現と、脳脊髄液への酵素の分泌をもたらし、臨床的有用性をもたらすことが示された。参照により本明細書に援用されるＫａｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ． ２０１５ Ｎｏｖ １１；７（３１３）：３１３ｒａ１８０；及びＫＡＴＺ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１７ Ｆｅｂ ２４（４）：２１５－２２３を参照のこと。しかしながら、ＡＡＶ２は脳実質に浸透せず、ニューロンを標的としないため、新規神経向性ＡＡＶで達成可能な有用性に比べて期待される有用性は限定される。
４．発明の概要
本明細書において、治療を必要とする対象の中枢神経系に、脳質量１グラムあたり１．２５×１０１１または４．５×１０１１ゲノムコピーの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含む、対象におけるＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２の治療方法を提供し、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含み、この方法は、ＣＬＮ２疾患の症状を改善させる。いくつかの実施形態では、ＣＬＮ２疾患の症状の改善には、投与後２４か月以内のＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅの運動領域及び言語領域の組み合わせの６段階における２カテゴリー未満の低下が含まれる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶを脳室内（ＩＣＶ）または大槽内（ＩＣ）に投与する。いくつかの実施形態では、対象の脳腫瘤を、試験参加者のスクリーニング脳ＭＲＩから取得する。
いくつかの実施形態では、（ｃ）のコード配列は、配列番号３に記載のコドン最適化ヒトＣＬＮ２である。いくつかの実施形態では、（ｃ）のコード配列は配列番号３である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、プロモーターはニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列及びサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。
いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、ポリＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、イントロンをさらに含む。いくつかの実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である。
いくつかの実施形態では、ベクターゲノムは、エンハンサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象の脳脊髄液において、疾患と関連しない天然のＴＰＰ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多形体の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれとほぼ同等か、もしくは１００％超のＴＰＰ１活性を生じさせる。いくつかの実施形態では、本方法は、疾患と関連しない天然のＴＰＰ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多形体の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれとほぼ同等か、もしくは１００％超の前記対象の血清ＴＰＰ１活性を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域と言語領域の組み合わせによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの言語領域によって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域によって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、介護者の発作日誌に記録されているベースラインと比較して、発作頻度を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる。いくつかの実施形態では、本方法は、介護者の発作日誌に記録されているベースラインと比較して、発作持続時間を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、短縮させる。
いくつかの実施形態では、本方法は、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（ＰｅｄｓＱＬ）Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＰｅｄｓＱＬ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｍｐａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、抗てんかん治療の使用を、ベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる。
いくつかの実施形態では、本方法は、Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅ ＩＩＩによって決定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、Ｍｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇによって決定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用した網膜の解剖学を評価することによって決定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｉｔｙによって決定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本方法は、Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅによって決定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＧＡＩＴＲｉｔｅによって決定した場合のベースラインと比較して、歩行パラメータを約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、改善する。
いくつかの実施形態では、本方法は、対象に免疫抑制療法を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫抑制療法は、コルチコステロイド、タクロリムス、及び／またはシロリムスを投与することを含む。
いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、生後４か月～６歳である。いくつかの実施形態では、対象は、生化学的、分子的、または遺伝的方法によって確認されたＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の文書化された診断を受けている。
５． 図面の簡単な説明
ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧベクターゲノムの概略図である。ＩＴＲは、ＡＡＶ２逆位末端配列を表す。ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリβアクチンプロモーターを表す。ＲＢＧ ＰｏｌｙＡは、ウサギβグロビンのポリアデニル化シグナルを表す。
ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターの産生プラスミドのマップを示す。
ＡＡＶシスプラスミド構築物のマップを示す。ＩＴＲ：逆位末端配列、ＣＭＶ ＩＥ プロモーター：サイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＢプロモーター：ニワトリβ－アクチンプロモーター ニワトリβ－アクチンイントロン、ｈＣＬＮ２：ヒトＣＬＮ２ ｃＤＮＡ、ウサギグロビンポリＡ：ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル、Ｋａｎ－ｒ：カナマイシン耐性遺伝子。
ＡＡＶトランスパッケージングプラスミド構築物のマップを示す。
アデノウイルスヘルパープラスミドのマップを示す。
カニクイザルの深部及び表層脳領域における構築物ＩＩＩの生体内分布を示す。
カニクイザルの深部及び表層脳領域における構築物ＩＩＩの生体内分布を示す。
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸスコアリングフローチャートを示す。
２歳以上３歳未満の対象に対するＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸスコアリングのフローチャートを示す。
構築物ＩＩＩが、非ヒト霊長類の（Ａ）血清及び（Ｂ）ＣＳＦ中のＴＰＰ１濃度を増加させたことを示す。
構築物ＩＩＩが、非ヒト霊長類の（Ａ）脳表層試料及び（Ｂ）深部脳試料中のＴＰＰ１濃度を用量依存的に増加させたことを示す。
構築物ＩＩＩが、ＴＰＰ１ｍ１Ｊ ＫＯ（Ａ）雄マウス及び（Ｂ）雌マウスの脳内のｈＴＰＰ１活性を増加させたことを示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。Ｐ値は、両側直接ウィルコクソン順位和検定を使用して得られ、検定では、各投与群を独立した対照群と比較し、２群間に差がないという帰無仮説を使用する）。
構築物ＩＩＩが、ＴＰＰ１ｍ１Ｊ ＫＯ（Ａ）雄マウス及び（Ｂ）雌マウスの寿命を延長したことを示す。
構築物ＩＩＩが、９週間後のＴＰＰ１ｍ１Ｊ ＫＯマウスの視床（Ｓ１ＢＦ）及び皮質（ＶＰＭ／ＶＰＬ）におけるアストロサイト増多症、ミクログリア活性化、及びＳＣＭＡＳを減少させたことを示す（野生型に対して＊＊ｐ＝０．０１、＊＊＊ｐ－０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ビヒクル処理ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定）。
６．発明を実施するための形態
本明細書において、ＣＬＮ２疾患を治療するための方法及び組成物を提供する。そのような組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ＡＡＶキャプシドを含む前記ｒＡＡＶ、及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む（６．１節を参照のこと）。また、本明細書において、ＣＬＮ２疾患を治療するために使用することができる、本明細書で提供されるｒＡＡＶを含む医薬組成物（６．２節を参照のこと）、及び本明細書で提供されるｒＡＡＶまたは組成物を使用したＣＬＮ２疾患の治療方法（６．３節を参照のこと）も記載する。
６．１ 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
特定の実施形態では、本明細書において提供するＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２を、以下の実施形態に記載する。本明細書に記載の方法及び組成物は、ＮＣＬを治療するために、それを必要とする対象にヒトトリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするＣＬＮ２核酸配列を送達するための組成物及び方法を含む。一実施形態では、そのような組成物は、配列番号３に示すような、ＣＬＮ２コード配列のコドン最適化を含む。生成物の効力を高め、したがって、より低い用量の試薬を使用し得ることから、安全性が高まることは望ましい。本明細書には、配列番号２に示すように、天然のＣＬＮ２コード配列を含む組成物も包含される。
ＣＬＮ２としても知られるＴＰＰ１遺伝子は、トリペプチジルペプチダーゼＩ活性を有するリソソームセリンプロテアーゼであるトリペプチジルペプチダーゼ１をコードする。これは、リソソームプロテイナーゼによって生成される分解産物からトリペプチドを生成し、非置換のＮ末端を有する基質を必要とする、非特異的なリソソームペプチダーゼとして作用するとも考えられている。本明細書中で使用する場合、用語「ＴＰＰ１」、「ＣＬＮ２」、及び「トリペプチジルペプチダーゼ１」は、コード配列を指す場合に同じ意味で用いられる。ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１をコードする天然の核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３９１．３で報告され、本明細書中では配列番号２に再現されている。ヒトトリペプチジルペプチダーゼ１の２つのアイソフォームは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号Ｏ１４７７３－１及びＯ１４７７３－２として報告されている（本明細書中では配列番号１及び４として再現されている）。ＣＬＮ２遺伝子の変異は、乳児期遅発型ＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ）病に関連している。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１に記載されるように設計してもよい。特定の実施形態では、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１エンドコーディング最適化ｃＤＮＡを、最適なコドン使用法のためにカスタム設計し、合成してもよい。特定の実施形態では、次いで、配列番号３として再現されるｈＴＰＰ１ｃｏ ｃＤＮＡを導入遺伝子発現カセット内に配置してもよく、これは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリβアクチンプロモーターの間のハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって駆動されたが、このプロモーターからの転写は、ニワトリβアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増強される（図１及び図２）。特定の実施形態では、発現カセットのポリＡシグナルは、ウサギβグロビン（ＲＢＧ）ポリＡである。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクター（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＴＰＰ１ｃｏ．ＲＢＧ）の６８４１ｂｐ産生プラスミドを、本明細書に記載のｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセットと、それに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲ及び選択マーカーとしてのアンピシリン耐性を用いて構築してもよい（図２）。特定の実施形態では、カナマイシン耐性を有する同様のＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏ産生プラスミドもまた、構築してもよい。特定の実施形態では、両方のプラスミドに由来するベクターは、本明細書に記載のｈＴＰＰ１ｃｏ発現カセットと、それに隣接するＡＡＶ２由来ＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムであってもよい。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを、三重トランスフェクションによって作製してもよく、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＦ６８）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）からなる賦形剤中に製剤化してもよい。例えば、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈｉｒｏａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｄｉｓｓ． Ｄｉ－ｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８を参照のこと。特定の実施形態では、産生されたベクターのゲノム力価を、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を介して測定してもよい。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５． ｄｏｉ： １０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１． Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照のこと。
本明細書において、例示的なＡＡＶ．ｈＴＰＰ１ｃｏベクターを記載し、これは、本明細書中ではＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２と呼ばれることもある。これらの用語は同じ意味で用いられる。さらに、一実施形態では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターが言及される場合、本明細書に記載するような成分を利用する代替の実施形態が企図される。
一態様では、ヒト（ｈ）ＴＰＰ１をコードする、コドン最適化された改変型核酸配列を提供する。特定の実施形態では、改変型ヒト（ｈ）ＴＰＰ１ ｃＤＮＡを、本明細書中に（配列番号３として）提供し、この配列は、天然ＴＰＰ１配列（配列番号２）と比較して翻訳が最大化されるように設計された。好ましくは、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、完全長の天然ＴＰＰ１コード配列（配列番号２）に対して約８０％未満の同一性、好ましくは約７５％以下の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の天然ＴＰＰ１コード配列に対して約７４％の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の天然ＴＰＰ１コード配列に対して約７０％の同一性を有する。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、ＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶ）を介した送達後の、天然ＴＰＰ１に比べて高い翻訳速度を特徴とする。一実施形態では、コドン最適化ＴＰＰ１コード配列は、配列番号２の完全長天然ＴＰＰ１コード配列と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％未満またはそれ未満の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３のバリアントである。別の実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％またはそれ以上の同一性を共有する。一実施形態では、コドン最適化核酸配列は、配列番号３である。別の実施形態では、核酸配列は、ヒトでの発現のためにコドン最適化されている。他の実施形態では、異なるＴＰＰ１コード配列を選択する。
核酸配列に関しての用語「同一性の割合（％）」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、または「～％同一である」は、一致するようにアラインする場合の２つの配列内の同一の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長にわたっていてもよく、遺伝子コード配列の全長、または少なくとも約５００～５０００ヌクレオチドの断片であることが望ましい。しかしながら、例えば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４ヌクレオチド、少なくとも約２８～３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれ以上のヌクレオチドのより小さな断片間の同一性もまた、望ましい場合がある。
タンパク質、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸、もしくはそのペプチド断片の全長にわたるアミノ酸配列または対応する核酸配列コード配列について、同一性の割合を容易に決定し得る。適切なアミノ酸断片は、少なくとも約８アミノ酸の長さであってもよく、最大約７００アミノ酸であり得る。一般的に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインした」配列を参照して決定される。「アラインした」配列または「アラインメント」は、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、欠失または追加の塩基またはアミノ酸の補正を含むことが多い。
同一性は、配列のアラインメントを準備することによって、及び当技術分野で公知であるかまたは市販の様々なアルゴリズム及び／またはコンピュータプログラムを使用することによって決定することができる［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して］。アラインメントは、公的に利用可能な、または市販の様々な多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実行する。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの配列アラインメントプログラムを、アミノ酸配列に対して利用することができる。一般的に、これらのプログラムはいずれもデフォルト設定で使用するが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるレベルと少なくとも同じレベルの同一性またはアラインメントを提供する別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照のこと。
多重配列アラインメントプログラムは、核酸配列にも利用することができる。そのようなプログラムの例として、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び「ＭＥＭＥ」などが挙げられ、これらはインターネット上のＷｅｂサーバーからアクセスすることができる。そのようなプログラムの他の供給元は、当業者に公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティも使用される。上記のプログラムに含まれるアルゴリズムを含む、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で公知の多くのアルゴリズムもまた、存在する。別の例として、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。ＦＡＳＴＡ（商標）は、クエリー配列と検索配列と間の最適なオーバーラップ領域のアラインメント及び配列同一性の割合を提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性の割合は、参照により本明細書に援用されるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）を、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６、及びスコアリングマトリックス用のＮＯＰＡＭ因子）で使用して、決定することができる。
コドン最適化コード領域は、様々な異なる方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行してもよい。１つのコドン最適化方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されている。例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を改変する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみを改変してもよい。これらの方法の１つを使用することにより、任意の所与のポリペプチド配列に出現頻度を適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を生成することができる。
コドンへの実際の改変を実行するため、または本明細書に記載するように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。そのような改変または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して実施することができる。１つのアプローチでは、それぞれの長さが８０～９０ヌクレオチドであり、所望の配列の長さに及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチドペアを、標準的な方法によって合成する。これらのオリゴヌクレオチドペアは、アニーリング時に、付着末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基が、ペアの他方のオリゴヌクレオチドに相補的な領域をはみ出して延長されるように、ペアの各オリゴヌクレオチドが合成される。各オリゴヌクレオチドペアの一本鎖末端は、別のオリゴヌクレオチドペアの一本鎖末端とアニーリングするように設計する。オリゴヌクレオチドペアをアニーリングさせ、次いでこれらの二本鎖断片のおよそ５～６個を一本鎖付着末端を介して一緒にアニーリングさせ、次いでそれらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カールズバッド，カリフォルニアから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法によって配列決定する。８０～９０塩基対の断片が一緒に連結されて出来た５～６断片、すなわち約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかを、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるように調製する。次いで、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして最終的な構築物を形成する。次いで、最終的な構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。当業者であれば、追加的な方法はすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は商業的に容易に利用可能である。
「改変型」とは、例えば、非ウイルス送達系（例えば、ＲＮＡベースの系、裸のＤＮＡなど）を生成するために、またはパッケージング宿主細胞でウイルスベクターを生成するために、及び／または対象内の宿主細胞に送達するために、本明細書に記載のＴＰＰ１タンパク質をコードする核酸配列を組み立て、エレメント上に保有するＴＰＰ１配列を宿主細胞へ移行させる任意の適切な遺伝子エレメント、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置することを意味する。一実施形態では、遺伝的エレメントはプラスミドである。そのような改変型構築物を作製するために使用する方法は、核酸操作の当業者に公知であり、方法には、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （２０１２）を参照のこと。
本明細書中で使用する場合、用語「宿主細胞」とは、組換えＡＡＶを産生プラスミドから産生するパッケージング細胞株を指し得る。あるいは、用語「宿主細胞」とは、コード配列を発現させることが望まれる任意の標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」は、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合によって細胞に導入された外来性または異種ＤＮＡを含む原核生物細胞または真核生物細胞を指す。本明細書の特定の実施形態では、用語「宿主細胞」は、ウイルスベクターまたは組換えウイルスを生成し、パッケージングするために使用する細胞を指す。本明細書の他の実施形態では、用語「宿主細胞」は、本明細書に記載の組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏ評価するための様々な哺乳動物種のＣＮＳ細胞の培養物を指す。さらに他の実施形態では、用語「宿主細胞」は、ＣＬＮ２疾患についてｉｎ ｖｉｖｏで治療中の対象の脳細胞を指すことを意図している。そのような宿主細胞として、上衣、すなわち脳室系の上皮内層を含む、ＣＮＳの上皮細胞が挙げられる。他の宿主細胞として、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアが挙げられる。
一実施形態では、ＴＰＰ１をコードする核酸配列は、それに共有結合したタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。タグポリペプチドは、限定されないが、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ－ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス血球凝集素タグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド、及びマルトース結合タンパク質タグポリペプチドを含む、既知の「エピトープタグ」から選択してもよい。
別の態様では、ＴＰＰ１をコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。一実施形態では、配列は、コドン最適化配列である。別の実施形態では、コドン最適化された核酸配列は、ヒトＴＰＰ１をコードする配列番号３である。
本明細書中で使用する場合、「発現カセット」とは、ＴＰＰ１タンパク質のコード配列、プロモーターを含み、それに対する他の調節配列を含み得る核酸分子を指し、このカセットを、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のキャプシドにパッケージングしてもよい。一般的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル及び本明細書に記載の配列などの他の発現調節配列に隣接する、本明細書に記載のＣＬＮ２配列を含む。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、パッケージングシグナルは、５’逆位末端配列（ＩＴＲ）と３’ＩＴＲである。ＡＡＶキャプシドにパッケージする場合、発現カセットと組み合わせたＩＴＲは、本明細書では「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」または「ベクターゲノム」と呼ばれ得る。一実施形態では、発現カセットは、ＴＰＰ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含む。一実施形態では、カセットは、宿主細胞においてＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列の発現を指示する発現調節配列と作動可能に関連するコドン最適化ＣＬＮ２を提供する。
別の実施形態では、ＡＡＶベクターで使用するための発現カセットを提供する。その実施形態では、ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端（ＩＴＲ）配列を含む。別の実施形態では、発現カセットは、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。一実施形態では、５’及び３’ＩＴＲは、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列に隣接し、場合により、宿主細胞においてＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列の発現を指示する追加の配列を含む。したがって、本明細書に記載のように、ＡＡＶ発現カセットは、その５’末端に５’ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）が隣接し、その３’末端に３’ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する上記の発現カセットを表すことを意味する。したがって、このｒＡＡＶゲノムは、発現カセットをＡＡＶウイルス粒子にパッケージングするために必要な最小限の配列、すなわちＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲ、を含む。ＡＡＶ ＩＴＲを、本明細書に記載のような任意のＡＡＶのＩＴＲ配列から取得してもよい。これらのＩＴＲは、得られる組換えＡＡＶで使用されるキャプシドと同じＡＡＶ起源のＩＴＲであるか、または異なるＡＡＶ起源の（ＡＡＶシュードタイプを生成するための）ＩＴＲであってもよい。一実施形態では、簡便性のために、及び規制当局の承認を迅速化するために、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列またはその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）を使用する。しかしながら、他のＡＡＶ供給源由来のＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、ＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合、得られるベクターをシュードタイプと呼称してもよい。通常、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ＴＰＰ１コード配列及び任意の調節配列、ならびにＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も適切である場合がある。Ｄ配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）を欠失させたΔＩＴＲと呼ばれる５’ＩＴＲの短縮版が記載されている。他の実施形態では、完全長ＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲを使用する。次いで、各ｒＡＡＶゲノムを産生プラスミドに導入することができる。
本明細書中で使用する場合、用語「調節配列」、「転写調節配列」または「発現調節配列」とは、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などのＤＮＡ配列を指し、これらは、それらが作動可能に連結されている、タンパク質をコードする核酸配列の転写を、誘導、抑制、または調節する。
本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結した」または「作動可能に関連する」は、転写及び発現を調節するための、ＴＰＰ１をコードする核酸配列と連続する発現調節配列及び／またはトランスまたは遠隔で作用する発現調節配列の両方を指す。
一態様では、本明細書に記載の発現カセットのいずれかを含むベクターを提供する。本明細書に記載するように、そのようなベクターは、様々な起源のプラスミドであり得、本明細書にさらに記載するように、組換え型複製欠損ウイルスの生成のための特定の実施形態において有用である。
本明細書中で使用する「ベクター」とは、その内部に外来性または異種または改変型核酸導入遺伝子を挿入し得、次いで適切な宿主細胞に導入することができる核酸分子である。ベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点、及び組換えＤＮＡを挿入することができる１つ以上の部位を有する。ベクターは、多くの場合、ベクターを含まない細胞からベクターを含む細胞を選択することができる手段を有しており、例えば、ベクターは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターとして、プラスミド、ウイルスゲノム、及び（主に酵母と細菌において）「人工染色体」が挙げられる。特定のプラスミドを本明細書に記載する。
一実施形態では、ベクターは、例えば、ミセル、リポソーム、陽イオン性脂質－核酸組成物、ポリ－グリカン組成物及び他のポリマー、脂質及び／またはコレステロール系核酸複合体、及び本明細書に記載のような他の構築物を含む、様々な組成物及びナノ粒子と結合させた、記載の発現カセットを含む非ウイルス性プラスミド、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡである。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ｗｅｂ公開：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照のこと（これらはすべて、参照により本明細書に援用される）。そのような非ウイルス性ＴＰＰ１ベクターを、本明細書に記載の経路により投与してもよい。ウイルスベクター、または非ウイルスベクターを、遺伝子導入及び遺伝子治療の用途で使用するために、生理学的に許容される担体と共に製剤化することができる。
別の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の発現カセットを含むウイルスベクターである。「ウイルスベクター」は、外来性または異種のＣＬＮ２核酸導入遺伝子を有する複製欠損ウイルスとして定義される。一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットを、薬物送達またはウイルスベクターの産生に使用されるプラスミド上に設計してもよい。適切なウイルスベクターは、好ましくは複製欠損型であり、脳細胞を標的とするベクターの中から選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、パルボウイルスなどを含むがこれらに限定されない遺伝子治療に適した任意のウイルスを含み得る。しかしながら、理解を容易にするために、アデノ随伴ウイルスを例示的なウイルスベクターとして本明細書中で参照する。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的の遺伝子を含む発現カセットがウイルスキャプシドまたはエンベロープにパッケージングされた合成または組換え型のウイルス粒子を指し、同様にウイルスキャプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされる任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損型であり、すなわち、それらは、子孫ビリオンを生成することはできないが、標的細胞に感染する能力を保持している。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス」であるようにこのゲノムを設計することができる）が、これらの遺伝子を生成中に供給してもよい。したがって、複製に必要なウイルス酵素の存在下以外では、子孫のビリオンによる複製及び感染は生じ得ないため、これは遺伝子治療での使用に安全であるとみなされる。
別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドとその内部にパッケージされたベクターゲノムを含む。
ベクターゲノムは、一実施形態では：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするコード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、ベクターゲノムは、本明細書に記載の発現カセットである。一実施形態では、ＣＬＮ２配列は、完全長ＴＰＰ１タンパク質をコードする。一実施形態では、ＴＰＰ１配列は、配列番号１のタンパク質配列である。別の実施形態では、コード配列は、配列番号３またはそのバリアントである。
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）～６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小型非エンベロープ正二十面体型ウイルスである。既知のＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などがある。ＩＴＲまたは他のＡＡＶ構成要素は、当業者に利用可能な技術を使用してＡＡＶから容易に単離または設計され得る。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、または公的な情報源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離し、設計し、または入手してもよい。あるいは、ＡＡＶ配列を、文献またはデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどで利用可能であるような公開された配列を参照することにより、合成手段または他の適切な手段によって設計してもよい。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学技術によって設計してもよく、それにより、核酸配列の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性と粒子寿命の調整、効率的な分解、核への正確な送達などのためにこれらの粒子を最適化することができる。
ＡＡＶの断片は、様々なベクター系及び宿主細胞において容易に利用し得る。望ましいＡＡＶ断片として、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３及び超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする配列が挙げられる。そのような断片を、単独で、他のＡＡＶ血清型配列もしくは断片と組み合わせて、または他のＡＡＶ配列もしくは非ＡＡＶウイルス配列由来のエレメントと組み合わせて使用してもよい。本明細書中で使用する場合、人工ＡＡＶ血清型には、限定されないが、非天然キャプシドタンパク質を有するＡＡＶが含まれる。本発明の新規ＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、別のＡＡＶ血清型（既知または新規）、同じＡＡＶ血清型の非隣接部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、そのような人工キャプシドを任意の適切な技術によって生成してもよい。人工ＡＡＶ血清型は、限定されないが、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってもよい。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ９ ｃａｐ及び／またはｒｅｐ配列を含む。参照により本明細書に援用される米国特許第７，９０６，１１１号を参照のこと。
一実施形態では、本明細書において、配列番号６のアミノ酸配列を特徴とするＡＡＶ９キャプシドを有するＡＡＶベクターを提供し、それを必要とする患者においてその発現を指示する調節配列の制御下にある古典的乳児期遅発型神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）遺伝子をコードする核酸を、本明細書中に提供する。
本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９キャプシド」は、配列番号６の異なる長さのタンパク質をもたらす選択的スプライシングバリアントとして一般的に発現する約６０の可変タンパク質（ｖｐ）の集合体であるＤＮＡｓｅ耐性粒子を特徴とする。参照により本明細書に援用されるＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４．１も参照のこと。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照のこと。本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９バリアント」には、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、及びＵＳ８，７３４，８０９に記載のバリアントが含まれる。そのアミノ酸配列は配列番号６に再現されており、そのコード配列は配列番号７に再現されている。一実施形態では、ＡＡＶ９キャプシドは、配列番号７によってコードされるキャプシド、またはそれと少なくとも約９０％、９５％、９５％、９８％、もしくは９９％の同一性を共有する配列を有する。
最も大型のタンパク質であるｖｐ１は、一般的に、配列番号６のアミノ酸配列の完全長（配列番号６のａａ １～７３６）である。特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ２タンパク質は、配列番号６の１３８～７３６のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ３は、配列番号６の２０３～７３６のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ｖｐ１、２、または３タンパク質は、トランケーションを有する場合がある（例えば、Ｎ末端またはＣ末端の１つ以上のアミノ酸）。ＡＡＶ９キャプシドは、約６０個のｖｐタンパク質からなり、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３は、組み立てられたキャプシド内に約１個のｖｐと、約１個のｖｐ２と、約１０～２０個のｖｐ３の比率で存在する。この比率は、使用する産生系によって異なり得る。特定の実施形態では、ｖｐ２が存在しない改変型ＡＡＶ９キャプシドを生成してもよい。
ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このＡＡＶ９キャプシドをコードする核酸配列を設計することは当技術分野の技術の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶ９ ｖｐ１キャプシドタンパク質をコードする核酸配列を、配列番号７で提供する。他の実施形態では、配列番号７に対して７０％～９９．９％の同一性の核酸配列を、ＡＡＶ９キャプシドを発現させるために選択してもよい。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号７と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。
本明細書中で使用する場合、ＡＡＶの群に関連する用語「クレード」とは、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、近隣結合アルゴリズムを使用して、少なくとも７５％（少なくとも１０００回反復の）のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定によって決定される、互いに系統発生的に関連するＡＡＶの群を指す。近隣結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、改変型Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１キャプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書中で同定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別のクレードに含まれるか、またはこれらのクレードの外側であるかどうかを容易に判定することができる。例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを識別し、新規ＡＡＶの核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９）を提供するＧ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０）：６３８１－６３８８を参照されたい。ＷＯ２００５／０３３３２１も参照のこと。ＡＡＶ９は、クレードＦ内にあることをさらに特徴とする。他のクレードＦ ＡＡＶには、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２が含まれる。
本明細書中で使用する場合、ＡＡＶに関して、バリアントという用語は、アミノ酸配列または核酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％またはそれ以上の配列同一性を共有する配列を含む、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味する。別の実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、任意の記載の、または既知のＡＡＶキャプシド配列に対して最大約１０％の変異を含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶキャプシドは、本明細書中で提供し、及び／または当技術分野で公知のＡＡＶキャプシドに対して約９０％～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、または約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９キャプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶキャプシドの同一性の割合を決定する場合、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３）のいずれかに対して比較を行ってもよい。一実施形態では、ＡＡＶキャプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３にわたってＡＡＶ９と少なくとも９５％の同一性を共有する。
本明細書中で使用する場合、「人工ＡＡＶ」は、限定されないが、非天然キャプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味する。選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１キャプシドタンパク質の断片）を、異なる選択されたＡＡＶ、同じＡＡＶの非隣接部分、非ＡＡＶウイルス源、または非ウイルス源から得られ得る異種配列と組み合わせて使用して、そのような人工キャプシドを任意の適切な技術によって生成してもよい。人工ＡＡＶは、限定されないが、シュードタイプＡＡＶ、キメラＡＡＶキャプシド、組換えＡＡＶキャプシド、または「ヒト化」ＡＡＶキャプシドであってもよい。１つのＡＡＶのキャプシドを異種キャプシドタンパク質に置換したシュードタイプベクターは、本発明において有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／９及びＡＡＶ２／ｒｈ．１０は、例示的なシュードタイプベクターである。
別の実施形態では、自己相補的ＡＡＶを使用する。「自己相補的ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列によって保持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計された発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染後、第２鎖の細胞媒介合成を待つよりもむしろ、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半体が会合して、即座に複製及び転写を行う準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照のこと。自己相補的ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用する用語「外来性」とは、その核酸またはタンパク質が、染色体、または宿主細胞においてそれが存在する位置に天然には存在しないことを意味する。外来性核酸配列はまた、同じ宿主細胞または対象に由来し、それらに挿入されているが、非天然状態、例えば、異なるコピー数で、または異なる調節エレメントの調節下に存在する配列も指す。
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用する用語「異種」とは、その核酸またはタンパク質が、それを発現する宿主細胞もしくは対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来することを意味する。タンパク質またはプラスミド、発現カセット、もしくはベクター内の核酸に関して使用する場合の用語「異種」とは、当のタンパク質または核酸が、天然に互いに同じ関係で見出されない別の配列または部分配列と共に存在することを示す。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の発現カセットのいずれかを含む発現カセットを使用して、組換えＡＡＶゲノムを生成する。
一実施形態では、ウイルスベクターを生成するために、及び／または、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどを宿主細胞に送達するために有用な適切な遺伝子エレメント（ベクター）に、本明細書に記載の発現カセットを組み込み、そこに含まれるＣＬＮ２配列を移行させる。選択されたベクターを、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含む任意の適切な方法によって送達してもよい。そのような構築物を作製するために使用する方法は、核酸操作の当業者に公知であり、方法には、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。
発現カセットまたはｒＡＡＶゲノムまたは産生プラスミドをビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットと同じ構築物内でシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。一実施形態では、複製（ｒｅｐ）及び／またはキャプシド（ｃａｐ）のコード配列を、ＡＡＶゲノムから除去し、これらを、ＡＡＶベクターを生成するためにトランスでまたはパッケージング細胞株によって供給する。
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを生成し、単離するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許７７９０４４９、米国特許７２８２１９９、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及びＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。１つの系では、産生用細胞株に、ＩＴＲに隣接させた導入遺伝子をコードする構築物と、ｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（複数可）を一過性にトランスフェクトする。第２の系では、ｒｅｐとｃａｐを安定的に供給するパッケージング細胞株に、ＩＴＲに隣接させた導入遺伝子をコードする構築物を一過性にトランスフェクトする。特定の実施形態では、産生用細胞株またはパッケージング細胞株は、本明細書に記載のＡＡＶウイルスベクターを、浮遊培養において産生用細胞株またはパッケージング細胞株を増殖させることによって製造することができるような浮遊細胞株である。これらの各系では、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答してＡＡＶビリオンが生成されるため、混入ウイルスからｒＡＡＶを分離する必要がある。より最近では、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発された－必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼ）はまた、系によってトランスで供給される。これらのより新しい系では、必要なヘルパー機能をコードする構築物で細胞を一過性にトランスフェクトすることによってヘルパー機能を供給することができるか、または、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むように細胞を改変することができ、その遺伝子の発現を転写レベルまたは転写後レベルで調節することができる。
用語「単離された」とは、物質を元の環境（例えば、それが天然型の場合は自然環境）から除去することを意味する。例えば、生きている動物内に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に共存する物質の一部またはすべてから分離させた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、たとえその後に天然の系に再導入する場合であっても、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部で有り得、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部で有り得、そしてそのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点で依然として単離され得る。
さらに別の系では、ＩＴＲに隣接する発現カセット及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルス系ベクターを用いて感染させることによって昆虫細胞に導入する。これらの産生系の概説については、一般的に、例えば、その内容の全体が参照により本明細書に援用されるＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照のこと。これら及び他のＡＡＶ産生系を作製し、使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、その各々の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される：５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び７，４３９，０６５。一般的に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ ＆ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３を参照のこと；また、以下に引用する参考文献は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
一態様では、本明細書において、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む、本明細書に記載のｒＡＡＶの製造方法を提供する。
特定の実施形態では、無血清及び動物成分フリーの培地を使用して細胞を浮遊培養に適応させることにより、付着細胞株から浮遊細胞株を誘導する。特定の実施形態では、浮遊細胞株は、ＨＥＫ２９３浮遊細胞株である。
本発明の任意の実施形態を構築するために使用する方法は、核酸操作の当業者に公知であり、方法には、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技術が含まれる。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （２０１２）を参照のこと。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は周知であり、適切な方法の選択は、本発明を制限するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
「プラスミド」は、一般的に、当業者によく知られた標準的な命名規則に従って、大文字及び／または数字の前後に小文字のｐで示される。本発明に従って使用することができる多くのプラスミドならびに他のクローニングベクター及び発現ベクターは周知であり、当業者であれば容易に利用可能である。さらに、当業者であれば、本発明での使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明におけるそのようなプラスミド、及び他のベクターの特性、構築及び使用は、本開示から当業者に容易に明らかになるであろう。
一実施形態では、産生プラスミドは、本明細書に記載のプラスミドであるか、または参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１２／１５８７５７に記載されているプラスミドである。様々なプラスミドが、ｒＡＡＶベクターの作製に使用するために当技術分野で公知であり、本明細書において有用である。ＡＡＶ ｃａｐ及び／またはｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞内で産生プラスミドを培養する。宿主細胞内で、各ｒＡＡＶゲノムをレスキューし、キャプシドタンパク質またはエンベロープタンパク質にパッケージングして感染性ウイルス粒子を形成させる。
一態様では、上記の発現カセットを含む産生プラスミドを提供する。一実施形態では、産生プラスミドは、図２に示すプラスミドである。このプラスミドは、ｒＡＡＶ－ヒトコドン最適化ＴＰＰ１ベクターの生成例において使用される。そのようなプラスミドは、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列、選択されたプロモーター、ポリＡ配列、及び３’ＩＴＲを含むプラスミドであり、さらに、プラスミドは、ニワトリβアクチンイントロンなどのイントロン配列も含む。例示的な概略図を図１に示す。さらなる実施形態では、イントロン配列は、約３キロベース（ｋｂ）～約６ｋｂ、約４．７ｋｂ～約６ｋｂ、約３ｋｂ～約５．５ｋｂ、または約４．７ｋｂ～５．５ｋｂのサイズのｒＡＡＶベクターゲノムを保持する。ＴＰＰ１コード配列を含む産生プラスミドの例は、配列番号５に見出し得る。別の実施形態では、産生プラスミドを、ベクタープラスミド産生効率が最適化されるように改変する。そのような改変として、他の中性配列を追加するか、またはベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを調節するためのλスタッファー配列を含めることが挙げられる。そのような改変が本明細書において企図される。他の実施形態では、ターミネーター及び他の配列を、プラスミドに含める。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセット、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、ウイルス（ｒＡＡＶなど）、及び／または産生プラスミドは、ＡＡＶ逆位末端配列、ＴＰＰ１をコードするコドン最適化核酸配列、及び／または宿主細胞におけるコードされたタンパク質の発現を指示する発現調節配列を含む。他の実施形態では、ｒＡＡＶ発現カセット、ウイルス、ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、及び／または産生プラスミドは、イントロン、コザック配列、ポリＡ、転写後調節エレメントなどのうちの１つ以上をさらに含む。一実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
発現カセット、ベクター及びプラスミドは、本明細書に記載のように、例えば、コドン最適化を含む当技術分野で公知の技術を使用して特定の種に対して最適化することができる他の成分を含む。本明細書に記載のカセット、ベクター、プラスミド及びウイルスまたは他の組成物の成分は、発現調節配列の一部としてプロモーター配列を含む。別の実施形態では、プロモーターは細胞特異的である。用語「細胞特異的」とは、組換えベクター用に選択された特定のプロモーターが、特定の細胞または組織タイプにおいて、最適化されたＴＰＰ１コード配列の発現を指示することができることを意味する。一実施形態では、プロモーターは、上衣、すなわち脳室系の上皮内層における導入遺伝子の発現に特異的である。別の実施形態では、プロモーターは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアから選択される脳細胞内での発現に特異的である。一実施形態では、クローニングを容易にするために、１つ以上の制限酵素部位を追加するようにプロモーターを改変する。
別の実施形態では、プロモーターは、遍在的または構成的プロモーターである。適切なプロモーターの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントを有するハイブリッドニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、例えば、配列番号５のｎｔ ３３９６～４０６１に示す配列である。別の実施形態では、プロモーターはＣＢ７プロモーターである。他の適切なプロモーターとして、ヒトβ－アクチンプロモーター、ヒト伸長因子－１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。例えば、Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ ｅｔ ａｌ，（Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９（８）：ｅ１０６４７２を参照のこと。さらに他の適切なプロモーターとして、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節性プロモーターが挙げられる［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照のこと］。あるいは、生理学的合図に応答するプロモーターを、本明細書に記載の発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド、及びウイルスにおいて利用してもよい。一実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶベクターのサイズ制限のために、１０００ｂｐ未満の小さなサイズである。別の実施形態では、プロモーターは４００ｂｐ未満である。当業者は、他のプロモーターを選択してもよい。
さらなる実施形態では、プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、ファージλ（ＰＬ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、テトラサイクリン調節性トランスアクチベーター応答性プロモーター（ｔｅｔ）系、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ＢＩＶ ＬＴＲまたはＨＩＶ ＬＴＲなどの末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（複数可）、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ＰＧＫプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０プロモーターなどの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、ＭＮＤプロモーター、またはＭＮＣプロモーターから選択される。そのプロモーター配列は、当業者に公知であるか、または文献もしくは、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースにおいて公的に入手可能である。
別の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、ラパマイシン／ラパログプロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン応答性プロモーター、及びテトラサイクリン応答性プロモーター、またはヘテロ二量体リプレッサースイッチを含む既知のプロモーターから選択され得る。いずれもその全体が参照により本明細書に援用されるＳｏｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎ Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５ Ｎｏｖ ２４；５：１７１０５及びＤａｂｅｒ Ｒ，Ｌｅｗｉｓ Ｍ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｗｉｔｃｈ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ａｕｇ ２８；３９１（４）：６６１－７０，Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｎ ２１を参照されたい。
他の実施形態では、本明細書に記載の発現カセット、ベクター、プラスミド及びウイルスは、他の適切な転写開始配列、転写終結配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、ＴＡＴＡ配列、細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、イントロン、タンパク質の安定性を高める配列、ならびに所望により、コード産物の分泌を促進する配列を含む。発現カセットまたはベクターには、本明細書に記載のエレメントをまったく含めないか、１つまたはそれ以上を含ませてもよい。
適切なポリＡ配列の例として、例えば、合成ポリＡまたはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＦ）由来のポリＡ配列が挙げられる。さらなる実施形態では、ポリＡは、配列番号５のｎｔ ３３～１５９の核酸配列を有する。
適切なエンハンサーの例として、例えば、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｋ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥなどが挙げられる。
一実施形態では、ＴＰＰ１コード配列の上流にコザック配列を含ませて、正しい開始コドンからの翻訳を増強する。別の実施形態では、発現カセットにＣＢＡエクソン１及びイントロンを含ませる。一実施形態では、ＴＰＰ１コード配列を、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの調節下に置く。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター、及びイントロン１配列に隣接するＣＢＡエクソン１からなる。
別の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、卵白アルブミン、ｐ５３、またはそれらの断片から選択される。
一実施形態では、発現カセット、ベクター、プラスミド及びウイルスは、５’ＩＴＲ、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡエクソン１及びイントロン、ヒトコドン最適化ＣＬＮ２配列、ウサギグロビンポリＡならびに３’ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、発現カセットは、配列番号８のｎｔ １～４０２０を含む。さらにさらなる実施形態では、５’ＩＴＲは、配列番号５のｎｔ ３１９９～ｎｔ ３３２８の核酸配列を有し、３’ＩＴＲは、配列番号５のｎｔ ２４８～ｎｔ ３７７の核酸配列を有する。さらなる実施形態では、産生プラスミドは、配列番号５の配列を有し、これを図１～５にも示す。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶは構築物ＩＩＩであり、５’から３’の順に：（１）５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、（２）（ｉ）ＣＭＶ前初期エンハンサー、（ｉｉ）ニワトリβ－アクチンプロモーター、及び（ｉｉｉ）ニワトリβ－アクチンイントロンを含むＣＢ７プロモーター、（３）ヒトＣＬＮ２導入遺伝子を含む発現カセット）、（４）ウサギβグロビンポリＡシグナル、ならびに（５）３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。構築物ＩＩＩの概略図を図１に示す。
一態様では、機能性ＴＰＰ１タンパク質をコードするコード配列を提供する。「機能性ｈＴＰＰ１」とは、天然のＴＰＰ１タンパク質、または疾患に関連しないその天然のバリアントまたは多形の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれとほぼ同等であるか、もしくは１００％超を提供するＴＰＰ１タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
特定の実施形態では、ＡＡＶ９．ＣＬＮ２ベクターを産生する。いくつかの適切な精製方法を選択し得る。適切な精製方法の例は、例えば、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号及びその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び参照により本明細書に援用される２０１５年１２月１１日に出願された同第６２／２２６，３５７号（表題「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」）に記載されている。
６．２ 医薬組成物
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物も提供する。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、（ｂ）塩化ナトリウム、（ｃ）塩化マグネシウム、（ｄ）塩化カリウム、（ｅ）デキストロース、（ｆ）ポロキサマー１８８、（ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び（ｈ）第二リン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは構築物ＩＩＩである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、当技術分野で公知の任意のｒＡＡＶであり得る。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、以下の特許出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７６５０（国際公開第ＷＯ２０１７／１８１０２１号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２７５６８（国際公開第ＷＯ２０１８／１９１６６６号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９１０（国際公開第ＷＯ２０１８／１４４４４１号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５２８５５（国際公開第ＷＯ２０１９／０６７５４０号として公開）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４２２０５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４３６３１、ＷＯ２０１９０７９４９４Ａ１、ＷＯ２０１９１６４８５４Ａ１、ＷＯ２０１９０７９４９６Ａ２、ＵＳ２０１９０２１１０９１Ａ１、ＵＳ２０１９０３８７７７Ａ１、ＵＳ２０１８２８９８３９Ａ１、ＵＳ２０１９１２７４５５Ａ１、ＫＲ２０１６００１０５２６Ａ、ＫＲ２０１９００８６５０３Ａ、ＴＷ２０１９０３１４６Ａ、ＷＯ２０１９２０４５１４Ａ１、ＷＯ２０１９２０４５１４Ａ１、ＷＯ２０１９１９１１１４Ａ１、ＷＯ２０１９１６９００４Ａ１、ＷＯ２０１９１６８９６１Ａ１、ＷＯ２０１９１６４８５４Ａ１、ＷＯ２０１９１１３２２４Ａ１、ＷＯ２０１９１０８８５６Ａ１、ＷＯ２０１９１０８８５７Ａ１、ＷＯ２０１９０６０６６２Ａ１、ＷＯ２０１９０３５０６６Ａ１、ＷＯ２０１９０３６４８４Ａ１、ＷＯ２０１９０１０３３５Ａ１、ＷＯ２０１８２３２１４９Ａ１、ＷＯ２０１８２１８３５９Ａ１、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１、ＷＯ２０１８２０４６２６Ａ１、ＷＯ２０１８２００５４２Ａ１、ＷＯ２０１８２００４１９Ａ１、ＷＯ２０１８１９１４９０Ａ１、ＷＯ２０１８１８３２９３Ａ１、ＷＯ２０１８１６０８４９Ａ１、ＷＯ２０１８１６０５８２Ａ８、ＷＯ２０１８１６０５７３Ａ１、ＷＯ２０１８１６０５８５Ａ２、ＷＯ２０１８１５２４８５Ａ１、ＷＯ２０１８１４４７０９Ａ２、ＷＯ２０１８１２６１１２Ａ１、ＷＯ２０１８１２６１１６Ａ１、ＷＯ２０１８０５９５４９Ａ１、ＷＯ２０１８０５７９１６Ａ１、ＷＯ２０１８０２２９０５Ａ２、ＷＯ２０１８０２２５１１Ａ１、ＷＯ２０１８００９８１４Ａ１、ＷＯ２０１７１９６８１４Ａ１、ＷＯ２０１７１８４４６３Ａ１、ＷＯ２０１７１８１０６８Ａ１、ＷＯ２０１７１８０９３６Ａ１、ＷＯ２０１７１８０８５４Ａ１、ＷＯ２０１７１８０８５７Ａ１、ＷＯ２０１７１５１８８４Ａ１、ＷＯ２０１７１５１８２３Ａ１、ＷＯ２０１７１４７１８０Ａ１、ＷＯ２０１７１３６５００Ａ１、ＷＯ２０１７１３６５３３Ａ１、ＷＯ２０１７１２０２９４Ａ１、ＷＯ２０１７１１４４９７Ａ１、ＷＯ２０１７１０６３４５Ａ１、ＷＯ２０１７１０６３５４Ａ１、ＷＯ２０１７１０６３２６Ａ１、ＷＯ２０１７１０６２４４Ａ１、ＷＯ２０１７１０６２０２Ａ２、ＷＯ２０１７１００６７６Ａ１、ＷＯ２０１７１００７０４Ａ１、ＷＯ２０１７１００６７４Ａ１、ＷＯ２０１７１００６８２Ａ１、ＷＯ２０１７１６０３６０Ａ９、ＷＯ２０１７０８７９００Ａ１、ＷＯ２０１７０７９６５６Ａ２、ＷＯ２０１７０６２７５０Ａ１、ＷＯ２０１７０５３７３２Ａ２、ＷＯ２０１７０４０５２４Ａ１、ＷＯ２０１７０４０５２８Ａ１、ＷＯ２０１７０２４１９８Ａ１、ＷＯ２０１７０１５１０２Ａ１、ＷＯ２０１６１９６３２８Ａ１、ＷＯ２０１６２００５４３Ａ８、ＷＯ２０１６１７９０３４Ａ２、ＷＯ２０１６１７６１９１Ａ１、ＷＯ２０１６１７６２１２Ａ１、ＷＯ２０１６０７３５５６Ａ１、ＷＯ２０１６０１９３６４Ａ１、ＷＯ２０１５１７５６３９Ａ１、ＷＯ２０１５１６４７２３Ａ１、ＷＯ２０１５１３８８７０Ａ２、ＷＯ２０１５１３８３５７Ａ２、ＷＯ２０１５０６６６２７Ａ１、ＷＯ２０１５００９５７５Ａ１、ＷＯ２０１５０１２９２４Ａ２、ＷＯ２０１４１５１３４１Ａ１、ＷＯ２０１４１５１２６５Ａ１、ＷＯ２０１４１２４２８２Ａ１、ＷＯ２０１４０５９０６８Ａ１、ＷＯ２０１４０５２６９３Ａ２、ＷＯ２０１４０１２０２５Ａ２、ＷＯ２０１３１７３７０２Ａ２、ＷＯ２０１３１６２７４８Ａ１、ＷＯ２０１３１４２３３７Ａ１、ＷＯ２０１４０１１２１０Ａ１、ＷＯ２０１３０４９４９３Ａ１、ＷＯ２０１２１５８７５７Ａ１、ＷＯ２０１２１４５５７２Ａ１、ＷＯ２０１２１１２８３２Ａ１、ＷＯ２０１２０７１３１８Ａ２、ＷＯ２０１１１２６８０８Ａ９、ＷＯ２０１１１１２５５４Ａ１、ＷＯ２０１１０６０２３３Ａ１、ＷＯ２０１１０４１５０２Ａ１、ＷＯ２０１１０３８１８７Ａ１、ＷＯ２０１１０３８０６３Ａ１、ＷＯ２０１０１３８６７５Ａ１、ＷＯ２０１０１２７０９７Ａ１、ＷＯ２０１０１０２１４０Ａ１、ＷＯ２０１００５６７５９Ａ１、ＷＯ２０１００５１３６７Ａ１、ＷＯ２０１００６２５６２Ａ１、ＷＯ２０１００４０１３５Ａ１、ＷＯ２０１００１１６４２Ａ２、ＷＯ２０１０００８７８２Ａ１、ＷＯ２００９１３４６８１Ａ２、ＷＯ２００９１３６９７７Ａ２、ＷＯ２００９１０５０８４Ａ２、ＷＯ２００９０７３１０４Ａ２、ＷＯ２００９０７３１０３Ａ２、ＷＯ２００８１５０４５９Ａ１、ＷＯ２００８１４０８１２Ａ２、ＷＯ２００８０８５４８６Ａ１、ＷＯ２００８０７９１７２Ａ２、ＷＯ２００８０１９１３１Ａ２、ＷＯ２００８０１３９２８Ａ２、ＷＯ２００７１３０４５５Ａ２、ＷＯ２００７１２７２６４Ａ２、ＷＯ２００８０２７０８４Ａ２、ＷＯ２００７１０６４７６Ａ２、ＷＯ２００７０７０７０５Ａ２、ＷＯ２００７０２４７０８Ａ２、ＷＯ２００７００２２８５Ａ２、ＷＯ２００６１１０６８９Ａ２、ＷＯ２００６１０２０７２Ａ２、ＷＯ２００６０３９２１８Ａ２、ＷＯ２００６０７８２７９Ａ２、ＷＯ２００５１１８６１１Ａ２、ＷＯ２００５０６２９５７Ａ２、ＷＯ２００５０３３３２１Ａ２、ＷＯ２００５０３０２９２Ａ２、ＷＯ２００５０２７９９５Ａ２、ＷＯ２００５０１８４３１Ａ２、ＷＯ２００５００１１０３Ａ２、ＷＯ２００４１０８９２２Ａ３、ＷＯ２００４０９４６０６Ａ２、ＷＯ２００４００９７６９Ａ２、ＷＯ０３０９３４６０Ａ１、ＷＯ０３０５７１７１Ａ２、ＷＯ０３０４６１２４Ａ２、ＷＯ０３０５２０５１Ａ３、ＷＯ０３０５２０５２Ａ３、ＷＯ０３０４２３９７Ａ３、ＷＯ０３０３８０６２Ａ２、ＷＯ０３０２４５０２Ａ２、ＷＯ０３０１４３６７Ａ１、ＷＯ０３０００８５１Ａ２、ＷＯ０２１００３１７Ａ２、ＷＯ０２０８２９０４Ａ２、ＷＯ０２３０４１０Ａ２、ＷＯ０２２０７１８Ａ２、ＷＯ０２１０４１０Ａ１、ＷＯ０１８３６９２Ａ２、ＷＯ０１７４１６３Ａ１、ＷＯ０１７２３２９Ａ１、ＷＯ０１２３００１Ａ２、ＷＯ０１２３５９７Ａ９、ＷＯ００５７８３７Ａ２、ＷＯ００５５３４２Ａ１、ＷＯ００２８０６１Ａ２、ＷＯ９９４４６４５Ａ１、ＷＯ９９４３３６０Ａ１、ＷＯ９９３１９８２Ａ１、ＷＯ９９１５６７７Ａ１、ＷＯ９９１４３５４Ａ１、ＷＯ９９１５６８５Ａ１、ＷＯ９９１００１３Ａ１、ＷＯ９６３９５３０Ａ３、ＷＯ９６３９４１６Ａ１、ＷＯ９６２６２８６Ａ１、及びＷＯ９６１３５９８Ａ２において開示されている任意のｒＡＡＶである（使用され得るｒＡＡＶについて、本明細書で参照されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により援用される）。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＲＧＸ－１２１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－１１１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－３１４（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、構築物ＩＩＩ（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、ＲＧＸ－５０１（ＲＥＧＥＮＸＢＩＯ Ｉｎｃ．）、Ｇｌｙｂｅｒａ（登録商標）（ａｌｉｐｏｇｅｎｅ ｔｉｐａｒｖｏｖｅｃ）（ｕｎｉＱｕｒｅ）、Ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ（ＳＰＫ－ＲＰＥ６５）（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＭｉｅｒａＧＴｘ ＵＫ ＩＩ Ｌｔｄ／Ｓｙｎｅ Ｑｕａ Ｎｏｎ Ｌｔｄ／ＵＣＬ）、ｒＡＡＶ２－ＣＢＳＢ－ｈＲＰＥ６５（ＵＰｅｎｎ；ＮＥＩ）、ｒＡＡＶ２－ｈＲＰＥ６５（ＨＭＯ）、ＳＰＫ－ＣＨＭ（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＮＧＡ３－ＡＣＨＭ（ＡＧＴＣ）、ＣＮＧＢ３－ＡＣＨＭ（ＡＧＴＣ）、ｓｃＡＡＶ２－Ｐ１ＮＤ４（ＮＥＩ）、ＸＬＲＳ遺伝子治療薬（Ｂｉｏｇｅｎ／ＡＧＴＣ）、ＢＭＮ－２７０（Ｂｉｏｍａｒｉｎ）、ＳＢ－５２５（Ｓａｎｇａｍｏ）、ＤＴＸ１０１（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＰＫ－９００１（ＳＰＫ－ＦＩＸ）（Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＭＴ－０６０（ｕｎｉＱｕｒｅ／Ｓｔ．Ｊｕｄｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、ＳＢ－ＦＩＸ（Ｓａｎｇａｍｏ）、ｓｃＡＡＶ２／８－ＬＰ１－ｈＦＩＸｃｏ（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ／ＵＣＬ）、ＡＤＶＭ－０４３（Ａｄｖｅｒｕｍ）、ＡＶＸＳ－１０１（ＡｖｅＸｉｓ）、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン（ＮＩＣＨＤ）、ＬＧＭＤ２Ｄ（ＮＣＨ）、ｒＡＡＶ１．ＣＭＶ．ヒトフォリスタチン３４４（ＮＣＨ）、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ＤＹＳＦ．ＤＶ（ＮＣＨ）、ＡＲＴ－１０２（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ）、脳内遺伝子治療薬（ＩＮＳＥＲＭ）、ＣＥＲＥ－１１０（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ）、ＣＥＲＥ－１２０（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ／Ｓａｎｇａｍｏ）、ＡＡＶ－ｈＡＡＤＣ（ＮＩＨ）、ＡＡＶ２ＣＵｈＣＬＮ２（ワイルコーネル医科大学；Ａｂｅｏｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＡＦ－３０１（Ｌｙｓｏｇｅｎｅ）、ＤＴＸ３０１（Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、及びＴＴ－０３４（Ｔａｃｅｒｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）からなる群から選択され得る（Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ． ＢｉｏＤｒｕｇｓ．２０１７；３１（４）：３１７－３３４を参照のこと）。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ｒＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６からなる群から選択される１つ以上のアデノ随伴ウイルス血清型由来の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のキャプシドタンパク質を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、ＡＡＶ９由来の成分を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、複数の化合物を含む。特定の実施形態では、化合物は、異なる水和物形態、例えば、無水物、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、及び１０水和物の形態からなるがこれらに限定されない群から選択される水和物形態である。
特定の実施形態では、医薬組成物中の化合物の重量／体積濃度は、異なる水和物形態の化合物と同等のモル量を有する無水形態の化合物に基づいて表され得る。特定の実施形態では、無水形態は天然には存在しない場合がある。
特定の実施形態では、医薬組成物中の特定の水和物形態の化合物は、同等のモル量を有する異なる水和物形態の同じ化合物を表し得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウム、例えば、二水和物形態の塩化カルシウムを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムを含まない。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．０～８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．０～９．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約６．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約８．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約９．０である。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．０～８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．０～９．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは６．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは７．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．０である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．１である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．２である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．３である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．４である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．５である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．６である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．７である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．８である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは８．９である。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは９．０である。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される１つ以上の化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される１つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される２つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される３つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される４つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される５つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される６つの化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供する医薬組成物は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびに塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、デキストロース、ポロキサマー１８８、第一リン酸ナトリウム、及び第二リン酸ナトリウムからなる群から選択される７つすべての化合物を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書において：
（ａ）組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、
（ｂ）塩化ナトリウム、
（ｃ）塩化マグネシウム、
（ｄ）塩化カリウム、
（ｅ）デキストロース、
（ｆ）ポロキサマー１８８、
（ｇ）第一リン酸ナトリウム、及び
（ｈ）第二リン酸ナトリウム、を含む医薬組成物を提供し、
その場合、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは：（ｉ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｉｖ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは構築物ＩＩＩである。
特定の実施形態では、医薬組成物は、塩化カルシウムをさらに含む。
特定の実施形態では、前記塩化ナトリウム、前記塩化マグネシウム、前記塩化カリウム、前記デキストロース、前記ポロキサマー１８８、前記第一リン酸ナトリウム、前記第二リン酸ナトリウム、及び前記塩化カルシウムは、それぞれ、無水、一水和物、二水和物、３水和物、４水和物、５水和物、６水和物、７水和物、８水和物、９水和物、または１０水和物の形態である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、
（ａ）前記ｒＡＡＶ、
（ｂ）約８．７７ｇ／Ｌの濃度の塩化ナトリウム、
（ｃ）約０．２４４ｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム６水和物、
（ｄ）約０．２２４ｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、
（ｅ）約０．２０６ｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム二水和物、
（ｆ）約０．７９３ｇ／Ｌの濃度の無水デキストロース、
（ｇ）約０．００１％（体積／体積）の濃度のポロキサマー１８８、
（ｈ）約０．０２７８ｇ／Ｌの濃度の第一リン酸ナトリウム一水和物、及び
（ｉ）約０．１１４ｇ／Ｌの濃度の第二リン酸ナトリウム無水物、を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）は、約１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、約１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、約６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または約１×１０１５ＧＣ／ｍＬである。特定の実施形態では、医薬組成物のベクターゲノム濃度（ＶＧＣ）は、１×１０１１ＧＣ／ｍＬ、３×１０１１ＧＣ／ｍＬ、６×１０１１ＧＣ／ｍＬ、１×１０１２ＧＣ／ｍＬ、３×１０１２ＧＣ／ｍＬ、６×１０１２ＧＣ／ｍＬ、１×１０１３ＧＣ／ｍＬ、２×１０１３ＧＣ／ｍＬ、約３×１０１３ＧＣ／ｍＬ、４×１０１３ＧＣ／ｍＬ、５×１０１３ＧＣ／ｍＬ、６×１０１３ＧＣ／ｍＬ、７×１０１３ＧＣ／ｍＬ、８×１０１３ＧＣ／ｍＬ、９×１０１３ＧＣ／ｍＬ、または１×１０１４ＧＣ／ｍＬ、３×１０１４ＧＣ／ｍＬ、６×１０１４ＧＣ／ｍＬ、または１×１０１５ＧＣ／ｍＬである。
特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約６．０～約９．０の範囲にある。特定の実施形態では、医薬組成物のｐＨは約７．４である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶは、参照医薬組成物中の同じ組換えｒＡＡＶに比べて凍結／解凍サイクルに対して、少なくとも２％、５％、７％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍、または１０００倍安定である。特定の実施形態では、組換えＡＡＶの安定性を、６．２．１節に開示する１つ以上のアッセイによって測定する。
特定の実施形態では、医薬組成物中の前記ｒＡＡＶの安定性を、
（ａ）ｒＡＡＶの感染力、
（ｂ）ｒＡＡＶの凝集レベル、または
（ｃ）ｒＡＡＶによって放出された遊離ＤＮＡのレベル、によって測定する。
特定の実施形態では、医薬組成物は、液体組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結組成物である。特定の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥組成物または再構成された凍結乾燥組成物である。
特定の実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、筋肉内、皮下、または皮内投与に適した特性を有する。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶの（ｉｉｉ）のコード配列は、コドン最適化されたヒトＣＬＮ２であり、これは、配列番号２の天然ヒトコード配列に対して少なくとも７０％同一である。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶの（ｉｉｉ）のコード配列は、配列番号３である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのｒＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ９またはそのバリアントである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのプロモーターは、ニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのプロモーターは、ＣＢＡプロモーター配列とサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、ポリＡをさらに含む。特定の実施形態では、ポリＡは、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ－グロビン（ＲＧＢ）、または修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、イントロンをさらに含む。特定の実施形態では、イントロンは、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３由来である。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、エンハンサーをさらに含む。特定の実施形態では、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである。
特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、サイズが約３キロベース～約５．５キロベースである。特定の実施形態では、医薬組成物中のｒＡＡＶのベクターゲノムは、サイズが約４キロベースである。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶを産生することができる浮遊細胞株を浮遊培養で増殖させることを含む方法を使用して、医薬組成物中のｒＡＡＶを製造する。
さらに別の態様では、本明細書において、１つ以上の容器及び使用説明書を含むキットを提供し、１つ以上の容器は、本明細書で提供する医薬組成物を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００１％（重量／体積、０．００１ｇ／Ｌ）～０．０１％（重量／体積、０．１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）～０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）～０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００５％（重量／体積、０．００５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００６％（重量／体積、０．００６ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００７％（重量／体積、０．００７ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００８％（重量／体積、０．００８ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０００９％（重量／体積、０．００９ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００１％（重量／体積、０．０１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００２％（重量／体積、０．０２ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００３％（重量／体積、０．０３ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００４％（重量／体積、０．０４ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．００５％（重量／体積、０．０５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０１％（重量／体積、０．１ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０５％（重量／体積、０．５ｇ／Ｌ）の濃度でポロキサマー１８８を含む。
本明細書中で使用する場合、及び特に明記されていない限り、用語「約」とは、所与の値または範囲の±１０％以内を意味する。
本明細書に記載の医薬組成物は、任意の適切な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に送達するように設計される。
さらに他の態様では、これらの核酸配列、ベクター、発現カセット及びｒＡＡＶウイルスベクターは、医薬組成物において有用であり、医薬組成物はまた、薬学的に許容される担体、賦形剤、緩衝液、希釈剤、界面活性剤、防腐剤及び／またはアジュバントなども含む。そのような医薬組成物を使用してそのような組換え改変型ＡＡＶまたは人工ＡＡＶで送達することにより、宿主細胞内で最適化されたＴＰＰ１を発現させる。
核酸配列、ベクター、発現カセット及びｒＡＡＶウイルスベクターを含有するこれらの医薬組成物を調製するために、配列またはベクターまたはウイルスベクターを、好ましくは、従来の方法によって汚染について評価し、次いで、患者への投与に適した医薬組成物に製剤化する。そのような製剤は、ｐＨを適切な生理学的レベルに維持するための薬学的及び／または生理学的に許容されるビヒクルまたは担体、例えば、緩衝生理食塩水または他の緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳ、ならびに場合により、他の薬剤、医薬品、安定剤、緩衝液、担体、アジュバント、希釈剤、界面活性剤、または賦形剤などの使用を含む。注射の場合、担体は通常、液体である。例示的な生理学的に許容される担体として、無菌のパイロジェンフリーの水及び無菌のパイロジェンフリーのリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。様々なそのような公知の担体は、参照により本明細書に援用される米国特許公開第７，６２９，３２２号に示されている。一実施形態では、担体は等張塩化ナトリウム溶液である。別の実施形態では、担体は平衡塩類溶液である。一実施形態では、担体は、ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存する場合は、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で凍結させてもよい。
例示的な特定の一実施形態では、担体または賦形剤の組成物は、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．３、０．０００１％～０．０１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（ＰＦ６８）を含有する。緩衝液の生理食塩水成分の正確な組成範囲は、１６０ｍＭ～１８０ｍＭ ＮａＣｌである。場合により、具体的に記載している緩衝液の代わりに、異なるｐＨ緩衝液（潜在的にＨＥＰＥＳ、重曹、ＴＲＩＳ）を使用する。さらに代わりに、０．９％のＮａＣｌを含有する緩衝液が有用である。
一実施形態では、組換えｒＡＡＶの生成方法は、上記のようにＡＡＶ発現カセットを有するプラスミドを取得し、ＡＡＶウイルスゲノムを感染性ＡＡＶのエンベロープまたはキャプシド内へパッケージング可能とするのに十分なウイルス配列の存在下で、プラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することを含む。ｒＡＡＶベクター生成の特定の方法は上記に記載されており、本明細書に記載の発現カセット及びゲノムにおけるコドン最適化ＣＬＮ２を送達することができるｒＡＡＶベクターを生成する際に使用してもよい。
ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量化は、製剤中に含まれる用量の尺度として使用され得る。当技術分野で公知の任意の方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を測定することができる。ＡＡＶ ＧＣ数の滴定を実行する１つの方法は、以下のとおりである：精製ＡＡＶベクター試料を最初にＤＮａｓｅで処理して、混入した宿主ＤＮＡを製造プロセスから排除する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理してキャプシドからゲノムを遊離させる。次いで、遊離したゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域（例えば、ポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを使用したリアルタイムＰＣＲによって定量化する。ゲノムコピー数を測定するための別の適切な方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、特に最適化されたｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲである［Ｌｏｃｋ Ｍａｒｔｉｎ，ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ ２０１４，２５（２）：１１５－１２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１、２０１３年１２月１３日編集前にオンラインで公開］。あるいは、ＶｉｒｏＣｙｔ３１００を粒子の定量、またはフローサイトメトリーに使用することができる。別の方法では、その全体が参照により援用されるＳ．Ｋ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に記載されているように、最適化ＴＰＰ１コード配列をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効量を測定する。
複製欠損ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、約１．０×１０９ＧＣ～約９×１０１５ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～２．７×１０１５ＧＣの範囲の量の複製欠損ウイルスを含む投与単位で製剤化することができる（体重７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）。一実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。別の実施形態では、組成物を、投与あたり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣ（範囲内のすべての整数または端数を含む）を含有するように製剤化する。一実施形態では、ヒトへの投与の場合、用量を、投与あたり１×１０１０～約２．７×１０１５ＧＣの範囲（範囲内のすべての整数または端数を含む）とすることができる。
特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、生理食塩水、界面活性剤、及び生理学的に適合性のある塩または塩の混合物を含有する水溶液にｒＡＡＶを適切に懸濁する。適切には、製剤を、生理的に許容されるｐＨ、例えばｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整する。脳脊髄液のｐＨが約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達または槽内送達には、この範囲内のｐＨが望ましい場合があり、一方、静脈内送達の場合、６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。一実施形態では、ｐＨは約７．３である。しかしながら、最も広い範囲内の他のｐＨ及びこれらの部分的範囲を、他の送達経路のために選択してもよい。
非毒性の非イオン性界面活性剤の中から、適切な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを選択してもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量が８４００である、ポロキサマー１８８としても公知のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８（ＢＡＳＦ）などの一級ヒドロキシル基で終結する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤を選択する。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ ヒドロキシステアリン酸）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールを選択してもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマー用）に続いて３桁の数字で名付けられ：最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子量を示し、最後の数字×１０はポリオキシエチレン含有率を示す。一実施形態では、ポロキサマー１８８を選択する。界面活性剤は、最大で懸濁液の約０．０００５％～約０．００１％の量で存在させてもよい。
一例では、製剤には、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、第二リン酸ナトリウム、及びその混合物のうちの１つ以上を水中に含有する緩衝生理食塩水を含有させてもよい。適切には、髄腔内送達または槽内送達の場合、浸透圧は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）であり、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照のこと。場合により、髄腔内送達または槽内送達の場合、市販の希釈剤を懸濁剤として、または別の懸濁剤及び他の任意選択の賦形剤と組み合わせて、使用してもよい。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液（Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を参照のこと。他の実施形態では、製剤に、１つ以上の透過促進剤を含有させてもよい。適切な透過促進剤の例として、例えば、マンニトール、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテール、またはＥＤＴＡが挙げられる。
別の実施形態では、組成物は、担体、溶媒、安定剤、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバントを含む。当業者であれば、導入ウイルスが向けられている適応症を考慮して、適切な担体を容易に選択し得る。例えば、１つの適切な担体として生理食塩水が挙げられ、これを、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）と共に製剤化してもよい。他の例示的な担体として、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ごま油、及び水が挙げられる。緩衝液／担体には、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、ｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含めるべきである。
一実施形態では、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２医薬品の提案された構成は、２ｍＬバイアルに含まれる１ｍＬの製剤緩衝液中のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２ベクターの凍結溶液である。提案された製剤緩衝液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．２ｍＭ塩化マグネシウム、３ｍＭ塩化カリウム、１．４ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭリン酸ナトリウム、４．４ｍＭデキストロース、及び０．００１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．３である。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＣＬＮ２医薬品の提案された定量的組成を以下の表１に示す。
Figure 2024505257000002
場合により、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、防腐剤、または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。適切な例示的な防腐剤として、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤として、ゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
本発明による組成物は、上記で定義されたような薬学的に許容される担体を含み得る。適切には、本明細書に記載の組成物は、注射、浸透圧ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別の装置もしくは経路で送達するために設計された、薬学的に適切な担体に懸濁し、及び／または適切な賦形剤と混合させた有効量の１つ以上のＡＡＶを含む。一例では、組成物を髄腔内送達用に製剤化する。一実施形態では、髄腔内送達は、脊柱管、例えばくも膜下腔への注射を包含する。一実施形態では、送達経路は、脳室内注射（ＩＣＶ）である。別の実施形態では、送達経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）送達である。さらに別の実施形態では、送達経路は、槽内（ＩＣ）注射（すなわち、大槽への画像誘導後頭下穿刺を介した髄腔内送達）である。
本明細書に記載のウイルスベクターは、ｈＴＰＰ１を、それを必要とする対象（例えば、ヒト患者）に送達するための薬剤の調製、対象への機能性ＴＰＰ１の供給、及び／またはＣＬＮ２疾患の治療に使用し得る。治療の過程は、場合により、同じウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９ベクター）または異なるウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を含み得る。さらに、本明細書に記載のウイルスベクター及び非ウイルス送達系を使用した他の組み合わせを選択してもよい。
本明細書に記載のｈＴＰＰ１ ｃＤＮＡ配列を、当技術分野で周知の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び合成的に生成することができる。例えば、Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｏｎｇ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １，７９１－７９７（２００６）に記載されているように、長いＤＮＡ配列のＰＣＲベースの正確な合成（ＰＡＳ）法を利用してもよい。デュアル非対称ＰＣＲ法とオーバーラップ伸長ＰＣＲ法を組み合わせた方法が、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄｏｎｇ，Ｔｗｏ－ｓｔｅｐ ｔｏｔａｌ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２（７）：ｅ５９に記載されている。Ｇｏｒｄｅｅｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ｐｈｙｔａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ． ２０１０ Ｍａｙ；８１（２）：１４７－５２． Ｅｐｕｂ ２０１０ Ｍａｒ １０も参照されたい；また、オリゴヌクレオチド合成及び遺伝子合成に関する以下の特許、Ｇｅｎｅ Ｓｅｑ．２０１２ Ａｐｒ；６（１）：１０－２１；ＵＳ８００８００５；及びＵＳ７９８５５６５も参照されたい。これらの各文献は、参照により本明細書に援用される。さらに、ＰＣＲを介してＤＮＡを生成するためのキットとプロトコールが市販されている。これらには、Ｔａｑポリメラーゼ；ＯｎｅＴａｑ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；及びＧｏＴａｑ（登録商標）Ｇ２ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むがこれらに限定されないポリメラーゼの使用が含まれる。ＤＮＡはまた、本明細書に記載のｈＯＴＣ配列を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞から生成され得る。キット及びプロトコールは公知かつ市販されており、ＱＩＡＧＥＮプラスミドキット、Ｃｈａｒｇｅｓｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｐｒｏフィルタープラスミドキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）プラスミドキット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で有用な他の技術として、サーモサイクリングの必要性を排除する配列特異的等温増幅法が挙げられる。これらの方法では、通常、熱の代わりに、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ，Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）などの鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを使用して、二本鎖ＤＮＡを分離させる。ＤＮＡは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである逆転写酵素（ＲＴ）を使用した増幅により、ＲＮＡ分子から生成してもよい。ＲＴは、元のＲＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ鎖を重合し、これはｃＤＮＡと呼ばれる。次いで、このｃＤＮＡを、上記のようにＰＣＲまたは等温法によってさらに増幅することができる。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＧＥＮＥＷＩＺ（登録商標）、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓを含むがこれらに限定されない企業で、カスタムＤＮＡを商業的に生成することもできる。
本明細書に記載の核酸分子、発現カセット及び／またはベクターを、単一の組成物または複数の組成物で送達してもよい。場合により、２つ以上の異なるＡＡＶ、または複数のウイルスを送達してもよい［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４９３を参照のこと］。別の実施形態では、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ及びアデノウイルス）を単独で、またはタンパク質と組み合わせて含み得る。
６．２．１ 医薬組成物に関連するアッセイ
当業者は、本明細書に記載のアッセイ及び／または当技術分野で公知の技術を使用して、本明細書に記載の組成物及び方法を試験する、例えば、本明細書に提供する製剤を試験してもよい。アッセイの詳細を、実施例３及び４に提供する。実施例３及び４はまた、そのようなアッセイをどのように使用して、本明細書で提供する製剤を試験することができるかをより詳細に示している。
Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９ Ｃｅｌｌ ＆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，５（４）：５３７－５４７（その全体が参照により援用される）に記載されているように、例示的なアッセイとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）ゲノムコピー数測定のためのデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）、（２）分光光度法によるＡＡＶのゲノム含有量及び全キャプシド割合の分析、（３）キャプシドのＤＮＡ分布及び純度を測定するためのサイズ排除クロマトグラフィー、（４）キャピラリー電気泳動を使用したキャプシドウイルスタンパク質の純度の評価、（５）ｉｎ ｖｉｔｒｏ力価法－ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＡＡＶベクターの感染力の差異を定量化するための信頼できる方法としての相対的感染力、ならびに（６）キャプシドの空／全比率及びサイズ分布を測定するための超遠心分析法（ＡＵＣ）。
制御された凍結／解凍サイクルを、凍結乾燥機で実行することができる。バイアルは、シェルフ上で十分な間隔を空けることができ、緩衝液の４つのバイアルをサーモカップリングすることができる。
温度ストレス発生安定性試験を、１．０×１０１２ＧＣ／ｍＬで、３７℃、４日間にわたって実施して、本明細書で提供する製剤の相対的安定性を評価することができる。
安定性を評価するために使用することができるアッセイとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相対力価（ＩＶＲＰ）、ベクターゲノム濃度（ｄｄＰＣＲによるＶＧＣ）、色素蛍光による遊離ＤＮＡ、動的光散乱、外観、及びｐＨが挙げられるが、これらに限定されない。
長期の開発安定性試験を１２か月間実施して、本明細書で提供する製剤における、－８０℃（≦－６０℃）及び－２０℃（－２５℃～－１５℃）でのｉｎ ｖｉｔｒｏ相対力価及び他の品質の維持を実証することができる。
ｄｄＰＣＲ ＧＣ力価を遺伝子発現に関連付けるために、ＨＥＫ２９３細胞を形質導入し、細胞培養上清を抗ＶＥＧＦ Ｆａｂタンパク質レベルについてアッセイすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイを実施してもよい。ＨＥＫ２９３細胞を３枚のポリ－Ｄ－リジンでコーティングした９６ウェル組織培養プレートに一晩プレーティングする。次いで、細胞を野生型ヒトＡｄ５ウイルスに事前感染させた後、構築物ＩＩ参照標準と、独立して調製した被験物質の３つの段階希釈液で形質導入し、各調製物を別々のプレートの異なる位置にプレーティングする。形質導入の３日後に、細胞培養培地をプレートから回収し、ＥＬＩＳＡを介してＶＥＧＦ結合Ｆａｂタンパク質レベルを測定する。ＥＬＩＳＡの場合、ＶＥＧＦでコーティングされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをブロックし、次いで回収した細胞培養培地と共にインキュベートして、ＨＥＫ２９３細胞によって産生された抗ＶＥＧＦ Ｆａｂを捕捉する。Ｆａｂ特異的抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、ＶＥＧＦで捕捉されたＦａｂタンパク質を検出する。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質溶液を添加し、発色させ、停止緩衝液で停止させ、プレートリーダーでプレートを読み取る。ＨＲＰ産物の吸光度またはＯＤを対数希釈に対してプロットし、各被験物質の相対力価を、平行類似性試験に合格した後の４パラメータロジスティック回帰モデルでフィッティングした同じプレート上の参照標準に対して、式：ＥＣ５０参照÷ＥＣ５０被験物質を使用して計算する。被験物質の力価は、３枚のプレートの加重平均から計算した、参照標準力価の割合として報告される。
ｄｄＰＣＲ ＧＣ力価を機能的遺伝子発現に関連付けるために、ＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、導入遺伝子（酵素など）の活性をアッセイすることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏバイオアッセイを実施してもよい。ＨＥＫ２９３細胞を、３枚の９６ウェル組織培養プレートに一晩プレーティングする。次いで、細胞を野生型ヒトアデノウイルス血清型５型ウイルスに事前感染させた後、酵素参照標準と被験物質の３つの独立して調製した段階希釈液で形質導入し、各調製物を別々のプレートの異なる位置にプレーティングする。形質導入の２日後に、細胞を溶解し、低ｐＨで処理して酵素を活性化し、導入遺伝子（酵素）による切断時に蛍光シグナルを増加させるペプチド基質を使用して酵素活性をアッセイする。蛍光またはＲＦＵを対数希釈に対してプロットし、各被験物質の相対力価を、平行類似性試験に合格した後の４パラメータロジスティック回帰モデルでフィッティングした同じプレート上の参照標準に対して、式：ＥＣ５０参照÷ＥＣ５０被験物質を使用して計算する。被験物質の力価は、３枚のプレートの加重平均から計算した、参照標準力価の割合として報告される。
ｄｄＰＣＲを使用してベクターゲノム濃度ＧＣを評価することもできる。
ＤＮＡに結合したＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（「ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素」）の蛍光によって、遊離ＤＮＡを測定することができる。マイクロプレートリーダーを使用して蛍光を測定し、ＤＮＡ標準で定量することができる。ｎｇ／μＬでの結果を報告することができる。
測定したｎｇ／μＬでの遊離ＤＮＡを、遊離ＤＮＡの割合に変換するために、２つのアプローチを使用して総ＤＮＡを推定することができる。第１のアプローチでは、ＵＶ－可視分光法によって測定したＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）を使用して、試料中の総ＤＮＡを推定した（式中、ＭはＤＮＡの分子量、１×１０６は単位変換係数である）：
推定総ＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）＝１×１０６×ＧＣ／ｍＬ（ＯＤ）×Ｍ（ｇ／ｍｏｌ）／６．０２×１０２３
第２のアプローチでは、試料を０．０５％ポロキサマー１８８と共に８５℃に２０分間加熱することができ、加熱した試料中でＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素アッセイによって測定した実際のＤＮＡを総量として使用することができる。したがって、これはすべてのＤＮＡを回収し、定量化したという仮定を有する。例えば、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素による総ＤＮＡの測定（ＵＶ測定値と比較して）は、構築物ＩＩ ｄＰＢＳ製剤では１３１％、スクロース製剤を含む構築物ＩＩ修飾ｄＰＢＳでは１５２％であることがわかる（遊離ＤＮＡのｎｇ／μＬから割合への変換の変動は、報告された結果の範囲として捉えることができる）。トレンド分析には、生のｎｇ／μＬを使用することができ、または一貫した方法で測定した割合を使用することができる。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ａｒｃ機器ＩＤ０４４７（Ｃ３ＰＯ）で、パス長２５ｍｍのフローセルを用いて、Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ ＳＥＣ－１０００ピークカラム（ＰＮ２１５９５０Ｐ－４６３０、ＳＮ：８Ａ１１９８２、ＬＮ：ＢＴ０９０、５μｍ １０００Ａ、４．６×３００ｍｍ）を使用して実施することができる。移動相は、例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ポロキサマー１８８、ｐＨ６．５とすることができ、流速は０．３５ｍＬ／分で２０分間、カラムは周囲温度とする。データ収集は、２ポイント／秒のサンプリングレートと１．２ｎｍの解像度で実施することができ、２１４、２６０、及び２８０ｎｍで２５ポイントの平均平滑化を行う。理想的な標的負荷は１．５Ｅ１１ＧＣであり得る。試料は、５０μＬで、理想的な標的の約１／３で、または５μＬで注入することができる。
動的光散乱（ＤＬＳ）は、試料量３０μＬのＣｏｒｎｉｎｇ３５４０ ３８４ウェルプレートを使用してＷｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏＩＩＩで実施することができる。反復ごとに１０秒間にそれぞれ１０回の取得結果を収集することができ、試料ごとに３回の反復測定を実施した。溶媒は、試料に使用する溶媒に応じて、例えば、ｄＰＢＳ中の構築物ＩＩの場合は「ＰＢＳ」、スクロース試料を含む修飾ｄＰＢＳ中の構築物ＩＩの場合は「４％スクロース」を設定することができる。データ品質基準（ベースライン、ＳＯＳ、ノイズ、適合）を満たさない結果を「マーク」して、分析から除外することができる。スクロース試料を含む修飾ｄＰＢＳの低遅延時間カットオフを１．４μｓから１０μｓに変更して、約１ｎｍでのスクロース賦形剤のピークが、人為的に低いキュムラント分析直径の結果をもたらすことに対して影響を及ぼすことを排除することができる。
低温示差走査熱量測定（低温ＤＳＣ）は、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＤＳＣ２５０を使用して実行することができる。約２０μＬの試料をＴｚｅｒｏ ｐａｎにロードし、Ｔｚｅｒｏ Ｈｅｒｍｅｔｉｃ ｌｉｄで圧着することができる。試料を２５℃で２分間平衡化し、次いで５℃／分で－６０℃に冷却し、２分間平衡化してから、次いで５℃／分で２５℃に加熱することができる。熱流データは、従来の様式で収集することができる。
様々な製剤緩衝液のｐＨを、－３０℃までのｐＨを検出可能なＩＮＬＡＢ ＣＯＯＬＰＲＯ－ＩＳＭ低温ｐＨプローブでモニタリングした。１ミリリットルの緩衝液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに入れ、次いでｐＨプローブを緩衝液に浸した。１枚のパラフィルムを使用して、ファルコンチューブとｐＨプローブの間のギャップを密閉し、汚染と蒸発を防いだ。ファルコンチューブと一緒にプローブを－２０ＡＤ冷凍庫に入れた。緩衝液のｐＨと温度を、約２０時間、またはｐＨ対温度の挙動が繰り返しパターンを達成するまで、２．５分ごとに記録した。自動霜取りプロセスによって引き起こされる温度変化は、緩衝液のｐＨ安定性のためのストレス条件を生成した。
浸透圧計は、凝固点降下の技術を使用して浸透圧を測定する。機器のキャリブレーションは、５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、８５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び２０００ｍＯｓｍ／ｋｇ ＮＩＳＴトレーサブル標準を使用して実施することができる。２９０ｍＯｓｍ／ｋｇの参照溶液を使用して、浸透圧計のシステム適合性を判定することができる。
密度は、Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ ＤＭＡ５００濃度計で、水を基準として測定することができる。試料間で、濃度計を、水、次いでメタノールで洗浄し、風乾することができる。
粘度は、当技術分野で公知の方法、例えば、２０１９年に公開された米国薬局方（ＵＳＰ）及びそれ以前のバージョン（その全体が参照により本明細書に援用される）で提供されている方法を使用して測定することができる。
Ｆｒａｎｃｏｉｓ，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１８）Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．２２３－２３６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを使用することができる。２０１８年１０月１５日に提出された仮出願６２／７４５８５９に記載されている相対感染力アッセイを使用することができる。
例示的な方法は、Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８（１７）：１２８１－９０に記載されている（その全体が参照により本明細書に援用される）。
６．３ ＣＬＮ２疾患の治療方法
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載のｒＡＡＶまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「後期乳児神経セロイドリポフスチン症２型（ＣＬＮ２）」または「ＣＬＮ２疾患」または「ＣＬＮ２バッテン疾患」は、同じ意味で使用され、ＴＰＰ１遺伝子の欠損によって引き起こされる疾患を指す。ＣＬＮ２疾患は、神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）として知られる障害の群の１つであり、総称してＣＬＮ２疾患と呼ばれる場合もある。
神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、進行性の知的能力及び運動能力の悪化、発作、及び早期死亡を特徴とする遺伝性の神経変性リソソーム蓄積症の一群である。視力喪失はほとんどの形態の特徴である。臨床表現型は、伝統的に、乳児期、乳児期遅発型、若年期、成人期、及び北部てんかん（精神遅滞を伴う進行性てんかん［ＥＰＭＲ］としても知られる）の臨床的特徴の発症年齢及び出現順序に従って特徴づけられている。しかしながら、そこには遺伝学的及び対立遺伝子的な異質性が存在し、原因遺伝子と発症年齢の両方を考慮に入れるために、新しい命名法及び分類システムが提唱され、開発されており、例えば、古典的乳児期遅発型ＣＬＮ２疾患である。最初の症状は通常、２歳～４歳の間に現れ、通常はてんかんから始まり、その後、発達段階の退行、ミオクローヌス性運動失調、及び錐体路徴候が続く。視覚障害は通常、４～６歳で現れ、急速に進行して明暗の認識のみとなる。平均余命は６歳～１０代前半までの範囲である。
特定の実施形態では、対象は、ＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の文書化された診断を受けている。診断は、生化学的、分子的、または遺伝的方法によって確認され得る。
本発明の特定の実施形態では、対象は神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）に罹患しており、本発明の成分、組成物及び方法は、それを治療するように設計される。
いくつかの実施形態では、ＣＬＮ２遺伝子の欠損によって引き起こされるＣＬＮ２疾患の治療方法は、本明細書に記載されるように、ＴＰＰ１をコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を、それを必要とする対象に送達することを含む。一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ（例えば、構築物ＩＩＩ）を用いてＣＬＮ２疾患を有する対象を治療する方法を提供する。また、本明細書では、本明細書に記載のｒＡＡＶを、それを必要とする対象に複数の経路を介して投与することを含む、ＣＬＮ２疾患の治療方法も提供する。特定の実施形態では、前記ｒＡＡＶを治療有効量で投与する。
本明細書で使用する場合、本明細書で使用する用語「対象」とは、ヒト、獣医動物または家畜、飼育動物またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳類動物を意味する。一実施形態では、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。さらに他の適切な対象には、限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類などが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「対象」は「患者」と同じ意味で使用される。特定の実施形態では、前記対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は、生後４か月～６歳である。
本明細書で使用する場合、用語「治療」または「治療すること」は、ＣＬＮ２疾患の１つ以上の症状を改善する目的で、本明細書に記載の１つ以上の化合物または組成物を対象に投与することを包含すると定義される。したがって、「治療」には、所与の対象における神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）の発症もしくは進行を軽減するか、疾患を予防するか、疾患症状の重篤度を軽減するか、または失明の進行を含むそれらの進行を遅延させるか、疾患症状を除去するか、疾患の発症を遅延させるか、または疾患の進行もしくは治療の有効性をモニタリングすることのうちの１つ以上が含まれ得る。
６．３．１ 用量及び投与経路
本明細書に記載の医薬組成物（例えば、６．２節に記載される）または本明細書に記載のｒＡＡＶ（例えば、６．１節に記載される）を、任意の適切な経路または異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象に投与してもよい。いくつかの実施形態では、脳への直接送達（場合により、髄腔内、槽内、ＩＣＶもしくはＩＴ－Ｌ注射を介した）、または全身経路、例えば、血管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の経口投与経路を介した送達を採用する。所望により、投与経路を組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、投与を定期的に繰り返す。
一実施形態では、本明細書に記載の治療方法は、髄腔内注射によってｒＡＡＶまたは組成物を送達することを含む。別の実施形態では、対象へのＩＣＶ注射を採用する。別の実施形態では、対象への腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）注射を採用する。一実施形態では、本方法は、槽内（ＩＣ）注射を介して組成物を送達すること（すなわち、大槽への画像誘導後頭下穿刺を介した髄腔内送達）を含む。本明細書で使用する場合、髄腔内という用語は、いくつかの実施形態では、槽内注射を指し得る。さらに別の方法では、血管内注射を採用してもよい。別の実施形態では、筋肉内注射を採用する。
本明細書中で使用する場合、用語「髄腔内送達」または「髄腔内投与」とは、薬物が脳脊髄液（ＣＳＦ）に到達するように、脊髄管、より具体的にはくも膜下腔内へ注射することによる薬物の投与経路を指す。髄腔内送達には、腰椎穿刺、脳室内（脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／またはＣ１－２穿刺が含まれ得る。例えば、くも膜下腔にわたって拡散させるために、腰椎穿刺によって物質を導入してもよい。別の例では、注射は大槽内であってもよい。
本明細書中で使用する場合、用語「槽内送達」または「槽内投与」とは、大槽小脳の脳脊髄液中に直接的に、より具体的には、後頭下穿刺を介するか、または大槽への直接注射によるか、または恒久的に配置されたチューブを介した、薬物の投与経路を指す。本明細書に記載の組成物を脳脊髄液に送達するのに有用な装置は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６１３３に記載されている。
一態様では、本明細書において、第１の経路及び第２の経路を介して、必要とする対象に本明細書に記載のｒＡＡＶまたは組成物を投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法を提供し、前記第１の経路及び前記第２の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、前記第１の経路は脳領域への経路であり、前記第２の経路は脊髄領域への経路であり、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは構築物ＩＩＩである。
特定の実施形態では、脳領域は、脳を覆う髄腔であってもよい。特定の実施形態では、脳領域は脳室であってもよい。特定の実施形態では、脳領域は大槽であってもよい。特定の実施形態では、脳領域への送達は、脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達であってもよい。
特定の実施形態では、脊髄領域は、脊髄周囲の髄腔であってもよい。特定の実施形態では、脊髄領域は脊柱管であってもよい。特定の実施形態では、脊髄領域はくも膜下腔であってもよい。特定の実施形態では、脊髄領域への送達は、脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達であってもよい。
特定の実施形態では、第１の経路は、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）である。他の実施形態では、第１の経路は、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外の脳領域への投与経路である。
特定の実施形態では、第２の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）である。他の実施形態では、第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）以外の脊髄領域への投与経路である。
特定の実施形態では、本方法は、第３の経路を介して対象にｒＡＡＶまたは組成物を投与することをさらに含み、第３の経路は、脳室内（ＩＣＶ）、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内、頭蓋内、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、第３の経路は、ｒＡＡＶを肝臓に送達する。特定の実施形態では、前記第３の経路は静脈内である。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、及び静脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、及び静脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
別の態様では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法を提供し、第１の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、第２の経路は、ｒＡＡＶをＣＮＳの外側に送達し、ｒＡＡＶは、ＡＡＶキャプシドとその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）、または大槽内（ＩＣ）である。特定の実施形態では、第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、第２の経路は静脈内である。
別の態様では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を、第１の経路及び第２の経路を介して、それを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法を提供し、第１の経路は、中枢神経系（ＣＮＳ）への経路であり、第２の経路は、ｒＡＡＶを肝臓に送達し、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物は、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは：（ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び（ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）、または大槽内（ＩＣ）である。他の実施形態では、第１の経路は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）、または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの投与経路である。特定の実施形態では、第２の経路は、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内からなる群から選択される。特定の実施形態では、第２の経路は静脈内である。他の実施形態では、第２の経路は、肝臓にｒＡＡＶを送達する、静脈内、血管内、動脈内、筋肉内、眼内、皮下、及び皮内以外の投与経路である。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を、ＣＮＳ及び静脈内経路に共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内及び静脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び静脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び静脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び静脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）、及び静脈内経路以外のＣＮＳへの経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、ＣＮＳへの経路及び血管内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内及び血管内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び血管内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び血管内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び血管内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの経路、及び血管内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、ＣＮＳへの経路及び動脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内経路及び動脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び動脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び動脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び動脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの経路、及び動脈内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、ＣＮＳへの経路及び筋肉内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内経路及び筋肉内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び筋肉内経路を介して共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び筋肉内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び筋肉内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの経路、及び筋肉内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、ＣＮＳへの経路及び眼内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内及び眼内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び眼内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び眼内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び眼内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの経路、及び眼内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、ＣＮＳへの経路及び皮下経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内経路及び皮下経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び皮下経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び皮下経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び皮下経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの経路、及び皮下経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。
特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、ＣＮＳへの経路及び皮内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、髄腔内及び皮内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）経路及び皮内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、脳室内（ＩＣＶ）経路及び皮内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、それを必要とする対象に、槽内（ＩＣ）経路及び皮内経路を介して、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を共投与することを含む。特定の実施形態では、対象におけるＣＬＮ２疾患の治療方法は、腰部髄腔内（ＩＴ－Ｌ）、脳室内（ＩＣＶ）、脳室内（ＩＣＶ）または槽内（ＩＣ）以外のＣＮＳへの経路、及び皮内経路を介して、それを必要とする対象に前記ｒＡＡＶを共投与することを含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を前記第１の経路で投与することと同時に、ｒＡＡＶまたは組成物を前記第２の経路で投与することを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を、前記第２の経路を介してｒＡＡＶまたは組成物を投与する前に、前記第１の経路を介して投与することを含み得る。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物を、前記第２の経路を介してｒＡＡＶまたは組成物を投与した後に、前記第１の経路を介して投与することを含み得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物の前記第１の経路を介した投与と、ｒＡＡＶまたは組成物の前記第２の経路を介した投与との間の間隔は、約０．５時間、１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１か月、約２か月、約３か月、約４か月、約５か月、約６か月、またはそれ以上であり得る。
特定の実施形態では、本明細書で提供するｒＡＡＶまたは組成物の前記第１の経路を介した投与と、ｒＡＡＶまたは組成物の前記第２の経路を介した投与との間の間隔は、０．５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、またはそれ以上であり得る。
対象に投与する本明細書に記載のｒＡＡＶのゲノムコピー（「ＧＣ」）の量は、対象の脳質量に基づいて決定してもよい。平均的な人間の脳の質量は、約１，３００ｇ～約１，４００ｇであることは当技術分野で公知である。また、本明細書の組成物は、約１０００ｇ～約１３００ｇの範囲の脳質量を有する子供に有用であると考えられる。対象の脳質量は、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって測定される対象の推定脳容積から導き出してもよい。
すべての用量は、例えば、参照により本明細書に援用されるＭ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１に記載されているｑＰＣＲまたはデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による測定を含む、任意の既知の方法によって測定してもよい。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、約１×１０９、約２×１０９、約３×１０９、約４×１０９、約５×１０９、約６×１０９、約７×１０９、約８×１０９、約９×１０９、約１×１０１０、約２×１０１０、約３×１０１０、約４×１０１０、約５×１０１０、約６×１０１０、約７×１０１０、約８×１０１０、約９×１０１０、約１×１０１１、約２×１０１１、約３×１０１１、約４×１０１１、約５×１０１１、約６×１０１１、約７×１０１１、約８×１０１１、約９×１０１１、約１×１０１２、約２×１０１２、約３×１０１２、約４×１０１２、約５×１０１２、約６×１０１２、約７×１０１２、約８×１０１２、約９×１０１２、約１×１０１３、約２×１０１３、約３×１０１３、約４×１０１３、約５×１０１３、約６×１０１３、約７×１０１３、約８×１０１３、約９×１０１３、約１×１０１４、約２×１０１４、約３×１０１４、約４×１０１４、約５×１０１４、約６×１０１４、約７×１０１４、約８×１０１４、約９×１０１４、または約１×１０１５ＧＣ／ｇ脳質量の本明細書に提供するｒＡＡＶを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、約１．２５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量または４．５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の本明細書に提供するｒＡＡＶを対象に投与することを含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、約１×１０９～約２×１０９、約２×１０９～約３×１０９、約３×１０９～約４×１０９、約４×１０９～約５×１０９、約５×１０９～約６×１０９、約６×１０９～約７×１０９、約７×１０９～約８×１０９、約８×１０９～約９×１０９、約９×１０９～約１×１０１０、約１×１０１０～約２×１０１０、約２×１０１０～約３×１０１０、約３×１０１０～約４×１０１０、約４×１０１０～約５×１０１０、約５×１０１０～約６×１０１０、約６×１０１０～約７×１０１０、約７×１０１０～約８×１０１０、約８×１０１０～約９×１０１０、約９×１０１０～約１×１０１１、約１×１０１１～約２×１０１１、約２×１０１１～約３×１０１１、約３×１０１１～約４×１０１１、約４×１０１１～約５×１０１１、約５×１０１１～約６×１０１１、約６×１０１１～約７×１０１１、約７×１０１１～約８×１０１１、約８×１０１１～約９×１０１１、約９×１０１１～約１×１０１２、約１×１０１２～約２×１０１２、約２×１０１２～約３×１０１２、約３×１０１２～約４×１０１２、約４×１０１２～約５×１０１２、約５×１０１２～約６×１０１２、約６×１０１２～約７×１０１２、約７×１０１２～約８×１０１２、約８×１０１２～約９×１０１２、約９×１０１２～約１×１０１３、約１×１０１３～約２×１０１３、約１２×１０１３～約３×１０１３、約３×１０１３～約４×１０１３、約４×１０１３～約５×１０１３、約５×１０１３～約６×１０１３、約６×１０１３～約７×１０１３、約７×１０１３～約８×１０１３、約８×１０１３～約９×１０１３、約９×１０１３～約１×１０１４、約１×１０１４～約２×１０１４、約２×１０１４～約３×１０１４、約３×１０１４～約４×１０１４、約４×１０１４～約５×１０１４、約５×１０１４～約６×１０１４、約６×１０１４～約７×１０１４、約７×１０１４～約８×１０１４、約８×１０１４～約９×１０１４、または約９×１０１４～約１×１０１５ＧＣ／ｇ脳質量の本明細書に提供するｒＡＡＶを対象に投与することを含む。
これらの用量及び濃度の送達に適した容量は、当業者が決定してもよい。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量を選択してもよく、大人にはより大容量を選択してもよい。一実施形態では、容量は約１０ｍＬ以下である。一般的には、新生児の場合、適切な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬであり、より高齢の乳児では、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬを選択してもよい。幼児には、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量を選択してもよい。小児には、最大約３０ｍＬの容量を選択してもよい。１３歳未満及び１０代では、最大約５０ｍＬの容量を選択してもよい。さらに他の実施形態では、患者に、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容量、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量を選択して、髄腔内投与を行ってもよい。さらに他の実施形態では、患者に、約５ｍＬ～約１５ｍＬの容量、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量を選択して、槽内投与を行ってもよい。他の適切な容量及び用量を決定してもよい。用量は、任意の副作用に対する治療効果のバランスを取るように調整し、そのような用量は、組換えベクターを使用する治療用途に応じて変化させてよい。
６．３．２ 有効性の評価方法
本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法の有効性は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、本節に記載の方法によって判定してもよい。本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法の有効性は、治療後の任意の時点、例えば、治療の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、約２４か月、約２７か月、約３０か月、約３３か月、約３６か月、約３９か月、約４２か月、約４５か月、約４８か月、約５１か月、約５４か月、約５７か月、約６０か月、約６３か月、約６６か月、約６９か月、または約７２か月後に判定してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法の有効性を、治療後に繰り返し、例えば、月１回、２か月ごと、３か月ごと、６か月ごと、年１回、２年ごと、３年ごと、４年ごと、５年ごと、１０年ごと、または５年ごとに評価する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法の有効性を、ＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＣＬＮ２ ＣＲＳ）を使用して評価する。個体の運動機能、言語、発作、及び視覚の経時的変化を評価するために、関連する２つのＣＬＮ２ ＣＲＳがＣＬＮ２疾患に特化して開発されている。オリジナルの１２段階Ｈａｍｂｕｒｇ評価尺度（Ｓｔｅｉｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ．２００２；１１２：３４７－５４）には４領域すべてが含まれており、この評価尺度の２０１８年の更新版（Ｗｙｒｗｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｂｏｒｎ Ｅｒｒｏｒｓ Ｍｅｔａｂ Ｓｃｒｅｅｎ ２０１８；６：１－７）では、運動及び言語の評価尺度表現を改訂し、０～６点の運動言語領域（ＣＬＮ２ ＣＲＳ Ｍ及びＬ）の組み合わせが形成された。各領域の最高スコアは３点であり、通常またはベースラインの能力に対応し、一方、スコア０はその領域において能力がないことを示す。これらの評価尺度は、Ｂｒｉｎｅｕｒａの臨床効果を評価するために使用される６段階の運動言語評価尺度など、臨床研究で以前に使用されている（Ｗｙｒｗｉｃｈ、２０１８）。ＣＬＮ２ ＣＲＳ運動言語及び運動領域は、個別に、及び／またはスコアを組み合わせて使用してもよい。
Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ－Ｍｏｔｏｒ（ＣＲＳ－ＭＸ）は、参加者の歩行能力の全範囲を評価するために設計されたパフォーマンス評価尺度である。オリジナルのＣＬＮ２ ＣＲＳ Ｍｏｔｏｒを拡張して、より広範囲の歩行機能レベルを捉えるように、精度を高め、能力を向上させている。新しい７段階評価尺度の範囲は０～６であり、０は自立した歩行がないことを示し、６は運動失調や病理学的転倒のない家庭及び地域環境での正常な歩行を示す。
Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ－Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＣＲＳ－ＬＸ）は、参加者の表現的言語の使用の全範囲を評価するために設計された、臨床医によって報告される項目である。ＣＬＮ２ ＣＲＳ Ｌａｎｇｕａｇｅを拡張して、より広範囲の言語レベルを捉えるように、精度を高め、能力を向上させている。諮問委員会の介護者報告書は、表現言語のピークレベルには不均一性が存在し、適切な対応の選択肢は年齢ごとの表現言語の期待値を参照すべきであることを支持した。さらに、ＣＬＮ２の子供たちは表現する言葉の数が徐々に減少するが、発声や身振りを使ってコミュニケーションを続ける。したがって、改正ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸには、発声／ジャーゴン及びジェスチャーを使用した応答オプションも含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域と言語領域の組み合わせによって測定した場合のベースライン（すなわち、治療前の値）と比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域と言語領域の組み合わせによって測定した場合のベースラインと比較して、１、２、３、４、５、または６カテゴリーの臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、治療の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、約２４か月、約２７か月、約３０か月、約３３か月、約３６か月、約３９か月、約４２か月、約４５か月、約４８か月、約５１か月、約５４か月、約５７か月、約６０か月、約６３か月、約６６か月、約６９か月、または約７２か月後に、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域と言語領域の組み合わせにおけるベースラインからの４つ未満、３つ未満、または２つ未満のカテゴリーの低下を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの言語領域によって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの言語領域によって測定した場合のベースラインと比較して、１、２、または３カテゴリーの臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、治療の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、約２４か月、約２７か月、約３０か月、約３３か月、約３６か月、約３９か月、約４２か月、約４５か月、約４８か月、約５１か月、約５４か月、約５７か月、約６０か月、約６３か月、約６６か月、約６９か月、または約７２か月後に、ＣＬＮ２ ＣＲＳの言語領域のベースラインからの２カテゴリー未満の低下を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域によって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域によって測定した場合のベースラインと比較して、１、２、または３カテゴリーの臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、治療の約３か月、約６か月、約９か月、約１２か月、約１５か月、約１８か月、約２１か月、約２４か月、約２７か月、約３０か月、約３３か月、約３６か月、約３９か月、約４２か月、約４５か月、約４８か月、約５１か月、約５４か月、約５７か月、約６０か月、約６３か月、約６６か月、約６９か月、または約７２か月後に、ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域のベースラインからの２カテゴリー未満の低下を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法の有効性を、対象における発作の頻度、持続時間及び／または種類を測定することによって評価してもよい。発作データは、例えば介護者発作日誌アプリを使用して、介護者によって電子日誌（ｅＤｉａｒｙ）で収集してもよい。観察された発作ごとに、発作の種類と発作が続いた時間の長さを記録してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、介護者の発作日記に記録されたベースラインと比較して、発作の頻度を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約３０％、４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、介護者の発作日誌に記録されたベースラインと比較して、発作の持続時間を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約３０％、４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ベースラインと比較して、抗てんかん治療の使用を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる。
いくつかの実施形態では、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（ＰｅｄｓＱＬ）Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅを使用して、本明細書に記載の治療方法の有効性を評価してもよい。ＰｅｄｓＱＬは、小児のＱＯＬ評価尺度である（Ｖａｒｎｉ ＪＷ． Ｓｃａｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｏｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（商標）ＰｅｄｓＱＬ（商標）．Ｌｙｏｎ， Ｆｒａｎｃｅ： Ｍａｐｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｕｓｔ；２０１７）。Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ ＳｃａｌｅのＰａｒｅｎｔ Ｐｒｏｘｙバージョンには、身体的、社会的、感情的、及び学校の機能が含まれる。ＰｅｄｓＱＬ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅは、２３項目のアンケートであり、生スコアの５段階評価尺度（０＝「まったく問題がない」～４＝「ほぼ常に問題がある」）でパフォーマンスを評価し、逆スコアリングして０～１００の評価尺度にマッピングし、スコアが高いほど健康関連のＱＯＬが優れていることを示す。Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅから導出されるスコアには、Ｔｏｔａｌ Ｓｃａｌｅ Ｓｃｏｒｅ、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃｏｒｅ、及びＰｓｙｃｈｏｓｏｃｉａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃｏｒｅが含まれる。
家族影響モジュール（ＦＩＭ）を使用して、身体的、感情的、社会的、及び認知機能、ならびにコミュニケーション、心配、日常的活動、及び家族関係の次元でスコアリングして、親及び家族に対する小児の慢性健康状態の影響を測定してもよい。介護者は、各カテゴリーを「まったく問題がない」（０）から「常に問題がある」（４）まで評価する。スコア計算ステップでは、これらのスコアを０～１００のスケールに変更する。０が最悪のスコア、１００が最高のスコアである。ＦＩＭから導出されるスコアには、合計スコア、Ｐａｒｅｎｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＨＲＱＬ）Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃｏｒｅ、Ｆａｍｉｌｙ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃｏｒｅが含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅによって測定した場合のベースラインと比較して、１、２、３、４、または５つのカテゴリーの臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＰｅｄｓＱＬ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｍｐａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅによって測定されたベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＰｅｄｓＱＬ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｍｐａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅによって測定した場合のベースラインと比較して、１、２、３、または４つのカテゴリーの臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法の有効性を、例えば、Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ Ｆｏｒｍ（ＶＡＢＳ－ＩＩＩ）及び／またはＭｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇ （ＭＳＥＬ）を使用して、適応、認知、運動、言語及び行動機能の神経発達パラメータを経時的に測定することによって評価してもよい。Ｔｈｅ ＶＡＢＳ ＩＩＩ（Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅｓ． ３ｒｄ ｅｄ． Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ：Ｐｅａｒｓｏｎ；２０１６）は、乳児期から９０歳までの個体の適応行動を評価する。これは、訓練を受けた臨床医及び介護者または参加者をよく知っている人物が行う。この評価尺度には、コミュニケーション、日常生活スキル、社交性、及び運動スキルの４つの領域が含まれ、これらは７歳未満の小児に適しているため、これらを評価する。各領域の項目は、個体が各適応スキル／行動を示す頻度に基づいて、２から０までスコアリングされ、２はほぼ常に示し、０はまったく示さないことに対応する。個々の項目を集計し、次いで、平均１００、標準偏差１５の、年齢が一致する標準的なベル曲線と比較される複合スコアとして計算する。各部分領域スコアからは、適応行動相当年齢スコア（ＡＢＡＥ）も生成される。平均ＡＢＡＥスコアは、運動部分領域を除くすべての部分領域相当年齢スコアを平均することによって計算することができる。
ＭＳＥＬ（＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｅａｒｓｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ．ｃｏｍ／ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／１０００００３０６／ｍｕｌｌｅｎ－ｓｃａｌｅｓ－ｏｆ－ｅａｒｌｙ－ｌｅａｒｎｉｎｇ．ｈｔｍｌ＞から入手可能）は、幼児の認知発達の評価尺度として一般的に使用される、標準化された臨床心理評価法である。ＭＳＥＬは、（ａ）粗大運動、（ｂ）微細運動、（ｃ）視覚受容（または非言語的問題解決）、（ｄ）受容言語、及び（ｅ）表現言語の５つの部分尺度に編成されている。各部分スケールは、標準スコア、パーセンタイル、及び相当年齢スコアを計算するために標準化されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅ ＩＩＩによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、Ｍｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、ＤＥＭ－ＣＨＩＬＤ：ＣＬＮ２ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙを、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法の有効性を評価するために使用してもよい。ＤＥＭ ＣＨＩＬＤアンケートは、ＣＬＮ２ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ及び／またはＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ－ｂａｓｅｄ ＱＯＬ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔを含み得る。ＣＬＮ２ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙには、参加者が経験するＭｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙの頻度と重症度に関する７つの質問が含まれており、タイプ（ミオクローヌス、ジストニア、測定障害、舞踏病、及びチック／常同症）ごとに分類されている。各質問は０から３で評価され、０は重症／一般的頻度がマークされ、３は重症なし／頻度なしである。ＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ－ｂａｓｅｄ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔは、「まったくない」（肯定的な結果）から「ほぼ常に」（否定的な結果）までの５つのカテゴリーの評価尺度で評価される２８の質問を含む。質問は、発作、摂食、睡眠、行動、及び日常活動の群に分類されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＤＥＭ－ＣＨＩＬＤ： ＣＬＮ２ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙを使用して測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法の有効性を、脳のＭＲＩを使用してＣＮＳの構造異常を測定すること、及び／またはＳＤ－ＯＣＴによって経時的に網膜の解剖学的構造の変化を測定することによって評価してもよい。脳のＭＲＩを使用して、脳全体の体積、灰白質の体積、白質の体積、ＣＳＦ体積、視神経路の視覚化のための拡散テンソル、及び脳全体の見かけの拡散係数を評価してもよい。ＭＲＩは、ガドリニウムを使用して実行される。腰部及び腰仙髄のＭＲＩを使用して、脊髄後柱の病変を評価してもよい。Ｆｌｅｘ Ｍｏｄｕｌｅを備えたＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＯＣＴ機器を使用したＳＤ－ＯＣＴを使用して、網膜の解剖学的構造を評価してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用して網膜の解剖学的構造を評価することによって決定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法の有効性を、臨床医の全体的な変化の印象（ＣＩ－ＧＩＣ）及び／または臨床医の重症度の全体的な印象（ＣＩ－ＧＩＳ）を使用して評価してもよい。Ｃｌ－ＧＩＳは、発作、認知機能、運動、会話、不随意運動／運動障害、視力、嚥下／摂食能力、ならびに疾患全般などのパラメータについて、参加者のＣＬＮ２疾患の重症度の経時変化を追跡するために臨床医が実施する８つの質問からなる手段である。Ｃｌ－ＧＩＳは、「なしまたは障害なし」（スコア１）から「重症または重度障害」（スコア５）までの５項目の評価尺度を有する。Ｃｌ－ＧＩＳの最後の質問はＣｌ－ＧＩＣである。Ｃｌ－ＧＩＣは、評価の間に参加者について、臨床医が観察した全体的な変化を評価する。５項目の評価尺度は、「かなり良い」（スコア１）から「かなり悪い」（スコア５）までの範囲である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＩ－ＧＩＳによって測定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＩ－ＧＩＣによって測定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＣＩ－ＧＩＣによって測定した場合のベースラインと比較して、１、２、３、４、または５カテゴリーの臨床効果を生じさせる。
別の態様では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法を、例えばＧＡＩＴＲｉｔｅを使用することによって、対象における歩行異常を測定することによって評価してもよい。ＧＡＩＴＲｉｔｅシステムは、圧力作動センサーの時間（タイミング）及び空間（２次元の幾何学的位置）パラメータを測定するために利用される電子式歩道である。ＧＡＩＴＲｉｔｅシステムは、対象の二足歩行能力を評価するための測定装置として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＬＮ２疾患の治療方法は、ＧＡＩＴＲｉｔｅによって測定されるベースラインと比較して、歩行パラメータを、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、向上させる。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の脊髄におけるＴＰＰ１活性を増加させ得る。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性を生じさせ得ることを含み、脊髄における参照ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の脊髄において、第２の対象の脊髄における参照ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性を生じさせ得ることを含み、脊髄における参照ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の肝臓ＴＰＰ１活性を増加させ得る。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、第２の対象における参照肝臓ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の肝臓ＴＰＰ１活性を生じさせ得ることを含み、参照肝臓ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、第２の対象における参照肝臓ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の肝臓ＴＰＰ１活性をもたらし得ることを含み、参照肝臓ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の血清ＴＰＰ１活性を増加させ得る。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、第２の対象における参照血清ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の血清ＴＰＰ１活性を生じさせ得ることを含み、参照血清ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、第２の対象における参照血清ＴＰＰ１活性ｍに比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高い前記対象の血清ＴＰＰ１活性を生じさせ得ることを含み、参照血清ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の皮質におけるミクログリア活性を低下させ得る。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、第２の対象における皮質における参照ミクログリア活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低い前記対象の皮質におけるミクログリア活性を生じさせ得ることを含み、皮質における参照ミクログリア活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、第２の対象における皮質における参照ミクログリア活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低い前記対象の皮質におけるミクログリア活性を生じさせ得ることを含み、皮質における参照ミクログリア活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。
特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の脳におけるＴＰＰ１活性を増加させ得る。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の脳において、第２の対象の脳における参照ＴＰＰ１活性に比べて、少なくとも２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性を生じさせ得、脳内の参照ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。特定の実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、前記対象の脳において、第２の対象の脳における参照ＴＰＰ１活性に比べて、２％、３％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１５％、１７％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％高いＴＰＰ１活性を生じさせ得、脳内の参照ＴＰＰ１活性は、前記第２の対象が前記方法を用いた治療を受けない場合に測定し、前記第２の対象は、前記対象と同じであるか、または異なる。
特定の実施形態では、本方法は、対象の脳脊髄液において、疾患に関連しない天然のＴＰＰ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多形体の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれとほぼ同等であるか、もしくは１００％超のＴＰＰ１活性を生じさせる。特定の実施形態では、本方法は、疾患に関連しない天然のＴＰＰ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多形体の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれとほぼ同等であるか、もしくは１００％超の、対象の血清ＴＰＰ１活性を生じさせる。
当業者は、本明細書に記載の組成物及び方法を研究するために、例えば、ＣＬＮ２疾患の治療方法における本明細書で提供されるｒＡＡＶを研究するために、本明細書に記載のアッセイ及び／または当技術分野で公知の技術（例えば、ＷＯ２０１８２０９２０５Ａ１に記載のアッセイ）を使用してもよい。
関連するアッセイには、以下が含まれ得るが、これらに限定されない：ＣＬＮ２疾患のＴＰＰ１ｍ１Ｊマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ研究、ＴＰＰ１ｍ１Ｊノックアウトマウスの自然史研究、ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスにおける薬理学研究、ＴＰＰ１酵素活性を測定するアッセイ、デジタル飼育室での非侵襲的フルタイムモニタリングを使用したマウスの脳室内有効性の評価、Ｃ５７ＢＬ／６ ＴＰＰ１ｍ１Ｊ ＫＯマウスにおけるＡＡＶ９ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＩＣＶ）を使用したＴＰＰ１置換の効果の測定、安全性薬学アッセイ、マウスでの毒性研究、及びカニクイザルでの薬力学研究、ベクターの生体内分布に関するアッセイ、ベクター脱落に関するアッセイ、反復投与研究、発がん性研究、及び他の毒性研究。
いくつかの実施形態では、疾患の進行を、小児患者へのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸの投与によって評価してもよい。いくつかの実施形態では、疾患の進行を、成人患者へのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸの投与によって評価してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書において、必要とする対象の中枢神経系に、脳質量１グラムあたり１．２５×１０１１または４．５×１０１１ゲノムコピーの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を中枢神経系（ＣＮＳ）へ投与することを含む、対象におけるＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の治療方法を提供し、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、
ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、
プロモーター、
ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び
ＡＡＶ ３’ＩＴＲ
を含み、本方法は、ベクターの投与中及び／または投与後の前記患者のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評価の変化またはその欠失をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評価において、ベースラインから＋１ポイント、＋２ポイント、＋３ポイント、＋４ポイント、＋５ポイント、または＋６ポイントの変化を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象におけるＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の進行を遅延させるか、または阻止し、これは、１か月以上、２か月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または２年以上の期間にわたって、対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評価の低下が遅延し、及び／または維持されることによって判定される。
いくつかの実施形態では、疾患の進行を、小児患者へのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの投与によって評価してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書において、ＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書において、それを必要とする対象の中枢神経系に、脳質量グラムあたり１．２５×１０１１または４．５×１０１１ゲノムコピーの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を中枢神経系（ＣＮＳ）へ投与するステップを含む、ＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の治療方法を提供し、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ＡＡＶキャプシド及びその中にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムは、
ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、
プロモーター、
ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び
ＡＡＶ ３’ＩＴＲ
を含み、本方法は、ベクターの投与中及び／または投与後の前記患者のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評価の変化またはその欠失をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評価において、ベースラインから＋１ポイント、＋２ポイント、＋３ポイント、＋４ポイント、＋５ポイント、または＋６ポイントの変化を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象におけるＣＬＮ２バッテン病に関連する眼症状の進行を遅延させ、または阻止し、これは、１か月以上、２か月以上、３か月以上、６か月以上、１年以上、または２年以上の期間にわたって、対象のＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ評価の低下が遅延し、及び／または維持されることによって判定される。
６．４ 併用療法
本明細書に記載の方法は、ＣＬＮ２疾患またはその症状を治療するための任意の他の療法と組み合わせることもできる。ＣＬＮ２疾患の管理は複雑である。患者は、症状の負荷が大きく、機能低下の速度が速いため、広範な集学的医療を必要とし、家族は広範な心理社会的サポートを必要とするが、この症状に対する管理ガイドラインは現在存在しない。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ＣＬＮ２ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６９（２０１７）１０２ｅ１１２を参照のこと。しかしながら、特定の実施形態では、標準治療は、脳室内セルリポナーゼα（ＢＭＮ１９０）を含み得る。参照により本明細書に援用されるＳｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｃｅｒｌｉｐｏｎａｓｅ ａｌｆａ（ＢＭＮ１９０）ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＣＬＮ ２ ｄｉｓｅａｓｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｈａｓｅ １／２ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｄｏｓｅ－ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｅａｓｅ，３９：Ｓ５１を参照のこと。推奨用量は、隔週で投与する３０～３００ｍｇのＩＣＶ注入である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＣＬＮ２疾患の治療方法は、対象に免疫療法を投与することをさらに含む。投与してもよい免疫療法の例として、コルチコステロイド、タクロリムス及びシロリムスが挙げられる。
７． 実施例
本節（すなわち、第５節）の実施例は、説明を目的として提供されており、本発明を限定することを意図するものではない。
７．１ 実施例１：安全性薬理学
７．１．１ 中枢神経系
（ａ）マウスにおける３か月の毒性試験
機能観察総合評価法（ＦＯＢ）による評価を１３週目に実施し、活動、姿勢、立ち上がり、行動、刺激への反応（接近、クリック、尻尾をつまむ、及びタッチ）、瞳孔反応、握力反応及び痛覚（痛覚［熱］刺激に対する反応潜時）の評価を含んでいた。これらのパラメータには影響はなく、唯一の注目すべき発見は、＞２．０×１０１１ＧＣ／動物の雄と８．５×１０１１ＧＣ／動物の雌のオープンフィールド内での立ち上がりの数の減少であった。他に所見がなかったため、これは構築物ＩＩＩに関連しているとは考えられなかった。
（ｂ）カニクイザルにおける４週間の薬力学試験：
カニクイザルにおける４週間の試験では、臨床観察に加えて、一般的な感覚及び運動機能、脳反射（瞳孔反射、眼輪筋反射及び角膜反射）ならびに脊髄反射（感覚反射、膝蓋反射、皮膚反射、固有反射、及び尾反射）を含む包括的な神経学的検査を４週目に実施した。これらのエンドポイントに対する構築物ＩＩＩ関連の影響はなく、試験中に行動異常や臨床徴候を示した動物はいなかった。
カニクイザルにおける４週間の調査毒性試験では、ＣＮＳ関連の影響は観察されなかった。
７．１．２ 呼吸器系
構築物ＩＩＩの投与後のＮＨＰでは呼吸変化は観察されなかった。マウス毒性試験（構築物ＩＩＩ．）のＦＯＢで評価した呼吸エンドポイント、または４週間もしくは１３週間後の肺の顕微鏡的変化には影響はなかった。
カニクイザルにおける４週間の試験では、４週目に実施した神経学的評価のエンドポイントとして含まれていた呼吸に対する影響は認められなかった。
７．１．３ 心血管系
４週間または１３週間の構築物ＩＩＩ処置後のマウス毒性試験では顕微鏡的変化はなかった。
カニクイザルにおける４週間の試験では、４週目に実施した神経学的評価のエンドポイントとして含まれた心拍数に対する影響は認められなかった。
７．２ 実施例２：カニクイザルにおける髄腔内投与による単回投与の薬力学試験
構築物ＩＩＩを用いたカニクイザルにおける４週間の薬力学試験及び毒性試験において、試料を脳（前頭皮質、後頭皮質、小脳、線条体、延髄、中脳及び視床の２つの４ｍｍの円形試料（１つは表層、もう１つは深層））、脊髄（頸部、胸部及び腰部の１ｃｍの切片）、ならびに肝臓から採取した。カニクイザルの群（雄１匹及び雌２匹／群）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物（１ｍＬ／動物）の用量で、大槽（ＣＭ）穿刺による髄腔内注射により構築物ＩＩＩを投与した。追加の動物群（雄１匹及び雌２匹）には、３．２×１０１２ＧＣ／動物を腰部髄腔内穿刺（ＩＴ－Ｌ、１ｍＬ／動物）により投与した。試験終了時、２９日目に動物を安楽死させた。全体として、大槽またはＩＴ－Ｌ投与により構築物ＩＩＩを投与した動物から採取したほぼすべての脳領域、三叉神経節、肝臓、坐骨神経及び脊髄組織において、ベクターＤＮＡレベルが定量下限を上回っていた。生体内分布の結果を図６、図７及び表２にまとめる。
７．３ 実施例３：カニクイザルにおける単回用量の髄腔内（ＩＴ）薬物動態学／薬力学試験
構築物ＩＩＩを用いたカニクイザルにおける４週間の薬力学試験及び毒性試験において、試料を脳（前頭皮質、後頭皮質、小脳、線条体、延髄、中脳及び視床の２つの４ｍｍの円形試料（１つは表層、もう１つは深層））、脊髄（頸部、胸部及び腰部の１ｃｍの切片）、ならびに関連する神経根及び神経節（ＤＲＧ）、眼（左）、心臓（左心室）、腎臓（左）、肝臓（左側葉）、肺（左側尾部）、近位坐骨神経、リンパ節（鼠径部、下顎部、腸間膜）、卵巣（左側）または精巣から採取した。眼組織をさらに網膜／脈絡膜と強膜に解剖した。カニクイザルの群（雄２匹、雌２匹／用量）に、１回の大槽穿刺（ＣＭ）を介して、０、３．１×１０１３または１．１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で構築物ＩＩＩ（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）を投与した。３．１×１０１３ＧＣ／動物で、３つの異なる方法を使用して構築物ＩＩＩを調製した。追加の動物群（ｎ＝２／性別／群）に、ヌルベクターを含むＡＡＶ９を、単回ＣＭ投与により２．８９×１０１３ＧＣ／動物の用量で投与した。試験終了時、３０日目に動物を安楽死させた。全体として、構築物ＩＩＩまたはヌルベクターを投与した動物から３０日目に採取したほぼすべての脳領域、脊髄及びＤＲＧ組織、近位坐骨神経、ならびに他の末梢組織において、ベクターＤＮＡレベルが定量下限を上回っていた。生体内分布の結果を図６、図７、及び表２に示す。
カニクイザルの群（ｎ＝３／群またはｎ＝４／群）に、３．４×１０１１、３．２×１０１２、２．９×１０１３ＧＣ／動物または１．１×１０１４ＧＣ／動物の用量で大槽（ＣＭ）への注射を介して構築物ＩＩＩ（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）を投与した。剖検では、前頭皮質、線条体、視床、中脳、後頭皮質、延髄及び小脳の深層（＞３ｍｍ、Ｄ）または表層（＜３ｍｍ、Ｓ）領域から、ｑＰＣＲ による分析のために２つの組織パンチを採取した。平均値と標準偏差を示す。ＢＬＱ値は、平均値の計算において５０．０コピー／μｇ ＤＮＡとして処理した。
カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、大槽（ＣＭ）への注射を介して、または腰部ＩＴ（ＩＴ－Ｌ）を介して、３．２×１０１２ＧＣ／動物の用量で構築物ＩＩＩ（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）を投与した。剖検では、前頭皮質、線条体、視床、中脳、後頭皮質、延髄及び小脳の深層（＞３ｍｍ、Ｄ）または表層（＜３ｍｍ、Ｓ）領域から、ｑＰＣＲによる分析のために２つの組織パンチを採取した。平均値と標準偏差を示す。ＢＬＱ値は、平均値の計算において５０．０コピー／μｇ ＤＮＡとして処理した。
Figure 2024505257000003
７．４ 実施例４：ＴＰＰ１ｍ１Ｊ ＫＯマウスにおける単回投与薬理試験
本試験の目的は、単回ＩＣＶ投与後のＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスにおける構築物ＩＩＩの薬理学（臨床徴候、神経病理及び生存率）を評価することであった。試験の最後に、生き残った動物で脊髄の追加の解剖学的病理学的評価を実施した。ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの群（９～１０／性別／群、４～５週齢）に、０（ビヒクル）、１．２５×１０１０、５．０×１０１０、２．０×１０１１、及び８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量で構築物ＩＩＩの単回ＩＣＶ注射（５μＬ）を投与した。割り当て前及び試験の終了時に、動物の遺伝子型を同定した。
本試験で評価したエンドポイントには、死亡率、臨床所見、体重、神経行動観察（投与前、８週目、及び１６週目）、ＴＰＰ１活性、抗ＴＰＰ１抗体分析、肉眼的剖検所見、臓器重量、及び神経病理が含まれていた。
本質的に、神経行動に対する構築物ＩＩＩの明らかな効果は観察されなかった。なぜなら、用量反応が観察されなかったか、または対照ノックアウト動物が後の時点で評価できるほど生存しなかったためである。本試験では、生存のための最小有効用量（８．５×１０１１ＧＣ／動物）で５２週まで、生存マウスにおける構築物ＩＩＩ関連の有害な所見はなかった。１．２５×１０１０及び５．０×１０１０ＧＣ／動物の用量は、未処置のＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスと比較した場合に、ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの生存率を増加させるようには思われなかった。２．０×１０１１ＧＣ／動物では、サプライヤーの間違いにより、試験終了時に遺伝子型決定した際、雄の４／５と雌の２／５がＴＰＰ１遺伝子に関してヘテロ接合性であったため、構築物ＩＩＩが生存率を延長したかどうかを判定することはできなかった。この用量では、確認された雄ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウス１匹が試験終了まで生存した。８．５×１０１１ＧＣ／動物で構築物ＩＩＩを投与したすべての動物において、５２週間の予定された剖検まで、雄及び雌の両方で生存率は１００％であった。
どの動物においても９週目では肉眼的所見はなかった。５２週目に、肝臓上の腫瘤が２×１０１１ＧＣ／動物（雄の１／５、ヘテロ接合体）及び８．５×１０１１ＧＣ／動物（ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスにおいて雄の３／５及び雌の１／５）で観察された。肝臓では、肝細胞腺腫（８．５×１０１１ＧＣ／動物において雄の１／５及び雌の１／５、ならびに２×１０１１ＧＣ／動物において雄の１／５）、肝細胞壊死（８．５×１０１１ＧＣ／動物において雄の３／５、ならびに２×１０１１ＧＣ／動物において雄の１／５）、肝細胞過形成（８．５×１０１１ＧＣ／動物において雄の４／５、ならびに２×１０１１ＧＣ／動物において雌の１／２）、ならびに肝細胞空胞化の重症度の増加が観察された。５２週間のコホートでは、構築物ＩＩＩの投与後、後根神経節と脊髄神経根に顕微鏡的な変化が観察された。後根神経節では、５．０×１０１０ＧＣ／動物以上のマウスで神経空胞化（最小～顕著）が認められ、２．０×１０１１ＧＣ／動物以上のマウスで細胞充実性の増加（グリア細胞様、最小～中等度）及び軸索ジストロフィー／軸索腫大（最小～軽度）が認められた。５．０×１０１０ＧＣ／動物以上のマウスで、脊髄根の変性（軽度～中等度）及び軸索ジストロフィー／軸索腫大（最小～軽度）が認められた。５２週間の剖検まで生存したビヒクル対照ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスがいなかったため、構築物ＩＩＩを投与しなかったＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの肝臓を評価することはできず、したがって、構築物ＩＩＩ関連病変と表現型関連病変を区別することはできなかった。
７．５ 実施例５：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおける３か月の毒性試験
本試験の目的は、単回ＩＣＶ投与後のＣ５７Ｂ１／６マウスにおける構築物ＩＩＩの薬力学及び免疫原性を評価することであった。マウスの群（ｎ＝３０／性別／群）に、０（ビヒクル）、１．２５×１０１０、５．０×１０１０、２．０×１０１１、及び８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量で構築物ＩＩＩの単回ＩＣＶ注射（５μＬ）を投与した。投与後４週間（１０／性別／群）または１３週間（１０／性別／群）後に、動物を安楽死させた。追加のサテライト動物群（ｎ＝５／性別／群）を各時点で安楽死させ、脳及び肝臓内の導入遺伝子産物（ＴＰＰ１活性）を評価した。正確な投与装置を使用した適合性試験では、低用量で一定程度のベクター損失が示されたため、投与用量は、１．２５×１０１０、５．０×１０１０、２．０×１０１１、及び８．５×１０１１ＧＣ／動物について、それぞれ、０．９×１０９（回収率７０％）、３．９×１０１０（回収率７７％）、１．８×１０１１ＧＣ／動物（回収率９０％）及び８．５×１０１１ＧＣ／動物（回収率１００％）であった。
エンドポイントには、ＴＰＰ１酵素活性（血清、脳及び肝臓）ならびに血清抗ＴＰＰ１抗体（ＡＴＰＡ）が含まれた。
マウスへの構築物ＩＩＩの投与は、雄及び雌において脳ＴＰＰ１活性の用量依存的増加をもたらし、性別に関連した差異はなく、両性とも４週目と１３週目との間に差異はなかった。肝臓のＴＰＰ１活性は、雄と雌で４週目と１３週目の両方で増加した。雄では、４週目と１３週目の間に差異はなく、しかしながら、雌では、肝臓のＴＰＰ１活性は、４週目よりも１３週目の方が一貫して低かった。最高用量の８．５×１０１１ＧＣ／動物では、肝臓のＴＰＰ１活性は、１３週目において、脳のＴＰＰ１よりも１８倍（雄）及び４倍（雌）高かった。血清ＴＰＰ１活性の用量依存的な増加が雄と雌で観察され、しかしながら、値は非常にばらつきがあった。１３週目では、血清ＴＰＰ１活性は一般に、すべての用量群にわたって雌より雄の方が高く、８．５×１０１１ＧＣ／動物では雄と雌の間でおよそ９．５倍増加した。１３週目の血清ＴＰＰ１活性は、４週目に比べて、雄では減少し、雌では増加していた。構築物ＩＩＩで処置した動物の大部分は、４週目と１３週目にＡＴＰＡ陽性であった。高用量（８．５×１０１１ＧＣ／動物）と比較した場合、低用量（１．２５×１０１０ＧＣ／動物）において最も高いＡＴＰＡ反応が観察された。低用量と高用量との差異は、高濃度の導入遺伝子産物によるアッセイの干渉に起因し得るか、または免疫寛容の誘導を反映している可能性があるため、その重要性は不明である。
７．６ 実施例６：カニクイザルにおける髄腔内投与による単回投与の薬力学試験
本試験の目的は、カニクイザルにおける大槽穿刺または腰部髄腔内穿刺による髄腔内注射後の４週間後の構築物ＩＩＩの薬力学を評価することであった。
カニクイザルの群（雄１匹及び雌２匹／群）に、０、３．４×１０１１、３．２×１０１２または２．９×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／動物（１ｍＬ／動物）の用量で、大槽穿刺（ＣＭ）による髄腔内注射により構築物ＩＩＩを投与した。さらなる動物群（雄１匹及び雌２匹）に、腰部髄腔内穿刺により３．２×１０１２ＧＣ／動物を投与した（ＩＴ－Ｌ、１ｍＬ／動物）。試験の終了時、２９日目に動物を安楽死させた。投与前、すべての動物は、抗ＡＡＶ９中和抗体（ＮＡｂ）の存在について陰性であった。
４日目、１５日目、及び２９日目にビヒクル対照品、２．９×１０１３ＧＣ／動物、または３．２×１０１２ＧＣ／動物を投与した動物から回収した血清及びＣＳＦ試料を、ＱｕａｎｔｅｒｉｘにおいてＬｕｍｉｎｅｘ技術及びＳｉｍｏａ技術を使用して、炎症マーカー及び神経変性マーカーについて分析した。バイオマーカーとしては、アミロイドβアイソフォーム４０（Ａβ４０）、Ａβ４２、タンパク質脱グリカーゼＤＪ－１、線維芽細胞増殖因子２、グリア細胞由来神経栄養因子、グリア線維性酸性タンパク質、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンγ、インターロイキン（ＩＬ）１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１受容体アゴニスト、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２５、ＩＬ－１８、ＩＬ、２１－ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、インターフェロンγ誘導タンパク質１０、単球走化性タンパク質１、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）１α、ＭＩＰ－１β、ＭＩＰ－３α、ニューロフィラメント軽鎖、ニューロン特異的エノラーゼ、ケモカインリガンド５（正常なＴ細胞の発現及び分泌の活性化において調節される）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ、可溶性ＣＤ４０（表面抗原分類４０）リガンド、可溶性Ｆａｓリガンド、終末糖化産物の可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子α、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素Ｌ１、及び血管内皮増殖因子が挙げられる。
治療に関連した臨床徴候、体重への影響、または身体的もしくは神経学的検査は、試験中に観察されなかった。
投与前、すべての動物は抗ＡＡＶ９中和抗体の存在に関して陰性であった。２９日目に、１２個の試料で抗ＡＡＶ９中和抗体（Ｎａｂ）の存在が陽性であった。２９日目における陽性の動物の発生率は、０ＧＣ／動物では０／３匹の動物、３．４×１０１１ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、及び３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）では３／３匹の動物であった。
１５匹中６匹（４０％）は、投与前の血清試料の時点で、抗導入遺伝子産物（ＴＰＰ１）抗体（ＡＴＰＡ）応答について陽性であるとみなされた。２９日目において、ＡＴＰＡ陽性動物の発生率は、０ＧＣ／動物（ＣＭ）では１／３匹の動物、３．４×１０１１ＧＣ／動物（ＣＭ）では２／３匹の動物、３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、及び３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）では２／３匹の動物であった。
対照動物と比較した場合、ＣＳＦ及び血清において、ＴＰＰ１活性及び濃度の用量関連増加が２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）で観察され、ピークレベルは１５日目に認められた。その後、試験終了に向かってＴＰＰ１は減少する傾向にあった。３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）の血清では、ＴＰＰ１活性及び濃度の最小限の増加が認められた。３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）以上の用量では、対照群と比較して、脊髄（頸部、胸部及び腰部）と肝臓でＴＰＰ１活性及び濃度の増加が認められた。ＴＰＰ１活性は、脊髄の異なる領域間で差異を示さなかった一方で、ＴＰＰ１濃度は、脊髄の頸部領域または胸部領域と比較して腰部領域で高かった。２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）では、ＴＰＰ１活性及び濃度は、深層脳領域と表層脳領域の両方で増加していた。３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）では、１匹の動物のみについて、対照平均値と比較した場合に、ほとんどの脳深層領域で小さな上昇の傾向が観察された。３．４×１０１１ＧＣ／動物（ＣＭ）では、ＴＰＰ１活性及び濃度は、脊髄（頸部、胸部及び腰部）と肝臓のみで増加していた。
３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）では、血清またはＣＳＦのＴＰＰ１活性に明確な差異はなかったが、試験期間にわたって対照群と比較した場合、時折ＴＰＰ１濃度の増加が観察された。一部の脳領域ではＴＰＰ１の活性と濃度が最小限に増加する傾向が観察されたものの、これは最小限であり、１匹または２匹の動物でのわずかな増加に起因するものであった。増加は最小限かつすべての動物で観察されたわけではなかったため、これらの変化と治療との関係は不明である。ＴＰＰ１活性及び濃度は、脊髄（頸部、胸部及び腰部）と肝臓で増加していた。一般に、ＴＰＰ１活性及び濃度の両方は、同じ用量のＩＴ－ＣＭ群と比較した場合、ＩＴ－Ｌ処置動物の脊髄、特に頸部領域及び腰部領域においてより高かった。脊髄の頸部領域における増加は、この群の動物が投与直後にトレンデレンブルグ体位に置かれたことに関連している可能性がある。
１５匹中６匹の動物が、投与前の血清試料の時点でＡＴＰＡ応答について陽性であるとみなされた。２９日目において、ＡＴＰＡ陽性動物の発生率は、０ＧＣ／動物（ＣＭ）では１／３匹の動物、３．４×１０１１ＧＣ／動物（ＣＭ）では２／３匹の動物、３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、２．９×１０１３ＧＣ／動物（ＣＭ）では３／３匹の動物、及び３．２×１０１２ＧＣ／動物（ＩＴ－Ｌ）では２／３匹の動物であった。
２９日目において、構築物ＩＩＩで処置したすべての動物は、血清抗ＡＡＶ９ ＮＡｂｓ抗体の存在について陽性であった。大槽またはＩＴ－Ｌ投与により構築物ＩＩＩを投与した動物から採取したほとんどの脳領域、三叉神経節、肝臓、坐骨神経及び脊髄組織において、ベクターＤＮＡレベルは定量下限を上回っていた。
７．７ 実施例７：ヒト対象を治療し、構築物ＩＩＩを用いた治療の有効性を評価するためのプロトコール
本実施例は、構築物ＩＩＩ治療の有効性の評価を可能にするヒト対象の治療のための例示的なプロトコールを提供する。構築物ＩＩＩは、約または少なくとも約１．２５×１０１１及び４．５×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ｇ脳質量の用量で投与してもよい。投与する総用量（総ＧＣ）は、脳の大きさの差異を考慮して調整する。投与する製品の総量は、ＣＳＦ総量の１０％を超えない（乳児の脳ではおよそ５０ｍＬ、およそ１３００ｇの成人の脳ではおよそ１５０ｍＬと推定される）。
発達中の小児の早期に起こる比較的急速な脳の成長のため、ＩＣまたはＩＣＶで投与する構築物ＩＩＩの総用量は、試験参加者のスクリーニング脳ＭＲＩから得られる推定脳質量に依存する。試験参加者のＭＲＩから推定される脳容積を脳質量に変換し、投与する最適な用量の計算に使用する。
７．７．１ 患者集団
本実施例に記載の方法に従って治療された患者は、生化学的、分子的、または遺伝的方法によって確認された、ＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の文書化された診断を受けている。患者は、初日の時点で生後４か月以上６歳以下の男児または女児であってもよい。患者が１８か月齢を超えている場合、患者のスクリーニングＣＬＮ２ ＣＲＳスコアは少なくとも３である（６段階の言語及び運動領域の組み合わせを使用）。
患者が酵素補充療法（ＥＲＴ、セルリポナーゼα、ＢＲＩＮＥＵＲＡ）を受けている場合、介護者または法的保護者は、構築物ＩＩＩ投与の少なくとも７日前にＥＲＴを中止する意思がある。
造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けた患者は、これが安全であるとみなされる場合には治療を受けてもよい。
患者は、ＩＣまたはＩＣＶ注射に対する禁忌（例えば、ＭＲＩに基づくＩＣもしくはＩＣＶ注射に対する禁忌、全身麻酔に対する禁忌、またはＭＲＩ（もしくはガドリニウム）に対する禁忌）を有する場合、本実施例に記載の方法に従って治療されるべきではない。測定されたクレアチニンを使用した推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）が３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満である患者は、本明細書に記載の方法に従って治療されるべきではない。
タクロリムス、シロリムス、もしくはプレドニゾロンに対する過敏症反応の病歴、あるいは原発性免疫不全症（例えば、分類不能型免疫不全症候群）、脾摘出術、もしくは参加者を感染症に罹患しやすくする何らかの基礎疾患の病歴を有する患者は、本明細書に記載の方法に従って治療されるべきではない。患者の絶対好中球数は、１×１０３／μＬ以上であるべきである。
７．７．２ 目的及びエンドポイント
有効性に関する主要エンドポイントは、１２、１８、及び２４か月後のＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ（ＣＲＳ）の６段階の運動領域と言語領域の組み合わせにおいて、回復していない（持続した）２カテゴリーの低下を有していない参加者の割合である。他の有効性エンドポイントには以下のものが含まれる：
・１２、１８、及び２４か月でのＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域と言語領域の組み合わせにおけるベースラインからの変化
・１２、１８、及び２４か月でのＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域におけるベースラインからの変化
・１２、１８、及び２４か月でのＣＬＮ２ ＣＲＳの言語領域におけるベースラインからの変化
・１２、１８、及び２４か月でのＣＬＮ２ ＣＲＳ ＭＸにおけるベースラインからの変化
・１２、１８、及び２４か月でのＣＬＮ２ ＣＲＳ ＬＸにおけるベースラインからの変化
・１２、１８、及び２４か月での介護者の発作日誌に記録された発作の頻度、持続時間、及び種類におけるベースラインからの変化
・ＣＬＮ２ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙの１２か月、１８か月、及び２４か月におけるベースラインからの変化
・１２、１８、及び２４か月でのＰｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ（ＰｅｄｓＱＬ）Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅにおけるベースラインからの変化
認知機能、日常生活活動、適応行動、発作活動、脳画像化、網膜解剖学、社会的機能及び生活の質に対する構築物ＩＩＩの効果を評価するためのエンドポイントには、以下が含まれる：
・長期にわたる抗てんかん治療の使用
・以下を含む、適応、認知、運動、言語及び行動機能の神経発達パラメータにおける経時的変化：
・Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＶＡＢＳ－ＩＩＩ）
・Ｍｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅｓ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇ（ＭＳＥＬ）
・脳のＭＲＩによって評価されるＣＮＳ構造異常
・Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙによる網膜の解剖学的構造の変化（経時的ＳＤ－ＯＣＴ）
・ＱＯＬ測定値の経時的変化：
・ＣＬＮ２疾患に基づくＱＯＬ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ
・Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｍｐａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅ（ＰｅｄｓＱＬ－ＦＩＭ）
・Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ（Ｃｌ－ＧＩＳ）の経時的変化
・Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅ（Ｃｌ－ＧＩＣ）の経時的変化
・ＧＡＩＴＲｉｔｅで捕捉された歩行パラメータの変化
薬力学的エンドポイントには、ＣＳＦ及び血清中のアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ９）及びＴＰＰ１に対する抗体、ならびにＣＳＦ及び血清中のＴＰＰ１発現が含まれる。
７．７．３ 免疫抑制療法。
ベクター及びトランスジェニックＴＰＰ１の免疫原性の可能性を考慮すると、免疫抑制が実施されるであろう。投与され得る免疫抑制療法として、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）、タクロリムス、及びシロリムスが挙げられる。
（ａ）コルチコステロイド
試験介入投与（最大５００ｍｇ）前の１日目に、メチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを少なくとも３０分間かけて１回静脈内投与する。アセトアミノフェンと抗ヒスタミン薬による前投薬は任意選択であり、治験責任医師の裁量に任される。
経口プレドニゾロンを、２日目に毎日０．５ｍｇ／ｋｇで開始し、徐々に漸減し、１２週目までに中止する：
・２日目から２週目の終わりまで０．５ｍｇ／ｋｇ／日
・３週目から４週目まで０．３５ｍｇ／ｋｇ／日
・５週目から８週目まで０．２ｍｇ／ｋｇ／日
・９週目から１２週目まで０．１ｍｇ／ｋｇ／日。
（ｂ）タクロリムス
０．０５ｍｇ／ｋｇを経口（ＰＯ）により、１日２回（ＢＩＤ）、２日目から３２週目まで、目標血中濃度は２～４ｎｇ／ｍＬである。２４週目から３２週目までの８週間にわたって漸減する。
・２４週目：用量をおよそ５０％減らす
・２８週目：用量をおよそ５０％減らす
・３２週目：タクロリムスの中止
（ｃ）シロリムス
－２日目において４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２の負荷用量×３回投与。－１日目～４８週目：シロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日を１～３ｎｇ／ｍＬの目標血中濃度にてＢＩＤで分割投与。４８週目：シロリムスの中止
シロリムス及びタクロリムスの用量は、血中濃度を目標範囲に維持するように調整する。タクロリムスとシロリムスの用量調整は、臨床薬剤師によって行われる。参加者は、新しい維持用量を少なくとも７～１４日間継続し、その後、濃度モニタリングによるさらなる用量調整を行う。
（ｄ）その他
免疫抑制のリスクを軽減するために、以下の治療も参加者に施す：
・Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎予防：５ｍｇ／ｋｇのトリメトプリム／スルファメトキサゾールを週３回、－２日目から４８週目まで投与する。トリメトプリム／スルファメトキサゾールの代替薬には、ペンタミジン、ダプソン、及びアトバクオンが含まれる。
・好中球の絶対数が５００μＬ未満の場合、抗真菌薬による予防。
７．８ 実施例８：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ Ｍｏｔｏｒ（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ）は歩行機能の評価を向上させる。
後期乳児性神経セロイドリポフスチン症２（ＣＬＮ２）疾患において、疾患の急速な進行は当初、Ｈａｍｂｕｒｇ ＣＬＮ２評価尺度を使用して定量化した。その後、Ｈａｍｂｕｒｇ運動領域を、ＣＬＮ２ ＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ Ｍｏｔｏｒ（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｍ）に適応させ、自然疾患経過における運動機能の損失をセルリポナーゼα脳室内酵素補充療法（ＥＲＴ）の治療反応と比較して定量化するために使用した。ＣＬＮ２疾患障害には、運動失調、低張、高張、及び衰弱が含まれる。しかしながら、小児では疾患の進行が遅いため、ＥＲＴの表現型の進展はあまり認識されない。
本試験の目的は、ＣＬＮ２疾患障害が歩行能力に及ぼす影響を評価するために、ＣＬＮ２－ＣＲＳ－ＭＸと呼ばれる、より広範囲かつより詳細な測定を提供することであった。
７．８．１ 方法
項目の導出は、目的の主要なＣＬＮ２疾患概念の同定に基づいていた。
重要な概念は、的を絞った文献レビュー、臨床専門医インタビュー、２つの実質的な介護者フォーカスグループ、及び６人のＣＬＮ２臨床専門医との１年間の継続中の隔週会議から特定された。
臨床医インタビュー及び介護者フォーカスグループは、特に運動機能に関連するＣＬＮ２の主要な症状と影響、ＥＲＴ治療を受けた患者とＥＲＴ未治療の患者における疾患進行の差異、及びＣＬＮ２ ＣＲＳにおける運動機能評価の精度を改善して、それを臨床試験での治療効果を評価するためにさらに有用なものにする方法について議論した。
反復的な開発プロセスには、パイロットアプリケーションと多数の項目改訂が含まれていた。追跡マトリックスを使用して、すべての尺度の反復と変更の根拠を文書化した。
評価者間の信頼性、すなわち臨床医間の一致レベルは、４人の評価者にわたる一致率として計算した。
評価は、主治医が実施し、採点し、さらにオブザーバー臨床医によっても独立して採点した。
各評価をビデオに録画し、追加の２人の臨床医によって独立して採点した。
生後２０か月～１６歳（平均７．８歳）の３０人の患者を、それぞれ４人の臨床医がＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評価尺度で採点した。現時点で患者全員がＥＲＴを受けていた。
７．８．２ 結果
本試験は、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸ評価尺度の詳細な管理、スコアリング、及びトレーニングマニュアルを開発した。
本試験は、症状の進行を判定するための一般的な歩行課題を開発した。一般に、臨床医や介護者は、歩行に悪影響を与える症状の顕著な進行によってＣＬＮ２疾患を特徴づけた。体幹の緊張低下、四肢の緊張亢進及び運動失調は、運動機能に影響を与える症状として一般的に報告される。症状が悪化するにつれて、患者がもはや歩くことができなくなるまで、バランスを取るために片手、両手、または胴体を保持するなどの介助の必要性が増加すると報告されている。本試験では、臨床医は、オリジナルのＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｍにおける１０ステップの歩行課題を、歩行距離を延長し、安全に停止する能力を考慮し、方向転換を等級付けし、歩行に必要な介助のレベルを測定する歩行課題に拡張することをサポートした。
表３は、評価基準の概要と、元のＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｍとの比較を示す。図８は、運動性評価を測定するためのＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸスコアリングフローチャートの概要を示す。
Figure 2024505257000004
評価者間の一致において、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸに関する臨床医間の一致レベルは、完全／完璧な一致を示す１．０であった（Ｌａｎｄｉｓ，ＪＲ，Ｋｏｃｈ，ＧＧ． Ａｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｋａｐｐａ－ｔｙｐｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｊｏｒｉｔｙ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｂｓｅｒｖｅｒｓ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９７７。一致レベルの範囲は０．８１～０．９９である）。
７．８．３ 結論
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸは、歩行能力に対するＣＬＮ２疾患の影響の測定において、より高い精度を提供し、項目の関連性を向上させ、応答オプションの数を増加させた。
この評価尺度は、ＣＬＮ２を有する小児のために設計されたが、同様の疾患障害を示す他の神経筋障害または神経変性障害にも関連し得る。
７．９ 実施例９：拡張ＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸ）は言語機能の評価を向上させる
ＥＲＴでの治療応答と比較した自然なＣＬＮ２疾患経過における言語機能の喪失を、ＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｌ）を使用して定量化した。しかしながら、ＥＲＴ治療における小児の疾患の進行と表現型の進展は遅く、認識されにくい。本試験の目的は、表現言語と非言語コミュニケーション能力の変化を捉えるために、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸと呼ばれる、より広範で詳細な測定を提供することであった。
７．９．１ 方法
項目の導出は、目的の主要なＣＬＮ２疾患概念の特定に基づいた。
主要なＣＬＮ２疾患概念は、対象を絞った文献レビュー［資料には明記されていない］、臨床専門医インタビュー、２つの実質的な介護者フォーカスグループ、及び６人のＣＬＮ２臨床専門医との１年間の継続中の隔週会議から特定された。
臨床医のインタビューと介護者フォーカスグループは、特に言語機能に関連するＣＬＮ２の主要な症状と影響、ＥＲＴ治療を受けた患者とＥＲＴ未治療の患者における疾患進行の差異、及びＣＬＮ２ ＣＲＳにおける言語機能評価の精度を改善して、臨床試験で治療効果を評価するためにそれをさらに有用にする方法について議論した。
反復的な開発プロセスには、パイロットアプリケーションと多数の項目改訂が含まれていた。追跡マトリックスを使用して、すべての評価尺度の反復と変更の根拠を文書化した。
評価者間信頼性、すなわち臨床医間の一致レベルは、４人の評価者にわたる一致率として計算した。
評価は、主治医が実施し、採点し、さらにオブザーバー臨床医によっても独立して採点した。
各評価をビデオに録画し、追加の２人の臨床医によって独立して採点した。
生後２０か月～１６歳（平均７．８歳）の３０人の患者を、それぞれ４人の臨床医がＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＭＸで採点した。現時点で患者全員がＥＲＴを受けていた。
７．９．２ 結果
本試験では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの詳細な管理、スコアリング及びトレーニングマニュアルを開発した。このマニュアルには、表現言語及び非言語コミュニケーション能力を判断するためのプロンプトの使用に関する具体的なガイダンスが含まれている。
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸは、喃語、語彙及びフレーズの発達、ならびに理解できない発声及びジェスチャーを含む、欲求及び要求を伝達するための小児の表現言語能力を測定した。一般に、臨床医及び介護者は、ＣＬＮ２の小児が進行性の言語喪失を経験しており、日常生活に影響を及ぼしていたと報告した。臨床医及び介護者は、２歳～３歳半の年齢範囲でのピーク単語数が２０～１００語であり、ＣＬＮ２の小児が単一語や二重語のフレーズ、理解できない発声及びジェスチャーを含む、様々なコミュニケーション戦略を使用していると報告した。本試験では、臨床医は、年齢ごとに期待される機能を区別し、より多くの応答オプションが組み込まれ、語彙とフレーズの発達、発声及びジェスチャーが考慮された、言語に関する拡張ＣＬＮ２ ＣＲＳの開発をサポートした。
評価基準の概要及びオリジナルのＣＬＮ２ ＣＲＳ－Ｌとの比較を表４及び５に示す。スコアリングのフローチャートを、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸの年齢カテゴリー（１～２歳未満、２～３歳未満、及び３年以上）ごとに作成した。図９は、例として２～３年未満のフローチャートを示す。
Figure 2024505257000005
Figure 2024505257000006
Figure 2024505257000007
評価者間の一致では、ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸに関する臨床医間の一致レベルは０．９３３であり、ほぼ完全な一致を示した（Ｌａｎｄｉｓ，ＪＲ，Ｋｏｃｈ，ＧＧ． Ａｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｋａｐｐａ－ｔｙｐｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｊｏｒｉｔｙ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ａｍｏｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｂｓｅｒｖｅｒｓ，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９７７を参照のこと。一致レベルの範囲は０．８１～０．９９である）。
７．９．３ 結論
ＣＬＮ２ ＣＲＳ－ＬＸは、表現言語及び非言語コミュニケーション能力に対するＣＬＮ２疾患の影響の測定において、より高い精度を提供し、項目の関連性を向上させ、応答オプションの数を増加させた。
この評価尺度は、ＣＬＮ２の小児向けに特別に設計したが、同様の疾患障害を示す他の神経筋疾患または神経変性疾患にも関連し得る。
７．１０ 実施例１０：カニクイザルにおける単回用量の髄腔内（ＩＴ）薬物動態学／薬力学試験
本実施例は、実施例３で報告した試験の続きである。構築物ＩＩＩを用いたカニクイザルにおける４週間の薬力学及び毒性試験において、試料を脳（前頭皮質、後頭皮質、小脳、線条体、延髄、中脳及び視床の２つの４ｍｍ円形試料、１つは表層、もう１つは深層）、脊髄（頸部、胸部、及び腰部の１ｃｍ切片）、及び関連する神経根及び神経節（ＤＲＧ）、眼（左）、心臓（左心室）、腎臓（左）、肝臓（左側葉）、肺（左尾部）、近位坐骨神経、リンパ節（鼠径部、下顎部、及び腸間膜）、卵巣（左）または精巣から採取した。眼組織をさらに網膜／脈絡膜と強膜に解剖した。カニクイザルの群（雄２匹、雌２匹／用量）に、単回の大槽穿刺（ＣＭ）を介して、０、３．１×１０１３または１．１×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ）／動物の用量で構築物ＩＩＩ（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）を投与した。３．１×１０１３ＧＣ／動物では、３つの異なる方法を使用して構築物ＩＩＩを調製した。追加の動物群（ｎ＝２／性別／群）に、ヌルベクターを含むＡＡＶ９を、単回ＣＭ投与により２．８９×１０１３ＧＣ／動物の用量で投与した。試験終了時、３０日目に動物を安楽死させた。全体として、３０日目に構築物ＩＩＩまたはヌルベクターを投与した動物から採取したほぼすべての脳領域、脊髄及びＤＲＧ組織、近位坐骨神経ならびに他の末梢組織において、ベクターＤＮＡレベルが定量下限を上回っていた。生体内分布の結果は、図６、図７、及び表６に見出すことができる。血清及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＴＰＰ１濃度の増加が観察された（図１０）。４週間で、脳（図１１）及び脊髄においてＴＰＰ１濃度の用量関連増加があった。血清及びＣＳＦ中のＴＰＰ１濃度の低下は、これらの動物で観察された免疫原性と関連していた。
カニクイザルの群（ｎ＝３／群またはｎ＝４／群）に、３．４×１０１１、３．２×１０１２、２．９×１０１３ＧＣ／動物または１．１×１０１４ＧＣ／動物の用量で、大槽（ＣＭ）への注射を介して構築物ＩＩＩ（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）を投与した。剖検では、前頭皮質、線条体、視床、中脳、後頭皮質、延髄及び小脳の深層（＞３ｍｍ、Ｄ）または表層（＜３ｍｍ、Ｓ）領域から、ｑＰＣＲによる分析のために２つの組織パンチを採取した。平均値と標準偏差を示す。ＢＬＱ値は、平均値の計算において５０．０コピー／μｇ ＤＮＡとして処理した。
カニクイザルの群（ｎ＝３／用量）に、大槽（ＣＭ）への注射を介して、または腰部ＩＴ（ＩＴ－Ｌ）を介して、３．２×１０１２ＧＣ／動物の用量で構築物ＩＩＩ（ＡＡＶ９．ｈＣＬＮ２）を投与した。剖検では、前頭皮質、線条体、視床、中脳、後頭皮質、延髄及び小脳の深層（＞３ｍｍ、Ｄ）または表層（＜３ｍｍ、Ｓ）領域から、ｑＰＣＲによる分析のために２つの組織パンチを採取した。平均値と標準偏差を示す。ＢＬＱ値は、平均値の計算において５０．０コピー／μｇ ＤＮＡとして処理した。
Figure 2024505257000008
７．１１ 実施例１１：ＴＰＰ１ｍ１Ｊ ＫＯマウスにおける単回投与薬理試験
本実施例は、実施例４の試験の続きである。本試験の目的は、単回ＩＣＶ投与後のＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスにおける構築物ＩＩＩの薬理学（臨床徴候、神経病理及び生存率）を評価することであった。試験終了時に、生き残った動物で脊髄の追加の解剖学的病理学的評価を実施した。ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの群（９～１０／性別／群、４～５週齢）に、０（ビヒクル）、１．２５×１０１０、５．０×１０１０、２．０×１０１１、及び８．５×１０１１ＧＣ／動物の用量で構築物ＩＩＩの単回ＩＣＶ注射（５μＬ）を投与した。割り当て前と試験終了時に、動物の遺伝子型を同定した。
本試験で評価したエンドポイントには、死亡率、臨床観察、体重、神経行動観察（投与前、８週目、及び１６週目）、ＴＰＰ１活性、抗ＴＰＰ１抗体分析、肉眼的剖検所見、臓器重量、及び神経病理が含まれていた。
本質的に、用量反応が観察されなかったか、または対照ノックアウト動物が後の時点で評価できるほど生存していなかったため、神経行動に対する構築物ＩＩＩの明らかな効果は観察されなかった。本試験では、生存のための最小有効用量（８．５×１０１１ＧＣ／動物）で、５２週まで生存マウスにおいて構築物ＩＩＩ関連の有害な所見はなかった。単回脳室内（ＩＣＶ）投与により、９週間後に脳及び脊髄において、ｈＴＰＰ１の発現（図１２）、生存率の増加（図１３）、アストロサイト増多症（ＧＦＡＰ）、ミクログリア活性化（ＣＤ６８）及びＳＣＭＡＳの低下が引き起こされた（図１４）。１．２５×１０１０及び５．０×１０１０ＧＣ／動物の用量は、未処置のＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスと比較した場合、ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの生存率を増加させたようには思われなかった。２．０×１０１１ＧＣ／動物では、サプライヤーの間違いにより、試験終了時に遺伝子型決定した際、４／５の雄と２／５の雌がＴＰＰ１遺伝子に関してヘテロ接合性であったため、構築物ＩＩＩが生存期間を延長したかどうかを判定することはできなかった。この用量では、確認された雄ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウス１匹が試験終了まで生存していた。８．５×１０１１ＧＣ／動物で構築物ＩＩＩを投与したすべての動物において、５２週間の予定された剖検まで、雄及び雌の両方で生存率は１００％であった。寿命の延長は、３×１０１１ＧＣ／動物（ＩＣＶ）でも観察された。
どの動物においても、９週目の期間において肉眼的所見はなかった。５２週目に、２×１０１１ＧＣ／動物（雄１／５、ヘテロ接合体）及び８．５×１０１１ＧＣ／動物（ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの３／５の雄及び１／５の雌）で、肝臓上に腫瘤が観察された。肝臓では、肝細胞腺腫（８．５×１０１１ＧＣ／動物では１／５の雄、１／５の雌、２×１０１１ＧＣ／動物では１／５の雄）、肝細胞壊死（８．５×１０１１ＧＣ／動物では３／５の雄）、肝細胞過形成（８．５×１０１１ＧＣ／動物では４／５の雄、２×１０１１ＧＣ／動物では１／２の雌）、及び肝細胞空胞化の重症度の増加が観察された。５２週間のコホートでは、構築物ＩＩＩの投与後、後根神経節と脊髄神経根に顕微鏡的な変化が観察された。後根神経節では、５．０×１０１０ＧＣ／匹以上のマウスで神経空胞化（最小～顕著）が認められ、２．０×１０１１ＧＣ／匹以上のマウスで細胞充実性の増加（グリア細胞様、最小～中等度）及び軸索ジストロフィー／軸索腫大（最小～軽度）が認められた。５．０×１０１０ＧＣ／匹以上のマウスでは、脊髄根の変性（軽度～中等度）及び軸索ジストロフィー／軸索腫大（最小～軽度）が認められた。５２週間の剖検まで生存したビヒクル対照ＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスがなかったため、構築物ＩＩＩを投与しなかったＴＰＰ１ｍ１ＪＫＯマウスの肝臓を評価することはできなかった。したがって、構築物ＩＩＩ関連病変と表現型関連病変を区別することはできなかった。
８． 参照による援用
本明細書で引用されるすべての公開文書は、参照により本明細書に援用される。同様に、本明細書中で参照し、添付の配列表に現れる配列番号は、参照により援用される。本発明を、特定の実施形態を参照して記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な変更を行い得ることは理解されたい。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
９． 配列
Figure 2024505257000009
Figure 2024505257000010
Figure 2024505257000011
Figure 2024505257000012
Figure 2024505257000013
Figure 2024505257000014
Figure 2024505257000015
識別番号<223>または<213>の下のフリーテキストを含む配列について、以下の情報を提供する。
Figure 2024505257000016

Claims (37)

  1. 対象におけるＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患を治療する方法であって、それを必要とする前記対象の中枢神経系に、脳質量あたり１．２５×１０１１または４．５×１０１１ゲノムコピーの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含み、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が、ＡＡＶキャプシド及びその内部にパッケージされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが：
    （ａ）ＡＡＶ ５’逆位末端（ＩＴＲ）配列、
    （ｂ）プロモーター、
    （ｃ）ヒトＴＰＰ１をコードするＣＬＮ２コード配列、及び
    （ｄ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ
    を含み、前記方法が、ＣＬＮ２疾患の症状を改善させる、前記方法。
  2. 前記ｒＡＡＶを、脳室内（ＩＣＶ）または大槽内（ＩＣ）に投与する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象の脳質量を、試験参加者のスクリーニング脳ＭＲＩから導出する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記（ｃ）のコード配列が、配列番号３に記載のコドン最適化ヒトＣＬＮ２である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記（ｃ）のコード配列が配列番号３である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ｒＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ９またはそのバリアントである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記プロモーターがニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記プロモーターが、ＣＢＡプロモーター配列及びサイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを含むハイブリッドプロモーターである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ＡＡＶ ５’ＩＴＲ及び／またはＡＡＶ ３’ＩＴＲがＡＡＶ２由来である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ベクターゲノムが、ポリＡをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記ポリＡが、合成ポリＡであるか、またはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβグロビン（ＲＧＢ）、もしくは修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）由来である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ベクターゲノムが、イントロンをさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記イントロンが、ＣＢＡ、ヒトβグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、αグロブリン、βグロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、またはｐ５３に由来する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ベクターゲノムが、エンハンサーをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記エンハンサーが、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、αｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記方法が、投与後２４か月以内に、ＣＬＮ２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅの運動領域と言語領域の組み合わせの６段階の２カテゴリー未満の低下をもたらす、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記方法が、前記対象の脳脊髄液中で、疾患と関連していない天然ＴＰＰ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多形体の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％であるか、または１００％とほぼ同じか、もしくはそれを超えるＴＰＰ１活性を生じさせる、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記方法が、疾患と関連していない天然ＴＰＰ１タンパク質、またはその天然のバリアントもしくは多形体の生物学的活性レベルの少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％であるか、または１００％とほぼ同じか、もしくはそれを超える前記対象の血清ＴＰＰ１活性を生じさせる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記方法が、前記ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域と言語領域の組み合わせによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記方法が、前記ＣＬＮ２ ＣＲＳの言語領域によって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記方法が、前記ＣＬＮ２ ＣＲＳの運動領域によって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記方法が、介護者の発作日誌に記録されたベースラインと比較して、発作頻度を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記方法が、介護者の発作日誌に記録されたベースラインと比較して、発作期間を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、短縮させる、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｃｏｒｅ Ｓｃａｌｅで測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. ＰｅｄｓＱＬ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｍｐａｃｔ Ｍｏｄｕｌｅによって測定した場合のベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記方法が、ベースラインと比較して、抗てんかん治療法の使用を約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、減少させる、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. Ｖｉｎｅｌａｎｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｅｈａｖｉｏｒ Ｓｃａｌｅ ＩＩＩによって決定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. Ｍｕｌｌｅｎ Ｓｃａｌｅ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｌｅａｒｎｉｎｇによって決定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用して網膜の解剖学的構造を評価することによって決定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｖｅｒｉｔｙによって決定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. Ｃｌｉｎｉｃｉａｎ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｈａｎｇｅによって決定されるベースラインと比較して、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超の臨床効果を生じさせる、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. ＧＡＩＴＲｉｔｅによって決定されたベースラインと比較して、歩行パラメータを約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％超、向上させる、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記方法が、前記対象に免疫抑制療法を施すことをさらに含む、１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記免疫抑制療法が、コルチコステロイド、タクロリムス、及び／またはシロリムスを投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記対象がヒトである、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記対象が、生後４か月～６歳である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記対象が、生化学的、分子的、または遺伝的方法によって確認され、ＴＰＰ１欠損に起因するＣＬＮ２疾患の文書化された診断を受けている、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
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