CN102575232B - 猿腺病毒41及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了新型猿腺病毒41及其两种分离物。提供了这些分离物的各种应用，包括构建包含在调控序列控制下的猿腺病毒41序列和异源基因的重组载体。还公开了表达一种或多种猿腺病毒41基因的细胞系。提供了利用所述载体和细胞系的方法。

Description

猿腺病毒41及其应用
关于联邦资助下研发的声明
本项工作部分受到国立卫生研究院的基金，NIH基金号P30-DK47757的支持。美国政府对本发明享有一定权利。
电子形式提交的资料通过引用纳入
申请人将以电子形式提交的序列表材料通过引用纳入本文。这些文件标记为“UPN-U4710PCT_ST25.txt”。
发明背景
腺病毒是双链DNA病毒，基因组大小约为36千碱基(kb)，由于能在多种靶组织中实现高效基因转移以及较大的转基因容量，它被广泛用于基因转移应用。通常，腺病毒的E1基因缺失，被替换为由所选启动子、感兴趣基因cDNA序列和聚A信号组成的转基因盒，从而产生复制缺陷型重组病毒。
腺病毒的形态特征是由三种主要蛋白和许多其他小蛋白VI、VIII、IX、IIIa和Iva2组成的二十面体衣壳，这三种主要蛋白是六邻体(II)、五邻体基质(III)和突结尾丝(knobbed fibre)(IV)[W.C.Russell，J.Gen Virol.，81：2573-3704(2000年11月)]。病毒基因组为线形双链DNA，末端蛋白共价连接于含有反向末端重复(ITR)的5’末端。病毒DNA与高碱性蛋白VII和小肽pX(之前称为mu)密切相连。另一种蛋白V与此DNA-蛋白复合物包装在一起，并通过蛋白VI提供与衣壳的结构连接。该病毒也含有病毒编码的蛋白酶，这种蛋白酶是加工某些结构蛋白以产生成熟的感染性病毒所必需的。
已经开发了一种对包括人、猿、牛、马、猪、羊、犬和负鼠腺病毒在内的哺乳动物腺病毒家族进行分类的方法。这种分类方法的开发依据该家族内的腺病毒序列凝集红血细胞的能力不同。结果得到了六个亚组，现在称为亚组A、B、C、D、E和F。参见T.Shenk等，“腺病毒科：病毒及其复制”(Adenoviridae：The Viruses and their Replication)，选自B.N Fields等编的《菲尔德病毒学》(FIELD′S VIROLOGY)第6版，第67章，(LR出版社(Lippincott RavenPublishers)，费城，1996)，第111-2112页。
已报道可使用重组腺病毒将异源分子递送至宿主细胞。参见美国专利6,083,716，它描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。猿腺病毒C5、C6和C7已经描述于美国专利7,247,472，它可用作疫苗载体。其他黑猩猩腺病毒描述于WO 2005/1071093，可用于制造腺病毒疫苗载体。
本领域需要其它腺病毒分离物用于制备可用于治疗和/或免疫应用的载体。
发明概述
本文提供了猿腺病毒41(SAdV-41)的分离核酸序列和氨基酸序列，以及含有这些序列的载体。还提供了利用本发明载体和细胞的许多方法。
本文所述方法包括通过给予本发明的载体将一种或多种所选异源基因递送给哺乳动物患者。用本文所述组合物进行疫苗接种能够呈递所选抗原从而引发保护性免疫反应。基于猿腺病毒41的载体也可用于体外产生异源基因产物。此类基因产物可用于各种目的，例如本文描述的。
下文将更加详细地描述本发明的这些和其它实施方式以及优点。
发明详述
本发明提供了分离自黑猩猩排泄物的猿腺病毒41的新型核酸和氨基酸序列。还提供了新型腺病毒载体和产生那些载体的包装细胞系，以便用于体外产生重组蛋白质或片段或其它制剂。还提供了用于递送异源分子的组合物以供治疗或疫苗目的。此类治疗性或疫苗组合物含有携带插入的异源分子的腺病毒载体。此外，所述新型SAdV-41序列可用于提供产生重组腺相关病毒(AAV)载体所必需的辅助功能。因此，提供了在此种产生方法中利用这些序列的辅助构建物、方法和细胞系。
本发明人测定到SAdV-41序列与人亚组B腺病毒处于同一亚组。以前根据限制性酶消化谱将人亚组B腺病毒细分成B：1和B：2亚进化支，发现它们分别成簇。SAdV-41簇含人B：1分离物。
在一个实施方式中，本发明提供称为SAdV41.1的新型腺病毒分离物。在另一实施方式中，本发明提供称为SAdV41.2的新型腺病毒分离物。这两种分离物具有氨基酸水平100％相同的六邻体蛋白(即，SEQ ID NO：11和SEQ IDNO：44相同)。除了另有表述之处，本文所述的构建物及腺病毒序列和构建物的应用适用于本文所述的SAdV41分离物。
术语“基本上同源”或“基本上相似”指核酸或其片段时，表示当任选比对含相应核苷酸插入或缺失的序列与另一核酸(或其互补链)时，所比对序列有至少约95、96、97、98、98.5、99或99.5％的核苷酸序列相同。
术语“基本上同源”或“基本上相似”指氨基酸或其片段时，表示当任选比对含相应氨基酸插入或缺失的序列与另一氨基酸(或其互补链)，所比对序列有至少约95、96、97、98、98.5、99或99.5％氨基酸序列相同。优选在全长序列，或其蛋白，或其至少8个氨基酸、或更理想至少15个氨基酸长度的片段上具有所述同源性。本文描述了合适片段的实例。
就核酸序列而言，术语“序列同一性百分比”或“相同”指当比对最大对应性时，两个序列中的残基相同。序列同一性比较的长度需要是基因组全长(例如，约36kbp)、基因的开放读框的全长、蛋白、亚基、或酶[参见，例如提供腺病毒编码区的表]、或至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，也可能需要较小片段之间的同一性，例如至少约9个核苷酸、通常至少约20到24个核苷酸、至少约28到32个核苷酸、至少约36或更多核苷酸的片段。类似地，不难测定氨基酸序列、蛋白全长或其片段的“序列同一性百分比”。片段长度宜是至少长约8个氨基酸，也可最多约700个氨基酸。本文描述了合适片段的实例。在一个实施方式中，所比对序列有至少约95、96、97、98、98.5、99或99.5％的氨基酸同一性。
利用文中所述用默认设置的算法和计算机程序不难测定同一性。优选在蛋白质、酶、亚基的全长或至少约8个氨基酸长度的片段上具有这种同一性。然而，同一性可基于较短的区域，适合使用相同基因产物的区域。
如本文所述，用各种公共可得或可购得的多序列比对程序进行比对，例如可通过互联网Web服务器获得的“Clustal W″。或者，也可使用载体实用程序[英杰公司(InVitrogen)]。还有许多本领域已知的算法也可用于检测核苷酸序列同一性，包括包含在上述程序中的算法。再例如，可使用GCG 6.1版中的程序Fasta来比较多核苷酸序列。Fasta可对查询序列与检索序列之间最佳重叠区域进行比对并提供序列同一性百分比。例如，可使用GCG 6.1版提供的Fasta及默认参数(字长为6和用于计分矩阵的NOPAM系数)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比，通过引用纳入本文。可采用相似程序进行氨基酸比对。虽然本领域技术人员可视需要改变设定值，但通常这些程序都利用默认设定值。或者，本领域技术人员也可采用能够象上述算法和程序一样至少提供同一性水平或进行比对的另一算法或计算机程序。
“重组”用于多核苷酸时表示该多核苷酸是产生不同于天然发现的多核苷酸的构建物的克隆、限制或连接步骤以及其它过程的各种组合的产物。重组病毒是其中包装了异源多核苷酸(例如，表达盒)的病毒颗粒。在某些实施方式中，可产生不含表达盒或其它异源多核苷酸的病毒颗粒。此类构建物可用于本文并称为“空衣壳”，例如2008年1月24日出版的国际专利公布号WO 2008/010864所述。
该术语分别包括原始多核苷酸构建物的复制物以及原始病毒构建物的子代。
“异源”表示衍生自与所比较的实体的其余部分在基因型上不同的实体。例如，通过遗传工程技术引入来源于不同物种的质粒或载体的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列上取下并操作性连接于天然情况下不连接的编码序列的启动子是异源启动子。已被克隆入病毒基因组或病毒载体中的位点特异性重组位点是异源重组位点，其中所述病毒基因组在天然情况下不含该位点。当具有重组酶编码序列的多核苷酸被用于遗传改变正常情况下不表达该重组酶的细胞时，多核苷酸和重组酶对于该细胞都是异源的。
本说明书和权利要求书中所用的术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包括”等其它形式，指包含其它组分、元素、数值、步骤等。术语“由...组成”不包括其它组分、元件、整数、步骤等。
I.猿腺病毒序列
本发明提供了各分离自天然相关的其它材料的猿腺病毒41(SAdV-41)的核酸序列和氨基酸序列。
A.核酸序列
本文提供的SAdV-41.1核酸序列包括SEQ ID NO：1的核苷酸1-35100。参见通过引用纳入本文的序列表。SAdV41.2的核苷酸序列，1到35776见SEQID NO：34。在一个实施方式中，本发明的核酸序列还包括分别与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：34的序列互补的链，以及以下序列和它们的互补链的序列的相应RNA和cDNA序列。在另一实施方式中，所述核酸序列还包括与序列表有98.5％以上，更优选约99％以上相同的序列。一个实施方式中还包括SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：34中所提供序列以及它们互补链的天然变体和工程构建修饰物。例如，此类修饰包括本领域已知的标记、甲基化、以及用简并核苷酸取代一个或多个天然产生的核苷酸。
表1
在一个实施方式中，提供了SAdV41的序列以及它们的互补链、与其互补的cDNA和RNA的片段。合适的片段至少长15个核苷酸，并包含功能性片段，即生物学感兴趣的片段。例如，功能性片段可表达所需的腺病毒产物，或用于产生重组病毒载体。此类片段包含本文下表所列的基因序列和片段。下表提供了SAdV-41序列中的转录区和开放读框。对于某些基因，其转录区和开放读框(ORF)位于与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：34的互补链上。参见例如E2b、E4和E2a。还显示了其编码蛋白的计算分子量。注意，SAdV-41的E1a开放读框和E2b开放读框含有内部剪接位点。这些剪接位点在下表中标出。
SAdV-41腺病毒核酸序列可用作治疗制剂并用于构建各种载体系统和宿主细胞。本文所用的载体包含任何合适的核酸分子包括，裸DNA、质粒、病毒、粘粒或附加体。这些序列和产物可单独应用，或与其它腺病毒序列或片段联用，或与其它腺病毒或非腺病毒序列的元件联用。所述SAdV-41序列还可用作反义递送载体、基因治疗载体或疫苗载体。因此，本发明还提供含有所述SAdV-41序列的核酸分子、基因递送载体和宿主细胞。
例如，本发明包括含有本发明猿Ad ITR序列的核酸分子。在另一实施；例中，本发明提供含有编码所需Ad基因产物的本发明猿Ad序列的核酸分子。本领域技术人员鉴于本文提供的信息不难明白采用本发明序列构建的其它核酸分子。
在一个实施方式中，本文鉴定的猿Ad基因区域可用在各种载体中以便向细胞递送异源分子。例如，为在包装宿主细胞中产生病毒载体而产生表达腺病毒衣壳蛋白(或其片段)的载体。可设计反式表达的这类载体。或者，可设计这类载体来提供稳定含有能表达所需腺病毒功能的序列的细胞，所述序列如E1a、E1b、末端重复序列、E2a、E2b、E4、E4ORF6区域中一个或多个。
此外，所述腺病毒基因序列及其片段可用于提供产生辅助依赖性病毒(如缺失了必须功能的腺病毒载体或腺相关病毒(AAV))所必需的辅助功能。对于此类产生方法，SAdV-41序列以类似于人Ad所述的方式用于此方法中。然而，由于SAdV-41序列和人Ad序列之间的序列差异，利用SAdV-41序列大大降低或消除了在带有人Ad E1功能的宿主细胞与辅助功能同源重组的可能性，如在rAAV产生期间可产生传染性腺病毒污染物的如293细胞中。
在许多关于人腺病毒血清型的文献中已详细描述了利用腺病毒辅助功能产生rAAV的方法。参见例如美国专利6,258,595和其中引用的参考文献。也可见美国专利5,871,982；WO 99/14354；WO 99/15685；WO 99/47691。这些方法也可用于产生非人血清型AAV，包括非人灵长类AAV血清型。提供必需辅助功能(如E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6)的SAdV-41序列尤其可用于提供必需的腺病毒功能，同时尽量减少或消除与人来源的典型rAAV-包装细胞中存在的任何其它腺病毒的重组可能性。因此，这些rAAV产生方法中，可采用选出的SAdV-41序列的基因或开放读框。
或者，这些方法中可采用重组SAdV-41载体。这类重组猿腺病毒载体可包括，例如杂交的黑猩猩Ad/AAV，其中黑猩猩Ad序列侧接有，例如AAV 3′和/或5′ITR组成的rAAV表达盒，和在控制其表达的调控序列控制下的转基因。本领域技术人员会知晓其它猿腺病毒载体和/或SAdV-41基因序列还可用于产生依赖腺病毒辅助的rAAV和其它病毒。
在还有另一实施方式中，设计了用于能在宿主细胞中递送和表达所选腺病毒基因产物以实现所需生理效应的核酸分子。例如，可将含有编码SAdV-41 E1a蛋白的序列的核酸分子递送给对象以便用作癌症治疗剂。任选地，可用脂质载体配制此类分子，优选靶向癌细胞。这类制剂可与其它癌症治疗剂(如顺铂、紫杉醇等)联用。本领域技术人员不难明白，本文提供的腺病毒序列还有其它用途。
此外，本领域技术人员不难理解，SAdV-41序列不难适用于各种病毒和非病毒载体系统以便在体外、离体或体内递送治疗性和免疫原性分子。例如，在各种rAd和非rAd载体系统中可采用SAdV-41猿Ad序列。此类载体系统可包括，如质粒、慢病毒、逆转录病毒、痘病毒、痘苗病毒和腺相关病毒系统等。这些载体系统的选择不限制本发明。
本发明还提供用于产生本发明的猿和猿衍生蛋白质的分子。载有包含本发明猿Ad DNA序列的多核苷酸的此类分子可包括裸DNA、质粒、病毒或任何其它遗传元件。
B.SAdV-41腺病毒蛋白
本发明还提供SAdV-41腺病毒的基因产物，如本文所述腺病毒核酸编码的蛋白质、酶、及其片段。本发明还包括具有用其它方法产生的这些核酸序列编码的氨基酸序列的SAdV-41蛋白、酶及其片段。这些蛋白包括上表确定的开放读框编码的蛋白、下表中(也示于序列表中)的蛋白以及所述蛋白质和多肽的片段。
表2
因此，本发明一方面提供基本纯的，即没有其它病毒和蛋白质的独特猿腺病毒41(SAdV-41)蛋白质。优选这些蛋白质至少10％同源，更优选60％同源，最优选95％同源。
在一个实施方式中，本发明提供独特的猿衍生的衣壳蛋白。本文所用的猿衍生衣壳蛋白包括含有上述SAdV-41衣壳蛋白或其片段的任何腺病毒衣壳蛋白，包括但不限于，嵌合性衣壳蛋白、融合蛋白、人工衣壳蛋白、合成的衣壳蛋白和重组衣壳蛋白，不限于产生这些蛋白的方法。
这些猿衍生的衣壳蛋白宜含有与本文所述不同腺病毒血清型衣壳区或其片段，或修饰的猿衣壳蛋白或片段组合的一个或多个SAdV-41区域或其片段(如六邻体、五邻体、尾丝或其片段)。本文所用的“与嗜性改变相关的衣壳蛋白的修饰”包括改变的衣壳蛋白，即五邻体、六邻体或尾丝蛋白区域或其片段，如尾丝区的突起结构域(knob domain)，或编码它们的多核苷酸，因此其特异性被改变。可用本发明的一个或多个猿Ad或人或非人来源的另一Ad血清型来构建猿衍生的衣壳。此类Ad可获自各种来源，包括ATCC、商业和学术来源，或此Ad序列可获自GenBank或其它合适来源。
提供了SAdV-41.1五邻体蛋白见SEQ ID NO：6，SAdV41.2五邻体蛋白见SEQ ID NO：39。该五邻体蛋白或其独特片段可适当地用于各种目的。合适片段的例子包括根据以上和SEQ ID NO：6和/或39中提供的氨基酸编号，具有约50、100、150或200个氨基酸的N-端和/或C-端截短的五邻体。其它合适的片段包括较短的内部片段、C-端或N-端片段。也可修饰该五邻体蛋白用于本领域技术人员已知的各种目的。
还提供了SAdV-41.1[SEQ ID NO：11]和SAdV41.2[SEQ ID NO：44]所示六邻体蛋白的氨基酸序列(这两种病毒具有在氨基酸水平100％相同的六邻体)。这些六邻体蛋白或其独特片段可适当地用于各种目的。合适片段的例子包括根据以上和SEQ ID NO：11或44中提供的氨基酸编号，具有约50、100、150、200、300、400或500个氨基酸的N-端和/或C-端截短的六邻体。其它合适的片段包括较短的内部片段、C-端或N-端片段。例如，一个合适的片段是该六邻体蛋白的环区(结构域)，命名为DE1和FG1，或其超变区。此类片段包括跨越该猿六邻体蛋白的氨基酸残基约125-443；约138-441；或较小片段如跨越残基约138-163；约170-176；约195-203；约233-246；约253-264；约287-297；和约404-430的区域，参见SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：44。本领域技术人员不难鉴定其它合适的片段。也可为本领域技术人员已知的各种目的修饰该六邻体蛋白。因为该六邻体蛋白是腺病毒血清型的决定簇，此类人工六邻体蛋白可产生具有人工血清型的腺病毒。其它人工衣壳蛋白也可用本发明的黑猩猩Ad五邻体序列和/或尾丝序列和/或其片段构建。
在一个实施方式中，利用SAdV-41六邻体蛋白的序列产生具有改变的六邻体蛋白的腺病毒。改变六邻体蛋白的一种合适方法见通过引用纳入本文的美国专利5,922,315所述。在该方法中，腺病毒六邻体的至少一个环区域换为另一腺病毒血清型的至少一个环区域。因此，此类被改变的腺病毒六邻体蛋白的至少一个环区是SAdV-41的猿Ad六邻体环区。在一个实施方式中，SAdV-41六邻体蛋白的一个环区被另一腺病毒血清型的一个环区替代。在另一实施方式中，用SAdV-41六邻体的该环区替代另一腺病毒血清型的环区。如本文所述，合适的腺病毒血清型不难从人和非人血清型中选择。对合适血清型的选择不是对本发明的限制。本领域技术人员不难明白SAdV-41六邻体蛋白序列还有其它用途。
SAdV-41.1的尾丝蛋白具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列，SAdV-41.2的尾丝蛋白具有SEQ ID NO：54所示氨基酸序列。可为各种目的适当地使用该尾丝蛋白或其独特片段。一种合适的片段是位于SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：54内的尾丝结(fiber knob)。其它合适片段的例子包括具有根据SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：54中提供的氨基酸编号，约50、100、150或200个氨基酸的N-端和/或C-端截短的尾丝。其它合适的片段包括内部片段。也可用本领域技术人员熟知的各种技术修饰该尾丝蛋白。
SAdV-41的蛋白的独特片段至少长8个氨基酸。然而，不难利用其它所需长度的片段。此外，本文提供引入后能提高SAdV-41基因产物产量和/或表达的修饰，如构建融合分子，其中SAdV-41基因产物的全部或其片段融合(直接或通过接头)于融合伴侣而得到增强。其它合适的修饰包括但不限于截短编码区(如蛋白或酶)以去除通常被切断的前蛋白或原蛋白产生成熟的蛋白或酶和/或突变编码区以提供可分泌的基因产物。本领域技术人员不难明白还可进行其它修饰。本发明还包括与本文提供的SAdV-41蛋白具有至少约99％同一性的蛋白质。
如本文所述，含SAdV-41的腺病毒衣壳蛋白的本发明载体特别适合于用中和抗体消除其它Ad血清型载体以及其它病毒载体作用的领域。rAd载体尤其有利于反复基因治疗或为加强免疫应答(疫苗滴度)的重复给药。
某些情况下可能需要采用一种或多种SAdV-41基因产物(如衣壳蛋白或其片段)来产生抗体。本文所用的术语“抗体”指能特异性结合某表位的免疫球蛋白分子。抗体可有各种形式，包括，例如高亲和力多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、嵌合型抗体、重组抗体和人源化抗体。此类抗体源自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE类。
此类抗体也可采用本领域已知的许多方法产生。可用熟知的常规技术如Kohler和Milstein及其众多已知的改进技术来产生适合的抗体。可将已知的重组技术应用于针对这些抗原产生的多克隆或单克隆抗体以产生类似的所需高滴度抗体[参见例如PTC专利申请号PTC/GB85/00392；英国专利申请公布号GB2188638A；Amit等，1986 Science，233：747-753；Queen等，1989 Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，86：10029-10033；PTC专利申请号PTC/WO9007861；和Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Huse等，1988a Science，246：1275-1281]。或者，通过操作针对本发明抗原的动物或人抗体的互补决定区产生这类抗体。参见例如，E Mark和Padlin的″Humanization of MonoclonalAntibodies″(单克隆抗体的人源化)，第四章，The Handbook of ExperimentalPharmacology(实验药理学手册)，第113卷，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies(单克隆抗体的药理学)，SV出版社(Springer-Verlag)(1994年6月)；Harlow等，1999，Using Antibodies：A Laboratory Manual(抗体使用实验室手册)，冷泉港实验室出版社，纽约；Harlow等，1989，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体实验室手册)，冷泉港，纽约；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；和Bird等，1988，Science 242：423-426。本发明还提供抗独特型抗体(Ab2)和抗-抗-独特型抗体(Ab3)。例如参见M.Wettendorff等，″Modulation of anti-tumor immunity by anti-idiotypic antibodies″(用抗独特型抗体调节抗肿瘤免疫力)，刊于Idiotypic Network and Diseases(独特型网络和疾病)，J.Cerny和J.Hiernaux编，1990，J.Am.Soc.Microbiol.，华盛顿特区：203-229页]。可用本邻域技术人员所熟知的技术生产这些抗独特型和抗-抗-独特型抗体。这些抗体可用于各种目的，包括诊断和临床方法及试剂盒。
在某些情况下可能需要在本发明的SAdV-41基因产物、抗体或其它构建物上引入可检测标记或标签。本文所用的可检测标记是单独或与另一分子相互作用后能提供可检测信号的分子。最理想的是该标记可目测，如通过荧光，以便在免疫组化分析或免疫荧光显微术中使用。例如，合适的标记包括异硫氰基荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻兰蛋白(APC)、科里膦-O(CPO)或串联染料，PE-花青-5(PC5)和PE-得克萨斯红(ECD)。所有这些荧光染料可商品化获得，它们的用途是本领域已知的。其它有用的标记是胶体金标记。其它有用的标记还包括放射活性化合物或元素。此外，标记还包括各种酶系统，它们能在试验中产生比色信号，如葡萄糖氧化酶(利用葡萄糖作底物)可释放过氧化氢，存在过氧化物酶和氢供体如四甲基联苯胺(TMB)时，此产物可产生呈兰色的氧化TMB。其它例子包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、和与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶联用的已糖激酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶能与ATP、葡萄糖和NAD+反应产生NADH，因340nm波长吸光值增加而可检测。
本文所述方法所用的其它标记系统可通过其它方法检测，如利用包埋有染料的着色乳胶微粒(Bangs实验室，印第安纳州)代替酶与靶序列形成偶联物，从而提供可视信号，表明应用试验中存在得到的复合物。
将标记与所需分子偶联或结合的方法是本领域技术人员已知的类似常规方法。标记物结合的已知方法已有描述[参见例如，Handbook of Fluorescentprobes and Research Chemicals(荧光探针和研究用化学制剂手册)，第六版，R.P.M.Haugland，分子探针有限公司(Molecular Probes，Inc.)，尤金，俄勒冈州，1996；Pierce Catalog and Handbook，Life Science and Analytical ResearchProducts(皮尔斯目录和手册之生命、科学和分析研究产品)，皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical Company)，罗克福德，伊利诺斯州，1994/1995]。因此，标记和偶联方法的选择不是对本发明范围的限制。
SAdV-41的序列、蛋白和片段可用任何适当的方法产生，包括重组产生、化学合成或其它合成方法。合适的生产技术是本领域技术人员熟知的。参见例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，冷泉港出版社(纽约，冷泉港)。或者，也可用熟知的固相肽合成法(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，85：2149(1962)；Stewart和Young，Solid PhasePeptide Synthesis(固相肽合成)(Freeman，旧金山，1969)，第27-62页)来合成肽。这些及其它适当的生产方法是本领域技术人员已知的，并且不构成对本发明的限制。
此外，本领域技术人员不难理解，SAdV-41序列不难适用于各种病毒和非病毒载体系统以在体外、离体或体内递送治疗性和免疫原性分子。例如，在一实施方式中，可将本文所述猿Ad衣壳蛋白和其它猿腺病毒蛋白用于基因、蛋白质和其它所需的诊断性、治疗性和免疫原性分子的基于非病毒性蛋白的递送。在一个此类实施方式中，将本发明的蛋白质直接或间接连接于能靶向带有腺病毒受体的细胞的分子。对于这种靶向，优选具有细胞表面受体的配体的衣壳蛋白，例如六邻体、五邻体、尾丝或其片段。适合递送的分子选自本文所述治疗性分子及其基因产物。各种接头，包括脂质、聚赖氨酸等可用作接头。例如，猿五邻体蛋白可通过使用猿五邻体序列生产融合蛋白而不难用于这种目的，所述生产方式类似于Medina-Kauwe LK等，Gene Ther.2001年5月；8(10)：795-803和Medina-Kauwe LK等，Gene Ther.2001年12月；8(23)：1753-1761所述。此外，如美国专利申请20010047081所述，猿Ad蛋白IX的氨基酸序列可用于使载体靶向细胞表面受体。合适的配体包括CD40抗原，含有RGD或聚赖氨酸的序列等。还有其它猿Ad蛋白，包括例如六邻体蛋白和/或尾丝蛋白可用于这些和类似的目的。
其它SAdV-41腺病毒蛋白可单独或与其它腺病毒蛋白联用于各种目的，本领域技术人员不难明白这一点。此外，本领域技术人员不难理解SAdV-41腺病毒蛋白的其它用途。
II.重组腺病毒载体
本文所述的组合物包括为治疗或疫苗目的将异源分子递送至细胞的载体。本文所用的载体可包含任何遗传元件，包括但不限于裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒。这些载体含有SAdV-41的猿腺病毒DNA和小基因。“小基因”指所选异源基因和在宿主细胞中驱动翻译、转录和/或基因产物表达所需的其它调控元件的组合。
通常设计SAdV-衍生的腺病毒载体，以使该小基因位于核酸分子中，而该核酸分子在所选腺病毒基因的天然区域中含有其它腺病毒序列。如果需要，可将该小基因插入现有基因区域以破坏该区域的功能。或者，可将该小基因插入部分或完全缺失的腺病毒基因的位点内。例如，可使该小基因位于可选择的位点，如功能性E1缺失位点或功能性E3缺失位点等中。术语“功能性缺失的”或“功能性缺失”指通过突变或修饰去除或损伤足够量的基因区域，以使该基因区域不再能产生基因表达的功能性产物。如果需要，可去除整个基因区域。本申请的它处讨论了基因破坏或缺失的其它合适位点。
例如，为了产生用于产生重组病毒的载体，该载体可含有该小基因和腺病毒基因组的5’端或腺病毒基因组的3’端，或同时含有腺病毒基因组的5’和3’端。腺病毒基因组的5’端含有包装和复制所需的5’顺式元件；即5’末端反向重复(ITR)序列(用作复制起点)和天然5’包装增强子结构域(含有包装线形Ad基因组所需序列和E1启动子的增强子元件)。腺病毒基因组的3’端包含包装和衣壳化所必需的3’顺式元件(含有ITR)。重组腺病毒适合含有5’和3’腺病毒顺式元件，小基因位于5’和3’腺病毒序列之间。基于SAdV-41的腺病毒载体也可含其它腺病毒序列。
这些基于SAdV-41的腺病毒载体宜含衍生自本发明腺病毒基因组的一种或多种腺病毒元件。在一个实施方式中，该载体含SAdV-41的腺病毒ITR和同一腺病毒血清型的其它腺病毒序列。在另一实施方式中，该载体含不同腺病毒血清型而非提供此ITR的腺病毒衍生的腺病毒序列。
本文所述的假型腺病毒指该腺病毒的衣壳蛋白来自与提供ITR的腺病毒不同的腺病毒。
此外，可采用本领域技术人员已知技术，用本文所述腺病毒构建嵌合或杂合腺病毒。参见例如美国专利7,291,498。
载体中存在的ITR的腺病毒来源和任何其它腺病毒序列来源的选择不是对本发明实施方式的限制。各种腺病毒株可从美国模式培养物保藏所(马纳萨斯，弗吉尼亚)获得，或可从各种商业和学术来源索取。此外，许多此类菌株的序列可从各种数据库，包括例如，PubMed和GenBank获得。发表的文献中已描述了从其它猿或人腺病毒制备的同源腺病毒载体[参见例如，美国专利号5,240,846]。许多类型腺病毒的DNA序列可获自GenBank，包括Ad5型[GenBank登录号M73260]。可获得任何已知腺病毒血清型，如血清型2、3、4、7、12和40的腺病毒序列，还包括任何目前已鉴定的人类型。在本发明的载体构建物中也可采用已知能感染非人动物(如猿)的相似腺病毒。参见例如，美国专利号6,083,716。
如上所述获得用于构建本文所述载体的病毒序列、辅助病毒(如果需要)和重组病毒颗粒，以及其它载体组分和序列。本发明的SAdV41猿腺病毒序列的DNA序列可用于构建载体和用于制备此类载体的细胞系。
可用标准分子生物学技术产生形成本发明载体的核酸序列的修饰，包括序列缺失、插入和其它突变，这些修饰包含在该实施方式的范围内。
A.“小基因”
根据本文提供的教导，本领域技术人员能够了解用于选择转基因、克隆和构建“小基因”，并将其插入病毒载体的方法。
1.转基因
转基因是编码感兴趣的多肽、蛋白质或其它产物，其侧接载体序列的异源核酸序列。核酸编码序列与调节组件操作性相连，其连接方式允许转基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达。
转基因序列的组成取决于所得载体的用途。例如：一类转基因序列包含表达后产生可检测信号的报告基因序列。这种报告基因序列包括但不限于编码以下物质的DNA序列：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸腺激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤光素酶、膜结合蛋白(如CD2、CD4、CD8)、流感血凝素蛋白和本领域熟知的存在高亲和力抗体或可通过常规方法产生所述抗体的其它物质，以及含有膜结合蛋白的融合蛋白，该膜结合蛋白适当地与血凝素或Myc等物质的抗原标记结构域融合。当这些编码序列与驱动其表达的调节元件相关联时，其提供常规方法可检测的信号，所述常规方法包括酶法、放射显影法、比色法、荧光法或其它光谱试验、荧光激活细胞分选测定与免疫测定，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和免疫组织化学。例如，当标记序列是LacZ基因时，通过β-半乳糖苷酶活性试验来检测携带信号的载体是否存在。当转基因是GFP或萤光素酶时，可用光度计产生的颜色或光来目测检测携带信号的载体。
在一个实施方式中，转基因是编码具有生物或医药用途的产物的非标记序列，所述产物例如蛋白质、肽、RNA、酶或催化性RNA。所需RNA分子包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化性RNA和反义RNA。有用的RNA序列的一个例子是消除靶核酸序列在经治疗动物中表达的序列。
可将转基因用于治疗，例如治疗遗传缺陷，作为癌症治疗剂或疫苗，用于诱导免疫应答，和/或达到预防性疫苗目的。本文所用的诱导免疫应答指分子(如基因产物)诱导针对该分子的T细胞和/或体液免疫应答的能力。本发明还包括使用多个转基因，例如用来纠正或减轻多亚基蛋白质所致疾病。在某些情况下，可利用不同转基因编码蛋白质的各亚基，或编码不同肽或蛋白质。当编码蛋白质亚基的DNA很大时这尤其适合，所述蛋白质例如免疫球蛋白、血小板衍生的生长因子或抗肌萎缩蛋白。为使细胞产生多亚基蛋白质，用含有各自不同亚基的重组病毒感染细胞。或者，蛋白质的不同亚基可由同一转基因编码。在这种情况下，单个转基因包含编码各亚基的DNA，而各亚基的DNA由内部核糖体进入位点(IRES)隔开。当编码各亚基的DNA较小时，例如编码亚基的DNA与IRES的总大小小于5千碱基对时，这尤其适合。作为IRES的替代，DNA可用编码在翻译后阶段自我切割的2A肽的序列隔开。参见，例如：M.L.Donnelly等，J.Gen.Virol.，78(第一部分)：13-21(1997年1月)；Furler，S.等，Gene Ther.，8(11)：864-873(2001年6月)；Klump H.等人，Gene Ther.，8(10)：811-817(2001年5月)。该2A肽明显小于IRES，使得其非常适合用于空间是制约因素的情况中。然而，选定的转基因可编码任何生物活性产物或其它产物，例如研究所需的产物。
本领域技术人员不难选择适当的转基因。转基因的选择不视作对该实施方式的限制。
2.调节元件
除了以上鉴定的小基因的主要元件外，载体还包含必需的常规控制元件，所述常规控制元件与转基因操作性相连，该连接方式允许转基因在本发明产生的质粒载体转染或病毒所感染的细胞中转录、翻译和/或表达。本文所用的“操作性相连的”序列包括与感兴趣基因毗连的表达调控序列和反式作用或远距离调控感兴趣基因的表达调控序列。
表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即：Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时增强编码产物分泌的序列。
许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子是本领域已知并可利用的。组成型启动子的例子包括但不限于：逆转录病毒罗斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选含RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选含CMV增强子)[参见，例如：Boshart等，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(英杰公司)。
诱导型启动子可调节基因的表达，并受外源提供的化合物、环境因素如温度或存在细胞的特定生理状态如急性期、特定分化阶段的调控，或只在复制性细胞中受调节。诱导型启动子和可诱导系统可从多种商业来源获得，包括但不限于英杰公司、克隆技术公司(Clontech)和阿里阿德公司(Ariad)。本领域技术人员不难选择已知的许多其它系统。例如，诱导型启动子包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子和地塞米松(Dex)-诱导型小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子。其它诱导型系统包括T7聚合酶启动子系统[WO 98/10088]；蜕皮激素昆虫启动子[No等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：3346-3351(1996)]，四环素-抑制性系统[Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992)]，四环素-诱导型系统[Gossen等，Science，378：1766-1769(1995)，也参见Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518(1998)]。其它系统包括FK506二聚体、采用甘珀二醇(castradiol)、联苯酚米勒甾酮(murislerone)的VP16或p65、RU486-诱导型系统[Wang等，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.，4：432-441(1997)]和雷帕霉素-诱导型系统[Magrosei等，J.Clin.Invest.，100：2865-2872(1997)]。一些诱导型启动子的有效性随时间提高。在这种情况下，可通过将多个阻抑物串联插入，如通过IRES将TetR与TetR连接，来提高这种系统的有效性。或者，可以在筛选所需功能之前等待至少3天。可通过已知方式提高所需蛋白的表达，以提高该系统的有效性。例如，使用土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
在另一实施方式中，使用转基因的天然启动子。当需要转基因的表达模拟天然表达时，可优选天然启动子。当转基因的表达必须瞬时或发育调节、或以组织特异性的方式或响应特定转录刺激而调节时，可使用天然启动子。在又一个实施方式中，也可使用其他天然表达控制元件，例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列以模拟天然表达。
转基因的另一实施方式包含操作性连接于组织特异性启动子的转基因。例如，如果需要在骨骼肌中表达，应该使用在肌肉中有活性的启动子。这包括编码以下产物的基因的启动子：骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、抗肌萎缩蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然启动子的合成肌肉启动子(参见：Li等，Nat.Biotech.，17：241-245(1999))。已知的组织特异性启动子的实例有肝特异性的(白蛋白，Miyatake等，J.Virol.，71：5124-32(1997)；乙肝病毒核心启动子，Sandig等，Gene Ther.，3：1002-9(1996)：甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等，Hum.Gene Ther.，7：1503-14(1996))、骨的骨钙蛋白(Stein等，Mol.Biol.Rep.，24：185-96(1997))；骨唾液蛋白(Chen等，J.Bone Miner.Res.，11：654-64(1996))、淋巴细胞特异性的(CD2，Hansal等，J.Immunol.161：1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体链)、神经元特异性的(例如神经元-特异性烯醇酶(NSE)启动子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993))、神经丝轻链基因(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，88：5611-5(1991))，以及神经元-特异性vgf基因(Piccioli等，Neuron，15：373-84(1995)))等。
任选地，携带编码有治疗用途或免疫原性产物的转基因的载体还可含有可选择标记基因，或报道基因可包含编码遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素(purimycin)抗性等的序列。可利用这种可选择的报道基因或标记基因(优选位于待包装入病毒颗粒的病毒基因组之外)传导细菌细胞中存在质粒的信号，例如氨苄青霉素抗性。载体的其它成分可包括复制起点。可通过常规方法选择这些和其它启动子与载体元件，许多这种序列可获得[参见例如：Sambrook等，以及本文引用的参考文献]。
利用本文提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知技术产生这些载体。这些技术包括如教科书中所述的常规cDNA克隆技术[Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold SpringHarbor Press(冷泉港出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约]、使用腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列、聚合酶链反应和提供所需核苷酸序列的任何合适方法。
III.病毒载体的制造
在一个实施方式中，用猿腺病毒质粒(或其它载体)来产生腺病毒载体。在一个实施方式中，所述腺病毒载体是复制缺陷型腺病毒颗粒。在一个实施方式中，所述腺病毒颗粒由于缺失E1a和/或E1b基因而变得复制缺陷。或者，所述腺病毒通过其它方式变得复制缺陷，任选仍保留E1a和/或E1b基因。所述腺病毒载体的腺病毒基因组中也可包含其他突变，如温度敏感性突变或其它基因缺失。在其它实施方式中，需要在腺病毒载体中保持完整的E1a和/或E1b区。这种完整的E1区可位于腺病毒基因组的天然位置中，或置于天然腺病毒基因组的缺失位点(如E3区)中。
在将基因递送给人(或其它哺乳动物)细胞的有用猿腺病毒载体的构建中，可将一系列腺病毒核酸序列用于该载体。例如，可由形成一部分重组病毒的猿腺病毒序列中清除全部或一部分腺病毒延迟早期基因E3。相信猿E3的功能与重组病毒颗粒的功能和产生无关。也可构建至少E4基因的ORF6区域缺失，更需要整个E4区缺失(因为该区域的功能冗余)的猿腺病毒载体。本发明另一种载体的延迟早期基因E2a中含有缺失。也可在猿腺病毒基因组的晚期基因L1-L5中产生缺失。相似地，中间基因IX和IVa2中的缺失可用于一些目的。可以在其它结构或非结构腺病毒基因组中产生其它缺失。上述缺失可单独使用，即本文所述使用的腺病毒序列可仅在一个区域中含有缺失。或者，可以任何组合形式使用能有效破坏其生物学活性的整个基因或其部分的缺失。例如，在一种示范性载体中，腺病毒序列可缺失E1基因和E4基因，或E1、E2a和E3基因，或E1和E3基因，或E1、E2a和E4基因，缺失或不缺失E3，等等。如上所述，这类缺失可与其它突变，如温敏型突变联用，以实现所需结果。
可以在腺病毒颗粒的病毒感染力和繁殖所需的缺失腺病毒基因产物存在下培养缺少任何必需腺病毒序列(如E1a、E1b、E2a、E2b、E4 ORF6、L1、L2、L3、L4和L5)的腺病毒载体。可以在一种或多种辅助构建物(如质粒或病毒)或包装宿主细胞的存在下培养腺病毒载体，从而提供这些辅助功能。参见例如，通过引用加入本文的1996年5月9日公布的国际专利申请号WO 96/13597中描述的″最小″人Ad载体的制备技术。
1.辅助病毒
因此，根据用于携带小基因的病毒载体的猿腺病毒基因含量，可能需要辅助腺病毒或非复制型病毒片段来提供足够的猿腺病毒基因序列，以便产生含有该小基因的感染性重组病毒颗粒。有用的辅助病毒含有腺病毒载体构建物中不存在和/或转染了载体的包装细胞系不表达的所选腺病毒基因序列。在一个实施方式中，该辅助病毒是复制缺陷型病毒，除上述序列外还含有各种腺病毒基因。这种辅助病毒宜与E1表达细胞系联用。
辅助病毒也可形成聚阳离子偶联物，如Wu等，J.Biol.Chem.，374：16985-16987(1989)；K.J.Fisher和J.M.Wilson，Biochem.J.，299：49(1994年4月1日)所述。辅助病毒可任选地含有第二报道小基因。本领域已知许多这类报道基因。辅助病毒上存在不同于腺病毒载体上的转基因的报道基因能独立监测Ad载体和辅助病毒。用该第二报道物能分开纯化后得到的重组病毒和辅助病毒。
2.补充细胞系
为产生上述任一基因中发生缺失的重组猿腺病毒(Ad)，如果缺失基因区域的功能是病毒复制或感染所必需的，必须通过辅助病毒或细胞系，即补充或包装细胞系向该重组病毒提供该功能。在许多情况下，可利用表达人E1的细胞系反式补充黑猩猩Ad载体。这特别有利，因为，由于本发明黑猩猩Ad序列和目前可得的包装细胞中发现的人AdE1序列之间的差异，使用现有含人E1的细胞能防止复制和产生过程中产生能复制的腺病毒。然而，在某些情况下，可能需要利用表达E1基因产物的细胞系产生E1缺失的猿腺病毒。已经描述过此类细胞系。参见例如，美国专利6,083,716。
如果需要，可利用本文提供的序列产生至少在所选亲代细胞系表达所用启动子的转录控制下表达SAdV41的腺病毒E1基因的包装细胞或细胞系。诱导型或组成型启动子可用于此目的。本说明书中它处详述了这类启动子的例子。选择亲代细胞以产生表达任何所需的SAdV41基因的新细胞系。如果不受限制，这类亲代细胞系可以是HeLa[ATCC登录号CCL 2]、A549[ATCC登录号CCL185]、HEK 293、KB[CCL 17]、Detroit[如Detroit 510，CCL 72]和WI-38[CCL75]细胞等。这些细胞系均可获自位于弗吉尼亚州玛纳萨斯(Manassas，Virginia)20110-2209大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)。其它合适的亲代细胞系可获自其它来源。
这类表达E1的细胞系可用于产生重组猿腺病毒E1缺失型载体。此外或或者，可利用与产生重组猿病毒载体所用方法基本相同的方法构建表达一种或多种猿腺病毒基因产物，如E1a、E1b、E2a和/或E4ORF6的细胞系。这类细胞系可用于反式补充编码这些产物的必需基因中缺失的腺病毒载体，或提供包装辅助依赖性病毒(如腺伴随病毒)所必需的辅助功能。宿主细胞的制备涉及诸如装配选定的DNA序列等技术。可使用常规技术实现这种装配。这种技术包括公知的且描述于前文引用的Sambrook等的著作中的cDNA和基因组克隆、使用腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列，结合聚合酶链式反应、合成方法以及提供所需核苷酸序列的任何其它合适方法。
在另一个替代方式中，通过腺病毒载体和/或辅助病毒反式提供必需腺病毒基因产物。在这种情况下，合适的宿主细胞可选自任何生物，包括原核(例如：细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。特别适合的宿主细胞选自任何哺乳动物物种，包括但不限于以下细胞：A549、WEHI、3T3、10T1/2、HEK 293细胞或PERC6(这二者均表达功能性腺病毒E1)[Fallaux，FJ等，(1998)，Hum Gene Ther，9：1909-1917]、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2以及衍生自哺乳动物，包括人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。提供细胞的哺乳动物种类和哺乳动物细胞类型(即成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等)的选择不是对本发明的限制。
3.病毒颗粒的组装和细胞系的转染
当通过转染递送含有小基因的载体时，通常将约5μg-100μg DNA、优选约10μg-50μg DNA递送给约1×104-1×1013个细胞、优选约1×105个细胞。然而，可根据诸如所选载体、递送方法和所选宿主细胞等因素调整载体DNA与宿主细胞的相对量。
该载体可以是本领域已知或上述任何载体，包括裸DNA、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、病毒等。可通过包括转染和感染在内的本领域已知或上述任何方式将载体引入宿主细胞。一个或多个腺病毒基因可稳定地整合入宿主细胞基因组，作为附加体稳定表达，或者瞬时表达。基因产物可全部瞬时表达，在附加体上或稳定整合；或者，一些基因产物可稳定地表达，而另一些瞬时表达。此外，各腺病毒基因的启动子可彼此独立地选自组成型启动子、诱导型启动子或天然腺病毒启动子。启动子可由生物或细胞的特定生理状态调节(即分化状态或复制或静息细胞)或由(例如)外源添加因子调节。
也可使用技术人员已知和本说明书中讨论的技术将这些分子(如质粒或病毒)引入宿主细胞。在优选实施方式中，采用标准转染技术，如CaPO4转染或电穿孔。
用常规技术将所选腺病毒的DNA序列(以及转基因和其它载体元件)组装入各种中间质粒，并用该质粒和载体产生重组病毒颗粒。这些技术包括如教科书中所述的常规cDNA克隆技术[Sambrook等，同上]、使用腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列、聚合酶链反应和提供所需核苷酸序列的任何合适方法。采用标准的转染和共转染技术，例如CaPO4沉淀技术。所用的其它常规方法包括病毒基因组的同源重组、测定琼脂覆盖层中的病毒空斑、测定信号产生的方法等。
例如，在构建和组装含所需小基因的病毒载体后，在辅助病毒的存在下将该载体体外转染入包装细胞系。在辅助和载体序列之间发生同源重组，这使得载体中的腺病毒转基因序列能被复制并包装到病毒颗粒衣壳中，从而产生重组病毒载体颗粒。目前产生这类病毒颗粒的方法是基于转染的方法。然而，本发明不限于这类方法。
得到的重组猿腺病毒可用于将所选转基因转移到所选细胞中。重组病毒在包装细胞系中增殖的体内实验中，本发明的E1缺失重组猿腺病毒载体证明可用于将转基因转移到非猿细胞中，优选人细胞。
IV.重组腺病毒载体的应用
可用基于重组猿腺病毒-41的载体将基因体外、离体和体内递送给人患者或非猿兽医学患者。
本文所述的重组腺病毒载体可用作体外产生异源基因编码产物的表达载体。例如，可将含插入到E1缺失部位某基因的重组腺病毒载体转染入上述E1表达细胞系中。或者，在另一所选细胞系中采用复制活性腺病毒。然后以常规方法培养转染细胞，使该重组腺病毒从启动子表达基因产物。然后，用已知的常规从培养物中分离和回收蛋白质方法回收培养基中的基因产物。
SAdV41-衍生的重组猿腺病毒载体提供了有效的基因转移载体，其可在体外或离体情况下将所选转基因递送给所选宿主细胞，甚至在该生物已有一种或多种AAV血清型的中和抗体时。在一个实施方案中，rAAV与细胞离体混合，使用常规方法培养感染的细胞，并将转导的细胞输回患者。这些组合物尤其适用于为治疗目的和免疫接种目的递送基因，包括诱导保护性免疫。
更通常的情况是，SAdV-41重组腺病毒载体可用于递送治疗性或免疫原性分子，如上所述。不难理解这两种用途，即本发明的重组腺病毒特别适合涉及反复递送重组腺病毒载体的治疗方案。这类方案一般包括递送病毒衣壳不同的一系列病毒载体。随后各次给药，或者在预选数量的特定血清型衣壳给药次数(如一次、两次、三次、四次或更多次)后改变可病毒衣壳。因此，方案可包括递送rAd与第一猿衣壳、递送rAd与第二猿衣壳和递送第三猿衣壳。本领域技术人员明白，有各种单独利用本发明Ad衣壳，与另一种联用，或与其它腺病毒(优选无免疫交叉反应性)联用的其它方案。这类方案可任选包括给予rAd与其它非人灵长类腺病毒、人腺病毒或人工序列，例如本文所述的衣壳。该方案的各阶段可包括用一种Ad衣壳进行一系列注射(或其它递送途径)，然后用另一种不同Ad来源的衣壳进行一系列注射。或者，所述SAdV-41载体可用于涉及其它非腺病毒介导的递送系统，包括其它病毒系统、非病毒递送系统、蛋白质、肽和其它生物活性分子的方案。
以下章节关注于可通过本发明的腺病毒载体递送的示范性分子。
A.Ad-介导的治疗分子递送
在一个实施方式中，按照已公开的基因治疗方法将上述重组载体给予人。可将携带所选转基因的猿病毒载体给予患者，优选悬浮于生物相容性溶液或药学上可接受的递送载体中。合适的载体包括无菌盐水。已知是药学上可接受的载体且本领域技术人员熟知的其它水性和非水性等渗无菌注射溶液以及水性和非水性无菌混悬液均可用于此目的。
猿腺病毒载体的给予量应足以转导靶细胞并提供足够的基因传送和表达水平以提供疗效而无过度副作用，或有医学上可接受的生理作用，这可由医学领域技术人员确定。常规和药学上可接受的给药途径包括但不限于：直接递送至视网膜和其它眼内递送方法、耳蜗递送(递送至耳)、直接递送至肝、吸入、鼻内、静脉内、肌肉内、气管内、皮下、皮内、直肠、口服、和其它胃肠道外给药途径。如果需要，可根据转基因或病症来组合或调节给药途径。给药途径主要取决于所治疗疾病的特性。
病毒载体的剂量主要取决于以下因素，例如治疗的病症、患者的年龄、体重和健康状况，因此可依患者而改变。例如，治疗有效的病毒载体的成人或兽用剂量通常为约100μL-100mL载体，其中病毒颗粒的浓度为约1x106-1x1015个颗粒，约1x1011-1x1013个颗粒，或约1x109-1x1012个颗粒。剂量范围取决于动物大小和给药途径。例如，适用于肌肉内注射的人用或兽用剂量(约80kg动物)约为一个部位1x109-5x1012个颗粒/毫升。任选地，可递送至多个给药部位。在另一个例子中，适用于口服制剂的人用或兽用剂量可以约为1x1011-1x1015个颗粒。本领域技术人员可根据给药途径、利用该重组载体的治疗或疫苗应用调节这些剂量。可监测转基因或免疫原的表达水平，或循环抗体水平以确定给药频率。本领域技术人员不难了解确定给药频率时间选择的其它方法。
任选的方法步骤包括给予该病毒载体的同时、之前、之后共同给予患者合适量的短时作用免疫调节剂。本文将所选的免疫调节剂定义为能抑制针对本发明重组载体的中和抗体产生的制剂，或能抑制该载体的溶细胞性T淋巴细胞(CTL)消除的制剂。此免疫调节剂可干扰T辅助细胞亚组(TH1或TH2)和B细胞之间的相互作用，从而抑制中和抗体形成。或者，该免疫调节剂可抑制TH1细胞和CTL之间的相互作用从而降低载体的CTL消除作用。各种有用的免疫调节剂和其使用剂量已公开，见例如，Yang等，J.Virol.，70(9)(1996年9月)；1996年5月2日公开的国际专利申请WO96/12406；和国际专利申请PCT/US96/03035，均通过引用纳入本文。
1.治疗性转基因
转基因编码的有用治疗产物包括激素与生长因子和分化因子，包括但不限于：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生产素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子超家族中的任一个(包括TGF、活化素、抑制素)、或骨形态发生蛋白(BMP)BMP1-15中的任一个、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一个、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(neurturin)、聚集蛋白、脑信号蛋白/瓦解蛋白家族的任一个、导蛋白-1和导蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、sonic hedgehog蛋白和酪氨酸羟化酶。
其它有用的转基因产物包括调节免疫系统的蛋白质，包括但不限于：细胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-1到IL-25(包括，例如：IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞化学诱导蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子和干扰素、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些产物包括但不限于：免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子，以及经工程改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包括补体调节蛋白质，例如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
其它有用的基因产物包括激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白质和免疫系统蛋白质等的受体中的任一种。本发明包括胆固醇调节的受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清除受体。本发明也包括以下基因产物：例如类固醇激素受体超家族的成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其它核受体。此外，有用的基因产物包括转录因子，例如jun、fos、max、mad、血清应答因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成蛋白、含ETS-盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT-盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、维尔姆斯肿瘤蛋白、ETS-结合蛋白、STAT、GATA-盒结合蛋白，例如GATA-3和翼状螺旋蛋白的叉头蛋白家族。
其它有用的基因产物包括氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨基琥珀酸合成酶、精氨基琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰-CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰-CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧酸盐、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)序列和抗肌萎缩蛋白cDNA序列。
其它有用的基因产物包括非天然产生的多肽，例如具有非天然产生的氨基酸序列的嵌合或杂交多肽，所述非天然产生的氨基酸序列含有插入、缺失或氨基酸取代。例如，经单链改造的免疫球蛋白可用在某些免疫低下患者中。其它类型的非天然产生的基因序列包括反义分子和催化性核酸，例如核酶，可用于降低靶标的过表达。
降低和/或调节基因表达对治疗以细胞过度增殖为特征的过度增殖性疾病，例如癌症和银屑病尤其理想。靶多肽包括，与正常细胞相比，仅在过度增殖细胞中产生或在过度增殖细胞中以更高水平产生的多肽。靶抗原包括癌基因，例如myb、myc、fyn和易位基因如bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的多肽。除了作为靶抗原的癌基因产物，用于抗癌治疗和保护性治疗方案的靶多肽包括B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在某些实施方式中，它们也用作自身免疫疾病的靶抗原。其它肿瘤相关多肽也可用作靶多肽，例如肿瘤细胞中水平较高的多肽，包括单克隆抗体17-1A所识别的多肽和叶酸结合多肽。
其它合适的治疗性多肽和蛋白质包括通过赋予抗自身免疫相关靶标的广谱基础保护性免疫应答来治疗患自身免疫疾病和紊乱的个体的多肽和蛋白，所述自身免疫相关靶标包括细胞受体和产生“自我”定向抗体的细胞。T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、斯耶格伦综合征、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳肉芽肿病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。这些疾病均以结合内源性抗原并引发自身免疫疾病相关炎性级联反应的T细胞受体(TCR)为特征。
本发明的猿腺病毒载体特别适合需要多种腺病毒介导的转基因递送的治疗方案，例如，包括再次递送相同转基因的方案或包括递送其它转基因的组合方案。这类方案可包括给予SAdV41猿腺病毒载体，然后再次给予相同血清型腺病毒的载体。特别理想的方案包括给予SAdV41猿腺病毒载体，其中第一次给予的载体的腺病毒衣壳序列的来源不同于一次或多次后续给药中所用病毒载体的腺病毒衣壳序列的来源。例如，治疗方案包括给予SAdV41载体和重复给予一种或多种血清型相同或不同的腺病毒载体。在另一个实施例中，治疗方案包括给予一种腺病毒载体，随后反复给予SAdV41载体，所述载体的衣壳来源不同于第一次递送的腺病毒载体的衣壳，并任选还给予来源相同，或优选不同于前一次给药步骤中载体腺病毒衣壳的另一种载体。这些方案不限于递送用SAdV41猿序列构建的腺病毒载体。而且，这些方案可容易地采用其它腺病毒序列，包括但不限于其它猿腺病毒序列(如Pan9或C68、C1等)，其它非人灵长类腺病毒序列或人腺病毒序列，与SAdV41载体中的一种或多种联用。本文件中它处讨论了这种猿、其它非人灵长类和人腺病毒血清型的例子。另外，这些治疗方案包括同时或依次递送SAdV41腺病毒载体，联用非腺病毒载体、非病毒载体和/或各种其它治疗上有用的化合物或分子。本发明不限于这些治疗方案，本领域技术人员不难明白这些方案的不同。
B.Ad-介导免疫原性转基因的递送
所述重组SAdV-41载体也可用作免疫原性组合物。本文所用的免疫原性组合物是这样一种组合物，将其递送给哺乳动物，优选灵长类后，能针对其所递送的转基因产物产生体液(如抗体)或细胞(如细胞毒T细胞)免疫应答的。重组猿Ad在其任意腺病毒序列中可含有编码所需免疫原的基因缺失。与人来源的腺病毒相比，这种猿腺病毒可能更适合用作不同种动物的重组活病毒疫苗，但不仅限于此用途。重组腺病毒可用作任何病原体的预防性或治疗性疫苗，对于该病原体，已鉴定到对诱导免疫应答至关重要且能够限制其传播的抗原，并可获得其cDNA。
这类疫苗(或其它免疫原性)组合物配制在合适的递送载体中，如上所述。通常，免疫原性组合物的剂量在上述治疗组合物的剂量范围内。可监测所选基因的免疫水平，以确定是否需要加强免疫(如果有的话)。评估血清中的抗体滴度后，可能需要任选的加强免疫。
可任选将本发明疫苗组合物配制成含有其它组分，包括例如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。疫苗领域技术人员熟知这类组分。合适佐剂的例子包括但不限于脂质体、明矾、单磷酰脂质A和任何生物学活性因子，如细胞因子、白介素、趋化因子、配体和其优化组合。可通过(例如)质粒或病毒载体在体内表达所述的某些生物活性因子。例如，这类佐剂可与编码抗原的初免DNA疫苗一起给予，以便与只用编码该抗原的DNA疫苗初免后产生的免疫应答相比增强抗原特异性免疫应答。
以“免疫原性量”给予重组腺病毒，即，重组腺病毒的用量在给药途径中能够有效转染所需细胞并且提供的所选基因表达水平足以诱导免疫应答。提供保护性免疫时，认为该重组腺病毒是用于防止感染和/或疾病复发的疫苗组合物。
或者，或此外，本发明的载体可含有编码能诱导针对所选免疫原的应答的肽、多肽或蛋白质的转基因。预计重组SAdV-41载体能高度有效地诱导针对插入的该载体表达的异源抗原蛋白的溶细胞性T细胞和抗体。
例如，免疫原可选自各种病毒科。需要免疫应答来抵御的病毒科的实例包括：小RNA病毒科，其包括导致约50％普通感冒病例的鼻病毒属；肠病毒属，其包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒和人肠病毒(例如甲肝病毒)；以及口疮病毒属，其主要在非人动物中导致口蹄疫。在小RNA病毒科内，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。另一病毒科包括杯状病毒科，包括诺沃克病毒群体，它是流行性胃肠炎的重要病原体。另一种对于用于靶向抗原从而在人或非人动物中诱导免疫应答的理想病毒科是披膜病毒科，包括甲型病毒属，该甲型病毒属包括辛德毕斯病毒、罗斯河病毒、和委内瑞拉、东部和西部马脑炎病毒和风疹病毒属，包括风疹病毒。黄病毒科包括登革热、黄热、日本脑炎、圣路易斯脑炎和蜱媒性脑炎病毒。其它靶抗原可从丙型肝炎或冠状病毒科产生，包括许多非人病毒，例如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠冠状病毒(猫)、狗冠状病毒(狗)和可导致普通感冒和/或非-甲型、乙型或丙型肝炎的人呼吸冠状病毒。在冠状病毒科内，靶抗原包括E1(也称为M或基质蛋白)、E2(也称为S或突起蛋白)、E3(也称为HE或血凝素-依尔替糖)、糖蛋白(并非所有冠状病毒中都有)或N(核衣壳)。其它抗原可靶向弹状病毒科，包括水疱病毒属(例如：疱疹口炎病毒)和狂犬病病毒属(例如：狂犬病)。
在杆状病毒科内，适当的抗原可源于G蛋白或N蛋白。包括出血热病毒例如马尔堡和埃博拉病毒在内的丝状病毒科可能是合适的抗原来源。副黏病毒科包括1型副流感病毒、3型副流感病毒、3型牛副流感病毒、腮腺炎病毒(流行性腮腺炎病毒)、2型副流感病毒、4型副流感病毒、新城疫病毒(鸡)、牛瘟病毒、麻疹病毒(包括麻疹和犬瘟热)，以及肺病毒(包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒分在正黏病毒科内，并且是抗原(例如：HA蛋白、N1蛋白)的合适来源。布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎，拉克罗斯脑炎)、白蛉热病毒属(裂谷热)、汉坦病毒属(普马拉是海玛哈金(hemahagin)热病毒)、内罗毕病毒属(内罗毕绵羊病)和各种未命名的银环蛇病毒(bungavirus)。沙粒病毒科提供抗LCM和拉沙热病毒的抗原来源。呼肠孤病毒科包括呼肠孤病毒属、轮状病毒属(其导致儿童急性肠胃炎)、环状病毒属和科罗拉多蜱热病毒属(科罗拉多蜱热病毒属、莱氏(Lebombo)病毒属(人)、马变性脑病病毒属、蓝舌病病毒属)。
逆转录病毒科包括致肿瘤RNA病毒亚科，该亚科包括人和兽医疾病，例如猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒亚科(包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、犬感染性贫血病毒和泡沫病毒亚科)。在慢病毒中，已经描述且不难选择许多合适抗原。合适的HIV和SIV抗原的实例包括但不限于gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef和Rev蛋白，及其各种片段。例如，Env蛋白的合适片段可包括其任何亚基，如gp120、gp160、gp41或其较小片段，如，长度至少约为8个氨基酸的片段。相似地，可选择tat蛋白的片段。[参见美国专利5,891,994和美国专利6,193,981。]还参见，在D.H.Barouch等，J.Virol.，75(5)：2462-2467(2001年3月)和R.R.Amara等，Science，292：69-74(2001年4月6日)中所描述的HIV和SIV蛋白。在另一个例子中，可利用HIV和/或SIV免疫原性蛋白质或肽形成融合蛋白或其它免疫原性分子。.参见例如，2001年8月2日公开的WO 01/54719和1999年4月8日公开的WO 99/16884所述的HIV-1 Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本发明不限于本文所述的HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽。此外，已经描述过对这些蛋白的各种修饰，本领域技术人员不难进行这些修饰。参见，例如：在美国专利5,972,596中描述了修饰的gag蛋白。另外，任何所需的HIV和/或SIV免疫原均可单独或联合递送。这类组合可包括由一种载体或多种载体表达。任选地，另一种联合递送可包括递送一种或多种表达的免疫原与递送一种或多种蛋白质形式的免疫原。下面更详细地讨论这种联合。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头瘤病毒亚科(与癌症或乳头瘤的恶性进展有关)。腺病毒科包括导致呼吸疾病和/或肠炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫全白细胞减少病病毒、狗细小病毒和猪细小病毒科。疱疹病毒科包括α-疱疹病毒亚科，其中包括单纯疱疹病毒属(HSVI，HSVII)、水痘病毒属(假性狂犬病、水痘带状疱疹)和β-疱疹病毒亚科包括巨细胞病毒属(HCMV，鼠巨细胞病毒)和γ-疱疹病毒亚科包括淋巴隐病毒属、EBV(伯基特淋巴瘤)、传染性鼻气管炎、马雷克病病毒和鼻病毒。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科，包括正痘病毒属(天花和牛痘病毒)、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属和昆虫痘病毒亚科。嗜肝DNA病毒科包括乙肝病毒。可能是合适抗原来源的一种未分类病毒是丁型肝炎病毒。其他的病毒来源包括鸟感染性粘液囊病病毒和猪呼吸和生殖综合征病毒。甲型病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
用于免疫人或非人动物的抗其他病原体的免疫原包括，例如，感染人和非人脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或来自癌细胞或肿瘤细胞的病原体。细菌病原体的例子包括致病性革兰阳性球菌，包括肺炎双球菌；葡萄球菌；和链球菌。致病性革兰阴性球菌包括脑膜炎球菌、淋球菌。致病性肠革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌科；假单胞菌属、不动杆菌属和埃肯菌属；类鼻疽假单孢菌属；沙门菌属；志贺菌属；嗜血杆菌属：莫拉菌属；杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)(其导致软下疳)；布鲁杆菌；野兔热弗朗西丝菌(Franisellatularensis)(其导致兔热病)；耶尔森菌属(巴斯德菌属)；念珠状链杆菌和螺菌属；革兰阳性杆菌，其包括单核细胞增多李斯特菌；红斑丹毒丝菌；白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)(白喉)；霍乱；炭疽杆菌(B.anthracis)(炭疽)；多诺万病(腹股沟肉芽肿)和巴尔通体病。致病性厌氧菌引起的疾病包括破伤风；肉毒中毒；其它梭菌病；结核病；麻风病；和其它分枝杆菌病。致病性螺旋体疾病包括梅毒；密螺旋体病：雅司病、品他病和地方性梅毒；以及钩端螺旋体病。较高致病性细菌和致病性真菌导致的其他感染包括放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、石样真菌病、球拟酵母病、足分枝菌病和着色真菌病；以及皮真菌病。立克次体感染包括斑疹伤寒热、落矶山斑疹热、Q热和立克次氏体痘。支原体和衣原体感染的实例包括：支原体肺炎、性病性淋巴肉芽肿、鹦鹉热和围产期衣原体感染。致病性真核细胞包括致病性原生动物和蠕虫，并且由其产生的感染包括：阿米巴病、疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形体病、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、Trichans、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、巴贝虫病、贾第虫病、旋毛虫病、丝虫病、血吸虫病、线虫、吸虫(trematode)或吸虫(fluke)感染和绦虫(绦虫)感染。
这些生物体和/或其产生的毒素中有许多已被疾病控制中心[(CDC)，健康与人类服务部(Department of Heath and Human Services)，美国]认定为是可用于生物攻击的物质。例如，某些此类生物物质包括目前分类为A类物质的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒杆菌毒素)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、大天花(天花)、野兔热弗朗西丝菌(Franisella tularensis)(兔热病)和病毒性出血热[丝状病毒(例如：埃博拉病毒、马尔堡病毒)和沙粒病毒[例如：拉沙病毒、马丘博病毒]；目前分类为B类物质的伯内特科克斯立克次体(Coxiella burnetti)(Q热)、布鲁杆菌(布鲁杆菌病)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)(类鼻疽)、蓖麻(Ricinus communis)及其毒素(蓖麻蛋白毒素)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌(Staphylococcus)及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(鹦鹉热)、水安全性威胁(如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、细小隐孢子菌(Cryptosporidiumparvum))、斑疹伤寒(普氏立克氏体(Richettsia powazekii))和病毒性脑炎(如α-病毒如委内端拉马脑炎、东方马脑炎、西方马脑炎；所有这些目前分类为B类病原；和日本病毒与汉坦病毒，其目前分类为C类病毒。此外，其他如此分类或不同分类的生物体也可能在将来可被鉴定和/或用于这种目的。容易理解的是，本文所述的病毒载体和其他构建体可用于传递来自这些生物体的抗原、病毒、其毒素或其他副产物，这可预防和/或治疗这些生物物质引起的感染或其它不良反应。
预计施用SAdV-41载体来递送抗T细胞可变区的免疫原能引发包括CTL在内的免疫应答来消除T细胞。在RA中，已鉴定了参与该疾病的数种特定TCR可变区。这些TCR包括V-3、V-14、V-17和Va-17。因此，递送编码这些多肽中至少一种的核酸序列将引发以参与RA的T细胞为目标的免疫应答。在MS中，已鉴定了参与该疾病的数种特定TCR可变区。这些TCR包括V-7和Va-10。因此，递送编码这些多肽中至少一种的核酸序列将引发以参与MS的T细胞为靶点的免疫应答。在硬皮病中，已鉴定了参与该疾病的数种特定TCR可变区。这些TCR包括V-6、V-8、V-14和Va-16、Va-3C、Va-7、Va-14、Va-15、Va-16、Va-28和Va-12。因此，递送编码这些多肽中至少一种的重组猿腺病毒将引发以参与硬皮病的T细胞为目标的免疫应答。
C.Ad-介导的递送方法
可监测所选基因的治疗水平或免疫力水平，以确定对加强免疫的需求(如果有的话)。评估血清中的CD8+T细胞应答，或任选评估血清中的抗体效价后，可能需要任选的加强免疫。任选地，可以单独给药或各种联合给药方案来递送重组SAdV-41载体，例如，与包括其它活性成分的方案或疗程联用或在初免-加强方案中递送。本领域已经描述过各种方案，不难进行选择。
例如，初免-加强方案可包括给予DNA(如质粒)载体，以使免疫系统对第二次加强给予传统抗原，如蛋白质或携带编码这种抗原的序列的重组病毒产生免疫力。参见例如，通过引用纳入本文的2000年3月2日公开的WO 00/11140。或者，免疫方案可包括给予重组SAdV-41载体以加强对携带抗原或蛋白质载体(病毒或DNA载体)的免疫应答。在另一个替换方式中，免疫方案包括给予蛋白质后用编码抗原的载体加强。
在一个实施方式中，描述的对所选抗原的初次和加强免疫应答的方法是通过递送载有所述抗原的质粒DNA载体，然后用重组SAdV-41载体加强。在一个实施方式中，该初免-加强方案包括表达初免和/或加强载体携带的多种蛋白质。见例如，R.R.Amara，Science，292：69-74(2001/4/6)，其描述了表达用于对HIV和SIV产生免疫应答的蛋白亚单位的多蛋白方案。例如，DNA初免时通过一种转录物递送Gag、Pol、Vif、VPX和Vpr和Env、Tat和Rev。或者，可在重组SAdV-41腺病毒构建物中递送SIV Gag、Pol和HIV-1 Env。其它方案见WO 99/16884和WO 01/54719。
然而，初免-加强方案不限于HIV的免疫或递送这些抗原。例如，初免可包括递送第一SAdV-41载体，然后用第二Ad载体或含有蛋白质形式的该抗原的组合物加强。在一个实例中，初免-加强方案可提供针对产生该抗原的病毒、细菌或其它生物体的保护性免疫应答。在另一实施方式中，初免-加强方案提供可用检测所治疗病症的存在的常规试验测定的疗效。
初免组合物可以剂量依赖性方式给予身体的不同部位，这取决于所需免疫应答靶向的抗原。本发明不受注射量或部位，或药物载体的限制。另外，该方案可包括初免和/或加强步骤，各步骤可包括每小时、每天、每周、每月或每年给予的单次给药或剂量。例如，该哺乳动物可接受载体中含有约10μg-50μg质粒的一个或两个剂量。DNA组合物的所需用量约为1μg-10,000μg DNA载体。剂量可以在约1-1000μg DNA/kg对象体重的范围中变化。宜根据哺乳动物的种类和条件选择递送量或递送部位。
本文描述了适合将该抗原递送给哺乳动物的载体的剂量单位。可通过悬浮或溶解于药学或生理学上可接受的运载体如等渗盐水；等渗盐溶液或本领域技术人员已知用于这类给药中的其它制剂中，制备给药载体。本领域技术人员了解合适的载体，载体的种类主要取决于给药途径。可按照上述途径将本文所述组合物给予哺乳动物，例如在采用可生物降解的生物相容性聚合物的缓释制剂中递送，或用胶束、凝胶和脂质体原位(on-site)递送。任选地，初免步骤也包括给予初免组合物、合适量的佐剂，如本文所述。
优选地，将初免组合物给予哺乳动物对象约2-27周后，给予加强组合物。用有效量的含有或能够递送与初免DNA疫苗所给抗原相同的抗原的加强组合物给予该加强组合物。该加强组合物由衍生自同一病毒来源(如本发明腺病毒序列)或另一来源的重组病毒载体组成。或者，该“加强组合物”可以是含有初免DNA疫苗编码的相同但是蛋白或多肽形式的抗原的组合物，此组合物可在宿主中诱导免疫应答。在另一实施方式中，该加强组合物含有编码抗原的DNA序列，例如载体，如熟知的细菌或病毒载体，所述DNA序列受指导其在哺乳动物细胞中表达的调节序列的控制。对加强组合物的主要要求是：该组合物的抗原是与初免组合物编码抗原相同的或能交叉反应的抗原。
在另一实施方式中，所述SAdV-41载体也适合用于各种免疫和治疗方案。这类方案可包括与不同血清型衣壳的Ad载体同时或依次递送SAdV-41载体的方案，与非Ad载体同时或依次递送SAdV-41载体的方案，与蛋白质、肽和/或其它有生物活性的治疗或免疫原性化合物同时或依次递送SAdV-41载体的方案。本领域技术人员不难理解这些应用。
以下实施例将阐明SAdV-41的克隆和示范性重组SAdV-41载体的构建。这些实施例只是为了说明而非限制本发明的范围。
实施例1-猿腺病毒41的分离和PCR分析
从美国的9个不同动物园获得各种巨猿(great ape)的粪便样品。从布法罗的大猩猩分离SAdV-41.1。
从饲养动物的设施的地板回收粪便样品，冷冻送至宾夕法尼亚州大学。将样品解冻，悬浮在汉克斯平衡盐溶液中，离心沉淀颗粒物，经0.2微米注射滤器作无菌过滤。将各100ml的过滤样品接种入在含10％FBS、1％青霉素-链霉素和50mg/ml庆大霉素的Ham F12中培养的A549细胞。培养约1-2周后，具有数个接种物的细胞培养物中明显有可见的致细胞病变效应(CPE)。PCR扩增六邻体的内部1.9kb(包含超变区(HVR)和主要负责赋予血清型特异性的区域)证实培养物中有腺病毒存在。用于PCR的引物对是CAGGATGCTTCGGAGTACCTGAG[SEQ ID NO：32]和TTGGCNGGDATDGGGTAVAGCATGTT[SEQ ID NO：33]。利用自该区域获得的序列初始测定腺病毒种类和血清型的新颖性。确定该序列是亚组B腺病毒的成员。
所测定的新型腺病毒分离物在A549细胞上作噬斑纯化，增殖至高滴度，采用标准氯化铯梯度方法纯化。完全测序纯化病毒制备物的病毒DNA(德国希尔登的凯杰基因组服务公司(Qiagen Genomic services，Hilden，Germany))。
按照保密条款，随后将得到的猿腺病毒41.1基因组序列保藏于GenBank，登录号为FJ025913，直至本申请提交后。
采用相似的方法，分离在亚特兰大饲养的大猩猩的猿腺病毒41.2(完整基因组)。按照保密条款，将该序列保藏于GenBank，登录号为FJ025927，直至本申请提交后。
实施例2-利用SAdV41.1构建载体
可利用SAdV-41制备E1缺失的载体。由于公开的报道和发明人对于AdC1的经验均表明HEK293细胞中Ad5 E1基因不能弥补亚组B腺病毒中的E1缺失，可利用依据利用AdC1的策略[Roy等.，J Virol.Methods.(2007)141，14-21；Roy等.，J Gen Virol.(2006)87，2477-2485]的杂交腺病毒，其中嵌合构建物的左右末端衍生自黑猩猩腺病毒Pan 5(a.k.a.猿腺病毒22)。
利用的亚组E腺病毒是SAdV-36，其在2009年3月3日提交的，通过引用纳入本文的国际专利申请号中有描述。起始质粒是E1-缺失SAdV36-pC36IP的分子克隆。
A.构建质粒(p)C36Asc-Not以便产生杂交腺病毒载体
C36正向-SEQ ID NO：66]gatcGGCGCGCCACGCGTGCGGCCGCttacaggattcgagcagttatt和C36反向-CTGGCCCTGTGGTTCCGCAG[SEQ IDNO：67]用于产生763bp片段，pC36IP用作模板。PCR片段E4 orf 6/7的末端以及编码AscI MluI和NotI的限制性位点的5’延伸。
用AscI和Acc65I消化PCR片段，连接入用同-酶切割的pC36 IP以产生pC36Asc-Not。用SmaI检测小量制备物以证实存在预期的片段。进一步检测该小量制备物以证实存在AscI、MluI和NotI位点。
B.根据SAdV-41构建E1-缺失腺病毒载体
利用以下引物产生4972bp片段，SAdV41.1(克隆DP957)用作模板：C41正向-gatcACGCGTtaacgcaggtgta cagctgg[SEQ ID NO：68]和C41反向-[SEQ ID NO：69]：CATGacgcgtACTGATTTTTCAATAAAAAGTTAAATTTATTTTTGTTGTC(Phusion聚合酶，55℃退火，2分钟延伸，30轮)。该PCR引物含有MluI位点以便插入pAsc-Not的MluI位点。
将SAdV-41.1的AscI(7936)-BsrGI片段插入如以上部分A所述制备的pC36 Asc-Not。质粒pC36/41 IP含有侧接PacI限制性位点的嵌合腺病毒基因组(在SAdV-36和SAdV-41.1之间嵌合)。从ITR向AscI位点(bp 6047号处)延伸的左末端源自SAdV-36。SAdV-36的E1基因缺失，在其位置插入了酶I-CeuI和PI-SceI的限制性位点以便插入转基因盒。从NotI位点向ITR延伸的右末端也源自SAdV-36。其包含E4基因。SAdV-41.1基因组存在于AscI和NotI位点之间。在SAdV-36和SAdV-41.1之间的AscI位点的融合产生嵌合型开放读框(编码DNA聚合酶)。
将设计表达FluA NP的转基因盒连接在pC36/41 IP的I-CeuI和PI-SceI位点之间。编码H1N1甲型流感病毒核蛋白(NP)(A/Puerto Rico/8/34/MountSinai，GenBank登录号AF389119.1)的核苷酸序列经密码子优化并完全合成(赛尔技术基因公司(Celtek Genes)，纳什维尔，田纳西州)。在穿梭质粒中构建表达盒(约2.5kb)，该表达盒由人巨细胞病毒早期启动子、源自威斯康星州麦迪逊市普洛迈格公司(Promega，Madison，Wisconsin)的质粒pCi的人工内含子、密码子优化的甲型流感NP编码序列和牛生长激素多聚腺苷酸化信号构成。
将得到的质粒转染入HEK293细胞，观察到致细胞病变效应表明成功拯救了依据SAdV-41.1的重组腺病毒载体，其设计用于转导细胞以便表达FluA抗原。通过氯化铯密度梯度离心纯化腺病毒，通过检测260和280nm吸光度测定颗粒滴度(particle titer)。
可采用Roy等，[″单剂量的表达核蛋白的黑猩猩腺病毒载体对小鼠的H5N1流感有部分保护作用(Partial protection against H5N1 influenza in micewith a single dose of a chimpanzee adenovirus vector expressingnucleoprotein)″，Vaccine 25：6845-6851(2007年8月6日)]所述方案，通过得到的重组腺病毒评估T细胞诱导作用，该篇文献通过引用纳入本文。
以上引用的所有文件，序列表和以下美国临时专利申请号的全部内容通过引用纳入本文：61/182,290(2009年5月29日提交)和61/219,917(2009年6月24日提交)。许多改进和改变包括在以上说明书的范围内，预计是本领域技术人员显而易见的。对组合物和方法的此类改进和改变，例如不同小基因的选择或载体或免疫调节剂的选择或剂量应落在随附权利要求的范围内。
表3
(比较SAdV-41.2与SAdV-41.1的核苷酸序列)
该表格比对了SEQ ID NO：1(SAdV-41.1)和34(SAdV-41.2)的核苷酸序列。核苷酸比对位置1对应于SEQ ID NO：1和34的核苷酸1。如果一个分离物不含序列，而另一个具有插入物，则利用虚线(-)。如果序列相同，表中不提供信息。
表4
(序列表自由文本)
以下提供在数字符号<223>下含有自由文本的序列的信息。

Claims (11)

1.一种重组腺病毒，其衣壳具有SAdV-41的六邻体蛋白，SAdV-41.1或SAdV-41.2的五邻体蛋白和SAdV-41.1或SAdV-41.2的尾丝蛋白，所述衣壳使异源分子衣壳化，所述SAdV-41六邻体蛋白的序列由SEQ ID NO:11的氨基酸1-943构成，所述SAdV-41.1的五邻体蛋白由SEQ ID NO:6的氨基酸1-584构成，所述SAdV-41.2的五邻体蛋白由SEQ ID NO:39的氨基酸1-584构成，所述SAdV-41.1的尾丝蛋白由SEQ ID NO:21的氨基酸1-321构成，所述SAdV-41.2的尾丝蛋白由SEQ ID NO:54的氨基酸1-321构成，所述异源分子携带操作性连接于表达控制序列的基因，而所述表达控制序列指导所述基因在宿主细胞中转录、翻译和/或表达。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒还包含复制和衣壳化所需的5’和3’腺病毒顺式元件。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒缺乏所有或部分的E1基因。
4.如权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒是复制缺陷型的。
5.如权利要求1所述的重组腺病毒，其衣壳包含序列如SEQ ID NO:11的氨基酸1-943所示的SAdV-41.1的六邻体蛋白，序列如SEQ ID NO:6的氨基酸1-584所示的SAdV-41.1的五邻体蛋白和序列如SEQ ID NO:21的氨基酸1-321所示的SAdV-41.1的尾丝蛋白。
6.如权利要求1所述的重组腺病毒，其衣壳包含序列如SEQ ID NO:44的氨基酸1-943所示的SAdV-41.2的六邻体蛋白，序列如SEQ ID NO:39的氨基酸1-584所示的SAdV-41.2的五邻体蛋白和序列如SEQ ID NO:54的氨基酸1-325所示的SAdV-41.2的尾丝蛋白。
7.如权利要求1所述的重组腺病毒，其衣壳包含序列如SEQ ID NO:6的氨基酸1-584所示的SAdV-41.1五邻体蛋白和序列如SEQ ID NO:54的氨基酸1-325所示的SAdV-41.2的尾丝蛋白。
8.如权利要求1所述的重组腺病毒，其衣壳包含序列如SEQ ID NO:39的氨基酸1-584所示的SAdV-41.2的五邻体蛋白和序列如SEQ ID NO:21的氨基酸1-321所示的SAdV-41.1的尾丝蛋白。
9.一种组合物，其在药学上可接受的载体中包含权利要求1-8中任一项所述的重组腺病毒。
10.权利要求1-8中任一项所述的重组腺病毒用于制造药物的用途，所述药物靶向具有腺病毒受体的细胞。
11.一种分离的猿腺病毒41(SAdV-41)核酸，其选自下组：SEQ ID NO:1的核酸1-35100、其互补序列、对应于其的cDNA和RNA，和SEQ ID NO:34的核酸1-35767、其互补序列、对应于其的cDNA和RNA。
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