ES2478625T3 - Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos - Google Patents

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Abstract

Un método para cultivar eficientemente un adenovirus quimérico en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico procedente de una cepa de adenovirus parental incapaz de crecimiento eficiente en la citada célula anfitrión, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) generar un adenovirus quimérico que comprende: (i) secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo y del extremo terminal derecho de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región de extremo izquierdo las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5', y comprendiendo dicha región de extremo derecho las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 3', y (ii) las regiones internas de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5' y 3' naturales, comprendiendo dichas regiones internas los genes tardíos que codifican la penton, la hexon y la fibra; en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5' hasta 3', una región terminal izquierda del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y la región terminal derecha del primer adenovirus, y (b) cultivar dicho adenovirus quimérico en presencia de genes E1a, E1b y E4 ORF6 de adenovirus funcional procedentes del primer adenovirus o de un serotipo de adenovirus que transcomplementa el primer adenovirus, y además en presencia de genes estructurales adenovirales necesarios procedentes del extremo izquierdo del adenovirus.

Description

Método de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos.
Antecedentes de la invención
La presencia de inmunidad humoral (anticuerpos circulantes) respecto a proteínas de cápside de adenovirus es una barrera al uso de vectores de adenovirus para terapia de gen. Los vectores prototipo de adenovirus que han sido desarrollados para terapia de gen se basan en adenovirus del subgrupo C, como el serotipo 5. La prevalencia de anticuerpos neutralizantes frente a adenovirus del subgrupo C es generalmente alta en poblaciones humanas como resultado de una exposición frecuente a esos patógenos. Este hecho es probable que limite en gran medida la efectividad de los vectores de terapia de gen basados en serotipos tales como el Ad5.
El análisis de la naturaleza de los anticuerpos protectores frente a los adenovirus, ha indicado que el objetivo más importante es la hexon, la proteína de cápside principal [Wolfhart (1986), J. Virol 62, 2321; Gall et al. (1986), J. Virol. 70, 2116]. Se han realizado diversos esfuerzos para diseñar la hexon de modo que se puedan evadir los anticuerpos anti-hexon construyendo adenovirus quiméricos que acojan las hexones desde otros serotipos [Roy et al., (1998), J. Virol. 72, 6875; Patente U.S. núm. 5.922.315; Gall et al., (1998), J. Virol. 72, 10260; Youil et al., (2002), Hum. Gene Ther. 13, 311; Wu et al., (2002), J. Virol. 76, 12775]. Sin embargo, esto ha sido infructuoso en gran medida cuando se intentan intercambios entre serotipos distantes.
El documento WO 00/03029 describe métodos para generar adenovirus híbridos, por ejemplo para alterar la inmunogenicidad del adenovirus. En un ejemplo, un adenovirus quimérico tiene una proteína de fibra de un serotipo con una hexon o una penton o con otro serotipo.
Youil, Journal Virology, Hum. Gene Therapy, vol. 13, núm. 2 (20 de Enero de 2002), describe intentos de realización de una diversidad de vectores basados en adenovirus-5 quiméricos. Mientras que fueron rescatables en cuatro vectores en los que los hexones de Ad1, Ad2, Ad6 o Ad12 están incorporados en el lugar del Ad5, los 14 intentos restantes para formar vectores adenovirales quiméricos a partir de los subgrupos A, B, C, D y E no tuvieron éxito.
Alternativamente, los investigadores han propuesto usar vectores de adenovirus que raramente causan infecciones humanas o hacen uso de adenovirus de fuentes no humanas. Sin embargo, la falta de una manera práctica en la que se produzcan grandes cantidades de tales vectores ha demostrado ser un obstáculo para el desarrollo de tales vectores.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método de modificación de adenovirus que tienen cápsides, y en particular, que incluyen hexones, procedentes de serotipos que no están bien adaptados para su crecimiento en células para producción de virión adenoviral. El método es útil para la producción de cantidades escalables de adenovirus. Los genomas de adenovirus quiméricos resultantes son útiles para una diversidad de propósitos que se describen en la presente memoria.
Más en particular, la invención proporciona, en un aspecto, un método de cultivo eficiente de un adenovirus quimérico en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico procedente de una cepa de adenovirus parental incapaz de un crecimiento eficiente en dicha célula anfitrión, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) generar un adenovirus quimérico que comprenda: (i) secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo y del extremo terminal derecho de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región extrema izquierda repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5’, y comprendiendo dicha región extrema derecha repeticiones terminales invertidas (ITRs) 3’; y, (ii) las regiones internas forman un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones internas los genes tardíos que codifican la penton, la hexon, y la fibra, en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ hasta 3’, una región terminal izquierda del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y la región terminal derecha del primer adenovirus; y, (b) cultivar dicho adenovirus quimérico en presencia de genes ORF6 de los adenovirus funcionales de E1a, E1b y E4 a partir del primer adenovirus o de un serotipo de adenovirus que transcomplementa el primer adenovirus, y además en presencia de genes estructurales adenovirales necesarios procedentes del extremo izquierdo del adenovirus.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para la generación de un adenovirus quimérico para su crecimiento en una célula anfitrión seleccionada, estando dicho adenovirus quimérico derivado de una cepa de adenovirus parental que es incapaz de un crecimiento eficiente en dicha célula anfitrión, comprendiendo dicho método la etapa de generar un adenovirus quimérico que comprende: regiones terminales 5’ y 3’ de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dichas regiones terminales 5’ las repeticiones terminales invertidas (ITRs) y funciones de gen E1 necesarias, y comprendiendo dichas regiones terminales 3’ repeticiones termines invertidas (ITRs) y funciones de gen E4 necesarias; y, regiones internas de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones la
hexon, una base de penton y fibra, en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ hasta 3’, la región terminal del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y las regiones terminales 3’ del primer adenovirus.
La invención proporciona también un adenovirus quimérico que comprende una proteína hexon de un serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecer de forma eficiente en una célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicho adenovirus modificado: (a) secuencia de adenovirus del extremo terminal izquierdo de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región extrema izquierda las repeticiones terminales invertidas (ITRs) de E1a, E1b y 5’; (b) secuencias de adenovirus de la región interna del serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecer de forma eficiente en la célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región interna los genes que codifican la penton, la hexon y la fibra del adenovirus seleccionado; (c) secuencias de adenovirus del extremo terminal derecho del primer adenovirus, comprendiendo dicha región extrema derecha las funciones de gen E4 necesarias y las repeticiones terminales invertidas (ITRs) 3’, en donde el adenovirus quimérico resultante comprende proteínas adenovirales estructurales y reguladoras necesarias para infección y replicación.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 proporciona el mapa del genoma del adenovirus de simio generado por clonación shotgun según se describe en el ejemplo que sigue;
La Figura 2 proporciona el mapa del virus quimérico Adhu5-SV25 recombinante, denominado H5S25H5.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona genomas de adenovirus quiméricos compuestos por el extremo terminal izquierdo y por el extremo terminal derecho de un adenovirus que puede ser cultivado en la célula anfitrión seleccionada, y las regiones internas que codifican, como mínimo, las proteínas de cápside de otro serotipo de adenovirus. Esta invención es particularmente ventajosa para generar adenovirus que tienen serotipos que son difíciles de cultivar en un tipo de célula deseada. La invención permite así la generación de adenovirus quiméricos de serotipos variables.
En las realizaciones ilustradas en la presente memoria, los adenovirus quiméricos han sido construidos donde la mayor parte de las proteínas estructurales, y no solamente la hexon o la fibra, se derivan de un adenovirus de un serotipo universal, conservando con ello la mayor parte de las interacciones de proteína-proteína que están involucradas en el ensamblaje de cápside. La mayor parte de los genes precoces, tal como los codificados por las regiones de adenovirus E1 y E4 que son responsables de la regulación de transcripción y de la regulación del ciclo de la célula anfitrión, son retenidos a partir de diferentes serotipos que se sabe que dan como resultado una generación de virus de título alto en los tipos de células usados normalmente, tal como la HEK 293 que proporciona las proteínas Ad5 E1 en trans.
También se describen en la presente memoria secuencias de ácido nucleico y de aminoácido procedentes de Ad SA18, las cuales fueron aisladas originalmente a partir del mono verde [ATCC VR-943]. La presente invención facilita la producción de vectores de adenovirus y el empaquetamiento de líneas de células para producir esos vectores para su uso en la producción in vitro de proteínas recombinantes o de fragmentos u otros reactivos. La invención proporciona además composiciones para su uso en el suministro de una molécula heteróloga con fines terapéuticos o de vacuna. Tales composiciones terapéuticas o de vacuna contienen vectores adenovirales que portan una molécula heteróloga insertada. Adicionalmente, las secuencias descritas en la presente memoria son útiles para proporcionar funciones auxiliares esenciales requeridas para la producción de vectores virales adenoasociados (AAV) recombinantes. De ese modo, la invención facilita la provisión de construcciones auxiliares, métodos y líneas de células que usan esas secuencias en tales métodos de producción.
El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a un ácido nucleico o a un fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o supresiones de nucleótido apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótido en al menos un 95 a 99% de las secuencias alineadas.
El término “homología sustancial” o “similitud sustancial”, cuando se refiere a aminoácidos o a fragmentos de los mismos, indica que cuando se alinean con inserciones o supresiones de aminoácido apropiadas con otro aminoácido (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de aminoácido en al menos alrededor de un 95 a 99% de las secuencias alineadas. Con preferencia, la homología es a través de la secuencia de longitud completa, o de una proteína de la misma, o de un fragmento de la misma que sea de al menos 8 aminoácidos, o más deseablemente, de al menos 15 aminoácidos de longitud. Ejemplos de fragmentos adecuados se describen en la presente memoria.
El término “porcentaje de identidad de secuencia” o “idéntico” en el contexto de secuencias de ácido nucleico se
refiere a residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia. La comparación de longitud de identidad de secuencia puede ser a través de la longitud completa del genoma (por ejemplo, alrededor de 36 kbp), la longitud completa de una trama de lectura abierta de un gen, una proteína, subunidad o enzima [véase, por ejemplo, las tablas que proporcionan las regiones de codificación adenoviral], o un fragmento de al menos alrededor de 500 a 5000 nucleótidos, si se desea. Sin embargo, la identidad entre fragmentos más pequeños, por ejemplo, de al menos alrededor de nueve nucleótidos, normalmente de al menos alrededor de 20 a 24 nucleótidos, al menos alrededor de 28 a 32 nucleótidos, al menos alrededor de 36 o más nucleótidos, también puede ser deseable. De forma similar, se puede determinar fácilmente el “porcentaje de identidad de secuencia” a partir de secuencias de aminoácido, sobre la longitud completa de una proteína, o sobre un fragmento de la misma. Adecuadamente, un fragmento es al menos de alrededor de 8 aminoácidos de longitud, y puede ser de hasta 700 aminoácidos. En la presente memoria se describen ejemplos de fragmentos adecuados.
La identidad se determina fácilmente usando algoritmos y programas de ordenador tales como los que se describen en la presente memoria en configuraciones por defecto. Con preferencia, tal identidad es sobre la longitud completa de la proteína, enzima, subunidad, o sobre un fragmento de al menos alrededor de 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, la identidad puede estar basada en regiones más cortas, bien adaptadas al uso para el que se está disponiendo el producto de gen idéntico.
Según se describe en la presente memoria, los alineamientos se realizan usando una variedad de Programas de Alineamiento de Secuencia Múltiple disponibles pública o comercialmente, tal como el “Clustal W”, accesible a través de Servidores Web por internet. Alternativamente, se usan también utilidades de Vector NTI. Existe también un número de algoritmos conocidos en el estado de la técnica que pueden ser usados para medir identidad de secuencia de nucleótido, incluyendo los contenidos en los programas descritos con anterioridad. Según otro ejemplo, las secuencias de polinucleótido pueden ser comparadas usando Fasta, un programa en GCG, Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede ser determinado usando Fasta con sus parámetros por defecto (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se prevé en GCG Versión 6.1, incorporados en la presente memoria por referencia. Se encuentran disponibles programas similares para realizar alineamientos de aminoácido. En general, esos programas se usan como configuraciones por defecto, aunque un experto en la materia puede alterar esas configuraciones según sea necesario. Alternativamente, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa de ordenador que proporcione al menos el nivel de identidad o alineamiento que se proporciona mediante los algoritmos y programas referenciados.
Según se usa a través de la presente descripción y de las reivindicaciones, el término “comprender” y sus variantes, incluyendo “comprende” y “comprendiendo” entre otras variantes, es inclusivo de otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares. Los términos “consiste en” o “consistiendo” son inclusive de otros componentes, elementos, números enteros, etapas y similares.
Excepto cuando se especifique otra cosa, el término “vector” incluye cualquier elemento genético conocido en el estado de la técnica que proporcione una molécula objetivo para una célula, incluyendo ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmidos, episomas, virus, etc.
Mediante “minigén” se indica la combinación de un gen heterólogo seleccionado y los otros elementos reguladores necesarios para activar traducción, transcripción y/o expresión del producto de gen en una célula anfitrión.
Según se utiliza en la presente memoria, el término “transcomplementar” se refiere a cuando un gen (o un producto de gen) de un serotipo de adenovirus suministra un serotipo de adenovirus que carece de ese gen (o producto de gen) a partir de otro serotipo con la función faltante. Por ejemplo, se sabe que las funciones de serotipo E1a y E1b de adenovirus humano transcomplementan el adenovirus Pan 9 de chimpancé suprimido en E1. De forma similar, los inventores han encontrado que el Ad5 E1 humano transcomplementa los serotipos Pan5, Pan6, Pan7 de adenovirus de chimpancé suprimidos en E1, y los serotipos SV1, SV25 y SV39 de adenovirus de simio. Otros ejemplos de transcomplementación de serotipos incluyen el Ad5 humano y los Ad2, Ad3, Ad4, Ad5, Ad7 y Ad12 humanos.
El término “funcionalmente suprimido” o “supresión funcional” significa que ha sido eliminada una cantidad suficiente de la región de gen o se ha dañado de otro modo, por ejemplo por mutación o modificación, de modo que la región de gen ya no es capaz de producir productos funcionales de expresión de gen. Si se desea, la región de gen completa puede ser eliminada. Otros sitios adecuados para la interrupción o supresión de gen se discuten en la solicitud.
El término “funcional” se refiere a un producto (por ejemplo, una proteína o un péptido) que realiza su función natural, aunque no necesariamente al mismo nivel que el producto natural. El término “funcional” puede referirse también a un gen codificador y a partir del cual puede ser expresado un producto deseado.
I. Vectores adenovirales quiméricos
Las composiciones de la presente invención incluyen vectores adenovirales quiméricos que suministran una
molécula heteróloga a células. Para el suministro de tal molécula heteróloga, el vector puede ser un plásmido o, con preferencia, un adenovirus quimérico. Los adenovirus quiméricos de la invención incluyen ADN de adenovirus procedente de al menos dos serotipos fuente, un “serotipo donador” y un “adenovirus parental” según se describe con mayor detalle en la presente memoria, y un minigén.
Puesto que el genoma adenoviral contiene tramas de lectura abierta en ambas cadenas, en muchos casos se hace referencia en la presente memoria a extremos 5’ y 3’ de las diversas regiones para evitar confusión entre tramas específicas de lectura abierta y regiones de gen. De ese modo, cuando se hace referencia en la presente memoria a extremo “izquierdo” y “derecho” del genoma de adenovirus, esta referencia es a los extremos del genoma adenoviral de aproximadamente 36 kb cuando se representa en forma esquemática según es convencional en el estado de la técnica [véase, por ejemplo, “Adenoviridae y Su Replicación”, en VIROLOGY, 2ª ed., pp. 1679-1721 (1990)]. De ese modo, según se usa en la presente memoria, el “extremo terminal izquierdo” del genoma de adenovirus se refiere a la porción del genoma adenoviral que, cuando el genoma se representa esquemáticamente en forma lineal, está situada en el extremo izquierdo de la representación esquemática. Típicamente, el extremo izquierdo se refiere a la porción del genoma que empieza en la unidad de mapa 0 y que se extiende a la derecha para incluir al menos las repeticiones terminales invertidas (ITRs) 5’, y excluye las regiones internas del genoma que codifica los genes estructurales. Según se usa en la presente memoria, el “extremo terminal derecho” del genoma adenoviral se refiere a la porción del genoma adenoviral que, cuando el genoma se representa esquemáticamente en forma lineal, está situada en el extremo derecho de la representación esquemática. Típicamente, el extremo derecho del genoma adenoviral se refiere a la porción del genoma que termina en la unidad de mapa 36 y que se extiende a la izquierda para incluir al menos las ITRs 3’, y excluye las regiones internas del genoma que codifica los genes estructurales.
A. Secuencias reguladoras de adenovirus
1. Serotipo
La selección del serotipo de adenovirus que dona su extremo terminal izquierdo y su extremo terminal derecho puede ser realizada fácilmente por un experto en la materia a partir de serotipos que pueden ser fácilmente cultivados en la línea de células deseada. Entre otros factores que pueden ser considerados en la selección de serotipo del serotipo donador está la compatibilidad con el serotipo de adenovirus que estará suministrando las regiones internas en la posición en la que se hibridizan sus secuencias.
Adenovirus adecuados para donar sus términos izquierdo y derecho están disponibles en la American Type Culture Collection, Mannassas, Virginia, US (ATCC), una diversidad de fuentes académicas y comerciales, o las regiones deseadas de los adenovirus donadores pueden ser sintetizadas usando técnicas conocidas con referencia a secuencias publicadas en la literatura o disponibles a partir de bases de datos (por ejemplo, GenBank, etc.). Ejemplos de adenovirus donadores adecuados incluyen, sin limitación, serotipos 2, 3, 4, 5, 7 y 12 de adenovirus humanos, y además incluyen cualquiera de los tipos humanos identificados actualmente [véase, por ejemplo, Horwitz, “Adenoviridae y Su Replicación”, en VIROLOGY, 2ª ed., pp. 1679-1721 (1990)] que pueden ser cultivados en la célula deseada. De forma similar, adenovirus que se sabe que infectan a los primates no humanos (por ejemplo, chimpancés, Rhesus, macaco, y otras especies de simios) u otros mamíferos no humanos y que crecen en la célula deseada, pueden ser empleados en las construcciones de vector de la presente invención. Tales serotipos incluyen, sin limitación, los adenovirus de chimpancé Pan5 [VR-591], Pan6 [VR-592], Pan7 [VR-593], y C66 (Pan9), descritos en la Patente US núm. 6.083.716; y, los adenovirus de simio que incluyen, sin limitación, SV1 [VR-195], SV25 [SV-201]; SV35; SV15; SV-34; SV-36; SV-37, y adenovirus de babuino [VR-275], entre otros. Las secuencias de Pan 5 (denominadas también C5), Pan 6 (denominadas también C6), Pan 7 (denominadas también C7), SV1, SV25 y SV39, han sido ya descritas [documento WO 03/046124, publicado el 5 de Junio de 2003; y, solicitud de Patente US núm. 10/739.096, depositada el 19 de Diciembre de 2003)], los cuales se incorporan por referencia. En los ejemplos que siguen, las células 293 humanas y el tipo 5 de adenovirus (Ad5), Pan9 y Ad40, se utilizan por motivos de conveniencia. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que otras líneas de células y/o regiones comparables derivadas de otras cepas adenovirales pueden ser fácilmente seleccionadas y usadas en la presente invención en lugar de (o en combinación con) estos serotipos.
2. Secuencias
Las secuencias mínimas que deben ser suministradas por el adenovirus que dona su extremo terminal izquierdo y su extremo terminal derecho incluyen los elementos cis 5’ y los elementos cis 3’ necesarios para la replicación y el empaquetamiento. Típicamente, los elementos cis 5’ necesarios para empaquetamiento y replicación incluyen las secuencias de repetición de terminal invertido (ITR) 5’ (que funciona como origen de replicación) y los dominios potenciadores de empaquetamiento 5’ naturales (que contienen las secuencias necesarias para empaquetar genomas de Ad lineal y elementos potenciadores para el promotor E1). El extremo derecho del genoma adenoviral incluye los elementos cis 3’ (incluyendo las ITRs) necesarios para empaquetamiento y encapsidación. Deseablemente, el serotipo de adenovirus que dona sus términos izquierdo y derecho y/o un serotipo de adenovirus que transcomplementa el serotipo del adenovirus donador, proporciona además las funciones de los genes precoces de adenovirus necesarios, incluyendo E1 (E1a y E1b), E2 (E2a y E2b), y E4 (incluyendo al menos la región ORF6). E3 no es esencial y puede ser suprimido según se desee, por ejemplo para inserción de un transgén en esa región o para proporcionar espacio para un transgén insertado en otra región (típicamente, para el empaquetamiento es
deseable que el genoma adenoviral total esté por debajo de 36 kb).
En ciertas realizaciones, los genes precoces de adenovirus necesarios están contenidos en la construcción quimérica de la invención. En otra realización, se puede proporcionar uno o más de los genes precoces de adenovirus necesarios mediante el empaquetamiento de la célula anfitrión o en trans.
En general, el adenovirus quimérico de la invención contiene secuencias reguladoras procedentes del serotipo de adenovirus donador, o un serotipo de transcomplementación, para dotar al adenovirus quimérico con proteínas reguladoras compatibles. Opcionalmente, se proporciona uno o más de los genes estructurales adenovirales necesarios mediante el adenovirus que dona su extremo terminal izquierdo y su extremo terminal derecho.
En ciertas realizaciones, el adenovirus quimérico contiene uno o más genes de adenovirus funcional, incluyendo la trama de lectura abierta de endoproteasa, la proteína de enlace de ADN, la proteína de andamiaje de 100 kDa, la proteína de 33 kDa, la proteína VIII, pTP, la proteína de 52/55 kDa, la proteína VII, Mu y/o proteína VI del serotipo de adenovirus que dona sus términos izquierdo y derecho. Donde todos esos genes sean derivados del serotipo de adenovirus que dona las ITRs 5’ y 3’, se forma un virus “seudotipado”. En una realización, el adenovirus quimérico contiene el extremo izquierdo del genoma de adenovirus procedente del serotipo donador, desde la ITR 5’ hasta el extremo del gen pol (o del pTP). En otra realización más, el adenovirus quimérico contiene el extremo izquierdo del serotipo de adenovirus donador, por ejemplo a través del extremo del pTP, pero contiene una ITR desde un heterólogo de serotipo de adenovirus hasta el serotipo de adenovirus donador. Otras realizaciones adicionales resultarán fácilmente evidentes a partir de la presente divulgación.
Opcionalmente, uno o más de los genes pueden ser híbridos formados a partir de la fusión del serotipo de adenovirus donador y del serotipo de adenovirus parental que proporciona las proteínas de cápside (por ejemplo, sin limitación, polimerasa, proteína terminal, proteína IIIa). De forma adecuada, estos genes expresan proteínas funcionales que permiten el empaquetamiento de los genes de adenovirus en la cápside. Alternativamente, una o más de esas proteínas (tanto si son hibridas como no híbridas) pueden ser suprimidas funcionalmente en el adenovirus quimérico. Cuando se desee, cualesquiera proteínas necesarias suprimidas funcionalmente en el adenovirus quimérico pueden ser expresadas en trans en la célula de empaquetamiento.
B. Proteínas estructurales de adenovirus parental
1. Serotipos
Esta invención está particularmente bien adaptada para su uso en la generación de adenovirus quiméricos en los que las proteínas de cápside son procedentes de un adenovirus parental que no crece eficazmente en una célula anfitrión deseable. La selección del serotipo de adenovirus parental que proporciona las regiones internas puede ser realizada fácilmente por un experto en la materia en base a la información proporcionada en la presente memoria.
Una diversidad de adenovirus adecuados pueden servir como adenovirus parental que suministre las regiones que codifican la estructura (es decir, proteínas de cápside). Muchos de esos adenovirus pueden ser obtenidos a partir de las mismas fuentes que se han descrito con anterioridad en relación con los serotipos de adenovirus donadores. Ejemplos de serotipos de adenovirus parentales adecuados incluyen, sin limitación, el serotipo 40 de adenovirus humano, entre otros [véase, por ejemplo, Horwitz, “Adenovirus y su Replicación”, en VIROLOGY, 2ª ed., pp. 16791721 (1990)], y adenovirus que se sabe que infectan a primates no humanos (por ejemplo, chimpancés, Rhesus, macacos, y otras especies de simio) u otros mamíferos no humanos, incluyendo, sin limitación, el adenovirus CI de chimpancé, descrito en la Patente US núm. 6.083.716, la cual se incorpora por referencia; el adenovirus de simio y el adenovirus de babuino, entre otros. Adicionalmente, el adenovirus parental que suministra las regiones internas puede provenir de un serotipo de adenovirus que ocurre de forma no natural, según pueda ser generado usando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la materia.
En una realización ilustrada en la presente memoria, un virus quimérico que fue construido fue uno entre los adenovirus Pan-5 y CI de chimpancé que mostró un título más alto en células 293 humana que el virus parental de tipo natural. Sin embargo, la invención no se limita al uso de esos adenovirus de chimpancé, o a la combinación de adenovirus quiméricos de simio-simio, humano-humano o simio-humano. Por ejemplo, puede ser deseable usar adenovirus bovino o canino, u otros adenovirus de mamífero no humano que no infecten y/o se repliquen de forma natural en células humanas.
En los ejemplos que siguen, se utiliza el adenovirus humano tipo 40 (Ad40) y el adenovirus CI de chimpancé, Pan 5 y Ad40 de simio, y Pan 5 y adenovirus SA18 de simio. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que pueden ser seleccionados fácilmente otros serotipos adenovirales y usados en la presente invención en lugar de (o en combinación con) esos serotipos.
2. Secuencias
El adenovirus parental proporciona a la construcción quimérica de la invención sus regiones internas que incluyen proteínas estructurales necesarias para la generación de una cápside que tenga las características deseadas del adenovirus parental. Estas características deseadas incluyen, aunque sin limitación, la capacidad de infectar células
objetivo y suministrar un transgén heterólogo, la capacidad de eludir anticuerpos neutralizantes dirigidos a otro serotipo de adenovirus (es decir, evitar separación debido a reactividad cruzada), y/o la capacidad de infectar células en ausencia de una respuesta inmune al adenovirus quimérico. La ventaja de tales características puede que no sea fácilmente evidente en un régimen que incluye el suministro repetitivo de vectores adenovirales. Los términos izquierdo y derecho del adenovirus parental, incluyendo al menos las ITRs 5’, la región E1, la región E4 y las ITRs 3’, son no funcionales y, con preferencia, completamente ausentes. Opcionalmente, todas las proteínas reguladoras de adenovirus procedentes del adenovirus parental son no funcionales y solamente se retienen las proteínas estructurales (o las proteínas estructurales seleccionadas).
Como mínimo, el adenovirus parental proporciona la región final adenoviral que codifica la proteína hexon. De forma adecuada, el adenovirus parental proporciona además las regiones finales que codifican la penton y la fibra. En ciertas realizaciones, todas las regiones finales adenovirales funcionales, incluyendo L1 (que codifican proteínas IIIa, de 52/55 Da), L2 (que codifican proteínas penton, VII, V, Mu), L3 (que codifican VI, hexon, endoproteasa), L4 (que codifican proteínas VIII de 100 kD, de 33 kD) y L5 (que codifican proteína de fibra) son suministradas por el adenovirus parental. Opcionalmente, una o más de esas funciones de gen tardío, con la excepción de las que codifican las proteínas hexon, penton y de fibra, pueden ser suprimidas funcionalmente. Cualesquiera proteínas estructurales necesarias pueden ser suministradas en trans.
De ese modo, en ciertas realizaciones, el adenovirus quimérico contiene además uno o más genes de adenovirus funcional, incluyendo la trama de lectura abierta de endoproteasa, la proteína de enlace de ADN, la proteína de andamiaje de 100 kDa, la proteína de 33 kDa, la proteína VIII, la proteína pTP, de 52/55 kDa, la proteína VII, Mu y/o la proteína VI del adenovirus parental donador de sus regiones internas. Opcionalmente, uno o más de los genes pueden ser híbridos formados a partir de la fusión del serotipo de adenovirus donador y del serotipo de adenovirus parental que proporciona las proteínas de cápside, según se ha descrito con anterioridad.
C. El “minigén”
Típicamente, se ha diseñado un vector adenoviral de la invención para que contenga un minigén que puede ser insertado en el sitio de un gen adenoviral parcialmente suprimido, totalmente suprimido (ausente), o interrumpido. Por ejemplo, el minigén puede estar situado en el sitio de tal supresión de E1 funcional o supresión de E3 funcional,
o en otro sitio adecuado.
Los métodos empleados para la selección del transgén, la clonación y construcción del “minigén” y su inserción en el vector viral, están dentro de la técnica que proporcionan las enseñanzas proporcionadas por la presente memoria.
1. El transgén
El transgén es una secuencia de ácido nucleico, heteróloga respecto a las secuencias de vector que flanquean el transgén, que codifica un polipéptido, una proteína, u otro producto de interés. La secuencia de codificación de ácido nucleico está enlazada operativamente a componentes reguladores de una manera que permite la transcripción, traducción y/o expresión del transgén en una célula anfitrión.
La composición de la secuencia de transgén dependerá del uso al que se destine el vector adenoviral. Por ejemplo, el vector adenoviral puede ser usado como virus auxiliar en la producción de virus adeno-asociados recombinantes o en la producción de adenovirus recombinantes suprimidos en cuanto a funciones esenciales de gen adenoviral, que son suministrados por el vector adenoviral, o para una diversidad de usos de producción. Alternativamente, el vector adenoviral puede ser usado a efectos de diagnóstico.
Un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia informadora, que tras la expresión produce una señal detectable. Tales secuencias informadoras incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican β-lactamasa, βgalactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina quinasa, proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, proteínas de enlace de membrana incluyendo, por ejemplo, CD2, CD4, CD8, la proteína de hemaglutinina de la influenza, y otros bien conocidos en el estado de la técnica, para los que existen anticuerpos de alta afinidad dirigidos a los mismos o pueden ser producidos con medios convencionales, y proteínas de fusión que comprenden una proteína enlazada a membrana fusionada apropiadamente con un dominio de etiqueta de antígeno procedente de, entre otros, hemaglutinina o Myc. Estas secuencias de codificación, cuando están asociadas a elementos reguladores que activan su expresión, proporcionan señales detectables con medios convencionales, incluyendo fluorescencia enzimática, radiográfica, colorimétrica u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación de células de activación fluorescente y ensayos inmunológicos, incluyendo el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), el radioinmunoensayo (RIA) y el inmunohistoquímico. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LaZ, la presencia del vector portador de la señal se detecta mediante ensayos sobre actividad de beta-galactosidasa. Cuando el transgén es GFP o luciferasa, el vector portador de la señal puede ser medido visualmente mediante producción de luz o color en un luminómetro.
Sin embargo, de manera deseable, el transgén es una secuencia no marcadora que codifica un producto que es útil en biología y medicina, tal como proteínas, péptidos, ARN, enzimas, o ARNs catalíticos. Las moléculas de ARN deseables incluyen tARN, dsARN, ARN ribosómico, siARNs, ARNs de horquilla pequeña, ARNs trans-empalme, ARNs catalíticos, y ARNs antisentido. Un ejemplo de secuencia de ARN útil es una secuencia que extingue la
expresión de una secuencia de ácido nucleico objetivo en el animal tratado.
El transgén puede ser usado para el tratamiento de, por ejemplo, deficiencias genéticas, tal como una terapéutica de cáncer o una vacuna, para inducción de una respuesta inmune, y/o con fines de vacuna profiláctica. Según se utiliza en la presente memoria, la inducción de una respuesta inmune se refiere a la capacidad de una molécula (por ejemplo, un producto de gen) a inducir una célula T y/o una respuesta humoral inmune a la molécula. La invención incluye además el uso de múltiples transgenes, por ejemplo para corregir o mejorar una condición causada por una proteína multi-subunidad. En ciertas situaciones, se puede usar un transgén diferente para codificar cada subunidad de una proteína, o para codificar diferentes péptidos o proteínas. Esto resulta deseable cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo para una inmunoglobulina, el factor de crecimiento derivado de plaqueta, o una proteína de distrofina. Con el fin de que la célula produzca la proteína multi-subunidad, se infecta una célula con virus recombinante que contiene cada una de las diferentes subunidades. Alternativamente, las diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas por el mismo transgén. En este caso, un transgén simple incluye el ADN que codifica cada una de las subunidades, con el ADN para cada subunidad separado por un sitio de entrada de ribozima interno (IRES). Esto resulta deseable cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es pequeño, por ejemplo el tamaño total del ADN que codifica las subunidades y los IRES es menor de cinco kilobases. Como alternativa a un IRES, el ADN puede estar separado por secuencias que codifican un péptido 2A, que se autoescinde en un evento post-traslacional. Véase por ejemplo, M.L. Donnelly, et al., J. Gen. Virol., 78(Pt 1): 13-21 (Enero de 1997); Furler, S. et al., Gene Ther., 8(11): 864-873 (Junio de 2001); Klump H., et al., Gene Ther., 8(10): 811-817 (Mayo de 2001). Este péptido 2A es significativamente más pequeño que un IRES, lo que hace que sea muy adecuado para su uso cuando el espacio es un factor limitativo. Sin embargo, el transgén seleccionado puede codificar cualquier producto biológicamente activo u otro producto, por ejemplo un producto deseable para su estudio.
Los transgenes adecuados pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la materia. La selección del transgén no se considera una limitación de la presente invención.
2. Vector y elementos reguladores de transgén
Adicionalmente a los elementos principales definidos en lo que antecede para el minigén, el vector adenoviral incluye también elementos de control convencionales que están enlazados operativamente al transgén de una manera que permite su transcripción, traslación y/o expresión en una célula transfectada con el vector de plásmido o infectada con el virus producido por la invención. Según se utiliza en la presente memoria, secuencias “enlazadas operativamente” incluyen tanto secuencias de control de expresión que están configuradas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés.
Las secuencias de control de expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, terminación promotoras y potenciadoras de transcripción; señales de procesamiento eficiente de ARN tales como señales de empalme y de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan mARN citoplásmico; secuencias que incrementan la eficacia de traducción (es decir, la secuencia de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de proteína; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Se puede utilizar un gran número de secuencias de control de expresión, incluyendo los promotores que sean naturales, constitutivos y/o específicos del tejido, conocidas en el estado de la técnica.
Ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma retroviral de Rous (RSV) (opcionalmente, con el potenciador de RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Célula, 41: 521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de β-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), y el promotor de EF1α [Invitrogen].
Los promotores inducibles permiten la regulación de expresión de gen y pueden ser regulados mediante compuestos suministrados exógenamente, factores medioambientales tales como la temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o en células replicantes solamente. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles a partir de una diversidad de fuentes comerciales, incluyendo aunque sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la materia. Por ejemplo, los promotores inducibles incluyen el promotor de metalotionina (MT) de oveja inducible con zinc y el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex). Otros sistemas inducibles incluyen el sistema promotor de polimerasa T7 [documento WO 98/10088]; el promotor de insecto ednisona [No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)], el sistema reprimible por tetraciclina [Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 515-518 (1998)]. Otros sistemas incluyen el dímero FK506, VP16 o p65 que usa castrodiol, difenol murislerona, el sistema inducible por RU486 [Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)] y el sistema inducible por rapamicina [Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)]. La efectividad de algunos promotores inducibles se incrementa con el tiempo. En esos casos, se puede aumentar la efectividad de tales sistemas insertando múltiples represores en tándem, por ejemplo TetR enlazado a TetR mediante un IRES. Alternativamente, se puede esperar al menos 3 días antes de la detección de la función deseada. Se puede aumentar la expresión de las
proteínas deseadas mediante medios que se sabe que potencian la efectividad de este sistema. Por ejemplo, usando el Elemento Regulador Post-transcripcional del Virus de la Hepatitis de Woodchuck (WPRE).
En otra realización, se usará el promotor natural para el transgén. El promotor natural puede ser el preferido cuando se desee que la expresión del transgén mimetice la expresión natural. Se puede usar el promotor natural cuando la expresión del transgén deba ser regulada temporalmente o en el desarrollo, o de una manera específica del tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, otros elementos de control de expresión, tal como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias de consenso de Kozak, pueden ser también usados para mimetizar la expresión natural.
Otra realización del transgén incluye un transgén enlazado operativamente a un promotor específico del tejido. Por ejemplo, si se desea expresión en el músculo esquelético, se debe usar un promotor que sea activo en el músculo. Éstos incluyen los promotores de genes que codifican la β-actina esquelética, la cadena 2A ligera de miosina, la distrofina, la creatina quinasa del músculo, así como promotores de musculo sintéticos con actividades más altas que los promotores que ocurren de forma natural (véase Li et al., Nat. Biotech. 17: 241-245 (1999)). Ejemplos de promotores que son específicos del tejido son conocidos para el hígado (albúmina, Mystake et al., J. Virol. 71: 512432 (1997); promotor central del virus de la hepatitis B Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); alfa-fetoproteina (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185-96 (1997)); sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11: 654-64 8996)), linfocitos (CD2, Hansal et al., J. Immunol. 161: 1063-8 (1998) cadena pesada de inmunoglobulina; cadena receptora de células T), neuronal tal como promotor de enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13: 503-15 (1993)), gen de cadena ligera de neurofilamento (Piccioliet al., o. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611-5 (1991)), y el gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neurona, 15: 373-84 (1995)) entre otros.
Opcionalmente, los vectores portadores de transgenes que codifican productos inmunogénicos o terapéuticamente útiles pueden incluir también genes marcadores o informadores seleccionables que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a la geniticina, higromicina o purimicina, entre otros. Tales genes informadores o marcadores seleccionables (con preferencia situados fuera del genoma viral para ser empaquetados en una partícula viral) pueden ser usados para señalar la secuencia de los plásmidos en células bacterianas tal como resistencia a la ampicilina. Otros componentes del vector pueden incluir un origen de replicación. La selección de esos y otros promotores y elementos de vector, es convencional y muchas de esas secuencias se encuentran disponibles [véase, por ejemplo, Sambrook et al., y las referencias citadas en la presente memoria].
Estos vectores son generados usando las técnicas y secuencias proporcionadas en la presente memoria, junto con técnicas conocidas por los expertos en la materia. Tales técnicas incluyen las técnicas de clonación convencionales de cADN tal como las que se describen en textos [Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY], utilización de secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus, reacción de cadena de polimerasas, y cualquier método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótido deseada.
II. Producción de la partícula viral recombinante
En una realización, la invención proporciona un método de generación de partículas adenovirales quiméricas recombinantes en las que la cápside del adenovirus quimérico es de un serotipo incapaz de crecimiento eficaz en la célula anfitrión seleccionada. Un vector adecuado para la producción de partículas adenovirales quiméricas recombinantes puede ser generado mediante clonación directa. Alternativamente, tales partículas pueden ser generadas mediante recombinación homóloga entre un primer vector que contiene el extremo izquierdo del genoma adenoviral quimérico y un segundo vector que contiene el extremo derecho del genoma adenoviral quimérico. Sin embargo, se puede utilizar cualquier metodología adecuada conocida por los expertos en la materia para generar un vector adecuado para generar un vector de producción, con preferencia que contenga el genoma adenoviral quimérico completo, incluyendo un minigén. Este vector de producción se introduce a continuación en una célula anfitrión en la que está ensambla la proteína de cápside adenoviral y se ensambla la partícula adenoviral quimérica, según se ha descrito.
Los adenovirus quiméricos de la invención incluyen aquellos en los que están ausentes uno o más genes adenovirales, o se han vuelto, de otro modo, no funcionales. Si cualquiera de las funciones de gen faltante es esencial para la replicación y la infectividad de la partícula adenoviral, esas funciones son suministradas por una línea de células de complementación (o transcomplementación) o por un vector auxiliar que exprese esas funciones durante la producción de la partícula adenoviral quimérica.
Ejemplos de adenovirus quiméricos que contienen tales funciones de gen adenoviral faltante incluyen los que están parcial o totalmente suprimidos en el gen E1a y/o E1b. En ese caso, las funciones de gen E1 pueden ser suministradas por la célula anfitrión de empaquetamiento, que permite que la construcción quimérica sea suprimida en cuanto a las funciones de gen E1 y, si se desea, respecto a un transgén que ha de ser insertado en esa región. Opcionalmente, el gen E1 puede ser de un serotipo que transcomplemente el serotipo que proporciona las otras secuencias de adenovirus con el fin de reducir más la posibilidad de recombinación y mejorar la seguridad. En otras realizaciones, resulta deseable mantener una región E1a y/o E1b intacta en los adenovirus recombinantes. Tal
región E1 intacta puede estar situada en su posición natural en el genoma adenoviral o colocada en el sitio de una supresión en el genoma adenoviral natural (por ejemplo, en la región E3).
En otro ejemplo, todo o una porción del gen E3 precoz retardado de adenovirus puede ser eliminado de la partícula de virus quimérico. Los vectores de adenovirus quimérico pueden ser también construidos de modo que tengan una supresión de al menos la región ORF 6 del gen E4, y más deseablemente debido a la redundancia en la función de esa región, la región E4 completa. Otro vector más de la presente invención contiene una supresión en el gen E2a precoz retardado. De forma similar, las supresiones en los genes IX y IVa2 intermedios pueden ser útiles para algunos fines. Opcionalmente, las supresiones pueden ser realizadas también en porciones seleccionadas de los genes tardíos L1 a L5, según se ha descrito con anterioridad.
Se pueden hacer otras supresiones en otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las supresiones mencionadas con anterioridad pueden ser usadas individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para su uso en la presente invención puede contener supresiones de una sola región. Alternativamente, las supresiones de genes enteros o de porciones de los mismos, efectivas para destruir su actividad biológica, pueden ser usadas en cualquier combinación. Por ejemplo, en un ejemplo de vector la secuencia de adenovirus puede tener supresiones de los genes E1 y del gen E4, o de los genes E1, E2a y E3, o de los genes E1 y E3, o de los genes E1, E2a y E4, con o sin supresión de E3, y así sucesivamente. Según se ha discutido con anterioridad, tales supresiones pueden ser usadas en combinación con otras mutaciones, tal como mutaciones sensibles a la temperatura, para conseguir un resultado deseado.
Ejemplos de serotipos de transcomplementación adecuados han sido proporcionados en lo que antecede. El uso de serotipos de transcomplementación puede ser particularmente ventajoso cuando exista una diversidad entre las secuencias de Ad en el vector de la invención y las secuencias de AdE1 humanas encontradas en células de empaquetamiento normalmente disponibles. En esos casos, el uso de las células normales que contienen E1 humano impide la generación de adenovirus competentes para la replicación durante el proceso de replicación y producción. Sin embargo, en algunas circunstancias, podrá ser deseable utilizar una línea de células que exprese los productos de gen E1 que pueden ser utilizados para la producción de adenovirus de simio suprimidos en E1. Tales líneas de células han sido ya descritas. Véase, por ejemplo, la Patente US núm. 6.083.716.
A. Células anfitrión de empaquetamiento
De manera adecuada, la célula anfitrión de empaquetamiento se selecciona entre células en las que el serotipo de adenovirus que dona los extremos terminales izquierdo y derecho del genoma quimérico está capacitado para un crecimiento eficiente. Las células anfitrión tienen con preferencia su origen en un mamífero, y más preferentemente son de origen humano o de un primate no humano.
Las células anfitrión particularmente deseables se seleccionan entre especies de mamífero que incluyen, sin limitación, células tales como las células A549 [ATCC Accession núm. CCL 185], células 911, células WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 o células PERC6 (de las que ambas expresan E1 adenoviral funcional) [Fallaux, FJ et al., (1998), Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2CI2, células L, células HT1080, HepG2, HeLa [ATCC Accession núm. CCL 2], KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, Detroit 510, CCL 72], y WI-38 [CCL 75], y células de fibroblasto primario, hepatocito y mioblasto derivadas de mamíferos que incluyen el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. Estas líneas de células están disponibles en la American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209. Otras líneas de células adecuadas pueden ser obtenidas en otras fuentes. La selección de las especies de mamífero que proporciona las células, no es una limitación de la invención, ni lo es el tipo de célula de mamífero, es decir, fibroblasto, hepatocito, célula de tumor, etc.
Según se ha descrito con anterioridad, un adenovirus quimérico según la invención puede carecer de uno o más genes adenovirales funcionales reguladores y/o estructurales que son suministrados ya sea por la célula anfitrión o ya sea en trans para efectuar empaquetamiento del adenovirus quimérico en la cápside viral para generar la partícula viral. De ese modo, la capacidad de una célula anfitrión seleccionada para suministrar secuencias adenovirales de transcomplementación puede ser tomada en consideración para la selección de una célula anfitrión deseada.
En un ejemplo, las células proceden de una línea de células estables que expresan funciones E1a y E1b a partir de una línea de células que transcomplementan el serotipo de adenovirus que dona los términos izquierdo y derecho a la quimera de la invención, permitiendo que la quimera esté suprimida en E1. Alternativamente, cuando la línea de células no transcomplementa el adenovirus que dona los términos, las funciones de E1 pueden ser proporcionadas por la quimera, o en trans.
Si se desea, se pueden utilizar las secuencias proporcionadas en la presente memoria para generar una célula de empaquetamiento o una línea de células que expresen, como mínimo, el gen E1 de adenovirus a partir del serotipo de adenovirus que dona la ITR 5’ bajo el control transcripcional de un promotor de expresión, o de un serotipo de transcomplementación, en una línea de células parentales seleccionada. Se pueden emplear promotores inducibles
o constitutivos para este propósito. Ejemplos de tales promotores se describen con detalle en otros sitios de la presente descripción. Una célula parental se selecciona para la generación de una nueva línea de células que
expresen algún adenovirus o gen de adenovirus deseado, incluyendo, por ejemplo, un gen de Ad5, AdPan5, Pan6, Pan7, SV1, SV25 o SV39 humano. Sin limitación, tal línea de célula parental puede consistir en las células HeLa [ATCC Accession No. CCL 2], A549 [ATCC Accession No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por ejemplo, la Detroit 510, CCL 72], y WI-38 [CCL 75], entre otras. Muchas de estas líneas de células están disponibles en ATCC. Otras líneas de células parentales adecuadas pueden ser obtenidas a partir de otras fuentes.
Tales líneas de células de expresión de E1 son útiles en la generación de vectores suprimidos en E1 de adenovirus quiméricos. Adicionalmente, o alternativamente, la invención proporciona líneas de células que expresan uno o más productos de gen adenoviral de simio, por ejemplo E1a, E1b, E2a y/o E4 ORF6 que pueden ser construidos usando esencialmente los mismos procedimientos que se usan en la generación de vectores virales quiméricos. Tales líneas de células pueden ser utilizadas para transcomplementar vectores de adenovirus suprimidos en los genes esenciales que codifican esos productos, o para proporcionar funciones auxiliares necesarias para el empaquetamiento de un virus auxiliar-dependiente (por ejemplo, un virus adeno-asociado). La preparación de una célula anfitrión conforme a la presente invención incluye técnicas tales como el ensamblaje de secuencias de ADN seleccionadas. Este ensamblaje puede ser realizado usando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen la clonación genómica y de cADN, lo que es bien conocido y ha sido descrito por Sambrook et al., citado con anterioridad, el uso de secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus, combinado con reacción de cadena de polimerasa, métodos sintéticos, y cualquier otro método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótido deseada.
En otra realización alternativa adicional, los productos de gen adenoviral esencial son proporcionados por el vector adenoviral y/o por el virus auxiliar. En ese caso, se puede seleccionar una célula anfitrión adecuada a partir de cualquier organismo biológico, incluyendo las células procarióticas (por ejemplo, bacterianas), las células eucarióticas, las células de insectos, las células de levadura y las células de mamíferos. En particular, las células anfitrión deseables se seleccionan de entre cualesquiera especies de mamífero incluyendo, sin limitación, células tales como las células A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 o PERC6 (todas ellas expresan E1 adenoviral funcional) [Fallaux, F.J. et al., (1998), Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2C12, células L, HT1080, HepG2 y fibroblasto primario, células de hepatocito y de mioblasto derivadas de mamíferos que incluyen el ser humano, el mono, el ratón, la rata, el conejo y el hámster. La selección de las especies de mamífero que proporcionan las células no constituye una limitación de la presente invención; ni lo es tampoco el tipo de célula de mamífero, por ejemplo fibroblasto, hepatocito, célula tumoral, etc.
B. Vectores auxiliares
De ese modo, dependiendo del contenido de gen de adenovirus de los vectores virales y de cualesquiera funciones de gen adenoviral expresadas a partir de la célula anfitrión, puede ser necesario un vector auxiliar que proporcione suficientes secuencias de gen de adenovirus necesarias para producir una partícula viral recombinante infecciosa que contenga el minigén. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas para la preparación de un vector de Ad humano “mínimo” en la solicitud de Patente Internacional núm. WO 96/13597, publicada el 9 de Mayo de 1996, e incorporada en la presente memoria por referencia. De forma adecuada, estos vectores auxiliares pueden ser elementos genéticos no replicantes, un plásmido o un virus.
Los vectores auxiliares útiles contienen secuencias de gen de adenovirus seleccionadas que no están presentes en la construcción de vector de adenovirus y/o no expresadas por la línea de células de empaquetamiento en la que ha sido transfectado el vector. En una realización, el virus auxiliar es defectuoso en la replicación y contiene una diversidad de genes de adenovirus además de las secuencias descritas con anterioridad. Tal vector auxiliar se usa deseablemente en combinación con una línea de células de expresión de E1.
Los vectores auxiliares pueden ser formados en conjugados poli-catión según ha sido descrito por Wu et al., en J. Biol. Chem. 264: 16985-16987 (1989); por K.J. Fisher y J.M. Wilson en Biochem. J., 299: 49 (1 de Abril de 1994). Un vector auxiliar puede contener opcionalmente un segundo minigén informador. Se conoce en el estado de la técnica un cierto número de tales genes informadores. La presencia de un gen informador en el virus auxiliar que sea diferente del transgén del vector de adenovirus, permite tanto al vector de Ad como al vector auxiliar ser monitorizados de forma independiente. Este segundo informador se utiliza para permitir la separación entre el virus recombinante resultante y el virus auxiliar tras la purificación.
C. Ensamblaje de partícula viral y transfección de una línea de células
En general, cuando se suministra el vector que comprende el minigén mediante transfección, este vector se suministra en una cantidad de alrededor de 5 µg a alrededor de 100 µg de ADN, y con preferencia de alrededor de 10 a alrededor de 50 µg de ADN en aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células, y con preferencia en aproximadamente 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN de vector respecto a las células anfitrión pueden ser ajustadas teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de suministro y las células anfitrión seleccionadas.
Las introducción en la célula anfitrión del vector puede conseguirse a través de cualquier medio conocido en el estado de la técnica o según se ha descrito en lo que antecede, incluyendo transfección, e infección. Uno o más de
los genes adenovirales puede estar integrado de manera estable en el genoma de la célula anfitrión, expresado de manera estable como episomas, o expresado transitoriamente. Los productos de gen pueden estar todos expresados de manera transitoria, sobre un episoma o integrados de forma estable, o algunos de los productos de gen pueden estar expresados de forma estable mientras otros están expresados de forma transitoria.
Además, los promotores de cada uno de los genes adenovirales pueden ser seleccionados independientemente a partir de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenoviral natural. Los promotores pueden estar regulados por un estado fisiológico específico del organismo o de la célula (es decir, por el estado de diferenciación o en células replicantes o quiescentes) o mediante factores añadidos exógenamente, por ejemplo.
La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula anfitrión puede ser también realizada usando técnicas conocidas por los expertos en la materia y según se ha discutido a través de la descripción. En una realización preferida, se usan técnicas de transfección estándar, por ejemplo mediante transfección de CaPO4 o por electroporación.
El ensamblaje de las secuencias de ADN seleccionadas del adenovirus (así como del transgén y de otros elementos de vector) en varios plásmidos intermedios, y el uso de los plásmidos y vectores para producir una partícula viral recombinante, se consiguen usando técnicas convencionales. Tales técnicas incluyen clonación directa según se ha descrito [G. Gao, et al., Gene Ther., Octubre de 2003; 10(22): 1926-1930; Publicación de Patente US núm. 20030092161-A, publicada el 15 de Mayo de 2003; solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US03/12405]. Se pueden usar otras técnicas de clonación de cADN tales como las descritas en textos [Sambrook et al., citadas con anterioridad], uso de secuencias solapantes de oligonucleótido de los genomas de adenovirus, reacción de cadena de polimerasa, y cualquier método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótido deseada. Se emplean técnicas estándar de transfección y co-transfección, por ejemplo, técnicas de precipitación de CaPO4. Otros métodos convencionales empleados incluyen recombinación homóloga del genoma viral, formación de placas de virus en recubrimiento de agar, métodos de medición de generación de señal, y similares.
Por ejemplo, a continuación de la construcción y ensamblaje del vector viral que contiene el minigén deseado, el vector es transfectado in vitro en presencia del vector auxiliar opcional en la línea de células de empaquetamiento. Las funciones expresadas a partir del plásmido, la línea de células de empaquetamiento y el virus auxiliar, si los hay, permiten que las secuencias de transgén de adenovirus del vector sean replicadas y empaquetadas en cápsides de virión, dando como resultado las partículas virales quiméricas. El método normal para producir tales partículas de virus se basa en transfección. Sin embargo, la invención no se limita a tales métodos. Los adenovirus quiméricos resultantes son útiles en la transferencia de un transgén seleccionado a una célula seleccionada.
III. Uso de los vectores de adenovirus quiméricos
Los vectores de adenovirus quiméricos de la invención son útiles para transferencia de gen a un sujeto humano o veterinario (incluyendo los primates no humanos, los primates no simios, y otros mamíferos), in vitro, ex vivo e in vivo.
Los vectores de adenovirus recombinantes descritos en la presente memoria pueden ser usados como vectores de expresión para la producción de los productos codificados por los genes heterólogos in vitro. Por ejemplo, los adenovirus recombinantes que contienen un gen insertado en la posición de una supresión de E1 pueden ser transfectados en una línea de células de expresión de E1 según se ha descrito en lo que antecede. Alternativamente, los adenovirus competentes para replicación pueden ser usados en otra línea de células seleccionada. Las células transfectadas son cultivadas después, de la manera convencional, permitiendo que el adenovirus recombinante exprese el producto de gen a partir del promotor. El producto de gen puede ser recuperado a partir del medio de cultivo mediante métodos convencionales conocidos de aislamiento y recuperación de proteína del cultivo.
Un vector adenoviral quimérico de la invención proporciona un vehículo eficaz de transferencia de gen que puede suministrar un transgén seleccionado a una célula anfitrión seleccionada in vivo o ex vivo incluso cuando el organismo tiene anticuerpos neutralizantes respecto a uno o más serotipos de AAV. En una realización, el rAd y las células se mezclan ex vivo; las células infectadas son cultivadas usando metodologías convencionales; y las células transducidas son re-infundidas en el paciente. Estas composiciones son particularmente adecuadas para suministro de gen a efectos terapéuticos y a efectos de inmunización, incluyendo inducción de inmunidad protectora.
Más habitualmente, los vectores adenovirales quiméricos de la invención podrán ser utilizados para el suministro de moléculas terapéuticas o inmunogénicas, según se describe en lo que sigue. Se comprenderá fácilmente para ambas aplicaciones que los vectores adenovirales recombinantes de la invención son particularmente adecuados para su uso en regímenes que incluyen suministro repetitivo de vectores adenovirales recombinantes. Tales regímenes incluyen típicamente el suministro de una serie de vectores virales en los que se alternan las cápsides virales. Las cápsides virales pueden ser cambiadas en cada administración posterior, o tras un número preseleccionado de administraciones de una cápside de serotipo particular (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o más). Así, un régimen puede incluir el suministro de un rAd con una primera cápside, el suministro de un rAd con una segunda cápside, y el suministro con una tercera cápside. Una diversidad de otros regímenes que hagan uso de
las cápsides de Ad de la invención solas, combinadas entre sí, o en combinación con otros serotipos de Ad, resultarán evidentes para los expertos en la materia. Opcionalmente, un régimen de ese tipo puede incluir la administración de rAd con cápsides de adenovirus de primate no humano, adenovirus humanos, o serotipos artificiales (por ejemplo, quiméricos), tal como los que se describen en la presente memoria. Cada fase del régimen puede incluir la administración de una serie de inyecciones (u otras vías de suministro) con una sola cápside de serotipo de Ad seguido de una serie con otra cápside de serotipo de Ad. Alternativamente, los vectores de Ad recombinantes de la invención pueden ser utilizados en regímenes que incluyan otros sistemas de suministro mediado no adenoviral, incluyendo otros sistemas virales, sistemas de suministro no viral, proteína, péptidos, y otras moléculas biológicamente activas.
Las secciones que siguen van a ser enfocadas sobre ejemplos de moléculas que pueden ser suministradas a través de los vectores adenovirales de la invención.
A. Suministro de moléculas terapéuticas mediado por Ad
En una realización, los vectores de Ad descritos en la presente memoria son administrados a humanos conforme a métodos publicados para terapia de gen. Un vector viral de la invención que porta el transgén seleccionado, puede ser administrado a un paciente, con preferencia suspendido en una solución biológicamente compatible o en un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril. Otras soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas o no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que se sabe que son portadores farmacéuticamente aceptables y conocidas por los expertos en la materia, pueden ser también empleadas para este propósito.
Los vectores adenovirales son administrados en cantidades suficientes para transducir las células objetivo y proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión de gen para proporcionar un beneficio terapéutico sin efectos adversos indebidos o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden ser determinados por los expertos en técnicas médicas. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, suministro directo a la retina y otros métodos de suministro intraocular, suministro directo al hígado, inhalación, intranasal, intravenoso, intramuscular, intratraqueal, subcutánea, intradérmica, rectal, oral y otras rutas parenterales de administración. Las rutas de administración pueden ser combinadas, si se desea, o ajustadas dependiendo del transgén o de la condición. La ruta de administración dependerá principalmente de la naturaleza de la condición que ha de ser tratada.
Las dosificaciones del vector viral dependerán principalmente de vectores tales como la condición que va a ser tratada, la edad, el peso y el estado de salud del paciente, y pueden por tanto variar entre pacientes. Por ejemplo, una dosis veterinaria o para un humano adulto terapéuticamente efectiva del vector viral está por lo general comprendida en la gama de alrededor de 100 µl a alrededor de 100 ml de un portador que contenga concentraciones de alrededor de 1 x 106 a alrededor de 1 x 1015 partículas, alrededor de 1 x 1011 a 1 x 1013 partículas, o alrededor de 1 x 109 a 1 x 1012 partículas. Las dosificaciones estarán en gamas dependientes del tamaño del animal y de la vía de administración. Por ejemplo, una dosificación humana o veterinaria adecuada (para un animal de aproximadamente 80 kg) para inyección intramuscular, está comprendida en la gama de alrededor de 1 x 109 a alrededor de 5 x 1012 partículas por ml, para un solo sitio. Opcionalmente, se pueden suministrar múltiples sitios de administración. En otro ejemplo, una dosis humana o animal adecuada puede estar comprendida en la gama de alrededor de 1 x 1011 a alrededor de 1 x 1015 partículas para una formulación oral. Un experto en la materia puede ajustar esas dosis, dependiendo de la ruta de administración y de la aplicación terapéutica o de vacuna para la que se emplee el vector recombinante. Los niveles de expresión del transgén (o para un inmunógeno, el nivel de anticuerpo circulante), pueden ser monitorizados a efectos de determinación de la frecuencia de administración de la dosis. Otros métodos adicionales para determinar la sincronización de la frecuencia de administración resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.
Una etapa de método opcional incluye la co-administración al paciente, ya sea concurrentemente con, o antes o después de, la administración del vector viral, de una cantidad adecuada de un modulador inmune de acción corta. El modulador inmune seleccionado se define en la presente memoria como un agente capaz de inhibir la formación de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra el vector recombinante de la presente invención, o capaz de inhibir la eliminación de linfocitos T citolíticos (CTL) del vector. El modulador inmune puede interferir con las interacciones entre los subconjuntos T auxiliares (TH1 o TH2) y células B para inhibir la formación de anticuerpo neutralizante. Alternativamente, el modulador inmune puede inhibir la interacción entre células TH1 y CTLs para reducir la ocurrencia de eliminación de CTL del vector. Se ha descrito una diversidad de moduladores inmunes útiles y de dosificaciones para uso de los mismos, por ejemplo, en Yang et al., J. Virol, 70(9) (Septiembre de 1996); solicitud de Patente Internacional núm. WO96/12406, publicada el 2 de Mayo de 1996; y, solicitud de Patente Internacional núm. PCT/US96/03035, todas ellas incorporadas en la presente memoria por referencia. Típicamente, tales moduladores inmunes podrían ser seleccionados cuando el transgén sea uno terapéutico que requiera suministro repetitivo.
1. Transgenes terapéuticos
Los productos terapéuticos útiles codificados por el transgén incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación que incluyen, sin limitación, insulina, glucagón, hormona de crecimiento (GH), hormona paratiroidea
(PTH), factor de liberación de hormona de crecimiento (GRF), hormona de estimulación de folículo (FSH), hormona leutinizante (LH), gondotropina coriónica humana (hCG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, factor de estimulación de colonia de granulocito (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTFG), factor de crecimiento de fibroblasto básico (hFGF), factor de crecimiento de fibroblasto acídico (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor α de crecimiento transformador, factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factores I y II de crecimiento de insulina (IGF-I) e (IGF-II), uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento de transformación, incluyendo TGF, activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogénicas óseas (BMP) BMPs 1-15, uno cualquiera de la familia de factores de crecimiento de la herogluína/neurogluína/ARIA/neu factor de diferenciación (NDF), factor de crecimiento nérveo (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3 y NT-4/5, factor neurotrófico ciliar (CMTF), factor neurotrófico derivado de línea celular glial ((GNDF), neurturina, agrina, uno cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrina-1 y netrina-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, noggin, erizo sonic y tirosina hidroxilasa.
Otros productos de transgén útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmune incluyendo, sin limitación, citoquinas y linfoquinas tales como trombopoyetina (TPO), interleuquinas (IL) IL-1 a IL-25 (incluyendo, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-2 e IL-18), proteína quimio atrayente de monocito, factor inhibitorio de leucemia, factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago, ligando Fas, factores de necrosis tumoral e interferonas, y factor de crecimiento de células madre, ligando flk-2/flt 3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune son también útiles en la invención. Éstos incluyen, sin limitación, inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, receptores de células T, receptores de células T quiméricas, receptores de células T de cadena simple, moléculas MHC de clase I y de clase II, así como inmunoglobulinas y moléculas MHC de diseño. Los productos de gen útiles incluyen también proteínas reguladoras de complemento tales como las proteínas reguladoras de complemento, la proteína de co-factor de membrana (MCP), el factor de decaimiento acelerado (DAF), CR1, CF2 y CD59.
Otros productos de gen útiles adicionales incluyen uno cualquiera de los receptores para hormonas, factores de crecimiento, citoquinas, linfoquinas, proteínas reguladoras y proteínas de sistema inmune. La invención abarca receptores para regulación del colesterol, incluyendo el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL), el receptor de lipoproteína de alta densidad (HDL), el receptor de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), proteínas útiles en la regulación de lípidos, incluyendo por ejemplo la apopoliproteína (apo) A y sus isoformas (por ejemplo, ApoAI), apoE y sus isoformas incluyendo E2, E3 y E4), SRB1, ABC1, y el receptor de barrido. La invención abarca también productos de gen tal como miembros de la superfamilia del receptor de hormona esteroide incluyendo receptores de glucocorticoides y receptores de estrógenos, receptores de Vitamina D y otros receptores nucleares. Adicionalmente, los productos de gen útiles incluyen factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta de suero (SRF), AP-1, AP-2, myb, MyoD y miogenina, proteínas que contienen ETS-box, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de enlace de CCAAT-box, factor de regulación de interferón (IRF-1), proteína de tumor de Wilms, proteína de enlace de ETS, STAT, proteínas de enlace de GATA-box, por ejemplo GATA-3, y la familia de cabeza bifurcada de proteínas de hélice alada.
Otros productos de gen útiles incluyen carbamoil sintetasa I, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato liasa, fumarilacetato hidrolasa, fenilamina Hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, forfobilinógeno desaminasa, cistationa beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-coA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilato, fosforilasa hepática, fosforilasa quinasa, glicina descarboxilada, proteína H, proteína T, una secuencia reguladora de transmembrana de fibrosis quística (CFTR), y una secuencia de distrofina cADN. Otros productos de gen útiles incluyen los que son útiles para el tratamiento de hemofilia A (por ejemplo, el Factor VIII y sus variantes, incluyendo la cadena ligera y la cadena pesada del heterodímero, opcionalmente enlazados de forma operativa por medio de una unión), el Factor VIII suprimido en el dominio B, véanse los documentos US núms. 6.200.560 y 6.221.349), y útiles para el tratamiento de la hemofilia B (por ejemplo, Factor IX).
Todavía otros productos de gen adiciona.les incluyen polipéptidos que ocurren de forma no natural, tal como polipéptidos quiméricos o híbridos que tienen una secuencia de aminoácido que ocurre de forma no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de diseño de cadena simple podrían ser útiles en ciertos pacientes inmunocomprometidos. Otros tipos de secuencias de gen que ocurren de forma no natural incluyen moléculas antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tal como ribozimas, que podrían ser usadas para reducir la sobreexpresión de un objetivo.
Las reducción y/o la modulación de expresión de gen son particularmente deseables para el tratamiento de condiciones hiperproliferativas caracterizadas por células hiperproliferantes, como son el cáncer y la psoriasis. Los polipéptidos objetivo incluyen aquellos polipéptidos que son producidos exclusivamente o a niveles más altos en células hiperproliferantes en comparación con células normales. Los antígenos objetivo incluyen polipéptidos codificados por oncogenes tal como myb, myc, fyn, y el gen de translocación bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk y EGRF. Adicionalmente a los productos de oncogén como antígenos objetivo, los polipéptidos objetivo para tratamientos anti-cáncer y para regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos formados por linfomas de células B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas realizaciones, se
usan también como antígenos objetivo para enfermedad autoinmune. Se pueden usar otros polipéptidos asociados a tumor como polipéptidos objetivo tal como los polipéptidos que se encuentran a niveles más altos en células de tumores incluyendo el polipéptido reconocido por el anticuerpo monoclonal 17-1A, y polipéptidos de enlace de folato.
Otros polipéptidos terapéuticos y proteínas adecuadas incluyen los que pueden ser útiles para el tratamiento de individuos que adolecen de enfermedades autoinmunes y desórdenes que confieren una amplia respuesta inmune de base protectora frente a objetivos asociados a autoinmunidad incluyendo los receptores de células que producen anticuerpos auto-dirigidos. Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen artritis reumatoide (RA), esclerosis múltiple (MS), síndrome de Sjörgen, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmune, artritis reactiva, espondilitis anquilosante, escleroderma, polimiositis, dermatomiositis, psoriasis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, enfermedad de Crohn y colitis ulcerante. Cada una de esas enfermedades se caracteriza por receptores de células T (TCRs) que enlazan con antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada a enfermedades autoinmunes.
Los vectores adenovirales quiméricos de la invención son particularmente adecuados para regímenes terapéuticos en los que se desean múltiples suministros adenovirales mediados por transgenes, por ejemplo en regímenes que incluyen el re-suministro del mismo transgén o en regímenes de combinación que incluyen el suministro de otros transgenes. Tales regímenes pueden incluir la administración de un vector adenoviral quimérico, seguido de readministración con un vector del mismo adenovirus del serotipo. Los regímenes particularmente deseables incluyen la administración del vector adenoviral quimérico de la invención, en el que el serotipo del vector viral suministrado en la primera administración difiere del serotipo del vector viral utilizado en una o más de las administraciones posteriores. Por ejemplo, un régimen terapéutico incluye la administración de un vector quimérico y la administración repetitiva con uno o más vectores adenovirales del mismo o de diferentes serotipos. En otro ejemplo, un régimen terapéutico incluye la administración de un vector adenoviral seguido de administración repetitiva con un vector quimérico de la invención que difiere del serotipo del primer vector adenoviral suministrado, y opcionalmente la administración adicional con otro vector que es igual o, con preferencia, difiere del vector de las etapas de administración anteriores. Estos regímenes no se limitan al suministro de vectores adenovirales construidos usando los serotipos quiméricos de la invención. Por el contrario, esos regímenes pueden utilizar fácilmente vectores quiméricos o no quiméricos de otros serotipos adenovirales, los cuales pueden proceder de fuentes artificiales, de primates humanos o no humanos, o de otros mamíferos, en combinación con uno o más de los vectores quiméricos de la invención. Ejemplos de tales serotipos se discuten en otras posiciones del presente documento. Además, esos regímenes terapéuticos pueden incluir ya sea el suministro simultáneo o bien secuencial de vectores adenovirales quiméricos de la invención en combinación con vectores no adenovirales, vectores no virales, y/o una diversidad de otros compuestos o moléculas terapéuticamente útiles. La invención no se limita a esos regímenes terapéuticos, de los que una diversidad de ellos resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.
B. Suministro mediado por Ad de transgenes inmunogénicos
Los adenovirus de la invención pueden ser empleados como posiciones inmunogénicas. Según se utiliza en la presente memoria, una composición inmunogénica es una composición en la que se ha montado una respuesta humoral (por ejemplo, anticuerpo) o celular (por ejemplo, una célula T citotóxica) para un producto de transgén suministrado por la composición inmunogénica a continuación del suministro a un mamífero, y con preferencia un primate. La presente invención proporciona un Ad que puede contener en cualquiera de sus supresiones de secuencia de adenovirus un gen que codifica el inmunógeno deseado. Los adenovirus quiméricos basados en serotipos de simio o de otro primate mamífero no humano es probable que sean más adecuados como vacuna de virus recombinante vivo en diferentes especies animales en comparación con un adenovirus de origen humano, pero no se limita a ese uso. Los adenovirus recombinantes pueden ser usados como vacunas profilácticas o terapéuticas frente a cualquier patógeno para el que el (los) antígeno(s) sea(n) crucial(es) para la inducción de una respuesta inmune y capaz(ces) de limitar la expansión del patógeno que haya sido identificado y para el que está disponible el cADN.
Tales composiciones de vacuna (u otro inmunogénico) son formuladas en un vehículo de suministro adecuado, según se ha descrito con anterioridad. En general, las dosis para las composiciones inmunogénicas están comprendidas en la gama definida con anterioridad para las composiciones terapéuticas. Se pueden monitorizar los niveles de inmunidad del gen seleccionado para determinar la necesidad, si la hay, de refuerzos. A continuación de una evaluación de los títulos de anticuerpo en el suero, se pueden desear inmunizaciones de refuerzo opcionales.
Opcionalmente, un composición de vacuna de la invención puede ser formulada de modo que contenga otros componentes, incluyendo, por ejemplo, adyuvantes, estabilizadores, ajustadores de pH, conservantes y similares. Tales componentes son bien conocidos por los expertos en la práctica de las vacunas. Ejemplos de adyuvantes adecuados incluyen, sin limitación, liposomas, alum, monofosforil lípido A, y cualquier factor biológicamente activo, tal como citoquina, una interleuquina, una quimioquina, un ligando, y combinaciones óptimas de los mismos. Algunos de esos factores biológicamente activos pueden ser expresados in vivo, por ejemplo a través de un plásmido o de un vector viral. Por ejemplo, un adyuvante de ese tipo puede ser administrado con una vacuna de ADN de inducción que codifica un antígeno para potenciar la respuesta inmune específica del antígeno en comparación con la respuesta inmune generada tras la inducción con vacuna de ADN que codifica el antígeno
solamente.
Los adenovirus son administrados en “una cantidad inmunogénica”, es decir, una cantidad de adenovirus que es efectiva en una ruta de administración para transfectar las células deseadas y proporcionar niveles de expresión suficientes del gen seleccionado para inducir una respuesta inmune. Cuando se proporciona inmunidad protectora, los adenovirus recombinantes son considerados como composiciones de vacuna útiles en la prevención de infección y/o de enfermedad recurrente.
Alternativamente, o adicionalmente, los vectores de la invención pueden contener un transgén que codifica un péptido, polipéptido o proteína que induce una respuesta inmune a un inmunógeno seleccionado. Los adenovirus recombinantes de la presente invención se espera que sean altamente eficaces en la inducción de células T citolíticas y de anticuerpos para ser insertados en la proteína antigénica heteróloga expresada por el vector.
Por ejemplo, los inmunógenos pueden ser seleccionados a partir de una diversidad de familias virales. Ejemplos de familias virales deseables frente a las que sería deseable incluir una respuesta inmune incluyen la familia picovirus, la cual incluye los géneros rinovirus, que son responsables de aproximadamente el 50% de los casos de resfriado común; los géneros enterovirus, que incluyen los poliovirus, coxsackievirus, ecovirus y enterovirus humanos tales como el virus de la hepatitis A, y los géneros ortovirus, que son responsables de la fiebre aftosa, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia de virus de los picomavirus, los antígenos objetivo incluyen VP1, BVP2, VP3, VP4 y VPG. Otra familia viral incluye la familia calcivirus, que abarca el grupo de virus de Norwalk, que son un importante agente causante de gastroenteritis epidémica, Otra familia viral más que es deseable usar en la objetivación de antígenos para inducir respuestas inmunes en humanos y animales no humanos, es la familia togavirus, la cual incluye el género alfavirus, que incluye el virus de Sindbis, el virus de Ross-River, y encefalitis equina Venezuelan, Eastern & Western, y los rubivirus, incluyendo el virus de la rubeola. La familia flaviviridae incluye los virus del dengue, de la fiebre amarilla, de la encefalitis japonesa, de la encefalitis de St. Louis, y de la encefalitis transmitida por garrapatas. Otros antígenos objetivo pueden ser generados a partir de la hepatitis C o de la familia coronavirus, la cual incluye un número de virus no humanos tal como el virus de la bronquitis infecciosa (aves de corral), el virus gastroentérico de transmisión porcina (cerdo), el virus de la encefalomielitis de hemaglutinina porcina (cerdo), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gato), el coronavirus entérico felino (gato), el coronavirus canino (perro), y los coronavirus respiratorios humanos, los cuales pueden causar el resfriado común y la hepatitis no A, B o C. Adicionalmente, los coronavirus humanos incluyen el agente causante putativo del síndrome respiratorio repentino agudo (SARS). Dentro de la familia coronavirus, los antígenos objetivo incluyen el E1 (también denominado M o proteína matriz), E2 (también denominado S o proteína de Spike), E3 (también denominado HE o hemaglutina-elterosa), glicoproteína (no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocápside). Incluso otros antígenos adicionales pueden ser objetivos frente a la familia rabdovirus, la cual incluye los géneros vesiculovirus (por ejemplo, el virus de la estomatitis vesicular), y los géneros lissavirus (por ejemplo, las rabias). Dentro de la familia rabdovirus, los antígenos adecuados pueden ser derivados de la proteína G o de la proteína N. La familia filoviridae, la cual incluye los virus de la fiebre hemorrágica tales como el virus Marburg y el Ébola, pueden ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramixovirus incluye el virus de parainfluenza tipo 1, el virus de parainfluenza tipo 3, el virus de parainfluenza bovina tipo 3, el rubulavirus (virus de las paperas), el virus de parainfluenza tipo 2, el virus de parainfluenza tipo 4, el virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), de la peste bovina, el morbilivirus, el cual incluye el sarampión y el moquillo canino, y el pneumovirus, el cual incluye el virus sincitial respiratorio. El virus de influenza está clasificado dentro de la familia ortomixovirus y es una fuente adecuada de antígeno (por ejemplo, la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye los géneros bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), flebovirus (fiebre del valle del Rift), hantavirus (el puremala es un virus de la fiebre de hemahagin), nairovirus (enfermedad de la oveja de Nairobi) y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos frente a LCM y el virus de la fiebre de Lassa. La familia reovirus incluyen el género reovirus, rotavirus (que causa gastroenteritis aguda en niños), orbivirus, y cultivirus (fiebre de la garrapata de Colorado), Lebombo (humanos) encefalosis equina, lengua azul.
La familia retrovirus incluye la sub-familia oncovirinal que abarca enfermedades humanas y veterinarias tales como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodficiencia en simios (VIS), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la anemia infecciosa equina, y el espumavirinal). Entre los lentivirus, han sido descritos muchos antígenos adecuados y pueden ser fácilmente seleccionados. Ejemplos de antígenos de VIH y de VIS adecuados incluyen, sin limitación, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef, y Rev, así como diversos fragmentos de las mismas. Por ejemplo, los fragmentos adecuados de la proteína Env pueden incluir cualquiera de sus subunidades tal como el gp120, gp160, gp41, o fragmentos más pequeños de las mismas, por ejemplo de al menos 8 aminoácidos de longitud. De forma similar, se pueden seleccionar fragmentos de la proteína tat. [Véanse los documentos de Patente US núm.
5.891.994 y Patente US núm. 6.193.981]. Véanse también las proteínas de VIH y VIS descritas por D.H. Barouch et al., en J. Virol., 75(5): 2462-2467 (Marzo de 2001), y R.R. Amara, et al., en Science, 292: 69-74 (6 de Abril de 2001). En otro ejemplo, las proteínas o péptidos inmunogénicos de VIH y/o VIS, pueden ser usados para formar proteínas de fusión u otras moléculas inmunogénicas. Véase, por ejemplo, las proteínas de fusión Tat y/o Nef de VIH-1 y los regímenes de inmunización descritos en el documento WO 01/54719, publicado el 2 de Agosto de 2001, y el documento WO 99/16884, publicado el 8 de Abril de 1999. La invención no se limita a las proteínas o los péptidos inmunogénicos de VIH y de VIS que se describen en la presente memoria. Adicionalmente, han sido descritas una pluralidad de modificaciones en esas proteínas, o pueden ser fácilmente realizadas por un experto en la materia.
Véase, por ejemplo, la proteína gag modificada que se describe en la Patente US núm. 5.972.596. Además, cualesquiera inmunógenos de VIH y/o de VIS deseados pueden ser suministrados solos o en combinación. Tales combinaciones pueden incluir expresión desde un vector simple o desde múltiples vectores. Opcionalmente, otra combinación puede incluir el suministro de uno o más inmunógenos expresados con el suministro de uno o más de los inmunógenos en forma de proteína. Tales combinaciones se discuten con mayor detalle en lo que sigue.
La familia papovavirus incluye la sub-familia poliomavirus (virus BKU y JCU) y la sub-familia papilomavirus (asociada a cánceres o progresión maligna de papiloma). La familia adenovirus incluye los virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que causan enfermedad respiratoria y/o enteritis. El parvovirus incluye la familia de parvovirus felino (enteritis felina), panleucopeniavirus felino, parvovirus canino, y parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la sub-familia alfaherpesvirinae, la cual abarca el género simplexvirus (HSVI, HSVII), varicelovirus (seudo-rabias, varicela zóster), y la sub-familia betaherpesvirus, la cual incluye el género citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la sub-familia gammaherpesvirinae, la cual incluye los géneros linfocitovirus, EBV (linfoma de Burkitt), rinotraqueitis infecciosa, virus de la enfermedad de Marek, y radovirus. La familia poxvirus incluye la sub-familia cordopoxvirinae, la cual abarca los géneros ortopoxvirus (Variola (viruela) y Vaccinia (viruela bovina), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la sub-familia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la hepatitis B. Un virus sin clasificar que puede ser una fuente adecuada de antígenos es el virus de la hepatitis delta. Otras fuentes adicionales pueden incluir el virus de la enfermedad bursal infecciosa aviar y el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino. La familia alfavirus incluye el virus de la arteritis equina y varios virus de encefalitis.
Los virus de la presente invención pueden portar también inmunógenos que sean útiles para inmunizar un animal humano o no humano frente a otros patógenos incluyendo las bacterias, hongos, microorganismos parásitos o parásitos multicelulares que infecten vertebrados humanos y no humanos, o procedentes de una célula de cáncer o de una célula de tumor. Ejemplos de patógenos bacterianos incluyen los cocos patogénicos gran-positivos que incluyen los neumococos; estafilococos, y estreptococos. Los cocos patogénicos gran-negativos incluyen los meningococos; gonococos. Los bacilos gran-negativos entéricos patogénicos incluyen los enterobacteriáceos; las seudomonas, acinetobacterias y eikenella; meloidiosis; salmonelosis; shigella; hemófilos; moraxella; H. ducreyl (que causa el cancroide); brucella; franisella tularensis (que causa tularemia); yersinia (pasteurella); streptobacillus molliformis y spirillum; los bacilos gran-positivos incluyen los listeria monocitogenes; erisipelotrix rusiopatiae; corynobacterium diphteria (difteria); cólera; anthracis B (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal); y bartyonelosis. Las enfermedades causadas por bacterias anaeróbicas patogénicas incluyen el tétanos; botulismo; otra clostridia; tuberculosis; lepra, y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patogénicas incluyen la sífilis; treponematosis; sífilis pian, pinta y endémica, y leptoespirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patógenas más elevadas y por hongos patogénicos incluyen la actinomicosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y coccidiyodomicosis; candidiasis, aspergilosis y mucomicosis; esporotricosis; paracoccidiyodomicosis, petrielidosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones ricketsianas incluyen la fiebre del tifus T, la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, la fiebre Q, y la rickettsiosis. Ejemplos de micoplasma y de infecciones clamidiales incluyen: mucoplasma penumoniae; linfogranuloma venéreo; psitacosis; e infecciones clamidiales perinatales. Las eucariotas patogénicas abarcan las infecciones de protozoos patogénicos y helmintos y las infecciones producidas por los mismos incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; pneumocystis carinii; Trichans; toxoplasm gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; nematodos; trematodos o platijas, y el cestodo (la tenia).
Muchos de esos organismos y/o toxinas producidas por los mismos han sido identificados por el Centro de Control de Enfermedades [(CDC), Departamento de Sanidad y Servicios Humanos, USA] como agentes que tienen potencial para uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de esos agentes biológicos incluyen Bacillus anthracis (ántrax), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (plaga), variola major (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebres hemorrágicas virales [filovirus (por ejemplo, Ébola, Marburg)], y arenavirus [por ejemplo, Lassa, Machupo], todos los cuales están clasificados en la actualidad como agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (meloidiosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium parfringens y su toxina (toxina épsilon), especies de estafilococos y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psitacci (psitacosis), ataques a la seguridad del agua (por ejemplo, Vibrio cholerae, Cryptosporidium parvum), fiebre del tifus (Rickettsia powazekii), y encefalitis viral (alfavirus, por ejemplo encefalitis equina Venezuelan; encefalitis equina Eastern; encefalitis equina western); todos los cuales están actualmente clasificados como agentes de categoría B; y virus Nipan y hantavirus, los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría C. Adicionalmente, otros organismos que están clasificados de ese modo o de manera diferente, pueden ser identificados y/o usados para tal propósito en el futuro. Se comprenderá fácilmente que los vectores virales y otras construcciones descritas en la presente memoria son útiles para suministrar antígenos a partir de esos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que podrán impedir y/o tratar la infección u otra reacción adversa con esos agentes biológicos.
La administración de los vectores de la invención para suministrar inmunógenos contra la región variable de las células T induce una respuesta inmune que incluye CTLs para eliminar esas células T. En RA, han sido caracterizadas varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad. Esas TCRs incluyen V-3, V-14, V-17 y Vα-17. De ese modo, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al
menos uno de esos polipéptidos inducirá una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en RA. En MS, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Esas TCRs incluyen V-7 y Vα-10. De ese modo, el suministro de una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos uno de esos polipéptidos inducirá una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en MS. En escleroderma, varias regiones variables específicas de TCRs que están involucradas en la enfermedad han sido caracterizadas. Esas TCRs incluyen V-6, BV-8, V-14 y Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 y Vα-12. De ese modo, el suministro de un adenovirus quimérico que codifique al menos uno de esos polipéptidos, inducirá una respuesta inmune que objetivará células T involucradas en escleroderma.
C. Métodos de suministro mediado por Ad
Los niveles terapéuticos, o niveles de inmunidad, del gen seleccionado pueden ser monitorizados para determinar la necesidad, si la hay, de amplificadores. A continuación de una evaluación de respuesta de célula T CD8+, u opcionalmente, de títulos de anticuerpo, en el suero, pueden resultar deseables inmunizaciones de refuerzo opcionales. Opcionalmente, los vectores adenovirales de la invención pueden ser suministrados en una sola administración o en varios regímenes de combinación, por ejemplo en una combinación con un régimen o curso de tratamiento que incluya otros ingredientes activos o en un régimen de inducción y refuerzo. Una diversidad de regímenes de ese tipo han sido descritos en el estado de la técnica y pueden ser seleccionados fácilmente.
Por ejemplo, los regímenes de inducción y refuerzo pueden incluir la administración de un vector a base de ADN (por ejemplo, plásmido), para inducir el sistema inmune hasta una segunda administración u otra adicional, de refuerzo, con antígeno tradicional, tal como una proteína o un virus recombinante portador de las secuencias que codifican dicho antígeno. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/11140, publicado el 2 de Marzo de 2000, incorporado aquí por referencia. Alternativamente, un régimen de inmunización puede incluir la administración de un vector adenoviral quimérico de la invención para reforzar la respuesta inmune a un vector (ya sea viral o a base de ADN) que porte un antígeno o una proteína. En otra alternativa más, un régimen de inmunización incluye la administración de una proteína seguido de un potenciador con un vector que codifique el antígeno.
En una realización, la invención permite un método de inducción y refuerzo de una respuesta inmune a un antígeno seleccionado mediante el suministro de un vector de ADN de plásmido portador de dicho antígeno, seguido de refuerzo con un vector adenoviral de la invención. En una realización, el régimen de inducción y refuerzo incluye la expresión de multi-proteínas desde el vehículo de inducción y/o refuerzo. Véase, por ejemplo, R.T. Amara, Science,
292: 69-74 (6 de Abril de 2001), el cual describe un régimen de multi-proteína para expresión de subunidades de proteína útiles para la generación de una respuesta inmune frente a VIH y VIS. Por ejemplo, una inducción de ADN puede suministrar las Gag, Pol, Vif, VPX y Vpr y Env, Tat y Rev a partir de una única transcripción. Alternativamente, las SIV, Gag, Pol y VIH-1 se suministran en una construcción de adenovirus recombinante de la invención. También se han descrito otros regímenes en los documentos WO 99/16884 y WO 01/54719.
Sin embargo, los regímenes de inducción y refuerzo no se limitan a inmunización para el VIH o para el suministro de esos antígenos. Por ejemplo, la inducción puede incluir el suministro con un primer vector de la invención seguido de refuerzo con un segundo vector, o con una composición que contenga el propio antígeno en forma de proteína. En un ejemplo, el régimen de inducción y refuerzo puede proporcionar una respuesta inmune protectora respecto al virus, la bacteria u otro organismo del que se derive el antígeno. En otra realización deseada, el régimen de inducción y refuerzo proporciona un efecto terapéutico que puede ser medido usando ensayos convencionales para la detección de presencia de la condición para la que se está administrando la terapia.
La composición de inducción puede ser administrada en varios sitios del cuerpo de una manera dependiente de la dosis, dependiendo del antígeno al que vaya dirigida la respuesta inmune. La invención no se limita a la cantidad o al sitio de la(s) inyección(es) o al portador farmacéutico. Por el contrario, el régimen puede incluir una etapa de inducción y/o refuerzo, cada uno de los cuales puede incluir una sola dosis o una dosificación que se administre por horas, por días, por semanas o por meses, o por años. Como ejemplo, los mamíferos pueden recibir una o dos dosis que contengan entre alrededor de 10 µg y alrededor de 50 µg de plásmido en el portador. Una cantidad deseable de una composición de ADN está comprendida en la gama de entre alrededor de 1 µg y alrededor de 10.000 µg del vector de ADN. Las dosificaciones pueden variar desde alrededor de 1 µg hasta alrededor de 1000 µg de ADN por kg de peso corporal del sujeto. La cantidad o el sitio de suministro se selecciona deseablemente en base a la identidad y a la condición del mamífero. La unidad de dosificación del vector adecuado para el suministro del antígeno al mamífero se describe en la presente memoria. El vector se prepara para su administración siendo suspendido o disuelto en un portador farmacéutica o fisiológicamente aceptable tal como solución salina isotónica; solución de sales isotónicas u otras formulaciones que resultarán evidentes para un experto en tales administraciones. El portador adecuado resultará evidente para los expertos en la materia y dependerá en gran parte de la ruta de administración. Las composiciones de la invención pueden ser administradas a un mamífero de acuerdo con las rutas de administración descritas con anterioridad, en una formulación de liberación sostenida que hace uso de un polímero biocompatible biodegradable, o mediante suministro en el sitio usando micelas, geles y liposomas. Opcionalmente, la etapa de inducción incluye también la administración con la composición de inducción, de una cantidad adecuada de un adyuvante, tal como se define en la presente memoria.
Con preferencia, se administra una composición de refuerzo en aproximadamente 2 a aproximadamente 27 semanas después de la administración de la composición de inducción al sujeto mamífero. La administración de la composición de refuerzo se realiza usando una vacuna de ADN efectiva. La composición de refuerzo puede estar compuesta de un vector viral recombinante derivado de la misma fuente viral (por ejemplo, las secuencias adenovirales descritas en la presente memoria) o de otra fuente. Alternativamente, la “composición de refuerzo” puede ser una composición que contenga el mismo antígeno que el codificado en la vacuna de ADN de inducción, pero en forma de una proteína o de un péptido, cuya composición induce una respuesta inmune en el anfitrión. En otra realización, la composición de refuerzo contiene una secuencia de ADN que codifica el antígeno bajo el control de una secuencia reguladora que dirige su expresión en una célula de mamífero, por ejemplo vectores tales como vectores bacterianos o virales bien conocidos. Los requisitos principales de la composición de refuerzo consisten en que el antígeno de la composición es el mismo antígeno, o un antígeno de reacción cruzada, que el codificado por la composición de inducción.
En otra realización, los vectores adenovirales de la invención son también adecuados para su uso en una diversidad de otros regímenes de inmunización y terapéuticos. Tales regímenes pueden incluir el suministro de vectores adenovirales de la invención de forma simultánea o secuencial con vectores de Ad de diferentes cápsides de serotipo, regímenes en los que los vectores adenovirales de la invención son suministrados simultáneamente o secuencialmente con proteínas, péptidos, y/u otros compuestos terapéuticos o inmunogénicos biológicamente útiles. Tales usos pueden resultar fácilmente evidentes para un experto en la materia.
IV. Secuencias de adenovirus 18 de simio
A continuación se describen secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácido SA18 de Ad, las cuales se han aislado a partir de otro material viral con el que las mismas están asociadas en la naturaleza. Estas secuencias son útiles en la preparación de moléculas heterólogas que contienen secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácido, y regiones y fragmentos de las mismas según se describe en la presente memoria, vectores virales que son útiles para una diversidad de propósitos, incluyendo las construcciones y composiciones, y métodos tales como los que se describen en la presente memoria para los adenovirus quiméricos, incluyendo por ejemplo en células anfitrión para la producción de virus que requieren funciones auxiliares, como vehículos de suministro para moléculas heterólogas tales como los que se describen en la presente memoria. Esas secuencias son también útiles para la generación de los adenovirus quiméricos de la invención
A. Secuencias de ácido nucleico
Las secuencias de ácido nucleico SA18 incluyen nucleótidos SEQ ID núm. 12, nt 1 a 31967. Véase el Listado de Secuencias que se acompaña. Las secuencias de ácido nucleico abarcan además la cadena que es complementaria con las secuencias de SEQ ID núm. 12, así como las secuencias de ARN y de cADN que corresponden a las secuencias de esos números de secuencias y sus cadenas complementarias. Además, están incluidas las secuencias de ácido nucleico que son de más del 95 a 98%, y más preferentemente de alrededor del 99 al 99,9%, homólogas o idénticas a las del Listado de Secuencias. También están incluidas en las secuencias de ácido nucleico las variantes naturales y las modificaciones de diseño de las secuencias proporcionadas en SEQ ID núm. 12 y sus cadenas complementarias. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas que son conocidas en el estado de la técnica, metilación, y sustitución de uno o más de los nucleótidos que ocurren de forma natural con un nucleótido degenerado.
También son de utilidad fragmentos de las secuencias de SA18, sus cadenas complementarias, cADN y ARN complementarios con las mismas. Los fragmentos adecuados son de al menos 15 nucleótidos de longitud, y abarcan fragmentos funcionales, es decir, fragmentos que son de interés biológico. Por ejemplo, un fragmento funcional puede expresar un producto adenoviral deseado o puede ser útil en la producción de vectores virales recombinantes. Tales fragmentos incluyen las secuencias y fragmentos de gen que se relacionan en las tablas que siguen.
Las tablas que siguen proporcionan las regiones de transcripción y tramas de lectura abierta en las secuencias de adenovirus de simio. Para algunos genes, las transcripciones y las tramas de lectura abierta (ORFs) se localizan en la cadena complementaria con la presentada en SEQ ID núm. 12. Véase, por ejemplo, E2b, E4 y E2a. También se muestran los pesos moleculares calculados de las proteínas codificadas.
Región de gen de adenovirus
Proteína Ad SA18, SEQ ID Núm. 12
Inicio
Fin P.M.
ITR
1 180
E1a
13S 916 1765 27264
12S
916 1765 24081
E1b
T pequeña 1874 2380 19423
T grande
2179 3609 52741
IX
3678 4079 13701
E2b
Iva2 5478 4126 51925
Polimerasa
13745 5229 128392
PTP
13745 8597 75358
Agnoproteína
8007 8705 23610
L1
52/55 kD 10788 11945 43416
IIIa
11966 13699 63999
Penton
13796 15322 57166
VII
15328 15873 20352
V
15920 17050 42020
L3
VI 17348 18154 29222
Hexon
18257 21010 102912
Endoproteasa
21029 21640 23015
2a
DBP 23147 21711 53626
L4
100 kD 23175 25541 87538
Homólogo de 22 kD
25204 25797 22206
Homólogo de 33 kD
25204 26025 24263
VIII
26107 26817 25490
E3
Orf #1 26817 27125 11814
L5
Fibra 27192 29015 65455
E4
Orf 6/7 30169 29087 13768
Orf 6
30169 29303 33832
Orf 4
30464 30099 14154
Orf 3
30816 30466 13493
Orf 2
31205 30813 14698
Orf 1
31608 31231 14054
ITR
31788 31967
Las secuencias de ácido nucleico adenoviral SA18 son útiles como agentes terapéuticos e inmunogénicos y en la construcción de una diversidad de sistemas de vector y de células anfitrión. Tales vectores son útiles para cualquiera de los objetivos descritos en lo que antecede para el adenovirus quimérico. Adicionalmente, esas secuencias y
5 productos de SA18 pueden ser usados solos o en combinación con otras secuencias o fragmentos adenovirales, o en combinación con elementos procedentes de otras secuencias adenovirales o no adenovirales. Las secuencias adenovirales son también útiles como vectores de suministro antisentido, vectores de terapia de gen, o vectores de vacuna, y en métodos de uso de los mismos. De ese modo, las moléculas de ácido nucleico, los vectores de suministro de gen, y las células anfitrión que contienen las secuencias de Ad descritas, son también de utilidad.
10 Por ejemplo, la invención puede utilizar una molécula de ácido nucleico que contenga secuencias ITR de Ad de simio. En otro ejemplo, la invención utiliza una molécula de ácido nucleico que contiene secuencias de Ad de simio que codifican un producto de gen de Ad deseado. Otra molécula más de ácido nucleico construida usando las secuencias descritas resultará fácilmente evidente para un experto en la materia, a la vista de la información que se proporciona en la presente memoria.
15 En una realización, las regiones de gen de Ad de simio identificadas en la presente memoria pueden ser usadas en
una diversidad de vectores para el suministro de una molécula heteróloga a una célula. Ejemplos de tales moléculas y métodos de suministro se proporcionan en la Sección III de la presente memoria. Por ejemplo, se generan vectores para expresión de una proteína de cápside adenoviral (o para un fragmento de la misma) a los efectos de generar un vector viral en una célula anfitrión de empaquetamiento. Tales vectores pueden ser diseñados para expresión en trans. Alternativamente tales vectores están diseñados para proporcionar células que contienen de forma estable secuencias que expresan funciones adenovirales deseadas, por ejemplo una o más de E1a, E1b, las secuencias de repetición terminales, E2a, E2b, E4, la región E4ORF6.
Adicionalmente, las secuencias de gen de adenovirus y los fragmentos de las mismas son útiles para proporcionar las funciones auxiliares necesarias para la producción de virus dependientes auxiliares (por ejemplo, vectores adenovirales de funciones esenciales o de virus adenoasociados (AAV)). Para esos métodos de producción, las secuencias adenovirales de simio se utilizan en dicho método de una manera similar a las descritas para el Ad humano. Sin embargo, debido a las diferencias en las secuencias entre las secuencias adenovirales de simio y las de Ad humano, el uso de las secuencias descritas en la presente memoria elimina esencialmente la posibilidad de recombinación homóloga con funciones auxiliares en una célula anfitrión portadora de funciones E1 de Ad humano, por ejemplo, las células 293, que pueden producir contaminantes adenovirales infecciosos durante la producción de rAAV.
Los métodos de producción de rAAV que usan funciones auxiliares adenovirales han sido descritos de forma extensa en la literatura con serotipos adenovirales humanos. Véase, por ejemplo, la Patente US núm. 6.258.595 y las referencias citadas en la presente memoria. Véanse también las Patentes US núm. 5.871.982; WO núm. 99/14354; WO núm. 99/15685, y WO núm. 99/47691: Estos métodos pueden ser usados también en la producción de AAV de serotipo no humano, incluyendo los serotipos de AAV de primate no humano. Las secuencias de gen adenovirales de simio que proporcionan las funciones auxiliares necesarias (por ejemplo, E1a, E1b, E2a y/o E4 ORF6) pueden ser particularmente útiles en la provisión de la función adenoviral necesaria mientras se minimiza o se elimina la posibilidad de recombinación con cualesquiera otros adenovirus presentes en la célula de empaquetamiento de rAAV que sean de origen humano. De ese modo, los genes seleccionados o las tramas de lectura abierta de las secuencias adenovirales pueden ser utilizados en esos métodos de producción de rAAV.
Alternativamente, los vectores de simio adenovirales recombinantes pueden ser utilizados en esos métodos. Tales vectores adenovirales recombinantes pueden incluir, por ejemplo, un Ad/AAV híbrido de simio en el que las secuencias de Ad flanquean una casete de expresión de rAAV compuesta de, por ejemplo, 3’ y/o 5’ ITRs de AAV y un transgén bajo el control de secuencias reguladoras que controlan su expresión. Un experto en la materia reconocerá que otros vectores adenovirales de simio y/o secuencias de gen podrán ser útiles para la producción de rAAV y otros virus dependientes del auxiliar adenoviral.
En otra realización más, las moléculas de ácido nucleico están diseñadas para el suministro y expresión de productos de gen adenovirales seleccionados en una célula anfitrión para conseguir un efecto sicológico deseado. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contenga secuencias que codifican una proteína E1 de adenovirus puede ser suministrada a un sujeto para su uso como terapia contra el cáncer. Opcionalmente, una molécula de ese tipo se formula en un portador a base de lípido y preferentemente en células de cáncer objetivo. Una formulación de ese tipo puede ser combinada con otras terapéuticas contra el cáncer (por ejemplo, cisplatina, taxol o similar). Incluso otros usos para las secuencias adenovirales proporcionadas en la presente memoria podrán resultar fácilmente evidentes para un experto en la materia.
Adicionalmente, un experto en la materia podrá comprender fácilmente que las secuencias de Ad pueden ser adaptadas fácilmente para su uso en una diversidad de sistemas de vector viral y no viral para el suministro in vitro, ex vivo o in vivo de moléculas terapéuticas e inmunogénicas, incluyendo cualquiera de las que se han identificado como suministrables a través de los adenovirus quiméricos de la invención. Por ejemplo, el genoma de Ad de simio puede ser utilizado en una diversidad de sistemas de vectores de rAd y de no rAd. Tales sistemas de vectores pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, lentivirus, retrovirus, parvovirus, virus de vacunas, y sistemas virales adenoasociados, entre otros. La selección de esos vectores no es una limitación de la presente invención.
También son de utilidad las moléculas útiles para la producción de las proteínas de simio y derivados de simio que se han descrito en la presente memoria. Tales moléculas, que portan polinucleótidos que incluyen las secuencias de ADN de Ad de simio descritas en la presente memoria, pueden estar en forma de vector.
B. Proteínas adenovirales de simio
La invención puede utilizar productos de gen de los adenovirus citados con anterioridad, tal como proteínas, enzimas, y fragmentos de los mismos, que son codificados mediante los ácidos nucleicos adenovirales descritos. La invención puede utilizar proteínas SA18, enzimas y fragmentos de las mismas, que tengan las secuencias de aminoácido codificadas por esas secuencias de ácido nucleico que son generadas por otros métodos. Tales proteínas incluyen las codificadas por las tramas de lectura abierta identificadas en las tablas anteriores, y por los fragmentos de las mismas.
La invención puede utilizar proteínas adenovirales de simio únicas que sean sustancialmente puras, es decir, que
estén libres de otras proteínas virales y proteinaceas. Con preferencia, esas proteínas son al menos un 10% homogéneas, más preferentemente un 60% homogéneas, y más preferiblemente un 95% homogéneas.
La invención puede utilizar proteínas de cápside derivadas de simio únicas. Según se utiliza en la presente memoria, una proteína de cápside derivada de simio incluye una proteína de cápside adenoviral que contiene una proteína de cápside SA18 o un fragmento de la misma, según se define en lo que antecede, incluyendo, sin limitación, las proteínas de cápside quiméricas, las proteínas de fusión, las proteínas de cápside artificiales, las proteínas de cápside sintéticas, y las proteínas de cápside recombinantes, sin limitación en los medios de generación de esas proteínas.
De forma adecuada, algunas proteínas de cápside derivadas de simio contienen una o más regiones SA18 o fragmentos de las mismas (por ejemplo, una hexon, penton, fibra o fragmento de las mismas) en combinación con regiones de cápside o fragmentos de las mismas de diferentes serotipos adenovirales, o proteínas de cápside o fragmentos modificados de simio, según se describe en la presente memoria. Una “modificación de una proteína de cápside asociada a tropismo alterado”, según se usa en la presente memoria, incluye una proteína de cápside alterada, es decir, una región de proteína penton, hexon o de fibra, o un fragmento de la misma, tal como el dominio de perilla de la región de fibra, o un polinucleótido que codifique la misma, tal como de especificidad alterada. La cápside derivada de simio puede ser construida con uno más de los Ad de simio según se ha descrito, o con otros serotipos de Ad que pueden ser de origen humano o no humano. Tal Ad puede ser obtenido a partir de una diversidad de fuentes incluyendo las fuentes ATCC, comerciales y académicas, o las secuencias de Ad pueden ser obtenidas a partir de GenBank o de otras fuentes adecuadas.
Las secuencias de aminoácido de las proteínas penton de adenovirus de simio se proporcionan en la presente memoria. La proteína penton SA18 de Ad se proporciona en SEQ ID núm. 13. De manera adecuada, cualquiera de esas proteínas penton, o fragmentos únicos de las mismas, puede ser utilizada para una diversidad de propósitos. Ejemplos de fragmentos adecuados incluyen la penton que tiene truncamientos de terminal N y/o de terminal C de alrededor de 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos, en base a la numeración de aminoácido que se ha proporcionado con anterioridad. Otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos de terminal C, o de terminal N, internos más cortos. Además, la proteína penton puede ser modificada para una diversidad de propósitos conocidos por los expertos en la materia.
La invención puede utilizar las secuencias de aminoácido de la proteína penton de SA18, SEQ ID núm. 14. De manera adecuada, esta proteína hexon, o los fragmentos únicos de la misma, pueden ser utilizados para una diversidad de propósitos. Ejemplos de fragmentos adecuados incluyen la hexon que tiene truncamientos de terminal N y/o de terminal C de alrededor de 50, 100, 150, 200, 300, 400 o 500 aminoácidos, en base a la numeración de aminoácido proporcionada con anterioridad y en SEQ ID núm. 14. Otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos de terminal C, o de terminal N, internos más cortos. Por ejemplo, un fragmento adecuado contiene la región de bucle (dominio) de la proteína hexon, designada como DE1 o FG1, o una región hipervariable de la misma. Tales fragmentos incluyen las regiones que abarcan residuos de aminoácido de alrededor de 125 a 443; alrededor de 138 a 441, o fragmentos más pequeños, tal como los que abarcan desde alrededor del residuo 138 al residuo 163; alrededor del 170 a alrededor del 176; alrededor del 195 a alrededor del residuo 203; alrededor del 233 a alrededor del 246; alrededor del 253 a alrededor del 264; alrededor del 287 a alrededor del 297; alrededor del 404 a alrededor del 430; alrededor del 430 al 559, alrededor del 545 al 650, de las proteínas hexon de simio con referencia a SEQ ID núm. 14. Otros fragmentos adecuados pueden ser identificados fácilmente por un experto en la materia. Además, la proteína hexon puede ser modificada para una diversidad de propósitos conocidos por los expertos en la materia. Puesto que la proteína hexon es la determinante para serotipo de un adenovirus, tales proteínas hexon artificiales podrían dar como resultado adenovirus que tengan serotipos artificiales. Otras proteínas de cápside artificiales pueden ser construidas también usando las secuencias penton de Ad de chimpancé y/o secuencias de fibra descritas en la presente memoria y/o fragmentos de las mismas.
En un ejemplo, puede ser deseable generar un adenovirus que tenga una proteína hexon alterada utilizando las secuencias de una proteína hexon. Un método adecuado para alterar proteínas hexon ha sido descrito en la Patente US núm. 5.922.315, la cual se incorpora por referencia. En este método, al menos una región de bucle de la hexon de adenovirus se cambia por al menos una región de bucle de otro serotipo de adenovirus. De ese modo, al menos una región de bucle de tal proteína hexon de adenovirus alterada es una región de bucle de hexon de Ad de simio. En una realización, se reemplaza una región de bucle de la proteína hexon SA18 por una región de bucle de otro serotipo de adenovirus. En otra realización, la región de bucle de la hexon SA18 se usa para reemplazar una región de bucle del otro serotipo de adenovirus. Los serotipos de adenovirus adecuados pueden ser fácilmente seleccionados entre serotipos humanos y no humanos. Según se describe en la presente memoria, la SA18 se selecciona a efectos de ilustración solamente; las otras proteínas hexon de Ad de simio pueden ser alteradas de forma similar, o usadas para alterar otra hexon de Ad. La selección de un serotipo adecuado no es una limitación de la presente invención. Incluso otros usos para las secuencias de proteínas hexon resultarán fácilmente evidentes para el experto en la materia.
La invención puede utilizar proteínas de fibra de los adenovirus de simio descritos en la presente memoria. La proteína de fibra de la AdSA18 tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID núm. 15. De forma adecuada, esta proteína de fibra, o los fragmentos únicos de la misma, puede ser utilizada para una diversidad de propósitos. Un
fragmento adecuado es la perilla de la fibra, la cual abarca aproximadamente los aminoácidos 247 a 425 de SEQ ID núm. 15. Ejemplos de otros fragmentos adecuados incluyen la fibra que tiene truncamientos de termina N y/o de terminal C de alrededor de 50, 100, 150 ó 200 aminoácidos, en base a la numeración de aminoácido proporcionada anteriormente y en SEQ ID núm. 15. Incluso otros fragmentos adecuados incluyen fragmentos internos. Además, la proteína de fibra puede ser modificada usando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la materia.
La invención puede utilizar fragmentos únicos de las proteínas descritas en la presente memoria que sean de al menos 8 aminoácidos de longitud. Sin embargo, se pueden utilizar también fácilmente fragmentos de otras longitudes deseadas. Además, la invención abarca tales modificaciones según puedan ser introducidas para potenciar la producción y/o la expresión de un producto de gen SA18, por ejemplo, la construcción de una molécula de fusión en la que todo, o un fragmento del producto de gen SA18 esté fusionado (ya sea directamente o ya sea a través de un ligante) con una pareja de fusión que se tenga que potenciar. Otras modificaciones adecuadas incluyen, sin limitación, el truncamiento de una región de codificación (por ejemplo, una proteína o una enzima) para eliminar una pre-o una pro-proteína normalmente troceada, y para proporcionar la proteína o enzima madura y/o la mutación de una región de codificación para proporcionar un producto de gen secretable. Otras modificaciones adicionales resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia. La invención puede utilizar proteínas que tengan al menos alrededor de un 95% a un 99% de identidad con las proteínas SA189 que se proporcionan en la presente memoria.
Según se describe en la presente memoria, los vectores de la invención que contienen las proteínas de cápside de adenovirus son particularmente adecuados para su uso en aplicaciones en las que los anticuerpos neutralizantes disminuyen la efectividad de otros vectores basados en serotipos de Ad, así como de otros vectores virales. Los vectores rAd de la invención son particularmente ventajosos en la re-administración para terapia repetitiva de gen o para potenciar la respuesta inmune (títulos de vacuna). Ejemplos de tales regímenes de vacuna se proporcionan en la presente memoria.
Bajo determinadas circunstancias, puede ser deseable usar uno o más de los productos de gen de SA18 (por ejemplo, un proteína de cápside o un fragmento de la misma) para generar un anticuerpo. El término “un anticuerpo” según se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que está capacitada para enlazar específicamente con un epítope. De ese modo, los anticuerpos enlazan, con preferencia específicamente y sin reactividad cruzada, con un epítope de SA18. Los anticuerpos existen en una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales de alta afinidad, anticuerpos monoclonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos recombinantes y anticuerpos humanizados. Tales anticuerpos se originan a partir de las clases IgG, IgM, IgA, IgD e IgE de inmunoglobulina.
Tales anticuerpos pueden ser generados usando un número cualquiera de métodos conocidos en el estado de la técnica. Anticuerpos adecuados pueden ser generados mediante técnicas convencionales bien conocidas, por ejemplo Kohler y Milstein y las muchas modificaciones conocidas de las mismas. Los anticuerpos de alto título similarmente deseables se generan por aplicación de técnicas recombinantes conocidas a los anticuerpos monoclonales o policlonales desarrollados para esos antígenos [véase, por ejemplo, la solicitud de Patente núm. PCT/GB85700392; LA PUBLICACIÓN DE LA SOLICITUD DE Patente británica núm. GB2188638A; Amit, et al., 1986, Science, 233: 747-753; Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033; solicitud de Patente PCT/WO9007861; y, Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Huse et al., 1988a Science, 246: 1275-1281]. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser producidos por manipulación de las regiones de determinación complementarias de anticuerpos animales o humanos respecto al antígeno de la presente invención. Véase, por ejemplo, E. Mark y Padlin, “Humanización de Anticuerpos Monoclonales”, Capítulo 4, El Manual de Farmacología Experimental, Vol. 113, La Farmacología de Anticuerpos Monoclonales, Springer-Verlag (Junio de 1994); Harlow et al., 1999, Usando Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor, Nueva York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; y, Bird et al., 1988, Science 242: 423-426. También se proporcionan además anticuerpos anti-idiotipo (Ab2) y anticuerpos anti-anti-idiotipo (Ab3). Véase, por ejemplo, M. Wettendorf et al., “Modulación de inmunidad antitumor mediante anticuerpos anti-idiotípicos”. En la Red y Enfermedades Idiotípicas, ed. por J. Cerny y J. Hiernaux, 1990, J. Am. Soc. Microbiol, Washington DC: pp. 203-229]. Estos anticuerpos antiidiotipo y anti-anti-idiotipo son producidos usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Esos anticuerpos pueden ser usados para una diversidad de propósitos, incluyendo métodos y kits clínicos y de diagnóstico.
Bajo ciertas circunstancias, puede resultar deseable introducir una etiqueta detectable o un marcador sobre un producto de gen de SA18, anticuerpo u otra construcción. Según se usa en la presente memoria, una etiqueta detectables es un molécula que es capaz, por si sola o por interacción con otra molécula, de proporcionar una señal detectable. Más deseablemente, la etiqueta es detectable visualmente, por ejemplo por fluorescencia, para su uso fácil en análisis inmunohistoquímicos o en microscopía inmunofluorescente. Por ejemplo, las etiquetas adecuadas incluyen isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), aloficocianina (APC), corifosfina-O (CPO) o tintes en tándem, PE-cianina-5 (PC5), y PE-Texas Red (ECD). Todos esos tintes fluorescentes están disponibles comercialmente, y sus usos son conocidos en el estado de la técnica. Otras etiquetas útiles incluyen una etiqueta de oro coloidal. Incluso otras etiquetas útiles incluyen compuestos o elementos radiactivos. Adicionalmente, las etiquetas incluyen una diversidad de sistemas de enzima que operan para poner de relieve una señal colorimétrica
en un ensayo, por ejemplo, la glucosa oxidasa (que usa la glucosa como un substrato) libera peróxido como un producto que en presencia de peroxidasa y de un donador de hidrógeno tal como la tetrametil benzidina (TMB), produce una TMB oxidizada que se muestra como de un color azul. Otros ejemplos incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), y hexoquinasa junto con glucosa-6-fosfatasa deshidrogenasa que reacciona con ATP, glucosa, y NAD+ para producir, entre otros productos, NADH que se detecta como absorbancia incrementada a una longitud de onda de 340 nm.
Otros sistemas de etiqueta que son utilizados en los métodos de la presente invención son detectables por otros medios, por ejemplo, se utilizan micropartículas de látex coloreadas [Bangs Laboratories, Indiana], en las que se ha incrustado un tinte, en lugar de enzimas para formar conjugados con las secuencias objetivo, que proporcionan una señal visual indicativa de la presencia del complejo resultante en ensayos aplicables.
Los métodos para acoplar o asociar la etiqueta con una molécula deseada, son asimismo convencionales y conocidos por los expertos en la materia. Se han descrito métodos conocidos de fijación de una etiqueta [véase, por ejemplo, Manual de Sondas Fluorescentes y Químicos de Investigación, 6ª Ed., R.P.M. Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, 1996; Pierce Catalog and Handbook, Ciencia de la Vida y Productos de Investigación Analítica, Pierce Chemical Company, Rockford, IL., 1994/1995]. De ese modo, los métodos de selección de etiqueta y acoplamiento, no limitan la presente invención.
Las secuencias, proteínas, y fragmentos descritos en la presente memoria, pueden ser producidos con cualquier medio adecuado, incluyendo producción recombinante, síntesis química, u otros medios sintéticos. Las técnicas de producción adecuadas son bien conocidas por el experto en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY). Alternativamente, los péptidos pueden ser también sintetizados mediante métodos bien conocidos de síntesis de péptidos de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1962); Stewart y Young, Síntesis de Péptido de Fase Sólida (Freeman, San Francisco, 1969), pp. 27-62). Estos y otros métodos de producción adecuados están dentro del conocimiento de los expertos en la materia y no son una limitación de la presente invención.
Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá fácilmente que las secuencias de Ad pueden ser adaptadas fácilmente para uso en una variedad de sistemas de vector viral y no viral para suministro in vitro, ex vivo o ex vivo de moléculas terapéuticas e inmunogénicas. Por ejemplo, en una realización, las proteínas de cápside de Ad de simio y otras proteínas de adenovirus de simio descritas en la presente memoria se usan para el suministro de genes no virales, a base de proteína, moléculas de proteínas y otras moléculas de diagnóstico deseables, terapéuticas e inmunogénicas. En una realización, una proteína está enlazada, directa o indirectamente, a una molécula para objetivar células con un receptor para adenovirus. Con preferencia, se selecciona una proteína de cápside tal como una hexon, penton, fibra o un fragmento de las mismas, que tiene un ligando para un receptor superficial de célula para tal objetivación. Las moléculas adecuadas para el suministro se seleccionan entre las moléculas terapéuticas descritas en la presente memoria y sus productos de gen. Una diversidad de ligantes, incluyendo los lípidos, poliLys, y similares, pueden ser usados como ligantes. Por ejemplo, la proteína penton de simio puede ser utilizada fácilmente para un propósito de ese tipo mediante la producción de una proteína de fusión que usa las secuencias penton de simio de un manera análoga a la descrita en Medina. Kauwe LK, et al., Gene Ther., Mayo de 2001; 8(10): 795-803 y Medina-Kauwe LK, et al., Gene Ther., Diciembre de 2001; 8(23): 1753-1761. Alternativamente, las secuencias de aminoácido de proteína IX de Ad de simio pueden ser utilizadas para objetivar vectores respecto a un receptor superficial de célula, según se ha descrito en la solicitud de Patente US núm. 20010047081. Los ligandos adecuados incluyen un antígeno CD40, una secuencia que contiene RGD o que contiene polilisina, y similares. Incluso otras proteínas de Ad de simio, que incluyen por ejemplo la proteína hexon y/o la proteína de fibra, pueden ser usadas para estos fines y para otros similares.
Incluso otras proteínas adenovirales de la invención pueden ser usadas, por sí solas o en combinación con otra proteína adenoviral, para una diversidad de fines que resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia. Además, otros usos más para las proteínas adenovirales de la invención resultarán fácilmente evidentes para un experto en la materia.
Las composiciones de la presente invención incluyen vectores que suministran una molécula heteróloga a las células, ya sea con fines terapéuticos o ya sea para vacuna. Tales vectores, que contienen ADN de SA18 de adenovirus de simio y un minigén, pueden ser construidos usando técnicas tales como las descritas en la presente memoria para los adenovirus quiméricos, y técnicas tales como las que se conocen en el estado de la técnica. Alternativamente, la SA19 puede ser un fuente de secuencias de adenovirus quiméricos según se describe en la presente memoria.
Los ejemplos que siguen ilustran la construcción y el uso de varios virus quiméricos, incluyendo los Pan5/C1, hu5/Pan7 y hu5/SV25, y Pan6/Pan7. Sin embargo, esas quimeras son solamente ilustrativas y no se pretende que limiten la invención a esas realizaciones ilustradas.
Ejemplo 1 – Construcción de virus de simio quiméricos Pan5/C1
Cinco adenovirus diferentes aislados inicialmente a partir de chimpancés, el AdC68 [Patente US núm. 6.083.716], el
AdPan5, el AdPan7, el AdPan6 y el AdC1 [Patente US núm. 6.083.716], han sido secuenciados. Véase la solicitud Internacional núm. PCT/US02/33645, depositada en Noviembre de 2002 para las secuencias de Pan5 [SEQ ID núm. 1], Pan7 [SEQ ID núm. 3], y Pan6 [SEQ ID núm. 2]. Esta solicitud proporciona también secuencias para SV1, SV25 y SV39 [SEQ ID núm. 4, 5, 6, respectivamente]. La comparación de secuencia de las secuencias de proteína de cápside pronosticaron que el AdC1 pertenecía claramente a un subgrupo serológicamente diferente de los otros cuatro adenovirus derivados de chimpancés.
Sin embargo, los intentos por cultivar AdC1 en células HEK293 pusieron de relieve que es exigente en cuanto a sus características de crecimiento (datos no mostrados), y por lo tanto posiblemente inadecuado para su uso como vector usando las líneas de células de transcomplementación de E1 actualmente disponibles. Sin embargo, debido a la disparidad obvia de secuencia de la secuencia de proteína de cápside de AdC1 con los adenovirus de derivados de los otros chimpancés (así como con el huAd5), se generaron vectores de adenovirus quiméricos con las características de cápside del AdC1. En vista de los inconvenientes mencionados anteriormente asociados solamente a la realización de cambios de hexon, se realizaron sustituciones más extensas en las quimeras descritas en la presente memoria, es decir, la construcción de quimeras donde la sustitución fue más allá de la hexon, para conseguir dos objetivos. El primero era determinar si realizar sustituciones extensas permitiría el rescate de virus que contienen hexons de serotipos sin relacionar que no pudieran ser susceptibles de rescate de otro modo. El segundo objetivo era comprobar si las características de crecimiento de vectores de adenovirus tales como el AdPan5, que según se ha encontrado en nuestro laboratorio están capacitados para crecer hasta un título alto a los efectos de fabricación, estarían también presentes en el virus quimérico, en particular cuando la hexon (y otras proteínas de cápside) se derivan de un virus tal como el AdC1, que son difíciles de crecer a una producción alta en líneas de células tales como HEK293. Un beneficio añadido de extender la sustitución para incluir la proteína de fibra podría ser incrementar más la disparidad antigénica hasta más allá de la proporcionada por un cambio de hexon solamente.
Como alternativa para la obtención de virus purificado como fuente para secuenciar ADN adenoviral, hemos recurrido a clonar fragmentos de restricción de ADN viral obtenido a partir de células infectadas (“Hirt prep”). El primer adenovirus que hemos secuenciado de esta manera es el Adenovirus de Simio. La digestión EcoRi del Adenovirus de Simio produjo 7 segmentos. La clonación shotgun produjo clones de los 5 fragmentos internos, los cuales fueron clonados y secuenciados. La terminación del secuenciamietno se llevó a cabo caminando hacia cada uno de los extremos del genoma. El mapa del genoma se ha mostrado en la Figura 1.
A. Construcción de dos plásmidos quiméricos de Pan5/C1
El enfoque global hacia la construcción de virus quiméricos consistió en ensamblar en primer lugar el ADN de virus suprimido en E1 completo en un plásmido simple flanqueado por sitios de reconocimiento para la enzima Swal de restricción, digestar el ADN de plásmido con Swal para liberar los extremos de ADN del virus, y transfectar el ADN en células HEK293 para determinar si se podía rescatar adenovirus quimérico viable. Se construyeron dos plásmidos de virus quimérico, p5C1 corto y PSc1 largo.
El plásmido p5C1 corto alberga un virus Pan5 suprimido en E1 donde un segmento interno de 15226 bp (18332 – 33557) ha sido sustituido por uno de 14127 bp funcionalmente análogo (18531 – 32657) del AdC1. Esto da como resultado la sustitución de las proteínas de Pan5 hexon, endoproteasa, proteína de enlace de ADN, proteína de andamiaje de 100 kD, proteína de 33 kD, proteína VIII, y fibra, así como la región E3 completa, con el segmento homólogo del AdC1. El sitio C1aI en el extremo izquierdo del fragmento de Adc1 está al principio del gen hexon y la proteína resultante es idéntica a la hexon de C1. El sitio EcoRI que constituye el fragmento del extremo derecho del fragmento de AdC1 está dentro de la parte E4 orf7 del AdC1. El extremo derecho estaba ligado a un fragmento de extremo derecho generado por PCR del AdPan5 de tal modo que el producto de traducción de orf-7 regenerado es quimérico entre AdPan5 y AdC1.
El plásmido p5C1 largo alberga un virus de Pan5 suprimido en E1 donde un segmento interno de 25603 bp (7955 – 33557) ha sido reemplazado por uno funcionalmente análogo de 24712 bp (7946 – 32657) procedente del AdC1. Esto da como resultado la sustitución de la proteína pre-terminal de AdPan5, proteína de 52/55 kD, proteína de base penton, proteína VII, Mu, y proteína VI con las de AdC1 adicionalmente a las sustituidas en p5C1 corto. El sitio AscI en el extremo izquierdo del fragmento de AdC1 está al principio del gen de polimerasa de ADN y da como resultado una proteína quimérica donde los primeros 165 aminoácidos de la polimerasa de ADN de AdPan5 han sido sustituidos por un segmento de 167 aminoácidos de la polimerasa de ADN de AdC1. En esta región de terminal N, la homología entre las proteínas de polimerasa de ADN de AdPan5 y de AdC1 es del 81% (identidad del 72%).
El plásmido pDVP5Mu que contiene el extremo izquierdo de AdPan5 fue usado como plásmido de partida para la construcción del vector quimérico.
El plásmido pDVP5Mu se hizo como sigue. Un fragmento de ADN sintético que alberga sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción SmaI, MiuI, EcoRI y EcoRV, respectivamente, fue ligado en pBR322 digestado con EcoRI y NdeI, con el fin de mantener el origen de replicación y el gen de beta-lactamasa. El extremo izquierdo de Pan5 que se extiende hasta el sitio MIuI (15135 bp), fue clonado en el plásmido entre los sitios SmaI y MIuI. El gen E1 fue suprimido funcionalmente y sustituido por un fragmento de ADN que alberga sitios de reconocimiento para los
sitios de enzima de restricción de corte extremadamente rara (I-CeuI y PI-SceI). Los 2904 pares de base del extremo derecho de Pan-5 fueron amplificados en PCR usando los iniciadores P5L [GCG CAC GCG TCT CTA TCG ATG AAT TCC ATT GGT GAT GGA CAT GC, SEQ ID núm. 7] y P5ITR [GCG CAT TTA AAT CAT CAT CAA TAA TAT ACC TCA AAC, SEQ ID núm. 8] usando Tgo polimerasa (Roche). El producto PCR fue cortado con MIuI y Swal, y clonado entre MIuI y EcoRV de pDVP5MIu para producir pPan5MIu+RE. Un fragmento de 3193 bp que se extiende desde el sitio MIuI (15135) hasta el sitio C1aI (18328) de Pan5 fue insertado a continuación entre los mismos sitios de pPan5MIu+RE para producir pPan5CIa+RE. El fragmento de 3671 bp de C1aI (18531) a EcoRI (22202) del adenovirus C1 fue clonado en pPan5CIa+RE entre D1aI (16111) y EcoRI (16116) para producir pPan5C1deIRI. El fragmento EcoRI interno de 10452 bp del adenovirus C1 (22202 – 32653) fue clonado en el sitio EcoRI de pPan5C1deIRI para producir p5CI corto. Para construir p5C1 largo, la sustitución fue extendida adicionalmente sustituyendo el fragmento AscI – CiaI de 10379 bp de AdPan5 en P5C1 corto por el fragmento AscI – C1aI de AdC1 de 10591 bp. Finalmente, se insertó una casete de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) en ambos p5C1 corto y p5C1 largo entre los sitios I-CeuI y PI-SceI para producir p5C1cortoGFP y p5C1largoGFP, respectivamente.
B. Rescate de adenovirus de vector recombinante Pan5/C1 quimérico
Los plásmidos p5C1cortoGFP y p5C1largoGFP fueron digestados con la enzima de restricción Swal y transfectados en células HEK 293. Se observó un efecto citopático inducido por un adenovirus típico. El rescate de adenovirus quimérico recombinante a partir de la transfección de p5C1largoGFP fue confirmado recogiendo el sobrenadante procedente de la transfección y re-infectando células nuevas que se encontró que fueron transducidas según se determinó por expresión de GFP: El ADN viral preparado a partir del virus recombinante quimérico, fue digestado con varias enzimas de restricción, y se encontró que tenía el patrón esperado en electroforesis (datos no representados).
La construcción adenoviral quimérica con el p5C1 corto de sustitución más corta, codifica la proteína hexon y la fibra de C1, así como las tramas de lectura abierta intervinientes para endoproteasa, proteína de enlace de ADN, proteína de andamiaje de 100 kDa, proteína de 33 kDa, y proteína VIII. (La región E3 está también incluida dentro de esta región, pero es improbable que tenga impacto sobre la viabilidad del virus quimérico). Cuando se extendió la sustitución para que incluyera las proteínas pTP de AdC1 adicionales (proteína pre-terminal), la proteína de 52/55 kDa, la base penton, la proteína VII, Mu, y la proteína VI, no hubo dificultad en el rescate del virus quimérico viable. En este experimento, la estrategia de construcción de adenovirus quimérico utilizó la presencia de sitios de enzima de restricción AscI y C1 presentes en los genes para la polimerasa de ADN y la hexon respectivamente sobre ambos AdPan5 y AdC1.
Las razones para la producción relativamente más alta del virus quimérico en comparación con el virus AdC1 de tipo natural, no están claras. En el crecimiento del virus quimérico C1 en células 293, los productos de gen de región adenoviral precoz de E1 y E4 se derivan de Ad5 y AdPan5, respectivamente. Los productos de gen E1 y E4 enlazan, regulan y desreprimen varios complejos de transcripción celular y coordinan su actividad hacia la multiplicación viral. De ese modo, es posible que los productos de gen E1 suministrados en trans desde las células 293 y los productos de gen E4 procedentes de AdPan5 sean los más óptimos en el fondo de las células 293 humanas de lo que son los productos de gen de AdC1 equivalentes. Esto puede aplicarse también a la actividad del promotor tardío principal cuya actividad es responsable de la transcripción de los genes de proteína de cápside. En el virus quimérico, el promotor tardío principal, y la proteína IVa2 que lo transactiva, se derivan del AdPan5. Sin embargo, los productos de gen E2 requeridos para replicación pTP de ADN adenoviral y de ADN de cadena simple – proteína de enlace, se derivan del AdC1. La polimerasa de ADN adenoviral, que forma complejos con pTP, es quimérica en Ad5C1 pero en su mayor parte deriva de AdPan5.
Ejemplo 2 – Construcción de Virus de simio quiméricos de Ad5
Los plásmidos han sido construidos donde las proteínas estructurales derivan del Pan7 de adenovirus de chimpancé y las secuencias de flanqueo derivan del Ad5 humano (cadena de vector usada habitualmente). El adenovirus quimérico de Adhu5-Pan7 ha sido rescatado, demostrando que el método de construcción de virus quimérico usado para deducir el virus quimérico es aplicable ampliamente.
A. Construcción del adenovirus quimérico Ad5 – Pan7
Se construyó un plásmido que abarca el genoma quimérico completo (suprimido en E1) con el fin de establecer que el adenovirus quimérico es viable, y a continuación fue transfectado el plásmido en la línea de células HEK 293 de complementación de E1. Se encontró que el virus recombinante podía ser rescatado. El genoma de adenovirus quimérico que se construyó estaba compuesto por un segmento extremo izquierdo derivado del Ad5 que contribuye en la ITR, conteniendo la región de supresión de E1 la casete de expresión de transgén, los genes pIX y IVa2 y los 954 aminoácidos de terminal C del gen de polimerasa (el cual ha sido transcrito en la dirección de derecha a izquierda de la cadena inferior). El Ad5 contribuye también con el extremo derecho del genoma quimérico que contiene los genes E4 y con la ITR derecha. Todos los demás genes presentes en la parte central de la construcción quimérica se derivan del adenovirus Pan7 de chimpancé que incluye los 235 aminoácidos de terminal N de una polimerasa de ADN quimérico.
Con el fin de construir el plásmido que alberga el genoma quimérico completo (suprimido en E1), el plásmido de partida fue pBRAd5Iere que comprende tres partes: el origen bacteriano de replicación y el gen de resistencia a la ampicilina derivado del plásmido pBR322, el extremo izquierdo de un vector suprimido en E1 de Ad5 que se extiende desde la ITR izquierda hasta el sitio StuI situado en el par de base número 5782 del genoma de Ad5 de tipo natural (la supresión de E1 se extiende desde el par de base 342 hasta el 3533 del genoma de Ad5 de tipo natural), y el extremo derecho de Ad5 que se extiende desde el sitio StuI en el par de base número 31954 del genoma de Ad5 de tipo natural hasta el extremo derecho de la ITR derecha. Los sitios PacI situados adyacentes a las dos ITRs se usan para liberar el genoma de Ad5 procedente del esqueleto de plásmido bacteriano. El fragmento que contiene los sitios I-CeuI y Pi-SceI que se localiza en lugar de la supresión de E1, se utiliza para insertar casetes de transgén.
Se insertó un oligómero de ADN sintético en el sitio StuI que contiene sitios para AscI, XbaI y EcoRI, los cuales permitieron la creación del plásmido pAd5endsAscRI cuando se usó PCR, el gen de polimerasa de Ad5 fue extendido al par de base #8068 del genoma de Ad5 de tipo natural, e incorporando un sitio AscI recién creado en esa posición mediante mutagénesis silente del gen de polimerasa (traducido a partir de la cadena inferior) según se representa a continuación.
Secuencia original:
GCG ACG GGC CGA [SEQ ID núm. 16]
CGC TGC CCG GCT
Arg Arg Ala [SEQ ID núm. 17]
Secuencia mutada: (El sitio de reconocimiento AscI está subrayado)
GCG GCG CGC CGA [SEQ ID núm. 18]
GCG TGC CCG GCT
Arg Arg Ala Ser [SEQ ID núm. 17]
La región que contiene fibra de Pan7, fue amplificada mediante PCR (mutando el codón de interrupción de fibra desde TGA a TAA para proporcionar una señal de poliadenilación similar a la de Ad5) e insertada en el sitio EcoRI para producir pAd5endsP7fib. Varias etapas de clonación condujeron a la construcción de pH5C7H5 donde el genoma adenoviral quimérico completo ha sido ensamblado. Una casete de transgén que expresa GFP (proteína fluorescente verde) fue insertada entre los sitios I-CeuI y PI-SceI de pH5C7H5. La construcción final fue digestada con PacI para separar el genoma adenoviral del esqueleto de plásmido y transfectado en células HEK 293. Se cultivó lisato de célula 2 semanas más tarde, y el adenovirus quimérico fue amplificado y purificado mediante métodos estándar.
B. Construcción del adenovirus quimérico de Ad5 – virus 25 de simio (SV-25)
[N.B. El virus 25 de simio (catálogo ATCC número VR-201) es distinto del adenovirus 25 de simio de adenovirus de chimpancé, catálogo ATCC número VR-594]
La construcción del adenovirus quimérico basado en Ad5, donde los segmentos extremos izquierdo y derecho se derivan del Ad5 y la porción central fue deducida del adenovirus SV-25 de mono, se llevó a cabo de una manera completamente análoga a la que se ha descrito con anterioridad para el adenovirus quimérico descrito anteriormente que es quimérico entre Ad5 y el adenovirus Pan7 de chimpancé. Así, el genoma de adenovirus quimérico que se construyó está compuesto por un segmento extremo izquierdo derivado del Ad5 que contribuye a la ITR, conteniendo la región de supresión de E·1 que contiene la casete de expresión de transgén, los genes pIX y IVa2 y los 958 aminoácidos de terminal C del gen de polimerasa. El Ad5 contribuye con el extremo derecho del genoma quimérico que contiene los genes E4 y la ITR derecha. [Adicionalmente, el extremo izquierdo del genoma de Ad5 fue extendido más allá de lo que está presente en pH5C7H5 de modo que estaban presentes 454 pares de base del extremo izquierdo de Ad5. Aunque no sea absolutamente esencial, esto se hizo con el fin de mejorar la eficacia de empaquetamiento]. Todos los genes presentes en la parte central de la construcción quimérica se derivan del adenovirus SV-25 de mono incluyendo los 230 aminoácidos de terminal N de una polimerasa de ADN quimérico. El plásmido de partida para la construcción del genoma quimérico fue pAd5endsAscRI que contiene ambos extremos izquierdo y derecho de Ad5, así como el sitio AscI creado (por mutación silente) en el gen de polimerasa donde se hizo la fusión de Ad5-SV25 (tal y como se hizo para el adenovirus quimérico Ad5 -Pan7). En el pH5S25H5 de la construcción final, el segmento de genoma de SV25 ha sido incorporado mediante etapas de clonación secuencial, incluyendo la creación de un sitio de AscI en la unión de enlace dentro de la secuencia de codificación de polimerasa. Una casete de transgén que expresa GFP (proteína fluorescente verde), fue insertada entre los sitios I-CeuI y PI-SceI de pH5S25H5. La construcción final fue digestada con PacI para separar el genoma adenoviral procedente del esqueleto de plásmido y transfectado en células HEK 293. El lisato de células fue cultivado 2 semanas más tarde, y el adenovirus quimérico fue amplificado y purificado mediante métodos estándar.
La Figura 2 proporciona el mapa del virus quimérico Adhu5-SV25 recombinante. Se ha indicado la porción del genoma reemplazada con ADN del Pan7.
Ejemplo 3 – Vector quimérico Pan5 – C1 de la invención como vehículo de suministro para composiciones inmunogénicas
Un Pan5 (adenovirus 22 de simio, un adenovirus del subgrupo E, denominado también C5) – C1 (adenovirus 21 de simio, un adenovirus del subgrupo B) quimérico que expresa glicoproteína (CSC1C5-CMVGP) del virus Ébola (Zaire) fue construido como antígeno modelo con el fin de probar la eficacia del vector C5C1C5-CMVGP como vacuna; este vector ha sido comparado con el vector basado en Adhu5 (H5-CMVGP). En comparación con H5-CNVGP, el vector C5C1-CMVGP produjo solamente un nivel ligeramente más bajo de expresión de GP en células A549 transducidas.
A continuación, se compararon las respuestas de las células T y de las células B, específicas de GP, inducidas en ratones vacunados intramuscularmente con 5 x 1010 vectores de H5-CMVGP o bien de C5C1-CMVGP.
El vector C5C1C5-CMVGP pareció inducir frecuencias más bajas de interferón gamma que produce células CD8+ T con cinéticas más lentas que el vector H5-CMVGP según se determinó mediante manchado de citoquina intracelular usando un péptido específico de GP restringido H-2k como estimulante. La respuesta de IgG total a GP, medida mediante ELISA, fue equivalente en suero de ratones vacunados con los vectores de C5C1C5-CMVGP o de H5-CMVGP. Sin embargo, el vector C5C1C5-CMVGP indujo una respuesta tipo Th1 más potente mientras que el vector H5-CMVGP estimuló una respuesta de tipo Th1/Th2 más equilibrada. En un estudio de supervivencia, se vacunaron ratones según se ha indicado anteriormente, y se expusieron 28 días más tarde a 200 LD/50 del virus Ébola Zaire adaptado a ratones. Sobrevivieron el 100% según se observó en ambos grupos.
Ejemplo 4 – Generación de vectores Pan6/Pan7 quiméricos
Se generó un panel de vectores que expresan GFP. Este panel incluye vectores que son quiméricos entre Pan6 y Pan7, donde: (a) la proteína hexon de Pan7 fue reemplazada por la de Pan6 (denominada C767); (b) la proteína de fibra de Pan7 fue reemplazada por la de Pan6 (denominada C776); (c) ambas proteínas hexon y de fibra del vector Pan7 han sido reemplazadas por las del Pan6 (denominadas C766).
El virus quimérico denominado C767 fue construido esencialmente según se ha descrito en lo que antecede para el virus C5C1C5 en el Ejemplo 1. Sin embargo, debido a homología sustancial entre las secuencias 5’ de Pan6 y Pan7 con la secuencia hexon, no fue necesario sustituir el extremo 5’ del genoma entre la penton y el gen pol.
El vector quimérico C767 fue comparado con el C776, el C766, el C6 parental, y C7 parental, expresando cada uno de ellos GFP.
Ratones Balb/C (25 por grupo) fueron inmunizados intramuscularmente con Pan6 o bien con Pan7 (1010 partículas). La readministración (1011 partículas i.v. mediante inyección en la vena de la cola) se intentó 3 semanas más tarde usando cada uno de los cinco vectores de expresión de GFP (C6-GFP, C7-GFP, y los tres vectores quiméricos). Tres días después, se estimó el nivel de transducción del hígado cualitativamente examinando secciones de hígado respecto a la presencia de expresión de GFP y cuantitativamente estimando copias de GFP ADN mediante análisis Taqman. La administración de uno cualquiera de los dos vectores de adenovirus de chimpancé no afectó a la eficacia de transducción del otro vector, mientras que la readministración del mismo vector se vio severamente comprometida. Los datos mostraron que los anticuerpos respecto a la hexon y la fibra eran importantes para evitar la readministración de vectores adenovirales.
Aunque la invención ha sido descrita con referencia a una realización particularmente preferida, se apreciará que se pueden realizar modificaciones. Se prevé que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
Listado de secuencias
<110> Los fideicomisarios de la Universidad de Pennsylvania; Roy, Soumitra Wilson, James M.
<120> Métodos de generación de adenovirus quiméricos y usos de tales adenovirus quiméricos
<130> UPN-P30667PCT 5 <150> US 10/465.302
<151> 20.06.2003
<150> US 60/566.212
<151> 28.04.2004
<150> US 60/575.429 10 <151> 28.05.2004
<160> 18
<170> Patentin versión 3.2
<210> 1
<211> 36462 15 <212> AND
<213> serotipo de adenovirus de chimpancé Pan5
<400> 1
<210> 2
<211> 36604
<212> ADN
<213> serotipo Pan6 de adenovirus de chimpancé
<400> 2
<210> 3
<211> 36535
<212> ADN
<213> serotipo Pan7 de adenovirus de chimpancé
<400> 3
<210> 4
<211> 34264
<212> ADN
<213> adenovirus sv-1 de simio
<400> 4
<210> 5
<211> 31044
<212> ADN
<213> adenovirus sv-25 de simio
<400> 5
<210> 6
<211> 34115
<212> ADN
<213> adenovirus SV-39 de simio
<400> 6
<210> 7
<211> 44
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> inductor P5L
<400> 7 gcgacgcgt ctctatcgat gaattccatt ggtgatggac atgc 44
<210> 8
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> inductor P5ITR
<400> 8 gcgcatttaa atcatcatca ataatatacc tcaaac 36
<210> 9
<211> 31
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> inductor P5XTOP
<400> 9 gatacctagg aacgaggagg atttgatatt g 31
<210> 10
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> inductor P5XBOT
<400> 10 atgtacgcct ccgcgctcac 20
<210> 11
<211> 31
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> inductor P5E4
<400> 11 gatcgaattc ccactctgta ccccatctct g 31
<210> 12
<211> 31967
<212> ADN
<213> Adenovirus de simio
<220>
<221> CDS
<222> (13796) .. (15322)
<220>
<221> CDS
<222> (18257) .. (21010)
<220>
<221> CDS
<222> (27192) .. (29015)
<400> 12
<210> 13
<211> 508
<212> ORT
<213> Adenovirus de simio
<400> 13
<210> 14
<211> 917
<212> PRT
<213> Adenovirus de simio
<400> 14
<210> 15
<211> 607
<212> PRT
<213> Adenovirus de simio
<400> 15
<210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> oligómero sintético
<400> 16 gcgacgggcc gacgctgccc ggct
24
<210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Artificial <400> 17
Arg Arg Ala Ser 1
<210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> oligómero sintético
<400> 18 gcggcgcgcc gacgctgccc ggct
24

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un método para cultivar eficientemente un adenovirus quimérico en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico procedente de una cepa de adenovirus parental incapaz de crecimiento eficiente en la citada célula anfitrión, comprendiendo dicho método las etapas de:
    (a) generar un adenovirus quimérico que comprende:
    (i)
    secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo y del extremo terminal derecho de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región de extremo izquierdo las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’, y comprendiendo dicha región de extremo derecho las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 3’, y
    (ii)
    las regiones internas de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones internas los genes tardíos que codifican la penton, la hexon y la fibra;
    en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ hasta 3’, una región terminal izquierda del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y la región terminal derecha del primer adenovirus, y
    (b) cultivar dicho adenovirus quimérico en presencia de genes E1a, E1b y E4 ORF6 de adenovirus funcional procedentes del primer adenovirus o de un serotipo de adenovirus que transcomplementa el primer adenovirus, y además en presencia de genes estructurales adenovirales necesarios procedentes del extremo izquierdo del adenovirus.
  2. 2.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región interna del adenovirus parental comprende además uno o más genes de adenovirus funcional seleccionados en el grupo consistente en trama de lectura abierta de endoproteasa, proteína de enlace de ADN, proteína de andamiaje de 100 kDa, proteína de 33 kDa, proteína VIII, pTP, proteína de 52/55 kDa, proteína VII, Mu y proteína VI.
  3. 3.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las funciones de polimerasa, proteína terminal y proteína de 52/55 kDa se proporcionan en trans.
  4. 4.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer adenovirus comprende además las funciones de polimerasa, proteína terminal y proteína de 52/55 kDa.
  5. 5.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus quimérico comprende los genes 1, 2, 3, 4 y 5 tardíos adenovirales del adenovirus parental.
  6. 6.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula anfitrión seleccionada contiene establemente una o más de las funciones E1a, E1b o E4 ORF6 de adenovirus.
  7. 7.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el adenovirus quimérico comprende uno o más de los E1a, E1b o E4 ORF6 del primer adenovirus.
  8. 8.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer adenovirus es de origen humano.
  9. 9.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer adenovirus de origen simio.
  10. 10.-El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además la etapa de aislar el adenovirus quimérico.
  11. 11.-Un método para generar un adenovirus quimérico para su crecimiento en una célula anfitrión seleccionada, siendo dicho adenovirus quimérico derivado de una cepa de adenovirus parental incapaz de crecimiento eficaz en dicha célula anfitrión, comprendiendo dicho método la etapa de generar un adenovirus quimérico que comprende:
    regiones terminales 5’ y 3’ de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dichas regiones terminales 5’ las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’ y las funciones de gen E1 necesarias, comprendiendo dichas regiones terminales 3’ repeticiones de terminal invertido (ITRs) y las funciones de gen E4 necesarias, y
    regiones internas procedentes de un adenovirus parental que carece de sus regiones terminales 5’ y 3’ naturales, comprendiendo dichas regiones terminales la hexon, la penton base y la fibra;
    en donde el adenovirus quimérico resultante comprende, desde 5’ a 3’, la región terminal 5’ del primer adenovirus, la región interna del adenovirus parental, y las regiones terminales 3’ del primer adenovirus.
  12. 12.-Un adenovirus quimérico que comprende una proteína hexon de un serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecimiento eficiente en una célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicho adenovirus modificado:
    (a)
    secuencias de adenovirus del extremo terminal izquierdo de un primer adenovirus que crece en un tipo de célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región de extremo izquierdo los E1a, E1b y repeticiones de terminal invertido (ITRs) 5’;
    (b)
    secuencias de adenovirus de la región interna del serotipo de adenovirus seleccionado que es incapaz de crecimiento eficiente en la célula anfitrión seleccionada, comprendiendo dicha región interna los genes que codifican la penton, la hexon y la fibra del adenovirus seleccionado;
    (c)
    secuencias de adenovirus del extremo terminal derecho del primer adenovirus, comprendiendo dicha región de extremo derecho las funciones de gen E4 necesarias y las repeticiones de terminal invertido (ITRs) 3’,
    en donde el adenovirus quimérico resultante comprende proteínas adenovirales estructurales y reguladoras necesarias para infección y replicación.
  13. 13.-El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico comprende además la proteína IIIa, la 52/55 kDa y la proteína terminal (pTP) del serotipo de adenovirus seleccionado.
  14. 14.-El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico comprende la polimerasa del primer adenovirus.
  15. 15.-El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico expresa una proteína quimérica funcional formada a partir del primer adenovirus y del adenovirus seleccionado, donde dicha proteína quimérica se selecciona a partir del grupo consistente en polimerasa, proteína terminal, proteína de 52/55 kDa, y similares.
  16. 16.-El adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el adenovirus quimérico comprende la proteína terminal, la 52/55 kDa, y/o la IIIa del adenovirus seleccionado.
  17. 17.-El adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en donde el adenovirus comprende además un gen heterólogo que codifica un producto deseado bajo el control de secuencias de control de expresión que dirigen la expresión del mismo en una célula objetivo.
  18. 18.-Una composición que comprende el adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en un portador farmacéuticamente aceptable.
  19. 19.-Un célula anfitrión que comprende un adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en cultivo.
  20. 20.-La célula anfitrión de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha célula anfitrión es una célula humana.
  21. 21.-Uso de un adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en la preparación de un medicamento, en donde el adenovirus quimérico comprende además un gen heterólogo que codifica un producto deseado bajo el control de secuencias de control de expresión que dirigen la expresión del mismo en una célula objetivo.
  22. 22.-Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el medicamento es para su uso en un método para administración repetitiva de un gen heterólogo a un mamífero, que comprende las etapas de introducir en dicho mamífero un primer vector que comprende el gen heterólogo, e introducir en dicho mamífero un segundo vector que comprende el gen heterólogo, en donde al menos el primer vector o el segundo vector es un adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, y en donde el primer y el segundo vector son diferentes.
  23. 23.-Uso de acuerdo con la reivindicación 21 ó 22, en donde el adenovirus quimérico comprende un gen heterólogo que codifica un antígeno de un agente infeccioso, siendo dicho medicamento útil para inducir una respuesta inmune.
  24. 24.-Uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en donde el primer vector es una vacuna de ADN que prepara al mamífero respecto al segundo vector que es un adenovirus quimérico de acuerdo con la reivindicación 23.
  25. 25.-Un método para la producción de un producto de gen seleccionado que comprende infectar una célula de mamífero con adenovirus quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, cultivar dicha célula bajo condiciones adecuadas, y recuperar desde dicho cultivo de célula el producto de gen expresado.
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