CN112770812A - 产生基因治疗制剂的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒和AAV制剂的方法和系统，包括重组腺相关病毒(rAAV)颗粒和制剂。在某些实施方案中，本公开提出了用于澄清、纯化、配制、过滤和加工AAV颗粒和AAV制剂的方法和系统。本公开还描述了用于设计、制备、制造、使用和/或配制包含调节性多核苷酸的AAV颗粒的组合物、方法和过程，所述调节性多核苷酸例如编码靶向亨廷顿蛋白(HTT)基因(例如野生型或突变型CAG扩增的HTT基因)的小干扰RNA(siRNA)分子的多核苷酸。还公开了使用配制的包含调节性多核苷酸的AAV颗粒在患有欧洲退行性疾病(例如，亨廷顿舞蹈病(HD))的受试者中抑制HTT基因表达的方法。
Description
相关申请的引用
本申请要求以下优先权的权益：2018年7月24日提交的标题为“GENE THERAPYFORMULATIONS(基因治疗制剂)”的美国临时专利申请号62/702,687；2018年7月24日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE(治疗亨廷顿舞蹈病的组合物和方法)”的美国临时专利申请号62/702,679；2018年8月31日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE(治疗亨廷顿舞蹈病的组合物和方法)”的美国临时专利申请号62/725,432；2018年10月4日提交的标题为“SYSTEMS AND METHODS FOR CLARIFYING GENE THERAPY FORMULATIONS(澄清基因治疗制剂的系统和方法)”的美国临时专利申请号62/741,508；2019年1月18日提交的标题为“METHODS AND SYSTEMS FOR PRODUCING AAV PARTICLES(产生AAV颗粒的方法和系统)”的美国临时专利申请号62/794,199；2019年1月18日提交的标题为“SYSTEMS AND METHODSFOR CLARIFYING GENE THERAPY FORMULATIONS(澄清基因治疗制剂的系统和方法)”的美国临时专利申请号62/794,212；2019年1月18日提交的标题为“FORMULATIONS FOR AAVPARTICLES(AAV颗粒制剂)”的美国临时专利申请号62/794,213；2019年3月29日提交的标题为“SYSTEMS AND METHODS FOR CLARIFYING AND PURIFYING GENE THERAPY FORMULATIONS(澄清和纯化基因治疗制剂的系统和方法)”的美国临时专利申请号62/826,363；2019年4月29日提交的标题为“COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE(治疗亨廷顿舞蹈病的组合物和方法)”的美国临时专利申请号62/839,880；其各自内容通过引用整体并入本文。
参考序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为20571527PCTSL.txt的文件形式提供，该文件创建于2019年7月24日，大小为352,382字节。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。
发明领域
本公开描述了用于生产腺相关病毒(AAV)颗粒和AAV制剂的方法和系统，包括重组腺相关病毒(rAAV)颗粒和制剂。在某些实施方案中，本公开提出了用于澄清、纯化、配制、过滤和加工AAV颗粒和AAV制剂的方法和系统。
本公开还描述了用于设计、制备、制造、使用和/或配制包含调节性多核苷酸的AAV颗粒的组合物、方法和过程，所述调节性多核苷酸是例如编码靶向亨廷顿蛋白(HTT)基因(例如野生型或突变型CAG扩增的HTT基因)的小干扰RNA(siRNA)分子的多核苷酸。还公开了使用配制的包含调节性多核苷酸的AAV颗粒在患有神经退行性疾病(例如，亨廷顿舞蹈病(HD))的受试者中抑制HTT基因表达的方法。
背景技术
AAV已经成为最广泛研究和利用的用于将基因转移到哺乳动物细胞的病毒载体之一。参见例如Tratschin等人,Mol.Cell Biol.,5(11):3251-3260(1985)和Grimm等人,Hum.Gene Ther.,10(15):2445-2450(1999)，其内容通过引用整体并入本文。腺相关病毒(AAV)载体是治疗性基因递送的有希望的候选物，并且在临床试验中已被证明安全有效。为此目的，改进的AAV颗粒的设计和生产是一个活跃的研究领域。
随着AAV领域的发展的到来，仍然需要用于生产AAV载体(例如AAV颗粒)和用于AAV颗粒的储存和递送的相应治疗制剂的改进的系统和方法。这些包括用于澄清、纯化、配制、过滤和加工AAV颗粒和AAV制剂的改进方法和系统。
发明内容
本公开提出了用于产生药物制剂的方法和系统。在某些实施方案中，药物制剂包含腺相关病毒(AAV)颗粒。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个选自以下的步骤：化学裂解、澄清过滤、亲和色谱、离子交换色谱、切向流过滤(TFF)和病毒保留过滤。
在某些实施方案中，本公开提出了用于生产包含腺相关病毒(AAV)颗粒的药物制剂的方法或过程。在某些实施方案中，该方法包括：在生物反应器内在一个或多个病毒生产细胞(VPC)中产生AAV颗粒，从而提供包括AAV颗粒和液体培养基的病毒生产汇聚物；通过一个或多个选自以下的步骤处理病毒生产汇聚物，这些步骤选自：化学裂解、澄清过滤、亲和色谱、离子交换色谱、切向流过滤(TFF)和病毒保留过滤；并将来自病毒生产汇聚物的AAV颗粒掺入药物制剂中，其中药物制剂包括AAV颗粒和至少一种药物赋形剂。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个化学裂解步骤，其中将病毒生产汇聚物暴露于化学裂解。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个澄清过滤步骤，其中通过一个或多个澄清过滤系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个亲和色谱步骤，其中通过一个或多个亲和色谱系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个离子交换色谱步骤，其中通过一个或多个离子交换色谱系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个切向流过滤(TFF)步骤，其中通过一个或多个TFF系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，该方法包括一个或多个病毒保留过滤(VRF)步骤，其中通过一个或多个VRF系统处理病毒生产汇聚物。
在某些实施方案中，AAV颗粒在生物反应器内在病毒生产细胞(VPC)中产生。在某些实施方案中，VPC包括昆虫细胞。在某些实施方案中，VPC包括Sf9昆虫细胞。在某些实施方案中，使用杆状病毒生产系统产生AAV颗粒。
在某些实施方案中，该方法包括一个或多个化学裂解步骤，其中将病毒生产汇聚物暴露于化学裂解。在某些实施方案中，该方法包括：从生物反应器收集病毒生产汇聚物，其中病毒生产汇聚物包括一个或多个VPC，并且其中AAV颗粒包含在VPC内；在化学裂解条件下，使用化学裂解溶液将病毒生产汇聚物中的VPC暴露于化学裂解，其中化学裂解将AAV颗粒从VPC释放到病毒生产汇聚物的液体培养基中。在某些实施方案中，化学裂解溶液包含选自精氨酸或精氨酸盐的稳定添加剂。在某些实施方案中，稳定添加剂的浓度为0.1-0.5M。在某些实施方案中，稳定添加剂的浓度为0.2-0.3M。
在某些实施方案中，化学裂解溶液不包括Triton X-100。在某些实施方案中，化学裂解溶液包括选自以下的两性离子去污剂：月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)；N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(Empigen BB)；3-(N,N-二甲基肉豆蔻铵基)丙磺酸盐(Zwittergent3-10)；正十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(Zwittergent 3-12)；正十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(Zwittergent 3-14)；3-(N,N-二甲基棕榈酰铵基)丙烷磺酸盐(两性离子3-16)；3-((3-胆酰氨丙基)二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)；或3-([3-胆酰氨丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。在某些实施方案中，化学裂解溶液包括月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)。在某些实施方案中，化学裂解溶液包括N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(Empigen BB)。
在某些实施方案中，该方法包括一个或多个澄清过滤步骤，其中通过一个或多个澄清过滤系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，一个或多个澄清过滤系统包括深度过滤系统。在某些实施方案中，深度过滤系统包括Millipore Millistak D0HC介质系列过滤器。在某些实施方案中，深度过滤系统包括Millipore Millistak C0SP介质系列过滤器。在某些实施方案中，一个或多个澄清过滤系统包括0.2μm微滤系统。
在某些实施方案中，该方法包括一个或多个亲和色谱步骤，其中通过一个或多个亲和色谱系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，该方法包括以结合-洗脱模式通过一个或多个免疫亲和色谱系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，免疫亲和色谱系统包括一种或多种能够结合一种或多种AAV衣壳变体的重组单链抗体。在某些实施方案中，使用再生溶液使免疫亲和色谱系统再生。在某些实施方案中，再生溶液包含1-3M的胍或胍盐。在某些实施方案中，使用包含2M盐酸胍的再生溶液再生免疫亲和色谱系统。
在某些实施方案中，该方法包括一个或多个离子交换色谱步骤，其中通过一个或多个离子交换色谱系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，该方法包括以流通(flow-through)模式通过一个或多个阴离子交换色谱系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，阴离子交换色谱系统包括结合非病毒杂质、非AAV病毒颗粒或它们的组合的固定相。在某些实施方案中，阴离子交换色谱系统包括不与AAV颗粒结合的固定相。在某些实施方案中，阴离子交换色谱系统的固定相包括季胺官能团。在某些实施方案中，阴离子交换色谱系统包含三甲基铵乙基(TMAE)官能团。
在某些实施方案中，该方法包括一个或多个切向流过滤(TFF)步骤，其中通过一个或多个TFF系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，TFF系统包括平板过滤器，该平板过滤器包括再生纤维素盒。在某些实施方案中，TFF系统包括中空纤维过滤器。在某些实施方案中，TFF系统在5.5-6.5PSI的跨膜压力(TMP)和5.5-6.5L/min/m2的目标交叉流(crossflow)下操作。在某些实施方案中，TFF系统在6PSI的跨膜压力(TMP)和6L/min/m2的目标交叉流下操作。在某些实施方案中，在一个或多个TFF步骤之前，将50％蔗糖混合物添加到病毒生产汇聚物中。在某些实施方案中，将50％蔗糖混合物以9-13％v/v的浓度加入到病毒生产汇聚物中。在某些实施方案中，将50％蔗糖混合物以10-12％v/v的浓度加入到病毒生产汇聚物中。在某些实施方案中，将50％蔗糖混合物以11％v/v的浓度加入到病毒生产汇聚物中。
在某些实施方案中，一个或多个TFF步骤包括第一渗滤步骤，其中至少一部分病毒生产汇聚物的液体培养基被低蔗糖渗滤缓冲液代替。在某些实施方案中，低蔗糖渗滤缓冲液包含4-6％w/v的糖或糖替代物和150-250mM的碱金属氯化物盐。在某些实施方案中，低蔗糖渗滤缓冲液包含4.5-5.5％w/v的蔗糖和210-230mM的氯化钠。在某些实施方案中，低蔗糖渗滤缓冲液包含5％w/v的蔗糖和220mM的氯化钠。
在某些实施方案中，一个或多个TFF步骤包括超滤浓缩步骤，其中将病毒生产汇聚物中的AAV颗粒浓缩至目标颗粒浓度。在某些实施方案中，病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至1.0x1012-5.0x1013 vg/mL。在某些实施方案中，病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至2.0x1012-5.0x1012 vg/mL。在某些实施方案中，病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至1.0x1013-5.0x1013 vg/mL。在某些实施方案中，病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至2.0x1013-3.0x1013 vg/mL。在某些实施方案中，病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至2.7x1013 vg/mL。
在某些实施方案中，一个或多个TFF步骤包括最终的渗滤步骤，其中至少一部分病毒生产汇聚物的液体培养基被高蔗糖制剂缓冲液代替。在某些实施方案中，高蔗糖制剂缓冲液包含6-8％w/v的糖或糖替代物和90-100mM的碱金属氯化物盐。在某些实施方案中，高蔗糖制剂缓冲液包含7％w/v的蔗糖和90-100mM的氯化钠。在某些实施方案中，高蔗糖制剂缓冲液包含7％w/v的蔗糖、10mM的磷酸钠、95-100mM的氯化钠和0.001％(w/v)的泊洛沙姆188。
在某些实施方案中，该方法包括一个或多个病毒保留过滤(VRF)步骤，其中通过一个或多个VRF系统处理病毒生产汇聚物。在某些实施方案中，VRF系统包括过滤介质，该过滤介质保留50nm或更大的颗粒。在某些实施方案中，VRF系统包括过滤介质，该过滤介质保留35nm或更大的颗粒。在某些实施方案中，VRF系统包括过滤介质，该过滤介质保留20nm或更大的颗粒。
本公开提出了用于生产基因治疗产品的方法和系统，其中所述方法包括：提供包含AAV颗粒的药物制剂，其中所述药物制剂通过本公开的方法产生；并适当地将药物制剂等分到制剂容器中。
本公开提出了可用于基因治疗形式的药物制剂。在某些实施方案中，药物制剂包括AAV颗粒。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度小于5x1013vg/ml的AAV颗粒。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为1.0x1012-5.0x1013 vg/mL的AAV颗粒。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为1.0x1012-5.0x1012 vg/mL的AAV颗粒。在某些实施方案中，药物制剂包括浓度为1.0x1013-5.0x1013 vg/mL的AAV颗粒。在某些实施方案中，药物制剂包含浓度为2.7x1013 vg/mL的AAV颗粒。
在某些实施方案中，药物制剂包括：(i)浓度小于5x1013 vg/ml的AAV颗粒；(ii)一种或多种盐；(iii)一种或多种糖或糖替代物；和(iv)一种或多种缓冲剂。在某些实施方案中，药物制剂是水性制剂。
在某些实施方案中，药物制剂包括：(i)浓度小于5x1013 vg/ml的AAV颗粒；(ii)氯化钠；(iii)糖或糖替代物；和(iv)共聚物。在某些实施方案中，药物制剂的pH为6.5-8。在某些实施方案中，药物制剂的重量克分子渗透压浓度为350-500mOsm/kg。
在某些实施方案中，药物制剂包含至少一种AAV颗粒、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾、糖或糖替代物和共聚物。在某些实施方案中，氯化钠的浓度为95mM。在某些实施方案中，磷酸钠的浓度为10mM。在某些实施方案中，10mM磷酸钠包括5mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠。在某些实施方案中，磷酸钾的浓度为1.5mM。在某些实施方案中，糖或糖替代物的浓度为7％w/v。在某些实施方案中，共聚物的浓度为0.001％w/v。在某些实施方案中，糖是蔗糖。在某些实施方案中，该共聚物是泊洛沙姆188(例如，
)。在某些实施方案中，pH为7.4。在某些实施方案中，药物制剂包括：95mM氯化钠；10mM磷酸钠(5mM磷酸二氢钠和5mM磷酸氢二钠)；1.5mM磷酸钾；7％w/v蔗糖；和0.001％w/v的泊洛沙姆188共聚物。
在某些实施方案中，氯化钠的浓度为155mM。在某些实施方案中，磷酸钠的浓度为2.7mM。在某些实施方案中，磷酸钾的浓度为1.5mM。在某些实施方案中，糖或糖替代物的浓度为5％w/v。在某些实施方案中，共聚物的浓度为0.001％w/v。在某些实施方案中，药物制剂包括：155mM氯化钠；2.7mM磷酸钠；1.5mM磷酸钾；5％w/v蔗糖；和0.001％w/v泊洛沙姆188共聚物。
在某些实施方案中，药物制剂包含至少一种AAV颗粒、氯化钠、氯化钾、糖或糖替代物和共聚物。在某些实施方案中，药物制剂包含Tris碱以调节pH。
在某些实施方案中，氯化钠的浓度为100mM。在某些实施方案中，Tris的浓度为10mM。在某些实施方案中，氯化钾的浓度为1.5mM。在某些实施方案中，糖或糖替代物的浓度为7％w/v。在某些实施方案中，共聚物的浓度为0.001％w/v。在某些实施方案中，糖是蔗糖。在某些实施方案中，该共聚物是泊洛沙姆188(例如，
)。在某些实施方案中，pH为8。
在某些实施方案中，制剂的一种或多种盐包括氯化钠。在某些实施方案中，制剂中氯化钠的浓度为80-220mM或80-150mM。在某些实施方案中，制剂中氯化钠的浓度为75、83、92、95、98、100、107、109、118、125、127、133、142、150、155、192或210mM。
在某些实施方案中，制剂的一种或多种盐包括氯化钾。在某些实施方案中，制剂中氯化钾的浓度为0-10mM、1-2mM、1-3mM或2-3mM。在某些实施方案中，氯化钾的浓度为1.5mM。在某些实施方案中，氯化钾的浓度为2.7mM。
在某些实施方案中，制剂的一种或多种盐包括磷酸钾。在某些实施方案中，制剂中磷酸钾的浓度为0-10mM或1-3mM。在某些实施方案中，磷酸钾的浓度为1.5mM。在某些实施方案中，磷酸钾的浓度为2mM。
在某些实施方案中，制剂的一种或多种盐包括磷酸钠。在某些实施方案中，制剂中磷酸钠的浓度为0-10mM、2-3mM或10-11mM。在某些实施方案中，磷酸钠的浓度为2.7mM。在某些实施方案中，磷酸钠的浓度为10mM。
在某些实施方案中，制剂中糖和/或糖替代物的浓度为1-10％w/v。在某些实施方案中，糖和/或糖替代物的浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％w/v。
在某些实施方案中，一种或多种糖或糖替代物包括至少一种二糖，其选自蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(Gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芸香酮糖(rutinulose)和木二糖。
在某些实施方案中，制剂中的至少一种糖包括蔗糖，并且蔗糖的浓度为1-10％w/v。在某些实施方案中，制剂中蔗糖的浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％w/v。
在某些实施方案中，制剂中的至少一种糖包括海藻糖，并且海藻糖的浓度为1-10％w/v。在某些实施方案中，制剂中的海藻糖浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％w/v。
在某些实施方案中，制剂中的至少一种糖包括山梨醇，并且山梨醇的浓度为1-10％w/v。在某些实施方案中，制剂中山梨醇的浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％w/v。
在某些实施方案中，制剂包含一种或多种缓冲剂。在某些实施方案中，所述制剂包含一种或多种缓冲剂，其选自Tris HCl、Tris碱、磷酸钠、磷酸钾、组氨酸、硼酸、柠檬酸、甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)和MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)。在某些实施方案中，制剂中缓冲剂的浓度为1-20mM。在某些实施方案中，制剂中缓冲剂的浓度为10mM。
在某些实施方案中，一种或多种缓冲剂包括磷酸钠，并且制剂pH在5℃下为7.2至7.6。在某些实施方案中，制剂中磷酸钠的浓度为8-11mM。在某些实施方案中，制剂中磷酸钠的浓度为10mM。
在某些实施方案中，一种或多种缓冲剂包括用盐酸调节的Tris碱。在某些实施方案中，制剂pH在5℃下为7.3至8.2。在某些实施方案中，制剂pH在5℃下为7.3至7.7。在某些实施方案中，制剂pH在5℃下为7.8至8.2。
在某些实施方案中，制剂包含共聚物表面活性剂。在某些实施方案中，共聚物的浓度为0.00001％-1％w/v。在某些实施方案中，共聚物的浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v。在一个实施方案中，浓度为0.001％w/v。
在某些实施方案中，该共聚物是环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。在某些实施方案中，环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的浓度为0.00001％-1％w/v。在某些实施方案中，环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v。在某些实施方案中，该共聚物是泊洛沙姆188(例如，
)。在某些实施方案中，泊洛沙姆188共聚物的浓度为0.01％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂中AAV颗粒的浓度小于5x1013 vg/ml。在某些实施方案中，所述制剂中AAV颗粒的浓度为2.7x1011 vg/ml、9x1011 vg/ml、1.2x1012 vg/ml、2.7x1012 vg/ml、4x1012 vg/ml、6x1012 vg/ml、7.9x1012 vg/ml、8x1012 vg/ml、1.8x1013 vg/ml、2.7x1013 vg/ml或3.5x1013 vg/ml。在某些实施方案中，所述制剂中AAV颗粒的浓度为2.5-2.9x1013 vg/ml。在某些实施方案中，所述制剂中AAV颗粒的浓度为2.7x1013 vg/ml。
在某些实施方案中，本公开的药物制剂包括AAV颗粒，其包含AAV载体基因组和AAV衣壳。在某些实施方案中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列。
在某些实施方案中，AAV衣壳的血清型是AAV1。在某些实施方案中，AAV衣壳的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、绵羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAVCBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAVCHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAVCKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAVCKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAVCKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAVCLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAVCLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAVCLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAVCSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、PHP.B、PHP.A、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35或本公开的任何修改的血清型或其变体。
与没有糖或糖替代物的相同制剂相比，本文所述的药物基因治疗(例如AAV)制剂可以具有增加的贮存期限、减少的聚集、过程汇聚物的更长保持时间和/或增加的AAV颗粒浓度。
本公开提出了治疗受试者的亨廷顿舞蹈病的方法。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的药物制剂。
在某些实施方案中，药物组合物通过输注至受试者的核壳和丘脑中来施用。在某些实施方案中，药物组合物通过双侧输注至受试者的核壳和丘脑中来施用。在某些实施方案中，使用磁共振成像(MRI)引导的对流增强递送(CED)来施用药物组合物。
在某些实施方案中，施用至核壳的药物制剂的体积不超过1500μL/半球。在某些实施方案中，施用至核壳的药物制剂的体积为900-1500μL/半球。在某些实施方案中，施用至核壳的剂量为8x1011至4x1013 VG/半球。
在某些实施方案中，施用至丘脑的药物制剂的体积不超过2500μL/半球。在某些实施方案中，施用至丘脑的药物制剂的体积为1300-2500μL/半球。在某些实施方案中，施用至丘脑的剂量为3.5x1012至6.8x1013 VG/半球。
在某些实施方案中，施用至受试者的总剂量为8.6x1012至2x1014 VG。
在某些实施方案中，向受试者施用药物制剂抑制或阻抑受试者的纹状体中亨廷顿蛋白(HTT)基因的表达。在某些实施方案中，核壳中HTT基因的表达被抑制或阻抑。在某些实施方案中，在核壳的一个或多个中型多棘神经元中HTT基因的表达被抑制或阻抑。在某些实施方案中，在核壳的一个或多个星形胶质细胞中HTT基因被抑制或阻抑。在某些实施方案中，核壳中HTT基因的表达降低了至少30％。在某些实施方案中，核壳中HTT基因的表达降低了40-70％。在某些实施方案中，核壳中HTT基因的表达降低了50-80％。
在某些实施方案中，尾状核中的HTT基因的表达被抑制或阻抑。在某些实施方案中，尾状核中的HTT基因降低了至少30％。在某些实施方案中，尾状核中的HTT基因降低了40-70％。在某些实施方案中，尾状核中的HTT基因降低了50-85％。
在某些实施方案中，药物制剂的施用抑制或阻抑受试者的大脑皮层中HTT基因的表达。在某些实施方案中，在初级运动皮层和躯体感觉皮层中HTT基因的表达被抑制或阻抑。在某些实施方案中，在初级运动皮层和躯体感觉皮层的锥体神经元中HTT基因的表达被抑制或阻抑。在某些实施方案中，在大脑皮层中HTT基因的表达降低了至少20％。在某些实施方案中，在大脑皮层中HTT基因的表达降低了30-70％。
在某些实施方案中，药物组合物的施用抑制或阻抑了受试者的丘脑中HTT基因的表达。在某些实施方案中，在丘脑中HTT基因的表达降低了至少30％。在某些实施方案中，在丘脑中HTT基因的表达降低了40-80％。
附图说明
根据以下本公开的特定实施方案的描述，前述和其他目标、特征和优点将是显而易见的，如附图中所示。附图不必然按比例绘制或理解，而是将重点放在说明本公开的各种实施方案的原理上。
图1示出了用于使用病毒生产细胞(VPC)和质粒构建体生产杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的系统的一个实施方案的示意图和方法的一个实施方案的流程图。
图2示出了用于使用病毒生产细胞(VPC)和杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)生产AAV颗粒的系统的一个实施方案的示意图和方法的一个实施方案的流程图。
图3示出了该方法用于通过加工、澄清和纯化AAV颗粒和病毒生产细胞的大量收获物来生产药物物质的系统的一个实施方案的示意图和方法的一个实施方案的流程图。
图4A示出了根据本公开的某些实施方案的以流通模式使用阴离子交换色谱系统的杆状病毒(BACV)病毒污染物的Log10降低值(TCID50)。
图4B示出了根据本公开的某些实施方案的以流通模式使用阴离子交换色谱系统的水疱性口炎病毒(VSV)病毒污染物的Log10降低值(TCID50)。
图4C示出了根据本公开的某些实施方案的以流通模式使用阴离子交换色谱系统的人类5型腺病毒(Ad5)病毒污染物的Log10降低值(TCID50)。
图4D示出了根据本公开的某些实施方案的以流通模式使用阴离子交换色谱系统的呼肠病毒3型(Reo3)病毒污染物的Log10降低值(TCID50)。
图5A-5C是显示从非人灵长类(NHP)核壳收集的组织穿孔中的HTT mRNA敲低和载体基因组水平的图。
图6A-5C是显示从NHP尾状核收集的组织穿孔中的HTT mRNA敲低和载体基因组水平的图
图7A-7C是显示从NHP运动皮层(mCTX)收集的组织穿孔中的HTT mRNA敲低和载体基因组水平的图。
图8A-8C是显示从NHP躯体感觉皮层(ssCTX)收集的组织穿孔中的HTT mRNA敲低和载体基因组水平的图。
图9A-9C是显示从NHP颞叶皮层(tCTX)收集的组织穿孔中的HTT mRNA敲低和载体基因组水平的图。
图10A和图10B是分别显示在来自NHP皮层的激光捕获的皮层锥体神经元中HTTmRNA敲低和载体基因组水平的图。
图11A显示了取自核壳的组织穿孔中HTT mRNA敲低相对于载体基因组水平的相关曲线。
图11B显示了取自核壳的组织穿孔中载体基因组相对于AAV1-VOYHT1miRNA水平的相关曲线。
图11C显示了取自核壳的组织穿孔中AAV1-VOYHT1 miRNA相对于HTT mRNA水平的相关曲线。
图12A显示了取自尾状核的组织穿孔中HTT mRNA敲低相对于载体基因组水平的相关曲线。
图12B显示了取自尾状核的组织穿孔中载体基因组相对于AAV1-VOYHT1 miRNA水平的相关曲线。
图12C显示了取自尾状核的组织穿孔中AAV1-VOYHT1 miRNA相对于HTT mRNA水平的相关曲线。
图13显示了取自丘脑的组织穿孔中HTT mRNA敲低相对于载体基因组水平的相关曲线。
发明详述
I、腺相关病毒(AAV)
综述
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的小的非包膜二十面体衣壳病毒，其特征在于单链DNA病毒基因组。细小病毒科家族病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的登革病毒亚科。细小病毒科包括依赖病毒属，其包括AAV，能够在脊椎动物宿主中复制，脊椎动物包括但不限于人、灵长类、牛、犬、马和绵羊物种。
细小病毒和细小病毒科的其他成员通常描述在Kenneth I.Berns，“Parvoviridae:The Viruses and Their Replication”(FIELDS VIROLOGY)(第3版，1996年)第69章中，其内容通过引用整体并入。
AAV由于结构相对简单，能够感染多种细胞(包括静止和分裂细胞)而不整合到宿主基因组中且无需复制以及其相对温和的免疫原性，已被证明可用作生物学工具。可以加工病毒的基因组以使其包含用于组装功能性重组病毒或病毒颗粒的最少组分，其装载有有效载荷，或工程化以靶向特定组织并表达或递送所需的有效载荷。
AAV病毒基因组
野生型AAV病毒基因组是一个线性，单链DNA(ssDNA)分子，长度为约5,000个核苷酸(nt)。反向末端重复序列(ITR)通常在5'和3'末端位于病毒基因组的侧翼，为病毒基因组提供复制起点。尽管不希望受到理论的束缚，但AAV病毒基因组通常包括两个ITR序列。这些ITR具有特征性T形发夹结构，其由在ssDNA的5'和3'端的自互补区(野生型AAV中为145nt)限定，形成了能量稳定的双链区。双链发夹结构包括多种功能，包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物来充当DNA复制的起点。
野生型AAV病毒基因组还包括两个开放阅读框的核苷酸序列，一个为四个非结构性Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因编码)，另一个为三个衣壳或结构性蛋白(VP1、VP2、VP3，由衣壳基因或Cap基因编码)。Rep蛋白对于复制和包装很重要，而衣壳蛋白则组装成AAV的蛋白壳或AAV衣壳。交替的剪接和交替的起始密码子和启动子导致从单个开放阅读框产生四种不同的Rep蛋白，并从单个开放阅读框产生三种衣壳蛋白。尽管作为非限制性实例，对于AAV9/hu.14(US 7,906,111的SEQ ID NO：123，其内容通过引用整体并入本文)其随AAV血清型而变化，VP1是指氨基酸1-736，VP2是指氨基酸138-736，并且VP3是指氨基酸203-736。换言之，VP1是全长衣壳序列，而VP2和VP3是整体的较短组成部分。结果，VP3区域中序列的变化也是VP1和VP2的变化，但是VP3的与亲本序列相比的百分比差异将是最大的，因为它是三个序列中最短的序列。尽管在此相对于氨基酸序列进行了描述，但是可以类似地描述编码这些蛋白的核酸序列。这三个衣壳蛋白一起组装形成AAV衣壳蛋白。尽管不希望受到理论的束缚，但AAV衣壳蛋白通常包括1:1:10摩尔比的VP1:VP2:VP3。如本文所用，“AAV血清型”主要由AAV衣壳定义。在一些情况下，ITR还通过AAV血清型(例如，AAV2/9)具体描述。
为了用作生物学工具，可以修饰野生型AAV病毒基因组，以用包括具有至少一个ITR区的有效载荷区的核酸序列替代rep/cap序列。通常，在重组AAV病毒基因组中有两个ITR区。可在生产过程中反式提供rep/cap序列，以产生AAV颗粒。
除编码的异源有效载荷外，AAV载体还可包含全部或部分的任何天然存在的和/或重组的AAV血清型核苷酸序列或变体的病毒基因组。AAV变体可在核酸(基因组或衣壳)和氨基酸水平(衣壳)上具有显著同源性的序列，以产生通常为物质和功能等同物的构建体，通过相似的机制复制，并通过相似的机制组装。参见Chiorini等人,J.Vir.71:6823-33(1997)；Srivastava等人,J.Vir.45:555-64(1983)；Chiorini等人,J.Vir.73:1309-1319(1999)；Rutledge等人,J.Vir.72:309-319(1998)；和Wu等人,J.Vir.74:8635-47(2000)，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒、病毒基因组和/或有效载荷及其使用方法可以如WO2017189963中所述，其内容通过引用整体并入本文。
本公开的AAV颗粒可以配制在本公开的任何基因治疗制剂中，包括对本领域技术人员显而易见的这类制剂的任何变化形式。在本申请中提到“AAV颗粒”、“AAV颗粒制剂”和“配制的AAV颗粒”是指可以配制的AAV颗粒和被配制而没有限制的AAV颗粒。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒是复制缺陷的重组AAV(rAAV)病毒颗粒，在其病毒基因组中缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。这些缺陷的AAV颗粒可能缺乏大多数或全部亲本编码序列，并且基本上仅携带一个或两个AAV ITR序列和用于递送至细胞、组织、器官或生物体的目标核酸(即有效载荷)。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一种控制元件，该控制元件提供了其中编码的编码序列的复制、转录和翻译。并非总是需要存在所有的控制元件，只要编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和/或翻译即可。表达控制元件的非限制性实例包括用于转录起始和/或终止的序列、启动子和/或增强子序列、有效的RNA加工信号(例如剪接和聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)、增强蛋白稳定性的序列和/或增强蛋白加工和/或分泌的序列。
根据本公开，用于治疗和/或诊断的AAV颗粒包含已被提取(distilled)或减少至转导目标核酸有效载荷或货物所需的最小组分的病毒。以这种方式，AAV颗粒被工程化为用于特异性递送的载体，同时缺少在野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征。
本公开的AAV颗粒可以重组产生，并且可以基于腺相关病毒(AAV)亲本或参考序列。如本文所用，“载体”是转运、转导或以其他方式充当异源分子(例如本文所述的核酸)的载体的任何分子或实体。
除了单链AAV病毒基因组(例如ssAAV)之外，本公开还提供了自互补AAV(scAAV)病毒基因组。scAAV载体基因组包含DNA链，它们退火在一起形成双链DNA。通过跳过第二链合成，scAAV可在细胞中快速表达。
在某些实施方案中，本公开的AAV病毒基因组是scAAV。在某些实施方案中，本公开的AAV病毒基因组是ssAAV。
本领域公开了产生和/或修饰AAV颗粒的方法，例如假型AAV颗粒(PCT专利公开号WO200028004；WO200123001；WO2004112727；WO2005005610和WO2005072364，其各自内容通过引用整体并入本文)。
可以修饰AAV颗粒以增强递送效率。这样的修饰的AAV颗粒可以被有效地包装，并被用于以高频率和最小毒性成功地感染靶细胞。在某些实施方案中，根据美国公开号US20130195801中描述的方法工程化AAV颗粒的衣壳，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，可以将包含编码本公开的多肽或蛋白的有效载荷区的AAV颗粒引入哺乳动物细胞中。
AAV血清型
本公开的AAV颗粒可以包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开，AAV颗粒可以利用或基于选自以下任一种的血清型，或包含选自以下任一种的肽：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、绵羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAVCBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAVCHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAVCKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAVCKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAVCKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAVCLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAVCLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAVCLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAVCSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAVrh20、AAVrh32/33、AAVrh39、AAVrh46、AAVrh73、AAVrh74、AAVhu.26、VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，AAV可以是选自表1中发现的任何血清型的血清型。
在一些实施方案中，AAV可包含表1中序列的序列、片段或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以由表1中所述的序列、片段或变体编码。
表1.AAV血清型
表1列出的每个专利、申请和/或出版物通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，血清型可以是AAVDJ(或AAV-DJ)或其变体，例如AAVDJ8(或AAV-DJ8)，如Grimm等人(Journal of Virology 82(12):5887-5911(2008)，通过引用整体并入本文)所述。AAVDJ8的氨基酸序列可以包含两个或更多个突变，以去除肝素结合域(HBD)。作为非限制性实例，在美国专利号7,588,772(其内容通过引用整体并入本文)中被描述为SEQ ID NO:1的AAV-DJ序列可以包含两个突变：(1)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(2)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。作为另一个非限制性实例，可包含3个突变：(1)K406R，其中氨基酸406处的赖氨酸(K；Lys)变为精氨酸(R；Arg)，(2)R587Q，其中氨基酸587处的精氨酸(R；Arg)变为谷氨酰胺(Q；Gln)和(3)R590T，其中氨基酸590处的精氨酸(R；Arg)变为苏氨酸(T；Thr)。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国公开号US 20160361439(其内容通过引用整体并入本文)中所述的修饰，例如但不限于野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和其杂交物的Y252F、Y272F、Y444F、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F、Y275F、Y281F、Y508F、Y576F、Y612G、Y673F和Y720F。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有如美国专利号US 9546112中所述的突变，其内容通过引用整体并入本文，例如但不限于AAV6(US 9546112的SEQ ID NO:4)、AAV1(US 9546112的SEQ ID NO:6)、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV9、AAV10或AAV11或其衍生物序列中的F129L、D418E、K531E、L584F、V598A和H642N突变的至少两个但不是全部。在另一个实施方案中，AAV血清型可以是或具有包含K531E突变的AAV序列(US 9546112的SEQID NO:5)
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有AAV1序列中的突变，如美国公开号US20130224836(其内容通过引用整体并入本文)中所述，例如但不限于至少一个表面暴露的酪氨酸残基(优选在AAV1的252、273、445、701、705和731位上(US 20130224836的SEQ IDNO:2))被另一种氨基酸取代，优选被苯丙氨酸残基取代。在一些实施方案中，AAV血清型可以是或具有AAV9序列中的突变，例如但不限于至少一个表面暴露的酪氨酸残基(优选地在AAV2的252、272、444、500、700、704和730位上(US 20130224836的SEQ ID NO:4))被另一个氨基酸取代，优选被苯丙氨酸残基取代。在一些实施方案中，AAV9(US 20130224836的SEQID NO:6)的446位上的酪氨酸残基被苯丙氨酸残基取代。
在一些实施方案中，如N Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078(2011)，通过引用整体并入本文)所述，AAV血清型可以是或具有AAV9序列中的突变，例如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些实施方案中，血清型可以是AAV2或其变体，如国际公开号WO2016130589中所述，其通过引用整体并入本文。AAV2的氨基酸序列可以包含N587A、E548A或N708A突变。在一些实施方案中，任何AAV的氨基酸序列可包含V708K突变。
在一些实施方案中，AAV血清型可以是或可以具有美国公开号US 20160369298(其内容通过引用整体并入本文)中描述的序列，例如但不限于AAV2的位点特异性突变的衣壳蛋白(US 20160369298的SEQ ID NO:97)或其变体，其中特异性位点是选自VP1或其片段的位点R447、G453、S578、N587、N587+1、S662的至少一个位点。
在一些实施方案中，可以如美国公开号US 20170145405(其内容通过引用整体并入本文)中所述修饰AAV血清型。AAV血清型可包括修饰的AAV2(例如，在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、修饰的AAV3(例如，在Y705F、Y731F和/或T492V处的修饰)和修饰的AAV6(例如，在S663V和/或T492V处的修饰)。
在一些实施方案中，AAV衣壳血清型的选择或使用可以来自多种物种。在一个实施方案中，AAV可以是禽类AAV(AAAV)。AAAV血清型可以是或具有美国专利号US 9238800(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于AAAV(US 9,238,800的SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12和14)，或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以是牛AAV(BAAV)。BAAV血清型可以是或具有美国专利号US 9,193,769(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于BAAV(US 9,193,769的SEQ ID NO:1和6)，或其变体。BAAV血清型可以是或具有美国专利号US7,427,396(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列，例如但不限于BAAV(US7,427,396的SEQ IDNO:5和6)，或其变体。
在一些实施方案中，AAV可以是山羊AAV。山羊AAV血清型可以是或具有美国专利号US7,427,396(其内容通过引用整体并入本文)中描述的序列，例如但不限于山羊AAV(US7,427,396的SEQ ID NO:3)，或其变体。
在其他实施方案中，可以将AAV工程化为来自两种或更多种亲本血清型的杂种AAV。在一些实施方案中，AAV可以是AAV2G9，其包含来自AAV2和AAV9的序列。AAV2G9 AAV血清型可以是或具有美国专利公开号US20160017005(其内容通过引用整体并入本文)中所述的序列。
在某些实施方案中，AAV可以是如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6)：1070-1078(2011))所述的由AAV9衣壳文库产生的具有390-627位氨基酸中突变(VP1编号)的血清型，其内容通过引用整体并入本文。血清型以及相应的核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)和AAV9.95(T1605A；F535L)。
在本文引用和/或描述的任何DNA和RNA序列中，单个字母符号具有以下描述：A代表腺嘌呤；C代表胞嘧啶；G代表鸟嘌呤；T代表胸腺嘧啶；U代表尿嘧啶；W代表弱碱基，例如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S代表强核苷酸，例如胞嘧啶和鸟嘌呤；M代表氨基核苷酸，如腺嘌呤和胞嘧啶；K代表酮核苷酸，如鸟嘌呤和胸腺嘧啶；R代表嘌呤腺嘌呤和鸟嘌呤；Y代表嘧啶胞嘧啶和胸腺嘧啶；B代表对于任何不是A的碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；D代表任何不是C的碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；H代表任何不是G的碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)；V代表任何不是T的碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)；N代表任何核苷酸(不是空位)；Z代表零。
在本文提及和/或描述的任何氨基酸序列中，单字母符号具有以下描述：G(Gly)代表甘氨酸；A(Ala)代表丙氨酸；L(Leu)代表亮氨酸；M(Met)代表甲硫氨酸；F(Phe)代表苯丙氨酸；W(Trp)代表色氨酸；K(Lys)代表赖氨酸；Q(Gln)代表谷氨酰胺；E(Glu)代表谷氨酸；S(Ser)代表丝氨酸；P(Pro)代表脯氨酸；V(Val)代表缬氨酸；I(Ile)代表异亮氨酸；C(Cys)代表半胱氨酸；Y(Tyr)代表酪氨酸；H(His)代表组氨酸；R(Arg)代表精氨酸；N(Asn)代表天冬酰胺；D(Asp)代表天冬氨酸；T(Thr)代表苏氨酸；B(Asx)代表天冬氨酸或天冬酰胺；J(Xle)代表亮氨酸或异亮氨酸；O(Pyl)为吡咯赖氨酸；U(Sec)代表硒代胱氨酸；X(Xaa)代表任何氨基酸；Z(Glx)代表谷氨酰胺或谷氨酸。
在某些实施方案中，AAV血清型可以是或可以包括序列、插入、修饰或突变，如专利公开WO2015038958、WO2017100671、WO2016134375、WO2017083722、WO2017015102、WO2017058892、WO2017066764、US9624274、US9475845、US20160369298、US20170145405中所述，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，AAV可以是如Devermian等人(Nature Biotechnology 34(2):204-209(2016)，其内容通过引用整体并入本文)所述的基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)生成的血清型。在某些实施方案中，AAV血清型可以如Jackson等人(Frontiers inMolecular Neuroscience 9:154(2016))所述，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，与其他AAV血清型相比，以这种方式产生的AAV血清型具有改善的CNS转导和/或神经元和星形胶质细胞嗜性。作为非限制性实例，AAV血清型可以是PHP.B、PHP.B2、PHP.B3、PHP.A、G2A12、G2A15。在一些实施方案中，这些AAV血清型可以是在氨基酸588-589之间具有7个氨基酸插入物的AAV9衍生物。
在某些实施方案中，选择使用AAV血清型是归因于其对中枢神经系统细胞的嗜性。在某些实施方案中，中枢神经系统的细胞是神经元。在另一个实施方案中，中枢神经系统的细胞是星形胶质细胞。
在某些实施方案中，选择使用AAV血清型是归因于其对肌肉细胞的嗜性。
在一些实施方案中，AAV血清型是PHP.B或AAV9。在一些实施方案中，与使用更遍在的启动子(例如CBA或CMV)时相比，AAV血清型与突触蛋白启动子配对以增强神经元转导。
在某些实施方案中，用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子可以是CTG、TTG或GTG，如美国专利号US8163543中所述，其内容通过引用整体并入本文。
本公开涉及由衣壳(Cap)基因编码的结构衣壳蛋白(包括VP1、VP2和VP3)。这些衣壳蛋白形成病毒载体例如AAV的外部蛋白结构壳(即衣壳)。由Cap多核苷酸合成的VP衣壳蛋白通常在肽序列中包括甲硫氨酸作为第一氨基酸(Met1)，其与相应Cap核苷酸序列中的起始密码子(AUG或ATG)相关。然而，通常在蛋白合成之后或期间通过蛋白加工酶例如Met-氨基肽酶将第一甲硫氨酸(Met1)残基或通常任何第一氨基酸(AA1)裂解掉。该“Met/AA-剪切”过程通常与多肽序列中第二氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的相应乙酰化相关。Met-剪切通常发生在VP1和VP3衣壳蛋白上，但也可能发生在VP2衣壳蛋白上。
当Met/AA剪切不完全时，可能会产生包括病毒衣壳的一个或多个(一个、两个或三个)VP衣壳蛋白的混合物，其中一些可包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)，并且其中一些由于Met/AA剪切可能缺少Met1/AA1氨基酸(Met-/AA-)。关于衣壳蛋白中Met/AA剪切的进一步讨论，请参见Jin等人Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis forComplete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus CapsidProteins.Hum Gene Ther Methods.2017Oct.28(5):255-267；Hwang等人N-TerminalAcetylation of Cellular Proteins Creates Specific DegradationSignals.Science.2010February 19.327(5968):973–977；其内容均通过引用整体并入本文。
根据本公开，提及衣壳蛋白不限于剪切的(Met-/AA-)或未剪切的(Met+/AA+)，并且在上下文中可以指独立的衣壳蛋白、包括衣壳蛋白混合物的病毒衣壳和/或编码、描述、产生或导致本公开的衣壳蛋白的多核苷酸序列(或其片段)。直接提及“衣壳蛋白”或“衣壳多肽”(例如VP1、VP2或VP2)还可以包括VP衣壳蛋白，其包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)以及相应的VP衣壳蛋白，其由于Met/AA剪切而缺少Met1/AA1氨基酸(Met-/AA-)。
进一步根据本公开，提及分别包含或编码一个或多个包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)的衣壳蛋白的特定SEQ ID NO:(无论是蛋白还是核酸)应理解为教导了VP衣壳蛋白，在检查序列时其缺少Met1/AA1氨基酸，很明显是任何仅缺少第一列出的氨基酸的序列(无论是否具有Met1/AA1)。
作为非限制性实例，提及长度为736个氨基酸并且包括由AUG/ATG起始密码子编码的“Met1”氨基酸(Met+)的VP1多肽序列也可以理解为教导了长度为735个氨基酸且不包括736个氨基酸的Met+序列的“Met1”氨基酸(Met-)的VP1多肽序列。作为第二非限制性实例，提及长度为736个氨基酸并且包括由任何NNN起始密码子编码的“AA1”氨基酸(AA1+)的VP1多肽序列也可以理解为教导了长度为735个氨基酸且不包含736个氨基酸的AA1+序列的“AA1”氨基酸(AA1-)的VP1多肽序列。
提及由VP衣壳蛋白形成的病毒衣壳(例如提及特异性AAV衣壳血清型)可以并入包含Met1/AA1氨基酸(Met+/AA1+)的VP衣壳蛋白，由于Met/AA1剪切而缺少Met1/AA1氨基的相应VP衣壳蛋白(Met-/AA1-)及其组合(Met+/AA1+和Met-/AA1-)。
作为非限制性实例，AAV衣壳血清型可包括VP1(Met+/AA1+)、VP1(Met-/AA1-)或VP1(Met+/AA1+)和VP1(Met-/AA1-)的组合。AAV衣壳血清型还可以包括VP3(Met+/AA1+)、VP3(Met-/AA1-)或VP3(Met+/AA1+)和VP3(Met-/AA1-)的组合；并且还可以包括VP2(Met+/AA1)和VP2(Met-/AA1-)的类似可选组合。
反向末端重复序列(ITR)
本公开的AAV颗粒包含具有至少一个ITR区和一个有效载荷区的病毒基因组。在某些实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR在5’和3’端位于有效载荷区的侧翼。ITR用作包含复制识别位点的复制的起点。ITR包含可以互补和对称排列的序列区。引入本公开的病毒基因组中的ITR可以由天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列组成。
ITR可以衍生自与衣壳相同的血清型或其衍生物。ITR可以具有与衣壳不同的血清型。在某些实施方案中，AAV颗粒具有多于一个ITR。在非限制性实例中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在某些实施方案中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一个实施方案中，ITR具有不同的血清型。非限制性实例包括具有与衣壳相同血清型的零个、一个或两个ITR。在某些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR均为AAV2 ITR。
独立地，每个ITR可以具有约100-约150个核苷酸长度。ITR可以具有约100-105个核苷酸长度、106-110个核苷酸长度、111-115个核苷酸长度、116-120个核苷酸长度、121-125个核苷酸长度、126-130个核苷酸长度、131-135个核苷酸长度、136-140个核苷酸长度、141-145个核苷酸长度或146-150个核苷酸长度。在某些实施方案中，ITR具有140-142个核苷酸长度。ITR长度的非限制性实例是102、130、140、141、142、145个核苷酸长度，以及与其具有至少95％同一性的核苷酸。
在某些实施方案中，每个ITR的长度可以是141个核苷酸。在某些实施方案中，每个ITR的长度可以是130个核苷酸。在某些实施方案中，每个ITR的长度可以是119个核苷酸。
在某些实施方案中，AAV颗粒包括两个ITR，并且一个ITR的长度为141个核苷酸，另一个ITR的长度为130个核苷酸。在某些实施方案中，AAV颗粒包括两个ITR，并且两个ITR的长度均为141个核苷酸。
独立地，每个ITR的长度可以为约75至约175个核苷酸。ITR的长度可以独立地具有例如但不限于75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。病毒基因组的ITR长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸和长度为约141个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸和长度为约130个核苷酸的ITR。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸和长度为141个核苷酸的ITR。
基因组大小
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的AAV颗粒可以是单链或双链载体基因组。载体基因组的大小可以是小、中等、大或最大大小。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的载体基因组可以是小单链载体基因组。小单链载体基因组的大小可以是2.1至3.5kb，例如2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为非限制性实例，小单链载体基因组的大小可以是3.2kb。作为另一非限制性实例，小单链载体基因组的大小可以是2.2kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的载体基因组可以是小双链载体基因组。小双链载体基因组的大小可以是1.3到1.7kb，例如约1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为非限制性实例，小双链载体基因组的大小可以是1.6kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷(例如多核苷酸、siRNA或dsRNA)的载体基因组可以是中等单链载体基因组。中等单链载体基因组的大小可以是3.6至4.3kb，例如约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为非限制性实例，中等单链载体基因组的大小可以是4.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的载体基因组可以是中等双链载体基因组。中等双链载体基因组的大小可以是1.8至2.1kb，例如约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为非限制性实例，中等双链载体基因组的大小可以是2.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的载体基因组可以是大单链载体基因组。大单链载体基因组的大小可能为4.4至6.0kb，例如约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是4.7kb。作为另一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是4.8kb。作为又一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是6.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
在某些实施方案中，包含本文所述的有效载荷的载体基因组可以是大双链载体基因组。大双链载体基因组的大小可以是2.2至3.0kb，例如约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性实例，大双链载体基因组的大小可以是2.4kb。另外，载体基因组可包含启动子和polyA尾。
载体基因组区：填充区
本公开的AAV颗粒包括具有至少一个填充区的病毒基因组。填充区的长度可以独立地为例如但不限于50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1001、1002、1003、1004、1005、1006、1007、1008、1009、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、1023、1024、1025、1026、1027、1028、1029、1030、1031、1032、1033、1034、1035、1036、1037、1038、1039、1040、1041、1042、1043、1044、1045、1046、1047、1048、1049、1050、1051、1052、1053、1054、1055、1056、1057、1058、1059、1060、1061、1062、1063、1064、1065、1066、1067、1068、1069、1070、1071、1072、1073、1074、1075、1076、1077、1078、1079、1080、1081、1082、1083、1084、1085、1086、1087、1088、1089、1090、1091、1092、1093、1094、1095、1096、1097、1098、1099、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110、1111、1112、1113、1114、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1121、1122、1123、1124、1125、1126、1127、1128、1129、1130、1131、1132、1133、1134、1135、1136、1137、1138、1139、1140、1141、1142、1143、1144、1145、1146、1147、1148、1149、1150、1151、1152、1153、1154、1155、1156、1157、1158、1159、1160、1161、1162、1163、1164、1165、1166、1167、1168、1169、1170、1171、1172、1173、1174、1175、1176、1177、1178、1179、1180、1181、1182、1183、1184、1185、1186、1187、1188、1189、1190、1191、1192、1193、1194、1195、1196、1197、1198、1199、1200、1201、1202、1203、1204、1205、1206、1207、1208、1209、1210、1211、1212、1213、1214、1215、1216、1217、1218、1219、1220、1221、1222、1223、1224、1225、1226、1227、1228、1229、1230、1231、1232、1233、1234、1235、1236、1237、1238、1239、1240、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2241、2242、2243、2244、2245、2246、2247、2248、2249、2250、2251、2252、2253、2254、2255、2256、2257、2258、2259、2260、2261、2262、2263、2264、2265、2266、2267、2268、2269、2270、2271、2272、2273、2274、2275、2276、2277、2278、2279、2280、2281、2282、2283、2284、2285、2286、2287、2288、2289、2290、2291、2292、2293、2294、2295、2296、2297、2298、2299、2300、2301、2302、2303、2304、2305、2306、2307、2308、2309、2310、2311、2312、2313、2314、2315、2316、2317、2318、2319、2320、2321、2322、2323、2324、2325、2326、2327、2328、2329、2330、2331、2332、2333、2334、2335、2336、2337、2338、2339、2340、2341、2342、2343、2344、2345、2346、2347、2348、2349、2350、2351、2352、2353、2354、2355、2356、2357、2358、2359、2360、2361、2362、2363、2364、2365、2366、2367、2368、2369、2370、2371、2372、2373、2374、2375、2376、2377、2378、2379、2380、2381、2382、2383、2384、2385、2386、2387、2388、2389、2390、2391、2392、2393、2394、2395、2396、2397、2398、2399、2400、2401、2402、2403、2404、2405、2406、2407、2408、2409、2410、2411、2412、2413、2414、2415、2416、2417、2418、2419、2420、2421、2422、2423、2424、2425、2426、2427、2428、2429、2430、2431、2432、2433、2434、2435、2436、2437、2438、2439、2440、2441、2442、2443、2444、2445、2446、2447、2448、2449、2450、2451、2452、2453、2454、2455、2456、2457、2458、2459、2460、2461、2462、2463、2464、2465、2466、2467、2468、2469、2470、2471、2472、2473、2474、2475、2476、2477、2478、2479、2480、2481、2482、2483、2484、2485、2486、2487、2488、2489、2490、2491、2492、2493、2494、2495、2496、2497、2498、2499、2500、2501、2502、2503、2504、2505、2506、2507、2508、2509、2510、2511、2512、2513、2514、2515、2516、2517、2518、2519、2520、2521、2522、2523、2524、2525、2526、2527、2528、2529、2530、2531、2532、2533、2534、2535、2536、2537、2538、2539、2540、2541、2542、2543、2544、2545、2546、2547、2548、2549、2550、2551、2552、2553、2554、2555、2556、2557、2558、2559、2560、2561、2562、2563、2564、2565、2566、2567、2568、2569、2570、2571、2572、2573、2574、2575、2576、2577、2578、2579、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、2606、2607、2608、2609、2610、2611、2612、2613、2614、2615、2616、2617、2618、2619、2620、2621、2622、2623、2624、2625、2626、2627、2628、2629、2630、2631、2632、2633、2634、2635、2636、2637、2638、2639、2640、2641、2642、2643、2644、2645、2646、2647、2648、2649、2650、2651、2652、2653、2654、2655、2656、2657、2658、2659、2660、2661、2662、2663、2664、2665、2666、2667、2668、2669、2670、2671、2672、2673、2674、2675、2676、2677、2678、2679、2680、2681、2682、2683、2684、2685、2686、2687、2688、2689、2690、2691、2692、2693、2694、2695、2696、2697、2698、2699、2700、2701、2702、2703、2704、2705、2706、2707、2708、2709、2710、2711、2712、2713、2714、2715、2716、2717、2718、2719、2720、2721、2722、2723、2724、2725、2726、2727、2728、2729、2730、2731、2732、2733、2734、2735、2736、2737、2738、2739、2740、2741、2742、2743、2744、2745、2746、2747、2748、2749、2750、2751、2752、2753、2754、2755、2756、2757、2758、2759、2760、2761、2762、2763、2764、2765、2766、2767、2768、2769、2770、2771、2772、2773、2774、2775、2776、2777、2778、2779、2780、2781、2782、2783、2784、2785、2786、2787、2788、2789、2790、2791、2792、2793、2794、2795、2796、2797、2798、2799、2800、2801、2802、2803、2804、2805、2806、2807、2808、2809、2810、2811、2812、2813、2814、2815、2816、2817、2818、2819、2820、2821、2822、2823、2824、2825、2826、2827、2828、2829、2830、2831、2832、2833、2834、2835、2836、2837、2838、2839、2840、2841、2842、2843、2844、2845、2846、2847、2848、2849、2850、2851、2852、2853、2854、2855、2856、2857、2858、2859、2860、2861、2862、2863、2864、2865、2866、2867、2868、2869、2870、2871、2872、2873、2874、2875、2876、2877、2878、2879、2880、2881、2882、2883、2884、2885、2886、2887、2888、2889、2890、2891、2892、2893、2894、2895、2896、2897、2898、2899、2900、2901、2902、2903、2904、2905、2906、2907、2908、2909、2910、2911、2912、2913、2914、2915、2916、2917、2918、2919、2920、2921、2922、2923、2924、2925、2926、2927、2928、2929、2930、2931、2932、2933、2934、2935、2936、2937、2938、2939、2940、2941、2942、2943、2944、2945、2946、2947、2948、2949、2950、2951、2952、2953、2954、2955、2956、2957、2958、2959、2960、2961、2962、2963、2964、2965、2966、2967、2968、2969、2970、2971、2972、2973、2974、2975、2976、2977、2978、2979、2980、2981、2982、2983、2984、2985、2986、2987、2988、2989、2990、2991、2992、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3000、3001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任何填充区的长度可以是50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区。
在一个实施方案中，填充区的长度为714个核苷酸。
载体基因组区：多克隆位点(MCS)区
本公开的AAV颗粒包括具有至少一个多克隆位点(MCS)区的病毒基因组。MCS区域的长度可以独立地为例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的MCS区的长度可以是2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150和145-150个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约5个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约10个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约14个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约18个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约73个核苷酸的MCS区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约121个核苷酸的MCS区。
在一个实施方案中，MCS区的长度为5个核苷酸。
在一个实施方案中，MCS区的长度为10个核苷酸。
载体基因组区：启动子和增强子区
本公开的AAV颗粒包括具有至少一个启动子区的病毒基因组。启动子区的长度可以独立地为例如但不限于4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的启动子区的长度可以是4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约4个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约17个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约204个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约219个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约260个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约588个核苷酸的启动子区。
在一个实施方案中，启动子区源自CBA启动子序列。作为非限制性实例，启动子的长度为260个核苷酸。
本公开的AAV颗粒包括具有至少一个增强子区的病毒基因组。增强子区的长度可以独立地为例如但不限于300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399和400个核苷酸。病毒基因组的增强子区的长度可以为300-310、300-325、305-315、310-320、315-325、320-330、325-335、325-350、330-340、335-345、340-350、345-355、350-360、350-375、355-365、360-370、365-375、370-380、375-385、375-400、380-390、385-395和390-400个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的增强子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的增强子区。
在一个实施方案中，增强子区源自CMV增强子序列。作为非限制性实例，CMV增强子的长度为382个核苷酸。
载体基因组区：外显子和内含子区
本公开的AAV颗粒包括具有至少一个外显子区的病毒基因组。外显子区的长度可以独立地为例如但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的外显子区的长度可以为2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150和145-150个核苷酸。作为非限制性的实例，病毒基因组包含长度为约53个核苷酸的外显子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约134个核苷酸的外显子区。
本公开的AAV颗粒包括具有至少一个内含子区的病毒基因组。内含子区的长度可以独立地为例如但不限于25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349和350个核苷酸。病毒基因组的内含子区的长度可以为25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350和335-345个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约32个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约172个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约201个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，生命基因组包含长度为约347个核苷酸的内含子区。
在一个实施方案中，内含子区源自SV40内含子序列。作为非限制性实例，内含子的长度为172个核苷酸。
II.AAV生产
通用生产过程及组成
用于生产rAAV颗粒的病毒生产细胞通常包括哺乳动物细胞类型。然而，哺乳动物细胞给rAAV颗粒的大规模生产带来了一些问题，包括每个复制细胞的病毒颗粒普遍低产率，以及病毒生产细胞中来自其他哺乳动物生物材料的不希望有的污染的高风险。结果，昆虫细胞已经成为大规模生产rAAV颗粒的替代载体。
使用昆虫细胞的AAV生产系统也存在一系列新问题。例如，与Rep52相比，高产量生产rAAV颗粒通常需要Rep78的较低表达。因此，控制Rep78和Rep52在昆虫细胞中的相对表达需要在Rep操纵子内精心设计的控制机制。这些控制机制可以包括单独优化的昆虫细胞启动子，例如Rep78的ΔIE1启动子和Rep52的PolH启动子，或将Rep编码核苷酸序列划分为独立优化的序列或构建体。但是，实施这些控制机制通常会导致rAAV颗粒产量降低或产生结构不稳定的病毒体。
在另一个实例中，rAAV颗粒的产生需要VP1、VP2和VP3蛋白，其组装以形成AAV衣壳。rAAV颗粒的高产量生产需要优化的VP1、VP2和VP3比例，通常应分别为约1:1:10，但相对于10个VP3拷贝，VP1可以是1-2和/或VP2可以是1-2。该比例对于衣壳的质量很重要，因为过多的VP1会破坏衣壳的稳定性，而太少的VP1则会降低病毒的感染性。
野生型AAV使用缺陷剪接方法来控制VP1的表达；用具有特殊周围环境(“Kozak”序列)的弱起始密码子(ACG)来控制VP2；以及用标准起始密码子(ATG)用于VP3表达。但是，在某些杆状病毒系统中，哺乳动物剪接序列并不总是被识别，并且不能适当地控制VP1、VP2和VP3的产生。因此，来自VP2的相邻核苷酸和ACG起始序列可用于驱动衣壳蛋白的产生。不幸的是，对于大多数AAV血清型，这种方法产生的衣壳具有较低的VP1比VP2的比(相对于10个VP3拷贝，<1)。为了更有效地控制VP蛋白的生产，已使用了非经典或起始密码子，例如TTG、GTG或CTG。然而，相对于野生型ATG或ACG起始密码子，这些起始密码子被本领域技术人员认为是次佳的(参见，WO2007046703和WO2007148971，其内容通过引用整体并入本文)。
在另一个示例中，使用杆状病毒/Sf9系统生产rAAV颗粒通常需要广泛使用的基于杆状病毒质粒的杆状病毒表达载体系统(BEV)，该系统未针对大规模AAV生产进行优化。基于杆状病毒质粒的BEV中病毒蛋白的异常蛋白水解降解是预料不到的问题，这妨碍了使用杆状病毒/Sf9系统可靠地大规模生产AAV衣壳蛋白的过程。
仍然需要允许在哺乳动物和昆虫细胞中有效和高效地大规模(商业)生产rAAV颗粒的方法和系统。
本公开的一个或多个实施方案的细节在下面的描述中阐明。从说明书、附图和权利要求书中，本公开的其他特征、目的和优点将是显而易见的。在说明书中，单数形式也包括复数，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在与通过引用并入的公开内容冲突的情况下，以本文的明确描述为准。
在某些实施方案中，本公开的构建体、多核苷酸、多肽、载体、血清型、衣壳制剂或颗粒可以是以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法，可以包括以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法，可以被以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法修饰，可以被以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法使用，可以用于以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法，可以与以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法一起使用，或可以用以下国际公布之一所述的任何序列、元件、构建体、系统、靶标或方法生产：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其内容均通过引用整体并入本文。
本公开的AAV生产包括生产AAV颗粒和病毒载体的过程和方法，所述AAV颗粒和病毒载体可以与靶细胞接触以递送有效载荷，例如重组病毒构建体，其包含编码有效载荷分子的核苷酸。在某些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体，例如重组腺相关病毒(rAAV)载体。在某些实施方案中，AAV颗粒是腺相关病毒(AAV)颗粒，例如重组腺相关病毒(rAAV)颗粒。
在某些实施方案中，本公开的方法包括使用病毒生产系统在病毒生产细胞中生产病毒颗粒，所述病毒生产系统包括至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体。可以将至少一种病毒表达构建体和至少一种有效载荷构建体共转染(例如双重转染，三次转染)到病毒生产细胞中。使用本领域技术人员已知和常规进行的标准分子生物学技术完成转染。病毒生产细胞提供表达蛋白所必需的细胞机制和生产AAV颗粒所必需的其他生物材料，包括复制有效载荷构建体的Rep蛋白和组装形成包围复制的有效载荷构建体的衣壳的Cap蛋白。从病毒生产细胞中提取所得的AAV颗粒，并将其加工成用于施用的药物制剂。
一旦施用，AAV颗粒接触靶细胞并以内体进入细胞。AAV颗粒从内体释放，然后接触靶细胞的核以递送有效载荷构建体。有效载荷构建体(例如重组病毒构建体)被递送至靶细胞的核，其中可以表达由有效载荷构建体编码的有效载荷分子。
在某些实施方案中，生产病毒颗粒的方法利用病毒生产细胞的种子培养物，其包括一种或多种杆状病毒(例如杆状病毒表达载体(BEV)或已被病毒表达构建体和有效载荷构建体载体转染的杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC))。在某些实施方案中，收获种子培养物，分成等分试样并冷冻，并可以在其后用于引发生产细胞未经处理群体的感染。
AAV颗粒的大规模生产可以利用生物反应器。使用生物反应器可以精确测量和/或控制支持病毒生产细胞生长和活性的变量，例如质量、温度、混合条件(喷射器RPM或波振荡)、CO2浓度、O2浓度、气体喷射速率和体积、气体覆盖率和体积、pH、活细胞密度(VCD)、细胞活力、细胞直径和/或光密度(OD)。在某些实施方案中，生物反应器用于批量生产，其中在实验确定的时间点收获整个培养物，并纯化AAV颗粒。在另一个实施方案中，生物反应器用于连续生产，其中在实验确定的时间点收获一部分培养物以纯化AAV颗粒，并且用额外的生长培养基组分更新生物反应器中的剩余培养物。
可以在包括细胞裂解、澄清、灭菌和纯化的过程中从病毒生产细胞中提取AAV病毒颗粒。细胞裂解包括破坏病毒生产细胞结构从而释放AAV颗粒的任何过程。在某些实施方案中，细胞裂解可以包括热激、化学或机械裂解方法。澄清可以包括裂解细胞、培养基成分和AAV颗粒混合物的粗纯化。在某些实施方案中，澄清包括离心和/或过滤，包括但不限于深度末端过滤、切向流过滤和/或中空纤维过滤。
病毒生产的最终结果是纯化的AAV颗粒收集物，其中包括两个组分：(1)有效载荷构建体(例如重组病毒构建体)和(2)病毒衣壳。
图1显示了使用病毒生产细胞(VPC)和质粒构建体生产杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的系统的一个实施方案的示意图，以及方法的一个实施方案的流程图。将来自细胞库(CB)的病毒生产细胞(VPC)解冻并扩增以提供目标工作体积和VPC浓度。生成的VPC汇聚物分为Rep/Cap VPC汇聚物和有效载荷VPC汇聚物。将一种或多种Rep/Cap质粒构建体(病毒表达构建体)加工成Rep/Cap杆状病毒质粒多核苷酸，并转染到Rep/Cap VPC汇聚物中。将一种或多种有效载荷质粒构建体(有效载荷构建体)加工成有效载荷杆状病毒质粒多核苷酸并转染到有效载荷VPC汇聚物中。孵育两个VPC汇聚物以产生P1 Rep/Cap杆状病毒表达载体(BEV)和P1有效载荷BEV。将两个BEV汇聚物扩增为斑块收集物，并选择一个斑块进行克隆斑块(CP)纯化(也称为单一斑块扩张)。该过程可以包括单个CP纯化步骤，或者可以包括串联或由其他处理步骤分开的多个CP纯化步骤。一个或多个CP纯化步骤提供了CP Rep/Cap BEV汇聚物和CP有效载荷BEV汇聚物。然后可以存储这两个BEV汇聚物并将其用于将来的生产步骤，或者可以将它们转染到VPC中以产生Rep/Cap BIIC汇聚物和有效载荷BIIC汇聚物。
图2示出了用于使用病毒生产细胞(VPC)和杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)生产AAV颗粒的系统的示意图的一个实施方案和方法的一个实施方案的流程图。将来自细胞库(CB)的病毒生产细胞(VPC)解冻并扩增以提供目标工作体积和VPC浓度。此扩增包括一个或多个小体积扩增步骤，工作体积可达2500-5000mL，随后是大规模生物反应器中的一个或多个大体积扩增步骤(例如Wave和/或N1生物反应器)，工作体积可达25-500L。将工作体积的病毒生产细胞接种到生产生物反应器中，并且可以进一步扩增到200-2000L的工作体积以及用于BIIC感染的目标VPC浓度。
然后将生产生物反应器中的VPC的工作体积与Rep/Cap BIIC和有效载荷BIIC以目标VPC:BIIC比例和目标BIIC:BIIC比例共感染。VCD感染也可以利用BEV。将共感染的VPC在生产生物反应器中孵育并扩增，以产生AAV颗粒和VPC的大量收获物。
图3显示了用于通过加工、澄清和纯化AAV颗粒和病毒生产细胞的大量收获物来生产药物的系统的一个实施方案的示意图，以及方法的一个实施方案的流程图。通过细胞破碎和裂解(例如化学裂解和/或机械裂解)处理AAV颗粒和VPC的大量收获物(在生产生物反应器内)，然后对裂解汇聚物进行核酸酶处理，从而产生粗裂解物汇聚物。粗裂解物汇聚物通过一个或多个过滤和澄清步骤进行处理，包括深度过滤和微滤，以提供澄清的裂解物汇聚物。通过一个或多个色谱和纯化步骤(包括亲和色谱(AFC)和离子交换色谱(AEX或CEX))对澄清的裂解物汇聚物进行处理，以提供纯化的产物汇聚物。然后，纯化的产物汇聚物可通过纳滤，然后通过切向流过滤(TFF)进行处理。TFF过程包括串联或交替的一个或多个渗滤(DF)步骤和一个或多个超滤(UF)步骤。通过病毒保留过滤(VRF)和最终过滤步骤进一步处理产物汇聚物，以提供药物汇聚物。药物汇聚物可以进一步过滤，然后分装到小瓶中进行存储和处理。
病毒构建体
病毒表达构建体
本公开的病毒生产系统包括一种或多种可以被转染/转导到病毒生产细胞中的病毒表达构建体。病毒表达构建体可包含在一个或多个启动子控制下的细小病毒基因。细小病毒基因可包括编码非结构性AAV复制蛋白的核苷酸序列，例如编码Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白的Rep基因。细小病毒基因可以包括编码结构性AAV蛋白的核苷酸序列，例如编码VP1、VP2和VP3蛋白的Cap基因。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可包括Rep52编码区；Rep52编码区是包含编码Rep52蛋白的Rep52核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包括Rep78编码区；Rep78编码区是包含编码Rep78蛋白的Rep78核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包含Rep40编码区；Rep40编码区是包含编码Rep40蛋白的Rep40核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包含Rep68编码区；Rep68编码区是包含编码Rep68蛋白的Rep68核苷酸序列的核苷酸序列。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可包括VP编码区；VP编码区是包括编码VP1、VP2、VP3或其组合的VP核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包含VP1编码区；VP1编码区是包括编码VP1蛋白的VP1核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包含VP2编码区；VP2编码区是包括编码VP2蛋白的VP2核苷酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可包括VP3编码区；VP3编码区是包括编码VP3蛋白的VP3核苷酸序列的核苷酸序列。
启动子可包括但不限于杆状病毒主要晚期启动子、昆虫病毒启动子、非昆虫病毒启动子、脊椎动物病毒启动子、核基因启动子、来自一种或多种包括病毒和非病毒元件的物种的嵌合启动子和/或合成启动子。在某些实施方案中，启动子可以选自：Op-EI、EI、ΔEI、EI-1、pH、PIO、polh(多面体)、ΔpolH、Dmhsp70、Hr1、Hsp70、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70、IE、IE-1、ΔIE-1、ΔIE、p10、Δp10(p10的修饰变体或衍生物)、p5、p19、p35、p40及其变体或衍生物。在某些实施方案中，启动子可以选自组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、细胞周期特异性启动子及其变体或衍生物。在某些实施方案中，启动子可以选自：CMV启动子、α1-抗胰蛋白酶(αl-AT)启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、甲状腺素结合球蛋白(LPS)启动子、HCR-ApoCII杂合启动子、HCR-hAAT杂合启动子、白蛋白启动子、载脂蛋白E启动子、α1-AT+EaIb启动子、肿瘤选择性E2F启动子、单核血液IL-2启动子及其变体或衍生物。在某些实施方案中，启动子是低表达启动子序列。在某些实施方案中，启动子是表达增强的启动子序列。在某些实施方案中，启动子可包括如美国专利申请20110136227中所述的Rep或Cap启动子，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以在所有核苷酸序列中包括相同的启动子。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以在两个或更多个核苷酸序列中包含相同的启动子。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以在两个或更多个核苷酸序列中包含不同的启动子。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以在所有核苷酸序列中包括不同的启动子。
本公开的病毒生产系统不受用于将细小病毒功能引入病毒复制细胞的病毒表达载体的限制。病毒复制细胞中存在病毒表达构建体不需要是永久的。病毒表达构建体可以通过任何已知的方式引入，例如通过化学处理细胞、电穿孔或感染。
本公开的病毒表达构建体可以包括任何生物的或化学的化合物或制剂，其有助于用核酸转化、转染或转导细胞。示例性生物病毒表达构建体包括质粒、线性核酸分子和包括杆状病毒的重组病毒。示例性化学载体包括脂质复合物。根据本公开，病毒表达构建体用于将核酸序列引入病毒复制细胞中。(O'Reilly,David R.,Lois K.Miller,and VerneA.Luckow.Baculovirus expression vectors:a laboratory manual.Oxford UniversityPress,1994；Maniatis Maniatis等人编辑，Molecular Cloning.CSH Laboratory,NY,N.Y.(1982)；和Philiport and Scluber,eds.Liposoes as tools in Basic Research andIndustry.CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995)，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体是AAV表达构建体，其包含编码非结构性AAV复制蛋白、结构性AAV复制蛋白或其组合的一个或多个核苷酸序列。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是质粒载体。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是杆状病毒构建体。
本公开不受用于生产AAV颗粒或病毒载体的病毒表达构建体的数量的限制。在某些实施方案中，根据本公开，可以采用一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个病毒表达构建体来在病毒生产细胞中生产AAV颗粒。在一个非限制性实例中，五个表达构建体可分别编码AAV VP1、AAV VP2、AAV VP3、Rep52、Rep78，以及伴随的包含有效载荷多核苷酸和至少一个AAV ITR的有效载荷构建体。在另一个实施方案中，可以使用表达构建体来表达例如Rep52和Rep40，或者Rep78和Rep 68。表达构建体可包括VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40和Rep78/Rep68编码序列的任何组合。
在某些实施方案中，病毒表达构建体编码在某些细胞类型中优化表达的元件。在另一个实施方案中，表达构建体可包括polh和/或ΔIE-1昆虫转录启动子、CMV哺乳动物转录启动子和/或p10昆虫特异性启动子，用于在哺乳动物或昆虫细胞中表达所需基因。
在本公开的某些实施方案中，病毒表达构建体可以用于在昆虫细胞中生产AAV颗粒。在某些实施方案中，可以对衣壳和/或rep基因的野生型AAV序列进行修饰，例如以改善病毒颗粒的特性，例如增加的感染性或特异性，或提高产量。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可包含含有起始密码子区的核苷酸序列，例如编码包含一个或多个起始密码子区的AAV衣壳蛋白的序列。起始密码子可以是ATG或非ATG密码子(即次佳的起始密码子，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG)。在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包含编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG，即次佳的起始密码子，从而允许以修饰的比例在昆虫衣壳生产系统中表达病毒衣壳蛋白，以提高宿主细胞的感染性。在非限制性实例中，本公开的病毒表达构建体可以包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是CTG、TTG或GTG，如美国专利号US8163543中所述，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包括表达控制区，其包括表达控制序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可包含IRES序列区，其包含编码内部核糖体进入位点(IRES)的IRES核苷酸序列。内部核糖体进入位点(IRES)可以选自：口蹄疫病毒的FMDV-IRES、脑心肌炎病毒的EMVV-IRES及其组合。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可包含2A序列区，其包含编码病毒2A肽的2A核苷酸序列。病毒2A序列是一个相对较短的序列(约20个氨基酸)，其包含共有序列：Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro。该序列允许在单个开放阅读框(ORF)内共翻译多个多肽。随着ORF的翻译，带有2A序列的甘氨酸和脯氨酸残基会阻止正常肽键的形成，这会导致多肽链内的核糖体“跳过(skipping)”和“自我切割”。病毒2A肽可以选自：口蹄疫病毒的F2A、阿萨那病毒(Thosea asigna virus)的T2A、马甲鼻炎病毒的E2A、猪破伤风病毒1的P2A、细胞质多角体病毒的BmCPV2A、B.mori flacherie病毒的BmIFV 2A及其组合。
在某些实施方案中，用于AAV生产的病毒表达构建体可以包含编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列，其中AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子是非ATG，即次佳的起始密码子，从而允许以修饰比例在生产系统中表达病毒衣壳蛋白，以提高宿主细胞的感染性。在非限制性实例中，病毒构建体载体可以包含核酸构建体，其包含编码AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列，其中用于AAV VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是CTG、TTG或GTG，如美国专利号US8,163,543中所述，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以是质粒载体或杆状病毒构建体，其编码细小病毒rep蛋白以在昆虫细胞中表达。在某些实施方案中，对Rep78和Rep52蛋白使用单一编码序列，其中用于Rep78蛋白翻译的起始密码子是次佳的起始密码子，其选自ACG、TTG、CTG和GTG，这些起始密码子影响部分外显子跳过在昆虫细胞中表达(如美国专利号8,512,981所述，其内容通过引用整体并入本文)，例如以降低与Rep52相比，Rep78的大量表达，这可能是因为它促进了高载体收率。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以是用于在昆虫细胞中表达的质粒载体或杆状病毒构建体，其包含具有不同密码子偏倚的重复密码子，例如以提高Rep蛋白(例如Rep78和Rep52)的比例，从而提高昆虫细胞中病毒表达构建体和/或有效载荷构建体载体的大规模(商业)生产，如美国专利号8,697,417所教导，其内容通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，可以使用美国专利号8,642,314中描述的方法和构建体来提高rep蛋白的比例，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以编码突变的细小病毒Rep多肽，与它们相应的野生型Rep多肽相比，其具有一种或多种改善的特性，例如制备更高病毒滴度以进行大规模生产。或者，它们可能能够产生质量更高的病毒颗粒或维持更稳定的病毒生产。在非限制性实例中，病毒表达构建体可编码具有突变的核定位序列或锌指结构域的突变Rep多肽，如专利申请US20130023034中所述,其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以编码具有引入的Gly-Ala重复区的细小病毒衣壳的组分，其可以起到免疫侵袭序列的作用，如美国专利申请20110171262中所述，其内容通过引用整体并入本文。
在本公开的某些实施方案中，病毒表达构建体可用于在昆虫细胞中生产AAV颗粒。在某些实施方案中，可以对衣壳和/或rep基因的野生型AAV序列进行修饰，例如以改善病毒颗粒的特性，例如增加的感染性或特异性，或提高产量。
在某些实施方案中，VP编码区编码具体AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白。VP编码区的AAV血清型可以相同或不同。在某些实施方案中，可以对VP编码区进行密码子优化。在某些实施方案中，可以针对哺乳动物细胞对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。在某些实施方案中，可以针对昆虫细胞对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。在某些实施方案中，VP编码区或核苷酸序列可以被密码子优化以用于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。在某些实施方案中，可以针对Sf9或Sf21细胞系对VP编码区或核苷酸序列进行密码子优化。
在某些实施方案中，可以对编码一种或多种VP衣壳蛋白的核苷酸序列进行密码子优化以使其与参考核苷酸序列的核苷酸同源性小于100％。在某些实施方案中，密码子优化的VP核苷酸序列和参考VP核苷酸序列之间的核苷酸同源性小于100％、小于99％、小于98％、小于97％、小于96％、小于95％、小于94％、小于93％、小于92％、小于91％、小于90％、小于89％、小于88％、小于87％、小于86％、小于85％、小于84％、小于83％、小于82％、小于81％、小于80％、小于78％、小于76％、小于74％、小于72％、小于70％、小于68％、小于66％、小于64％、小于62％、小于60％、小于55％、小于50％和小于40％。
在某些实施方案中，可以使用在美国专利号US 8,512,981、US 8,163,543、US 8,697,417、US 8,642,314、美国专利申请号US20130296532、US20110119777、US20110136227、US20110171262、US20130023034、国际专利申请号PCT/NL2008/050613、PCT/NL2009/050076、PCT/NL2009/050352、PCT/NL2011/050170、PCT/NL2012/050619和美国专利申请号14/149,953中教导的病毒表达构建体，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以源自美国专利号US6,468,524、US 6,984,517、US 7,479,554、US 6,855,314、US 7,271,002、US6,723,551、美国专利公开号20140107186、美国专利申请号US 09/717,789、US 11/936,394、US 14/004,379、欧洲专利申请EP1082413、EP2500434、EP2683829、EP1572893，以及国际专利申请PCT/US99/11958、PCT/US01/09123、PCT/EP2012/054303和PCT/US2002/035829中教导的病毒表达构建体，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，病毒表达构建体可以包括来自猿猴物种的序列。在某些实施方案中，病毒表达构建体可包含序列，其包括但不限于来自以下的衣壳和rep序列：国际专利申请PCT/US1997/015694、PCT/US2000/033256、PCT/US2002/019735、PCT/US2002/033645、PCT/US2008/013067、PCT/US2008/013066、PCT/US2008/013065、PCT/US2009/062548、PCT/US2009/001344、PCT/US2010/036332、PCT/US2011/061632、PCT/US2013/041565、美国申请号US13/475535、US13/896722、US10/739096、US14/073979、美国专利公开号US20010049144、US20120093853、US20090215871、US20040136963、US20080219954、US20040171807、US20120093778、US20080090281、US20050069866、US20100260799、US20100247490,US20140044680、US20100254947、US20110223135、US20130309205、US20120189582、US20130004461、US20130315871、美国专利号US6083716、US7838277、US7344872、US8603459、US8105574、US7247472、US8231880、US8524219、US8470310、欧洲专利申请号EP2301582、EP2286841、EP1944043、EP1453543、EP1409748、EP2463362、EP2220217、EP2220241、EP2220242、EP2350269、EP2250255、EP2435559、EP2643465、EP1409748、EP2325298、EP1240345，其各自内容均通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以包含来自以下中描述的一种或多种病毒构建体的一种或多种核苷酸序列：国际申请号PCT/US2002/025096、PCT/US2002/033629、PCT/US2003/012405、美国申请号US10/291583、US10/420284、US 7,319,002、美国专利公开号US20040191762、US20130045186、US20110263027、US20110151434、US20030138772、US20030207259、欧洲申请号EP2338900、EP1456419、EP1310571、EP1359217、EP1427835、EP2338900、EP1456419、EP1310571、EP1359217，以及美国专利号US7,235,393和US 8,524,446。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可包含以下中描述的序列或组合物：国际专利申请号PCT/US1999/025694、PCT/US1999/010096、PCT/US2001/013000、PCT/US2002/25976、PCT/US2002/033631、PCT/US2002/033630、PCT/US2009/041606、PCT/US2012/025550、美国专利号US8637255、US8637255、US7186552、US7105345、US6759237、US7056502、US7198951、US8318480、US7790449、US7282199、美国专利公开号US20130059289、US20040057933、US20040057932、US20100278791、US20080050345、US20080050343、US20080008684、US20060204479、US20040057931、US20040052764、US20030013189、US20090227030、US20080075740、US20080075737、US20030228282、US20130323226、US20050014262、美国专利申请号US14/136331、US09/076369、US10/738609、欧洲申请号EP2573170、EP1127150、EP2341068、EP1845163、EP1127150、EP1078096、EP1285078、EP1463805、EP2010178940、US20140004143、EP2359869、EP1453547、EP2341068和EP2675902，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可包含来自以下中描述的一个或多个核苷酸序列的一个或多个核苷酸序列：美国专利号US7186552、US7105345、US6759237、US7056502、US7198951、US8318480、US7790449、US7282199、美国专利公开号US20130059289、US20040057933、US20040057932、US20100278791、US20080050345、US20080050343、US20080008684、US20060204479、US20040057931、US20140004143、US20090227030、US20080075740、US20080075737、US20030228282、US20040052764、US20030013189、US20050014262、US20130323226、美国专利申请号US14/136331、US10/738609、欧洲专利申请号EP1127150、EP2341068、EP1845163、EP1127150、EP1078096、EP1285078、EP2573170、EP1463805、EP2675902、EP2359869、EP1453547、EP2341068，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可包括修饰的AAV的构建体，如国际专利申请号PCT/US1995/014018、PCT/US2000/026449、PCT/US2004/028817、PCT/US2006/013375、PCT/US2007/010056、PCT/US2010/032158、PCT/US2010/050135、PCT/US2011/033596、美国专利申请号12/473917、US08/331384、US09/670277、美国专利号US5871982、US5856152、US6251677、US6387368、US6399385、US7906111、欧洲专利申请号EP2000103600、欧洲专利公开号EP797678、EP1046711、EP1668143、EP2359866、EP2359865、EP2357010、EP1046711、EP1218035、EP2345731、EP2298926、EP2292780、EP2292779、EP1668143、US20090197338、EP2383346、EP2359867、EP2359866、EP2359865、EP2357010、EP1866422、US20090317417、EP2016174、美国专利公开号US20110236353、US20070036760、US20100186103、US20120137379和US20130281516中所述，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体可以包括以下中描述的一种或多种构建体：国际申请号PCT/US1999/004367、PCT/US2004/010965、PCT/US2005/014556、PCT/US2006/009699、PCT/US2010/032943、PCT/US2011/033628、PCT/US2011/033616、PCT/US2012/034355、美国专利号US8394386、EP1742668、美国专利公开号US20080241189、US20120046349、US20130195801、US20140031418、EP2425000、US20130101558、EP1742668、EP2561075、EP2561073、EP2699688，其各自内容通过引用整体并入本文。
有效载荷构建体：通用
本公开的AAV颗粒可以包括至少一种有效载荷构建体或使用其来生产，所述至少一种有效载荷构建体包含至少一个有效载荷区。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码或在其内编码的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区(例如有效载荷序列)，或这种多核苷酸或多核苷酸区(例如转基因、编码多肽或多个多肽的多核苷酸或调节性(modulatory)核酸或调控性(regulatory)核酸)的表达产物。
有效载荷区可以以反映与mRNA的天然组织相似或镜像的区的方式构建。
有效载荷区可以包含编码和非编码核酸序列的组合。在某些实施方案中，AAV有效载荷区可以编码编码RNA或非编码RNA，或其组合。
有效载荷区还可任选地包含一种或多种功能性或调节性元件，以促进转录表达和/或多肽翻译。可以对本文公开的核酸序列和多肽进行工程化，以使其包含模块元件和/或序列基序，其被组装以使得能够表达调节性多核苷酸和/或基于调节性多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，包含有效载荷区的核酸序列可包含启动子区、内含子、Kozak序列、增强子或聚腺苷酸化序列中的一个或多个。本文公开的有效载荷区通常彼此结合或与其他多肽部分结合来编码至少一个有义和反义序列、基于siRNA的组合物或前述的片段。
AAV颗粒公开的病毒基因组内的有效载荷区可以被递送至一个或多个靶细胞、组织、器官或生物体。
在某些实施方案中，有效载荷区可以位于病毒基因组内，例如有效载荷构建体的病毒基因组。在有效载荷区的5'和/或3'端可能至少有一个反向终端重复(ITR)。在有效载荷区内，可以有启动子区、内含子区和编码区。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善疾病和/或病症，包括神经疾病和/或病症。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善弗里德希氏共济失调或因Frataxin蛋白的丧失或部分丧失而引起的任何疾病。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善帕金森病。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善肌萎缩性侧索硬化。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善亨廷顿舞蹈病。
在某些实施方案中，AAV颗粒的有效载荷区包含一个或多个编码目标多肽或蛋白的核酸序列。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码多于一种目标多肽的核酸序列。在某些实施方案中，可以复制编码一种或多种多肽的病毒基因组，并将其包装到病毒颗粒中。用包含载体基因组的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个靶细胞中表达一种或多种多肽的每一种。
如果AAV颗粒有效载荷区编码多肽，该多肽可以是肽、多肽或蛋白。作为非限制性实例，有效载荷区可以编码至少一种目标治疗性蛋白。编码本文描述的多肽的AAV病毒基因组可用于人类疾病、病毒、感染、兽医应用和各种体内和体外环境的领域。
在某些实施方案中，将配制的AAV颗粒(其包含病毒基因组)施用于受试者将增加蛋白在受试者中的表达。在某些实施方案中，蛋白表达的增加将减少与有效载荷编码的多肽相关的疾病或病症的作用和/或症状。
在某些实施方案中，本公开的配制的AAV颗粒可以用于减少通过标准评估系统测量的功能性能力和日常生活活动的下降，所述标准评估系统例如但不限于总功能能力(TFC)量表。
在某些实施方案中，AAV颗粒包括具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码目标蛋白(即有效载荷蛋白、治疗性蛋白)的核酸序列。
在某些实施方案中，有效载荷区包含编码蛋白的核酸序列，所述蛋白包括但不限于抗体、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、ApoE2、Frataxin、存活运动神经元(SMN)蛋白、葡萄糖脑苷脂酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶、N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶、艾杜糖2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖苷酶(alpha-L-iduronidase)、棕榈酰蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、battenin、CLN5、CLN6(linclin)、MFSD8、CLN8、天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)、颗粒蛋白前体(progranulin)(GRN)、MeCP2、β-半乳糖苷酶(GLB1)和/或巨轴索神经病蛋白(gigaxonin)(GAN)。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码AADC或本领域已知的用于治疗帕金森病的任何其他有效载荷的核酸序列。作为非限制性实例，有效载荷可以包括以下序列，例如NM_001082971.1(GI:132814447)、NM_000790.3(GI:132814459)、NM_001242886.1(GI:338968913)、NM_001242887.1(GI:338968916)、NM_001242888.1(GI:338968918)、NM_001242889.1(GI:338968920)、NM_001242890.1(GI:338968922)及其片段或变体。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码frataxin或本领域已知的用于治疗弗里德希氏共济失调的任何其他有效载荷的核酸序列。作为非限制性实例，有效载荷可以包含以下序列，例如NM_000144.4(GI:239787167)、NM_181425.2(GI:239787185)、NM_001161706.1(GI:239787197)及其片段或变体。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码SMN或本领域已知的用于治疗脊髓性肌萎缩(SMA)的任何其他有效载荷的核酸序列。作为非限制性实例，有效载荷可以包含以下序列，例如NM_001297715.1(GI:663070993)、NM_000344.3(GI:196115055)、NM_022874.2(GI:196115040)及其片段或变体。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码美国专利公开号20180258424中描述的任何与疾病相关的蛋白(及其片段或变体)的核酸序列；其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码以下任一个中描述的任何与疾病相关的蛋白(及其片段或变体)的核酸序列：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其各自内容均通过引用整体并入本文。
有效载荷：靶向目标基因的调节性多核苷酸
常规
本公开包括配制的AAV颗粒的用途，其载体基因组编码调节性多核苷酸，例如RNA或DNA分子。如本文所用，“调节性多核苷酸”是起到调节(增加或减少)靶基因的水平或量(例如mRNA或蛋白水平)的作用的任何核酸序列。因此，本公开提供了编码多核苷酸的载体基因组，所述多核苷酸可被加工到可靶向细胞内目标基因的RNA分子，这些RNA分子包括但不限于双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、pre-miRNA或其他RNAi试剂。本公开还提供了其用于抑制目标基因的等位基因的基因表达和蛋白产生，治疗疾病、病症和/或病况的方法。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码或包含一种或多种调节性多核苷酸的核酸序列。在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码目标调节性多核苷酸的核酸序列。在本公开的某些实施方案中，调节性多核苷酸(例如RNA或DNA分子)作为治疗剂提供。RNA干扰介导的基因沉默可以特异性抑制靶基因表达。
在某些实施方案中，有效载荷区包含编码调节性多核苷酸的核酸序列，所述调节性多核苷酸干扰靶基因表达和/或靶蛋白产生。在某些实施方案中，待抑制/修饰的基因表达或蛋白产生可包括但不限于超氧化物歧化酶1(SOD1)、染色体9开放阅读框72(C90RF72)、TAR DNA结合蛋白(TARDBP)、共济失调蛋白-3(ATXN3)、亨廷顿蛋白(HTT)、淀粉样前体蛋白(APP)、载脂蛋白E(ApoE)、微管相关蛋白τ(MAPT)、α-突触核蛋白(SNCA)、电压门控钠通道α亚基9(SCN9A)和/或门控钠通道α亚基10(SCN10A)。
本公开提供了靶向SOD1 mRNA以干扰SOD1的基因表达和/或蛋白产生的小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)。本公开还提供了其用于抑制SOD1的等位基因的基因表达和蛋白产生，治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)的方法。在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体可以沿着相应核苷酸序列的任何区段靶向SOD1。在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体可将SOD1靶向核苷酸序列内的SNP或变体的位置。
本公开提供了靶向HTT mRNA以干扰HTT的基因表达和/或蛋白产生的小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)。本公开还提供了其用于抑制HTT等位基因的基因表达和蛋白产生，治疗亨廷顿舞蹈病(HD)的方法。在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体可以沿着相应核苷酸序列的任何区段靶向HTT。在某些实施方案中，本公开的siRNA双链体可以将HTT靶向核苷酸序列内的SNP或变体的位置。
在某些实施方案中，AAV颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码以下任何一个中描述的任何调节性多核苷酸、RNAi分子、siRNA分子、dsRNA分子和/或RNA双链体的任一种的核酸序列：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其各自的内容均通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，将编码此类siRNA分子或siRNA分子的单链的核酸序列插入腺相关病毒载体，并引入细胞，特别是中枢神经系统中的细胞。
因为几个独特的特征，已经针对siRNA递送研究了AAV颗粒。所述特征的非限制性实例包括(i)感染分裂的细胞和非分裂的细胞的能力；(ii)侵染性的广宿主范围，包括人细胞；(iii)野生型AAV尚未与任何疾病相关，且尚未被证实在受感染的细胞中复制；(iv)细胞介导的针对载体的免疫应答的缺乏，和(v)在宿主染色体中的不整合性质，由此减少长期表达的可能。此外，AAV颗粒感染对改变细胞基因表达模式均仅具有微小影响(Stilwell和Samulski等人，Biotechniques,2003,34,148-150；其内容通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，本公开的编码的siRNA双链体包含杂交在一起的反义链和有义链，其中所述反义链与所述目标靶向基因的核酸序列互补，并且其中有义链与目标靶基因的核酸序列同源。在其他方面，每条链的3'端有0、1或2个核苷酸突出端。
根据本公开，靶向目标基因的siRNA双链体的每条链的长度可以为约19至25、19至24或19至21个核苷酸，例如长度为约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸。
在某些实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。dsRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包括与编码目标基因的mRNA的至少一部分基本互补的核苷酸序列，并且互补区的长度为30个核苷酸或更少，并且至少15个核苷酸。通常，dsRNA的长度为19至25、19至24或19至21个核苷酸。在某些实施方案中，dsRNA的长度为约15至约25个核苷酸，并且在某些实施方案中，dsRNA的长度为约25至约30个核苷酸。
当通过本领域已知的方法或本文所述的方法进行测定时，与表达目标基因编码的蛋白的细胞接触后，表达载体中编码的dsRNA将目标基因编码的蛋白表达抑制了至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或更多。
根据本公开，设计siRNA分子，并测试了其降低培养细胞中mRNA水平的能力。
在某些实施方案中，设计siRNA分子，并测试其降低培养细胞中目标基因水平的能力。
本公开还提供了药物组合物，其包含至少一个靶向目标基因的siRNA双链体和药学上可接受的载体。在一些方面，siRNA双链体由AAV颗粒中的载体基因组编码。
在某些实施方案中，本公开提供了用于抑制/沉默细胞中的基因表达的方法。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制了至少约20％，例如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、35-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，例如至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在某些实施方案中，编码的siRNA双链体可用于将目标基因编码的蛋白的表达降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、35-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，蛋白的表达可以降低50-90％。作为非限制性实例，蛋白的表达可以降低30-70％。作为非限制性实例，蛋白的表达可以降低40-70％。
在某些实施方案中，编码的siRNA双链体可以用于将从目标基因转录的mRNA的表达降低至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、35-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，mRNA表达的表达可以降低50-90％。
在某些实施方案中，编码的siRNA双链体可用于降低CNS的至少一个区域中由目标基因和/或转录的mRNA编码的蛋白的表达。在CNS的至少一个区域中，蛋白和/或mRNA的表达降低了至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、35-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，该区域是神经元(例如皮层神经元)。
在某些实施方案中，可例如通过输注到核壳中，将配制的包含此类编码的siRNA分子的AAV颗粒直接引入受试者的中枢神经系统。
在某些实施方案中，可例如通过输注到受试者的丘脑中，将配制的包含此类编码的siRNA分子的AAV颗粒直接引入受试者的中枢神经系统。
在某些实施方案中，可例如通过输注至受试者的白质中，将配制的包含此类编码的siRNA分子的AAV颗粒直接引入受试者的中枢神经系统。
在某些实施方案中，可例如通过静脉内施用于受试者，将配制的包含此类编码的siRNA分子的AAV颗粒引入受试者的中枢神经系统。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物用作单独疗法。在某些实施方案中，本公开的药物组合物用于联合疗法。联合疗法可以与一种或多种神经保护剂例如小分子化合物、生长因子和激素组合，所述神经保护剂已经过测试其对运动神经元退化的神经保护作用。
siRNA分子
本公开的配制的AAV颗粒的有效载荷可以编码一种或多种物质，所述物质经受RNA干扰(RNAi)诱导的基因表达抑制。本文提供了靶向目标基因的编码的siRNA双链体或编码的dsRNA(本文统称为“siRNA分子”)。此类siRNA分子(例如编码的siRNA双链体、编码的dsRNA或编码的siRNA或dsRNA前体)可以降低或沉默细胞(例如星形胶质细胞或小胶质细胞神经元、皮层神经元、海马体神经元、内嗅神经元、丘脑神经元、感觉神经元或运动神经元)中的基因表达。
RNAi(也称为转录后基因沉默(PTGS)、压抑或共抑制)是转录后基因沉默的过程，其中RNA分子以序列特异性方式抑制基因表达，通常是通过导致破坏特异性的mRNA分子。RNAi的活性组分是短/小双链RNA(dsRNA)，称为小干扰RNA(siRNA)，其通常包含15-30个核苷酸(例如19至25、19至24或19-21个核苷酸)和2个核苷酸的3’突出端，且其与靶基因的核酸序列匹配。这些短RNA物质可能是由Dicer介导的较大dsRNA的裂解在体内自然产生的，并且它们在哺乳动物细胞中具有功能。
在一些实施方案中，载体基因组的调节性多核苷酸可包含编码至少一个siRNA分子的至少一个核酸序列。如果存在多于一个，则核酸序列可以独立地编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或多于9个siRNA分子。
天然表达的小RNA分子，称为microRNA(miRNA)，通过调节mRNA的表达引起基因沉默。包含RNA诱导沉默复合物(RISC)的miRNA靶向mRNA，所述mRNA与在miRNA的5’区中的核苷酸2-7(称为种子区)和其他具有其3’区的碱基对呈完美序列互补性。miRNA介导的基因表达下调可能是由靶标mRNA的切割、靶标mRNA的翻译抑制或mRNA降解引起的。miRNA靶向序列通常位于靶mRNA的3’-UTR中。单个miRNA可以靶向来自多种基因的超过100个转录物，而一个mRNA可以被不同的miRNA靶向。
可以将靶向特定mRNA的siRNA双链体或dsRNA设计成AAV颗粒的有效载荷，并引入细胞中以激活RNAi过程。Elbashir等人证明了21个核苷酸的siRNA双链体(称为小干扰RNA)能够在不诱导哺乳动物细胞的免疫应答的情况下有效地强烈且特异性地敲低基因(Elbashir SM等人,Nature,2001,411,494-498)。自从这份初步报告以来，通过siRNA进行转录后基因沉默迅速成为哺乳动物细胞遗传分析的有力工具，并具有产生新疗法的潜力。
siRNA双链体由与靶mRNA同源的有义链和与靶mRNA互补的反义链组成，其与单链(ss)-siRNA(例如反义链RNA或反义寡核苷酸)的使用相比，在破坏靶RNA的效率方面，siRNA双链体具有更多优势。在许多情况下，需要更高浓度的ss-siRNA才能实现对应双链体的有效基因沉默效力。
引入细胞-AAV颗粒
本公开的编码的siRNA分子(例如，siRNA双链体)可以通过被AAV颗粒的载体基因组编码而被引入细胞中。对这些AAV颗粒进行了工程化和优化，以帮助其进入不易被转染/转导修饰的细胞。而且，一些合成的病毒载体具有将shRNA整合到细胞基因组中的能力，从而导致稳定的siRNA表达和靶基因的长期敲低。以这种方式，将病毒载体工程化为用于特定递送的载体，同时缺乏在野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征。
在某些实施方案中，通过用AAV颗粒转染、感染或转导细胞，将编码的siRNA分子引入细胞，所述AAV颗粒包含当在细胞中转录时能够产生siRNA分子的核酸序列。在某些实施方案中，通过将AAV颗粒注射到细胞或组织中来将siRNA分子引入细胞，所述AAV颗粒包含当在细胞中转录时能够产生siRNA分子的核酸序列。
在某些实施方案中，在转染/转导之前，可以将包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒转染到细胞中。
引入包含本文所述的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒的其他方法可包括如美国专利公开号20120264807中所述的光化学内在化，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本文所述的制剂可包含至少一种AAV颗粒，其包含编码本文所述的siRNA分子的核酸序列。在某些实施方案中，siRNA分子可以在一个靶位点靶向目标基因。在另一个实施方案中，所述制剂包含多个AAV颗粒，每个AAV颗粒包含编码在不同靶位点靶向目标基因的siRNA分子的核酸序列。目标基因可靶向2、3、4、5或超过5个位点。
在某些实施方案中，可以将来自任何相关物种(例如但不限于人、猪、狗、小鼠、大鼠或猴)的AAV颗粒引入细胞中。
在某些实施方案中，可以将配制的AAV颗粒引入与待治疗的疾病有关的细胞或组织中。
在某些实施方案中，可以将配制的AAV颗粒引入具有高水平靶序列内源性表达的细胞中。
在另一个实施方案中，可以将配制的AAV颗粒引入具有低水平靶序列内源性表达的细胞中。
在某些实施方案中，细胞可以是具有高AAV转导效率的细胞。
在某些实施方案中，配制的包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用于将siRNA分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些方面，配制的包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以进一步包含修饰的衣壳，其包含来自非病毒来源的肽。在其他方面，AAV颗粒可以包含CNS特异性嵌合衣壳，以促进将编码的siRNA双链体递送至脑和脊髓。例如，可以构建来自显示CNS嗜性的AAV变体的cap核苷酸序列的比对，以识别可变区(VR)序列和结构。
在某些实施方案中，配制的包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以编码作为多顺反子分子的siRNA分子。siRNA分子可在siRNA分子的区域之间另外包含一个或多个接头。
在某些实施方案中，配制的AAV颗粒可以包含至少一个编码本文所述的siRNA序列或双链体中的至少一个的调节性多核苷酸。
在某些实施方案中，表达载体从ITR至ITR可包含(从5'至3'陈述)ITR、启动子、内含子、调节性多核苷酸、poly A序列和ITR。
在某些实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子的下游，该启动子例如但不限于CMV、U6、H1、CBA或具有SV40内含子的CBA启动子。此外，编码的siRNA分子在表达载体中还可位于聚腺苷酸化序列的上游。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸内。
在某些实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可位于聚腺苷酸化序列的上游。此外，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子的下游，该启动子例如但不限于CMV、U6、CBA或具有SV40内含子的CBA启动子。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可位于启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％的核苷酸内。
在某些实施方案中，编码的siRNA分子可以位于scAAV中。
在某些实施方案中，编码的siRNA分子可以位于ssAAV中。
在某些实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于flip ITR的5’端附近。在另一个实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于flip ITR的3’端附近。在又一个实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于flop ITR的5’端附近。在又一个实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于flop ITR的3’端附近。在某些实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于flip ITR的5’端和flop ITR的3’端之间。在某些实施方案中，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于flip ITR的3’端和flopITR的5’端之间(例如，在flip ITR的5’端与flop ITR的3’端或在flop ITR的3’端和flipITR的5’端之间的中间)。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端下游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端下游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于ITR(例如Flip或FlopITR)的5’或3’端上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或大于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的siRNA分子在表达载体中可以位于ITR(例如Flip或Flop ITR)的5’或3’端下游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或大于25％内。
在某些实施方案中，可以配制包含本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒用于CNS递送。可以使用穿过大脑血液屏障的药物。例如，可以将siRNA分子靶向脑血屏障内皮的一些细胞穿透肽可用于配制靶向目标基因的siRNA双链体。
在某些实施方案中，可以将配制的包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒直接施用于CNS。作为非限制性实例，载体包含编码靶向目标基因的siRNA分子的核酸序列。
在特定实施方案中，可以以促进载体或siRNA分子进入中枢神经系统并渗透进运动神经元的方式施用配制的包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒的组合物。
在某些实施方案中，可以以治疗有效量将配制的AAV颗粒施用于受试者(例如，通过鞘内施用于受试者的CNS)，以使siRNA双链体或dsRNA靶向脊髓和/或脑干中的运动神经元和星形胶质细胞。作为非限制性实例，siRNA双链体或dsRNA可减少蛋白或mRNA的表达。
病毒生产细胞和载体
哺乳动物生产系统
本文公开的本公开的病毒生产描述了生产AAV颗粒或病毒载体的过程和方法，所述AAV颗粒或病毒载体与靶细胞接触以递送有效载荷构建体，例如(重组AAV颗粒或病毒构建体)，其包含编码有效载荷分子的核苷酸。病毒生产细胞可以选自任何生物，包括原核(例如细菌)细胞和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在包括哺乳动物细胞的病毒生产细胞中产生。病毒生产细胞可包含哺乳动物细胞，例如A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO.W138、HeLa、HEK293、HEK293T(293T)、Saos、C2C12、L细胞、HT1080、HepG2和来源于哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒生产细胞可包括衍生自哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠或细胞类型，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。
通常用于生产重组AAV颗粒的AAV病毒生产细胞包括但不限于HEK293细胞、COS细胞、C127、3T3、CHO、HeLa细胞、KB细胞、BHK和其他哺乳动物细胞系，如美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176、6,428,988和5,688,676；美国专利申请2002/0081721和国际专利公开号WO 00/47757、WO 00/24916和WO 96/17947中所描述的，其各自内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，AAV病毒生产细胞是反式互补包装细胞系，其提供从复制缺陷性辅助病毒中缺失的功能，例如HEK293细胞或其他Ea反式互补细胞。
在某些实施方案中，包装细胞系293-10-3(ATCC登录号PTA-2361)可用于生产AAV颗粒，如美国专利号6,281,010中所述，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开的用于反式互补E1缺失的腺病毒载体的细胞系(例如Hela细胞系)可在磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子的控制下编码腺病毒Ela和腺病毒Elb，其可用于AAV颗粒生产，如美国专利号6365394中所述的，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，使用三重转染方法在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒，其中有效载荷构建体、细小病毒Rep和细小病毒Cap以及辅助构建体包含在三个不同的构建体中。AAV颗粒生产的三个组成部分的三重转染方法可用于生产少量病毒，用于包括转导效率、靶组织(嗜性)评估和稳定性在内的测定。
待配制的AAV颗粒可以通过三次转染或杆状病毒介导的病毒生产，或本领域已知的任何其他方法来生产。本领域已知的任何合适的允许或包装细胞均可用于产生载体。在某些实施方案中，使用反式互补包装细胞系，其提供从复制缺陷性辅助病毒中缺失的功能，例如293细胞或其他E1a反式互补细胞。
基因盒可以包含一些或全部细小病毒(例如，AAV)cap和rep基因。在某些实施方案中，通过将编码衣壳和/或Rep蛋白的包装载体引入细胞中反式提供一些或全部的cap和rep功能。在某些实施方案中，基因盒不编码衣壳或Rep蛋白。或者，使用包装细胞系，其被稳定转化以表达cap和/或rep基因。
在某些实施方案中，重组AAV病毒颗粒根据如US2016/0032254(其内容通过引用并入)所述的程序从培养上清物中生产和纯化。生产还可以涉及本领域已知的方法，包括使用293T细胞的方法、三重转染或任何合适的生产方法。
在某些实施方案中，哺乳动物病毒生产细胞(例如293T细胞)可以处于贴壁/粘附状态(例如，采用磷酸钙)或悬浮状态(例如，采用聚乙烯亚胺(PEI))。用产生AAV所需的质粒(即AAV rep/cap构建体、腺病毒辅助构建体和/或ITR侧翼有效载荷构建体)转染哺乳动物病毒生产细胞。在某些实施方案中，转染过程可以包括任选的培养基改变(例如，对于贴壁形式的细胞，培养基改变；对于悬浮形式的细胞，培养基没有改变；如果需要，对于悬浮形式的细胞，培养基改变)。在某些实施方案中，转染过程可包括转染培养基，例如DMEM或F17。在某些实施方案中，转染培养基可以包括血清或可以是无血清的(例如，贴壁状态的细胞采用磷酸钙和血清，悬浮状态的细胞采用PEI而没有血清)。
随后可以通过刮擦(贴壁形式)和/或沉淀(悬浮形式和刮擦的贴壁形式)收集细胞，并将其转移到容器中。可以根据需要重复收集步骤，以完全收集产生的细胞。接下来，可以通过连续的冻融循环(-80℃至37℃)、化学裂解(例如添加去污剂Triton)、机械裂解或通过使细胞培养物在达到～0％的生存能力后降解来实现细胞裂解。通过离心和/或深度过滤除去细胞碎片。通过DNA qPCR通过DNA酶抗性基因组滴定定量样品中的AAV颗粒。
根据基因组拷贝数(每毫升基因组颗粒数)测量AAV颗粒滴度。如先前所报道(Clark等人(1999)Hum.Gene Ther.,10:1031-1039；Veldwijk等人(2002)Mol.Ther.,6:272-278)，基因组颗粒浓度基于载体DNA的DNA qPCR。
昆虫细胞
本公开的病毒生产包括用于生产与靶细胞接触以递送有效载荷构建体(例如重组病毒构建体)的AAV颗粒或病毒载体的过程和方法，所述有效载荷构建体包含编码有效载荷分子的核苷酸。在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒或病毒载体可以在包括昆虫细胞的病毒生产细胞中产生。
培养中昆虫细胞的生长条件以及培养中昆虫细胞的异源产物的生产在本领域是众所周知的，参见美国专利号6,204,059，其内容通过引用整体并入本文。
根据本公开，可以使用允许细小病毒复制并且可以在培养物中维持的任何昆虫细胞。通常用于生产重组AAV颗粒的AAV病毒生产细胞包括但不限于草地贪夜蛾，包括但不限于Sf9或Sf21细胞系，果蝇(Drosophila)细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedesalbopictus)起源的细胞系。昆虫细胞用于表达异源蛋白的用途已得到充分证明，将核酸例如载体(例如昆虫细胞相容性载体)引入此类细胞的方法以及在培养中维持此类细胞的方法也已得到充分证明。参见，例如，Methods In Molecular Biology,ed.Richard,HumanaPress,NJ(1995)；O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors,A LaboratoryManual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人,Vir.219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)；和Samulski等人美国专利号6,204,059，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，使用在WO2015/191508中描述的方法制备AAV颗粒，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，可以使用昆虫宿主细胞系统与杆状病毒系统的组合(例如，如Luckow等人，Bio/Technology 6:47(1988)所述)。在某些实施方案中，用于制备嵌合肽的表达系统是Trichoplusia ni,Tn 5B1-4昆虫细胞/杆状病毒系统，其可以用于高水平的蛋白，如美国专利号6660521中所述，其内容通过引用整体并入本文。
昆虫细胞的扩增、培养、转染、感染和储存可以在本领域已知的任何细胞培养基、细胞转染培养基或储存培养基中进行，包括Hyclone SFX昆虫细胞培养基、表达系统ESF AF昆虫细胞培养基、ThermoFisher Sf900II培养基，ThermoFisher Sf900III培养基或ThermoFisher Grace的昆虫培养基。本公开的昆虫细胞混合物还可以包括本公开中描述的任何制剂添加剂或成分，包括(但不限于)盐、酸、碱、缓冲剂、表面活性剂(例如泊洛沙姆188/普兰尼克F-68)以及其他已知的培养基成分。制剂添加剂可以逐渐加入，也可以“掺入”(短时间内大量掺入)。
杆状病毒生产系统
在某些实施方案中，本公开的方法可以包括在使用病毒表达构建体和有效载荷构建体载体的杆状病毒系统中生产AAV颗粒或病毒载体。在某些实施方案中，杆状病毒系统包括杆状病毒表达载体(BEV)和/或杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。在某些实施方案中，本公开的病毒表达构建体载体和有效载荷构建体载体各自通过以下方法引入：通过本领域技术人员已知和进行的标准分子生物学技术通过同源重组(转座子供体/受体系统)引入杆状病毒质粒(bacmid)(也称为杆状病毒质粒(baculovirus))中。分离的病毒复制细胞群的转染产生两组或更多组(例如，两组、三组)杆状病毒(BEV)，包含病毒表达构建体(表达BEV)的一组或多组，以及包含有效载荷构建体(有效载荷BEV)的一组或多组。杆状病毒可用于感染病毒生产细胞以生产AAV颗粒或病毒载体。
在某些实施方案中，该方法包括转染单个病毒复制细胞群体以产生单个杆状病毒(BEV)基团，其包括病毒表达构建体和有效载荷构建体两者。这些杆状病毒可用于感染病毒生产细胞，以产生AAV颗粒或病毒载体。
在某些实施方案中，使用杆状病毒质粒转染剂如Promega FuGENE HD、WFI水或ThermoFisher Cellfectin II试剂产生BEV。在某些实施方案中，BEV在病毒生产细胞如昆虫细胞中产生并扩增。
在某些实施方案中，该方法利用病毒生产细胞的种子培养物，其包括一种或多种BEV，包括杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)。种子BIIC已经用包括病毒表达构建体的表达BEV以及包括有效载荷构建体的有效载荷BEV转染/转导/感染。在某些实施方案中，收获种子培养物，分成等分试样并冷冻，并可以在以后的时间用于起始转染/转导/感染天然生产细胞群体。在某些实施方案中，种子BIIC库储存在-80℃或LN2蒸气中。
杆状病毒由几种对于杆状病毒的功能和复制必不可少的必需蛋白组成，例如复制蛋白、包膜蛋白和衣壳蛋白。因此，杆状病毒基因组包括几个编码必需蛋白的必需基因核苷酸序列。作为非限制性的实例，基因组可以包括必需基因区，该必需基因区包括编码杆状病毒构建体的必需蛋白的必需基因核苷酸序列。必需蛋白可以包括：GP64杆状病毒包膜蛋白、VP39杆状病毒衣壳蛋白或杆状病毒构建体的其他类似必需蛋白。
用于在昆虫细胞中产生AAV颗粒的杆状病毒表达载体(BEV)，包括但不限于草地贪夜蛾(Sf9)细胞，可提供高滴度的病毒载体产物。编码病毒表达构建体和有效载荷构建体的重组杆状病毒引发病毒载体复制细胞的生产性感染。从初次感染中释放出来的感染性杆状病毒颗粒会继而感染培养物中的其他细胞，并在多个感染周期内以指数增长方式感染整个细胞培养种群，这是最初感染复数的函数，参见Urabe,M.等人J Virol.2006Feb；80(4):1874-85，其内容通过引用整体并入本文。
在昆虫细胞系统中用杆状病毒生产AAV颗粒可能解决了已知的杆状病毒的遗传和物理不稳定性。
在某些实施方案中，本公开的生产系统通过利用无滴度的感染细胞保存和放大系统解决了杆状病毒在多次传代中的不稳定性。用编码AAV颗粒的结构和/或非结构组成的病毒表达构建体转染病毒生产细胞的小规模种子培养物。将杆状病毒感染的病毒生产细胞收集成等分试样，然后将其冷冻保存在液氮中。等分试样保留了感染大规模病毒生产细胞培养物的生存力和感染力，Wasilko DJ等人Protein Expr Purif.2009Jun；65(2):122-32，其内容通过引用整体并入本文。
遗传稳定的杆状病毒可用于产生一种或多种用于在无脊椎动物细胞中生产AAV颗粒的组分的来源。在某些实施方案中，缺陷型杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中以游离体维持。在这样的实施方案中，杆状病毒粒载体用复制控制元件工程化，包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节的复制元件。
在某些实施方案中，杆状病毒可以用(非)选择性标记工程化以重组成几丁质酶/组织蛋白酶基因座。Chia/v-cath基因座对于在组织培养中传播杆状病毒不是必需的，而V-cath(EC 3.4.22.50)是半胱氨酸内切蛋白酶，对含Arg-Arg二肽的底物最活跃。Arg-Arg二肽存在于浓核病毒和细小病毒衣壳结构蛋白中，但很少在依赖病毒VP1中发生。
在某些实施方案中，杆状病毒感染允许的稳定的病毒生产细胞用AAV复制和载体产生所必需的任何元件的至少一个稳定的整合拷贝进行工程化，所述元件包括但不限于整个AAV基因组、Rep和Cap基因、Rep基因、Cap基因、作为一个单独的转录盒的各个Rep蛋白、作为一个单独的转录盒的各个VP蛋白、AAP(装配激活蛋白)或至少一个带有天然或非天然启动子的杆状病毒辅助基因。
在某些实施方案中，杆状病毒表达载体(BEV)基于AcMNPV杆状病毒或BmNPV杆状病毒BmNPV。
在某些实施方案中，杆状病毒表达载体(BEV)是其中杆状病毒v-cath基因已被缺失(“v-cath缺失的BEV”)或突变的BEV。
其他
在某些实施方案中，表达宿主包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)的细菌物种。
在某些实施方案中，可以将包含稳定整合在细胞染色体内的AAV rep和cap基因的宿主细胞用于AAV颗粒的生产。在非限制性实例中，根据美国专利号7238526中所述的方法和构建体(其内容通过引用整体并入本文)，在宿主细胞的染色体中稳定整合了至少两个拷贝的AAV rep基因和AAV cap基因的宿主细胞可以用于生产AAV颗粒。
在某些实施方案中，AAV颗粒可以在用包含核酸序列的分子稳定转化的宿主细胞中产生，所述核酸序列允许在宿主细胞中调节稀有限制酶的表达，如US20030092161和EP1183380所述，其内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，生产AAV颗粒的生产方法和细胞系可以包括但不限于以下中教导的那些：PCT/US1996/010245、PCT/US1997/015716、PCT/US1997/015691、PCT/US1998/019479、PCT/US1998/019463、PCT/US2000/000415、PCT/US2000/040872、PCT/US2004/016614、PCT/US2007/010055、PCT/US1999/005870、PCT/US2000/004755、美国专利申请号US08/549489、US08/462014、US09/659203、US10/246447、US10/465302、美国专利号US6281010、US6270996、US6261551、US5756283(受让人NIH)、US6428988、US6274354、US6943019、US6482634,(受让人NIH:US7238526、US6475769)、US6365394(受让人NIH)、US7491508、US7291498、US7022519、US6485966、US6953690、US6258595、EP2018421、EP1064393、EP1163354、EP835321、EP931158、EP950111、EP1015619、EP1183380、EP2018421、EP1226264、EP1636370、EP1163354、EP1064393、US20030032613、US20020102714、US20030073232、US20030040101(受让人NIH)、US20060003451、US20020090717、US20030092161、US20070231303、US20060211115、US20090275107、US2007004042、US20030119191、US20020019050，其各自内容通过引用整体并入本文。
病毒生产系统
大规模生产
在某些实施方案中，可以修改AAV颗粒生产以增加生产规模。根据本公开的大规模病毒生产方法可以包括以下中教导的方法或过程步骤：美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公布号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。
增加AAV颗粒生产规模的方法通常包括增加病毒生产细胞的数量。在某些实施方案中，病毒生产细胞包括贴壁细胞。为了增加通过贴壁病毒生产细胞产生AAV颗粒的规模，需要更大的细胞培养表面。在某些实施方案中，大规模生产方法包括使用滚瓶来增加细胞培养表面。具有增加的表面积的其他细胞培养衬底是本领域已知的。具有增加的表面积的其他贴壁细胞培养产品的示例包括但不限于iCELLis(Pall Corp,Port Washington,NY)、
(Corning Corp.,Corning,NY)和NuncTM Cell FactoryTM(Thermo Scientific,Waltham,MA.)。在某些实施方案中，大规模贴壁细胞表面可以包括约1,000cm2至约100,000cm2。
在某些实施方案中，本公开的大规模病毒生产方法可包括使用悬浮细胞培养。悬浮细胞培养可以使细胞数量显著增加。通常，可以在约10-50cm2表面积上生长的贴壁细胞的数量可以在约1cm3体积的悬浮液中生长。
在某些实施方案中，大规模细胞培养物可包括约107至约109个细胞、约108至约1010个细胞、约109至约1012个细胞或至少1012个细胞。在某些实施方案中，大规模培养物可产生109至约1012、约1010至约1013、约1011至约1014、约1012至约1015或至少1015个AAV颗粒。
可以按照本领域已知的任何方法进行大规模培养形式的复制细胞的转染。对于大规模贴壁细胞培养，转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物(例如聚乙烯亚胺(PEI))或使用非化学方法(例如电穿孔)。对于细胞悬浮培养，转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物(例如聚乙烯亚胺(PEI))或使用非化学方法(例如电穿孔)。在某些实施方案中，可以按照Feng,L.等人,2008.BiotechnolAppl Biochem.50:121-32(其内容通过引用整体并入本文)中描述的标题“TransfectionProcedure”章节，进行大规模悬浮培养物的转染。根据这样的实施方案，可以形成PEI-DNA复合物用于引入待转染的质粒。在某些实施方案中，用PEI-DNA复合物转染的细胞可在转染前被“休克”。这包括将细胞培养温度降低到4℃持续约1小时。在某些实施方案中，可将细胞培养物休克约10分钟至约5小时。在某些实施方案中，可以在约0℃至约20℃的温度下休克细胞培养物。
在某些实施方案中，转染可包括一种或多种用于表达RNA效应分子的载体，以减少来自一种或多种有效载荷构建体的核酸的表达。这样的方法可以通过减少浪费在表达有效载荷构建体上的细胞资源来增强AAV颗粒的生产。在某些实施方案中，可以根据美国公开号US2014/0099666中教导的方法进行此类方法，其内容通过引用整体并入本文。
生物反应器
在某些实施方案中，细胞培养生物反应器可用于大规模生产AAV颗粒。在某些实施方案中，生物反应器包括搅拌釜反应器。这样的反应器通常包括带有搅拌器(例如叶轮)的通常为圆柱形的容器。在某些实施方案中，可以将这类生物反应器容器放置在水套内以控制容器温度和/或最小化来自环境温度变化的影响。
生物反应器容器体积的大小可以是约500ml至约2L、约1L至约5L、约2.5L至约20L、约10L至约50L、约25L至约100L、约75L至约500L、约250L至约2,000L、约1,000L至约10,000L、约5,000L至约50,000L或至少50,000L。容器底部可以是圆形或扁平的。在某些实施方案中，动物细胞培养物可以保持在具有圆形容器底部的生物反应器中。
在某些实施方案中，可以通过使用热循环仪来加热生物反应器容器。热循环器将热水输送到水套周围。在某些实施方案中，可将热水泵送通过生物反应器容器内存在的管道(例如盘管)。在某些实施方案中，热空气可在生物反应器周围循环，包括但不限于培养基正上方的空气空间。另外，可以维持pH和CO2水平以优化细胞活力。
在某些实施方案中，生物反应器可以包括中空纤维反应器。中空纤维生物反应器可以支持锚定依赖性和锚定独立性细胞的培养。其他生物反应器可包括但不限于填充床或固定床生物反应器。这类生物反应器可以包括带有玻璃珠的容器，用于贴壁细胞粘附。其他填充床反应器可包含陶瓷珠。
在某些实施方案中，病毒颗粒通过使用一次性生物反应器生产。在某些实施方案中，生物反应器可以包括GE WAVE生物反应器、GE Xcellerax生物反应器、SartoriusBiostat生物反应器、ThermoFisher Hyclone生物反应器或Pall Allegro生物反应器。
在某些实施方案中，可以根据美国专利号5,064764、6,194,191、6,566,118、8,137,948或美国专利申请号US2011/0229971中教导的方法或系统进行细胞生物反应器培养物中的AAV颗粒生产，其各自内容通过引用整体并入本文。
扩增病毒生产细胞(VPC)混合物
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒或病毒载体可以在病毒生产细胞(VPC)(例如昆虫细胞)中产生。生产细胞可以来自细胞库(CB)，并通常存储在冷冻细胞库中。
在某些实施方案中，以冷冻形式提供来自细胞库的病毒生产细胞。将冷冻细胞的小瓶解冻，通常直到冰晶消散。在某些实施方案中，将冷冻细胞在10-50℃、15-40℃、20-30℃、25-50℃、30-45℃、35-40℃或37-39℃的温度下解冻。在某些实施方案中，使用热水浴解冻冷冻的病毒生产细胞。
在某些实施方案中，解冻的CB细胞混合物的细胞密度将为1.0x104-1.0x109个细胞/mL。在某些实施方案中，解冻的CB细胞混合物的细胞密度为1.0x104-2.5x104个细胞/mL、2.5x104-5.0x104个细胞/mL、5.0x104-7.5x104个细胞/mL、7.5x104-1.0x105个细胞/mL、1.0x105-2.5x105个细胞/mL、2.5x105-5.0x105个细胞/mL、5.0x105-7.5x105个细胞/mL、7.5x105-1.0x106个细胞/mL、1.0x106-2.5x106个细胞/mL、2.5x106-5.0x106个细胞/mL、5.0x106-7.5x106个细胞/mL、7.5x106-1.0x107个细胞/mL、1.0x107-2.5x107个细胞/mL、2.5x107-5.0x107个细胞/mL、5.0x107-7.5x107个细胞/mL、7.5x107-1.0x108个细胞/mL、1.0x108-2.5x108个细胞/mL、2.5x108-5.0x108个细胞/mL、5.0x108-7.5x108个细胞/mL或7.5x108-1.0x109个细胞/mL。
在某些实施方案中，CB细胞混合物的体积被扩大。此过程通常称为种子培养、种子扩增或CB细胞扩增。细胞/种子扩增可以包括连续的步骤，即通过使用连续更大的工作体积的多个扩增步骤来接种和扩增细胞混合物。在某些实施方案中，细胞扩增可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或多于七个扩增步骤。在某些实施方案中，细胞扩增中的工作体积可以包括一个或多个以下工作体积或工作体积范围：5mL、10mL、20mL、5-20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、20-50mL、75mL、100mL、125mL、150mL、175mL、200mL、50-200mL、250mL、300mL、400mL、500mL、750mL、1000mL、250-1000mL、1250mL、1500mL、1750mL、2000mL、1000-2000mL、2250mL、2500mL、2750mL、3000mL、2000-3000mL、3500mL、4000mL、4500mL、5000mL、3000-5000mL、5.5L、6.0L、7.0L、8.0L、9.0L、10.0L和5.0-10.0L。
在某些实施方案中，来自第一扩增细胞混合物的一定体积的细胞可以用于接种第二单独的种子培养/种子扩增(而不是使用解冻的CB细胞混合物)。此过程通常称为滚动接种。在某些实施方案中，滚动接种物用在一系列的两个或更多个(例如两个、三个、四个或五个)单独的种子培养/种子扩增。
在某些实施方案中，大体积细胞扩增可以包括使用生物反应器，例如GE WAVE生物反应器、GE Xcellerax生物反应器、Sartorius Biostat生物反应器、ThermoFisherHyclone生物反应器或Pall Allegro生物反应器。
在某些实施方案中，工作体积内的细胞密度被扩增至目标输出细胞密度。在某些实施方案中，扩增步骤的输出细胞密度为1.0x105-5.0x105、5.0x105-1.0x106、1.0x106-5.0x106、5.0x106-1.0x107、1.0x107-5.0x107、5.0x107-1.0x108、5.0x105、6.0x105、7.0x105、8.0x105、9.0x105、1.0x106、2.0x106、3.0x106、4.0x106、5.0x106、6.0x106、7.0x106、8.0x106、9.0x106、1.0x107、2.0x107、3.0x107、4.0x107、5.0x107、6.0x107、7.0x107、8.0x107或9.0x107个细胞/mL。
在某些实施方案中，工作体积的输出细胞密度为较大的连续工作体积提供了接种细胞密度。在某些实施方案中，扩增步骤的接种细胞密度为1.0x105-5.0x105、5.0x105-1.0x106、1.0x106-5.0x106、5.0x106-1.0x107、1.0x107-5.0x107、5.0x107-1.0x108、5.0x105、6.0x105、7.0x105、8.0x105、9.0x105、1.0x106、2.0x106、3.0x106、4.0x106、5.0x106、6.0x106、7.0x106、8.0x106、9.0x106、1.0x107、2.0x107、3.0x107、4.0x107、5.0x107、6.0x107、7.0x107、8.0x107或9.0x107个细胞/mL。
在某些实施方案中，细胞扩增可以持续1-50天。每个细胞扩增步骤或总细胞扩增可以持续1-10天、1-5天、1-3天、2-3天、2-4天、2-5天、2-6天、3-4天、3-5天、3-6天、3-8天、4-5天、4-6天、4-8天、5-6天或5-8天。在某些实施方案中，每个细胞扩增步骤或总细胞扩增可以持续1-100代、1-1000代、100-1000代、100代或更多或1000代或更多。
在某些实施方案中，感染或转染的生产细胞可以以与CB细胞混合物相同的方式扩增，如本公开中所述。
病毒生产细胞的感染
在某些实施方案中，通过用包含AAV表达构建体的病毒载体和/或包含AAV有效载荷构建体的病毒载体感染VPC，在病毒生产细胞(VPC)例如昆虫细胞中生产本公开的AAV颗粒。在某些实施方案中，VPC被包含AAV表达构建体的表达BEV和包含AAV有效载荷构建体的有效载荷BEV感染。
在某些实施方案中，通过用包含AAV表达构建体和AAV有效载荷构建体两者的病毒载体感染VPC来产生AAV颗粒。在某些实施方案中，VPC被单个BEV感染，该单个BEV包括AAV表达构建体和AAV有效载荷构建体。
在某些实施方案中，在感染过程中使用感染BIIC感染VPC(例如昆虫细胞)，所述感染过程包括以下步骤：(i)将VPC收集物接种到生产生物反应器中；(ii)接种的VPC可以任选地扩增到目标工作体积和细胞密度；(iii)将包含表达BEV的感染BIIC和包含有效载荷BEV的感染BIIC注入生产生物反应器，产生感染的病毒生产细胞；(iv)孵育感染的病毒生产细胞以在病毒生产细胞内产生AAV颗粒。
在某些实施方案中，感染时的VPC密度是1.0x105-2.5x105、2.5x105-5.0x105、5.0x105-7.5x105、7.5x105-1.0x106、1.0x106-5.0x106、1.0x106-2.0x106、1.5x106-2.5x106、2.0x106-3.0x106、2.5x106-3.5x106、3.0x106-4.0x106、3.5x106-4.5x106、4.0x106-5.0x106、4.5x106-5.5x106、5.0x106-1.0x107、5.0x106-6.0x106、5.5x106-6.5x106、6.0x106-7.0x106、6.5x106-7.5x106、7.0x106-8.0x106、7.5x106-8.5x106、8.0x106-9.0x106、8.5x106-9.5x106、9.0x106-1.0x107、9.5x106-1.5x107、1.0x107-5.0x107或5.0x107-1.0x108个细胞/mL。在某些实施方案中，感染时的VPC密度是5.0x105、6.0x105、7.0x105、8.0x105、9.0x105、1.0x106、1.5x106、2.0x106、2.5x106、3.0x106、3.5x106、4.0x106、4.5x106、5.0x106、5.5x106、6.0x106、6.5x106、7.0x106、7.5x106、8.0x106、8.5x106、9.0x106、9.5x106、1.0x107、1.5x107、2.0x107、2.5x107、3.0x107、4.0x107、5.0x107、6.0x107、7.0x107、8.0x107或9.0x107个细胞/mL。
在某些实施方案中，感染BIIC与VPC以VPC与BIIC的目标比例组合。在某些实施方案中，VPC与BIIC的感染比率(体积比体积)为1.0x103-5.0x103、5.0x103-1.0x104、1.0x104-5.0x104、5.0x104-1.0x105、1.0x105-5.0x105、5.0x105-1.0x106、1.0x103、2.0x103、3.0x103、4.0x103、5.0x103、6.0x103、7.0x103、8.0x103、9.0x103、1.0x104、2.0x104、3.0x104、4.0x104、5.0x104、6.0x104、7.0x104、8.0x104或9.0x104、1.0x105、2.0x105、3.0x105、4.0x105、5.0x105、6.0x105、7.0x105、8.0x105或9.0x105 BIIC/VPC。在某些实施方案中，VPC与BIIC的感染比率(细胞比细胞)为1.0x103-5.0x103、5.0x103-1.0x104、1.0x104-5.0x104、5.0x104-1.0x105、1.0x105-5.0x105、5.0x105-1.0x106、1.0x103、2.0x103、3.0x103、4.0x103、5.0x103、6.0x103、7.0x103、8.0x103、9.0x103、1.0x104、2.0x104、3.0x104、4.0x104、5.0x104、6.0x104、7.0x104、8.0x104、或9.0x104、1.0x105、2.0x105、3.0x105、4.0x105、5.0x105、6.0x105、7.0x105、8.0x105或9.0x105 BIIC/VPC。
在某些实施方案中，包含表达BEV的感染BIIC和包含有效载荷BEV的感染BIIC以目标BIIC与BIIC的比率与VPC组合。在某些实施方案中，表达(Rep/Cap)BIIC与有效载荷BIIC的比率为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:9、1:10、3.5-4.5:1、3-4:1、2.5-3.5:1、2-3:1、1.5-2.5:1、1-2:1、1-1.5:1、1:1-1.5、1:1-2、1:1.5-2.5、1:2-3、1:2.5-3.5、1:3-4、1:3.5-4.5、1:4-5、1:4.5-5.5、1:5-6、1:5.5-6.5、1:6-7或1:6.5-7.5。
细胞裂解
本公开的细胞(包括但不限于病毒生产细胞)可以根据本领域已知的任何方法进行细胞裂解。可以进行细胞裂解以获得存在于本公开的任何细胞内的一种或多种试剂(例如病毒颗粒)。在某些实施方案中，根据本发明，将大量收获的AAV颗粒和病毒生产细胞进行细胞裂解。
在某些实施方案中，细胞裂解可以根据以下中呈现的任何方法或系统来进行：美国专利号7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935、7,968,333、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公布号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。
细胞裂解方法和系统可以是化学的或机械的。化学细胞裂解通常包括在化学裂解条件下使一个或多个细胞与一种或多种裂解剂接触。机械裂解通常包括使一个或多个细胞经受一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。还可以通过使细胞在达到～0％的活力后降解来完成裂解。
在某些实施方案中，化学裂解可用于裂解细胞。如本文所用，术语“裂解剂”是指可以帮助破坏细胞的任何试剂。在某些实施方案中，将裂解剂引入溶液中，称为裂解溶液或裂解缓冲液。如本文所用，术语“裂解溶液”是指包含一种或多种裂解剂的溶液(通常为水溶液)。除裂解剂外，裂解溶液可包括一种或多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、冷冻保护剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。裂解缓冲液是包含一种或多种缓冲剂的裂解溶液。裂解溶液的其他组分可包括一种或多种增溶剂。如本文所用，术语“增溶剂”是指增强溶液的一种或多种组分的溶解度和/或施加溶液的一种或多种实体的溶解度的化合物。在某些实施方案中，增溶剂增强蛋白质溶解性。在某些实施方案中，基于增溶剂增强蛋白质溶解性同时保持蛋白构象和/或活性的能力来选择增溶剂。
示例性裂解剂可以包括以下描述的任何裂解剂：美国专利号8,685,734、7,901,921、7,732,129、7,223,585、7,125,706、8,236,495、8,110,351、7,419,956、7,300,797、6,699,706和6,143,567，其各自的内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，裂解剂可以选自裂解盐、两性剂、阳离子剂、离子去污剂和非离子去污剂。裂解盐可包括但不限于氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)。其他裂解盐可包括以下中描述的任何裂解盐：美国专利号8,614,101、7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935和7,968,333，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，细胞裂解物溶液包含稳定添加剂。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括海藻糖、甘氨酸甜菜碱、甘露醇、柠檬酸钾、CuCl2、脯氨酸、木糖醇、NDSB 201、CTAB和K2PO4。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括氨基酸如精氨酸，或酸化的氨基酸混合物如精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.1M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.2M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.25M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.3M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.4M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.5M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.6M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.7M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.8M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括0.9M精氨酸或精氨酸HCl。在某些实施方案中，稳定添加剂可包括1.0M精氨酸或精氨酸HCl。
盐的浓度可以增加或减少以获得用于细胞膜破裂的有效浓度。如本文所指，两性剂是能够作为酸或碱反应的化合物。两性剂可包括但不限于溶血磷脂酰胆碱、3-((3-胆酰氨丙基)二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、
等。阳离子剂可包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵(C(16)TAB)和苯扎氯铵。包含去污剂的裂解剂可以包括离子去污剂或非离子去污剂。
去污剂可以起到分解或溶解细胞结构的作用，包括但不限于细胞膜、细胞壁、脂质、碳水化合物、脂蛋白和糖蛋白。示例性的离子型去污剂包括美国专利号7,625,570和6,593,123或美国公开号US2014/0087361中教导的任何离子去污剂，其各自内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，裂解溶液包含一种或多种离子型去污剂。用于裂解溶液的离子型去污剂的实例包括但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)、胆酸盐和脱氧胆酸盐。在某些实施方案中，裂解溶液中可包含离子型去污剂作为增溶剂。在某些实施方案中，裂解溶液包含一种或多种非离子型去污剂。用于裂解液的非离子型去污剂可包括但不限于辛基葡萄糖苷、洋地黄皂苷、芦布若尔、C12E8、
Triton X-100、TritonXl 14、Brij-35、Brij-58和Noniodet P-40。非离子型去污剂通常是较弱的裂解剂，但可以包括其作为增溶剂，以增溶细胞和/或病毒蛋白。在某些实施方案中，裂解溶液包含一种或多种两性离子去污剂。用于裂解溶液的两性离子去污剂可包括但不限于：月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)；N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(Empigen BB)；3-(N,N-二甲基肉豆蔻铵基)丙磺酸盐(Zwittergent 3-10)；正十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(Zwittergent 3-12)；正十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(Zwittergent 3-14)；3-(N,N-二甲基棕榈酰铵基)丙烷磺酸盐(Zwittergent3-16)；3-((3-胆酰氨丙基)二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)；或3-([3-胆酰氨丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。
在某些实施方案中，裂解溶液包括Triton X-100，例如0.5％w/v的Triton X-100。在某些实施方案中，裂解溶液包含月桂基二甲基胺N-氧化物(LDAO)，例如0.184％w/v(4×CMC)的LDAO。在某些实施方案中，裂解溶液包含种子油表面活性剂，例如Ecosurf SA-9。在某些实施方案中，裂解溶液包括N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(Empigen BB)。在某些实施方案中，裂解溶液包括两性离子去污剂，例如Zwittergent 3-12(正十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐)、Zwittergent 3-14(正十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐)或Zwittergent 3-16(3-(N,N-二甲基棕榈酰铵基)丙烷磺酸盐)。
其他裂解剂可包括酶和尿素。在某些实施方案中，可将一种或多种裂解剂组合在裂解溶液中，以增强细胞裂解和蛋白溶解度中的一种或多种。在某些实施方案中，裂解溶液中可包含酶抑制剂，以防止可能被细胞膜破坏触发的蛋白水解。
在某些实施方案中，裂解溶液包含0.1-1.0％w/v、0.2-0.8％w/v、0.3-0.7％w/v、0.4-0.6％w/v或约0.5％w/v的细胞裂解剂(例如去污剂)。在某些实施方案中，裂解溶液包括0.3-0.35％w/v、0.35-0.4％w/v、0.4-0.45％w/v、0.45-0.5％w/v、0.5-0.55％w/v、0.55-0.6％w/v、0.6-0.65％w/v或0.65-0.7％w/v的细胞裂解剂(例如去污剂)。
在某些实施方案中，可以用一种或多种核酸酶处理从贴壁细胞培养物产生的细胞裂解物，所述核酸酶例如Benzonase核酸酶(I级，纯度99％)或c-LEcta Denarase核酸酶(以前为Sartorius Denarase)。在某些实施方案中，添加核酸酶以降低由释放的DNA引起的裂解物的粘度。
在某些实施方案中，化学裂解使用单一化学裂解混合物。在某些实施方案中，化学裂解使用串联添加的几种裂解剂以提供最终的化学裂解混合物。
在某些实施方案中，化学裂解混合物包括酸化的氨基酸混合物(例如精氨酸HCl)、非离子型去污剂(例如Triton X-100)和核酸酶(例如Benzonase核酸酶)。在某些实施方案中，化学裂解混合物可包含酸或碱以提供目标裂解pH。
在某些实施方案中，化学裂解在化学裂解条件下进行。如本文所用，术语“化学裂解条件”是指环境条件(例如温度、压力、pH等)的任何组合，其中靶细胞可以被裂解剂裂解。
在某些实施方案中，裂解pH为3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、4.5-5.0、5.0-5.5、5.5-6.0、6.0-6.5、6.5-7.0、7.0-7.5或7.5-8.0.
在某些实施方案中，裂解温度为15-35℃、20-30℃、25-39℃、20-21℃、20-22℃、21-22℃、21-23℃、22-23℃、22-24℃、23-24℃、23-25℃、24-25℃、24-26℃、25-26℃、25-27℃、26-27℃、26-28℃、27-28℃、27-29℃、28-29℃、28-30℃、29-30℃、29-31℃、30-31℃、30-32℃、31-32℃或31-33℃。
某些实施方案中，进行机械细胞裂解。机械细胞裂解方法可包括使用一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。如本文所用，术语“裂解条件”是指促进细胞破坏的状态或情况。裂解条件可包括某些温度、压力、渗透纯度、盐度等。在某些实施方案中，裂解条件包括升高或降低的温度。根据某些实施方案，裂解条件包括温度变化以促进细胞破坏。根据这样的实施方案进行的细胞裂解可以包括冻融裂解。如本文所用，术语“冻融裂解”是指细胞裂解，其中细胞溶液经历一个或多个冻融循环。根据冻融裂解方法，将溶液中的细胞冷冻以诱导由冰晶的形成和膨胀引起的细胞膜的机械破坏。根据冻融裂解方法使用的细胞溶液可以进一步包含一种或多种裂解剂、增溶剂、缓冲剂、冷冻保护剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。一旦将要冷冻的细胞溶液融化，这些成分就可以提高所需细胞产物的回收率。在某些实施方案中，一种或多种冷冻保护剂包括在经历冻融裂解的细胞溶液中。如本文所用，术语“冷冻保护剂”是指用于保护一种或多种物质免于由于冷冻而损坏的试剂。冷冻保护剂可包括美国公开号US2013/0323302或美国专利号6,503,888、6,180,613、7,888,096、7,091,030中教导的任何一种，其各自内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，冷冻保护剂可包括但不限于二甲基亚砜、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲酰胺、甘油、乙二醇、1,3-丙二醇和正二甲基甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、琼脂糖、葡聚糖、肌醇、葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖、山梨醇、甲基葡萄糖、蔗糖和尿素。在某些实施方案中，可根据美国专利号7,704,721中描述的任何方法进行冻融裂解，其内容通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“裂解力”是指用于破坏细胞的物理活动。裂解力可包括但不限于机械力、声力、重力、光学力、电力等。通过机械力进行的细胞裂解在本文中称为“机械裂解”。可以根据机械裂解使用的机械力可能包括高剪切流体力。根据这类机械裂解方法，可以使用微流化器。微流化器通常包括入口池，可在其中施加细胞溶液。然后可以通过泵(例如高压泵)以高速和/或高压将细胞溶液泵入相互作用室以产生剪切流体力。然后可以将得到的裂解物收集在一个或多个输出容器中。可以调节泵的速度和/或压力以调节细胞裂解并增强产物(例如病毒颗粒)的回收。其他机械裂解方法可能包括通过刮擦对细胞进行物理破坏。
可以基于要裂解的细胞的细胞培养形式来选择细胞裂解方法。例如，对于贴壁细胞培养，可以使用一些化学和机械裂解方法。此类机械裂解方法可包括冻融裂解或刮擦。在另一个实例中，贴壁细胞培养物的化学裂解可以通过与包含表面活性剂的裂解溶液如Triton-X-100一起孵育来进行。
某些实施方案中，无需裂解即可收获AAV颗粒的方法可用于有效且可扩张的AAV颗粒生产。在非限制性实例中，可以通过以下过程来生产AAV颗粒：培养缺乏肝素结合位点的AAV颗粒，从而使AAV颗粒进入细胞培养物中的上清液中，从培养物中收集上清液；从上清液中分离AAV颗粒，如美国专利申请20090275107中所述，其内容通过引用整体并入本文。
澄清和纯化：通用
可以对包含病毒颗粒的细胞裂解物进行澄清和纯化。澄清一般是指从细胞裂解物中纯化病毒颗粒时所采取的初始步骤，其作用是通过从大量裂解收获物中去除较大的不溶性碎片来制备裂解物，以进行进一步纯化。病毒生产可以在病毒生产过程中的任何时候包括澄清步骤。澄清步骤可包括但不限于离心和过滤。在澄清过程中，可以低速离心以仅去除较大的碎片。类似地，可以使用具有较大孔径的过滤器进行过滤，从而仅除去较大的碎片。
纯化通常是指在制备最终的合并药物物质中，通过从澄清的裂解收获物中除去较小的碎片从细胞裂解物中纯化和浓缩病毒颗粒中采取的最终步骤。病毒生产可以包括在病毒生产过程中任何时候的纯化步骤。纯化步骤可包括但不限于过滤和色谱法。可以使用孔径较小的过滤器进行过滤，以从产品中清除较小的碎片，或者使用孔径较大的过滤器从产品中保留较大的碎片进行过滤。过滤可用于改变病毒生产汇聚物或流的浓度和/或含量。可以进行色谱法以从杂质汇聚物中选择性地分离出目标颗粒。
高浓度AAV颗粒易于聚集或附聚的趋势使高浓度AAV制剂的大规模生产变得复杂。小规模的澄清和浓缩系统(例如透析盒或旋转离心)通常不足以扩展至大规模生产。本公开提供用于处理大体积的高浓度AAV生产制剂的澄清、纯化和浓缩系统的实施方案。在某些实施方案中，大体积澄清系统包括以下处理步骤中的一个或多个：深度过滤、微滤(例如0.2μm过滤)、亲和色谱、离子交换色谱(例如阴离子交换色谱(AEX)或阳离子交换色谱(CEX))、切向流过滤系统(TFF)、纳滤(例如病毒保留过滤(VRF))、最终过滤(FF)和填充过滤。
病毒澄清和纯化的目标包括细胞裂解液的高通量处理和优化最终病毒回收率。包括本公开的澄清和纯化步骤的优点包括用于处理较大体积的裂解物的可扩展性。在某些实施方案中，澄清和纯化可以根据以下中呈现的任何方法或系统来进行：美国专利号8,524,446、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498、7,491,508、美国公开号US2013/0045186、US2011/0263027、US2011/0151434、US2003/0138772，以及国际公布号WO2002012455、WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，可以使用美国专利号US 6146874、US 6660514、US 8283151或US 8524446中描述的方法或系统分离或纯化包含至少一种AAV颗粒的组合物，其内容通过引用整体并入本文。
澄清和纯化：离心
根据某些实施方案，可以通过一个或多个离心步骤来澄清细胞裂解物。离心可用于使溶解物中的不溶性颗粒沉淀。在澄清过程中，离心强度(可以用重力单位(g)表示，代表标准重力的倍数)可能低于随后的纯化步骤。在某些实施方案中，可以在约200g至约800g、约500g至约1500g、约1000g至约5000g、约1200g至约10000g或约8000g至约15000g的重力下对细胞裂解物进行离心。在某些实施方案中，细胞裂解物离心以8000g进行15分钟。在某些实施方案中，可以进行密度梯度离心以便通过沉降速率在细胞裂解物中分配颗粒。根据本公开的方法或系统使用的梯度可以包括但不限于氯化铯梯度和碘克沙醇阶梯梯度。在某些实施方案中，离心使用倾析器离心系统。在某些实施方案中，离心使用盘叠式离心系统。在某些实施方案中，离心包括超速离心，如二周期CsCl梯度超速离心或碘克沙醇不连续密度梯度超速离心。
澄清和纯化：过滤
在某些实施方案中，在澄清、纯化和/或灭菌过程中可以使用一个或多个微滤、纳滤和/或超滤步骤。一个或多个微滤、纳滤或超滤步骤可包括使用过滤系统，例如EMDMillipore Express SHC XL10 0.5/0.2μm过滤器、EMD Millipore Express SHCXL60000.5/0.2μm过滤器、EMD Millipore Express SHCXL150过滤器、EMD Millipore MillipakGamma Gold 0.22μm过滤器(双列灭菌级过滤器)、Pall Supor EKV,0.2μm灭菌级过滤器、Asahi Planova 35N，Asahi Planova 20N，Asahi Planova 75N，Asahi Planova 35N、AsahiPlanova20N、Asahi Planova 75N、Asahi Planova BioEx、Millipore Viresolve NFR或Sartorius Sartopore 2XLG,0.8/0.2μm。
在某些实施方案中，在澄清、纯化和/或灭菌过程中可以使用一个或多个微滤步骤。微滤利用孔径通常在0.1μm和10μm之间的微滤膜。微滤通常用于一般的澄清、灭菌和去除微粒。在某些实施方案中，微滤用于去除聚集的病毒颗粒块。在某些实施方案中，本公开的生产方法或系统包括至少一个微滤步骤。一个或多个微滤步骤可包括带有深度过滤系统的深度过滤步骤，所述深度过滤系统例如EMD Millipore Millistak+POD过滤器(D0HC介质系列)、Millipore MC0SP23CL3过滤器(C0SP介质系列)或Sartorius Sartopore过滤器系列。本公开的微滤系统可以用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的AAV药物、加工和储存制剂)进行预冲洗、包装、平衡、冲洗、加工、洗脱、洗涤或清洗。
在某些实施方案中，在澄清和纯化过程中可以使用一个或多个超滤步骤。超滤步骤可用于使本公开的加工和/或配制溶液浓缩、配制、脱盐或脱水。超滤利用超滤膜，孔径通常在0.001至0.1μm之间。超滤膜还可以通过其分子量截留值(MWCO)来定义，并且范围可以从1kD到500kD。超滤通常用于浓缩和配制溶解的生物分子，例如蛋白、肽、质粒、病毒颗粒、核酸和碳水化合物。本公开的超滤系统可以用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的AAV药物、加工和储存制剂)进行预冲洗、包装、平衡、冲洗、加工、洗脱、洗涤或清洗。
在某些实施方案中，在澄清和纯化过程中可以使用一个或多个纳滤步骤。纳滤利用纳滤膜，其孔径通常小于100nm。纳滤通常用于去除不需要的内源性病毒杂质(例如杆状病毒)。在某些实施方案中，纳滤可以包括病毒去除过滤(VRF)。VRF过滤器的过滤尺寸通常在15nm至100nm之间。VRF过滤器的示例包括(但不限于)：Planova 15N、Planova 20N和Planova 35N(Asahi-Kasei Corp,日本东京)；以及Viresolve NFP和Viresolve NFR(Millipore Corp,Billerica,MA,USA)。本公开的纳滤系统可以用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的AAV药物、加工和储存制剂)进行预冲洗、包装、平衡、冲洗、加工、洗脱、洗涤或清洗。在某些实施方案中，纳滤用于去除聚集的病毒颗粒块。
在某些实施方案中，在澄清和纯化过程中可以使用一个或多个切向流过滤(TFF)(也称为交叉流过滤)步骤。切向流过滤是膜过滤的一种形式，其中进料流(其包括要澄清和浓缩的目标试剂/颗粒)从进料罐流入过滤模块或滤筒。在TFF过滤模块内，进料流平行于膜表面通过，以使一部分料流通过膜(渗透物/滤液)，而料流的其余部分(截留物)则通过过滤系统再循环回去，并回到进料罐。
在某些实施方案中，TFF过滤模块可以是平板模块(堆叠的平面盒)、螺旋缠绕模块(螺旋缠绕膜层)或中空纤维模块(膜管束)。在本公开中使用的TFF系统的示例包括但不限于：Spectrum mPES中空纤维TFF系统(0.5mm fiber ID,100kDA MWCO)或带有Pellicon-3盒的Millipore Ultracel PLCTK系统(0.57m2,30kDA MWCO)。
当进料流通过TFF过滤系统循环时，可以将新的缓冲物质添加到TFF进料罐中。在某些实施方案中，当流动流循环通过TFF过滤系统时，缓冲物质可以被完全补充。在该实施方案中，将缓冲物质以与渗透物中损失的缓冲物质相等的量添加至料流中，从而产生恒定的浓度。在某些实施方案中，当流动流循环通过过滤系统时，可以减少缓冲物质。在该实施方案中，相对于渗透物中损失的缓冲物质，将减少量的缓冲物质添加至料流中，导致浓度增加。在某些实施方案中，当流动流循环流过过滤系统时，可以替代缓冲物质。在该实施方案中，添加到料流中的缓冲液不同于渗透物中损失的缓冲物质，导致最终替代料流中的缓冲物质。本公开的TFF系统可以用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的AAV药物、加工和储存制剂)进行预冲洗、包装、平衡、冲洗、加工、洗脱、洗涤或清洗。
在某些实施方案中，可以在过滤之前将赋形剂或稀释剂掺入TFF负载汇聚物中。在某些实施方案中，在过滤之前，将高盐混合物(例如氯化钠或氯化钾)掺入TFF负载汇聚物。在某些实施方案中，在过滤之前，将高糖混合物(例如50％w/v蔗糖)掺入TFF负载汇聚物。
TFF处理的有效性可能取决于几个因素，包括(但不限于)：来自流设计的剪切应力、交叉流速率、滤液流量控制、跨膜压力(TMP)、膜条件化、膜组成(例如中空纤维结构)和设计(例如表面积)、系统流设计、储存设计和混合策略。在某些实施方案中，可以将滤膜暴露于预TFF膜条件化。
在某些实施方案中，TFF处理可包括一个或多个微滤阶段。在某些实施方案中，TFF处理可包括一个或多个超滤阶段。在某些实施方案中，TFF处理可包括一个或多个纳滤阶段。
在某些实施方案中，TFF处理可包括一个或多个浓缩阶段，例如超滤(UF)或微滤(MF)浓缩阶段。在浓缩阶段，当料流循环通过过滤系统时，减少的缓冲物质量被替代(相对于随渗透液流失的缓冲物质的量而言)。无法完全替代渗透液中损失的所有缓冲物质将导致过滤流中病毒颗粒的浓度增加。在某些实施方案中，当物流循环通过过滤系统时，增加量缓冲物质被替代。相对于渗透物中损失的缓冲物质的量而言，过量缓冲物质的掺入导致过滤流内病毒颗粒的浓度降低。
在某些实施方案中，TFF处理可以包括一个或多个渗滤(DF)阶段。渗滤阶段包括在第二缓冲物质(例如低盐或零盐物质)内替换第一缓冲物质(例如高盐物质)。在该实施方案中，将第二缓冲物质添加到料流中，该第二缓冲物质不同于渗透物中损失的第一缓冲物质，导致最终替换料流中的缓冲剂。
在某些实施方案中，TFF处理可以包括串联的多个阶段。在某些实施方案中，TFF处理可以包括超滤(UF)浓缩阶段，随后是渗滤阶段(DF)。在某些实施方案中，TFF处理可包括渗滤阶段，随后是超滤浓缩阶段。在某些实施方案中，TFF处理可包括第一渗滤阶段，随后是超滤浓缩阶段，然后是第二渗滤阶段。在某些实施方案中，TFF处理可包括第一渗滤阶段，其将高盐-低糖缓冲物质掺入流动流中，随后进行超滤/浓缩阶段(其导致流动流中高浓度的病毒物质)，然后是第二渗滤阶段(其将低盐高糖或零盐高糖的缓冲物质掺入到流动流中)。在某些实施方案中，该盐可以是氯化钠、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾或其组合。在某些实施方案中，糖可以是蔗糖，例如5％w/v蔗糖混合物或7％w/v蔗糖混合物。
在某些实施方案中，TFF处理可以包括同时发生的多个阶段。作为非限制性实例，TFF澄清过程可包括与浓缩阶段同时发生的超滤阶段。
细胞裂解物通过过滤澄清和纯化的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据多种可用方法进行，包括但不限于被动过滤和流动过滤。所使用的过滤器可包括多种材料和孔径。例如，细胞裂解物过滤器可包括约1μM至约5μM、约0.5μM至约2μM、约0.1μM至约1μM、约0.05μM至约0.05μM和约0.001μM至约0.1μM的孔径。细胞裂解物过滤器的示例性孔径可包括但不限于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001和0.001μM。在某些实施方案中，澄清可包括通过具有2.0μM孔径的过滤器过滤以去除大的碎片，然后通过具有0.45μM孔径的过滤器以去除完整的细胞。
过滤材料可以由多种材料组成。这样的材料可以包括但不限于聚合物材料和金属材料(例如，烧结金属和多孔铝)。示例性材料可以包括但不限于尼龙、纤维素材料(例如乙酸纤维素)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜、聚酰胺、聚砜、聚丙烯和聚对苯二甲酸亚乙基酯。在某些实施方案中，用于澄清细胞裂解物的过滤器可以包括但不限于ULTIPLEAT PROFILETM过滤器(Pall Corporation,Port Washington,NY)、SUPORTM膜过滤器(Pall Corporation,Port Washington,NY)。
在某些实施方案中，可以进行流动过滤以提高过滤速度和/或有效性。在某些实施方案中，流动过滤可以包括真空过滤。根据这样的方法，在过滤器的与要过滤的细胞裂解物相反的一侧上形成真空。在某些实施方案中，细胞裂解物可通过离心力通过过滤器。在某些实施方案中，使用泵迫使细胞裂解物通过澄清过滤器。通过一个或多个过滤器的细胞裂解物的流速可以通过调节通道大小和/或流体压力之一来调节。
澄清和纯化：色谱
在某些实施方案中，可以使用一种或多种不同的色谱方法通过一个或多个色谱步骤从细胞裂解物中澄清和纯化制剂中的AAV颗粒。色谱法是指本领域已知的用于从混合物中选择性分离出一种或多种成分的任何方法。这样的方法可以包括但不限于离子交换色谱法(例如阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法)、亲和色谱法(例如免疫亲和色谱法、金属亲和色谱法、假亲和色谱法例如蓝琼脂糖树脂)、疏水相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法和多元谱法(multimodal chromatography)(利用固定相和分析物之间多于一种相互作用形式的色谱方法)。在某些实施方案中，病毒色谱的方法或系统可以包括以下教导的任何方法或系统：美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公布号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597，其各自内容通过引用整体并入本文。
本公开的色谱系统可以用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的AAV药物、加工和储存制剂)进行预冲洗、包装、平衡、冲洗、加工、洗脱、洗涤或清洗。
在某些实施方案中，一个或多个离子交换(IEX)色谱步骤可用于分离病毒颗粒。离子交换步骤可包括阴离子交换(AEX)色谱、阳离子交换(CEX)色谱或其组合。在某些实施方案中，离子交换色谱法以结合/洗脱模式使用。结合/洗脱IEX可通过基于病毒颗粒的衣壳蛋白(或其他带电组分)与固定相上存在的带电位点之间的电荷-电荷相互作用，将病毒颗粒与固定相结合来使用。该过程可以包括使用柱子，使病毒制剂(例如，澄清裂解物)通过柱子。在将病毒制剂应用于带电的固定相(例如色谱柱)后，可以通过应用洗脱溶液破坏电荷与电荷的相互作用，从固定相洗脱结合的病毒颗粒。洗脱液可通过调节盐浓度和/或pH值以增强结合的病毒颗粒的回收来优化。根据分离的病毒衣壳的电荷，可以选择阳离子或阴离子交换色谱法。在某些实施方案中，离子交换色谱法以流通模式使用。可以通过将非病毒杂质或不需要的病毒颗粒结合到固定相(基于电荷-电荷相互作用)，并使病毒制剂中的目标病毒颗粒“流过”IEX系统进入收集池来使用流通IEX。
离子交换色谱法的方法或系统可包括但不限于美国专利号7,419,817、6,143,548、7,094,604、6,593,123、7,015,026和8,137,948中教导的任何方法或系统，其各自内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，IEX过程使用AEX色谱系统，例如SartoriusSartobind Q膜、Millipore Fractogel TMAE HiCap(m)流通膜，GE Q Sepharose HP膜、Poros XQ或Poros HQ。在某些实施方案中，IEX过程使用CEX系统，例如Poros XS膜。在某些实施方案中，AEX系统包括固定相，该固定相包括三甲基铵乙基(TMAE)官能团。
在某些实施方案中，一个或多个亲和色谱步骤(例如免疫亲和色谱)可用于分离病毒颗粒。免疫亲和色谱是利用一种或多种免疫化合物(例如抗体或抗体相关结构)保留病毒颗粒的色谱形式。免疫化合物可以特异性结合病毒颗粒表面上的一种或多种结构，包括但不限于一种或多种病毒外壳蛋白。在某些实施方案中，免疫化合物可以对特定病毒变体具有特异性。在某些实施方案中，免疫化合物可以结合多种病毒变体。在某些实施方案中，免疫化合物可包括重组单链抗体。这样的重组单链抗体可以包括Smith,R.H.等人,2009.Mol.Ther.17(11):1888-96中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。此类免疫化合物能够结合几种AAV衣壳变体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV6和AAV8或本文教导的任何AAV衣壳变体。在某些实施方案中，AFC过程使用GE AVB Sepharose HP柱树脂、PorosCaptureSelect AAV8树脂(ThermoFisher)、Poros CaptureSelect AAV9树脂(ThermoFisher)和Poros CaptureSelect AAVX树脂(ThermoFisher)。
在某些实施方案中，一个或多个尺寸排阻色谱(SEC)步骤可用于分离病毒颗粒。SEC可包括使用凝胶根据尺寸分离颗粒。在病毒颗粒纯化中，SEC过滤有时称为“精制”。在某些实施方案中，可以进行SEC以产生接近均质的最终产物。在某些实施方案中，此类最终产品可用于临床前研究和/或临床研究(Kotin,R.M.2011.Human Molecular Genetics.20(1):R2-R6，其内容通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，可以根据美国专利号6,143,548、7,015,026、8,476,418、6,410,300、8,476,418、7,419,817、7,094,604、6,593,123和8,137,948中教导的任何方法进行SEC，将其各自内容通过引用整体并入本文。
III.组合物和制剂
通用
基因治疗药物产品(例如rAAV颗粒)归因于其在液态中有限的稳定性和在低浓度下大规模聚集的高倾向性而难以掺入组合物和制剂中。基因治疗药物产品通常直接递送至治疗区(包括CNS组织)；这就要求赋形剂和配方参数必须与组织功能、微环境和体积限制相容。
根据本公开，AAV颗粒可以被制备为药物组合物或包含在药物组合物中。将理解的是，这样的组合物必须包含一种或多种活性成分，并且最通常地一种或多种药学上可接受的赋形剂。
根据本公开的药物组合物中的活性成分(例如AAV颗粒)、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量可以变化，这取决于正在治疗的受试者的身份、大小和/或状况，并且还取决于要施用所述组合物的途径。例如，组合物可以包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。作为实例，组合物可以包含0.1％至100％、例如0.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。
在某些实施方案中，本文所述的AAV颗粒药物组合物可包含至少一种本公开的有效载荷。作为非限制性实例，药物组合物可包含具有1、2、3、4或5种有效载荷的AAV颗粒。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人施用的药物组合物，本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用于任何其他动物，例如非人类动物，例如非人类哺乳动物。修饰适合于施用于人的药物组合物以使组合物适合于施用于各种动物是众所周知的，并且本领域的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠、大鼠；禽类，包括与商业相关的禽类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在某些实施方案中，将组合物施用于人、人类患者或受试者
本公开的制剂可以包括但不限于盐水、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、肽、蛋白、被AAV颗粒转染的细胞(例如，用于转移或移植到细胞中)及其组合。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
通常，这类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合的步骤。如本文所用，短语“活性成分”通常是指带有编码本公开的多核苷酸或多肽的有效载荷区的AAV颗粒，或由本文所述的AAV颗粒的病毒基因组编码的终产物。
在一些实施方案中，所述制剂可包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指制剂中包括的一种或多种非活性剂。在一些实施方案中，可以在本公开的制剂中使用的所有非活性成分或一些非活性成分可以被美国食品和药物管理局(FDA)批准，或者可以在本公开的制剂中使用的所有非活性成分没有被美国食品和药物管理局(FDA)批准。
本文所述的AAV颗粒和药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后如果必要和/或期望，将产品分割、成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物可以散装、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或销售。本文中使用的“单位剂量”表示包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要施用给受试者的活性成分的剂量，和/或这样的剂量的合宜分数，如这样的剂量的二分之一或三分之一。
在某些实施方案中，本公开的制剂是含水制剂(即，包含水的制剂)。在某些实施方案中，本公开的制剂包含水、消毒水或注射用水(WFI)。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以在pH为约7.0的含0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的PBS中配制。
在某些实施方案中，本文所述的AAV制剂可包含足够的AAV颗粒以表达至少一种表达的功能性有效载荷。作为非限制性实例，AAV颗粒可包含编码1、2、3、4或5个功能性有效载荷的病毒基因组。
根据本公开，可以配制AAV颗粒用于CNS递送。可以使用穿过血脑屏障的药物。例如，可以将可以靶向分子到脑血屏障内皮的分子的一些细胞穿透肽用于配制(例如，Mathupala,Expert Opin Ther Pat.,2009,19,137-140；其内容通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，本文所述的AAV制剂可包括缓冲系统，其包括磷酸盐、Tris和/或组氨酸。磷酸盐、Tris和/或组氨酸的缓冲剂可以在制剂中独立地以2-12mM的范围使用。
本公开的制剂可用于生产、加工、制备、储存、扩增或施用本公开的AAV颗粒和病毒载体的任何步骤。在某些实施方案中，药物制剂和组分可以用于本公开的AAV生产、AAV加工、AAV澄清、AAV纯化和AAV精整系统中，所有这些都可以用本领域技术人员已知的制剂(包括本公开的AAV药物、加工和储存制剂)进行预冲洗、包装、平衡、冲洗、加工、洗脱、洗涤或清洗。
赋形剂和稀释剂
可以将本发明的AAV颗粒配制成药物组合物，其包括一种或多种赋形剂或稀释剂，以(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续或延迟释放有效载荷；(4)改变生物分布(例如，将病毒颗粒靶向特定的组织或细胞类型)；(5)增加编码蛋白的翻译；(6)改变编码蛋白的释放特性和/或(7)允许可调节地表达本公开的有效载荷。
根据本公开的药物组合物中的活性成分(例如AAV颗粒)、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量可以根据所治疗的受试者的身份、大小和/或状况以及进一步取决于施用该组合物的途径而变化。在某些实施方案中，组合物可包含0.001％至99％(w/w)的活性成分。举例来说，组合物可包含0.001％至100％，例如0.5至50％、1-30％、5-80％或至少80％(w/w)的活性成分。在某些实施方案中，组合物可包含0.001％至99％(w/w)的赋形剂和稀释剂。举例来说，组合物可包含0.001％至100％，例如0.5至50％、1-30％、5-80％或至少80％(w/w)的赋形剂和稀释剂。
在某些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在某些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和用于兽医学应用。在某些实施方案中，赋形剂可以被美国食品和药品管理局批准。在某些实施方案中，赋形剂可以属于药用级。在某些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
本文中使用的赋形剂包括但不限于任意种和所有的溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，只要它们适合于所希望的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；通过引用整体并入本文)。在本公开的范围内可以预见到常规赋形剂介质的应用，但是除了任何常规赋形剂介质可能与物质或它的衍生物不相容以外，诸如通过产生任何不希望的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任意其它组分相互作用。
本公开的制剂中包含的示例性赋形剂和稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干燥的淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和/或它们的组合。
本公开的制剂中包含的示例性赋形剂和稀释剂包括但不限于1,2,6-己三醇；1，2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-S-(1-甘油))；1，2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1，2-二油酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1，2-二棕榈酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-Rac-(1-甘油))；1，2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-Rac-(1-甘油))；1，2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1-O-甲苯基双胍；2-乙基-1,6-己二醇；乙酸；冰醋酸；乙酸酐；丙酮；丙酮亚硫酸氢钠；乙酰化羊毛脂醇；乙酰化甘油单酯；乙酰半胱氨酸；乙酰色氨酸，DL-；丙烯酸酯共聚物；丙烯酸-丙烯酸异辛酯共聚物；丙烯酸胶粘剂788；活性炭；Adcote72A103；粘合带；己二酸；Aerotex树脂3730；丙氨酸；聚集的白蛋白；胶体白蛋白；人类白蛋白；醇；脱水醇；变性醇；稀释醇；α环糊精；海藻酸；烷基磺酸铵甜菜碱；烷基芳基磺酸钠；尿囊素；烯丙基α-紫罗兰酮；杏仁油；α-松油醇；α-生育酚；乙酸α-生育酚，Dl-；α-生育酚，Dl-；乙酸铝；尿囊素氯羟基铵(Aluminum Chlorhydroxy Allantoinate)；氢氧化铝；水合氢氧化铝-蔗糖；氢氧化铝凝胶；氢氧化铝凝胶F 500；氢氧化铝凝胶F 5000；单硬脂酸铝；氧化铝；铝聚酯；硅酸铝；淀粉辛烯基琥珀酸铝；硬脂酸铝；次醋铝；无水硫酸铝；Amerchol C；Amerchol-Cab；氨基甲基丙醇；氨；氨溶液；浓氨溶液；乙酸铵；氢氧化铵；月桂基硫酸铵；壬苯醇醚-4硫酸铵；C-12-C-15线性伯醇乙氧基化物铵盐；硫酸铵；Ammonyx；Amphoteric-2；Amphoteric-9；茴香烯；无水柠檬酸；无水葡萄糖；无水乳糖；无水柠檬酸三钠；茴香油；Anoxid Sbn；消泡剂；安替比林；阿帕氟烷；杏仁油Peg-6酯；优色林(Aquaphor)；精氨酸；阿拉西(Arlacel)；抗坏血酸；棕榈酸抗坏血酸酯；天冬氨酸；秘鲁香脂；硫酸钡；蜂蜡；合成蜂蜡；Beheneth-10；膨润土；苯扎氯铵；苯磺酸；苄索氯铵；苄索溴铵；苯甲酸；苯甲醇；苯甲酸苯甲酯；苄基氯；β环糊精；二聚阿帕西肽；碱式没食子酸铋；硼酸；溴克利那；丁烷；丁基醇；乙烯基甲基醚/马来酸酐共聚物丁酯(125000Mw)；硬脂酸丁酯；丁基化羟基茴香醚；丁基化羟甲苯；丁二醇；对羟基苯甲酸丁酯；丁酸；C20-40 Pareth-24；咖啡因；钙；碳酸钙；氯化钙；葡庚糖酸钙；氢氧化钙；乳酸钙；考布曲钙；卡地酰胺钠；钙塞酸三钠(Caloxetate Trisodium)；卡特里多钙(CalteridolCalcium)；加拿大树胶(Canada Balsam)；辛酸/癸酸甘油三酯；辛酸/癸酸/硬脂酸甘油三酯；卡普坦；Captisol；焦糖；卡波姆1342；卡波姆1382；卡波姆934；卡波姆934p；卡波姆940；卡波姆941；卡波姆980；卡波姆981；B型卡波姆均聚物(烯丙基季戊四醇交联)；C型卡波姆均聚物(烯丙基季戊四醇交联)；二氧化碳；羧基乙烯基共聚物；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素钠；羧聚乙烯；角叉菜胶；角叉菜胶盐；蓖麻油；雪松叶油；纤维素；微晶纤维素；Cerasynt-Se；地蜡；Ceteareth-12；Ceteareth-15；Ceteareth-30；鲸蜡硬脂醇/Ceteareth-20；鲸蜡硬脂基己酸乙酯Ceteth-10；Ceteth-2；Ceteth-20；Ceteth-23；鲸蜡硬脂醇；西曲氯铵；鲸蜡醇；鲸蜡酯蜡；棕榈酸鲸蜡酯；鲸蜡基氯化吡啶；氯丁醇；氯丁醇半水合物；无水氯丁醇；氯甲酚；氯二甲苯酚；胆固醇；胆甾醇聚醚；胆甾醇聚醚-24；柠檬酸盐；柠檬酸；一水合柠檬酸；含水柠檬酸；椰油酰胺醚硫酸盐；可卡因氧化物；可可甜菜碱；可可二乙醇酰胺；可可单乙醇酰胺；可可脂；可可甘油；椰子油；氢化椰子油；氢化椰子油/棕榈仁油甘油酯；椰油酰基癸酰癸酸酯；光亮可乐果种子提取物；胶原；着色悬浮液；玉米油；棉籽油；乳膏基质；肌酸；肌酐酐；甲酚；交联羧甲基纤维素钠；交联聚维酮；硫酸铜；无水硫酸铜；环甲硅油；环甲硅油/二甲硅油共聚多元醇；半胱氨酸；盐酸半胱氨酸；无水半胱氨酸盐酸盐；半胱氨酸，Dl-；D&C28号红；D&C33号红；D&C36号红；D&C39号红；D&C10号黄；达伐吡啶；Daubert 1-5Pestr(Matte)164z；癸基甲基亚砜；Dehydag Wax Sx；脱氢乙酸；Dehymuls E；苯甲酸地那铵；脱氧胆酸；葡聚糖；葡聚糖40；糊精；右旋糖；一水合右旋糖；葡右旋糖溶液；泛影酸；重氮烷基脲；二氯苄醇；二氯二氟甲烷；二氯四氟乙烷；二乙醇胺；焦碳酸二乙酯；癸二酸二乙酯；二乙二醇单乙基醚；邻苯二甲酸二乙基己酯；氨基乙酸二羟基铝；二异丙醇胺；己二酸二异丙酯；二亚油酸二异丙酯；聚二甲基硅氧烷350；聚二甲基硅氧烷共聚醇；聚二甲基硅氧烷Mdx4-4210；聚二甲基硅氧烷药液360；二甲基异山梨醇；二甲基亚砜；甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物；二甲基二十八烷基铵膨润土；二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物；地乐酚铵盐；二棕榈酰磷脂酰甘油，Dl-；二丙二醇；椰油酰两性基二乙酸二钠；月桂醇聚醚磺基琥珀酸酯二钠；月桂基磺基琥珀酸二钠；黄基水杨酸二钠；地芬净；二乙烯基苯苯乙烯共聚物；Dmdm乙内酰脲；二十二醇；多库酯钠；Duro-Tak 280-2516；Duro-Tak 387-2516；Duro-Tak 80-1196；Duro-Tak 87-2070；Duro-Tak 87-2194；Duro-Tak 87-2287Duro-Tak 87-2296；Duro-Tak 87-2888；Duro-Tak 87-2979；乙二胺四乙酸钙二钠；乙二胺四乙酸钠；无水乙二胺四乙酸二钠；乙二胺四乙酸钠；乙二胺四乙酸；蛋磷脂；辛苯氧磺钠(Entsufon)；辛苯氧磺钠钠；依匹乳糖；盐酸差向四环素；精华花束9200(Essence Bouquet9200)；盐酸乙醇胺；乙酸乙酯；油酸乙酯；乙基纤维素；乙二醇；乙烯乙酸乙烯酯共聚物；乙二胺；乙二胺二盐酸盐；乙烯-丙烯共聚物；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(28％乙酸乙烯酯)；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(9％乙酸乙烯酯)；羟基硬脂酸乙基己酯；对羟基苯甲酸乙酯；桉树油；依沙美肟；可食用脂肪；硬脂；脂肪酸酯；脂肪酸季戊四醇酯；脂肪酸；脂肪醇柠檬酸酯；脂肪醇；Fd&C 1号蓝；Fd&C 3号绿；Fd&C 4号红；F&C 40号红；Fd&C 10号黄(已摘牌)；Fd&C 5号黄；Fd&C 6号黄；氯化铁；氧化铁；调味剂89-186；调味剂89-259；调味剂Df-119；调味剂Df-1530；增味剂；调味剂Fig 827118；调味剂覆盆子Pfc-8407；调味剂罗地亚药品号Rf451；氟氯烃；甲醛；甲醛溶液；分馏椰子油；香料3949-5；香料520a；香料6.007；香料91-122；香料9128-Y；香料93498g；香料冷杉号5124；香料芬芳10328；香料Chemoderm 6401-B；香料Chemoderm 6411；香料乳膏号73457；香料Cs-28197；香料Felton 066m；香料Firmenich47373；香料Givaudan Ess 9090/1c；香料H-6540；香料草本10396；香料Nj-1085；香料P OFl-147；香料Pa 52805；香料Pera Derm D；香料Rbd-9819；香料Shaw Mudge U-7776；香料Tf044078；香料Ungerer Honeysuckle K 2771；香料Ungerer N5195；果糖；氧化钆；半乳糖；伽玛环糊精；明胶；交联明胶；明胶海绵；结冷胶(低酰基)；Gelva 737；龙胆酸；龙胆酸乙醇酰胺；葡庚糖酸钠；葡庚糖酸钠二水合物；葡糖内酯；葡萄糖醛酸；谷氨酸Dl-；谷胱甘肽；甘油；氢化松香甘油酯；柠檬酸甘油酯；异硬脂酸甘油酯；月桂酸甘油酯；单硬脂酸甘油酯；油酸甘油酯；油酸甘油酯/丙二醇；棕榈酸甘油酯；蓖麻酸甘油酯；硬脂酸甘油酯；甘油硬脂酸酯-月桂醇聚醚-23；甘油硬脂酸酯/Peg硬脂酸酯；甘油硬脂酸酯/Peg-100硬脂酸酯；甘油硬脂酸酯/Peg-40硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯-硬脂酰氨基乙基二乙胺；三油酸甘油酯；甘氨酸；盐酸甘氨酸；二硬脂酸乙二醇酯；硬脂酸乙二醇酯；盐酸胍；瓜尔胶；护发素(18nl95-lm)；庚烷；羟乙基淀粉；己二醇；高密度聚乙烯；组氨酸；人白蛋白微球；透明质酸钠；烃；增塑烃凝胶；盐酸；稀释盐酸；氢化可的松；水凝胶聚合物；过氧化氢；氢化蓖麻油；氢化棕榈油；氢化棕榈/棕榈仁油Peg-6酯；氢化聚丁烯635-690；氢氧根离子；羟乙基纤维素；羟乙基哌嗪乙烷磺酸；羟甲基纤维素；羟基硬脂酸羟基二十八完醇酯；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素2906；羟丙基-β-环糊精；羟丙甲纤维素2208(15000Mpa.S)；羟丙甲纤维素2910(15000Mpa.S)；羟丙甲纤维素；咪脲；碘；碘沙酸；盐酸碘法明；爱尔兰苔藓提取物；异丁烷；Isoceteth-20；异亮氨酸；丙烯酸异辛酯；异丙醇；异硬脂酸异丙酯；肉豆蔻酸异丙酯；肉豆蔻酸异丙酯-肉豆蔻醇；棕榈酸异丙酯；硬脂酸异丙酯；异硬脂酸；异硬脂醇；等渗氯化钠溶液；Jelene；高岭土；Kathon Cg；Kathon Cg II；乳酸盐/酯；乳酸；Dl-乳酸；L-乳酸；乳糖酸；乳糖；一水合乳糖；含水乳糖；Laneth；羊毛脂；羊毛脂醇-矿物油；羊毛脂醇；无水羊毛脂；羊毛脂胆固醇；羊毛脂非离子衍生物；乙氧基化羊毛脂；氢化羊毛脂；劳拉氯铵；氧化月桂胺；月桂基二甲基铵水解动物胶原蛋白；月桂醇聚醚硫酸盐；月桂醇聚醚-2；月桂醇聚醚-23；月桂醇聚醚-4；月桂酸二乙醇酰胺；月桂酸肉豆蔻二乙醇酰胺；月桂酰肌氨酸；乳酸月桂酯；月桂基硫酸盐；薰衣草花顶(Lavandula Angustifolia Flowering Top)；卵磷脂；未漂白卵磷脂；鸡蛋卵磷脂；氢化卵磷脂；氢化大豆卵磷脂；大豆卵磷脂；柠檬油；亮氨酸；乙酰丙酸；利多苯宁；轻质矿物油；轻质矿物油(85Ssu)；柠檬烯，(+/-)-；Lipocol Sc-15；赖氨酸；乙酸赖氨酸；一水合赖氨酸；硅酸铝镁；硅酸铝镁水合物；氯化镁；硝酸镁；硬脂酸镁；马来酸；甘露醇；磺化脂肪醇(Maprofix)；甲溴苯宁(Mebrofenin)；医用胶粘剂改性S-15；医用消泡剂A-F乳液；亚甲基双磷酸氢钠；亚甲基二磷酸；葡甲胺；薄荷醇；间甲酚；偏磷酸；甲磺酸；甲硫氨酸；甲醇；甲基葡萄糖醇聚醚-10；甲基葡萄糖醇聚醚-20；甲基葡糖醇聚醚-20半硬脂酸酯；倍半硬脂酸甲基葡萄糖；月桂酸甲酯；甲基吡咯烷酮；水杨酸甲酯；硬脂酸甲酯；甲基硼酸；甲基纤维素(4000Mpa.S)；甲基纤维素；甲基氯异噻唑啉酮；亚甲基蓝；甲基异噻唑啉酮；对羟基苯甲酸甲酯；微晶蜡；矿物油；甘油单酯和甘油二酯；柠檬酸单硬脂酯；一硫代甘油；多固醇提取物(Multisterol Extract)；肉豆蔻醇；乳酸肉豆蔻酯；肉豆蔻基-γ-氯化吡啶甲酸；N-(氨基甲酰基-甲氧基Peg-40)-1,2-二硬脂酰基-脑磷脂钠；N，N-二甲基乙酰胺；烟酰胺；1,2-环己二酮二肟；硝酸；氮；碘化壬苯醇醚；壬苯醇醚-15；壬苯醇醚-9；诺氟烷；麦片；十八烯-1/马来酸共聚物；辛酸；水杨酸辛酯(Octisalate)；辛苯聚醇-1；辛苯聚醇-40；辛苯聚醇-9；辛基十二烷醇；辛基酚聚亚甲基；油酸；Oleth-10/Oleth-5；Oleth-2；Oleth-20；油醇；油酸油酯；橄榄油；奥昔膦酸二钠；氧喹啉；棕榈仁油；氧化棕榈胺；对羟基苯甲酸酯；石蜡；白色软石蜡；Parfum Creme 45/3；花生油；精制花生油；果胶；Peg 6-32硬脂酸酯/乙二醇硬脂酸酯；Peg植物油；Peg-100硬脂酸酯；Peg-12月桂酸甘油酯；Peg-120硬脂酸甘油酯；Peg-120甲基葡萄糖二油酸酯；Peg-15椰油胺；Peg-150二硬脂酸酯；Peg-2硬脂酸酯；Peg-20失水山梨糖醇异硬脂酸酯；Peg-22甲醚/十二烷基二醇共聚物；Peg-25丙二醇硬脂酸酯；Peg-4二月桂酸酯；Peg-4月桂酸酯；Peg-40蓖麻油；Peg-40失水山梨聚糖二异硬脂酸酯；Peg-45/十二烷基二醇共聚物；Peg-5油酸酯；Peg-50硬脂酸酯；Peg-54氢化蓖麻油；Peg-6异硬脂酸酯；Peg-60蓖麻油；Peg-60氢化蓖麻油；PEG-7甲醚；Peg-75羊毛脂；Peg-8月桂酸酯；Peg-8硬脂酸酯；聚乙二醇(pegoxol)7硬脂酸酯；十五内酯；季戊四醇可可酸酯(Pentaerythritol Cocoate)；喷替酸五钠；喷替酸三钠钙；戊酸；薄荷油；全氟丙烷；香水25677；香水花束；香水E-1991；香水Gd 5604；香水Tana 90/42Scba；香水W-1952-1；凡士林；白色凡士林；石油馏分；苯酚；液化苯酚；Phenonip；苯氧乙醇；苯丙氨酸；苯乙醇；乙酸苯汞；硝酸苯汞；鸡蛋磷脂酰甘油；磷脂；鸡蛋磷脂；Phospholipon90g；磷酸；松针油(Pinus Sylvestris)；哌嗪六水合物；Plastibase-50w；聚克立林；泊利氯铵；泊洛沙姆124；泊洛沙姆181；泊洛沙姆182；泊洛沙姆188；泊洛沙姆237；泊洛沙姆407；聚(双(P-羧苯氧基)丙烷酐)：癸二酸；聚(二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷/甲基氢硅氧烷)二甲基乙烯基或二甲基羟基或三甲基封端；聚(Dl-乳酸-共-甘氨酸)乙酸，(50:50；聚(Dl-乳酸-共-乙醇酸)乙酯封端，(50:50；聚丙烯酸(250000Mw)；聚丁烯(1400Mw)；聚卡波非；聚酯；聚酯多胺共聚物；聚酯人造丝；聚乙二醇1000；聚乙二醇1450；聚乙二醇1500；聚乙二醇1540；聚乙二醇200；聚乙二醇300；聚乙二醇300-1600；聚乙二醇3350；聚乙二醇400；聚乙二醇4000；聚乙二醇540；聚乙二醇600；聚乙二醇6000；聚乙二醇8000；聚乙二醇900；高密度含氧化铁黑聚乙烯(<1％)；低密度含硫酸钡聚乙烯(20-24％)；聚乙烯T；聚对苯二甲酸亚乙基酯；聚糖乳酸；聚甘油-3油酸酯；聚甘油-4油酸酯；聚甲基丙烯酸羟乙酯；聚异丁烯；聚异丁烯(1100000Mw)；聚异丁烯(35000Mw)；聚异丁烯178-236；聚异丁烯241-294；聚异丁烯35-39；低分子量聚异丁烯；中等分子量聚异丁烯；聚异丁烯/聚丁烯胶粘剂；聚丙交酯；多元醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯1800；聚氧乙烯醇；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯丙烯；聚氧乙烯20十八硬脂基醚；聚氧乙烯35蓖麻油；聚氧乙烯40氢化蓖麻油；聚氧乙烯40硬脂酸酯；聚氧乙烯400硬脂酸酯；聚氧乙烯6和聚氧乙烯32棕榈硬脂酸酯；聚氧乙烯二硬脂酸酯；聚氧乙烯甘油硬脂酸酯；聚氧乙烯羊毛脂；聚氧乙烯棕榈酸酯；聚氧乙烯硬脂酸酯；聚丙烯；聚丙二醇；聚季铵盐-10；聚季铵盐-7(70/30丙烯酰胺/二烯丙基二甲基氯化铵；聚硅氧烷；聚山梨酯20；聚山梨酯40；聚山梨酯60；聚山梨酯65；聚山梨酯80；聚氨酯；聚乙烯乙酸酯；聚乙烯醇；聚氯乙烯；聚氯乙烯-聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯吡啶；罂粟籽油；钾碱；乙酸钾；钾明矾；碳酸氢钾；亚硫酸氢钾；氯化钾；柠檬酸钾；氢氧化钾；焦亚硫酸钾；磷酸氢二钾；磷酸二氢钾；钾皂；山梨酸钾；聚维酮丙烯酸酯共聚物；聚维酮水凝胶；聚维酮K17；聚维酮K25；聚维酮K29/32；聚维酮K30；聚维酮K90；聚维酮K90f；聚维酮/二十碳烯共聚物；聚维酮；Ppg-12/Smdi共聚物；Ppg-15硬脂醚；Ppg-20甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯；Ppg-26油酸酯；Product Wat；脯氨酸；Promulgen D；Promulgen G；丙烷；推进剂A-46；没食子酸丙酯；碳酸丙烯酯；丙二醇；丙二醇二乙酸酯；丙二醇二辛酸酯；丙二醇单月桂酸酯；丙二醇棕榈硬脂酸酯；丙二醇棕榈硬脂酸酯；丙二醇蓖麻油酸酯；丙二醇/重氮烷基脲/对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯；对羟基苯甲酸丙酯；硫酸鱼精蛋白；蛋白水解物；Pvm/Ma共聚物；季铵盐-15；顺式季铵盐-15；季铵盐-52；Ra-2397；Ra-3011；糖精；糖精钠；无水糖精钠；红花油；变性乙醇3a；变性乙醇40；变性乙醇40-2；变性乙醇40b；Sepineo P 600；丝氨酸；芝麻油；乳木果油；硅橡胶牌医用级管(Silastic Brand Medical Grade Tubing)；硅橡胶医用胶粘剂，A型；牙科二氧化硅；硅；二氧化硅；胶体二氧化硅；硅酮；硅酮胶粘剂4102；硅酮胶粘剂4502；硅酮胶粘剂Bio-Psa Q7-4201；硅胶胶粘剂Bio-Psa Q7-4301；硅酮乳液；硅酮/聚酯薄膜带；二甲硅油；二甲硅油乳液；Sipon Ls 20np；苏打粉；乙酸钠；无水乙酸钠；烷基硫酸钠；抗坏血酸钠；苯甲酸钠；碳酸氢钠；硫酸氢钠；亚硫酸氢钠；硼酸钠；十水合硼酸钠；碳酸钠；十水合碳酸钠；一水合碳酸钠；鲸蜡硬脂基硫酸钠；氯酸钠；氯化钠；氯化钠注射液；抑菌氯化钠注射液；胆固醇硫酸钠；柠檬酸钠；椰油酰肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；连二亚硫酸钠；十二烷基苯磺酸钠；甲醛次硫酸钠；葡萄糖酸钠；氢氧化钠；次氯酸钠；碘化钠；乳酸钠；L-乳酸钠；月桂醇聚醚-2硫酸钠；月桂醇聚醚-3硫酸钠；月桂醇聚醚-5硫酸钠；月桂酰肌氨酸钠；月桂基硫酸钠；月桂基磺基乙酸钠；焦亚硫酸钠；硝酸钠；磷酸钠；二水合磷酸钠；磷酸氢二钠；无水磷酸氢二钠；二水合磷酸氢二钠；十二水合磷酸氢二钠；七水合磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；无水磷酸二氢钠；二水合磷酸二氢钠；一水合磷酸二氢钠；聚丙烯酸钠(2500000Mw)；焦磷酸钠；吡咯烷酮羧酸钠；淀粉乙醇酸钠；琥珀酸钠六水合物；硫酸钠；无水硫酸钠；十水合硫酸钠；亚硫酸钠；磺基琥珀酸十一烯酸单烷醇酰胺钠(SodiumSulfosuccinated Undecyclenic Monoalkylolamide)；酒石酸钠；硫代乙醇酸钠；硫代马来酸钠；硫代硫酸钠；无水硫代硫酸钠；三偏磷酸钠；二甲苯磺酸钠；Somay 44；山梨酸；失水山梨醇；失水山梨醇异硬脂酸酯；失水山梨酸单月桂酸酯；失水山梨醇单油酸酯；失水山梨糖单棕榈酸酯；失水山梨醇单硬脂酸酯；失水山梨醇倍半油酸酯；失水山梨酸三油酸酯；失水山梨酸三硬脂酸酯；山梨醇；山梨醇溶液；大豆粉；豆油；薄荷油；鲸蜡；角鲨烷；稳定的氧氯配合物(Stabilized Oxychloro Complex)；2-乙基己酸亚锡；氯化亚锡；无水氯化亚锡；氟化亚锡；酒石酸亚锡；淀粉；预胶化淀粉1500；玉米淀粉；司拉氯铵；司拉氯铵水辉石/碳酸丙烯酯；硬脂酰氨基乙基二乙胺；硬脂醇聚醚-10；硬脂醇聚醚-100；硬脂醇聚醚-2；硬脂醇聚醚-20；硬脂醇聚醚-21；硬脂醇聚醚-40；硬脂酸；硬脂酸二乙醇酰胺；硬脂氧基三甲基硅烷；硬脂基三甲基铵水解动物胶原蛋白(Steartrimonium Hydrolyzed Animal Collagen)；硬脂醇；吸入无菌水；苯乙烯/异戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物；琥巯酸(Succimer)；琥珀酸；三氯蔗糖；蔗糖；蔗糖二硬脂酸酯；蔗糖聚酯；磺乙酰胺钠；磺丁基醚β-环糊精；二氧化硫；硫酸；亚硫酸；Surfactol Qs；D-塔格糖；滑石；妥尔油；牛油甘油酯；酒石酸；D1-酒石酸；Tenox；Tenox-2；叔丁基醇；叔丁基过氧化氢；叔丁基对苯二酚；四(2-甲氧基异丁基异氰酸酯)四氟硼酸铜(I)；正硅酸四丙基酯；替曲膦；茶碱；硫柳汞；苏氨酸；百里酚；锡；二氧化钛；生育酚；托可索仑；全胃肠外营养脂乳剂；三醋精；三辛酸甘油酯；三氯一氟甲烷；十三烷醇聚醚-10；三乙醇胺月桂基硫酸盐；三氟乙酸；中链甘油三酯；三羟基硬脂精；三(羊毛醇聚醚-4)磷酸酯；三(月桂醇聚醚-4)磷酸酯；柠檬酸三钠二水合物；HEDTA三钠；Triton 720；Triton X-200；三乙醇胺；曲金刚胺；胺丁三醇(TRIS)；色氨酸；泰洛沙泊；酪氨酸；十一碳烯酸；Union76Amsco-Res 6038；尿素；缬氨酸；植物油；氢化植物油甘油酯；氢化植物油；维塞胺；内脂素；粘胶/棉；维生素E；乳化蜡；Wecobee Fs；白地蜡；白蜡；黄原胶；锌；乙酸锌；碳酸锌；氯化锌和氧化锌。
本文公开的AAV颗粒的药物制剂可包括阳离子或阴离子。在某些实施方案中，所述制剂包含金属阳离子，例如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+及其组合。作为非限制性实例，制剂可包括与金属阳离子络合的聚合物和组合物(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，其各自内容通过引用整体并入本文)。
本公开的制剂还可包含一种或多种药学上可接受的盐。本文中使用的“药学上可接受的盐”表示公开的化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。
在某些实施方案中，可用于配制药物组合物的其他赋形剂可包括氯化镁(MgCl2)、精氨酸、山梨醇和/或海藻糖。
除AAV颗粒外，本发明的制剂还可包含至少一种赋形剂和/或稀释剂。除AAV颗粒外，该制剂还可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种的赋形剂和/或稀释剂。
在某些实施方案中，所述制剂可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。作为非限制性实例，PBS可包括氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和蒸馏水。在某些情况下，PBS不包含钾或镁。在其他情况下，PBS包含钙和镁。
磷酸钠
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是磷酸钠。该制剂可以包括一碱式磷酸钠、二碱式磷酸钠或一碱式磷酸钠和二碱式磷酸钠的组合。
在某些实施方案中，制剂中磷酸钠的浓度可以是但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM、5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM、6.5mM、6.6mM、6.7mM、6.8mM、6.9mM、7mM、7.1mM、7.2mM、7.3mM、7.4mM、7.5mM、7.6mM、7.7mM、7.8mM、7.9mM、8mM、8.1mM、8.2mM、8.3mM、8.4mM、8.5mM、8.6mM、8.7mM、8.8mM、8.9mM、9mM、9.1mM、9.2mM、9.3mM、9.4mM、9.5mM、9.6mM、9.7mM、9.8mM、9.9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM、10.5mM、10.6mM、10.7mM、10.8mM、10.9mM、11mM、11.1mM、11.2mM、11.3mM、11.4mM、11.5mM、11.6mM、11.7mM、11.8mM、11.9mM、12mM、12.1mM、12.2mM、12.3mM、12.4mM、12.5mM、12.6mM、12.7mM、12.8mM、12.9mM、13mM、13.1mM、13.2mM、13.3mM、13.4mM、13.5mM、13.6mM、13.7mM、13.8mM、13.9mM、14mM、14.1mM、14.2mM、14.3mM、14.4mM、14.5mM、14.6mM、14.7mM、14.8mM、14.9mM或15mM。
所述制剂包含的磷酸钠范围可以为0-0.5mM、0.1-0.6mM、0.2-0.7mM、0.3-0.8mM、0.4-0.9mM、0.5-1mM、0.6-1.1mM、0.7-1.2mM、0.8-1.3mM、0.9-1.4mM、1-1.5mM、1.1-1.6mM、1.2-1.7mM、1.3-1.8mM、1.4-1.9mM、1.5-2mM、1.6-2.1mM、1.7-2.2mM、1.8-2.3mM、1.9-2.4mM、2-2.5mM、2.1-2.6mM、2.2-2.7mM、2.3-2.8mM、2.4-2.9mM、2.5-3mM、2.6-3.1mM、2.7-3.2mM、2.8-3.3mM、2.9-3.4mM、3-3.5mM、3.1-3.6mM、3.2-3.7mM、3.3-3.8mM、3.4-3.9mM、3.5-4mM、3.6-4.1mM、3.7-4.2mM、3.8-4.3mM、3.9-4.4mM、4-4.5mM、4.1-4.6mM、4.2-4.7mM、4.3-4.8mM、4.4-4.9mM、4.5-5mM、4.6-5.1mM、4.7-5.2mM、4.8-5.3mM、4.9-5.4mM、5-5.5mM、5.1-5.6mM、5.2-5.7mM、5.3-5.8mM、5.4-5.9mM、5.5-6mM、5.6-6.1mM、5.7-6.2mM、5.8-6.3mM、5.9-6.4mM、6-6.5mM、6.1-6.6mM、6.2-6.7mM、6.3-6.8mM、6.4-6.9mM、6.5-7mM、6.6-7.1mM、6.7-7.2mM、6.8-7.3mM、6.9-7.4mM、7-7.5mM、7.1-7.6mM、7.2-7.7mM、7.3-7.8mM、7.4-7.9mM、7.5-8mM、7.6-8.1mM、7.7-8.2mM、7.8-8.3mM、7.9-8.4mM、8-8.5mM、8.1-8.6mM、8.2-8.7mM、8.3-8.8mM、8.4-8.9mM、8.5-9mM、8.6-9.1mM、8.7-9.2mM、8.8-9.3mM、8.9-9.4mM、9-9.5mM、9.1-9.6mM、9.2-9.7mM、9.3-9.8mM、9.4-9.9mM、9.5-10mM、9.6-10.1mM、9.7-10.2mM、9.8-10.3mM、9.9-10.4mM、10-10.5mM、10.1-10.6mM、10.2-10.7mM、10.3-10.8mM、10.4-10.9mM、10.5-11mM、10.6-11.1mM、10.7-11.2mM、10.8-11.3mM、10.9-11.4mM、11-11.5mM、11.1-11.6mM、11.2-11.7mM、11.3-11.8mM、11.4-11.9mM、11.5-12mM、11.6-12.1mM、11.7-12.2mM、11.8-12.3mM、11.9-12.4mM、12-12.5mM、12.1-12.6mM、12.2-12.7mM、12.3-12.8mM、12.4-12.9mM、12.5-13mM、12.6-13.1mM、12.7-13.2mM、12.8-13.3mM、12.9-13.4mM、13-13.5mM、13.1-13.6mM、13.2-13.7mM、13.3-13.8mM、13.4-13.9mM、13.5-14mM、13.6-14.1mM、13.7-14.2mM、13.8-14.3mM、13.9-14.4mM、14-14.5mM、14.1-14.6mM、14.2-14.7mM、14.3-14.8mM、14.4-14.9mM、14.5-15mM、0-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-11mM、11-12mM、12-13mM、13-14mM、14-15mM、15-16mM、0-2mM、1-3mM、2-4mM、3-5mM、4-6mM、5-7mM、6-8mM、7-9mM、8-10mM、9-11mM、10-12mM、11-13mM、12-14mM、13-15mM、0-3mM、1-4mM、2-5mM、3-6mM、4-7mM、5-8mM、6-9mM、7-10mM、8-11mM、9-12mM、10-13mM、11-14mM、12-15mM、0-4mM、1-5mM、2-6mM、3-7mM、4-8mM、5-9mM、6-10mM、7-11mM、8-12mM、9-13mM、10-14mM、11-15mM、0-5mM、1-6mM、2-7mM、3-8mM、4-9mM、5-10mM、6-11mM、7-12mM、8-13mM、9-14mM、10-15mM、0-6mM、1-7mM、2-8mM、3-9mM、4-10mM、5-11mM、6-12mM、7-13mM、8-14mM、9-15mM、0-7mM、1-8mM、2-9mM、3-10mM、4-11mM、5-12mM、6-13mM、7-14mM、8-15mM、0-8mM、1-9mM、2-10mM、3-11mM、4-12mM、5-13mM、6-14mM、7-15mM、0-9mM、1-10mM、2-11mM、3-12mM、4-13mM、5-14mM、6-15mM、0-10mM、1-11mM、2-12mM、3-13mM、4-14mM、5-15mM、0-11mM、1-12mM、2-13mM、3-14mM、4-15mM、0-12mM、1-13mM、2-14mM、3-15mM、0-13mM、1-14mM、2-15mM、0-14mM、1-15mM或0-15mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10mM的磷酸钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-12mM的磷酸钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-3mM的磷酸钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含9-10mM的磷酸钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10-11mM的磷酸钠。
在某些实施方案中，所述制剂可包含2.7mM的磷酸钠。
在某些实施方案中，所述制剂可包含10mM的磷酸钠。
磷酸钾
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是磷酸钾。该制剂可包括一碱式磷酸钾、二碱式磷酸钾或一碱式磷酸钾和二碱式磷酸钾的组合。
在某些实施方案中，制剂中磷酸钾的浓度可以是但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM、5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM、6.5mM、6.6mM、6.7mM、6.8mM、6.9mM、7mM、7.1mM、7.2mM、7.3mM、7.4mM、7.5mM、7.6mM、7.7mM、7.8mM、7.9mM、8mM、8.1mM、8.2mM、8.3mM、8.4mM、8.5mM、8.6mM、8.7mM、8.8mM、8.9mM、9mM、9.1mM、9.2mM、9.3mM、9.4mM、9.5mM、9.6mM、9.7mM、9.8mM、9.9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM、10.5mM、10.6mM、10.7mM、10.8mM、10.9mM、11mM、11.1mM、11.2mM、11.3mM、11.4mM、11.5mM、11.6mM、11.7mM、11.8mM、11.9mM、12mM、12.1mM、12.2mM、12.3mM、12.4mM、12.5mM、12.6mM、12.7mM、12.8mM、12.9mM、13mM、13.1mM、13.2mM、13.3mM、13.4mM、13.5mM、13.6mM、13.7mM、13.8mM、13.9mM、14mM、14.1mM、14.2mM、14.3mM、14.4mM、14.5mM、14.6mM、14.7mM、14.8mM、14.9mM或15mM。
所述制剂包含的磷酸钾范围可以为0-0.5mM、0.1-0.6mM、0.2-0.7mM、0.3-0.8mM、0.4-0.9mM、0.5-1mM、0.6-1.1mM、0.7-1.2mM、0.8-1.3mM、0.9-1.4mM、1-1.5mM、1.1-1.6mM、1.2-1.7mM、1.3-1.8mM、1.4-1.9mM、1.5-2mM、1.6-2.1mM、1.7-2.2mM、1.8-2.3mM、1.9-2.4mM、2-2.5mM、2.1-2.6mM、2.2-2.7mM、2.3-2.8mM、2.4-2.9mM、2.5-3mM、2.6-3.1mM、2.7-3.2mM、2.8-3.3mM、2.9-3.4mM、3-3.5mM、3.1-3.6mM、3.2-3.7mM、3.3-3.8mM、3.4-3.9mM、3.5-4mM、3.6-4.1mM、3.7-4.2mM、3.8-4.3mM、3.9-4.4mM、4-4.5mM、4.1-4.6mM、4.2-4.7mM、4.3-4.8mM、4.4-4.9mM、4.5-5mM、4.6-5.1mM、4.7-5.2mM、4.8-5.3mM、4.9-5.4mM、5-5.5mM、5.1-5.6mM、5.2-5.7mM、5.3-5.8mM、5.4-5.9mM、5.5-6mM、5.6-6.1mM、5.7-6.2mM、5.8-6.3mM、5.9-6.4mM、6-6.5mM、6.1-6.6mM、6.2-6.7mM、6.3-6.8mM、6.4-6.9mM、6.5-7mM、6.6-7.1mM、6.7-7.2mM、6.8-7.3mM、6.9-7.4mM、7-7.5mM、7.1-7.6mM、7.2-7.7mM、7.3-7.8mM、7.4-7.9mM、7.5-8mM、7.6-8.1mM、7.7-8.2mM、7.8-8.3mM、7.9-8.4mM、8-8.5mM、8.1-8.6mM、8.2-8.7mM、8.3-8.8mM、8.4-8.9mM、8.5-9mM、8.6-9.1mM、8.7-9.2mM、8.8-9.3mM、8.9-9.4mM、9-9.5mM、9.1-9.6mM、9.2-9.7mM、9.3-9.8mM、9.4-9.9mM、9.5-10mM、9.6-10.1mM、9.7-10.2mM、9.8-10.3mM、9.9-10.4mM、10-10.5mM、10.1-10.6mM、10.2-10.7mM、10.3-10.8mM、10.4-10.9mM、10.5-11mM、10.6-11.1mM、10.7-11.2mM、10.8-11.3mM、10.9-11.4mM、11-11.5mM、11.1-11.6mM、11.2-11.7mM、11.3-11.8mM、11.4-11.9mM、11.5-12mM、11.6-12.1mM、11.7-12.2mM、11.8-12.3mM、11.9-12.4mM、12-12.5mM、12.1-12.6mM、12.2-12.7mM、12.3-12.8mM、12.4-12.9mM、12.5-13mM、12.6-13.1mM、12.7-13.2mM、12.8-13.3mM、12.9-13.4mM、13-13.5mM、13.1-13.6mM、13.2-13.7mM、13.3-13.8mM、13.4-13.9mM、13.5-14mM、13.6-14.1mM、13.7-14.2mM、13.8-14.3mM、13.9-14.4mM、14-14.5mM、14.1-14.6mM、14.2-14.7mM、14.3-14.8mM、14.4-14.9mM、14.5-15mM、0-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-11mM、11-12mM、12-13mM、13-14mM、14-15mM、15-16mM、0-2mM、1-3mM、2-4mM、3-5mM、4-6mM、5-7mM、6-8mM、7-9mM、8-10mM、9-11mM、10-12mM、11-13mM、12-14mM、13-15mM、0-3mM、1-4mM、2-5mM、3-6mM、4-7mM、5-8mM、6-9mM、7-10mM、8-11mM、9-12mM、10-13mM、11-14mM、12-15mM、0-4mM、1-5mM、2-6mM、3-7mM、4-8mM、5-9mM、6-10mM、7-11mM、8-12mM、9-13mM、10-14mM、11-15mM、0-5mM、1-6mM、2-7mM、3-8mM、4-9mM、5-10mM、6-11mM、7-12mM、8-13mM、9-14mM、10-15mM、0-6mM、1-7mM、2-8mM、3-9mM、4-10mM、5-11mM、6-12mM、7-13mM、8-14mM、9-15mM、0-7mM、1-8mM、2-9mM、3-10mM、4-11mM、5-12mM、6-13mM、7-14mM、8-15mM、0-8mM、1-9mM、2-10mM、3-11mM、4-12mM、5-13mM、6-14mM、7-15mM、0-9mM、1-10mM、2-11mM、3-12mM、4-13mM、5-14mM、6-15mM、0-10mM、1-11mM、2-12mM、3-13mM、4-14mM、5-15mM、0-11mM、1-12mM、2-13mM、3-14mM、4-15mM、0-12mM、1-13mM、2-14mM、3-15mM、0-13mM、1-14mM、2-15mM、0-14mM、1-15mM或0-15mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10mM的磷酸钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1-3mM的磷酸钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1-2mM的磷酸钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-3mM的磷酸钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-12mM的磷酸钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1.5mM的磷酸钾。作为非限制性实例，该制剂可以包含1.54mM的磷酸钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2mM的磷酸钾。
氯化钠
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是氯化钠。
在某些实施方案中，制剂中氯化钠的浓度可以是但不限于75mM、76mM、77mM、78mM、79mM、80mM、81mM、82mM、83mM、84mM、85mM、86mM、87mM、88mM、89mM、90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、101mM、102mM、103mM、104mM、105mM、106mM、107mM、108mM、109mM、110mM、111mM、112mM、113mM、114mM、115mM、116mM、117mM、118mM、119mM、120mM、121mM、122mM、123mM、124mM、125mM、126mM、127mM、128mM、129mM、130mM、131mM、132mM、133mM、134mM、135mM、136mM、137mM、138mM、139mM、140mM、141mM、142mM、143mM、144mM、145mM、146mM、147mM、148mM、149mM、150mM、151mM、152mM、153mM、154mM、155mM、156mM、157mM、158mM、159mM、160mM、161mM、162mM、163mM、164mM、165mM、166mM、167mM、168mM、169mM、170mM、171mM、172mM、173mM、174mM、175mM、176mM、177mM、178mM、179mM、180mM、181mM、182mM、183mM、184mM、185mM、186mM、187mM、188mM、189mM、190mM、191mM、192mM、193mM、194mM、195mM、196mM、197mM、198mM、199mM、200mM、201mM、202mM、203mM、204mM、205mM、206mM、207mM、208mM、209mM、210mM、211mM、212mM、213mM、214mM、215mM、216mM、217mM、218mM、219mM或220mM。
所述制剂包含的氯化钠范围可以为75-85mM、80-90mM、85-95mM、90-100mM、95-105mM、100-110mM、105-115mM、110-120mM、115-125mM、120-130mM、125-135mM、130-140mM、135-145mM、140-150mM、145-155mM、150-160mM、155-165mM、160-170mM、165-175mM、170-180mM、175-185mM、180-190mM、185-195mM、190-200mM、75-95mM、80-100mM、85-105mM、90-110mM、95-115mM、100-120mM、105-125mM、110-130mM、115-135mM、120-140mM、125-145mM、130-150mM、135-155mM、140-160mM、145-165mM、150-170mM、155-175mM、160-180mM、165-185mM、170-190mM、175-195mM、180-200mM、75-100mM、80-105mM、85-110mM、90-115mM、95-120mM、100-125mM、105-130mM、110-135mM、115-140mM、120-145mM、125-150mM、130-155mM、135-160mM、140-165mM、145-170mM、150-175mM、155-180mM、160-185mM、165-190mM、170-195mM、175-200mM、75-105mM、80-110mM、85-115mM、90-120mM、95-125mM、100-130mM、105-135mM、110-140mM、115-145mM、120-150mM、125-155mM、130-160mM、135-165mM、140-170mM、145-175mM、150-180mM、155-185mM、160-190mM、165-195mM、170-200mM、75-115mM、80-120mM、85-125mM、90-130mM、95-135mM、100-140mM、105-145mM、110-150mM、115-155mM、120-160mM、125-165mM、130-170mM、135-175mM、140-180mM、145-185mM、150-190mM、155-195mM、160-200mM、75-120mM、80-125mM、85-130mM、90-135mM、95-140mM、100-145mM、105-150mM、110-155mM、115-160mM、120-165mM、125-170mM、130-175mM、135-180mM、140-185mM、145-190mM、150-195mM、155-200mM、75-125mM、80-130mM、85-135mM、90-140mM、95-145mM、100-150mM、105-155mM、110-160mM、115-165mM、120-170mM、125-175mM、130-180mM、135-185mM、140-190mM、145-195mM、150-200mM、75-125mM、80-130mM、85-135mM、90-140mM、95-145mM、100-150mM、105-155mM、110-160mM、115-165mM、120-170mM、125-175mM、130-180mM、135-185mM、140-190mM、145-195mM、150-200mM、75-135mM、80-140mM、85-145mM、90-150mM、95-155mM、100-160mM、105-165mM、110-170mM、115-175mM、120-180mM、125-185mM、130-190mM、135-195mM、140-200mM、75-145mM、80-150mM、85-155mM、90-160mM、95-165mM、100-170mM、105-175mM、110-180mM、115-185mM、120-190mM、125-195mM、130-200mM、75-155mM、80-160mM、85-165mM、90-170mM、95-175mM、100-180mM、105-185mM、110-190mM、115-195mM、120-200mM、75-165mM、80-170mM、85-175mM、90-180mM、95-185mM、100-190mM、105-195mM、110-200mM、75-175mM、80-180mM、85-185mM、90-190mM、95-195mM、100-200mM、80-220mM、90-220mM、100-220mM、110-220mM、120-220mM、130-220mM、140-220mM、150-220mM、160-220mM、170-220mM、180-220mM、190-220mM、200-220mM或210-220mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含80-220mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含80-150mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含75mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含83mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含92mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含95mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含98mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含100mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含107mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含109mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含118mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含125mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含127mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含133mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含142mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含150mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含155mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含192mM的氯化钠。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含210mM的氯化钠。
氯化钾
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是氯化钾。
在某些实施方案中，制剂中氯化钾的浓度可以是但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM、5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM、6.5mM、6.6mM、6.7mM、6.8mM、6.9mM、7mM、7.1mM、7.2mM、7.3mM、7.4mM、7.5mM、7.6mM、7.7mM、7.8mM、7.9mM、8mM、8.1mM、8.2mM、8.3mM、8.4mM、8.5mM、8.6mM、8.7mM、8.8mM、8.9mM、9mM、9.1mM、9.2mM、9.3mM、9.4mM、9.5mM、9.6mM、9.7mM、9.8mM、9.9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM、10.5mM、10.6mM、10.7mM、10.8mM、10.9mM、11mM、11.1mM、11.2mM、11.3mM、11.4mM、11.5mM、11.6mM、11.7mM、11.8mM、11.9mM、12mM、12.1mM、12.2mM、12.3mM、12.4mM、12.5mM、12.6mM、12.7mM、12.8mM、12.9mM、13mM、13.1mM、13.2mM、13.3mM、13.4mM、13.5mM、13.6mM、13.7mM、13.8mM、13.9mM、14mM、14.1mM、14.2mM、14.3mM、14.4mM、14.5mM、14.6mM、14.7mM、14.8mM、14.9mM或15mM。
所述制剂包含的氯化钾范围可以为0-0.5mM、0.1-0.6mM、0.2-0.7mM、0.3-0.8mM、0.4-0.9mM、0.5-1mM、0.6-1.1mM、0.7-1.2mM、0.8-1.3mM、0.9-1.4mM、1-1.5mM、1.1-1.6mM、1.2-1.7mM、1.3-1.8mM、1.4-1.9mM、1.5-2mM、1.6-2.1mM、1.7-2.2mM、1.8-2.3mM、1.9-2.4mM、2-2.5mM、2.1-2.6mM、2.2-2.7mM、2.3-2.8mM、2.4-2.9mM、2.5-3mM、2.6-3.1mM、2.7-3.2mM、2.8-3.3mM、2.9-3.4mM、3-3.5mM、3.1-3.6mM、3.2-3.7mM、3.3-3.8mM、3.4-3.9mM、3.5-4mM、3.6-4.1mM、3.7-4.2mM、3.8-4.3mM、3.9-4.4mM、4-4.5mM、4.1-4.6mM、4.2-4.7mM、4.3-4.8mM、4.4-4.9mM、4.5-5mM、4.6-5.1mM、4.7-5.2mM、4.8-5.3mM、4.9-5.4mM、5-5.5mM、5.1-5.6mM、5.2-5.7mM、5.3-5.8mM、5.4-5.9mM、5.5-6mM、5.6-6.1mM、5.7-6.2mM、5.8-6.3mM、5.9-6.4mM、6-6.5mM、6.1-6.6mM、6.2-6.7mM、6.3-6.8mM、6.4-6.9mM、6.5-7mM、6.6-7.1mM、6.7-7.2mM、6.8-7.3mM、6.9-7.4mM、7-7.5mM、7.1-7.6mM、7.2-7.7mM、7.3-7.8mM、7.4-7.9mM、7.5-8mM、7.6-8.1mM、7.7-8.2mM、7.8-8.3mM、7.9-8.4mM、8-8.5mM、8.1-8.6mM、8.2-8.7mM、8.3-8.8mM、8.4-8.9mM、8.5-9mM、8.6-9.1mM、8.7-9.2mM、8.8-9.3mM、8.9-9.4mM、9-9.5mM、9.1-9.6mM、9.2-9.7mM、9.3-9.8mM、9.4-9.9mM、9.5-10mM、9.6-10.1mM、9.7-10.2mM、9.8-10.3mM、9.9-10.4mM、10-10.5mM、10.1-10.6mM、10.2-10.7mM、10.3-10.8mM、10.4-10.9mM、10.5-11mM、10.6-11.1mM、10.7-11.2mM、10.8-11.3mM、10.9-11.4mM、11-11.5mM、11.1-11.6mM、11.2-11.7mM、11.3-11.8mM、11.4-11.9mM、11.5-12mM、11.6-12.1mM、11.7-12.2mM、11.8-12.3mM、11.9-12.4mM、12-12.5mM、12.1-12.6mM、12.2-12.7mM、12.3-12.8mM、12.4-12.9mM、12.5-13mM、12.6-13.1mM、12.7-13.2mM、12.8-13.3mM、12.9-13.4mM、13-13.5mM、13.1-13.6mM、13.2-13.7mM、13.3-13.8mM、13.4-13.9mM、13.5-14mM、13.6-14.1mM、13.7-14.2mM、13.8-14.3mM、13.9-14.4mM、14-14.5mM、14.1-14.6mM、14.2-14.7mM、14.3-14.8mM、14.4-14.9mM、14.5-15mM、0-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-11mM、11-12mM、12-13mM、13-14mM、14-15mM、15-16mM、0-2mM、1-3mM、2-4mM、3-5mM、4-6mM、5-7mM、6-8mM、7-9mM、8-10mM、9-11mM、10-12mM、11-13mM、12-14mM、13-15mM、0-3mM、1-4mM、2-5mM、3-6mM、4-7mM、5-8mM、6-9mM、7-10mM、8-11mM、9-12mM、10-13mM、11-14mM、12-15mM、0-4mM、1-5mM、2-6mM、3-7mM、4-8mM、5-9mM、6-10mM、7-11mM、8-12mM、9-13mM、10-14mM、11-15mM、0-5mM、1-6mM、2-7mM、3-8mM、4-9mM、5-10mM、6-11mM、7-12mM、8-13mM、9-14mM、10-15mM、0-6mM、1-7mM、2-8mM、3-9mM、4-10mM、5-11mM、6-12mM、7-13mM、8-14mM、9-15mM、0-7mM、1-8mM、2-9mM、3-10mM、4-11mM、5-12mM、6-13mM、7-14mM、8-15mM、0-8mM、1-9mM、2-10mM、3-11mM、4-12mM、5-13mM、6-14mM、7-15mM、0-9mM、1-10mM、2-11mM、3-12mM、4-13mM、5-14mM、6-15mM、0-10mM、1-11mM、2-12mM、3-13mM、4-14mM、5-15mM、0-11mM、1-12mM、2-13mM、3-14mM、4-15mM、0-12mM、1-13mM、2-14mM、3-15mM、0-13mM、1-14mM、2-15mM、0-14mM、1-15mM或0-15mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10mM的氯化钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1-3mM的氯化钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1-2mM的氯化钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-3mM的氯化钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1.5mM的氯化钾。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2.7mM的氯化钾。
氯化镁
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是氯化镁。
在某些实施方案中，氯化镁的浓度可以是但不限于1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM、60mM、61mM、62mM、63mM、64mM、65mM、66mM、67mM、68mM、69mM、70mM、71mM、72mM、73mM、74mM、75mM、76mM、77mM、78mM、79mM、80mM、81mM、82mM、83mM、84mM、85mM、86mM、87mM、88mM、89mM、90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM或100mM。
所述制剂包含的氯化镁范围可以为0-5mM、1-5mM、2-5mM、3-5mM、4-5mM、0-10mM、1-10mM、2-10mM、3-10mM、4-10mM、5-10mM、6-10mM、7-10mM、8-10mM、9-10mM、0-25mM、1-25mM、2-25mM、3-25mM、4-25mM、5-25mM、6-25mM、7-25mM、8-25mM、9-25mM、10-25mM、11-25mM、12-25mM、13-25mM、14-25mM、15-25mM、16-25mM、17-25mM、18-25mM、19-25mM、20-25mM、21-25mM、22-25mM、23-25mM、24-25mM、0-50mM、1-50mM、2-50mM、3-50mM、4-50mM、5-50mM、6-50mM、7-50mM、8-50mM、9-50mM、10-50mM、11-50mM、12-50mM、13-50mM、14-50mM、15-50mM、16-50mM、17-50mM、18-50mM、19-50mM、20-50mM、21-50mM、22-50mM、23-50mM、24-50mM、25-50mM、26-50mM、27-50mM、28-50mM、29-50mM、30-50mM、31-50mM、32-50mM、33-50mM、34-50mM、35-50mM、36-50mM、37-50mM、38-50mM、39-50mM、40-50mM、41-50mM、42-50mM、43-50mM、44-50mM、45-50mM、46-50mM、47-50mM、48-50mM、49-50mM、0-75mM、1-75mM、2-75mM、3-75mM、4-75mM、5-75mM、6-75mM、7-75mM、8-75mM、9-75mM、10-75mM、11-75mM、12-75mM、13-75mM、14-75mM、15-75mM、16-75mM、17-75mM、18-75mM、19-75mM、20-75mM、21-75mM、22-75mM、23-75mM、24-75mM、25-75mM、26-75mM、27-75mM、28-75mM、29-75mM、30-75mM、31-75mM、32-75mM、33-75mM、34-75mM、35-75mM、36-75mM、37-75mM、38-75mM、39-75mM、40-75mM、41-75mM、42-75mM、43-75mM、44-75mM、45-75mM、46-75mM、47-75mM、48-75mM、49-75mM、50-75mM、51-75mM、52-75mM、53-75mM、54-75mM、55-75mM、56-75mM、57-75mM、58-75mM、59-75mM、60-75mM、61-75mM、62-75mM、63-75mM、64-75mM、65-75mM、66-75mM、67-75mM、68-75mM、69-75mM、70-75mM、71-75mM、72-75mM、73-75mM、74-75mM、50-100mM、60-100mM、75-100mM、80-100mM或90-100mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-75mM的氯化镁。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-5mM的氯化镁。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含50-100mM的氯化镁。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2mM的氯化镁。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含75mM的氯化镁。
Tris
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是Tris(也称为三(羟甲基)氨基甲烷、氨丁三醇或THAM))。
在某些实施方案中，制剂中Tris的浓度可以是但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM、5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM、6.5mM、6.6mM、6.7mM、6.8mM、6.9mM、7mM、7.1mM、7.2mM、7.3mM、7.4mM、7.5mM、7.6mM、7.7mM、7.8mM、7.9mM、8mM、8.1mM、8.2mM、8.3mM、8.4mM、8.5mM、8.6mM、8.7mM、8.8mM、8.9mM、9mM、9.1mM、9.2mM、9.3mM、9.4mM、9.5mM、9.6mM、9.7mM、9.8mM、9.9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM、10.5mM、10.6mM、10.7mM、10.8mM、10.9mM、11mM、11.1mM、11.2mM、11.3mM、11.4mM、11.5mM、11.6mM、11.7mM、11.8mM、11.9mM、12mM、12.1mM、12.2mM、12.3mM、12.4mM、12.5mM、12.6mM、12.7mM、12.8mM、12.9mM、13mM、13.1mM、13.2mM、13.3mM、13.4mM、13.5mM、13.6mM、13.7mM、13.8mM、13.9mM、14mM、14.1mM、14.2mM、14.3mM、14.4mM、14.5mM、14.6mM、14.7mM、14.8mM、14.9mM或15mM。
所述制剂包含的Tris范围可以为0-0.5mM、0.1-0.6mM、0.2-0.7mM、0.3-0.8mM、0.4-0.9mM、0.5-1mM、0.6-1.1mM、0.7-1.2mM、0.8-1.3mM、0.9-1.4mM、1-1.5mM、1.1-1.6mM、1.2-1.7mM、1.3-1.8mM、1.4-1.9mM、1.5-2mM、1.6-2.1mM、1.7-2.2mM、1.8-2.3mM、1.9-2.4mM、2-2.5mM、2.1-2.6mM、2.2-2.7mM、2.3-2.8mM、2.4-2.9mM、2.5-3mM、2.6-3.1mM、2.7-3.2mM、2.8-3.3mM、2.9-3.4mM、3-3.5mM、3.1-3.6mM、3.2-3.7mM、3.3-3.8mM、3.4-3.9mM、3.5-4mM、3.6-4.1mM、3.7-4.2mM、3.8-4.3mM、3.9-4.4mM、4-4.5mM、4.1-4.6mM、4.2-4.7mM、4.3-4.8mM、4.4-4.9mM、4.5-5mM、4.6-5.1mM、4.7-5.2mM、4.8-5.3mM、4.9-5.4mM、5-5.5mM、5.1-5.6mM、5.2-5.7mM、5.3-5.8mM、5.4-5.9mM、5.5-6mM、5.6-6.1mM、5.7-6.2mM、5.8-6.3mM、5.9-6.4mM、6-6.5mM、6.1-6.6mM、6.2-6.7mM、6.3-6.8mM、6.4-6.9mM、6.5-7mM、6.6-7.1mM、6.7-7.2mM、6.8-7.3mM、6.9-7.4mM、7-7.5mM、7.1-7.6mM、7.2-7.7mM、7.3-7.8mM、7.4-7.9mM、7.5-8mM、7.6-8.1mM、7.7-8.2mM、7.8-8.3mM、7.9-8.4mM、8-8.5mM、8.1-8.6mM、8.2-8.7mM、8.3-8.8mM、8.4-8.9mM、8.5-9mM、8.6-9.1mM、8.7-9.2mM、8.8-9.3mM、8.9-9.4mM、9-9.5mM、9.1-9.6mM、9.2-9.7mM、9.3-9.8mM、9.4-9.9mM、9.5-10mM、9.6-10.1mM、9.7-10.2mM、9.8-10.3mM、9.9-10.4mM、10-10.5mM、10.1-10.6mM、10.2-10.7mM、10.3-10.8mM、10.4-10.9mM、10.5-11mM、10.6-11.1mM、10.7-11.2mM、10.8-11.3mM、10.9-11.4mM、11-11.5mM、11.1-11.6mM、11.2-11.7mM、11.3-11.8mM、11.4-11.9mM、11.5-12mM、11.6-12.1mM、11.7-12.2mM、11.8-12.3mM、11.9-12.4mM、12-12.5mM、12.1-12.6mM、12.2-12.7mM、12.3-12.8mM、12.4-12.9mM、12.5-13mM、12.6-13.1mM、12.7-13.2mM、12.8-13.3mM、12.9-13.4mM、13-13.5mM、13.1-13.6mM、13.2-13.7mM、13.3-13.8mM、13.4-13.9mM、13.5-14mM、13.6-14.1mM、13.7-14.2mM、13.8-14.3mM、13.9-14.4mM、14-14.5mM、14.1-14.6mM、14.2-14.7mM、14.3-14.8mM、14.4-14.9mM、14.5-15mM、0-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-11mM、11-12mM、12-13mM、13-14mM、14-15mM、15-16mM、0-2mM、1-3mM、2-4mM、3-5mM、4-6mM、5-7mM、6-8mM、7-9mM、8-10mM、9-11mM、10-12mM、11-13mM、12-14mM、13-15mM、0-3mM、1-4mM、2-5mM、3-6mM、4-7mM、5-8mM、6-9mM、7-10mM、8-11mM、9-12mM、10-13mM、11-14mM、12-15mM、0-4mM、1-5mM、2-6mM、3-7mM、4-8mM、5-9mM、6-10mM、7-11mM、8-12mM、9-13mM、10-14mM、11-15mM、0-5mM、1-6mM、2-7mM、3-8mM、4-9mM、5-10mM、6-11mM、7-12mM、8-13mM、9-14mM、10-15mM、0-6mM、1-7mM、2-8mM、3-9mM、4-10mM、5-11mM、6-12mM、7-13mM、8-14mM、9-15mM、0-7mM、1-8mM、2-9mM、3-10mM、4-11mM、5-12mM、6-13mM、7-14mM、8-15mM、0-8mM、1-9mM、2-10mM、3-11mM、4-12mM、5-13mM、6-14mM、7-15mM、0-9mM、1-10mM、2-11mM、3-12mM、4-13mM、5-14mM、6-15mM、0-10mM、1-11mM、2-12mM、3-13mM、4-14mM、5-15mM、0-11mM、1-12mM、2-13mM、3-14mM、4-15mM、0-12mM、1-13mM、2-14mM、3-15mM、0-13mM、1-14mM、2-15mM、0-14mM、1-15mM或0-15mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10mM的Tris。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-12mM的Tris。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM的Tris。
组氨酸
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是组氨酸。
在某些实施方案中，组氨酸在制剂中的浓度可以是但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM、5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM、6.5mM、6.6mM、6.7mM、6.8mM、6.9mM、7mM、7.1mM、7.2mM、7.3mM、7.4mM、7.5mM、7.6mM、7.7mM、7.8mM、7.9mM、8mM、8.1mM、8.2mM、8.3mM、8.4mM、8.5mM、8.6mM、8.7mM、8.8mM、8.9mM、9mM、9.1mM、9.2mM、9.3mM、9.4mM、9.5mM、9.6mM、9.7mM、9.8mM、9.9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM、10.5mM、10.6mM、10.7mM、10.8mM、10.9mM、11mM、11.1mM、11.2mM、11.3mM、11.4mM、11.5mM、11.6mM、11.7mM、11.8mM、11.9mM、12mM、12.1mM、12.2mM、12.3mM、12.4mM、12.5mM、12.6mM、12.7mM、12.8mM、12.9mM、13mM、13.1mM、13.2mM、13.3mM、13.4mM、13.5mM、13.6mM、13.7mM、13.8mM、13.9mM、14mM、14.1mM、14.2mM、14.3mM、14.4mM、14.5mM、14.6mM、14.7mM、14.8mM、14.9mM或15mM。
所述制剂包含的组氨酸范围可以为0-0.5mM、0.1-0.6mM、0.2-0.7mM、0.3-0.8mM、0.4-0.9mM、0.5-1mM、0.6-1.1mM、0.7-1.2mM、0.8-1.3mM、0.9-1.4mM、1-1.5mM、1.1-1.6mM、1.2-1.7mM、1.3-1.8mM、1.4-1.9mM、1.5-2mM、1.6-2.1mM、1.7-2.2mM、1.8-2.3mM、1.9-2.4mM、2-2.5mM、2.1-2.6mM、2.2-2.7mM、2.3-2.8mM、2.4-2.9mM、2.5-3mM、2.6-3.1mM、2.7-3.2mM、2.8-3.3mM、2.9-3.4mM、3-3.5mM、3.1-3.6mM、3.2-3.7mM、3.3-3.8mM、3.4-3.9mM、3.5-4mM、3.6-4.1mM、3.7-4.2mM、3.8-4.3mM、3.9-4.4mM、4-4.5mM、4.1-4.6mM、4.2-4.7mM、4.3-4.8mM、4.4-4.9mM、4.5-5mM、4.6-5.1mM、4.7-5.2mM、4.8-5.3mM、4.9-5.4mM、5-5.5mM、5.1-5.6mM、5.2-5.7mM、5.3-5.8mM、5.4-5.9mM、5.5-6mM、5.6-6.1mM、5.7-6.2mM、5.8-6.3mM、5.9-6.4mM、6-6.5mM、6.1-6.6mM、6.2-6.7mM、6.3-6.8mM、6.4-6.9mM、6.5-7mM、6.6-7.1mM、6.7-7.2mM、6.8-7.3mM、6.9-7.4mM、7-7.5mM、7.1-7.6mM、7.2-7.7mM、7.3-7.8mM、7.4-7.9mM、7.5-8mM、7.6-8.1mM、7.7-8.2mM、7.8-8.3mM、7.9-8.4mM、8-8.5mM、8.1-8.6mM、8.2-8.7mM、8.3-8.8mM、8.4-8.9mM、8.5-9mM、8.6-9.1mM、8.7-9.2mM、8.8-9.3mM、8.9-9.4mM、9-9.5mM、9.1-9.6mM、9.2-9.7mM、9.3-9.8mM、9.4-9.9mM、9.5-10mM、9.6-10.1mM、9.7-10.2mM、9.8-10.3mM、9.9-10.4mM、10-10.5mM、10.1-10.6mM、10.2-10.7mM、10.3-10.8mM、10.4-10.9mM、10.5-11mM、10.6-11.1mM、10.7-11.2mM、10.8-11.3mM、10.9-11.4mM、11-11.5mM、11.1-11.6mM、11.2-11.7mM、11.3-11.8mM、11.4-11.9mM、11.5-12mM、11.6-12.1mM、11.7-12.2mM、11.8-12.3mM、11.9-12.4mM、12-12.5mM、12.1-12.6mM、12.2-12.7mM、12.3-12.8mM、12.4-12.9mM、12.5-13mM、12.6-13.1mM、12.7-13.2mM、12.8-13.3mM、12.9-13.4mM、13-13.5mM、13.1-13.6mM、13.2-13.7mM、13.3-13.8mM、13.4-13.9mM、13.5-14mM、13.6-14.1mM、13.7-14.2mM、13.8-14.3mM、13.9-14.4mM、14-14.5mM、14.1-14.6mM、14.2-14.7mM、14.3-14.8mM、14.4-14.9mM、14.5-15mM、0-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-11mM、11-12mM、12-13mM、13-14mM、14-15mM、15-16mM、0-2mM、1-3mM、2-4mM、3-5mM、4-6mM、5-7mM、6-8mM、7-9mM、8-10mM、9-11mM、10-12mM、11-13mM、12-14mM、13-15mM、0-3mM、1-4mM、2-5mM、3-6mM、4-7mM、5-8mM、6-9mM、7-10mM、8-11mM、9-12mM、10-13mM、11-14mM、12-15mM、0-4mM、1-5mM、2-6mM、3-7mM、4-8mM、5-9mM、6-10mM、7-11mM、8-12mM、9-13mM、10-14mM、11-15mM、0-5mM、1-6mM、2-7mM、3-8mM、4-9mM、5-10mM、6-11mM、7-12mM、8-13mM、9-14mM、10-15mM、0-6mM、1-7mM、2-8mM、3-9mM、4-10mM、5-11mM、6-12mM、7-13mM、8-14mM、9-15mM、0-7mM、1-8mM、2-9mM、3-10mM、4-11mM、5-12mM、6-13mM、7-14mM、8-15mM、0-8mM、1-9mM、2-10mM、3-11mM、4-12mM、5-13mM、6-14mM、7-15mM、0-9mM、1-10mM、2-11mM、3-12mM、4-13mM、5-14mM、6-15mM、0-10mM、1-11mM、2-12mM、3-13mM、4-14mM、5-15mM、0-11mM、1-12mM、2-13mM、3-14mM、4-15mM、0-12mM、1-13mM、2-14mM、3-15mM、0-13mM、1-14mM、2-15mM、0-14mM、1-15mM或0-15mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10mM的组氨酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2-12mM的组氨酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM的组氨酸。
精氨酸
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是精氨酸。
在某些实施方案中，精氨酸的浓度可以是但不限于1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM、60mM、61mM、62mM、63mM、64mM、65mM、66mM、67mM、68mM、69mM、70mM、71mM、72mM、73mM、74mM、75mM、76mM、77mM、78mM、79mM、80mM、81mM、82mM、83mM、84mM、85mM、86mM、87mM、88mM、89mM、90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM或100mM。
所述制剂包含的精氨酸范围可以为0-5mM、1-5mM、2-5mM、3-5mM、4-5mM、0-10mM、1-10mM、2-10mM、3-10mM、4-10mM、5-10mM、6-10mM、7-10mM、8-10mM、9-10mM、0-25mM、1-25mM、2-25mM、3-25mM、4-25mM、5-25mM、6-25mM、7-25mM、8-25mM、9-25mM、10-25mM、11-25mM、12-25mM、13-25mM、14-25mM、15-25mM、16-25mM、17-25mM、18-25mM、19-25mM、20-25mM、21-25mM、22-25mM、23-25mM、24-25mM、0-50mM、1-50mM、2-50mM、3-50mM、4-50mM、5-50mM、6-50mM、7-50mM、8-50mM、9-50mM、10-50mM、11-50mM、12-50mM、13-50mM、14-50mM、15-50mM、16-50mM、17-50mM、18-50mM、19-50mM、20-50mM、21-50mM、22-50mM、23-50mM、24-50mM、25-50mM、26-50mM、27-50mM、28-50mM、29-50mM、30-50mM、31-50mM、32-50mM、33-50mM、34-50mM、35-50mM、36-50mM、37-50mM、38-50mM、39-50mM、40-50mM、41-50mM、42-50mM、43-50mM、44-50mM、45-50mM、46-50mM、47-50mM、48-50mM、49-50mM、0-75mM、1-75mM、2-75mM、3-75mM、4-75mM、5-75mM、6-75mM、7-75mM、8-75mM、9-75mM、10-75mM、11-75mM、12-75mM、13-75mM、14-75mM、15-75mM、16-75mM、17-75mM、18-75mM、19-75mM、20-75mM、21-75mM、22-75mM、23-75mM、24-75mM、25-75mM、26-75mM、27-75mM、28-75mM、29-75mM、30-75mM、31-75mM、32-75mM、33-75mM、34-75mM、35-75mM、36-75mM、37-75mM、38-75mM、39-75mM、40-75mM、41-75mM、42-75mM、43-75mM、44-75mM、45-75mM、46-75mM、47-75mM、48-75mM、49-75mM、50-75mM、51-75mM、52-75mM、53-75mM、54-75mM、55-75mM、56-75mM、57-75mM、58-75mM、59-75mM、60-75mM、61-75mM、62-75mM、63-75mM、64-75mM、65-75mM、66-75mM、67-75mM、68-75mM、69-75mM、70-75mM、71-75mM、72-75mM、73-75mM、74-75mM、50-100mM、60-100mM、75-100mM、80-100mM或90-100mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-75mM的精氨酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含50-100mM的精氨酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含75mM的精氨酸。
盐酸
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是盐酸。
在某些实施方案中，制剂中盐酸的浓度可以是但不限于0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM、5mM、5.1mM、5.2mM、5.3mM、5.4mM、5.5mM、5.6mM、5.7mM、5.8mM、5.9mM、6mM、6.1mM、6.2mM、6.3mM、6.4mM、6.5mM、6.6mM、6.7mM、6.8mM、6.9mM、7mM、7.1mM、7.2mM、7.3mM、7.4mM、7.5mM、7.6mM、7.7mM、7.8mM、7.9mM、8mM、8.1mM、8.2mM、8.3mM、8.4mM、8.5mM、8.6mM、8.7mM、8.8mM、8.9mM、9mM、9.1mM、9.2mM、9.3mM、9.4mM、9.5mM、9.6mM、9.7mM、9.8mM、9.9mM、10mM、10.1mM、10.2mM、10.3mM、10.4mM、10.5mM、10.6mM、10.7mM、10.8mM、10.9mM、11mM、11.1mM、11.2mM、11.3mM、11.4mM、11.5mM、11.6mM、11.7mM、11.8mM、11.9mM、12mM、12.1mM、12.2mM、12.3mM、12.4mM、12.5mM、12.6mM、12.7mM、12.8mM、12.9mM、13mM、13.1mM、13.2mM、13.3mM、13.4mM、13.5mM、13.6mM、13.7mM、13.8mM、13.9mM、14mM、14.1mM、14.2mM、14.3mM、14.4mM、14.5mM、14.6mM、14.7mM、14.8mM、14.9mM或15mM。
所述制剂包含的盐酸范围可以为0-0.5mM、0.1-0.6mM、0.2-0.7mM、0.3-0.8mM、0.4-0.9mM、0.5-1mM、0.6-1.1mM、0.7-1.2mM、0.8-1.3mM、0.9-1.4mM、1-1.5mM、1.1-1.6mM、1.2-1.7mM、1.3-1.8mM、1.4-1.9mM、1.5-2mM、1.6-2.1mM、1.7-2.2mM、1.8-2.3mM、1.9-2.4mM、2-2.5mM、2.1-2.6mM、2.2-2.7mM、2.3-2.8mM、2.4-2.9mM、2.5-3mM、2.6-3.1mM、2.7-3.2mM、2.8-3.3mM、2.9-3.4mM、3-3.5mM、3.1-3.6mM、3.2-3.7mM、3.3-3.8mM、3.4-3.9mM、3.5-4mM、3.6-4.1mM、3.7-4.2mM、3.8-4.3mM、3.9-4.4mM、4-4.5mM、4.1-4.6mM、4.2-4.7mM、4.3-4.8mM、4.4-4.9mM、4.5-5mM、4.6-5.1mM、4.7-5.2mM、4.8-5.3mM、4.9-5.4mM、5-5.5mM、5.1-5.6mM、5.2-5.7mM、5.3-5.8mM、5.4-5.9mM、5.5-6mM、5.6-6.1mM、5.7-6.2mM、5.8-6.3mM、5.9-6.4mM、6-6.5mM、6.1-6.6mM、6.2-6.7mM、6.3-6.8mM、6.4-6.9mM、6.5-7mM、6.6-7.1mM、6.7-7.2mM、6.8-7.3mM、6.9-7.4mM、7-7.5mM、7.1-7.6mM、7.2-7.7mM、7.3-7.8mM、7.4-7.9mM、7.5-8mM、7.6-8.1mM、7.7-8.2mM、7.8-8.3mM、7.9-8.4mM、8-8.5mM、8.1-8.6mM、8.2-8.7mM、8.3-8.8mM、8.4-8.9mM、8.5-9mM、8.6-9.1mM、8.7-9.2mM、8.8-9.3mM、8.9-9.4mM、9-9.5mM、9.1-9.6mM、9.2-9.7mM、9.3-9.8mM、9.4-9.9mM、9.5-10mM、9.6-10.1mM、9.7-10.2mM、9.8-10.3mM、9.9-10.4mM、10-10.5mM、10.1-10.6mM、10.2-10.7mM、10.3-10.8mM、10.4-10.9mM、10.5-11mM、10.6-11.1mM、10.7-11.2mM、10.8-11.3mM、10.9-11.4mM、11-11.5mM、11.1-11.6mM、11.2-11.7mM、11.3-11.8mM、11.4-11.9mM、11.5-12mM、11.6-12.1mM、11.7-12.2mM、11.8-12.3mM、11.9-12.4mM、12-12.5mM、12.1-12.6mM、12.2-12.7mM、12.3-12.8mM、12.4-12.9mM、12.5-13mM、12.6-13.1mM、12.7-13.2mM、12.8-13.3mM、12.9-13.4mM、13-13.5mM、13.1-13.6mM、13.2-13.7mM、13.3-13.8mM、13.4-13.9mM、13.5-14mM、13.6-14.1mM、13.7-14.2mM、13.8-14.3mM、13.9-14.4mM、14-14.5mM、14.1-14.6mM、14.2-14.7mM、14.3-14.8mM、14.4-14.9mM、14.5-15mM、0-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-11mM、11-12mM、12-13mM、13-14mM、14-15mM、15-16mM、0-2mM、1-3mM、2-4mM、3-5mM、4-6mM、5-7mM、6-8mM、7-9mM、8-10mM、9-11mM、10-12mM、11-13mM、12-14mM、13-15mM、0-3mM、1-4mM、2-5mM、3-6mM、4-7mM、5-8mM、6-9mM、7-10mM、8-11mM、9-12mM、10-13mM、11-14mM、12-15mM、0-4mM、1-5mM、2-6mM、3-7mM、4-8mM、5-9mM、6-10mM、7-11mM、8-12mM、9-13mM、10-14mM、11-15mM、0-5mM、1-6mM、2-7mM、3-8mM、4-9mM、5-10mM、6-11mM、7-12mM、8-13mM、9-14mM、10-15mM、0-6mM、1-7mM、2-8mM、3-9mM、4-10mM、5-11mM、6-12mM、7-13mM、8-14mM、9-15mM、0-7mM、1-8mM、2-9mM、3-10mM、4-11mM、5-12mM、6-13mM、7-14mM、8-15mM、0-8mM、1-9mM、2-10mM、3-11mM、4-12mM、5-13mM、6-14mM、7-15mM、0-9mM、1-10mM、2-11mM、3-12mM、4-13mM、5-14mM、6-15mM、0-10mM、1-11mM、2-12mM、3-13mM、4-14mM、5-15mM、0-11mM、1-12mM、2-13mM、3-14mM、4-15mM、0-12mM、1-13mM、2-14mM、3-15mM、0-13mM、1-14mM、2-15mM、0-14mM、1-15mM或0-15mM。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10mM的盐酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6.2-6.3mM的盐酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含8.9-9mM的盐酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6.2mM的盐酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6.3mM的盐酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含8.9mM的盐酸。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含9mM的盐酸。
糖
在某些实施方案中，所述制剂可以包含至少一种糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含至少一种糖和/或糖替代物以增加制剂的稳定性。稳定性的增加可以提供过程汇聚物的更长保持时间，提供更长的“贮存期限”，增加溶液中AAV颗粒的浓度(例如，制剂能够具有更高的AAV颗粒浓度，而不会出现rAAV从溶液脱离)和/或减少制剂中聚集的产生或形成。在某些实施方案中，与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，制剂中包含至少一种糖和/或糖替代物可以使制剂的稳定性增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在某些实施方案中，糖和/或糖替代物与磷酸盐缓冲液组合使用以增加稳定性。与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，糖和/或糖替代物与磷酸盐缓冲液的组合可将稳定性增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，糖是蔗糖。作为另一个非限制性实例，糖是海藻糖。作为另一个非限制性实例，糖替代物是山梨醇。
在某些实施方案中，与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，制剂的保持时间可以增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在某些实施方案中，与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，制剂的贮存期限可以增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。贮存期限可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时，或1、2、3、4个星期或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月，或1、2、3、4、5、6、7或大于7年。
在某些实施方案中，与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，制剂中的AAV颗粒的浓度可以增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在某些实施方案中，由于添加糖和/或糖替代物，与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，制剂中聚集体的形成或产生可减少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在某些实施方案中，由于添加糖和/或糖替代物，通过本领域已知的方法(例如，通过DLS测量)确定的并且与没有糖和/或糖替代物的相同制剂相比，聚集体的形成或产生可为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、1-5％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，通过向制剂中添加至少一种糖和/或糖替代物，制剂的聚集可小于2％。可以通过本领域已知的方法除去其他聚集体。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含以下量的糖和/或糖替代物：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％或10％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含糖和/或糖替代物，其范围为0-1％、0.1-1％、0.2-1％、0.3-1％、0.4-1％、0.5-1％、0.6-1％、0.7-1％、0.8-1％、0.9-1％、0-1.5％、0.1-1.5％、0.2-1.5％、0.3-1.5％、0.4-1.5％、0.5-1.5％、0.6-1.5％、0.7-1.5％、0.8-1.5％、0.9-1.5％、1-1.5％、1.1-1.5％、1.2-1.5％、1.3-1.5％、1.4-1.5％、0-2％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％、0.6-2％、0.7-2％、0.8-2％、0.9-2％、1-2％、1.1-2％、1.2-2％、1.3-2％、1.4-2％、1.5-2％、1.6-2％、1.7-2％、1.8-2％、1.9-2％、0-2.5％、0.1-2.5％、0.2-2.5％、0.3-2.5％、0.4-2.5％、0.5-2.5％、0.6-2.5％、0.7-2.5％、0.8-2.5％、0.9-2.5％、1-2.5％、1.1-2.5％、1.2-2.5％、1.3-2.5％、1.4-2.5％、1.5-2.5％、1.6-2.5％、1.7-2.5％、1.8-2.5％、1.9-2.5％、2-2.5％、2.1-2.5％、2.2-2.5％、2.3-2.5％、2.4-2.5％、0-3％、0.1-3％、0.2-3％、0.3-3％、0.4-3％、0.5-3％、0.6-3％、0.7-3％、0.8-3％、0.9-3％、1-3％、1.1-3％、1.2-3％、1.3-3％、1.4-3％、1.5-3％、1.6-3％、1.7-3％、1.8-3％、1.9-3％、2-3％、2.1-3％、2.2-3％、2.3-3％、2.4-3％、2.5-3％、2.6-3％、2.7-3％、2.8-3％、2.9-3％、0-3.5％、0.1-3.5％、0.2-3.5％、0.3-3.5％、0.4-3.5％、0.5-3.5％、0.6-3.5％、0.7-3.5％、0.8-3.5％、0.9-3.5％、1-3.5％、1.1-3.5％、1.2-3.5％、1.3-3.5％、1.4-3.5％、1.5-3.5％、1.6-3.5％、1.7-3.5％、1.8-3.5％、1.9-3.5％、2-3.5％、2.1-3.5％、2.2-3.5％、2.3-3.5％、2.4-3.5％、2.5-3.5％、2.6-3.5％、2.7-3.5％、2.8-3.5％、2.9-3.5％、3-3.5％、3.1-3.5％、3.2-3.5％、3.3-3.5％、3.4-3.5％、0-4％、0.1-4％、0.2-4％、0.3-4％、0.4-4％、0.5-4％、0.6-4％、0.7-4％、0.8-4％、0.9-4％、1-4％、1.1-4％、1.2-4％、1.3-4％、1.4-4％、1.5-4％、1.6-4％、1.7-4％、1.8-4％、1.9-4％、2-4％、2.1-4％、2.2-4％、2.3-4％、2.4-4％、2.5-4％、2.6-4％、2.7-4％、2.8-4％、2.9-4％、3-4％、3.1-4％、3.2-4％、3.3-4％、3.4-4％、3.5-4％、3.6-4％、3.7-4％、3.8-4％、3.9-4％、0-4.5％、0.1-4.5％、0.2-4.5％、0.3-4.5％、0.4-4.5％、0.5-4.5％、0.6-4.5％、0.7-4.5％、0.8-4.5％、0.9-4.5％、1-4.5％、1.1-4.5％、1.2-4.5％、1.3-4.5％、1.4-4.5％、1.5-4.5％、1.6-4.5％、1.7-4.5％、1.8-4.5％、1.9-4.5％、2-4.5％、2.1-4.5％、2.2-4.5％、2.3-4.5％、2.4-4.5％、2.5-4.5％、2.6-4.5％、2.7-4.5％、2.8-4.5％、2.9-4.5％、3-4.5％、3.1-4.5％、3.2-4.5％、3.3-4.5％、3.4-4.5％、3.5-4.5％、3.6-4.5％、3.7-4.5％、3.8-4.5％、3.9-4.5％、4-4.5％、4.1-4.5％、4.2-4.5％、4.3-4.5％、4.4-4.5％、0-5％、0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.4-5％、0.5-5％、0.6-5％、0.7-5％、0.8-5％、0.9-5％、1-5％、1.1-5％、1.2-5％、1.3-5％、1.4-5％、1.5-5％、1.6-5％、1.7-5％、1.8-5％、1.9-5％、2-5％、2.1-5％、2.2-5％、2.3-5％、2.4-5％、2.5-5％、2.6-5％、2.7-5％、2.8-5％、2.9-5％、3-5％、3.1-5％、3.2-5％、3.3-5％、3.4-5％、3.5-5％、3.6-5％、3.7-5％、3.8-5％、3.9-5％、4-5％、4.1-5％、4.2-5％、4.3-5％、4.4-5％、4.5-5％、4.6-5％、4.7-5％、4.8-5％、4.9-5％、0-5.5％、0.1-5.5％、0.2-5.5％、0.3-5.5％、0.4-5.5％、0.5-5.5％、0.6-5.5％、0.7-5.5％、0.8-5.5％、0.9-5.5％、1-5.5％、1.1-5.5％、1.2-5.5％、1.3-5.5％、1.4-5.5％、1.5-5.5％、1.6-5.5％、1.7-5.5％、1.8-5.5％、1.9-5.5％、2-5.5％、2.1-5.5％、2.2-5.5％、2.3-5.5％、2.4-5.5％、2.5-5.5％、2.6-5.5％、2.7-5.5％、2.8-5.5％、2.9-5.5％、3-5.5％、3.1-5.5％、3.2-5.5％、3.3-5.5％、3.4-5.5％、3.5-5.5％、3.6-5.5％、3.7-5.5％、3.8-5.5％、3.9-5.5％、4-5.5％、4.1-5.5％、4.2-5.5％、4.3-5.5％、4.4-5.5％、4.5-5.5％、4.6-5.5％、4.7-5.5％、4.8-5.5％、4.9-5.5％、5-5.5％、5.1-5.5％、5.2-5.5％、5.3-5.5％、5.4-5.5％、0-6％、0.1-6％、0.2-6％、0.3-6％、0.4-6％、0.5-6％、0.6-6％、0.7-6％、0.8-6％、0.9-6％、1-6％、1.1-6％、1.2-6％、1.3-6％、1.4-6％、1.5-6％、1.6-6％、1.7-6％、1.8-6％、1.9-6％、2-6％、2.1-6％、2.2-6％、2.3-6％、2.4-6％、2.5-6％、2.6-6％、2.7-6％、2.8-6％、2.9-6％、3-6％、3.1-6％、3.2-6％、3.3-6％、3.4-6％、3.5-6％、3.6-6％、3.7-6％、3.8-6％、3.9-6％、4-6％、4.1-6％、4.2-6％、4.3-6％、4.4-6％、4.5-6％、4.6-6％、4.7-6％、4.8-6％、4.9-6％、5-6％、5.1-6％、5.2-6％、5.3-6％、5.4-6％、5.5-6％、5.6-6％、5.7-6％、5.8-6％、5.9-6％、0-6.5％、0.1-6.5％、0.2-6.5％、0.3-6.5％、0.4-6.5％、0.5-6.5％、0.6-6.5％、0.7-6.5％、0.8-6.5％、0.9-6.5％、1-6.5％、1.1-6.5％、1.2-6.5％、1.3-6.5％、1.4-6.5％、1.5-6.5％、1.6-6.5％、1.7-6.5％、1.8-6.5％、1.9-6.5％、2-6.5％、2.1-6.5％、2.2-6.5％、2.3-6.5％、2.4-6.5％、2.5-6.5％、2.6-6.5％、2.7-6.5％、2.8-6.5％、2.9-6.5％、3-6.5％、3.1-6.5％、3.2-6.5％、3.3-6.5％、3.4-6.5％、3.5-6.5％、3.6-6.5％、3.7-6.5％、3.8-6.5％、3.9-6.5％、4-6.5％、4.1-6.5％、4.2-6.5％、4.3-6.5％、4.4-6.5％、4.5-6.5％、4.6-6.5％、4.7-6.5％、4.8-6.5％、4.9-6.5％、5-6.5％、5.1-6.5％、5.2-6.5％、5.3-6.5％、5.4-6.5％、5.5-6.5％、5.6-6.5％、5.7-6.5％、5.8-6.5％、5.9-6.5％、6-6.5％、6.1-6.5％、6.2-6.5％、6.3-6.5％、6.4-6.5％、0-7％、0.1-7％、0.2-7％、0.3-7％、0.4-7％、0.5-7％、0.6-7％、0.7-7％、0.8-7％、0.9-7％、1-7％、1.1-7％、1.2-7％、1.3-7％、1.4-7％、1.5-7％、1.6-7％、1.7-7％、1.8-7％、1.9-7％、2-7％、2.1-7％、2.2-7％、2.3-7％、2.4-7％、2.5-7％、2.6-7％、2.7-7％、2.8-7％、2.9-7％、3-7％、3.1-7％、3.2-7％、3.3-7％、3.4-7％、3.5-7％、3.6-7％、3.7-7％、3.8-7％、3.9-7％、4-7％、4.1-7％、4.2-7％、4.3-7％、4.4-7％、4.5-7％、4.6-7％、4.7-7％、4.8-7％、4.9-7％、5-7％、5.1-7％、5.2-7％、5.3-7％、5.4-7％、5.5-7％、5.6-7％、5.7-7％、5.8-7％、5.9-7％、6-7％、6.1-7％、6.2-7％、6.3-7％、6.4-7％、6.5-7％、6.6-7％、6.7-7％、6.8-7％、6.9-7％、0-7.5％、0.1-7.5％、0.2-7.5％、0.3-7.5％、0.4-7.5％、0.5-7.5％、0.6-7.5％、0.7-7.5％、0.8-7.5％、0.9-7.5％、1-7.5％、1.1-7.5％、1.2-7.5％、1.3-7.5％、1.4-7.5％、1.5-7.5％、1.6-7.5％、1.7-7.5％、1.8-7.5％、1.9-7.5％、2-7.5％、2.1-7.5％、2.2-7.5％、2.3-7.5％、2.4-7.5％、2.5-7.5％、2.6-7.5％、2.7-7.5％、2.8-7.5％、2.9-7.5％、3-7.5％、3.1-7.5％、3.2-7.5％、3.3-7.5％、3.4-7.5％、3.5-7.5％、3.6-7.5％、3.7-7.5％、3.8-7.5％、3.9-7.5％、4-7.5％、4.1-7.5％、4.2-7.5％、4.3-7.5％、4.4-7.5％、4.5-7.5％、4.6-7.5％、4.7-7.5％、4.8-7.5％、4.9-7.5％、5-7.5％、5.1-7.5％、5.2-7.5％、5.3-7.5％、5.4-7.5％、5.5-7.5％、5.6-7.5％、5.7-7.5％、5.8-7.5％、5.9-7.5％、6-7.5％、6.1-7.5％、6.2-7.5％、6.3-7.5％、6.4-7.5％、6.5-7.5％、6.6-7.5％、6.7-7.5％、6.8-7.5％、6.9-7.5％、7-7.5％、7.1-7.5％、7.2-7.5％、7.3-7.5％、7.4-7.5％、0-8％、0.1-8％、0.2-8％、0.3-8％、0.4-8％、0.5-8％、0.6-8％、0.7-8％、0.8-8％、0.9-8％、1-8％、1.1-8％、1.2-8％、1.3-8％、1.4-8％、1.5-8％、1.6-8％、1.7-8％、1.8-8％、1.9-8％、2-8％、2.1-8％、2.2-8％、2.3-8％、2.4-8％、2.5-8％、2.6-8％、2.7-8％、2.8-8％、2.9-8％、3-8％、3.1-8％、3.2-8％、3.3-8％、3.4-8％、3.5-8％、3.6-8％、3.7-8％、3.8-8％、3.9-8％、4-8％、4.1-8％、4.2-8％、4.3-8％、4.4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在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-9％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含3％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含4％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含5％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含7％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含8％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含9％w/v的糖和/或糖替代物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10％w/v的糖和/或糖替代物。
在一些实施方案中，本文描述的药物组合物的制剂可包含二糖。可以在本文所述的制剂中使用的合适的二糖可以包括蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芸香酮糖和木二糖。制剂中使用的二糖的浓度(w/v)可以为1％-15％，例如1％-5％、3％-6％、5％-8％、7％-10％或10％-15％。
在一些实施方案中，本文描述的药物组合物的制剂可包含糖醇。作为非限制性实例，可以在本文所述的制剂中使用的糖醇可包括山梨醇。制剂中使用的糖醇的浓度(w/v)可以为1％-15％，例如1％-5％、3％-6％、5％-8％、7％-10％或10％-15％。
蔗糖
在某些实施方案中，制剂可包含至少一种糖，其为二糖，例如但不限于蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含以下量的蔗糖：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％或10％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含蔗糖，其范围为0-1％、0.1-1％、0.2-1％、0.3-1％、0.4-1％、0.5-1％、0.6-1％、0.7-1％、0.8-1％、0.9-1％、0-1.5％、0.1-1.5％、0.2-1.5％、0.3-1.5％、0.4-1.5％、0.5-1.5％、0.6-1.5％、0.7-1.5％、0.8-1.5％、0.9-1.5％、1-1.5％、1.1-1.5％、1.2-1.5％、1.3-1.5％、1.4-1.5％、0-2％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％、0.6-2％、0.7-2％、0.8-2％、0.9-2％、1-2％、1.1-2％、1.2-2％、1.3-2％、1.4-2％、1.5-2％、1.6-2％、1.7-2％、1.8-2％、1.9-2％、0-2.5％、0.1-2.5％、0.2-2.5％、0.3-2.5％、0.4-2.5％、0.5-2.5％、0.6-2.5％、0.7-2.5％、0.8-2.5％、0.9-2.5％、1-2.5％、1.1-2.5％、1.2-2.5％、1.3-2.5％、1.4-2.5％、1.5-2.5％、1.6-2.5％、1.7-2.5％、1.8-2.5％、1.9-2.5％、2-2.5％、2.1-2.5％、2.2-2.5％、2.3-2.5％、2.4-2.5％、0-3％、0.1-3％、0.2-3％、0.3-3％、0.4-3％、0.5-3％、0.6-3％、0.7-3％、0.8-3％、0.9-3％、1-3％、1.1-3％、1.2-3％、1.3-3％、1.4-3％、1.5-3％、1.6-3％、1.7-3％、1.8-3％、1.9-3％、2-3％、2.1-3％、2.2-3％、2.3-3％、2.4-3％、2.5-3％、2.6-3％、2.7-3％、2.8-3％、2.9-3％、0-3.5％、0.1-3.5％、0.2-3.5％、0.3-3.5％、0.4-3.5％、0.5-3.5％、0.6-3.5％、0.7-3.5％、0.8-3.5％、0.9-3.5％、1-3.5％、1.1-3.5％、1.2-3.5％、1.3-3.5％、1.4-3.5％、1.5-3.5％、1.6-3.5％、1.7-3.5％、1.8-3.5％、1.9-3.5％、2-3.5％、2.1-3.5％、2.2-3.5％、2.3-3.5％、2.4-3.5％、2.5-3.5％、2.6-3.5％、2.7-3.5％、2.8-3.5％、2.9-3.5％、3-3.5％、3.1-3.5％、3.2-3.5％、3.3-3.5％、3.4-3.5％、0-4％、0.1-4％、0.2-4％、0.3-4％、0.4-4％、0.5-4％、0.6-4％、0.7-4％、0.8-4％、0.9-4％、1-4％、1.1-4％、1.2-4％、1.3-4％、1.4-4％、1.5-4％、1.6-4％、1.7-4％、1.8-4％、1.9-4％、2-4％、2.1-4％、2.2-4％、2.3-4％、2.4-4％、2.5-4％、2.6-4％、2.7-4％、2.8-4％、2.9-4％、3-4％、3.1-4％、3.2-4％、3.3-4％、3.4-4％、3.5-4％、3.6-4％、3.7-4％、3.8-4％、3.9-4％、0-4.5％、0.1-4.5％、0.2-4.5％、0.3-4.5％、0.4-4.5％、0.5-4.5％、0.6-4.5％、0.7-4.5％、0.8-4.5％、0.9-4.5％、1-4.5％、1.1-4.5％、1.2-4.5％、1.3-4.5％、1.4-4.5％、1.5-4.5％、1.6-4.5％、1.7-4.5％、1.8-4.5％、1.9-4.5％、2-4.5％、2.1-4.5％、2.2-4.5％、2.3-4.5％、2.4-4.5％、2.5-4.5％、2.6-4.5％、2.7-4.5％、2.8-4.5％、2.9-4.5％、3-4.5％、3.1-4.5％、3.2-4.5％、3.3-4.5％、3.4-4.5％、3.5-4.5％、3.6-4.5％、3.7-4.5％、3.8-4.5％、3.9-4.5％、4-4.5％、4.1-4.5％、4.2-4.5％、4.3-4.5％、4.4-4.5％、0-5％、0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.4-5％、0.5-5％、0.6-5％、0.7-5％、0.8-5％、0.9-5％、1-5％、1.1-5％、1.2-5％、1.3-5％、1.4-5％、1.5-5％、1.6-5％、1.7-5％、1.8-5％、1.9-5％、2-5％、2.1-5％、2.2-5％、2.3-5％、2.4-5％、2.5-5％、2.6-5％、2.7-5％、2.8-5％、2.9-5％、3-5％、3.1-5％、3.2-5％、3.3-5％、3.4-5％、3.5-5％、3.6-5％、3.7-5％、3.8-5％、3.9-5％、4-5％、4.1-5％、4.2-5％、4.3-5％、4.4-5％、4.5-5％、4.6-5％、4.7-5％、4.8-5％、4.9-5％、0-5.5％、0.1-5.5％、0.2-5.5％、0.3-5.5％、0.4-5.5％、0.5-5.5％、0.6-5.5％、0.7-5.5％、0.8-5.5％、0.9-5.5％、1-5.5％、1.1-5.5％、1.2-5.5％、1.3-5.5％、1.4-5.5％、1.5-5.5％、1.6-5.5％、1.7-5.5％、1.8-5.5％、1.9-5.5％、2-5.5％、2.1-5.5％、2.2-5.5％、2.3-5.5％、2.4-5.5％、2.5-5.5％、2.6-5.5％、2.7-5.5％、2.8-5.5％、2.9-5.5％、3-5.5％、3.1-5.5％、3.2-5.5％、3.3-5.5％、3.4-5.5％、3.5-5.5％、3.6-5.5％、3.7-5.5％、3.8-5.5％、3.9-5.5％、4-5.5％、4.1-5.5％、4.2-5.5％、4.3-5.5％、4.4-5.5％、4.5-5.5％、4.6-5.5％、4.7-5.5％、4.8-5.5％、4.9-5.5％、5-5.5％、5.1-5.5％、5.2-5.5％、5.3-5.5％、5.4-5.5％、0-6％、0.1-6％、0.2-6％、0.3-6％、0.4-6％、0.5-6％、0.6-6％、0.7-6％、0.8-6％、0.9-6％、1-6％、1.1-6％、1.2-6％、1.3-6％、1.4-6％、1.5-6％、1.6-6％、1.7-6％、1.8-6％、1.9-6％、2-6％、2.1-6％、2.2-6％、2.3-6％、2.4-6％、2.5-6％、2.6-6％、2.7-6％、2.8-6％、2.9-6％、3-6％、3.1-6％、3.2-6％、3.3-6％、3.4-6％、3.5-6％、3.6-6％、3.7-6％、3.8-6％、3.9-6％、4-6％、4.1-6％、4.2-6％、4.3-6％、4.4-6％、4.5-6％、4.6-6％、4.7-6％、4.8-6％、4.9-6％、5-6％、5.1-6％、5.2-6％、5.3-6％、5.4-6％、5.5-6％、5.6-6％、5.7-6％、5.8-6％、5.9-6％、0-6.5％、0.1-6.5％、0.2-6.5％、0.3-6.5％、0.4-6.5％、0.5-6.5％、0.6-6.5％、0.7-6.5％、0.8-6.5％、0.9-6.5％、1-6.5％、1.1-6.5％、1.2-6.5％、1.3-6.5％、1.4-6.5％、1.5-6.5％、1.6-6.5％、1.7-6.5％、1.8-6.5％、1.9-6.5％、2-6.5％、2.1-6.5％、2.2-6.5％、2.3-6.5％、2.4-6.5％、2.5-6.5％、2.6-6.5％、2.7-6.5％、2.8-6.5％、2.9-6.5％、3-6.5％、3.1-6.5％、3.2-6.5％、3.3-6.5％、3.4-6.5％、3.5-6.5％、3.6-6.5％、3.7-6.5％、3.8-6.5％、3.9-6.5％、4-6.5％、4.1-6.5％、4.2-6.5％、4.3-6.5％、4.4-6.5％、4.5-6.5％、4.6-6.5％、4.7-6.5％、4.8-6.5％、4.9-6.5％、5-6.5％、5.1-6.5％、5.2-6.5％、5.3-6.5％、5.4-6.5％、5.5-6.5％、5.6-6.5％、5.7-6.5％、5.8-6.5％、5.9-6.5％、6-6.5％、6.1-6.5％、6.2-6.5％、6.3-6.5％、6.4-6.5％、0-7％、0.1-7％、0.2-7％、0.3-7％、0.4-7％、0.5-7％、0.6-7％、0.7-7％、0.8-7％、0.9-7％、1-7％、1.1-7％、1.2-7％、1.3-7％、1.4-7％、1.5-7％、1.6-7％、1.7-7％、1.8-7％、1.9-7％、2-7％、2.1-7％、2.2-7％、2.3-7％、2.4-7％、2.5-7％、2.6-7％、2.7-7％、2.8-7％、2.9-7％、3-7％、3.1-7％、3.2-7％、3.3-7％、3.4-7％、3.5-7％、3.6-7％、3.7-7％、3.8-7％、3.9-7％、4-7％、4.1-7％、4.2-7％、4.3-7％、4.4-7％、4.5-7％、4.6-7％、4.7-7％、4.8-7％、4.9-7％、5-7％、5.1-7％、5.2-7％、5.3-7％、5.4-7％、5.5-7％、5.6-7％、5.7-7％、5.8-7％、5.9-7％、6-7％、6.1-7％、6.2-7％、6.3-7％、6.4-7％、6.5-7％、6.6-7％、6.7-7％、6.8-7％、6.9-7％、0-7.5％、0.1-7.5％、0.2-7.5％、0.3-7.5％、0.4-7.5％、0.5-7.5％、0.6-7.5％、0.7-7.5％、0.8-7.5％、0.9-7.5％、1-7.5％、1.1-7.5％、1.2-7.5％、1.3-7.5％、1.4-7.5％、1.5-7.5％、1.6-7.5％、1.7-7.5％、1.8-7.5％、1.9-7.5％、2-7.5％、2.1-7.5％、2.2-7.5％、2.3-7.5％、2.4-7.5％、2.5-7.5％、2.6-7.5％、2.7-7.5％、2.8-7.5％、2.9-7.5％、3-7.5％、3.1-7.5％、3.2-7.5％、3.3-7.5％、3.4-7.5％、3.5-7.5％、3.6-7.5％、3.7-7.5％、3.8-7.5％、3.9-7.5％、4-7.5％、4.1-7.5％、4.2-7.5％、4.3-7.5％、4.4-7.5％、4.5-7.5％、4.6-7.5％、4.7-7.5％、4.8-7.5％、4.9-7.5％、5-7.5％、5.1-7.5％、5.2-7.5％、5.3-7.5％、5.4-7.5％、5.5-7.5％、5.6-7.5％、5.7-7.5％、5.8-7.5％、5.9-7.5％、6-7.5％、6.1-7.5％、6.2-7.5％、6.3-7.5％、6.4-7.5％、6.5-7.5％、6.6-7.5％、6.7-7.5％、6.8-7.5％、6.9-7.5％、7-7.5％、7.1-7.5％、7.2-7.5％、7.3-7.5％、7.4-7.5％、0-8％、0.1-8％、0.2-8％、0.3-8％、0.4-8％、0.5-8％、0.6-8％、0.7-8％、0.8-8％、0.9-8％、1-8％、1.1-8％、1.2-8％、1.3-8％、1.4-8％、1.5-8％、1.6-8％、1.7-8％、1.8-8％、1.9-8％、2-8％、2.1-8％、2.2-8％、2.3-8％、2.4-8％、2.5-8％、2.6-8％、2.7-8％、2.8-8％、2.9-8％、3-8％、3.1-8％、3.2-8％、3.3-8％、3.4-8％、3.5-8％、3.6-8％、3.7-8％、3.8-8％、3.9-8％、4-8％、4.1-8％、4.2-8％、4.3-8％、4.4-8％、4.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在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-9％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-8％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-7％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-6％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-5％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-4％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-3％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-2％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-1％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含3％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含4％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含5％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含7％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含8％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含9％w/v的蔗糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10％w/v的蔗糖。
海藻糖
在某些实施方案中，制剂可包含至少一种糖，其为二糖，例如但不限于海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含以下量的海藻糖：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％或10％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含海藻糖，其范围为0-1％、0.1-1％、0.2-1％、0.3-1％、0.4-1％、0.5-1％、0.6-1％、0.7-1％、0.8-1％、0.9-1％、0-1.5％、0.1-1.5％、0.2-1.5％、0.3-1.5％、0.4-1.5％、0.5-1.5％、0.6-1.5％、0.7-1.5％、0.8-1.5％、0.9-1.5％、1-1.5％、1.1-1.5％、1.2-1.5％、1.3-1.5％、1.4-1.5％、0-2％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％、0.6-2％、0.7-2％、0.8-2％、0.9-2％、1-2％、1.1-2％、1.2-2％、1.3-2％、1.4-2％、1.5-2％、1.6-2％、1.7-2％、1.8-2％、1.9-2％、0-2.5％、0.1-2.5％、0.2-2.5％、0.3-2.5％、0.4-2.5％、0.5-2.5％、0.6-2.5％、0.7-2.5％、0.8-2.5％、0.9-2.5％、1-2.5％、1.1-2.5％、1.2-2.5％、1.3-2.5％、1.4-2.5％、1.5-2.5％、1.6-2.5％、1.7-2.5％、1.8-2.5％、1.9-2.5％、2-2.5％、2.1-2.5％、2.2-2.5％、2.3-2.5％、2.4-2.5％、0-3％、0.1-3％、0.2-3％、0.3-3％、0.4-3％、0.5-3％、0.6-3％、0.7-3％、0.8-3％、0.9-3％、1-3％、1.1-3％、1.2-3％、1.3-3％、1.4-3％、1.5-3％、1.6-3％、1.7-3％、1.8-3％、1.9-3％、2-3％、2.1-3％、2.2-3％、2.3-3％、2.4-3％、2.5-3％、2.6-3％、2.7-3％、2.8-3％、2.9-3％、0-3.5％、0.1-3.5％、0.2-3.5％、0.3-3.5％、0.4-3.5％、0.5-3.5％、0.6-3.5％、0.7-3.5％、0.8-3.5％、0.9-3.5％、1-3.5％、1.1-3.5％、1.2-3.5％、1.3-3.5％、1.4-3.5％、1.5-3.5％、1.6-3.5％、1.7-3.5％、1.8-3.5％、1.9-3.5％、2-3.5％、2.1-3.5％、2.2-3.5％、2.3-3.5％、2.4-3.5％、2.5-3.5％、2.6-3.5％、2.7-3.5％、2.8-3.5％、2.9-3.5％、3-3.5％、3.1-3.5％、3.2-3.5％、3.3-3.5％、3.4-3.5％、0-4％、0.1-4％、0.2-4％、0.3-4％、0.4-4％、0.5-4％、0.6-4％、0.7-4％、0.8-4％、0.9-4％、1-4％、1.1-4％、1.2-4％、1.3-4％、1.4-4％、1.5-4％、1.6-4％、1.7-4％、1.8-4％、1.9-4％、2-4％、2.1-4％、2.2-4％、2.3-4％、2.4-4％、2.5-4％、2.6-4％、2.7-4％、2.8-4％、2.9-4％、3-4％、3.1-4％、3.2-4％、3.3-4％、3.4-4％、3.5-4％、3.6-4％、3.7-4％、3.8-4％、3.9-4％、0-4.5％、0.1-4.5％、0.2-4.5％、0.3-4.5％、0.4-4.5％、0.5-4.5％、0.6-4.5％、0.7-4.5％、0.8-4.5％、0.9-4.5％、1-4.5％、1.1-4.5％、1.2-4.5％、1.3-4.5％、1.4-4.5％、1.5-4.5％、1.6-4.5％、1.7-4.5％、1.8-4.5％、1.9-4.5％、2-4.5％、2.1-4.5％、2.2-4.5％、2.3-4.5％、2.4-4.5％、2.5-4.5％、2.6-4.5％、2.7-4.5％、2.8-4.5％、2.9-4.5％、3-4.5％、3.1-4.5％、3.2-4.5％、3.3-4.5％、3.4-4.5％、3.5-4.5％、3.6-4.5％、3.7-4.5％、3.8-4.5％、3.9-4.5％、4-4.5％、4.1-4.5％、4.2-4.5％、4.3-4.5％、4.4-4.5％、0-5％、0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.4-5％、0.5-5％、0.6-5％、0.7-5％、0.8-5％、0.9-5％、1-5％、1.1-5％、1.2-5％、1.3-5％、1.4-5％、1.5-5％、1.6-5％、1.7-5％、1.8-5％、1.9-5％、2-5％、2.1-5％、2.2-5％、2.3-5％、2.4-5％、2.5-5％、2.6-5％、2.7-5％、2.8-5％、2.9-5％、3-5％、3.1-5％、3.2-5％、3.3-5％、3.4-5％、3.5-5％、3.6-5％、3.7-5％、3.8-5％、3.9-5％、4-5％、4.1-5％、4.2-5％、4.3-5％、4.4-5％、4.5-5％、4.6-5％、4.7-5％、4.8-5％、4.9-5％、0-5.5％、0.1-5.5％、0.2-5.5％、0.3-5.5％、0.4-5.5％、0.5-5.5％、0.6-5.5％、0.7-5.5％、0.8-5.5％、0.9-5.5％、1-5.5％、1.1-5.5％、1.2-5.5％、1.3-5.5％、1.4-5.5％、1.5-5.5％、1.6-5.5％、1.7-5.5％、1.8-5.5％、1.9-5.5％、2-5.5％、2.1-5.5％、2.2-5.5％、2.3-5.5％、2.4-5.5％、2.5-5.5％、2.6-5.5％、2.7-5.5％、2.8-5.5％、2.9-5.5％、3-5.5％、3.1-5.5％、3.2-5.5％、3.3-5.5％、3.4-5.5％、3.5-5.5％、3.6-5.5％、3.7-5.5％、3.8-5.5％、3.9-5.5％、4-5.5％、4.1-5.5％、4.2-5.5％、4.3-5.5％、4.4-5.5％、4.5-5.5％、4.6-5.5％、4.7-5.5％、4.8-5.5％、4.9-5.5％、5-5.5％、5.1-5.5％、5.2-5.5％、5.3-5.5％、5.4-5.5％、0-6％、0.1-6％、0.2-6％、0.3-6％、0.4-6％、0.5-6％、0.6-6％、0.7-6％、0.8-6％、0.9-6％、1-6％、1.1-6％、1.2-6％、1.3-6％、1.4-6％、1.5-6％、1.6-6％、1.7-6％、1.8-6％、1.9-6％、2-6％、2.1-6％、2.2-6％、2.3-6％、2.4-6％、2.5-6％、2.6-6％、2.7-6％、2.8-6％、2.9-6％、3-6％、3.1-6％、3.2-6％、3.3-6％、3.4-6％、3.5-6％、3.6-6％、3.7-6％、3.8-6％、3.9-6％、4-6％、4.1-6％、4.2-6％、4.3-6％、4.4-6％、4.5-6％、4.6-6％、4.7-6％、4.8-6％、4.9-6％、5-6％、5.1-6％、5.2-6％、5.3-6％、5.4-6％、5.5-6％、5.6-6％、5.7-6％、5.8-6％、5.9-6％、0-6.5％、0.1-6.5％、0.2-6.5％、0.3-6.5％、0.4-6.5％、0.5-6.5％、0.6-6.5％、0.7-6.5％、0.8-6.5％、0.9-6.5％、1-6.5％、1.1-6.5％、1.2-6.5％、1.3-6.5％、1.4-6.5％、1.5-6.5％、1.6-6.5％、1.7-6.5％、1.8-6.5％、1.9-6.5％、2-6.5％、2.1-6.5％、2.2-6.5％、2.3-6.5％、2.4-6.5％、2.5-6.5％、2.6-6.5％、2.7-6.5％、2.8-6.5％、2.9-6.5％、3-6.5％、3.1-6.5％、3.2-6.5％、3.3-6.5％、3.4-6.5％、3.5-6.5％、3.6-6.5％、3.7-6.5％、3.8-6.5％、3.9-6.5％、4-6.5％、4.1-6.5％、4.2-6.5％、4.3-6.5％、4.4-6.5％、4.5-6.5％、4.6-6.5％、4.7-6.5％、4.8-6.5％、4.9-6.5％、5-6.5％、5.1-6.5％、5.2-6.5％、5.3-6.5％、5.4-6.5％、5.5-6.5％、5.6-6.5％、5.7-6.5％、5.8-6.5％、5.9-6.5％、6-6.5％、6.1-6.5％、6.2-6.5％、6.3-6.5％、6.4-6.5％、0-7％、0.1-7％、0.2-7％、0.3-7％、0.4-7％、0.5-7％、0.6-7％、0.7-7％、0.8-7％、0.9-7％、1-7％、1.1-7％、1.2-7％、1.3-7％、1.4-7％、1.5-7％、1.6-7％、1.7-7％、1.8-7％、1.9-7％、2-7％、2.1-7％、2.2-7％、2.3-7％、2.4-7％、2.5-7％、2.6-7％、2.7-7％、2.8-7％、2.9-7％、3-7％、3.1-7％、3.2-7％、3.3-7％、3.4-7％、3.5-7％、3.6-7％、3.7-7％、3.8-7％、3.9-7％、4-7％、4.1-7％、4.2-7％、4.3-7％、4.4-7％、4.5-7％、4.6-7％、4.7-7％、4.8-7％、4.9-7％、5-7％、5.1-7％、5.2-7％、5.3-7％、5.4-7％、5.5-7％、5.6-7％、5.7-7％、5.8-7％、5.9-7％、6-7％、6.1-7％、6.2-7％、6.3-7％、6.4-7％、6.5-7％、6.6-7％、6.7-7％、6.8-7％、6.9-7％、0-7.5％、0.1-7.5％、0.2-7.5％、0.3-7.5％、0.4-7.5％、0.5-7.5％、0.6-7.5％、0.7-7.5％、0.8-7.5％、0.9-7.5％、1-7.5％、1.1-7.5％、1.2-7.5％、1.3-7.5％、1.4-7.5％、1.5-7.5％、1.6-7.5％、1.7-7.5％、1.8-7.5％、1.9-7.5％、2-7.5％、2.1-7.5％、2.2-7.5％、2.3-7.5％、2.4-7.5％、2.5-7.5％、2.6-7.5％、2.7-7.5％、2.8-7.5％、2.9-7.5％、3-7.5％、3.1-7.5％、3.2-7.5％、3.3-7.5％、3.4-7.5％、3.5-7.5％、3.6-7.5％、3.7-7.5％、3.8-7.5％、3.9-7.5％、4-7.5％、4.1-7.5％、4.2-7.5％、4.3-7.5％、4.4-7.5％、4.5-7.5％、4.6-7.5％、4.7-7.5％、4.8-7.5％、4.9-7.5％、5-7.5％、5.1-7.5％、5.2-7.5％、5.3-7.5％、5.4-7.5％、5.5-7.5％、5.6-7.5％、5.7-7.5％、5.8-7.5％、5.9-7.5％、6-7.5％、6.1-7.5％、6.2-7.5％、6.3-7.5％、6.4-7.5％、6.5-7.5％、6.6-7.5％、6.7-7.5％、6.8-7.5％、6.9-7.5％、7-7.5％、7.1-7.5％、7.2-7.5％、7.3-7.5％、7.4-7.5％、0-8％、0.1-8％、0.2-8％、0.3-8％、0.4-8％、0.5-8％、0.6-8％、0.7-8％、0.8-8％、0.9-8％、1-8％、1.1-8％、1.2-8％、1.3-8％、1.4-8％、1.5-8％、1.6-8％、1.7-8％、1.8-8％、1.9-8％、2-8％、2.1-8％、2.2-8％、2.3-8％、2.4-8％、2.5-8％、2.6-8％、2.7-8％、2.8-8％、2.9-8％、3-8％、3.1-8％、3.2-8％、3.3-8％、3.4-8％、3.5-8％、3.6-8％、3.7-8％、3.8-8％、3.9-8％、4-8％、4.1-8％、4.2-8％、4.3-8％、4.4-8％、4.5-8％、4.6-8％、4.7-8％、4.8-8％、4.9-8％、5-8％、5.1-8％、5.2-8％、5.3-8％、5.4-8％、5.5-8％、5.6-8％、5.7-8％、5.8-8％、5.9-8％、6-8％、6.1-8％、6.2-8％、6.3-8％、6.4-8％、6.5-8％、6.6-8％、6.7-8％、6.8-8％、6.9-8％、7-8％、7.1-8％、7.2-8％、7.3-8％、7.4-8％、7.5-8％、7.6-8％、7.7-8％、7.8-8％、7.9-8％、0-8.5％、0.1-8.5％、0.2-8.5％、0.3-8.5％、0.4-8.5％、0.5-8.5％、0.6-8.5％、0.7-8.5％、0.8-8.5％、0.9-8.5％、1-8.5％、1.1-8.5％、1.2-8.5％、1.3-8.5％、1.4-8.5％、1.5-8.5％、1.6-8.5％、1.7-8.5％、1.8-8.5％、1.9-8.5％、2-8.5％、2.1-8.5％、2.2-8.5％、2.3-8.5％、2.4-8.5％、2.5-8.5％、2.6-8.5％、2.7-8.5％、2.8-8.5％、2.9-8.5％、3-8.5％、3.1-8.5％、3.2-8.5％、3.3-8.5％、3.4-8.5％、3.5-8.5％、3.6-8.5％、3.7-8.5％、3.8-8.5％、3.9-8.5％、4-8.5％、4.1-8.5％、4.2-8.5％、4.3-8.5％、4.4-8.5％、4.5-8.5％、4.6-8.5％、4.7-8.5％、4.8-8.5％、4.9-8.5％、5-8.5％、5.1-8.5％、5.2-8.5％、5.3-8.5％、5.4-8.5％、5.5-8.5％、5.6-8.5％、5.7-8.5％、5.8-8.5％、5.9-8.5％、6-8.5％、6.1-8.5％、6.2-8.5％、6.3-8.5％、6.4-8.5％、6.5-8.5％、6.6-8.5％、6.7-8.5％、6.8-8.5％、6.9-8.5％、7-8.5％、7.1-8.5％、7.2-8.5％、7.3-8.5％、7.4-8.5％、7.5-8.5％、7.6-8.5％、7.7-8.5％、7.8-8.5％、7.9-8.5％、8-8.5％、8.1-8.5％、8.2-8.5％、8.3-8.5％、8.4-8.5％、0-9％、0.1-9％、0.2-9％、0.3-9％、0.4-9％、0.5-9％、0.6-9％、0.7-9％、0.8-9％、0.9-9％、1-9％、1.1-9％、1.2-9％、1.3-9％、1.4-9％、1.5-9％、1.6-9％、1.7-9％、1.8-9％、1.9-9％、2-9％、2.1-9％、2.2-9％、2.3-9％、2.4-9％、2.5-9％、2.6-9％、2.7-9％、2.8-9％、2.9-9％、3-9％、3.1-9％、3.2-9％、3.3-9％、3.4-9％、3.5-9％、3.6-9％、3.7-9％、3.8-9％、3.9-9％、4-9％、4.1-9％、4.2-9％、4.3-9％、4.4-9％、4.5-9％、4.6-9％、4.7-9％、4.8-9％、4.9-9％、5-9％、5.1-9％、5.2-9％、5.3-9％、5.4-9％、5.5-9％、5.6-9％、5.7-9％、5.8-9％、5.9-9％、6-9％、6.1-9％、6.2-9％、6.3-9％、6.4-9％、6.5-9％、6.6-9％、6.7-9％、6.8-9％、6.9-9％、7-9％、7.1-9％、7.2-9％、7.3-9％、7.4-9％、7.5-9％、7.6-9％、7.7-9％、7.8-9％、7.9-9％、8-9％、8.1-9％、8.2-9％、8.3-9％、8.4-9％、8.5-9％、8.6-9％、8.7-9％、8.8-9％、8.9-9％、0-9.5％、0.1-9.5％、0.2-9.5％、0.3-9.5％、0.4-9.5％、0.5-9.5％、0.6-9.5％、0.7-9.5％、0.8-9.5％、0.9-9.5％、1-9.5％、1.1-9.5％、1.2-9.5％、1.3-9.5％、1.4-9.5％、1.5-9.5％、1.6-9.5％、1.7-9.5％、1.8-9.5％、1.9-9.5％、2-9.5％、2.1-9.5％、2.2-9.5％、2.3-9.5％、2.4-9.5％、2.5-9.5％、2.6-9.5％、2.7-9.5％、2.8-9.5％、2.9-9.5％、3-9.5％、3.1-9.5％、3.2-9.5％、3.3-9.5％、3.4-9.5％、3.5-9.5％、3.6-9.5％、3.7-9.5％、3.8-9.5％、3.9-9.5％、4-9.5％、4.1-9.5％、4.2-9.5％、4.3-9.5％、4.4-9.5％、4.5-9.5％、4.6-9.5％、4.7-9.5％、4.8-9.5％、4.9-9.5％、5-9.5％、5.1-9.5％、5.2-9.5％、5.3-9.5％、5.4-9.5％、5.5-9.5％、5.6-9.5％、5.7-9.5％、5.8-9.5％、5.9-9.5％、6-9.5％、6.1-9.5％、6.2-9.5％、6.3-9.5％、6.4-9.5％、6.5-9.5％、6.6-9.5％、6.7-9.5％、6.8-9.5％、6.9-9.5％、7-9.5％、7.1-9.5％、7.2-9.5％、7.3-9.5％、7.4-9.5％、7.5-9.5％、7.6-9.5％、7.7-9.5％、7.8-9.5％、7.9-9.5％、8-9.5％、8.1-9.5％、8.2-9.5％、8.3-9.5％、8.4-9.5％、8.5-9.5％、8.6-9.5％、8.7-9.5％、8.8-9.5％、8.9-9.5％、9-9.5％、9.1-9.5％、9.2-9.5％、9.3-9.5％、9.4-9.5％、0-10％、0.1-10％、0.2-10％、0.3-10％、0.4-10％、0.5-10％、0.6-10％、0.7-10％、0.8-10％、0.9-10％、1-10％、1.1-10％、1.2-10％、1.3-10％、1.4-10％、1.5-10％、1.6-10％、1.7-10％、1.8-10％、1.9-10％、2-10％、2.1-10％、2.2-10％、2.3-10％、2.4-10％、2.5-10％、2.6-10％、2.7-10％、2.8-10％、2.9-10％、3-10％、3.1-10％、3.2-10％、3.3-10％、3.4-10％、3.5-10％、3.6-10％、3.7-10％、3.8-10％、3.9-10％、4-10％、4.1-10％、4.2-10％、4.3-10％、4.4-10％、4.5-10％、4.6-10％、4.7-10％、4.8-10％、4.9-10％、5-10％、5.1-10％、5.2-10％、5.3-10％、5.4-10％、5.5-10％、5.6-10％、5.7-10％、5.8-10％、5.9-10％、6-10％、6.1-10％、6.2-10％、6.3-10％、6.4-10％、6.5-10％、6.6-10％、6.7-10％、6.8-10％、6.9-10％、7-10％、7.1-10％、7.2-10％、7.3-10％、7.4-10％、7.5-10％、7.6-10％、7.7-10％、7.8-10％、7.9-10％、8-10％、8.1-10％、8.2-10％、8.3-10％、8.4-10％、8.5-10％、8.6-10％、8.7-10％、8.8-10％、8.9-10％、9-10％、9.1-10％、9.2-10％、9.3-10％、9.4-10％、9.5-10％、9.6-10％、9.7-10％、9.8-10％或9.9-10％w/v.
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-9％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-8％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-7％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-6％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-5％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-4％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-3％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-2％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-1％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含3％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含4％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含5％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含7％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含8％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含9％w/v的海藻糖。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10％w/v的海藻糖。
山梨醇
在某些实施方案中，所述制剂可以包含至少一种糖替代物(例如，糖醇)，其为山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含以下量的山梨醇：0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％或10％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含山梨醇，其范围为0-1％、0.1-1％、0.2-1％、0.3-1％、0.4-1％、0.5-1％、0.6-1％、0.7-1％、0.8-1％、0.9-1％、0-1.5％、0.1-1.5％、0.2-1.5％、0.3-1.5％、0.4-1.5％、0.5-1.5％、0.6-1.5％、0.7-1.5％、0.8-1.5％、0.9-1.5％、1-1.5％、1.1-1.5％、1.2-1.5％、1.3-1.5％、1.4-1.5％、0-2％、0.1-2％、0.2-2％、0.3-2％、0.4-2％、0.5-2％、0.6-2％、0.7-2％、0.8-2％、0.9-2％、1-2％、1.1-2％、1.2-2％、1.3-2％、1.4-2％、1.5-2％、1.6-2％、1.7-2％、1.8-2％、1.9-2％、0-2.5％、0.1-2.5％、0.2-2.5％、0.3-2.5％、0.4-2.5％、0.5-2.5％、0.6-2.5％、0.7-2.5％、0.8-2.5％、0.9-2.5％、1-2.5％、1.1-2.5％、1.2-2.5％、1.3-2.5％、1.4-2.5％、1.5-2.5％、1.6-2.5％、1.7-2.5％、1.8-2.5％、1.9-2.5％、2-2.5％、2.1-2.5％、2.2-2.5％、2.3-2.5％、2.4-2.5％、0-3％、0.1-3％、0.2-3％、0.3-3％、0.4-3％、0.5-3％、0.6-3％、0.7-3％、0.8-3％、0.9-3％、1-3％、1.1-3％、1.2-3％、1.3-3％、1.4-3％、1.5-3％、1.6-3％、1.7-3％、1.8-3％、1.9-3％、2-3％、2.1-3％、2.2-3％、2.3-3％、2.4-3％、2.5-3％、2.6-3％、2.7-3％、2.8-3％、2.9-3％、0-3.5％、0.1-3.5％、0.2-3.5％、0.3-3.5％、0.4-3.5％、0.5-3.5％、0.6-3.5％、0.7-3.5％、0.8-3.5％、0.9-3.5％、1-3.5％、1.1-3.5％、1.2-3.5％、1.3-3.5％、1.4-3.5％、1.5-3.5％、1.6-3.5％、1.7-3.5％、1.8-3.5％、1.9-3.5％、2-3.5％、2.1-3.5％、2.2-3.5％、2.3-3.5％、2.4-3.5％、2.5-3.5％、2.6-3.5％、2.7-3.5％、2.8-3.5％、2.9-3.5％、3-3.5％、3.1-3.5％、3.2-3.5％、3.3-3.5％、3.4-3.5％、0-4％、0.1-4％、0.2-4％、0.3-4％、0.4-4％、0.5-4％、0.6-4％、0.7-4％、0.8-4％、0.9-4％、1-4％、1.1-4％、1.2-4％、1.3-4％、1.4-4％、1.5-4％、1.6-4％、1.7-4％、1.8-4％、1.9-4％、2-4％、2.1-4％、2.2-4％、2.3-4％、2.4-4％、2.5-4％、2.6-4％、2.7-4％、2.8-4％、2.9-4％、3-4％、3.1-4％、3.2-4％、3.3-4％、3.4-4％、3.5-4％、3.6-4％、3.7-4％、3.8-4％、3.9-4％、0-4.5％、0.1-4.5％、0.2-4.5％、0.3-4.5％、0.4-4.5％、0.5-4.5％、0.6-4.5％、0.7-4.5％、0.8-4.5％、0.9-4.5％、1-4.5％、1.1-4.5％、1.2-4.5％、1.3-4.5％、1.4-4.5％、1.5-4.5％、1.6-4.5％、1.7-4.5％、1.8-4.5％、1.9-4.5％、2-4.5％、2.1-4.5％、2.2-4.5％、2.3-4.5％、2.4-4.5％、2.5-4.5％、2.6-4.5％、2.7-4.5％、2.8-4.5％、2.9-4.5％、3-4.5％、3.1-4.5％、3.2-4.5％、3.3-4.5％、3.4-4.5％、3.5-4.5％、3.6-4.5％、3.7-4.5％、3.8-4.5％、3.9-4.5％、4-4.5％、4.1-4.5％、4.2-4.5％、4.3-4.5％、4.4-4.5％、0-5％、0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.4-5％、0.5-5％、0.6-5％、0.7-5％、0.8-5％、0.9-5％、1-5％、1.1-5％、1.2-5％、1.3-5％、1.4-5％、1.5-5％、1.6-5％、1.7-5％、1.8-5％、1.9-5％、2-5％、2.1-5％、2.2-5％、2.3-5％、2.4-5％、2.5-5％、2.6-5％、2.7-5％、2.8-5％、2.9-5％、3-5％、3.1-5％、3.2-5％、3.3-5％、3.4-5％、3.5-5％、3.6-5％、3.7-5％、3.8-5％、3.9-5％、4-5％、4.1-5％、4.2-5％、4.3-5％、4.4-5％、4.5-5％、4.6-5％、4.7-5％、4.8-5％、4.9-5％、0-5.5％、0.1-5.5％、0.2-5.5％、0.3-5.5％、0.4-5.5％、0.5-5.5％、0.6-5.5％、0.7-5.5％、0.8-5.5％、0.9-5.5％、1-5.5％、1.1-5.5％、1.2-5.5％、1.3-5.5％、1.4-5.5％、1.5-5.5％、1.6-5.5％、1.7-5.5％、1.8-5.5％、1.9-5.5％、2-5.5％、2.1-5.5％、2.2-5.5％、2.3-5.5％、2.4-5.5％、2.5-5.5％、2.6-5.5％、2.7-5.5％、2.8-5.5％、2.9-5.5％、3-5.5％、3.1-5.5％、3.2-5.5％、3.3-5.5％、3.4-5.5％、3.5-5.5％、3.6-5.5％、3.7-5.5％、3.8-5.5％、3.9-5.5％、4-5.5％、4.1-5.5％、4.2-5.5％、4.3-5.5％、4.4-5.5％、4.5-5.5％、4.6-5.5％、4.7-5.5％、4.8-5.5％、4.9-5.5％、5-5.5％、5.1-5.5％、5.2-5.5％、5.3-5.5％、5.4-5.5％、0-6％、0.1-6％、0.2-6％、0.3-6％、0.4-6％、0.5-6％、0.6-6％、0.7-6％、0.8-6％、0.9-6％、1-6％、1.1-6％、1.2-6％、1.3-6％、1.4-6％、1.5-6％、1.6-6％、1.7-6％、1.8-6％、1.9-6％、2-6％、2.1-6％、2.2-6％、2.3-6％、2.4-6％、2.5-6％、2.6-6％、2.7-6％、2.8-6％、2.9-6％、3-6％、3.1-6％、3.2-6％、3.3-6％、3.4-6％、3.5-6％、3.6-6％、3.7-6％、3.8-6％、3.9-6％、4-6％、4.1-6％、4.2-6％、4.3-6％、4.4-6％、4.5-6％、4.6-6％、4.7-6％、4.8-6％、4.9-6％、5-6％、5.1-6％、5.2-6％、5.3-6％、5.4-6％、5.5-6％、5.6-6％、5.7-6％、5.8-6％、5.9-6％、0-6.5％、0.1-6.5％、0.2-6.5％、0.3-6.5％、0.4-6.5％、0.5-6.5％、0.6-6.5％、0.7-6.5％、0.8-6.5％、0.9-6.5％、1-6.5％、1.1-6.5％、1.2-6.5％、1.3-6.5％、1.4-6.5％、1.5-6.5％、1.6-6.5％、1.7-6.5％、1.8-6.5％、1.9-6.5％、2-6.5％、2.1-6.5％、2.2-6.5％、2.3-6.5％、2.4-6.5％、2.5-6.5％、2.6-6.5％、2.7-6.5％、2.8-6.5％、2.9-6.5％、3-6.5％、3.1-6.5％、3.2-6.5％、3.3-6.5％、3.4-6.5％、3.5-6.5％、3.6-6.5％、3.7-6.5％、3.8-6.5％、3.9-6.5％、4-6.5％、4.1-6.5％、4.2-6.5％、4.3-6.5％、4.4-6.5％、4.5-6.5％、4.6-6.5％、4.7-6.5％、4.8-6.5％、4.9-6.5％、5-6.5％、5.1-6.5％、5.2-6.5％、5.3-6.5％、5.4-6.5％、5.5-6.5％、5.6-6.5％、5.7-6.5％、5.8-6.5％、5.9-6.5％、6-6.5％、6.1-6.5％、6.2-6.5％、6.3-6.5％、6.4-6.5％、0-7％、0.1-7％、0.2-7％、0.3-7％、0.4-7％、0.5-7％、0.6-7％、0.7-7％、0.8-7％、0.9-7％、1-7％、1.1-7％、1.2-7％、1.3-7％、1.4-7％、1.5-7％、1.6-7％、1.7-7％、1.8-7％、1.9-7％、2-7％、2.1-7％、2.2-7％、2.3-7％、2.4-7％、2.5-7％、2.6-7％、2.7-7％、2.8-7％、2.9-7％、3-7％、3.1-7％、3.2-7％、3.3-7％、3.4-7％、3.5-7％、3.6-7％、3.7-7％、3.8-7％、3.9-7％、4-7％、4.1-7％、4.2-7％、4.3-7％、4.4-7％、4.5-7％、4.6-7％、4.7-7％、4.8-7％、4.9-7％、5-7％、5.1-7％、5.2-7％、5.3-7％、5.4-7％、5.5-7％、5.6-7％、5.7-7％、5.8-7％、5.9-7％、6-7％、6.1-7％、6.2-7％、6.3-7％、6.4-7％、6.5-7％、6.6-7％、6.7-7％、6.8-7％、6.9-7％、0-7.5％、0.1-7.5％、0.2-7.5％、0.3-7.5％、0.4-7.5％、0.5-7.5％、0.6-7.5％、0.7-7.5％、0.8-7.5％、0.9-7.5％、1-7.5％、1.1-7.5％、1.2-7.5％、1.3-7.5％、1.4-7.5％、1.5-7.5％、1.6-7.5％、1.7-7.5％、1.8-7.5％、1.9-7.5％、2-7.5％、2.1-7.5％、2.2-7.5％、2.3-7.5％、2.4-7.5％、2.5-7.5％、2.6-7.5％、2.7-7.5％、2.8-7.5％、2.9-7.5％、3-7.5％、3.1-7.5％、3.2-7.5％、3.3-7.5％、3.4-7.5％、3.5-7.5％、3.6-7.5％、3.7-7.5％、3.8-7.5％、3.9-7.5％、4-7.5％、4.1-7.5％、4.2-7.5％、4.3-7.5％、4.4-7.5％、4.5-7.5％、4.6-7.5％、4.7-7.5％、4.8-7.5％、4.9-7.5％、5-7.5％、5.1-7.5％、5.2-7.5％、5.3-7.5％、5.4-7.5％、5.5-7.5％、5.6-7.5％、5.7-7.5％、5.8-7.5％、5.9-7.5％、6-7.5％、6.1-7.5％、6.2-7.5％、6.3-7.5％、6.4-7.5％、6.5-7.5％、6.6-7.5％、6.7-7.5％、6.8-7.5％、6.9-7.5％、7-7.5％、7.1-7.5％、7.2-7.5％、7.3-7.5％、7.4-7.5％、0-8％、0.1-8％、0.2-8％、0.3-8％、0.4-8％、0.5-8％、0.6-8％、0.7-8％、0.8-8％、0.9-8％、1-8％、1.1-8％、1.2-8％、1.3-8％、1.4-8％、1.5-8％、1.6-8％、1.7-8％、1.8-8％、1.9-8％、2-8％、2.1-8％、2.2-8％、2.3-8％、2.4-8％、2.5-8％、2.6-8％、2.7-8％、2.8-8％、2.9-8％、3-8％、3.1-8％、3.2-8％、3.3-8％、3.4-8％、3.5-8％、3.6-8％、3.7-8％、3.8-8％、3.9-8％、4-8％、4.1-8％、4.2-8％、4.3-8％、4.4-8％、4.5-8％、4.6-8％、4.7-8％、4.8-8％、4.9-8％、5-8％、5.1-8％、5.2-8％、5.3-8％、5.4-8％、5.5-8％、5.6-8％、5.7-8％、5.8-8％、5.9-8％、6-8％、6.1-8％、6.2-8％、6.3-8％、6.4-8％、6.5-8％、6.6-8％、6.7-8％、6.8-8％、6.9-8％、7-8％、7.1-8％、7.2-8％、7.3-8％、7.4-8％、7.5-8％、7.6-8％、7.7-8％、7.8-8％、7.9-8％、0-8.5％、0.1-8.5％、0.2-8.5％、0.3-8.5％、0.4-8.5％、0.5-8.5％、0.6-8.5％、0.7-8.5％、0.8-8.5％、0.9-8.5％、1-8.5％、1.1-8.5％、1.2-8.5％、1.3-8.5％、1.4-8.5％、1.5-8.5％、1.6-8.5％、1.7-8.5％、1.8-8.5％、1.9-8.5％、2-8.5％、2.1-8.5％、2.2-8.5％、2.3-8.5％、2.4-8.5％、2.5-8.5％、2.6-8.5％、2.7-8.5％、2.8-8.5％、2.9-8.5％、3-8.5％、3.1-8.5％、3.2-8.5％、3.3-8.5％、3.4-8.5％、3.5-8.5％、3.6-8.5％、3.7-8.5％、3.8-8.5％、3.9-8.5％、4-8.5％、4.1-8.5％、4.2-8.5％、4.3-8.5％、4.4-8.5％、4.5-8.5％、4.6-8.5％、4.7-8.5％、4.8-8.5％、4.9-8.5％、5-8.5％、5.1-8.5％、5.2-8.5％、5.3-8.5％、5.4-8.5％、5.5-8.5％、5.6-8.5％、5.7-8.5％、5.8-8.5％、5.9-8.5％、6-8.5％、6.1-8.5％、6.2-8.5％、6.3-8.5％、6.4-8.5％、6.5-8.5％、6.6-8.5％、6.7-8.5％、6.8-8.5％、6.9-8.5％、7-8.5％、7.1-8.5％、7.2-8.5％、7.3-8.5％、7.4-8.5％、7.5-8.5％、7.6-8.5％、7.7-8.5％、7.8-8.5％、7.9-8.5％、8-8.5％、8.1-8.5％、8.2-8.5％、8.3-8.5％、8.4-8.5％、0-9％、0.1-9％、0.2-9％、0.3-9％、0.4-9％、0.5-9％、0.6-9％、0.7-9％、0.8-9％、0.9-9％、1-9％、1.1-9％、1.2-9％、1.3-9％、1.4-9％、1.5-9％、1.6-9％、1.7-9％、1.8-9％、1.9-9％、2-9％、2.1-9％、2.2-9％、2.3-9％、2.4-9％、2.5-9％、2.6-9％、2.7-9％、2.8-9％、2.9-9％、3-9％、3.1-9％、3.2-9％、3.3-9％、3.4-9％、3.5-9％、3.6-9％、3.7-9％、3.8-9％、3.9-9％、4-9％、4.1-9％、4.2-9％、4.3-9％、4.4-9％、4.5-9％、4.6-9％、4.7-9％、4.8-9％、4.9-9％、5-9％、5.1-9％、5.2-9％、5.3-9％、5.4-9％、5.5-9％、5.6-9％、5.7-9％、5.8-9％、5.9-9％、6-9％、6.1-9％、6.2-9％、6.3-9％、6.4-9％、6.5-9％、6.6-9％、6.7-9％、6.8-9％、6.9-9％、7-9％、7.1-9％、7.2-9％、7.3-9％、7.4-9％、7.5-9％、7.6-9％、7.7-9％、7.8-9％、7.9-9％、8-9％、8.1-9％、8.2-9％、8.3-9％、8.4-9％、8.5-9％、8.6-9％、8.7-9％、8.8-9％、8.9-9％、0-9.5％、0.1-9.5％、0.2-9.5％、0.3-9.5％、0.4-9.5％、0.5-9.5％、0.6-9.5％、0.7-9.5％、0.8-9.5％、0.9-9.5％、1-9.5％、1.1-9.5％、1.2-9.5％、1.3-9.5％、1.4-9.5％、1.5-9.5％、1.6-9.5％、1.7-9.5％、1.8-9.5％、1.9-9.5％、2-9.5％、2.1-9.5％、2.2-9.5％、2.3-9.5％、2.4-9.5％、2.5-9.5％、2.6-9.5％、2.7-9.5％、2.8-9.5％、2.9-9.5％、3-9.5％、3.1-9.5％、3.2-9.5％、3.3-9.5％、3.4-9.5％、3.5-9.5％、3.6-9.5％、3.7-9.5％、3.8-9.5％、3.9-9.5％、4-9.5％、4.1-9.5％、4.2-9.5％、4.3-9.5％、4.4-9.5％、4.5-9.5％、4.6-9.5％、4.7-9.5％、4.8-9.5％、4.9-9.5％、5-9.5％、5.1-9.5％、5.2-9.5％、5.3-9.5％、5.4-9.5％、5.5-9.5％、5.6-9.5％、5.7-9.5％、5.8-9.5％、5.9-9.5％、6-9.5％、6.1-9.5％、6.2-9.5％、6.3-9.5％、6.4-9.5％、6.5-9.5％、6.6-9.5％、6.7-9.5％、6.8-9.5％、6.9-9.5％、7-9.5％、7.1-9.5％、7.2-9.5％、7.3-9.5％、7.4-9.5％、7.5-9.5％、7.6-9.5％、7.7-9.5％、7.8-9.5％、7.9-9.5％、8-9.5％、8.1-9.5％、8.2-9.5％、8.3-9.5％、8.4-9.5％、8.5-9.5％、8.6-9.5％、8.7-9.5％、8.8-9.5％、8.9-9.5％、9-9.5％、9.1-9.5％、9.2-9.5％、9.3-9.5％、9.4-9.5％、0-10％、0.1-10％、0.2-10％、0.3-10％、0.4-10％、0.5-10％、0.6-10％、0.7-10％、0.8-10％、0.9-10％、1-10％、1.1-10％、1.2-10％、1.3-10％、1.4-10％、1.5-10％、1.6-10％、1.7-10％、1.8-10％、1.9-10％、2-10％、2.1-10％、2.2-10％、2.3-10％、2.4-10％、2.5-10％、2.6-10％、2.7-10％、2.8-10％、2.9-10％、3-10％、3.1-10％、3.2-10％、3.3-10％、3.4-10％、3.5-10％、3.6-10％、3.7-10％、3.8-10％、3.9-10％、4-10％、4.1-10％、4.2-10％、4.3-10％、4.4-10％、4.5-10％、4.6-10％、4.7-10％、4.8-10％、4.9-10％、5-10％、5.1-10％、5.2-10％、5.3-10％、5.4-10％、5.5-10％、5.6-10％、5.7-10％、5.8-10％、5.9-10％、6-10％、6.1-10％、6.2-10％、6.3-10％、6.4-10％、6.5-10％、6.6-10％、6.7-10％、6.8-10％、6.9-10％、7-10％、7.1-10％、7.2-10％、7.3-10％、7.4-10％、7.5-10％、7.6-10％、7.7-10％、7.8-10％、7.9-10％、8-10％、8.1-10％、8.2-10％、8.3-10％、8.4-10％、8.5-10％、8.6-10％、8.7-10％、8.8-10％、8.9-10％、9-10％、9.1-10％、9.2-10％、9.3-10％、9.4-10％、9.5-10％、9.6-10％、9.7-10％、9.8-10％或9.9-10％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-10％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-9％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-8％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-7％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-6％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-5％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-4％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-3％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-2％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0-1％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含1％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含2％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含3％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含4％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含5％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含6％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含7％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含8％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含9％w/v的山梨醇。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含10％w/v的山梨醇。
表面活性剂
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物的制剂可包含表面活性剂。表面活性剂可以帮助控制悬浮培养物中的剪切力。本文中使用的表面活性剂可以是阴离子、两性离子或非离子表面活性剂，并且可以包括本领域已知的适合用于药物制剂的那些。阴离子表面活性剂的实例包括但不限于硫酸盐、磺酸盐、磷酸酯和羧酸盐。非离子表面活性剂的实例包括但不限于乙氧基化物(ehoxylates)、脂肪醇乙氧基化物、烷基酚乙氧基化物(例如壬氧基醇、Triton X-100)、脂肪酸乙氧基化物、乙氧基化胺和/或脂肪酸酰胺(例如聚乙氧基牛脂胺、椰油酰胺单乙醇胺、椰油酰胺二乙醇胺)、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(例如泊洛沙姆、如
或F-127)、脂肪酸和多元醇的酯、脂肪酸链烷醇酰胺、乙氧基化脂肪酸、乙氧基化脂肪醇、乙氧基化山梨醇脂肪酸酯、乙氧基化甘油酯、与EDTA(乙二胺四乙酸)的乙氧基化嵌段共聚物、乙氧基化环醚加合物、乙氧基化酰胺和咪唑啉加合物、乙氧基化胺加合物、乙氧基化硫醇加合物、与烷基酚的乙氧基化缩合物、乙氧基化的基于氮的疏水物、乙氧基化聚氧化丙烯、聚合硅酮、氟化表面活性剂和可聚合表面活性剂。两性离子表面活性剂的实例包括但不限于烷基酰氨基甜菜碱和其胺氧化物、烷基甜菜碱和其胺氧化物、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱、两性甘氨酸盐、两性丙酸盐、平衡的两性聚羧酸甘氨酸盐和烷基聚氨基甘氨酸盐。蛋白质具有根据pH值带电或不带电的能力，因此，在合适的pH值下，蛋白质(优选pI约为8至9，例如修饰的牛血清白蛋白或胰凝乳蛋白酶原)可以用作两性离子表面活性剂。如果需要，可以使用表面活性剂的各种混合物。
共聚物
在某些实施方案中，制剂中的至少一种组分是共聚物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v的至少一种共聚物。
在某些实施方案中，所述制剂可包含至少一种共聚物，其范围为0.00001％-0.0001％、0.00001％-0.001％、0.00001％-0.01％、0.00001％-0.1％、0.00001％-1％、0.0001％-0.001％、0.0001％-0.01％、0.0001％-0.1％、0.0001％-1％、0.001％-0.01％、0.001％-0.1％、0.001％-1％、0.01％-0.1％、0.01％-1％或0.1-1％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0.001％w/v的共聚物。
在某些实施方案中，所述共聚物是环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v的至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
在某些实施方案中，所述制剂可包含至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物，其范围为0.00001％-0.0001％、0.00001％-0.001％、0.00001％-0.01％、0.00001％-0.1％、0.00001％-1％、0.0001％-0.001％、0.0001％-0.01％、0.0001％-0.1％、0.0001％-1％、0.001％-0.01％、0.001％-0.1％、0.001％-1％、0.01％-0.1％、0.01％-1％或0.1-1％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0.001％w/v的环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
在某些实施方案中，所述制剂可包含至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物，其为泊洛沙姆。在某些实施方案中，所述制剂可以包含浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v的泊洛沙姆。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含泊洛沙姆，其范围为0.00001％-0.0001％、0.00001％-0.001％、0.00001％-0.01％、0.00001％-0.1％、0.00001％-1％、0.0001％-0.001％、0.0001％-0.01％、0.0001％-0.1％、0.0001％-1％、0.001％-0.01％、0.001％-0.1％、0.001％-1％、0.01％-0.1％、0.01％-1％或0.1-1％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0.001％w/v的泊洛沙姆。
在某些实施方案中，所述制剂可包含至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物，其为泊洛沙姆188(例如
)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v的泊洛沙姆188。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含泊洛沙姆188，其范围为0.00001％-0.0001％、0.00001％-0.001％、0.00001％-0.01％、0.00001％-0.1％、0.00001％-1％、0.0001％-0.001％、0.0001％-0.01％、0.0001％-0.1％、0.0001％-1％、0.001％-0.01％、0.001％-0.1％、0.001％-1％、0.01％-0.1％、0.01％-1％或0.1-1％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0.001％-0.1w/v的泊洛沙姆188。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0.001％w/v的泊洛沙姆188。
在某些实施方案中，所述制剂可包含至少一种环氧乙烷/环氧丙烷共聚物，其为
在某些实施方案中，所述制剂可以包含浓度为0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％或1％w/v的
在某些实施方案中，所述制剂可以包含
其范围为0.00001％-0.0001％、0.00001％-0.001％、0.00001％-0.01％、0.00001％-0.1％、0.00001％-1％、0.0001％-0.001％、0.0001％-0.01％、0.0001％-0.1％、0.0001％-1％、0.001％-0.01％、0.001％-0.1％、0.001％-1％、0.01％-0.1％、0.01％-1％或0.1-1％w/v。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含0.001％-0.1％w/v的
制剂性质
在某些实施方案中，制剂已被优化以具有特定的pH、重量克分子渗透压浓度、浓度、AAV颗粒的浓度和/或AAV颗粒的总剂量。
pH
在某些实施方案中，可以针对特定pH优化制剂。在某些实施方案中，制剂可以包含pH缓冲剂(在本文中也称为“缓冲剂”)，其是弱酸或弱碱，当在制剂中使用时，即使在将另一种酸或碱加入到制剂中之后，其仍将制剂的pH值保持在选定值附近。制剂的pH可以是但不限于0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9和14。
在某些实施方案中，可以针对特定pH范围优化制剂。pH范围可以是但不限于0-4、1-5、2-6、3-7、4-8、5-9、6-10、7-11、8-12、9-13、10-14、0-1.5、1-2.5、2-3.5、3-4.5、4-5.5、5-6.5、6-7.5、7-8.5、8-9.5、9-10.5、10-11.5、11-12.5、12-13.5、0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12、12-13、13-14、0-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.2-8.2、7.2-7.6、7.3-7.7、7.5-8、7.8-8.2、8-8.5、8.5-9、9-9.5、9.5-10、10-10.5、10.5-11、11-11.5、11.5-12、12-12.5、12.5-13、13-13.5或13.5-14。
在某些实施方案中，制剂的pH为6至8.5。
在某些实施方案中，制剂的pH为7至8.5
在某些实施方案中，制剂的pH为7至7.6。
在某些实施方案中，制剂的pH为7。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.1。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.2。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.3。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.4。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.5。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.6。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.7。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.8。
在某些实施方案中，制剂的pH为7.9。
在某些实施方案中，制剂的pH为8。
在某些实施方案中，制剂的pH为8.1。
在某些实施方案中，制剂的pH为8.2。
在某些实施方案中，制剂的pH为8.3。
在某些实施方案中，制剂的pH为8.4。
在某些实施方案中，制剂的pH为8.5。
在某些实施方案中，当制剂处于5℃时确定pH。
在某些实施方案中，当制剂处于25℃时测定pH。
合适的缓冲剂可包括但不限于Tris HCl、Tris碱、磷酸钠(磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠)、磷酸钾(磷酸二氢钾和/或磷酸氢二钾)、组氨酸、硼酸、柠檬酸、甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)和MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)。
制剂中缓冲剂的浓度可以介于1-50mM、1-25mM、5-30mM、5-20mM、5-15mM、10-40mM或15-30mM。制剂中缓冲剂的浓度可以为约1mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或50mM。
在一些实施方案中，制剂可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。作为非限制性实例，PBS可包括氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和蒸馏水。在某些情况下，PBS不包含钾或镁。在其他情况下，PBS包含钙和镁。
在一些实施方案中，在本文描述的药物组合物的制剂中使用的缓冲剂可包含磷酸钠(磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠)。作为非限制性实例，可以将磷酸钠调节至pH(在5℃下)为7.4±0.2的范围内。在一些实施方案中，在本文所述的药物组合物的制剂中使用的缓冲剂可包含Tris碱。可用盐酸将Tris碱调节至7.1至9.1范围内的任何pH。作为非限制性实例，可将在本文所述制剂中使用的Tris碱调节至8.0±0.2。作为非限制性实例，可将在本文所述制剂中使用的Tris碱调节至7.5±0.2。
重量克分子渗透压浓度
在某些实施方案中，可以针对特定重量克分子渗透压浓度优化制剂。制剂的重量克分子渗透浓度可以为但不限于350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500mOsm/kg(毫渗透摩尔/kg)。
在某些实施方案中，可以针对特定重量克分子渗透压浓度范围优化制剂。该范围可以是但不限于350-360、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、460-470、470-480、480-490、490-500、350-370、360-380、370-390、380-400、390-410、400-420、410-430、420-440、430-450、440-460、450-470、460-480、470-490、480-500、350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、475-500、350-380、360-390、370-400、380-410、390-420、400-430、410-440、420-450、430-460、440-470、450-480、460-490、470-500、350-390、360-400、370-410、380-420、390-430、400-440、410-450、420-460、430-470、440-480、450-490、460-500、350-400、360-410、370-420、380-430、390-440、400-450、410-460、420-470、430-480、440-490、450-500、350-410、360-420、370-430、380-440、390-450、400-460、410-470、420-480、430-490、440-500、350-420、360-430、370-440、380-450、390-460、400-470、410-480、420-490、430-500、350-430、360-440、370-450、380-460、390-470、400-480、410-490、420-500、350-440、360-450、370-460、380-470、390-480、400-490、410-500、350-450、360-460、370-470、380-480、390-490、400-500、350-460、360-470、370-480、380-490、390-500、350-470、360-480、370-490、380-500、350-480、360-490、370-500、350-490、360-500或350-500mOsm/kg。
在某些实施方案中，制剂的重量克分子渗透压浓度为350-500mOsm/kg。
在某些实施方案中，制剂的重量克分子渗透压浓度为400-500mOsm/kg。
在某些实施方案中，制剂的重量克分子渗透压浓度为400-480mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为395mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为413mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为420mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为432mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为447mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为450mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为452mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为459mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为472mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为490mOsm/kg。
在某些实施方案中，重量克分子渗透压浓度为496mOsm/kg。
AAV颗粒浓度
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度可以为在约1x106VG/ml至约1x1016VG/ml。如本文所用，“VG/ml”代表每毫升(ml)的载体基因组(VG)。VG/ml还可以描述每毫升的基因组拷贝或每毫升的DNA酶抗性颗粒。
在某些实施方案中，制剂可包含AAV颗粒，其浓度为约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012,4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、7.1x1012、7.2x1012、7.3x1012、7.4x1012、7.5x1012、7.6x1012、7.7x1012、7.8x1012、7.9x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、2.1x1013、2.2x1013、2.3x1013、2.4x1013、2.5x1013、2.6x1013、2.7x1013、2.8x1013、2.9x1013、3x1013、3.1x1013、3.2x1013、3.3x1013、3.4x1013、3.5x1013、3.6x1013、3.7x1013、3.8x1013、3.9x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为1x1011至5x1013、1x1012至5x1012、2x1012至1x1013、5x1012至1x1013、1x1013至2x1013、2x1013至3x1013、2x1013至2.5x1013、2.5x1013至3x1013，或不超过5x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为2.7x1011VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为9x1011VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为1.2x1012VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为2.7x1012VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为4x1012VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为6x1012VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为7.9x1012VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为8x1012VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为1x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为1.8x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为2.2x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为2.7x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为3.5x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为2.7-3.5x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为7.0x1013VG/ml。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度为5.0x1012VG/mL。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的浓度可以在约1x106总衣壳/mL至约1x1016总衣壳/mL之间。在某些实施方案中，递送可包括的组合物浓度为约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1、1x1012、1、2x1012、1、3x1012、1、4x1012、1、5x1012、1、6x1012、1、7x1012、1、8x1012、1、9x1012、2x1012、2、1x1012、2、2x1012、2、3x1012、2、4x1012、2、5x1012、2、6x1012、2、7x1012、2、8x1012、2、9x1012、3x1012、3、1x1012、3、2x1012、3、3x1012、3、4x1012、3、5x1012、3、6x1012、3、7x1012、3、8x1012、3、9x1012、4x1012、4、1x1012、4、2x1012、4、3x1012、4、4x1012、4、5x1012、4、6x1012、4、7x1012、4、8x1012、4、9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、2x1013、2、1x1013、2、2x1013、2、3x1013、2、4x1013、2、5x1013、2、6x1013、2、7x1013、2、8x1013、2、9x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6、7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016总衣壳/ml。
AAV颗粒的总剂量
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量可以在约1x106VG和约约1x1016VG之间。在某些实施方案中，制剂可包含的AAV颗粒的总剂量为约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012,4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、7.1x1012、7.2x1012、7.3x1012、7.4x1012、7.5x1012、7.6x1012、7.7x1012、7.8x1012、7.9x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、2.1x1013、2.2x1013、2.3x1013、2.4x1013、2.5x1013、2.6x1013、2.7x1013、2.8x1013、2.9x1013、3x1013、3.1x1013、3.2x1013、3.3x1013、3.4x1013、3.5x1013、3.6x1013、3.7x1013、3.8x1013、3.9x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为1x1011至5x1013VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为1x1011至2x1014VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为1.4x1011VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为4.5x1011VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为6.8x1011VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为1.4x1012VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为2.2x1012VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为4.6x1011VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为9.2x1012VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为1.0x1013VG。
在某些实施方案中，制剂中AAV颗粒的总剂量为2.3x1013VG。
示例性制剂
下面描述的是本公开的示例性非限制性制剂。所述制剂可以包括AAV颗粒制剂。表2给出了本公开的某些示例性制剂的组分和性质的概述。每种制剂可任选地包含0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如，普兰尼克F-68)。
表2.制剂
在某些实施方案中，所述制剂可以包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、蔗糖、和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、100mM氯化钠、5％w/v蔗糖和任选的泊洛沙姆188(缓冲液pH为7.5)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、220mM氯化钠、5％w/v蔗糖和任选的泊洛沙姆188(缓冲液pH为7.5)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、100mM氯化钠、7％w/v蔗糖和任选的泊洛沙姆188(缓冲液pH为7.5)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、蔗糖或海藻糖，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含磷酸钾、氯化钠、氯化钾、组氨酸、糖，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、氯化钾、蔗糖、Tris、和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、氯化钾、蔗糖、Tris、盐酸，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、蔗糖、Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、蔗糖、Tris、氯化镁，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、蔗糖、Tris、精氨酸和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、山梨醇、Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、蔗糖、组氨酸和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、蔗糖和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含105mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188。在某些实施方案中，所述制剂可以包含95mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188。在某些实施方案中，所述制剂可以包含220mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含磷酸钾、蔗糖、tris和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钾、蔗糖、tris和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含100mM氯化钠、20mMTris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为8.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含220mM氯化钠、20mM Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为7.0-8.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含290mM氯化钠、20mM Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为8.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含305mM氯化钠、20mM Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为8.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含2M氯化钠、20mM Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为8.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含170mM氯化钠、40mM Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为8.5)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含2M氯化钠、1M Tris，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为7.5)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含氯化钠、Tris-Bis丙烷，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含200mM氯化钠、50mM Tris-Bis丙烷，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为9.0)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含磷酸钠、氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188。在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、180mM氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为7.3)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含20mM磷酸钠、350mM氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为7.4)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含50mM磷酸钠、350mM氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为7.4)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钾、氯化钠，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188。在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、2.7mM氯化钾、192mM氯化钠，和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为7.5)。
在某些实施方案中，所述制剂可以包含柠檬酸钠、氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188。在某些实施方案中，所述制剂可以包含20mM柠檬酸钠、1M氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为6.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含10mM柠檬酸钠、350mM氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为6.0)。在某些实施方案中，所述制剂可以包含20mM柠檬酸钠、350mM氯化钠和任选的共聚物，例如泊洛沙姆188(混合物pH为3.0)。
在某些实施方案中，制剂可包含PBS。在某些实施方案中，所述制剂可以包含PBS和糖和/或糖替代物。制剂可包含3-5％(w/v)的糖和/或糖替代物以增加制剂的稳定性。作为非限制性实例，该制剂是PBS和3％(w/v)的蔗糖(VYFORM30)。作为另一个非限制性实例，所述制剂是PBS和5％(w/v)的蔗糖(VYFORM31)。作为另一个非限制性实例，所述制剂是PBS和7％(w/v)的蔗糖。在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以与环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(也称为普兰尼克或泊洛沙姆)组合配制在PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在含3％(w/v)蔗糖和0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在含5％(w/v)蔗糖和0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在pH为约7.0的含0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在pH为约7.3的含0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在pH为约7.4的含0.001％-0.1％(w/v)的泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的PBS中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在包含氯化钠、磷酸钠和环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的溶液中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在包含95mM氯化钠、5mM磷酸氢二钠、5mM磷酸二氢钠、1.5mM磷酸钾、7％w/v蔗糖和.001％泊洛沙姆188(例如普兰尼克F-68)的溶液中。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在pH为约7.3的包含约180mM氯化钠、约10mM磷酸钠和约0.001％泊洛沙姆188的溶液中。最终溶液中氯化钠的浓度可以为150mM-200mM。作为非限制性实例，最终溶液中氯化钠的浓度可以是150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。最终溶液中磷酸钠的浓度可以是1mM-50mM。作为非限制性实例，最终溶液中磷酸钠的浓度可以是1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM。泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的浓度可以为0.0001％-1％(w/v)。作为非限制性实例，泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的浓度可以为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％(w/v)。最终溶液的pH可以为6.8-7.7。最终溶液的pH的非限制性实例包括6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制在pH为约7.4的包含约1.05％(w/v)氯化钠、约0.212％(w/v)磷酸氢二钠七水合物、约0.025％(w/v)磷酸二氢钠一水合物和0.001％(w/v)泊洛沙姆188的溶液中。作为非限制性实例，该配制溶液中AAV颗粒的浓度可以为约0.001％(w/v)。最终溶液中氯化钠的浓度可以为0.1-2.0％(w/v)，非限制性实例为0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、0.95％、0.96％、0.97％、0.98％、0.99％、1.00％、1.01％、1.02％、1.03％、1.04％、1.05％、1.06％、1.07％、1.08％、1.09％、1.10％、1.25％、1.5％、1.75％或2％(w/v)。最终溶液中磷酸氢二钠的浓度可以为0.100-0.300％(w/v)，非限制性实例包括0.100％、0.125％、0.150％、0.175％、0.200％、0.210％、0.211％、0.212％、0.213％、0.214％、0.215％、0.225％、0.250％、0.275％、0.300％(w/v)。最终溶液中磷酸二氢钠的浓度可以为0.010-0.050％(w/v)，非限制性实例为0.010％、0.015％、0.020％、0.021％、0.022％、0.023％、0.024％、0.025％、0.026％、0.027％、0.028％、0.029％、0.030％、0.035％、0.040％、0.045％或0.050％(w/v)。泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的浓度可以为0.0001％-1％(w/v)。作为非限制性实例，泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的浓度可以为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％(w/v)。最终溶液的pH可以为6.8-7.7。最终溶液的pH的非限制性实例包括6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。
在某些实施方案中，所述制剂包含具有以下的CAS(化学文摘社)注册号的组分：7647-14-15(氯化钠)、7782-85-6(磷酸氢二钠七水合物)、10049-21-5(磷酸二氢钠一水合物)和9003-11-6(泊洛沙姆188)。
可注射制剂
可以根据已知技术使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂来配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳剂，例如1,3-丁二醇溶液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂是水、U.S.P.级林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。
可注射制剂可以例如通过细菌保持过滤器过滤和/或通过加入无菌固体组合物形式的灭菌剂进行灭菌，所述灭菌固体组合物可以在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的作用，通常期望减慢皮下或肌肉内注射的活性成分的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。活性成分的吸收速率取决于溶解速率，而溶解速率又取决于晶体尺寸和晶体形式。或者，通过将药物溶解或悬浮在油溶媒中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备储库型可注射制剂。
储库制剂
在本公开的某些实施方案中，将本公开的AAV颗粒制剂配制在储库中以延长释放。通常，将特定的器官或组织(“目标组织”)作为施用靶。
在本公开的某些实施方案中，本公开的药物组合物、AAV颗粒制剂在空间上保留在靶组织内或靶组织附近。提供了通过使靶组织(其包含一个或多个靶细胞)与药物组合物、AAV颗粒制剂在以下条件下接触，将药物组合物、AAV颗粒制剂提供给哺乳动物受试者的靶组织，所述条件使得药物组合物、AAV颗粒制剂基本保留在靶组织中，意味着至少10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的组合物保留在靶组织中。有利地，通过测量进入一个或多个靶细胞的药物组合物和AAV颗粒制剂的量来确定保留。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的施用于受试者的药物组合物、AAV颗粒制剂在施用后的一段时间内在细胞内存在。
本公开的某些方面涉及通过使靶组织(其包含一个或多个靶细胞)与本公开的药物组合物、AAV颗粒制剂在使它们基本保留在靶组织的条件下接触，将本公开的药物组合物、AAV颗粒制剂提供给哺乳动物受试者的靶组织。药物组合物、AAV颗粒制剂包含足够的活性成分，从而在至少一个靶细胞中产生目标作用。
测量与分析
可以使用本领域已知的各种方法来确定有效载荷的表达或来自病毒基因组的此类有效载荷的下调作用，所述本领域已知的各种方法例如但不限于免疫化学(例如IHC)、原位杂交(ISH)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、亲和ELISA、ELISPOT、流式细胞术、免疫细胞学、表面等离振子共振分析、动力学排斥测定、液相色谱-质谱(LCMS)、高效液相色谱(HPLC)、BCA测定、免疫电泳、Western印迹、SDS-PAGE、蛋白免疫沉淀和/或PCR。
IV.施用
可以通过导致治疗有效结果的任何途径施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。这些包括但不限于器官的实质内，例如但不限于脑(例如实质内)、纹状体(纹状体内)、肠内(进入肠)、胃肠内、硬膜外、口服(通过口腔)、透皮、硬膜外、大脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、软膜下(软膜下面)、颈内动脉(进入颈内动脉)、表皮(应用在皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内快速浓注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、神经节内(进入神经节)、腹膜内(输注或注射进腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵窦内注射(进入病理性腔体)、腔内(进入阴茎的基底)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(穿过完整皮肤扩散用于全身分布)、透粘膜(穿过粘膜扩散)、经阴道、吹入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼(在结膜上)、滴耳、耳(在耳朵中或通过耳朵)、含服(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙(至一个或多个牙)、电渗透、宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、体外、血液透析、渗入、间质、腹部内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、脊尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内(dental intracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(intracorporuscavernosum)(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺的导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远侧部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、骨髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或它的支气管内)、窦内(在鼻或眼窝窦内)、椎管内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平在脑脊液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在aurus介质内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子透入法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移进身体的组织中)、冲洗(浸泡或冲洗开放性创伤或体腔)、喉头(直接在喉上)、鼻胃(穿过鼻并进入胃)、封闭敷裹技术(局部途径施用，其然后被封闭该区域的敷料覆盖)、眼(至外眼)、口咽(直接至口和咽)、胃肠外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(在呼吸道内，为了局部或全身效应通过口或鼻吸入)、眼球后(脑桥后或眼球后)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经传导阻滞、胆灌注、心脏灌注、体外光化学疗法或脊柱。
在特定实施方案中，可以以促进载体或siRNA分子进入中枢神经系统并渗透到中型多棘和/或皮层神经元和/或星形胶质细胞中的方式施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒的组合物。
在一些实施方案中，可以通过肌肉内注射施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以通过实质内注射施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以通过实质内注射和鞘内注射施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以通过纹状体内注射施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以通过纹状体内注射和本文所述的另一种施用途径施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以通过外周注射(例如，静脉内)和/或鼻内递送将表达本公开的siRNA双链体的AAV颗粒施用给受试者。本领域中公开了用于siRNA双链体的AAV颗粒的外周施用可以转运至中枢神经系统，例如转运至神经元(例如，美国专利公开号20100240739；和20100130594；其各自内容通过引用整体并入本文)。
在其他实施方案中，可以通过颅内递送将包含至少一个包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒的组合物施用于受试者(参见，例如，美国专利号8,119,611；其内容通过引用整体并入本文)。
包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以以任何合适的形式施用，可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适合用于液体溶液或液体溶液中的悬浮液的固体形式。siRNA双链体可以与任何合适且药学上可接受的赋形剂一起配制。
可以以“治疗有效”量，即足以减轻和/或预防与疾病相关的至少一种症状或提供受试者状况的改善的量，施用包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用于小脑延髓池，以转导中型多棘神经元、皮层神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，可以鞘内施用载体。
在一些实施方案中，可以使用鞘内输注施用治疗有效量的AAV颗粒，以转导中型多棘神经元、皮层神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，可以鞘内施用载体。
在一些实施方案中，可以配制包含调节性多核苷酸的AAV颗粒。作为非限制性实例，可以优化制剂的盐基度(baricity)和/或重量克分子渗透压浓度，以确保在中枢神经系统或中枢神经系统的区或组成中的最佳药物分布。
在一些实施方案中，可以通过单一施用途径将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至受试者。
在一些实施方案中，可以通过多位点施用途径将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至受试者。可以在2、3、4、5或大于5个位点向受试者施用包含调节性多核苷酸的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以使用快速浓注向受试者施用包含本文所述的调节性多核苷酸的AAV颗粒。
在一些实施方案中，可以使用在几分钟、几小时或几天的时间内持续递送向受试者施用包含本文所述的调节性多核苷酸的AAV颗粒。输注速率可以根据受试者、分布、制剂或其他递送参数而改变。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过核壳和尾状核输注来施用。作为非限制性实例，双重输注提供了广泛的纹状体分布以及额叶和颞叶皮层分布。
在一些实施方案中，AAV颗粒是AAV-DJ8，其通过单侧核壳输注施用。作为非限制性实例，所施用的AAV-DJ8的分布类似于经由单侧核壳输注递送的AAV1的分布。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过鞘内(IT)输注在C1施用。输注可以持续1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或大于15个小时。
在一些实施方案中，可以使用血管周间隙(PVS，也称为Virchow-Robin间隙)成像来评估用于本文所述的AAV颗粒施用的受试者的选择和/或剂量、施用途径和/或施用体积的有效性。在PVS穿透脑薄壁组织并充满脑脊髓液(CSF)/间质液时，PVS围绕着小动脉和小静脉。PVS常见于中脑、基底神经节和半卵圆中心。尽管不希望受到理论的束缚，但PVS可能在代谢物的正常清除中起作用，并且与认知能力下降和一些疾病状态(包括帕金森病)相关。PVS的大小通常是正常的，但在许多疾病状态下它们的大小可能会增加。Potter等人(Cerebrovasc Dis.2015Jan；39(4):224–231；其全部内容通过引用整体并入本文)开发了一种分级方法，在该方法中，他们研究了全范围的PVS，并对基底神经节、半卵圆中心和中脑PVS分级。他们使用了Mac和Lullich等人(J Neurol Neurosurg Psychiatry.2004Nov；75(11):1519-23；其内容通过引用整体并入本文)使用的PVS的频率和范围，并且Potter等人对基底神经节和半卵圆中心PVS给予5级：0(无)、1(1-10)、2(11-20)、3(21-40)和4(>40)；对中脑PVS给予2级：0(不可见)或1(可见)。Potter等人的评级系统的用户指南可以参见：www.sbirc.ed.ac.uk/documents/epvs-rating-scale-user-guide.pdf。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过丘脑输注施用。输注到丘脑可以是双侧的或单侧的。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过核壳输注施用。输注到丘脑可以是双侧的或单侧的。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过核壳和丘脑输注施用。双重输注到核壳和丘脑可通过轴突转运至皮层区使大脑分布最大化。Evers等人观察到在将AAV5-GFP双侧注射到tgHD小型猪的核壳和丘脑后运动皮层和部分顶叶皮层神经元的正转导(Molecular Therapy(2018),doi:10.1016/j.ymthe.2018.06.021)。输注到核壳和丘脑可以独立地是双侧或单侧的。作为非限制性实例，可以将AAV颗粒从脑的两侧输注到核壳和丘脑中。作为另一个非限制性实例，可以将AAV颗粒输注到左核壳和左丘脑，或右核壳和右丘脑。作为另一个非限制性实例，可以将AAV颗粒输注到左核壳和右丘脑，或右核壳和左丘脑。双重输注可以连续或同时发生。
在一些实施方案中，可以在不存在与基因疗法相关的体重变化的情况下将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至受试者。
在一些实施方案中，可以在不存在与基因疗法相关的临床体征的情况下将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至受试者，所述临床体征包括但不限于不协调、食欲不振、进食减少和总体虚弱。
在一些实施方案中，可以在不存在与基因疗法相关的受试者血液变化的情况下将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至受试者。在某些实施方案中，受试者的血液变化是血清化学和凝血参数。
在一些实施方案中，可以在不存在受试者组织(例如受试者的脑)的病理改变的情况下将包含调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至受试者。在某些实施方案中，病理改变是总体病理改变，例如但不限于萎缩。在某些实施方案中，病理改变是组织病理改变，包括但不限于靶特异性(例如HTT)包含物。
V.使用方法
通用
本公开提供了一种用于在包括人类受试者的哺乳动物受试者中治疗疾病、病症和/或病况的方法，其包括向受试者施用本文所述的任何病毒颗粒或制剂或向受试者施用任何所述的组合物，包括本文所述的药物组合物或制剂。
在某些实施方案中，向受试者施用配制的AAV颗粒不会改变潜在疾病的进程，但会减轻受试者的症状。
在某些实施方案中，将本公开的病毒颗粒预防性地施用于受试者。
在某些实施方案中，将本公开的病毒颗粒施用于患有本文所述疾病中的至少一种的受试者。
在某些实施方案中，将本公开的病毒颗粒施用于受试者以治疗本文所述的疾病或病症。受试者可能患有该疾病或病症或可能处于发展该疾病或病症的风险中。
本公开提供了一种用于向有需要的受试者(包括人类受试者)施用治疗有效量的本公开的AAV颗粒以减缓、停止或逆转疾病进展的方法。作为非限制性实例，可以通过本领域技术人员已知的测试或诊断工具来测量疾病进展。作为另一个非限制性实例，可以通过受试者的脑、CSF或其他组织的病理特征的变化来测量疾病的进展。
在某些实施方案中，可用本公开的药物组合物治疗各种非感染性疾病，包括神经系统疾病。AAV颗粒(特别是本公开的穿过血脑屏障的AAV颗粒)在治疗各种神经系统疾病中特别有用。作为非限制性实例，神经系统疾病可以是透明隔缺失(Absence of the SeptumPellucidum)、酸性脂肪酶病(Acid Lipase Disease)、酸性麦芽糖酶缺乏症(Acid MaltaseDeficiency)、获得性癫痫样失语症(Acquired Epileptiform Aphasia)、急性弥漫性脑脊髓炎(Acute Disseminated Encephalomyelitis)、注意缺陷多动障碍(AttentionDeficit-Hyperactivity Disorder，ADHD)、艾迪瞳孔(Adie's Pupil)、艾迪综合征(Adie'sSyndrome)、肾上腺脑白质营养不良(Adrenoleukodystrophy)、胼胝体发育不全(Agenesisof the Corpus Callosum)、失认症(Agnosia)、艾卡迪综合征(Aicardi Syndrome)、Aicardi-Goutieres综合征病症(Aicardi-Goutieres Syndrome Disorder)、艾滋病-神经系统并发症(AIDS-Neurological Complications)、亚历山大病(Alexander Disease)、阿尔柏思病(Alpers'Disease)、交替性偏瘫(Alternating Hemiplegia)、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、无脑(Anencephaly)、动脉瘤(Aneurysm)、安格尔曼综合征(Angelman Syndrome)、血管瘤病(Angiomatosis)、缺氧(Anoxia)、抗磷脂综合征(Antiphospholipid Syndrome)、失语症(Aphasia)、失用症(Apraxia)、蛛网膜囊肿(Arachnoid Cysts)、蛛网膜炎(Arachnoiditis)、阿诺德-基亚里畸形(Arnold-ChiariMalformation)、动静脉畸形(Arteriovenous Malformation)、阿斯珀格氏综合征(Asperger Syndrome)、共济失调(Ataxia)、共济失调毛细血管扩张(AtaxiaTelangiectasia)、共济失调和小脑或脊髓小脑退化(Ataxias and Cerebellar orSpinocerebellar Degeneration)、心房颤动和中风(Atrial Fibrillation and Stroke)、注意缺陷多动障碍(Attention Deficit-Hyperactivity Disorder)、自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder)、自主神经功能障碍(Autonomic Dysfunction)、背痛(BackPain)、Barth综合征(Barth Syndrome)、Batten病(Batten Disease)、Becker肌强直(Becker's Myotonia)、贝切特病(Behcet's Disease)、贝尔麻痹(Bell's Palsy)、良性原发性眼睑痉挛(Benign Essential Blepharospasm)、良性局灶性肌萎缩(Benign FocalAmyotrophy)、良性颅内高压(Benign Intracranial Hypertension)、伯-罗二氏综合征(Bernhardt-Roth Syndrome)、宾斯旺格病(Binswanger's Disease)、眼睑痉挛(Blepharospasm)、Bloch-Sulzberger综合征(Bloch-Sulzberger Syndrome)、臂丛出生伤(Brachial Plexus Birth Injuries)、臂丛损伤(Brachial Plexus Injuries)、Bradbury-Eggleston综合征(Bradbury-Eggleston Syndrome)、脑和脊柱肿瘤(Brain and SpinalTumors)、脑动脉瘤(Brain Aneurysm)、脑损伤(Brain Injury)、Brown-Sequard综合征(Brown-Sequard Syndrome)、脊髓延髓肌萎缩症(Bulbospinal Muscular Atrophy)、伴有皮层下梗死和白细胞性脑病的脑常染色体显性动脉病(Cerebral Autosomal DominantArteriopathy with Sub-cortical Infarcts and Leukoencephalopathy，CADASIL)、卡那万病(Canavan Disease)、腕管综合征(Carpal Tunnel Syndrome)、灼性神经痛(Causalgia)、海绵状血管瘤(Cavernomas)、海绵状血管瘤(cavernous angioma)、海绵状畸形(Cavernous Malformation)、中央颈脊髓综合征(Central Cervical Cord Syndrome)、中枢脊髓综合征(Central Cord Syndrome)、中枢疼痛综合征(Central Pain Syndrome)、脑桥中央髓鞘溶解症(Central Pontine Myelinolysis)、脑疾病(Cephalic Disorders)、神经酰胺酶缺乏症(Ceramidase Deficiency)、小脑退化(Cerebellar Degeneration)、小脑发育不全(Cerebellar Hypoplasia)、脑动脉瘤(Cerebral Aneurysms)、脑动脉硬化(Cerebral Arteriosclerosis)、大脑萎缩(Cerebral Atrophy)、脑型脚气病(CerebralBeriberi)、脑海绵状畸形(Cerebral Cavernous Malformation)、脑性巨人症(CerebralGigantism)、脑缺氧(Cerebral Hypoxia)、脑瘫(Cerebral Palsy)、脑-眼-脸-骨骼综合征(Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome，COFS)、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth Disease)、Chiari畸形(Chiari Malformation)、胆固醇酯贮积病(CholesterolEster Storage Disease)、舞蹈症(Chorea)、神经棘红细胞增多症(Choreoacanthocytosis)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(Chronic InflammatoryDemyelinating Polyneuropathy，CIDP)、慢性立位不耐受(Chronic OrthostaticIntolerance)、慢性疼痛、II型科凯恩综合征(Cockayne Syndrome Type II)、科-勒二氏综合征(Coffin Lowry Syndrome)、枕角扩大(Colpocephaly)、昏迷(Coma)、复杂区域性疼痛综合征(Complex Regional Pain Syndrome)、先天性双侧面瘫(Congenital FacialDiplegia)、先天性肌无力(Congenital Myasthenia)、先天性肌病(CongenitalMyopathy)、先天性血管性海绵状畸形(Congenital Vascular CavernousMalformations)、皮层基底节变性(Corticobasal Degeneration)、颅动脉炎(CranialArteritis)、颅缝早闭(Craniosynostosis)、Cree脑病(Cree encephalitis)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、累积性创伤疾病(Cumulative Trauma Disorders)、库欣综合征(Cushing's Syndrome)、巨细胞包涵体疾病(Cytomegalic Inclusion BodyDisease)、巨细胞病毒感染(Cytomegalovirus Infection)、跳舞性眼-脚综合征(DancingEyes-Dancing Feet Syndrome)、丹迪-沃克综合征(Dandy-Walker Syndrome)、Dawson病(Dawson Disease)、德摩西埃综合征(De Morsier's Syndrome)、代-克二氏麻痹(Dejerine-Klumpke Palsy)、痴呆、痴呆-多发性梗塞(Dementia-Multi-Infarct)、语义性痴呆(Dementia-Semantic)、皮层下痴呆(Dementia-Subcortical)、路易体痴呆(DementiaWith Lewy Bodies)、齿状核小脑共济失调(Dentate Cerebellar Ataxia)、齿状核红核萎缩(Dentatorubral Atrophy)、皮肌炎(Dermatomyositis)、发展性运动障碍(Developmental Dyspraxia)、Devic综合征(Devic's Syndrome)、糖尿病性神经病(Diabetic Neuropathy)、弥漫性硬化症(Diffuse Sclerosis)、Dravet综合征(DravetSyndrome)、自主神经机能异常(Dysautonomia)、书写困难(Dysgraphia)、诵读困难(Dyslexia)、吞咽困难(Dysphagia)、运用障碍(Dyspraxia)、肌阵挛性小脑性协调障碍(Dyssynergia Cerebellaris Myoclonica)、进行性小脑协同失调(DyssynergiaCerebellaris Progressiva)、肌张力异常(Dystonias)、婴儿早期癫痫性脑病(EarlyInfantile Epileptic Encephalopathy)、空蝶鞍综合症(Empty Sella Syndrome)、脑炎、昏睡性脑炎(Encephalitis Lethargica)、脑突出(Encephaloceles)、脑病(Encephalopathy)、脑病(家族性婴儿性(familial infantile))、脑三叉神经血管瘤病(Encephalotrigeminal Angiomatosis)、癫痫(Epilepsy)、癫痫性偏瘫(EpilepticHemiplegia)、欧勃麻痹(Erb's Palsy)、Erb-Duchenne和Dejerine-Klumpke麻痹(Erb-Duchenne and Dejerine-Klumpke Palsies)、特发性震颤(Essential Tremor)、脑桥外髓鞘溶解(Extrapontine Myelinolysis)、法布里病(Fabry Disease)、法尔综合征(Fahr'sSyndrome)、昏厥(Fainting)、家族性植物神经障碍(Familial Dysautonomia)、家族性血管瘤(Familial Hemangioma)、家族性特发性基底神经节钙化(Familial Idiopathic BasalGanglia Calcification)、家族性周期性瘫痪(Familial Periodic Paralyses)、家族性痉挛性瘫痪(Familial Spastic Paralysis)、法伯病(Farber's Disease)、高热性惊厥(Febrile Seizures)、纤维肌发育不良(Fibromuscular Dysplasia)、菲希尔综合征(Fisher Syndrome)、软性婴儿综合征(Floppy Infant Syndrome)、足下垂(Foot Drop)、弗雷德里希氏病(Friedreich's Ataxia)、额颞痴呆(Frontotemporal Dementia)、戈谢病(Gaucher Disease)、全身型神经节苷脂贮积病(Generalized Gangliosidoses)、格斯特曼综合征(Gerstmann's Syndrome)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)；巨轴索神经病(Giant Axonal Neuropathy)；巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis)；巨细胞包涵体疾病(Giant Cell Inclusion Disease)、球样细胞脑白质营养不良(Globoid Cell Leukodystrophy)、舌咽神经痛(GlossopharyngealNeuralgia)、糖原贮积病(Glycogen Storage Disease)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-BarréSyndrome)、哈-斯病(Hallervorden-Spatz Disease)、头损伤(Head Injury)、头痛、连续性偏头痛(Hemicrania Continua)、半面肌痉挛(Hemifacial Spasm)、交替性偏瘫(Hemiplegia Alterans)、遗传性神经病(Hereditary Neuropathies)、遗传性痉挛性截瘫(Hereditary Spastic Paraplegia)、多神经炎型遗传性共济失调(HeredopathiaAtactica Polyneuritiformis)、带状疱疹(Herpes Zoster)、耳部带状疱疹(HerpesZoster Oticus)、平山综合征(Hirayama Syndrome)、Holmes-Adie综合征(Holmes-Adiesyndrome)、全前脑畸形(Holoprosencephaly)、HTLV-1相关的脊髓病(HTLV-1AssociatedMyelopathy)、Hughes综合征(Hughes Syndrome)、亨廷顿病、积水性无脑畸形(Hydranencephaly)、脑积水(Hydrocephalus)、常压脑积水(Hydrocephalus-NormalPressure)、脊髓积水(Hydromyelia)、皮层醇增多症(Hypercortisolism)、嗜睡症(Hypersomnia)、张力亢进(Hypertonia)、张力减退(Hypotonia)、缺氧(Hypoxia)、免疫介导的脑脊髓炎(Immune-Mediated Encephalomyelitis)、包涵体肌炎(Inclusion BodyMyositis)、色素失调症(Incontinentia Pigmenti)、婴儿张力减退(InfantileHypotonia)、婴儿神经轴索营养不良(Infantile Neuroaxonal Dystrophy)、婴儿植酸贮积症(Infantile Phytanic Acid Storage Disease)、婴儿雷弗苏姆病(Infantile RefsumDisease)、婴儿痉挛(Infantile Spasms)、炎性肌病(Inflammatory Myopathies)、枕骨裂脑露畸形(Iniencephaly)、肠性脂质营养不良(Intestinal Lipodystrophy)、颅内囊肿(Intracranial Cysts)、颅内高压(Intracranial Hypertension)、艾萨克综合征(Isaacs'Syndrome)、朱伯特综合征(Joubert Syndrome)、基-塞二氏综合征(Kearns-SayreSyndrome)、肯尼迪病(Kennedy's Disease)、金斯布林纳综合征(Kinsbourne syndrome)、克莱思-莱文综合征(Kleine-Levin Syndrome)、克-费二氏综合征(Klippel-FeilSyndrome)、克-特二氏综合征(Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、克吕弗-布西综合征(Klüver-Bucy Syndrome)、Korsakoff遗忘综合征(Korsakoff's Amnesic Syndrome)、克拉伯病(Krabbe Disease)、Kugelberg-Welander病(Kugelberg-Welander Disease)、库鲁病(Kuru)、郎-爱二氏肌无力综合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、Landau-Kleffner综合征(Landau-Kleffner Syndrome)、股外侧皮神经卡压(Lateral FemoralCutaneous Nerve Entrapment)、延髓外侧综合征(Lateral Medullary Syndrome)、学习障碍(Learning Disabilities)、Leigh病(Leigh's Disease)、Lennox-Gastaut综合征(Lennox-Gastaut Syndrome)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan Syndrome)、脑白质营养不良(Leukodystrophy)、舞蹈-棘状细胞增多综合征(Levine-Critchley Syndrome)、路易体痴呆症(Lewy Body Dementia)、脂质贮积病(Lipid Storage Diseases)、类脂蛋白沉积症(Lipoid Proteinosis)、平脑症(Lissencephaly)、闭锁综合征(Locked-In Syndrome)、LouGehrig病(Lou Gehrig's Disease)、狼疮-神经性后遗症(Lupus-NeurologicalSequelae)、莱姆病神经系统并发症(Lyme Disease-Neurological Complications)、马-约病(Machado-Joseph Disease)、巨脑(Macrencephaly)、巨脑畸形(Megalencephaly)、梅-罗综合征(Melkersson-Rosenthal Syndrome)、脑膜炎(Meningitis)、脑膜炎和脑炎(Meningitis and Encephalitis)、门克斯病(Menkes Disease)、感觉异常性股痛(Meralgia Paresthetica)、异染性脑白质营养不良(Metachromatic Leukodystrophy)、小头畸形(Microcephaly)、偏头痛(Migraine)、米勒-费希尔综合征(Miller FisherSyndrome)、小中风(Mini Stroke)、线粒体肌病(Mitochondrial Myopathy)、Moebius综合征(Moebius Syndrome)、单体肌萎缩(Monomelic Amyotrophy)、运动神经元疾病(MotorNeuron Diseases)、烟雾病(Moyamoya Disease)、粘脂贮积病(Mucolipidoses)、粘多糖贮积病(Mucopolysaccharidoses)、多发梗死性痴呆(Multi-Infarct Dementia)、多灶性运动神经病(Multifocal Motor Neuropathy)、多发性硬化(Multiple Sclerosis)、多系统萎缩(Multiple System Atrophy)、伴有直立性低血压的多系统萎缩(Multiple SystemAtrophy with Orthostatic Hypotension)、肌营养不良(Muscular Dystrophy)、先天性肌无力(Myasthenia-Congenital)、重症肌无力(Myasthenia Gravis)、髓鞘增生性弥漫性硬化(Myelinoclastic Diffuse Sclerosis)、婴儿肌阵挛性脑病(MyoclonicEncephalopathy of Infants)、肌阵挛(Myoclonus)、肌病(Myopathy)、先天性肌病(Myopathy-Congenital)、甲状腺毒性肌病(Myopathy-Thyrotoxic)、肌强直(Myotonia)、先天性肌强直(Myotonia Congenita)、发作性睡病(Narcolepsy)、神经棘红细胞病(Neuroacanthocytosis)、脑铁蓄积性神经退行变性(Neurodegeneration with BrainIron Accumulation)、神经纤维瘤病(Neurofibromatosis)、抗精神病药恶性综合征(Neuroleptic Malignant Syndrome)、AIDS的神经学并发症(NeurologicalComplications of AIDS)、莱姆病的神经学并发症(Neurological Complications ofLyme Disease)、巨细胞病毒感染的神经学后果(Neurological Consequences ofCytomegalovirus Infection)、庞贝病的神经学表现(Neurological Manifestations ofPompe Disease)、狼疮神经后遗症(Neurological Sequelae Of Lupus)、视神经脊髓炎(Neuromyelitis Optica)、神经性肌强直(Neuromyotonia)、神经元蜡样脂褐质沉积症(Neuronal Ceroid Lipofuscinosis)、神经元迁移障碍(Neuronal MigrationDisorders)、遗传性神经病(Neuropathy-Hereditary)、神经结节病(Neurosarcoidosis)、神经性梅毒(Neurosyphilis)、神经毒性(Neurotoxicity)、海绵状痣(Nevus Cavernosus)、尼曼皮克病(Niemann-Pick Disease)、O'Sullivan-McLeod综合征(O'Sullivan-McLeodSyndrome)、枕骨神经痛(Occipital Neuralgia)、大田原综合征(Ohtahara Syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩(Olivopontocerebellar Atrophy)、Opsoclonus肌阵挛(OpsoclonusMyoclonus)、直立性低血压(Orthostatic Hypotension)、过度使用综合征(OveruseSyndrome)、慢性疼痛(Pain-Chronic)、泛酸激酶依赖型神经退行性疾病(PantothenateKinase-Associated Neurodegeneration)、副肿瘤综合征(Paraneoplastic Syndromes)、感觉异常(Paresthesia)、帕金森病、阵发性舞蹈手足徐动症(ParoxysmalChoreoathetosis)、阵发性偏头痛(Paroxysmal Hemicrania)、Parry-Romberg病(Parry-Romberg)、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、Pena Shokeir II综合征(PenaShokeir II Syndrome)、神经周围囊肿(Perineural Cysts)、周期性麻痹(PeriodicParalyses)、周围神经病(Peripheral Neuropathy)、脑室周围白质软化(PeriventricularLeukomalacia)、持续性植物状态(Persistent Vegetative State)、广泛性发育障碍(Pervasive Developmental Disorders)、植酸贮积病(Phytanic Acid StorageDisease)、匹克病(Pick's Disease)、神经挟捏(Pinched Nerve)、梨状肌综合征(Piriformis Syndrome)、垂体瘤(Pituitary Tumors)、多肌炎(Polymyositis)、庞皮病(Pompe Disease)、脑穿通畸形(Porencephaly)、脊髓灰质炎后综合征(Post-PolioSyndrome)、带状疱疹后神经痛(Postherpetic Neuralgia)、感染后脑脊髓炎(Postinfectious Encephalomyelitis)、体位性低血压(Postural Hypotension)、体位性直立性心动过速综合征(Postural Orthostatic Tachycardia Syndrome)、体位性心动过速综合征(Postural Tachycardia Syndrome)、原发性齿槽萎缩(Primary DentatumAtrophy)、原发性侧索硬化(Primary Lateral Sclerosis)、原发性进行性失语症(PrimaryProgressive Aphasia)、朊病毒病(Prion Diseases)、进行性面偏侧萎缩(ProgressiveHemifacial Atrophy)、进行性运动性共济失调(Progressive Locomotor Ataxia)、进行性多灶性脑白质病(Progressive Multifocal Leukoencephalopathy)、进行性硬化性灰质萎缩(Progressive Sclerosing Poliodystrophy)、进行性核上性麻痹(ProgressiveSupranuclear Palsy)、脸盲症(Prosopagnosia)、假Torch综合征(Pseudo-Torchsyndrome)、假弓形虫综合征(Pseudotoxoplasmosis syndrome)、假性脑瘤(PseudotumorCerebri)、心理运动(Psychogenic Movement)、拉姆齐·亨特综合征I(Ramsay HuntSyndrome I)、拉姆齐·亨特综合征II(Ramsay Hunt Syndrome II)、Rasmussen脑炎(Rasmussen's Encephalitis)、反射性交感神经营养不良综合征(Reflex SympatheticDystrophy Syndrome)、雷弗苏姆病(Refsum Disease)、婴儿雷弗苏姆病(Refsum Disease-Infantile)、反复性运动障碍(Repetitive Motion Disorders)、重复性应激损伤(Repetitive Stress Injuries)、不宁腿综合征(Restless Legs Syndrome)、逆转录病毒相关性脊髓病(Retrovirus-Associated Myelopathy)、Rett综合征(Rett Syndrome)、瑞氏综合征(Reye's Syndrome)、风湿性脑炎(Rheumatic Encephalitis)、赖利-戴综合征(Riley-Day Syndrome)、骶神经根囊肿(Sacral Nerve Root Cysts)、圣维特斯舞蹈病(Saint Vitus Dance)、唾液腺疾病(Salivary Gland Disease)、Sandhoff病(SandhoffDisease)、谢耳德病(Schilder's Disease)、脑裂畸形(Schizencephaly)、赛特贝格病(Seitelberger Disease)、癫痫症(Seizure Disorder)、语义性痴呆(SemanticDementia)、隔-视发育不良(Septo-Optic Dysplasia)、严重的婴儿肌阵挛性癫痫病(Severe Myoclonic Epilepsy of Infancy，SMEI)、婴儿摇晃综合征(Shaken BabySyndrome)、带状疱疹(Shingles)、夏伊-德雷格综合征(Shy-Drager Syndrome)、肖格伦氏氏综合征(
Syndrome)、睡眠窒息症(Sleep Apnea)、睡眠病(SleepingSickness)、Sotos综合征(Sotos Syndrome)、痉挛(Spasticity)、脊柱裂(Spina Bifida)、脊髓梗死(Spinal Cord Infarction)、脊髓损伤(Spinal Cord Injury)、脊髓肿瘤(SpinalCord Tumors)、脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy)、脊髓小脑萎缩症(Spinocerebellar Atrophy)、脊髓小脑退化(Spinocerebellar Degeneration)、Steele-Richardson-Olszewski综合征(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵硬人综合征(Stiff-Person Syndrome)、纹状体黑质变性(Striatonigral Degeneration)、中风、斯德奇-韦伯综合征(Sturge-Weber Syndrome)、亚急性硬化性全脑炎(Subacute SclerosingPanencephalitis)、皮层下动脉硬化性脑病(Subcortical ArterioscleroticEncephalopathy)、持续时间短的单侧神经痛样(Short-lasting,Unilateral,Neuralgiform，SUNCT)头痛、吞咽障碍(Swallowing Disorders)、西德纳姆舞蹈病(Sydenham Chorea)、晕厥(Syncope)、梅毒性脊髓硬化症(Syphilitic SpinalSclerosis)、脊髓空洞积水症(Syringohydromyelia)、脊髓空洞症(Syringomyelia)、全身性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)、脊髓痨(Tabes Dorsalis)、迟发性运动障碍(Tardive Dyskinesia)、Tarlov囊肿(Tarlov Cysts)、泰-萨克斯病(Tay-SachsDisease)、颞动脉炎(Temporal Arteritis)、脊髓栓系综合征(Tethered Spinal CordSyndrome)、Thomsen肌强直(Thomsen's Myotonia)、胸廓出口综合征(Thoracic OutletSyndrome)、甲状腺功能亢进性肌病(Thyrotoxic Myopathy)、三叉神经痛(TicDouloureux)、Todd麻痹(Todd's Paralysis)、抽动秽语综合征(Tourette Syndrome)、短暂性脑缺血发作(Transient Ischemic Attack)、传染性海绵状脑病(TransmissibleSpongiform Encephalopathies)、横贯性脊髓炎(Transverse Myelitis)、外伤性脑损伤(Traumatic Brain Injury)、震颤(Tremor)、三叉神经痛(Trigeminal Neuralgia)、热带痉挛性轻瘫(Tropical Spastic Paraparesis)、Troyer综合征(Troyer Syndrome)、结节性硬化症(Tuberous Sclerosis)、血管勃起性肿瘤(Vascular Erectile Tumor)、中枢和外周神经系统的血管炎综合征(Vasculitis Syndromes of the Central and PeripheralNervous Systems)、Von Economo病(Von Economo’s Disease)、希-林二氏病(Von Hippel-Lindau Disease，VHL)、Von Recklinghausen病(Von Recklinghausen's Disease)、瓦伦伯格综合征(Wallenberg's Syndrome)、Werdnig-Hoffman病(Werdnig-Hoffman Disease)、韦-科综合征(Wernicke-Korsakoff Syndrome)、West综合征(West Syndrome)、颈部过度屈伸(Whiplash)、Whipple病(Whipple's Disease)、威廉斯综合征(Williams Syndrome)、Wilson病(Wilson Disease)、Wolman病(Wolman’s Disease)、X连锁性脊髓和延髓性肌萎缩(X-Linked Spinal and Bulbar Muscular Atrophy)。
本公开另外提供了一种用于治疗哺乳动物受试者(包括人类受试者)的神经系统疾病的方法，该方法包括向该受试者施用本公开的任何AAV颗粒或药物组合物。在一个实施方案中，AAV颗粒是跨越血脑屏障的颗粒。在某些实施方案中，根据本文描述的方法治疗的神经系统疾病包括但不限于肌萎缩性侧索硬化(ALS)、亨廷顿病(HD)、帕金森病(PD)和/或弗里德希氏共济失调(FA)。
试剂盒和装置
试剂盒
本公开提供了用于方便和/或有效地实施本公开的方法的多种试剂盒。通常，试剂盒将包含足够量和/或数量的组分，以允许使用者对受试者进行多种治疗和/或进行多种实验。
本公开的任何AAV颗粒可以包含在试剂盒中。在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括用于产生和/或合成本公开的化合物和/或组合物的试剂和/或说明书。在一些实施方案中，试剂盒还可包含一种或多种缓冲液。在一些实施方案中，本公开的试剂盒可包括用于制备蛋白或核酸阵列或文库的组分，因此可包括例如固体支持物。
在一些实施方案中，试剂盒组分可以包装在水性介质中或处于冻干形式。试剂盒的容器装置通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，可以将组分放置在其中，并且优选适当地等分。如果试剂盒的组分不止一种(标记试剂和标签可以包装在一起)，试剂盒通常还可以包含第二、第三或其他额外的容器，可以在其中分别放置额外的组分。在一些实施方案中，试剂盒还可包含第二容器装置，用于容纳无菌的、药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。在一些实施方案中，组分的各种组合可以包含在一个或多个小瓶中。本公开的试剂盒通常还可以包括严格用于销售的用于容纳本公开的化合物和/或组合物的装置，例如蛋白、核酸和任何其他试剂容器。这样的容器可以包括其中保留有期望的小瓶的注射或吹塑塑料容器。
在一些实施方案中，试剂盒组分以一种和/或多种液体溶液提供。在一些实施方案中，液体溶液是水溶液，尤其优选无菌水溶液。在一些实施方案中，试剂盒组分可以干燥粉末的形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加适当体积的溶剂来重构此类粉末。在一些实施方案中，可以预见的是，也可以在另一容器装置中提供溶剂。在一些实施方案中，标记染料以干粉形式提供。在一些实施方案中，预期在本公开的试剂盒中提供了10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000微克或至少或至多那些量的干染料。在这样的实施方案中，然后可以将染料重悬浮在任何合适的溶剂(例如DMSO)中。
在一些实施方案中，试剂盒可包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其他试剂的说明书。说明书可以包括可以实现的变型。
装置
在一些实施方案中，可使用递送AAV颗粒的装置和头部固定组件将AAV颗粒递送至受试者。头部固定组件可以是但不限于通过MRI措施出售的任何头部固定组件。作为非限制性实例，头部固定组件可以是美国专利号8,099,150、8,548,569和9,031,636以及国际专利公开号WO201108495和WO2014014585中描述的任何组件，其各自内容通过引用整体并入本文。头部固定组件可以与MRI兼容钻头结合使用，例如但不限于国际专利公开WO2013181008和美国专利公开号US20130325012中的MRI兼容钻头，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用用于将器具定位到受试者上的靶点以递送AAV颗粒的方法、系统和/或计算机程序来递送AAV颗粒。作为非限制性实例，该方法、系统和/或计算机程序可以是美国专利号8,340,743中描述的方法、系统和/或计算机程序，其内容通过引用整体并入本文。该方法可以包括：确定身体的靶点和参考点，其中靶点和参考点定义延伸穿过每个点的计划轨迹线(PTL)；确定可视化平面，其中PTL在照准点处与可视化平面相交；相对于主体安装导向装置以相对于PTL移动，其中导向装置不与可视化平面相交；确定引导轴和可视化平面之间的相交点(GPP)；将GPP与可视化平面中的照准点对齐。
在一些实施方案中，可以使用常规增强的递送装置将AAV颗粒递送至受试者。使用对流靶向递送药物的非限制性实例描述于美国专利公开号US20100217228、US20130035574和US20130035660以及国际专利公开号WO2013019830和WO2008144585，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以在递送AAV颗粒之前、期间和/或之后对受试者成像。成像方法可以是本领域已知和/或本文描述的方法，例如但不限于磁共振成像(MRI)。作为非限制性实例，可以将成像用于评估治疗效果。作为另一个非限制性实例，可以将成像用于AAV颗粒的辅助递送。
在一些实施方案中，可使用MRI引导的装置来递送AAV颗粒。MRI引导的装置的非限制性实例描述于美国专利号9,055,884、9,042,958、8,886,288、8,768,433、8,396,532、8,369,930、8,374,677和8,175,677和美国专利申请号US20140024927，其各自内容通过引用整体并入本文。作为非限制性实例，MRI引导的设备可以能够实时提供数据，例如美国专利号8,886,288和8,768,433中描述的，其各自内容通过引用整体并入本文。作为另一个非限制性实例，MRI引导的装置或系统可以与靶向套管一起使用，例如美国专利号8,175,677和8,374,677中描述的系统，其各自内容通过引用整体并入本文。作为又一个非限制性实例，MRI引导的装置包括用于引导介入装置的轨迹引导框架，例如在美国专利号9,055,884和美国专利申请号US20140024927中描述的，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可使用MRI兼容的尖端组件来递送AAV颗粒。MRI兼容的尖端组件的非限制性实例在美国专利公开号US20140275980中描述，其内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可使用MRI兼容的套管来递送AAV颗粒。MRI兼容的套管的非限制性实例包括国际专利公开号WO2011130107中教导的那些，其内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，导管或其一部分或与导管相连的管道被附接、安装、胶合、固定或以其他方式与围绕手术部位/视野的组织可逆地接触。在整个或部分过程中，这种接触可以被定位和/或稳定在一个位置。
在一些实施方案中，可使用MRI兼容的导管来递送AAV颗粒。MRI兼容的导管的非限制性实例包括在国际专利公开号WO2012116265、美国专利公开号8,825,133和美国专利公开号US20140024909中教导的那些，其各自的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可使用具有细长管状主体和隔膜的装置来递送AAV颗粒，如美国专利公开号US20140276582和US20140276614所述，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可使用MRI兼容的定位和/或引导系统来递送AAV颗粒，所述定位和/或引导系统例如但不限于美国专利公开号US20150223905和US20150230871中描述的那些，其各自内容通过引用整体并入本文。作为非限制性实例，MRI兼容的定位和/或引导系统可包括适于固定到患者的底座，具有配置成附接到底座的内腔从而能够以至少三个维度可控地转移的靶向套管，以及细长探针，该细长探针被配置为通过滑动紧贴地前进并在靶向套管内腔中缩回，该细长探针包括刺激或记录电极中的至少一个。
在一些实施方案中，可以使用如美国专利公开号US20150031982和US20140066750以及国际专利公开号WO2015057807和WO2014039481中所述的轨迹框架将AAV颗粒递送至受试者，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，可以使用基因枪将AAV颗粒递送至受试者。
编码蛋白有效载荷的AAV颗粒的使用
本公开提供了将根据本公开的方法和系统制造的AAV颗粒引入细胞的方法，该方法包括将足以增加靶mRNA和蛋白产生的量的任何载体引入所述细胞中。在一些方面，细胞可以是肌肉细胞、干细胞、神经元，例如但不限于运动、海马、内嗅、丘脑或皮层神经元，以及神经胶质细胞，例如星形胶质细胞或小胶质细胞。
本公开公开了用于在需要治疗的受试者中治疗与靶蛋白的功能/存在不足相关的神经系统疾病的方法。该方法任选地包括向受试者施用治疗有效量的包含本公开的AAV颗粒的组合物。作为非限制性实例，AAV颗粒可以增加靶基因的表达，增加靶蛋白的产生，并因此减少受试者中神经系统疾病的一种或多种症状，从而对受试者进行治疗性治疗。
在某些实施方案中，包含编码蛋白有效载荷的核酸的本公开的AAV颗粒包括AAV衣壳，其允许在静脉内施用后穿过血脑屏障递送。
在某些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒的组合物通过全身性施用被施用至受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中，全身性施用是静脉内注射。
在某些实施方案中，将包含本公开的AAV颗粒的组合物施用于受试者的中枢神经系统。在某些实施方案中，将包含本公开的AAV颗粒的组合物施用于受试者的组织(例如受试者的脑)。
在某些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒的组合物通过实质内注射施用于受试者的中枢神经系统。实质内注射的非限制性实例包括丘脑内、纹状体内、海马内或靶向内嗅皮层。
在某些实施方案中，通过实质内注射和鞘内注射将包含本公开的AAV颗粒的组合物施用于受试者的中枢神经系统。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以被递送到特定类型的靶细胞中，包括但不限于海马、皮层、运动或内嗅神经元；或神经胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞；和/或其他围绕神经元的细胞，例如T细胞。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以被递送至纹状体(例如核壳)和/或皮质中的神经元。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以用作神经系统疾病的疗法。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以用于增加靶蛋白并减轻受试者的神经系统疾病的症状。靶蛋白的增加和/或神经系统疾病症状的减轻可以独立地改变(靶蛋白的产生增加和神经系统疾病症状减轻)5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
包含RNAi多核苷酸的AAV颗粒的用途
本公开提供了将包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒引入细胞的方法，该方法包括将足以降解靶mRNA的量的任何载体引入所述细胞，从而激活细胞中的靶标特异性RNAi。在一些方面，细胞可以是肌肉细胞、干细胞、神经元，例如但不限于运动、海马、内嗅、丘脑或皮层神经元，以及神经胶质细胞，例如星形胶质细胞或小胶质细胞。
本公开公开了用于在需要治疗的受试者中治疗与靶蛋白的功能障碍有关的神经系统疾病的方法。所述方法任选地包括向受试者施用治疗有效量的包含AAV颗粒的组合物，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。作为非限制性实例，siRNA分子可以沉默靶基因的表达，抑制靶蛋白的产生，并减轻受试者中神经系统疾病的一种或多种症状，从而对受试者进行治疗性治疗。
在某些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(其包含编码siRNA分子的核酸序列)的组合物包括AAV衣壳，其允许在静脉内施用后通过血脑屏障递送。
在某些实施方案中，将包含AAV颗粒的组合物施用于受试者的中枢神经系统，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。在某些实施方案中，将包含AAV颗粒的组合物施用于受试者的组织(例如，受试者的脑)，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。
在某些实施方案中，包含AAV颗粒的组合物通过全身性施用被施用于受试者的中枢神经系统，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。在某些实施方案中，全身性施用是静脉内注射。
在某些实施方案中，将包含AAV颗粒的组合物通过实质内注射施用于受试者的中枢神经系统，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。实质内注射的非限制性实例包括丘脑内、纹状体内、海马内或靶向内嗅皮层。
在某些实施方案中，通过实质内注射和鞘内注射将包含AAV颗粒的组合物施用于受试者的中枢神经系统，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。
在某些实施方案中，可以将包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒递送至特定类型的靶向细胞，包括但不限于海马、皮层、运动或内嗅神经元；神经胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞；和/或其他围绕神经元的细胞，例如T细胞。
在某些实施方案中，可以将包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒递送至纹状体和/或皮层中的神经元。
在某些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用作神经系统疾病的疗法。
在某些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用作肌萎缩性侧索硬化症的疗法。
在某些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用作亨廷顿舞蹈症的疗法。
在某些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用作帕金森病的疗法。
在某些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用作弗里德希氏共济失调的疗法。
在某些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可用于抑制靶标以治疗神经系统疾病。星形胶质细胞中的靶蛋白可能被阻抑5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。星形胶质细胞中的靶蛋白可能减少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在某些实施方案中，向受试者施用编码本公开的siRNA的AAV颗粒可以降低受试者中的靶蛋白水平。在受试者中，例如但不限于受试者的CNS、CNS区域或CNS的特定细胞中，靶蛋白水平可以降低约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，AAV颗粒可以使靶蛋白的蛋白水平降低至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可以使靶蛋白的蛋白水平降低至少40％。
治疗适应症
帕金森病
帕金森病(PD)是一种神经系统的进行性疾病，尤其会影响大脑的黑质。PD是由于产生多巴胺的脑细胞丧失而发展的。PD的典型早期症状包括肢体(例如手、胳膊、腿、脚和脸)的抖动或颤抖。其他特征性症状是肢体和躯干的僵硬、移动缓慢或无法移动、平衡与协调能力受损、认知变化以及精神疾病，例如抑郁症和视觉幻觉。PD具有家族和特发性形式，建议与遗传和环境原因相关。PD影响全球超过400万人。在美国，每年约有60,000例病例被发现。通常，PD开始于50岁或50岁以上。这种疾病的早发形式始于50岁以下，而少年PD则始于20岁。
与PD相关的产生多巴胺的脑细胞的死亡与α-突触核蛋白的聚集、沉积和功能障碍有关(参见例如Marques和Outeiro,2012,Cell Death Dis.3:e350,Jenner,1989,J NeurolNeurosurg Psychiatry，特别增补22-28及其中的参考文献)。研究表明，α-突触核蛋白在突触前信号传导、膜运输以及多巴胺释放和运输的调节中具有作用。α-突触核蛋白聚集物(例如以寡聚体形式)被认为是导致神经元功能障碍和死亡的物质。已经确定了PD家族形式的α-突触核蛋白基因(SNCA)突变，但也识别了环境因素，例如神经毒素影响α-突触核蛋白的聚集。PD中脑细胞死亡的其他提示原因是蛋白体和溶酶体系统功能障碍、线粒体活性减少。
PD与同α-突触核蛋白聚集有关的其他疾病相关，称为“共核蛋白病(synucleinopathy)”。这类疾病包括但不限于帕金森病痴呆症(PDD)、多系统萎缩症(MSA)、路易体痴呆症、少年发作的广泛性神经轴索营养不良(Hallervorden-Spatz病)、纯自主神经衰竭(PAF)、伴有1型脑铁蓄积的神经退行变性(NBIA-1)以及合并的阿尔茨海默氏病和帕金森病。
迄今为止，尚未发现PD的治愈或预防性疗法。可用的多种药物疗法可缓解症状。对症药物治疗的非限制性实例包括卡比多巴和左旋多巴的组合以减少僵硬和缓慢运动，以及抗胆碱能药以减少发抖和僵硬。其他可选疗法包括例如深层大脑刺激和手术。仍然需要影响潜在病理生理的疗法。例如，靶向α-突触核蛋白的抗体或与PD中脑细胞死亡相关的其他蛋白的抗体可用于预防和/或治疗PD。
在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗患有PD和其他共核蛋白病的受试者。在某些情况下，本公开的方法可以用于治疗怀疑患有PD和其他共核蛋白病的受试者。
本公开中描述的AAV颗粒、药物制剂和使用病毒颗粒的方法可以用于预防、管理和/或治疗PD。
脊髓性肌萎缩
脊髓性肌萎缩(SMA)是一种遗传性疾病，可导致婴儿和儿童手臂和腿部的随意肌的无力和虚弱。SMA与存活的运动神经元基因1(SMN1)的蛋白产生异常有关。蛋白缺乏会影响下运动神经元的变性和死亡。典型的症状包括四肢和躯干松软、手臂和腿部动作微弱、吞咽和进食困难以及呼吸障碍。SMA是导致2岁以下儿童死亡的最常见的遗传疾病。每6,000至10,000人中就有一人受到SMA影响。
到目前为止，SMA还没有治愈方法。可用的疗法旨在症状的管理和预防其他并发症。这样的疗法例如与心脏病学、运动管理、呼吸保健和心理健康相关。仍然需要影响SMA的潜在病理生理学以及相关疾病和病症的疗法。
在某些实施方案中，本公开的AAV颗粒和方法可以用于治疗患有SMA以及相关疾病和病症的受试者。在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗怀疑患有SMA或相关疾病和病症的受试者。
本公开中描述的AAV颗粒、药物制剂和使用病毒颗粒的方法可以用于预防、管理和/或治疗SMA以及相关疾病和病症。
阿尔茨海默氏病
阿尔茨海默氏病(AD)是一种衰老性神经退行性疾病，是影响记忆，思维和行为的最常见的痴呆形式。典型的早期症状是难以记住新学习的信息。随着疾病的发展，症状包括迷失方向、睡眠改变、情绪和行为改变、困惑、没有根据的怀疑以及最终难以说话、吞咽和行走。AD目前在全球范围内影响超过3500万人，并且在未来几十年中，这个数字有望翻倍。
到目前为止，尚未发现AD的治愈或预防疗法。可以使用药物疗法来治疗记忆力减退、行为改变和睡眠改变，并减慢AD的进程。但是，这些对症治疗不能解决潜在的病理生理问题。
在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗患有AD及相关疾病和病症的受试者。在某些实施方案中，本公开的方法可以用作用于治疗怀疑患有AD或相关疾病和病症的受试者的疗法。
本公开中描述的AAV颗粒、药物制剂和使用病毒颗粒的方法可以用于预防、管理和/或治疗AD及相关疾病和病症。
肌萎缩性侧索硬化(ALS)
肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，也称为Lou Gehrig病或经典运动神经元疾病，是一种快速进行性致命神经系统疾病。ALS与细胞变性以及上运动神经元和下运动神经元的死亡相关，导致肌肉运动丧失、对随意肌运动的肌肉运动启动、减弱、消瘦和丧失。早期症状包括手、腿和吞咽肌肉的肌肉无力，最终由于隔膜衰竭而发展为无法呼吸。根据疾病控制与预防中心(CDC)的数据，在美国，ALS影响了大约12,000-15,000人，大约5-10％的病例是家族性的。
ALS像其他非感染性神经退行性疾病一样，其特征是存在错误折叠的蛋白。家族性ALS与TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)和RNA结合蛋白FUS/TLS的突变有关。已经识别出一些蛋白可以减缓ALS的进展，例如但不限于生长因子，例如胰岛素样生长因子1(IGF-1)、神经胶质细胞系生长因子、脑源性生长因子、血管内皮生长因子和睫状神经营养因子或促进肌肉生长的生长因子，例如肌生长抑制素。
到目前为止，尚无ALS的预防或治疗方法。FDA批准的药物利鲁唑(niluzole)已被批准延长寿命，但对症状没有影响。另外，可以使用药物和医疗设备来耐受与ALS相关的疼痛和发作。仍然需要影响潜在病理生理的疗法。
在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗患有ALS的受试者。在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗怀疑患有ALS或相关疾病和病症的受试者。
本公开中描述的AAV颗粒、药物制剂和使用病毒颗粒的方法可以用于预防、管理和/或治疗ALS以及相关疾病和病症。
亨廷顿舞蹈病
亨廷顿舞蹈病(HD)是一种单基因致命性神经退行性疾病，是一种罕见的遗传性疾病，会导致大脑运动控制区以及其他区的神经元退化。在美国，HD影响到大约30,000人。HD是由与亨廷顿蛋白(HTT)相关的基因突变引起的。突变导致DNA的(CAG)区段异常重复多次。在一些实施方案中，受试者具有完全外显的HD，其中HTT基因具有41个或更多个CAG重复(例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或大于90个CAG重复)。在一些实施方案中，受试者具有不完全的外显率，其中HTT基因具有36至40个CAG重复(例如36、37、38、39和40个CAG重复)。
已知亨廷顿舞蹈病是由常染色体显性三联体(CAG)重复扩增引起的，该扩增在亨廷顿蛋白(HTT)的N端编码聚谷氨酰胺。疾病发生的扩增阈值被认为是大约35-40个残基。这种重复扩增导致HTT功能的毒性增加，并最终导致纹状体神经退化，其进而发展为广泛的脑萎缩。在HD中，纹状体的中型多棘神经元似乎特别脆弱，损失高达95％，而中间神经元在很大程度上得以幸免。
特别地，HD还与由HTT的N末端区形成的纹状体神经元中富含β折叠的聚集体相关。随着HD的发展，扩增和聚集导致神经元逐渐丢失。此外，HD中的细胞死亡与死亡受体6(DR6)有关，DR6已知会诱导细胞凋亡。症状通常出现在35-44岁之间，发病后的预期寿命是10-25年。有趣的是，HTT扩增的长度与发病年龄和疾病进展速度相关，更长的扩增与更严重的疾病程度相关。在少数HD群体(约6％)中，疾病发作从2-20岁开始，伴有运动僵硬综合征。这些病例的进展往往比后来发病的病例要快，并且已被分类为青少年或Westphal变异HD。据估计，在美国和欧洲，目前约有35,000-70,000患者患有HD。当前，仅症状缓解和支持疗法可用于HD的治疗，尚未找到治愈的方法。最终，患有HD的个体会死于其他疾病(例如肺炎、心力衰竭)、气哽(choking)、窒息(suffocation)或其他并发症，例如跌倒造成的身体伤害。
CAG扩增的HTT导致神经毒性的机制尚不清楚。亨廷顿蛋白在所有细胞中都有表达，尽管其浓度在大脑中最高。HTT的正常功能尚不清楚，但在HD患者的大脑中，HTT聚集成异常的核包含物。现在认为，正是这种错误折叠和聚集以及相关的蛋白中间体(即可溶性物质和有毒的N-末端片段)的过程导致了神经毒性。
亨廷顿舞蹈症对生活质量产生深远影响。症状通常出现在35-44岁，发病后的预期寿命是10-25年。在少数HD群体(约6％)中，疾病发作在21岁之前开始，伴有运动僵硬综合征。这些病例的进展往往比后来发病的病例要快，并且已被分类为青少年或Westphal变异HD。据估计，在美国和欧洲，目前约有35,000-70,000患者患有HD。当前，仅症状缓解和支持疗法可用于HD的治疗，尚未找到治愈的方法。最终，患有HD的个体会死于肺炎、心力衰竭、或其他并发症，例如跌倒造成的身体伤害。
HD的症状可能包括归因于CNS变性的特征，例如但不限于舞蹈症(运动不受控制)、肌张力障碍、运动迟缓、不协调、烦躁和沮丧、解决问题困难、由于行为、判断和认知的变化人的正常日常生活能力降低(例如神经精神病学障碍和认知障碍)、言语减弱和吞咽困难；以及非归因于CNS变性的特征，例如但不限于体重减轻(例如来自吞咽食物困难)、肌肉消瘦、代谢功能障碍和内分泌失调。
到目前为止，还没有治愈或预防该疾病进展的疗法。可用的药物疗法旨在缓解症状。例如，FDA已批准将tetrabenezine用于预防舞蹈症。另外，例如抗精神病药可以帮助控制妄想、幻觉和暴力爆发。仍然需要影响潜在病理生理问题的疗法，例如靶向HTT蛋白、DR6蛋白和/或其他HD相关蛋白的抗体疗法。
腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的成员，并且已成为基因治疗的吸引人的载体，这在很大程度上是因为这种病毒是明显非致病性的；事实上，AAV尚未与任何人类疾病有关。进一步的吸引力是由于它具有转导分裂和非分裂细胞的能力(包括有效的神经元转导)，减少了人类的促炎和免疫反应，在没有辅助病毒的情况下无法自主复制(AAV是一种依赖于辅助基因的DNA细小病毒(属依赖病毒属)及其长期基因表达。尽管已将10多种重组AAV血清型(rAAV)工程化到载体中，但rAAV2是基因治疗试验中最常用的血清型。还开发了其他神经元转导方面更为有效的rAAV血清型，并在动物模型中进行了测试。
对HD动物模型的研究表明，表型逆转是可行的，例如在受调节的表达模型中基因关闭后。在允许关闭94-聚谷氨酰胺重复HTT蛋白表达的小鼠模型中，不仅临床症状被逆转，而且细胞内聚集体也被溶解。此外，其中测试了HTT沉默的动物模型显示出有希望的结果，该疗法具有良好的耐受性并显示出潜在的治疗益处。这些发现表明，HTT沉默可能作为HD治疗的潜在治疗靶标。
可与本文所述的调节性多核苷酸和AAV颗粒一起使用的用于研究亨廷顿舞蹈病的模型系统包括但不限于细胞模型(例如原代神经元和诱导性多能干细胞)、无脊椎动物模型(例如果蝇(drosophila)或秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans))、小鼠模型(例如YAC128小鼠模型；R6/2小鼠模型；BAC和敲入小鼠模型)、大鼠模型(例如BAC)和大型哺乳动物模型(例如小型猪、猪、绵羊或猴)。
本文公开了在需要治疗的受试者中治疗与HTT蛋白相关的亨廷顿舞蹈病(HD)的方法。所述方法任选地包括向受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物至少包含AAV颗粒，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列。作为非限制性实例，siRNA分子可沉默HTT基因表达，抑制HTT蛋白产生，并减轻受试者中HD的一种或多种症状，从而对HD进行治疗性治疗。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒及其制剂可用于抑制或预防受试者(例如，被诊断出HD体征或显示出HD体征的受试者)中CAG扩增的HTT的表达以治疗HD。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒及其制剂可用于靶向HTT mRNA以治疗HD。AAV颗粒可以包括编码双链RNA(dsRNA)构建体和siRNA构建体的调节性多核苷酸。
在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗患有HD以及相关疾病和病症的受试者。在某些实施方案中，本公开的方法可以用于治疗怀疑发展成HD或相关疾病和病症的受试者。
本公开中描述的AAV颗粒、药物制剂和使用病毒颗粒的方法可以用于预防、管理和/或治疗HD和相关疾病和病症。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可用于减少有此需要的受试者中HTT的量，并因此提供本文所述的治疗益处。
本文描述的是用于施用AAV颗粒的组合物、方法、过程、试剂盒和/或装置，其包含编码siRNA分子的调节性多核苷酸，用于治疗、预防、缓解和/或改善亨廷顿舞蹈病(HD)相关的症状和病症。
本公开提供了用于治疗亨廷顿舞蹈症(HD)的药学上可接受的制剂形式的药物组合物，该药物组合物包含AAV颗粒，该AAV颗粒包含靶向HTT mRNA的调节性多核苷酸(例如，siRNA)。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含AAV病毒基因组，其包含选自SEQ ID NO:41-82或其具有至少95％同一性的变体的多核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸序列是SEQID NO:41或其具有至少95％同一性的变体。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以包含血清型，例如但不限于本文列出的任何血清型。在一些实施方案中，AAV颗粒包含AAV1血清型。
在一些实施方案中，药物组合物中AAV颗粒的浓度不大于5x1013VG/mL。在一些实施方案中，AAV颗粒的浓度为2.5x1013至3x1013 VG/mL。在一些实施方案中，AAV颗粒的浓度为5x1011至1x1013 VG/mL。在一些实施方案中，AAV颗粒的浓度为2.7x1013 VG/mL。在一些实施方案中，AAV颗粒的浓度为2.7x1012 VG/mL。
在一些实施方案中，药学上可接受的制剂是一种水溶液，包含a)一种或多种盐；b)至少一种二糖；和c)缓冲剂。
在一些实施方案中，一种或多种盐可以包括氯化钠、氯化钾和/或磷酸钾，或其组合。
在一些实施方案中，盐可以包括氯化钠。制剂中氯化钠的浓度可以为80至220mM。氯化钠的浓度可以是85至110mM。在一些实施方案中，氯化钠的浓度是95mM。在一些实施方案中，氯化钠的浓度是100mM。
在一些实施方案中，盐可以包括氯化钾。氯化钾的浓度可以为1至3mM。在一些实施方案中，氯化钾的浓度为1.5mM。
在一些实施方案中，盐可以包括磷酸钾。磷酸钾的浓度可以为1至3mM。在一些实施方案中，磷酸钾的浓度可以为1.5mM。
在一些实施方案中，盐可以包括氯化钠和氯化钾。
在一些实施方案中，盐可以包括氯化钠和磷酸钾。
在一些实施方案中，盐可以包括氯化钠、氯化钾和磷酸钾。
在一些实施方案中，二糖可以包括选自以下的至少一种：蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芸香酮糖(rutinulose)和木二糖。
在一些实施方案中，二糖包括蔗糖。相对于制剂的总体积，蔗糖的浓度可以为5至9重量％。在一些实施方案中，相对于制剂的总体积，蔗糖的浓度可以为5重量％。在一些实施方案中，相对于制剂的总体积，蔗糖的浓度可以为7重量％。
在一些实施方案中，缓冲剂可包括选自以下的任一种：Tris HCl、Tris碱、磷酸钠、磷酸钾、组氨酸、硼酸、柠檬酸、甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)和MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)。
在一些实施方案中，缓冲剂在5℃下提供7.2至8.2的pH。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为1-20mM。在一些实施方案中，缓冲剂的浓度为10mM。
在一些实施方案中，缓冲剂是磷酸钠，并且5℃下的pH为7.2至7.6。
在一些实施方案中，缓冲剂是Tris碱，并用盐酸将在5℃下的pH调节至7.8至8.2。
在一些实施方案中，缓冲剂是Tris碱，并用盐酸将在5℃下的pH调节至7.3至7.7。
在一些实施方案中，药学上可接受的制剂还包含表面活性剂。
在一些实施方案中，表面活性剂可以是泊洛沙姆188(例如
)。相对于制剂的总体积，泊洛沙姆188的浓度可以为0.0001重量％至0.01重量％(mg/L)。在一些实施方案中，相对于制剂的总体积，泊洛沙姆188的浓度为0.001重量％。
在一些实施方案中，制剂的重量克分子渗透压浓度为400至500mOsm/kg。在一些实施方案中，重量克分子渗透浓度可以为400至480mOsm/kg。
本文还提供了通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的药物组合物来治疗受试者的亨廷顿舞蹈病的方法。在一些实施方案中，药物组合物可以通过输注到受试者的核壳和丘脑中来施用。输注可以独立地为双侧或单侧注入到核壳和丘脑中。可以使用磁共振成像(MRI)引导的对流增强递送(CED)来施用药物组合物。在一些实施方案中，可以使用递增的输注速率将剂量体积施用到输注部位。
在一些实施方案中，施用至核壳的药物组合物的体积可以不大于1500μL/半球。在一些实施方案中，施用至核壳的药物组合物的体积可以为300-1500μL/半球。在一些实施方案中，施用至核壳的药物组合物的体积可以为900μL/半球形。在一些实施方案中，施用至核壳的剂量可以为8x1011至4x1013 VG/半球。
在一些实施方案中，施用至丘脑的药物组合物的体积可以不大于2500μL/半球。施用至丘脑的药物组合物的体积可以为1300-2500μL/半球。在一些实施方案中，施用至丘脑的药物组合物的体积可以为1700μL/半球。在一些实施方案中，施用至丘脑的剂量可以为3.5x1012至6.8x1013 VG/半球。
在一些实施方案中，施用至受试者的总剂量可以为8.6x1012至2x1014VG。
在一些实施方案中，本文描述的方法抑制或阻抑受试者的纹状体中的亨廷顿蛋白(HTT)基因的表达。在一些实施方案中，HTT基因在核壳中的表达被抑制或阻抑。HTT基因在核壳的一个或多个中型多棘神经元和/或星形胶质细胞中的表达可以被抑制或阻抑。在一些实施方案中，HTT基因在尾状核中的表达被抑制或阻抑。HTT基因在核壳中的表达可被降低至少30％。在一些实施方案中，HTT基因在核壳中的表达可被降低40-70％。在一些实施方案中，HTT基因在核壳中的表达可被降低50-80％。HTT基因在尾状核中的表达可被降低至少30％。在一些实施方案中，HTT基因在尾状核中的表达可被降低40-70％。在一些实施方案中，HTT基因在尾状核中的表达可被降低50-80％。
在一些实施方案中，本文所述的方法抑制或阻抑受试者的丘脑中的亨廷顿蛋白(HTT)基因的表达。HTT基因在丘脑的一个或多个丘脑神经元和/或星形胶质细胞中的表达可以被抑制或阻抑。HTT基因在丘脑中的表达可降低至少30％。在一些实施方案中，HTT在丘脑中的表达可以减少40-80％。
在一些实施方案中，本文所述的方法抑制或阻抑受试者的大脑皮层中的亨廷顿蛋白(HTT)基因的表达。HTT基因在初级运动皮层和躯体感觉皮层中的表达可以被抑制或阻抑。HTT基因在初级运动皮层和躯体感觉皮层的锥体神经元中的表达被抑制或阻抑。HTT基因的表达被降低至少20％。在一些实施方案中，HTT的表达被降低30-70％。
在一些实施方案中，本文所述的方法抑制或阻抑受试者的纹状体和大脑皮层中的亨廷顿蛋白(HTT)基因的表达。
靶向HTT的siRNA分子
在一些实施方案中，调节性多核苷酸(例如RNA或DNA分子)可用于治疗神经退行性疾病，特别是亨廷顿舞蹈病(HD)。作为非限制性实例，在美国专利号9,169,483和9,181,544和国际专利公开号WO2015179525(其各自内容通过引用整体并入本文)中描述了RNAi分子，所述RNAi分子被设计为靶向编码会引起聚谷氨酰胺扩增疾病(诸如亨廷顿舞蹈病)的聚氨酰胺重复蛋白的核酸序列。美国专利号9,169,483和9,181,544以及国际专利公开号WO2015179525各自提供了分离的RNA双链体，其包含RNA的第一条链(例如15个连续的核苷酸)和RNA的第二条链(例如与第一条链的至少12个连续的核苷酸互补)，其中RNA双链体的长度为约15至30个碱基对。RNA的第一条链和RNA的第二条链可以通过RNA环(～4至50个核苷酸)有效地连接以形成发夹结构，该发夹结构可以插入表达盒中。环部分的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO:9-14，其内容通过引用整体并入本文。可用于(完整序列或部分序列)形成RNA双链体的RNA链的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO:1-8和美国专利号9,181,544的SEQ ID NO:1-11、33-59、208-210、213-215和218-221，其各自内容通过引用整体并入本文。RNAi分子的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的SEQ ID NO:1-8，美国专利号9,181,544的SEQ ID NO:1-11、33-59、208-210、213-215和218-221和国际专利公开号WO2015179525的SEQ ID NO:1、6、7和35-38，其各自内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，靶向HTT mRNA以干扰HTT基因表达和/或HTT蛋白产生的小干扰RNA(siRNA)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)包括在本公开的AAV颗粒及其制剂中。
在本领域中已经提出了一些设计siRNA的指南。这些指南通常建议生成19个核苷酸的双链体区、对称的2-3个核苷酸的3’突出端、5’-磷酸基团和3’-羟基，靶向待沉默的基因中的区域。其他可能影响siRNA序列偏好的规则包括但不限于：(i)反义链5’端的A/U；(ii)有义链5’端的G/C；(iii)在反义链的5’端三分之一的至少五个A/U残基；和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何GC片段。根据这样的考虑以及靶基因的特定序列，可以容易地设计阻抑哺乳动物靶基因表达所必需的高效siRNA分子。
根据本公开，设计了靶向HTT基因的siRNA分子(例如，siRNA双链体或编码的dsRNA)。这样的siRNA分子可以特异性地阻抑HTT基因表达和蛋白产生。在某些方面，siRNA分子被设计并用于选择性“敲除”细胞中的HTT基因变体，即在HD疾病患者中识别的突变型HTT转录物。在一些方面，siRNA分子被设计并用于选择性“敲低”细胞中的HTT基因变体。在其他方面，siRNA分子能够抑制或阻抑野生型和突变型HTT基因。
在一些实施方案中，本公开的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与HTT mRNA序列具有足够的互补性以引导靶特异性RNAi，即siRNA分子具有足以触发通过RNAi机制或过程破坏靶mRNA的序列。
在一些实施方案中，本公开的siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起以形成双链体结构，并且与HTT mRNA杂交的起始位点在HTT mRNA序列的核苷酸100至7000之间。作为非限制性实例，起始位点可以在HTT mRNA序列的以下核苷酸之间：100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200、3200-3250、3250-3300、3300-3350、3350-3400、3400-3450、3450-3500、3500-3550、3550-3600、3600-3650、3650-3700、3700-3750、3750-3800、3800-3850、3850-3900、3900-3950、3950-4000、4000-4050、4050-4100、4100-4150、4150-4200、4200-4250、4250-4300、4300-4350、4350-4400、4400-4450、4450-4500、4500-4550、4550-4600、4600-4650、4650-4700、4700-4750、4750-4800、4800-4850、4850-4900、4900-4950、4950-5000、5000-5050、5050-5100、5100-5150、5150-5200、5200-5250、5250-5300、5300-5350、5350-5400、5400-5450、5450-5500、5500-5550、5550-5600、5600-5650、5650-5700、5700-5750、5750-5800、5800-5850、5850-5900、5900-5950、5950-6000、6000-6050、6050-6100、6100-6150、6150-6200、6200-6250、6250-6300、6300-6350、6350-6400、6400-6450、6450-6500、6500-6550、6550-6600、6600-6650、6650-6700、6700-6750、6750-6800、6800-6850、6850-6900、6900-6950、6950-7000、7000-7050、7050-7100、7100-7150、7150-7200、7200-7250、7250-7300、7300-7350、7350-7400、7400-7450、7450-7500、7500-7550、7550-7600、7600-7650、7650-7700、7700-7750、7750-7800、7800-7850、7850-7900、7900-7950、7950-8000、8000-8050、8050-8100、8100-8150、8150-8200、8200-8250、8250-8300、8300-8350、8350-8400、8400-8450、8450-8500、8500-8550、8550-8600、8600-8650、8650-8700、8700-8750、8750-8800、8800-8850、8850-8900、8900-8950、8950-9000、9000-9050、9050-9100、9100-9150、9150-9200、9200-9250、9250-9300、9300-9350、9350-9400、9400-9450、9450-9500、9500-9550、9550-9600、9600-9650、9650-9700、9700-9750、9750-9800、9800-9850、9850-9900、9900-9950、9950-10000、10000-10050、10050-10100、10100-10150、10150-10200、10200-10250、10250-10300、10300-10350、10350-10400、10400-10450、10450-10500、10500-10550、10550-10600、10600-10650、10650-10700、10700-10750、10750-10800、10800-10850、10850-10900、10900-10950、10950-11000、11050-11100、11100-11150、11150-11200、11200-11250、11250-11300、11300-11350、11350-11400、11400-11450、11450-11500、11500-11550、11550-11600、11600-11650、11650-11700、11700-11750、11750-11800、11800-11850、11850-11900、11900-11950、11950-12000、12000-12050、12050-12100、12100-12150、12150-12200、12200-12250、12250-12300、12300-12350、12350-12400、12400-12450、12450-12500、12500-12550、12550-12600、12600-12650、12650-12700、12700-12750、12750-12800、12800-12850、12850-12900、12900-12950、12950-13000、13050-13100、13100-13150、13150-13200、13200-13250、13250-13300、13300-13350、13350-13400、13400-13450和13450-13500。作为又一个非限制性实例，起始位点可以是HTT mRNA序列的核苷酸315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、1375、1376、1377、1378、1379、1380、1381、1382、1383、1384、1385、1386、1387、1388、1389、1390、1391、1392、1393、1394、1395、1396、1397、1398、1399、1400、1401、1402、1403、1404、1405、1406、1407、1408、1409、1410、1411、1412、1413、1414、1415、1416、1417、1418、1419、1420、1421、1422、1423、1424、1425、1426、1427、1428、1429、1430、1431、1432、1433、1434、1435、1436、1437、1438、1439、1440、1441、1442、1443、1444、1445、1446、1447、1448、1449、1450、1660、1661、1662、1663、1664、1665、1666、1667、1668、1669、1670、1671、1672、1673、1674、1675、2050、2051、2052、2053、2054、2055、2056、2057、2058、2059、2060、2061、2062、2063、2064、2065、2066、2067、2068、2069、2070、2071、2072、2073、2074、2075、2076、2077、2078、2079、2080、2081、2082、2083、2084、2085、2086、2087、2088、2089、2090、2091、2092、2093、2094、2095、2096、2097、2098、2099、2100、2580、2581、2582、2583、2584、2585、2586、2587、2588、2589、2590、2591、2592、2593、2594、2595、2596、2597、2598、2599、2600、2601、2602、2603、2604、2605、4525、4526、4527、4528、4529、4530、4531、4532、4533、4534、4535、4536、4537、4538、4539、4540、4541、4542、4543、4544、4545、4546、4547、4548、4549、4550、4575、4576、4577、4578、4579、4580、4581、4582、4583、4584、4585、4586、4587、4588、4589、4590、4591、4592、4593、4594、4595、4596、4597、4598、4599、4600、4850、4851、4852、4853、4854、4855、4856、4857、4858、4859、4860、4861、4862、4863、4864、4865、4866、4867、4868、4869、4870、4871、4872、4873、4874、4875、4876、4877、4878、4879、4880、4881、4882、4883、4884、4885、4886、4887、4888、4889、4890、4891、4892、4893、4894、4895、4896、4897、4898、4899、4900、5460、5461、5462、5463、5464、5465、5466、5467、5468、5469、5470、5471、5472、5473、5474、5475、5476、5477、5478、5479、5480、6175、6176、6177、6178、6179、6180、6181、6182、6183、6184、6185、6186、6187、6188、6189、6190、6191、6192、6193、6194、6195、6196、6197、6198、6199、6200、6315、6316、6317、6318、6319、6320、6321、6322、6323、6324、6325、6326、6327、6328、6329、6330、6331、6332、6333、6334、6335、6336、6337、6338、6339、6340、6341、6342、6343、6344、6345、6600、6601、6602、6603、6604、6605、6606、6607、6608、6609、6610、6611、6612、6613、6614、6615、6725、6726、6727、6728、6729、6730、6731、6732、6733、6734、6735、6736、6737、6738、6739、6740、6741、6742、6743、6744、6745、6746、6747、6748、6749、6750、6751、6752、6753、6754、6755、6756、6757、6758、6759、6760、6761、6762、6763、6764、6765、6766、6767、6768、6769、6770、6771、6772、6773、6774、6775、7655、7656、7657、7658、7659、7660、7661、7662、7663、7664、7665、7666、7667、7668、7669、7670、7671、7672、8510、8511、8512、8513、8514、8515、8516、8715、8716、8717、8718、8719、8720、8721、8722、8723、8724、8725、8726、8727、8728、8729、8730、8731、8732、8733、8734、8735、8736、8737、8738、8739、8740、8741、8742、8743、8744、8745、9250、9251、9252、9253、9254、9255、9256、9257、9258、9259、9260、9261、9262、9263、9264、9265、9266、9267、9268、9269、9270、9480、9481、9482、9483、9484、9485、9486、9487、9488、9489、9490、9491、9492、9493、9494、9495、9496、9497、9498、9499、9500、9575、9576、9577、9578、9579、9580、9581、9582、9583、9584、9585、9586、9587、9588、9589、9590、10525、10526、10527、10528、10529、10530、10531、10532、10533、10534、10535、10536、10537、10538、10539、10540、11545、11546、11547、11548、11549、11550、11551、11552、11553、11554、11555、11556、11557、11558、11559、11560、11875、11876、11877、11878、11879、11880、11881、11882、11883、11884、11885、11886、11887、11888、11889、11890、11891、11892、11893、11894、11895、11896、11897、11898、11899、11900、11915、11916、11917、11918、11919、11920、11921、11922、11923、11924、11925、11926、11927、11928、11929、11930、11931、11932、11933、11934、11935、11936、11937、11938、11939、11940、13375、13376、13377、13378、13379、13380、13381、13382、13383、13384、13385、13386、13387、13388、13389和13390。
在一些实施方案中，反义链和靶mRNA序列具有100％互补性。反义链可以与靶mRNA序列的任何部分互补。
在其他实施方案中，反义链和靶mRNA序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链和靶mRNA序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。
在一些实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。
根据本公开，编码的siRNA分子的长度为约10-50个或更多个核苷酸，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，siRNA分子的长度为约15-30个核苷酸，例如每条链15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区充分互补。在一些实施方案中，siRNA分子的每条链的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在一些实施方案中，siRNA分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。
在一些实施方案中，本公开的编码的siRNA分子可以是合成的RNA双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸，和在3'端的两个突出的核苷酸。在一些方面，siRNA分子可以是未修饰的RNA分子。在其他方面，siRNA分子可包含至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或骨架修饰。
在一些实施方案中，本公开的编码的siRNA分子可包含核苷酸序列，例如但不限于反义(引导)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，在本公开的siRNA分子中使用的反义序列为表1中核苷酸序列(其包括WO2017201258的SEQ ID NO:3-102，其内容通过引用整体并入本文)的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，本公开的siRNA分子中使用的反义序列包含表1中核苷酸序列(其包括WO2017201258的SEQID NO:3-102，其内容通过引用整体并入本文)的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或大于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性实例，本公开的siRNA分子中使用的反义序列包含表1中序列(其包括WO2017201258的SEQ ID NO:3-102，其内容通过引用整体并入本文)的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。
在一些实施方案中，本公开的编码的siRNA分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表2中的有义(过客)序列(其包括WO2017201258的SEQ ID NO:103-249，其内容通过引用整体并入本文)或其片段或变体。作为非限制性实例，在本公开的siRNA分子中使用的有义序列为表2中核苷酸序列(其包括WO2017201258的SEQ ID NO:103-249，其内容通过引用整体并入本文)的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，在本公开的siRNA分子中使用的有义序列包含表2中核苷酸序列(其包括WO2017201258的SEQ ID NO:103-249，其内容通过引用整体并入本文)的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或大于21个连续核苷酸。作为另一个非限制性实例，在本公开的siRNA分子中使用的有义序列包含表2中序列(其包括WO2017201258的SEQ ID NO:103-249，其内容通过引用整体并入本文)的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。
在一些实施方案中，本公开的siRNA分子可包含如WO2017201258(其内容通过引用整体并入本文)的表3-5中所述的有义和反义siRNA双链体。作为非限制性实例，可以测试这些siRNA双链体对内源性HTT基因表达的体外抑制活性。将有义和反义序列的起始位点与来自NCBI的已知为NM_002111.7的HTT基因序列进行比较。
本公开的编码的siRNA双链体包含杂交在一起形成双链体结构的反义链和有义链，其中反义链与靶HTT基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶HTT基因的核酸序列同源。在某些方面，反义链的5'末端具有5'磷酸基团，而有义链的3'末端包含3'羟基基团。在其他方面，每条链的3'端有0、1或2个核苷酸突出端。
在一些实施方案中，配制的AAV颗粒编码阻抑(或降解)HTT mRNA的siRNA双链体或dsRNA。因此，siRNA双链体或dsRNA可用于基本上抑制细胞(例如神经元)中的HTT基因表达。在一些方面，对HTT基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，siRNA分子包含位于引导链中的HTT的miRNA种子匹配。在另一个实施方案中，siRNA分子包含位于过客链中的HTT的miRNA种子匹配。在又一个实施方案中，靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA不包含位于引导链或过客链中的HTT的种子匹配。
在一些实施方案中，靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于引导链可以几乎没有明显的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于过客链可以几乎没有明显的全长脱靶效应。靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于过客链可以具有小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％,11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在又一个实施方案中，靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于引导链或过客链可以几乎没有明显的全长脱靶效应。靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA对于引导链或过客链可以具有小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％,11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。
在一些实施方案中，靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可以具有高体外活性。在另一个实施方案中，siRNA分子可以具有低体外活性。在又一个实施方案中，靶向HTT基因的siRNA双链体或dsRNA在体外可以具有高引导链活性和低过客链活性。
在一些实施方案中，siRNA分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的靶敲低(KD)可以是至少30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的靶敲低可以是30-40％、35-40％、40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性实例，引导链的靶敲低(KD)大于70％。作为非限制性实例，引导链的靶敲低(KD)大于60％。
在一些实施方案中，设计了siRNA双链体，因此对于非HTT序列的有义或反义序列不存在miRNA种子匹配。
在一些实施方案中，针对最接近脱靶的引导链的IC50大于中靶基因HTT的引导链的IC50乘以100。作为非限制性实例，如果对于最接近脱靶的引导链的IC50大于对于靶标的引导链的IC50乘以100，则siRNA分子被认为具有体外抑制HTT的高引导链选择性。
在一些实施方案中，引导链的5'加工在体外或体内至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间内在5'末端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外至少99％的时间内在5'末端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内至少99％的时间内在5'末端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外至少90％的时间内在5'末端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内至少90％的时间内在5'末端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外至少85％的时间内在5'末端正确开始(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内至少85％的时间内在5'末端正确开始(n)。
在一些实施方案中，体外或体内表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1；1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。引导链与过客链比是指在pri-microRNA的细胞内加工后引导链与过客链的比。例如，引导链与过客链比为80:20，则每2条从前体中加工的过客链中将有8条引导链。作为非限制性实例，体外引导链与过客链比为8:2。作为非限制性实例，体内引导链与过客链的比为8:2。作为非限制性实例，体外引导链与过客链比为9:1。作为非限制性实例，体内引导链与过客链比为9:1。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比大于1。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比大于2。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比大于5。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比大于10。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比大于20。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比大于50。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比为至少3:1。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比为至少5:1。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比为至少10:1。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比为至少20:1。
在一些实施方案中，表达的引导链与过客链(G:P)(也称为反义链与有义链)比为至少50:1。
在一些实施方案中，体外或体内表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1；1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。过客链与引导链比是指在pri-microRNA的细胞内加工后过客链与引导链的比。例如，过客链与引导链的比为80:20，则每2条从前体中加工的引导链中将有8条过客链。作为非限制性实例，体外过客链与引导链比为80:20。作为非限制性实例，体内过客链与引导链比为80:20。作为非限制性实例，体外过客链与引导链比为8:2。作为非限制性实例，体内过客链与引导链比为8:2。作为非限制性实例，体外过客链与引导链比为9:1。作为非限制性实例，体内过客链与引导链比为9:1。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比大于1。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比大于2。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比大于5。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比大于10。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比大于20。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比大于50。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比为至少3:1。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比为至少5:1。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比为至少10:1。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比为至少20:1。
在一些实施方案中，表达的过客链与引导链(P:G)(也称为有义链与反义链)比为至少50:1。
在一些实施方案中，通过本领域已知和本文描述的方法，当测量加工时，pri-或pre-microRNA表现出大于2倍的引导链与过客链比，过客-引导链双链体被认为是有效的。作为非限制性实例，当测量加工时，pri-或pre-microRNA表现出大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍的引导链与过客链比。
在一些实施方案中，编码dsRNA的载体基因组包含的序列为构建体全长的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性实例，载体基因组包含的序列为构建体全长序列的至少80％
在一些实施方案中，通过靶向HTT序列上的至少一个外显子，siRNA分子可用于沉默野生型和/或突变型HTT。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。作为非限制性实例，通过靶向外显子1，siRNA分子可用于沉默野生型和/或突变型HTT。作为另一非限制性实例，通过靶向外显子1外的其他外显子，siRNA分子可用于沉默野生型和/或突变型HTT。作为另一非限制性实例，通过靶向外显子50，siRNA分子可用于沉默野生型和/或突变型HTT。作为另一非限制性实例，通过靶向外显子67，siRNA分子可用于沉默野生型和/或突变型HTT。
根据本公开，生产了包含编码靶向HTT mRNA的siRNA分子的核酸的AAV颗粒，所述AAV血清型可以是表1中列出的任何血清型。AAV血清型的非限制性实例包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV9.47、AAV9(hu14)、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ8、AAV-DJ、AAV-PHP.A和/或AAV-PHP.B及其变体。
包含HTT调节性多核苷酸的AAV颗粒
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，其具有包含调节性多核苷酸序列的有效载荷区。在这样的实施方案中，可以复制编码多于一种多肽的病毒基因组，并将其包装到病毒颗粒中。用包含调节性多核苷酸的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达编码的有义和/或反义序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒在医学领域中可用于治疗、预防、缓解或改善神经系统疾病和/或病症。
表3中描述了包含病毒基因组的AAV颗粒的ITR至ITR序列的非限制性实例，所述病毒基因组具有有效载荷区，所述有效载荷区包含具有靶向HTT的siRNA分子的调节性多核苷酸。
表3.包含HTT调节性多核苷酸的AAV颗粒的ITR至ITR序列
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含与SEQ ID NO:41-82中任一个具有百分比同一性的序列。病毒基因组可与SEQ ID NO:41-82中任一个具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。病毒基因组可与SEQ ID NO:41-82中任一个具有1-10％、10-20％、30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％的同一性。作为非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:41-82中任一个具有80％同一性的序列。作为另一非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ IDNO:41-82中任一个具有85％同一性的序列。作为另一非限制性实例，病毒基因组包含与SEQID NO:41-82中任一个具有90％同一性的序列。作为另一非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:41-82中任一个具有95％同一性的序列。作为另一非限制性实例，病毒基因组包含与SEQ ID NO:41-82中任一个具有99％同一性的序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒基因组，其包含对应于SEQ ID NO：41或其具有至少95％同一性的变体的序列。AAV颗粒可以包含AAV1血清型。
在一些实施方案中，可以将包含调节性多核苷酸序列的AAV颗粒引入哺乳动物细胞，所述调节性多核苷酸序列包含编码至少一个siRNA分子的核酸序列。
在AAV颗粒有效载荷区包含调节性多核苷酸的情况下，调节性多核苷酸可以包含有义和/或反义序列以敲低靶基因。编码本文所述的调节性多核苷酸的AAV病毒基因组可用于人类疾病、病毒、感染、兽医应用以及各种体内和体外环境。
可以修饰AAV颗粒以增强递送效率。这样的包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的修饰的AAV颗粒可以被有效地包装，并且可以被用于成功地以高频且最小的毒性感染靶细胞。
在一些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以是人血清型AAV颗粒。这样的人AAV颗粒可以源自任何已知的血清型，例如源自血清型AAV1-AAV11的任何一种。作为非限制性实例，AAV颗粒可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV1衍生的基因组的载体；在AAV2衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；在AAV4衍生的衣壳中包含AAV4衍生的基因组的载体；在AAV6衍生的衣壳中包含AAV6衍生的基因组的载体；或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV9衍生的基因组的载体。
在其他实施方案中，包含用于编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以是假型杂合或嵌合AAV颗粒，其包含源自至少两种不同的AAV血清型的序列和/或组分。假型AAV颗粒可以是包含衍生自一种AAV血清型的AAV基因组和至少部分源自另一种AAV血清型的衣壳蛋白的载体。作为非限制性实例，此类假型AAV颗粒可以是在AAV1衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV6衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV4衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组的载体；或在AAV9衍生的衣壳中包含AAV2衍生的基因组。以类似的方式，本公开涵盖任何杂合或嵌合AAV颗粒。
在其他实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以用于将siRNA分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。
在一些方面，包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒可以进一步包含修饰的衣壳，其包括来自非病毒来源的肽。在其他方面，AAV颗粒可以包含CNS特异性嵌合衣壳以促进将编码的siRNA双链体递送至大脑和脊髓。例如，可以构建来自显示CNS嗜性的AAV变体的cap核苷酸序列的比对，以识别可变区(VR)序列和结构。
施用和给药
施用
在一些实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用于CNS以改善患有亨廷顿舞蹈病(HD)的受试者的功能和/或存活。作为非限制性实例，可以通过直接输注到纹状体中来施用载体。
在一些实施方案中，可以以对siRNA双链体或dsRNA的治疗有效量将AAV颗粒施用于受试者(例如，通过鞘内施用来施用于受试者的CNS)，以靶向中型多棘神经元、皮层神经元和/或星形胶质细胞。作为非限制性实例，siRNA双链体或dsRNA可减少HTT蛋白或mRNA的表达。作为另一个非限制性实例，siRNA双链体或dsRNA可以阻抑HTT并降低HTT介导的毒性。HTT蛋白和/或mRNA以及HTT介导的毒性的减少几乎可以在没有增强炎症的情况下完成。
在一些实施方案中，可以以治疗有效量将AAV颗粒施用于受试者(例如，施用于受试者的CNS)，以减慢受试者的功能衰退(例如，使用已知的评估方法如统一的亨廷顿舞蹈病分级量表(UHDRS))。作为非限制性实例，可以通过实质内注射施用载体。
给药
本公开的药物组合物可以使用任何有效减少、预防和/或治疗HTT相关疾病(例如，亨廷顿舞蹈病(HD))的量施用于受试者。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、具体组成、其施用方式、其活性方式等。
通常将本公开的组合物配制成单位剂型，以易于施用和剂量均匀。然而，应理解，本公开的组合物的每日总使用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者而言，特定的治疗效果将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；所用特定化合物的活性；使用的具体组成；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用siRNA双链体的排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。
在一些实施方案中，受试者的年龄和性别可用于确定本公开的组合物的剂量。作为非限制性实例，与较年轻受试者相比，年龄较大的受试者可以接受较大剂量(例如5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％)的组合物。作为另一非限制性实例，与年龄较大的受试者相比，较年轻受试者可以接受较大剂量(例如5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％)的组合物。作为又一个非限制性实例，与男性受试者相比，女性受试者可以接受较大剂量(例如5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％)的组合物。作为又一个非限制性实例，与女性受试者相比，男性受试者可以接受较大剂量(例如5-10％、10-20％、15-30％、20-50％、25-50％或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％)的组合物。
在一些具体的实施方案中，可以根据疾病状况、受试者和治疗策略来调整用于递送本公开的siRNA双链体的AAV颗粒的剂量。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物向细胞的递送包括由[VG/小时＝mL/小时*VG/mL]定义的递送速率，其中VG是病毒基因组，VG/mL是组合物浓度，和mL/小时是延长的递送速率。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物向细胞的递送可包括每个受试者约1x106 VG至约1x1016 VG的总浓度。在一些实施方案中，递送可包含以下浓度的组合物：约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、1.1x1011、1.2x1011、1.3x1011、1.4x1011、1.5x1011、1.6x1011、1.7x1011、1.8x1011、1.9x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、6.1x1012、6.2x1012、6.3x1012、6.4x1012、6.5x1012、6.6x1012、6.7x1012、6.8x1012、6.9x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、2.7x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/受试者或VG/剂量。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物向细胞的递送可包括每个受试者约1x106VG/kg至约1x1016 VG/kg的总浓度。在一些实施方案中，递送可包含以下的组合物浓度：约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、1.1x1011、1.2x1011、1.3x1011、1.4x1011、1.5x1011、1.6x1011、1.7x1011、1.8x1011、1.9x1011、2x1011、2.1x1011、2.2x1011、2.3x1011、2.4x1011、2.5x1011、2.6x1011、2.7x1011、2.8x1011、2.9x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、7.1x1011、7.2x1011、7.3x1011、7.4x1011、7.5x1011、7.6x1011、7.7x1011、7.8x1011、7.9x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、6.1x1012、6.2x1012、6.3x1012、6.4x1012、6.5x1012、6.6x1012、6.7x1012、6.8x1012、6.9x1012、7x1012、8x1012、8.1x1012、8.2x1012、8.3x1012、8.4x1012、8.5x1012、8.6x1012、8.7x1012、8.8x1012、8.9x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、2.7x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016VG/kg。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物向细胞的递送可包括每个受试者约1x106 VG/mL至约1x1016 VG/mL的总浓度。在一些实施方案中，递送可包含以下的组合物浓度：约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、1.1x1011、1.2x1011、1.3x1011、1.4x1011、1.5x1011、1.6x1011、1.7x1011、1.8x1011、1.9x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、6.1x1012、6.2x1012、6.3x1012、6.4x1012、6.5x1012、6.6x1012、6.7x1012、6.8x1012、6.9x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、1.1x1013、1.2x1013、1.3x1013、1.4x1013、1.5x1013、1.6x1013、1.7x1013、1.8x1013、1.9x1013、2x1013、2.7x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016 VG/mL。
在一些实施方案中，待递送的根据本公开的组合物可包含9x1011 VG/mL–2.7x1013VG/mL的浓度。在一些实施方案中，待递送的根据本公开的组合物可以包含2.7x1013 VG/mL的浓度。
在一些实施方案中，根据本公开的组合物向细胞的递送可包括约1x106总衣壳/mL至约1x1016总衣壳/mL的总浓度。在一些实施方案中，递送可包含以下的组合物浓度：约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.1x1012、1.2x1012、1.3x1012、1.4x1012、1.5x1012、1.6x1012、1.7x1012、1.8x1012、1.9x1012、2x1012、2.1x1012、2.2x1012、2.3x1012、2.4x1012、2.5x1012、2.6x1012、2.7x1012、2.8x1012、2.9x1012、3x1012、3.1x1012、3.2x1012、3.3x1012、3.4x1012、3.5x1012、3.6x1012、3.7x1012、3.8x1012、3.9x1012、4x1012、4.1x1012、4.2x1012、4.3x1012、4.4x1012、4.5x1012、4.6x1012、4.7x1012、4.8x1012、4.9x1012、5x1012、6x1012、7x1012、8x1012、9x1012、1x1013、2x1013、2.7x1013、3x1013、4x1013、5x1013、6x1013、6.7x1013、7x1013、8x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015、5x1015、6x1015、7x1015、8x1015、9x1015或1x1016总衣壳/mL。
在某些实施方案中，使用多次施用(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多次施用)，可以递送所需的siRNA双链体剂量。当采用多次施用时，可以使用分次剂量施用方案，诸如本文描述的那些。本文中使用的“分次剂量”是将单一单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量，例如，单一单位剂量的两次或更多次施用。本文中使用的“单一单位剂量”是在一个剂量/在一个时间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)中施用的任何调节性多核苷酸治疗剂的剂量。本文中使用的“总每日剂量”是24小时内给定或处方的量。它可以单一单位剂量施用。在一些实施方案中，将包含本公开的调节性多核苷酸的AAV颗粒以分次剂量施用于受试者。它们可以仅在缓冲液中或本文所述的制剂中配制。
在一些实施方案中，本文所述组合物的剂量、浓度和/或体积可根据施用后尾状核或核壳对皮层和皮层下分布的贡献来调节。施用可以是脑室内、核壳内、丘脑内、实质内、软膜下和/或鞘内施用。
在一些实施方案中，本文所述组合物的剂量、浓度和/或体积可以根据在通过脑室内、核壳内、丘脑内、实质内、软膜下和/或鞘内递送施用后的皮层和神经轴分布来调节。
可以基于受试者、靶结构的体积和/或组合物的剂量来确定待施用的药物组合物的体积。在一些实施方案中，受试者是灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，输注到受试者的核壳或丘脑的药物组合物的体积可以为每侧约1-3000μL。在一些实施方案中，输注到核壳或丘脑的组合物的体积可以为每侧约10μl、25μl、50μl、75μl、100μl、125μl、150μl、175μl、200μl、225μl、250μl、275μl、300μl、325μl、350μl、375μl、400μl、425μl、450μl、475μl、500μl、525μl、550μl、575μl、600μl、625μl、650μl、675μl、700μl、725μl、750μl、775μl、800μl、825μl、850μl、875μl、900μl、925μl、950μl、975μl、1000μl、1025μl、1050μl、1075μl、1100μl、1125μl、1150μl、1175μl、1200μl、1225μl、1250μl、1275μl、1300μl、1325μl、1350μl、1375μl、1400μl、1425μl、1450μl、1475μl、1500μl、1600μl、1700μl、1800μl、1900μl、2000μl、2250μl、2500μl、2750μl或3000μl。
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物施用于非人灵长类动物的受试者。在一些实施方案中，待输注到非人灵长类动物的核壳中的组合物的体积为每侧50-150μL。在一些实施方案中，待输注到非人灵长类动物的核壳中的组合物的体积为每侧100-200μL。在一些实施方案中，待输注到非人灵长类动物的核壳中的组合物的体积为每侧175-525μL。
在一些实施方案中，待输注到非人灵长类动物的丘脑中的组合物的体积为每侧70-250μL。在一些实施方案中，待输注到非人灵长类动物的丘脑中的组合物的体积为每侧200-300μL。在一些实施方案中，待输注到非人灵长类动物的丘脑中的组合物的体积为每侧450-1500μL。
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物被施用于人类受试者。在一些实施方案中，待施用于人的核壳的药物组合物的体积可以不大于2000μL/半球。在一些实施方案中，待输注到人的核壳的组合物的体积可以每侧不大于1500μL/半球。
在一些实施方案中，待输注到人的核壳的组合物的体积为每侧300-1500μL。在一些实施方案中，待输注到人的核壳的组合物的体积可以为每侧约300μl、325μl、350μl、375μl、400μl、425μl、450μl、475μl、500μl、525μl、550μl、575μl、600μl、625μl、650μl、675μl、700μl、725μl、750μl、775μl、800μl、825μl、850μl、875μl、900μl、925μl、950μl、975μl、1000μl、1025μl、1050μl、1075μl、1100μl、1125μl、1150μl、1175μl、1200μl、1225μl、1250μl、1275μl、1300μl、1325μl、1350μl、1375μl、1400μl、1425μl、1450μl、1475μl或1500μl。在一些实施方案中，待输注到人的核壳的组合物的体积为每侧900μl。
在一些实施方案中，待施用于人的丘脑的药物组合物的体积可以不大于3000μL/半球。在一些实施方案中，待输注到人的丘脑的组合物的体积为每侧不大于2500μL。
在一些实施方案中，待输注到人的丘脑的组合物的体积为每侧1300-2500μL。在一些实施方案中，待输注到人的丘脑的组合物的体积为每侧1300μL、1325μL、1350μL、1375μL、1400μL、1425μL、1450μL、1475μL、1500μL、1525μL、1550μL、1575μL、1600μL、1625μL、1650μL、1675μL、1700μL、1725μL、1750μL、1775μL、1800μL、1825μL、1850μL、1875μL、1900μL、1925μL、1950μL、1975μL、2000μL、2025μL、2050μL、2075μL、2100μL、2125μL、2150μL、2175μL、2200μL、2225μL、2250μL、2275μL、2300μL、2325μL、2350μL、2375μL、2400μL、2425μL、2450μL、2475μL或2500μL。在一些实施方案中，待输注到人的丘脑的组合物的体积为每侧1700μl。
在一些实施方案中，施用于受试者的核壳的剂量可以为每侧约1x1010至1x1015VG。在一些实施方案中，施用于受试者的核壳的剂量可以为每侧约1x1010、5x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013、3x1013、3.5x1013、4x1013、4.5x1013、5x1013、5.5x1013、6x1013、6.5x1013、7x1013、7.5x1013、8x1013、8.5x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014或1x1015 VG。
在一些实施方案中，施用于受试者的丘脑的剂量可以为每侧约1x1010至1x1015VG。在一些实施方案中，施用于受试者的丘脑的剂量可以为每侧约1x1010、5x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013、3x1013、3.5x1013、4x1013、4.5x1013、5x1013、5.5x1013、6x1013、6.5x1013、7x1013、7.5x1013、8x1013、8.5x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014或1x1015 VG。
在一些实施方案中，通过核壳和丘脑输注施用于受试者的总剂量为1x1010至5x1015 VG。在一些实施方案中，通过核壳和丘脑输注施用于受试者的总剂量可以为约1x1010、5x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013、3x1013、3.5x1013、4x1013、4.5x1013、5x1013、5.5x1013、6x1013、6.5x1013、7x1013、7.5x1013、8x1013、8.5x1013、9x1013、1x1014、2x1014、3x1014、4x1014、5x1014、6x1014、7x1014、8x1014、9x1014、1x1015、2x1015、3x1015、4x1015或5x1015 VG。
在一些实施方案中，施用于非人灵长类动物的核壳的剂量可以为每侧约9x1010至5.5x1012 VG。在一些实施方案中，施用于非人灵长类动物的核壳的剂量可以为每侧约9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012或5.5x1012 VG。
在一些实施方案中，施用于非人灵长类动物的丘脑的剂量可以为每侧约1.5x1011至8.5x1012 VG。在一些实施方案中，施用于非人灵长类动物的丘脑的剂量可以为每侧约1.5x1011、1.8x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012或8.5x1012 VG。
在一些实施方案中，通过核壳和丘脑输注施用于非人灵长类动物的总剂量为5x1011至3x1013 VG。在一些实施方案中，通过核壳和丘脑输注施用于非人灵长类动物的总剂量可以为约5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013或3x1013 VG。
在一些实施方案中，施用于人的核壳的剂量可以为每侧约2.5x1011至4.5x1013VG。在一些实施方案中，施用于人的核壳的剂量可以为每侧约2.5x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013、3x1013、3.5x1013、4x1013或4.5x1013 VG。在一些实施方案中，施用于人的核壳的剂量可以为每侧8x1011至4x1013 VG。
在一些实施方案中，施用于人的丘脑的剂量可以为每侧约1x1012至7x1013 VG。在一些实施方案中，施用于人的丘脑的剂量可以为每侧约1x1012、1.5x1012、2x1012、2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013、3x1013、3.5x1013、4x1013、4.5x1013、5x1013、5.5x1013、6x1013、6.5x1013、6.8x1013、7x1013 VG。在一些实施方案中，施用于人的丘脑的剂量可以为每侧3.5x1012至6.8x1013 VG。
在一些实施方案中，通过核壳和丘脑输注施用于人的总剂量为2.5x1012至2.5x1014 VG。在一些实施方案中，通过核壳和丘脑输注施用于人的总剂量可以为约2.5x1012、3x1012、3.5x1012、4x1012、4.5x1012、5x1012、5.5x1012、6x1012、6.5x1012、7x1012、7.5x1012、8x1012、8.5x1012、8.6x1012、9x1012、9.5x1012、1x1013、1.5x1013、2x1013、2.5x1013、3x1013、3.5x1013、4x1013、4.5x1013、5x1013、5.5x1013、6x1013、6.5x1013、7x1013、7.5x1013、8x1013、8.5x1013、9x1013、1x1014、2x1014、2.1x1014、2.2x1014、2.3x1014、2.4x1014或2.5x1014VG。在一些实施方案中，施用于受试者的总剂量为8.6x1012至2x1014 VG。
在一些实施方案中，剂量体积可以使用递增的输注速率沉积到输注部位。作为非限制性实例，可以以适当的持续时间以三个不同阶段(例如，以1、3、5μL/min的剂量速率)将剂量体积沉积到输注部位中，以完成总剂量体积。
示例性制剂
在一些实施方案中，制剂可以包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、和任选的表面活性剂，例如泊洛沙姆188(例如
)。作为非限制性实例，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、192mM氯化钠、2.7mM氯化钾和0.001％(w/v)泊洛沙姆188。所述制剂可以用于配制浓度为约2.7x1012 VG/mL的AAV颗粒。
在一些实施方案中，制剂可以包含磷酸盐缓冲液盐水、蔗糖和任选的表面活性剂，例如泊洛沙姆188。作为非限制性实例，所述制剂可以包含磷酸盐缓冲液盐水、5％蔗糖和0.001％(w/v)泊洛沙姆188。所述制剂可以用于配制浓度为约2.2x1012 VG/mL的AAV颗粒。
在一些实施方案中，制剂可以包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、蔗糖和任选的表面活性剂，例如泊洛沙姆188。作为非限制性实例，所述制剂可以包含2.7mM磷酸钠、1.54mM磷酸钾、155mM氯化钠和5％(w/v)蔗糖，pH为7.2，并且渗透压为450mOsm/kg。
在一些实施方案中，制剂可以包含磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、蔗糖和任选的表面活性剂，例如泊洛沙姆188。作为非限制性实例，所述制剂可以包含10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、95mM氯化钠、7％(w/v)蔗糖和0.001％(w/v)泊洛沙姆188，5℃下pH 7.4±0.2。所述制剂可以用于配制浓度为约2.7x1013 VG/mL的AAV颗粒。
在一些实施方案中，所述制剂可以包含Tris碱、盐酸、氯化钾、氯化钠、蔗糖和任选的表面活性剂，例如泊洛沙姆188。作为非限制性实例，所述制剂可以包含10mM Tris碱、6.3mM HCl、1.5mM氯化钾、100mM氯化钠、7％(w/v)蔗糖和0.001％(w/v)泊洛沙姆188，5℃下pH 8.0±0.2。作为另一非限制性实例，所述制剂可以包含10mM Tris碱、9mM HCl、1.5mM氯化钾、100mM氯化钠、7％(w/v)蔗糖和0.001％(w/v)泊洛沙姆188，5℃下pH 7.5±0.2。所述制剂可以用于配制浓度为2.7x1013 VG/mL的AAV颗粒约。
亨廷顿舞蹈病的治疗方法
本公开提供了包含编码靶向HTT基因的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒，及其设计和制造方法。尽管不希望被单一的可操作性理论所束缚，但本文所述的AAV颗粒提供了调节性多核苷酸，包括siRNA，其干扰HTT表达，所述HTT表达包括HTT突变体和/或野生型HTT基因表达。特别地，本公开采用病毒基因组，例如腺相关病毒(AAV)病毒基因组，其包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸序列。包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV载体可以增加活性剂向目标神经元(例如纹状体的中型多棘神经元和皮层神经元)递送。靶向HTT基因的siRNA双链体或编码的dsRNA可能能够显著抑制细胞内HTT基因的表达(例如mRNA水平)；因此，减少HTT表达诱导的细胞内应激，例如蛋白聚集和包含物形成、自由基增加、线粒体功能障碍和RNA代谢。
本公开提供了将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸序列的AAV颗粒引入细胞的方法，该方法包括将足以降解靶HTT mRNA的量的任何AAV颗粒引入所述细胞，从而激活细胞中的靶特异性RNAi。在一些方面，细胞可以是干细胞、神经元(例如中型多棘或皮层神经元)、肌肉细胞和神经胶质细胞，例如星形胶质细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了通过向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或AAV载体来治疗或缓解亨廷顿舞蹈病(HD)的方法。
在一些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒可以用于治疗和/或改善HD。
在一些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒可以用于减少患有HD的受试者的认知和/或运动衰退，其中衰退的量由标准评估系统确定，所述标准评估系统例如但不限于统一的亨廷顿舞蹈病评分量表(UHDRS)和分评分，以及认知测试。
在一些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒可用于减少通过标准评估系统(例如但不限于总功能能力(TFC)量表)测量的功能能力和日常生活活动的下降。
在一些实施方案中，本公开提供了用于在需要治疗的受试者中治疗或改善与HTT基因和/或HTT蛋白相关的亨廷顿舞蹈病的方法，该方法包括向受试者施用药学有效量的包含调节性多核苷酸的AAV颗粒，所述调节性多核苷酸编码至少一种靶向HTT基因、抑制HTT基因表达和蛋白产生并改善受试者的HD症状的siRNA双链体。
在一些实施方案中，本公开的AAV载体可在有治疗需求的受试者中用作治疗亨廷顿氏舞蹈病的方法。本领域已知的用于定义有治疗需求的受试者的任何方法均可用于鉴定所述受试者。受试者可能有亨廷顿氏舞蹈病的临床诊断或可能是症状前的。可以使用任何已知的用于诊断HD的方法，包括但不限于认知评价和/或神经学或神经精神病学检查、运动测试、感觉测试、精神病学评价、脑成像、家族史和/或基因测试。
在一些实施方案中，使用亨廷顿氏舞蹈病的预后指数或其衍生物来确定HD受试者的选择(Long JD等人，Movement Disorders，2017,32(2)，256-263，其内容通过引用整体并入本文)。该预后指数使用四种组分来预测运动诊断的概率：(1)来自统一亨廷顿氏舞蹈病分级量表(UHDRS)的总运动评分(TMS)，(2)符号数字模式测试(SDMT)，(3)基线年龄和(4)胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)扩增。
在一些实施方案中，用以下公式计算亨廷顿氏舞蹈病的预后指数：PIHD＝51×TMS+(-34)×SDMT+7×年龄×(CAG-34)，其中PIHD值越大表示诊断或症状发作的风险越大。
在另一个实施方案中，用以下归一化公式计算亨廷顿氏舞蹈病的预后指数，该公式给出了在50％的10年生存背景下待解释的标准偏差单位：PINHD＝(PIHD-883)/1044，其中PINHD<0表示10年生存大于50％，而PINHD>0表示10年生存低于50％。
在一些实施方案中，预后指数可用于鉴定将在几年内发展出HD症状但尚未具有临床可诊断症状的受试者。此外，可以在无症状期间使用本公开的AAV载体和组合物选择这些无症状患者并接受治疗。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以施用于已经历生物标志物评价的受试者。血液中用于HD显现前(premanifest)和早期进展的潜在生物标志物包括但不限于8-OHdG氧化应激标志物、代谢标志物(例如，肌酸激酶、支链氨基酸)、胆固醇代谢物(例如，24-OH胆固醇)、免疫和炎症蛋白(例如，簇蛋白、补体组分、白细胞介素6和8)、基因表达变化(例如，转录组标志物)、内分泌标志物(例如，皮质醇、胃饥饿素和瘦蛋白)、BDNF、腺苷2A受体。用于HD显现前和早期进展的脑成像的潜在生物标志物包括但不限于纹状体体积、皮层下白质体积、皮层厚度、全脑和室容积、功能性成像(例如，功能性MRI)、PET(例如，用氟脱氧葡萄糖)和磁共振光谱法(例如，乳酸盐)。除了测量亨廷顿蛋白外，其他潜在的生物标记物是神经丝轻链，它是神经退化的潜在标志物，并且可以在诸如脑脊液的生物液体中或使用神经影像学方法进行评估。用于HD的显现前和早期进展的定量临床工具的潜在生物标志物包括但不限于定量运动评价、运动生理评价(例如，经颅磁刺激)和定量眼运动测量。定量临床生物标志物评价的非限制性实例包括舌力变异性、节拍器-引导的拍击、握力、眼运动评价和认知测试。多中心观察研究的非限制性实例包括PREDICT-HD和TRACK-HD。受试者可具有HD的症状、被诊断为HD或可能无HD症状。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以施用于已经使用神经成像进行生物标志物评价的受试者。受试者可具有HD的症状，被诊断为HD或可能无HD症状。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以施用于无HD症状的受试者。受试者可能是无症状的，但可能已经历预测性基因检测或生物标志物评价，以确定他们是否有HD风险和/或受试者可能有已被诊断患有HD的家庭成员(例如，母亲、父亲、兄弟、姐妹、姑姨、叔舅、祖父母)。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以施用于处于HD早期阶段的受试者。在早期阶段，在协调、一些不自主运动(舞蹈病)、情绪变化如烦躁和抑郁、解决问题困难、人们在正常日常生活中运作能力降低方面，受试者存在微妙的变化。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以施用于处于HD中期的受试者。在中期，受试者的运动障碍增加、言语减少、吞咽困难并且普通活动将变得更难。在这个阶段，受试者可能有职业和物理治疗师帮助维持对自主运动的控制，并且受试者可能有语言病理学家。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以施用于处于HD晚期的受试者。在晚期阶段，HD受试者几乎完全或完全依赖他人进行护理，因为受试者不再能走路而且无法说话。受试者通常仍能理解语言，并且知道家人和朋友，但是气哽是主要关注的问题。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以用于治疗具有青少年形式HD的受试者，其HD发作在20岁之前，甚至早至2岁。
在一些实施方案中，AAV颗粒可以用于治疗具有完全外显性(penetrance)HD的HD受试者，其中HTT基因具有41或更多个CAG重复(例如41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90或大于90个CAG重复)。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于治疗具有不完全外显性的HD受试者，其中HTT基因具有36至40个CAG重复(例如，36、37、38、39和40个CAG重复)。
在一些实施方案中，将包含AAV颗粒的组合物施用于受试者的中枢神经系统，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸。在其他实施方案中，将包含AAV颗粒的组合物施用于受试者的组织(例如，受试者的脑)，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸。
在一些实施方案中，可以将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒递送到特定类型的靶细胞中，所述靶细胞包括但不限于神经元，其包括中型多棘或皮层神经元；神经胶质细胞，其包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞；和/或其他围绕神经元的细胞，例如T细胞。
在一些实施方案中，可以将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒递送至纹状体的神经元和/或皮层的神经元中。
在一些实施方案中，通过静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、实质内、软膜下、鞘内和/或室内，将用于治疗HD的本公开的组合物施用至有需求的受试者，从而允许siRNA分子或包含siRNA分子的载体通过血脑屏障和血液脊髓屏障的一个或两个、或直接进入脑和/或脊髓。在一些方面，方法包括(使用例如输注泵和/或递送支架)直接向受试者的中枢神经系统(CNS)施用(例如，实质内施用、软膜下施用、室内施用和/或鞘内施用)治疗有效量的组合物，所述组合物包含编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒。载体可用于沉默或阻抑HTT基因表达和/或减少受试者中HD的一种或多种症状，使得治疗性治疗HD。
在一些实施方案中，可例如通过输注到受试者的白质中将siRNA分子或包含此类siRNA分子的AAV载体直接引入受试者的中枢神经系统。尽管不希望受到理论的束缚，但通过直接白质输注的分布可能独立于轴突转运机制，而轴突转运机制可能在患有亨廷顿舞蹈病的受试者中受损，这意味着白质输注可能允许更多地转运AAV载体。
在一些实施方案中，通过实质内注射将包含AAV颗粒的组合物施用于受试者的中枢神经系统，所述AAV颗粒包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸。
在一些实施方案中，通过实质内注射和鞘内注射将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒组合物施用于受试者的中枢神经系统。
在一些实施方案中，通过实质内注射和脑室内注射将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒组合物施用于受试者的中枢神经系统。
在一些实施方案中，通过实质内施用将用于治疗HD的本公开的组合物施用于有需要的受试者。
在一些实施方案中，例如，通过输注到核壳中，可以将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒组合物直接引入受试者的中枢神经系统中。
在一些实施方案中，例如通过输注至受试者的丘脑，可以将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒组合物直接引入受试者的中枢神经系统。尽管不希望受到理论的束缚，但丘脑是大脑中的一个区域，其在亨廷顿舞蹈病的受试者中相对幸免(spared)，这意味着它可能允许通过AAV载体的轴突转运进行更广泛的皮层转导。
在一些实施方案中，可以将包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒组合物间接地引入受试者的中枢神经系统中，例如通过静脉内施用。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒通过核壳和丘脑输注来施用。双重输注到核壳和丘脑可能独立地是双侧或单侧。作为非限制性实例，可以将AAV颗粒从脑的两侧注入到核壳和丘脑中。作为另一个非限制性实例，可以将AAV颗粒注入左核壳和左丘脑，或右核壳和右丘脑。作为另一个非限制性实例，可以将AAV颗粒输注到左核壳和右丘脑，或右核壳和左丘脑。双重输注可以连续或同时发生。
调节HTT表达
在一些实施方案中，向受试者施用AAV颗粒将降低受试者中HTT的表达，并且降低HTT的表达将降低HD在受试者中的作用。
在一些实施方案中，例如当通过本文所述的方法测定时，编码的dsRNA一旦表达并接触表达HTT蛋白的细胞，将HTT蛋白的表达抑制至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％％或至少40％或更多。
在一些实施方案中，向受试者施用包含编码本公开的siRNA的调节性多核苷酸序列的AAV颗粒可以在受试者中降低HTT(例如，突变型HTT、野生型HTT和/或突变型和野生型HTT)。在一些实施方案中，向受试者施用AAV颗粒可以降低受试者中的野生型HTT。在又一个实施方案中，向受试者施用AAV颗粒可以降低受试者中的突变型HTT和野生型HTT。在受试者(例如但不限于CNS、CNS的区域或受试者CNS的特定细胞)中，突变型和/或野生型HTT可以降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。在受试者(例如但不限于CNS、CNS的区域或受试者CNS的特定细胞)中，突变型HTT可以降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。在受试者(例如但不限于CNS、CNS的区域或受试者CNS的特定细胞)中，野生型HTT可以降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。在受试者(例如但不限于CNS、CNS的区域或受试者CNS的特定细胞)中，突变型和野生型HTT可以降低约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，AAV颗粒可以使中型多棘神经元中HTT的表达降低至少50％。作为非限制性实例，载体(例如AAV载体)可以使中型多棘神经元中HTT的表达降低至少40％。作为非限制性实例，AAV颗粒可以使在核壳的中型多棘神经元中HTT的表达降低至少40％。作为非限制性实例，AAV颗粒可以使在核壳的中型多棘神经元中HTT的表达降低至少30％。作为又一个非限制性实例，AAV颗粒可以使核壳和皮层中HTT的表达降低至少40％。作为又一个非限制性实例，AAV颗粒可以使核壳和皮层中HTT的表达降低至少30％。作为又一个非限制性实例，AAV颗粒可以使核壳中HTT的表达降低至少30％。作为又一个非限制性实例，AAV颗粒可以使核壳中HTT的表达降低至少30％，并使皮层中的表达降低至少15％
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于将HTT蛋白的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，HTT蛋白的表达降低50-90％。作为非限制性实例，HTT蛋白的表达降低30-70％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于将HTT mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，HTT mRNA的表达可降低50-90％。作为非限制性实例，HTT mRNA的表达可降低30-70％。作为非限制性实例，HTT mRNA的表达可降低40-70％。作为非限制性实例，HTT mRNA的表达可降低50-80％。作为非限制性实例，HTT mRNA的表达可降低50-85％。作为非限制性实例，HTT mRNA的表达可降低60-90％。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于降低受试者的HTT蛋白。降低可以独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，受试者可以具有50％的HTT蛋白降低。作为非限制性实例，受试者可具有70％的HTT蛋白降低和10％的野生型HTT蛋白降低。作为非限制性实例，核壳的中型多棘神经元中HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，尾状核神经元中HTT的降低可为约30％。作为非限制性实例，丘脑神经元中HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，皮层中HTT的降低可以为约20％。作为一个非限制性的例子，初级运动和躯体感觉皮层的锥体神经元中HTT的降低可为约30％。作为非限制性实例，核壳和皮层中HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，核壳、尾状核和皮层中HTT的降低可以为约40％。作为非限制性实例，核壳、尾状核、皮层和丘脑中HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，核壳的中型多棘神经元中HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，尾状核神经元中HTT的降低可为30％-70％。作为非限制性实例，核壳和皮层中HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，核壳、尾状核和皮层中HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，核壳、尾状核、皮层和丘脑中HTT的降低可为40％-80％。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于降低受试者中的野生型HTT蛋白。降低可以独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，受试者可具有野生型HTT蛋白的50％降低。作为非限制性实例，核壳的中型多棘神经元中野生型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，尾状核神经元中野生型HTT的降低可为约30％。作为非限制性实例，丘脑神经元中野生型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，皮层中野生型HTT的降低可以为约20％。作为非限制性实例，初级运动皮层和躯体感觉皮层的锥体神经元中野生型HTT的降低可为约30％。作为非限制性实例，核壳和皮层中野生型HTT的降低可以为约40％。作为非限制性实例，核壳、尾状核和皮层中野生型HTT的降低可以为约40％。作为非限制性实例，核壳、尾状核、皮层和丘脑中野生型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，核壳的中型多棘神经元中野生型HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，尾状核神经元中野生型HTT的降低可为30％-70％。作为非限制性实例，核壳和皮层中野生型HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，核壳、尾状核和皮层中野生型HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，核壳、尾状核、皮层和丘脑中野生型HTT的降低可为40％-80％。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于降低受试者中的突变型HTT蛋白。降低可以独立为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。作为非限制性实例，受试者可具有突变型HTT蛋白的50％降低。作为非限制性实例，核壳的中型多棘神经元中突变型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，尾状核神经元中突变型HTT的降低可为约30％。作为非限制性实例，丘脑神经元中突变型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，皮层中突变型HTT的降低可为约20％。作为非限制性实例，初级运动皮层和躯体感觉皮层的锥体神经元中突变型HTT的降低可为约30％。作为非限制性实例，核壳和皮层中突变型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，核壳、尾状核和皮层中突变型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，核壳、尾状核、皮层和丘脑中突变型HTT的降低可为约40％。作为非限制性实例，核壳的中型多棘神经元中突变型HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，尾状核神经元中突变型HTT的降低可为30％-70％。作为非限制性实例，核壳和皮层中突变型HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，核壳、尾状核和皮层中突变型HTT的降低可为40％-70％。作为非限制性实例，核壳、尾状核、皮层和丘脑中突变型HTT的降低可为40％-80％。
在一些实施方案中，本公开提供了用于抑制/沉默细胞中HTT基因表达的方法。因此，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于基本上抑制细胞(特别是神经元)中的HTT基因表达。在一些方面，对HTT基因表达的抑制是指抑制至少约20％，例如至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选地至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，本公开提供了用于在细胞(特别是在中型多棘神经元)中抑制/沉默HTT基因表达。在一些方面，对HTT基因表达的抑制是指抑制至少约20％，例如至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选地至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，本公开提供了用于抑制/沉默细胞(特别是星形胶质细胞)中的HTT基因表达的方法。在一些方面，对HTT基因表达的抑制是指抑制至少约20％，例如至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选地至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于减少CNS的至少一个区域(例如但不限于中脑)中的HTT蛋白和/或mRNA的表达。在CNS的至少一个区域中，HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了50-90％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了60％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了至少20％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了30％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-80％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了40-60％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了50-80％。作为非限制性实例，纹状体、丘脑和/或皮层中HTT蛋白和mRNA的表达降低了50-70％。
在一些实施方案中，本公开提供了用于抑制/沉默细胞(特别是初级运动皮层或初级躯体感觉皮层的锥体神经元)中的HTT基因表达的方法。在一些方面，对HTT基因表达的抑制是指抑制至少约20％，例如至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选地至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于减少在CNS的至少一个区域(例如但不限于前脑)中HTT蛋白和/或mRNA的表达。在CNS的至少一个区域中，HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-90％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-70％。
作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了61％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了62％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了63％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了64％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了65％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了66％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了67％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了68％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了69％。作为非限制性实例，纹状体和/或皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了70％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达。HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了61％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了62％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了63％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了64％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了65％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了66％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了67％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了68％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了69％。作为非限制性实例，纹状体中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了70％。
在一些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒可以用于阻抑纹状体和/或皮层的神经元和/或星形胶质细胞中的HTT蛋白。作为非限制性实例，HTT蛋白的阻抑是在纹状体的中型多棘神经元和/或皮层的神经元中。作为非限制性实例，HTT蛋白的阻抑是在纹状体的中型多棘神经元和/或初级运动皮层和初级躯体感觉皮层的锥体神经元中。
在一些实施方案中，包含编码本公开的siRNA分子的调节性多核苷酸的AAV颗粒可以用于阻抑纹状体和/或皮层的神经元和/或星形胶质细胞中的HTT蛋白并减少相关神经元毒性。在纹状体和/或皮层的神经元和/或星形胶质细胞中HTT蛋白的阻抑可以独立地被阻抑5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。相关神经元毒性的降低可以为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或大于95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达。HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达。HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了20-30％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，运动皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达。HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了20-30％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，躯体感觉皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达。HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-70％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，颞叶皮层中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达。核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了30-40％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-80％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60-70％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了61％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了62％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了63％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了64％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了65％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了66％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了67％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了68％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了69％。作为非限制性实例，核壳中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了70％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于减少尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达。尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-50％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-85％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-80％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-70％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50-60％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60-70％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了50％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了51％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了52％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了53％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了54％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了55％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了56％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了57％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了58％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了59％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了61％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了62％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了63％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了64％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了65％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了66％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了67％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了68％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了69％。作为非限制性实例，尾状核中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了70％。
在一些实施方案中，siRNA双链体或编码的dsRNA可用于降低丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达。丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、95％和100％、或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、50-100％、55-60％、55-70％、55-80％、55-90％、55-95％、55-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了至少30％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-70％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了40-80％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60-90％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60-80％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60-70％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了60％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了61％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了62％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了63％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了64％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了65％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了66％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了67％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了68％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了69％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了70％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了71％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了72％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了73％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了74％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了75％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了76％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了77％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了78％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了79％。作为非限制性实例，丘脑中HTT蛋白和/或mRNA的表达降低了80％。
在一些实施方案中，编码siRNA双链体的AAV颗粒或其药物组合物具有约1-300VG/细胞的半数最大有效浓度(EC50)。如本文所用，半数最大有效浓度(EC50)是指编码siRNA双链体的AAV载体产生细胞中HTT表达降低50％的浓度。HTT表达可以是HTT mRNA或蛋白表达。编码siRNA双链体的AAV颗粒或其药物组合物的EC50可以为1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、15-30、20-30、20-40、20-50、20-60、20-70、30-40、30-50、30-60、30-70、30-80、35-50、40-50、40-60、40-70、40-80、40-90、50-60、50-70、50-80、50-90、50-100、60-70、60-80、60-90、60-100、70-90、70-100、70-120、80-100、80-120、80-140、90-120、90-150、90-180、100-120、100-150、100-180、100-200、120-160、120-180、150-200、200-250、200-300或250-300VG/细胞。例如，编码siRNA双链体的AAV颗粒或其药物组合物的EC50可以为约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250或300VG/细胞。作为非限制性实例，编码siRNA双链体的AAV颗粒或其药物组合物在核壳中可具有约35-50VG/细胞的EC50。作为另一个非限制性实例，编码siRNA双链体的AAV颗粒或其药物组合物在尾状核中可具有约15-30VG/细胞的EC50。
单独疗法和联合疗法
在一些实施方案中，本公开的组合物作为单独治疗剂或联合治疗剂施用，用于治疗HD。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物用作单独疗法。在其他实施方案中，本公开的药物组合物用于联合疗法。联合疗法可以与一种或多种神经保护剂(例如小分子化合物、生长因子和激素)组合使用，所述神经保护剂已经过测试其对神经元退化的神经保护作用。
编码靶向HTT基因的siRNA双链体的AAV颗粒可以与一种或多种其他治疗剂组合使用。“与......组合”并不意味着试剂必须同时施用和/或配制用于一起递送，尽管这些递送方法落入本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其它所需治疗剂或医疗程序同时、在其之前或之后施用。通常，将以针对每种药剂确定的剂量和/或按时间表施用该试剂。
可以与编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒组合使用的治疗剂，可以是小分子化合物，其是抗氧化剂、抗炎剂、抗凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸能试剂、结构蛋白抑制剂、参与肌肉功能的化合物以及参与金属离子调节的化合物。
可以与本文所述载体组合使用的测试用于治疗HD的化合物包括但不限于多巴胺消耗剂(例如，用于舞蹈病的丁苯那嗪)、苯并二氮杂卓(例如，用于肌阵挛、舞蹈病、肌张力障碍、僵直和/或痉挛状态的氯硝西泮)、抗惊厥药(例如，用于肌阵挛的丙戊酸钠和左乙拉西坦)、多巴胺的氨基酸前体(例如，用于僵直的左旋多巴，上述僵直尤其与青少年HD或年轻成人发病的帕金森病表型相关)、骨骼肌松弛剂(例如，用于僵直和/或痉挛状态的巴氯芬、替扎尼定)、用于乙酰胆碱在神经肌肉接头处释放以引起肌肉麻痹的抑制剂(例如，用于磨牙症和/或肌张力障碍的肉毒杆菌毒素)、非典型神经松弛剂(例如，用于精神病和/或烦躁的奥氮平和喹硫平；利培酮、舒必利和用于精神病、舞蹈病和/或烦躁的氟哌啶醇；用于治疗耐受性精神病的氯氮平；用于伴有明显阴性症状的精神病的阿立哌唑)、增加ATP/细胞能的药物(例如，肌酸)、选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)(例如，用于抑郁症、焦虑症、强迫性行为和/或烦躁的西酞普兰、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、米氮平、文拉法辛)、催眠药(例如，改变睡眠-觉醒周期的佐匹克隆和/或唑吡坦)、抗惊厥药(例如，用于躁狂或轻度躁狂的丙戊酸钠和卡马西平)和情绪稳定剂(例如，用于躁狂或轻度躁狂的锂)。
神经营养因子可以与编码本公开的siRNA分子的核酸序列的AAV颗粒组合使用来用于治疗HD。通常，神经营养因子被定义为促进神经元的生存、生长、分化、增殖和/或成熟，或刺激神经元活性增加的物质。在一些实施方案中，本方法还包括将一种或多种营养因子递送到有治疗需求的受试者中。营养因子可包括但不限于IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、Colivelin、扎利罗登(Xaliproden)、促甲状腺激素释放激素和ADNF及其变体。
在一个方面，编码靶向HTT基因的siRNA双链体的调节性多核苷酸的AAV颗粒可以与表达神经营养因子的AAV载体共同施用，例如AAV-IGF-I(参见例如Vincent等人，Neuromolecular medicine，2004,6,79-85；其内容通过引用整体并入本文)和AAV-GDNF(参见例如Wang等人，J Neurosci.，2002，22，6920-6928；其内容通过引用整体并入本文)。
VI.定义
在本公开的各个地方，以组或范围公开了本公开的化合物的取代基或性质。特别意图表示的是，本公开包括这种组和范围的成员的每个单独个体或子组合。
除非另外说明，否则以下术语和短语具有下面描述的含义。所述定义无意在性质上成为限制性的，且用于提供本公开的某些方面的更清楚理解。
约：如本文所用，术语“约”是指所述值的+/-10％。
腺相关病毒：本文所用的术语“腺相关病毒”或“AAV”是指依赖病毒属的成员，其包含任何颗粒、序列、基因、蛋白或衍生自其的组分。
AAV颗粒：如本文所用，“AAV颗粒”是包含衣壳和病毒基因组的病毒，所述病毒基因组具有至少一个有效载荷区和至少一个ITR区。本公开的AAV颗粒可以重组产生并且可以基于腺相关病毒(AAV)的亲本或参考序列。AAV颗粒可衍生自本文所述或本领域已知的任何血清型，包括血清型的组合(即“假型”AAV)或多种基因组(例如单链或自互补型)。另外，AAV颗粒可能是复制缺陷的和/或靶向的。
活性：如本文所用，术语“活性”是指事物正在发生或正在完成的状况。本公开的组合物可以具有活性，并且该活性可以涉及一种或多种生物学事件。
施用：如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物。
联合施用：如本文所用，术语“联合施用(administered in combination)”或“组合施用(combined administration)”是指将两种或更多种药剂同时或在一定间隔内施用于受试者，从而可能存在每种药剂对患者的作用的重叠。在某些实施方案中，它们在彼此的约60、30、15、10、5或1分钟内施用。在某些实施方案中，药剂的施用间隔足够紧密地在一起，从而实现组合(例如，协同)作用。
改善：如本文所用，术语“改善(amelioration)”或“改善(ameliorating)”是指减轻至少一种病症或疾病指标的严重性。例如，在神经退行性疾病的背景下，改善包括神经元损失的减少。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在某些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在某些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在某些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼类和蠕虫。在某些实施方案中，动物是转基因动物、基因工程动物或克隆。
反义链：如本文所用，siRNA分子的术语“反义链”或“第一链”或“引导链”是指与靶向沉默基因的mRNA的约10-50个核苷酸(例如约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸)的区段基本互补的链。所述反义链或第一链具有与期望的靶mRNA序列足够互补的序列以指导靶标特异性的沉默，例如，足以触发RNAi机制或过程对期望的靶mRNA的破坏的互补性。
大约：如本文所用，如应用于一个或多个值，术语“大约”或“约”是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，术语“大约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的值的范围，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％)。
结合：如本文所用，术语“结合”、“共轭”、“连接”、“附接”和“拴系”，当针对两个或多个部分使用时，是指这些部分直接地或通过一个或多个另外的用作连接剂的部分物理上彼此结合或连接，以形成足够稳定的结构，从而在使用该结构的条件(例如生理条件)下，这些部分保持物理结合。“结合”不必严格地通过直接共价化学键来实现。也可能暗示离子或氢键或基于杂交的连接性足够稳定，以使“结合的”实体保持物理结合。
杆状病毒表达载体(BEV)：如本文所用，BEV是杆状病毒表达载体，即杆状病毒来源的多核苷酸载体。使用BEV的系统称为杆状病毒表达载体系统(BEVS)。
mBEV或修饰的BEV：如本文所用，修饰的BEV是杆状病毒来源的表达载体，其已通过添加和/或缺失和/或复制和/或倒置以下的一个或多个从起始BEV(无论是野生型还是人工型)改变而来：基因；基因片段；切割位点；限制地点；序列区；编码有效载荷或目标基因的序列；或上述各项的组合。
双功能：如本文所用，术语“双功能”是指能够或维持至少两种功能的任何物质、分子或部分。这些功能可能会实现相同或不同的结果。产生功能的结构可以相同或不同。
BIIC：如本文所用，BIIC是杆状病毒感染的昆虫细胞。
生物相容性：如本文所用，术语“生物相容性”是指与活细胞、组织、器官或系统相容，对所述活细胞、组织、器官或系统具有很少的或没有免疫系统的伤害、毒性或排斥风险。
可生物降解的：如本文所用，术语“可生物降解的”是指能够通过生物的作用分解成无害的产品。
生物学活性：如本文所用，短语“生物学活性”是指任何物质在生物系统和/或生物体中具有活性的特征。例如，当施用于生物体时对该生物体具有生物学作用的物质被认为具有生物学活性。在特定的实施方案中，即使编码的有效载荷的一部分具有生物学活性或模拟被认为与生物学相关的活性，则本公开的AAV颗粒也可以被认为具有生物学活性。
衣壳：如本文所用，术语“衣壳”是指病毒颗粒的蛋白壳。
优化的密码子：如本文所用，术语“优化的密码子(codon optimized)”或“密码子优化(codon optimization)”是指修饰的核酸序列，其编码与亲本/参考序列相同的氨基酸序列，但是已经被改变使得修饰的核酸序列的密码子优化或改进以在特定系统(例如特定物种或物种组)中表达。作为非限制性实例，可以对包含AAV衣壳蛋白的核酸序列进行密码子优化以在昆虫细胞或特定的昆虫细胞(如草地贪夜蛾细胞)中表达。密码子优化可以使用本领域技术人员已知的方法和数据库来完成。
互补的和基本上互补的：本文使用的术语“互补的”表示多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以沃森-克里克方式(例如，A至T、A至U、C至G)或以允许形成双链体的任意其它方式形成碱基对。本领域技术人员知晓，当使用RNA而不是DNA时，尿嘧啶(而不是胸腺嘧啶)是被认为与腺苷互补的碱基。但是，当在本公开的上下文中提及U时，暗示置换T的能力，除非另有说明。完美互补性或100％互补性表示这样的情形：其中一个多核苷酸链的每个核苷酸单元都可以与第二个多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键。小于完美互补性表示这样的情形：其中两个链的一些(但是并非全部)核苷酸单元可以彼此形成氢键。例如，对于两个20-聚体，如果在每个链上的仅两个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出10％互补性。在相同的例子中，如果在每个链上的18个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出90％互补性。本文使用的术语“基本上互补的”是指，所述siRNA具有足以结合期望的靶mRNA和触发靶mRNA的RNA沉默的序列(例如，在反义链中)。
化合物：本公开的化合物包括存在于中间或最终化合物中的原子的所有同位素。“同位素”是指由原子核中中子数量不同产生的具有相同原子序数但具有不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。
本公开的化合物和盐可以通过常规方法与溶剂或水分子组合制备以形成溶剂化物和水合物。
有条件的活性：如本文所用，术语“有条件的活性”是指野生型多肽的突变体或变体，其中该突变体或变体在生理条件下比亲本多肽具有或多或少的活性。此外，与亲本多肽相比，有条件的活性多肽在异常条件下的活性可能增加或降低。有条件的活性多肽可以在正常生理条件或异常条件下可逆地或不可逆地失活。
保守的：如本文所用，术语“保守的”分别是指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，其是在比较的两个或更多个序列的相同位置上未发生改变的那些。相对保守的核苷酸或氨基酸是比序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的核苷酸或氨基酸。
在某些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此100％同一，则称它们为“完全保守的”。在某些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一或至少95％同一，则被认为是“高度保守的”。在某些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约70％同一、约80％同一、约90％同一、约95％、约98％或约99％同一，则被称为“高度保守”。在某些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少30％同一、至少40％同一、至少50％同一、至少60％同一、至少70％同一、至少80％同一，至少90％同一或至少95％同一，则被认为是“保守的”。在某些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约30％同一、约40％同一、约50％同一、约60％同一、约70％同一、约80％同一、约90％同一、约95％同一，约98％同一或约99％同一，则被称为“保守的”。序列的保守性可以应用于多核苷酸或多肽的全长，或者可以应用于其一部分、区域或特征。
控制元件：如本文所用，“控制元件”、“调控调控元件”或“调控序列”是指启动子区域、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等，其在受体细胞中提供编码序列的复制、转录和翻译。并非总是需要所有这些控制元件，只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中复制、转录和/或翻译即可。
控制释放：如本文所用，术语“控制释放”是指符合释放的特定样式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放曲线。
细胞抑制：如本文所用，“细胞抑制”是指抑制、减少、阻抑细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合的生长、分裂或繁殖。
细胞毒性：如本文所用，“细胞毒性”是指杀死细胞(例如，哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或引起对其的伤害、毒性或致命作用。
递送：如本文所用，“递送”是指递送AAV颗粒、化合物、物质、实体、部分、货物(cargo)或有效载荷。
递送剂：如本文所用，“递送剂”是指至少部分促进AAV颗粒向靶细胞的体内递送的任何物质。
不稳定的：如本文所用，术语“不稳定的”、“不稳定”或“不稳定区域”是指比相同区域或分子的起始、野生型或初始形式更不稳定的区域或分子。
可检测的标记：如本文所用，“可检测的标记”是指一种或多种标志物、信号或部分，其与易于通过本领域已知的方法检测的另一实体连接、相连或结合，所述方法包括放射线照相、荧光、化学发光、酶促活性、吸光度等。可检测的标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、染料、金属离子、诸如生物素、亲和素、链霉亲和素和半抗原之类的配体、量子点等。可检测的标记可以位于本文公开的肽或蛋白中的任何位置。它们可以在氨基酸、肽或蛋白内，或位于N或C末端。
消化：如本文所用，术语“消化”是指分解成较小的碎片或组分。当涉及多肽或蛋白时，消化导致肽的产生。
远端：如本文所用，术语“远端”是指位于远离中心或远离目标点或区域。
给药方案：如本文所用，“给药方案”是施用的时间表，或医生确定的治疗、预防或姑息治疗方案。
包封：如本文所用，术语“包封”是指封入、包围或围住。
工程化：如本文所用，当本公开的实施方案被设计为具有不同于起始点、野生型或初始分子的特征或特性时，则其是被“工程化的”。
有效量：如本文所用，术语药剂的“有效量”是这样的量：所述量足以实现有益的或期望的结果，例如，临床结果，且这样，“有效量”取决于它所应用的上下文。例如，在施用治疗癌症的药剂的上下文中，与不施用该药剂获得的应答相比，该药剂的有效量例如是足以实现如本文所定义的治疗的量。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白；(4)多肽或蛋白的翻译后修饰。
特征：如本文所用，“特征”是指特点、特性或独特要素。
制剂：如本文所用，“制剂”包括至少一种AAV颗粒和递送剂或赋形剂。
片段：如本文所用，“片段”是指一部分。例如，蛋白片段可包含通过消化从培养的细胞分离的全长蛋白而获得的多肽。
功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是处于表现出表征其的性质和/或活性的形式的生物分子。
基因表达：术语“基因表达”表示这样的过程：核酸序列通过该过程发生成功转录和(在大多数情况下)翻译以生产蛋白或肽。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应当被理解为是指，可以测量转录的核酸产物(例如，RNA或mRNA)或翻译的氨基酸产物(例如，多肽或肽)。测量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法是本领域众所周知的。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。在某些实施方案中，如果聚合物分子的序列为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同或相似，则认为它们彼此“同源”。术语“同源的”必定是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本公开，如果两个多核苷酸序列编码的多肽是至少一个至少约20个氨基酸片段中的至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％，则它们被认为是同源的。在某些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于能够编码至少4-5个独特指定的氨基酸片段的能力。对于长度少于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性由编码至少4-5个独特指定的氨基酸的片段能力决定。根据本公开，如果蛋白对于至少一个约20个氨基酸的片段至少约50％、60％、70％、80％或90％同一，则认为两个蛋白序列是同源的。
异源区域：如本文所用，术语“异源区域”是指将不被视为同源区域的区域。
同源区域：如本文所用，术语“同源区域”是指位置、结构、进化起源、特征、形式或功能相似的区域。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。例如，可以通过比对两个序列以达到最佳比对的目的来进行两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算(例如，可以在第一和第二核酸序列中的一个或两个中引入缺口以实现最佳比对，以及出于比对的目的，可以忽略非同一的序列)。在某些实施方案中，为了比对的目的而比对的序列的长度为参考序列长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。然后比较相应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。考虑到缺口的数目和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数，需要引入所述缺口以实现两个序列的最佳比对。序列的比对和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如，两个核苷酸序列之间的同一性百分数可以使用诸如以下描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；和SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991；其各自均通过引用并入本文。例如，可以使用Meyers和Miller(CABIOS，1989，4：11-17)的算法确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，该算法已合并到ALIGN程序(2.0版)中。或者，可以使用使用NWSgapdna.CMP矩阵的GCG软件包中的GAP程序确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。通常用于确定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于在Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)中公开的那些方法，其通过引用并入本文。确定同一性的技术已编入公共可用的计算机程序中。确定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG程序包，Devereux,J.,等人，Nucleic Acids Research,12(1),387(1984)),BLASTP,BLASTN和FASTA Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
抑制基因的表达：本文中使用的短语“抑制基因的表达”是指造成基因的表达产物的量的减少。所述表达产物可以是从基因转录的RNA(例如mRNA)或从基因转录的mRNA所翻译成的多肽。通常，mRNA水平的降低会导致从其翻译的多肽的水平的降低。通过使用用于测量mRNA或蛋白的标准技术，可以确定表达的水平。
体外：本文使用的术语“体外”表示在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿等中，发生的事件，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。
体内：本文使用的术语“体内”表示在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指已经从与之结合的至少一些组分中分离的物质或实体(无论是在自然界还是在实验环境中)。分离出的物质相对于与它们结合的物质可能具有不同的纯度水平。分离的物质和/或实体可以从最初与它们相连的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或更多的其他组分分开。在某些实施方案中，分离的试剂大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、98％、约99％或大于约99％的纯度。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。
基本上分离的：“基本上分离的”是指物质与形成或检测出物质的环境实质上分离。部分分离可以包括例如富含本发明的物质或AAV颗粒的组合物。基本上分离可包括含有按重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的本公开的化合物或其盐的组合物。分离化合物及其盐的方法是本领域常规的。
接头：如本文所用，“接头”是指连接两个分子的一个分子或一组分子。接头可以是连接编码两个不同多肽的两个核酸序列的核酸序列。接头可能会被翻译，也可能不会被翻译。接头可以是可裂解的接头。
MicroRNA(miRNA)结合位点：如本文所用，microRNA(miRNA)结合位点代表至少与miRNA的“种子”区域结合的核酸转录物的核苷酸位置或区域。
修饰的：如本文所用，“修饰的”是指本公开分子的改变的状态或结构。分子可以多种方式被修饰，包括化学、结构和功能上的修饰。如本文所用，当本公开的实施方案有或具有自起始点、野生型或天然分子变化的特征或性质(无论是结构还是化学性质)时，其均被“修饰”。
突变：如本文所用，术语“突变”是指基因结构的任何改变，从而形成可以传递至后代的变体(也称为“突变体”)。基因中的突变可能是由于DNA中单个碱基的改变，或基因或染色体较大部分的缺失、插入或重排引起的。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”或“野生型”是指在自然中存在而没有人工辅助或人的介入。
神经退化：如本文所用，术语“神经退化”是指导致神经细胞死亡的病理状态。大量神经系统疾病与神经退化具有共同的病理状态。例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)都会引起慢性神经退化，其特点是在几年内的缓慢进行性神经细胞死亡，而急性神经退化的特点是由于缺血(例如中风或创伤，例如创伤性脑损伤)引起的、或由于脱髓鞘或由创伤所致轴突横断(例如由脊髓损伤或多发性硬化)引起的神经细胞死亡突然发作。在一些神经系统病症中，主要地，一类神经细胞是退行性的，例如早期HD中的中型多棘神经元退化。
非人类脊椎动物：如本文所用，“非人类脊椎动物”包括智人以外的所有脊椎动物，包括野生和驯养的物种。非人类脊椎动物的实例包括但不限于哺乳动物，例如羊驼、白臀野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、狗、驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、美洲驼、骡、猪、兔、驯鹿、绵羊、水牛和牦牛。
核酸：如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)或多核糖核苷酸(含有D-核糖)或任何其它类型的多核苷酸组成的任何核酸聚合物，其中所述其它类型的多核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷。术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间在长度上没有预期的区别，并且这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。
脱靶：本文中使用的“脱靶”表示对任意一种或多种靶标、基因和/或细胞转录物的任何非目的效果。
开放阅读框：如本文所用，“开放阅读框”或“ORF”是指在阅读框末端之外的给定阅读框中不包含终止密码子的序列。
有效地连接：如本文所用，短语“有效地连接”是指两个或更多个分子、构建体、转录本、实体、部分等之间的功能连接。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求治疗或有治疗需要、需要治疗、正在接受治疗、将要接受治疗的受试者，或由受过训练的专业人员针对特定疾病或疾病进行护理的受试者。
有效载荷：如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码或在其中的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，或此类多核苷酸或多核苷酸区的表达产物，例如转基因、编码多肽或多个多肽的多核苷酸，或调节核酸或调节性核酸。
有效载荷构建体：如本文所用，“有效载荷构建体”是一种或多种载体构建体，其包含编码或包含有效载荷的多核苷酸区，所述有效载荷在一侧或两侧侧接有反向末端重复(ITR)序列。有效载荷构建体提供了在病毒生产细胞中复制以产生治疗性病毒基因组的模板。
有效载荷构建体载体：如本文所用，“有效载荷构建体载体”是编码或包含有效载荷构建体以及用于在细菌细胞中复制和表达有效载荷构建体的调节区的载体。
有效载荷构建体表达载体：如本文所用，“有效载荷构建体表达载体”是编码或包含有效载荷构建体的载体，并且其还包含一个或多个编码或包含用于病毒复制细胞中病毒表达的组分的多核苷酸区。
肽：如本文所用，“肽”的长度小于或等于50个氨基酸，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
药学上可接受的：本文中使用的短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
药学上可接受的赋形剂：如本文所用，短语“药学上可接受的赋形剂”是指除本文所述化合物以外的任何成分(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的溶媒)，并且具有在患者中基本上无毒且无炎症性的性质。赋形剂可以包括例如：抗粘剂、抗氧化剂、粘合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(着色剂)、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性的赋形剂包括但不限于：丁基羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸氢钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟乙酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
药学上可接受的盐：本公开还可包含本文所述的化合物的药学上可接受的盐。本文中使用的“药学上可接受的盐”表示公开的化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐；等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括形成的母体化合物的常规无毒盐，例如，从无毒的无机或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或这两者的混合物中反应，可以制备这样的盐；通常，可以使用非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表可在以下文献中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008,以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66,1-19(1977)；其各自的内容通过引用整体并入本文。
药学上可接受的溶剂合物：本文中使用的术语“药学上可接受的溶剂合物”是指这样的本公开的化合物，其中合适的溶剂的分子掺入晶格中。合适的溶剂在施用的剂量是生理学上可耐受的。通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液结晶、重结晶或沉淀，可以制备溶剂合物。合适的溶剂的实例是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂合物被称作“水合物”。
药代动力学：如本文所用，“药代动力学”是指当分子或化合物涉及确定施用于活生物体的物质的命运时分子或化合物的任何一种或多种性质。药代动力学分为几个方面，包括吸收、分布、代谢和排泄的程度和速率。通常将其称为ADME，其中：(A)吸收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是指物质在人体的所有液体和组织中的分散或扩散；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆地转化为子代代谢物；(E)排泄(或消除)是指物质从体内消除。在极少数情况下，某些药物会不可逆地积聚在人体组织中。
物理化学的：如本文所用，“物理化学的”是指物理或化学性质或与之有关。
预防：如本文所用，术语“预防(preventing)”或“预防(prevention)”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或病况的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病况的一种或多种症状、特征或临床表现的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或病况的一种或多种症状、特征或表现的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或病况的进展；和/或降低发生与感染、疾病、病症和/或病况相关的病理的风险。
增殖：如本文所用，术语“增殖”是指生长、扩增或增加，或引起迅速生长、扩增或增加。“增殖性”是指具有增殖的能力。“抗增殖性”是指具有与增殖性质相反或不适当的性质。
预防的：如本文所用，“预防的”是指用于预防疾病传播的治疗或作用过程。
预防(Prophylaxis)：如本文所用，“预防”是指为维持健康和预防疾病传播而采取的措施。
目标蛋白：如本文所用，术语“目标蛋白”或“所需蛋白”包括本文提供的蛋白及其片段、突变体、变体和改变。
近端：如本文所用，术语“近端”是指位于更靠近中心或目标点或区域。
纯化的：如本文所用，“纯化”、“纯化的”、“纯化”是指从不需要的组分、材料变质、掺混或混杂物(imperfection)中使之基本上纯化或澄清。“纯化的”是指纯净的状态。“纯化”是指进行纯化的过程。
区域(region)：如本文所用，术语“区域”是指区(zone)或一般区域(generalarea)。在某些实施方案中，当提及蛋白或蛋白模块时，区域可包含沿着蛋白或蛋白模块的氨基酸的线性序列，或可包含三维区域、表位和/或表位簇。在某些实施方案中，区域包含末端区域。如本文所用，术语“末端区域”是指位于给定试剂的端点或末端的区域。当提及蛋白时，末端区域可包含N末端和/或C末端。N末端是指包含具有游离氨基的氨基酸的蛋白的末端。C末端是指包含具有游离羧基的氨基酸的蛋白的末端。N-和/或C-末端区域可因此包含N-和/或C-末端以及周围的氨基酸。在某些实施方案中，N-和/或C-末端区域包含约3个氨基酸至约30个氨基酸、约5个氨基酸至约40个氨基酸、约10个氨基酸至约50个氨基酸、约20个氨基酸至约100个氨基酸和/或至少100个氨基酸。在某些实施方案中，N末端区域可包含任何长度的氨基酸，其包含N末端，但不包含C末端。在某些实施方案中，C末端区域可包含任何长度的氨基酸，其包含C末端，但不包含N末端。
在某些实施方案中，当提及多核苷酸时，区域可以包含沿着多核苷酸的核酸的线性序列，或者可以包含三维区域、二级结构或三级结构。在某些实施方案中，区域包含末端区域。如本文所用，术语“末端区域”是指位于给定试剂的端点或末端的区域。当提及多核苷酸时，末端区域可包含5'和3'末端。5'末端是指包含具有游离磷酸基团的核酸的多核苷酸的末端。3'末端是指包含具有游离羟基的核酸的多核苷酸的末端。5'和3'区域可因此包含5'和3'末端以及周围的核酸。在某些实施方案中，5'和3'末端区域包含约9个核酸至约90个核酸、约15个核酸至约120个核酸、约30个核酸至约150个核酸、约60个核酸至约300个核酸和/或至少300个核酸。在某些实施方案中，5'区域可包含任何长度的核酸，其包含5'末端，但不包含3'末端。在某些实施方案中，3'区域可包含任何长度的核酸，其包含3'末端，但不包含5'末端。
RNA或RNA分子：本文使用的术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”表示核糖核苷酸的聚合物；术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”表示脱氧核糖核苷酸的聚合物。可以天然地合成(例如，分别通过DNA复制和DNA的转录)或化学地合成DNA和RNA。DNA和RNA可以是单链的(即，分别是ssRNA或ssDNA)或多链的(例如，双链的，即，分别是dsRNA和dsDNA)。本文中使用的术语“mRNA”或“信使RNA”表示编码一个或多个多肽链的氨基酸序列的单链RNA。
RNA干扰或RNAi：本文使用的术语“RNA干扰”或“RNAi”表示由RNA分子介导的序列特异性的调节机制，其导致对应的蛋白编码基因的表达的抑制或干扰或“沉默”。RNAi已经在许多类型的生物中观察到，包含植物、动物和真菌。RNAi天然地发生在细胞中以除去外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA切割的片段进行，其将降解机制引导至其它类似的RNA序列。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)控制，且由细胞质中的短/小dsRNA分子起始，其中它们与催化性的RISC组分argonaute相互作用。可以将dsRNA分子外源地引入细胞中。外源dsRNA通过激活核糖核酸酶蛋白Dicer而起始RNAi，所述Dicer结合和切割dsRNA以产生21-25个碱基对的双链片段，其在每个末端上具有几个未配对的突出端碱基。这些短双链片段被称作小干扰RNA(siRNA)。
样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”是指其组织、细胞或组成部分(例如体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊脐血、尿液、阴道液和精液)的子集。样品还可以包括从整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集或其一部分或部分制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于例如血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部区域，眼泪，唾液，乳汁，血细胞，肿瘤，器官。样品还指可能包含细胞成分(例如蛋白或核酸分子)的培养基，例如营养肉汤或胶。
自互补病毒颗粒：如本文所用，“自互补病毒颗粒”是由至少两种组分(蛋白衣壳和编码包封在所述衣壳内的自身互补基因组的多核苷酸序列)组成的颗粒。
有义链：如本文所用，术语siRNA分子的“有义链”或“第二条链”或“过客链”表示与反义链或第一链互补的链。siRNA分子的反义链和有义链发生杂交以形成双链体结构。本文中使用的“siRNA双链体”包括与为了沉默而靶向的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的段具有足够互补性的siRNA链和具有足够互补性以与另一条siRNA链形成双链体的siRNA链。
短干扰RNA或siRNA：本文使用的术语“短干扰RNA”、“小干扰RNA”或“siRNA”表示能够指导或介导RNAi的包含约5-60个核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA分子(或RNA类似物)。在某些实施方案中，siRNA分子包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，诸如约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)，约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)，约19-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，和约19-24个核苷酸(或核苷酸类似物)。术语“短”siRNA表示包含5-23个核苷酸，例如21个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸)的siRNA。术语“长”siRNA表示包含24-60个核苷酸，例如约24-25个核苷酸(例如，23、24、25或26个核苷酸)的siRNA。在某些情况下，短siRNA可以包含少于19个核苷酸，例如，16、17或18个核苷酸，或少至5个核苷酸，前提条件是，较短的siRNA保留介导RNAi的能力。同样地，在某些情况下，长siRNA可以包含超过26个核苷酸，例如，27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸，前提条件是，较长的siRNA保留介导RNAi或翻译抑制的能力，无需进一步加工(例如，酶促加工)成短siRNA。siRNA可以是单链RNA分子(ss-siRNA)或包含有义链和反义链的双链RNA分子(ds-siRNA)，所述有义链和反义链杂交以形成被称作siRNA双链体的双链体结构。
信号序列：如本文所用，短语“信号序列”是指可以指导蛋白的运输或定位的序列。
单个单位剂量：如本文所用，“单个单位剂量”是指以一剂/一次/单途径/单接触点(即单次施用事件)施用的任何治疗剂的剂量。在某些实施方案中，提供单个单位剂量作为离散剂型(例如，片剂、胶囊、贴剂、装载的注射器、小瓶等)。
相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体相关性。聚合物分子彼此的相似性百分比的计算可以与计算同一性百分比相同的方式进行，除了相似性百分比的计算考虑了本领域已知的保守取代。
分剂量：如本文所用，“分剂量”是将单个单位剂量或每日总剂量分成两个或更多个剂量。
稳定：如本文所用，“稳定”是指足够强健以从反应混合物中存活分离到有用纯度并且，在某些实施方案中，能够配制成有效治疗剂的化合物。
稳定化的：如本文所用，术语“稳定化(stabilize)”，“稳定化的(stabilized)”，“稳定化的区域(stabilized region)”是指使得或变得稳定。
受试者：本文使用的术语“受试者”或“患者”表示可以给其施用根据本公开的组合物的任何生物，例如，为了实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型受试者包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和人类)和/或植物。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现出目标特征或特性的全部或接近全部程度或度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完全完成和/或进行到完全或达到或避免绝对结果。因此，本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在的完整性缺乏。
基本上相等：如在本文中所使用的，当它涉及剂量之间的倍数差时，该术语是指正/负2％。
基本上同时：如本文所用并且在涉及多个剂量时，该术语表示在2秒内。
患有：“患有”疾病、病症和/或病况的个体已被诊断出或表现出疾病、病症和/或病况的一种或多种症状。
易感：“易感”疾病、病症和/或病况的个体尚未被诊断为和/或未表现出该疾病、病症和/或病况的症状但具有发展疾病或其症状的倾向。在某些实施方案中，易患疾病、病症和/或病况(例如，癌症)的个体可以以下一种或多种为特征：(1)与疾病、病症和/或病况的发展相关的遗传突变；(2)与疾病、病症和/或病况发展相关的遗传多态性；(3)与疾病、病症和/或病况相关的蛋白和/或核酸的表达和/或活性的增加和/或降低；(4)与疾病、病症和/或病况发展相关的习惯和/或生活方式；(5)疾病、病症和/或病况的家族病史；(6)暴露于和/或感染与疾病、病症和/或病况发展相关的微生物。在某些实施方案中，易患疾病、病症和/或病况的个体将发展疾病、病症和/或病况。在某些实施方案中，易患疾病、病症和/或病况的个体将不会发展疾病、病症和/或病况。
持续释放：如本文所用，术语“持续释放”是指符合特定时间段内的释放速率的药物组合物或化合物释放曲线。
合成的：术语“合成的”是指通过人手生产、制备和/或制造。本公开的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学的或酶促的。
靶向：如本文所用，“靶向”是指设计和选择将与靶核酸杂交并诱导所需作用的核酸序列的过程。
靶细胞：如本文所用，“靶细胞”是指任何一种或多种目标细胞。可以在体外、体内、原位或生物体的组织或器官中发现细胞。该生物可以是动物，例如哺乳动物、人或人类患者。
末端区：如本文所用，术语“末端区”是指连接的核苷或氨基酸(分别为多核苷酸或多肽)的区的5’或3’末端上的区。
末端优化：术语“末端优化”在指核酸时是指核酸的末端区以某种方式(例如密码子优化)在天然或野生型末端区上改进。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引起期望的生物学和/或药理作用的任何药剂。
治疗有效量：本文使用的术语“治疗有效量”是指要递送的药剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，当施用给遭受或易患感染、疾病、病症和/或病况的受试者时，所述量足以治疗、诊断、预防所述感染、疾病、病症和/或病况，改善其症状，和/或延迟其发作。在某些实施方案中，以单剂量提供治疗有效量。在某些实施方案中，以包括多个剂量的剂量方案施用治疗有效量。本领域技术人员将理解，在某些实施方案中，如果单位剂型包含当作为这种剂量方案的一部分施用时有效的量，则可以认为该单位剂型包含治疗有效量的特定试剂或实体。
治疗有效的结果：如本文所用，术语“治疗有效的结果”是指在患有或易感感染、疾病、病症和/或病况的受试者中足以治疗、诊断、预防所述感染、疾病、病症和/或病况，改善其症状，和/或延迟其发作的结果。
总日剂量：如本文所用，“总日剂量”是在24小时内给定或处方的剂量。它可以单个单位剂量施用。
转染：如本文所用，术语“转染”是指将外源核酸引入细胞的方法。转染的方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、改进、解除特定的感染、疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或降低其发生率。例如，“治疗”癌症可以指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于降低发展成与疾病、病症和/或病况相关的病理的风险，治疗可施用于不表现出疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或施用于仅表现出疾病、病症和/或病况的早期体征的受试者。
未修饰的：如本文所用，“未修饰的”是指在以任何方式改变之前的任何物质、化合物或分子。未修饰的可能但并非总是指生物分子的野生型或初始形式。分子可以经历一系列修饰，由此每个修饰的分子可以用作随后修饰的“未修饰的”起始分子。
载体：如本文所用，“载体”是运输、转导或以其他方式充当异源分子的载体的任何分子或部分。本公开的载体可以重组产生，并且可以基于和/或可以包含腺相关病毒(AAV)亲本或参考序列。这样的亲本或参考AAV序列可以用作工程载体的原始、第二、第三或后续序列。在非限制性实例中，此类亲本或参考AAV序列可包含以下序列中的任何一个或多个：编码多肽或多个多肽的多核苷酸序列，该序列可以是野生型或从野生型修饰的，以及该序列可以编码蛋白、蛋白结构域或蛋白的一个或多个亚基的全长或部分序列；包含调节性或调控性核酸的多核苷酸，其序列可以是野生型或从野生型修饰的；以及可以从或不从野生型序列修饰的转基因。这些AAV序列可以用作一个或多个密码子(在核酸水平)或氨基酸(在多肽水平)的“供体”序列或一个或多个密码子(在核酸水平)或氨基酸(在多肽水平上)的“受体”序列。
病毒基因组：如本文所用，“病毒基因组”或“载体基因组”或“病毒载体”是指封装在AAV颗粒中的核酸序列。病毒基因组包含至少一个编码多肽或其片段的有效载荷区。
VII.等同和范围
本领域技术人员会认识到或使用不超过例行实验能够确定根据本文描述的公开内容的具体实施方案的许多等同方案。本公开的范围无意限于上面的描述，而是如所附权利要求所述。
在权利要求中，诸如“一个”、“一种”和“所述”的冠词可以是指一个/种或超过一个/种，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。如果群体成员中的一个、超过一个或所有成员存在于指定的产品或过程中、在指定的产品或过程中使用或以其它方式与指定的产品或过程相关，则认为满足在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非指示相反情形或以其它方式从上下文显而易见。本公开包括这样的实施方案，其中所述组的刚好一个成员存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或者以其它方式与给定产品或方法相关。本公开包括这样的实施方案，其中所述组成员中的超过一个或全部都存在于给定产品或方法中、用于给定产品或方法中或者以其它方式与给定产品或方法相关。
还应当指出，术语“包含”意图是开放式的，并且允许但不要求包括额外的要素或步骤。因此，当在本文中使用术语“包含”时，还包括和公开术语“由……组成”。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指示或以其它方式从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，以范围表述的数值在本公开的不同实施方案中可呈现处于所述范围内的任何具体数值或子范围，其精确至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。
另外，应当理解，可以从任意一项或多项权利要求中明确地排除落在现有技术内的本公开的任何特定实施方案。因为这样的实施方案被视为本领域普通技术人员已知的，所以可以排除它们，即使所述排除并未在本文中明确地阐明。可以因为任何原因从任意一项或多项权利要求排除本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗剂或活性成分；任何生产方法；任何使用方法等)，无论是否与现有技术的存在相关。
应当理解，已经使用的词语是描述而不是限制的词语，并且可以在所附权利要求的范围内做出变化，而不背离在它的更宽方面的本公开的真实范围和精神。
尽管已经就几个描述的实施方案而言相当详尽地且相当特定地描述了本公开，但是无意将本发明限于任何这样的细节或实施方案或任何具体实施方案，而是应当参考所附权利要求来解释本发明，从而考虑到现有技术提供这类权利要求的最广泛的可能解释，并因此有效地包括本公开的预期范围。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体并入本文。如果发生冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的，而非意图限制。
实施例
实施例1.下游–细胞裂解
使用本公开的杆状病毒生产系统生产了批量收获的AAV颗粒汇聚物，其中Sf9昆虫细胞用作AAV病毒生产细胞。
在生产生物反应器中在批量收获物上开始化学裂解，其通过加入0.2M精氨酸HCl、0.25％w/v Triton X-100表面活性剂、10U/mL Benzonase核酸酶，最后加入2M Tris碱，以提供6.7-7.3的裂解pH而完成。将裂解混合物在37℃下保持4.0-6.0小时，直到生成粗裂解物汇聚物。使粗裂解物汇聚物达到室温，并在进一步处理之前进行无菌采样。
在另一种选择中，在生产生物反应器中在批量收获物上开始化学裂解，其通过加入精氨酸HCl和Triton X-100表面活性剂，裂解pH为6.8-7.5而完成。将裂解混合物在27℃下保持4.0-6.0小时，直到生成粗裂解物汇聚物。
在另一种选择中，在生产生物反应器(225L工作体积)中在批量收获物上开始化学裂解，其通过以下完成：加入Tris碱，以提供6.9-7.1的裂解pH，然后在PBS背景中添加精氨酸HCl、赛多利斯Denarase核酸酶，最后添加Triton X-100表面活性剂。将裂解混合物在37℃下保持3-4小时，直到产生粗裂解物汇聚物。
在另一种选择中，在生产生物反应器中在批量收获物上开始化学裂解，其通过加入Triton X-100表面活性剂和Benzonase核酸酶而完成。将裂解混合物在搅拌下于37℃保持6-12小时，直到产生粗裂解物汇聚物。
实施例2.理解方案研究
裂解剂研究
对裂解剂进行了研究，以确定可以提供预料不到且改善的环境安全性、裂解效率、过滤通量和产品产量的具体试剂。测试了44种裂解剂，包括非离子去污剂、离子去污剂和两性离子型去污剂。该研究还包括三种PBS混合物作为阳性对照，并且裂解溶剂作为阴性对照。
根据本公开的方法和系统，使用sf9病毒生产细胞生产AAV颗粒。然后在以下条件下进行裂解研究：目标最终去污剂浓度为0.5％w/v；20mL实验规模；并在27℃裂解孵育4小时。使用ddPCR测量AAV颗粒产品的回收率。用0.22μm过滤通量测量AAV颗粒产物的通量。将Triton X-100(目标最终浓度为0.5％w/v)用作参考标准，用于结果的相关比较。
裂解剂和来自该研究的相应结果总结在下表4中(相对通量和相对产率的数据是相对于Triton X-100参考的百分比)：
表4.裂解剂研究结果
研究结果突出显示了几类值得注意的非离子、离子和两性离子物质，它们显示出改进的相对过滤通量和更高的产品产率。
病毒清除研究
在使用杆状病毒生产系统和Sf9昆虫细胞产生的多批量收获物汇聚物的AAV颗粒中，研究了四种裂解剂在灭活杆状病毒(BACV)和水疱性口炎病毒(VSV)方面的功效。BACV是已知的工艺污染物，并且VSV被用作已知的弹状病毒细胞系污染物的模型。
四种裂解剂如下：去污剂1-月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)(MilliporeSigma P/N40236)；去污剂2-Ecosurf SA-9(Dow Chemical,MilliporeSigma P/N STS0007)；去污剂3-Empigen BB(Calbiochem,MilliporeSigma P/N 324690)；和去污剂4-Zwittergent 3-14(Calbiochem,MilliporeSigma P/N 693017)。
该病毒清除研究的结果总结在下表5中(数值代表病毒污染物TCID50的Log10降低值)。
表5.病毒清除研究
研究结果表明，去污剂3(Empigen BB)具有最强的病毒BACV和VSV病毒清除活性。
精氨酸浓度研究
使用0.25％Triton X-100裂解剂在不同的pH条件下研究了化学裂解。在收获物汇聚物裂解之前，还向细胞培养液中添加了不同浓度的精氨酸。这项研究的结果总结在下表6中。
表6.精氨酸浓度研究
研究结果表明，在裂解前向收获物汇聚物中加入0.5M精氨酸可显著提高化学裂解过程中AAV的回收产率，并且在pH为6.0-7.0时最有效。
实施例3.下游-深度过滤
提供了来自实施例1中所述的化学裂解过程的粗裂解物汇聚物。使用EMDMillipore Millistak+POD过滤器通过深度过滤对粗裂解物汇聚物进行处理。将使用20mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为7.4)的过滤器回收冲洗液通过深度过滤器，并将冲洗后的回收液添加到深度过滤汇聚物中。
在另一种选择中，使用Millipore MC0SP23CL3过滤器通过深度过滤对粗裂解物汇聚物进行处理。
在另一种选择中，回收冲洗液使用50mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为7.4)。在另一种选择中，回收冲洗液使用PBS。
实施例4.深度过滤研究
研究了来自四(4)个供应商(MilliporeSigma、Pall Corporation、3M、Sartorius)的深度过滤系统，以识别可以提供预料不到的和改进的过滤通量和产品产量的具体系统和过滤器组合。
在与Sartopore 2XLG Sartoscale(5445307GV-LX-C)无菌过滤器(0.22μm过滤器)组合的选自四个供应商每一个的四个深度过滤器上完成了过滤器测试。无菌过滤器来自EMD Millipore Express SHC(SHGEA25NB6)、Pall Supor EKV膜(KM2EKVS)和3MLifeASSURE PDA(70357-03-B-PDA020N)。但是，发现Sartopore 2XLG可提供更好的结果，并且是用于测试的精选无菌过滤器。
来自测试的深度过滤器的数据输出包括以下内容：(i)Pmax(在恒定流量下，穿过深度过滤器的Δ压力(delta-pressure)增加)；(ii)回收产率(滤液中存在的全部载体基因组占装载在过滤器上的全部载体基因组的百分比)；(iii)浊度(以NTU标准单位计量)；和(iv)串联无菌级过滤器的Vmax(恒定压力)(在完全堵塞之前，每平方米过滤器面积可过滤的最大负载升数，无菌过滤器Vmax评估上游深度过滤器去除颗粒的程度)。
来自测试的无菌过滤器的数据输出包括直接测试Vmax(仅无菌过滤器)和串联测试(与深度过滤器串联的无菌过滤器，以评估上游深度过滤器去除颗粒的程度)。
Vmax恒压试验(仅深度过滤器)-测量流量减少量(L/m2)作为颗粒保留而产生的通量的函数(最小流速终点)；(ii)(iii)回收产率(深度过滤器+无菌过滤器)-测量产品回收量输出占病毒产品输入的百分比；和(iv)输出浊度(仅浊度过滤器)，以比浊法浊度单位(NTU)计。
第1阶段
在研究的第1阶段，使用AAV颗粒裂解物测试了所有16个过滤器系统(单个过滤器组)。这项研究的结果总结在下表7中(归一化的回收率百分比是相对于98％的最高回收百分比进行归一化)。
表7.深度过滤研究-第1阶段结果
第2阶段
在研究的第2阶段，从每个供应商选择了第1阶段的一个初级过滤器。然后，使用来自同一供应商的四个二级深度过滤器对每个选定的初级过滤器进行单独测试(双过滤器组)。这项研究的结果总结在下表8中(归一化的回收率百分比是相对于103％的最高回收百分比进行归一化)。
表8.深度过滤研究–第2阶段结果
第3阶段
在研究的第3阶段，从每个供应商选择了来自第2阶段的初级过滤器+二级过滤器的一个组合。然后测试每种选择的过滤器组合(双过滤器组+无菌过滤器)的回收率和浊度。这项研究的结果总结在下表9中(归一化回收率百分比是相对于87％的最高回收百分比进行归一化)。
表9.深度过滤研究–第3阶段结果
实施例5.下游–0.2μm过滤
提供来自实施例3的深度过滤汇聚物。使用EMD Millipore Express SHC XL1500.5/0.2μm过滤器，通过0.2μm过滤，处理来自深度过滤的深度过滤汇聚物。将使用20mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为7.4)的过滤器回收冲洗液通过0.2μm过滤器，并将冲洗后的回收液添加到0.2μm的过滤汇聚物中。所得的0.2μm过滤汇聚物中加入NaCl并保持1-2天，形成澄清的裂解物汇聚物。澄清的裂解物汇聚物保存在2-8℃。
在另一种选择中，0.2μm过滤使用Sartorius Sartopore 2XLG，0.8/0.2μm过滤器。在另一个可选方案中，0.2μm过滤包括使用50mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为7.4)进行冲洗。
实施例6.下游–亲和色谱
提供来自实施例5的澄清的裂解物汇聚物。通过使用GE AVB Sepharose HP柱树脂的亲和色谱(AFC)处理来自深度过滤和0.2μm过滤的澄清的裂解物汇聚物。用20mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为7.4)平衡柱树脂。然后，在18-25℃下，将澄清的裂解物汇聚物装入柱树脂中，然后用20mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为7.4)的混合物冲洗。随后用20mM柠檬酸钠、1M氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为6.0)的混合物进行柱树脂的第一洗涤；并用10mM柠檬酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为6.0)进行柱树脂的第二洗涤。然后使用20mM柠檬酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为3.0)的混合物从柱树脂上洗脱过滤的产物。
用0.5M Tris碱和普兰尼克F-68中和所得的洗脱汇聚物。然后，使用EMDMillipore Express SHC XL6000 0.5/0.2μm过滤器通过0.2μm过滤处理中和的洗脱汇聚物，产生AFC汇聚物(也称为AVB汇聚物)，工作汇聚物体积为8.5-9.0L。
在另一种选择中，柱树脂用50mM磷酸钠、350mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为7.4)平衡和冲洗。在另一种选择中，在第一和第二洗涤步骤之前不冲洗柱树脂。在另一种选择中，将所得洗脱汇聚物用2M Tris碱和普兰尼克F-68中和。
实施例7.亲和色谱(AFC)再生/循环研究
对亲和色谱(AFC)再生进行了研究，以鉴定可以提供预料不到的和改进的AVB再生和循环的具体再生剂。
在第1阶段中，使用20个连续运行和再生循环(洗脱峰AUC(mL x mAU)在每次再生后进行测量)，分析AFC再生和循环的残留物脱模剂(legacy strip agent，350mM NaCl、20mM柠檬酸盐、0.001％普兰尼克F-68，pH 2.5)。经过5个再生循环后，使用残留物脱模剂再生的AFC柱的洗脱峰AUC从原始值降低到70％；10次运行后洗脱峰AUC下降至27％，15次运行后下降至25％，然后洗脱峰AUC保持在25％左右直至20次运行。
在第2阶段中，在6个连续的AFC再生循环下，使用四种AFC脱模剂研究了AFC再生。这项研究的结果总结在以下表10中。
表10.AFC再生研究
在第3阶段中，在12个连续的AFC再生循环下，使用2M盐酸胍研究了AFC再生。这项研究的结果总结在以下表11中
表11.2M盐酸胍再生研究
| 运行编号 | AUC(mL*mAU) | 第1次运行的％ |
| 1 | 240.5 | 100％ |
| 5 | 231.7 | 96％ |
| 10 | 229.8 | 96％ |
| 12 | 185.8 | 77％ |
这项研究表明2M盐酸胍提供了预料不到的且改进的AFC再生和循环结果，因为它能够在10个连续的AVB再生循环后保持高于95％的洗脱峰AUC，在12个连续的AFC再生循环后保持高于75％的洗脱峰AUC。
实施例8.下游–离子交换色谱
提供了来自实施例6的中和的AFC汇聚物。使用Sartorius Sartobind Q膜(结合-洗脱模式)通过阴离子交换色谱(AEX)处理AFC汇聚物。AEX膜用20mM Tris、2M氯化钠和普兰尼克F-68的第一混合物(混合物pH为8.0)平衡，然后用20mM Tris、100mM氯化钠和普兰尼克F-68的第二混合物(混合物pH为8.0)平衡。然后在18-25℃将AEX膜系统加载AFC汇聚物。用20mM Tris、100mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为8.0)冲洗系统。然后用20mMTris、220mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为8.0)从AEX膜系统洗脱产物，并收集全部洗脱液。然后使用EMD Millipore Express SHCXL150过滤器通过0.2μm过滤处理AEX洗脱汇聚物，从而形成AEX汇聚物，工作汇聚物体积为1.5-2.0L。
在一种选择中，使用Millipore Fractogel TMAE HiCap(m)流通膜树脂通过AEX处理中和的AFC汇聚物。向AEX膜装入20mM Tris、2M氯化钠和普兰尼克F-68的第一混合物(混合物pH值为8.0)，然后加入40mM Tris、170mM氯化钠和普兰尼克F-68的第二混合物(混合物pH为8.5)，并使其平衡。然后在18-25℃将AEX膜系统加载AFC汇聚物。用40mM Tris、170mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为8.5)冲洗和洗脱系统，并收集全部洗脱液。然后使用EMD Millipore Express SHCXL150过滤器通过0.2μm过滤处理AEX洗脱汇聚物，形成AEX汇聚物。
在一种选择中，使用GE Q Sepharose膜树脂通过AEX处理中和的AFC汇聚物。用50mM Bis-Tris丙烷、200mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为9.0)平衡AEX膜。在18-25℃和150cm/hr下将AEX膜系统加载AFC汇聚物。用50mM Bis-Tris丙烷、200mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为9.0)冲洗并洗脱系统。用Tris、NaCl和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为pH 7.5)中和AEX洗脱汇聚物。然后使用EMD Millipore Express SHCXL150过滤器通过0.2μm过滤处理AEX洗脱汇聚物，形成AEX汇聚物。
在一种选择中，使用Poros HQ膜树脂通过阴离子交换色谱法(AEX)处理中和的AFC汇聚物。
在一种选择中，使用Poros XS膜树脂通过阳离子交换色谱法(CEX)处理中和的AFC汇聚物。向CEX膜上装入1M NaCl，然后用20mM Tris、100mM NaCl和普兰尼克F-68(混合物pH为pH 8.5)平衡。然后将AFC汇聚物加载到CEX膜系统中。用20mM Tris和普兰尼克F-68(混合物pH为8.5)洗涤该系统；然后先用20mM Tris、290mM NaCl和普兰尼克F-68(混合物pH为pH8.5)洗脱；然后用20mM Tris、305mM NaCl和普兰尼克F-68(混合物pH为pH 8.5)进行第二次洗脱。CEX洗脱汇聚物用乙酸中和至混合物pH 7.0。然后使用EMD Millipore Express SHCXL150过滤器通过0.2μm过滤处理AEX洗脱汇聚物，得到与AEX汇聚物相当的CEX汇聚物。
实施例9.下游–TFF过滤
提供了来自实施例8的中和的AEX汇聚物。使用Spectrum mPES中空纤维TFF系统通过切向流过滤(TFF)处理中和的AEX汇聚物。首先用WFI水冲洗TFF系统，然后用0.1M NaOH消毒，然后用AEX洗脱缓冲液(pH 8.0)平衡，该缓冲液包含20mM Tris、220mM氯化钠和普兰尼克F-68，并持续进行平衡，直到渗透流出物和保留流出物的pH值均为8.0。使用Asahi KaseiPlanova 35N过滤器通过Pre-TFF纳滤对AEX汇聚物进行处理，以产生TFF负载汇聚物。使用第一渗滤缓冲液(高盐，低蔗糖)通过第一渗滤(DF)步骤处理TFF负载汇聚物，该缓冲液包括10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、220mM氯化钠、5％w/v蔗糖和普兰尼克F-68(缓冲液pH为7.5)。渗滤产物汇聚物后，通过超滤浓缩至目标浓度为5.0-9.0x1013 VG/mL(通过qPCR或ddPCR确认)，然后使用最终制剂缓冲液(低盐，高蔗糖)进行第二渗滤步骤，该缓冲液包括10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、氯化钠、7％w/v蔗糖和普兰尼克F-68(缓冲液pH为7.5)。将包含产物和最终制剂缓冲液的保留物收集到最终TFF汇聚物中。使用qPCR或ddPCR过夜分析最终TFF汇聚物的病毒滴度。
使用最终制剂缓冲液(低盐，高蔗糖)对TFF系统进行回收冲洗，该缓冲液包括10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、100mM氯化钠、7％w/v蔗糖和普兰尼克F-68(缓冲液pH为7.5)。最终TFF回收冲洗液与最终TFF汇聚物分开收集。使用qPCR或ddPCR过夜分析最终TFF回收冲洗液的病毒滴度。将最终TFF回收冲洗液添加到最终TFF汇聚物中，以提供病毒浓度为2.0-5.0x1013 VG/mL的VRF负载汇聚物。根据需要添加其他最终制剂缓冲液(低盐，高蔗糖)以达到VRF负载汇聚物的目标病毒浓度。
在一个选择中，使用Millipore Pellicon-3Ultracel PLCTK系统通过TFF处理中和的AEX汇聚物。用20mM Tris、290mM氯化钠和普兰尼克F-68平衡TFF系统，持续进行平衡，直到渗透流出物和保留流出物的pH均达到7.0。用20mM Tris、290mM氯化钠和0.001％(w/v)普兰尼克F-68稀释TFF负载汇聚物，使病毒浓度达到1.0-5.0x1012 VG/mL。TFF负载汇聚物未通过Pre-TFF纳滤处理，而是使用包含10mM磷酸钠、180mM氯化钠和普兰尼克F-68的渗滤缓冲液(混合物pH为7.3)直接处理成渗滤步骤。然后将汇聚物通过超滤浓缩至2.5-7.0x1012VG/mL的目标浓度。将包含产物和制剂缓冲液的保留物收集到最终TFF汇聚物中。该过程不包括第二个渗滤步骤或回收冲洗。
在另一个选择中，使用带有Pellicon-3盒的Millipore Ultracel PLCTK系统通过TFF处理中和的AEX汇聚物。首先用WFI水冲洗TFF系统，然后用0.25M NaOH消毒，然后用包含40mM Tris、170mM氯化钠和普兰尼克F-68的平衡缓冲液(pH 8.5)平衡，持续进行平衡，直到渗透流出物和保留流出物的pH值均为8.5。TFF负载汇聚物未通过Pre-TFF纳滤或第一个渗滤步骤处理，而是通过超滤浓缩至2.5-7.0x1012 VG/mL的目标浓度(通过qPCR或ddPCR确认)，然后使用渗滤缓冲液的渗滤步骤，所述渗滤缓冲液包括10mM磷酸钠、180mM氯化钠和普兰尼克F-68(混合物pH为7.5)。使用相同的渗滤缓冲液对TFF系统进行回收冲洗。最终TFF回收冲洗液与最终TFF汇聚物分开收集，并且每个汇聚物使用EMD Millipore ExpressSHCXL150过滤器通过0.2μm过滤分别处理。过滤的TFF回收冲洗液添加到过滤的TFF汇聚物中，然后根据需要用渗滤缓冲液稀释，以提供病毒浓度为2.5-7.0x1012VG/mL的VRF负载汇聚物。
在另一个选择中，用10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、2.7mM氯化钾、192mM氯化钠和普兰尼克F-68的混合物(混合物pH为7.5)平衡TFF系统。TFF负荷汇聚物未通过Pre-TFF纳滤或第一渗滤步骤进行处理，而是通过超滤浓缩至1.5-5.0x1013 VG/mL的目标浓度(通过qPCR确认)，然后使用包含10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、2.7mM氯化钾、192mM氯化钠和普兰尼克F-68的渗滤缓冲液(混合物pH为7.5)进行渗滤步骤。使用包含10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、2.7mM氯化钾、192mM氯化钠和普兰尼克F-68的缓冲液对TFF系统进行回收冲洗。将最终TFF回收冲洗液添加到最终TFF汇聚物中，以提供病毒浓度为1.5-5.0x1013VG/mL的VRF负载汇聚物。
实施例10.切向流过滤系统的改进–膜构造
进行了研究，以改进切向流过滤系统，从而处理大体积的含AAV的制剂。研究了多种膜构造，以识别具体的切向流过滤(TFF)系统参数和膜特性，这些参数和特性可以提供预料不到的且改进的过滤通量、质量平衡、产品步骤产率和产品回收产率。考虑到以下几个特征，对膜构造进行分组和评估：(i)膜结构(中空纤维(HF)、平板(FS))；(ii)孔径(100KDa，50KDa，30KDa)；(iii)膜化学(改性聚醚砜(mPES)、再生纤维素(RC))。在各种TFF处理条件下评估膜构造，包括负载量、负载滴度、汇聚物体积、汇聚物滴度、冲洗体积和冲洗滴度的变化。测量并计算产物步骤产率、产物保留产率和膜质量平衡的结果。
这些研究的结果总结在以下表12中(体积以毫升为单位；滴度以x1012vg/mL为单位)。
表12.TFF膜构造研究
实施例11.切向流过滤过程的改进
进行了研究以改善切向流过滤过程，从而处理大体积的含AAV的制剂。这些研究的参数和结果总结在下表13中。
表13.TFF过程改进
实施例12.rAAV颗粒制剂的制剂优化
初步制剂筛选确定了磷酸盐/蔗糖/氯化钠制剂(2.7mM磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、155mM氯化钠和5％(w/v)蔗糖，pH 7.2，450mOsm/kg)作为治疗性rAAV颗粒的可接受的稳定制剂。高盐配方也被认为是稳定的。
进一步优化制剂了的赋形剂、钠/钾比、pH和重量克分子渗透压浓度，同时调整了适合CNS施用的因素。表14中列出了三种可用于配制治疗性rAAV颗粒的溶液。
表14.治疗性rAAV颗粒的制剂
要在上述确定的溶液中配制的AAV1-HD载体的浓度为约2.7x1013vg/mL，但浓度可以增加到多达5x1013vg/tnl。高浓度的AAV-HD载体显示在没有聚集的情况下难以稳定。制剂筛选的分析表明，蔗糖水平的提高通常会改善载体的稳定性并防止聚集。约5％至9％的蔗糖水平为AAV-HD载体提供了良好的稳定性，对于测试的载体和所需的制剂浓度，最佳浓度为约7％。蔗糖的使用水平可能受生理重量克分子渗透压浓度的限制。此外，显示出较高的重量克分子渗透压浓度和/或更多的氯化钠有利于载体稳定性。
实施例13.制剂优化研究
制剂研究旨在优化制剂组分和比例，以实现制剂和载体的最佳稳定性。在研究期间，所有测试均在5℃下进行，并且样品保持在5℃下。
筛选I-缓冲液替换
第一组研究比较了不同制剂的缓冲液。在用优选的缓冲液稀释之前，制剂的体积减少了。然后将制剂浓缩至3.4×1013vg/ml。所有制剂发生聚集，并且确定在浓缩期间需要糖以减少聚集。
筛选II–可选的缓冲液和糖的添加
将本研究中的制剂透析至所需的缓冲液中，然后浓缩至3x1013 vg/ml、4x1013 vg/ml或5.65x1012。测试的制剂为(1)含0.001％
的VYFORM2，(2)含0.001％
的VYFORM9，(3)含0.001％
的VYFORM10，(4)含0.001％
的VYFORM11，(5)含0.001％
的VYFORM23和(6)含0.001％
的VYFORM12。
依据筛选，最靠前的可选缓冲液是Tris和组氨酸，并且它们与蔗糖和氯化钠组合用于制剂中。滴度结果大部分与制剂所见的聚集趋势相符。较高的聚集导致较低的滴度。
筛选III-糖水平
将制剂透析到所需的缓冲液中，然后浓缩至4×1013vg/ml。测试的制剂为(1)含0.001％
的VYFORM7，(2)含0.001％
的VYFORM8，(3)含0.001％
的VYFORM21，(4)含0.001％
的VYFORM22，(5)含0.001％
的VYFORM24，(6)含0.001％
的VYFORM28和(7)含0.001％
的VYFORM25。
根据该研究，确定需要糖(例如蔗糖)和磷酸盐缓冲液以稳定制剂。滴定结果大部分与制剂所见的聚集趋势相符。较高的聚集导致较低的滴度。
筛选IV-pH范围对AAV稳定性的影响
比较了不同pH的制剂的AAV(浓度为5.65x1012和4x1013 vg/ml)的稳定性。测试的制剂为(1)pH 7的含0.001％
的VYFORM12，(2)pH7.8的含0.001％
的VYFORM26，(3)pH6的含0.001％
的VYFORM26，以及(4)pH8.5的含0.001％F-68的VYFORM26。发现pH对稳定性没有即时影响。
筛选V-制剂组分比例的优化
为了优化制剂，对不同的成分比例和用量进行了评估。在5℃和25℃下pH值为6.9的测试制剂为(1)重量克分子渗透压浓度为428mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM3，(2)重量克分子渗透压浓度为402mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM4，(3)重量克分子渗透压浓度为425mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM5，和(4)重量克分子渗透压浓度为402mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM6。在5℃下的pH为7.5，在25℃下的pH为7.4的测试制剂是(5)重量克分子渗透压浓度为424mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM13，(6)重量克分子渗透压浓度为404mOsm/kg的含0.001％的
的VYFORM14，(7)重量克分子渗透压浓度为432mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM15，(8)重量克分子渗透压浓度为413mOsm/kg的含0.001％
的VYFORM16，(9)重量克分子渗透压浓度为436mOsm/kg的含0.001％的
的VYFORM17，以及(10)重量克分子渗透压浓度为410mOsm/kg的含0.001％的
的VYFORM18。发现许多制剂具有继续研究所需的稳定性水平。
筛选VI–稳定性
表15提供了筛选II-V中测试的制剂的稳定性的总结。在表15中，“NT”是指未测试，并且“-”表示观察到少于85％的单体，“+”是指观察到85-90％的单体，而“++”是指观察到90-100％的单体。
表15.制剂稳定性结果
发现具有高浓度的AAV的制剂难以稳定。制剂的稳定性倾向于随蔗糖水平的增加而增加，但是稳定性水平似乎在7％蔗糖后趋于平稳，并且具有9％蔗糖的制剂没有赋予任何额外的稳定性。还发现组氨酸缓冲的蔗糖制剂也是高度稳定的。另外，发现具有更高的重量克分子渗透压浓度和更高的氯化钠浓度的制剂可以提供更稳定的制剂，更高的载体稳定性以及更好的CNS递送制剂。
实施例14.长期储存制剂稳定性研究
研究了制剂1(实施例12)在各种温度和搅拌条件下的长期储存稳定性。提供制剂1中的AAV颗粒的初始样品(AAV1衣壳)，其具有以下性质：滴度-2.77×1013vg/ml；平均粒子半径(DLS)-16.5nm；单体纯度(DLS)-100％；重量克分子渗透压浓度-462mOsm/kg；pH-7.36；相对效力-82.1。
在-80℃至40℃的温度范围下储存某些样品；某些样品在5℃和37℃下经受了多次冻融循环；并将某些样品置于搅拌下5个小时。
长期储存制剂稳定性研究的结果总结在下表16中。
表16.制剂稳定性结果
长期储存制剂稳定性研究的结果表明制剂1提供了以下内容：(i)在≤4℃的储存温度下AAV滴度一致性可达274天(测试极限)；(ii)在≤4℃的存储温度下高单体纯度(即，低AAV颗粒聚集)一致性可达100天储存，并且在≤-20℃的温度下可达274天(测试极限)；(iii)AAV效力一致性在≤4℃的储存温度下可达274天(测试极限)；并且(iv)通过7个冻/融循环后中保持AAV滴度、高单体纯度和AAV效能一致性。
实施例15.下游–病毒保留过滤
提供了来自实施例9的VRF负载汇聚物。使用Asahi Kasei Planova 35N过滤器通过病毒保留过滤(VRF)处理VRF负载汇聚物，该过滤器已通过用10mM磷酸钠、1.5mM磷酸钾、100mM氯化钠、7％w/v蔗糖和普兰尼克F-68(缓冲液pH为7.5)的制剂缓冲液在使用前冲洗来处理。VRF过滤后，使用EMD Millipore Express SHCXL150过滤器通过0.2μm过滤进行处理，从而形成工作病毒浓度为2.5-7.0x1013 VG/mL的VRF汇聚物。
然后使用EMD Millipore Sterile Millipak 0.22μm通过Millipore最终过滤(FF)对VRF汇聚物进行处理，以提供工作病毒浓度为1.5-5.0x1013VG/mL的药物物质汇聚物。在2-8℃下，将一部分药物物质汇聚物在与大气隔离的无菌生物处理袋中储存≤1个月。一部分药物物质汇聚物在≤-60℃的环境中于与大气格力的无菌聚丙烯容器中存储≥1个月。
在一种选择中，将VRF过滤器和FF过滤器均用WFI水进行使用前冲洗，然后用10mM磷酸钠、180mM氯化钠和普兰尼克F68(混合物pH为7.3)进行第二使用前冲洗。
在一种选择中，VRF过滤器用10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、2.7mM氯化钾、192mM氯化钠和普兰尼克F68的混合物(混合物pH为7.5)进行使用前冲洗。
实施例16.下游–填充和完成
提供了来自实施例15的汇聚的药物物质。汇聚的药物物质被转移到生物安全柜(BSC)中并通过EMD Millipore Millipak Gamma Gold 0.22μm过滤器(双重在线灭菌级过滤器)过滤。然后使用BSC内的可编程蠕动分配泵将过滤后的药物物质汇聚物无菌填充到2ml冷冻管中。将产品小瓶塞好，盖上密封盖，100％目视检查，并贴上标签(在25℃下)，然后在≤-65℃下储存。
在一种选择中，通过Pall Supor EKV,0.2μm灭菌级过滤器过滤汇聚的药物物质。
实施例17.累积病毒清除研究
研究了实施例2(裂解去污剂)、实施例7(亲和色谱)、实施例8(离子交换色谱法)和实施例15(病毒保留过滤)的工艺步骤在灭活使用杆状病毒生产系统和Sf9昆虫细胞产生的AAV颗粒的批量收获汇聚物中的已知病毒污染物的有效性。杆状病毒(BACV)是一种已知的工艺污染物；水疱性口炎病毒(VSV)被用作已知的弹状病毒细胞系污染物的模型；5型人类腺病毒(Ad5)是已知的工艺污染物，其可以充当辅助病毒来促进不需要的AAV复制；并且3型呼肠病毒(Reo3)被用作已知dsRNA病毒污染物的代表模型。
病毒清除研究的结果总结在下表17中。值代表病毒污染物的Log10降低值(TCID50)；“NV”表示未收集到任何值。
表17.病毒清除研究
结果表明实施例2(裂解去污剂)、实施例7(亲和色谱)、实施例8(离子交换色谱)和实施例15(病毒保留过滤)的工艺步骤的组合可提供大于20的Log10病毒减少值。如表17和图4A-4D所示，使用流通AEX色谱提供了非常可靠的病毒清除能力。
实施例18.剂量优化研究I
i.研究设计
这项研究的主要目的是在恒河猴的纹状体、皮层和丘脑中评估递送参数，以优化AAV1包装的AAV1-miRNA表达载体的分布，该载体包含ITR至ITR序列VOYHT1(以下称为AAV1-VOYHT1；VOYHT1的SEQ ID NO：41)；并为建立将来的剂量参数和外推到临床剂量范例提供基础。第二目标是对递送参数进行有限的安全性和耐受性评估。
恒河猴(Macaca mulatta)被选作测试系统，是因为它已确立了实用性并被接受为药理学和毒理学研究的模型，特别是当使用向中枢神经系统(CNS)的基因疗法传递时。相对于其他非人类灵长类动物(NHP)，更完整地了解的恒河猴基因组图谱与评估RNA干扰产物特别相关。大脑体积和解剖结构也是选择这个品种时来解决研究目标时考虑的重要因素。
这项研究涉及对34只动物的筛选，以获得用于剂量的18只和备选的2只。如表18所总结的，将18只动物分为6个治疗组。选择向核壳和丘脑中进行双侧实质内输注，以最大化通过轴突运输至皮层区的大脑分布。此外，核壳和丘脑是优选的输注部位，因为早期HD人类患者的核壳和丘脑比恒河猴大4-5倍，而且尾状核严重萎缩会阻止直接输注到尾状核中。
表18.研究设计
表19列出了对应于表18中每个组的计算的人当量剂量。
表19.人当量剂量
每只动物均使用磁共振成像(MRI)引导的对流增强递送(CED)接受含有AAV1-VOYHT1的测试物品或溶媒对照的的双侧颅内输注到核壳和丘脑。施用后5星期(第36±3天)对动物实施安乐死，并收集组织用于死后分析。
ii.动物护理和样品收集
选择34(N＝34)只健康成年雄性或雌性恒河猴(4-10岁龄)进行预筛选。动物重4-10kg。从疾病控制与预防中心(CDC)隔离结束后，至少要让动物适应2星期。收集动物的项目前血液样品以筛选抗AAV1中和抗体(nAb)滴度。选择18只(N＝18)抗AAV1 NAb血清滴度≤1:16的动物，称重，并随机分为研究组进行给药，如表18所示。选择另外2只动物作为备选研究动物。对动物维持Harlan 20％灵长类动物饮食，可以自由饮水。定期对水样进行特定微生物和环境污染物的分析。动物房的环境对照设置为保持70±6°F，每小时至少换气10次，光照12小时/黑暗12小时循环。每天两次进行笼侧监测，每天一次进行食物消耗评估。每周测量一次体重。在整个研究中，将动物饲养在单独的笼子中。
在给药前(即接受AAV1-VOYHT1输注的第一只动物给药开始前7天)，第15±2天以及第36±3天紧接尸检前，收集血液样品进行临床病理评估和中和抗体(nAb)分析。临床病理评估包括血液学(CBC)、血清临床化学(Chem)和凝血(Coag)分析。在给药前(第1天)和第36±3天紧接尸检前，从颈部区域收集脑脊液(CSF)样品进行nAb分析。尸检后，收集脑、脊髓、背根神经节和主要器官，然后通过浸入用新鲜冷冻或4％多聚甲醛(PFA)后固定。
iii.测试物品的制备和给药程序
该研究中使用的测试物品包含配制在水溶液中的AAV1-VOYHT1基因转移载体(2.7e12 vg/mL)，该水溶液包含192mM氯化钠、10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、2.7mM氯化钾和0.001％泊洛沙姆188
溶媒对照仅包含制剂缓冲液。将样品储存在-60℃或更低的温度下，并在给药当天解冻并保持在2-8℃。
(BraccoDiagnostics,Inc，即钆特醇)以1:250的比例添加(每250μL的测试物品或对照1μLProHance)，并在装入输液系统之前，通过倒转管小心混合。给药溶液包含测试物品或对照和2mM浓度的钆特醇。给药溶液的稀释总结于表20中。“N/A”表示数据不可用。
表20.给药溶液的稀释
在即将手术之前，每只动物均用肌内(IM)氯胺酮(10mg/kg)和IM右美托咪定(15μg/kg)麻醉，称重，插管并维持在1-5％的异氟烷中。将头部固定在立体定向仪上，并备皮上面的皮肤准备用于神经外科植入手术。使用无菌技术，在解剖层中打开伤口部位以暴露头骨。在位于每侧额叶和/或顶叶上方的进入部位进行双侧开颅手术。使用钛螺钉将颅骨安装的套管引导球阵列临时固定在每个钻孔上方的颅骨上。植入导管引导器的手术后，立即将动物转移到MRI套件中。MR成像用于将套管引导器与每个套管引导器同侧的核壳和丘脑靶标对准。采用重复MR成像来施用测试物品或对照，以目测监测大脑内的上述表18所示的输注。每只动物在每个核壳和丘脑中使用对流增强递送(CED)接受测试物品或对照的最多2次输注(部位)。通过颅骨安装的套管阵列将可调节尖端的16G套管(MRI InterventionsInc.)引导到每个目标部位。套管连接到安装在注射泵(Harvard Apparatus)上的注射器。使用递增的输注速率(最高10μL/分钟)将剂量体积(每半球50-400μL)沉积到每个壳壳或丘脑中。获得了连续MRI扫描以监视每个目标部位内的输注物分布，并提供给药的实时监视。在某些情况下，在输注期间，插管会更深地进入到核壳或丘脑中，以使注入物在核壳或丘脑内的分布最大化。MRI CED给药程序完成后，立即将动物转移回手术室，植出套管引导系统，并使用可吸收的vicryl缝合线并采用简单的间断缝合方式将伤口部位在解剖层中封闭。术前和术后用药包括丁丙诺啡(0.03mg/kg,IM,b.i.d.)、卡洛芬(2.2mg/kg SQ,b.i.d.)、酮洛芬(2mg/kg,IM,s.i.d.)和头孢唑啉(100mg IV，手术前和手术后，然后25mg/kg,IM,b.i.d)或头孢曲松(50mg/kg,IM,s.i.d.)。监测动物从麻醉中的完全恢复并返回其笼中。
iv.在来自不同输注体积的NHP纹状体、皮层和丘脑的穿孔中进行HTT敲低和载体
基因组(VG)测量
设计该分析来评估不同输注体积对载体分布和覆盖范围的影响。来自A1组(低体积)、A2组(中体积)、A3组(高体积)和A6组(对照)的含有运动和躯体感觉皮层和前核壳的选定脑板被用于收集2mm穿孔。从大脑的每一侧收集了6个皮层、8个核壳、2个尾状核和5个丘脑穿孔(每只动物总共42个)，从所有四个组中总共收集了504个穿孔。将样品在
匀浆缓冲液中均质化，然后进行蛋白酶K消化。在另外的DNA纯化步骤(Qiagen，目录号69506)之后，生成澄清的细胞裂解液，并进行处理，以用于使用分支DNA(bDNA)测定进行的HTT mRNA测量和使用液滴数字PCR(ddPCR)进行的载体基因组(VG)测量。使用专门针对恒河猴HTT的探针，根据
测定(ThermoFisherScientific)方案，进行bDNA测定。一式两份测定细胞裂解物。将HTT mRNA水平标准化为三个恒河猴管家基因(即AARS、TBP和XPNPEP1)的几何平均值。将结果校准至溶媒组的归一化平均值，并表示为：相对剩余HTT mRNA的平均值(％)±stdev。对于ddPCR，从bDNA测定中所用的相同组织匀浆中制备全细胞DNA。用探针组CBAPromoter检测的载体基因组水平相对于宿主探针组(RNA酶P)进行了归一化。在分析期间所有样品均是不知情的。
在核壳中，所有组均显示HTT mRNA敲低，对于A1组、A2和A3，相对于溶媒分别保留63％、48％和39％的HTT mRNA(参见图5A-5C)。在每只动物的16个穿孔中(每组总共3只动物)，A1、A2和A3组分别平均有52％、79％和92％的穿孔达到至少30％的HTT mRNA敲低。表21列出了相对于溶媒对照组归一化后，每个AAV1-VOYHT1处理组平均的每组的核壳中HTTmRNA水平。
表21.相对于每只动物平均的各输注体积的核壳中HTT mRNA敲低
在从三组中每组采样的所有核壳穿孔中分析VG拷贝时，在不同的载体输注体积上均观察了差异的VG分布。在A3组中观察到最高和最稳定的VG分布模式，随后是A2组和A1组(图5A-5C)。在左半球和右半球中观察到了这种差异载体分布模式。用核壳HTT敲低跟踪VG水平，A3组同时具有最高的VG代表性和最大的HTT mRNA敲低。对于VG水平，表22列出了按照每只动物平均的从每组的核壳穿孔中检测到的VG拷贝数。
表22.按照每只动物平均的各输注体积的核壳穿孔中的VG拷贝
应用Grubbs检验(Q＝0.1％)去除异常值，并重新计算VG拷贝/细胞。在此事后统计分析之后，A1组和A3组每只动物的核壳穿孔的VG拷贝没有变化，但是对于A2组，VG拷贝/细胞被重新计算为489.7±204.0。
在尾状核中，A3组显示出最大的HTT mRNA敲低，相对于溶媒剩余70％的HTT mRNA(见图6A-6C)。A1组和A2组分别显示相对于溶媒剩余91％和87％的HTT mRNA。VG水平与HTTmRNA敲低相关(参见图6A-6C)。表23显示了相对于溶媒对照组归一化后按照每只动物平均的各AAV1-VOYHT1处理组的尾状核中HTT mRNA水平。
表23.按照每只动物平均的各输注体积的尾状核穿孔中HTT mRNA敲低
在从三组中每组采样的所有尾状核穿孔中分析VG拷贝时，用HTT mRNA敲低跟踪VG水平(参见图6A-6C)。因此，A3组表现出最高的VG表现和最大的HTT mRNA敲低。对于VG水平，表24列出了按照每只动物平均的从每组的尾状核穿孔中检测到的VG拷贝数。
表24.按照每只动物平均的各输注体积的尾状核穿孔中的VG拷贝
应用Grubbs检验(Q＝0.1％)去除异常值，A1组中尾状核穿孔中检测的VG拷贝/细胞平均数保持不变，但A2组和A3组分别重新定量为1.8±0.5和10.7±10.3。分析了三个皮层区的穿孔：运动皮层(mCTX)、躯体感觉皮层(ssCTX)和颞叶皮层(tCTX)。在mCTX中，对于A3和A2组观察到显著的HTT敲低，A3组中的敲低大于A2组，分别导致相对于溶媒保留86％和91％的HTT mRNA(参见图7A-7C)。表25显示了相对于溶媒对照组归一化后按照每只动物平均的各AAV1-VOYHT1处理组的mCTX中的HTT mRNA水平。
表25.按照每只动物平均的各输注体积的mCTX穿孔中HTT mRNA敲低
在从三组中每组采样的所有mCTX穿孔中分析VG拷贝时，在所有组中，mCTX中的VG水平低于核壳中的VG水平，其中A3组显示出最高的VG表现(见图7A-7C)。在mCTX的左侧和右侧之间可见VG变异性。对于VG水平，表26列出了按照每只动物平均的每组mCTX穿孔中检测到的VG拷贝数。VG拷贝低于A6组(溶媒对照)的定量限(BLQ)。
表26.按照每只动物平均的各输注体积的mCTX穿孔中VG拷贝
在ssCTX中，仅在A3组的躯体感觉皮层中观察到HTT敲低，其中相对于溶媒保留了93％的HTT mRNA(参见图8A-8C)。表27显示了相对于溶媒对照组归一化后按照每只动物平均的各AAV1-VOYHT1处理组的ssCTX中HTT mRNA水平。
表27.按照每只动物平均的各输注体积的ssCTX穿孔中HTT mRNA敲低
在从三组中每组采样的所有ssCTX穿孔中分析VG拷贝时，在所有组中检测到的VG水平均低于mCTX中所观察到的水平，并且相比于A1组和A2组，A3组具有相对更高的VG表现(见图8)。对于VG水平，表28列出了按照每只动物平均的每组mCTX穿孔中检测到的VG拷贝平均数。VG拷贝低于A6组(溶媒对照)的定量限(BLQ)。
表28.按照每只动物平均的各输注体积的ssCTX穿孔中VG拷贝
合并的mCTX和ssCTX样品也包括在皮层穿孔分析中。当将mCTX和ssCTX样品合并时，A1、A2组和A3组的相对于溶媒残留的HTT mRNA分别为95±3％(平均值±标准偏差)、94±5％和90±5％。相对于对照，溶媒对照A6组中剩余的HTT mRNA为100±2％。因此，对于A1组，HTT mRNA敲低为约5％，对于A2组为约6％，并且对于A3组为10％。表29也显示了相对于溶媒对照组归一化后按照每只动物平均的各AAV1-VOYHT1处理组的合并的mCTX和ssCTX中HTT mRNA水平。
表29.按照每只动物平均的各输注体积的mCTX和ssCTX穿孔中HTT mRNA敲低
对于合并的mCTX和ssCTX穿孔中的VG水平，A3组显示出1.74±0.3VG拷贝/细胞(按照每只动物平均)，高于在A2组和A1组的穿孔中分别观察到的VG表现，后者分别包含1.01±0.7和0.99±0.4VG拷贝/细胞。VG拷贝低于A6组(溶媒对照)的定量限(BLQ)。对于VG水平，表30列出了按照每只动物平均的每组的mCTX和ssCTX穿孔中检测到的VG拷贝平均数。
表30.按照每只动物平均的各输注体积的合并的mCTX和ssCTX穿孔中VG拷贝
综上，对于mCTX和ssCTX的合并样品，用增强的HTT敲低和更高的VG表现跟踪增加的输液体积。
在tCTX中，对于三组中的任何一组均未观察到统计学上显著的HTT KD(参见图9A-9C)。当在从三组中每组采样的所有tCTX穿孔中分析VG拷贝时，相对于其他皮层区，在所有组中检测到较低的VG表现，但A3组的VG表现相对于A1和A2组相对较高(请参见图9A-9C)。
总之，在皮层中始终检测到VG，在mCTX中表现最高，其次是ssCTX。在穿孔、皮层区以及左右半球之间观察到差异。与ssCTX和tCTX相比，在mCTX中观察到相对较高的HTT mRNA敲低。在这些组中，A3组表现出最高的VG表现和最大的HTT mRNA敲低。在皮层中观察到了VG水平升高与HTT mRNA敲除增强之间的关系，就像在核壳和尾状核中一样。
在丘脑中，所有组均表现出HTT mRNA敲低，相对于溶媒，A1、A2和A3分别保留了35％、38％和30％的HTT。表31显示了相对于溶媒对照组归一化后来自AAV1-VOYHT1处理组的丘脑中HTT mRNA水平。
表31.按照每只动物平均的各输注体积的丘脑穿孔中HTT mRNA敲低
对于VG水平，表32列出了按照每只动物平均的每组丘脑穿孔中检测到的VG拷贝平均数。丘脑表现出最大的VG表现和最大的输注体积。因此，A3组具有比A1和A2组更大的VG表现。VG拷贝低于A6组(溶媒对照)的定量限(BLQ)。
表32.按照每只动物平均的各输注体积的丘脑穿孔中HTT mRNA敲低
总体而言，这些观察结果证明载体体积影响体内载体生物分布。在测试区中，所有组在核壳中均显示出显著的HTT mRNA敲低，而在尾状核中，A3组引起了显著的HTT敲低。在皮层中，mCTX(A3和A2组)和ssCTX(A3组)显示出统计学上显著的HTT mRNA敲低，这对应于高载体分布。所有组均显示丘脑中的HTT mRNA敲低，其中VG表现在所有采样区中最高。与核壳相比，在皮层中检测到较低的VG表现，但是与其他皮层区相比，在mCTX中观察到的VG拷贝相对更多。高VG水平与核壳、尾状核、皮层和丘脑中增强的HTT敲低相关。A3组显示出最高的VG分布，并显示出在所采样的四个脑区中每个区中最大的HTT mRNA敲低。最后，AAV1-VOYHT1以体积依赖性方式降低纹状体和初级运动皮层中的HTT mRNA水平。
v.中等浓度和低浓度下在来自NHP纹状体的穿孔中进行HTT敲低和载体基因组
(VG)测量
设计此分析来评估中等剂量浓度(其也可以称为中间剂量浓度)和低剂量浓度对载体分布和覆盖范围的影响。来自A4组(中等浓度)、A5(低浓度)和A6组(对照)的含有运动和躯体感觉皮层和前核壳的选定脑板被用于收集2mm穿孔。从大脑的每一侧收集了6个皮层、8个核壳、2个尾状核和5个丘脑穿孔(每只动物总共42个)，从所有四个组中总共收集了504个穿孔。将样品在
匀浆缓冲液中均质化，然后进行蛋白酶K消化。在另外的DNA纯化步骤(Qiagen，目录号69506)之后，生成澄清的细胞裂解液，并进行处理，以用于使用分支DNA(bDNA)测定进行的HTT mRNA测量和使用液滴数字PCR(ddPCR)进行的载体基因组(VG)测量。使用专门针对恒河猴HTT的探针，根据
测定(ThermoFisher Scientific)方案，进行bDNA测定。一式两份测定细胞裂解物。将HTT mRNA水平标准化为三个恒河猴管家基因(即AARS、TBP和XPNPEP1)的几何平均值。将结果校准至溶媒组的归一化平均值，并表示为：相对剩余HTT mRNA的平均值(％)±stdev。对于ddPCR，从bDNA测定中所用的相同组织匀浆中制备全细胞DNA。用探针组CBAPromoter检测的载体基因组水平相对于宿主探针组(RNA酶P)进行了归一化。在分析期间所有样品均是不知情的。
在核壳中，A4组(中等浓度)和A5组(低浓度)均显示HTT mRNA敲低，相对于对照，分别剩下63±9％(平均±stdev)和73±9％HTT mRNA。因此，mRNA水平以剂量相关的方式降低，中低浓度组的HTT mRNA分别降低了约37％和27％。对于VG水平，在A4组和A5组的核壳穿孔中检测到的VG拷贝的平均数分别为119.4±18.1和66.9±21.5VG拷贝/细胞。
在尾状核中还观察到HTT mRNA敲低，相对于对照，A4组和A5组的敲低分别为88±6％(平均±标准差)和91±10％。因此，mRNA水平以剂量相关的方式降低，中低浓度组的HTTmRNA分别降低了约12％和9％。A4组和A5组的尾状核中HTT mRNA的降低比核壳相比低约20％。对于VG水平，在A4组和A5组的尾状核穿孔中检测到的VG拷贝的平均数分别为0.4±0.1和9.3±15.4VG拷贝/细胞。当应用Grubbs检验(Q＝0.1％)去除异常值时，在A5组的尾状核穿孔中检测到的VG拷贝的平均数从9.3变为0.3±0.2。Grubbs检验后，A4组的平均VG保持不变。在中等剂量浓度(低约300倍)和低剂量浓度(低约7倍)下，尾状核的VG拷贝表现均比核壳低几倍。
最后，在丘脑中观察到HTT mRNA敲低，相对于对照，A4组和A5组的敲低分别为59±20％(平均±stdev)和52±13％。对于中低浓度组，丘脑中HTT mRNA水平分别降低了约41％和48％。虽然在纹状体中观察到了HTT mRNA敲低与剂量浓度之间的新关系，但丘脑却不是这种情况，与低剂量浓度相比，丘脑中等剂量浓度与较低的mRNA敲低水平有关。对于VG水平，来自A4和A5组丘脑穿孔中检测到的VG拷贝平均数分别为416.0±149.3和246.7±87VG拷贝/细胞。在中低剂量浓度下，丘脑中的VG表现高于纹状体。
综上，中低AAV1-VOYHT1浓度都与纹状体(核壳和尾状核)和丘脑中的HTT mRNA水平降低有关。与核壳和尾状核相比，丘脑中HTT mRNA的敲低更高。在纹状体中，与尾状核相比，核壳中的HTT mRNA敲低高约20％。与纹状体中的低AAV1-VOYHT1剂量相比，中等AAV1-VOYHT1剂量与更高的HTT敲低相关，而在丘脑中，无论剂量如何，敲低均为约45％。在评估的三个脑区中，VG拷贝数/细胞在丘脑中最高，在尾状核中最低。
vi.来自NHP皮层的激光捕获(LC)神经元中的HTT敲低和载体基因组(VG)测量
对来自A3组(高体积；高浓度)和A6组(溶媒对照)的选定脑板进行处理，以分离初级运动皮层(mCTX)和躯体感觉皮层(ssCTX)样品。将样品切成14μm的切片，并用1％甲酚紫染色。使用激光捕获显微切割术(LCM)捕获皮层锥体神经元。对于1st LCM分析，从脑的每一侧收集一个mCTX和一个ssCTX样品(每只动物4个样品)，总共收集了24个样品。激光捕获(LC)皮层V和VI中的两组750个锥体神经元，并在50μl裂解缓冲液中均质化，合并至总共100μl。对于2nd LCM分析，从大脑的每一侧收集了两个mCTX和四个ssCTX样品(每只动物12个样本)，总共收集了72个样品。从每个样品的皮层V和VI激光捕获了900个锥体神经元。每个样品最初使用
分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific，目录号KIT0204)分离，随后在另外的DNA纯化步骤(Qiagen，目录号56304)之后，针对HTTmRNA水平使用定量逆转录PCR(RT-qPCR)处理样品，并且针对载体基因组(VG)水平，使用数字液滴PCR(ddPCR)处理样品。对于RT-qPCR，所有样品均使用TaqManTM PreAmp Master Mix(Thermo Fisher Scientific，目录号4391128)。数据集的计算是根据Vandesompele J等人，Genome Biol.2002；3(7):RESEARCH0034进行。将HTT mRNA水平归一化为三个恒河猴管家基因(即AARS、TBP和XPNPEP1)的几何平均值。计算结果为相对于给定组织中所有溶媒样品平均值的HTT mRNA倍数。对于ddPCR，将探针组CBA Promoter检测到的载体基因组水平相对于宿主探针组(RNA酶P)进行归一化。在分析期间所有样品均是不知情的。
根据1st LCM分析，在A3组(最高体积和浓度)中实现了适度的HTT mRNA敲低(在mCTX中为19％，在ssCTX中为23％)(参见图10A)。约3-7个VG拷贝/细胞与mCTX和ssCTX锥体神经元中的适度HTT mRNAKD相关(见图10B)。与来自mCTX和ssCTX的组织穿孔相比(见上文)，在LCM样品中检测到更多的HTT敲低和载体基因组拷贝。
根据2nd LCM分析，表33-36列出了相对于溶媒归一化的HTT mRNA水平和VG水平。显示的数据是一组中所有mCTX或ssCTX样品或一组中单个动物(每组3个NHP)的平均值±标准差。如表34和表36所示，还对一组中的单个动物评估了合并的mCTX和ssCTX锥体神经元样品。在A3组中实现了适度但显著的HTT mRNA敲低(在mCTX中为21％，在ssCTX中为23％)。在来自mCTX和ssCTX的LC锥体神经元中分别检测到平均2.79和1.36VG拷贝/细胞。与组织穿孔相比，在LCM样品中观察到更好的HTT mRNA敲低(mCTX中为14％，ssCTX中为6％)。2nd LCM分析中HTT mRNA敲低结果读数与1st LCM结果一致，而在2nd LCM中测量的VG拷贝数则略低于1st LCM分析中的VG拷贝数。
表33.mCTX和ssCTX的所有LC神经元中的HTT mRNA水平(2nd LCM)
表34.每个动物的mCTX和ssCTX的LC神经元中的HTT mRNA水平(2nd LCM)
表35.mCTX和ssCTX的所有LC神经元中的VG水平(2nd LCM)
表36.每个动物的mCTX和ssCTX的LC神经元中的VG水平(2nd LCM)
vii.NHP运动和躯体感觉中的VG和HTT mRNA的原位杂交
使用BaseScopeTM测定对包含来自A3组(高体积；高浓度)和A6组(溶媒对照)的运动和躯体感觉皮层的选定脑板进行处理，用于原位杂交(ISH)，以检测载体基因组DNA和HTTmRNA。将五个μm厚的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的脑切片与针对恒河猴HTT mRNA(GenBank登录号：XM_015137840.1)和AAV1载体基因组的BaseScopeTMISH靶特异性探针温育。三对双Z探针用于HTT mRNA，并且这些探针针对HTT基因中的3个外显子接头而设计。将四对用于载体基因组，并且针对多个非pri-miRNA区设计了这些探针。还加入了阳性对照探针BA-Mmu-PPIB-3zz(肽基脯氨酰异构酶B(亲环蛋白B)，目录号708161)和阴性对照探针BA-dapB-3zz(目录号701011)。信号放大和组织染色使用BaseScopeTMRed试剂盒(目录号322910)进行。检测图像并在显微镜下分析载体基因组和HTT mRNA水平。
使用ImageJ成像分析软件对BaseScopeTM ISH结果进行定量。表37中列出了用于评估BaseScopeTM染色的评分标准。以40倍放大倍数进行评分。评分是根据每个细胞的点数而不是信号强度进行的，因为点与单个靶分子的数量相关，而点强度反映了结合到每个分子的探针对的数量。AAV载体的生物分布计算为具有点的细胞相对于特定皮层区中细胞总数的百分比。对于载体基因组读数，仅计数核信号。
表37.ISH染色的评分标准
| 评分 | 标准 |
| 0 | 无染色或<1个点/10个细胞 |
| 1 | 1-3个点/细胞 |
| 2 | 4-9个点/细胞，没有或非常少的点簇 |
| 3 | 10-15个点/细胞，并且<10％的点成簇 |
| 4 | >15个点/细胞，并且>10％的点成簇 |
对于载体的生物分布，在A3组的注射部位(丘脑和核壳)检测到广泛的载体基因组。在皮层中，在A3组中平均18％的mCTX细胞和9％的ssCTX细胞在细胞核中具有可检测的AAV载体。在mCTX中观察到比ssCTX更多的具有可检测的载体基因组的细胞，在NHP中，mCTX和ssCTX中的vg+细胞合计平均值为12.48％。表38和39列出了基于载体基因组ISH的NHP皮层中载体生物分布的结果。
表38.mCTX和ssCTX中的VG分布/皮层区
表39.mCTX和ssCTX中的VG分布/动物
对于VG水平，通过双侧丘脑和核壳输注给予AAV1-VOYHT1的A3组(高体积，高浓度)的NHP中，mCTX和ssCTX中的细胞的平均载体基因组得分为～1。表40和41列出了使用上述评分标准在NHP皮层中进行VG评分的结果。
表40.mCTX和ssCTX中的VG评分/皮层区
表41.mCTX和ssCTX中的VG评分/动物
对于HTT mRNA水平，AAV1-VOYHT1处理组的mCTX和ssCTX中的HTT mRNA评分均显著低于溶媒组，表明AAV1-VOYHT1处理导致HTT mRNA水平显著降低。表42和43列出了使用上述评分标准在NHP皮层中进行HTT mRNA评分的结果。
表42.mCTX和ssCTX中的HTT mRNA评分/皮层区
表43.mCTX和ssCTX中的HTT mRNA评分/动物
viii.临床体征和组织病理学
在18只试验动物中的7只中观察到了最小至轻度的临床体征，包括轻度不协调、食欲不振、食量减少和总体虚弱。组织病理学分析总体上显示了在测试剂量下的安全性。在核壳和丘脑中检测到低水平的单核细胞浸润。单核细胞的浸润程度与输注体积成正比。在溶媒组中坏死最为明显。在顶叶皮层和枕叶皮层中观察到的损伤最小。
ix.总结
这些数据表明，通过使用最佳剂量方案，可以通过丘脑内和/或核壳内输注达到皮层中HTT敲低的目标水平。根据临床体征和脑组织学评估，AAV1-VOYHT 1的耐受性良好。
实施例19.剂量优化研究II
进行这项研究以进一步评估递送参数，以优化NHP脑中AAV1-VOYHT1的覆盖，并将参数外推至临床给药方案。这项研究总共使用了10只动物，将它们分为4个治疗组，如表44所总结的。与实施例18相比，动物接受了AAV1-VOYHT1的核壳和丘脑的双侧实质内输注(4次输注)。实验步骤与实施例18中描述的相似。给药后5星期对动物实施安乐死，并收集组织用于死后分析。
表44.研究设计
表45中列出了对应于表44中每个给药组的计算的人当量剂量。
表45.人当量剂量
给药后观察到副作用，这可能是由于对大输注体积的不耐受。在给与大体积溶媒对照的动物(B1组)中观察到一个或两个后肢的失能。在接受中等体积AAV1-VOYHT1处理的两只动物(B2、B3组)中，观察到临床体征，如双腿麻痹、俯卧/行走减慢、头倾。MRI观察显示，三只动物中的两个导管均出现一定的反流。
组织病理学分析显示了溶媒组的核壳中轻度胶质细胞增生和坏死(由于放置导管而不可避免)。在B2组动物中，在核壳和丘脑输注部位的单核细胞浸润明显增加，但预计不会导致临床体征。观察到两个结构中神经胶质增生和坏死的轻微增加，但是均没有发现预期会导致任何临床症状。还观察到水肿。在B3组动物中，相对于对照，在两个结构中均可见神经胶质增生和坏死的轻微增加，但认为没有生物学相关性。与溶媒组相比，单核浸润增加。还观察到水肿增加，但是预计不会引起任何临床体征。
实施例20.剂量优化研究III
i.研究设计
这项研究的主要目的是证明在AAV1-VOYHT1的NHP皮层中HTT mRNA的敲低，并证明针对仅丘脑以及结合丘脑和核壳输注方案的安全性。第二目标是显示来自初级运动皮层和躯体感觉皮层的激光捕获(LC)锥体神经元中VG和HTT mRNA水平之间的相关性；证明来自核壳、丘脑和尾状核的组织穿孔中HTT mRNA和VG水平之间的相关性；证明核壳中HTT蛋白与HTT mRNA水平之间的相关性；测量来自核壳和尾状核的组织穿孔中AAV1-VOYHT1特异性miRNA的表达水平；证明来自核壳和尾状核组织穿孔中的载体基因组(VG)与AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达水平之间的相关性；并证明来自核壳和尾状核的组织穿孔中HTT mRNA和AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达水平之间的相关性。
这项研究分两期实施。将总共15只雄性和雌性恒河猴分为5组，每组3只动物(参见表34)。在I期中，第一组动物(C1a组)通过使用MRI引导的对流增强递送(CED)向丘脑和核壳内进行双侧实质性内注射，给予溶媒对照，以在进行II期研究之前确定输注参数(例如速率、体积和持续时间)。第二组(C1b组)采用了完善的手术程序给药，并作为治疗组的对照组。在I期中确定输液参数后，它们在三个治疗组中用于给药含有AAV1-VOYHT1的测试物品。第一个治疗组(C2组)仅使用MRI引导的CED接受双侧向丘脑输注测试物品。对该组给药，以通过激光捕获显微切割术(LCM)证明仅在丘脑输注后的安全性和在初级运动皮层和躯体感觉皮层中的皮层锥体神经元的亨廷顿蛋白(HTT)mRNA敲低(KD)。接下来，在其他两个治疗组(C3组和C4组)中，将测试物品以2种不同剂量水平双向输注到丘脑和核壳中，以优化剂量。
研究方案如下。在I期中，使用预先选择的输液参数对第一溶媒组(C1a组)给药。输注后5±2天和终止前3±天进行针对神经状态的功能性观察组合试验(FunctionalObservation Battery，FOB)评估。对于C1a组，在给药后5±2天和终止前3±天，向另外3只动物(C1b组)给药，然后用FOB进行评估。在II期中，根据I期中建立的输注参数，向所有动物(N＝9)给药含有AAV1-VOYHT1的测试物品。首先对C2组(仅丘脑)进行给药，然后以中等剂量进行C3组，然后以高剂量进行C4组。除了其中仅对动物进行双侧丘脑给药的C2组外，每只动物均对核壳和丘脑进行了双侧颅内输注溶媒或测试物品。实质内给药方案被采用，其中以最高5μL/min的速度进行2-4次输注(每个结构1次输注)。在给药前对每只动物进行基线神经FOB评估，然后在给药后5±2天对每只动物进行第二次FOB评估。当第二次FOB令人满意时，在第36±3天(生命期约5星期)对动物实施安乐死，并在尸检前3±2天进行第三次FOB评估。收集组织用于死后分析。
研究设计摘要如表46所示。对于高剂量组(C4组)，基于达到的最大滴度(2.2e13vg/ml)计算1.8e13 vg的总剂量。
表46.研究设计
ii.动物护理和样品收集
开始步行训练前15天，根据抗AAV1中和抗体(nAb)血清滴度选择了18只(N＝18)成年雄性或雌性恒河猴(4-11岁龄)。C2、C3和C4组的选定候选对象整体显示出较低的AAV1nAb。动物重5-14kg。在动物入选之前，每天进行长达4个连续星期的步行训练。称重动物并按nAb状态分配给研究组，如表34所示。保持选做备用的3只动物，直到给药完成，才对其豁免。动物饲养条件与实施例18中所述类似。
在第1天(给药前)、第15±2天以及第36±3天进行尸检之前即刻，收集血液样品进行临床病理评估和中和抗体(nAb)分析。临床病理评估包括血液学(CBC)、血清临床化学(Chem)和凝血(Coag)分析。在第1天(给药前)、第15±2天以及在尸检前第36±3天即刻从颈部区域收集脑脊液(CSF)样品进行nAb分析。尸检后，收集脑和选定的周围器官，然后新鲜冷冻，或通过浸入用4％多聚甲醛(PFA)后固定。
iii.测试物品准备和给药程序
该研究中使用的测试物品包含AAV1-VOYHT1基因转移载体，该载体配制在含5％蔗糖和0.001％泊洛沙姆188
的磷酸盐缓冲盐水中。载体对照仅包含制剂缓冲液。将样品储存在-60℃或更低的温度下，并在给药当天解冻并保持在2-8℃。以1:250的比例(每250μL的测试物品或对照1μL ProHance)添加
(BraccoDiagnostics,Inc，即钆特醇)，在装入输注系统之前，通过倒转管小心混合。给药溶液包含测试物品或对照和2mM浓度的钆特醇。
在即将手术之前，每只动物均用肌内(1M)氯胺酮(10mg/kg)和IM右美托咪定(15μg/kg)麻醉，称重，将头和颈部的头发剃毛，插管并保持在1-5％异氟烷中。将动物的头部固定在在耳棒的每一侧均包含一个MRI表面线圈的立体定向仪上，然后转移至MRI以进行基线扫描。获得T1和T2加权的MRI序列，并用于确定中央沟的坐标。接下来，将动物转移回手术室，头部准备用于神经外科植入手术。使用无菌技术，在解剖层中打开伤口部位以暴露头骨。根据哪个剂量组，在每侧顶叶和/或枕叶上方的进入部位进行开颅手术。使用钛螺钉将颅骨安装的套管引导球阵列临时固定在每个钻孔上方的颅骨上。植入球阵列后，立即将动物转移到MRI套件中。MR成像用于将套管引导器与每个套管引导器同侧的核壳和/或丘脑靶标对准。采用重复MR成像来施用测试物品或对照，以目测监测大脑内的上述表34所示的输注。每只动物在每个核壳(C2组除外)和丘脑中使用对流增强递送(CED)接受测试物品或对照的输注(部位)。16G插管(MRI Interventions Inc.)供有给药溶液，并通过颅骨安装的球阵列引导到每个目标部位。每个套管通过微孔延长管(Smiths Medical)连接到安装在注射泵(Harvard Apparatus)上的3-6cc注射器。表47列出了在实质内输注的三个不同阶段中使用递增输注速率向每个核壳和丘脑中施用的剂量速率、持续时间和体积。“N/A”表示不适用的数据。
表47.输注参数
获得了一系列MRI扫描以监控每个目标部位内的输注物分布，并提供给药的实时监视。在某些情况下，在输注过程中，插管会更深地进入到核壳或丘脑中，以使输注在核壳或丘脑内的分布最大化。归因于每个部位要递送的总体积，输注物分配到与核壳和丘脑相邻的CNS结构中是可以预料的，并预期会发生。MRI CED给药程序完成后，立即将动物转移回手术室，植出球阵列系统，并使用可吸收的vicryl缝合线并采用简单的间断缝合方式将伤口部位在解剖层中封闭。术前和术后的药物包括阿替米唑(0.03mL/kg,IM)、丁丙诺啡(0.03mg/kg,IM,b.i.d.)、卡洛芬(2.2mg/kg SQ,b.i.d.)、酮洛芬(2mg/kg,IM,s.i.d.)和头孢唑啉(100mg IV,术前和术后,然后是25mg/kg,IM,b.i.d.)或头孢曲松(50mg/kg,IM,s.i.d.)。监测动物从麻醉中的完全恢复并返回其笼中。
iv.来自合并的NHP mCTX和ssCTX在LC神经元中HTT敲低和VG测量
通过激光捕获显微切割术(LCM)处理来自三组(C1组、C3组和C4组)的选定脑板，以分离出初级运动皮层(mCTX)和躯体感觉皮层(ssCTX)样品。总共收集了54个mCTX样本和90个ssCTX LCM样本。每个LCM样本包含从皮层V和VI层激光捕获(LC)的900个锥体神经元，总共捕获了129,600个神经元。如实施例18所述，针对HTT mRNA水平，使用RT-qPCR处理样品，并且针对载体基因组(VG)水平使用ddPCR处理样品。在分析期间所有样品均是不知情的。
对于HTT mRNA敲低，表46列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自AAV1-VOYHT1处理组的合并的mCTX和ssCTX的LC神经元中相对HTT mRNA水平。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中观察到在来自mCTX和ssCTX的LC锥体神经元合并样品中最大的HTT敲低(32％)，在C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)中HTT敲低较少(13％)。在C4组中，在mCTX中观察到平均30％的HTT mRNA敲低，在ssCTX中观察到33％的HTT mRNA敲低。HTT敲低与剂量成正比(剂量增加2.25倍导致敲低提高2.9倍)。表48还显示了表现出超过30％的HTT敲低的LC皮层神经元样品百分比。在LC运动和躯体感觉皮层神经元中，C4组(高剂量核壳+丘脑组)中58％的样品显示≥30％的HTT敲低，27％的样品显示≥40％的HTT敲低，而在C3组(中等剂量的核壳+丘脑组)中，36％的样品显示≥30％的HTT敲低，7％的样品显示≥40％的HTT敲低。因此，运动和躯体感觉皮层神经元中的HTT mRNA敲低取决于注入丘脑和核壳的AAV1-VOYHT1的浓度。此外，在中等剂量组和高剂量组中，超过40％的LCM mCTX样品显示≥30％的HTT mRNA敲低，而在高剂量组中，60％的LCM ssCTX样品显示≥30％的HTT mRNA敲低。
表48.来自合并的mCTX和ssCTX的LC神经元中HTT敲低
对于VG水平，来自合并的mCTX和ssCTX的LC神经元样品显示VG拷贝/细胞呈剂量依赖性增加，如表49所示。高剂量组中VG拷贝数/细胞为约30个拷贝/细胞。用HTT mRNA敲低跟踪VG拷贝，以便更高的VG拷贝数对应于更大的HTT mRNA敲低。
表49.来自合并的mCTX和ssCTX的LC神经元中VG水平
v.来自NHP mCTX的LC神经元中的HTT敲低和VG测量
通过激光捕获显微切割术(LCM)处理来自三个组(C1组、C3组和C4组)的选定脑板，以分离初级运动皮层(mCTX)样品。总共收集了54个mCTX样品。每个LCM样品包含从皮层V和VI激光捕获(LC)的900个锥体神经元。如实施例18中所述，针对HTT mRNA水平，使用RT-qPCR处理样品，并且针对的基因组(VG)水平，使用ddPCR处理样品。在分析期间所有样品均不知情。
对于HTT mRNA敲低，表50列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自AAV1-VOYHT1处理组的mCTX的LC神经元中相对HTT mRNA水平。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中观察到来自mCTX的LC锥体神经元的最大HTT敲低(30％)，而在C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)中，HTT敲低(13％)较低。
表50.来自mCTX的LC神经元中HTT敲低
对于VG水平，来自mCTX的LC神经元显示VG拷贝/细胞呈剂量相关增加，如表51所示。C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中VG拷贝数/细胞达到约20拷贝/细胞，而C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)中VG拷贝数/细胞达到约10拷贝/细胞。因此，使用HTT mRNA敲低跟踪VG拷贝，使得更高的VG拷贝数对应于更大的HTT mRNA敲低。
表51.来自mCTX的LC神经元中VG水平
vi.来自NHP ssCTX的LC神经元中的HTT敲低和VG测量
通过激光捕获显微切割术(LCM)处理来自三个组(C1组、C3组和C4组)的选定脑板，以分离躯体感觉皮层(ssCTX)样品。总共收集了90个ssCTX LCM样品。每个LCM样品包含从皮层V和VI激光捕获(LC)的900个锥体神经元。如实施例18所述，针对HTT mRNA水平，使用RT-qPCR处理样品，并且针对载体基因组(VG)水平，使用ddPCR处理样品。在分析期间所有样品均不知情。
对于HTT mRNA敲低，表52列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自AAV1-VOYHT1处理组的ssCTX的LC神经元中相对HTT mRNA水平。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中观察到来自ssCTX的LC锥体神经元中的最大HTT敲低(33％)，在C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)中HTT敲低(13％)较低。
表52.来自ssCTX的LC神经元中HTT敲低
对于VG水平，来自sCTX的LC神经元显示VG拷贝/细胞呈剂量相关增加，如表53所示。C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中VG拷贝数/细胞达到约33拷贝/细胞，而C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)中VG拷贝数/细胞达到7拷贝/细胞。因此，使用HTT mRNA敲低跟踪VG拷贝，使得更高的VG拷贝数对应于更大的HTT mRNA敲低。
表53.来自ssCTX的LC神经元中VG水平
LCM结果表明，在中高剂量组中，AAV1-VOYHT1的组合双侧核壳和丘脑输注导致运动和躯体感觉皮层锥体神经元的VG递送和HTT mRNA敲低，并且在高剂量组中，载体基因组递送更大，HTT mRNA敲低更高。
vii来自合并的NHP mCTX和ssCTX的穿孔中HTT敲低和VG测量
从所有四个组中选择两个包含运动皮层和躯体感觉皮层的脑板用来收集2mm初级运动皮层(mCTX)和躯体感觉皮层(ssCTX)穿孔。每只动物收集了6个mCTX和6个ssCTX穿孔，总共收集了144个穿孔。从皮层的每侧收集相同数量的穿孔。处理样品并分别使用bDNA和ddPCR分别分析HTT mRNA和载体基因组(VG)。如实施例18所述进行bDNA和ddPCR。在分析期间所有样品均不知情。
对于HTT mRNA敲低，表54列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自AAV1-VOYHT1处理组的合并的mCTX和ssCTX的LC神经元中相对HTT mRNA水平。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)的皮层穿孔观察到平均16％的HTT敲低。基于C3和C4组，HTT敲低与剂量成比例(剂量增加2.25倍，敲低增加2.28倍)。表54还显示了每组中表现出超过20％的HTT敲低的穿孔百分比。39％的合并的mCTX和ssCTX穿孔显示≥20％的HTT敲低，但72％的mCTX穿孔显示≥20％的HTT敲低。高剂量核壳+丘脑C4组观察到比仅丘脑的C2组更大的HTT敲低，表明AAV1-VOYHT1的核壳输注有助于运动和躯体感觉皮层的HTT敲低。仅丘脑输注AAV1-VOYHT1(C2组)，运动皮层和躯体感觉皮层中没有明显的HTT敲低。
表54.合并的mCTX和ssCTX穿孔中的HTT敲低
对于VG水平，结果汇总在表55中。核壳+丘脑组C3和C4的VG水平是剂量依赖性和剂量成比例的(剂量增加2.25倍导致载体基因组水平增加3倍)。在每组中，在mCTX中检测到的VG拷贝高于ssCTX。在C4组(高剂量核壳+丘脑)中检测到的VG拷贝数高于在C2组(仅丘脑)中的VG拷贝数，表明AAV1-VOYHT1的核壳输注有助于运动和躯体感觉皮层的VG拷贝。在穿孔分析中，VG拷贝与HTT mRNA敲低相关。
表55.合并的mCTX和ssCTX取样中的VG水平
viii.来自NHP mCTX的穿孔的HTT敲低和VG测量
从所有四个组中选择两个包含运动皮层的脑板收集2mm初级运动皮层(mCTX)穿孔。每只动物收集6个mCTX穿孔，总共收集72个穿孔。从皮层的每一侧收集相同数量的穿孔。处理样品并分别使用bDNA和ddPCR分析HTT mRNA和载体基因组(VG)。如实施例18所述进行bDNA和ddPCR。在分析期间所有样品均不知情。
对于HTT mRNA敲低，表56列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自AAV1-VOYHT1处理组的mCTX穿孔的相对HTT mRNA水平。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中观察到最大的HTT敲低(28％)，而在C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)和C2组(10％；仅丘脑)中观察到较低的HTT敲低(9％)。高剂量输注到双侧核壳和丘脑可观察到HTT mRNA降低约三分之一，而中等剂量输注到双侧核壳以及仅丘脑输注可观察到降低约10％。
表56.mCTX穿孔中的HTT敲低
对于VG水平，mCTX穿孔显示VG拷贝/细胞呈剂量相关增加，如表57所示。C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中VG拷贝数/细胞为约32拷贝/细胞，而C3组(中等剂量双侧壳核壳素+丘脑组)中为14拷贝/细胞。与C3组相似，在C2组(仅丘脑)中可见约13vg拷贝/细胞。通常，在mCTX穿孔中用HTT mRNA敲低跟踪VG水平，使得更高的VG拷贝数对应于更大的HTT mRNA敲低。
表57.mCTX穿孔中的VG水平
ix.来自NHP ssCTX穿孔中的HTT敲低和VG测量
从所有四个组中选择两个包含躯体感觉皮层的脑板用于收集2mm的躯体感觉皮层(ssCTX)穿孔。每只动物收集了六个ssCTX穿孔，总共收集了72个穿孔。从皮层的每一侧收集相同数量的穿孔。处理样品并分别使用bDNA和ddPCR分析HTT mRNA和载体基因组(VG)。如实施例18所述进行bDNA和ddPCR。在分析期间所有样品均不知情。
对于HTT mRNA敲低，表58列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自AAV1-VOYHT1处理组的ssCTX穿孔的相对HTT mRNA水平。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中观察到最大的HTT敲低(9％)，而在C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)和C2组(4％；仅丘脑)中观察到较低的HTT敲低(5％)。C4组的HTT mRNA敲低约为C3和C2组的两倍。
表58.ssCTX穿孔中的HTT敲低
对于VG水平，mCTX穿孔显示VG拷贝/细胞呈剂量相关增加，如表59所示。在C4组(高剂量双侧核壳+丘脑组)中，VG拷贝数/细胞为约14拷贝/细胞，C3组(中等剂量双侧核壳+丘脑组)为8拷贝/细胞。与C3组类似，C2组(仅丘脑)中观察到约8个VG拷贝/细胞。在mCTX穿孔中通常用HTT mRNA敲低跟踪VG水平，使得更高的VG拷贝数对应于更大的HTT mRNA敲低。
表59.ssCTX穿孔中的VG水平
x.NHP运动和躯体感觉皮层中VG和HTT mRNA的原位杂交(ISH)
如实施例18所述，使用BaseScopeTM测定对包含来自C1组(溶媒组)和C4组(高剂量–核壳+丘脑组)的运动和躯体感觉皮层的选定脑片进行处理，用于原位杂交(ISH)，以检测载体基因组DNA和HTT mRNA。检测图像并在显微镜下分析载体基因组和HTT mRNA水平。
在输注部位(丘脑)的细胞核中检测到广泛的VG。在运动和躯体感觉皮层(主要是锥体神经元)的多个不同层中也检测到VG。AAV1-VOYHT1处理后，在I-VI层的运动和感觉皮层神经元的核中检测到大量VG信号
在输注部位(丘脑)的细胞中观察到HTT mRNA大量降低。在用于ISH分析的脑片中，包含的核壳不显著。ISH结果表明，在所有NHP皮层和输注部位均存在广泛的AAV1-VOYHT1分布，并证实了这些区的HTT mRNA降低。ISH结果支持运动和躯体感觉皮层中HTT的降低以及这些区多层中神经元的转导。
xi.来自NHP核壳的穿孔中的HTT敲低、VG测量和AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达
来自所有四个组的两个包含核壳的选定脑板用于收集2mm核壳穿孔。从一个板的每一侧收集五个穿孔，从另一板的每一侧收集三个穿孔，从每只动物收集总共16个核壳穿孔。从所有12只动物中总共收集了192个穿孔。处理样品并分别使用bDNA和ddPCR分析HTTmRNA水平和VG水平。如实施例18所述进行bDNA和ddPCR。处理样品，并使用深度测序和/或两步茎环实时定量PCR(RT-qPCR)方法分析其AAV1-VOYHT1特异性miRNA水平。对于茎环RT-qPCR，从用于分析HTT mRNA和VG的相同穿孔裂解物纯化了总RNA(miRvana，目录号AM1560，ThermoFisher Scientific)，并使用与AAV1-VOYHT1特异性miRNA引导链同源的茎环寡核苷酸引发逆转录酶反应以生成cDNA。然后，将与AAV 1-VOYHT1特异性miRNA和茎环同源的正向和反向引物用于传统的qPCR反应(第二)步骤。茎环引物和qPCR探针组都经过定制设计，用于AAV1-VOYHT1 miRNA引导链的特异性检测。在分析期间所有样品均不知情。使用单因素方差分析Tukey多重比较检验对数据进行统计比较。P值小于0.05表示统计学上的显著差异。
对于HTT mRNA敲低，表60列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自每个AAV1-VOYHT1处理组的所有核壳穿孔的相对HTT mRNA水平。通过仅双侧丘脑给药(C2组)、中等剂量(C3组)和高剂量(C4组)双侧核壳和丘脑给药，核壳穿孔中分别达到平均12％、61％和67％的HTT mRNA敲低。仅双侧丘脑给药导致核壳中统计学上显著的HTT mRNA敲低。表60还显示了每组中表现出超过30％的HTT敲低的穿孔百分比。中高剂量双侧核壳和丘脑给药均导致超过60％的核壳穿孔表现出超过30％的HTT mRNA敲低，而高剂量组的所有穿孔都超过30％HTT mRNA敲低。
表60.所有核壳穿孔中的HTT敲低
表61列出了相对于溶媒对照组归一化后，由AAV1-VOYHT1处理组的每个动物分析的相对HTT mRNA水平。
表61.按照每只动物平均的核壳穿孔中的HTT敲低
对于VG水平，表62中列出了在每组的所有核壳穿孔中检测到的载体基因组拷贝的平均数量。仅双侧丘脑、中等剂量和高剂量双侧核壳和丘脑给药的情况下，在核壳穿孔中获得了平均21、869和1211个VG拷贝/二倍体细胞。中高剂量的双侧核壳和丘脑给药得到了比仅双侧丘脑给药显著更高的VG核壳分布。
表62.所有核壳穿孔中的VG拷贝
表63中列出了每个动物分析的载体基因组拷贝数。
表63.按照每只动物平均的核壳穿孔的VG拷贝
应用Grubbs检验(Q＝0.1％)去除异常值，并重新计算VG拷贝/细胞。在此事后统计分析之后，C2、C3和C4组的每只动物的核壳穿孔中VG拷贝分别定量为21.0±6.5、869.3±283.0和1210.8±387.3。
核壳穿孔中HTT mRNA敲低与载体基因组水平的相关性在图11A中示出。来自所有给药组的所有核壳穿孔的相关曲线形成了剂量-响应曲线，其中溶媒组在顶部、仅丘脑组主要在上肩、中等剂量组沿斜坡和底部均匀分布，而高剂量组则主要位于曲线的底部。在约40VG/二倍体细胞(范围为20-50VG/二倍体细胞)下计算HTT敲低的EC50(Graphpad Prism，非线性回归4参数曲线拟合)。
对于miRNA分析，表64列出了AAV1-VOYHT1特异性miRNA拷贝/细胞的平均数和对应平均VG拷贝/细胞、相对于对照的HTT mRNA水平和按照每只动物平均计算的AAV1-VOYHT1特异性miRNA/VG。这些分析是使用核壳穿孔的一个子组进行的，因此表64中列出的值是指每只动物6个核壳穿孔(每半球3个)的数据，总共有72个样本。
表64.按照每只动物平均的核壳穿孔中的AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达
每个处理组的所有核壳穿孔中AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与载体基因组水平的相关性(r＝0.8606，p<0.001)显示在图11B中。AAV1-VOYHT1处理组中增强的VG生物分布对应于AAV1-VOYHT1特异的miRNA表达增加。
图11C显示了在来自每个治疗组的所有核壳穿孔中AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与载体HTT mRNA降低的相关性(r＝-0.6788，p＜0.0001)。增加的AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达对应于AAV1-VOYHT1处理组中增强的HTT mRNA降低。
总之，仅丘脑给药可导致核壳中更适度(modest)的VG生物分布、AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达和HTT mRNA降低。与仅丘脑给药相比，联合的核壳和丘脑给药可导致更大的VG生物分布、AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达以及强烈的HTT mRNA降低。最后，AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与VG生物分布和HTT mRNA降低相关。
xii.来自NHP尾状核的穿孔中的HTT敲低、VG测量和AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达
来自所有四个组的包含尾状核的选定脑板用于收集2mm尾状核穿孔。从板的每一侧收集两个穿孔，从每只动物收集总共4个穿孔。从所有12只动物中总共收集了48个尾状核穿孔。处理样品并分别使用bDNA和ddPCR分析HTT mRNA水平和VG水平。如实施例18所述进行bDNA和ddPCR。处理样品，并使用深度测序和/或两步茎环实时定量PCR(RT-qPCR)方法分析其AAV1-VOYHT1特异性miRNA水平。对于茎环RT-qPCR，从用于分析HTT mRNA和VG的相同穿孔裂解物纯化了总RNA(miRvana，目录号AM1560，ThermoFisher Scientific)，并使用与AAV1-VOYHT1特异性miRNA引导链同源的茎环寡核苷酸引发逆转录酶反应以生成cDNA。然后，将与AAV1-VOYHT1特异性miRNA和茎环同源的正向和反向引物用于传统的qPCR反应(第二)步骤。茎环引物和qPCR探针组都经过定制设计，用于AAV1-VOYHT1 miRNA引导链的特异性检测。在分析期间所有样品均不知情。使用单因素方差分析Tukey多重比较检验对数据进行统计比较。P值小于0.05表示统计学上的显著差异。
对于HTT mRNA敲低，表63列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自每个AAV1-VOYHT1处理组的所有尾状核穿孔的相对HTT mRNA水平。通过仅双侧丘脑给药(C2组)、中等剂量(C3组)和高剂量(C4组)双侧核壳和丘脑给药，尾状核穿孔中分别达到平均51％、61％和68％的HTT mRNA敲低。仅双侧丘脑给药导致尾状核穿孔中可靠且显著的HTT mRNA敲低(降低了51％)。表65还显示了每组中表现出超过30％的HTT敲低的穿孔百分比。所有三个给药组(仅双侧丘脑给药、中等和高剂量双侧核壳和丘脑给药)有92％的尾状核穿孔实现了至少30％的HTT mRNA敲低。
表65.所有尾状核穿孔中的HTT敲低
表66列出了相对于溶媒对照组归一化后，由AAV1-VOYHT1处理组的每个动物分析的相对HTT mRNA水平。
表66.按照每只动物平均的尾状核穿孔中的HTT敲低
对于VG水平，表67中列出了在每组的所有尾状核穿孔中检测到的载体基因组拷贝的平均数量。仅双侧丘脑、中等剂量和高剂量双侧核壳和丘脑给药的情况下，在尾状核穿孔中获得了平均44、146和99个VG拷贝/二倍体细胞。
表67.所有尾状核穿孔中的VG拷贝
表68中列出了每个动物分析的载体基因组拷贝数。
表68.按照动物平均的尾状核穿孔的VG拷贝
应用Grubbs检验(Q＝0.1％)去除异常值，并重新计算VG拷贝/细胞。在此事后统计分析之后，C2、C3和C4组的每只动物的尾状核穿孔中VG拷贝分别定量为4.2±10.2、107.4±116.0和99.2±29.2。
尾状核穿孔中HTT mRNA敲低与载体基因组水平的相关性在图12A中示出。来自所有给药组的所有尾状核穿孔的相关曲线形成了剂量-响应曲线，其中溶媒组在顶部，而所有其他剂量组沿着曲线的斜坡和底部起点分散。在约23VG/二倍体细胞(范围为20-50VG/二倍体细胞)下计算HTT敲低的EC50(Graphpad Prism，非线性回归4参数曲线拟合)。
对于miRNA分析，表69列出了AAV1-VOYHT1特异性miRNA拷贝/细胞的平均数和对应平均VG拷贝/细胞、相对于对照的HTT mRNA水平和按照每只动物平均计算的AAV1-VOYHT1特异性miRNA/VG。这些分析是使用尾状核穿孔的一个子组进行的，因此表69中列出的值是指每只动物4个核壳穿孔(每半球2个)的数据，总共有48个样本。
表69.按照每只动物平均的尾状核穿孔中的AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达
每个处理组的所有尾状核穿孔中AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与载体基因组水平的相关性(r＝0.6782,p<0.0001)显示在图12B中。AAV1-VOYHT1处理组中增强的VG生物分布对应于AAV1-VOYHT1特异的miRNA表达增加。如上所述，当将剂量优化研究III中动物组的载体基因组水平数据与剂量优化研究I中动物组的基因组水平数据相结合时，使用了Grubbs检验(Q＝0.1％)来检测明显的离群值。从图12B所示的相关性分析中除去一个离群值后，来自每个治疗组的尾状核穿孔中AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与载体基因组水平之间存在正相关关系(r＝0.7452，p<0.001)。除去所有离群值后，在A2、A3、A5和C3组的尾状核穿孔中，VG拷贝/细胞(平均值±stdev)分别为1.8±0.5、10.7±10.3、0.3±0.2和107.4±116.0VG拷贝/单元。
图12C显示了在来自每个治疗组的所有尾状核穿孔中AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与载体HTT mRNA降低的相关性(r＝-0.8798,p<0.0001)。增加的AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达对应于AAV1-VOYHT1处理组中增强的HTT mRNA降低。
总之，仅丘脑给药可导致尾状核中显著的VG生物分布、显著的AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达和大量的HTT mRNA降低。与仅丘脑给药相比，联合核壳和丘脑给药可导致更大的VG生物分布、AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达以及可靠的HTT mRNA降低。最后，AAV1-VOYHT1特异性miRNA表达与VG生物分布和HTT mRNA降低相关。
xiii.来自NHP丘脑的穿孔中HTT敲低和VG测量
来自所有四个组的包含丘脑的选定脑板用于收集2mm丘脑穿孔。从板的每一侧收集五个穿孔，从每只动物收集总共10个穿孔。从所有12只动物中总共收集了120个丘脑穿孔。处理样品并分别使用bDNA和ddPCR分析HTT mRNA水平和VG水平。如实施例18所述进行bDNA和ddPCR。在分析期间所有样品均不知情。使用单因素方差分析Tukey多重比较检验对数据进行统计比较。P值小于0.05表示统计学上显著的差异。
对于HTT mRNA敲低，表70列出了相对于溶媒对照组归一化后，来自每个AAV1-VOYHT1处理组的所有丘脑穿孔的相对HTT mRNA水平。通过仅双侧丘脑给药(C2组)、中等剂量(C3组)和高剂量(C4组)双侧核壳和丘脑给药，丘脑穿孔中分别达到平均76％、76％和73％的HTT mRNA敲低。表70还显示了每组中表现出超过30％的HTT敲低的穿孔百分比。所有三个给药组100％的丘脑穿孔实现了至少30％的HTT mRNA敲低。
表70.所有丘脑穿孔中的HTT敲低
表71列出了相对于溶媒对照组归一化后，由AAV1-VOYHT1处理组的每个动物分析的相对HTT mRNA水平。
表71.按照每只动物平均的丘脑穿孔中的HTT敲低
对于VG水平，表72中列出了在每组的所有丘脑穿孔中检测到的载体基因组拷贝的平均数量。在所有3个处理组中均观察到类似的载体基因组拷贝水平。仅双侧丘脑、中等剂量和高剂量双侧核壳和丘脑给药的情况下，在丘脑取样中获得了平均2015、1704、2747个载体基因组拷贝/二倍体细胞。
表72.所有丘脑穿孔中的VG拷贝
表73中列出了每个动物分析的载体基因组拷贝数。
表73.按照动物平均的丘脑穿孔的VG拷贝
丘脑穿孔中HTT mRNA敲低与载体基因组水平的相关性在图13中示出。所有给药组在丘脑穿孔中获得了相似的载体基因组拷贝/细胞和相似的敲低效率。来自所有给药组的所有丘脑穿孔的相关图显示溶媒组在左上方，所有其他给药组在底部最右端大部分彼此相互重叠。由于存在基本上完全正和负群体，因此EC50计算不明确。
总之，从核壳、尾状核和丘脑的穿孔分析表明，在所有三个给药组(仅丘脑给药，以及中等剂量和高剂量双侧核壳和丘脑给药)的输注部位(核壳和丘脑)以及尾状核中均实现了显著的HTT mRNA敲低。此外，在核壳、尾状和丘脑中，载体基因组水平与HTT mRNA敲低良好相关，并有证据表明在高载体基因组水平下敲低进入平台期。
xiv.临床体征和组织病理学
在接受AAV1-VOYHT1的9个NHP中，有7个在输注后未观察到临床体征或肢体发现。在其他两个NHP中，观察到了缩短步幅(shortened step)和轻微的肢体发现。但是，未见可解释或与这些临床症状相关的组织病理学变化。归因于手术程序，预期与导管尖端和/或轨迹相关的组织病理学发现，但均未导致任何特定的临床体征。预期在丘脑输注部位的发现最少，并且包括神经胶质增生、神经元变性、神经胶质细胞空泡化和单核细胞浸润，其扩散程度比核壳略微更大。没有一项预期会导致任何临床症状。仅在导管通道附近观察到水肿，表明该体积耐受性良好。在任何组中都没有发现对躯体感觉或运动皮层神经元有有害作用的证据。这些发现表明，以高剂量通过核壳和丘脑输注施用的AAV1-VOYHT1(参见C4组)至少没有观察到的副反应水平(NOAEL)。
实施例21.制剂优化
初始制剂筛选确定了磷酸盐/蔗糖/NaCl制剂(2.7mM磷酸氢二钠、1.54mM磷酸一氢钾、155mM NaCl和5％(w/v)蔗糖，pH 7.2，450mOsm/kg)作为AAV1-VOYHT1载体可接受的稳定制剂。高盐制剂也被认为是稳定的。
进一步优化制剂的赋形剂、Na/K比、pH和重量克分子渗透压浓度，同时调整了适合CNS施用的因素。表74中列出了可用于配制AAV1-VOYHT1载体的三种溶液。
表74.AAV1-VOYHT1载体的制剂
在上述确定的溶液中要配制的AAV1-VOYHT1载体的浓度约为2.7e13vg/mL，但浓度可以增加到5e13 vg/ml。高浓度的AAV1-VOYHT1载体在没有聚集的情况下难以稳定。制剂筛选的分析表明，蔗糖水平的提高通常会改善载体稳定性并防止聚集。约5％至9％的蔗糖水平为AAV1-VOYHT1载体提供了良好的稳定性，对于所测试的载体和所需制剂浓度而言，最佳浓度为约7％蔗糖。蔗糖的使用水平可能受生理重量克分子渗透压浓度的限制。此外，显示出较高的重量克分子渗透压浓度和/或更多的NaCl有利于载体的稳定性。
实施例22.向HD患者施用AAV1-VOYHT1
使用实施例21中鉴定的合适制剂配制的AAV1-VOYHT1载体通过使用MRI引导的对流增强递送(CED)，通过双侧实质输注到核壳和丘脑而施用于1期HD患者。AAV1-VOYHT1载体在配制溶液中的浓度为2.7e12至2.7e13vg/mL。输注到核壳和丘脑中的AAV1-VOYHT1的体积分别为300-1500μL/半球和1300-2500μL/半球。施用到核壳和丘脑的剂量分别为8e11至4e13 vg/半球和3.5e12至6.8e13 vg/半球。施用于患者的总剂量约为8.6el2至2el4 vg。AAV1-VOYHT1治疗可显著降低患者纹状体和皮层中HTT mRNA的水平。
Claims (121)
1.一种制备包含腺相关病毒(AAV)颗粒的药物制剂的方法，所述方法包括：
在生物反应器内的一个或多个病毒生产细胞(VPC)中产生AAV颗粒，从而提供包含AAV颗粒和液体培养基的病毒生产汇聚物；
通过一个或多个步骤处理病毒生产汇聚物，所述步骤选自：化学裂解、澄清过滤、亲和色谱、离子交换色谱、切向流过滤(TFF)和病毒保留过滤；和
将来自病毒生产汇聚物的AAV颗粒掺入药物制剂中，其中药物制剂包含AAV颗粒和至少一种药物赋形剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述VPC包括Sf9昆虫细胞，并且其中所述AAV颗粒是使用杆状病毒生产系统产生的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述方法包括：
从生物反应器中收集病毒生产汇聚物，其中病毒生产汇聚物包含一个或多个VPC，并且其中AAV颗粒包含在VPC内；和
在化学裂解条件下，使用化学裂解溶液将病毒生产汇聚物中的VPC暴露于化学裂解，其中化学裂解将AAV颗粒从VPC释放到病毒生产汇聚物的液体培养基中。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述化学裂解溶液包含选自精氨酸或精氨酸盐的稳定化添加剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述稳定化添加剂的浓度为0.1-0.5M。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述稳定化添加剂的浓度为0.2-0.3M。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述化学裂解溶液不包括Triton X-100。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述化学裂解溶液包含两性离子去污剂，其选自月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)；N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(EmpigenBB)；3-(N,N-二甲基肉豆蔻铵基)丙磺酸盐(Zwittergent 3-10)；正十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(Zwittergent 3-12)；正十四烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸盐(Zwittergent 3-14)；3-(N,N-二甲基棕榈酰铵基)丙烷磺酸盐(Zwittergent3-16)；3-((3-胆酰氨丙基)二甲基铵基)-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)；或3-([3-胆酰氨丙基]二甲基铵基)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。
9.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述化学裂解溶液包含月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)。
10.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述化学裂解溶液包含N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱(Empigen BB)。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个澄清过滤步骤，其中所述病毒生产汇聚物通过一个或多个澄清过滤系统进行处理。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一个或多个澄清过滤系统包括深度过滤系统。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述深度过滤系统包括Millipore MillistakD0HC介质系列过滤器。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述深度过滤系统包括Millipore MillistakC0SP介质系列过滤器。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述一个或多个澄清过滤系统包括0.2μm微滤系统。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个亲和色谱步骤，其中通过一个或多个亲和色谱系统处理所述病毒生产汇聚物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述方法包括以结合-洗脱模式通过一个或多个免疫亲和色谱系统处理病毒生产汇聚物；其中所述免疫亲和色谱系统包含一种或多种能够结合一种或多种AAV衣壳变体的重组单链抗体。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述免疫亲和色谱系统使用再生溶液再生，其中所述再生溶液包含1-3M的胍或胍盐。
19.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述免疫亲和色谱系统使用再生溶液再生，所述再生溶液包含2M的盐酸胍。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个离子交换色谱步骤，其中所述病毒生产汇聚物通过一个或多个离子交换色谱系统进行处理。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法包括以流通模式通过一个或多个阴离子交换色谱系统处理病毒生产汇聚物；其中所述阴离子交换色谱系统包括结合非病毒杂质、非AAV病毒颗粒或其组合的固定相；并且其中阴离子交换色谱系统的固定相不与AAV颗粒结合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述阴离子交换色谱系统的固定相包含季胺官能团。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述阴离子交换色谱系统的固定相包含三甲基铵乙基(TMAE)官能团。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述方法包括一个或多个切向流过滤(TFF)步骤，其中通过一个或多个切向流过滤(TFF)系统处理所述病毒生产汇聚物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中TFF系统包括平板过滤器，所述平板过滤器包括再生纤维素盒。
26.根据权利要求25所述的方法，其中TFF系统在5.5-6.5PSI的跨膜压力(TMP)和5.5-6.5L/min/m2的目标交叉流下操作。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中在一个或多个TFF步骤之前，将50％蔗糖混合物添加到病毒生产汇聚物中；并且其中将50％蔗糖混合物以9-13％v/v的浓度加入到病毒生产汇聚物中。
28.根据权利要求24-27中任一项所述的方法，其中一个或多个TFF步骤包括第一渗滤步骤，其中至少一部分病毒生产汇聚物的液体培养基被低蔗糖渗滤缓冲液代替，其中低蔗糖渗滤缓冲液包含4-6％w/v的糖或糖替代物和150-250mM的碱金属氯化物盐。
29.根据权利要求28所述的方法，其中低蔗糖渗滤缓冲液包含4.5-5.5％w/v的蔗糖和210-230mM的氯化钠。
30.根据权利要求28所述的方法，其中低蔗糖渗滤缓冲液包含5％w/v的蔗糖和220mM的氯化钠。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，其中一个或多个TFF步骤包括超滤浓缩步骤，其中病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至1.0x1012-5.0x1013 vg/mL。
32.根据权利要求31所述的方法，其中病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至1.0-5.0x1013 vg/mL。
33.根据权利要求31所述的方法，其中病毒生产汇聚物中的AAV颗粒被浓缩至2.7x1013vg/mL。
34.根据权利要求24-33中任一项所述的方法，其中一个或多个TFF步骤包括最终的渗滤步骤，其中至少一部分病毒生产汇聚物的液体培养基被高蔗糖制剂缓冲液代替，其中高蔗糖制剂缓冲剂包含6-8％w/v的糖或糖替代物和90-100mM的碱金属氯化物盐。
35.根据权利要求34所述的方法，其中高蔗糖制剂缓冲液包含7％w/v的蔗糖和90-100mM的氯化钠。
36.根据权利要求34所述的方法，其中高蔗糖制剂缓冲液包含7％w/v的蔗糖、10mM的磷酸钠、95-100mM的氯化钠和0.001％(w/v)的泊洛沙姆188。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中该方法包括一个或多个病毒保留过滤(VRF)步骤，其中通过一个或多个病毒保留过滤(VRF)系统处理病毒生产汇聚物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中VRF系统包括过滤介质，该过滤介质保留35nm或更大的颗粒。
39.根据权利要求37所述的方法，其中VRF系统包括过滤介质，该过滤介质保留20nm或更大的颗粒。
40.一种生产基因治疗产品的方法，包括：(i)提供包含AAV颗粒的药物制剂，其中所述药物制剂通过权利要求1-39中任一项所述的方法生产；和(ii)适当地将药物制剂等分到制剂容器中。
41.一种药物制剂，其包含(i)浓度小于5x1013 vg/ml的AAV颗粒；(ii)一种或多种盐；(iii)一种或多种糖或糖替代物；和(iv)一种或多种缓冲剂；其中药物制剂是水性制剂。
42.根据权利要求41所述的药物制剂，其中药物制剂包含浓度为1.0x1012-5.0x1013 vg/mL的AAV颗粒。
43.根据权利要求41所述的药物制剂，其中药物制剂包含浓度为1.0-5.0x1013 vg/mL的AAV颗粒。
44.根据权利要求41所述的药物制剂，其中药物制剂包含浓度为2.7x1013 vg/mL的AAV颗粒。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的药物制剂，其中制剂的一种或多种盐包括氯化钠。
46.根据权利要求45所述的药物制剂，其中制剂中氯化钠的浓度为80-220mM。
47.根据权利要求45所述的药物制剂，其中制剂中氯化钠的浓度为85-110mM。
48.根据权利要求45所述的药物制剂，其中制剂中氯化钠的浓度为95mM。
49.根据权利要求45所述的药物制剂，其中制剂中氯化钠的浓度为100mM。
50.根据权利要求41-49中任一项所述的药物制剂，其中制剂的一种或多种盐包括氯化钾。
51.根据权利要求50所述的药物制剂，其中制剂中氯化钾的浓度为0-10mM。
52.根据权利要求50所述的药物制剂，其中制剂中氯化钾的浓度为1-3mM。
53.根据权利要求50所述的药物制剂，其中制剂中氯化钾的浓度为1-2mM。
54.根据权利要求50所述的药物制剂，其中制剂中氯化钾的浓度为1.5mM。
55.根据权利要求41-54中任一项所述的药物制剂，其中制剂的一种或多种盐包括磷酸钾。
56.根据权利要求55所述的药物制剂，其中制剂中磷酸钾的浓度为0-10mM。
57.根据权利要求55所述的药物制剂，其中制剂中磷酸钾的浓度为1-3mM。
58.根据权利要求55所述的药物制剂，其中制剂中磷酸钾的浓度为1.5mM。
59.根据权利要求41-58中任一项所述的药物制剂，其中制剂中糖和/或糖替代物的浓度为1-10％w/v。
60.根据权利要求41-58中任一项所述的药物制剂，其中制剂中糖和/或糖替代物的浓度为4-6％w/v。
61.根据权利要求41-58中任一项所述的药物制剂，其中制剂中糖和/或糖替代物的浓度为5％w/v。
62.根据权利要求41-58中任一项所述的药物制剂，其中制剂中糖和/或糖替代物的浓度为6-8％w/v。
63.根据权利要求41-58中任一项所述的药物制剂，其中制剂中糖和/或糖替代物的浓度为7％w/v。
64.根据权利要求41-63中任一项所述的药物制剂，其中一种或多种糖或糖替代物包括至少一种二糖，其选自蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香糖、芸香酮糖和木二糖。
65.根据权利要求41-63中任一项所述的药物制剂，其中所述一种或多种糖或糖替代物包括蔗糖。
66.根据权利要求41-63中任一项所述的药物制剂，其中所述一种或多种糖或糖替代物包括海藻糖。
67.根据权利要求41-63中任一项所述的药物制剂，其中所述一种或多种糖或糖替代物包括山梨醇。
68.根据权利要求41-67中任一项所述的药物制剂，其中所述一种或多种缓冲剂提供了在5℃下7.0至8.2的制剂pH。
69.根据权利要求41-68中任一项所述的药物制剂，其中缓冲剂在所述制剂中的浓度为1-20mM。
70.根据权利要求41-68中任一项所述的药物制剂，其中缓冲剂在所述制剂中的浓度为10mM。
71.根据权利要求41-70中任一项所述的药物制剂，其中一种或多种缓冲剂选自TrisHCl、Tris碱、磷酸钠、磷酸钾、组氨酸、硼酸、柠檬酸、甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)和MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)。
72.根据权利要求41-70中任一项所述的药物制剂，其中一种或多种缓冲剂包括磷酸钠，并且制剂pH在5℃下为7.2至7.6。
73.根据权利要求72所述的药物制剂，其中制剂中磷酸钠的浓度为8-11mM。
74.根据权利要求72所述的药物制剂，其中制剂中磷酸钠的浓度为10mM。
75.根据权利要求41-70中任一项所述的药物制剂，其中一种或多种缓冲剂包括用盐酸调节的Tris碱，并且制剂pH在5℃下为7.8至8.2。
76.根据权利要求41-70中任一项所述的药物制剂，其中一种或多种缓冲剂包括用盐酸调节的Tris碱，并且制剂pH在5℃下为7.3至7.7。
77.根据权利要求41-70中任一项所述的药物制剂，其中药物制剂包含共聚物表面活性剂。
78.根据权利要求77所述的药物制剂，其中所述共聚物表面活性剂的浓度为0.00001％-1％w/v。
79.根据权利要求77所述的药物制剂，其中所述共聚物表面活性剂的浓度为0.001％w/v。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的药物制剂，其中所述共聚物表面活性剂包括环氧乙烷/环氧丙烷共聚物。
81.根据权利要求80所述的药物制剂，其中所述环氧乙烷/环氧丙烷共聚物是泊洛沙姆188。
82.根据权利要求41-81中任一项所述的药物制剂，其中制剂的重量克分子渗透压浓度为400至500mOsm/kg。
83.根据权利要求41-81中任一项所述的药物制剂，其中制剂的重量克分子渗透压浓度为400至480mOsm/kg。
84.一种药物制剂，其包含：至少一种AAV颗粒、磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、蔗糖和共聚物表面活性剂；其中所述药物制剂的pH为6.5-8，并且AAV颗粒浓度为1x1012-5x1013 vg/ml。
85.根据权利要求84所述的药物制剂，其包含：(i)浓度为1x1013-5x1013vg/ml的AAV颗粒；(ii)9-11mM的磷酸钠；(iii)1-2mM的磷酸钾；(iv)90-100mM的氯化钠；(v)6-8％w/v的糖或糖替代物；和(vi)环氧乙烷/环氧丙烷共聚物；其中药物制剂的pH为7-8。
86.根据权利要求84所述的药物制剂，其包含：(i)浓度为2x1013-3x1013vg/ml的AAV颗粒；(ii)10mM的磷酸钠；(iii)1.5mM的磷酸钾；(iv)95mM的氯化钠；(v)7％w/v的蔗糖和(vi)0.001％v/v的泊洛沙姆-188共聚物。
87.一种药物制剂，其包含：(i)浓度为2x1013-3x1013 vg/ml的AAV颗粒；(ii)1.5mM的氯化钾；(iii)100mM的氯化钠；(iv)7％w/v的蔗糖，和(v)0.001％v/v的泊洛沙姆-188共聚物；其中药物制剂包含足够的Tris HCl以提供7.3-8.2的制剂pH。
88.根据权利要求41-87中任一项所述的药物制剂，其中AAV颗粒包含AAV载体基因组和AAV衣壳；其中，AAV载体基因组包含SEQ ID NO:41的多核苷酸序列。
89.根据权利要求88所述的药物制剂，其中所述AAV衣壳具有选自以下的血清型：AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、绵羊AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、AAV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAVCBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAVCHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAVCKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAVCKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAVCKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAVCLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAVCLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAVCLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAVCLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAVCLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAVCSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAVCSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAV-PHP.B、AAV-PHP.A、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4和/或AAVG2B5及其变体。
90.根据权利要求88所述的药物制剂，其中所述AAV衣壳血清型是AAV1。
91.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述药物制剂包括权利要求41-90中任一项所述的药物制剂。
92.一种治疗受试者的亨廷顿舞蹈病的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求41-90中任一项所述的药物制剂。
93.根据权利要求92所述的方法，其中药物组合物通过输注到受试者的核壳和丘脑中来施用。
94.根据权利要求92所述的方法，其中药物组合物通过双侧输注到受试者的核壳和丘脑中来施用。
95.根据权利要求93或94所述的方法，其中药物组合物通过使用磁共振成像(MRI)引导的对流增强递送(CED)来施用。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的方法，其中施用于核壳的药物制剂的体积不大于1500μL/半球。
97.根据权利要求93-95中任一项所述的方法，其中施用于核壳的药物制剂的体积为900-1500μL/半球。
98.根据权利要求93-97中任一项所述的方法，其中施用于核壳的剂量为8x1011至4x1013VG/半球。
99.根据权利要求93-98中任一项所述的方法，其中施用于丘脑的药物制剂的体积不大于2500μL/半球。
100.根据权利要求93-98中任一项所述的方法，其中施用于丘脑的药物制剂的体积为1300-2500μL/半球。
101.根据权利要求93-100中任一项所述的方法，其中施用于丘脑的剂量为3.5x1012至6.8x1013 VG/半球。
102.根据权利要求92-101中任一项所述的方法，其中施用于受试者的总剂量为8.6x1012至2x1014 VG。
103.根据权利要求92-102中任一项所述的方法，其中施用于受试者的药物制剂抑制或阻抑受试者的纹状体中的亨廷顿蛋白(HTT)基因的表达。
104.根据权利要求103所述的方法，其中HTT基因在核壳中的表达被抑制或阻抑。
105.根据权利要求103所述的方法，其中HTT基因在核壳的一个或多个中型多棘神经元中的表达被抑制或阻抑。
106.根据权利要求103所述的方法，其中HTT基因在核壳的一个或多个星形胶质细胞中的表达被抑制或阻抑。
107.根据权利要求103-106中任一项所述的方法，其中HTT基因在核壳中的表达降低了至少30％。
108.根据权利要求103-106中任一项所述的方法，其中HTT基因在核壳中的表达降低了40-70％。
109.根据权利要求103-106中任一项所述的方法，其中HTT基因在核壳中的表达降低了50-80％。
110.根据权利要求103-109中任一项所述的方法，其中HTT基因在尾状核中的表达被抑制或阻抑。
111.根据权利要求110所述的方法，其中HTT基因在尾状核中的表达降低了至少30％。
112.根据权利要求110所述的方法，其中HTT基因在尾状核中的表达降低了40-70％。
113.根据权利要求110所述的方法，其中HTT基因在尾状核中的表达降低了50-85％。
114.根据权利要求92-113中任一项所述的方法，其中施用药物制剂抑制或阻抑HTT基因在受试者的大脑皮层中的表达。
115.根据权利要求114所述的方法，其中HTT基因在初级运动皮层和躯体感觉皮层中的表达被抑制或阻抑。
116.根据权利要求114所述的方法，其中HTT基因在初级运动皮层和躯体感觉皮层的锥体神经元中的表达被抑制或阻抑。
117.根据权利要求114-116中任一项所述的方法，其中HTT基因在大脑皮层中的表达降低了至少20％。
118.根据权利要求114-116中任一项所述的方法，其中HTT基因在大脑皮层中的表达降低了30-70％。
119.根据权利要求92-118中任一项所述的方法，其中施用药物组合物抑制或阻抑了HTT基因在受试者的丘脑中的表达。
120.根据权利要求119所述的方法，其中HTT基因在丘脑中的表达降低了至少30％。
121.根据权利要求119所述的方法，其中HTT基因在丘脑中的表达降低了40-80％。
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