ES2929031T3

ES2929031T3 - Optimización de la expresión de las proteínas rep y cap parvovirales en células de insecto

Info

Publication number: ES2929031T3
Application number: ES17181630T
Authority: ES
Inventors: Andrew Christian Bakker; Wilhelmus Theodorus Johannes Maria Hermens; Yvet Noordman
Original assignee: Uniqure IP BV
Current assignee: Uniqure IP BV
Priority date: 2008-02-19
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2022-11-24
Anticipated expiration: 2029-02-19
Also published as: EP3257937B1; US20140127801A1; JP2011512156A; AU2009215987A1; US9260724B2; US8642314B2; IL207671A; CA2715924C; EA020969B1; AU2009215987B2; IL207671A0; EP2250256B1; CA2715924A1; WO2009104964A1; EP3257937A1; EP2250256A1; CN102007209A; US20110136227A1; CN102007209B; ES2644880T3

Abstract

La presente invención se refiere a la producción mejorada de viriones parvovirales recombinantes en células de insectos. En particular, la invención se refiere a un proceso mejorado para la producción de viriones parvovirales recombinantes en células de insectos, en el que se incrementa la proporción de viriones parvovirales llenos/vacíos. La invención también se relaciona con la producción de vectores parvovirales que pueden usarse en terapia génica y con mejoras en la expresión de las proteínas Rep virales que aumentan la productividad de los vectores parvovirales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Optimización de la expresión de las proteínas rep y cap parvovirales en células de insecto

Campo de la invención

[0001] Esta invención se refiere a la producción de vectores de parvovirus, especialmente a la producción de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) en células de insectos, vectores de expresión baculoviral que comprenden un constructo de la invención y una célula que comprende dicho vector de expresión baculoviral. Antecedentes de la invención

[0002] El sistema de expresión de baculovirus es bien conocido por su uso como vector de clonación y expresión de eucariotas. King, L. A. y R. D. Possee, 1992, "The baculovirus expression system", Chapman and Hall, Reino Unido; O'Reilly, D. R., et al., 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. Nueva York: WH Freeman.). Las ventajas del sistema de expresión de baculovirus son, entre otras, que las proteínas expresadas son casi siempre solubles, están correctamente plegadas y son biológicamente activas. Otras ventajas incluyen altos niveles de expresión de proteínas, producción más rápida, idoneidad para la expresión de proteínas grandes e idoneidad para la producción a gran escala. Sin embargo, en la producción a gran escala o continua de proteínas heterólogas utilizando el sistema de expresión de baculovirus en biorreactores de células de insectos, la inestabilidad de los niveles de producción, también conocida como efecto de paso, es un obstáculo importante. Este efecto se debe, al menos en parte, a la recombinación entre secuencias homólogas repetidas en el ADN baculoviral.

[0003] El sistema de expresión de baculovirus también se ha utilizado con éxito para la producción de vectores recombinantes de virus adenoasociados (AAV) (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; EE. UU.

6.723.551 y EE. UU. 20040197895). El AAV puede considerarse como uno de los vectores virales más prometedores para la terapia génica humana. El AAV tiene la capacidad de infectar eficientemente células humanas, tanto las que se dividen como las que no. El genoma viral del AAV se integra en un solo sitio cromosómico en el genoma de la célula huésped y, lo que es más importante, aunque el AAV está presente en muchos humanos, nunca se ha asociado con ninguna enfermedad. En vista de estas ventajas, el virus adenoasociado recombinante (rAAV) se está evaluando en ensayos clínicos de terapia génica para hemofilia B, melanoma maligno, fibrosis quística, hiperlipoproteinemia tipo I y otras enfermedades.

[0004] Para superar los problemas con los sistemas de producción de mamíferos para AAV, Urabe et al. (2002, supra) desarrollaron un sistema de producción de AAV en células de insecto. Para la producción de AAV en células de insecto, fueron necesarias algunas modificaciones para lograr la estequiometría correcta de las tres proteínas de la cápside de los AAV (VP1, VP2 y VP3), que se basa en una combinación del uso alternativo de dos sitios aceptores de empalme y la utilización subóptima de un codón de iniciación ACG para VP2 que no se reproduce con precisión en las células de insecto. Para imitar la estequiometría correcta de las proteínas de la cápside en células de insectos, Urabe et al. (2002, supra) usan un constructo que se transcribe en un solo mensajero policistrónico que puede expresar las tres proteínas VP sin necesidad de corte y empalme y en el que el codón iniciador más alejado aguas arriba se reemplaza por el codón iniciador subóptimo ACG. WO2007/046703 describe una mejora adicional de la infectividad de la producción basada en vectores de rAAV producidos por baculovirus mediante la optimización de la estequiometría de las proteínas de la cápside de AAV tal como se producen en células de insecto.

[0005] Para la expresión de las proteínas Rep de AAV en el sistema de expresión de células de insectos AAV desarrollado inicialmente por Urabe et al. (2002, supra), se usa un constructo de baculovirus recombinante que alberga dos unidades de expresión de Rep independientes (una para Rep78 y otra para Rep52), cada una de ellas bajo el control de un promotor de células de insecto separado, los promotores AIE1 y PolH, respectivamente. Sin embargo, Kohlbrenner et al. (2005, Mol. Ther. 12: 1217-25; WO 2005/072364) informaron de que el constructo de baculovirus para la expresión de la proteína de dos Rep, tal como lo utilizan Urabe et al., adolece de una inestabilidad inherente. Al dividir la orientación palindrómica de los dos genes Rep en el vector original de Urabe y diseñar dos vectores de baculovirus separados para expresar Rep52 y Rep78, Kohlbrenner et al. (2005, supra) aumentaron la estabilidad de paso del vector. Sin embargo, a pesar de la expresión consistente de Rep78 y Rep52 a partir de los dos constructos independientes de baculovirus Rep en células de insecto durante al menos 5 pases, el rendimiento del vector rAAV es de 5 a 10 veces menor en comparación con el constructo original de baculovirus Rep diseñado por Urabe et al. (2002, supra).

[0006] En la solicitud WO2007/148971 los presentes inventores han mejorado significativamente la estabilidad de la producción del vector rAAV en células de insecto mediante el uso de una sola secuencia codificante para las proteínas Rep78 y Rep52 en la que se usa un codón iniciador subóptimo para la proteína Rep78 omitida parcialmente por los ribosomas que se están explorando para permitir que el inicio de traducción también ocurra aguas abajo en el codón de iniciación de la proteína Rep52.

[0007] La solicitud de patente internacional WO 2007/084773 describe un método de producción de rAAV en células de insecto, en el que la producción de partículas víricas infecciosas aumenta complementando VP1 con respecto a VP2 y VP3. La suplementación se puede efectuar introduciendo en la célula de insecto un vector de cápside que comprende secuencias de nucleótidos que expresan VP1, VP2 y VP3 y, además, introduciendo en la célula de insecto secuencias de nucleótidos que expresan VP1, que pueden estar en el mismo vector de cápside o en un vector diferente.

[0008] Sin embargo, todavía existe la necesidad de mejoras adicionales en la producción a gran escala (comercial) de vectores parvovirales en células de insectos. Por lo tanto, es un objetivo de la presente invención proporcionar medios y métodos que permitan una producción estable y de alto rendimiento (a gran escala) de vectores parvovirales y una producción que resulte en una proporción mejorada de partículas llenas:vacías (es decir, una mayor proporción de partículas llenas).

Resumen de la invención

[0009] La invención se refiere a un método para la producción de un virión parvoviral recombinante. El uso de dicho método puede permitir la producción de dichos viriones con títulos de producción incrementados. El uso del método puede, alternativa o adicionalmente, permitir una producción que tenga una mayor proporción de partículas llenas, es decir, una relación llenas:vacías o una relación totales:llenas más favorable.

[0010] La invención proporciona un método para la producción de un virión parvoviral recombinante, el cual comprende los pasos de:

(a) proporcionar una célula de insecto que comprende uno o varios constructos de ácidos nucleicos que comprenden:

(i) una secuencia de nucleótidos que comprende un transgén que está flanqueado por al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral;

(ii) un primer casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep78 parvoviral a partir de la cual se expresan las proteínas Rep52 y Rep78 en la célula de insecto, cuya secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de impulsar la expresión de la proteína Rep en la célula de insecto, y en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína parvoviral Rep78 no comprende un intrón artificial;

(iii) un segundo casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside parvoviral que está operativamente enlazada a un segundo promotor que es capaz de dirigir la expresión de la proteína de la cápside en la célula de insecto; y

(b) cultivar la célula definida en (a) en condiciones propicias para la expresión de la Rep y la proteína de la cápside;

donde los casetes de expresión primero y segundo están presentes en un solo constructo de ácidos nucleicos, donde los casetes de expresión primero y segundo están presentes en cantidad equimolar en la célula de insecto, y donde el primer promotor es tan fuerte como el segundo promotor.

[0011] La invención también proporciona:

una célula de insecto tal como se define en las reivindicaciones adjuntas; y

un kit que comprende

(a) un constructo de ácidos nucleicos que comprende el primer y segundo casete de expresión tal como se define en las reivindicaciones adjuntas; y

(b) un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de clonación múltiple para un transgén que está flanqueado por al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral, cuyo transgén está operativamente enlazado a un promotor capaz de impulsar la expresión del transgén en una célula huésped.

Breve descripción de las figuras.

[0012]

La figura 1 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD118 (nuevo).

La figura 2 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD118 (nuevo) HR1.

La figura 3 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD165.

La figura 4 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD165 HR1.

La figura 5 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD165 4xEcRE CAP.

La figura 6 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD165+4*EcRE Rep78.

La figura 7 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD165 deltalEI CAP.

La figura 8 muestra una representación esquemática de la construcción de deltaIE1 Cap pPolh Rep (pVD190).

La figura 9 muestra una representación esquemática de la construcción de p10 Cap pPolh Rep.

La figura 10 muestra una representación esquemática de la construcción de pVD194.

La figura 11A muestra el análisis de transferencia Western de las proteínas Cap y Rep expresadas a partir de Bac.VD194, tres días después de la infección con el baculovirus en proporciones 1:1 y 5:1 (C=Bac.VD88:Bac.VD84:Bac.VD43 a 5:1:1 respectivamente). La figura 11B muestra los títulos virales para las mismas producciones analizadas en la figura 11A.

Descripción de la invención

Definiciones

[0013] Tal como se usa en el presente documento, el término "operativamente enlazado" se refiere a un enlace de elementos polinucleotídicos (o polipeptídicos) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está operativamente enlazada a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que se enlazan son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, son contiguas y están en el marco de lectura.

[0014] "Secuencia de control de la expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una secuencia de nucleótidos a la que está operativamente enlazada.

[0015] Una secuencia de control de la expresión está operativamente enlazada a una secuencia de nucleótidos cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y/o la traducción de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, una secuencia de control de la expresión puede incluir promotores, potenciadores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), terminadores de la transcripción, un codón de inicio frente a un gen que codifica una proteína, una señal de empalme para intrones y codones de terminación. El término "secuencia de control de la expresión" pretende incluir, como mínimo, una secuencia cuya presencia está diseñada para influir en la expresión y también puede incluir componentes ventajosos adicionales. Por ejemplo, las secuencias líder y las secuencias asociadas de fusión son secuencias de control de la expresión. El término también puede incluir el diseño de la secuencia de ácidos nucleicos de manera que los codones de iniciación potenciales no deseables dentro y fuera del marco se eliminen de la secuencia. También puede incluir el diseño de la secuencia de ácidos nucleicos de manera que se eliminen los sitios de empalme potenciales no deseables. Incluye secuencias, entre ellas de poliadenilación (pA) que dirigen la adición de una cola poliA, es decir, una cadena de residuos de adenina en el extremo 3' de un ARNm, secuencias denominadas secuencias poliA. También se puede diseñar para mejorar la estabilidad del ARNm. Las secuencias de control de la expresión que afectan a la estabilidad de la transcripción y la traducción, por ejemplo, los promotores, así como las secuencias que afectan a la traducción, por ejemplo, las secuencias de Kozak, son conocidas en la células de insectos. Las secuencias de control de la expresión pueden ser de tal naturaleza que modulen la secuencia de nucleótidos a la que están operativamente enlazadas de modo que se consigan niveles de expresión más bajos o más altos.

[0016] Según se usa en el presente documento, los términos "promotor" o "secuencia reguladora de la transcripción" se refieren a un fragmento de ácidos nucleicos que funciona para controlar la transcripción de una o más secuencias codificantes, y está ubicado corriente arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción de la secuencia codificante, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ^aRⁿpolimerasa dependiente de ADN, sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluyendo, entre otros, los sitios de unión al factor de transcripción, los sitios de unión a las proteínas represora y activadora y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la técnica que actúe directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de los tejidos en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado fisiológica o evolutivamente, p. ej., mediante la aplicación de un inductor químico. Un promotor "específico de tejido" solo está activo en tipos específicos de tejidos o células.

[0017] La "identidad de secuencia" y la "similitud de secuencia" se pueden determinar mediante la alineación de dos secuencias de péptidos o de dos nucleótidos usando algoritmos de alineación globales o locales, dependiendo de la longitud de las dos secuencias. Las secuencias de longitudes similares se alinean preferiblemente usando algoritmos de alineación globales (por ejemplo, Needleman Wunsch) que alinea las secuencias de manera óptima en toda la longitud, mientras que las secuencias de longitudes sustancialmente diferentes se alinean preferiblemente usando un algoritmo de alineación local (por ejemplo, Smith Waterman). Las secuencias pueden entonces denominarse "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando comparten al menos un cierto porcentaje mínimo de identidad de secuencia (como se define a continuación) (cuando se alinean de manera óptima, por ejemplo, mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando parámetros predeterminados). GAP utiliza el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud (longitud completa), maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de gaps. Una alineación global se usa adecuadamente para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares. Generalmente, se utilizan los parámetros predeterminados de GAP, con una penalización por creación de gap = 50 (nucleótidos)/8 (proteínas) y una penalización por extensión de gap = 3 (nucleótidos)/2 (proteínas). Para los nucleótidos, la matriz de puntuación predeterminada utilizada es nwsgapdna y para las proteínas, la matriz de puntuación predeterminada es Blosum62 (Henikoff y Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Las alineaciones de secuencias y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencias se pueden determinar utilizando programas informáticos, como el paquete Wisconsin de GCG, versión 10.3, disponible en Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 EE. UU., o utilizando software de código abierto, como el programa "needle" (usando el algoritmo global de Needleman Wunsch) o "water" (usando el algoritmo local de Smith Waterman) en EmbossWIN versión 2.10.0, usando los mismos parámetros que para GAP anteriormente, o usando la configuración predeterminada (ambos para "needle" y para "water" y tanto para proteínas como para alineaciones de ADN, la penalización por abertura de gap predeterminada es 10.0 y la penalización por extensión de gap predeterminada es 0.5; las matrices de puntuación predeterminadas son Blossum62 para proteínas y DNAFull para ADN). Cuando las secuencias tienen longitudes totales sustancialmente diferentes, se prefieren las alineaciones locales, como las que utiliza el algoritmo de Smith Waterman. Alternativamente, el porcentaje de similitud o identidad puede determinarse mediante la búsqueda en bases de datos públicas, utilizando algoritmos como FASTA, BLAST, etc.

[0018] Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas Cap y/o Rep parvovirales de la invención también pueden definirse por su capacidad para hibridarse con las secuencias de nucleótidos de la SEC ID N.° bajo estrictas condiciones de hibridación.

[0019] Las condiciones de hibridación estrictas se definen en el presente documento como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 50, 75 o 100 y más preferiblemente aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 65 °C en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 X SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y se lave a 65 °C en una solución que comprende aproximadamente 0.1 M de sal o menos, preferiblemente 0.2 X SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir al menos durante 10 horas y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán la hibridación específica de secuencias que tengan aproximadamente un 90 % o más de identidad de secuencia.

[0020] Las condiciones moderadas se definen en el presente documento como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 45 °C en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 X SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y se lave a temperatura ambiente en una solución que comprende aproximadamente 1 M de sal, preferiblemente 6 X SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferiblemente, la hibridación se realiza durante la noche, es decir al menos durante 10 horas y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán la hibridación específica de secuencias que tengan hasta un 50 % o más de identidad de secuencia. La persona experta en la materia podrá modificar estas condiciones de hibridación para identificar específicamente secuencias cuya identidad varía entre el 50 % y el 90 %.

[0021] Un "vector" es una molécula de ácido nucleico (típicamente ADN o ARN) que sirve para transferir una secuencia de ácido nucleico pasajero (es decir, ADN o ARN) a una célula huésped. Tres tipos comunes de vectores son los plásmidos, los fagos y los virus. Preferiblemente, el vector es un virus. Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que se puede enlazar operativamente un polinucleótido son bien conocidos en la técnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y están comercialmente disponibles en fuentes tales como Stratagene (La Jolla, Calif.) y Promega Biotech (Madison, Wis.). Para optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser necesario eliminar, añadir o alterar las porciones no traducidas de 5' y/o 3' de los clones para eliminar codones alternativos potenciales de iniciación de la traducción adicionales e inapropiados u otras secuencias que puedan interferir con la expresión o reducirla, ya sea a nivel de transcripción o de traducción. Alternativamente, los sitios de unión a ribosomas de consenso se pueden insertar inmediatamente en 5' del codón de inicio para mejorar la expresión.

[0022] Un "vector viral" se refiere a un vector que comprende algunos o todos los siguientes: genes virales que codifican un producto génico, secuencias de control y secuencias de empaquetamiento viral.

[0023] Un "vector parvoviral" se define como un parvovirus producido de forma recombinante o una partícula parvoviral que comprende un polinucleótido que se administrará en una célula huésped, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores parvovirales incluyen, por ejemplo, vectores de virus adenoasociados. En el presente documento, un constructo de vector parvoviral se refiere al polinucleótido que comprende el genoma viral o parte del mismo, y un transgén.

[0024] La adaptabilidad de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima al uso de codones de una célula huésped puede expresarse como índice de adaptación de codones (CAI). El índice de adaptación de codones se define en el presente documento como una medida de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen al uso de codones de genes altamente expresados en una célula huésped u organismo particulares. La adaptabilidad relativa (w) de cada codón es la relación entre el uso de cada codón y el del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice CAI se define como la media geométrica de estos valores de adaptabilidad relativa. Se excluyen los codones no sinónimos y los codones de terminación (que dependen del código genético). Los valores de CAI varían de 0 a 1; y los valores más altos indican una mayor proporción de los codones más abundantes (ver Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; ver también: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51).

[0025] El término "reportero" (o gen reportero o proteína reportera) se utiliza principalmente para referirse a la secuencia de nucleótidos que codifica proteínas marcadoras visibles, como la proteína verde fluorescente (GFP), eGFP, otras proteínas fluorescentes, la luciferasa, la fosfatasa alcalina secretada (SEAP), el GUS y similares, así como marcadores nptII y similares

Descripción detallada de la invención

[0026] La presente invención se refiere al uso de parvovirus, en particular dependovirus tales como AAV humano o de simio infeccioso, y los componentes de los mismos (p. ej., un genoma de parvovirus) para usar como vectores para la introducción y/o expresión de ácidos nucleicos en células de mamífero, preferiblemente células humanas. En particular, la invención se refiere a mejoras en la productividad de dichos vectores parvovirales cuando se producen en células de insectos.

[0027] La productividad en este contexto abarca mejoras en los títulos de producción y mejoras en la calidad del producto resultante, por ejemplo, un producto que ha mejorado la relación totales:llenas (una medida del número de partículas que comprenden ácidos nucleicos). Es decir, el producto final puede tener una mayor proporción de partículas llenas, donde lleno implica que la partícula comprende ácidos nucleicos.

[0028] Los virus de la familia Parvoviridae son pequeños virus de ADN. La familia Parvoviridae se puede dividir en dos subfamilias: Parvovirinae, que infecta a los vertebrados, y Densovirinae, que infecta a los invertebrados, incluidos los insectos. Los miembros de la subfamilia Parvovirinae se denominan aquí parvovirus e incluyen el género Dependovirus. Como puede deducirse del nombre de su género, los miembros del Dependovirus son únicos en el sentido de que normalmente requieren la coinfección con un virus auxiliar como el adenovirus o el virus del herpes para la infección productiva en cultivo celular. El género Dependovirus incluye AAV, que normalmente infecta a humanos (p. ej., serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (p. ej., serotipos 1 y 4), y virus relacionados que infectan a otros animales de sangre caliente (por ejemplo, virus adenoasociados bovinos, caninos, equinos y ovinos). Se describe más información sobre parvovirus y otros miembros de Parvoviridae en Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", capítulo 69 en Fields Virology (3.a ed. 1996). Por conveniencia, la presente invención se ejemplifica y describe adicionalmente en el presente documento con referencia a AAV. Sin embargo, se entiende que la invención no se limita a AAV sino que puede aplicarse igualmente a otros parvovirus.

[0029] La organización genómica de todos los serotipos de AAV conocidos es muy similar. El genoma de AAV es una molécula de ADN monocatenario lineal que tiene menos de aproximadamente 5000 nucleótidos (nt) de longitud. Las repeticiones terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias codificantes de nucleótidos únicas para las proteínas de replicación no estructural (Rep) y las proteínas estructurales (VP). Las proteínas VP (VP1, -2 y -3) forman la cápside. Los 145 nt terminales son autocomplementarios y están organizados de manera que se puede formar un dúplex intramolecular energéticamente estable que forma una horquilla en forma de T. Estas estructuras en horquilla funcionan como un origen para la replicación del ADN viral, sirviendo como cebadores para el complejo celular de ADN polimerasa. Después de la infección con wtAAV en células de mamífero, los genes Rep (es decir, Rep78 y Rep52) se expresan a partir del promotor P5 y el promotor P19, respectivamente, y ambas proteínas Rep tienen una función en la replicación del genoma viral. Un evento de empalme en el ORF de Rep da como resultado la expresión de cuatro proteínas Rep (es decir, Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40).

[0030] Sin embargo, se ha demostrado que el ARNm no empalmado, que codifica las proteínas Rep78 y Rep52, en células de mamífero es suficiente para la producción del vector AAV. También en células de insecto, las proteínas Rep78 y Rep52 son suficientes para la producción del vector AAV.

[0031] Un "vector parvoviral o AAV recombinante" (o "vector rAAV") en el presente documento se refiere a un vector que comprende una o más secuencias de polinucleótidos de interés, genes de interés o "transgenes" que están flanqueados por al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) parvoviral o de AAV. Preferiblemente, el o los transgenes están flanqueados por ITR, uno a cada lado del o de los transgenes. Dichos vectores de rAAV se pueden replicar y empaquetar en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula huésped de insecto que expresa productos de los genes rep y cap de AAV (es decir, proteínas AAV Rep y Cap). Cuando un vector rAAV se incorpora a un constructo de ácidos nucleicos más grande (p. ej., en un cromosoma o en otro vector, como un plásmido o baculovirus utilizado para la clonación o la transfección), el vector rAAV generalmente se denomina "pro-vector" que puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de funciones de empaquetamiento AAV y funciones auxiliares necesarias.

[0032] La invención se refiere a un método para producir un virión de parvovirus recombinante (rAAV), que comprende un vector de parvovirus recombinante (rAAV), en una célula de insecto.

[0033] En un primer aspecto, la invención está relacionada con un método para la producción de un virión parvoviral recombinante que comprende los pasos de: (a) proporcionar una célula de insecto que comprende uno o varios constructos de ácidos nucleicos que comprenden: (i) una secuencia de nucleótidos que comprende un transgén que está flanqueado por al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral; (ii) un primer casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep78 parvoviral que está operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de dirigir la expresión de la proteína Rep en la célula de insecto, y en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rep78 parvoviral no comprende un intrón artificial; (iii) un segundo casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside parvoviral que está operativamente enlazada a un segundo promotor que es capaz de dirigir la expresión de la proteína de la cápside en la célula de insecto; y (b) cultivar la célula definida en (a) en condiciones propicias para la expresión de Rep y la proteína de la cápside; donde los casetes de expresión primero y segundo están presentes en un solo constructo de ácidos nucleicos, donde los casetes de expresión primero y segundo están presentes en cantidad equimolar en la célula de insecto, y donde el primer promotor es tan fuerte como el segundo promotor.

[0034] Preferiblemente, los casetes de expresión primero y segundo presentes en cantidad equimolar en una célula de insecto producen una proporción de niveles de ARNm que codifica proteínas Rep frente a ARNm que codifica proteínas de la cápside de al menos aproximadamente 0.5, al menos aproximadamente 0.75, al menos aproximadamente 1.0, al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 2.0, al menos aproximadamente 5.0 o al menos aproximadamente 10.0. Los niveles de ARNm que codifican Rep y cápsides se determinan preferiblemente mediante PCR de transcripción inversa cuantitativa, transferencia Northern u otros medios para la cuantificación de ARN conocidos en la técnica.

[0035] Preferiblemente, la proporción de los niveles de ARNm que codifican Rep y cápsides se produce en la célula de insecto en un periodo de tiempo de 24, 30, 36, 40, 44 o 46 horas después de la transfección a 72, 66, 60, 54, 52 o 50 horas después de la transfección. Más preferiblemente, la proporción de los niveles de ARNm que codifican Rep y cápsides se producen al menos en la célula de insecto 2 o 1 hora alrededor de 48 horas después de la transfección.

[0036] En otra alternativa preferida, los casetes de expresión primero y segundo presentes en cantidad equimolar en una célula de insecto producen una proporción de niveles de proteínas Rep frente a proteínas de la cápside de al menos aproximadamente 0.5, al menos aproximadamente 0.75, al menos aproximadamente 1.0, al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 2.0, al menos aproximadamente 5.0 o al menos aproximadamente 10.0. Los niveles de proteína Rep y de la cápside se determinan preferiblemente utilizando anticuerpos de referencia contra las proteínas Rep y de la cápside en un inmunoensayo cuantitativo (p. ej., ELISA o transferencia Western cuantitativa). Preferiblemente, la proporción de los niveles de proteína Rep y de la cápside se produce en la célula de insecto en un periodo de tiempo de 24, 30, 36, 40, 44 o 46 horas después de la transfección a 72, 66, 60, 54, 52 o 50 horas después de la transfección. Más preferiblemente, la proporción de los niveles de proteína Rep y de la cápside se produce en la célula de insecto 2 o 1 hora alrededor de 48 horas después de la transfección. Los anticuerpos de referencia adecuados para la cuantificación de Rep de AAV y los niveles de proteína de la cápside son, por ejemplo, anti-AAV-rep, monoclonal de ratón, clon 303.9, o anti-AAV VP1/VP2/VP3, monoclonal de ratón, clon B1 que se pueden obtener de PROGEN Biotechnik GmbH.

[0037] En el método de la invención, los casetes de expresión primero y segundo están presentes en un solo constructo de ácidos nucleicos. Una de las ventajas de que ambos casetes de expresión estén presentes en un único constructo de ácidos nucleicos es que las células de insecto transfectadas expresarán tanto la proteína Rep como la proteína de la cápside. Solo la expresión tanto de la proteína Rep como de la proteína de la cápside en una célula de insecto dará como resultado la formación de viriones parvovirales. Otra ventaja es que la proporción mínima requerida de expresión de la proteína Rep frente a la proteína de la cápside se puede controlar cuando los casetes de expresión primero y segundo están en un solo constructo.

[0038] Es una realización de la invención que también pueda estar presente en la célula otro constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep.

[0039] En un método de la invención, la secuencia de nucleótidos del primer casete de expresión (ii) puede comprender preferiblemente solo un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleótidos que codifican al menos la proteína Rep78. Es decir, la proteína o proteínas Rep estarán codificadas por un solo marco de lectura abierto, no por dos o más marcos de lectura abiertos. Dicho de otra manera, el primer casete de expresión típicamente no tendrá dos o más marcos de lectura abiertos separados que codifiquen las mismas o diferentes proteínas Rep. Sin embargo, para evitar dudas, un único marco de lectura abierto puede ser capaz de codificar más de una proteína, por ejemplo, dos, tres o cuatro proteínas.

[0040] Todo lo anterior puede aplicarse por igual a las proteínas VP1, VP2 y VP3, es decir, dos o todas esas proteínas pueden estar codificadas convenientemente por un único marco de lectura abierto.

[0041] Normalmente, en un método de la invención, al menos un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 o al menos un marco de lectura abierto que comprende un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleótidos que codifican al menos la proteína Rep78 no comprende un intrón artificial (o una secuencia derivada de un intrón artificial). Es decir, al menos los marcos de lectura abiertos usados para codificar proteínas Rep o VP no comprenderán un intrón artificial. Por intrón artificial se entiende un intrón que no se encontraría de forma natural en una secuencia Rep o Cap de un virus adenoasociado, por ejemplo, un intrón que se ha diseñado para permitir el empalme funcional dentro de una célula de insecto. Por lo tanto, un intrón artificial en este contexto abarca intrones de células de insectos de tipo salvaje. Un casete de expresión de la invención puede comprender una secuencia de intrones truncada nativa (por nativa se entiende una secuencia que ocurre de manera natural en un virus adenoasociado) - tales secuencias no pretenden caer dentro del significado de intrón artificial tal como se define en el presente documento.

[0042] En la invención, una posibilidad es que ningún marco de lectura abierto que comprenda secuencias de nucleótidos que codifiquen las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 y/o ningún marco de lectura abierto que comprenda secuencias de nucleótidos que codifiquen al menos una de las proteínas Rep78 y Rep68 comprenda un intrón artificial.

[0043] En una realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén también está en el mismo constructo de ácidos nucleicos que el primer y el segundo casete de expresión. Una ventaja de esto es que todas las células transfectadas comprenden cada una de las tres secuencias de nucleótidos que se necesitan para la producción de viriones parvovirales.

[0044] Además, los presentes inventores descubrieron que cuanto mayor es la proporción de proteína Rep:proteína de la cápside, mayor es la proporción de virión lleno frente a virión vacío. El término "virión lleno" se refiere a una partícula de virión que comprende un vector parvoviral. El término "virión vacío" se refiere a una partícula de virión que no comprende un vector parvoviral. En una realización preferida de la invención, la proporción de virión lleno frente a virión vacío es de al menos 1:100, más preferiblemente de al menos 1:10 e incluso más preferiblemente de al menos 1:1. Aún más preferiblemente, no se pueden detectar viriones vacíos y lo más preferiblemente no hay viriones vacíos presentes. El experto en la materia sabrá determinar la relación virión lleno frente a virión vacío, por ejemplo dividiendo el número de copias del gen entre (cápside total - número de copias del genoma), ya que por virión habrá una sola copia del genoma presente. A la inversa, cuanto mayor sea la proporción de proteína Rep:proteína de la cápside, menor será la proporción de viriones vacíos frente a viriones totales (es decir, viriones llenos vacíos). El experto en la materia sabrá cómo determinar dichas proporciones. Por ejemplo, la proporción de viriones vacíos frente a cápsides totales se puede determinar dividiendo la cantidad de copias del genoma (es decir, el número de copias del genoma) por la cantidad de partículas parvovirales totales (es decir, el número de partículas parvovirales), donde la cantidad de copias del genoma por ml se mide mediante PCR cuantitativa y la cantidad de partículas parvovirales totales por ml se mide con un inmunoensayo enzimático, p. ej., de Progen. En una realización preferida de la invención, la proporción de viriones vacíos frente a viriones totales es inferior a 100:1, más preferentemente inferior a 10:1, e incluso más preferentemente inferior a 1:1. Aún más preferiblemente, no se pueden detectar viriones vacíos y lo más preferiblemente no hay viriones vacíos presentes.

[0045] En una realización preferida, la proporción de expresión de Rep frente a la proteína de la cápside se regula adicionalmente mediante uno o más de los siguientes: (a) la presencia de elementos potenciadores en mayor cantidad y/o más fuertes en el primer casete de expresión en comparación con el segundo casete de expresión; (b) la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rep parvoviral tiene un índice de adaptación de codones más alto en comparación con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápside; (c) la optimización de la temperatura de la proteína Rep parvoviral; y/o (d) las proteínas Rep variantes con una o varias alteraciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con una proteína Rep de tipo salvaje correspondiente y donde la alteración de uno o más aminoácidos da como resultado aumentos en la actividad de la función Rep según lo evaluado mediante la detección de una mayor producción de AAV en células de insecto. Los métodos para la generación, selección y/o cribado de proteínas Rep variantes con una actividad incrementada de la función Rep según lo evaluado mediante la detección de una producción incrementada de AAV en células de insecto pueden obtenerse mediante la adaptación a células de insecto de los métodos descritos en EE. UU. 20030134351 para la obtención de proteínas Rep variantes con función aumentada con respecto a la producción de AAV en células de mamífero. En el presente documento, se entiende que las proteínas Rep variantes con una o varias alteraciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con una proteína Rep de tipo salvaje correspondiente incluyen proteínas Rep con una o varias sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos variante en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína Rep de tipo salvaje correspondiente.

[0046] Que el primer promotor sea igual o más fuerte que el segundo promotor, según lo determinado mediante la expresión del gen informador (por ejemplo, luciferasa o SEAP), o mediante transferencia Northern, significa que en el caso de que haya más secuencias de nucleótidos que codifiquen una proteína Rep que secuencias de nucleótidos que codifiquen una proteína de la cápside, se puede usar un promotor igualmente fuerte, ya que la expresión de la proteína Rep aumentará en comparación con la expresión de la proteína de la cápside, mientras que en el caso de cantidades similares de secuencias de nucleótidos que codifiquen Rep y codifiquen la proteína de la cápside, se puede usar un promotor más fuerte para la expresión de la proteína Rep que para la expresión de la proteína de la cápside. La fuerza del promotor puede determinarse mediante la expresión que se obtiene en las condiciones que se usan en el método de la invención. En una realización preferida, el primer promotor o el segundo promotor se seleccionan del grupo que consiste en un promotor PolH, un promotor p10, un promotor de proteína básica, un promotor inducible o un promotor deltaE1 o un promotor E1, o cualquier otro promotor génico de baculovirus tardío o muy tardío. Más preferiblemente, el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor PolH, un promotor p10 o un promotor de proteína básica y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un promotor E1, o cualquier otro promotor génico de baculovirus temprano o tardío. Preferiblemente, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor PolH o un promotor 4xHsp27 EcRE+Hsp70 mínimo. En otra realización, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor 4xHsp27 EcRE+Hsp70 mínimo y el segundo promotor es un promotor PolH. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor p10, deltaE1 o E1. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o E1. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o E1. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor PolH. Lo más preferiblemente, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1.

[0047] Un "elemento potenciador" o un "potenciador" tiene por objeto definir una secuencia que potencia la actividad de un promotor (es decir, aumenta la tasa de transcripción de una secuencia cadena abajo del promotor) que, a diferencia de un promotor, no posee actividad promotora, y que normalmente puede funcionar independientemente de su ubicación con respecto al promotor (es decir, aguas arriba o aguas abajo del promotor). Los elementos potenciadores son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitantes de elementos potenciadores (o partes de los mismos) que podrían usarse en la presente invención incluyen potenciadores de baculovirus y elementos potenciadores que se encuentran en células de insectos. Se prefiere que el elemento potenciador aumente en una célula la expresión de ARNm de un gen, al que está operativamente enlazado el promotor, en al menos un 25 %, más preferiblemente al menos un 50 %, incluso más preferiblemente al menos un 100 % y lo más preferiblemente al menos un 200 % en comparación con la expresión del ARNm del gen en ausencia del elemento potenciador. La expresión de ARNm se puede determinar, por ejemplo, mediante RT-PCR cuantitativa.

[0048] En el presente documento se prefiere usar un elemento potenciador para potenciar la expresión de la proteína Rep parvoviral. Por lo tanto, en una realización preferida adicional, el primer casete de expresión comprende al menos un elemento potenciador de baculovirus y/o al menos un elemento sensible a la ecdisona. Preferiblemente, el elemento potenciador se selecciona del grupo que consta de hr1, hr2, hr3, hr4 y hr5.

[0049] La optimización de codones de la proteína Rep parvoviral se analiza con más detalle a continuación.

[0050] La optimización de la temperatura de la proteína Rep parvoviral se refiere al uso de la condición óptima con respecto tanto a la temperatura a la que crecerá la célula de insecto como a la que Rep está funcionando. Una proteína Rep puede, por ejemplo, ser óptimamente activa a 37 °C, mientras que una célula de insecto puede crecer de manera óptima a 28 °C. Una temperatura a la que tanto la proteína Rep es activa como a la que la célula de insecto crece puede ser de 30 °C. En una realización preferida, la temperatura optimizada es superior a 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 °C y/o inferior a 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31,30 o 29 °C.

[0051] Como comprenderá el experto en la técnica, la proporción virión lleno:virión vacío también puede mejorarse mediante la expresión de Cap atenuada, por ejemplo mediante un promotor más débil, en comparación con la expresión de Rep de moderada a alta.

[0052] Preferiblemente, un constructo de ácidos nucleicos de la invención es un vector compatible con células de insecto. Por "vector compatible con células de insectos" o "vector" se entiende una molécula de ácido nucleico capaz de transformar o transfectar productivamente un insecto o una célula de insecto. Los ejemplos de vectores biológicos incluyen plásmidos, moléculas de ácidos nucleicos lineales y virus recombinantes. Puede emplearse cualquier vector siempre que sea compatible con células de insecto. El vector puede integrarse en el genoma de las células de insecto pero la presencia del vector en la célula de insecto no necesita ser permanente y también se incluyen vectores episomales transitorios. Los vectores pueden introducirse por cualquier medio conocido, por ejemplo, por tratamiento químico de las células, electroporación o infección. En una realización preferida, el vector es un baculovirus, un vector viral o un plásmido. En una realización más preferida, el vector es un baculovirus, es decir, el constructo de ácidos nucleicos es un vector de expresión de baculovirus. Los vectores de expresión de baculovirus y los métodos para su uso se describen, por ejemplo, en Summers y Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. N.° 7555, College Station, Texas; Luckow. 1991. En Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. y R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, Reino Unido; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York; W. H. Freeman y Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volumen 39; EE. UU. 4.745.051; EE. UU. 2003148506; y WO 03/074714.

[0053] El número de constructos de ácidos nucleicos empleados en la célula de insecto para la producción del vector parvoviral recombinante (rAAV) no es limitante en la invención. Por ejemplo, se pueden emplear uno, dos, tres o más constructos separados para producir rAAV en células de insecto de acuerdo con los métodos de la presente invención. Si se emplean dos constructos, un constructo puede comprender la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén que está flanqueado por al menos una secuencia ITR parvoviral y el otro constructo puede comprender un primer y un segundo casete de expresión. Si se emplean tres constructos, un constructo puede comprender la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén que está flanqueado por al menos una secuencia ITR parvoviral, otro constructo puede comprender el primer y el segundo casete de expresión y otro constructo puede comprender una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un proteína Rep, opcionalmente optimizada ya sea por codón, por AT o por GC, para minimizar o prevenir la recombinación, tal como se describe a continuación.

[0054] Una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep parvovirales, se entiende en el presente documento como una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas Rep no estructurales que son necesarias y suficientes para la producción de vectores parvovirales en células de insectos tales como las proteínas Rep78 o Rep68 y/o Rep52 o Rep40. La secuencia de nucleótidos del parvovirus es preferiblemente de un dependovirus, más preferiblemente de un virus adenoasociado (AAV) humano o de simio y lo más preferiblemente de un AAV que normalmente infecta a humanos (p. ej., serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, y 6) o primates (p. ej., serotipos 1 y 4). Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep de parvovirus se proporciona en la SEC ID N.° 5, que representa una parte del genoma de la secuencia del serotipo 2 de AAV que codifica las proteínas Rep. La secuencia de codificación de Rep78 comprende los nucleótidos 11 -1876 y la secuencia de codificación de Rep52 comprende los nucleótidos 683 - 1876, también representados por separado en las SEC ID N.° 5 y 7. Se entiende que los pesos moleculares exactos de las proteínas Rep78 y Rep52, así como las posiciones exactas de los codones de iniciación de la traducción pueden diferir entre diferentes parvovirus. Sin embargo, el experto en la materia sabrá cómo identificar la posición correspondiente en la secuencia de nucleótidos de otros parvovirus distintos del AAV-2.

[0055] En una realización preferida, el primer casete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína Rep78 parvoviral. Preferiblemente, la proteína Rep parvoviral es una proteína Rep de virus adenoasociados (AAV).

[0056] En una realización preferida, la invención se refiere a una célula de insecto que comprende no más de un tipo de secuencia de nucleótidos que comprende un único marco de lectura abierto que codifica una proteína Rep78 parvoviral. Preferiblemente, el único marco de lectura abierto codifica la proteína Rep 78 de longitud completa a partir de la cual preferiblemente al menos las proteínas Rep 52 y Rep 78 pueden expresarse en la célula de insecto. Se entiende en el presente documento que la célula de insecto puede comprender más de una copia del único tipo de secuencia de nucleótidos, p. ej., en un vector episomal multicopia, pero que estas son copias múltiples de esencialmente una única molécula de ácido nucleico, o al menos moléculas de ácido nucleico que codifican una única secuencia de aminoácidos de Rep, p. ej., moléculas de ácidos nucleicos que solo difieren entre sí debido a la degeneración del código genético. La presencia de un solo tipo de molécula de ácido nucleico que codifica las proteínas Rep parvovirales evita la recombinación entre secuencias homólogas que pueden estar presentes en diferentes tipos de vectores que comprenden secuencias Rep, lo que puede dar lugar a constructos de expresión Rep defectuosos que afectan a (la estabilidad de) los niveles de producción parvovirales en células de insecto.

[0057] En una realización alternativa de la invención, el primer casete de expresión comprende más de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep parvoviral. Se prefiere que la secuencia de nucleótidos de (ii) comprenda un marco de lectura abierto que comprenda secuencias de nucleótidos que codifiquen al menos las proteínas Rep78 y Rep68. Preferiblemente, las secuencias de nucleótidos son del mismo serotipo. Más preferiblemente, las secuencias de nucleótidos difieren entre sí en que pueden estar optimizadas por codón, optimizadas por AT u optimizadas por GC, para minimizar o evitar la recombinación. Preferiblemente, el primer casete de expresión comprende dos secuencias de nucleótidos que codifican una proteína Rep parvoviral, es decir, una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos. Preferiblemente, la diferencia en la primera y la segunda secuencia de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos comunes de una proteína Rep parvoviral se maximiza (es decir, se minimiza la identidad de nucleótidos) mediante una o más de las siguientes opciones: a) cambiando el sesgo del uso de codones de la primera secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos comunes de Rep parvoviral; b) cambiando el sesgo del uso de codones de la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos común de Rep parvoviral; c) cambiando el contenido de GC de la primera secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos común; y d) cambiando el contenido de GC de la segunda secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos común. La optimización de codones se puede realizar sobre la base del uso de codones de la célula de insecto usada en el método de la invención, preferiblemente Spodoptera frugiperda, tal como puede verse en una base de datos de uso de codones (véase, por ejemplo, http://www.kazusa.or.jp/codon/). Los programas informáticos adecuados para la optimización de codones están disponibles para los expertos (véase, p. ej., Jayaraj et al., 2005, Nucl. Acids Res. 33(9):3011-3016; y en internet). Alternativamente, las optimizaciones se pueden hacer a mano, utilizando la misma base de datos de uso de codones.

[0058] Una secuencia de nucleótidos del primer casete de expresión que codifica una proteína Rep52 parvoviral puede definirse como una secuencia de nucleótidos:

a) que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.° 6

b) que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEC ID N.° 1 - 5;

c) cuya cadena complementaria se hibrida con una secuencia de moléculas de ácidos nucleicos de (a) o (b); d) secuencias de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácidos nucleicos de (c) debido a la degeneración del código genético.

[0059] Una secuencia de nucleótidos del primer casete de expresión que codifica una proteína Rep78 parvoviral puede definirse como una secuencia de nucleótidos:

a) que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.° 8

b) que tiene al menos un 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las posiciones 11 - 1876 de la SEC ID N.° 7

1.

Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos codifica proteínas Rep de parvovirus que son necesarias y suficientes para la producción de vectores parvovirales en células de insectos.

[0060] La eliminación de posibles sitios de iniciación de la traducción falsos en las secuencias codificantes de la proteína Rep, distintos de los sitios de iniciación de la traducción Rep78 y Rep52 de otros parvovirus será bien comprendida por un experto en la técnica, al igual que la eliminación de los sitios de empalme putativos que puede reconocerse en células de insecto.

[0061] En una realización preferida, el codón de iniciación para la traducción de la proteína Rep78 parvoviral es un codón de iniciación subóptimo. El codón de iniciación subóptimo preferiblemente es un codón de iniciación que efectúa la omisión parcial de exón. La omisión parcial de exón se entiende en el presente documento como que al menos una parte de los ribosomas no inician la traducción en el codón de iniciación subóptimo de la proteína Rep78 sino en un codón de iniciación aguas abajo, siendo preferiblemente el codón de iniciación aguas abajo el codón de iniciación de la proteína Rep52. El codón de iniciación subóptimo realiza preferentemente una omisión parcial de exón tras la expresión de la secuencia de nucleótidos en una célula de insecto. Preferiblemente, el codón de iniciación subóptimo efectúa la omisión parcial de exón en una célula de insecto para producir en la célula de insecto una relación molar de Rep78 con respecto a Rep52 en el rango de 1:10 a 10:1, 1:5 a 5:1, o 1:3 a 3:1, preferiblemente aproximadamente 20 - 40 horas después de la infección, más preferiblemente aproximadamente 30 - 40 horas después de la infección, usando una expresión de baculovirus. La relación molar de Rep78 y Rep52 puede determinarse mediante transferencia Western, preferiblemente usando un anticuerpo monoclonal que reconozca un epítopo común de Rep78 y de Rep52, o usando p. ej., un anticuerpo anti-Rep de ratón (303.9, Progen, Alemania; dilución 1:50).

[0062] El término "codón de iniciación subóptimo" en el presente documento no solo se refiere al propio codón de iniciación de trinucleótido sino también a su contexto. Por lo tanto, un codón de iniciación subóptimo puede consistir en un codón ATG "óptimo" en un contexto subóptimo, p. ej., un contexto no Kozak. Sin embargo, son más preferidos los codones de iniciación subóptimos en los que el propio codón de iniciación de trinucleótido es subóptimo, es decir, no es ATG. Se entiende en el presente documento que subóptimo significa que el codón es menos eficaz en la iniciación de la traducción en un contexto por lo demás idéntico en comparación con el codón ATG normal. Preferiblemente, la eficacia del codón subóptimo es inferior al 90, 80, 60, 40 o 20 % de la eficacia del codón ATG normal en un contexto por lo demás idéntico. Los métodos para comparar la eficacia relativa de la iniciación de la traducción son conocidos per se por el experto en la materia. Los codones de iniciación subóptimos preferidos pueden seleccionarse entre ACG, TTG, CTG y GTG. El más preferido es ACG. Una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep de parvovirus, se entiende en el presente documento como una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas Rep no estructurales que son necesarias y suficientes para la producción de vectores parvovirales en células de insectos tales como las proteínas Rep78 y Rep52.

[0063] También es posible reemplazar otros ATG en la secuencia con un codón diferente que codifique metionina de modo que haya menos posibilidad de iniciar la traducción desde dichos ATG.

[0064] Se logran diversas modificaciones de la secuencia codificante de nucleótidos tal como se ha definido anteriormente, que incluyen, p. ej., las secuencias de parvovirus de tipo salvaje, para la adecuada expresión en células de insecto mediante la aplicación de técnicas de ingeniería genética bien conocidas, tales como las descritas, p. ej., en Sambrook y Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3.a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. El experto en la materia conoce varias modificaciones adicionales de las regiones codificantes que podrían aumentar el rendimiento de las proteínas codificantes. Estas modificaciones están dentro del alcance de la presente invención.

[0065] Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la cápside parvoviral (Cap) se entiende en el presente documento que comprende secuencias de nucleótidos que codifican una o varias de las tres proteínas de la cápside parvoviral, VP1, -2 y -3. La secuencia de nucleótidos del parvovirus es preferiblemente de un dependovirus, más preferiblemente de un virus adenoasociado (AAV) humano o de simio y lo más preferiblemente de un AAV que normalmente infecta a humanos (p. ej., serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5, y 6) o primates (p. ej., serotipos 1 y 4). Se proporcionan ejemplos de una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas de la cápside de parvovirus en las SEC ID N.° 20, 22 y 24.

[0066] En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos de (iii) comprende un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Las secuencias codificantes de la proteína de la cápside pueden estar presentes en varias formas. P. ej., pueden usarse secuencias de codificación separadas para cada una de las proteínas de la cápside VP1, -2 y -3, por lo que cada secuencia codificante está operativamente enlazada a secuencias de control de la expresión para la expresión en una célula de insecto. Más preferiblemente, sin embargo, el segundo casete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un único marco de lectura abierto que codifica las tres proteínas de la cápside parvoviral (AAV) VP1, VP2 y VP3, donde el codón de iniciación para la traducción de la proteína de la cápside VP1 es un codón de iniciación subóptimo que no es ATG tal como se describe, p. ej., en Urabe et al. (2002, supra) y en WO2007/046703. Un codón de iniciación subóptimo para la proteína de la cápside VP1 puede ser como se ha definido anteriormente para la proteína Rep78. Los codones de iniciación subóptimos de mayor preferencia para la proteína de la cápside de VP1 se pueden seleccionar entre ACG, TTG, CTG y GTG, de los cuales CTG y GTG son los preferidos. La secuencia de nucleótidos comprendida en el segundo casete de expresión para la expresión de las proteínas de la cápside puede comprender además una o varias modificaciones tal como se describe en WO2007/046703. El experto en la materia conoce varias modificaciones adicionales de las regiones codificantes de VP que podrían aumentar el rendimiento de VP y el virión o tener otros efectos deseados, como alterar el tropismo o reducir la antigenicidad del virión. Estas modificaciones están dentro del alcance de la presente invención.

[0067] En una realización preferida, la expresión de VP1 aumenta en comparación con la expresión de VP2 y VP3. La expresión de VP1 puede incrementarse mediante la suplementación de VP1, introduciendo en la célula de insecto un solo vector que comprende secuencias de nucleótidos para VP1 tal como se ha descrito en WO 2007/084773.

[0068] En el contexto de la invención, "al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral" se entiende como una secuencia palindrómica, que comprende secuencias dispuestas simétricamente, en su mayoría complementarias, también denominadas regiones "A", "B" y "C". La ITR funciona como un origen de replicación, un sitio que tiene un papel "cis" en la replicación, es decir, es un sitio de reconocimiento para las proteínas de replicación que actúan en trans, como p. ej., Rep 78 (o Rep68) que reconocen el palíndromo y secuencias específicas internas al palíndromo. Una excepción a la simetría de la secuencia ITR es la región "D" de la ITR. Es única (no tiene un complemento dentro de una ITR). El corte del ADN monocatenario se produce en la unión entre las regiones A y D. Es la región donde se inicia la síntesis de ADN nuevo. La región D normalmente se encuentra a un lado del palíndromo y proporciona direccionalidad al paso de replicación del ácido nucleico. Un parvovirus que se replica en una célula de mamífero normalmente tiene dos secuencias ITR. Sin embargo, es posible diseñar una ITR de modo que los sitios de unión en ambas cadenas de las regiones A y las regiones D estén ubicadas simétricamente, una a cada lado del palíndromo. En una plantilla de ADN circular bicatenario (p. ej., un plásmido), la replicación del ácido nucleico asistida por Rep78 o Rep68 procede en ambas direcciones y una única ITR es suficiente para la replicación parvoviral de un vector circular. Por lo tanto, se puede usar una secuencia de nucleótidos de ITR en el contexto de la presente invención. Preferiblemente, sin embargo, se utilizan dos u otro número par de ITR regulares. Más preferiblemente, se usan dos secuencias ITR. Una ITR parvoviral preferida es una ITR de AAV. Por razones de seguridad, puede ser deseable construir un vector parvoviral recombinante (rAAV) que no pueda seguir propagándose después de la introducción inicial en una célula en presencia de un segundo AAV. Dicho mecanismo de seguridad para limitar la propagación de vectores no deseados en un receptor puede proporcionarse mediante el uso de rAAV con una ITR quimérica como se describe en US2003148506.

[0069] El término "flanqueado" con respecto a una secuencia que está flanqueada por otro(s) elemento(s) en el presente documento indica la presencia de uno o varios de los elementos flanqueantes aguas arriba y/o aguas abajo, es decir, 5' y/o 3', en relación con la secuencia. El término "flanqueado" no pretende indicar que las secuencias son necesariamente contiguas. Por ejemplo, puede haber secuencias intermedias entre el ácido nucleico que codifica el transgén y un elemento flanqueante. Una secuencia que está "flanqueada" por otros dos elementos (por ejemplo, secuencias ITR), indica que un elemento está ubicado en 5' respecto de la secuencia y el otro está ubicado en 3' respecto de la secuencia; sin embargo, puede haber secuencias intermedias entre ellos. En una realización preferida, una secuencia de nucleótidos de (i) está flanqueada a cada lado por secuencias de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral.

[0070] En las realizaciones de la invención, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén (que codifica un producto génico de interés) que está flanqueada por al menos una secuencia ITR parvoviral, preferiblemente se incorpora al genoma de un vector parvoviral recombinante (rAAV) producido en la célula de insecto. . Preferiblemente, el transgén codifica un producto génico de interés para la expresión en una célula de mamífero. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén está flanqueada por dos secuencias de nucleótidos ITR parvovirales (AAV) y en donde el transgén está ubicado entre las dos secuencias de nucleótidos ITR parvovirales (AAV). Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés (para la expresión en la célula de mamífero) se incorporará al vector parvoviral recombinante (rAAV) producido en la célula de insecto si está ubicado entre dos ITR regulares, o si está ubicado a ambos lados de una ITR diseñada con dos regiones D.

[0071] Las secuencias de AAV que pueden usarse en la presente invención para la producción de un virión de AAV recombinante en células de insectos pueden derivarse del genoma de cualquier serotipo de AAV. Generalmente, los serotipos de AAV tienen secuencias genómicas de homología significativa a nivel de aminoácidos y ácidos nucleicos, proporcionan un conjunto idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente física y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan mediante mecanismos prácticamente idénticos. Para conocer la secuencia genómica de los diversos serotipos de AAV y una descripción general de las similitudes genómicas, véase, p. ej., número de acceso de GenBank U89790; número de acceso de GenBank J01901; número de acceso de GenBank AF043303; Número de acceso de GenBank AF085716; Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir. 45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J. Vir. 72:309-319); y Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Los serotipos 1,2, 3, 4 y 5 de AAV son la fuente preferida de secuencias de nucleótidos de AAV para el uso en el contexto de la presente invención. Preferiblemente, las secuencias ITR de AAV para su uso en el contexto de la presente invención se derivan de AAV1, AAV2 y/o AAV4. Asimismo, las secuencias codificantes de Rep (Rep78/68 y Rep52/40) se derivan preferentemente de AAV1, AAV2 y/o AAV4. Sin embargo, las secuencias que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 para su uso en el contexto de la presente invención pueden tomarse de cualquiera de los 42 serotipos conocidos, más preferiblemente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o partículas similares a AAV recientemente desarrolladas obtenidas, p. ej., mediante técnicas de barajado de cápside y bibliotecas de cápside de AAV, o de ITR recientemente diseñadas, desarrolladas o evolucionadas.

[0072] Las secuencias Rep e ITR de AAV se conservan particularmente entre la mayoría de los serotipos. Las proteínas Rep78 de varios serotipos de AAV son, p. ej., son idénticas en más de un 89 % y la identidad total de la secuencia de nucleótidos a nivel del genoma entre AAV2, AAV3A, AAV3B y AAV6 es de alrededor del 82 % (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947). Además, se sabe que las secuencias Rep y las ITR de muchos serotipos de AAV complementan con eficiencia de forma cruzada (es decir, sustituyen funcionalmente) las secuencias correspondientes de otros serotipos en la producción de partículas de AAV en células de mamífero. EE. UU. 2003148506 informa de que las secuencias AAV Rep e ITR también complementan con eficiencia de manera cruzada otras secuencias AAV Rep e ITR en células de insectos.

[0073] Se sabe que las proteínas VP de AAV determinan la tropicidad celular del virión de AAV. Las secuencias que codifican la proteína VP están significativamente menos conservadas que las proteínas y los genes Rep entre los diferentes serotipos de AAV. La capacidad de las secuencias Rep e ITR para complementar de forma cruzada las secuencias correspondientes de otros serotipos permite la producción de partículas de rAAV pseudotipadas que comprenden las proteínas de la cápside de un serotipo (por ejemplo, AAV3) y las secuencias Rep y/o ITR de otro serotipo de AAV (por ejemplo, AAV2). Dichas partículas de rAAV pseudotipadas son parte de la presente invención.

[0074] Las secuencias "AAV" modificadas también se pueden usar en el contexto de la presente invención, p. ej., para la producción de vectores rAAV en células de insectos. Dichas secuencias modificadas incluyen, p. ej., secuencias que tienen al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos alrededor del 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o más de identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos (por ejemplo, una secuencia que tiene aproximadamente un 75-99 % de identidad de secuencia de nucleótidos) con una ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9, Rep o VP se pueden usar en lugar de secuencias de tipo salvaje ITR de AAV, Rep o VP.

[0075] Aunque es similar a otros serotipos de AAV en muchos aspectos, AAV5 difiere de otros serotipos de AAV humanos y simios más que otros serotipos humanos y simios conocidos. En vista de ello, la producción de rAAV5 puede diferir de la producción de otros serotipos en células de insecto. Cuando se emplean métodos de la invención para producir rAAV5, se prefiere que uno o varios constructos que comprendan, colectivamente en el caso de más de un constructo, una secuencia de nucleótidos que comprenda una ITR de AAV5, una secuencia de nucleótidos comprende una secuencia codificante de Rep de AAV5 (es decir, una secuencia de nucleótidos comprende una Rep78 de AAV5). Dichas secuencias ITR y Rep pueden modificarse según se desee para obtener una producción eficaz de vectores rAAV5 o rAAV5 seudotipados en células de insecto. Por ejemplo, el codón de inicio de las secuencias de Rep se puede modificar, los sitios de empalme de VP se pueden modificar o eliminar y/o el codón de inicio de VP1 y los nucleótidos cercanos se pueden modificar para mejorar la producción de vectores rAAV5 en la célula de insecto.

[0076] La secuencia de nucleótidos que comprende el transgén como se ha definido anteriormente en el presente documento puede comprender, por lo tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica al menos un "producto génico de interés" para la expresión en una célula de mamífero, ubicada de manera que se incorporará en un vector parvoviral recombinante (rAAV) replicado en la célula de insecto. En el contexto de la invención se entiende que una célula de mamífero particularmente preferida en la que se va a expresar el "producto génico de interés" es una célula humana. Puede incorporarse cualquier secuencia de nucleótidos para expresión posterior en una célula de mamífero transfectada con el vector parvoviral recombinante (rAAV) producido de acuerdo con la presente invención. La secuencia de nucleótidos puede, p. ej., codificar una proteína, que puede expresar un agente de ARNi, es decir, una molécula de ARN que es capaz de interferir con el ARN, como p. ej., un ARNhc (ARN de horquilla corta) o un ARNpi (ARN pequeño de interferencia). "ARNpi" significa ARN pequeño de interferencia que es un ARN de doble cadena de longitud corta que no es tóxico en las células de mamíferos (Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98; Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 98: 9742-47). En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén puede comprender dos secuencias de nucleótidos codificantes, cada una de las cuales codifica un producto génico de interés para la expresión en una célula de mamífero. Cada una de las dos secuencias de nucleótidos que codifican un producto de interés se ubica de manera que se incorporará en un vector parvoviral recombinante (rAAV) replicado en la célula de insecto.

[0077] El producto de interés para la expresión en una célula de mamífero puede ser un producto génico terapéutico. Un producto génico terapéutico puede ser un polipéptido, una molécula de ARN (ARNpi) u otro producto génico que, cuando se expresa en una célula diana, proporciona un efecto terapéutico deseado, como p. ej., ablación de una actividad no deseada, p. ej., la ablación de una célula infectada, o la complementación de un defecto genético, p. ej., causando una deficiencia en una actividad enzimática. Los ejemplos de productos génicos de polipéptidos terapéuticos incluyen CFTR, Factor IX, lipoproteína lipasa (LPL, preferiblemente LPL S447X; véase WO 01/00220), apolipoproteína A1, uridina difosfato glucuronosiltransferasa (UGT), proteína que interactúa con el regulador de la GTPasa de la retinosis pigmentaria (RP-GRIP) y citoquinas o interleucinas como p. IL-10, porfobilinógeno desaminasa (PBGD), un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF) y alanina:glioxilato aminotransferasa (AGT).

[0078] Alternativamente, o adicionalmente como otro producto génico, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén como se ha definido en el presente documento anteriormente puede comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que sirve como proteína marcadora para evaluar la transformación y la expresión celulares. Proteínas marcadoras adecuadas para este fin son, p. ej., la proteína fluorescente GFP y los genes marcadores seleccionables HSV timidina quinasa (para selección en medio HAT), la higromicina B fosfotransferasa bacteriana (para selección en higromicina B), la aminoglucósido fosfotransferasa Tn5 (para selección en G418) y la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para selección en metotrexato), CD20, el gen del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad. Las fuentes para obtener estos genes marcadores y los métodos para su uso se proporcionan en Sambrook y Russel, supra. Además, la secuencia de nucleótidos que comprende el transgén como se ha definido anteriormente en el presente documento puede comprender una secuencia de nucleótidos adicional que codifica un polipéptido que puede servir como mecanismo a prueba de fallos que permite curar a un sujeto a partir de células transducidas con el vector parvoviral recombinante (rAAV) de la invención, si se considera necesario. Dicha secuencia de nucleótidos, a menudo denominada gen suicida, codifica una proteína que es capaz de convertir un profármaco en una sustancia tóxica que es capaz de destruir las células transgénicas en las que se expresa la proteína. Los ejemplos adecuados de dichos genes suicidas incluyen p. ej., el gen de la citosina desaminasa de E. coli o uno de los genes de la timidina quinasa del virus del herpes simple, el citomegalovirus y el virus de la varicela-zoster, en cuyo caso se puede usar ganciclovir como profárma

Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 844-849).

[0079] En otra realización, uno de los productos génicos de interés puede ser una proteína AAV. En particular, una proteína Rep, por ejemplo, Rep78 o Rep68, o un fragmento funcional de las mismas. Una secuencia de nucleótidos que codifica un Rep78 y/o un Rep68, si está presente en el genoma de un vector parvoviral recombinante (rAAV) de la invención y se expresa en una célula de mamífero transducida con el vector, permite la integración del vector parvoviral recombinante (rAAV) en el genoma de la célula de mamífero transducida. La expresión de Rep78 y/o Rep68 en una célula de mamífero transducida o infectada con rAAV puede proporcionar una ventaja para ciertos usos del vector parvoviral recombinante (rAAV), al permitir la expresión a largo plazo o permanente de cualquier otro producto génico de interés introducido en la célula por el vector.

[0080] En los vectores de parvovirus recombinantes (rAAV) de la invención, la secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico de interés para la expresión en una célula de mamífero, preferiblemente está operativamente enlazada a al menos una secuencia de control de expresión compatible con células de mamífero, por ejemplo, un promotor. Muchos de estos promotores son conocidos en la técnica (ver Sambrook y Russel, 2001, supra). Pueden usarse promotores constitutivos que se expresan ampliamente en muchos tipos de células, como el promotor CMV. Sin embargo, se preferirán más los promotores que sean inducibles, específicos de tejido, específicos de tipo celular o específicos de ciclo celular. Por ejemplo, para la expresión específica del hígado, un promotor puede seleccionarse entre un promotor de a1-antitripsina (a At ), un promotor de globulina fijadora de hormona tiroidea, un promotor de albúmina, un promotor de LPS (globulina fijadora de tiroxina), un promotor híbrido ApoCII, un promotor híbrido HCR-hAAT, un promotor AAT combinado con el elemento potenciador del gen de la albúmina de ratón (Ealb) y un promotor de la apolipoproteína E. Otros ejemplos incluyen el promotor E2F para la expresión selectiva de tumores y, en particular, la expresión selectiva de tumores de células neurológicas (Parr et al., 1997, Nat. Med. 3:1145-9) o el promotor de IL-2 para uso en células sanguíneas mononucleares (Hagenbaugh et al., 1997, J Exp Med; 185: 2101-10).

[0081] El AAV es capaz de infectar varias células de mamíferos. Véase, por ejemplo, Tratschin et al. (1985, Mol. Cell Biol. 5:3251-3260) y Grimm et al. (1999, Hum. Gene Ther. 10:2445-2450). Sin embargo, la transducción de AAV de fibroblastos sinoviales humanos es significativamente más eficiente que en células murinas similares, Jennings et al., Arthritis Res, 3:1 (2001), y la tropicidad celular de AAV difiere entre los serotipos. Véase, por ejemplo, Davidson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 97: 3428-3432), que discuten las diferencias entre Aa v 2, AAV4 y AAV5 con respecto al tropismo de células del SNC de mamíferos y la eficiencia de transducción. En una realización preferida, una célula huésped de la invención es cualquier célula de mamífero que puede ser infectada por un virión parvoviral, por ejemplo, entre otras, una célula muscular, una célula hepática, una célula nerviosa, una célula glial y una célula epitelial. En una realización preferida, una célula huésped de la invención es una célula humana.

[0082] Preferiblemente, en el constructo, la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Rep parvoviral y/o una proteína de la cápside parvoviral está operativamente enlazada a las secuencias de control de la expresión para la expresión en una célula de insecto. Estas secuencias de control de la expresión incluirán al menos un promotor que sea activo en células de insectos. Las técnicas conocidas por los expertos en la técnica para expresar genes foráneos en células huésped de insectos se pueden utilizar para poner en práctica la invención. La metodología para la ingeniería molecular y la expresión de polipéptidos en células de insectos se describe, por ejemplo, en Summers y Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. N.° 7555, College Station, Texas; Luckow.

1991. En Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. y R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, Reino Unido; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York; W. H. Freeman y Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volumen 39; EE. UU. 4.745.051; EE. UU. 2003148506; y WO 03/074714. Los promotores adecuados para la transcripción de las secuencias de nucleótidos comprendidas en los constructos primero y segundo de la invención incluyen, p. ej., los promotores poliedro (PolH), p10, p35, IE-1 o AIE-1 y otros promotores descritos en las referencias anteriores.

[0083] El constructo de ácidos nucleicos que comprende al menos el primer y/o segundo casete de expresión, puede comprender además una secuencia de control de expresión que comprende una secuencia de nueve nucleótidos de la SEC. ID N.°: 9 o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a la SEC. ID N.°: 9, corriente arriba del codón de iniciación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Rep parvoviral y/o del codón de iniciación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápside VP1 parvoviral. Una secuencia con identidad sustancial con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID N.°: 9 y que ayudará a aumentar la expresión de la proteína Rep parvoviral es, p. ej., una secuencia que tiene al menos un 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de identidad con la secuencia de nueve nucleótidos de la SEC ID N.°: 9.

[0084] La célula de insecto puede ser cualquier célula que sea adecuada para la producción de proteínas heterólogas. Preferiblemente, la célula de insecto permite la replicación de vectores baculovirales y puede mantenerse en cultivo. Más preferiblemente, la célula de insecto también permite la replicación de vectores parvovirales recombinantes, incluidos los vectores rAAV. Por ejemplo, la línea celular utilizada puede ser de las líneas celulares de Spodoptera frugiperda, Drosophila, o líneas celulares de mosquito, por ejemplo, líneas celulares derivadas de Aedes albopictus. Las células o líneas celulares de insectos preferidas son células de las especies de insectos que son susceptibles a la infección por baculovirus, incluidas, p. ej., S2 (CRL-1963, ATCC), Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, EE. UU.) y expresSF+® (EE. UU. 6.103.526; Protein Sciences Corp., CT, EE. UU.). Una célula de insecto preferida según la invención es una célula de insecto para la producción de vectores parvovirales recombinantes.

[0085] El constructo o constructos de ácidos nucleicos del método de la invención pueden integrarse de forma estable en el genoma de la célula de insecto. Un experto normal en la técnica sabe cómo introducir de forma estable una secuencia de nucleótidos en el genoma de un insecto y cómo identificar una célula que tiene dicha secuencia de nucleótidos en el genoma. La incorporación en el genoma puede ayudarse, por ejemplo, del uso de un vector que comprenda secuencias de nucleótidos altamente homólogas a las regiones del genoma del insecto. El uso de secuencias específicas, como los transposones, es otra forma de introducir una secuencia de nucleótidos en un genoma.

[0086] Las condiciones de crecimiento para células de insecto en cultivo y la producción de productos heterólogos en células de insecto en cultivo son bien conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en las referencias citadas anteriormente sobre ingeniería molecular de células de insectos (ver también WO2007/046703).

[0087] En una realización preferida del método de la invención, se recupera el virión parvoviral recombinante. La recuperación comprende preferentemente la etapa de purificación por afinidad de (viriones que comprenden) el vector parvoviral recombinante (rAAV) usando un anticuerpo anti-AAV, preferentemente un anticuerpo inmovilizado. El anticuerpo anti-AAV es preferentemente un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo particularmente adecuado es un anticuerpo de camélido de cadena sencilla o un fragmento del mismo como, p. ej., el que se puede obtener de camellos o llamas (ver p. ej., Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302). El anticuerpo para la purificación por afinidad de rAAV preferiblemente es un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo en una proteína de la cápside de AAV, siendo preferiblemente el epítopo un epítopo que está presente en la proteína de la cápside de más de un serotipo de AAV. Por ejemplo, el anticuerpo puede generarse o seleccionarse sobre la base de la unión específica a la cápside de Aa v 2 pero, al mismo tiempo, también puede unirse específicamente a las cápsides de AAV1, AAV3 y AAV5.

[0088] En un segundo aspecto, la invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende uno o más casetes de expresión de la invención tal como se ha definido anteriormente en el presente documento. En una realización preferida, el constructo de ácidos nucleicos de la invención comprende un primer y un segundo casete de expresión de la invención y, opcionalmente, una secuencia de ácidos nucleicos de (i). Preferiblemente, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor PolH o un promotor 4xHsp27 EcRE+Hsp70 mínimo. Más preferiblemente, el primer promotor está operativamente enlazado con un potenciador, preferiblemente un potenciador HR1. En otra realización, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor 4xHsp27 EcRE+Hsp70 mínimo y el segundo promotor es un promotor PolH. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor p10, deltaE1 o E1. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o E1. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o E1. En otra realización más, el primer promotor en el constructo de ácidos nucleicos de la invención es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor PolH. En realizaciones adicionales, cualquier otra combinación del primer promotor y el segundo promotor son parte de la invención. El primer promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en un promotor PolH, un promotor p10, un promotor de proteína básica, un promotor inducible o un promotor deltaE1 o un promotor E1, o cualquier otro promotor génico de baculovirus tardío o muy tardío. El segundo promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en un promotor PolH, un promotor p10, un promotor de proteína básica, un promotor inducible o un promotor deltaE1 o un promotor E1, o cualquier otro promotor génico de baculovirus tardío o muy tardío. Más preferiblemente, el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor PolH, un promotor p10 o un promotor de proteína básica y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un promotor E1, o cualquier otro promotor génico de baculovirus temprano o tardío.

[0089] En una realización preferida, el primer casete de expresión comprendido en el constructo de ácidos nucleicos de la invención comprende un elemento potenciador tal como se ha definido anteriormente.

[0090] En un tercer aspecto, la invención se refiere a una célula de insecto tal como se ha definido anteriormente.

[0091] En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende (a) un constructo de ácidos nucleicos que comprende el primer y segundo casete de expresión tal como se ha definido anteriormente; y (b) un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio de clonación múltiple para un transgén que está flanqueado por al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral, cuyo transgén está operativamente enlazado a un promotor capaz de impulsar la expresión del transgén en una célula huésped.

[0092] En una realización preferida, el constructo de ácidos nucleicos (b) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un transgén que está flanqueado por al menos una secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral, cuyo transgén está operativamente enlazado a un promotor capaz de impulsar la expresión del transgén en una célula huésped.

[0093] El kit puede comprender además células de insecto y una secuencia de ácidos nucleicos que codifica funciones auxiliares de baculovirus para la expresión en la célula de insecto.

[0094] En otro aspecto, la invención se refiere a un lote de viriones parvovirales producidos en los métodos de la invención descritos anteriormente. Un "lote de viriones parvovirales" se define en el presente documento como todos los viriones parvovirales que se producen en la misma ronda de producción, opcionalmente por contenedor de células de insecto. En una realización preferida, el lote de viriones parvovirales de la invención comprende una relación virión lleno:virión total como se ha descrito anteriormente y/o una relación virión lleno:vacío como se ha descrito anteriormente.

[0095] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo «comprender» y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitante para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento mediante los artículos indefinidos "un" o "uno" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto claramente requiera que haya uno y solo uno de los elementos. De este modo, los artículos indefinidos «un» o «una» significan generalmente «al menos uno».

[0096] Los siguientes ejemplos ilustran la invención:

Ejemplos

Ejemplo 1

1.1 Materiales y métodos

1.1.1 Generación de baculovirus recombinantes

[0097] Se generaron los siguientes constructos:

1.1.1.1 Construcción de pVD118 (nuevo)

[0098] El pVD118 (nuevo) es un vector de control que comprende un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de Rep78 bajo el control del promotor p10 y un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de los genes Cap bajo el control del promotor poliedro (PolH o pPH). El pVD118 (nuevo) se construyó como se muestra en la figura 1. Antes de que pudiera fabricarse el plásmido final pVD118 (nuevo), se construyeron los predecesores pFastBac Dual Rep78/ACG y pVD118 (lote n.° 1). En resumen, el plásmido REP-ACG/PSC (solicitud de patente WO2007148971; también denominado en el presente documento pVD88) pVD88 fue digerido con SpeI* Xbal y los extremos salientes 5' se hicieron romos. El fragmento de 2057 bp se aisló de un gel de agarosa, se purificó y se ligó en pFastBac Dual linealizado con Smal (Invitrogen), dando como resultado pFastBac Dual Rep78/ACG. Posteriormente, este plásmido se digirió con BstZ17I y SnaBI y el fragmento p10_Rep78/ACG de 2537 bp se aisló y se ligó en el pVD84 linealizado con BstZ17I, generando pVD118 (lote n.° 1). Sin embargo, la orientación del casete de expresión Rep78/ACG era incorrecta y, por lo tanto, se eliminó realizando una digestión con NheI.* Blpl. Después de hacer romos los salientes 5', el fragmento de vector de 12431 bp se aisló y purificó del gel. Posteriormente, el fragmento purificado de 2057 bp de REP-ACG/PSC se ligó en el vector y la mezcla de transformación se transformó en células TOP10 químicamente competentes (Invitrogen) y se sembró en placas que contenían ampicilina. Se realizó un análisis de restricciones con NaebSacI en ADN aislado de cultivos miniprep. Los clones correctos dan fragmentos con un tamaño de 2204 bp y 12292 bp.

1.1.1.2 Construcción de pVD118 (nuevo) HR1

[0099] El pVD118 (nuevo) HR1 es el mismo que el pVD118, con la adición de un potenciador hr1 que se encuentra entre los promotores p10 y poliedro y se construyó como se muestra en la figura 2. En resumen, una PCR realizada en el ADN viral de AcMNPV (Protein Sciences Corporation, Meriden, EE. UU.) con los cebadores HR1-Fw 5'-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3' (SEC ID N.°: 10) y HRl-Rv 5'-gtatacgramoatcgattattgctccaatactag-3' (SEC ID N.°: 11) dio como resultado un producto de 904 bp que se clonó en el vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BstZ17I, el fragmento de 898 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD118 (nuevo) que se abrió con BstZ17I y se desfosforiló. El control de las digestiones de los clones correctos con SpebEcoNI dio como resultado fragmentos de 1269 bp y 14125 bp.

1.1.1.3 Construcción de pVD84 (+p10 Rep) (=pVD165)

[0100] El pVD165 es un vector de control que comprende un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de Rep78 donde el codón de inicio se ha mutado en ACG bajo el control del promotor p10 y un casete de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de los genes Cap bajo el control del promotor PolH. Los casetes de expresión están en dirección opuesta en el plásmido. El pVD165 se construyó como se muestra en la figura 3. En resumen, se realizó una PCR en pVD118 (nuevo) con los cebadores poliA Fw 5'-agatct gtagtggctatggcagggc-3' (SEC ID N.°: 12) y p10 Rv 5'-agatct ccgggg acggacctttaattcaacccaac-3' (SEC ID N.°: 13) dio como resultado un producto de 2566 bp que se clonó en el vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BglII, el fragmento de 2541 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD84 que se abrió con BglII y se desfosforiló. El control de las digestiones de los clones correctos con SpebXbaI dio como resultado fragmentos de 1269 bp y 11810 bp.

1.1.1.4 Construcción de pVD165 HR1

[0101] El pVD165 HR1 es el mismo que el pVD165, con la adición de un potenciador hr1 detrás del promotor p10 y se construyó como se muestra en la figura 4. En resumen, una PCR realizada en el ADN viral de AcMNPV con los cebadores HR1-Fw 5'-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3' (SEC ID N.°: 10) y HR1-Rv 5'-gtatacgramoatcgattattgctccaatactag-3' (SEC ID N.°: 11) dio como resultado un producto de 904 bp que se clonó en el vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BstZ17I, el fragmento de 898 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD165 que se abrió con SmaI y se desfosforiló. Las digestiones de control de los clones correctos con ClaI dieron como resultado fragmentos de 875 bp, 1184 bp, 4160 bp y 9180 bp.

1.1.1.5 Construcción de pVD165 con un promotor inducible aguas arriba de CAP (pVD165 4xEcRE CAP) [0102] El pVD165 4xEcRE CAP es similar al pVD165, pero comprende un promotor inducible en lugar del promotor poliedro (pPH). El pVD165 4xEcRE CAP se construyó como se muestra en la figura 5. En resumen, el promotor inducible, que comprende 4 EcRE consecutivos, un promotor hsp70 mínimo (Poels et al. Insect Biochem Mol Biol 2004, 34(5):451-458) y parte de la secuencia codificante de CAP, se sintetizó y se ligó en pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BstZ17I y EcoNI, el fragmento de 375 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD165 que se abrió con BstZ17I y EcoNI. El control de las digestiones de los clones correctos con PmebEcoRV dio como resultado fragmentos de 2554 bp y 12116 bp.

1.1.1.6 Construcción de pVD165 con un promotor inducible aguas arriba de Rep (pVD165 4*EcRE Rep78-52)

[0103] El pVD165 4*EcRE Rep78 es similar al pVD165, pero comprende un promotor inducible en lugar del promotor p10. El pVD165 4*EcRE Rep78 se construyó como se muestra en la figura 6. En resumen, el promotor inducible que consiste en 4 EcRE consecutivos y un promotor hsp70 mínimo se sintetizó y se ligó en pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BstZ17I y SpeI, el fragmento de 290 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD165 que se abrió con SmaI y SpeI. El control de las digestiones de los clones correctos con SpebBglII dio como resultado fragmentos de 298 bp, 2376 bp y 11954 bp.

1.1.1.7 Construcción del constructo pVD190 (deltaIE1 Cap pPolic Rep)

[0104] El DeltaIE1 Cap pPolh Rep es similar al pVD165, pero comprende un promotor delta IE1 en lugar del promotor pPH y un promotor pPolH en lugar del promotor p10. El DeltaIE1 Cap pPolh Rep se construyó como se muestra en las figuras 7 y 8. Para ello, se construyó un vector precursor de la siguiente manera. Una PCR realizada en pFBDSLR (Urabe et al. Human gene therapy 2002;13(16):1935-1943) con los cebadores BstZ17I-deltaIE1 Fw: 5'-ggtcc gtatacgacgataacgccgttggtggcg-3' (SEC ID N.°: 14) y AflII-delta IE1 Rv: 5'-cgacttaagacggcgaattctgc agatggc-3' (SEC ID N.°: 15) dio como resultado un producto de 181 bp que se clonó en el vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BstZ17I*AflII, el fragmento de 165 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD165 4xEcRE CAP que se abrió con BstZ17I y AflII. El plásmido resultante es pVD165 deltaIE1 CAP y el control de digestión con BstZ17I*AflII debería dar como resultado fragmentos de 165 bp y 14374 bp. Posteriormente, el promotor de poliedrina se clonó frente al casete de expresión de Rep en pVD165 deltaIE1 CAP. A este fin, se realizó una PCR con los cebadores Smal-pPolh Fw: 5'-tctcccgggagatcatggaga taattaaaatgataac-3' (SEC ID N.°: 16) y Spel-pPolh Rv: 5'- gttactuargagctcgtcgac-3' (SEC ID N.°: 17) en el pVD88. Esto generó un producto de PCR de 198 bp que se clonó en el vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con SpebSmaII, el fragmento de 188 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el vector pVD165 deltaIE1_Cap que se abrió con SpeI y SmaI. Finalmente, esto dio como resultado la construcción pVD165 deltaIE1 CAP.

1.1.1.8 Construcción del constructo p10-Cap-pPolh-Rep

[0105] El constructo p10_Cap pPolh_Rep es similar al constructo delta-IE1-Cap-pPolh-Rep, pero comprende un promotor p10 en lugar del promotor delta-IE1 frente al casete de expresión Cap y se construyó como se muestra en la figura 9. Una PCR realizada en pFastBac Dual con los cebadores BstZ17I-p10 Fw: 5'-agtatacggacctttaattcaac-3' (SEC ID N.°: 18) y AflII-p10 Rv: 5'-cgacttaagagcgggccgctttcgaatc-3' (S^eC ID N.°: 19) dio como resultado un producto de 171 bp que se clonó en el vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen). Después de la digestión con BstZ17I*AflII, el fragmento de 160 bp se aisló del gel, se purificó y se ligó en el constructo delta-IE1-Cap-pPolh-Rep que se abrió con BstZ17I y AflII.

1.1.1.9 Construcción de pVD194 (rep78/CTG (delta ATG))

[0106] Primero se construyó un plásmido rep con un codón de inicio CTG sin ningún sitio ATG interno sintetizando el gen necesario de acuerdo con la secuencia establecida en la SEC ID N.°: 31. Luego se eliminó el gen rep del plásmido pVD88 usando las enzimas de restricción RsrII y XbaI. A continuación, el gen sintetizado se ligó en el plásmido pVD88 usando los sitios de restricción RsrII y XbaI para dar pVD195. Luego se digirió pVD195 con BglII, dando como resultado fragmentos de 9297 bp y 2231 bp. Los salientes 5' se llenaron luego con Klenow y se digirieron con SexAI. Esto da como resultado fragmentos de 9297 bp, 1372 y 859 bp. A continuación, se aisló el fragmento de 859 bp. El vector necesario se generó digiriendo pVD165 con SpeI para dar un fragmento lineal de 14501 bp. Los salientes 5' se llenaron con Klenow y luego se digirieron con SexAI para producir fragmentos de 13 600 bp y 901 bp. Se aisló el fragmento de 13 600 bp. El fragmento BglII(Klenow)*SexAI de 859 bp se ligó luego en pVD165 (SpeI(Klenow)*SexAI) para producir pVD194 (ver Fig. 10). Una digestión de control con SexAbXmaI debería dar como resultado fragmentos de 13435 bp y 1029 bp.

1.1.1.10 Construcción de pVD84

[0107] Para convertir el sitio de inicio del vector de expresión de baculovirus pFBAAV1VPm11 (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943) de ACG a GTG se realizó una PCR utilizando los siguientes cebadores: La secuencia del cebador directo contiene un sitio BamHI (cebador AMT n.° 169; SEC ID N.°:29) 5'- TTAGGATCCTGTTAAGGTGGCTGCCGACGG -3' La secuencia del cebador inverso contiene un sitio StuI (cebador AMT n.° 158; SEC ID N.°:30) 5'- GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC -3'

[0108] Se realizó la PCR con los cebadores n.° 169 y n.° 158 y el producto de la PCR (250 bp) se purificó con el kit de purificación de PCR (Qiagen, lote n.° 11879372) y se cortó con las enzimas de restricción BamHI y StuI. El vector de expresión de baculovirus también se digirió con BamHI y StuI. Después de la desfosforilación del vector con SAP (Promega, lote n.° 17501504), tanto el inserto (Cap con sitio de inicio GTG) como el vector se purificaron en gel. Después de ligar el vector y el inserto, se transformaron en células DH5a químicamente competentes (Invitrogen, lote n.° 1241753) y se sembraron en placas LB que contenían ampicilina. Se purificó el ADN de pVD63 (sitio de inicio Cap/GTG) y se examinó su identidad usando el análisis de secuencia mediante BaseClear y restricción.

[0109] Para clonar el gen Cap con el sitio de inicio GTG en el vector de expresión de baculovirus pPSC10 (Protein Sciences), se separó del pVD63 con SmaI y AvrII y se ligó en el vector de expresión desfosforilado que se abrió con EcoRV y XbaI. Posteriormente, la mezcla de ligadura se transformó en células DH10P químicamente competentes (Invitrogen, lote n.° 1268527) y se sembró en placas de LB-ampicilina. Después del aislamiento del ADN en miniprep utilizando el kit de miniprep QIAprep Spin (Qiagen, lote n.° 12180218), se seleccionó un miniprep (clon n.° 13) mediante análisis de restricción con SphI. Con este clon, el ADN (pVD84) se purificó con el kit SNAP midiprep (Invitrogen solution, lote n.° 1256921 y columna, lote n.° 1259367). La identidad de pVD84 se comprobó a través del análisis de secuencias alrededor del codón de inicio realizado mediante BaseClear y mediante análisis de restricción con BamHI y Sphl (SEC ID N.°:28).

1.1.1.11 Producción de baculovirus recombinantes

[0110] Los Bac.VD118 (nuevo), Bac.VD118 (nuevo)+HR1, Bac.VD165, Bac.VD165+HR1, Bac.VD 165+4xEcRE CAP, Bac.VD165+4*EcRE Rep78, Bac.VD190 y Bac.VD194 (p0) recombinantes se generaron con el sistema de Protein Sciences (Protein Sciences Corporation, Meriden, EE. UU.). Los baculovirus recombinantes se amplificaron diluyéndolos 1:100 en 2x106 células SF+ por ml. Tres días después de la infección, las células se centrifugaron y se recuperó el sobrenadante que contenía el virus. La amplificación de los siguientes pasajes se realizó de la misma manera.

1.1.2 Producción de rAAV

[0111] Los lotes de rAAV se produjeron de acuerdo con Urabe et al., 2002 (supra), pero con la excepción de que se utilizaron dos baculovirus recombinantes en lugar de tres. Un baculovirus albergaba un constructo de expresión bajo el control del promotor de CMV y está flanqueado por ITR de AAV. El otro baculovirus es el baculovirus Rep-Cap que albergaba dos casetes de expresión, uno para el gen de replicación de AAV y otro para la cápside de AAV. La expresión del gen de replicación o cápside bajo el control del promotor inducible se reguló mediante la adición de 0.001-1 uM de Ponasterona A al medio de cultivo. Los diferentes experimentos de producción de rAAV1 se realizaron con stocks de baculovirus Bac.VD43 p5 que contenían el transgén LPL bajo el control del promotor CMV y diferentes pasajes (p3, p4 o p5) de los baculovirus Rep/Cap. En cada experimento se tomó como control la producción estándar de rAAV1 (Bac.VD88:Bac.VD84:Bac.VD43 con una proporción de 5:1:1).

1.1.3 Determinación de particulas AAV llenas/totales

[0112] Para determinar la proporción de cápsides llenas frente a totales, la cantidad de copias del genoma (gc) se divide por la cantidad de partículas AAV totales. La cantidad de gc/ml se midió mediante un ensayo Q-PCR y la cantidad de partículas de AAV totales se determinó con un inmunoensayo enzimático de Progen (ver más adelante). Para la reacción de Q-PCR, se utilizó SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, n.° 4309155) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (25 |_il de volumen total; programa de PCR: 10 min a 95 °C, 40 ciclos de 15 s a 95 °C y 1 min a 60 °C) utilizando uno de los siguientes conjuntos de cebadores:

pr59 AATGGGCGGTAGGCGTGTA CMV SEC ID N.°: 26

pr60 AGGCGATCT GACGGTT CACT AA CMV SEC ID N.°: 27

[0113] La relación se compara con la relación obtenida en condiciones de producción estándar, usando una relación de volumen de 5:1:1 de Bac.Rep, Bac.Cap y Bac.ITR.

1.1.4 Análisis de transferencia Western

[0114] Tres días después de la producción de rAAV, las células se lisaron añadiendo tampón de lisis 0.1 V 10 x TRIS (NaCl 1.5 M, TRIS 0.5 M, MgCl 0.01 M, TRITON X-100 al 1 %, pH 8.5, filtro esterilizado) y se incubaron en hielo durante 30 minutos. El ADN y el ARN libres se degradaron mediante incubación con benzonasa a 37 °C durante 15 minutos. El lisado celular se centrifugó (1900 x g; ¹⁵min; 4 °C). Se añadió tampón de muestra NuPAGE LDS (4x, Invitrogen) a una muestra del sobrenadante y se cargó en un gel Bis-Tris al 4-12 % (120 V). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (BioRad) durante 30 minutos, 10 V (transferencia semiseca). La inmunoquímica Western se realizó mediante el bloqueo de la membrana con tampón de bloqueo Superblock-PBS (PIERCE) y la posterior incubación con ratón anti-Rep (303.9, Progen, Alemania; dilución 1:50) y conejo anti-ratón-HRP (DAKO, dilución 1: 500). Las proteínas Rep se visualizaron mediante tinción quimioluminiscente con lumi-light más sustrato de transferencia Western (Roche).

1.1.5 ELISA de partículas de rAAV1 totales

[0115] La cantidad total de partículas de rAAV1 (tp) realizadas en cada producción se determinó con el kit AAV1 Titration ELISA (Progen, Heidelberg, Alemania) y se realizó de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante, pero con la excepción de que todas las muestras y controles fueron prediluidos en lisado crudo a granel (CLB). En resumen, el CLB se hizo cosechando células expressSF+ después de tres días, añadiendo tampón de lisis 10X e incubando durante 1 hora a 28 °C. Después del tratamiento con benzonasa durante 1 hora a 37 °C, el lisado se centrifugó a 1900 g y el sobrenadante se almacenó a 4 °C. Para determinar las partículas de rAAV1 totales en el lisado crudo de cada producción, las muestras se prediluyeron 50 veces en CLB, esta es la dilución inicial. Posteriormente se realizaron diluciones adicionales de 250, 1250 y 6250 veces en el CLB. La línea estándar también se diluyó en el CLB. Las muestras de la producción con Bac.VD190 solo se diluyeron 50 y 100 veces, debido a los bajos niveles de expresión de las proteínas de la cápside.

1.1.6 Análisis de partículas totales mediante HPLC

[0116] Se inyectan stocks de AAV-1 desconocidos en el sistema de HPLC, lo que da como resultado un pico en el cromatograma. Este pico puede ser integrado por el software Chemstation y representa la cantidad de partículas totales inyectadas. Una reserva concentrada de AAV-1 se tituló por su cantidad de partículas totales por mililitro mediante microscopía electrónica y se le aplicó el método. Usando este estándar como calibrador, se puede calcular la cantidad de partículas totales de los stocks desconocidos. Además, al inyectar una cantidad particular de copias genómicas (que representa aproximadamente la cantidad de partículas llenas) dentro del rango del estándar, se puede estimar la relación de partículas llenas y vacías.

1.2 Resultados

La proporción de partículas de AAVllenas:vacías mejora con el uso de dos sistemas de baculovirus, en particular con una alta expresión de proteína Rep y una expresión moderada de proteína Cap

[0117] Se investigaron en detalle tres constructos, pVD165, pVD190 y pVD194.

[0118] Para determinar la proporción totales/llenas de las partículas rAAV1 producidas con Bac.VD165, se determinó la concentración de partículas totales en los lisados crudos en dos experimentos independientes. Los resultados de estos ELISA y las proporciones totales/llenas correspondientes se muestran en la tabla 1.

Tabla 1: Proporción totales/llenas de rAAV1 producida con el stock de baculovirus Bac.VD165. La concentración de partículas totales se determinó con el ELISA de partículas de AAV1 totales. La concentración de partículas llenas se determinó mediante Q-PCR. Las proporciones totales/llenas solo se pueden comparar con el control r i n lmi m x rim n ^

[0119] La relación totales/llenas para las producciones 1:1 es en ambos experimentos 1.6 veces mejor en comparación con el control. Para la producción 5:1 la relación totales/llenas es 2.1 y 1.4 veces mejor en comparación con el control. En conclusión, la relación totales/llenas mejora para las partículas rAAV1 producidas con Bac.VD165.

[0120] En Bac.VD190, el casete de expresión Cap está bajo el control del promotor débil AIE1. Esto puede resultar en una expresión de la cápside más baja que en las producciones realizadas con otros baculovirus Rep/Cap o en la situación del control, porque en todas esas condiciones la expresión de Cap es inducida por el promotor de poliedrina fuerte. Para probar esta hipótesis a partir de dos experimentos diferentes realizados con Bac.VD190 se determinó la concentración de partículas totales. Los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2: Proporción totales/llenas de rAAV1 producida con el stock de baculovirus Bac.VD190. La concentración de partículas totales se determinó con el ELISA de partículas de AAV1 totales. La concentración de partículas llenas se determinó mediante Q-PCR. Las proporciones totales/llenas solo se pueden comparar con el control r l i n ii mi m i x rlm n

[0121] Los resultados de la producción # 1 (tabla 2) muestran que las proporciones totales/llenas obtenidas por las producciones 1:1 y 5:1 mejoraron 114 y 8 veces en comparación con el control, respectivamente. En la producción #2, la proporción totales/llenas es 1.4 veces menor o 1.4 veces mayor para la producción 1:1 o 5:1. En conclusión, la relación totales/llenas parece mejorar también para las partículas rAAV1 producidas con Bac.VD190 (como se observó para Bac.VD165).

[0122] Para Bac.VD194, se llevó a cabo un análisis de transferencia Western para determinar la expresión de Rep y Cap. En consecuencia, tres días después de que las células se infectaran con dos proporciones diferentes de baculovirus (es decir, 1:1 y 9:1, con 5:1:1 para el control de tres componentes), se recolectaron los lisados celulares y se sometieron a análisis de transferencia Western. Como se muestra en la figura 11A, la expresión de Cap es baja en la producción con una proporción de baculovirus de 1:1, pero la producción con una proporción de 9:1 es comparable al control de tres componentes. Sin embargo, para las producciones de proporción 1:1 y 9:1, la expresión de rep se reduce drásticamente en comparación con el control de tres componentes. La figura 11B, sin embargo, muestra que la producción de virus fue mayor en las producciones con Bac.VD194. El hecho de que la producción sea mayor, pero la expresión de Cap sea menor indica una proporción totales:llenas más favorable. Una vez más, la conclusión es que el sistema de dos componentes con cantidades equimolares de Rep y Cap, en particular con una expresión de Rep alta y Cap moderada, conduce a una relación totales:llenas más baja (es decir, un mayor porcentaje de partículas llenas).

Ejemplo 2

Materiales y métodos

[0123] Tres matraces agitadores (todos cultivados a 28 °C antes de la infección) se inocularon con el inóculo P5; 4 ml de Bac.VD43, 4 ml de Bac.VD84 y 20 ml de Bac.VD88. Los agitadores se incubaron durante las 72 horas de producción viral a tres temperaturas diferentes (26, 28 y 30 °C).

[0124] El tratamiento de lisis de todos los matraces con agitación se llevó a cabo dentro de una incubadora con agitación utilizando Triton X-100 al 0.9 % (v/v). Después de la adición del tampón de lisis, los agitadores se incubaron durante 30 minutos a una temperatura de 28 °C, se añadió benzonasa (16 |_il por 400 ml) y los agitadores se incubaron durante 1 hora a una temperatura de 37 °C. Después del tratamiento con benzonasa, todos los matraces agitadores se colocaron durante la noche a 29 °C para la eliminación viral, y después se almacenaron a 4 °C durante un máximo de 3 días.

[0125] De cada incubador con agitador, se procesaron 200 ml de lisado crudo a granel en una columna de afinidad de 1 ml usando una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después del lavado, el producto se eluyó con PBS, pH 3.5.

Resultados

[0126] El recuento de células en el proceso de los matraces agitadores utilizados para el estudio de temperatura se muestra en la tabla 1. Un aumento de la temperatura se correlaciona con una disminución de la concentración celular total y la viabilidad en el momento de la recolección. La viabilidad obtenida a 28°C fue comparable a los resultados obtenidos con el sistema de biorreactor Wave.

T l 1: R n l l n l r r i n l i r

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la producción de un virión parvoviral recombinante, el cual comprende los pasos de:

(ii) un primer casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende un único marco de lectura abierto que codifica una proteína Rep78 parvoviral de longitud completa a partir de la cual se expresan las proteínas Rep52 y Rep78 en la célula de insecto, cuya secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de impulsar la expresión de las proteínas Rep en la célula de insecto, y en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína parvoviral Rep78 no comprende un intrón artificial;

2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además la etapa de recuperación del virión parvoviral recombinante.

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la secuencia de nucleótidos de (iii) que codifica una proteína de la cápside parvoviral comprende un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 no comprende un intrón artificial.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el primer promotor o el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor PolH, un promotor p10, un promotor básico, un promotor inducible, un promotor E1 y un promotor deltaE1.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el primer casete de expresión comprende al menos un elemento potenciador de baculovirus y/o al menos un elemento sensible a la ecdisona.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el elemento potenciador se selecciona del grupo que consta de hr1, hr2, hr3, hr4 y hr5.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la secuencia de nucleótidos de repetición terminal invertida parvoviral, la proteína Rep78 parvoviral y/o la proteína de la cápside parvoviral son de un virus adenoasociado (^aA^v).

9. Célula de insecto tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Kit que comprende

(a) un constructo de ácidos nucleicos que comprende el primer y segundo casete de expresión tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y