KR20210043580A - 재조합 aav 생산을 위한 규모 조정 가능한 방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 생산하기 위한 개선된 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 AAV(rAAV) 입자의 생산 방법은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제의 존재 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 AAV(rAAV) 입자의 생산 방법은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 및 증가된 양의 나트륨염의 존재 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 미국 가출원 제62/717,212호(출원일: 2018년 8월 10일)의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
재조합 아데노-연관 바이러스(Recombinant Adeno-Associated Virus: rAAV)-기반 벡터는 현재 개발 중인 가장 널리 사용되는 유전자 요법 제품이다. rAAV 벡터 시스템의 바람직한 사용은 부분적으로 야생형 바이러스와 연관된 질환의 결여, 분열하지 않는 세포뿐만 아니라 분열하는 세포에 형질도입하는 AAV의 능력, 및 임상 시험에서 관찰되고, 유전자 요법 적응증에서 전달에 대해 큰 가능성을 나타내는 결과적인 장기간의 강력한 트랜스진(transgene) 발현으로 인한 것이다. 추가로, 상이한 자연 발생 AAV 및 재조합 AAV 벡터 혈청형(serotype)은 상이한 조직, 기관 및 세포를 특이적으로 표적으로 하고, 벡터에 대한 임의의 기존 면역을 회피하는 것을 돕고, 따라서 AAV-기반 유전자 요법의 치료 적용을 확장시킨다.
히스톤 데아세틸라제(Histone deacetylase: HDAC) 저해제는 재조합 동물 세포 배양물에서 단백질의 발현을 위한 형질주입 프로토콜에 사용되어 왔다. 예를 들어, Vazquez-Lombardi는 IgG를 발현하는 플라스미드와의 공동-형질주입 시약으로서의 HDAC 저해제("인핸서 1 및 2")의 사용을 예시하였고, 추가로 이 인핸서를 제2일에 배양물에 첨가하였다(Vazquez-Lombardi et al., Nature Protocols, 13(1): 99-117 (2018), 온라인 공개일 2017년 12월 14일). 국제 특허 제WO2013166339A1호에는 50ℓ 미만의 작은 배양 조건에서 인핸서 1(발프로산) 및 인핸서 2(프로피온산 나트륨)를 사용하는 것이 기재되어 있고, 인핸서 2가 단독으로는 강한 효과를 갖지 않지만, 인핸서 1과 조합하면 재조합 IgG 생산에 이점을 제공할 수 있다는 것을 발견하였다. Chun은 프로피온산 및 부티르산이 CHO 세포에 의한 재조합 B-도메인 결실된 인자 VIII의 생산을 향상시켰다고 보고하였지만, 이러한 알칸산 둘 다는 세포 성장을 저해하였고, rFVIII 생산은 약 3.5일에 최대였다(Chun et al., Biotechnology Letters, 25: 315-319 (2003)). Cervera는 형질주입 인핸서의 혼합물을 사용하여 HEK293 부유 세포 배양물 중에 단일 재조합 폴리펩타이드(예를 들어, Gag-유사 바이러스-유사 입자)를 포함하는 바이러스-유사 입자의 생산을 증가시키는 것을 보고한다(Cervera et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 9935-9949 (2015)). 그러나, 이들 보고 중 어느 것도 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제를 사용하여 게놈을 캡시드화(encapsidating)하는 바이러스 입자, 예를 들어 다중 폴리펩타이드 및 뉴클레오타이드 게놈을 포함하는 rAAV 입자를 발현하는 배양된 세포의 재조합 생산을 증가시키는 것은 개시하지 않는다.
Tiernan 및 Tipper는 rAAV 트랜스진을 포함하는 안정적인 세포주를 생성시키는 방법에서 HDAC 저해제인 트라이코스타틴(trichostatin) A의 사용을 개시한다(WO 2018/175775). Tiernan 및 Tipper는, HDAC 저해제에 재조합 바이러스 벡터를 공동-형질주입시키는 단계를 포함하는 방법이 숙주 세포 게놈 내로의 바이러스 벡터의 통합을 향상시키고, 숙주 세포로부터 수거된 바이러스 벡터의 수율을 개선시킬 수 있다는 것을 개시한다. Tiernan 및 Tipper는 rAAV 입자의 생산에서 안정적인 세포주를 사용하는 것을 개시하지만, rAAV 입자의 생산 배양물에서 HDAC 저해제의 사용을 교시하거나 시사하지 않는다.
AAV-기반 유전자 요법이 후기 임상 단계 및 상업적 사용을 위해 보다 광범위하게 채택될 수 있기 이전에, rAAV 입자의 대규모 GMP 준수 생산을 위한 새로운 방법이 개발될 필요가 있다. 상류 공정 개발을 위한 주요 도전은 rAAV 생산을 위한 규모 조정 가능하고, 비용 효과적인 GMP 준수 방법의 확립이다. 단일 단위 용량을 위해서 rAAV 입자를 제조하는 것은 현재 승인된 방법을 사용하면 수 $100k를 소비할 수 있다. 따라서, rAAV 입자를 생산하기 위한 규모 조정 가능한 GMP 준수 방법이 필요하다.
본 개시내용은 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유효량의 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제의 존재 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 AAV(rAAV) 입자의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 HDAC 저해제 및 약 110mM 내지 250mM의 농도의 나트륨염의 존재 하에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 멸균 여과 또는 이들의 임의의 조합물(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포 배양물의 수거, 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 모노리쓰(모노리쓰) 음이온 교환 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 제공한다.
[1.] rAAV 입자의 생산 방법으로서,
(a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 세포에
i. 패키징될 rAAV 게놈,
ii. 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및
iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
(c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(d) (b) 이후에 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 동안 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
[2.] [2]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염인, 방법.
[3.] [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염인, 방법.
[4.] [3]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, 방법.
[5.] [3]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, 방법.
[6.] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, 방법.
[7.] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, 방법.
[8.] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 이후에 첨가되는, 방법.
[9.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 1시간 내지 약 48시간 이후에 첨가되는, 방법.
[10.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 12시간 내지 약 36시간 이후에 첨가되는, 방법.
[11.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 18시간 내지 약 30시간 이후에 첨가되는, 방법.
[12.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 48시간 미만 후에 첨가되는, 방법.
[13.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 36시간 미만 후에 첨가되는, 방법.
[14.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 적어도 약 6시간 이후에 첨가되는, 방법.
[15.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 적어도 약 12시간 이후에 첨가되는, 방법.
[16.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간 또는 약 48시간 이후에 첨가되는, 방법.
[17.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 20시간 이후에 첨가되는, 방법.
[18.] [8]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 24시간 이후에 첨가되는, 방법.
[19.] [1] 내지 [18] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[20.] [19]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도가 약 20mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 80mM 또는 약 70mM 내지 약 120 mM만큼 증가되는, 방법.
[21.] [19]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 40mM 내지 약 140mM만큼 증가되는, 방법.
[22.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM로 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[23.] [22]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM인, 방법.
[24.] [22]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM인, 방법.
[25.] [22]에 있어서, 상기 나트륨염을 첨가하기 전에, 상기 세포 배양물은 약 90mM 내지 약 120mM의 NaCl을 포함하는, 방법.
[26.] [19] 내지 [25]항 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, 방법.
[27.] [19] 내지 [26] 중 어느 하나에 있어서, 상기 HDAC 저해제 및 상기 나트륨염은 임의의 순서로 별도로 첨가되는, 방법.
[28.] [19] 내지 [27] 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 b) 이전에 투여되는, 방법.
[29.] [19] 내지 [27] 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 b) 이후에 투여되는, 방법.
[30.] [19] 내지 [29] 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가한 이후에 첨가되는, 방법.
[31.] [30]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 5분 내지 약 6시간 후에 첨가되는, 방법.
[32.] [30]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 20분 내지 약 2시간 후에 첨가되는, 방법.
[33.] [30]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 2시간 미만 후에 첨가되는, 방법.
[34.] [30]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 1시간 미만 후에 첨가되는, 방법.
[35.] [30]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 5분 후에 투여되는, 방법.
[36.] [30]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 20분 후에 투여되는, 방법.
[37.] [1] 내지 [36] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는, 방법.
[38.] [37]에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 5일 동안 유지되는, 방법.
[39.] [1] 내지 [38] 중 어느 하나에 있어서, 세포에
i. 패키징될 rAAV 게놈,
ii. 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및
iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
[40.] [1] 내지 [39] 중 어느 하나에 있어서, 상기 아데노바이러스 헬퍼 기능은 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
[41.] [1] 내지 [40] 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하는 단계는 형질주입에 의해서 수행되는, 방법.
[42.] [1] 내지 [41] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, 방법.
[43.] [1] 내지 [41] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포인, 방법.
[44.] [1] 내지 [41] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포, HEK 유래 세포, CHO 세포, CHO 유래 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 또는 PerC6 세포인, 방법.
[45.] [1] 내지 [41] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포인, 방법.
[46.] [1] 내지 [45] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 부유 배양물인, 방법.
[47.] [1] 내지 [46] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자를 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[48.] [1] 내지 [47] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 5×10e+10GC/㎖ 초과의 rAAV 입자를 생산하는, 방법.
[49.] [1] 내지 [48] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 GC/㎖로 측정되는 경우 상기 HDAC 저해제 및 나트륨염이 첨가되지 않은 배양물보다 rAAV 입자를 적어도 약 2배 더 많이 생산하는, 방법.
[50.] [1] 내지 [49] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 20,000리터의 부피를 갖는, 방법.
[51.] rAAV 입자의 생산 방법으로서,
(a) rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
[52.] [51]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염인, 방법.
[53.] [52]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염인, 방법.
[54.] [53]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, 방법.
[55.] [53]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, 방법.
[56.] [51] 내지 [55] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, 방법.
[57.] [51] 내지 [55] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, 방법.
[58.] [51] 내지 [57] 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[59.] [58]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도가 약 20mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 80mM 또는 약 70mM 내지 약 120 mM만큼 증가되는, 방법.
[60.] [58]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 40mM 내지 약 140mM만큼 증가되는, 방법.
[61.] [51] 내지 [60] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM로 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[62.] [61]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM인, 방법.
[63.] [61]에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM인, 방법.
[64.] [51] 내지 [63] 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염을 첨가하기 전에, 상기 세포 배양물은 약 90mM 내지 약 120mM의 NaCl을 포함하는, 방법.
[65.] [51] 내지 [64]항 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, 방법.
[66.] [51] 내지 [65] 중 어느 하나에 있어서, 상기 HDAC 저해제 및 상기 나트륨염은 임의의 순서로 별도로 첨가되는, 방법.
[67.] [66]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가한 이후에 첨가되는, 방법.
[68.] [67]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 5분 내지 약 6시간 후에 첨가되는, 방법.
[69.] [67]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 20분 내지 약 2시간 후에 첨가되는, 방법.
[70.] [67]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 2시간 미만 후에 첨가되는, 방법.
[71.] [67]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 1시간 미만 후에 첨가되는, 방법.
[72.] [67]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 5분 후에 투여되는, 방법.
[73.] [67]에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 20분 후에 투여되는, 방법.
[74.] [51] 내지 [73] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 14일 동안 유지되는, 방법.
[75.] [51] 내지 [73] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는, 방법.
[76.] [75]에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 5일 동안 유지되는, 방법.
[77.] rAAV 입자의 생산 방법으로서, 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
[78.] [77]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염인, 방법.
[79.] [78]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염인, 방법.
[80.] [79]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, 방법.
[81.] [79]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, 방법.
[82.] [77] 내지 [81] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지는 약 0.5mM 내지 약 5mM의 상기 HDAC 저해제를 포함하는, 방법.
[83.] [77] 내지 [81] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지는 약 0.5mM 내지 약 3mM의 상기 HDAC 저해제를 포함하는, 방법.
[84.] [77] 내지 [83] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지는 약 120mM 내지 약 250mM의 염화나트륨을 더 포함하는, 방법.
[85.] [77] 내지 [83] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM의 NaCl 염화나트륨을 포함하는, 방법.
[86.] [77] 내지 [83] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지는 약 150mM 내지 약 240mM의 염화나트륨을 더 포함하는, 방법.
[87.] [51] 내지 [86] 중 어느 하나에 있어서, rAAV를 생산할 수 있는 상기 세포는
(a) 패키징될 rAAV 게놈,
(b) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
(c)패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및
(d) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된, 방법.
[88.] [51] 내지 [86] 중 어느 하나에 있어서, rAAV를 생산할 수 있는 상기 세포는
(a) 패키징될 rAAV 게놈,
(b) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
(c)패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및
(d) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된, 방법.
[89.] [51] 내지 [88] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포인, 방법.
[90.] [51] 내지 [88] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 또는 PerC6 세포이되, 선택적으로 상기 세포는 HEK293 세포인, 방법.
[91.] [51] 내지 [90] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 부유 배양물인, 방법.
[92.] [77] 내지 [91] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서의 상기 배양은 약 2일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 14일 동안인, 방법.
[93.] [77] 내지 [91] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서의 상기 배양은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안인, 방법.
[94.] [93]에 있어서, 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서의 상기 배양은 약 5일 동안인, 방법.
[95.] [51] 내지 [94] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자를 회수하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[96.] [51] 내지 [95] 중 어느 하나에 있ㅇ서, 상기 세포 배양물은 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산하는, 방법.
[97.] [51] 내지 [96] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 GC/㎖로 측정되는 경우 상기 HDAC 저해제 및 나트륨염이 첨가되지 않은 배양물보다 rAAV 입자를 적어도 약 2배 더 많이 생산하는, 방법.
[98.] rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법으로서,
(a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 세포에
i. 패키징될 rAAV 게놈,
ii. 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및
iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
(c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(d) (b) 이후에 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 동안 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
[99.] [98]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, 방법.
[100.] [98]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, 방법.
[101.] [98] 내지 [100] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 40mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[102.] [98] 내지 [101] 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, 방법.
[103.] rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법으로서,
(a) rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함하는, 방법.
[104.] [103]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, 방법.
[105.] [103]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, 방법.
[106.] [103] 내지 [105] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM로 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
[107.] [103] 내지 [106] 중 어느 하나에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, 방법.
[108.] [103] 내지 [107] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 14일 동안 유지되는, 방법.
[109.] [103] 내지 [107] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는, 방법.
[110.] [109]에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 5일 동안 유지되는, 방법.
[111.] rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법으로서, 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
[112.] [111]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, 방법.
[113.] [111]에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, 방법.
[114.] [111] 내지 [113] 중 어느 하나에 있어서, 상기 배지는 약 120mM 내지 약 250mM의 염화나트륨을 더 포함하는, 방법.
[115.] [1] 내지 [114] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
[116.] [1] 내지 [114] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자는 AAV8, AAV9, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 또는 AAV.hu37 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
[117.] [1] 내지 [114] 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 포함하는, 방법.
[118.] [1] 내지 [117] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 20,000리터의 부피를 갖는, 방법.
[119.] [118]에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 5,000리터의 부피를 갖는, 방법.
[120.] [118]에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 2,000리터의 부피를 갖는, 방법.
[121.] [118]에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 1,000리터의 부피를 갖는, 방법.
[122.] [118]에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 500리터의 부피를 갖는, 방법.
[123.] [1] 내지 [122] 중 어느 하나의 방법에 의해서 생산된 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
[124.] [1] 내지 [50] 및 [98] 내지 [102] 중 어느 하나에 있어서, 상기 패키징된 rAAV 게놈은 트랜스젠을 포함하는, 방법.
[125.] [124]에 있어서, 상기 트랜스젠은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
[126.] [125]에 있어서, 상기 조절 요소는 인핸서, 프로모터 및 polyA 영역 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
[127.] [125] 또는 [126]에 있어서, 상기 조절 요소 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이종(heterologous)인, 방법.
[128.] [124] 내지 [127] 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스젠은 항-VEGF Fab, 이두로니다제(iduronidase: IDUA), 이두레네이트 2-설파타제(IDS), 저밀도 지질단백질 수용체(low-density lipoprotein receptor: LDLR), 트라이펩티딜 펩티다제 1(tripeptidyl peptidase: TPP1) 또는 VEGF 수용체 1의 비-막 연관 스플라이스 변이체(non-membrane associated splice variant of VEGF receptor 1)(sFlt-1)인, 방법.
[129.] [124] 내지 [127] 중 어느 하나에 있어서, 상기 트랜스진은 감마-사코글리칸, Rab Escort 단백질 1(REP1/CHM), 레티노이드 아이소머로하이드롤라제(retinoid isomerohydrolase: RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(cyclic nucleotide gated channel alpha 3: CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(cyclic nucleotide gated channel beta 3: CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카복실라제(aromatic L-amino acid decarboxylase: AADC), 리소좀-연관 구성원 단백질 2 아이소폼 B(lysosome-associated membrane protein 2 isoform B: LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제(retinitis pigmentosa GTPase regulator: RPGR), 레티노쉬신(retinoschisin: RS1), 근소포체 칼슘(sarcoplasmic reticulum calcium) ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주-유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(aquaporin1: AQP1), 디스트로핀(dystrophin), 마이오튜불라린 1(myotubularin 1: MTM1), 폴리스타틴(follistatin: FST), 글루코스-6-포스파타제(glucose-6-phosphatase: G6Pase), 아포지질단백질 A2(apolipoprotein A2: APOA2), 유리딘 다이포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1: UGT1A1), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B: ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다제(N-acetyl-alpha-glucosaminidase: NAGLU), 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase: GAA), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase: GLA), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase: GLB1), 지질단백질 리파제(lipoprotein lipase: LPL), 알파 1-항트립신(alpha 1-antitrypsin: AAT), 포스포다이에스터라제 6B(phosphodiesterase 6B: PDE6B), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) 9OTC), 생존 운동 뉴런(survival motor neuron: SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(neurturin: NRTN), 뉴로트로핀(Neurotrophin)-3 (NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase: PBGD), 신경 성장 인자(NGF), 미토콘드리아 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(protective protein cathepsin A: PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자(proto-oncogene), 타이로신 카이나제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor: TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체인, 방법.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 [1] 내지 [129] 중 어느 하나의 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자의 하류 가공을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 멸균 여과 중 적어도 하나이다. 추가 실시형태에서, 상류 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 멸균 여과 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6개를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 수거된 세포 배양물의 원심분리를 포함하지 않는다.
도 1. 염화나트륨, 부티르산 나트륨 및/또는 발프로산 나트륨의 첨가 후 얻어진 재조합 바이러스의 수율. 첨가된 시약의 최종 농도를 도시한다. 베이스 배지는 부티르산 나트륨 또는 발프로산 나트륨이 아닌 약 100mM의 염화나트륨을 포함하였다.
도 2. 염화나트륨 및/또는 발프로산 나트륨의 첨가 후 얻어진 재조합 바이러스 수율. 첨가된 시약의 최종 농도를 도시한다. 베이스 배지는 발프로산 나트륨이 아닌 약 100mM의 염화나트륨을 포함하였다.
도 3. NaCl 및 프로피온산 나트륨을 사용한 rAAV8 입자의 대규모 생산으로부터의 바이러스 수율.
도 4. 염화나트륨 및/또는 프로피온산 나트륨의 첨가 후 얻어진 rAAV9 수율.
도 5. 염화나트륨 및/또는 프로피온산 나트륨의 첨가 후 얻어진 rAAV9 수율.
도 2. 염화나트륨 및/또는 발프로산 나트륨의 첨가 후 얻어진 재조합 바이러스 수율. 첨가된 시약의 최종 농도를 도시한다. 베이스 배지는 발프로산 나트륨이 아닌 약 100mM의 염화나트륨을 포함하였다.
도 3. NaCl 및 프로피온산 나트륨을 사용한 rAAV8 입자의 대규모 생산으로부터의 바이러스 수율.
도 4. 염화나트륨 및/또는 프로피온산 나트륨의 첨가 후 얻어진 rAAV9 수율.
도 5. 염화나트륨 및/또는 프로피온산 나트륨의 첨가 후 얻어진 rAAV9 수율.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 rAAV 입자가 생산되는 조건 하에서 유효량의 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제의 존재 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양함으로써 rAAV 입자를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포는 HDAC 저해제 및 약 110mM 내지 250mM의 농도의 나트륨염의 존재 하에서 배양된다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 생산된 rAAV 입자는 예를 들어, rAAV 입자를 수거 및 정제하여, 단리된 rAAV 입자 및 이를 포함하는 조성물, 예를 들어, 약제학적 조성물을 생산함으로써 추가 하류 가공에 적합하다. 기재된 방법은 유전자 요법 응용에 사용하기 위한 rAAV 입자를 생산하기 위한 GMP 규제 요건과 일치하는 유연하고, 비용 효율적이고, 상업적으로 규모 확대 가능한 공정을 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법은 비제한적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 및 AAV.HSC16 및 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 포함하는, 임의의 rAAV 혈청형에 적합하다. 일부 실시형태에서, 방법을 사용하여 rAAV8 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법을 사용하여 rAAV8 유도체 입자, rAAV8 변형 입자 또는 rAAV8 위형 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법을 사용하여 rAAV9 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법을 사용하여 rAAV9 유도체 입자, rAAV9 변형 입자 또는 rAAV9 위형 입자를 생산한다.
본 발명자들은 놀랍게도 본 명세서에 개시된 방법이 AAV 수율에서 2배 또는 그 초과의 증가를 제공한다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 HDAC 저해제가 형질주입된 세포에서 재조합 폴리펩타이드의 발현을 증가시킬 수 있다는 이전 발견에 기초하면 예상할 수 없었다. AAV 입자의 세포 생산은 3개의 캡시드 단백질 및 단일 가닥 뉴클레오타이드 게놈을 기능성 바이러스 단위로 조립하는 것을 필요로 한다. HDAC 저해제가 AAV 게놈의 생산을 비롯한, 모든 AAV 성분의 생산을 동시에 증가시킬 수 있을 것이라고 여겨질 어떠한 이유도 없었다. 그리고 HDAC 저해제가 바이러스 폴리펩타이드의 생산을 증가시켰더라도, 숙주 세포 머시너리가 증가된 수의 AAV 입자를 조립할 수 있다고 여겨지는 어떠한 이유도 없었다. 형질주입 인핸서가 바이러스-유사 입자(VLP)의 생산을 증가실 수 있다는 Cervera의 보고도 HDAC 저해제가 숙주 세포에서 rAAV 입자의 생산을 증가시킬 수 있다고 여겨지는 이유를 제공하지 못했는데, 그 이유는 VLP가 단일 gag 단백질을 포함하고, 어떠한 게놈도 포함하지 않았기 때문이다(Cervera et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 99: 9935-9949 (2015)). 따라서, VLP의 생산은 다중 폴리펩타이드 및 뉴클레오타이드 게놈의 조립을 필요로 하지 않았다.
단일 단위 용량을 제조하는데 필요한 매우 많은 수의 rAAV 입자를 고려할 때, rAAV 수율의 2배 또는 그 초과의 증가는 단위 용량당 물품의 비용을 상당히 감소시킨다. 바이러스 수율의 증가는 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 소모품 비용뿐만 아니라 산업적인 바이러스 정제 시설 건설과 관련된 자본 지출 비용도 상응하게 감소시킬 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속한 당업계의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 개시된 방법의 이해를 용이하게 하기 위해서, 다수의 용어 및 구를 하기에 정의한다.
예를 들어, 본 명세서에 제공된 방법에 사용된, 조성물 중의 성분의 양, 조성물 중의 성분의 농도, 유량, rAAV 입자 수율, 공급 부피, 염 농도 등 및 이들의 값 및 범위를 수식하는 "약"은 예를 들어, 농축액 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 취급 절차를 통해서; 이들 절차에서의 부주의한 오류로 인해서; 조성물을 제조하거나 방법을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이를 통해서; 유사한 고려사항을 통해서 일어날 수 있는 수치 양의 변화를 지칭한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 농도를 갖는 조성물 또는 혼합물의 노화로 인해서 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 농도를 갖는 조성물 또는 혼합물의 혼합 또는 가공으로 인해서 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해서 수식되든 수식되지 않든, 청구범위는 그 양에 대한 등가물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 제시된 수치 또는 범위보다 대략 10 내지 20% 더 크거나 더 작은 범위를 지칭한다. 추가 실시형태에서, "약"은 제시된 수 또는 범위의 ± 10%를 지칭한다. 예를 들어, "약 10%"는 9% 내지 11%의 범위를 나타낸다.
"AAV"는 아데노-연관 바이러스에 대한 약어이며, 바이러스 자체 또는 이의 변형, 유도체 또는 위형을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고, 모든 아형(subtype) 및 자연 발생 형태 및 재조합 형태 둘 다를 포괄한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 지칭한다. 용어 "AAV"는 AAV 1형 (AAV1), AAV 2형(AAV2), AAV 3형(AAV3), AAV 4형(AAV4), AAV 5형(AAV5), AAV 6형(AAV6), AAV 7형(AAV7), AAV 8형(AAV8), AAV 9형(AAV9), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV 및 양 AAV 및 이들의 변형, 유도체 또는 위형을 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비-영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, 그 등등이다. 일부 실시형태에서, AAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16의 유도체, 변형 또는 위형이다.
AAV 입자에 적용되는 바와 같은 "재조합"은 AAV 입자가 본래 AAV 입자와 구별되는 AAV 입자 작제물을 야기하는 하나 이상의 절차의 생성물인 것을 의미한다.
재조합 아데노-연관 바이러스 입자 "rAAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 이종 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈이 아닌 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 캡시드화된(encapsidated) 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. rAAV 입자는 임의의 변형, 유도체 또는 위형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 또는 이들의 유도체/변형/위형)을 포함하는 임의의 AAV 혈청형을 가질 수 있다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/변형/위형, 및 이러한 혈청형/유도체/변형/위형의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Asokan et al., Mol. Ther. 20(4):699-708 (2012)] 참고). 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.
본 개시내용의 rAAV 입자는 임의의 혈청형 또는 혈청형의 임의의 조합(예를 들어, 2개 이상의 혈청형을 포함하는, 예를 들어, rAAV2, rAAV8 및 rAAV9 입자 중 2개 이상을 포함하는 rAAV 입자의 집단)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10 또는 다른 rAAV 입자 또는 이들 둘 이상의 조합이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV8 또는 rAAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 2개 이상의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16 캡시드 단백질로부터 선택된 2개 이상의 혈청헝의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9의 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB, 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 갖는다.
용어 "세포 배양물"은 부착 성장되거나 또는 현탁액, 생물반응기, 롤러 병, 하이퍼스택(hyperstack), 마이크로스피어(microsphere), 마크로스피어(macrosphere), 플라스크 등 중의 세포뿐만 아니라 rAAV 입자, 세포, 세포 부스러기, 세포 오염물질, 콜로이드 입자, 생물분자, 숙주 세포 단백질, 핵산 및 지질 및 응집제(flocculant)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 상청액 또는 현탁액 자체의 성분을 지칭한다. 대규모 접근법, 예컨대, 교반 생물반응기 내의 마이크로담체 또는 마크로담체에 부착하여 성장하는 부착 세포 및 부유 배양을 포함하는 생물반응기가 용어 "세포 배양물"에 또한 포함된다. 단백질의 대규모 및 소규모 생산 둘 다에 대한 세포 배양 절차가 본 개시내용에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "정제시키는", "정제", "분리시키다", "분리시키는", "분리", "단리시키다", "단리시키는" 또는 "단리"는 표적 생성물 및 1종 이상의 불순물을 포함하는 샘플로부터 rAAV 입자의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 생성물의 순도는 샘플로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다. 일부 실시형태에서, 샘플에서 rAAV의 순도는 본 명세서에 기재된 방법을 사용함으로써 샘플로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본 개시내용 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
본 명세서에서 실시형태가 "포함하는"이라는 언어와 함께 기재된 곳마다, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 관점에서 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 실시형태가 "본질적으로 이루어진"이라는 언어와 함께 기재된 곳마다, "이루어진"의 관점에서 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 또한 이해된다.
본 명세서에서 구, 예컨대, "A 및/또는 B"에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A와 B 둘 다; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)을 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, 구 예컨대, "A, B 및/또는 C"에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 실시형태 각각을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
본 개시내용의 실시형태가 마쿠스 군 또는 다른 대안의 군의 관점에서 기재된 경우, 개시된 방법은 전체로 열거된 전체 군뿐만 아니라 그 군의 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위군 및 또는 군 구성원 중 하나 이상이 없는 주요 군을 포함한다. 개시된 방법은 또한 개시된 방법에서 임의의 그룹 구성원 중 하나 이상의 명시 적 배제를 고려한다.
rAAV 생산을 위한 방법
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포 배양물에 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 (c) 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함하는, rAAV 입자의 생산을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨), 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨) 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제를 첨가한 후, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 10mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨) 또는 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단계 b) 약 12시간 내지 약 36시간 이후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 40mM 내지 140mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 HDAC 저해제를 첨가한 이후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 20분 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV 입자를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포는 (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포는 (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB, 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 단계 b) 이후에 약 2일 내지 약 10일 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 단계 b) 이후에 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포에, (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 (d) 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함하는, 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자의 생산을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨), 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨) 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제를 첨가한 후, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 10mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨) 또는 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단계 b) 약 12시간 내지 약 36시간 이후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 40mM 내지 140mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 HDAC 저해제를 첨가한 이후에 세포 배양물에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 20분 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV 입자를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, 세포는 (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된다. 일부 실시형태에서, 세포는 (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB, 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 단계 b) 이후에 약 2일 내지 약 10일 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 단계 b) 이후에 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 rAAV 입자의 생산을 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨), 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨) 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 0.5mM 내지 약 10mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨) 또는 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 0.5mM 내지 약 5mM의 부티레이트(예를 들어, 부티르산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 0.5mM 내지 약 5mM의 발프로에이트(예를 들어, 발프로산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배지는 약 0.5mM 내지 약 5mM의 프로피오네이트(예를 들어, 프로피온산 나트륨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 120mM 내지 250mM의 NaCl을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM의 NaCl을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV 입자를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포는 (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포는 (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB, 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, rAAV 생산을 증가시키는 방법은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포에, (i) 패키징될 rAAV 게놈, (ii) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능, (iii) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및 (iv) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 (d) 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 단계 b) 이후에 약 2일 내지 약 10일 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 단계 b) 이후에 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산을 증가시키는 방법은 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 단계 b) 이후에 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산을 증가시키는 방법은 (a) rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 (c) 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 배양된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다.
당업자는 임의의 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제 화합물이 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다는 것을 이해한다. HDAC 저해제는 당업계에서 인지되는 화합물의 부류이다(예를 들어, 문헌[Eckschlager et al., Int. J. Mol. Sci. 18, 1414; doi:10.3390/ijms18071414 (2017); Huber et al., The Journal of Biological Chemistry, 286(25):22211-22218 (2011)] 참고). 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 HDAC 아이소폼-선택적인 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 하나 이상의 클래스 I, II, III 및 IV HDAC의 활성도를 저해한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 클래스 I 및 클래스 II로부터의 하나 이상의 HDAC의 활성도를 저해한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 pan-저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 하이드록삼산, 단쇄 지방산, 벤즈아마이드, 환식 테트라펩타이드 또는 시르투인(sirtuin) 저해제를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 하이드록삼산을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 하이드록삼산, 예를 들어, 트라이코스타틴 A, 수베라닐로하이드록삼산(suberanilohydroxamic acid: SAHA), 벨리노스타트(belinostat)(PXD101), 파나바이오스타트(panabiostat), 기비노스타트(givinostat), 레스미노스타트(resminostat), 아벡시노스타트(abexinostat), 퀴시노스타트(quisinostat), 로실리노스타트(rocilinostat), 프락티노스타트(practinostat) 및 CHR-3996을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염, 예를 들어, 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 2,2-다이메틸부티레이트, 2-에틸부티레이트, 펜타노네이트, 헥사노에이트, 헤타노에이트, 옥타노에이트, 페닐부티레이트 및 이들의 염을 포함한다(Steliou et al., BioResearch Open Access, Vol. 1, Issue 4, doi.org/10.1089/biores.2012.0223 (2012)). 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 벤즈아마이드, 예를 들어, 엔티노스타트(entinostat), 타세디날린(tacedinaline), 4SC202 및 모세티노스타트(mocetinostat)를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 환식 테트라펩타이드, 예를 들어, 로미뎁신(romidepsin)을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 시르투인 저해제, 예를 들어, 니코틴아마이드, 시르티놀(sirtinol), 캄비놀(cambinol) 및 EX-527을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 [4-(2-아미노-페닐카바모일)-벤질]카밤산 피리딘-3-일메틸에스터 및 이의 유도체, 피록사마이드, 옥삼플라틴, 아피시딘, 뎁시펩타이드, 데푸데신, 트라폭신, M344, 스크립타이드(scriptaid), MC 1293, 소듐 1-나프토에이트, CAY10398, 소듐-페닐부티레이트, 수베로일 비스-하이드록삼산(SBHA), CAY10433, 옥삼플라틴 또는 HC 독소를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 피루베이트 또는 이의 염을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 니토틴아마이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 2종 이상의 HDAC 저해제의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 rAAV를 생산할 수 있는 세포를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함한다. 예를 들어, 2mM의 HDAC 저해제를 포함하는 세포 배양물은 세포 및 2mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지를 포함한다고 이해된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 0.5mM 내지 약 10mM이다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 0.5mM 내지 약 5mM이다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 0.5mM 내지 약 3mM이다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 0.5mM, 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM 또는 약 5mM이다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 1.5mM이고, 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 2mM이고, 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 3mM이고, 일부 실시형태에서, HDAC 저해제의 농도는 약 4mM이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 10mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM, 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM 또는 약 5mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 1.5mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 2mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 3mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 4mM의 발프로에이트 또는 이의 염(예를 들어, 발프로산 나트륨)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 10mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM, 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM 또는 약 5mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 1.5mM 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 2mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 3mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 4mM의 부티레이트 또는 이의 염(예를 들어, 부티르산 나트륨)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 10mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 0.5mM, 약 1mM, 약 1.5mM, 약 2mM, 약 2.5mM, 약 3mM, 약3.5mM, 약 4mM, 약 4.5mM 또는 약 5mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 1.5mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 2mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 3mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 4mM의 프로피오네이트 또는 이의 염(예를 들어, 프로피온산 나트륨)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계 및 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 전에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입한 이후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 1시간 내지 약 48시간 또는 약 12시간 내지 약 36시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 16시간 내지 약 30시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 18시간 내지 약 26시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 18시간 내지 약 22시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 22시간 내지 약 26시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 48시간 또는 약 36시간 미만 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 적어도 약 6시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 18시간, 적어도 약 20시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간 또는 약 48시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 18시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 20시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 22시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하고 약 24시간 후에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형질주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계와 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 사이에 대체된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계와 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 사이에 보충된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계와 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 사이에 영양제, 염, 완충제 및 첨가제(예를 들어, 소포제) 중 1종 이상이 보충된다. 일부 실시형태에서, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형질주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포 배양물에 나트륨염을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포를 나트륨염을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 나트륨염을 포함한다. 나트륨염을 포함하는 세포 배양물은 세포 및 나트륨염을 포함하는 배지를 포함한다고 이해된다.
일부 실시형태에서, 나트륨염은 무기염이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 유기염이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 할로겐(예를 들어, 불소, 염소, 브로민 및 아이오딘)을 포함하는 소듐 할라이드이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨 또는 소듐 브로마이드이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨, 탄산나트륨, 인산나트륨 또는 황산나트륨이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 120mM 내지 약 250mM의 나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM의 나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 150mM 내지 약 240mM의 나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 150mM 내지 약 190mM의 나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 180mM 내지 약 240mM의 나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 120mM 내지 약 250mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 150mM 내지 약 240mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 150mM 내지 약 190mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 세포 배양 배지는 약 180mM 내지 약 240mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 140mM의 염화나트륨으로 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 170mM의 염화나트륨으로 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 200mM의 염화나트륨으로 증가된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양의 나트륨염을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 20mM 내지 약 50mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 40mM 내지 약 80mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 70mM 내지 약 120mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 40mM 내지 약 140mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 30mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 60mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 90mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 염화나트륨의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양의 염화나트륨을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 20mM 내지 약 50mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 40mM 내지 약 80mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 70mM 내지 약 120mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 40mM 내지 약 140mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 30mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 60mM만큼 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 90mM만큼 증가된다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물은 이의 농도를, 예를 들어, 90mM만큼 추가로 증가시키기 위해서 나트륨염을 첨가하기 전에 나트륨염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 이의 농도를 추가로 증가시키기 위해서 나트륨염을 세포 배양물에 첨가하기 전에 약 90mM, 약 100mM 또는 약 110mM의 나트륨염을 포함한다. 세포 배양물이 약 110mM의 염화나트륨을 포함하고, 이의 농도를 약 90mM만큼 증가시키기 위해서 충분한 양의 염화나트륨이 세포 배양물에 첨가되는 경우, 염화나트륨의 최종 농도는 약 200mM일 것이라고 이해된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물은 이의 농도를 추가로 증가시키기 위해서 염화나트륨을 세포 배양물에 첨가하기 전에 약 90mM, 약 100mM 또는 약 110mM의 염화나트륨을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM까지 증가시키기에 충분한 양의 나트륨염을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 130mM 내지 약 160mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 150mM 내지 약 190mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 180mM 내지 약 240mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 140mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 170mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염의 최종 농도는 약 200mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 나트륨염은 염화나트륨이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 염화나트륨의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM까지 증가시키기에 충분한 양의 염화나트륨을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 130mM 내지 약 160mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 150mM 내지 약 190mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 180mM 내지 약 240mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 140mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 170mM까지 증가된다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨의 최종 농도는 약 200mM까지 증가된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, (b) 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 및 (d) 세포 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 첨가하는 단계를 포함한다. (b), (c) 및 (d)는 임의의 순서로 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, (b), (c) 및 (d)는 (b)-(c)-(d)의 순서로 수행된다. 일부 실시형태에서, (b), (c) 및 (d)는 (b)-(d)-(c)의 순서로 수행된다. 일부 실시형태에서, (b), (c) 및 (d)는 (d)-(c)-(b)의 순서로 수행된다. 일부 실시형태에서, (b), (c) 및 (d)는 (d)-(b)-(c)의 순서로 수행된다. 일부 실시형태에서, (c) 및 (d)는 (b) 이후에 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c) 및 (d)는 세포 배양물에 HDAC 저해제 및 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 포함하는 조성물을 첨가함으로써 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c) 및 (d)는 세포 배양물에 HDAC 저해제를 포함하는 제1 조성물 및 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 포함하는 제2 조성물을 첨가함으로써 동시에 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형질주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, (b) 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 및 (d) 세포 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서 (c)는 (b) 이후에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 1시간 내지 약 48시간 또는 약 12시간 내지 약 36시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 48시간 또는 약 36시간 미만에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 적어도 약 6시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 12시간 또는 적어도 약 18시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간 또는 약 48시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 24시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 20시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형질주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, (b) 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 및 (d) 세포 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서 (b), (c) 및 (d)는 (b)-(c)-(d)의 순서로 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 5분 내지 약 6시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 20분 내지 약 2시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 2시간 미만 또는 약 1시간 미만에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 40분, 적어도 약 50분에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 적어도 약 30분에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분 또는 약 60분에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 40분에 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형질주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, (b) 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 및 (d) 세포 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서 (b), (c) 및 (d)는 (b)-(c)-(d)의 순서로 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 1시간 내지 약 48시간 또는 약 12시간 내지 약 36시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 48시간 또는 약 36시간 미만에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 적어도 약 6시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 12시간 또는 적어도 약 18시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 22시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간 또는 약 48시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 24시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (c)는 (b) 이후 약 20시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 5분 내지 약 6시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 20분 내지 약 2시간에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 2시간 미만 또는 약 1시간 미만에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 40분, 적어도 약 50분에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 적어도 약 30분에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분 또는 약 60분에 수행된다. 일부 실시형태에서, (d)는 (c) 이후 약 40분에 수행된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계, 세포 배양물에 HDAC 저해제를 첨가하는 단계, 세포 배양물에 나트륨염(예를 들어, 염화나트륨)을 첨가하는 단계 및 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후 약 2일 내지 약 10일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후 약 5일 내지 약 14일 또는 그 초과 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후 약 2일 내지 약 7일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 세포를 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 도입한 후 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후 약 5일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입한 후 약 6일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 연속적인 수거 동안 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계는 세포에 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형질주입하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 또는 나트륨염을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하지 않는 방법에 비해서 rAAV 입자의 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 rAAV 생산을 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 100% 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 rAAV 생산을 적어도 2배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 5배 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 rAAV 생산을 적어도 2배 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 생산의 증가는 생산 배양물에서 rAAV 역가를 비교함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, rAAV 역가는 세포 배양물의 밀리리터당 게놈 카피(genome copy: GC)로서 측정된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB, 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 rAAV 입자 및 이를 포함하는 조성물의 품질 속성을 유지시키거나 개선시키면서 rAAV 입자의 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자 및 이를 포함하는 조성물의 품질은 rAAV 입자의 농도(예를 들어, GC/㎖), rAAV 게놈의 카피를 포함하는 입자의 백분율; 게놈이 없는 입자의 비, rAAV 입자의 감염력, rAAV 입자의 안정성, 잔류하는 숙주 세포 단백질의 농도, 또는 잔류하는 숙주 세포 핵산(예를 들어, 숙주 세포 게놈 DNA, rep 및 cap 유전자를 암호화하는 플라스미드, 헬퍼 기능을 암호화하는 플라스미드, rAAV 게놈을 암호화하는 플라스미드)의 농도를 결정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 생산된 rAAV 입자 또는 이를 포함하는 조성물의 품질은 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 또는 나트륨염을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하지 않는 방법에 의해서 생산된 rAAV 입자 또는 조성물의 품질과 동일하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 생산된 rAAV 입자 또는 이를 포함하는 조성물의 품질은 HDAC 저해제를 첨가하는 단계 또는 나트륨염을 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함하지 않는 방법에 의해서 생산된 rAAV 입자 또는 조성물의 품질보다 더 우수하다 동일하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 1×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+11GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 1×10e+13GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 1×10e+11GC/㎖ 내지 약 5×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 1×10e+11GC/㎖ 초과의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 5×10e+11GC/㎖ 초과의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 약 1×10e+12GC/㎖ 초과의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 5×10e+10GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 1×10e+11GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 5×10e+11GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 1×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 5×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 1×10e+13GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 적어도 약 5×10e+13GC/㎖의 rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다.
다수의 세포 배양물 기반 시스템은 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업자에게 공지되어 있고, 이들 중 임의의 것이 본 명세서에 개시된 방법을 실시하는데 사용될 수 있다. 세포 배양물 기반 시스템은 형질주입, 안정적인 세포주 생산 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 허피스 바이러스-AAV 하이브리드 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 포함한다. rAAV 바이러스 입자의 생산을 위한 rAAV 생산 배양물은 (1) 예를 들어, 인간-유래 세포주, 예컨대, HeLa, A549 또는 HEK293 세포 및 이들의 유도체(HEK293T 세포, HEK293F 세포), 포유동물 세포주, 예컨대, Vero, CHO 세포 또는 CHO-유래 세포 또는 곤충-유래 세포주, 예컨대, 바큘로바이러스 생산 시스템의 경우 SF-9를 포함한 적합한 숙주 세포; (2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예컨대, 온도 민감성 아데노바이러스), 허피스 바이러스, 바큘로바이러스에 의해서 제공되는, 적합한 헬퍼 바이러스 기능 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물; (3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; (4) AAV ITR 서열이 측접된 트랜스진(예컨대, 치료용 트랜스진); 및 (5) rAAV 생산을 지원하기 위한 적합한 배지 및 배지 성분이 모두 필요하다.
일 양상에서, 본 명세서에는 rAAV 입자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 곤충 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포에 i. 패키징될 rAAV 게놈, ii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 iii. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 바큘로바이러스 벡터를 도입하는 단계; (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 세포 배양물을 (b) 이후에 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 또는 그 초과 동안 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제1 바큘로바이러스 벡터 및 rAAV 게놈을 암호화하는 제2 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV 게놈을 암호화하는 바큘로바이러스 및 rep 및 cap 유전자를 발현하는 곤충 세포를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 rep 및 cap 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 곤충 세포는 Sf-9 세포이다. 일부 실시형태에서, 곤충 세포는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 안정적으로 통합된 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 Sf-9 세포이다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양물에 나트륨염을 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 바큘로바이러스 생산 시스템을 사용한다. 일부 실시형태에서 바큘로바이러스 생산 시스템은 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제1 바큘로바이러스 및 rAAV 게놈을 암호화하는 제2 바큘로바이러스를 사용한다. 일부 실시형태에서 바큘로바이러스 생산 시스템은 rAAV 게놈을 암호화하는 바큘로바이러스 및 rep 및 cap 유전자를 발현하는 숙주 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서 바큘로바이러스 생산 시스템은 rep 및 cap 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 바큘로바이러스를 사용한다. 일부 실시형태에서, 바큘로바이러스 생산 시스템은 Sf-9 세포를 사용한다.
당업자는 AAV rep 및 cap 유전자, AAV 헬퍼 유전자(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자) 및 rAAV 게놈(반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)가 측접된 관심대상의 하나 이상의 유전자 포함)을 세포에 도입하여 rAAV를 생산하거나 패키징하는 다수의 방법을 인식한다. 구 "아데노바이러스 헬퍼 기능"은 AAV가 세포에서 효율적으로 성장하도록 세포에서 (RNA 또는 단백질로서) 발현되는 다수의 바이러스 헬퍼 유전자를 지칭한다. 당업자는 아데노바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus: HSV)를 포함하는 헬퍼 바이러스가 AAV 복제를 촉진시킨다는 것을 이해하며, 필수적인 기능을 제공하는 특정 유전자가 식별되어 있고, 예를 들어, 헬퍼는 이러한 AAV 유전자 발현 및 복제를 용이하게 하는 세포 환경에 대한 변화를 유도할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 하나 이상의 플라스미드 벡터의 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 바이러스 벡터, 예를 들어, rHSV 벡터를 형질도입시킴으로써 세포에 도입될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈 중 하나 이상은 rHSV 벡터를 형질도입시킴으로써 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 유전자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 유전자 및 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 rAAV 입자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포에 i. 패키징될 rAAV 게놈, ii. rAAV 입자를 패키징하는데 필요한 헬퍼 기능, iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 rHSV 벡터를 도입하는 단계; (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 세포 배양물을 (b) 이후에 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 또는 그 초과 동안 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능을 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능을 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터 comprises 하나 이상의 헬퍼 기능을 암호화하는 하나 이상의 이질(heterogeneous) 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능 및 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 실시형태에서, rHSV 벡터는 헬퍼 기능 및 AAV rep 및 cap 유전자를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 세포는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 안정적으로 통합된 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양물에 나트륨염을 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염이다.
일 양상에서, 본 명세서에는 rAAV 입자를 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 포유동물 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; (b) 세포에 i. 패키징될 rAAV 게놈, ii. rAAV 입자를 패키징하는데 필요한 헬퍼 기능, iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및 iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계; (c) 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및 세포 배양물을 (b) 이후에 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 또는 그 초과 동안 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 기능은 아데노바이러스 유전자에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포는 rep 및 cap 유전자를 암호화하는 하나 이상의 안정적으로 통합된 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 배양물에 나트륨염을 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염이다.
AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및/또는 rAAV 게놈을 암호화하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 개발하기 위한 분자 생물학 기술은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, AAV 헬퍼 유전자(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)는 하나의 플라스미드 벡터에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 또는 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현되고, 남아있는 AAV 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 및 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현되며, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의한 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현되며, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의한 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, AAV 헬퍼 유전자(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)는 하나의 바이러스 벡터에 의해서 암호화된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 또는 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현되고, 남아있는 AAV 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 및 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현되며, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해서 안정적으로 발현되며, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 및 패키징될 rAAV 게놈은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 벡터로의 형질주입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 세포를 다음 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물로 형질주입시키는 단계를 포함하는데, 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능(예를 들어, 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)을 암호화하고, 하나는 패키징될 rAAV 게놈을 암호화한다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV8 또는 AAV9 cap 유전자이다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 또는 AAV.7m8 유전자이다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 패키징될 rAAV 게놈을 암호화하는 벡터는 AAV ITR이 측접된 관심대상 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형으로부터 유래된다.
벡터의 임의의 조합물을 사용하여 AAV rep 및 cap 유전자, AAV 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을, rAAV 입자가 생산되거나 패키징될 세포에 도입할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV 반전 말단 반복부(ITR)가 측접된 관심대상 유전자를 포함하는 rAAV 게놈을 암호화하는 제1 플라스미드 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제2 벡터 및 헬퍼 유전자를 암호화하는 제3 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3개의 벡터의 혼합물이 세포에 공동 형질주입된다.
일부 실시형태에서, 형질주입 및 감염의 조합이 플라스미드 벡터뿐만 아니라 바이러스 벡터 둘 다를 사용함으로써 사용된다.
일부 실시형태에서, rep 및 cap 유전자, 및 AAV 헬퍼 유전자 중 하나 이상은 세포에 의해서 구성적으로 발현되고, 세포에 형질주입되거나 형질도입될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 세포는 rep 및/또는 cap 유전자를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 AAV 헬퍼 유전자를 구성적으로 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 E1a를 구성적으로 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 게놈을 암호화하는 안정적인 트랜스진을 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV rep, cap 및 헬퍼 유전자(예를 들어, Ela 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 또는 VA 유전자)는 임의의 AAV 혈청형을 가질 수 있다. 유사하게, AAV ITR은 또한 임의의 AAV 혈청형을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형(예를 들어, 하나 초과의 혈청형으로부터의 서열을 보유하는 하이브리드 혈청형)으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV9 또는 AAV8 cap 유전자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형(예를 들어, 하나 초과의 혈청형으로부터의 서열을 보유하는 하이브리드 혈청형)으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자의 생산을 위한 AAV rep 및 cap 유전자는 상이한 혈청형으로부터 유래된다. 예를 들어, rep 유전자는 AAV2로부터 유래되는 반면, cap 유전자는 AAV9로부터 유래된다.
세포를 형질주입하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법이 본 명세서에 개시된 방법에 따른 rAAV 입자의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 화학 기반 형질주입 방법을 사용하여 세포를 형질주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학 기반 형질주입 방법은 인산칼슘, 고도로 분지화된 유기 화합물(덴드리머), 양이온성 중합체(예를 들어, DEAE 덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI)), 리포펙션을 사용한다. 일부 실시형태에서, 화학 기반 형질주입 방법은 양이온성 중합체(예를 들어, DEAE 덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI))을 사용한다. 일부 실시형태에서, 화학 기반 형질주입 방법은 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학 기반 형질주입 방법은 DEAE 덱스트란을 사용한다. 일부 실시형태에서, 화학 기반 형질주입 방법은 인산칼슘을 사용한다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 배지는 본 명세서에 개시된 방법에 따른 rAAV 입자의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 이들 배지는 비제한적으로 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 변형 이글 배지(Modified Eagle Medium: MEM), 둘베코 변형 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 및 Sf-900 II SFM 배지를 포함한 하이클론 래보러토리즈사(Hyclone Laboratories) 및 JRH에 의해서 생산된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 인비트로젠사(Invitrogen)/써모피셔사(ThermoFisher)로부터의 DynamisTM 배지, FreeStyleTM 293 발현 배지 또는 Expi293TM 발현 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 DynamisTM 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 무혈청 배지, 동물-성분 무함유 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함하는 세포 배양물을 사용한다. 일부 실시형태에서, 배지은 동물-성분 무함유 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 우 태아 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민-무함유 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 영양제, 염, 완충제 및 첨가제(예를 들어, 소포제) 중 1종 이상이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 혈청이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 우태아 혈청이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 폴록사머, 예를 들어, Kolliphor® P 188 Bio가 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 베이스 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 공급 배지이다.
rAAV 생산 배양물은 사용될 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 온도 범위, 다양한 시간 길이 등) 하에서 일상적으로 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생산 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 롤러 보틀, 중공 섬유 필터, 다층 또는 멀티트레이 조직 배양 플라스크(또는 스택(stack), 예를 들어, 하이퍼스택(hyperstack)), 마이크로캐리어 및 패킹층 또는 유동층 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생산 배양물은 또한 부유-개작 숙주 세포(suspension-adapted host cell), 예컨대, HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 및 SF-9 세포를 포함할 수 있고, 이것은 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flask), 교반 탱크 생물반응기 및 일회용 시스템, 예컨대, 웨이브 백 시스템(Wave bag system)을 포함한 다양한 방식으로 배양될 수 있다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 부유 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다.
rAAV 입자를 생산하기 위한 당업계에 공지된 임의의 세포 또는 세포주가 본 명세서에 개시된 방법 중 임의의 하나에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 생산하는 방법 또는 rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법은 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 포유동물 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 곤충 세포, 예를 들어, SF-9 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 HEK293 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 부유 배양에서의 성장을 위해서 개작된 HEK293 세포를 사용한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 HEK293을 포함하는 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 부유 배양물에서의 성장을 위해서 개작된 HEK293 세포를 포함하는 부유 배양물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지, 동물-성분 무함유 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 부유-개작된 세포는 진탕기 플라스크, 스피너 플라스크, 세포백 또는 생물반응기에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 배지에서 그 자체로 현탁물로 존재하는 기질(예를 들어, 마이크로담체)에 부착된 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 부착 배양물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 HEK293을 포함하는 부착 배양물이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지, 동물-성분 무함유 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 배양물은 고밀도 세포 배양물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 약 1×10E+06개 세포/㎖ 내지 약 30×10E+06개 세포/㎖의 총 세포 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포 중 약 50% 초과가 살아 있는 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포 또는 SF-9 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 부유 배양으로 성장하도록 개작된 HEK293 세포이다.
본 명세서에 개시된 방법은 임의의 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자의 생산에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV9 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 또는 AAV.7m8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100%의 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법의 일부 실시형태에서 큰 부피의 또는 세포 배양물이 존재할 수 있다(예를 들어, 상업적인 제조 공정 동안). 일부 실시형태에서 본 명세서에 개시된 방법은 rAAV 입자를 포함하는 큰 부피의 세포 배양물 또는의 가공에 적합하다. 용어 "큰 부피"는 rAAV 입자의 상업적 그리고/또는 산업적 생산과 연관된 부피를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 20리터 내지 약 20000리터, 약 50리터 내지 약 20000리터, 약 100리터 내지 약 20000리터, 약 500리터 내지 약 20000리터, 약 1000리터 내지 약 20000리터, 약 20리터 내지 약 5000리터, 약 50리터 내지 약 5000리터, 약 100리터 내지 약 3000리터, 약 500리터 내지 약 3000리터, 약 1500리터 내지 약 2500리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 50리터 내지 약 2,000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 50리터 내지 약 3,000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 50리터 내지 약 5,000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 200리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 500리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 1000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 1500리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 2000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 2500리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 3000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 5000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 10000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 15000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 20000리터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "큰 부피"는 약 10리터 내지 1000리터, 약 10리터 내지 100리터, 약 20리터 내지 500리터, 약 50리터 내지 500리터, 약 100리터 내지 1000리터 또는 약 100리터 내지 500리터를 지칭한다.
rAAV 입자
제공된 방법은 임의의 단리된 재조합 AAV 입자의 생성에 사용하기에 적합하다. 이와 같이, 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV는 당업계에 공지된 임의의 혈청형, 변형 또는 유도체, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 둘 이상의 혈청형을 포함하는 rAAV 입자의 집단)을 가질 수 있고, 예를 들어, AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7,AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 또는 다른 rAAV 입자 또는 이들 둘 이상의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형으로부터의 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전문이 참조에 의해 포함된 문헌[Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068]에 기재된 바와 같은 Anc80 또는 Anc80L65의 캡시드를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 하기 아미노산 삽입물 중 하나를 갖는 캡시드를 포함한다: 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 및 미국 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 LGETTRP 또는 LALGETTRP. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9,458,517호; 및 제9,587,282호 및 미국 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 AAV.7m8의 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제9,585,971호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV-PHP.B를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제9,840,719호 및 국제 특허 공개 제WO 2015/013313호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV.Rh74 및 RHM4-1을 포함하며, 이들 특허 각각은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 특허 공개 제WO 2014/172669호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV rh.74를 포함하며, 상기 특허는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌[Georgiadis et al., 2016, Gene Therapy 23: 857-862 및 Georgiadis et al., 2018, Gene Therapy 25: 450]에 기재된 바와 같은 AAV2/5의 캡시드를 포함하며, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 특허 공개 제WO 2017/070491호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV2tYF를 포함하며, 상기 특허는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌[Puzzo et al., 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418]에 기재된 바와 같은 AAVLK03 또는 AAV3B의 캡시드를 포함하며, 상기 문헌은 전문이 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제8,628,966; 제8,927,514호; 제9,923,120호 및 국제 특허 공개 제WO 2016/049230호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10, HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15 또는 HSC16을 포함하며, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 포함된다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드를 포함한다: 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다: 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 제WO 2003/052051호(예를 들어, 서열번호 2 참고), 제WO 2005/033321호(예를 들어, 서열번호 123 및 88 참고), 제WO 03/042397호(예를 들어, 서열번호 2, 81, 85 및 97 참고), 제WO 2006/068888호(예를 들어, 서열번호 1 및 3 내지 6 참고), 제WO 2006/110689호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고), 제WO2009/104964호(예를 들어, 서열번호 1 내지 5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참고), 제WO 2010/127097호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고) 및 제WO 2015/191508호(예를 들어, 서열번호 80 내지 294 참고) 및 미국 출원 공개 제20150023924호(예를 들어, 서열번호 1, 5 내지 10 참고)에 개시된 캡시드 단백질을 갖고, 이들 각각의 내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 제WO 2003/052051호(예를 들어, 서열번호 2 참고), 제WO 2005/033321호(예를 들어, 서열번호 123 및 88 참고), 제WO 03/042397호(예를 들어, 서열번호 2, 81, 85 및 97 참고), 제WO 2006/068888호(예를 들어, 서열번호 1 및 3 내지 6 참고), 제WO 2006/110689호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고), 제WO2009/104964호(예를 들어, 서열번호 1 내지 5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참고), 제WO 2010/127097호(예를 들어, 서열번호 5 내지 38 참고) 및 제WO 2015/191508호(예를 들어, 서열번호 80 내지 294 참고) 및 미국 출원 공개 제20150023924호(예를 들어, 서열번호 1, 5 내지 10 참고)에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.
AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257; 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호; 제WO 2003/052051호, 제WO 2005/033321호, 제WO 03/042397호, 제WO 2006/068888호, 제WO 2006/110689호, 제WO2009/104964호, 제W0 2010/127097호 및 제 WO 2015/191508호 및 미국 출원 공개 제20150023924호에 교시되어 있다.
제공된 방법은 트랜스진을 암호화하는 재조합 AAV의 생산에 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 트랜스진은 하기 표 1A 내지 표 1C으로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부 (2) 조절 제어 요소, 예컨대, a) 프로모터/인핸서, b) poly A 신호 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 트랜스진을 위한 핵산 서열 암호. 무손상 또는 실질적으로 무손상인 단클론성 항체(mAb)를 발현시키기 위한 다른 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부 (2) 조절 제어 요소, 예컨대, a) 프로모터/인핸서, b) poly A 신호 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 항체의 경쇄 Fab 및 중쇄 Fab 또는 중쇄 또는 경쇄 Fab 및 선택적으로 중쇄 Fc 영역을 위한 트랜스진을 위한 핵산 서열 암호. 무손상 또는 실질적으로 무손상인 mAb를 발현시키기 위한 더 다른 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부; (2) 조절 제어 요소, 예컨대, a) 프로모터/인핸서, b) poly A 신호 및 c) 선택적으로 인트론; 및 (3) 항-VEGF(예를 들어, 세바시주맙(sevacizumab), 라니비주납(ranibizumab), 베바시주맙(bevacizumab) 및 브롤루시주맙(brolucizumab)), 항-EpoR(예를 들어, LKA-651), 항-ALK1(예를 들어, 아스크린바쿠맙(ascrinvacumab)), 항-C5(예를 들어, 테시돌루맙(tesidolumab) 및 에쿨리주맙(eculizumab)), 항-CD105(예를 들어, 카로툭시맙(carotuximab)), 항-CC1Q(예를 들어, ANX-007), 항-TNFα(예를 들어, 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab) 및 골리무맙(golimumab)), 항-RGMa(예를 들어, 엘레자누맙(elezanumab)), 항-TTR(예를 들어, NI-301 및 PRX-004), 항-CTGF(예를 들어, pamrevlumab), 항-IL6R(예를 들어, 사트랄리주맙(satralizumab) 및 사릴루맙(sarilumab)), 항-IL4R(예를 들어, 두필루맙(dupilumab)), 항-IL17A(예를 들어, 익세키주맙(ixekizumab) 및 세쿠키누맙(secukinumab)), 항-IL-5(예를 들어, 메폴리주맙(mepolizumab)), 항-IL12/IL23(예를 들어, 유스테키누맙(ustekinumab)), 항-CD19(예를 들어, 이네빌리주맙(inebilizumab)), 항-ITGF7 mAb(예를 들어, 에트롤리주맙(etrolizumab)), 항-SOST mAb(예를 들어, 로모소주맙(romosozumab)), 항-pKal mAb(예를 들어, 라나델루맙(lanadelumab)), 항-ITGA4(예를 들어, 나탈리주맙(natalizumab)), 항-ITGA4B7(예를 들어, 베돌리주맙(vedolizumab)), 항-BLyS(예를 들어, 벨리무맙(belimumab)), 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)), 항-RANKL(예를 들어, 덴소맙(densomab)), 항-PCSK9(예를 들어, 알리로쿠맙(alirocumab) 및 에볼로쿠맙(evolocumab)), 항-ANGPTL3(예를 들어, 에비나쿠맙(evinacumab)*), 항-OxPL(예를 들어, E06), 항-fD(예를 들어, 람팔리주맙(lampalizumab)) 또는 항-MMP9(예를 들어, 안데칼릭시맙(andecaliximab))의 중쇄 Fab; 선택적으로 치료용 항체의 네이티브 형태와 동일한 아이소타입의 Fc 폴리펩타이드, 예컨대, IgG 아이소타입 아미노산 서열 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 Fc; 및 항-VEGF(예를 들어, 세바시주맙(sevacizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 베바시주맙(bevacizumab) 및 브롤루시주맙(brolucizumab)), 항-EpoR(예를 들어, LKA-651), 항-ALK1(예를 들어, 아스크린바쿠맙(ascrinvacumab)), 항-C5(예를 들어, 테시돌루맙(tesidolumab) 및 에쿨리주맙(eculizumab)), 항-CD105 또는 항-ENG(예를 들어, 카로툭시맙(carotuximab)), 항-CC1Q(예를 들어, ANX-007), 항-TNFα(예를 들어, 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab) 및 골리무맙(golimumab)), 항-RGMa(예를 들어, 엘레자누맙(elezanumab)), 항-TTR(예를 들어, NI-301 및 PRX-004), 항-CTGF(예를 들어, 팜레브루맙(pamrevlumab)), 항-IL6R(예를 들어, 사트랄리주맙(satralizumab) 및 사릴루맙(sarilumab)), 항-IL4R(예를 들어, 두필루맙(dupilumab)), 항-IL17A(예를 들어, 익세키주맙(ixekizumab) 및 세쿠키누맙(secukinumab)), 항- IL-5(예를 들어, 메폴리주맙(mepolizumab)), 항-IL12/IL23(예를 들어, 우스테키누납(ustekinumab)), 항-CD19(예를 들어, 이네빌리주맙(inebilizumab)), 항-ITGF7 mAb(예를 들어, 에트롤리주맙(etrolizumab)), 항-SOST mAb(예를 들어, 로모소주맙(romosozumab)), 항-pKal mAb(예를 들어, 라나델루맙(lanadelumab)), 항-ITGA4(예를 들어, 나탈리주맙(natalizumab)), 항-ITGA4B7(예를 들어, 베돌리주맙(vedolizumab)), 항-BLyS(예를 들어, 벨리무맙(belimumab)), 항-PD-1(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab) 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)), 항-RANKL(예를 들어, 덴소맙(densomab)), 항-PCSK9(예를 들어, 알리로쿠맙(alirocumab) 및 에볼로쿠맙(evolocumab)), 항-ANGPTL3(예를 들어, 에비나쿠맙(evinacumab)), 항-OxPL(예를 들어, E06), 항-fD(예를 들어, 람팔리주맙(lampalizumab)) 또는 항-MMP9(예를 들어, 안데칼릭시맙(andecaliximab))의 경쇄를 위한 핵산 서열 암호(여기서 중쇄(Fab 및 선택적으로 Fc 영역) 및 경쇄는 자가-절단 퓨린(F)/F2A 또는 가요성 링커에 의해서 분리되어, 동일한 양의 중쇄 폴리펩타이드 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장함).
[표 1A]
[표 1B]
[표 1C]
일부 실시형태에서, 본 명세서에는 항-VEGF Fab를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 항-VEGF Fab를 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 라니비주맙(ranibizumab)을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 이두로니다제(IDUA)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 IDUA를 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 이두로네이트 2-설파타제(IDS)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 IDS를 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 LDLR을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 트라이펩티딜 펩티다제 1(TPP1) 단백질을 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에는 TPP1을 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 VEGF 수용체 1의 비-막 연관 스플라이스 변이체(sFlt-1)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 감마-사코글리칸, Rab Escort 단백질 1(REP1/CHM), 레티노이드 아이소머로하이드롤라제(RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카복실라제(AADC), 리소좀-연관 구성원 단백질 2 아이소폼 B(LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제(RPGR), 레티노쉬신(RS1), 근소포체 칼슘 ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주-유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(aquaporin1: AQP1), 디스트로핀(dystrophin), 마이오튜불라린 1(myotubularin 1: MTM1), 폴리스타틴(follistatin: FST), 글루코스-6-포스파타제(glucose-6-phosphatase: G6Pase), 아포지질단백질 A2(apolipoprotein A2: APOA2), 유리딘 다이포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1: UGT1A1), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B: ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다제(N-acetyl-alpha-glucosaminidase: NAGLU), 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase: GAA), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase: GLA), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase: GLB1), 지질단백질 리파제(LPL), 알파 1-항트립신(AAT), 포스포다이에스터라제 6B(PDE6B), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(OTC), 생존 운동 뉴런(SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(NRTN), 뉴로트로핀-3(NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD), 신경 성장 인자(NGF), 미토콘드리아 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자, 타이로신 카이나제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 제공된다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 AAV 캡시드는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형 AAV 캡시드이다. 위형 rAAV 입자의 생성 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001)] 참고).
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2종 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다.
특정 실시형태에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 자가-상보성 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol. 8, Number 16, Pages 1248-1254]; 및 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 및 제7,456,683호 참고, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨).
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV4의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV5의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형을 갖는다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 또는 AAV.7m8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100%의 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9와 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질, 예컨대, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상의 동일성, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 최대 100% 동일성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 모자이크 AAV 입자는 AAV의 상이한 혈청형으로부터의 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물로 구성된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 rAAV 입자는 (a) AAV ITR을 포함하는 핵산 벡터 및 (b) AAVx(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16)로부터 유래된 캡시드 단백질로 구성된 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 구성된 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질을 함유하는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질로 구성된 위형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 rAAV8 또는 rAAV9 입자는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형 입자이다. 위형 rAAV 입자의 생성 및 사용 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081 (2001)] 참고).
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, rAAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2종 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다. 추가 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 2개 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질과, AV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 AAV 혈청형으로부터의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8 및 AAVrh.10으로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
rAAV 입자의 단리 방법
본 명세서에 개시된 rAAV 입자의 생산 방법(예를 들어, [1] 내지 [129] 중 어느 하나의 방법)은 하류 가공과 조합하여 사용되어 rAAV 입자를 단리시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법(예를 들어, [1] 내지 [129] 중 어느 하나의 방법)에 따라서 생산된 rAAV 입자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 하류 가공, 예컨대, 예를 들어, 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 멸균 여과 또는 이들의 임의의 조합물(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 원심분리 또는 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 멸균 여과 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6개를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 세포 배양물의 수거, (예를 들어, 심층 여과에 의한) 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4차 아민 리간드를 사용한 AEX 크로마토그래피), 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 따라서 생산된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 4차 아민 리간드를 사용한 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 rAAV 입자를 단리시키는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4차 아민 리간드를 사용한 AEX 크로마토그래피), 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
형질주입, 안정적인 세포주 생산 및 아데노바이러스-rAAV 하이브리드, 허피스 바이러스-AAV 하이브리드 및 바큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 비롯한, 다수의 방법이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다. rAAV 바이러스 입자의 생산을 위한 rAAV 생산 배양물은 (1) 예를 들어, 인간-유래 세포주, 예컨대, HeLa, A549 또는 HEK293 세포 및 이들의 유도체(HEK293T 세포, HEK293F 세포), 포유동물 세포주, 예컨대, Vero 또는 곤충-유래 세포주, 예컨대, 바큘로바이러스 생산 시스템의 경우 SF-9를 포함한 적합한 숙주 세포; (2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예컨대, 온도 민감성 아데노바이러스), 허피스 바이러스, 바큘로바이러스에 의해서 제공되는, 적합한 헬퍼 바이러스 기능 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물; (3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; (4) AAV ITR 서열이 측접된 트랜스진(예컨대, 치료용 트랜스진); 및 (5) rAAV 생산을 지원하기 위한 적합한 배지 및 배지 성분이 모두 필요하다. 당업계에 공지된 적합한 배지가 rAAV 벡터의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 이들 배지는 비제한적으로 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 변형 이글 배지(Modified Eagle Medium: MEM), 둘베코 변형 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium: DMEM) 및 Sf-900 II SFM 배지를 포함한 하이클론 래보러토리즈사(Hyclone Laboratories) 및 JRH에 의해서 생산된 배지를 포함한다.
rAAV 생산 배양물은 사용될 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 온도 범위, 다양한 시간 길이 등) 하에서 일상적으로 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생산 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 롤러 보틀, 중공 섬유 필터, 마이크로캐리어 및 패킹층 또는 유동층 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생산 배양물은 또한 부유-개작 숙주 세포(suspension-adapted host cell), 예컨대, HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포를 포함할 수 있고, 이것은 예를 들어, 스피너 플라스크(spinner flask), 교반 탱크 생물반응기 및 일회용 시스템, 예컨대, 웨이브 백 시스템(Wave bag system)을 포함한 다양한 방식으로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 부유 배양으로 성장하도록 개작된 HEK293 세포이다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 부유 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물은 고밀도 세포 배양물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 약 1×10E+06개 세포/㎖ 내지 약 30×10E+06개 세포/㎖의 총 세포 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포 중 약 50% 초과가 살아 있는 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포 또는 SF-9 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 부유 배양으로 성장하도록 개작된 HEK293 세포이다.
제공된 방법의 추가 실시형태에서 rAAV 생산 배양물은 rAAV 입자를 포함하는 부유 배양물을 포함한다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 부유 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 부유 배양은 포유동물 세포 또는 곤충 세포의 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부유 배양은 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예를 들어, HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포의 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부유 배양은 HEK293 세포의 배양을 포함한다.
재조합 AAV 입자는 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물의 수거에 의해서 또는 생산 배양물로부터의 소모된 배지의 수거에 의해서 rAAV 생산 배양물로부터 수거될 수 있되, 단 세포는 rAAV 입자가 무손상 숙주 세포로부터 배지로 방출되는 당업계에 공지된 조건 하에서 배양되어야 한다. 재조합 AAV 입자는 또한 생산 배양물의 숙주 세포의 용해에 의해서 rAAV 생산 배양물로부터 수거될 수 있다. 적합한 세포 용해 방법이 또한 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 다중 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유동 및 화학물질, 예컨대, 세제 및/또는 프로테아제로의 처리를 포함한다.
수거 시, rAAV 생산 배양물은 하기 중 하나 이상을 함유할 수 있다: (1) 숙주 세포 단백질; (2) 숙주 세포 DNA; (3) 플라스미드 DNA; (4) 헬퍼 바이러스; (5) 헬퍼 바이러스 단백질; (6) 헬퍼 바이러스 DNA; 및 (7) 예를 들어, 혈청 단백질, 아미노산, 트랜스페린 및 다른 저분자량 단백질을 포함한 배지 성분. rAAV 생산 배양물은 생성물-관련 불순물, 예를 들어, 불활성 벡터 형태, 빈 바이러스 캡시드, 응집된 바이러스 입자 또는 캡시드, 잘못 접힌 바이러스 캡시드, 분해된 바이러스 입자를 추가로 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물 수거물을 정화시켜 숙주 세포 부스러기를 제거한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물은 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해서 정화된다. 정화는 또한 당업계에 공지된 다양한 다른 표준 기술, 예컨대, 원심분리 또는 당업계에 공지된 0.2mm 이상의 공극 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해서 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물은 원심분리에 의해서 정화된다. 일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물의 정화는 원심분리를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 여과를 사용하여 정화된다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 심층 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 심층 여과 및 멸균 여과를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 1종 이상의 상이한 여과 배지를 포함하는 필터 트레인(filter train)을 사용하여 정화된다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 심층 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 1종 이상의 심층 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 2종의 심층 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 멸균 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 2종의 심층 여과 배지 및 멸균 여과 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 필터 매질은 다공성 심층 필터이다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC 및 멸균 등급 필터 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC 및 Sartopore® 2 XLG 0.2 ㎛를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 그것을 심층 필터와 접촉시키기 전에 전처리된다. 일부 실시형태에서, 전처리는 염을 수거된 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전처리는 화학 응집제(flocculent)를 수거된 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 그것을 심층 필터와 접촉시키기 전에 전처리되지 않는다.
일부 실시형태에서, 생산 배양물 수거물은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 PCT 국제 특허 출원 제PCT/US2019/029539호(출원일: 2019년 4월 27일, 발명의 명칭: "SCALABLE CLARIFICATION PROCESS FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION")에 개시된 여과에 의해서 정화된다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물 수거물은 뉴클레아제(예를 들어, Benzonase®) 또는 엔도뉴클레아제(예를 들어, 세라티아 마세센스(Serratia marcescens)로부터의 엔도뉴클레아제)로 처리되어 생산 배양물 중에 존재하는 고분자량 DNA를 소화시킨다. 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 소화는 당업계에 공지된 표준 조건 하에서 일상적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 소화는 1 내지 2.5단위/㎖의 Benzonase®의 최종 농도에서 주변 온도 내지 37℃ 범위의 온도에서 30분 내지 수 시간 동안 수행된다.
멸균 여과는 멸균 등급 필터 매질을 사용한 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 또는 0.22㎛ 공극 필터이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 폴리에터설폰(PES)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 폴리바이닐리덴 플루오라이드(PVDF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.8㎛ 프리-필터 및 0.2㎛ 최종 필터 막의 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 1.2㎛ 프리-필터 및 0.2㎛ 최종 필터 막의 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 또는 0.22㎛ 공극 필터이다. 추가 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2㎛ 공극 필터이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 Sartopore® 2 XLG 0.2㎛, DuraporeTM PVDF Membranes 0.45㎛ 또는 Sartoguard® PES 1.2㎛ + 0.2㎛ 공칭 공극 크기 조합이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 Sartopore® 2 XLG 0.2㎛이다.
일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 크로마토그래피 매질, 예를 들어, 친화도 크로마토그래피 매질에 적용되기 전에 접선 유동 여과("TFF")를 통해서 농축된다. TFF 초여과를 사용한 바이러스의 대규모 농축은 문헌[Paul et al., Human Gene Therapy 4:609-615 (1993)]에 기재되어 있다. 정화된 공급물의 TFF 농축은 기술적으로 관리 가능한 부피의 정화된 공급물을 크로마토그래피에 적용되게 할 수 있고, 긴 재순환 시간을 필요로 하는 일 없이 칼럼의 보다 타당한 크기 설정을 허용한다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 2배 내지 적어도 10배 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 10배 내지 적어도 20배 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 20배 내지 적어도 50배 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 약 20배 농축된다. 당업자는 또한 TFF가 또한 투석을 통해서 정화된 공급물로부터 소분자 불순물(예를 들어, 배지 성분, 혈청 알부민 또는 다른 혈청 단백질을 포함하는 세포 배양물 오염물질)을 제거하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물을 투석시켜 소분자 불순물을 제거한다. 일부 실시형태에서, 투석은 약 3 내지 약 10 투석 부피의 완충액의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투석은 약 5 투석 부피의 완충액의 사용을 포함한다. 당업자는 또한 TFF가 또한 정제 공정에서 다음 단계를 수행하기 전에 완충액을 교환하는 것이 바람직한 정제 공정의 임의의 단계에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 정화된 공급물로부터 rAAV를 단리시키는 방법은 TFF를 사용하여 완충액을 교환시키는 것을 포함한다.
친화도 크로마토그래피를 사용하여 조성물로부터 rAAV 입자를 단리시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정화된 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시킨다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피를 사용하여 접선 유동 여과에 적용된 정화된 공급물로부터 rAAV 입자를 단리시킨다. 적합한 친화도 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있고, 이것은 비제한적으로 AVB SepharoseTM, POROSTM CaptureSelectTM AAVX 친화도 수지, POROSTM CaptureSelectTM AAV9 친화도 수지 및 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화도 수지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROSTM CaptureSelectTM AAV9 친화도 수지이다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화도 수지이다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROSTM CaptureSelectTM AAVX 친화도 수지이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 조성물로부터 rAAV 입자를 단리시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 최종 농축 및 폴리쉬(polish) 단계로서 친화도 크로마토그래피 이후에 사용된다. 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있고, 비제한적으로 Unosphere Q(바이오래드사(Biorad), 미국 캘리포니아주 허큘스 소재) 및 N-하전된 아미노 또는 이미노 수지, 예컨대, 예를 들어, POROS 50 PI 또는 임의의 DEAE, TMAE, 3차 또는 4차 아민 또는 당업계에 공지된 PEI계 수지(미국 특허 제6,989,264호; 문헌[Brument et al., Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); Gao et al., Hum. Gene Therapy11:2079-2091(2000)])을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 4차 아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 매질은 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 글리시딜메타크릴레이트-에틸렌다이메타크릴레이트 또는 스타이렌-다이바이닐벤젠 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIMmultusTM QA-1 어드밴스트 복합 칼럼(4차 아민), CIMmultusTM DEAE-1 어드밴스트 복합 칼럼(다이에틸아미노), CIM® QA Disk(4차 아민), CIM® DEAE 및 CIM® EDA Disk(에틸렌 다이아미노)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIMmultusTM QA-1 어드밴스트 복합 칼럼(4차 아민)이다. 일부 실시형태에서, 모노리쓰 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIM® QA Disk(4차 아민)이다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIM QA(비아 세퍼레이션사(BIA Separations), 슬로베니아 소재)이다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 BIA CIM® QA-80(칼럼 부피는 80㎖임)이다. 당업자는, 하류 정제 단계에 의해서 도입될 수 있는 불순물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 불순물을 제거하면서, rAAV가 수지에 결합되어 유지되도록 하는 적합한 이온 농도의 세척 완충액이 식별될 수 있다는 것을 인식할 수 있다.
일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 미국 가출원 제62/684,835호(출원일: 2018년 6월 14일, 발명의 명칭 "Anion Exchange Chromatography for Recombinant AAV production"에 개시된 방법에 따라서 수행된다.
추가 실시형태에서 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 생산된 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합한 생물학적으로 허용 가능한 제형, 기체, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "약제학적으로 허용 가능한" 조성물은 생물학적으로 바람직하거나 달리 바람직한 물질이며, 예를 들어, 이 물질은 실질적인 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 약제학적 조성물은 예를 들어, 개시된 방법에 따라서 단리된 rAAV를 대상체에게 투여할 때 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 약제학적 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달과 양립성인 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀션(예를 들어, 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르(elixir), 분산 및 현탁 배지, 코팅, 등장제 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 또는 결정을 포함한다. 보충 활성 화합물(예를 들어, 보존제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제)가 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 약제학적 조성물은 본 명세서에 제시된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 바와 같이, 특정 투여 또는 전달 경로와 양립성이도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 다양한 경로에 의해서 투여되기에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 rAAV 입자 및 방법 및 용도에 적절한 약제학적 조성물 및 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.; 및 Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315] 참고).
일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적 단위 용량이다. "단위 용량"은 치료될 대상체를 위한 단위 투여량으로서 적절한 물리적으로 구별되는 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 1회 이상의 용량으로 투여되는 경우 목적하는 효과(예를 들어, 예방적 또는 치료적 효과)를 생성하도록 계산된 선택적으로 약제학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 회합된 미리 결정된 양을 함유한다. 단위 용량 형태는 예를 들어, 액체 조성물 또는 동결-건조 또는 동결건조 상태의 조성물; 예를 들어, 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있는 멸균 액체 담체를 포함할 수 있는 앰플 및 바이알 내에 존재할 수 있다. 개별 단위 용량 형태는 다회-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 재조합 벡터(예를 들어, AAV) 서열, 플라스미드, 벡터 게놈 및 재조합 바이러스 입자 및 이의 약제학적 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해서 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 포장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 혈청형은 AAV8이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 혈청형은 AAV9이다.
실시예
실시예 1. rAAV 수율에 대한 염화나트륨, 부티르산 나트륨 및/또는 발프로산 나트륨의 효과.
HEK293 부유 세포 기반 공정에서 rAAV 수율에 대한 염화나트륨, 부티르산 나트륨 및/또는 발프로산 나트륨의 효과를 시험하였다. HEK293 세포를 어드밴스트 마이크로스케일 생물반응기(advanced microscale bioreactor)에서 1×10e6개의 살아 있는 세포/㎖ 밀도로 시딩하였다. 배지는 100mM의 NaCl을 포함하였다. 48시간 ECD(Elapsed Culture Duration)에, 세포에 폴리에틸렌이민 및 아데노-바이러스 헬퍼 기능, 트랜스진 및 AAV 2/8 Rep/Cap을 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입 24시간 후, NaCl, Na 부티레이트 및/또는 Na 발프로에이트를 배양물에 첨가하였다. 시험된 조건은 0, 25mM 및 90mM의 NaCl, 0, 2mM 및 4mM의 Na 부티레이트 및 0, 1.5mM 및 3mM의 Na 발프로에이트였다. 조건의 완전 인자 조합을 36개 반응 조건을 사용하여 시험하였다. 배양물의 상청액을 168시간 ECD, 즉, 형질주입 5일 후에 수거하였다. 얻은 rAAV 수율을 도 1에 도시한다. 60mM의 염화나트륨, 및 4mM의 부티르산 나트륨 또는 3mM의 발프로산 나트륨을 형질주입 1일 후에 첨가함으로써 바이러스 수율의 상당한 개선을 얻었다.
실시예 2. rAAV 수율에 대한 염화나트륨 및/또는 발프로산 나트륨의 효과.
HEK293 부유 세포 기반 공정에서 rAAV 수율에 대한 상이한 시간에 첨가된 염화나트륨, 발프로산 나트륨 및 이들의 조합물의 효과를 시험하였다. HEK293 부유 세포를 어드밴스트 마이크로스케일 생물반응기에서 1×10e6개의 살아 있는 세포/㎖ 밀도로 시딩하였다. 배지는 100mM의 NaCl을 포함하였다. 48시간 ECD(Elapsed Culture Duration)에, 세포에 폴리에틸렌이민 및 아데노-바이러스 헬퍼 기능, 트랜스진 및 AAV 2/8 Rep/Cap을 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 형질주입하였다. NaCl 및/또는 Na 발프로에이트를 형질주입 4시간, 24시간 또는 48시간 후에 배양물에 첨가하였다. 시험된 NaCl 및 Na 발프로에이트 농도는 0, 30mM 및 60mM의 NaCl, 및 0, 1mM 및 2mM의 Na 발프로에이트였다. 배양물의 상청액을 168시간 ECD, 즉, 형질주입 5일 후에 수거하였다. 얻은 rAAV 수율을 도 2에 도시한다. 24가지의 상이한 조건을 시험하였고, 실험 전략의 설계를 사용하여 분석하였다. 24-조건 DOE 시험으로부터 생성된 모델은, 형질주입 4시간 후에 2mM의 Na 발프로에이트를 첨가하고, 그 다음 형질주입 24시간 후에 30mM의 NaCl을 첨가하는 것이 바이러스 수율을 상당히 증가시킨다고 예측하였다.
실시예 3. NaCl 인핸서를 사용한 rAAV의 대규모 생산.
rAAV 수율에 대한 NaCl의 효과를 트랜스진을 캡시드화한 AAV8을 발현하는 HEK293 세포의 50리터 배양물에서 시험하였다. HEK 부유 배양물을 표준 공정을 사용하여 성장시켰다. 세포를 약 4×10e6개의 살아있는 세포로 희석시켰다. 사용된 배지는 100mM의 NaCl을 포함하였다. 희석한지 24시간 후에 세포에 폴리에틸렌이민 및 아데노-바이러스 헬퍼 기능, 트랜스진 및 AAV Cap/Rev를 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입 24시간 후에, 충분한 NaCl을 첨가하여 최종 NaCl 농도를 60mM만큼(즉, 최종 NaCl 농도는 약 160mM이었음) 증가시켰다. 상청액을 형질주입 4일 후 수거하였다. 공정은 1×10e+11개의 게놈 카피(GC)/㎖ 및 9×10e+10을 산출하였다. 이것은 형질주입 후 NaCl 농도를 증가시키지 않은 동일한 공정의 수율보다 약 2배 더 높다.
실시예 4. NaCl 및 프로피온산 나트륨을 사용한 AAV의 대규모 생산.
rAAV 수율에 대한 NaCl의 효과를 트랜스진을 캡시드화한 AAV8을 발현하는 HEK293 세포의 50리터 배양물에서 시험하였다. HEK 부유 배양물을 표준 공정을 사용하여 성장시켰다. 세포를 약 4×10e6개의 살아있는 세포로 희석시켰다. 사용된 배지는 100mM의 NaCl을 포함하였다. 희석한지 24시간 후에 세포에 폴리에틸렌이민 및 아데노-바이러스 헬퍼 기능, 트랜스진 및 AAV 2/8 Rep/Cap를 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입 24시간 후에, 충분한 NaCl을 첨가하여 최종 NaCl 농도를 30mM만큼(즉, 최종 NaCl 농도는 약 130mM이었음) 증가시켰고, 충분한 프로피온산 나트륨(NaPr)을 첨가하여 최종 NaPr 농도를 2mM로 증가시켰다(NaPr은 시작 시에 배지에 존재하지 않음). 상청액을 형질주입 4일 후 수거하였다. 공정은 1×10e+11개의 게놈 카피(GC)/㎖를 산출하였다. 이것은 형질주입 후 NaCl 및 NaPr 농도를 증가시키지 않은 동일한 공정의 수율보다 약 1.7배 더 높았다. 도 3. 또한, 역가는 품질을 손상시키지 않고 상당히 증가되었다. 생성물 품질, 예를 들어, 완전 캡시드 %, 단편화된 rAAV % 및 잔류하는 DNA, 예컨대, 잔류하는 18S(잔류하는 포유동물 게놈 DNA를 예측하는데 사용되는 18S RNA에 대한 유전자), 잔류하는 E1a 및 잔류하는 플라스미드는 인핸서가 없는 유사한 공정에 비해서 인핸서가 있는 대규모 생산 공정에 의해서 부정적으로 영향을 받지 않았다.
실시예 5. rAAV 수율에 대한 염화나트륨 및/또는 프로피온산 나트륨의 효과.
트랜스진을 캡시드화한 rAAV9 입자를 발현하는 HEK293 세포의 부유 배양물에서 rAAV 수율에 대한 염화나트륨 및 프로피온산 나트륨(NaPr)(써모피셔 사이언티픽사)의 효과. HEK293 세포를 어드밴스트 마이크로스케일 생물반응기에서 1×10e6개의 살아 있는 세포/㎖ 밀도로 시딩하였다. 배지는 100mM의 NaCl을 포함하였다. 48시간 ECD에, 세포에 폴리에틸렌이민 및 아데노-바이러스 헬퍼 기능, 트랜스진 및 AAV 2/9 Rep/Cap을 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입 4, 20 또는 36시간 후, NaCl, NaPr, 항-클럼프(clump), EFC+ 및/또는 Na 발프로에이트를 배양물에 첨가하였다. 시험된 조건은 0, 30mM 및 60mM의 NaCl, 0, 2mM 및 4mM의 NaPr이었다. 실험 접근법의 설계를 사용하여 다수의 조건을 시험하였다. 배양물의 상청액을 168시간 ECD, 즉, 형질주입 5일 후에 수거하였다. rAAV 수율을 얻었다. 형질주입 20시간 후에 30mM의 염화나트륨 및 2mM의 프로피온산 나트륨 둘 다를 첨가함으로써 바이러스 수율의 상당하고 상승작용적 개선을 얻었다. NaCl 및/또는 NaPr을 첨가함으로써 생성된 역가 개선을 도 4에 도시하는데, 여기서 다른 시험 조건의 효과를 평균낸다. 증가된 NaCl의 부재 하에서 2mM의 프로피온산 나트륨은 역가의 약 1.5배 증가를 초래하였다. 프로피온산 나트륨의 부재 하에서 증가된 NaCl은 역가의 약 1.2배 증가를 초래하였다. 조합물에서 2mM의 프로피온산 나트륨 및 증가된 NaCl은 형질주입 후 NaCl 및 NaPr 농도가 증가하지 않은 동일한 공정의 기준선 수율보다 약 2배 더 높은 수율을 초래하였다. 관찰된 약 2배 증가는 NaPr 및 증가된 NaCl의 효과가 상가적인 경우 예상될 것보다 더 높다.
실시예 6. rAAV 수율에 대한 염화나트륨 및/또는 프로피온산 나트륨의 효과.
트랜스진을 캡시드화한 rAAV9 입자를 발현하는 HEK293 세포의 부유 배양물에서 rAAV 수율에 대한 염화나트륨 및 프로피온산 나트륨(써모피셔 사이언티픽사)의 효과. HEK293 세포를 어드밴스트 마이크로스케일 생물반응기에서 1×10e6개의 살아 있는 세포/㎖ 밀도로 시딩하였다. 배지는 100mM의 NaCl을 포함하였다. 48시간 ECD에, 세포에 폴리에틸렌이민 및 아데노-바이러스 헬퍼 기능, 트랜스진 및 AAV 2/9 Rep/Cap을 암호화하는 3개의 플라스미드의 혼합물을 형질주입하였다. 형질주입 20시간 후에, NaCl 및 프로피온산 나트륨(NaPr)을 배양물에 첨가하였다. 시험된 조건은 0 및 30mM의 NaCl, 0 및 2mM의 NaPr이었다. 조건의 조합을 실험 전략의 설계를 사용하여 다수의 반응 조건에서 시험하였다. 배양물의 상청액을 168시간 ECD, 즉, 형질주입 5일 후에 수거하였다. rAAV 수율을 얻었다. 형질주입 20시간 후에 30mM의 염화나트륨 및 2mM의 프로피온산 나트륨 둘 다를 첨가함으로써 바이러스 수율의 상당한 개선을 얻었다. NaCl 및/또는 NaPr을 첨가함으로써 생성된 역가 개선을 도 5에 도시하는데, 여기서 다른 시험 조건의 효과를 평균낸다. 이것은 형질주입 후 NaCl 및 NaPr 농도를 증가시키지 않은 동일한 공정의 수율보다 약 1.6배 더 높았다.
개시된 방법이 가장 실질적이고 바람직한 실시형태인 것으로 현재 간주되는 것과 관련하여 기재되었지만, 본 개시내용에 포함되는 방법은 개시된 실시형태에 제한되지 않고, 그 반대로, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주에 포함되는 다양한 변형 및 등가의 배열을 포함하도록 의도된다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 및 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 둘 다를 포함한 수탁 번호/데이터베이스 서열은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 또는 수탁 번호/데이터베이스 서열이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조에 의해 그렇게 제시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 이들의 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
Claims (129)
- rAAV 입자의 생산 방법으로서,
(a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 세포에
i. 패키징될 rAAV 게놈,
ii. 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및
iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질
중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
(c) 상기 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(d) (b) 이후에 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 동안 유지시키는 단계
를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법. - 제2항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 1시간 내지 약 48시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 12시간 내지 약 36시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 18시간 내지 약 30시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 48시간 미만 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 36시간 미만 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 적어도 약 6시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 적어도 약 12시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 6시간, 약 9시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간 또는 약 48시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 20시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단계 b) 약 24시간 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 20mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 80mM 또는 약 70mM 내지 약 120 mM만큼 증가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 40mM 내지 약 140mM만큼 증가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM로 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 나트륨염을 첨가하기 전에, 상기 세포 배양물은 약 90mM 내지 약 120mM의 NaCl을 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 저해제 및 상기 나트륨염은 임의의 순서로 별도로 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 b) 이전에 투여되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 b) 이후에 투여되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제19항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가한 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 5분 내지 약 6시간 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 20분 내지 약 2시간 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 2시간 미만 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 1시간 미만 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 5분 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 20분 후에 투여되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 5일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에
i. 패키징될 rAAV 게놈,
ii. 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및
iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질
을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법. - 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 헬퍼 기능은 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자 중 적어도 하나를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하는 단계는 형질주입에 의해서 수행되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포, HEK 유래 세포, CHO 세포, CHO 유래 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 또는 PerC6 세포인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 부유 배양물(suspension culture)인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자를 회수하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 5×10e+10GC/㎖ 초과의 rAAV 입자를 생산하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 GC/㎖로 측정되는 경우 상기 HDAC 저해제 및 나트륨염이 첨가되지 않은 배양물보다 rAAV 입자를 적어도 약 2배 더 많이 생산하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 20,000리터의 부피를 갖는, rAAV 입자의 생산 방법.
- rAAV 입자의 생산 방법으로서,
(a) rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계
를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법. - 제51항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제52항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 5mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 0.5mM 내지 약 3mM의 최종 HDAC 저해제 농도를 갖는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 20mM 내지 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도가 약 20mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 80mM 또는 약 70mM 내지 약 120 mM만큼 증가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 40mM 내지 약 140mM만큼 증가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM로 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 나트륨염의 상기 최종 농도는 약 150mM 내지 약 240mM인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염을 첨가하기 전에, 상기 세포 배양물은 약 90mM 내지 약 120mM의 NaCl을 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 저해제 및 상기 나트륨염은 임의의 순서로 별도로 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가한 이후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 5분 내지 약 6시간 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 20분 내지 약 2시간 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 2시간 미만 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 약 1시간 미만 후에 첨가되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 5분 후에 투여되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 나트륨염은 상기 HDAC 저해제를 첨가하고 적어도 약 20분 후에 투여되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 14일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 5일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산 방법.
- rAAV 입자의 생산 방법으로서, 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 단쇄 지방산 또는 이의 염인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제78항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로에이트, 프로피오네이트, 부티레이트 또는 이들의 염인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 0.5mM 내지 약 5mM의 상기 HDAC 저해제를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 0.5mM 내지 약 3mM의 상기 HDAC 저해제를 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 120mM 내지 약 250mM의 염화나트륨을 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 130mM 내지 약 160mM, 약 150mM 내지 약 190mM 또는 약 180mM 내지 약 240mM의 NaCl 염화나트륨을 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 150mM 내지 약 240mM의 염화나트륨을 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 생산할 수 있는 상기 세포는
(a) 패키징될 rAAV 게놈
(b) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능
(c) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및
(d) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질
중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된, rAAV 입자의 생산 방법. - 제51항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV를 생산할 수 있는 상기 세포는
(a) 패키징될 rAAV 게놈,
(b) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능
(c) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및
(d) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질
을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 형질주입된, rAAV 입자의 생산 방법. - 제51항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 HEK293 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 또는 PerC6 세포이되, 선택적으로 상기 세포는 HEK293 세포인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 부유 배양물인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서의 상기 배양은 약 2일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 14일 동안인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제77항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서의 상기 배양은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제93항에 있어서, 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서의 상기 배양은 약 5일 동안인, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자를 회수하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 5×10e+10GC/㎖ 내지 약 1×10e+12GC/㎖의 rAAV 입자를 생산하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- 제51항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 GC/㎖로 측정되는 경우 상기 HDAC 저해제 및 나트륨염이 첨가되지 않은 배양물보다 rAAV 입자를 적어도 약 2배 더 많이 생산하는, rAAV 입자의 생산 방법.
- rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법으로서,
(a) 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 세포에
i. 패키징될 rAAV 게놈,
ii. 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
iii. 패키징에 충분한 AAV rep 단백질 및
iv. 패키징에 충분한 AAV cap 단백질
중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계;
(c) 상기 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(d) (b) 이후에 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 15일 동안 유지시키는 단계
를 포함하는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제98항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제98항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 40mM 내지 약 150mM만큼 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법으로서,
(a) rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 세포 배양물에 HDAC 저해제를 약 0.1mM 내지 약 20mM의 최종 농도로 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양물을 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 유지시키는 단계
를 포함하는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제103항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제103항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물에 나트륨염을 상기 나트륨염의 최종 농도를 약 120mM 내지 약 250mM로 증가시키기에 충분한 양으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나트륨염은 염화나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제103항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 약 2일 내지 약 10일 또는 약 5일 내지 14일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제103항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제109항에 있어서, 상기 세포 배양물은 b) 이후에 약 5일 동안 유지되는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법으로서, 약 0.1mM 내지 약 20mM의 HDAC 저해제를 포함하는 배지에서 상기 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건 하에서 rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포를 배양하는 단계를 포함하는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 발프로산 나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제111항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는 프로피온산 나트륨인, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지는 약 120mM 내지 약 250mM의 염화나트륨을 더 포함하는, rAAV 입자의 생산을 증가시키는 방법.
- 제1항 내지 114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자는 AAV8, AAV9, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 또는 AAV.hu37 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 20,000리터의 부피를 갖는, 방법.
- 제118항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 5,000리터의 부피를 갖는, 방법.
- 제118항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 2,000리터의 부피를 갖는, 방법.
- 제118항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 1,000리터의 부피를 갖는, 방법.
- 제118항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 50리터 내지 약 500리터의 부피를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 생산된 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제50항 또는 제98항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패키징된 rAAV 게놈은 트랜스진(transgene)을 포함하는, 방법.
- 제124항에 있어서, 상기 트랜스진은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는, 방법.
- 제125항에 있어서, 상기 조절 요소는 인핸서, 프로모터 및 polyA 영역 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제125항 또는 제126항에 있어서, 상기 조절 요소 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이종(heterologous)인, 방법.
- 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진은 항-VEGF Fab, 이두로니다제(iduronidase: IDUA), 이두레네이트 2-설파타제(IDS), 저밀도 지질단백질 수용체(low-density lipoprotein receptor: LDLR), 트라이펩티딜 펩티다제 1(tripeptidyl peptidase: TPP1) 또는 VEGF 수용체 1의 비-막 연관 스플라이스 변이체(non-membrane associated splice variant of VEGF receptor 1)(sFlt-1)인, 방법.
- 제124항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진은 감마-사코글리칸, Rab Escort 단백질 1(REP1/CHM), 레티노이드 아이소머로하이드롤라제(retinoid isomerohydrolase: RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(cyclic nucleotide gated channel alpha 3: CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(cyclic nucleotide gated channel beta 3: CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카복실라제(aromatic L-amino acid decarboxylase: AADC), 리소좀-연관 구성원 단백질 2 아이소폼 B(lysosome-associated membrane protein 2 isoform B: LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제(retinitis pigmentosa GTPase regulator: RPGR), 레티노쉬신(retinoschisin: RS1), 근소포체 칼슘(sarcoplasmic reticulum calcium) ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주-유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(aquaporin1: AQP1), 디스트로핀(dystrophin), 마이오튜불라린 1(myotubularin 1: MTM1), 폴리스타틴(follistatin: FST), 글루코스-6-포스파타제(glucose-6-phosphatase: G6Pase), 아포지질단백질 A2(apolipoprotein A2: APOA2), 유리딘 다이포스페이트 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1: UGT1A1), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B: ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다제(N-acetyl-alpha-glucosaminidase: NAGLU), 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase: GAA), 알파-갈락토시다제(alpha-galactosidase: GLA), 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase: GLB1), 지질단백질 리파제(lipoprotein lipase: LPL), 알파 1-항트립신(alpha 1-antitrypsin: AAT), 포스포다이에스터라제 6B(phosphodiesterase 6B: PDE6B), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(ornithine carbamoyltransferase) 9OTC), 생존 운동 뉴런(survival motor neuron: SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(neurturin: NRTN), 뉴로트로핀(Neurotrophin)-3 (NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase: PBGD), 신경 성장 인자(NGF), 미토콘드리아 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(protective protein cathepsin A: PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자(proto-oncogene), 타이로신 카이나제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(tumor necrosis factor receptor: TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체인, 방법.
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