CN112567027A - 用于重组aav生产的可扩展方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的改善方法。在一些实施方案中，本文提供的用于产生重组AAV(rAAV)颗粒的方法包括在组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂存在的情况下培养能够产生rAAV颗粒的细胞。在一些实施方案中，本文提供的用于产生重组AAV(rAAV)颗粒的方法包括在组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和增加量的钠盐存在的情况下培养能够产生rAAV颗粒的细胞。

Description

用于重组AAV生产的可扩展方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月10日提交的美国临时申请号62/717,212的优先权，所述临时申请整体并入本文。
背景技术
基于重组腺相关病毒(rAAV)的载体目前是开发中使用最广泛的基因疗法产物。rAAV载体系统的优选用途部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、AAV转导非分裂细胞和分裂细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。此外，不同的天然存在AAV载体血清型和重组AAV载体血清型特异性地靶向不同的组织、器官和细胞，并帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫，从而扩大基于AAV的基因疗法的治疗性应用。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂已用于转染方案中，以在重组动物细胞培养物中表达蛋白质。例如，Vazquez-Lombardi例证了使用HDAC抑制剂(“增强剂1和2”)作为具有表达IgG的质粒的共转染试剂，并且此外在第二天将所述增强剂加入到培养物中(Vazquez-Lombardi等,Nature Protocols,13(1):99-117(2018)，于2017年12月14日在线公布)。WO2013166339A1描述了在小于50L的小型培养条件下使用增强剂1(丙戊酸)和增强剂2(丙酸钠)，观察到单独增强剂2没有强大的作用，但与增强剂1组合可为重组IgG生产提供益处。Chun报道的是，使用丙酸和丁酸可增强CHO细胞产生重组B结构域缺失因子VIII，然而所述两种链烷酸均抑制细胞生长，并且rFVIII的产生在约3.5天时达到最大(Chun等,Biotechnology Letters,25:315-319(2003))。Cervera报道的是，在HEK293悬浮细胞培养物中使用转染增强剂的混合物来增加包含单一重组多肽的病毒样颗粒(例如Gag样病毒样颗粒)的产生(Cervera等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,99:9935-9949(2015))。然而，这些报道均未公开使用组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂来增加使基因组衣壳化的病毒颗粒的重组生产，例如表达包含多个多肽和核苷酸基因组的rAAV颗粒的培养细胞。
Tiernan和Tipper公开了HDAC抑制剂曲古抑菌素A在产生包含rAAV转基因的稳定细胞系的方法中的用途(WO 2018/175775)。Tiernan和Tipper公开了包括重组病毒载体与HDAC抑制剂共转染的方法，可增强将病毒载体整合到宿主细胞基因组中并提高从宿主细胞中收获的病毒载体的产量。Tiernan和Tipper公开了在rAAV颗粒的生产中使用稳定的细胞系，然而没有教导或建议在rAAV颗粒的生产培养中使用HDAC抑制剂。
在基于AAV的基因疗法可更广泛地用于临床后期和商业用途之前，需要开发用于大规模符合GMP的rAAV颗粒生产的新方法。上游加工开发的主要挑战是建立可扩展的、具有成本效益的、符合GMP的rAAV生产方法。使用目前批准的方法，制造单次单位剂量的rAAV颗粒可能花费数万美元。因此，需要符合GMP的可扩展方法来生产rAAV颗粒。
发明内容
本公开提供了用于产生重组AAV(rAAV)颗粒的方法，其包括在允许产生rAAV颗粒的条件下，在有效量的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂存在的情况下培养能够产生rAAV颗粒的细胞。在一些实施方案中，在HDAC抑制剂和约110mM与250mM之间的浓度的钠盐存在的情况下培养细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法涵盖分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法涵盖收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、无菌过滤或它们的任何组合。在一些实施方案中，本文公开的方法不包括离心。在一些实施方案中，本文公开的方法包括收获细胞培养物、通过深度过滤澄清所述收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。
在一些实施方案中，本公开提供：
[1.]一种产生rAAV颗粒的方法，其包括：
(a)提供包含细胞的细胞培养物；
(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：
i.待包装的rAAV基因组，
ii.包装所需的腺病毒辅助功能，
iii.足以包装的AAV rep蛋白以及
iv.足以包装的AAV cap蛋白；
(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；
(d)在(b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约15天之间。
[2.]如[2]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是短链脂肪酸或其盐。
[3.]如[1]或[2]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或它们的盐。
[4.]如[3]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸钠。
[5.]如[3]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙酸钠。
[6.]如[1]至[5]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约5mM之间。
[7.]如[1]至[5]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约3mM之间。
[8.]如[1]至[7]中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后加入。
[9.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约1小时与约48小时之间加入。
[10.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约12小时与约36小时之间加入。
[11.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约18小时与约30小时之间加入。
[12.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后少于约48小时加入。
[13.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后少于约36小时加入。
[14.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后至少约6小时加入。
[15.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后至少约12小时加入。
[16.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约6小时、约9小时、约12小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时加入。
[17.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约20小时加入。
[18.]如[8]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约24小时加入。
[19.]如[1]至[18]中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约150mM之间。
[20.]如[19]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约50mM之间、约40mM与约80mM之间或约70mM与约120mM之间。
[21.]如[19]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约140mM之间。
[22.]如[1]至[21]中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。
[23.]如[22]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间。
[24.]如[22]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约150mM与约240mM之间。
[25.]如[22]所述的方法，其中在加入所述钠盐之前，所述细胞培养物包含约90mM与约120mM之间的NaCl。
[26.]如[19]至[25]中任一项所述的方法，其中所述钠盐是氯化钠。
[27.]如[19]至[26]中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和所述钠盐以任何顺序分开加入。
[28.]如[19]至[27]中任一项所述的方法，其中所述钠盐在b)之前加入。
[29.]如[19]至[27]中任一项所述的方法，其中所述钠盐在b)后加入。
[30.]如[19]至[29]中任一项所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后加入所述钠盐。
[31.]如[30]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约5分钟与约6小时之间加入所述钠盐。
[32.]如[30]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约20分钟与约2小时之间加入所述钠盐。
[33.]如[30]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约2小时加入所述钠盐。
[34.]如[30]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约1小时加入所述钠盐。
[35.]如[30]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约5分钟加入所述钠盐。
[36.]如[30]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约20分钟加入所述钠盐。
[37.]如[1]至[36]中任一项所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
[38.]如[37]所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约5天。
[39.]如[1]至[38]中任一项所述的方法，其包括将编码以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：
i.待包装的rAAV基因组，
ii.包装所需的腺病毒辅助功能，
iii.足以包装的AAV rep蛋白以及
iv.足以包装的AAV cap蛋白。
[40.]如[1]至[39]中任一项所述的方法，其中所述腺病毒辅助功能包括腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因中的至少一种。
[41.]如[1]至[40]中任一项所述的方法，其中将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中是通过转染。
[42.]如[1]至[41]中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
[43.]如[1]至[41]中任一项所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞。
[44.]如[1]至[41]中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞或PerC6细胞。
[45.]如[1]至[41]中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞。
[46.]如[1]至[45]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物。
[47.]如[1]至[46]中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
[48.]如[1]至[47]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生大于5x10e+10GC/ml的rAAV颗粒。
[49.]如[1]至[48]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生的以GC/ml测量的rAAV颗粒的量是培养物在不存在加入所述HDAC抑制剂和钠盐情况下的至少约两倍。
[50.]如[1]至[49]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约20,000升之间。
[51.]一种用于产生rAAV颗粒的方法，其包括：
(a)提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；
(b)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(c)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。
[52.]如[51]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是短链脂肪酸或其盐。
[53.]如[52]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或它们的盐。
[54.]如[53]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙酸钠。
[55.]如[53]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸钠。
[56.]如[51]至[55]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约5mM之间。
[57.]如[51]至[55]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约3mM之间。
[58.]如[51]至[57]中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。
[59.]如[58]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约50mM之间、约40mM与约80mM之间或约70mM与约120mM之间。
[60.]如[58]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约140mM之间。
[61.]如[51]至[60]中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。
[62.]如[61]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间。
[63.]如[61]所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约150mM与约240mM之间。
[64.]如[51]至[63]中任一项所述的方法，其中在加入所述钠盐之前，所述细胞培养物包含约90mM与约120mM之间的NaCl。
[65.]如[51]至[64]中任一项所述的方法，其中所述钠盐是氯化钠。
[66.]如[51]至[65]中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和所述钠盐以任何顺序分开加入。
[67.]如[66]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后加入所述钠盐。
[68.]如[67]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约5分钟与约6小时之间加入所述钠盐。
[69.]如[67]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约20分钟与约2小时之间加入所述钠盐。
[70.]如[67]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约2小时加入所述钠盐。
[71.]如[67]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约1小时加入所述钠盐。
[72.]如[67]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约5分钟加入所述钠盐。
[73.]如[67]所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约20分钟加入所述钠盐。
[74.]如[51]至[73]中任一项所述的方法，其中在b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间或约5天与约14天之间。
[75.]如[51]至[73]中任一项所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
[76.]如[75]所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约5天。
[77.]一种用于产生rAAV颗粒的方法，其包括在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV颗粒的细胞。
[78.]如[77]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是短链脂肪酸或其盐。
[79.]如[78]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或它们的盐。
[80.]如[79]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸钠。
[81.]如[79]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙酸钠。
[82.]如[77]至[81]中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约0.5mM与约5mM之间的所述HDAC抑制剂。
[83.]如[77]至[81]中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约0.5mM与约3mM之间的所述HDAC抑制剂。
[84.]如[77]至[83]中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约120mM与约250mM之间的氯化钠。
[85.]如[77]至[83]中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间的氯化钠。
[86.]如[77]至[83]中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约150mM与约240mM之间的氯化钠。
[87.]如[51]至[86]中任一项所述的方法，其中能够产生rAAV的所述细胞已被编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸转染：
(a)待包装的rAAV基因组，
(b)包装所需的腺病毒辅助功能，
(c)足以包装的AAV rep蛋白以及
(d)足以包装的AAV cap蛋白。
[88.]如[51]至[86]中任一项所述的方法，其中能够产生rAAV的所述细胞已被编码以下物质的一种或多种多核苷酸转染：
(a)待包装的rAAV基因组，
(b)包装所需的腺病毒辅助功能，
(c)足以包装的AAV rep蛋白以及
(d)足以包装的AAV cap蛋白。
[89.]如[51]至[88]中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞。
[90.]如[51]至[88]中任一项所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞或PerC6细胞，任选地其中所述细胞是HEK293细胞。
[91.]如[51]至[90]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物是悬浮培养物。
[92.]如[77]至[91]中任一项所述的方法，其中在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，所述培养为约2天与约10天之间或约5天与约14天之间。
[93.]如[77]至[91]中任一项所述的方法，其中在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，所述培养为约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
[94.]如[93]所述的方法，其中在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，所述培养为约5天。
[95.]如[51]至[94]中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
[96.]如[51]至[95]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。
[97.]如[51]至[96]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生的以GC/ml测量的rAAV颗粒的量是培养物在不存在加入所述HDAC抑制剂和钠盐情况下的至少约两倍。
[98.]一种增加rAAV颗粒产生的方法，其包括：
(a)提供包含细胞的细胞培养物；
(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：
i.待包装的rAAV基因组，
ii.包装所需的腺病毒辅助功能，
iii.足以包装的AAV rep蛋白以及
iv.足以包装的AAV cap蛋白；
(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(d)在(b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约15天之间。
[99.]如[98]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸钠。
[100.]如[98]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙酸钠。
[101.]如[98]至[100]中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约150mM之间。
[102.]如[98]至[101]中任一项所述的方法，其中所述钠盐是氯化钠。
[103.]一种增加rAAV颗粒产生的方法，其包括：
(a)提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；
(b)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(c)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。
[104.]如[103]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸钠。
[105.]如[103]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙酸钠。
[106.]如[103]至[105]中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。
[107.]如[103]至[106]中任一项所述的方法，其中所述钠盐是氯化钠。
[108.]如[103]至[107]中任一项所述的方法，其中在b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间或约5天与约14天之间。
[109.]如[103]至[107]中任一项所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
[110.]如[109]所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约5天。
[111.]一种增加rAAV颗粒产生的方法，其包括在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV颗粒的细胞。
[112.]如[111]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙戊酸钠。
[113.]如[111]所述的方法，其中所述HDAC抑制剂是丙酸钠。
[114.]如[111]至[113]中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约120mM与约250mM之间的氯化钠。
[115.]如[1]至[114]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
[116.]如[1]至[114]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。
[117.]如[1]至[114]中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
[118.]如[1]至[117]中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约20,000升之间。
[119.]如[118]所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约5,000升之间。
[120.]如[118]所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约2,000升之间。
[121.]如[118]所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约1,000升之间。
[122.]如[118]所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约500升之间。
[123.]一种组合物，其包含通过如[1]至[122]中任一项所述的方法产生的分离的rAAV颗粒。
[124.]如[1]至[50]或[98]至[102]中任一项所述的方法，其中包装的所述rAAV基因组包含转基因。
[125.]如[124]所述的方法，其中所述转基因包含可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的调节元件。
[126.]如[125]所述的方法，其中所述调节元件包含增强子、启动子和polyA区域中的一种或多种。
[127.]如[125]或[126]所述的方法，其中所述调节元件和编码多肽的多核苷酸是异源的。
[128.]如[124]至[127]中任一项所述的方法，其中所述转基因编码抗VEGF Fab、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。
[129.]如[124]至[127]中任一项所述的方法，其中所述转基因编码γ-肌聚糖、Rab护航蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普(aflibercept)、battenin(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、肌微管素(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、存活运动神经元(SMN1)、存活运动神经元(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白(dysferlin)、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括进一步下游加工根据[1]至[129]中任一项所述的方法产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述下游加工是以下中的至少一种：收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、无菌过滤。在其他实施方案中，所述上游加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱和无菌过滤。在一些实施方案中，所述下游加工不包括离心所述收获的细胞培养物。
附图说明
图1.加入氯化钠、丁酸钠和/或丙戊酸钠后获得的重组病毒产量。示出了加入试剂的最终浓度。基础培养基包含约100mM氯化钠，但不包含丁酸钠或丙戊酸钠。
图2加入氯化钠和/或丙戊酸钠后获得的重组病毒产量。示出了加入试剂的最终浓度。基础培养基包含约100mM氯化钠，但不包含丙戊酸钠。
图3.使用NaCl和丙酸钠大规模生产rAAV8颗粒的病毒产量。
图4.加入氯化钠和/或丙酸钠后获得的rAAV9产量。
图5.加入氯化钠和/或丙酸钠后获得的rAAV9产量。
具体实施方式
在一些实施方案中，本公开提供了通过在产生rAAV颗粒的条件下，在有效量的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂存在的情况下培养能够产生rAAV颗粒的细胞来产生rAAV颗粒的方法。在一些实施方案中，在HDAC抑制剂和约110mM与250mM之间的浓度的钠盐存在的情况下培养细胞。通过本文公开的方法产生的rAAV颗粒适用于进一步下游加工，例如通过收获和纯化所述rAAV颗粒，以产生分离的rAAV颗粒和组合物，例如包含rAAV颗粒的药物组合物。所描述的方法提供了与GMP监管要求一致的灵活的、具有成本效益的、商业上可扩展的过程，以生产用于基因疗法应用的rAAV颗粒。本文所述的方法适用于任何rAAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16以及它们的衍生物、修饰或假型。在一些实施方案中，所述方法用于产生rAAV8颗粒。在一些实施方案中，所述方法用于产生rAAV8衍生物颗粒、rAAV8修饰颗粒或rAAV8假型颗粒。在一些实施方案中，所述方法用于产生rAAV9颗粒。在一些实施方案中，所述方法用于产生rAAV9衍生物颗粒、rAAV9修饰颗粒或rAAV9假型颗粒。
发明人令人惊奇地发现，本文公开的方法提供了rAAV产量的两倍或更多倍的提高。基于较早的发现，即HDAC抑制剂可增加重组多肽在转染细胞中的表达，无法预期这些结果。AAV颗粒的细胞生产需要将三种衣壳蛋白和单链核苷酸基因组组装成功能性病毒单位。没有理由相信HDAC抑制剂将能够同时增加所有AAV组分的产生，包括AAV基因组的产生。并且没有理由相信宿主细胞机制能够组装增加数量的AAV颗粒，即使HDAC抑制剂增加病毒多肽的产生。Cervera报道的是，转染增强剂可增加病毒样颗粒(VLP)的产生，但也没有理由相信HDAC抑制剂可增加宿主细胞中rAAV颗粒的产生，因为VLP包含单一gag蛋白而不包含基因组。Cervera等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,99:9935-9949(2015)。因此，VLP的产生不需要组装多个多肽和核苷酸基因组。
鉴于制备单一单位剂量所需的大量rAAV颗粒，rAAV产量的两倍或更多倍的提高可提供显著降低的每单位剂量的商品成本。提高的病毒产量不仅可对应地降低产生AAV颗粒所需的消耗品成本，而且可对应地减少与建设工业病毒纯化设施相关的资本支出成本。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为促进对本公开方法的理解，以下定义多个术语和短语。
限定例如本文提供的方法中使用的组合物中成分的量、组合物中成分的浓度、流速、rAAV颗粒产量、进料体积、盐浓度和类似的值及其范围的“约(about)”，是指例如通过用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和处理程序；通过这些程序中的无意错误；通过制备组合物或实施方法使用的成分的制造、来源或纯度方面的差异；和类似的考虑因素可出现的数值数量变化。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度或混合物的组合物的老化而不同的量。术语“约”还涵盖由于混合或加工具有特定初始浓度的组合物或混合物而不同的量。无论是否被术语“约”限定，权利要求书都包括数量的等效物。在一些实施方案中，术语“约”是指大于或小于所指示的数字或范围大约10％-20％的范围。在其他实施方案中，“约”是指所指示的数字或范围加或减10％。例如，“约10％”表示9％至11％的范围。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其修饰、衍生物或假型。除了另外要求的情况外，所述术语覆盖所有亚型以及天然存在和重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒。术语“AAV”包括AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV以及它们的修饰、衍生物或假型。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等。在一些实施方案中，所述AAV颗粒是AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的衍生物、修饰或假型。
应用于AAV颗粒的“重组”意指AAV颗粒是产生与自然界中的AAV颗粒不同的AAV颗粒构建体的一种或多种程序的产物。
重组腺相关病毒颗粒“rAAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒，所述载体包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，诸如待递送到哺乳动物细胞的转基因)。所述rAAV颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何修饰、衍生物或假型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10或它们的衍生物/修饰/假型)。此类AAV血清型和衍生物/修饰/假型，以及产生此类血清型/衍生物/修饰/假型的方法是本领域已知的(参见例如，Asokan等,Mol.Ther.20(4):699-708(2012)。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含作为AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
本公开的rAAV颗粒可以是任何血清型或血清型的任何组合(例如包含两种或更多种血清型的rAAV颗粒群体，例如包含rAAV2、rAAV8和rAAV9颗粒中的两种或更多种)。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10或其他rAAV颗粒或它们的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是rAAV8或rAAV9颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的两种或更多种血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含作为选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16衣壳蛋白的两种或更多种血清型的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16或它们的衍生物、修饰或假型组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8、AAV9或它们的衍生物、修饰或假型的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
术语“细胞培养物”是指在生物反应器、滚瓶、多层培养瓶(hyperstack)、微球、大球、烧瓶等中贴壁或悬浮生长的细胞，以及上清液或混悬液本身的组分，包括但不限于rAAV颗粒、细胞、细胞碎片、细胞污染物、胶体颗粒、生物分子、宿主细胞蛋白、核酸和脂质以及絮凝剂。术语“细胞培养物”也涵盖大规模方法，诸如生物反应器，包括悬浮培养物和附着在搅拌的生物反应器中的微载剂或大载剂上生长的贴壁细胞。本公开涵盖用于大规模和小规模生产蛋白质的细胞培养程序。
如本文所用，术语“纯化(purifying/purification)”、“分离(separate/separating/separation)”或“分离(isolate/isolating/isolation)”是指从包含靶产物和一种或多种杂质的样品中提高rAAV颗粒的纯度。通常，通过从样品中(完全或部分地)去除至少一种杂质来提高靶产物的纯度。在一些实施方案中，通过使用本文所述的方法从样品中(完全或部分地)去除一种或多种杂质来提高样品中rAAV的纯度。
除非上下文另外明确规定，否则如本公开和权利要求书所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应理解无论在本文中将实施方案用语言“包含”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的另外相似的实施方案。还应理解无论在本文中将实施方案用语言“基本上由……组成”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”的术语描述的另外相似的实施方案。
如本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在以马库什组(Markush group)或替代方案的其他分组来描述本公开的实施方案的情况下，所公开的方法不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且还包括单独列出的组的每个成员和主组的所有可能的子组，并且还包括缺少一个或多个组成员的主组。所公开的方法还设想在所公开的方法中明确排除任何组成员中的一个或多个。
rAAV生产的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生rAAV颗粒的方法，其包括：(a)提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；(b)向所述细胞培养物中加入组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及(c)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)、丙酸盐(例如丙酸钠)或它们的组合。在一些实施方案中，在加入所述HDAC抑制剂后，所述细胞培养物包含约0.5mM与约10mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)或丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在步骤b)后约12小时与约36小时之间加入。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述培养物中加入足量的钠盐(例如氯化钠)，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约40mM与140mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度为约150mM与约240mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。在一些实施方案中，在加入所述HDAC抑制剂后加入所述钠盐。在一些实施方案中，在加入所述HDAC抑制剂后至少约20分钟加入所述钠盐。在一些实施方案中，所述方法还包括回收所述rAAV颗粒。在一些实施方案中，能够产生rAAV颗粒的细胞是HEK293细胞，其已被编码以下物质的一种或多种多核苷酸转染：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，能够产生rAAV颗粒的细胞是HEK293细胞，其已被编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸转染：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的方法，其包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物；(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白；(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及(d)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)、丙酸盐(例如丙酸钠)或它们的组合。在一些实施方案中，在加入所述HDAC抑制剂后，所述细胞培养物包含约0.5mM与约10mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)或丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在步骤b)后约12小时与约36小时之间加入。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述培养物中加入足量的钠盐(例如氯化钠)，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约40mM与140mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度为约150mM与约240mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。在一些实施方案中，在加入所述HDAC抑制剂后，将所述钠盐加入到所述细胞培养物中。在一些实施方案中，在加入所述HDAC抑制剂后至少约20分钟加入所述钠盐。在一些实施方案中，所述方法还包括回收所述rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，所述细胞使用编码以下物质的一种或多种多核苷酸转染：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白。在一些实施方案中，所述细胞使用编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸转染：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生rAAV颗粒的方法，其包括在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV颗粒的细胞。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)、丙酸盐(例如丙酸钠)或它们的组合。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.5mM与约10mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)或丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.5mM与约5mM之间的丁酸盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.5mM与约5mM之间的丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述培养基包含约0.5mM与约5mM之间的丙酸盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述培养基还包含约120mM与250mM之间的NaCl。在一些实施方案中，所述培养基包含约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间的NaCl。在一些实施方案中，所述方法还包括回收所述rAAV颗粒。在一些实施方案中，能够产生rAAV颗粒的细胞是HEK293细胞，其已被编码以下物质的一种或多种多核苷酸转染：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白。在一些实施方案中，能够产生rAAV颗粒的细胞是HEK293细胞，其已被编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸转染：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAVrep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白。在一些实施方案中，所述细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，将所述细胞在允许产生所述rAAV颗粒的条件下培养约2天与约10天之间。在一些实施方案中，将所述细胞在允许产生所述rAAV颗粒的条件下培养约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。
在一些实施方案中，本公开提供了用于增加rAAV颗粒产生的方法。在一些实施方案中，一种增加rAAV产生的方法包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物；(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：(i)待包装的rAAV基因组，(ii)包装所需的腺病毒辅助功能，(iii)足以包装的AAV rep蛋白以及(iv)足以包装的AAV cap蛋白；(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及(d)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。
在一些实施方案中，一种增加rAAV产生的方法包括在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV颗粒的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞在允许产生所述rAAV颗粒的条件下培养约2天与约10天之间。在一些实施方案中，在步骤b)后，将所述细胞在允许产生所述rAAV颗粒的条件下培养约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。
在一些实施方案中，一种增加rAAV产生的方法包括：(a)提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；(b)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及(c)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，将所述细胞在允许产生所述rAAV颗粒的条件下培养约2天与约10天之间。在一些实施方案中，将所述细胞在允许产生所述rAAV颗粒的条件下培养约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。
技术人员理解的是，任何组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂化合物均可用于本文公开的方法中。HDAC抑制剂是本领域公认的一类化合物。参见例如Eckschlager等,Int.J.Mol.Sci.18,1414；doi:10.3390/ijms18071414(2017)；Huber等,The Journal ofBiological Chemistry,286(25):22211-22218(2011)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括HDAC同工型选择性抑制剂。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂选择性地抑制一种或多种I、II、III和IV类HDAC的活性。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂抑制来自I类和II类的一种或多种HDAC的活性。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括泛抑制剂。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括异羟肟酸、短链脂肪酸、苯甲酰胺、环四肽或瑟土因(sirtuin)抑制剂。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括异羟肟酸。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括异羟肟酸，例如曲古抑菌素A、辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、贝利司他(belinostat)(PXD101)、帕比司他(panabiostat)、吉维司他(givinostat)、瑞米司他(resminostat)、阿贝司他(abexinostat)、奎西诺司他(quisinostat)、罗西诺他(rocilinostat)、普诺司他(practinostat)和CHR-3996。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括短链脂肪酸或其盐，例如丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯、2,2-二甲基丁酸酯、2-乙基丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、庚酸酯、辛酸酯、苯基丁酸酯以及它们的盐。Steliou等,BioResearch Open Access,第1卷,第4期,doi.org/10.1089/biores.2012.0223(2012)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括苯甲酰胺，例如恩替司他(entinostat)、泰克地那林(tacedinaline)、4SC202和莫西司他(mocetinostat)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括环四肽，例如罗米地辛(romidepsin)。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括瑟土因抑制剂，例如烟酰胺、瑟汀诺(sirtinol)、cambinol和EX-527。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括[4-(2-氨基-苯基氨基甲酰基)-苄基]氨基甲酸吡啶-3-基甲基酯及其衍生物、吡罗沙胺(pyroxamide)、奥沙莱丁(oxamflatin)、阿匹西丁(apicidin)、缩肽、地普迪辛(depudecin)、曲霉毒素(trapoxin)、M344、scriptaid、MC 1293、1-萘甲酸钠、CAY10398、苯基丁酸钠、辛二酰基双异羟肟酸(SBHA)、CAY10433、奥沙莱丁或HC毒素。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂不包括丙酮酸酯或其盐。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂不包括烟酰胺。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括两种或更多种HDAC抑制剂的组合。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV的细胞。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂。应理解，包含例如2mMHDAC抑制剂的细胞培养物包含细胞和含有2mM HDAC抑制剂的培养基。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约0.5mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约0.5mM与约5mM之间。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约0.5mM与约3mM之间。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM或约5mM。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约1.5mM。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约2mM。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约3mM。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂的浓度为约4mM。
在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约10mM之间的丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM或约5mM丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约1.5mM丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约2mM丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约3mM丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约4mM丙戊酸酯或其盐(例如丙戊酸钠)。
在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约10mM之间的丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM或约5mM丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约1.5mM丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约2mM丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约3mM丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约4mM丁酸酯或其盐(例如丁酸钠)。
在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约10mM之间的丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约5mM之间的丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM与约3mM之间的丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM或约5mM丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约1.5mM丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约2mM丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约3mM丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含约4mM丙酸酯或其盐(例如丙酸钠)。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括提供包含细胞的细胞培养物，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，并向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中前加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约1小时与约48小时之间或约12小时与约36小时之间加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约16小时与约30小时之间加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约18小时与约26小时之间加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约18小时与约22小时之间加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约22小时与约26小时之间加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后少于约48小时或少于约36小时加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时、至少约18小时、至少约20小时加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约6小时、约9小时、约12小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约18小时加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约20小时加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约22小时加入。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后约24小时加入。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中包括使用一种或多种多核苷酸转染所述细胞。
在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中与向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂之间，更换细胞培养基。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中与向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂之间，补充细胞培养基。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中与向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂之间，所述细胞培养基补充有营养素、盐、缓冲剂和添加剂(例如消泡剂)中的一种或多种。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中包括使用一种或多种多核苷酸转染所述细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向细胞培养物中加入钠盐。在一些实施方案中，本文公开的方法包括在包含钠盐的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包含钠盐。应理解，包含钠盐的细胞培养物包含细胞和含有钠盐的培养基。
在一些实施方案中，钠盐是无机盐。在一些实施方案中，所述钠盐是有机盐。在一些实施方案中，所述钠盐是包含卤素(例如氟、氯、溴和碘)的卤化钠。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠或溴化钠。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠、碳酸钠、磷酸钠或硫酸钠。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。
在一些实施方案中，细胞培养物或细胞培养基包含约120mM与约250mM之间的钠盐。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间的钠盐。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约150mM与约240mM之间的钠盐。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约150mM与约190mM之间的钠盐。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约180mM与约240mM之间的钠盐。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。
在一些实施方案中，细胞培养物或细胞培养基包含约120mM与约250mM之间的氯化钠。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间的氯化钠。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约150mM与约240mM之间的氯化钠。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约150mM与约190mM之间的氯化钠。在一些实施方案中，所述细胞培养物或细胞培养基包含约180mM与约240mM之间的氯化钠。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约140mM氯化钠。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约170mM氯化钠。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约200mM氯化钠。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向细胞培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约150mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约50mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约80mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约70mM与约120mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约140mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约30mM。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约60mM。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加约90mM。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向细胞培养物中加入足量的氯化钠，以使氯化钠的最终浓度增加约20mM与约150mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约20mM与约50mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约40mM与约80mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约70mM与约120mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约40mM与约140mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约30mM。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约60mM。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加约90mM。
在一些实施方案中，在加入钠盐以使细胞培养物浓度进一步增加例如90mM之前，其包含钠盐。在一些实施方案中，在向所述细胞培养物中加入钠盐以进一步增加其浓度之前，所述细胞培养物包含约90mM、约100mM或约110mM钠盐。应理解，当细胞培养物包含约110mM氯化钠，并且向所述细胞培养物中加入足量的氯化钠以使其浓度增加约90mM时，氯化钠的最终浓度将为约200mM。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。
在一些实施方案中，在向所述细胞培养物中加入氯化钠以进一步增加其浓度之前，所述细胞培养物包含约90mM、约100mM或约110mM氯化钠。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向细胞培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约130mM与约160mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约150mM与约190mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约180mM与约240mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约150mM与约240mM之间。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约140mM。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约170mM。在一些实施方案中，所述钠盐的最终浓度增加至约200mM。在一些实施方案中，所述钠盐是氯化钠。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括向细胞培养物中加入足量的氯化钠，以使氯化钠的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约130mM与约160mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约150mM与约190mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约180mM与约240mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约150mM与约240mM之间。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约140mM。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约170mM。在一些实施方案中，氯化钠的最终浓度增加至约200mM。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物，(b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂，以及(d)向所述细胞培养物中加入钠盐(例如氯化钠)。应理解，(b)、(c)和(d)可以任何顺序进行。在一些实施方案中，(b)、(c)和(d)以(b)-(c)-(d)的顺序进行。在一些实施方案中，(b)、(c)和(d)以(b)-(d)-(c)的顺序进行。在一些实施方案中，(b)、(c)和(d)以(d)-(c)-(b)的顺序进行。在一些实施方案中，(b)、(c)和(d)以(d)-(b)-(c)的顺序进行。在一些实施方案中，(c)和(d)在(b)之后同时进行。在一些实施方案中，通过向所述细胞培养物中加入包含所述HDAC抑制剂和所述钠盐(例如氯化钠)的组合物来同时进行(c)和(d)。在一些实施方案中，通过向所述细胞培养物中加入包含所述HDAC抑制剂的第一组合物和包含所述钠盐(例如氯化钠)的第二组合物来同时进行(c)和(d)。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中包括使用一种或多种多核苷酸转染所述细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物，(b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂，以及(d)向所述细胞培养物中加入钠盐(例如氯化钠)，其中(c)在(b)之后进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约1小时与约48小时之间或约12小时与约36小时之间进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后少于约48小时或少于约36小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时或至少约18小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约6小时、约9小时、约12小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约24小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约20小时进行。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中包括使用一种或多种多核苷酸转染所述细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物，(b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂，以及(d)向所述细胞培养物中加入钠盐(例如氯化钠)，其中(b)、(c)和(d)以(b)-(c)-(d)的顺序进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约5分钟与约6小时之间进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约20分钟与约2小时之间进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后少于约2小时或少于约1小时进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后至少约30分钟进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约40分钟进行。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中包括使用一种或多种多核苷酸转染所述细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物，(b)将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂，以及(d)向所述细胞培养物中加入钠盐(例如氯化钠)，其中(b)、(c)和(d)以(b)-(c)-(d)的顺序进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约1小时与约48小时之间或约12小时与约36小时之间进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后少于约48小时或少于约36小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时或至少约18小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约6小时、约9小时、约12小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约24小时进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后约20小时进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约5分钟与约6小时之间进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约20分钟与约2小时之间进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后少于约2小时或少于约1小时进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后至少约30分钟进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟进行。在一些实施方案中，(d)在(c)之后约40分钟进行。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括提供包含细胞的细胞培养物，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中，向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂，向所述细胞培养物中加入钠盐(例如氯化钠)，并将所述细胞培养物保持在允许产生rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后，将所述细胞培养物保持约2天与约10天之间。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后，将所述细胞培养物保持约5天与约14天之间或更长时间。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后，将所述细胞培养物保持约2天与约7天之间。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后，将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后，将所述细胞培养物保持约5天。在一些实施方案中，在将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中后，将所述细胞培养物保持约6天。在一些实施方案中，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下用于连续收获。在一些实施方案中，将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中包括使用一种或多种多核苷酸转染所述细胞。
在一些实施方案中，相对于不包括向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂或加入钠盐的方法，本文公开的方法增加了rAAV颗粒的产生。在一些实施方案中，本文公开的方法使rAAV生产增加至少约50％、至少约75％或至少约100％。在一些实施方案中，本文公开的方法使rAAV生产增加至少约两倍、至少约三倍或至少约五倍。在一些实施方案中，本文公开的方法使rAAV生产增加至少约两倍。在一些实施方案中，生产的增加通过比较生产培养物中的rAAV滴度来确定。在一些实施方案中，rAAV滴度以每毫升生产培养物的基因组拷贝(GC)进行测量。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，本文公开的方法增加了rAAV颗粒的产生，同时保持或改善了所述rAAV颗粒和包含其的组合物的质量属性。在一些实施方案中，rAAV颗粒和包含其的组合物的质量通过确定rAAV颗粒的浓度(例如GC/ml)、包含rAAV基因组拷贝的颗粒的百分比；没有基因组的颗粒的比率、rAAV颗粒的感染性、rAAV颗粒的稳定性、残留宿主细胞蛋白的浓度或残留宿主细胞核酸(例如宿主细胞基因组DNA、编码rep和cap基因的质粒、编码辅助功能的质粒、编码rAAV基因组的质粒)的浓度来评估。在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的rAAV颗粒或包含其的组合物的质量与通过不包括向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂或加入钠盐的方法产生的rAAV颗粒或组合物的质量相同。在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的rAAV颗粒或包含其的组合物的质量优于通过不包括向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂或加入钠盐的方法产生的rAAV颗粒或组合物的质量。
在一些实施方案中，本文公开的方法产生约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生约1x10e+10GC/ml与约1x10e+11GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生约5x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生约1x10e+11GC/ml与约1x10e+13GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生约5x10e+10GC/ml与约5x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生约1x10e+11GC/ml与约5x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生大于约1x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生大于约5x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生大于约1x10e+12GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约5x10e+10GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约1x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约5x10e+11GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约1x10e+12GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约5x10e+12GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约1x10e+13GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法产生至少约5x10e+13GC/ml的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
用于生产rAAV颗粒的许多基于细胞培养物的系统是本领域已知的，所述系统中的任何一种都可用于实施本文公开的方法。基于细胞培养物的系统包括转染、稳定的细胞系生产以及包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体和杆状病毒-AAV杂合体的感染性杂合病毒生产系统。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞以及它们的衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)；哺乳动物细胞系，诸如Vero、CHO细胞或CHO衍生细胞或昆虫衍生细胞系诸如SF-9(就杆状病毒生产系统而言)；(2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAVrep和cap基因以及基因产物；(4)与AAV ITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支撑rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。
在一方面，本文提供了一种产生rAAV颗粒的方法，其包括：(a)提供包含昆虫细胞的细胞培养物；(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种杆状病毒载体引入到所述细胞中：i.待包装的rAAV基因组，ii.足以包装的AAV rep蛋白，以及iii.足以包装的AAV cap蛋白；(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及在(b)之后，将所述细胞培养物在允许产生所述rAAV颗粒的条件下保持约2天与约15天之间或更长时间。在一些实施方案中，所述方法包括使用编码rep和cap基因的第一杆状病毒载体和编码rAAV基因组的第二杆状病毒载体。在一些实施方案中，所述方法包括使用编码rAAV基因组的杆状病毒和表达rep和cap基因的昆虫细胞。在一些实施方案中，所述方法包括使用编码rep和cap基因以及rAAV基因组的杆状病毒载体。在一些实施方案中，所述昆虫细胞是Sf-9细胞。在一些实施方案中，所述昆虫细胞是包含编码rep和cap基因的一种或多种稳定整合的异源多核苷酸的Sf-9细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或它们的盐。
在一些实施方案中，本文公开的方法使用杆状病毒生产系统。在一些实施方案中，所述杆状病毒生产系统使用编码rep和cap基因的第一杆状病毒和编码rAAV基因组的第二杆状病毒。在一些实施方案中，所述杆状病毒生产系统使用编码rAAV基因组的杆状病毒和表达rep和cap基因的宿主细胞。在一些实施方案中，所述杆状病毒生产系统使用编码rep和cap基因以及rAAV基因组的杆状病毒。在一些实施方案中，所述杆状病毒生产系统使用Sf-9细胞。
技术人员知道可将AAV rep和cap基因、AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)和rAAV基因组(包含与反向末端重复序列(ITR)侧接的一个或多个感兴趣的基因)引入到细胞中以产生或包装rAAV的许多方法。短语“腺病毒辅助功能”是指在细胞中表达的多种病毒辅助基因(如RNA或蛋白质)，从而使AAV在细胞中高效生长。技术人员理解的是，包括腺病毒和单纯疱疹病毒(HSV)的辅助病毒促进AAV复制，并且已鉴定出提供基本功能的某些基因，例如，辅助基因可诱导细胞环境发生变化，从而促进此类AAV基因表达和复制。在本文公开的方法的一些实施方案中，通过转染编码AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组的一种或多种质粒载体来将AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组引入到细胞中。在本文公开的方法的一些实施方案中，通过使用病毒载体，例如编码AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组的rHSV载体转导来将AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组引入到细胞中。在本文公开的方法的一些实施方案中，通过使用rHSV载体转导来将AAV rep和cap基因、辅助基因和rAAV基因组中的一种或多种引入到所述细胞中。在一些实施方案中，rHSV载体编码AAV rep和cap基因。在一些实施方案中，rHSV载体编码辅助基因。在一些实施方案中，rHSV载体编码rAAV基因组。在一些实施方案中，rHSV载体编码AAV rep和cap基因。在一些实施方案中，rHSV载体编码辅助基因和rAAV基因组。在一些实施方案中，rHSV载体编码辅助基因以及AAV rep和cap基因。
在一方面，本文提供了一种产生rAAV颗粒的方法，其包括：(a)提供包含细胞的细胞培养物；(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种rHSV载体引入到所述细胞中：i.待包装的rAAV基因组，ii.包装所述rAAV颗粒所需的辅助功能，iii.足以包装的AAV rep蛋白，以及iv.足以包装的AAV cap蛋白；(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及在(b)之后，将所述细胞培养物在允许产生所述rAAV颗粒的条件下保持约2天与约15天之间或更长时间。在一些实施方案中，rHSV载体编码AAV rep和cap基因。在一些实施方案中，rHSV载体编码辅助功能。在一些实施方案中，rHSV载体包含编码辅助功能的一种或多种内源基因。在一些实施方案中，rHSV载体包含编码辅助功能的一种或多种异源基因。在一些实施方案中，rHSV载体编码rAAV基因组。在一些实施方案中，rHSV载体编码AAV rep和cap基因。在一些实施方案中，rHSV载体编码辅助功能和rAAV基因组。在一些实施方案中，rHSV载体编码辅助功能以及AAV rep和cap基因。在一些实施方案中，所述细胞包含编码rep和cap基因的一种或多种稳定整合的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或它们的盐。
在一方面，本文提供了一种产生rAAV颗粒的方法，其包括：(a)提供包含哺乳动物细胞的细胞培养物；(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：i.待包装的rAAV基因组，ii.包装所述rAAV颗粒所需的辅助功能，iii.足以包装的AAVrep蛋白，以及iv.足以包装的AAV cap蛋白；(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及在(b)之后，将所述细胞培养物在允许产生所述rAAV颗粒的条件下保持约2天与约15天之间或更长时间。在一些实施方案中，辅助功能由腺病毒基因编码。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞包含编码rep和cap基因的一种或多种稳定整合的异源多核苷酸。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂是丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或它们的盐。
开发编码AAV rep和cap基因、辅助基因和/或rAAV基因组的质粒或病毒载体的分子生物学技术是本领域通常已知的。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因由一种质粒载体编码。在一些实施方案中，AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)由一种质粒载体编码。在一些实施方案中，E1a基因或E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将剩余的AAV辅助基因引入到所述细胞中。在一些实施方案中，E1a基因和E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种质粒载体的转染来将E4基因、E2a基因和VA基因引入到所述细胞中。在一些实施方案中，一种或多种辅助基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种质粒载体的转染来将一种或多种辅助基因引入到所述细胞中。在一些实施方案中，辅助基因由宿主细胞稳定表达。在一些实施方案中，AAV rep和cap基因由一种病毒载体编码。在一些实施方案中，AAV辅助基因(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)由一种病毒载体编码。在一些实施方案中，E1a基因或E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将剩余的AAV辅助基因引入到所述细胞中。在一些实施方案中，E1a基因和E1b基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将E4基因、E2a基因和VA基因引入到所述细胞中。在一些实施方案中，一种或多种辅助基因由宿主细胞稳定表达，并且通过一种病毒载体的转染来将一种或多种辅助基因引入到所述细胞中。在一些实施方案中，通过使用一种或多种多核苷酸例如载体转染来将AAV rep和cap基因、包装所需的腺病毒辅助功能以及待包装的rAAV基因组引入到所述细胞中。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用三种多核苷酸的混合物转染所述细胞：编码cap和rep基因的一种多核苷酸，编码包装所需的腺病毒辅助功能(例如腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的一种多核苷酸，以及编码待包装的rAAV基因组的一种多核苷酸。在一些实施方案中，AAV cap基因是AAV8或AAV9 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因是AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8 cap基因。在一些实施方案中，AAV cap基因编码与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，编码待包装的rAAV基因组的载体包含与AAVITR侧接的感兴趣的基因。在一些实施方案中，AAV ITR来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型。
载体的任何组合都可用于将AAV rep和cap基因、AAV辅助基因和rAAV基因组引入到其中待产生或包装rAAV颗粒的细胞中。在本文公开的方法的一些实施方案中，可使用编码rAAV基因组的第一质粒载体(所述rAAV基因组包含与AAV反向末端重复序列(ITR)侧接的感兴趣的基因)、编码AAV rep和cap基因的第二载体以及编码辅助基因的第三载体。在一些实施方案中，将三种载体的混合物共转染到细胞中。
在一些实施方案中，通过使用质粒载体以及病毒载体两者来使用转染和感染的组合。
在一些实施方案中，rep和cap基因以及AAV辅助基因中的一种或多种由所述细胞组成性表达，并且不需要被转染或转导到所述细胞中。在一些实施方案中，所述细胞组成性表达rep和/或cap基因。在一些实施方案中，所述细胞组成性表达一种或多种AAV辅助基因。在一些实施方案中，所述细胞组成性表达E1a。在一些实施方案中，所述细胞包含编码rAAV基因组的稳定转基因。
在一些实施方案中，AAV rep、cap和辅助基因(例如Ela基因、E1b基因、E4基因、E2a基因或VA基因)可以是任何AAV血清型。同样，AAV ITR也可以是任何AAV血清型。例如，在一些实施方案中，AAV ITR来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如带有来自一种以上血清型的序列的杂合血清型)。在一些实施方案中，AAV cap基因来自AAV9或AAV8 cap基因。在一些实施方案中，AAVcap基因来自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他AAV血清型(例如带有来自一种以上血清型的序列的杂合血清型)。在一些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的AAV rep和cap基因来自不同的血清型。例如，rep基因来自AAV2，而cap基因来自AAV9。
根据本文公开的方法，本领域已知的任何合适的用于转染细胞的方法都可用于生产rAAV颗粒。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使用基于化学的转染方法转染细胞。在一些实施方案中，基于化学的转染方法使用磷酸钙、高度支化的有机化合物(树状聚合物)、阳离子聚合物(例如DEAE葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI))、脂质转染。在一些实施方案中，基于化学的转染方法使用阳离子聚合物(例如DEAE葡聚糖或聚乙烯亚胺(PEI))。在一些实施方案中，基于化学的转染方法使用聚乙烯亚胺(PEI)。在一些实施方案中，基于化学的转染方法使用DEAE葡聚糖。在一些实施方案中，基于化学的转染方法使用磷酸钙。
根据本文公开的方法，本领域已知的任何合适的培养基都可用于生产rAAV颗粒。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6,723,551中所述的改良伊格尔培养基(Modified Eagle Medium，MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)和Sf-900 II SFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所述培养基包括来自Invitrogen/ThermoFisher的DynamisTM培养基、FreeStyleTM293表达培养基或Expi293TM表达培养基。在一些实施方案中，所述培养基包括DynamisTM培养基。在一些实施方案中，本文公开的方法使用包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基的细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养基是无动物组分培养基。在一些实施方案中，所述培养基包含血清。在一些实施方案中，所述培养基包含胎牛血清。在一些实施方案中，所述培养基是无谷氨酰胺的培养基。在一些实施方案中，所述培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述培养基补充有营养素、盐、缓冲剂和添加剂(例如消泡剂)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述培养基补充有谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述培养基补充有血清。在一些实施方案中，所述培养基补充有胎牛血清。在一些实施方案中，所述培养基补充有泊洛沙姆(poloxamer)，例如
Figure BDA0002939510460000501
P 188Bio。在一些实施方案中，培养基是基础培养基。在一些实施方案中，所述培养基是进料培养基。
rAAV生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在宽的温度范围内、变化的时间长度等)生长。如本领域中已知的，rAAV生产培养物包括可在合适的粘附依赖性容器，例如像滚瓶、中空纤维过滤器、多层或多托盘组织培养瓶(或堆积，例如多层培养瓶)、微载体和填充床或流化床生物反应器中培养的粘附依赖性培养物。rAAV载体生产培养物还可包括悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞和SF-9细胞，它们可以多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌釜生物反应器和一次性系统，诸如波浪袋(Wave bag)系统。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公布号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
本领域已知可生产rAAV颗粒的任何细胞或细胞系可用于本文公开的任何方法中。在一些实施方案中，本文公开的生产rAAV颗粒或增加rAAV颗粒的生产的方法使用HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用昆虫细胞，例如SF-9细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用HEK293细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物是悬浮培养物。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物是包含HEK293的悬浮培养物。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物是包含适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞的悬浮培养物。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包括无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包括无血清培养基。在一些实施方案中，悬浮适应性细胞在摇瓶、旋转瓶、细胞袋或生物反应器中进行培养。
在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包括附着于基质(例如微载体)的自身悬浮于培养基中的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。
在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物是贴壁培养物。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物是包含HEK293的贴壁培养物。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包括无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基。在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包括无血清培养基。
在一些实施方案中，本文公开的细胞培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养物的总细胞密度为约1x10E+06细胞/ml与约30x10E+06细胞/ml之间。在一些实施方案中，约50％以上的细胞是活细胞。在一些实施方案中，所述细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在其他实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
本文公开的方法可用于生产包含来自任何AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含作为AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含作为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含作为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在另外的实施方案中，所述rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。在另外的实施方案中，所述rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。
在本文公开的方法的一些实施方案中，可存在大体积的细胞培养物(例如在商业制造过程中)。在一些实施方案中，本文公开的方法适用于加工包含rAAV颗粒的大体积细胞培养物。术语“大体积”是指与rAAV颗粒的商业和/或工业生产相关联的体积。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约20升与约20000升之间、约50升与约20000升之间、约100升与约20000升之间、约500升与约20000升之间、约1000升与约20000升之间、约20升与约5000升之间、约50升与约5000升之间、约100升与约3000升之间、约500升与约3000升之间、约1500升与约2500升之间。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约50升与约2,000升之间。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约50升与约3,000升之间。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约50升与约5,000升之间。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约200升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约500升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约1000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约1500升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约2000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约2500升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约3000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约5000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约10000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约15000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约20000升。在一些实施方案中，术语“大体积”是指约10升与1000升之间、约10升与100升之间、约20升与500升之间、约50升与500升之间、约100升与1000升之间或约100升与500升之间。
rAAV颗粒
所提供的方法适用于生产任何分离的重组AAV颗粒。因此，根据公开的方法生产的rAAV可以是本领域已知的任何血清型、修饰或衍生物或它们的任何组合(例如包含两种或更多种血清型的rAAV颗粒群体，例如包含AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV颗粒中的两种或更多种，或它们的两种或更多种的组合)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有来自选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或它们的衍生物、修饰或假型的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与例如AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或它们的衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与例如AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含Anc80或Anc80L65的衣壳，如Zinn等,2015,CellRep.12(6):1056-1068中所述，所述参考以引用的方式整体并入。在某些实施方案中，所述rAAV颗粒包含具有以下氨基酸插入中的一种的衣壳：LGETTRP或LALGETTRP，如美国专利号9,193,956；9458517；和9,587,282以及美国专利申请公布号2016/0376323中所述，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV.7m8的衣壳，如美国专利号9,193,956；9,458,517；和9,587,282以及美国专利申请公布号2016/0376323中所述，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,585,971中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV-PHP.B。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,840,719和WO 2015/013313中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV.Rh74和RHM4-1，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2014/172669中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV rh.74，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2/5的衣壳，如Georgiadis等,2016,Gene Therapy 23:857-862和Georgiadis等,2018,Gene Therapy 25:450中所述，所述参考各自以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2017/070491中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV2tYF，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAVLK03或AAV3B的衣壳，如Puzzo等,2017,Sci.Transl.Med.29(9):418中所述，所述参考以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号8,628,966；US 8,927,514；US9,923,120和WO 2016/049230中公开的任何AAV衣壳，诸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，所述专利各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含在以下任何专利和专利申请中公开的AAV衣壳，所述专利和专利申请各自以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳在以下任何专利和专利申请中公开，所述专利和专利申请各自以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有在国际申请公布号WO 2003/052051(参见例如SEQ ID NO:2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO:123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQ ID NO:2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO:1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO:5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、WO 2010/127097(参见例如SEQ ID NO:5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ IDNO:80-294)和美国申请公布号20150023924(参见例如SEQ ID NO:1、5-10)中公开的衣壳蛋白，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳在国际申请公布号WO 2003/052051(参见例如SEQID NO:2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO:123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQID NO:2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO:1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO:5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、WO 2010/127097(参见例如SEQ ID NO:5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ ID NO:80-294)和美国申请公布号20150023924(参见例如SEQ ID NO:1、5-10)中公开。
基于AAV的病毒载体的核酸序列以及制备重组AAV和AAV衣壳的方法在例如美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335；WO 2003/052051、WO2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、WO 2010/127097和WO 2015/191508，以及美国申请公布号20150023924中有所教导。
所提供的方法适用于产生编码转基因的重组AAV。在某些实施方案中，所述转基因来自表1A-表1C。在一些实施方案中，rAAV基因组包含含有以下组分的载体：(1)位于表达盒侧面的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码转基因的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的单克隆抗体(mAb)的其他实施方案中，rAAV基因组包含含有以下组分的载体：(1)位于表达盒侧面的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗体的轻链Fab和重链Fab或至少重链或轻链Fab以及任选地重链Fc区的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的mAb的其他实施方案中，rAAV基因组包含含有以下组分的载体：(1)位于表达盒侧面的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗VEGF(例如赛伐珠单抗(sevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)和溴珠单抗(brolucizumab))、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗(ascrinvacumab))、抗C5(例如特斯多鲁单抗(tesidolumab)和依库丽单抗(eculizumab))、抗CD105(例如卡罗妥昔单抗(carotuximab))、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)和戈利木单抗(golimumab))、抗RGMa(例如伊莱单抗(elezanumab))、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗(pamrevlumab))、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗(satralizumab)和沙利姆单抗(sarilumab))、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗(dupilumab))、抗IL17A(例如依克珠单抗(ixekizumab)和苏金单抗(secukinumab))、抗IL-5(例如美泊利单抗(mepolizumab))、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗(ustekinumab))、抗CD19(例如尼比珠单抗(inebilizumab))、抗ITGF7 mAb(例如依托珠单抗(etrolizumab))、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗(romosozumab))、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗(lanadelumab))、抗ITGA4(例如那他珠单抗(natalizumab))、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗(vedolizumab))、抗BLyS(例如贝利木单抗(belimumab))、抗PD-1(例如纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab))、抗RANKL(例如地诺单抗(densomab))、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗(alirocumab)和依洛尤单抗(evolocumab))、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗(evinacumab)*)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗(lampalizumab))或抗MMP9(例如安达昔单抗(andecaliximab))的重链Fab；任选地，具有与治疗性抗体的天然形式相同的同种型的Fc多肽，诸如IgG同种型氨基酸序列IgG1、IgG2或IgG4或其修饰的Fc；以及抗VEGF(例如赛伐珠单抗、兰尼单抗、贝伐珠单抗和溴珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗)、抗C5(例如特斯多鲁单抗和依库丽单抗)、抗CD105或抗ENG(例如卡罗妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如伊莱单抗)、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗)、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗和沙利姆单抗)、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗)、抗IL17A(例如依克珠单抗和苏金单抗)、抗IL-5(例如美泊利单抗)、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗)、抗CD19(例如尼比珠单抗)、抗ITGF7 mAb(例如依托珠单抗)、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗)、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗)、抗ITGA4(例如那他珠单抗)、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗)、抗BLyS(例如贝利木单抗)、抗PD-1(例如纳武单抗和派姆单抗)、抗RANKL(例如地诺单抗)、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗和依洛尤单抗)、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗)或抗MMP9(例如安达昔单抗)的轻链的核酸序列；其中所述重链(Fab和任选地Fc区)和所述轻链由自裂解的弗林蛋白酶(furin)(F)/F2A或柔性接头分离，确保表达等量的所述重链和所述轻链多肽。
表1A
Figure BDA0002939510460000621
Figure BDA0002939510460000631
Figure BDA0002939510460000641
Figure BDA0002939510460000651
Figure BDA0002939510460000661
表1B
Figure BDA0002939510460000662
Figure BDA0002939510460000671
表1C
Figure BDA0002939510460000672
Figure BDA0002939510460000681
Figure BDA0002939510460000691
在一些实施方案中，本文提供了编码抗VEGF Fab的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码抗VEGF Fab的基于rAAV8的病毒载体。在更具体的实施方案中，本文提供了编码兰尼单抗的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码艾杜糖苷酸酶(IDUA)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码IDUA的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码IDS的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码LDLR的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码三肽基肽酶1(TPP1)蛋白的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码TPP1的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体的rAAV病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码γ-肌聚糖、Rab护航蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、battenin(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、肌微管素(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、存活运动神经元(SMN1)、存活运动神经元(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白的rAAV病毒载体。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型AAV衣壳。在一些实施方案中，所述假型AAV衣壳是rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣壳。用于产生和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio等,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。
在某些实施方案中，可使用单链AAV(ssAAV)。在某些实施方案中，可使用自补载体，例如scAAV(参见例如Wu,2007,Human Gene Therapy,18(2):171-82,McCarty等,2001,Gene Therapy,第8卷,第16号,第1248-1254页；以及美国专利号6,596,535；7,125,717和7,456,683，所述参考各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8或AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自由AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV1或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV4或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV5或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含作为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB或AAV.7m8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。镶嵌AAV颗粒由来自不同AAV的血清型的病毒衣壳蛋白的混合物组成。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的血清型的衣壳蛋白的镶嵌衣壳。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10的血清型的衣壳蛋白的镶嵌衣壳。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述假型rAAV颗粒包含(a)包含AAV ITR的核酸载体以及(b)由衍生自AAVx(例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)的衣壳蛋白组成的衣壳。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含由选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV血清型的衣壳蛋白组成的假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含含有AAV8衣壳蛋白的假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含由AAV9衣壳蛋白组成的假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，假型rAAV8或rAAV9颗粒是rAAV2/8或rAAV2/9假型颗粒。用于产生和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio等,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在其他实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV2、rAAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。在其他实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8和AAVrh.10。
用于分离rAAV颗粒的方法
本文公开的产生rAAV颗粒的方法(例如，如[1]-[129]中任一项所述的方法)可用于与上游加工组合以分离rAAV颗粒。
根据本文公开的方法(例如，如[1]-[129]中任一项所述的方法)产生的rAAV颗粒可使用本领域已知的方法分离。在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括下游加工，例如像收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、无菌过滤或它们的任何组合。在一些实施方案中，下游加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工包括收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，下游处理不包括离心。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，本文公开的分离rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，本文公开的分离rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，本文公开的分离rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，所述方法不包括离心。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
用于生产rAAV颗粒的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定的细胞系生产以及包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体和杆状病毒-AAV杂合体的感染性杂合病毒生产系统。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞以及它们的衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)；哺乳动物细胞系，诸如Vero或昆虫衍生细胞系诸如SF-9(就杆状病毒生产系统而言)；(2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAV rep和cap基因以及基因产物；(4)与AAV ITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支撑rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。本领域已知的合适的培养基可用于生产rAAV载体。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6,723,551中所述的改良伊格尔培养基(Modified Eagle Medium，MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium，DMEM)和Sf-900 II SFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。
rAAV生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在宽的温度范围内、变化的时间长度等)生长。如本领域中已知的，rAAV生产培养物包括可在合适的粘附依赖性容器，例如像滚瓶、中空纤维过滤器、微载体和填充床或流化床生物反应器中培养的粘附依赖性培养物。rAAV载体生产培养物还可包括悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞，它们可以多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌釜生物反应器和一次性系统，诸如波浪袋系统。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在一些实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公布号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，所述rAAV生产培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养物的总细胞密度为约1x10E+06细胞/ml与约30x10E+06细胞/ml之间。在一些实施方案中，约50％以上的细胞是活细胞。在一些实施方案中，所述细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在其他实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
在所提供方法的另外的实施方案中，所述rAAV生产培养物包含含有rAAV颗粒的悬浮培养物。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公布号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括哺乳动物细胞或昆虫细胞的培养物。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞的培养物。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括HEK293细胞的培养物。
可通过收获包含宿主细胞的生产培养物或从生产培养物中收获废培养基来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒，前提是要在本领域已知的条件下培养细胞以使rAAV颗粒从完整的宿主细胞释放到培养基中。还可通过裂解生产培养物的宿主细胞来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒。裂解细胞的合适方法也是本领域已知的，并且包括例如多次冷冻/解冻循环、超声处理、微流化和使用化学物质诸如洗涤剂和/或蛋白酶处理。
在收获时，rAAV生产培养物可含有以下中的一种或多种：(1)宿主细胞蛋白；(2)宿主细胞DNA；(3)质粒DNA；(4)辅助病毒；(5)辅助病毒蛋白；(6)辅助病毒DNA；和(7)培养基组分，包括例如血清蛋白、氨基酸、转铁蛋白和其他低分子量蛋白。rAAV生产培养物还可包含产物相关的杂质，例如无活性载体形式、空的病毒衣壳、聚集的病毒颗粒或衣壳、错误折叠的病毒衣壳、降解的病毒颗粒。
在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养物收获物以去除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过经由一系列深度过滤器的过滤来澄清。还可通过本领域已知的多种其他标准技术来实现澄清，诸如通过本领域已知的0.2mm或更大孔径的任何乙酸纤维素过滤器的离心或过滤。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过离心来澄清。在一些实施方案中，澄清所述生产培养物收获物不包括离心。
在一些实施方案中，使用过滤澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括深度过滤。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物还包括深度过滤和无菌过滤。在一些实施方案中，使用包含一种或多种不同过滤介质的过滤器系列澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括一种或多种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括两种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括无菌过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括2种深度过滤介质和无菌过滤介质。在一些实施方案中，深度过滤器介质是多孔深度过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括
Figure BDA0002939510460000801
20MS、
Figure BDA0002939510460000802
C0HC和无菌级过滤器介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括
Figure BDA0002939510460000803
20MS、
Figure BDA0002939510460000804
C0HC和
Figure BDA0002939510460000805
2XLG 0.2μm。在一些实施方案中，在使所述收获的细胞培养物与深度过滤器接触前对其进行预处理。在一些实施方案中，所述预处理包括将盐加入到所述收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，所述预处理包括将化学絮凝剂加入到所述收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，在使所述收获的细胞培养物与深度过滤器接触前不对其进行预处理。
在一些实施方案中，在2019年4月27日提交的标题为“SCALABLE CLARIFICATIONPROCESS FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION”的PCT国际专利申请号PCT/US2019/029539中公开了通过过滤澄清的生产培养物收获物，所述申请以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，使用核酸酶(例如
Figure BDA0002939510460000806
)或核酸内切酶(例如来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶)处理rAAV生产培养物收获物，以消化所述生产培养物中存在的高分子量DNA。核酸酶或核酸内切酶消化可常规地在本领域已知的标准条件下进行。例如，核酸酶消化在最终浓度为1-2.5单位/ml
Figure BDA0002939510460000807
温度在环境温度至37℃范围内，时间段为30分钟至若干个小时下进行。
无菌过滤涵盖使用无菌级过滤器介质的过滤。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚偏氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有0.8μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有1.2μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在其他实施方式中，所述无菌级过滤器介质是0.2μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是
Figure BDA0002939510460000811
2XLG 0.2μm、DuraporeTMPVDF膜0.45μm或
Figure BDA0002939510460000812
PES 1.2μm+0.2μm标称孔径组合。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是
Figure BDA0002939510460000813
2XLG 0.2μm。
在一些实施方案中，在将澄清的进料施加到色谱介质例如亲和色谱介质之前，将其通过切向流过滤(“TFF”)进行浓缩。Paul等,Human Gene Therapy 4:609-615(1993)已描述了使用TFF超滤的大规模病毒浓缩。澄清进料的TFF浓缩使得经受色谱法的澄清进料的体积在技术上可以控制，并且可使柱得以更合理地设定大小，而无需漫长的再循环时间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少两倍与至少十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少十倍与至少二十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少二十倍与至少五十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩约二十倍。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于通过渗滤从所述澄清进料中去除小分子杂质(例如包含培养基组分、血清白蛋白或其他血清蛋白的细胞培养物污染物)。在一些实施方案中，对所述澄清进料进行渗滤以去除小分子杂质。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约3倍与约10倍之间的渗滤体积的缓冲液。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约5倍渗滤体积的缓冲液。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于纯化过程中的任何步骤，其中期望在进行纯化过程的下一步骤之前交换缓冲液。在一些实施方案中，本文公开的用于从澄清进料中分离rAAV的方法包括使用TFF以交换缓冲液。
亲和色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从所述澄清进料中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从已经过切向流过滤的澄清进料中分离rAAV颗粒。合适的亲和色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于AVBSepharoseTM、POROSTMCaptureSelectTMAAVX亲和树脂、POROSTMCaptureSelectTMAAV9亲和树脂和POROSTMCaptureSelectTMAAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTMAAV9亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTMAAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTMAAVX亲和树脂。
阴离子交换色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，在亲和色谱后使用阴离子交换色谱作为最终浓缩和抛光步骤。合适的阴离子交换色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于Unosphere Q(Biorad，Hercules，Calif.)和N带电荷的氨基或亚氨基树脂，例如像POROS 50PI或任何DEAE、TMAE、叔胺或季胺或本领域已知的PEI基树脂(美国专利号6,989,264；Brument等,Mol.Therapy 6(5):678-686(2002)；Gao等,Hum.GeneTherapy 11:2079-2091(2000))。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质包含季胺。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是整体式阴离子交换色谱树脂。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质包括甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯或苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质选自由CIMmultusTMQA-1高级复合柱(季胺)、CIMmultusTMDEAE-1高级复合柱(二乙氨基)、
Figure BDA0002939510460000821
QA盘(季胺)、
Figure BDA0002939510460000822
DEAE和
Figure BDA0002939510460000823
EDA盘(乙烯二氨基)组成的组。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是CIMmultusTMQA-1高级复合柱(季胺)。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是
Figure BDA0002939510460000831
QA盘(季胺)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是CIM QA(BIA Separations，Slovenia)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是BIA
Figure BDA0002939510460000832
QA-80(柱体积为80mL)。本领域普通技术人员可理解的是，可确定具有合适离子强度的洗涤缓冲液，使得rAAV保持与树脂的结合，同时杂质(包括但不限于通过上游纯化步骤可能引入的杂质)被除去。
在一些实施方案中，根据在2018年6月14日提交的标题为“Anion ExchangeChromatography for Recombinant AAV production”的美国临时申请号62/684,835中公开的方法进行阴离子交换色谱，所述申请以引用的方式整体并入本文。
在另外的实施方案中，本公开提供了包含根据本文公开的方法产生的分离的rAAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是包含药学上可接受的载剂的药物组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指适用于一种或多种施用途径、体内递送或接触的生物学上可接受的制剂，其为气态、液态或固态或它们的混合物。“药学上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不期望的材料，例如可向受试者施用所述材料而不会引起实质的不期望的生物学效应。因此，这种药物组合物可用于例如向受试者施用根据所公开的方法分离的rAAV。此类组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载剂包括片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬或软的)、微珠、粉末、颗粒和晶体。也可将补充活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)掺入所述组合物中。如本文所列出或本领域技术人员已知的，可将药物组合物配制为与特定的施用或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径施用的载剂、稀释剂或赋形剂。适用于本发明的rAAV颗粒以及方法和用途的药物组合物和递送系统是本领域已知的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)第20版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；The Merck Index(1996)第12版,MerckPublishing Group,Whitehouse,N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid DosageForms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel和Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)第11版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,Md.；以及Poznansky等,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano编,Oxford,N.Y.,第253-315页)。
在一些实施方案中，所述组合物是药物单位剂量。“单位剂量”是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的实体上离散单位；每个单位含有任选地与药物载剂(赋形剂、稀释剂、媒介物或填充剂)缔合的预定数量，该数量经过计算以便当以一个或多个剂量施用时，可产生所需的作用(例如预防性或治疗性作用)。单位剂型可在例如安瓿和小瓶内，所述单位剂型可包括液体组合物或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可在体内施用或递送之前添加无菌液体载剂。单个单位剂型可包含在多剂量药盒或容器中。出于易于施用和剂量均一性，重组载体(例如AAV)序列、质粒、载体基因组和重组病毒颗粒以及它们的药物组合物可以单一单位剂量或多单位剂量的形式进行包装。在一些实施方案中，所述组合物包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV衣壳血清型是AAV8。在一些实施方案中，所述AAV衣壳血清型是AAV9。
实施例
实施例1.氯化钠、丁酸钠和/或丙戊酸钠对rAAV产量的影响。
在基于HEK293悬浮细胞的方法中，测试了氯化钠、丁酸钠和/或丙戊酸钠对rAAV产量的影响。将HEK293细胞以1x10e6活细胞/ml的密度接种在高级微型生物反应器中。培养基包含100mM NaCl。在48小时ECD(经过的培养持续时间)时，使用聚乙烯亚胺和编码腺病毒辅助功能、转基因和AAV 2/8Rep/Cap的3种质粒的混合物转染细胞。转染后24小时，将NaCl、丁酸Na和/或丙戊酸Na加入到培养物中。测试的条件为0mM、25mM和90mM NaCl；0mM、2mM和4mM丁酸Na；0mM、1.5mM和3mM丙戊酸Na。使用36种反应条件测试所述条件的完全因子组合。在168小时ECD时，即转染后第5天，收获培养物的上清液。获得的rAAV产量示出在图1中。在转染后第1天，通过添加60mM氯化钠和4mM丁酸钠或3mM丙戊酸钠，病毒产量得到显著提高。
实施例2.氯化钠和/或丙戊酸钠对rAAV产量的影响。
在基于HEK293悬浮细胞的方法中，测试了不同时间添加的氯化钠、丙戊酸钠以及它们的组合对rAAV产量的影响。将HEK293悬浮细胞以1x10e6活细胞/ml的密度接种在高级微型生物反应器中。培养基包含100mM NaCl。在48小时ECD(经过的培养持续时间)时，使用聚乙烯亚胺和编码腺病毒辅助功能、转基因以及AAV 2/8Rep/Cap的3种质粒的混合物转染细胞。在转染后4小时、24小时或48小时，将NaCl和/或丙戊酸Na加入到培养物中。所测试的NaCl和丙戊酸Na的浓度为0mM、30mM和60mM NaCl以及0mM、1mM和2mM丙戊酸Na。在168小时ECD时，即转染后第5天，收获培养物的上清液。获得的rAAV产量示出在图2中。使用实验设计策略测试和分析了24种不同的条件。由24种条件DOE测试生成的模型预测，转染后4小时添加2mM丙戊酸Na，然后在转染后24小时添加30mM NaCl可显著提高病毒产量。
实施例3.使用NaCl增强剂大规模生产rAAV。
NaCl对rAAV产量的影响在表达使转基因衣壳化的AAV8颗粒的HEK293细胞的50升培养物中进行了测试。将HEK悬浮培养物使用标准方法进行生长。将细胞稀释至约4x10e6个活细胞。所用的培养基包括100mM NaCl。稀释后24小时，使用聚乙烯亚胺和编码腺病毒辅助功能、转基因以及AAV Cap/Rev的3种质粒的混合物转染细胞。转染后24小时，添加足够的NaCl以使最终的NaCl浓度增加60mM。(即最终的NaCl浓度为约160mM)。在转染后第4天收获上清液。所述过程产生1x10e+11基因组拷贝(GC)/ml和9x10e+10。这比转染后不增加NaCl浓度的相同过程的产量高约2倍。
实施例4.使用NaCl和丙酸钠大规模生产AAV。
NaCl对rAAV产量的影响在表达使转基因衣壳化的AAV8颗粒的HEK293细胞的50升培养物中进行了测试。将HEK悬浮培养物使用标准方法进行生长。将细胞稀释至约4x10e6个活细胞。所用的培养基包括100mM NaCl。稀释后24小时，使用聚乙烯亚胺和编码腺病毒辅助功能、转基因以及AAV 2/8Rep/Cap的3种质粒的混合物转染细胞。转染后24小时，添加足够的NaCl以使最终的NaCl浓度增加30mM。(即最终的NaCl浓度为约130mM)，并添加足够的丙酸钠(NaPr)以使最终的NaPr浓度增加至2mM(开始时培养基中没有NaPr)。在转染后第4天收获上清液。所述过程产生1x10e+11基因组拷贝(GC)/ml。这比转染后不增加NaCl和NaPr浓度的相同过程的产量高约1.7倍。图3.同样，滴度显著增加而不牺牲质量。与不使用增强剂的类似过程相比，使用增强剂的放大生产过程对产物质量例如完整衣壳％、片段化rAAV％以及残留的DNA，诸如残留的18S(用于评估残留的哺乳动物基因组DNA的18S RNA基因)、残留的E1a和残留的质粒没有负面影响。
实施例5.氯化钠和/或丙酸钠对rAAV产量的影响。
氯化钠和丙酸钠(NaPr)(ThermoFisher Scientific)对表达使转基因衣壳化的rAAV9颗粒的HEK293细胞悬浮培养物中的rAAV产量的影响。将HEK293细胞以1x10e6活细胞/ml的密度接种在高级微型生物反应器中。培养基包含100mM NaCl。在48小时ECD(经过的培养持续时间)时，使用聚乙烯亚胺和编码腺病毒辅助功能、转基因以及AAV 2/9Rep/Cap的3种质粒的混合物转染细胞。转染后4小时、20小时或36小时，将NaCl、NaPr、抗结块、EFC+和/或丙戊酸Na加入到培养物中。测试的条件为0mM、30mM和60mM NaCl；0mM、2mM和4mM NaPr。使用实验设计方法测试了多种条件。在168小时ECD时，即转染后第5天，收获培养物的上清液。获得了rAAV产量。转染后20小时通过添加30mM氯化钠和2mM丙酸钠两者，病毒产量得到显著且协同的提高。通过添加NaCl和/或NaPr所获得的滴度改善结果如图4所示，其中平均了其他测试条件的影响。在不存在增加的NaCl的情况下，2mM丙酸钠会导致滴度增加约1.5倍。在不存在丙酸钠的情况下，增加的NaCl会导致滴度增加约1.2倍。而2mM丙酸钠和增加的NaCl的组合会导致转染后产量比没有增加NaCl和NaPr浓度的相同过程的基线产量高约2倍。观察到的约2倍增加高于将NaPr和增加的NaCl的影响相加时的预期增加。
实施例6.氯化钠和/或丙酸钠对rAAV产量的影响。
氯化钠和丙酸钠(ThermoFisher Scientific)对表达使转基因衣壳化的rAAV9颗粒的HEK293细胞悬浮培养物中的rAAV产量的影响。将HEK293细胞以1x10e6活细胞/ml的密度接种在高级微型生物反应器中。培养基包含100mM NaCl。在48小时ECD(经过的培养持续时间)时，使用聚乙烯亚胺和编码腺病毒辅助功能、转基因以及AAV2/9Rep/Cap的3种质粒的混合物转染细胞。转染后20小时，将NaCl和丙酸钠(NaPr)加入到培养物中。测试的条件为0mM和30mM NaCl；0mM和2mM NaPr。使用实验设计策略在多种反应条件下测试条件的组合。在168小时ECD时，即转染后第5天，收获培养物的上清液。获得了rAAV产量。转染后20小时通过添加30mM氯化钠和2mM丙酸钠两者，病毒产量得到显著提高。通过添加NaCl和/或NaPr所获得的滴度改善结果如图5所示，其中平均了其他测试条件的影响。这比转染后不增加NaCl和NaPr浓度的相同过程的产量高约1.6倍。
尽管所公开的方法已经结合当前被认为是最实际和优选的实施方案来描述，但是应当理解，本公开所涵盖的方法不限于所公开的实施方案，而是相反，旨在覆盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效安排。
所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括本文引用的多核苷酸和多肽序列)出于所有目的在此以引用的方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列具体地和单独地被指示为以引用的方式并入。

Claims (129)

1.一种产生rAAV颗粒的方法，其包括：
(a)提供包含细胞的细胞培养物；
(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：
i.待包装的rAAV基因组，
ii.包装所需的腺病毒辅助功能，
iii.足以包装的AAV rep蛋白，以及
iv.足以包装的AAV cap蛋白；
(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(d)在(b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约15天之间。
2.如权利要求2所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为短链脂肪酸或其盐。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或其盐。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙酸钠。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约5mM之间。
7.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约3mM之间。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后加入。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约1小时与约48小时之间加入。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约12小时与约36小时之间加入。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约18小时与约30小时之间加入。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后少于约48小时加入。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后少于约36小时加入。
14.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后至少约6小时加入。
15.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后至少约12小时加入。
16.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约6小时、约9小时、约12小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时或约48小时加入。
17.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约20小时加入。
18.如权利要求8所述的方法，其中所述HDAC抑制剂在步骤b)后约24小时加入。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约150mM之间。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约50mM之间、约40mM与约80mM之间或约70mM与约120mM之间。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约140mM之间。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约150mM与约240mM之间。
25.如权利要求22所述的方法，其中在加入所述钠盐之前，所述细胞培养物包含约90mM与约120mM之间的NaCl。
26.如权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述钠盐为氯化钠。
27.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和所述钠盐以任何顺序分开加入。
28.如权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述钠盐在b)之前加入。
29.如权利要求19至27中任一项所述的方法，其中所述钠盐在b)后加入。
30.如权利要求19至29中任一项所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后加入所述钠盐。
31.如权利要求30所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约5分钟与约6小时之间加入所述钠盐。
32.如权利要求30所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约20分钟与约2小时之间加入所述钠盐。
33.如权利要求30所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约2小时加入所述钠盐。
34.如权利要求30所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约1小时加入所述钠盐。
35.如权利要求30所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约5分钟加入所述钠盐。
36.如权利要求30所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约20分钟加入所述钠盐。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
38.如权利要求37所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约5天。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其包括将编码以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：
i.待包装的rAAV基因组，
ii.包装所需的腺病毒辅助功能，
iii.足以包装的AAV rep蛋白，以及
iv.足以包装的AAV cap蛋白。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述腺病毒辅助功能包括腺病毒E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因中的至少一种。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中将一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中是通过转染来进行的。
42.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
43.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞为昆虫细胞。
44.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞为HEK293细胞、HEK衍生细胞、CHO细胞、CHO衍生细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞或PerC6细胞。
45.如权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞为HEK293细胞。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物为悬浮培养物。
47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
48.如权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生大于5x10e+10Gc/ml的rAAV颗粒。
49.如权利要求1至48中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生的以GC/ml测量的rAAV颗粒的量为培养物在不存在加入所述HDAC抑制剂和钠盐情况下的至少约两倍。
50.如权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约20,000升之间。
51.一种用于产生rAAV颗粒的方法，其包括：
(a)提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；
(b)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(c)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为短链脂肪酸或其盐。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或其盐。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙酸钠。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
56.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约5mM之间。
57.如权利要求51至55中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的最终HDAC抑制剂浓度为约0.5mM与约3mM之间。
58.如权利要求51至57中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约20mM与150mM之间。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约20mM与约50mM之间、约40mM与约80mM之间或约70mM与约120mM之间。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约140mM之间。
61.如权利要求51至60中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述钠盐的最终浓度为约150mM与约240mM之间。
64.如权利要求51至63中任一项所述的方法，其中在加入所述钠盐之前，所述细胞培养物包含约90mM与约120mM之间的NaCl。
65.如权利要求51至64中任一项所述的方法，其中所述钠盐为氯化钠。
66.如权利要求51至65中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂和所述钠盐以任何顺序分开加入。
67.如权利要求66所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后加入所述钠盐。
68.如权利要求67所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约5分钟与约6小时之间加入所述钠盐。
69.如权利要求67所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后约20分钟与约2小时之间加入所述钠盐。
70.如权利要求67所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约2小时加入所述钠盐。
71.如权利要求67所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后少于约1小时加入所述钠盐。
72.如权利要求67所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约5分钟加入所述钠盐。
73.如权利要求67所述的方法，其中在加入所述HDAC抑制剂后至少约20分钟加入所述钠盐。
74.如权利要求51至73中任一项所述的方法，其中在b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间或约5天与约14天之间。
75.如权利要求51至73中任一项所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
76.如权利要求75所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约5天。
77.一种用于产生rAAV颗粒的方法，其包括在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV颗粒的细胞。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为短链脂肪酸或其盐。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸酯、丙酸酯、丁酸酯或其盐。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙酸钠。
82.如权利要求77至81中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约0.5mM与约5mM之间的所述HDAC抑制剂。
83.如权利要求77至81中任一项所述的方法，其中所述培养基包含约0.5mM与约3mM之间的所述HDAC抑制剂。
84.如权利要求77至83中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约120mM与约250mM之间的氯化钠。
85.如权利要求77至83中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约130mM与约160mM之间、约150mM与约190mM之间或约180mM与约240mM之间的氯化钠。
86.如权利要求77至83中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约150mM与约240mM之间的氯化钠。
87.如权利要求51至86中任一项所述的方法，其中能够产生rAAV的所述细胞已被编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸转染：
(a)待包装的rAAV基因组，
(b)包装所需的腺病毒辅助功能，
(c)足以包装的AAV rep蛋白，以及
(d)足以包装的AAV cap蛋白。
88.如权利要求51至86中任一项所述的方法，其中能够产生rAAV的所述细胞已被编码以下物质的一种或多种多核苷酸转染：
(a)待包装的rAAV基因组，
(b)包装所需的腺病毒辅助功能，
(c)足以包装的AAV rep蛋白，以及
(d)足以包装的AAV cap蛋白。
89.如权利要求51至88中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞。
90.如权利要求51至88中任一项所述的方法，其中所述细胞为HEK293细胞、HeLa细胞、SF-9细胞、BHK细胞、Vero细胞或PerC6细胞，任选地其中所述细胞为HEK293细胞。
91.如权利要求51至90中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物为悬浮培养物。
92.如权利要求77至91中任一项所述的方法，其中在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，所述培养为约2天与约10天之间或约5天与约14天之间。
93.如权利要求77至91中任一项所述的方法，其中在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，所述培养为约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
94.如权利要求93所述的方法，其中在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，所述培养为约5天。
95.如权利要求51至94中任一项所述的方法，其还包括回收所述rAAV颗粒。
96.如权利要求51至95中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml之间的rAAV颗粒。
97.如权利要求51至96中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物产生的以GC/ml测量的rAAV颗粒的量为培养物在不存在加入所述HDAC抑制剂和钠盐情况下的至少约两倍。
98.一种增加rAAV颗粒产生的方法，其包括：
(a)提供包含细胞的细胞培养物；
(b)将编码至少一种以下物质的一种或多种多核苷酸引入到所述细胞中：
i.待包装的rAAV基因组，
ii.包装所需的腺病毒辅助功能，
iii.足以包装的AAV rep蛋白，以及
iv.足以包装的AAV cap蛋白；
(c)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(d)在(b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约15天之间。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
100.如权利要求98所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙酸钠。
101.如权利要求98至100中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加约40mM与约150mM之间。
102.如权利要求98至101中任一项所述的方法，其中所述钠盐为氯化钠。
103.一种增加rAAV颗粒产生的方法，其包括：
(a)提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；
(b)向所述细胞培养物中加入HDAC抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及
(c)将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
105.如权利要求103所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙酸钠。
106.如权利要求103至105中任一项所述的方法，其还包括向所述培养物中加入足量的钠盐，以使所述钠盐的最终浓度增加至约120mM与约250mM之间。
107.如权利要求103至106中任一项所述的方法，其中所述钠盐为氯化钠。
108.如权利要求103至107中任一项所述的方法，其中在b)后，将所述细胞培养物保持在允许产生所述rAAV颗粒的条件下约2天与约10天之间或约5天与约14天之间。
109.如权利要求103至107中任一项所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。
110.如权利要求109所述的方法，其中在b)后将所述细胞培养物保持约5天。
111.一种增加rAAV颗粒产生的方法，其包括在允许产生所述rAAV颗粒的条件下，在包含约0.1mM与约20mM之间的HDAC抑制剂的培养基中培养能够产生rAAV颗粒的细胞。
112.如权利要求111所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠。
113.如权利要求111所述的方法，其中所述HDAC抑制剂为丙酸钠。
114.如权利要求111至113中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含约120mM与约250mM之间的氯化钠。
115.如权利要求1至114中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
116.如权利要求1至114中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8、AAV9、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1或AAV.hu37血清型的衣壳蛋白。
117.如权利要求1至114中任一项所述的方法，其中所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
118.如权利要求1至117中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约20,000升之间。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约5,000升之间。
120.如权利要求118所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约2,000升之间。
121.如权利要求118所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约1,000升之间。
122.如权利要求118所述的方法，其中所述细胞培养物的体积为约50升与约500升之间。
123.一种组合物，其包含通过如权利要求1至122中任一项所述的方法产生的分离的rAAV颗粒。
124.如权利要求1至50或98至102中任一项所述的方法，其中包装的所述rAAV基因组包含转基因。
125.如权利要求124所述的方法，其中所述转基因包含可操作地连接到编码多肽的多核苷酸的调节元件。
126.如权利要求125所述的方法，其中所述调节元件包含增强子、启动子和polyA区域中的一种或多种。
127.如权利要求125或权利要求126所述的方法，其中所述调节元件和编码多肽的多核苷酸为异源的。
128.如权利要求124至127中任一项所述的方法，其中所述转基因编码抗VEGF Fab、艾杜糖苷酶(IDUA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、三肽基肽酶1(TPP1)或VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体。
129.如权利要求124至127中任一项所述的方法，其中所述转基因编码γ-肌聚糖、Rab护航蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环状核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)、阿柏西普、battenin(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、抗肌萎缩蛋白、肌微管素(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、存活运动神经元(SMN1)、存活运动神经元(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白。
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