JP2023554389A - 組換えアデノ随伴ウイルスウイルス粒子を生成する方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、組換えウイルス粒子を生成するための改善された方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組換えウイルス粒子を生成するための方法は、ウイルス粒子を生成することが可能な細胞の集団を含む浮遊細胞培養物を準備することと、細胞に形質移入するためにポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の第１の体積を浮遊培養物に移すことと、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の第２の体積を浮遊培養物に移すこととを含み、第１及び第２の体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子である。【選択図】なし
Description
本開示は、組換えウイルス粒子を大規模に浮遊細胞培養物中で生成する方法であって、培養物中の細胞に形質移入することを含む、方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国特許出願第６３／１２６，４０５号による利益を主張し、当該出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年１２月１６日に出願された米国特許出願第６３／１２６，４０５号による利益を主張し、当該出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
背景
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースベクターは、現在最も広く使用されている開発中の遺伝子療法製品である。ｒＡＡＶベクター系の使用が好まれる理由は、部分的には、野生型ウイルスに関連する疾患がないこと、ＡＡＶの形質導入が非分裂細胞にも分裂細胞にも可能であること、及び臨床試験で結果的に長期のロバストな導入遺伝子発現が観察されていることによるものであり、このことは、遺伝子療法の適応症における送達の大きな可能性を示している。加えて、種々の天然及び組換えｒＡＡＶベクター血清型は、種々の組織、器官、及び細胞を特異的に標的化し、ベクターに対する任意の既存の免疫を回避するのに役立ち、そのためＡＡＶベース遺伝子療法の治療応用を拡大する。複製欠損型ウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法をより広く後期臨床段階及び商業的使用に採用できるようになる前に、組換えウイルス粒子を大規模生産するための新たな方法を開発する必要がある。
したがって、当技術分野では、ｒＡＡＶ粒子を大規模に生成するための方法の生産性及び収率の改善が必要とされている。
簡単な概要
１つの態様において、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をｒＡＡＶ粒子が変性される条件に供してから、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または洗浄剤を含む。いくつかの実施形態において、移動相はさらに、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
１つの態様において、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ゲノムを単離する方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物をｒＡＡＶ粒子が変性される条件に供してから、変性したｒＡＡＶ粒子を含む組成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または洗浄剤を含む。いくつかの実施形態において、移動相はさらに、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
さらなる態様において、本開示は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を特性評価する方法を提供する。単離されたｒＡＡＶ粒子の特性評価としては、限定されるものではないが、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノムサイズ純度を定量すること、カプシド内のベクターゲノムの折畳みまたは二次構造を評価すること、及び単離ｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価（Ｖｇ）を定量することが挙げられる。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、塩、有機溶媒、または洗浄剤を含む。いくつかの実施形態において、移動相はさらに、緩衝剤を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、バッチリリース、例えば、バッチリリース試験及び／またはロットリリース試験に適している。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ロットリリース試験の一部として実施される。
いくつかの実施形態において、本開示は以下を提供する。
［１．］組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）前記組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｄ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、
（ｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約６０分未満で完了し、
（ｉｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、約６時間以下の期間にわたって実施され、かつ
（ｉｖ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される、
前記方法。
ａ）前記組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｄ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、
（ｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約６０分未満で完了し、
（ｉｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、約６時間以下の期間にわたって実施され、かつ
（ｉｖ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される、
前記方法。
［２．］ステップｃ）がもう１回繰り返される、［１］に記載の方法。
［３．］ステップｃ）が１回以上繰り返される、［１］に記載の方法。
［４．］ステップｃ）が１、２、３、４、５、６、７、または８回繰り返される、［１］に記載の方法。
［５．］前記浮遊培養物に移された前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積が、ステップａ）の前記浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６．］ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７．］ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約６０分以内に開始される、［１］～［５］のいずれか１つに記載の方法。
［８．］組換えウイルス粒子の生成を増加させる方法であって、
ａ）前記組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｄ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、
（ｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約６０分未満で完了し、
（ｉｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、約６時間以下の期間にわたって実施され、かつ
（ｉｖ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される、
前記方法。
ａ）前記組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｄ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、
（ｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約６０分未満で完了し、
（ｉｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、約６時間以下の期間にわたって実施され、かつ
（ｉｖ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される、
前記方法。
［９．］ステップｃ）がもう１回繰り返される、［８］に記載の方法。
［１０．］ステップｃ）が１回以上繰り返される、［８］に記載の方法。
［１１．］ステップｃ）が１、２、３、４、５、６、７、または８回繰り返される、［８］に記載の方法。
［１２．］前記浮遊培養物に移された前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積が、ステップａ）の前記浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である、［８］～［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３．］ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される、［８］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４．］ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約６０分以内に開始される、［８］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［１５．］前記１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和することが、インラインミキサーによって実施される、［１］～［１４］のいずれか１つに記載の方法。
［１６．］ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約３０分未満で完了する、［１］～［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１７．］ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約３５分未満で完了する、［１］～［１５］のいずれか１つに記載の方法。
［１８．］ステップｂ）及びステップｃ）の前記インキュベートすることが各々約１０～約２０分間である、［１］～［１７］のいずれか１つに記載の方法。
［１９．］ステップｂ）及びステップｃ）の前記インキュベートすることが各々約１０～約１５分間である、［１］～［１７］のいずれか１つに記載の方法。
［２０．］前記少なくとも１つの形質移入試薬が安定なカチオン性ポリマーを含む、［１］～［１９］のいずれか１つに記載の方法。
［２１．］前記少なくとも１つの形質移入試薬がＰＥＩを含む、［１］～［２０］のいずれか１つに記載の方法。
［２２．］前記細胞培養物が、約２００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２３．］前記細胞培養物が、約２００リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２４．］前記細胞培養物が、約２００リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２５．］前記細胞培養物が、約２００リットルから約５００リットルの間の体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２６．］前記細胞培養物が、約２００リットル、約３００リットル、約４００リットル、約５００リットル、約７５０リットル、約１，０００リットル、約２，０００リットル、約３，０００リットル、または約５，０００リットルの体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２７．］前記細胞培養物が約５００リットルの体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２８．］前記細胞培養物が約１，０００リットルの体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［２９．］前記細胞培養物が約２，０００リットルの体積を有する、［１］～［２１］のいずれか１つに記載の方法。
［３０．］前記細胞の集団が、哺乳類細胞または昆虫細胞の集団を含む、［１］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３１．］前記細胞の集団が哺乳類細胞の集団を含む、［１］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［２１．］前記細胞の集団が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞の集団を含む、［１］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３３．］前記細胞の集団がＨＥＫ２９３細胞の集団を含む、［１］～［２９］のいずれか１つに記載の方法。
［３４．］ステップａ）で準備される前記浮遊細胞培養物が、約２×１０Ｅ＋６から約１０Ｅ＋７個の間の生存細胞／ｍｌを含む、［１］～［３３］のいずれか１つに記載の方法。
［３５．］前記細胞培養物が、約２日から約１０日の間、約３日から約５日の間、または約５日から１４日の間、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持される、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３６．］前記細胞培養物が、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３７．］前記細胞培養物が少なくとも約３日間維持される、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３８．］前記細胞培養物が約３日間維持される、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［３９．］前記細胞培養物が約４日間維持される、［１］～［３４］のいずれか１つに記載の方法。
［４０．］前記組換えウイルス粒子が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子または組換えレンチウイルス粒子である、［１］～［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４１．］前記組換えウイルス粒子がｒＡＡＶ粒子である、［１］～［３９］のいずれか１つに記載の方法。
［４２．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、［４１］に記載の方法。
［４３．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、［４１］に記載の方法。
［４４．］前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、［４１］に記載の方法。
［４５．］前記ｒＡＡＶ粒子が、導入遺伝子を含むゲノムを含む、［４１］～［４４］のいずれか１つに記載の方法。
［４６．］前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作用可能に接続した調節エレメントを含む、［４５］に記載の方法。
［４７．］前記調節エレメントが、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む、［４６］に記載の方法。
［４８．］前記調節エレメント及びポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが異種である、［４５］または［４６］に記載の方法。
［４９．］前記導入遺伝子が、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、Ｆｃ融合ポリペプチド、イムノアドヘシン、免疫グロブリン、操作タンパク質、タンパク質フラグメント、または酵素をコードする、［４５］～［４８］のいずれか１つに記載の方法。
［５０．］前記導入遺伝子が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ－１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードする、［４５］～［４８］のいずれか１つに記載の方法。
［５１．］前記導入遺伝子が、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする、［４５］～［４８］のいずれか１つに記載の方法。
［５２．］前記１つ以上のポリヌクレオチドが、
ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及び
ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質
をコードする、［４１］～［５１］のいずれか１つに記載の方法。
ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及び
ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質
をコードする、［４１］～［５１］のいずれか１つに記載の方法。
［５３．］前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記ｒＡＡＶゲノムをコードするポリヌクレオチドと、前記ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶ ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記アデノウイルスヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドとを含む、［５２］に記載の方法。
［５４．］前記アデノウイルスヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、［５２］または［５３］のいずれか１つに記載の方法。
［５５．］前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、［４１２］～［５４］のいずれか１つに記載の方法。
［５６．］前記細胞培養物が、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する、［４１］～［５５］のいずれか１つに記載の方法。
［５７．］前記細胞培養物が、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する、［４１］～［５６］のいずれか１つに記載の方法。
［５８．］［４１］～［５７］のいずれか１つに記載の方法によって生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子
を含む、組成物。
を含む、組成物。
本明細書で説明される組成物及び方法のさらなる他の特徴及び利点は、添付の図面と共に読めば、以下の詳細な説明からさらに明らかになるであろう。
詳細な説明
本明細書では、大規模な培養物、例えば浮遊培養物中で組換えウイルス粒子を生成するための方法であって、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む１体積より多い別々に生成された組成物を培養物に移すことを含み、１体積より多い組成物を移すことが約６時間以下の期間にわたって実施され、１体積より多い組成物を移すことが同時または連続的に実施される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、安定なカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、大規模な細胞培養物は、約２００リットルから約２０，０００リットルの間であり、培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の合わせた体積は、細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の各体積は、約６０分以下（例えば、約３０分以下）で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の合わせた体積は、約６０分以下（例えば、約３０分以下）で単一バッチで生成され、大規模培養物に移され得る体積より大きい。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書で開示される方法は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む大きな総体積の組成物を細胞培養物に移すことを可能にすることによって生産性の増加をもたらし、ここで、組成物の各構成成分体積は、約６０分以下（例えば、約３０分以下）で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の各体積は、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３５分以下、３０分以下、２５分以下、または２０分以下で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の各体積は、３０分以下で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法の生産性は、単一バッチで生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む組成物の同じ総体積を移すことを含む参照方法の生産性の少なくとも約２倍である。いくつかの実施形態において、生産性は、収集時の培養物ｍｌ当たりのウイルス粒子として定量される。いくつかの実施形態において、生産性は、単位体積、例えば１ｍｌの培養物から回収されたウイルス粒子の数として定量される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長する接着性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ＨＥＫ２９３細胞を含む浮遊細胞培養物である。
本明細書では、大規模な培養物、例えば浮遊培養物中で組換えウイルス粒子を生成するための方法であって、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む１体積より多い別々に生成された組成物を培養物に移すことを含み、１体積より多い組成物を移すことが約６時間以下の期間にわたって実施され、１体積より多い組成物を移すことが同時または連続的に実施される、方法が提供される。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、安定なカチオン性ポリマー（例えば、ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、大規模な細胞培養物は、約２００リットルから約２０，０００リットルの間であり、培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の合わせた体積は、細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の各体積は、約６０分以下（例えば、約３０分以下）で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の合わせた体積は、約６０分以下（例えば、約３０分以下）で単一バッチで生成され、大規模培養物に移され得る体積より大きい。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書で開示される方法は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む大きな総体積の組成物を細胞培養物に移すことを可能にすることによって生産性の増加をもたらし、ここで、組成物の各構成成分体積は、約６０分以下（例えば、約３０分以下）で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の各体積は、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３５分以下、３０分以下、２５分以下、または２０分以下で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む別々に生成された組成物の各体積は、３０分以下で生成され、細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法の生産性は、単一バッチで生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を含む組成物の同じ総体積を移すことを含む参照方法の生産性の少なくとも約２倍である。いくつかの実施形態において、生産性は、収集時の培養物ｍｌ当たりのウイルス粒子として定量される。いくつかの実施形態において、生産性は、単位体積、例えば１ｍｌの培養物から回収されたウイルス粒子の数として定量される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は浮遊細胞培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長する接着性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ＨＥＫ２９３細胞を含む浮遊細胞培養物である。
いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
１つの治療単位用量を調製するのに極めて多数のｒＡＡＶ粒子が必要であることを考えると、ｒＡＡＶ収量が２倍増加すれば単位用量当たりの製品コストが顕著に低減する。ウイルス収量が増加すれば、それに応じて、ｒＡＡＶ粒子の生成に必要な消耗品のコストだけでなく、工業用ウイルス精製施設の建設に関連する設備投資のコストも低減することができる。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本開示の方法の理解を容易にするため、以下に複数の用語及び表現を定義する。
例えば、組成物中の成分の量、組成物中の成分の濃度、流量、ｒＡＡＶ粒子収量、フィード体積、塩濃度、類似の値、及びこれらの範囲を修飾し、本明細書で提供される方法で用いられる「約」とは、例えば、濃縮物もしくは使用溶液を作製するために使用される典型的な測定及び取扱い手順によって；これらの手順における偶発性のエラーによって；組成物の作製もしくは方法の実行に用いられる製造、供給源、もしくは成分の純度の違いによって；及び類似の考慮事項によって生じ得る、数値的量のバリエーションを意味する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物が老化することによって相違する量も包含する。「約」という用語は、特定の初期濃度を有する組成物または混合物を混合または処理することによって相違する量も包含する。「約」という用語で修飾されているかどうかにかかわらず、請求項は、その量の等価物を含む。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、示された数または範囲よりも約１０～２０％多いまたは少ない範囲を意味する。さらなる実施形態において、「約」とは、示された数または範囲のプラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示す。
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその修飾物、派生物、もしくはシュードタイプを意味するように使用することができる。当該用語は、別段に要求される場合を除いて、全てのサブタイプ、ならびに天然の形態及び組換え形態両方を包含する。省略形「ｒＡＡＶ」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを意味する。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ９）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶ、ならびにこれらの修飾物、派生物、またはシュードタイプを含む。「霊長類ＡＡＶ」とは霊長類に感染するＡＡＶを意味し、「非霊長類ＡＡＶ」とは非霊長類哺乳類に感染するＡＡＶを意味し、「ウシＡＡＶ」とはウシ哺乳類に感染するＡＡＶを意味する、などとなる。
ＡＡＶ粒子に適用される「組換え」とは、ＡＡＶ粒子が、本質的にＡＡＶ粒子とは異なるＡＡＶ粒子コンストラクトをもたらす１つ以上の手順の生成物であることを意味する。
組換えアデノ随伴ウイルス粒子「ｒＡＡＶ粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質と、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達させる導入遺伝子）を含むカプシド化ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターゲノムとから構成されるウイルス粒子を意味する。ｒＡＡＶ粒子は、任意の修飾物、派生物、またはシュードタイプを含めた任意のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０、またはこれらの派生体／修飾物／シュードタイプ）とすることができる。このようなＡＡＶ血清型及び派生物／修飾物／シュードタイプ、ならびにこのような血清型／派生物／修飾物／シュードタイプを生成する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照）。
本開示のｒＡＡＶ粒子は、任意の血清型、または血清型の任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１０、もしくはその他のｒＡＡＶ粒子、またはこれらの２つ以上の組合せである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子である。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプからなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプの血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。
「細胞培養物」という用語は、マイクロキャリアまたはマクロキャリア、バイオリアクター、ローラーボトル、ハイパースタック、ミクロスフェア、マクロスフェア、フラスコなどで、浮遊状態でまたは接着して成長させる細胞、及び上清または浮遊液自体の構成成分を意味し、このような構成成分としては、限定されるものではないが、ｒＡＡＶ粒子、細胞、細胞デブリ、細胞混入物、コロイド粒子、生体分子、宿主細胞タンパク質、核酸、脂質、及び凝集剤が挙げられる。バイオリアクターなどの大規模アプローチ（浮遊培養物、及び撹拌バイオリアクター内のマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長させる付着細胞が含まれる）は、「細胞培養物」という用語に包含される。ウイルス粒子またはタンパク質の大規模生産及び小規模生産いずれのための細胞培養手順も、本開示に包含される。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、懸濁液中で成長した細胞を意味する。いくつかの実施形態において、「細胞培養物」という用語は、撹拌バイオリアクター内でマイクロキャリアまたはマクロキャリアに付着して成長した接着性細胞を意味する。
本明細書で使用する場合、「精製すること」、「精製」、「分離」、「分離すること」、「分離」、「単離する」、「単離すること」、または「単離」という用語は、ターゲット生成物と１つ以上の不純物とを含む試料からのターゲット生成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶゲノム）の純度の程度を高めることを意味する。典型的には、ターゲット生成物の純度の程度は、試料から少なくとも１つの不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって高められる。いくつかの実施形態において、試料中のｒＡＡＶの純度の程度は、本明細書で説明される方法を使用することにより、試料から１つ以上の不純物を（完全にまたは不完全に）除去することによって増加する。
本開示及び請求項で使用する場合、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形を含む。
諸実施形態が「～を含む」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」及び／または「本質的に～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。また、諸実施形態が「本質的に～からなる」という語を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「～からなる」という観点から説明されている別の類似の実施形態も提供されるものと理解されたい。
「及び／または」という用語は、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」などの表現で使用される場合、Ａ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むように意図されている。同様に、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
本開示の実施形態がマルクーシュグループまたはその他の代替のグループに関して説明される場合、本開示の方法は、全体として挙げられたグループ全体を包含するだけでなく、グループの各メンバーも個別に包含し、メイングループの全ての可能なサブグループも包含し、さらにグループメンバーの１つ以上不在のメイングループも包含する。また、本開示の方法は、本開示の方法におけるグループメンバーのいずれかの１つ以上が明示的に除外されることも想定している。
組換えウイルス生成のための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップｃ）はもう１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は２回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は４回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は５回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は６回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は８回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は９回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップｃ）はもう１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は２回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は４回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は５回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は６回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は８回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は９回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子の生成を増加させる方法であって、
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えウイルス粒子の生成を増加させる方法であって、
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、ステップｃ）はもう１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は２回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は４回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は５回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は６回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は８回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は９回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
ａ）組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む細胞培養物を、組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
１つ以上のポリヌクレオチドが、組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、ステップｃ）はもう１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は２回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は４回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は５回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は６回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は８回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は９回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はカチオン性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、
ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊細胞培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊細胞培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の生成を増加させる方法であって、
ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することを含み、形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞の集団を含む約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートすることと、ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を培養物に移すことと、ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含み、形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップｃ）はもう１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は２回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は４回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は５回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は６回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は８回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は９回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の生成を増加させる方法であって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞の集団を含む約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートすることと、ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を培養物に移すことと、ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含み、形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。
いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物は、浮遊細胞培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物は、約４００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
ａ）ｒＡＡＶを生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊細胞培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊細胞培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の生成を増加させる方法であって、
ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すことと、
ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することを含み、形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を生成する方法であって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞の集団を含む約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートすることと、ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を培養物に移すことと、ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含み、形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、ステップｃ）はもう１回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は２回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は３回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は４回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は５回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は６回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は８回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は９回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は７回繰り返される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）は１０回繰り返される。いくつかの実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の生成を増加させる方法であって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を生成可能な細胞の集団を含む約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートすることと、ｃ）第２の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を培養物に移すことと、ｄ）形質移入された細胞を含む浮遊細胞培養物を、ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で維持することとを含み、形質移入試薬がＰＥＩを含み、１つ以上のポリヌクレオチドがｒＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含み、ステップｃ）が１回以上繰り返される、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、当該方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法と比較して、ｒＡＡＶ生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、ステップａ）の浮遊細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、先行ステップの移すことを完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｃ）の移すことは、ステップｂ）の移すことを完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、各々約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことは、各々約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分から約１５分の間に行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）のインキュベートは、約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約８時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約６時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約５時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約４時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１時間から約３時間の間の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約１２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約９時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約８時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約７時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約６時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約５時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約３時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、約２時間以下の期間にわたって実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、同時または任意の順序で連続的に実施される。
いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の移すことは、任意の順序で連続的に実施される。いくつかの実施形態において、ステップｂ）及びステップｃ）の混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、同じ方法で実施される。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物は、浮遊細胞培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、浮遊細胞培養物は、約４００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
形質移入に基づく組換えウイルス粒子生成系は、当業者に知られている。例えば、Ｒｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（１１）：９１０－３（２０００）；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３－８４７１（１９９８）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９７（１１）６１０８－６１１３（２０００）；Ｍｉｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３５（２６）：３４２３－３４３０ （２０１７）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。本明細書で開示される方法は、形質移入に基づく生成系で組換えウイルス粒子を生成するために使用することができる。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えデングウイルス、組換えエボラウイルス、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、組換えヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えレンチウイルス、組換えインフルエンザウイルス、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、組換えポリオウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えワクシニア、組換えレオウイルス、組換え麻疹、組換えニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、組換え帯状疱疹ウイルス（ＨＺＶ）、組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、または組換えバキュロウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、組換えレンチウイルス、または組換えインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えインフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えバキュロウイルスである。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
当技術分野で知られている細胞に形質移入するための任意の好適な形質移入試薬を、本明細書で開示される方法に従って組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成に使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、化学ベースの形質移入法を用いて細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、カチオン性有機キャリアを用いて細胞に形質移入することを含む。例えば、Ｇｉｇａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ １０（１０）：１６９２－１７１８（２０１９）；Ｄａｍｅｎ ｅｔ ａｌ．ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ ９（９）：１４０４－１４２５（２０１８）（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、脂質、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ヘルパー脂質（Ｄｏｐｅ、コレステロール）、及びこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、多価カチオン性脂質、例えば、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、及びこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、双極性脂質、またはボラ両親媒性物質（ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ）（ボラ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、生物学的還元性及び／または二量体化可能な脂質を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ジェミニ界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＰＬＵＳ ２０００（商標）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ポリマー、例えば、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、多糖（キトサン、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ））、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、及びデンドリマー（ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ））を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、ペプチド、例えば、塩基性アミノ酸に富むペプチド（ＣＷＬ１８）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（Ａｒｇに富むペプチド（オクタアルギニン、ＴＡＴ））、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（ＳＶ４０）、及びターゲティング（ＲＧＤ）を含む。いくつかの実施形態において、カチオン性有機キャリアは、カチオン性リポソームと組み合わせたポリマー（例えば、ＰＥＩ）を含む。Ｐａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２５（１４）：３２７７（２０２０）（参照によりその全体が本明細書に援用される）。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（デンドリマー）、カチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、リポフェクションを含む。
いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、デキストラン、シクロデキストリン（ＣＤ）、ポリ［２－（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］（ＰＤＭＡＥＭＡ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状ＰＥＩ、分枝状ＰＥＩ、またはこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は直鎖状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は分枝状ＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、約５から約２５ｋＤａの間の分子量を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＧ化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬は、疎水性部位（例えば、コレステロール、コリン、アルキル基、及びいくつかのアミノ酸）が付着した修飾ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。
組成物ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和することは、形質移入試薬及び１つ以上のポリヌクレオチドの各々を無菌液体（例えば、組織培養基）に希釈することと、希釈された形質移入試薬及び希釈された１つ以上のポリヌクレオチドを混合することとを含む。いくつかの実施形態において、混合することは、希釈された１つ以上のポリヌクレオチド及び希釈された少なくとも１つの形質移入試薬を、２つの別々の容器から新たな容器に移すことを含む。いくつかの実施形態において、希釈された１つ以上のポリヌクレオチド及び希釈された少なくとも１つの形質移入試薬を新たな容器に移すことは、約５００ｍｌ／分、約１リットル／分、約２リットル／分、約３リットル／分、約４リットル／分、約５リットル／分、約６リットル／分、約７リットル／分、約８リットル／分、約９リットル／分、または約１０リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは約３リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは約４リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは約５リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは約６リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、希釈された１つ以上のポリヌクレオチドを希釈された少なくとも１つの形質移入試薬と混合することは、インラインミキサーによって実施される。いくつかの実施形態において、インラインミキサーは低剪断インラインミキサーである。いくつかの実施形態において、インラインミキサーはスタティックインラインミキサーである。ポリヌクレオチドと形質移入試薬との混合に適したインラインミキサーは当技術分野で知られており、例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ（Ｆｌｅｘｓａｆｅ（登録商標）Ｐｒｏ Ｍｉｘｅｒ）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＵＳ，Ｉｎｃ（ＨＹＰＥＲＳＨＥＡＲ（商標））、Ｆｌｕｉｔｅｃ、またはＳＴＲＩＫＯから入手することができる。当業者は、希釈及び混合が、形質移入試薬及びポリヌクレオチドを所望の比率及び濃度で含む組成物を生成するように行われることを理解する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの形質移入試薬及び１つ以上のポリヌクレオチドの希釈及び混合は、形質移入試薬及びポリヌクレオチドを約１：５から５：１の間の重量比で含む組成物を生成する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：３から３：１の間である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：３から１：１の間である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：２から１：１．５の間である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は、約１：５、１：４、１：３、１：２．５、１：２、１：１．７５、１：１．５、１：１．２５、１：１、１．２５：１、１．５：１、１．７５：１、２：１、２．５：１、３：１、４：１、または５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：２である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１．７５である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１．５である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１．２５である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１．２５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１．５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約１．７５：１である。いくつかの実施形態において、形質移入試薬及びポリヌクレオチドの重量比は約２：１である。いくつかの実施形態において、組成物は、約１μｇから約２０μｇの間の１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは３つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは２つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは１つのプラスミドを含む。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えＡＡＶであり、１つ以上のポリヌクレオチドは、３つのポリヌクレオチド（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）の混合物を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９粒子である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択される血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩである。
いくつかの実施形態において、形質移入試薬及び１つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬の複合体の形成を可能にするようにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、インキュベートは室温で行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは組成物を、例えば、シェーカーにおいて約１００ｒｐｍから約２００ｒｐｍの間で振とうすることを含む。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約５分から約２０分の間、約１０分から約２０分の間、約５分から約１５分の間、約１０分から約１５分の間、または約１５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約５分から約２０分の間に行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約１０分～約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約５分間、約１０分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、または約２０分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１１分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１２分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１３分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１４分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、１５分以下の間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、１０分以下の間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは、約５分間、約１０分間、または約１５分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートは約１０分間行われる。いくつかの実施形態において、インキュベートの長さは、混和すること、インキュベートすること、及び移すことが、約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了するような長さである。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。
ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すための方法は、当業者に知られている。いくつかの実施形態において、移すことは蠕動ポンプを用いて実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約１００ｍｌ／分から約１０リットル／分の間の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約５００ｍｌ／分、約１リットル／分、約２リットル／分、約３リットル／分、約４リットル／分、約５リットル／分、約６リットル／分、約７リットル／分、約８リットル／分、約９リットル／分、または約１０リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約３リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約４リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約５リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約６リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約７リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約８リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約９リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移すことは、約１０リットル／分の速度で実施される。いくつかの実施形態において、移す速度は、混和すること、インキュベートすること、及び移すことが、約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了するように設定される。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、同じプロセスを用いて生成される。いくつかの実施形態において、第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と別々に混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、混合物をインキュベートし、細胞に形質移入するために、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に移すこととは、同じプロセスを使用する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に別々に移すことは、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移すことを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を浮遊培養物に別々に移すことは、異なる体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移すことを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成可能な細胞の集団を含む細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である。いくつかの実施形態において、移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、細胞培養物の体積の約７％から約１５％の間である。いくつかの実施形態において、移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、細胞培養物の体積の約１０％である。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、約０．１μｇの１つ以上のポリヌクレオチド／１０Ｅ＋６生細胞／ｍｌから約５μｇの１つ以上のポリヌクレオチド／１０Ｅ＋６生細胞／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、約０．２μｇの１つ以上のポリヌクレオチド／１０Ｅ＋６生細胞／ｍｌから約２μｇの１つ以上のポリヌクレオチド／１０Ｅ＋６生細胞／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物に移されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積は、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１μｇの１つ以上のポリヌクレオチド／１０Ｅ＋６生細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約７００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約１，０００リットルから約２０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約７００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約１，０００リットルから約１０，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約４００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約５００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約７００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約１，０００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で言及される細胞培養体積は、表１に記載のような最終的なバイオリアクター／容器の容量である。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２００リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２００リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２００リットルから約５００リットルの間の体積を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で言及される細胞培養体積は、表１に記載のような最終的なバイオリアクター／容器の容量である。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約３００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約４００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約７５０リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約１，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約２，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約３，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５，０００リットルの体積を有する。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、２つの別々に生成された約２０リットル体積（例えば、約２１リットル）のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約４００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、３つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約６００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、４つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約８００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、５つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，０００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、６つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，２００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、７つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，４００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、８つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，６００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、９つの別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，８００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、１０の別々に生成された約２０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約２，０００リットルの細胞培養物に移すことを含む。参考のため、別々に生成された形質移入複合体混合物の体積における非限定的な例を表１に示す。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、１つの約４０リットル体積（例えば、約４２リットル）のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約４００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、２つの別々に生成された約４０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約８００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、４つの別々に生成された約４０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，６００リットルの細胞培養物に移すことを含む。参考のため、別々に生成された形質移入複合体混合物の体積における非限定的な例を表１に示す。
いくつかの実施形態において、移す速度は、混和すること、インキュベートすること、及び移すことが、約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了するように設定される。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、２つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約６００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、３つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約９００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、４つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，２００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、５つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，５００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、６つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約１，８００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、７つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約２，１００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、８つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約２，４００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、９つの別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約２，７００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、１０の別々に生成された約３０リットル体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を、約３，０００リットルの細胞培養物に移すことを含む。いくつかの実施形態において、移す速度は、混和すること、インキュベートすること、及び移すことが、約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了するように設定される。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約９０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約４０分未満、約３５分未満、約３０分未満、約２５分未満、または約２０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約６０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約５０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約４０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約３０分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約２５分未満で完了する。いくつかの実施形態において、混和すること、インキュベートすること、及び移すことは、約２０分未満で完了する。
別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を細胞培養物に移すことは、同時にまたは連続的に実施することができる。同時に移すことは、重複して移すことを含む。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、同時に細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、連続的に細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了する前に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了した直後に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積を移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約１０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約１５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約２０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約３０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約４５分以内に開始される。いくつかの実施形態において、別々に生成されたポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の体積を移すことは、先行する別々に生成された体積の移行を完了してから約６０分以内に開始される。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１時間から約１２時間の間の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１時間から約８時間の間の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１時間から約６時間の間の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１時間から約５時間の間の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１時間から約４時間の間の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１時間から約３時間の間の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約１２時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約９時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約８時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約７時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約６時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約５時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約５時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約３時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、別々に生成された体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体は、約２時間以下の期間にわたって細胞培養物に移される。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、組換えＡＡＶ粒子の生成に必要な遺伝情報（遺伝子を含む）をコードする。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のヘルパー遺伝子、ｒｅｐ遺伝子、キャップ遺伝子、及び導入遺伝子（例えば、目的遺伝子またはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノム）を含む。いくつかの実施形態において、形質移入試薬はＰＥＩを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約２×１０Ｅ＋６から約１０Ｅ＋７生存細胞／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、約３×１０Ｅ＋６から約８×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌの間を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約３×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約４×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約５×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約６×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約７×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、細胞培養物は約８×１０Ｅ＋６生存細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、哺乳類細胞または昆虫細胞の集団を含む。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、哺乳類細胞の集団を含む。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞の集団を含む。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、ＨＥＫ２９３細胞の集団を含む。
いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約２日から約１０日の間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約３日から約５日の間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約５日から約１４日またはそれ以上の間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約２日から約７日の間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約３日から約５日の間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから少なくとも約３日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約５日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を移してから約６日間維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養物は、継続的な収集のためのｒＡＡＶ粒子の生成が可能な条件下で維持される。いくつかの実施形態において、培養物はＨＥＫ２９３細胞（例えば、浮遊培養に適応したＨＥＫ２９３細胞）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法に比べて、組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えウイルスの生成を少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、組換えウイルスの生成を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、または少なくとも約５倍増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶの生成を少なくとも約２倍増加させる。いくつかの実施形態において、生成の増加は、生成培養物の組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）力価を比較することによって定量される。いくつかの実施形態において、組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）力価は、生成培養物のミリリットル当たりのゲノムコピー（ＧＣ）として測定される。いくつかの実施形態において、組換えウイルスはｒＡＡＶである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質属性を維持または改善しながら、ｒＡＡＶ粒子の生成を増加させる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子及びそれを含む組成物の品質は、ｒＡＡＶ粒子の濃度（例えば、ＧＣ／ｍｌ）、ｒＡＡＶゲノムのコピーを含む粒子のパーセンテージ、ゲノムを含まない粒子の比率、ｒＡＡＶ粒子の感染性、ｒＡＡＶ粒子の安定性、残留する宿主細胞タンパク質の濃度または残留する宿主細胞核酸の濃度（例えば、宿主細胞ゲノムＤＮＡ、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするプラスミド、ヘルパー機能をコードするプラスミド、ｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミド）を定量することにより、評価される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子または組成物の品質と同じである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子またはそれを含む組成物の品質は、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法によって生成されたｒＡＡＶ粒子または組成物の品質よりも良好である。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌから約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌ超のｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１１ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約１×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、少なくとも約５×１０ｅ＋１３ＧＣ／ｍｌのｒＡＡＶ粒子を生成する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
当技術分野では、ｒＡＡＶ粒子の生成のための多数の細胞培養に基づく系が知られており、これらはいずれも、本明細書で開示される方法の実施に使用することができる。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物は、（１）好適な宿主細胞（例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、ＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ由来細胞を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。
当業者は、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）、ならびにｒＡＡＶゲノム（逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する１つ以上の目的遺伝子を含む）を細胞に導入して、ｒＡＡＶを生成またはパッケージングすることができる多数の方法を認識している。「アデノウイルスヘルパー機能」という表現は、ＡＡＶが細胞内で効率的に成長するように細胞内で（ＲＮＡまたはタンパク質として）発現する複数のウイルスヘルパー遺伝子を意味する。当業者は、アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含めたヘルパーウイルスがＡＡＶ複製を促進すること、そして、必須機能を提供するある特定の遺伝子が同定されており、例えば、ヘルパーが、このようなＡＡＶ遺伝子発現及び複製を促進する細胞環境への変化を誘導し得ることを理解している。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムをコードする１つ以上のプラスミドベクターの形質移入により、細胞に導入される。
ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ヘルパー遺伝子、及び／またはｒＡＡＶゲノムをコードするプラスミドまたはウイルスベクターを開発する分子生物学技法は、当技術分野で一般的に知られている。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのプラスミドベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのプラスミドベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）は、１つのウイルスベクターによってコードされる。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子またはＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、残りのＡＡＶヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパー遺伝子は、宿主細胞によって安定的に発現し、１つ以上のヘルパー遺伝子は、１つのウイルスベクターによる形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、及びパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムは、１つ以上のポリヌクレオチド、例えばベクターを用いた形質移入によって細胞に導入される。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、３つのポリヌクレオチドの混合物（１つはｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子をコードし、１つはパッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子）をコードし、１つはパッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードする）を細胞に形質移入することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８ ｃａｐ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７をコードする。いくつかの実施形態において、パッケージング対象のｒＡＡＶゲノムをコードするベクターは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型からのものである。
任意のベクターの組合せを使用して、ｒＡＡＶ粒子が生成またはパッケージングされる細胞に、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ＡＡＶヘルパー遺伝子、ならびにｒＡＡＶゲノムを導入することができる。本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する対象遺伝子を含むｒＡＡＶゲノムをコードする第１のプラスミドベクターと、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２のベクターと、ヘルパー遺伝子をコードする第３のベクターとを使用することができる。いくつかの実施形態において、３つのベクターの混合物を細胞内に同時形質移入することができる。
いくつかの実施形態において、プラスミドベクターに加えてウイルスベクターを共に使用することにより、形質移入及び感染の組合せが使用される。
いくつかの実施形態において、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子のうちの１つ以上ならびにＡＡＶヘルパー遺伝子は、細胞によって構成的に発現し、細胞に形質移入または形質導入する必要がない。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、１つ以上のＡＡＶヘルパー遺伝子を構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｅ１ａを構成的に発現する。いくつかの実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶゲノムをコードする安定的な導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ、ｃａｐ、及びヘルパー遺伝子（例えば、Ｅｌａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、またはＶＡ遺伝子）は、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。同様に、ＡＡＶ ＩＴＲも、任意のＡＡＶ血清型とすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からのものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ９またはＡＡＶ８ ｃａｐ遺伝子からのものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはその他のＡＡＶ血清型（例えば、２つ以上の血清型からの配列を有するハイブリッド血清型）からのものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子生成のためのＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、異なる血清型からのものである。例えば、ｒｅｐ遺伝子はＡＡＶ２からのものであり、一方ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ９からのものである。
当技術分野で知られている任意の好適な培地を、本明細書で開示される方法に従って組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。いくつかの実施形態において、培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のＤｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地、またはＥｘｐｉ２９３（商標）発現培地を含む。いくつかの実施形態において、培地は、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む細胞培養物を使用する。いくつかの実施形態において、培地は、動物成分フリー培地である。いくつかの実施形態において、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、ウシ胎児血清を含む。いくつかの実施形態において、培地は、無グルタミン培地である。いくつかの実施形態において、培地は、グルタミンを含む。いくつかの実施形態において、培地には、栄養素、塩、緩衝剤、及び添加物（例えば、消泡剤）のうちの１つ以上が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、グルタミンが補充される。いくつかの実施形態において、培地には、血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ウシ胎児血清が補充される。いくつかの実施形態において、培地には、ポロキサマー、例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ １８８ Ｂｉｏが補充される。いくつかの実施形態において、培地は、基本培地である。いくつかの実施形態において、培地は、フィード培地である。
組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶウイルス生成培養物には、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、及びＳＦ－９細胞が含まれ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは組換えＡＡＶである。
当技術分野で組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成することが知られている任意の細胞または細胞株を、本明細書で開示される方法のいずれか１つで使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を生成する、または組換えウイルス粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の生成を増加させる方法は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＰＫ１５細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、哺乳類細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、昆虫細胞、例えばＳＦ－９細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、浮遊培養での成長に適応した細胞を使用する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を使用する。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は組換えＡＡＶ粒子である。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、浮遊培養物である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される大規模浮遊細胞培養物は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地を含む。いくつかの実施形態において、浮遊適応性細胞は、振とうフラスコ、スピナーフラスコ、細胞バッグ、またはバイオリアクター中で培養される。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地、動物成分フリー培地、または化学的に定義された培地を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、無血清培地を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、抗凝集剤を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、デキストラン硫酸塩を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される細胞培養物は、約０．１ｍｇ／Ｌから約１０ｍｇ／Ｌの間のデキストラン硫酸塩を含む。デキストラン硫酸塩を含む培養基中で宿主細胞を形質移入するための方法は、２０２１年１月２１日に出願された米国仮出願第６３／１３９，９９２号（表題「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓｅｓ」）（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される大規模浮遊培養細胞培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
本明細書で開示される方法は、任意のＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の生成で使用することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、及びＡＡＶ．７ｍ８からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＢ、またはＡＡＶ．７ｍ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に対し高い配列相同性を備えたＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、及びＡＡＶ．ｈｕ３７のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上の同一性、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質キメラを含むカプシドを含む。
ｒＡＡＶ粒子
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子の集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらの２つ以上の組合せである。
提供される方法は、任意の単離された組換えＡＡＶ粒子の生成で使用するのに適している。そのため、ｒＡＡＶは、当技術分野で知られている任意の血清型、修飾物、もしくは派生物、またはこれらの任意の組合せ（例えば、２つ以上の血清型を含む（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、及びｒＡＡＶ９粒子のうちの２つ以上を含む）ｒＡＡＶ粒子の集団）とすることができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子、あるいはこれらの２つ以上の組合せである。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはこれらの派生物、修飾物、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一である、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が援用される）で説明されているように、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５のカプシドを含む。ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているように、アミノ酸挿入物：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号（これらの各々は、参照によりその全体が明細書に援用される）で説明されているように、ＡＡＶ．７ｍ８のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，５８５，９７１号で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶＰＨＰ．Ｂを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ ｒｈ．７４を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（これらの各々は、参照によりその全体が援用される）で説明されているように、ＡＡＶ２／５のカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えばＡＡＶ２ｔＹＦを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が援用される）で説明されているようなＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、第ＵＳ８，９２７，５１４号、第ＵＳ９，９２３，１２０号、及びＷＯ２０１６／０４９２３０で開示されている任意のＡＡＶカプシド、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６を含む（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）のいずれかで開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、以下で開示されているＡＡＶカプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列に対し、少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一であるカプシドタンパク質を有する：国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、配列番号２を参照）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、配列番号１２３及び８８を参照）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、配列番号２、８１、８５、及び９７を参照）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、配列番号１及び３～６を参照）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、配列番号５～３８を参照）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照）、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号（例えば、配列番号５～３８を参照）、ならびに第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、配列番号８０～２９４を参照）、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号（例えば、配列番号１、５～１０を参照）。
ＡＡＶベースウイルスベクターの核酸配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、以下で教示されている：米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、第ＵＳ９，２８４，３５７号、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第ＷＯ２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、ならびに米国特許出願公開第２０１５００２３９２４号。
提供される方法は、導入遺伝子をコードする組換えＡＡＶの生成で使用するのに適している。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は表２Ａ～２Ｃから選択される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）導入遺伝子をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトなまたは実質的にインタクトなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現させるための他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復と、（２）調節制御要素、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロンと、（３）抗体の軽鎖Ｆａｂ及び重鎖Ｆａｂ、または少なくとも重鎖または軽鎖Ｆａｂ、ならびに任意選択で重鎖Ｆｃ領域をコードする核酸配列とを含む、ベクターを含む。インタクトまたは実質的にインタクトなｍＡｂを発現させるためのさらに他の実施形態において、ｒＡＡＶゲノムは、以下の構成要素を含むベクターを含む：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ逆方向末端反復；（２）調節制御エレメント、例えば、ａ）プロモーター／エンハンサー、ｂ）ポリＡシグナル、及びｃ）任意選択でイントロン；ならびに（３）以下のものの重鎖Ｆａｂをコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ＊）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）；任意選択で、治療抗体のネイティブ形態と同じアイソタイプのＦｃポリペプチド、例えば、ＩｇＧアイソタイプアミノ酸配列ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ４、またはこれらの修飾Ｆｃ；ならびに以下のものの軽鎖をコードする核酸配列：抗ＶＥＧＦ（例えば、セバシズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、及びブロルシズマブ）、抗ＥｐｏＲ（例えば、ＬＫＡ－６５１）、抗ＡＬＫ１（例えば、アスクリンバクマブ）、抗Ｃ５（例えば、テシドルマブ及びエクリズマブ）、抗ＣＤ１０５もしくは抗ＥＮＧ（例えば、カロツキシマブ）、抗ＣＣ１Ｑ（例えば、ＡＮＸ－００７）、抗ＴＮＦα（例えば、アダリムマブ、インフリキシマブ、及びゴリムマブ）、抗ＲＧＭａ（例えば、エレザヌマブ）、抗ＴＴＲ（例えば、ＮＩ－３０１及びＰＲＸ－００４）、抗ＣＴＧＦ（例えば、パムレブルマブ）、抗ＩＬ６Ｒ（例えば、サトラリズマブ及びサリルマブ）、抗ＩＬ４Ｒ（例えば、デュピルマブ）、抗ＩＬ１７Ａ（例えば、イキセキズマブ及びセクキヌマブ）、抗ＩＬ－５（例えば、メポリズマブ）、抗ＩＬ１２／ＩＬ２３（例えば、ウステキヌマブ）、抗ＣＤ１９（例えば、イネビリズマブ）、抗ＩＴＧＦ７ ｍＡｂ（例えば、エトロリズマブ）、抗ＳＯＳＴ ｍＡｂ（例えば、ロモソズマブ）、抗ｐＫａｌ ｍＡｂ（例えば、ラナデルマブ）、抗ＩＴＧＡ４（例えば、ナタリズマブ）、抗ＩＴＧＡ４Ｂ７（例えば、ベドリズマブ）、抗ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ）、抗ＰＤ－１（例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デンソマブ）、抗ＰＣＳＫ９（例えば、アリロクマブ及びエボロクマブ）、抗ＡＮＧＰＴＬ３（例えば、エビナクマブ）、抗ＯｘＰＬ（例えば、Ｅ０６）、抗ｆＤ（例えば、ラムパリズマブ）、または抗ＭＭＰ９（例えば、アンデカリキシマブ）。このとき、重鎖（Ｆａｂ及び任意選択でＦｃ領域）ならびに軽鎖は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフリン（Ｆ）／Ｆ２Ａまたはフレキシブルリンカーによって分離され、重鎖及び軽鎖ポリペプチドが等しい量で発現するのを確実にする。
いくつかの実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、抗ＶＥＧＦ ＦａｂをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。より具体的な実施形態において、本明細書では、ラニビズマブをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＵＡをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＩＤＳをコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＬＤＬＲをコードするｒＡＡＶ８ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）タンパク質をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。具体的な実施形態において、本明細書では、ＴＰＰ１をコードするｒＡＡＶ９ベースウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ－１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。いくつかの実施形態において、本明細書では、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードするｒＡＡＶウイルスベクターが提供される。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶカプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの２つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質のキメラである。
ある特定の実施形態において、１本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）を使用することができる。ある特定の実施形態において、自己相補的ベクター、例えばｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６：１２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号、及び第７，４５６，６８３号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照）。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８のＡＡＶカプシド血清型を有する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９のＡＡＶカプシド血清型を有する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質またはＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ８カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の派生物、修飾物、またはシュードタイプであるカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列に対し少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％など、すなわち、最大１００％同一のＡＡＶ９カプシドタンパク質を有する、カプシドタンパク質を含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、モザイクカプシドを含む。モザイクＡＡＶ粒子は、ＡＡＶの異なる血清型からのウイルスカプシドタンパク質の混合物から構成される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ならびにＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される血清型のカプシドタンパク質を含むモザイクカプシドを含む。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ＡＡＶ ＩＴＲを含む核酸ベクター、ならびに（ｂ）ＡＡＶｘ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６）に由来するカプシドタンパク質から構成されたカプシドを含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質から構成されたシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質から構成されるシュードタイプｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、シュードタイプｒＡＡＶ８またはｒＡＡＶ９粒子は、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプ粒子である。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を生成し使用するための方法は当技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照）。
追加の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型のキメラであるカプシドタンパク質を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのＡＡＶカプシドタンパク質キメラを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ｒＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択されるＡＡＶ血清型からの１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質と、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．２０、及びＡＡＶｒｈ．７４から選択される１つ以上のＡＡＶカプシド血清型のカプシドタンパク質とのキメラである、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
ｒＡＡＶ粒子を単離するための方法
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を製造する方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、及び（ｂ）製剤を生成するために、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を製造する方法は、（ａ）不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、及び（ｂ）製剤を生成するために、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む。
いくつかの実施形態において、本開示はさらに、医薬単位薬用量の単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む製剤を生成するための方法であって、不純物を含むフィード（例えば、ｒＡＡＶ生成培養物）からｒＡＡＶ粒子を単離することと、単離されたｒＡＡＶ粒子を製剤化することとを含む、方法を提供する。
単離されたｒＡＡＶ粒子は、当技術分野で知られている方法を用いて単離することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、下流処理、例えば、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、無菌濾過、またはこれらの任意の組合せ（複数可）を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、遠心分離または深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び無菌濾過のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、無菌濾過、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、下流処理は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従うｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、細胞培養物の収集、（例えば、深層濾過による）収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法に従って生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法にしたがって生成されたｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、第１のタンジェンシャルフロー濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、第２のタンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、深層濾過による収集した細胞培養物の清澄化、第１の無菌濾過、アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、４級アミンリガンドを用いたモノリスアニオン交換クロマトグラフィーまたはＡＥＸクロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、及び第２の無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、遠心分離を含まない。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む。
当技術分野では、形質移入、安定細胞株生成、及び感染性ハイブリッドウイルス生成系（アデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド、及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む）を含むｒＡＡＶ粒子の生成のための多数の細胞培養に基づく系が知られている。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためのｒＡＡＶ生成培養物はいずれも、（１）好適な宿主細胞（例えば、ヒト由来細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、またはＨＥＫ２９３細胞及びその派生物（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞））、哺乳類細胞株（例えば、ベロ）、またはバキュロウイルス生成系の場合は昆虫由来細胞株（例えば、ＳＦ－９）を含む）；（２）野生型もしくは変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミドコンストラクトによって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；（３）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；（４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；ならびに（５）ｒＡＡＶ生成を支持するための好適な培地及び培地構成成分を必要とする。当技術分野で知られている好適な培地をｒＡＡＶベクターの生成に使用することができる。このような培地としては、限定されるものではないが、変法イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び米国特許第６，７２３，５５１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）で説明されているようなＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含めたＨｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＪＲＨが生産する培地が挙げられる。
ｒＡＡＶ生成培養物は、利用されている特定の宿主細胞に適した様々な条件下で（広い温度範囲にわたり、様々な長さの時間で、など）ルーチン的に成長させることができる。当技術分野で知られているように、ｒＡＡＶ生成培養物は、好適な付着依存性容器（例えば、ローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリア、及び充填床または流動床バイオリアクター）中で培養することができる付着依存性の培養物を含む。また、ｒＡＡＶベクター生成培養物は、浮遊適応性の宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞も含むことができ、これらは、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、及びＷａｖｅバッグシステムなどの使い捨てシステムを含めた様々な方法で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、高密度細胞培養物を含む。いくつかの実施形態において、培養物は、約１×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌから約３０×１０Ｅ＋０６細胞／ｍｌの間の総細胞密度を有する。いくつかの実施形態において、細胞の約５０％超が生細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、またはＳＦ－９細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、浮遊培養での成長に適応したＨＥＫ２９３細胞である。
提供される方法の追加の実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物は、ｒＡＡＶ粒子を含む浮遊培養物を含む。ｒＡＡＶ粒子を生成するための多数の浮遊培養物が当技術分野で知られており、これには例えば、米国特許第６，９９５，００６号、第９，７８３，８２６号、及び米国特許出願公開第２０１２０１２２１５５号（これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている培養物が含まれる。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、哺乳類細胞または昆虫細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３由来細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＥＢ６６細胞、ＢＳＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＬＬＣ－ＭＫ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＲＡＦ細胞、ＲＫ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、ＬＬＣＰＫ細胞、ＰＫ１５細胞、ＬＬＣ－ＲＫ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＮＳ－１細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＢＨＫ細胞、３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＲＫ細胞、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞、ニワトリ胚細胞、またはＳＦ－９細胞の培養物を含む。いくつかの実施形態において、浮遊培養物は、ＨＥＫ２９３細胞の培養物を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の生成のための方法は、ｒＡＡＶを生成可能な細胞を含む細胞培養物を準備することと、当該細胞培養物に、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの間の最終濃度までヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を添加することと、当該ｒＡＡＶ粒子の生成を可能にする条件下で当該細胞培養物を維持することとを包含する。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、短鎖脂肪酸またはその塩を含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤は、酪酸（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸（例えば、バルプロ酸ナトリウム）、プロピオン酸（例えば、プロピオン酸ナトリウム）、またはこれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０２０／０３３８４２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されているように生成される。
組換えＡＡＶ粒子は、インタクトな宿主細胞から培地中へのｒＡＡＶ粒子放出を引き起こすことが当技術分野で知られている条件下で細胞が培養されることを条件に、宿主細胞を含む生成培養物を収集することにより、または生成培養物から消費培地を収集することにより、ｒＡＡＶ生成培養物から収集することができる。また、組換えＡＡＶ粒子は、生成培養物の宿主細胞を溶解することによってｒＡＡＶ生成培養物から収集することもできる。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野で知られており、例えば、複数の凍結／解凍サイクル、超音波処理、マイクロ流動化、ならびに化学物質（例えば、界面活性剤及び／またはプロテアーゼ）による処理が挙げられる。
収集時に、ｒＡＡＶ生成培養物は、以下：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；ならびに（７）培地構成成分（例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリン、及び他の低分子量タンパク質を含む）のうちの１つ以上を含むことができる。ｒＡＡＶ生成培養物はさらに、生成物関連不純物、例えば、不活性なベクター形態、空のウイルスカプシド、凝集したウイルス粒子またはカプシド、ミスフォールドしたウイルスカプシド、分解されたウイルス粒子を含むことができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、宿主細胞デブリを除去するように清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、一連の深層フィルターによる濾過によって清澄化される。また、清澄化は、当技術分野で知られている他の様々な標準的技法により、例えば、遠心分離、または当技術分野で知られている０．２ｍｍ以上の細孔サイズの任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過により、達成することができる。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は、遠心分離によって清澄化される。いくつかの実施形態において、生成培養物収集物の清澄化は、遠心分離を含まない。
いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、濾過を用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化は、深層濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物の清澄化はさらに、深層濾過及び無菌濾過を含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、１つ以上の異なる濾過媒体を含むフィルタートレインを用いて清澄化される。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つ以上の深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、２つの深層濾過媒体及び１つの無菌濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、深層フィルター媒体は、多孔質深層フィルターである。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及び無菌グレード濾過媒体を含む。いくつかの実施形態において、フィルタートレインは、Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ（登録商標）２０ＭＳ、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｃ０ＨＣ、及びＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理される。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に塩を添加することを含む。いくつかの実施形態において、前処理は、収集した細胞培養物に化学凝集剤を添加することを含む。いくつかの実施形態において、収集した細胞培養物は、深層フィルターに接触させる前に前処理されない。
いくつかの実施形態において、生成培養物収集物は濾過によって清澄化され、これはＷＯ２０１９／２１２９２１（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ生成培養物収集物は、生成培養物中に存在する高分子量ＤＮＡを消化するようにヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））またはエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ由来のエンドヌクレアーゼ）で処理される。ヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ消化は、当技術分野で知られている標準的な条件下でルーチン的に実施することができる。例えば、ヌクレアーゼ消化は、周囲温度から３７℃までの範囲の温度の最終濃度１～２．５単位／ｍＬのベンゾナーゼ（登録商標）で、３０分～数時間の間実施される。
無菌濾過は、無菌グレードフィルター媒体を用いた濾過を包含する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）を含む。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．８μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、１．２μｍのプレフィルター及び０．２μｍの最終フィルター膜の親水性の不均一な二重層設計を有する。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２または０．２２μｍの細孔フィルターである。さらなる実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、０．２μｍの細孔フィルターである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ（商標）ＰＶＤＦ膜０．４５μｍ、またはＳａｒｔｏｇｕａｒｄ（登録商標）ＰＥＳ １．２μｍ＋０．２μｍの名目孔径の組合せである。いくつかの実施形態において、無菌グレード濾過媒体は、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２ ＸＬＧ ０．２μｍである。
いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、クロマトグラフィー媒体、例えば、アフィニティークロマトグラフィー媒体に適用される前に、タンジェンシャルフロー濾過（「ＴＦＦ」）を介して濃縮される。ＴＦＦ限外濾過を用いたウイルスの大規模用濃度は、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）で説明されている。清澄化フィードのＴＦＦ濃度により、技術的に管理可能な量の清澄化フィードをクロマトグラフィーにかけることが可能になり、また、長い再循環時間を必要とせずにカラムをより合理的にサイジングすることが可能になる。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２倍から少なくとも１０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも１０倍から少なくとも２０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、少なくとも２０倍から少なくとも５０倍の間で濃縮される。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、約２０倍に濃縮される。また、当業者は、透析濾過を介して清澄化されたフィードから小分子不純物（例えば、培地成分、血清アルブミン、または他の血清タンパク質を含む細胞培養不純物）を除去するためにＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、清澄化されたフィードは、小分子不純物を除去するために透析濾過に供される。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約３から約１０の間の透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態において、透析濾過は、約５透析濾過体積の緩衝液を使用することを含む。また、当業者は、精製処理における次のステップを実施する前に緩衝液の交換が望ましい場合における精製プロセスの任意のステップでＴＦＦが使用されてもよいことも認識するであろう。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される清澄化されたフィードからｒＡＡＶを単離するための方法は、緩衝液を交換するためのＴＦＦの使用を含む。
アフィニティークロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーを使用して、タンジェンシャルフロー濾過に供されて清澄化されたフィードからｒＡＡＶ粒子を単離する。好適なアフィニティークロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂が挙げられる。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティー樹脂である。いくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィー媒体は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティー樹脂である。
アニオン交換クロマトグラフィーを使用して、組成物からｒＡＡＶ粒子を単離することができる。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、最終濃縮及び研磨ステップとしてアフィニティークロマトグラフィーの後に使用される。好適なアニオン交換クロマトグラフィー媒体は当技術分野で知られており、限定されるものではないが、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＮ－荷電アミノもしくはイミノ樹脂、例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）５０ ＰＩ、または任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、３級もしくは４級アミン、または当技術分野で知られているＰＥＩベース樹脂が挙げられる（米国特許第６，９８９，２６４号；Ｂｒｕｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ６（５）：６７８－６８６（２００２）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：２０７９－２０９１（２０００））。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、４級アミンを含む。いくつかの実施形態において、アニオン交換媒体は、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー樹脂である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、グリシジルメタクリレート－エチレンジメタクリレートポリマーまたはスチレン－ジビニルベンゼンポリマーを含む。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＤＥＡＥ－１アドバンストコンポジットカラム（ジエチルアミノ）、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）、ＣＩＭ（登録商標）ＤＥＡＥ、及びＣＩＭ（登録商標）ＥＤＡディスク（エチレンジアミノ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡ－１アドバンストコンポジットカラム（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、モノリスアニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ（登録商標）ＱＡディスク（４級アミン）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＣＩＭ ＱＡ（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）である。いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィー媒体は、ＢＩＡ ＣＩＭ（登録商標）ＱＡ－８０（カラム体積８０ｍＬ）である。当業者は、ｒＡＡＶが樹脂との結合を保ちながら不純物（限定されるものではないが、上流精製ステップによって導入され得る不純物を含む）が除去されるように、好適なイオン強度の洗浄緩衝液が特定され得ることを理解することができる。
いくつかの実施形態において、アニオン交換クロマトグラフィーは、ＷＯ２０１９／２４１５３５（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示される方法に従って実施される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子を単離する方法は、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物中のベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比を定量することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）またはデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量される。いくつかの実施形態において、カプシド力価は、血清型特異的ＥＬＩＳＡによって定量される。いくつかの実施形態において、完全なカプシド：空のカプシドの比は、分析用超遠心分離（ＡＵＣ）または透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって定量される。
いくつかの実施形態において、ベクターゲノム力価、カプシド力価、及び／または完全なカプシド：空のカプシドの比は、分光測光法により、例えば、２６０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定することにより、定量される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性されない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物の吸光度を測定する前に変性される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、分光光度計を用いて定量される。いくつかの実施形態において、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度は、ＨＰＬＣを用いて定量される。いくつかの実施形態において、吸光度はピーク吸光度である。２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける組成物の吸光度を測定するためのいくつかの方法が、当技術分野で知られている。単離された組換えｒＡＡＶ粒子を含む組成物のベクターゲノム力価及びカプシド力価を定量する方法は、ＷＯ２０１９／２１２９２２（参照によりその全体が本明細書に援用される）で開示されている。
追加の実施形態において、本開示は、本明細書で開示される方法に従って生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達または接触に適した、生物学的に許容される製剤、気体、液体、もしくは固体、またはこれらの混合物を意味する。「医薬的に許容される」組成物は、生物学的または他の点で望ましくないものではない材料であり、例えば、この材料は、実質的な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。したがって、このような医薬組成物は、例えば、本開示の方法に従って単離されたｒＡＡＶを対象に投与する際に使用することができる。このような組成物としては、医薬投与またはｉｎ ｖｉｖｏでの接触または送達と適合性である、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば、水中油または油中水）、懸濁液、シロップ、エリキシル、分散及び懸濁媒体、コーティング、等張性及び吸収の促進剤または遅延剤が挙げられる。水性及び非水性の溶媒、溶液、及び懸濁液は、懸濁剤及び増粘剤を含むことができる。このような医薬的に許容される担体としては、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、粉末、顆粒、及び結晶が挙げられる。補足活性化合物（例えば、防腐剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、及び抗真菌剤）も、組成物に組み込むことができる。医薬組成物は、本明細書で記載のように、または当業者に知られているように、特定の投与経路または送達経路と適合性であるように製剤化することができる。したがって、医薬組成物には、様々な経路による投与に適した担体、希釈剤、または賦形剤が含まれる。本発明のｒＡＡＶ粒子ならびに方法及び使用に適切な医薬組成物及び送達系は、当技術分野で知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（１９９３），Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．；Ａｎｓｅｌ ａｎｄ Ｓｔｏｋｌｏｓａ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．；及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （１９８０），Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２５３－３１５を参照）。
いくつかの実施形態において、組成物は、医薬単位用量である。「単位用量」とは、治療される対象のための単位薬用量として適した物理的に別々の単位を意味する。各単位は、任意選択で医薬担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクル、または充填剤）と共に所定の量を含み、１回以上の用量で投与されたときに所望の効果（例えば、予防または治療効果）をもたらすように計算される。単位剤形は、例えば、アンプル及びバイアル内にあってもよく、これらは液体組成物、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥状態の組成物を含むことができ、例えば、無菌液体担体をｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に添加してもよい。個々の単位剤形は、多回用量キットまたは容器に含めることができる。組換えベクター（例えば、ＡＡＶ）配列、プラスミド、ベクターゲノム、及び組換えウイルス粒子、ならびにこれらの医薬組成物は、投与を容易にし、薬用量を均一にするために、単一または複数の単位用量形態でパッケージ化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型からのＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ８である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシド血清型は、ＡＡＶ９である。
実施例１：５００Ｌバイオリアクターでの単回用量一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ生産性は、５０Ｌ及び２００Ｌバイオリアクターを用いて得られた生産性の４８～６０％であった。
遺伝子治療分野における細胞培養からのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成は、単純な接着フラスコから複雑な接着システム、そして浮遊ベースの撹拌タンクバイオリアクタープロセスへと発展してきた。哺乳類細胞（例えば、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞）の一過性形質移入を含めた多くのＡＡＶ遺伝子治療生成系が存在する。しかし、最近の浮遊哺乳類バイオテクノロジープロセスで一般に使用されている装置のほとんどは、ＡＡＶの大規模一過性生成向けに特化して設計されているものではない。
遺伝子治療分野における細胞培養からのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成は、単純な接着フラスコから複雑な接着システム、そして浮遊ベースの撹拌タンクバイオリアクタープロセスへと発展してきた。哺乳類細胞（例えば、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞）の一過性形質移入を含めた多くのＡＡＶ遺伝子治療生成系が存在する。しかし、最近の浮遊哺乳類バイオテクノロジープロセスで一般に使用されている装置のほとんどは、ＡＡＶの大規模一過性生成向けに特化して設計されているものではない。
バイオリアクターの規模及び設計を比較すると、浮遊哺乳類細胞形質移入プロセスでＡＡＶを生成するという課題が拡大する。したがって、現状のＡＡＶ生成向けのバイオリアクター系を比較する必要がある。バイオリアクターの構成及び混合が形質移入及びＡＡＶ生成に及ぼす影響を比較した。５０Ｌ～５００Ｌのバイオリアクターをスケーラビリティ及びプロセス性能について最適化した。バイオリアクターの設定及び典型的なスケールアップ要因が細胞の成長、生存率、及び収集力価に及ぼす影響を、様々なスケールにおける複数タイプのバイオリアクターで比較した。
実質的に本明細書に記載のように、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞の一過性形質移入を介してＡＡＶ－Ａベクター（ＡＡＶ９カプシドを含む）を生成した。簡潔に述べると、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞を解凍し増やした。バイオリアクターに、浮遊適応性ＨＥＫ２９３細胞を約１．０～１．２×１０６生存細胞／ｍＬの密度で播種した。７２時間ＥＣＤ（経過培養期間）時に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、アデノウイルスヘルパー機能、ＡＡＶ－Ａ導入遺伝子、及びＡＡＶ９ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする３つのプラスミドとの混合物を細胞に形質移入した。形質移入は、１：１．７５のＤＮＡ：ＰＥＩ比を用いて実施した。２０Ｌ、２００Ｌ、及び５００Ｌバイオリアクターの形質移入複合体調製プロセスフロー図を図１～３に示す。インラインミキサーを用いてＤＮＡ及びＰＥＩを混合した。添加した形質移入複合体の体積は、細胞培養物の体積のおよそ１０％であった。培養物の上清を、１４４～１９２時間のＥＣＤ時（例えば、形質移入から３～５日後）に収集した。得られたＡＡＶ－Ａ収率を図４に示す。相対力価は、当技術分野で通例のように定量した。
複数のベンダーのバイオリアクター（ベンダーＡまたはＢ）における最大５００Ｌスケールの第一世代プロセスからは、生成開始まで（例えば、一過性形質移入ステップまで）の細胞成長パラメーターが直線的であることが示された（データは示さず）。このことから、Ｐ／Ｖ及びＴｉｐ Ｓｐｅｅｄが細胞成長にとって最適なスケーリングパラメーターであることが示された。生成段階の間、細胞の成長及び生存率は、５０Ｌ及び２００Ｌのバイオリアクターにおいて同様の傾向をたどった。５００Ｌの収集ＶＣＤ及び生存率は、実際には５０Ｌ及び２００Ｌよりも高かった。これは、形質移入効率が低いことを示している。２つの異なるベンダーの手によって試験した複数のバイオリアクターで細胞成長及び生存率が同様であったことを考慮すると、ＡＡＶ－Ａについての５００Ｌバイオリアクターの生産性が、過去４回の生成ランの平均に基づいて４８～６０％にとどまったことは驚くべきことであった。これに対し、５０Ｌ及び２００Ｌバイオリアクターの生産性は平均に適合していた。図４。
実施例２：複合体化時間がＡＡＶの生産性に影響を及ぼす
ＤＮＡ及びＰＥＩの複合体化時間が、形成される複合体のサイズに影響を及ぼすことが報告されているが、これは、ひいては形質移入効率に影響を及ぼし得る。図５に示すように、複合体化時間を長くすると、より大きなＤＮＡ：ＰＥＩ複合体が形成された。既知の方法を用いて動的光散乱法を用いて複合体サイズを測定した。
ＤＮＡ及びＰＥＩの複合体化時間が、形成される複合体のサイズに影響を及ぼすことが報告されているが、これは、ひいては形質移入効率に影響を及ぼし得る。図５に示すように、複合体化時間を長くすると、より大きなＤＮＡ：ＰＥＩ複合体が形成された。既知の方法を用いて動的光散乱法を用いて複合体サイズを測定した。
図６の実験概略を用いて、複合体化時間の増加がＡＡＶ－Ａ生産性に及ぼす影響を試験した。簡潔に述べると、ＰＥＩと、アデノウイルスヘルパー機能、ＡＡＶ－Ａトランスジーン、ＡＡＶ９ Ｃａｐ／Ｒｅｐをコードする（３）プラスミドとの４２Ｌ形質移入複合体を、インラインミキサーを介してＤＮＡ及びＰＥＩを共に混合することによって調製した。混合したら、形質移入複合体をインキュベートさせた。次いで、所定の時点（複合体インキュベートの開始から１０、２０、４０、６０分後）に固定された体積の形質移入複合体を取り出し、バイオリアクター及び振とうフラスコの形質移入に使用した。
図７に示すように、複合体化時間が増加すると、ＡＡＶの生産性が低下した。この実験の結果は、形質移入から４日後及び５日後のＧＣ力価が、形質移入複合体時間の増加に伴って着実に減少したことを示している。
実施例３：単回用量及び分割一過性形質移入に基づくプロセスは、ＡＡＶの生産性が同等であった。
特定の理論に束縛されるものではないが、５００Ｌバイオリアクターを用いて実施例１で観察されたＡＡＶ－Ａの低い生産性の説明としては、狭い（３０分）操作ウインドウの間に混合、複合体化、及び必要な体積の形質移入複合体（５００Ｌバイオリアクターの場合４２Ｌ）を追加することに関する制約が原因と考えられる。実施例２で示しているように、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体のサイズは時間と共に増加し、最適なサイズを上回るＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を使用すると、ＡＡＶ－Ａの生産性が低下する。約３０分という狭い操作ウインドウと大きな体積の形質移入複合体（４２Ｌ）との組合せは、この大きな体積の形質移入複合体のインキュベート及びポンピング時間が潜在的に不十分だったという事実ゆえに低い収率（予想の５０～６０％）につながったものと仮定された。
特定の理論に束縛されるものではないが、５００Ｌバイオリアクターを用いて実施例１で観察されたＡＡＶ－Ａの低い生産性の説明としては、狭い（３０分）操作ウインドウの間に混合、複合体化、及び必要な体積の形質移入複合体（５００Ｌバイオリアクターの場合４２Ｌ）を追加することに関する制約が原因と考えられる。実施例２で示しているように、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体のサイズは時間と共に増加し、最適なサイズを上回るＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を使用すると、ＡＡＶ－Ａの生産性が低下する。約３０分という狭い操作ウインドウと大きな体積の形質移入複合体（４２Ｌ）との組合せは、この大きな体積の形質移入複合体のインキュベート及びポンピング時間が潜在的に不十分だったという事実ゆえに低い収率（予想の５０～６０％）につながったものと仮定された。
分割一過性形質移入に基づくプロセスを試験して、単一の大きな体積の代わりに、より小さな体積の形質移入複合体を混合し、複合体化し、細胞培養物に添加するという、形質移入プロセスの２つ以上のステップへの分割を使用して、形質移入複合体体積及び狭い操作ウインドウに関する制約を解消することができるかどうかを判定した。２００Ｌバイオリアクタープロセスを使用して、単回用量及び分割一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ－Ｂ（ＡＡＶ８カプシドを含む）の生産性を定量した。単回用量一過性形質移入に基づくプロセスは、実質的に実施例１に記載のように実施した。分割形質移入に基づくプロセスにおける形質移入複合体調製プロセスフロー図を図８に示す。添加した形質移入複合体の総体積は、単回用量及び分割形質移入プロセスで実質的に同一（約１６Ｌ）であった。単回用量プロセスが、１つのステップで総体積の混合、複合体化、及び添加を伴うのに対し、分割形質移入プロセスは、約８Ｌの体積の形質移入複合体に対し２つの別々の混合、複合体化、及び添加のステップを使用し、第２の添加ステップは、第１の添加ステップを完了してから１５～３０分後に開始した。１６８時間ＥＣＤのＥＣＤ、すなわち形質移入から４日後に培養上清を収集した。得られたＡＡＶ－Ｂ収量を図９に示す。分割一過性形質移入プロセスでは、単回用量の形質移入複合体を用いたランと同様の力価が得られた。これは、大型（例えば、２００Ｌ以上）のバイオリアクターの場合の形質移入複合体体積の調製及び添加における狭い操作ウインドウ（３０分）に対処するため、重要な知見であった。形質移入複合体を小さい用量に分割することで、各用量について３０分の操作ウインドウ内でよりロバストな複合体インキュベート時間及びポンプ流量を使用することが可能になる。
実施例４：分割形質移入複合体用量は、ＡＡＶの生産性を著しく損なわずに数時間の間隔で添加することができる。
ＡＡＶ－Ｂを用いた２Ｌベンチスケール実験を実施して、分割一過性形質移入プロセスのロバストネスを試験した。目的は、分割形質移入複合体の添加の間隔をどの程度空け、同等のＧＣ力価を依然として得ることができるかを確認することであった。形質移入複合体の分割添加の間隔を１５分から６時間まで変化させた。細胞の成長及び生存率の傾向は、試験した諸条件で同様であった（データは示さず）。グルコースの傾向も条件間で同様であった（データは示さず）。Ｌ－グルタミン及びＮＨ４＋の傾向は、試験した全条件で１４４時間のＥＣＤまで同様であった。この時点以降、形質移入複合体の分割添加の間に１５分空けたバイオリアクターは、より多くのＬ－グルタミンを消費し、より多くのＮＨ４＋を生成した。この差は生成に悪影響を及ぼさなかった。というのは、これらのバイオリアクターが、形質移入複合体の分割添加の間に４時間及び６時間おいたバイオリアクターと同等か、場合によってはより高いＧＣ力価を示したためである。図１０。わずかにより大きなＧＣ力価のばらつきが見られたものの、形質移入複合体の分割添加は、バイオリアクターに最大６時間間隔で添加し、依然として予測範囲の８０～９０％以内の力価をもたらすことができる。
ＡＡＶ－Ｂを用いた２Ｌベンチスケール実験を実施して、分割一過性形質移入プロセスのロバストネスを試験した。目的は、分割形質移入複合体の添加の間隔をどの程度空け、同等のＧＣ力価を依然として得ることができるかを確認することであった。形質移入複合体の分割添加の間隔を１５分から６時間まで変化させた。細胞の成長及び生存率の傾向は、試験した諸条件で同様であった（データは示さず）。グルコースの傾向も条件間で同様であった（データは示さず）。Ｌ－グルタミン及びＮＨ４＋の傾向は、試験した全条件で１４４時間のＥＣＤまで同様であった。この時点以降、形質移入複合体の分割添加の間に１５分空けたバイオリアクターは、より多くのＬ－グルタミンを消費し、より多くのＮＨ４＋を生成した。この差は生成に悪影響を及ぼさなかった。というのは、これらのバイオリアクターが、形質移入複合体の分割添加の間に４時間及び６時間おいたバイオリアクターと同等か、場合によってはより高いＧＣ力価を示したためである。図１０。わずかにより大きなＧＣ力価のばらつきが見られたものの、形質移入複合体の分割添加は、バイオリアクターに最大６時間間隔で添加し、依然として予測範囲の８０～９０％以内の力価をもたらすことができる。
実施例５：５００Ｌバイオリアクターでの分割一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ－Ｂ生産性は、５０Ｌ及び２００Ｌバイオリアクターを用いて得られた生産性と同様である。
浮遊適応性ＨＥＫ２９３クローンを用いて、５００Ｌのバイオリアクターにおける分割一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ－Ｂ生産性を試験した。分割形質移入に基づくプロセスにおける形質移入複合体調製プロセスのフロー図を図１１に示す。約２１Ｌの形質移入複合体の２回用量を、添加間で１５～３０分おいて培養物に添加した。１６８時間のＥＣＤ、すなわち形質移入から４日後に培養上清を収集した。生成されたＡＡＶ－Ｂの相対力価を図１２に示す。５００Ｌバイオリアクターの生産性は、「過去の平均値」にも、２００Ｌ及び５０Ｌバイオリアクターで単回用量形質移入プロセスを用いて得られた生産性にも類似していた。
浮遊適応性ＨＥＫ２９３クローンを用いて、５００Ｌのバイオリアクターにおける分割一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ－Ｂ生産性を試験した。分割形質移入に基づくプロセスにおける形質移入複合体調製プロセスのフロー図を図１１に示す。約２１Ｌの形質移入複合体の２回用量を、添加間で１５～３０分おいて培養物に添加した。１６８時間のＥＣＤ、すなわち形質移入から４日後に培養上清を収集した。生成されたＡＡＶ－Ｂの相対力価を図１２に示す。５００Ｌバイオリアクターの生産性は、「過去の平均値」にも、２００Ｌ及び５０Ｌバイオリアクターで単回用量形質移入プロセスを用いて得られた生産性にも類似していた。
実施例６：２，０００Ｌプロセスの２００Ｌスケールダウンにおける分割一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ－Ｂの生産性。
２，０００Ｌ分割一過性形質移入に基づくプロセスの２００ＬスケールダウンにおけるＡＡＶ－Ｂ生産性を２００Ｌバイオリアクターで試験した。シードトレイン培養基に抗凝集剤を含めた。約４Ｌの形質移入複合体４回用量を、添加間で約１５分おいて培養物に添加した。プロセスフロー図を図１３に示す。１６８時間のＥＣＤ、すなわち形質移入から４日後に培養上清を収集した。上清の力価は約６．２５Ｅ＋１０であった。溶解力価は約１．１５Ｅ＋１１であった。
２，０００Ｌ分割一過性形質移入に基づくプロセスの２００ＬスケールダウンにおけるＡＡＶ－Ｂ生産性を２００Ｌバイオリアクターで試験した。シードトレイン培養基に抗凝集剤を含めた。約４Ｌの形質移入複合体４回用量を、添加間で約１５分おいて培養物に添加した。プロセスフロー図を図１３に示す。１６８時間のＥＣＤ、すなわち形質移入から４日後に培養上清を収集した。上清の力価は約６．２５Ｅ＋１０であった。溶解力価は約１．１５Ｅ＋１１であった。
実施例７：２，０００Ｌ分割一過性形質移入に基づくプロセスのＡＡＶ生産性。
いくつかの実施形態において、２，０００Ｌ分割一過性形質移入に基づくプロセスは、４×約４２Ｌ形質移入複合体を、約１６００Ｌの細胞培養物（例えば、ＨＥＫ細胞培養物）を含む２，０００Ｌバイオリアクターに移すことを含む。いくつかの実施形態において、培養物は抗凝集剤を含む。いくつかの実施形態において、形質移入複合体は、インラインミキサーを用いて、希釈された１つ以上のポリヌクレオチド及び希釈された少なくとも１つの形質移入試薬を混合することによって生成され、混合することは、希釈された１つ以上のポリヌクレオチド及び希釈された少なくとも１つの形質移入試薬を２つの別々の容器から新しい容器に約８リットル／分の速度で移すことを含む。いくつかの実施形態において、形質移入複合体は、バイオリアクターに移す前に１０～２０分間（例えば、１０～１５分間）保持される。いくつかの実施形態において、形質移入複合体は、約５Ｌ／分の速度でバイオリアクターに移される。いくつかの実施形態において、形質移入複合体の各バッチは、３０分以下でバイオリアクターに移される。いくつかの実施形態において、１つのバッチの形質移入複合体を移すことを終了してから次のバッチの形質移入複合体を移すことを開始するまでに、１０～２０分（例えば、約１５分）のギャップがあると考えられる。
いくつかの実施形態において、２，０００Ｌ分割一過性形質移入に基づくプロセスは、４×約４２Ｌ形質移入複合体を、約１６００Ｌの細胞培養物（例えば、ＨＥＫ細胞培養物）を含む２，０００Ｌバイオリアクターに移すことを含む。いくつかの実施形態において、培養物は抗凝集剤を含む。いくつかの実施形態において、形質移入複合体は、インラインミキサーを用いて、希釈された１つ以上のポリヌクレオチド及び希釈された少なくとも１つの形質移入試薬を混合することによって生成され、混合することは、希釈された１つ以上のポリヌクレオチド及び希釈された少なくとも１つの形質移入試薬を２つの別々の容器から新しい容器に約８リットル／分の速度で移すことを含む。いくつかの実施形態において、形質移入複合体は、バイオリアクターに移す前に１０～２０分間（例えば、１０～１５分間）保持される。いくつかの実施形態において、形質移入複合体は、約５Ｌ／分の速度でバイオリアクターに移される。いくつかの実施形態において、形質移入複合体の各バッチは、３０分以下でバイオリアクターに移される。いくつかの実施形態において、１つのバッチの形質移入複合体を移すことを終了してから次のバッチの形質移入複合体を移すことを開始するまでに、１０～２０分（例えば、約１５分）のギャップがあると考えられる。
本開示の方法は、現在最も実用的で好ましい実施形態であると考えられるものと共に説明してきたが、本開示に包含される方法は、開示された実施形態に限定されるべきではなく、逆に、添付の請求項の趣旨及び範囲に含まれる様々な変更及び同等のアレンジを網羅するように意図されていることを理解されたい。
本明細書で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、及びアクセッション番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の両方を含む）は、各々の個別の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が、具体的かつ個別に参照によって援用されるのと同程度に、あらゆる目的において、参照によりこれらの全体が本明細書に援用される。
Claims (58)
- 組換えウイルス粒子を生成する方法であって、
ａ）前記組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｄ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、
（ｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約６０分未満で完了し、
（ｉｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、約６時間以下の期間にわたって実施され、かつ
（ｉｖ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される、
前記方法。 - ステップｃ）がもう１回繰り返される、請求項１に記載の方法。
- ステップｃ）が１回以上繰り返される、請求項１に記載の方法。
- ステップｃ）が、１、２、３、４、５、６、７、または８回繰り返される、請求項１に記載の方法。
- 前記浮遊培養物に移された前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積が、ステップａ）の前記浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約６０分以内に開始される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 組換えウイルス粒子の生成を増加させる方法であって、
ａ）前記組換えウイルス粒子を生成可能な細胞の集団を含む、約２００リットルから約２０，０００リットルの間の浮遊細胞培養物を準備することと、
ｂ）第１の混合物を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｃ）第２の混合物を形成するために、前記１つ以上のポリヌクレオチドを前記少なくとも１つの形質移入試薬と混和し、ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を形成するために、前記混合物をインキュベートし、前記細胞に形質移入するために、前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を前記浮遊培養物に移すことと、
ｄ）前記形質移入された細胞を含む前記細胞培養物を、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持することと
を含み、
（ｉ）前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記組換えウイルス粒子の生成に必要な遺伝子を含み、
（ｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約６０分未満で完了し、
（ｉｉｉ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、約６時間以下の期間にわたって実施され、かつ
（ｉｖ）ステップｂ）及びステップｃ）の前記移すことが、同時または任意の順序で連続的に実施される、
前記方法。 - ステップｃ）がもう１回繰り返される、請求項８に記載の方法。
- ステップｃ）が１回以上繰り返される、請求項８に記載の方法。
- ステップｃ）が、１、２、３、４、５、６、７、または８回繰り返される、請求項８に記載の方法。
- 前記浮遊培養物に移された前記ポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体の合わせた体積が、ステップａ）の前記浮遊細胞培養物の体積の約５％から約２０％の間である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約５分から約６０分の間に開始される、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｃ）の前記移すことが、ステップｂ）の前記移すことを完了してから約６０分以内に開始される、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のポリヌクレオチドを少なくとも１つの形質移入試薬と混和することが、インラインミキサーによって実施される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約３０分未満で完了する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｂ）及びステップｃ）の前記混和すること、前記インキュベートすること、及び前記移すことが、各々約３５分未満で完了する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｂ）及びステップｃ）の前記インキュベートすることが各々約１０～約２０分間である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｂ）及びステップｃ）の前記インキュベートすることが各々約１０～約１５分間である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの形質移入試薬が安定なカチオン性ポリマーを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの形質移入試薬がＰＥＩを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２００リットルから約５，０００リットルの間の体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２００リットルから約２，０００リットルの間の体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２００リットルから約１，０００リットルの間の体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２００リットルから約５００リットルの間の体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２００リットル、約３００リットル、約４００リットル、約５００リットル、約７５０リットル、約１，０００リットル、約２，０００リットル、約３，０００リットル、または約５，０００リットルの体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約５００リットルの体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約１，０００リットルの体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２，０００リットルの体積を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、哺乳類細胞または昆虫細胞の集団を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、哺乳類細胞の集団を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ由来細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ由来細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ－９細胞、ＢＨＫ細胞、ベロ細胞、及び／またはＰｅｒＣ６細胞の集団を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、ＨＥＫ２９３細胞の集団を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- ステップａ）で準備される前記浮遊細胞培養物が、約２×１０Ｅ＋６から約１０Ｅ＋７個の間の生存細胞／ｍｌを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２日から約１０日の間、約３日から約５日の間、または約５日から１４日の間、前記組換えウイルス粒子の生成を可能にする条件下で維持される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、または約７日間維持される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が少なくとも約３日間維持される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が約３日間維持される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が約４日間維持される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換えウイルス粒子が、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子または組換えレンチウイルス粒子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換えウイルス粒子がｒＡＡＶ粒子である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、またはＡＡＶ．ｈｕ３７血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９血清型のカプシドタンパク質を含む、請求項４１に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子が、導入遺伝子を含むゲノムを含む、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作用可能に接続した調節エレメントを含む、請求項４５に記載の方法。
- 前記調節エレメントが、エンハンサー、プロモーター、及びポリＡ領域のうちの１つ以上を含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記調節エレメント、及びポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、異種である、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、Ｆｃ融合ポリペプチド、イムノアドヘシン、免疫グロブリン、操作タンパク質、タンパク質フラグメント、または酵素をコードする、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、抗ＶＥＧＦ Ｆａｂ、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、イズロン酸２－スルファターゼ（ＩＤＳ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、トリペプチジルペプチダーゼ１（ＴＰＰ１）、またはＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｌｔ－１）の非膜結合型スプライスバリアントをコードする、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、ガンマ－サルコグリカン、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１／ＣＨＭ）、レチノイドイソメロヒドロラーゼ（ＲＰＥ６５）、環状ヌクレオチドゲートチャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）、環状ヌクレオチドゲートチャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、リソソーム関連膜タンパク質２アイソフォームＢ（ＬＡＭＰ２Ｂ）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子（ＲＰＧＲ）、レチノスキシン（ＲＳ１）、筋小胞体カルシウムＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、アフリベルセプト、バッテニン（ＣＬＮ３）、膜貫通ＥＲタンパク質（ＣＬＮ６）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオチューブラリン１（ＭＴＭ１）、フォリスタチン（ＦＳＴ）、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、アリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ホスホジエステラーゼ６Ｂ（ＰＤＥ６Ｂ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ９ＯＴＣ）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ１）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ２）、ニュールツリン（ＮＲＴＮ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３／ＮＴＦ３）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ミトコンドリアコードＮＡＤＨ：ユビキノンオキシドレダクターゼコアサブユニット４（ＭＴ－ＮＤ４）、保護タンパク質カテプシンＡ（ＰＰＣＡ）、ジスフェリン、ＭＥＲがん原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、または腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）－免疫グロブリン（ＩｇＧ１）Ｆｃ融合体をコードする、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上のポリヌクレオチドが、
ａ）パッケージング対象のｒＡＡＶゲノム、
ｂ）パッケージングするのに必要なアデノウイルスヘルパー機能、
ｃ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐタンパク質、及び
ｄ）パッケージングするのに十分なＡＡＶ ｃａｐタンパク質
をコードする、請求項４１～５１のいずれか１項に記載の方法。 - 前記１つ以上のポリヌクレオチドが、前記ｒＡＡＶゲノムをコードするポリヌクレオチドと、前記ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質及び前記ＡＡＶ ｃａｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記アデノウイルスヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドとを含む、請求項５２に記載の方法。
- 前記アデノウイルスヘルパー機能が、アデノウイルスＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、及びＶＡ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項５２または５３に記載の方法。
- 前記ｒＡＡＶ粒子を回収することをさらに含む、請求項４１～５４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、約５×１０ｅ＋１０ＧＣ／ｍｌから約１×１０ｅ＋１２ＧＣ／ｍｌの間のｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項４１～５５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、同じ体積のポリヌクレオチド：形質移入試薬複合体を混和し、インキュベートし、移す単一ステップを含む参照方法の少なくとも約２倍多く、ＧＣ／ｍｌとして測定されるｒＡＡＶ粒子を生成する、請求項４１～５６のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項４１～５７のいずれか１項に記載の方法によって生成された、単離されたｒＡＡＶ粒子
を含む、組成物。
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