KR20230120128A - 재조합 바이러스 입자의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 개선된 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 재조합 바이러스 입자를 생산하는 방법은 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계, 제1 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물에 전달하여 세포를 형질주입하는 단계 및 제2 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물에 전달하는 단계를 포함하며, 제1 부피 및 제2 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속해서 수행된다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 AAV(rAAV) 입자이다.
Description
본 발명은 배양에서 세포를 형질주입하는 것을 포함하는 대규모 현탁 세포 배양물에서 재조합 바이러스 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 12월 16일에 출원된 미국 출원 제63/126,405호의 혜택을 청구하고, 이를 그 전체로 참조하여 본 명세서에 기재한 것으로 본다.
재조합 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 기반 벡터는 현재 개발 중인 가장 널리 사용되는 유전자 치료 제품이다. rAAV 벡터 시스템의 바람직한 사용은 부분적으로 야생형 바이러스와 연관된 질환의 결여, 분열하지 않는 세포뿐만 아니라 분열하는 세포에 형질주입하는 AAV의 능력 및 임상 시험에서 관찰되고 유전자 치료 적응증에서 전달에 대해 큰 가능성을 나타내는 결과적인 장기간의 강력한 트랜스진(transgene) 발현으로 인한 것이다. 또한, 상이한 자연 발생 및 재조합 rAAV 벡터 혈청형(serotype)은 특히 상이한 조직, 기관 및 세포를 특이적으로 표적으로 하고 벡터에 대한 임의의 기존 면역을 회피하는 데 도움을 주어 AAV-기반 유전자 치료의 치료 적용을 확장한다. 예를 들어 복제 결함 바이러스 이전에 AAV-기반 유전자 치료는 후기 임상 단계 및 상업적 사용을 위해 더 광범위하게 채택될 수 있으므로 재조합 바이러스 입자의 대규모 생산을 위한 새로운 방법을 개발해야 한다.
따라서, rAAV 입자의 대규모 생산을 위한 방법의 생산성과 수율을 개선할 필요성이 당업계에 존재한다.
일 양태에서, 본 개시내용은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 게놈을 분리하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 rAAV 입자를 포함하는 조성물이 크기 배제 크로마토그래피에 적용되기 전에 rAAV 입자가 변성되는 조건에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 크기 배제 크로마토그래피를 위한 이동상(mobile phase)은 염, 유기 용매 또는 세제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이동상은 완충제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, A AV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HS C1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
추가 양태에서, 본 개시내용은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 특성화하는 방법을 제공한다. 단리된 rAAV 입자의 특성화는 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 벡터 게놈 크기 순도 결정, 캡시드 내부 벡터 게놈의 폴딩 또는 2차 구조 평가 및 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 벡터 게놈 역가(Vg) 결정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 크기 배제 크로마토그래피를 위한 이동상은 염, 유기 용매 또는 세제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이동상은 완충제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, A AV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 배치 방출, 예를 들어 배치 방출 시험 및/또는 로트(lot) 방출 시험에 적합하다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 로트 방출 시험의 일부로서 수행된다.
일부 실시형태에서, 본 개시는 다음을 제공한다.
[1.] 하기를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 생산 방법:
a) 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계,
상기 방법에서,
(i) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고;
(ii) b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료되고;
(iii) b) 단계 및 c) 단계의 전달은 약 6시간 이하의 기간에 걸쳐 수행되고; 및
(iv)
b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다.
[2.]
[1]에서, c) 단계를 1회 더 반복하는 것인 방법.
[3.]
[1]에서, c) 단계를 1회 이상 더 반복하는 것인 방법.
[4.]
[1]에서, c) 단계를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 반복하는 것인 방법.
[5.]
[1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 현탁 세포 배양물로 전달되는 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 5% 내지 약 20%인 것인 방법.
[6.]
[1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분 사이에 시작되는 것인 방법.
[7.]
[1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작되는 것인 방법.
[8.] 하기를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법
;
a) 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계,
상기 방법에서,
(i) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고;
(ii)
b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료되고;
(iii) b) 단계 및 c) 단계의 전달은 약 6시간 이하의 기간에 걸쳐 수행되고; 및
(iv)
b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다.
[9.]
[8]에서, c) 단계를 1회 더 반복하는 것인 방법.
[10.] [8]에서, c) 단계를 1회 이상 더 반복하는 것인 방법.
[11.] [8]에서, c) 단계를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 반복하는 것인 방법.
[12.] [8] 내지 [11] 중 어느 하나에서, 현탁 세포 배양물로 전달되는 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 5% 내지 약 20%인 것인 방법.
[13.] [8] 내지 [12] 중 어느 하나에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분 사이에 시작되는 것인 방법.
[14.] [8] 내지 [13] 중 어느 하나에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작되는 것인 방법.
[15.] [1] 내지 [14] 중 어느 하나에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 하나의 형질주입 시약을 혼합하는 단계는 인라인 믹서(inline mixer)에 의해 수행되는 것인 방법.
[16.] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료되는 것인 방법.
[17.] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료되는 것인 방법.
[18.] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 각각 약 10 내지 약 20분 동안 수행되는 것인 방법.
[19.] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 각각 약 10 내지 약 15분 동안 수행되는 것인 방법.
[20.] [1] 내지 [19] 중 어느 하나에서, 적어도 하나의 형질주입 시약은 안정한 양이온성 고분자(cationic polymer)를 포함하는 것인 방법.
[21.] [1] 내지 [20] 중 어느 하나에서, 적어도 하나의 형질주입 시약은 PEI를 포함하는 것인 방법.
[22.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 5,000 리터인 것인 방법.
[23.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 2,000 리터인 것인 방법.
[24.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 1,000 리터인 것인 방법.
[25.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 500 리터인 것인 방법.
[26.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터, 약 300 리터, 약 400 리터, 약 500 리터, 약 750 리터, 약 1,000 리터, 약 2,000 리터, 약 3,000 리터 또는 약 5,000 리터인 것인 방법.
[27.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터인 것인 방법.
[28.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 1,000 리터인 것인 방법.
[29.] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터인 것인 방법.
[30.] [1] 내지 [29] 중 어느 하나에서, 세포 집단은 포유동물 세포 또는 곤충 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
[31.] [1] 내지 [29] 중 어느 하나에서, 세포 집단은 포유동물 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
[32.] [1] 내지 [29] 중 어느 하나에서, 세포 집단은 HEK293 세포, HEK 유래 세포, CHO 세포, CHO 유래 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 및/또는 PerC6 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
[33.] [1] 내지 [29] 중 어느 하나에서, 세포 집단은 HEK293 세포 집단을 포함하는 것인 방법.
[34.] [1] 내지 [33] 중 어느 하나에서, a) 단계에서 제공되는 현탁 세포 배양물은 약 2x10E+6 내지 약 10E+7 생존 세포/ml를 포함하는 것인 방법.
[35.] [1] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 약 2일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 5일 또는 약 5일 내지 약 14일 동안 재조합 바이러스 입자의 생산을 가능하게 하는 조건에서 유지되는 것인 방법.
[36.] [1] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는 것인 방법.
[37.] [1] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 적어도 약 3일 동안 유지되는 것인 방법.
[38.] [1] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 약 3일 동안 유지되는 것인 방법.
[39.] [1] 내지 [34] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 약 4일 동안 유지되는 것인 방법.
[40.] [1] 내지 [39] 중 어느 하나에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자 또는 재조합 렌티바이러스 입자인 것인 방법.
[41.] [1] 내지 [39] 중 어느 하나에서, 재조합 바이러스 입자는 rAAV 입자인 것인 방법.
[42.] [41]에서, rAAV 입자는 AAV1, A AV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인 방법.
[43.] [41]에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 또는 AAV.hu37 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인 방법.
[44.] [41]에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인 방법.
[45.] [41] 내지 [44] 중 어느 하나에서, rAAV 입자는 트랜스진을 포함하는 게놈을 포함하는 것인 방법.
[46.] [45]에서, 트랜스진은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 것인 방법.
[47.] [46]에서, 조절 요소는 인핸서, 프로모터 및 polyA 영역 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
[48.] [45] 또는 [46]에서, 조절 요소 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이종(heterologous)인 것인 방법.
[49.] [45] 내지 [48] 중 어느 하나에서, 트랜스진은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 융합 단백질, Fc-융합 폴리펩타이드, 면역어드헤신(immunoadhesin), 면역글로불린, 조작 단백질, 단백질 단편 또는 효소를 암호화하는 것인 방법.
[50.] [45] 내지 [48] 중 어느 하나에서, 트랜스진은 항-VEGF Fab, 이두로니다제(IDUA), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR), 트리펩티딜 펩티다제 1(TPP1) 또는 VEGF 수용체 1의 비-막 연관 스플라이스 변이체(sFlt-1)를 암호화하는 것인 방법.
[51.] [45] 내지 [48] 중 어느 하나에서, 트랜스진은 감마-사르코글리칸, Rab Escort Protein 1(REP1/CHM), 레티노이드 이소메로하이드롤라제(RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC), 리소좀 관련 막 단백질 2 이소형 B(LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제(RPGR), 레티노스키신(RS1), 근소포체 칼슘(sarcoplasmic reticulum calcium) ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주 유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(AQP1), 디스트로핀, 마이크로디스트로핀, 미오투불라린 1(MTM1), 폴리스타틴(FST), 글루코스-6-포스파타제(G6Pase), 아포지단백 A2(APOA2), 우리딘 이인산 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1), 아릴설파타제 B(ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다아제(NAGLU), 알파-글루코시다아제(GAA), 알파-갈락토시다아제(GLA), 베타-갈락토시다아제(GLB1), 지질단백질 리파아제(LPL), 알파 1-항트립신(AAT), 포스포디에스테라아제 6B(PDE6B), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 9OTC), 생존 운동 뉴런(SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(NRTN), 뉴로트로핀-3(NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD), 신경 성장 인자( NGF), 미토콘드리아로 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자, 타이로신 키나아제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체를 암호화하는 것인 방법.
[52.] [41] 내지 [51] 중 어느 하나에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 암호화하는 것인 방법.
a) 패키징할 rAAV 게놈,
b) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
c) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및
d) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질.
[53.] [52]에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 rAAV 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, AAV rep 단백질 및 AAV cap 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 방법.
[54.] [52] 또는 [53]에서, 아데노바이러스 헬퍼 기능은 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
[55.] [41] 내지 [54] 중 어느 하나에서, rAAV 입자를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
[56.] [41] 내지 [55] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 약 5x10e+10 GC/ml 내지 약 1x10e+12 GC/ml rAAV 입자를 생산하는 것인 방법.
[57.] [41] 내지 [56] 중 어느 하나에서, 세포 배양은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법보다 GC/ml로 측정된 rAAV 입자를 적어도 약 2배 생산하는 것인 방법.
[58.] [41] 내지 [57] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 단리 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
본원에 기재된 조성물 및 방법의 다른 특징과 이점은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 다음의 상세한 설명으로부터 더 명백해질 것이다.
도 1은 단일 용량 50 L 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 2는 단일 용량 200 L 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 3은 단일 용량 500 L 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 4는 단일 용량 형질주입을 사용한 50 L, 200 L 및 500 L 반응기의 생물반응기 생산성을 나타낸다.
도 5는 복합체 형성 시간이 증가하면 더 큰 형질주입 복합체가 생산되는 것을 나타낸다.
도 6은 복합체 형성 시간이 일시적 형질주입 효율에 미치는 영향을 테스트하기 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 7은 일시적 형질주입 효율에 대한 복합체 형성 시간의 영향을 나타낸다.
도 8은 200 L 분할 일시적(split transient) 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 9는 200 L 생물반응기에서 단일 용량과 분할 형질주입 사이의 생산성 비교를 나타낸다.
도 10은 분할 형질주입의 견고성(robustness)을 나타낸다.
도 11은 500 L 분할 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 12는 분할 형질주입을 사용한 500 L 반응기의 생물반응기 생산성을 나타낸다.
도 13은 2,000 L 공정의 200 L 규모 축소에 대한 분할 형질주입 공정 흐름도이다.
도 2는 단일 용량 200 L 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 3은 단일 용량 500 L 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 4는 단일 용량 형질주입을 사용한 50 L, 200 L 및 500 L 반응기의 생물반응기 생산성을 나타낸다.
도 5는 복합체 형성 시간이 증가하면 더 큰 형질주입 복합체가 생산되는 것을 나타낸다.
도 6은 복합체 형성 시간이 일시적 형질주입 효율에 미치는 영향을 테스트하기 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 7은 일시적 형질주입 효율에 대한 복합체 형성 시간의 영향을 나타낸다.
도 8은 200 L 분할 일시적(split transient) 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 9는 200 L 생물반응기에서 단일 용량과 분할 형질주입 사이의 생산성 비교를 나타낸다.
도 10은 분할 형질주입의 견고성(robustness)을 나타낸다.
도 11은 500 L 분할 일시적 형질주입을 위한 복합체 제조 방법 흐름도이다.
도 12는 분할 형질주입을 사용한 500 L 반응기의 생물반응기 생산성을 나타낸다.
도 13은 2,000 L 공정의 200 L 규모 축소에 대한 분할 형질주입 공정 흐름도이다.
대규모 배양, 예를 들어 현탁 배양에서 재조합 바이러스 입자를 생산하는 방법이 본원에 제공되며, 이는 세포를 형질주입하기 위해 배양물에 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 두 개 이상의 별도로 생산된 조성물을 전달하는 단계를 포함하며, 2개 이상의 조성물 부피의 전달은 약 6시간 이하인 기간에 걸쳐 수행되고, 2개 이상의 조성물 부피의 전달은 동시에 또는 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 안정한 양이온성 고분자, 예를 들어 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대규모 세포 배양은 약 200 리터 내지 약 20,000 리터이고, 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 별도로 생산된 조성물의 합한 부피는 세포 배양 부피의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 별도로 생산된 조성물의 각 부피는 약 60분 이하, 예를 들어 약 30분 이내에 생산되고 세포 배양물로 전달된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 별도로 생산된 조성물의 각 부피는 약 60분 이하, 예를 들어 약 30분 이하로 생산되어 세포 배양물로 전달된다. 임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 본원에 개시된 방법은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 조성물의 대량의 총 부피를 세포 배양으로 전달하는 것을 가능하게 함으로써 증가된 생산성을 제공하며, 조성물의 각 성분 부피는 예를 들어, 약 60분 이내, 예를 들어 약 30분 이내에 생산되어 세포 배양물로 전달된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 별도로 생산된 조성물의 각 부피는 약 60분 이내, 50분 이내, 40분 이내, 35분 이내, 30분 이내, 25분 이내 또는 20분 이내에 생산되어 세포 배양물로 전달된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 별도로 생산된 조성물의 각 부피는 30분 이내에 생산되어 세포 배양물로 전달된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법의 생산성은 단일 배치로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 포함하는 동일한 총 부피의 조성물을 전달하는 단계를 포함하는 기준 방법 생산성의 적어도 약 2배이다. 일부 실시형태에서, 생산성은 수거 시점에 배양물 ml당 바이러스 입자로 결정된다. 일부 실시형태에서, 생산성은 단위 부피, 예를 들어 1ml의 배양물로부터 회수된 바이러스 입자의 수로 결정된다. 일부 실시형태에서 세포 배양은 현탁 세포 배양물이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 교반된 생물반응기에서 미세담체(microcarrier) 또는 거대담체(macrocarrier)에 부착되어 성장하는 부착성 세포(adherent cell)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 HEK293 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물이다.
일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
단일 치료 단위 용량을 준비하는 데 필요한 매우 많은 수의 rAAV 입자를 고려할 때 rAAV 수율이 2배 증가하면 단위 용량당 제품 비용이 많이 감소한다. 바이러스 수율의 증가는 rAAV 입자를 생산하는 데 필요한 소모품 비용뿐만 아니라 산업용 바이러스 정제 시설 건설과 관련된 자본 지출 비용도 상응하게 줄일 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 구를 하기에 정의한다.
예를 들어, 본원에 제공된 방법에 사용된 조성물 중 성분의 양, 조성물 중 성분의 농도, 유량, rAAV 입자 수율, 공급 부피, 염 농도 및 이들의 값 및 범위를 수식하는 "약"은 예를 들어 농축액 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 취급 절차를 통해서; 이들 절차의 부주의한 오류로 인해서; 조성물을 제조하거나 방법을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이를 통해서; 및 유사한 고려사항을 통해서 일어날 수 있는 수치 양의 변화를 지칭한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물의 노화로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물의 혼합 또는 처리로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해 수식되든 수식되지 않든 청구범위는 그 양에 해당하는 등가물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "약"은 제시된 수치 또는 범위보다 대략 10 내지 20% 더 크거나 더 작은 범위를 지칭한다. 추가 실시형태에서, "약"은 제시된 수치 또는 범위의 ±10%를 지칭한다. 예를 들어, "약 10%"는 9%에서 11%의 범위를 나타낸다.
"AAV"는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus)의 약자로, 바이러스 자체 또는 이의 변종, 유도체 또는 위형을 지칭하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고 모든 아형(subtype) 및 자연 발생 및 재조합 형태를 모두 포괄한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관 바이러스를 의미한다. 용어 "AAV"는 AAV 1형(AAV1), AAV 2형(AAV2), AAV 3형(AAV3), AAV 4형(AAV4), AAV 5형(AAV5), AAV 6형(AAV6), AAV 7형(AAV7), AAV 8형(AAV8), AAV 9형(AAV9), 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV 및 양 AAV 및 이들의 변형, 유도체 또는 위형을 포함한다. "영장류 AAV"는 영장류를 감염시키는 AAV를 지칭하고, "비-영장류 AAV"는 비영장류 포유동물을 감염시키는 AAV를 지칭하고, "소 AAV"는 소 포유동물을 감염시키는 AAV 지칭하고, 그 등등이다.
AAV 입자에 적용되는 바와 같은 "재조합"은 AAV 입자가 본래 AAV 입자와 구별되는 AAV 입자 작제물을 야기하는 하나 이상의 절차의 생산물임을 의미한다.
재조합 아데노-연관 바이러스 입자 "rAAV 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 이종 폴리뉴클레오타이드(즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 포유동물 세포에 전달될 트랜스진)를 포함하는 캡시드화된(encapsidated) 폴리뉴클레오타이드 rAAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. rAAV 입자는 임의의 변형, 유도체 또는 위형(예: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 또는 이들의 유도체/변형/위형)을 포함하는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 이러한 AAV 혈청형 및 유도체/변형/위형 및 이러한 혈청형/유도체/변형/위형을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예: Asokan et al., Mol. Ther. 20(4):699- 708(2012) 참고).
본 개시내용의 rAAV 입자는 임의의 혈청형 또는 혈청형의 임의의 조합(예: 2개 이상의 혈청형을 포함하는, 예를 들어 rAAV2, rAAV8 및 rAAV9 입자 중 2개 이상을 포함하는 rAAV 입자의 집단)일 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10 또는 다른 rAAV 입자, 또는 이들의 둘 이상의 조합이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 rAAV8 또는 rAAV9 입자이다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9의 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
용어 "세포 배양물"은 현탁액에서 성장하거나 미세담체 또는 거대담체, 생물반응기, 롤러병, 하이퍼스택, 미세구(microsphere), 거대구(macrosphere), 플라스크 등에 부착된 세포뿐만 아니라, rAAV 입자, 세포, 세포 부스러기, 세포 오염 물질, 콜로이드 입자, 생물분자, 숙주 세포 단백질, 핵산 및 지질 및 응집제(flocculant)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 상청액 또는 현탁액 자체의 성분을 지칭한다. 생물반응기와 같은 대규모 접근법에는 용어 "세포 배양"에 의해 교반된 생물반응기 내의 미세담체 또는 거대담체에 부착하여 성장하는 부착 세포 및 현탁 배양이 포함된다. 바이러스 입자 또는 단백질의 대규모 및 소규모 생산 모두에 대한 세포 배양 절차가 본 개시내용에 포함된다. 일부 실시형태에서, 용어 "세포 배양"은 현탁액에서 성장한 세포를 의미한다. 일부 실시형태에서, 용어 "세포 배양"은 교반된 생물반응기 내에서 미세담체 또는 거대담체에 부착되어 성장하는 부착성 세포를 지칭한다.
본원에서 "정제시키는", "정제", "분리시키다", "분리시키는", "분리", "단리시키다", "단리시키는" 또는 "단리"는 표적 생산물, 예를 들어, 표적 생산물 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플의 rAAV 입자 및 rAAV 게놈의 순도를 높이는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 생산물의 순도는 샘플로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가한다. 일부 실시형태에서, 샘플 중 rAAV의 순도는 본원에 기재된 방법을 사용하여 샘플로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
본원에서 실시형태가 "포함하는"이라는 언어와 함께 기재된 곳마다 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 관점에서 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 본원에서 실시형태가 "본질적으로 이루어진"이라는 언어와 함께 기재된 곳마다, "이루어진"의 관점에서 기재된 달리 유사한 실시형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에서 구 예컨대 "A 및/또는 B"에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다, A 또는 B, A(단독) 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 구, 예컨대, "A, B 및/또는 C"에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 하기 실시형태 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본 발명의 실시형태가 마쿠스 군 또는 다른 대안의 군 관점에서 기재된 경우, 개시된 방법은 전체적으로 열거된 전체 군뿐만 아니라 그 군 각각의 구성원 및 주요 군의 모든 가능한 하위 군 및 군 구성원 중 하나 이상이 없는 주요 군도 포함한다. 개시된 방법은 또한 개시된 방법에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상의 명시적 배제를 고려한다.
재조합 바이러스 생산 방법
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 생산 방법을 제공하며,
a) 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계,
하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자 또는 패키징될 rAAV 게놈)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 7% 내지 약 15%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 10%이다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달을 완료하기 전에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 직후에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 10분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 15분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 20분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 30분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 45분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 50분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 40분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 25분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분 내지 약 20분, 약 10분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 10분 내지 약 15분 또는 약 15분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 내지 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분, 약 10분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 12분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 12시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 8시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 6시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 5시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 4시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 3시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 12시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 9시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 8시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 7시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 6시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 3시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 2시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 같은 방식으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 양이온성 고분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 생산 방법을 제공하며,
a) 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계,
하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고, c) 단계는 한 번 이상 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 한 번 더 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 2회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 4회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 5회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 6회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 8회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 9회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 10회 반복된다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 7% 내지 약 15%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 10%이다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달을 완료하기 전에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 직후에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 5분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 10분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 15분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 20분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 30분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 45분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 60분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 50분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 40분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 25분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분 내지 약 20분, 약 10분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 10분 내지 약 15분 또는 약 15분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 내지 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분, 약 10분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 12분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 12시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 8시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 6시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 5시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 4시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 3시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 12시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 9시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 8시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 7시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 6시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 3시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 2시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 같은 방식으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 양이온성 고분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며,
a) 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계,
하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법보다 GC/ml로 측정된 rAAV 입자를 적어도 약 2배 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 100%만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 5배만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 7% 내지 약 15%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 10%이다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달을 완료하기 전에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 직후에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 10분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 15분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 20분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 30분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 45분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 50분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 40분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 25분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분 내지 약 20분, 약 10분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 10분 내지 약 15분 또는 약 15분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 내지 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분, 약 10분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 12분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 12시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 8시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 6시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 5시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 4시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 3시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 12시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 9시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 8시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 7시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 6시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 3시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 2시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 같은 방식으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 양이온성 고분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며,
a) 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 세포 배양물을 유지하는 단계,
하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고, c) 단계는 한 번 이상 반복된다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법보다 GC/ml로 측정된 rAAV 입자를 적어도 약 2배 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 100%만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 5배만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 한 번 더 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 2회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 4회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 5회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 6회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 8회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 9회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 10회 반복된다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 7% 내지 약 15%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 세포 배양의 약 10%이다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달을 완료하기 전에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 직후에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 5분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 10분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 15분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 20분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 30분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 45분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 60분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 50분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 40분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 25분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분 내지 약 20분, 약 10분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 10분 내지 약 15분 또는 약 15분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 내지 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분, 약 10분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 12분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 12시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 8시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 6시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 5시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 4시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 3시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 12시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 9시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 8시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 7시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 6시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 3시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 2시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 같은 방식으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 양이온성 고분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자 또는 패키징될 rAAV 게놈)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자의 생산 방법을 제공하며,
a) rAAV를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 세포 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 세포 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건에서 형질주입된 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물을 유지하는 단계,
형질주입 시약은 PEI를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 rAAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며,
a) rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계;
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 형질주입된 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건으로 유지하는 단계, 형질주입 시약은 PEI를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 rAAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법보다 GC/ml로 측정된 rAAV 입자를 적어도 약 2배 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 100%만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 5배만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 생산하는 방법을 제공하며, a) rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계; b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및 d) 형질주입된 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건으로 유지시키는 단계, 형질주입 시약은 PEI를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 rAAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고, c) 단계는 한 번 이상 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 한 번 더 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 2회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 3회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 4회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 5회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 6회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 8회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 9회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 7회 반복된다. 일부 실시형태에서, c) 단계는 10회 반복된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자의 생산을 증가시키는 방법을 제공하며, a) rAAV 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계; b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 단계; 및 d) 형질주입된 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물을 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건으로 유지시키는 단계, 형질주입 시약은 PEI를 포함하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 rAAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법보다 GC/ml로 측정된 rAAV 입자를 적어도 약 2배 생산한다. 일부 실시형태에서, 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 100%만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 5배만큼 rAAV 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 현탁 세포 배양물로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 세포 배양물로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 세포 배양물로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 7% 내지 약 15%이다. 일부 실시형태에서, 현탁 세포 배양물로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 10%이다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달을 완료하기 전에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 직후에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 5분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 10분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 15분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 20분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 30분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 45분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, c) 단계의 전달은 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 50분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 40분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 25분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분 내지 약 20분, 약 10분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 10분 내지 약 15분 또는 약 15분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 내지 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 5분, 약 10분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 10분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 12분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 12시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 8시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 6시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 5시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 4시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 1시간 내지 약 3시간인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 12시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 9시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 8시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 7시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 6시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 3시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계에서의 전달은 약 2시간 이내인 기간에 걸쳐 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계와 c) 단계의 전달은 임의의 순서로 연속하여 수행된다. 일부 실시형태에서, b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 같은 방식으로 수행된다. 일부 실시형태에서, 현탁 세포 배양물은 현탁 배양에서의 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 10,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자 또는 패키징될 rAAV 게놈)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
형질주입 기반 재조합 바이러스 입자 생산 시스템은 숙련된 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Reiser et al., Gene Ther 7(11):910-3 (2000); Dull et al., J Virol. 72(11):8463-8471 (1998); Hoffmann et al., PNAS 97 (11) 6108-6113 (2000); Milian et al., Vaccine 35(26): 3423-3430 (2017)를 참조하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 개시된 방법은 형질주입 기반 생산 시스템에서 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 뎅기 바이러스, 재조합 에볼라 바이러스, 재조합 인간 유두종 바이러스(HPV), 재조합 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV), 재조합 렌티바이러스, 재조합 인플루엔자 바이러스, 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV), 재조합 폴리오바이러스, 재조합 아데노바이러스, 재조합 레트로바이러스, 재조합 백시니아, 재조합 레오바이러스, 재조합 홍역, 재조합 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 재조합 헤르페스 조스터 바이러스(HZV), 재조합 헤르페스 단순 바이러스(HSV) 또는 재조합 바쿨로바이러스이다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV), 재조합 렌티바이러스 또는 재조합 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 렌티바이러스이다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 바쿨로바이러스이다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다.
세포를 형질주입시키기 위해 당업계에 공지된 임의의 적합한 형질주입 시약은 본원에 개시된 방법에 따라 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)의 생산에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 화학적 기반 형질주입 방법을 사용하여 세포를 형질주입하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 양이온성 유기 담체를 사용하여 세포를 형질주입하는 것을 포함한다. 예를 들어, Gigante et al., MedChemComm 10(10): 1692-1718 (2019); Damen et al. MedChemComm 9(9): 1404-1425 (2018)를 참고하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 지질, 예를 들어 DOTMA, DOTAP, 헬퍼 지질(도프, 콜레스테롤) 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 다가 양이온성 지질, 예를 들어 DOSPA, DOGS 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 양극성 지질 또는 양친매성체(볼라스)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 생환원성 및/또는 이합체성 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 제미니 계면활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 LipofectinTM, TransfectamTM, LipofectamineTM, Lipofectamine 2000TM 또는 Lipofectamin PLUS 2000TM을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 고분자, 예를 들어 폴리(L-리신)(PLL), 폴리에틸렌이민(PEI), 다당류(키토산, 덱스트란, 사이클로덱스트린(CD)), 폴리[2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트](PDMAEMA) 및 덴드리머(폴리아미도아민(PAMAM), 폴리(프로필렌 이민)(PPI))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 펩타이드, 예를 들어 염기성 아미노산이 풍부한 펩타이드(CWL18), 세포 침투 펩타이드(CPP)(Arg-풍부 펩타이드(옥타아르기닌, TAT)), 핵 국소화 신호(NLS)(SV40) 및 타겟팅(RGD)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 유기 담체는 양이온성 리포좀과 조합된 고분자(예: PEI)를 포함한다. Paris et al., Molecules 25(14): 3277 (2020), 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 인산칼슘, 고도로 분지된 유기 화합물(덴드리머), 양이온성 고분자(예: DEAE 덱스트란 또는 폴리에틸렌이민(PEI)), 리포펙션을 포함한다.
일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 폴리(L-리신)(PLL), 폴리에틸렌이민(PEI), 선형 PEI, 분지형 PEI, 덱스트란, 사이클로덱스트린(CD), 폴리[2-(디메틸아미노) 에틸 메타크릴레이트](PDMAEMA), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리(프로필렌 이민)(PPI)) 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 폴리에틸렌이민(PEI), 선형 PEI, 분지형 PEI 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 선형 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 분지형 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 분자량이 약 5 내지 약 25 kDa인 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEG화된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 콜레스테롤, 콜린, 알킬기 및 일부 아미노산과 같은 소수성 모이어티가 부착된 변형된 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함한다.
조성물 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하는 것은 각각의 형질주입 시약 및 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 멸균 액체, 예를 들어 조직 배양 배지로 희석하는 단계 및 희석된 형질주입 시약과 희석된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혼합은 희석된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 희석된 적어도 하나의 형질주입 시약을 2개의 별도 용기로부터 새로운 용기로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 희석된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 희석된 적어도 하나의 형질주입 시약을 새로운 용기로 전달하는 것은 약 500 ml/분, 약 1 리터/분, 약 2 리터/분, 약 3 리터, 약 4리터/분, 약 5리터/분, 약 6리터/분, 약 7리터/분, 약 8리터/분, 약 9리터/분 또는 약 10리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 3 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 4 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 5 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 6 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 희석된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 희석된 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하는 것은 인라인 믹서에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 인라인 믹서는 저전단 인라인 믹서이다. 일부 실시형태에서, 인라인 믹서는 정적 인라인 믹서이다. 폴리뉴클레오타이드를 형질주입 시약과 혼합하기에 적합한 인라인 믹서는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 Sartorius(Flexsafe® Pro Mixer), Analytical Scientific Instruments US, Inc.(HYPERSHEARTM), Fluitec 또는 STRIKO에서 구매할 수 있다. 당업자는 원하는 비와 농도로 형질주입 시약 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 생산하기 위해 희석 및 혼합이 수행된다는 것을 이해한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 형질주입 시약과 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 희석 및 혼합은 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드를 약 1:5 내지 5:1의 중량비로 포함하는 조성물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:3 내지 3:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:3 내지 1:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:2 내지 1:1.5이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:5, 1:4, 1:3, 1:2.5, 1:2, 1:1.75, 1:1.5, 1:1.25, 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 1.75:1, 2:1, 2.5:1, 3:1, 4:1 또는 5:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:2이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:1.75이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:1.5이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:1.25이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1.25:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1.5:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 1.75:1이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약과 폴리뉴클레오타이드의 중량비는 약 2:1이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 1 μg 내지 약 20 μg의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 3개의 플라스미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 2개의 플라스미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 1개의 플라스미드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 재조합 AAV이고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화하고(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9 입자이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI이다.
일부 실시형태에서, 형질주입 시약 및 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물은 인큐베이팅되어 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 형성을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 실온에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 예를 들어 진탕기(shaker) 상에서 약 100 내지 약 200 rpm으로 조성물을 진탕시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 5분 내지 약 20분, 약 10분 내지 약 20분, 약 5분 내지 약 15분, 약 10분 내지 약 15분 또는 약 15분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 5분 내지 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 10분 내지 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 5분, 약 10분, 약 12분, 약 13분, 약 14분, 약 15분, 약 16분, 약 17분, 약 18분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 11분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 12분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 13분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 14분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 15분 이내로 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 10분 이내로 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 5분, 약 10분 또는 약 15분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션은 약 10분 동안 수행된다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션의 길이는 혼합, 인큐베이팅 및 전달이 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료되도록 하는 것이다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양으로 전달하는 방법은 숙련된 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 전달은 연동 펌프를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 100 ml/분 내지 약 10 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 500 ml/분, 약 1 리터/분, 약 2 리터/분, 약 3 리터/분, 약 4 리터/분, 약 5 리터/분, 약 6 리터/분, 약 7 리터/분, 약 8 리터/분, 약 9 리터/분 또는 약 10 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 3 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 4 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 5 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 6 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 7 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 8 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 9 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달은 약 10 리터/분의 속도로 수행된다. 일부 실시형태에서, 전달 속도는 혼합, 인큐베이팅 및 전달이 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료되도록 설정된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 동일한 방법을 사용하여 생산된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 별도로 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 이 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 현탁 배양물로 옮겨 세포를 형질주입하는 것은 같은 방법을 사용한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 별도의 전달은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양으로의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 별도 전달은 상이한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 세포 배양의 약 5% 내지 약 20%이다. 일부 실시형태에서, 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 세포 배양물 부피의 약 7% 내지 약 15%이다. 일부 실시형태에서, 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 세포 배양물 부피의 약 10%이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 약 0.1㎍의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 /10E+6 생존 세포/ml 및 약 5 ㎍의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드/10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 약 0.2㎍의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 /10E+6 생존 세포/ml 및 약 2 ㎍의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드/10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양으로 전달된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 약 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 μg의 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 /10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 20,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터 내지 약 20,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 700 리터 내지 약 20,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 1,000 리터 내지 약 20,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 10,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터 내지 약 10,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 700 리터 내지 약 10,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 1,000 리터 내지 약 10,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 700 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 1,000 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 본원에서 언급된 세포 배양물 부피는 표 1에 기재된 바와 같은 최종 생물반응기/용기 용량이다. 일부 실시형태에서, 배양액은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 2,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 1,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 본원에서 언급된 세포 배양물 부피는 표 1에 기재된 바와 같은 최종 생물반응기/용기 용량이다. 일부 실시형태에서, 배양액은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 200 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 300 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 400 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 500 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 750 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 1,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 2,000리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 3,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물의 부피는 약 5,000 리터이다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 21 리터의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체와 같은 약 20리터 부피의 2개를 별도로 생산하여 약 400 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 3개를 별도로 생산하여 약 600 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 4개를 별도로 생산하여 약 800 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 5개를 별도로 생산하여 약 1,000 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 6개를 별도로 생산하여 약 1,200 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 7개를 별도로 생산하여 약 1,400 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 8개를 별도로 생산하여 약 1,600 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 9개를 별도로 생산하여 약 1,800 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 20 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 10개를 별도로 생산하여 약 2,000 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 참고로, 별도로 생산된 형질주입 복합 혼합물의 부피에 대한 비제한적인 실시예가 표 1에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 42 리터의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체와 같은 약 40리터 부피의 1개를 별도로 생산하여 약 400 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 40 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 2개를 별도로 생산하여 약 800 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 40 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 4개를 별도로 생산하여 약 1,600 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 참고로, 별도로 생산된 형질주입 복합 혼합물의 부피에 대한 비제한적인 실시예가 표 1에 제공되어 있다.
| 별도로 생산된 형질주입 복합 혼합물의 수 및 부피 | 총 형질주입 복합체 부피 | 형질주입 복합체 추가 전 세포 배양 부피 | 최종 생물반응기 / 용기 용량 |
| 1x4L | 4L | 40L | 50L |
| 4x4L | 16L | 160L | 200L |
| 2x8L | 16L | 160L | 200L |
| 1x16L | 16L | 160L | 200L |
| 2x21L | 42L | 420L | 500L |
| 1x42L | 42L | 420L | 500L |
| 4x20L | 80L | 800L | 1,000L |
| 2x40L | 80L | 800L | 1,000L |
| 8x20L | 160L | 1,600L | 2,000L |
| 4x40L | 160L | 1,600L | 2,000L |
| 2x80L | 160L | 1,600L | 2,000L |
| 8x100L | 800L | 8,000L | 10,000L |
| 2x400L | 800L | 8,000L | 10,000L |
| 8x200L | 1,600L | 16,000L | 20,000L |
| 2x800L | 1,600L | 16,000L | 20,000L |
일부 실시형태에서, 전달 속도는 혼합, 인큐베이팅 및 전달이 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료되도록 설정된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자 또는 패키징될 rAAV 게놈)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 2개를 별도로 생산하여 약 600 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 3개를 별도로 생산하여 약 900 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 4개를 별도로 생산하여 약 1,200 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 5개를 별도로 생산하여 약 1,500 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 6개를 별도로 생산하여 약 1,800 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 7개를 별도로 생산하여 약 2,100 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 8개를 별도로 생산하여 약 2,400 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 9개를 별도로 생산하여 약 2,700 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 방법은 약 30 리터 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 10개를 별도로 생산하여 약 3,000 리터의 세포 배양물로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전달 속도는 혼합, 인큐베이팅 및 전달이 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료되도록 설정된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 90분, 약 60분, 약 50분, 약 40분, 약 35분, 약 30분, 약 25분 또는 약 20분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 60분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 50분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 40분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 35분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 30분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 25분 미만에 완료된다. 일부 실시형태에서, 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 약 20분 미만에 완료된다.
별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 세포 배양으로의 전달은 동시에 또는 연속해서 수행될 수 있다. 동시 전달은 중첩 전달을 포함한다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 동시에 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 연속하여 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료하기 전에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달의 완료 직후에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 5분 내지 약 60분에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 5분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 10분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 15분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 20분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 30분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 45분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 부피의 전달은 별도로 생산된 부피의 이전 전달을 완료한 후 약 60분 이내에 시작된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 1시간 내지 약 12시간인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 1시간 내지 약 8시간인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 1시간 내지 약 6시간인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 1시간 내지 약 5시간인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 1시간 내지 약 4시간인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 1시간 내지 약 3시간인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 12시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 9시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 8시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 7시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 6시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 5시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 3시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 별도로 생산된 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체는 약 2시간 이내인 기간에 걸쳐 세포 배양물에 전달된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 AAV 입자를 생산하는 데 필요한 유전 정보를 암호화한다(유전자를 함유한다). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 헬퍼 유전자, rep 유전자, cap 유전자 및 트랜스진(예를 들어 관심 유전자 또는 패키징될 rAAV 게놈)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 시약은 PEI를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 2x10E+6 내지 약 10E+7 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 3x10E+6 내지 약 8x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 3x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 4x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 5x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 6x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 7x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 약 8x10E+6 생존 세포/ml를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 집단은 포유동물 세포 또는 곤충 세포 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 포유동물 세포 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 HEK293 세포, HEK 유래 세포, CHO 세포, CHO 유래 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 및/또는 PerC6 세포 집단을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 집단은 HEK293 세포 집단을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 2일 내지 약 10일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 3일 내지 약 5일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 5일 내지 약 14일 이상 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 2일 내지 약 7일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 3일 내지 약 5일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 적어도 약 3일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 5일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 전달한 후 약 6일 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양은 연속 수거를 위한 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건으로 유지된다. 일부 실시형태에서, 배양은 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포와 같은 HEK293 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법과 비교하여 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)의 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 재조합 바이러스 생산을 약 50% 이상, 약 75% 이상 또는 약 100% 이상 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 재조합 바이러스 생산을 약 2배 이상, 약 3배 이상 또는 약 5배 이상 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 rAAV 생산을 약 2배 이상 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 생산의 증가는 생산 배양에서 재조합 바이러스(예: rAAV) 역가를 비교함으로써 결정된다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스(예: rAAV) 역가는 생산 배양 밀리리터당 게놈 카피(GC: genome copy)로서 측정된다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 rAAV이다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질을 갖는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 rAAV 입자 및 이를 포함하는 조성물의 품질 속성을 유지하거나 개선하면서 rAAV 입자의 생산을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자 및 이를 포함하는 조성물의 품질은 rAAV 입자의 농도(예: GC/ml), rAAV 게놈의 카피를 포함하는 입자의 백분율; 게놈이 없는 입자의 비율, rAAV 입자의 감염성, rAAV 입자의 안정성, 잔류 숙주 세포 단백질의 농도 또는 잔류 숙주 세포 핵산의 농도(예: 숙주 세포 게놈 DNA, rep 및 cap 유전자를 암호화하는 플라스미드, 헬퍼 기능을 암호화하는 플라스미드, rAAV 게놈을 암호화하는 플라스미드)를 결정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 rAAV 입자 또는 이를 포함하는 조성물의 품질은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법에 의해 생산된 rAAV 입자 또는 조성물의 품질과 동일하다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생산된 rAAV 입자 또는 이를 포함하는 조성물의 품질은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법에 의해 생산된 rAAV 입자 또는 조성물의 품질보다 더 우수하다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+10 GC/ml 내지 약 1x10e+13 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+10 GC/ml 내지 약 1x10e+11 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+10 GC/ml 내지 약 1x10e+12 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+10 GC/ml 내지 약 1x10e+13 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+11 GC/ml 내지 약 1x10e+13 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+10 GC/ml 내지 약 5x10e+12 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+11 GC/ml 내지 약 5x10e+12 GC/ml rAAV 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+11 GC/ml rAAV를 넘는 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+11 GC/ml를 넘는 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+12 GC/ml rAAV를 넘는 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+10 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+11 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+11 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+12 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+12 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 1x10e+13 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 약 5x10e+13 GC/ml rAAV 이상의 입자를 생산한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
다수의 세포 배양 기반 시스템은 rAAV 입자의 생산을 위해 당업계에 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것은 본원에 개시된 방법을 실행하는 데 사용될 수 있다. rAAV 바이러스 입자 생산을 위한 rAAV 생산 배양에는 다음이 필요하다. (1) 예를 들어 HeLa, A549 또는 HEK293 세포 및 이들의 유도체(HEK293T 세포, HEK293F 세포)와 같은 인간-유래 세포주, 또는 Vero, CHO 세포 또는 CHO-유래 세포와 같은 포유동물 세포주를 포함하는 적합한 숙주 세포; (2) 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예: 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바쿨로바이러스 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 구조에 의해 제공되는 적합한 헬퍼 바이러스 기능; (3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; (4) AAV ITR 서열이 측접된 트랜스진(예: 치료 트랜스진); 및 (5) rAAV 생산을 지원하는 적합한 배지 및 배지 성분.
당업자는 AAV rep 및 cap 유전자, AAV 헬퍼 유전자(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자) 및 rAAV 게놈(반전 말단 반복부(ITR: inverted terminal repeat))가 측접된 하나 이상의 관심 유전자를 포함)을 세포에 도입하여 rAAV를 생산하거나 패키징하는 다수의 방법을 인식한다. "아데노바이러스 헬퍼 기능"은 AAV가 세포에서 효율적으로 성장하도록 세포에서 (RNA 또는 단백질로서) 발현되는 다수의 바이러스 헬퍼 유전자를 지칭한다. 당업자는 아데노바이러스 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV: herpes simplex virus)를 포함하는 헬퍼 바이러스가 AAV 복제를 촉진시키는 것을 이해하며, 필수 기능을 제공하는 특정 유전자가 식별되어 있고, 예를 들어, 헬퍼는 이러한 AAV 유전자 발현 및 복제를 용이하게 하는 세포 환경에 대해 변화를 유도할 수 있다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈은 AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 암호화하는 하나 이상의 플라스미드 벡터의 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다.
AAV rep 및 cap 유전자, 헬퍼 유전자 및/또는 rAAV 게놈을 암호화하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 개발하기 위한 분자 생물학 기술은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, AAV 헬퍼 유전자(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)는 하나의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 또는 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 나머지 AAV 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 및 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의한 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 헬퍼 유전자 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 하나의 플라스미드 벡터에 의한 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현된다. 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, AAV 헬퍼 유전자(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자)는 하나의 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 또는 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 나머지 AAV 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, E1a 유전자 및 E1b 유전자는 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 헬퍼 유전자 숙주 세포에 의해 안정적으로 발현되고, 하나 이상의 헬퍼 유전자는 하나의 바이러스 벡터에 의한 형질주입에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, AAV rep 및 cap 유전자, 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 및 패키징될 rAAV 게놈은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 벡터로의 형질주입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 세포를 하기 3개의 폴리뉴클레오타이드의 혼합물로 형질주입하는 단계를 포함한다. 하나는 cap 및 rep 유전자를 암호화하고, 하나는 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능 암호화(예: 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자를 암호화) 및 하나는 패키징할 rAAV 게놈을 암호화하는 것. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV8 또는 AAV9 cap 유전자이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡 유전자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 또는 AAV.7m8 캡 유전자이다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, 패키징될 rAAV 게놈을 암호화하는 벡터는 AAV ITR이 측접된 관심 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형에서 유래한다.
벡터의 임의의 조합을 사용하여 AAV rep 및 cap 유전자, AAV 헬퍼 유전자 및 rAAV 게놈을 rAAV 입자가 생산되거나 패키징되는 세포에 도입할 수 있다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시형태에서, AAV 반전 말단 반복부(ITR)가 측접된 관심 유전자를 포함하는 rAAV 게놈을 암호화하는 제1 플라스미드 벡터, AAV rep 및 cap 유전자를 암호화하는 제2 벡터 및 헬퍼 유전자를 암호화하는 제3 벡터가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 3개 벡터의 혼합물은 세포 내로 공동-형질주입된다.
일부 실시형태에서, 형질주입 및 감염의 조합은 플라스미드 벡터뿐만 아니라 바이러스 벡터를 둘 다 사용함으로써 사용된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 rep 및 cap 유전자 및 AAV 헬퍼 유전자는 세포에 의해 구성적으로 발현되며 세포 내로 형질주입되거나 형질주입될 필요가 없다. 일부 실시형태에서, 세포는 구성적으로 rep 및/또는 cap 유전자를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 구성적으로 하나 이상의 AAV 헬퍼 유전자를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 구성적으로 E1a를 발현한다. 일부 실시형태에서, 세포는 rAAV 게놈을 암호화하는 안정한 트랜스진을 포함한다.
일부 실시형태에서, AAV rep, cap 및 헬퍼 유전자(예: Ela 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 또는 VA 유전자)는 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 유사하게, AAV ITR은 또한, 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, AAV ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형(예: 하나 초과의 혈청형으로부터의 서열을 보유하는 하이브리드 혈청형)에서 유래한다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV9 또는 AAV8 cap 유전자에서 유래한다. 일부 실시형태에서, AAV cap 유전자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 AAV 혈청형(예: 하나 초과의 혈청형으로부터의 서열을 보유하는 하이브리드 혈청형)에서 유래한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자의 생산을 위한 AAV rep 및 cap 유전자는 상이한 혈청형으로부터 유래한다. 예를 들어, rep 유전자는 AAV2에서 유래한 반면 cap 유전자는 AAV9에서 유래한다.
당업계에 공지된 임의의 적합한 배지는 본원에 개시된 방법에 따라 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)의 생산에 사용될 수 있다. 이들 배지는 비제한적으로 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 MEM(Modified Eagle Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 Sf-900 II SFM 배지를 포함한 Hyclone Laboratories 및 JRH에 의해 생산된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 Invitrogen/ThermoFisher의 DynamisTM Medium, FreeStyleTM 293 Expression Medium 또는 Expi293TM Expression Medium을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 DynamisTM 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 무혈청 배지, 동물-성분이 없는 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함하는 세포 배양물을 사용한다. 일부 실시형태에서, 배지는 동물-성분이 없는 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 소 태아 혈청을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 글루타민이 없는 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배지는 영양소, 염, 완충제 및 추가제(예: 소포제) 중 하나 이상이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 글루타민이 보충된다. 일 실시형태에서, 배지는 혈청이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 소 태아 혈청이 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 폴록사머, 예를 들어 Kolliphor® P 188 Bio가 보충된다. 일부 실시형태에서, 배지는 베이스 배지이다. 일부 실시형태에서, 배지는 공급 배지이다.
재조합 바이러스(예: rAAV) 생산 배양물은 사용될 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 온도 범위에 걸쳐, 다양한 시간 길이 등) 하에서 일상적으로 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 바이러스 생산 배양물은 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예: HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포와 같은 현탁-적응 숙주 세포를 포함한다. 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 및 SF-9 세포와 같은 현탁-개작(suspension-adapted) 숙주 세포를 포함하며, 예를 들어 스피너 플라스크, 교반 탱크 생물반응기 및 웨이브 백(Wave bag) 시스템과 같은 일회용 시스템을 포함하는 다양한 방식으로 배양될 수 있다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 신청 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 현탁 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스는 재조합 AAV이다.
당업계에 공지된 임의의 세포 또는 세포주는 본원에 개시된 방법 중 임의의 하나에서 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)의 생산에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)를 생산하거나 재조합 바이러스 입자(예: rAAV 입자)의 생산을 증가시키는 방법은 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예: HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, LLC-MK 세포, MDCK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, PK15 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, BHK 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 포유동물 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 곤충 세포, 예컨대 SF-9 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 현탁 배양에서 성장에 적합한 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 현탁 배양에서 성장에 적합한 HEK293 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 재조합 바이러스 입자는 재조합 AAV 입자이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양은 현탁 배양이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 대규모 현탁 세포 배양물은 현탁 배양에서 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지, 동물-성분이 없는 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁-개작 세포는 진탕기 플라스크, 스피너 플라스크, 셀백 또는 생물반응기에서 배양된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지, 동물-성분이 없는 배지 또는 화학적으로 정의된 배지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 무혈청 배지를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 항응집제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 덱스트란 설페이트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 세포 배양물은 약 0.1 mg/L 내지 약 10 mg/L 덱스트란 설페이트를 포함한다. 덱스트란 설페이트를 포함하는 배양 배지에서 숙주 세포를 형질주입하는 방법은 2021년 1월 21일 자로 출원된 "재조합 폴리펩타이드 및 바이러스의 개선된 생산"이라는 제목의 미국 가출원 제63/139,992호에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 대규모 현탁 세포 배양물은 고밀도 세포 배양물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 약 1x10E+06 세포/ml 내지 약 30x10E+06 세포/ml의 총 세포 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포의 약 50% 이상이 생존 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예: HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포 또는 SF-9 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다.
본원에 개시된 방법은 임의의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자의 생산에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 및 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 및 AAV.7m8로 이루어진 군으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.PHB 또는 AAV.7m8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 및 AAV.hu37과 같은 AAV8 또는 AAV9에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 AAV 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2개 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다.
rAAV 입자
제공된 방법은 임의의 분리된 재조합 AAV 입자의 생산에 사용하기에 적합하다. 이와 같이, rAAV는 당업계에 공지된 임의의 혈청형, 변형 또는 유도체, 또는 당업계에 공지된 임의의 조합(예를 들어, 2개 이상의 혈청형을 포함하는 rAAV 입자 집단, 예를 들어 2개 이상의 rAAV2, rAAV8 및 rAAV9 입자를 포함함)일 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HS C1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 또는 기타 rAAV 입자, 또는 이들의 2개 이상의 조합이다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV. 7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 예컨대, VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예컨대 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 100%까지 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 예컨대, VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예컨대 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉 100%까지 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전체 내용이 참조로 포함된 Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068에 기재된 바와 같은 Anc80 또는 Anc80L65의 캡시드를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 하기 아미노산 삽입물 중 하나를 갖는 캡시드를 포함한다: 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호 및 미국 특허 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 LGETTRP 또는 LALGETTRP. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제9,193,956호; 제9,458,517호; 및 제9,587,282호 및 미국 특허 출원 공개 제2016/0376323호에 기재된 바와 같은 AAV.7m8의 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAVPHP.B와 같은 미국 특허 제9,585,971호에 개시된 임의의 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제9,840,719호 및 제WO 2015/013313호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 AAV.Rh74 및 RHM4-1을 포함하며, 이들 특허 각각은 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 제WO 2014/172669호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV rh.74를 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 문헌[Georgiadis et al., 2016, Gene Therapy 23: 857-862 및 Georgiadis et al., 2018, Gene Therapy 25: 450 에 기재된 바와 같이 AAV2/5의 캡시드를 포함하며, 이들 특허 각각은 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 제WO 2017/070491호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예를 들어 AAV2tYF를 포함하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 Puzzo et al., 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418에 기재된 바와 같은 AAVLK03 또는 AAV3BD의 캡시드를 포함하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제9,923,120호 및 제WO 2016/049230호에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대 HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10, HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15 또는 HSC16을 포함하며, 이들 각각은 전문이 참조에 의해 포함된다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드를 포함한다: 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 각각 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 하기 특허 및 특허 출원 중 임의의 것에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다: 미국 특허 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 및 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 제WO 2003/052051호( 예를 들어, SEQ ID NO: 2 참조), 제WO 2005/033321호( 예를 들어, SEQ ID NO: 123 및 88 참조), 제WO 03/042397호( 예를 들어, SEQ ID NO: 2, 81, 85 및 97 참조), 제WO 2006/068888호( 예를 들어, SEQ ID NO: 1 및 3 내지 6 참조), 제WO 2006/110689호(예를 들어, SEQ ID NO: 5 내지 38 참조), 제WO2009/104964호(예를 들어, SEQ ID NO: 1 내지 5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참조), 제WO 2010/127097호(예를 들어, SEQ ID NO: 5 내지 38 참조) 및 제WO 2015/191508호(예를 들어 SEQ ID NO: 80 내지 294 참조) 및 미국 출원 공개 제2015/0023924호(예를 들어, SEQ ID NO: 1, 5 내지 10 참조)에 개시된 캡시드 단백질을 갖고, 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 제WO 2003/052051호(예를 들어, SEQ ID NO: 2 참조), 제WO 2005/033321호(예를 들어, SEQ ID NO: 123 및 88 참조), 제WO 03/042397호(예를 들어, SEQ ID NO: 2, 81, 85 및 97 참조), 제WO 2006/068888호(예를 들어, SEQ ID NO: 1 및 3 내지 6 참조), 제WO 2006/110689호(예를 들어, SEQ ID NO: 5 내지 38 참조), 제WO2009/104964호(예를 들어, SEQ ID NO: 1 내지 5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참조), 제WO 2010/127097호(예를 들어, SEQ ID NO: 5 내지 38 참조) 및 제WO 2015/191508호(예를 들어 SEQ ID NO: 80 내지 294 참조) 및 미국 출원 공개 제2015/0023924호(예를 들어 SEQ ID NO: 1, 5 내지 10 참조)에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.
AAV 기반 바이러스 벡터의 핵산 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 제7,282,199호; 제7,906,111호; 제8,524,446호; 제8,999,678호; 제8,628,966호; 제8,927,514호; 제8,734,809호; 제9,284,357호; 제9,409,953호; 제9,169,299호; 제9,193,956호; 제9458517호; 및 제9,587,282호; 미국 특허 출원 공개 제2015/0374803호; 제2015/0126588호; 제2017/0067908호; 제2013/0224836호; 제2016/0215024호; 제2017/0051257호; 국제 특허 출원 제PCT/US2015/034799호; 제PCT/EP2015/053335호; 제WO 2003/052051호, 제WO 2005/033321호, 제WO 03/042397호, 제WO 2006/068888호, 제WO 2006/110689호, 제WO2009/104964호, 제W0 2010/127097호 및 제WO 2015/191508호 및 미국 출원 공개 제2015/0023924호에 교시되어 있다.
제공된 방법은 트랜스진을 암호화하는 재조합 AAV의 생산에 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 트랜스진은 표 2 내지 3 에서 선택된다. 일부 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다. (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 반전 말단 반복부; (2) a) 프로모터/인핸서, b) 폴리 A 신호 및 c) 선택적으로 인트론과 같은 조절 제어 요소; 및 (3) 트랜스진을 암호화하는 핵산 서열. 무손상 또는 실질적으로 무손상인 단클론성 항체(mAb)를 발현시키기 위한 다른 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다. (1) 발현 카세트 측면에 있는 AAV 반전 말단 반복부; (2) a) 프로모터/인핸서, b) 폴리 A 신호, 및 c) 선택적으로 인트론과 같은 조절 제어 요소; 및 (3) 항체의 경쇄 Fab 및 중쇄 Fab 또는 중쇄 또는 경쇄 Fab 및 선택적으로 중쇄 Fc 영역에 대한 트랜스진을 위한 핵산 서열 암호. 무손상 또는 실질적으로 무손상 mAb를 발현시키기 위한 또 다른 실시형태에서, rAAV 게놈은 하기 성분을 포함하는 벡터를 포함한다: (1) 발현 카세트에 측접한 AAV 반전 말단 반복부; (2) a) 프로모터/인핸서, b) 폴리 A 신호 및 c) 선택적으로 인트론과 같은 조절 제어 요소; 및 (3) 항-VEGF(예: 세바시주맙, 라니비주맙, 베바시주맙 및 브롤루시주맙), 항-EpoR(예: LKA-651), 항-ALK1(예: 아스크린바쿠맙), 항-C5(예: 테시돌루맙 및 에쿨리주맙), 항-CD105(예: 카로툭시맙), 항-CC1Q(예: ANX-007), 항-TNFα(예: 아달리무맙, 인플릭시맙 및 골리무맙), 항-RGMa(예: 엘레자누밥), 항-TTR(예: NI-301 및 PRX-004), 항-CTGF(예: 팜레블루맙), 항-IL6R(예: 사트랄리주맙 및 사릴루맙), 항-IL4R(예: 두필루맙), 항-IL17A(예: 익세키주맙 및 세쿠키누맙), 항-IL-5(예: 메폴리주맙), 항-IL12/IL23(예: 우스테키누맙), 항-CD19(예: 이네빌리주맙), 항-ITGF7 mAb(예: 에틀롤리주맙), 항-SOST mAb(예: 로모소주맙), 항-pKal mAb(예: 라나델루맙), 항-ITGA4(예: 나탈리주맙), 항-ITGA4B7(예: 베돌리주맙), 항-BLyS(예: 벨리무맙), 항-PD-1(예: 니볼루맙 및 펨브롤리주맙), 항-RANKL(예: 덴소맙), 항-PCSK9(예: 알리로쿠맙 및 에볼로쿠맙), 항-ANGPTL3(예: 에비나쿠맙*), 항-OxPL(예: E06), 항-fD(예: 람팔리주맙) 또는 항-MMP9(예: 안데칼리시맙)의 중쇄 Fab; 선택적으로 치료용 항체의 천연 형태와 동일한 이소형의 Fc 폴리펩타이드, 예컨대 IgG 이소형 아미노산 서열 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 이의 변형된 Fc; 및 항-VEGF(예: 세바시주맙, 라니비주맙, 베바시주맙 및 브롤루시주맙), 항-EpoR(예: LKA-651), 항-ALK1(예: 아스크린바쿠맙), 항-C5(예: 테시도루맙) 및 에쿨리주맙), 항-CD105 또는 항-ENG(예: 카로툭시맙), 항-CC1Q(예: ANX-007), 항-TNFα(예: 아달리무맙, 인플릭시맙 및 골리무맙), 항-RGMa(예: 엘레자누맙), 항-TTR(예: NI-301 및 PRX-004), 항-CTGF(예: 팜레블루맙), 항-IL6R(예: 사트랄리주맙 및 사릴루맙), 항-IL4R(예: 두필루맙), 항-IL17A(예: 익세키주맙 및 세쿠키누맙), 항-IL-5(예: 메폴리주맙), 항-IL12/IL23(예: 우스테키누맙), 항-CD19(예: 이네빌리주맙), 항-ITGF7 mAb(예: 에트롤리주맙), 항 -SOST mAb(예: 로모소주맙), 항-pKal mAb(예: 라나델루맙), 항-ITGA4(예: 나탈리주맙), 항-ITGA4B7(예: 베돌리주맙), 항-BLyS(예: 벨리무밥), 항-PD- 1(예: 니볼루맙 및 펨브롤리주맙), 항-RANKL(예: 덴소맙), 항-PCSK9(예: 알리로쿠맙 및 에볼로쿠맙), 항-ANGPTL3(예: 에비나쿠맙), 항-OxPL(예: E06), 항-fD (예: 람팔리주맙) 또는 항-MMP9(예: 안데칼리시맙)의 경쇄를 위한 핵산 서열 암호; 여기서 중쇄(Fab 및 선택적으로 Fc 영역) 및 경쇄는 자가 절단 푸린(F)/F2A 또는 푸린(F)/F2A 또는 가요성 링커에 의해 분리되어 동일한 양의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 발현을 보장한다.
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질환
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트랜스진
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| MPS I | 알파-L-이두로니다제(IDUA) |
| MPS II(헌터증후군) | 이두로네이트-2-설파타제(IDS) |
| 세로이드 리포푸신증(배턴병(Batten disease)) | (CLN1, CLN2, CLN10, CLN13), 가용성 리소좀 단백질(CLN5), 분비 경로에서의 단백질(CLN11), 막과 또한 주위에서 회?d된 2개의 세포질 단백질(CLN4, CLN14) 및 상이한 세포하 위치를 갖는 다수의 막관통 단백질(CLN3, CLN6, CLN7, CLN8, CLN12) |
| MPS IIIa(산필리포 타입 A 증후군(Sanfilippo type A Syndrome)) |
헤파란 설페이트(N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(SGSH) |
| MPS IIIB(산필리포 타입 B 증후군) | N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제(NAGLU) |
| MPS VI(마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy Syndrome)) | 아릴설파타제 B |
| 고세병(I형, II형 및 III형) | 글루코세레브로시다제, GBA1 |
| 파킨슨병 | 글루코세레브로시다제; GBA1 |
| 파킨슨병 | 도파민 데카복실라제 |
| 폼페병 | 산 말타제; GAA |
| 이염성 백질디스트로피(Metachromatic leukodystrophy) |
아릴 설파타제 A |
일부 실시형태에서, 항-VEGF Fab을 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, 항-VEGF Fab을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 더 구체적인 실시형태에서, 라니비주맙을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 이두로니다제를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, IDUA를 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 이두로네이트 2-설파타제(IDS)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, IDS를 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR)를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, LDLR을 암호화하는 rAAV8-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 트라이펩티딜 펩티다제 1(TPP1) 단백질을 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 구체적인 실시형태에서, TPP1을 암호화하는 rAAV9-기반 바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, VEGF 수용체 1(sFlt-1)의 비-막 연관 스플라이스 변이체를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터를 본원에 제공한다. 일부 실시형태에서, 감마-사르코글리칸, Rab Escort Protein 1(REP1/CHM), 레티노이드 이소메로하이드롤라제(RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC), 리소좀 관련 막 단백질 2 이소형 B(LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제( RPGR), 레티노스키신(RS1), 근소포체 칼슘(sarcoplasmic reticulum calcium) ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주 유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(AQP1), 디스트로핀, 마이크로디스트로핀, 미오투불라린 1(MTM1), 폴리스타틴(FST), 글루코스-6-포스파타제(G6Pase), 아포지단백 A2(APOA2), 우리딘 이인산 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1), 아릴설파타제 B(ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다아제(NAGLU), 알파-글루코시다아제(GAA), 알파-갈락토시다아제(GLA), 베타-갈락토시다아제(GLB1), 지질단백질 리파아제(LPL), 알파 1-항트립신(AAT), 포스포디에스테라아제 6B(PDE6B), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 9OTC), 생존 운동 뉴런(SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(NRTN), 뉴로트로핀-3(NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD), 신경 성장 인자 ( NGF), 미토콘드리아로 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자, 타이로신 키나아제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체를 암호화하는 rAAV 바이러스 벡터가 본원에 제공된다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 AAV 캡시드는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형 AAV 캡시드이다. 위형 rAAV 입자를 생산하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001) 참조.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2개 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형의 2종 이상의 AAV 캡시드 단백질의 키메라이다.
특정 실시형태에서, 단일 가닥 AAV(ssAAV)가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 자가-상보성 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol. 8, Number 16, Pages 1248-1254; 및 미국 특허 제6,596,535호, 제7,125,717호 및 제7,456,683호 참고, 이들 각각은 전문이 참조로 본원에 포함됨).
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 또는 AAV9로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 AAV 캡시드 혈청형을 갖는다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8, AAV9 캡시드 단백질의 유도체, 변형 또는 위형인 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9의 혈청형 또는 이들의 유도체, 변형 또는 위형의 AAV 캡시드 단백질을 갖는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등만큼 동일한, 즉, 최대 100% 동일한 AAV9 캡시드 단백질을 포함한다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 모자이크 캡시드를 포함한다. 모자이크 AAV 입자는 AAV의 상이한 혈청형에서 유래한 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물로 구성된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20 및 AAVrh.74로부터 선택된 혈청형의 캡시드 단백질을 함유하는 모자이크 캡시드를 포함한다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 rAAV 입자는 (a) AAV ITR을 포함하는 핵산 벡터 및 (b) AAVx(예: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16)로부터 유도된 캡시드 단백질로 구성된 모자이크 캡시드를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20 및 AAVrh.74로부터 선택된 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 구성된 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질을 함유하는 위형 rAAV 입자를 포함한다. 추가 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질로 구성된 위형 rAAV 입자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 위형 rAAV8 또는 rAAV9 입자는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 위형 입자이다. 위형 rAAV 입자를 생산하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001) 참조.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 2종 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질 키메라를 함유하는 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV. 7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 혈청형의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20 및 AAVrh.74로부터 선택된 AAV 혈청형의 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV. 7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 캡시드 단백질과, AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20 및 AAVrh.74로부터 선택된 하나 이상의 AAV 캡시드 혈청형의 캡시드 단백질의 AAV 캡시드 단백질 키메라를 포함한다.
rAAV 입자의 단리 방법
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 불순물을 포함하는 공급물(예: rAAV 생산 배양물)로부터 rAAV 입자를 단리하는 것을 포함하는, 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 제제를 생산하는 방법은 (a) 불순물을 포함하는 공급물(예: rAAV 생산 배양물) 로부터 rAAV 입자를 분리하는 단계 및 (b) 분리된 rAAV 입자를 제형화하여 제제를 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 불순물을 포함하는 공급물(예: rAAV 생산 배양물)로부터 rAAV 입자를 단리하는 단계를 포함하는, 단리된 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자를 포함하는 제제의 약학적 단위 투여량을 생산하고 단리된 rAAV 입자를 제형화하는 방법을 더 제공한다.
단리된 rAAV 입자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자를 단리하는 방법은 하류 가공, 예를 들어 세포 배양물의 수거, 수거된 세포 배양물의 정화(예: 원심분리 또는 심층 여과에 의한), 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 멸균 여과 또는 이들의 임의의 조합(들)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, 수거된 세포 배양물의 정화(예: 원심분리 또는 심층 여과에 의한), 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 멸균 여과 중 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 적어도 6개를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 세포 배양물의 수거, 수거된 세포 배양물의 정화(예: 심층 여과에 의한), 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 수거된 세포 배양물의 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 수거된 세포 배양물의 심층 여과에 의한 정화, 멸균 여과, 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하류 가공은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 rAAV 입자를 단리하는 방법은 세포 배양물의 수거, 수거된 세포 배양물의 정화(예: 심층 여과에 의한), 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예: 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 아민 리간드를 사용하는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV 입자를 분리하는 방법은 세포 배양물의 수거, 수거된 세포 배양물의 정화(예: 심층 여과에 의한), 제1 멸균 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예: 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 아민 리간드를 사용하는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 rAAV 입자를 단리하는 방법은 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예: 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 아민 리간드를 사용하는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV 입자를 단리하는 방법은 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예: 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 아민 리간드를 사용하는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 rAAV 입자를 단리하는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예: 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 아민 리간드를 사용하는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 rAAV 입자를 단리하는 방법은 심층 여과에 의한 수거된 세포 배양물의 정화, 제1 멸균 여과, 제1 접선 유동 여과, 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피(예: 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 또는 4급 아민 리간드를 사용하는 AEX 크로마토그래피), 제2 접선 유동 여과 및 제2 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 원심분리를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV8 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함한다.
형질주입, 안정적인 세포주 생산 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드 및 바쿨로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 비롯한 다수의 방법이 rAAV 입자의 생산을 위해 당업계에 공지되어 있다. 이들 중 임의의 것은 본원에 개시된 방법을 실행하는 데 사용될 수 있다. rAAV 바이러스 입자 생산을 위한 rAAV 생산 배양물은, (1) 예를 들어, 인간-유래 세포주, 예컨대, HeLa, A549 또는 HEK293 세포 및 이들의 유도체(HEK293T 세포, HEK293F 세포), 포유동물 세포주, 예컨대, Vero 또는 곤충-유래 세포주, 예컨대, 바쿨로바이러스 생산 시스템의 경우 SF-9를 포함하는 적합한 숙주 세포; (2) 야생형 또는 돌연변이체 아데노바이러스(예: 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 바쿨로바이러스에 의해 제공되는, 적합한 헬퍼 바이러스 기능 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 작제물; (3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; (4) AAV ITR 서열이 측접된 트랜스진(예: 치료용 트랜스진); 및 (5) rAAV 생산을 지원하는 적합한 배지 및 배지 성분이 모두 필요하다. 당업계에 공지된 적합한 배지가 rAAV 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 이들 배지는 비제한적으로 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제6,723,551호에 기재된 바와 같은 MEM(Modified Eagle Medium), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 및 Sf-900 II SFM 배지를 포함한 Hyclone Laboratories 및 JRH에 의해 생산된 배지를 포함한다.
rAAV 생산 배양물은 사용될 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(다양한 온도 범위에 걸쳐, 다양한 시간 길이 등) 하에서 일상적으로 성장될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, rAAV 생산 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 롤러 보틀, 중공 섬유 필터, 마이크로캐리어 및 패킹층 또는 유동층 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생산물은 또한 현탁-개작 숙주 세포, 예컨대, HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예: HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포와 같은 현탁-적응 숙주 세포를 포함한다. 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포를 포함할 수 있고, 이것은 예를 들어, 스피너 플라스크, 교반 탱크 생물반응기 및 웨이브 백(Wave bag) 시스템과 같은 일회용 시스템을 포함하는 다양한 방식으로 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 현탁 배양에서 성장에 적합한 HEK293 세포를 포함한다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제20120122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 현탁 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양물은 고밀도 세포 배양물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 약 1x10E+06 세포/ml 내지 약 30x10E+06 세포/ml의 총 세포 밀도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포의 약 50% 이상이 생존 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예: HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포 또는 SF-9 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 HEK293 세포이다. 추가 실시형태에서, 세포는 현탁 배양에서 성장에 적합한 HEK293 세포이다.
제공된 방법의 추가 실시형태에서, rAAV 생산 배양물은 rAAV 입자를 포함하는 현탁 배양을 포함한다. 예를 들어, 각각 전문이 참조에 의해 본원에 포함된 미국 특허 제6,995,006호, 제9,783,826호 및 미국 특허 출원 공개 제2012/0122155호에 개시된 배양을 포함한, 다수의 현탁 배양이 rAAV 입자의 생산을 위해서 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양은 포유동물 세포 또는 곤충 세포의 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양물은 HeLa 세포, HEK293 세포, HEK293 유래 세포(예: HEK293T 세포, HEK293F 세포), Vero 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, CHO 유래 세포, EB66 세포, BSC 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, BHK 세포, 3T3 세포, 293 세포, RK 세포, Per.C6 세포, 닭 배아 세포 또는 SF-9 세포의 배양을 포함한다. 일부 실시형태에서, 현탁 배양은 HEK293 세포의 배양을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자의 생산 방법은 rAAV를 생산할 수 있는 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 단계; 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 최종 농도로 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제를 세포 배양물에 추가하는 단계; 및 rAAV 입자의 생산을 허용하는 조건에서 세포 배양물을 유지하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 억제제는 단쇄 지방산 또는 이의 염을 포함한다. 일부 실시형태에서, HDAC 억제제는 부티레이트(예: 부티르산 나트륨), 발프로에이트(예: 발프로산 나트륨), 프로피오네이트(예: 프로피온산 나트륨) 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 제WO 2020/033842호에 개시된 바와 같이 생산되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
재조합 AAV 입자는 숙주 세포를 포함하는 생산 배양물의 수거에 의해 또는 생산 배양물로부터 소비된 배지의 수거에 의해 rAAV 생산 배양물로부터 수거될 수 있다. 단, 세포는 rAAV 입자가 무손상 숙주 세포로부터의 배지로 방출되는 당업계에 공지된 조건에서 배양되어야 한다. 재조합 AAV 입자는 또한 생산 배양물의 숙주 세포의 용해에 의해 rAAV 생산 배양물로부터 수거될 수 있다. 적합한 세포 용해 방법이 또한, 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 다중 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유동화 및 세제 및/또는 프로테아제와 같은 화학물질 처리를 포함한다.
수거 시, rAAV 생산 배양물은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다. (1) 숙주 세포 단백질; (2) 숙주 세포 DNA; (3) 플라스미드 DNA; (4) 헬퍼 바이러스; (5) 헬퍼 바이러스 단백질; (6) 헬퍼 바이러스 DNA; 및 (7) 예를 들어, 혈청 단백질, 아미노산, 트랜스페린 및 기타 저분자량 단백질을 포함하는 배지 성분. rAAV 생산 배양물은 생성물-관련 불순물, 예를 들어 불활성 벡터 형태, 빈 바이러스 캡시드, 응집된 바이러스 입자 또는 캡시드, 잘못 접힌 바이러스 캡시드, 분해된 바이러스 입자를 추가로 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양 수거물을 정화시켜 숙주 세포 부스러기를 제거한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양 수거물은 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해 정화된다. 정화는 또한 당업계에 공지된 0.2 mm 이상의 공극 크기의 임의의 셀룰로스 아세테이트 필터를 통한 원심분리 또는 여과와 같은 당업계에 공지된 다양한 다른 표준 기술에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 멸균 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생산 배양 수거물은 원심분리에 의해 정화된다. 일부 실시형태에서, 생산 배양 수거물의 정화는 원심분리를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 여과를 사용하여 정화된다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 심층 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물의 정화는 심층 여과와 멸균 여과를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 1종 이상의 상이한 여과 매질을 포함하는 필터 트레인(filter train)을 사용하여 정화된다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 심층 여과 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 1종 이상의 심층 여과 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 2종의 심층 여과 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 멸균 여과 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 2종의 심층 여과 매질과 멸균 여과 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 필터 매질은 다공성 심층 필터이다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC 및 멸균 등급 필터 매질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 필터 트레인은 Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC 및 Sartopore® 2 XLG 0.2 μm을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 심층 필터와 접촉하기 전에 전처리된다. 일부 실시형태에서, 전처리는 수거된 세포 배양물에 염을 추가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전처리는 수거된 세포 배양물에 화학 응집제(chemical flocculent)를 추가하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수거된 세포 배양물은 심층 필터와 접촉하기 전에 전처리되지 않는다.
일부 실시형태에서, 생산 배양 수거물은 여과에 의해 정화되며, 제WO 2019/212921호에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, rAAV 생산 배양 수거물은 생산 배양물에 존재하는 고분자량 DNA를 분해하기 위해 뉴클레아제(예: Benzonase®) 또는 엔도뉴클레아제(예: Serratia marcescens의 엔도뉴클레아제)로 처리된다. 뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제 분해는 당업계에 공지된 표준 조건에서 통상적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 분해는 30분 내지 몇 시간 동안 상온에서 37℃ 범위의 온도에서 Benzonase®의 1~2.5 단위/ml의 최종 농도에서 수행된다.
멸균 여과는 멸균 등급 필터 매질을 사용하는 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 또는 0.22 ㎛ 공극 필터이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 폴리에터설폰(PES)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 폴리비닐리덴 플로라이드(PVDF)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.8 μm 프리-필터 및 0.2 μm 최종 필터 막의 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 1.2 μm 프리-필터 및 0.2 μm 최종 필터 막의 친수성 불균질 이중층 설계를 갖는다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 또는 0.22 ㎛ 공극 필터이다. 추가 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 0.2 ㎛ 공극 필터이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 Sartopore® 2 XLG 0.2 ㎛, DuraporeTM PVDF 멤브레인 0.45 ㎛, 또는 Sartoguard® PES 1.2 ㎛ + 0.2 ㎛ 공칭 공극 크기 조합이다. 일부 실시형태에서, 멸균 등급 필터 매질은 Sartopore® 2 XLG 0.2 μm이다.
일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 크로마토그래피 매질, 예를 들어 친화도 크로마토그래피 매질에 적용되기 전에 접선 유동 여과("TFF")를 통해 농축된다. TFF 한외여과를 사용하는 바이러스의 대규모 농축은 Paul et al., Human Gene Therapy 4:609-615 (1993)에 설명되어 있다. 정화된 공급물의 TFF 농축은 기술적으로 관리 가능한 양의 정화된 공급물을 크로마토그래피에 적용할 수 있게 하고 긴 재순환 시간 없이도 컬럼의 더 타당한 크기 설정을 허용한다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 2배 내지 적어도 10배로 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 10배 내지 적어도 20배로 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 적어도 20배 내지 적어도 50배로 농축된다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 약 20배로 농축된다. 당업자는 또한 정용여과를 통해 정화된 공급물로부터 소분자 불순물(예: 배지 성분, 혈청 알부민 또는 다른 혈청 단백질을 포함하는 세포 배양 오염물)을 제거하기 위해 TFF를 사용할 수도 있음을 인지할 것이다. 일부 실시형태에서, 정화된 공급물은 소분자 불순물을 제거하기 위해 정용여과된다. 일부 실시형태에서, 정용여과는 약 3 내지 약 10 정용여과 부피의 완충제 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 정용여과는 약 5 정용여과 부피의 완충제 사용을 포함한다. 당업자는 또한 TFF가 정제 공정의 다음 단계를 수행하기 전에 완충액을 교환하는 것이 바람직한 정제 공정의 임의의 단계에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 정화된 공급물로부터 rAAV를 단리하는 방법은 완충액을 교환하기 위한 TFF의 사용을 포함한다.
친화도 크로마토그래피를 사용하여 조성물로부터 rAAV 입자를 단리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피는 정화된 공급물로부터 rAAV 입자를 단리하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피는 접선 유동 여과에 적용된 정화된 공급물로부터 rAAV 입자를 분리하는 데 사용된다. 적합한 친화도 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있고 제한 없이 AVB SepharoseTM, POROSTM CaptureSelectTM AAVX 친화도 수지, POROSTM CaptureSelectTM AAV9 친화도 수지 및 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화도 수지를 포함한다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROSTM CaptureSelectTM AAV9 친화도 수지이다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROSTM CaptureSelectTM AAV8 친화도 수지이다. 일부 실시형태에서, 친화도 크로마토그래피 매질은 POROSTM CaptureSelectTM AAVX 친화도 수지이다.
음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 조성물로부터 rAAV 입자를 단리할 수 있다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 최종 농축 및 폴리시(polish) 단계로서 친화도 크로마토그래피 후에 사용된다. 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 당업계에 공지되어 있고 제한 없이, UNOsphereTM Q(Biorad, Hercules, CA) 및 N-하전된 아미노 또는 이미노 수지, 예컨대, POROSTM 50 PI 또는 임의의 DEAE, TMAE, 3차 또는 4차 아민 또는 당업계에 공지된 PEI계 수지(미국 특허 제6,989,264호; Brument et al., Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); Gao et al., Hum. Gene Therapy11:2079-2091(2000))을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 4차 아민을 포함한다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 매질은 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 일부 실시형태에서, 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 글리시딜메타크릴레이트-에틸렌디메타크릴레이트 또는 스타이렌-다이바이닐벤젠 중합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIMmultusTM QA-1 Advanced Composite Column(4차 아민), CIMmultusTM DEAE-1 Advanced Composite Column(디에틸아미노), CIM® QA Disk(4차 아민), CIM® DEAE 및 CIM® EDA Disk(에틸렌 디아미노)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIMmultusTM QA-1 Advanced Composite Column(4차 아민)이다. 일부 실시형태에서, 모노리스 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIM® QA Disk(4차 아민) 이다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 CIM QA(BIA Separations, Slovenia)이다. 일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 매질은 BIA CIM® QA-80(컬럼 부피는 80 mL임)이다. 당업자는 상류 정제 단계에 의해 도입될 수 있는 불순물을 포함하나 이에 제한되지 않는 불순물이 제거되는 동안 rAAV가 수지에 결합된 채로 남아 있도록 하는 적합한 이온 농도의 세척 완충액이 식별될 수 있음을 이해할 수 있다.
일부 실시형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피는 제WO 2019/241535호에 개시된 방법에 따라 수행되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자를 단리하는 방법은 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물에서 벡터 게놈 역가, 캡시드 역가 및/또는 전체 캡시드 대 빈 캡시드의 비를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터 게놈 역가는 정량적 PCR(qPCR) 또는 디지털 PCR(dPCR) 또는 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 캡시드 역가는 혈청형-특이적 ELISA에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 전체 캡시드 대 빈 캡시드의 비는 Analytical Ultracentrifugation(AUC) 또는 Transmission Electron Microscopy(TEM)에 의해 결정된다.
일부 실시형태에서, 벡터 게놈 역가, 캡시드 역가 및/또는 가득 찬 캡시드 대 빈 캡시드의 비는 분광광도계에 의해, 예를 들어 260 nm에서 조성물의 흡광도 측정 및 280 nm에서 조성물의 흡광도 측정으로 결정된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 조성물의 흡광도를 측정하기 전에 변성되지 않는다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 조성물의 흡광도를 측정하기 전에 변성된다. 일부 실시형태에서, 260 nm 및 280 nm에서 조성물의 흡광도는 분광광도계를 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 260 nm 및 280 nm에서 조성물의 흡광도는 HPLC를 사용하여 결정된다. 일부 실시형태에서, 흡광도는 피크 흡광도이다. 260 nm 및 280 nm에서 조성물의 흡광도를 측정하기 위한 여러 방법이 당업계에 공지되어 있다. 단리된 재조합 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 벡터 게놈 역가 및 캡시드 역가를 결정하는 방법은 제WO 2019/212922호에 개시되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
추가 실시형태에서 본 개시내용은 본원에 개시된 방법에 따라 생산된 단리된 rAAV 입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합한 생물학적으로 허용 가능한 제형, 기체, 액체 또는 고체 또는 이들의 혼합물을 의미한다. "약학적으로 허용 가능한" 조성물은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 물질이 아닌 물질이며, 예를 들어 이 물질은 실질적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않고 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 이러한 약학적 조성물은 예를 들어 개시된 방법에 따라 단리된 rAAV를 대상체에게 투여하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 약학적 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달과 양립성인 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀션(예: 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르(elixir), 분산 및 현탁 배지, 코팅, 등장제 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액에는 현탁제 및 증점제가 포함될 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 정제(코팅 또는 비코팅), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 분말, 과립 및 결정을 포함한다. 보충 활성 화합물(예: 보존제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)도 조성물에 포함될 수 있다. 약학적 조성물은 본원에 기술되거나 당업자에게 공지된 바와 같이 특정 투여 또는 전달 경로와 양립하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 본 발명의 rAAV 입자와 방법 및 용도에 적합한 약학적 조성물 및 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa.; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, Md.; and Poznansky et al., Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y., pp. 253-315 참조).
일부 실시형태에서, 조성물은 약학적 단위 용량이다. "단위 용량"은 치료 대상체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 말하며, 각각의 단위는 1회 이상의 용량으로 투여되는 경우 원하는 효과(예: 예방 또는 치료 효과)를 생산하도록 계산된 선택적으로 약학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 회합된 미리 결정된 양을 함유한다. 단위 용량 형태는 예를 들어 액체 조성물 또는 동결 건조 또는 동결건조 상태의 조성물을 포함할 수 있는 앰플 및 바이알 내에 있을 수 있으며; 예를 들어, 멸균 액체 담체는 생체내 투여 또는 전달 전에 추가될 수 있다. 개별 단위 용량 형태는 다회-용량 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 재조합 벡터(예: AAV) 서열, 플라스미드, 벡터 게놈 및 재조합 바이러스 입자 및 이들의 약학적 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단일 또는 다중 단위 투여 형태로 포장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 및 AAV.HSC16으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 혈청형은 AAV8이다. 일부 실시형태에서, AAV 캡시드 혈청형은 AAV9이다.
실시예
실시예 1 - 500L 생물반응기에서 단일 용량 일시적 형질주입-기반 공정의 AAV 생산성은 50 L 및 200 L 생물반응기를 사용하여 얻은 생산성의 48~60%였다.
유전자 치료 분야를 위한 세포 배양에서 아데노-연관 바이러스(AAV) 생산은 단순한 접착 플라스크에서 복잡한 접착 시스템, 현탁-기반 교반-탱크 생물반응기 공정으로 성장했다. 현탁 적응된(suspension adapted) HEK293 세포와 같은 포유동물 세포의 일시적 형질주입을 포함하는 많은 AAV 유전자 치료 생산 시스템이 존재한다. 그러나 현대 현탁 포유동물 생명공학 공정에 일반적으로 사용되는 대부분의 장비는 AAV의 대규모 일시적 생산을 위해 특별히 설계되지 않았다.
현탁 포유동물 세포 형질주입 공정에서 AAV를 생산하는 문제는 생물반응기 규모와 설계를 비교할 때 확장된다. 따라서, AAV 생산을 위한 현재의 생물반응기 시스템을 비교할 필요가 있다. 생물반응기 구성 및 혼합이 형질주입 및 AAV 생산에 미치는 영향을 비교했다. 50 L 내지 500 L의 생물반응기는 확장성과 공정 성능을 위해 최적화되었다. 세포 성장, 생존력 및 수거 역가에 대한 생물반응기 설정 및 전형적인 확장 인자의 효과를 다양한 규모에서 여러 유형의 생물반응기에 대해 비교했다.
AAV-A 벡터(AAV9 캡시드 포함)는 본원에 기재된 바와 같이 실질적으로 현탁 적응된 HEK293 세포의 일시적 형질주입을 통해 생산되었다. 간략하게, 현탁 적응된 HEK293 세포를 해동시키고 확장시켰다. 약 1.0-1.2x106 생존 세포/mL의 밀도로 현탁 적응된 HEK293 세포를 생물반응기에 시딩하였다. 72시간 ECD(Elapsed Culture Duration)에, 세포를 폴리에틸렌이민(PEI)과 아데노-바이러스 헬퍼 기능을 암호화하는 3개의 플라스미드, AAV-A 트랜스진 및 AAV9 Cap/Rep의 혼합물로 형질주입시켰다. 1:1.75 DNA:PEI 비를 사용하여 형질주입을 수행했다. 20 L, 200 L 및 500 L 생물반응기에 대한 형질주입 복합체 제조 방법 흐름도가 도 1~3에 나와 있다. DNA와 PEI는 인라인 믹서를 사용하여 혼합되었다. 추가된 형질주입 복합체의 부피는 세포 배양물 부피의 약 10%였다. 배양물의 상청액을 144~192시간, 예를 들어 형질주입 후 3~5일의 ECD에서 수거하였다. 얻어진 AAV-A 수율은 도 4에 제시되어 있다. 관련 역가는 당업계에서 통상적인 방법으로 결정하였다.
여러 생물반응기 공급업체(공급업체 A 또는 B)에 걸친 최대 500 L 규모의 1세대 프로세스는 생산 시작까지(예: 일시적 형질주입 단계까지) 세포 성장 매개변수가 선형임을 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 이는 P/V 및 팁(tip) 속도가 세포 성장을 위한 최적의 스케일링 매개변수임을 나타낸다. 생성기(production stage) 동안 세포 성장 및 생존력은 50 L 및 200 L 생물반응기에서 유사한 경향을 따랐다. 500 L에 대한 수거 VCD 및 생존율은 실제로 50 L 및 200 L보다 높았으며, 이는 낮은 형질주입 효율을 나타낸다. 두 개의 서로 다른 공급업체에서 테스트한 여러 생물반응기에서 유사한 세포 성장 및 생존력을 고려할 때, AAV-A의 500 L 생물반응기 생산성이 이전 4번의 생산 실행 평균을 기준으로 48~60%에 불과한 것과 50 L 및 200 L 생물반응기 생산성이 평균과 일치했다는 것은 놀라운 일이었다. 도 4.
실시예 2 - 복합체 형성 시간이 AAV 생산성에 영향을 미침
DNA:PEI 복합체 형성 시간은 형성된 복합체의 크기에 영향을 미치며, 이는 이어서 형질주입 효율에 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다. 도 5에서 볼 수 있듯이 복합체 형성 시간이 증가하면 더 큰 DNA:PEI 복합체가 형성된다. 공지된 방법을 사용하여 동적 광산란을 사용하여 복합체 크기를 측정했다.
AAV-A 생산성에 대한 증가된 복합체 형성 시간의 효과는 도 6의 실험 개요를 사용하여 테스트되었다. 간략하게, PEI 및 (3) 아데노-바이러스 헬퍼 기능을 암호화하는 플라스미드, AAV-A 트랜스진, AAV9 Cap/Rep의 42 L 형질주입 복합체는 인라인 믹서를 통해 DNA와 PEI를 함께 혼합하여 제조했다. 일단 혼합되면, 복합체가 형성된 형질주입을 인큐베이팅했다. 그런 다음 고정된 부피의 형질주입 복합체를 사전 결정된 시점(복합체 인큐베이션 시작 후 10, 20, 40, 60분)에 제거하고 생물반응기를 형질주입하고 플라스크를 진탕하는 데 사용했다.
도 7에서 볼 수 있듯이 복합체 형성 시간이 증가하면 AAV 생산성이 낮아진다. 이 실험의 결과는 형질주입 복합 시간이 증가함에 따라 형질주입 후 4일 및 5일째 GC 역가가 꾸준히 감소함을 보여준다.
실시예 3 - 단일 용량 및 분할 일시적 형질주입-기반 공정은 비슷한 AAV 생산성을 가졌다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 500 L 생물반응기를 사용하여 실시예 1에서 관찰된 더 낮은 AAV-A 생산성에 대한 가능한 설명은 짧은 작동 기간(30분)에 필요한 부피의 형질주입 복합체(500 L 생물반응기에 대해 42 L)의 혼합, 복합체 형성 및 추가에 대한 제약으로 인한 것이었다. 실시예 2에 나타낸 바와 같이, DNA:PEI 복합체의 크기는 시간이 지남에 따라 증가하고, 최적 크기 이상의 DNA:PEI 복합체를 사용하면 AAV-A 생산성이 낮아진다. 이러한 대량의 형질주입 복합체에 대한 복합체 인큐베이션 및 펌핑 시간이 잠재적으로 불만족스러웠다는 사실로 인해 ~30분의 짧은 작동 기회와 대량 형질주입 복합체(42 L)의 조합이 낮은 수율(예상치의 50~60%)을 초래한다는 가설을 세웠다.
분할 일시적 형질주입-기반 공정을 테스트하여 형질주입 공정을 단일 대용량 대신 세포 배양에 더 적은 부피의 형질주입 복합체를 혼합, 복합체 형성 및 추가하는 두 개 이상의 단계로 분할하여 형질주입 복합체 부피 및 짧은 작동 기회와 관련된 제약 조건을 제거할 수 있는지를 결정했다. 200 L 생물반응기 공정을 사용하여 단일 용량 및 분할 일시적 형질주입-기반 공정의 AAV-B(AAV8 캡시드 포함) 생산성을 결정했다. 단일 용량 일시적 형질주입-기반 공정은 실질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 분할 형질주입 기반 공정에 대한 형질주입 복합체 제조 방법 흐름도는 도 8에 도시되어 있다. 추가된 형질주입 복합체의 총 부피는 (~16L) 단일 용량 및 분할 형질주입 공정에서 실질적으로 동일했다. 단일 용량 공정이 한 단계에서 전체 부피를 혼합, 복합체 형성 및 추가하는 것을 포함하는 반면, 분할 형질주입 공정은 혼합, 복합화 및 ~8L 부피의 형질주입 복합체를 추가하는 두 단계를 사용했으며, 첫 번째 추가 단계를 완료한 후 15~30분에 두 번째 추가 단계가 시작되었다 배양물의 상청액을 168 시간 ECD, 즉 형질주입 후 4일의 ECD에 수거하였다. 얻은 AAV-B 수율은 도 9에 나와 있다. 분할 일시적 형질주입(Split Transient Transfection) 공정은 단일 용량의 형질주입 복합체를 사용한 실행과 유사한 역가를 산출했다. 이는 예를 들어 200 L 이상과 같은 대형 생물반응기에 대한 형질전환 복합체 부피의 제조 및 추가를 위한 짧은 작동 기회(30분)를 다루기 때문에 중요한 발견이었다. 형질주입 복합체를 더 작은 용량으로 분할하면 각 용량에 대해 30분 작동 기회 내에서 더 강력한 복합체 인큐베이션 시간 및 펌프 유속을 사용할 수 있다.
실시예 4 - 분할 형질주입 복합체 용량은 AAV 생산성의 상당한 손실 없이 몇 시간 간격으로 추가될 수 있다.
분할 일시적 형질주입 공정의 견고성을 테스트하기 위해 AAV-B를 사용한 2 L 벤치 규모 실험을 수행했다. 목적은 분할 형질주입 복합체의 추가가 얼마나 떨어지더라도 여전히 동등한 GC 역가를 얻을 수 있는지 확인하는 것이었다. 형질주입 복합체의 분할 추가 사이의 시간 간격은 15분에서 6시간까지 다양했다. 세포 성장 및 생존력 경향은 시험된 조건에 대해 유사하였다(데이터는 표시되지 않음). 포도당 경향도 조건들 간에 유사했다(데이터는 표시되지 않음). L-글루타민 및 NH4+ 경향은 144시간의 ECD까지 테스트된 모든 조건에서 유사했다. 이 시점 이후에 형질주입 복합체의 분할 추가들 사이에 15분이 있는 생물반응기는 더 많은 L-글루타민을 소비하고 더 많은 NH4+를 생산했다. 이러한 차이는 생산에 부정적인 영향을 미치지 않았는데, 이는 이들 생물반응기가 형질주입 복합체의 분할 추가들 사이에 4시간 및 6시간으로 생물반응기보다 동등하고 일부 경우 더 높은 GC 역가를 가졌기 때문이다. 도 10. GC 역가에 약간 더 많은 가변성이 있었지만 형질주입 복합체의 분할 추가는 최대 6시간 간격으로 생물반응기에 추가될 수 있으며 여전히 예상 범위의 80~90% 이내의 역가를 생산한다.
실시예 5 - 500 L 생물반응기에서 분할 일시적 형질주입-기반 공정의 AAV 생산성은 50 L 및 200 L 생물반응기를 사용하여 얻은 생산성과 유사하다.
분할 일시적 형질주입 기반 공정의 AAV-B 생산성을 현탁 적응된 HEK293 클론을 사용하여 500 L 생물반응기에서 시험하였다. 분할 일시적 형질주입 기반 공정에 대한 형질주입 복합체 제조 방법 흐름도는 도 11에 나와 있다. 추가들 사이에 15~30분을 두고 2개의 ~21 L 형질주입 복합체 용량을 배양물에 추가하였다. 배양물의 상청액을 168시간 ECD, 예를 들어 형질주입 후 4일의 ECD에 수거하였다. 생산된 AAV-B의 상대 역가는 도 12에 제시되어 있다. 500 L 생물반응기 생산성은 "역사적 평균" 및 200 L 및 50 L 생물반응기에서 단일 용량 형질주입 공정을 사용하여 얻은 생산성 모두와 유사하였다.
실시예 6 - 2,000 L 공정의 200 L 규모 축소에서 분할 일시적 형질주입-기반 공정의 AAV-B 생산성.
2,000 L 분할 일시적 형질주입-기반 공정의 200 L 규모 축소에서 AAV-B 생산성을 200 L 생물반응기에서 테스트했다. 시드 트레인 배양 배지는 항응집제를 포함하였다. 형질주입 복합체 용량을 배양물에 추가하고 추가들 사이에 ~15분을 두었다. 공정 흐름도를 도 13에 나타내었다. 배양물의 상청액을 168시간 ECD, 예를 들어 형질주입 후 4일의 ECD에 수거하였다. 상청액의 역가는 ~6.25E+10이었다. 용해된 역가는 ~1.15E+11이었다.
실시예 7 - 2,000 L 분할 일시적 형질주입-기반 공정의 AAV-B 생산성.
일부 실시형태에서, 2,000 L 분할 일시적 형질주입 기반 공정은 4x ~42L 형질주입 복합체를 ~1600 L 세포 배양물(예: HEK 세포 배양물)을 포함하는 2,000 L 생물반응기로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 항응집제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 복합체는 인라인 믹서를 사용하여 희석된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 희석된 적어도 하나의 형질주입 시약을 혼합함으로써 생산될 것이며, 이 혼합은 희석된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 및 희석된 적어도 하나의 형질주입 시약을 2개의 별도 용기로부터 약 8 리터/분의 속도로 새 용기로 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형질주입 복합체는 생물반응기로 옮기기 전에 10분 내지 20분(예: 10분 내지 15분) 동안 유지될 것이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 복합체는 약 5 L/분의 속도로 생물반응기로 전달될 것이다. 일부 실시형태에서, 형질주입 복합체의 각 배치(batch)는 30분 이내에 생물반응기로 전달될 것이다. 일부 실시형태에서, 한 배치의 형질주입 복합체의 전달을 완료하는 것과 다음 배치의 형질주입 복합체의 전달을 시작하는 사이에 10~20분(예: ~15분)의 간격이 있을 것이다.
개시된 방법은 현재 가장 실용적이고 바람직한 실시예로 간주하는 것과 관련하여 설명되었지만, 개시에 포함된 방법은 개시된 실시예에 제한되지 않고, 반대로, 첨부된 청구범위의 사상 및 범주에 포함된 다양한 변형 및 등가의 배열을 포함하도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원, 인터넷 사이트 및 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 둘 다를 포함한 수탁 번호/데이터베이스 서열은 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트 또는 수탁 번호/데이터베이스 서열이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조에 의해 그렇게 제시된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해서 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
Claims (58)
- 재조합 바이러스 입자의 생산 방법에서,
a) 상기 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 상기 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 상기 현탁 배양물로 옮겨 상기 세포를 형질주입하는 단계;
c) 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 상기 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 상기 현탁 배양물로 옮겨 상기 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 상기 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 상기 형질주입된 세포를 포함하는 상기 세포 배양물을 유지하는 단계를 포함하며,
(i) 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고;
(ii) 상기 b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료되고;
(iii) 상기 b) 단계 및 c) 단계의 전달은 약 6시간 이내의 기간에 걸쳐 수행되고; 및
(iv) 상기 b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행되는, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 제1항에서,
상기 c) 단계를 1회 더 반복하는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 제1항에서,
상기 c) 단계를 1회 이상 더 반복하는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 제1항에서,
상기 c) 단계를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 반복하는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서,
상기 현탁 배양물로 전달되는 상기 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 상기 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 5% 내지 약 20%인 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서,
상기 c) 단계의 전달은 상기 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분 사이에 시작되는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서,
상기 c) 단계의 전달은 상기 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작되는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산 방법. - 상기 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법에서,
a) 상기 재조합 바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포 집단을 포함하는 약 200 리터 내지 약 20,000 리터의 현탁 세포 배양물을 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제1 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 상기 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 상기 현탁 배양물로 옮겨 상기 세포를 형질주입하는 단계;
c) 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 상기 적어도 하나의 형질주입 시약과 혼합하여 제2 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 인큐베이팅하여 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 형성하고, 상기 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 상기 현탁 배양물로 옮겨 상기 세포를 형질주입하는 단계; 및
d) 상기 재조합 바이러스 입자의 생산을 허용하는 조건에서 상기 형질주입된 세포를 포함하는 상기 세포 배양물을 유지하는 단계를 포함하며,
(i) 상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 유전자를 함유하고;
(ii) 상기 b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 60분 미만에 완료되고;
(iii) 상기 b) 단계 및 c) 단계의 전달은 약 6시간 이내의 기간에 걸쳐 수행되고; 및
(iv) 상기 b) 단계와 c) 단계의 전달은 동시에 또는 임의의 순서로 연속하여 수행되는, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제8항에서,
상기 c) 단계를 1회 더 반복하는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제8항에서,
상기 c) 단계를 1회 이상 더 반복하는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제8항에서,
상기 c) 단계를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 반복하는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에서,
상기 현탁 배양물로 전달되는 상기 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체의 합한 부피는 상기 a) 단계의 현탁 세포 배양물의 약 5% 내지 약 20%인 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에서,
상기 c) 단계의 전달은 상기 b) 단계의 전달 완료 후 약 5분 내지 약 60분 사이에 시작되는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에서,
상기 c) 단계의 전달은 상기 b) 단계의 전달 완료 후 약 60분 이내에 시작되는 것인, 재조합 바이러스 입자의 생산을 증가시키는 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에서,
상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드와 적어도 하나의 형질주입 시약을 혼합하는 단계는 인라인 믹서에 의해 수행되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서,
상기 b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 30분 미만에 완료되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에서,
상기 b) 단계 및 c) 단계의 혼합, 인큐베이팅 및 전달은 각각 약 35분 미만에 완료되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서,
상기 b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 각각 약 10 내지 약 20분 동안 수행되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에서,
상기 b) 단계 및 c) 단계의 인큐베이팅은 각각 약 10 내지 약 15분 동안 수행되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에서,
상기 적어도 하나의 형질주입 시약은 안정한 양이온성 고분자(cationic polymer)를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에서,
상기 적어도 하나의 형질주입 시약은 PEI를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 5,000 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 2,000 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 1,000 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 200 리터 내지 약 500 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 200 리터, 약 300 리터, 약 400 리터, 약 500 리터, 약 750 리터, 약 1,000 리터, 약 2,000 리터, 약 3,000 리터 또는 약 5,000 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 500 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 1,000 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물의 부피는 약 2,000 리터인 것인, 방법. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 집단은 포유동물 세포 또는 곤충 세포의 집단을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 집단은 포유동물 세포의 집단을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 집단은 HEK293 세포, HEK 유래 세포, CHO 세포, CHO 유래 세포, HeLa 세포, SF-9 세포, BHK 세포, Vero 세포 및/또는 PerC6 세포의 집단을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에서,
상기 세포의 집단은 HEK293 세포의 집단을 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에서,
상기 a) 단계에서 제공되는 현탁 세포 배양물은 약 2x10E+6 내지 약 10E+7 생존 세포/ml를 포함하는 것인, 방법. - 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 약 2일 내지 약 10일, 약 3일 내지 약 5일 또는 약 5일 내지 약 14일 동안 상기 재조합 바이러스 입자의 생산을 가능하게 하는 조건에서 유지되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일 동안 유지되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 적어도 약 3일 동안 유지되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 약 3일 동안 유지되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 약 4일 동안 유지되는 것인, 방법. - 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에서,
상기 재조합 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 입자 또는 재조합 렌티바이러스 입자인 것인, 방법. - 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에서,
상기 재조합 바이러스 입자는 rAAV 입자인 것인, 방법. - 제41항에서,
상기 rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV. 7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15 또는 AAV.HSC16 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인, 방법. - 제41항에서,
상기 rAAV 입자는 AAV8, AAV9, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1 또는 AAV.hu37 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인, 방법. - 제41항에서,
상기 rAAV 입자는 상기 AAV8 또는 AAV9 혈청형의 캡시드 단백질을 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에서,
상기 rAAV 입자는 트랜스진(transgene)을 포함하는 게놈을 포함하는 것인, 방법. - 제45항에서,
상기 트랜스진은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 조절 요소(regulatory element)를 포함하는 것인, 방법. - 제46항에서,
상기 조절 요소는 인핸서(enhancer), 프로모터(promotor) 및 polyA 영역 중 하나 이상을 포함하는 것인, 방법. - 제45항 또는 제46항에서,
상기 조절 요소 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이종(heterologous)인 것인, 방법. - 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에서,
상기 트랜스진은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 융합 단백질, Fc-융합 폴리펩타이드, 면역어드헤신(immunoadhesin), 면역글로불린, 조작 단백질, 단백질 단편 또는 효소를 암호화하는 것인, 방법. - 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에서,
상기 트랜스진은 항-VEGF Fab, 이두로니다제(IDUA), 이두로네이트 2-설파타제(IDS), 저밀도 지질단백질 수용체(LDLR), 트리펩티딜 펩티다제 1(TPP1) 또는 VEGF 수용체 1의 비-막(non-membrane) 연관 스플라이스 변이체(sFlt-1)를 암호화하는 것인, 방법. - 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에서,
상기 트랜스진은 감마-사르코글리칸, Rab Escort Protein 1(REP1/CHM), 레티노이드 이소메로하이드롤라제(RPE65), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 알파 3(CNGA3), 환식 뉴클레오타이드 게이팅형 채널 베타 3(CNGB3), 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC), 리소좀 관련 막 단백질 2 이소형 B(LAMP2B), 인자 VIII, 인자 IX, 색소 망막염 GTPase 조절제( RPGR), 레티노스키신(RS1), 근소포체 칼슘(sarcoplasmic reticulum calcium) ATPase(SERCA2a), 애플리버셉트(aflibercept), 바테닌(battenin)(CLN3), 막관통 ER 단백질(CLN6), 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase: GAD), 교질 세포주 유래 신경영양 인자(Glial cell line-derived neurotrophic factor: GDNF), 아쿠아포린 1(AQP1), 디스트로핀, 마이크로디스트로핀, 미오투불라린 1(MTM1), 폴리스타틴(FST), 글루코스-6-포스파타제(G6Pase), 아포지단백 A2(APOA2), 우리딘 이인산 글루쿠로노실 트랜스퍼라제 1A1(UGT1A1), 아릴설파타제 B(ARSB), N-아세틸-알파-글루코사미니다아제(NAGLU), 알파-글루코시다아제(GAA), 알파-갈락토시다아제(GLA), 베타-갈락토시다아제(GLB1), 지질단백질 리파아제(LPL), 알파 1-항트립신(AAT), 포스포디에스테라아제 6B(PDE6B), 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제 9OTC), 생존 운동 뉴런(SMN1), 생존 운동 뉴런(SMN2), 뉴투린(NRTN), 뉴로트로핀-3(NT-3/NTF3), 포르포빌리노겐 데아미나제(PBGD), 신경 성장 인자( NGF), 미토콘드리아로 암호화된 NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 코어 소단위 4(MT-ND4), 보호 단백질 카텝신 A(PPCA), 디스페를린, MER 원종양유전자, 타이로신 키나아제(MERTK), 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR) 또는 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)-면역글로불린(IgG1) Fc 융합체를 암호화하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제51항 중 어느 한 항에서,
상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는,
a) 패키징될 rAAV 게놈,
b) 패키징에 필요한 아데노바이러스 헬퍼 기능,
c) 패키징에 충분한 AAV rep 단백질, 및
d) 패키징에 충분한 AAV cap 단백질
을 암호화하는 것인, 방법. - 제52항에서,
상기 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 rAAV 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 AAV rep 단백질 및 상기 AAV cap 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 아데노바이러스 헬퍼 기능을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 방법. - 제52항 또는 제53항에서,
상기 아데노바이러스 헬퍼 기능은 아데노바이러스 E1a 유전자, E1b 유전자, E4 유전자, E2a 유전자 및 VA 유전자 중 적어도 하나를 포함하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에서,
상기 rAAV 입자를 회수하는 것을 더 포함하는, 방법. - 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 약 5x10e+10 GC/ml 내지 약 1x10e+12 GC/ml rAAV 입자를 생산하는 것인, 방법. - 제41항 내지 제56항 중 어느 한 항에서,
상기 세포 배양물은 동일한 부피의 폴리뉴클레오타이드:형질주입 시약 복합체를 혼합, 인큐베이팅 및 전달하는 단일 단계를 포함하는 기준 방법보다 GC/ml로 측정된 rAAV 입자를 적어도 약 2배 생산하는 것인, 방법. - 상기 제41항 내지 제57항 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 단리 rAAV 입자를 포함하는 조성물.
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