ES2644880T3 - Optimización de expresión de proteínas Rep y Cap parvovirales en las células de insecto - Google Patents

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Description

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Optimizacion de expresion de protefnas Rep y Cap parvovirales en las celulas de insecto Campo de la invencion
[0001] Esta invencion se refiere a la produccion de vectores de parvovirus, especialmente a la produccion de virus adeno-asociados recombinantes (rAAV) en las celulas de insecto, vectores de expresion baculovirales que comprenden un constructo de la invencion y una celula que comprende tal vector de expresion baculoviral.
Antecedentes de la invencion
[0002] El sistema de expresion de baculovirus es bien conocido por su uso como clonacion eucariotica y vector de expresion (rey, L.A., y F D. Possee, 1992, "The baculovirus expression system", Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., et al., 1992. Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual. Nueva York: W. H. Freeman.).
Las ventajas del sistema de expresion de baculovirus son entre otras que las protefnas expresadas son casi siempre solubles, correctamente plegadas y biologicamente activas.
Otras ventajas incluyen altos niveles de expresion de protefna, produccion mas rapida, idoneidad para la expresion de protefnas grandes e idoneidad para produccion a gran escala.
Sin embargo, en la produccion a gran escala o continua de protefnas heterologas utilizando el sistema de expresion de baculovirus en los biorreactores de celula de insecto, la inestabilidad de niveles de produccion, tambien conocida como el efecto de pasaje, es un gran obstaculo.
Este efecto es al menos en parte debido a la recombinacion entre secuencias homologas repetidas en el ADN baculoviral.
[0003] El sistema de expresion de baculovirus tambien se ha usado exitosamente para la produccion de vectores (AAV) de virus adeno-asociados recombinantes (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; US 6,723,551 y US 20040197895).
AAV se puede considerar como uno de los vectores virales mas prometedores para terapia genetica humana.
AAV tiene la capacidad de infectar eficazmente la division al igual que celulas humanas que no se dividen, el genoma vfrico AAV se integra en un sitio cromosomico unico en el genoma de la celula huesped, y lo mas importante, aunque AAV este presente en muchos seres humanos nunca se ha asociado a ninguna enfermedad.
En vista de estas ventajas, el virus adeno-asociado recombinante (rAAV) esta siendo evaluado en las pruebas clfnicas de terapia genetica para hemofilia B, melanoma maligno, fibrosis cfstica, hiperlipoproteinemia tipo I y otras enfermedades.
[0004] Para superar problemas con sistemas de producciones mamfferas para AAV Urabe et al. (2002; supra) desarrollo un sistema de produccion AAV en las celulas de insecto.
Para la produccion de AAV en las celulas de insecto algunas modificaciones fueron necesarias para conseguir la estequiometrfa correcta de las tres proteinas capsidas AAV (VP1, VP2 y VP3), que dependen de una combinacion de uso alterno de dos sitios de aceptor de empalme y la utilizacion suboptima de un aCg codon iniciador para VP2 que no esta reproducido con precision por celulas de insecto.
Para imitar la estequiometrfa correcta de las proteinas capsidas en las celulas de insecto Urabe et al. (2002; supra) se usa un constructo que se transcribe en un mensajero policistronico unico que es capaz de expresar todas las tres protefnas de vasopresina sin requerir empalme y donde el codon de inicio aguas arriba se sustituye por el codon de inicio suboptimo ACG.
La WO2007/046703 divulga otra mejora de la infectividad de la produccion basada en vectores rAAV producidos por baculovirus por optimizacion de la estequiometrfa de proteinas capsidas AAV como se ha producido en las celulas de insecto.
[0005] Para la expresion de las protefnas AAV Rep en el sistema de expresion de celula de insecto AAV como se ha desarrollado inicialmente por Urabe et al. (2002; supra), un constructo de baculovirus recombinante se usa que alberga dos unidades de expresion Rep independientes (una para Rep78 y un para Rep52), cada una bajo el control de un promotor de celula de insecto separado, los promotores ®IE1 y PolH, respectivamente.
Sin embargo, Kohlbrenner et al. (2005, Mol. Ther. 12: 1217-25; Wo 2005/072364) declaro que el constructo de baculovirus para la expresion de las dos protefnas Rep, como se ha usado por Urabe et al., padece de una inestabilidad inherente.
Por la separacion de la orientacion palfndroma de los dos genes Rep en el vector original Urabe y disenar dos vectores de baculovirus separados para la expresion Rep52 y Rep78, Kohlbrenner et al. (2005; supra) aumento la estabilidad de pasaje del vector.
Sin embargo, a pesar de la expresion que consiste en Rep78 y Rep52 de los dos constructos de baculovirus-Rep independientes en las celulas de insecto sobre al menos 5 pasajes, el rendimiento de vector rAAV es 5 a 10-pliegues inferior en comparacion con el constructo de baculovirus-Rep original disenado por Urabe et al. (2002, supra).
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[0006] En la aplicacion WO2007/148971, los presentes inventores han mejorado significativamente la estabilidad de produccion de vector rAAV en las celulas de insecto usando una secuencia codificante unica para las protefnas Rep78 y Rep52 donde un codon de inicio suboptimo se usa para la protefna Rep78 que es omitida parcialmente por el escaneado deribosomas para permitir la iniciacion de traduccion para tambien producirse en el codon de inicio aguas abajo de la protefna Rep52.
[0007] La solicitud de patente internacional WO 2007/084773 divulga un metodo de produccion rAAV en las celulas de insecto, donde la produccion de partfculas vfricas infecciosas se aumenta por la complementacion VP1 con respecto a VP2 y VP3.
La suplementacion se puede efectuar por la introduccion en la celula de insecto de una expresion de secuencias de nucleotidos que comprenden el vector de capsida VP1, VP2 y VP3 y adicionalmente introducion en la celula de insecto de una expresion de secuencias de nucleotidos VP1, que puede estar bien en el mismo vector capsida o en un vector diferente.
[0008] Sin embargo, todavfa hay una necesidad de otras mejoras en la produccion (comercial) a gran escala de vectores parvovirales en las celulas de insecto.
Asf es un objeto de la presente invencion proveer de medios y metodos que permiten una produccion de rendimiento elevado y estable (a gran escala) de vectores parvovirales y para la produccion que resulta en una proporcion de partfcula mejorada completa:vacfa (es decir, una proporcion superior de partfculas rellenadas).
Resumen de la invencion
[0009] La invencion se refiere a un metodo para la produccion de un virion parvoviral recombinante.
El uso de tal metodo puede permitir la produccion de tales viriones en valoraciones de produccion aumentadas.
El uso del metodo puede alternativamente, o adicionalmente, permitir la produccion con una proporcion superior de partfculas rellenadas, es decir, una proporcion completa: vacfa o proporcion total:completa mas favorable.
[0010] La invencion proporciona un metodo para la produccion de un virion parvoviral recombinante, cuyo metodo comprende los pasos de:
(a) proporcionar una celula de insecto que comprende uno o mas constructos de acidos nucleicos que comprende:
(i) una secuencia de nucleotidos que comprende un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion terminal invertida parvoviral;
(ii) un primer casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna Rep parvoviral que esta operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de dirigir la expresion de la protefna Rep en la celula de insecto;
(iii) un segundo casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina capsida parvoviral que esta operativamente enlazada a un segundo promotor que es capaz de dirigir la expresion de la proteina capsida en la celula de insecto;
(b) cultivo de la celula definido en (a) bajo una condicion propicia para la expresion de la protefna Rep y la proteina capsida; y,
(c) opcionalmente recuperacion del virion parvoviral recombinante;
donde los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en un constructo de acidos nucleicos unico y donde los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en la cantidad equimolar en la celula de insecto, donde el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor PolH, promotor p10 o promotor basico y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un promotor E1.
[0011] La invencion tambien proporciona:
- un constructo de acidos nucleicos que comprende un primer y un segundo casete de expresion tal como se ha definido anteriormente, donde:
(d) el primer promotor es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un E1;
(e) el primer promotor es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un E1; o y donde el primer casete de expresion opcionalmente comprende un elemento intensificador;
- una celula de insecto tal y como se define por arriba; y
- un equipo que comprende
(a) un constructo de acidos nucleicos que comprende el primer y segundo casete de expresion tal como se ha definido anteriormente; y
(b) un constructo de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un sitio de clonacion multiple para un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion terminal invertida parvoviral, donde el transgen esta operativamente enlazado a un promotor capaz de dirigir la expresion del transgen en una celula huesped.
Breve descripcion de las figuras
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La Figura 1 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD118(nueva).
La Figura 2 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD118(nueva)+HR1.
La Figura 3 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD165.
La Figura 4 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD165+HR1.
La Figura 5 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD165 + 4xEcRE Cap.
La Figura 6 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD165 + 4*EcRE Rep78.
La Figura 7 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD165 + deltaIE1 Cap.
La Figura 8 muestra una representacion esquematica de la construccion de deltaIE1 Cap + pPolh Rep (pVD190).
La Figura 9 muestra una representacion esquematica de la construccion de p10 de Cap + pPolh Rep.
La Figura 10 muestra una representacion esquematica de la construccion de pVD194.
La Figura 11A muestra analisis de electrotransferencia de protefnas Cap y Rep expresadas de Bac.VD194, tres dfas despues de la infeccion con las proporciones de baculovirus 1:1 y 5:1 (C=Bac.VD88:Bac.VD84:Bac.VD43 a 5:1:1 respectivamente).
La Figura 11B muestra las valoraciones vfricas para las mismas producciones analizadas en la figura 11A. Descripcion de la invencion Definiciones
[0013] Como se utiliza en este caso, el termino "operativamente enlazado" se refiere a una conexion de elementos de polinucleotido (o polipeptido) en una relacion funcional.
Un acido nucleico esta "operativamente enlazado" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acidos nucleicos.
Por ejemplo, una secuencia reguladora de transcripcion esta operativamente enlazada a una secuencia codificante si esta afecta a la transcripcion de la secuencia codificante.
Operativamente enlazado significa que las secuencias de ADN que estan enlazadas son contiguas tfpicamente y, donde es necesario para unir dos regiones de codificacion de protefna, contiguas y en el marco de lectura.
[0014] "Secuencia de control de expresion" se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que regula la expresion de una secuencia de nucleotidos a la que esta operativamente enlazada.
[0015] Una secuencia de control de expresion esta "operativamente enlazada" a una secuencia de nucleotidos cuando la secuencia de control de expresion controla y regula la transcripcion y/o la traduccion de la secuencia de nucleotidos.
Asf, una secuencia de control de expresion puede incluir promotores, potenciadores, sitios de introduccion de ribosoma interno (IRES), terminadores de transcripcion, un codon de inicio delante de un gen de codificacion de protefna, senal de empalme para intrones y codones de parada.
El termino "secuencia de control de expresion" se destina a incluir, como mfnimo, una secuencia cuya presencia esta disenada para influir en la expresion y tambien puede incluir componentes ventajas adicionales.
Por ejemplo, las secuencias lfder y secuencias de pareja de fusion son secuencias de control de expresion.
El termino puede tambien incluir el diseno de la secuencia de acidos nucleicos de manera que, codones de iniciacion indeseables potenciales dentro y fuera del bastidor se retiran de la secuencia.
Esto puede tambien incluir el diseno de la secuencia de acidos nucleicos de manera que se quiten los sitios de empalme potencial indeseable.
Incluye secuencias o secuencias de poliadenilacion (pA) que dirigen la adicion de una cola polyA, es decir, una cadena de residuos de adenina en el 3'-terminal de un ARNm, secuencias referidas como secuencias polyA.
Tambien se puede disenar para mejorar la estabilidad de ARNm.
Las secuencias de control de expresion que afectan a la transcripcion y estabilidad de traduccion, por ejemplo, promotores, al igual que las secuencias que efectuan la traduccion, por ejemplo, las secuencias Kozak, se conocen en las celulas de insecto.
Las secuencias de control de expresion pueden ser de tal naturaleza en cuanto a modular la secuencia de nucleotidos a la que estan operativamente enlazadas de manera que niveles de expresion inferiores o niveles de expresion mas altos se consiguen.
[0016] Como se utiliza en este caso, el termino "promotor" o "secuencia de regulacion de transcripcion" se refiere a un fragmento de acido nucleico que funciona para controlar la transcripcion de una o mas secuencias codificantes y esta localizada arriba con respecto a la direccion de transcripcion del sitio de iniciacion de transcripcion de la secuencia codificante y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de union para RNA-polimerasa que depende del ADN, sitios de iniciacion de transcripcion y cualquier otra secuencia de ADN, que incluya, pero no de forma limitada sitios de union de factor de transcripcion, represor y sitios de union a protefnas activadoras, y cualquier otra secuencia de nucleotidos conocida por un experto en la tecnica para actuar directamente o regular indirectamente la cantidad de transcripcion del promotor.
Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayorfa de tejidos bajo las mayores condiciones fisiologicas y de desarrollo.
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Un promotor "inducible" es un promotor que es fisiologicamente o de desarrollo regulado, por ejemplo por la aplicacion de un inductor qufmico.
Un promotor de "tejido especffico" solo es activo en tipos especfficos de tejidos o celulas.
[0017] "Identidad de secuencia" y "similaridad de secuencia" se puede determinar por alineamiento de dos peptidos o dos secuencias de nucleotidos que usan algoritmos de alineamiento globales o locales, dependiendo de la longitud de las dos secuencias.
Las secuencias de longitudes similares son preferiblemente alineadas utilizando unos algoritmos de alineamiento global (por ejemplo Needleman Wunsch) que alinean las secuencias optimamente sobre la longitud entera, mientras las secuencias de longitudes diferentes sustancialmente son preferiblemente alineadas utilizando un algoritmo de alineamiento local (por ejemplo Smith Waterman).
Las secuencias pueden luego denominarse "sustancialmente identicas" o "esencialmente similares" cuando estas (cuando se han alineado optimamente mediante por ejemplo los programas GAP o BESTFIT usando parametros por defecto) comparten al menos un determinado porcentaje mfnimo de identidad de secuencia (como se ha definido abajo).
GAP usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias sobre su longitud entera (longitud total), maximizando el numero de coincidencias y minimizando el numero de espacios.
Un alineamiento global se usa adecuadamente para determinar la identidad de secuencia cuando las dos secuencias tienen longitudes similares.
Generalmente, se usan los parametros por defecto GAP, con una penalizacion de creacion del espacio=50 (nucleotidos)/8 (protefnas) y penalizacion de extension del espacio=3 (nucleotidos) / 2 (protefnas).
Para los nucleotidos de la matriz de puntuacion por defecto usada es nwsgapdna y para las protefnas de la matriz de puntuacion por defecto es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89,915-919).
Los alineamientos de secuencia y puntuaciones para identidad de secuencia de porcentaje se pueden determinar utilizando los programas informaticos, tal como el paquete GCG Wisconsin, version 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA o usando el software de fuente abierta, tal como el programa "needle" (utilizando el algoritmo global Needleman Wunsch) o "water" (utilizando el algoritmo local Smith Waterman) en EmbossWIN version 2.10.0, usando los mismos parametros que para GAP de arriba o utilizando los ajustes por defecto (ambos para 'needle' y 'water' y ambos para alineamientos de protefna y de ADN, la penalizacion de apertura de espacio predeterminada es 10.0 y la penalizacion por extension de espacio predeterminada es 0.5; los matrices de puntuacion por defecto son Blossum62 para protefnas y DNAFull para ADN).
Cuando las secuencias tienen unas longitudes diferentes sustancialmente en general, los alineamientos locales, tal como aquellos que utilizan el algoritmo de Smith Waterman, son preferidos.
Alternativamente, la similitud de porcentaje o identidad se puede determinar por la busqueda contra las bases de datos publicas, usando algoritmos tal como FASTA, BLAST, etc.
[0018] Las secuencias de nucleotidos que codifican protefnas Cap y/o Rep parvovirales de la invencion tambien se pueden definir por su capacidad para hibridar con las secuencias de nucleotidos de la SEC ID del n° 20, 22,24 y 1 - 4, respectivamente, bajo condiciones moderadas o preferiblemente bajo hibridacion rigurosa.
[0019] Las condiciones de hibridacion rigurosa se definen aquf como condiciones que permiten una secuencia de acidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, preferiblemente aproximadamente 50 nucleotidos, 75 o 100 y de la forma mas preferible de aproximadamente 200 o mas nucleotidos, para hibridar a una temperatura de aproximadamente 65°C en una solucion que comprende aproximadamente 1 M sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable y lavada a 65°C en una solucion que comprende aproximadamente 0.1 M sal, o menos, preferiblemente 0.2 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable.
Preferiblemente, la hibridacion se realiza durante toda la noche, es decir, al menos durante 10 horas y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solucion de lavado. Estas condiciones normalmente permitiran la hibridacion especffica de las secuencias con aproximadamente 90% o mas identidad de secuencia.
[0020] Las condiciones moderadas se definen aquf como condiciones que permiten unas secuencias de acidos nucleicos de al menos 50 nucleotidos, preferiblemente de aproximadamente 200 o mas nucleotidos, para hibridar a una temperatura de aproximadamente 45°C en una solucion que comprende aproximadamente 1 M sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable, y lavado a temperatura ambiente en una solucion que comprende aproximadamente 1 M sal, preferiblemente 6 x SSC o cualquier otra solucion con una fuerza ionica comparable.
Preferiblemente, la hibridacion se realiza durante toda la noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferiblemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solucion de lavado. Estas condiciones normalmente permitiran la hibridacion especffica de secuencias con hasta 50% de identidad de secuencia.
El experto en la tecnica sera capaz de modificar estas condiciones de hibridacion para especfficamente identificar secuencias variables en identidad entre 50% y 90%.
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[0021] Un "vector" es una molecula de acido nucleico (tfpicamente ADN o ARN) que sirve para transferir una secuencia de acidos nucleicos pasajeros (es decir, ADN o aRn) en una celula huesped.
Tres tipos comunes de vectores incluyen plasmidos, fagos y virus.
Preferiblemente, el vector es un virus.
Los vectores que contienen ambos un promotor y un sitio de clonacion en que un polinucleotido se puede enlazar operativamente se conocen en la tecnica. Tales vectores son capaces de la transcripcion ARN in vitro o in vivo, y estan disponibles comercialmente de fuentes tal como Stratagene (La Jolla, Calif.) y Promega Biotech (Madison, Wis.).
Para optimizar la expresion y/o transcripcion in vitro, puede ser necesario eliminar, anadir o alterar 5' y/o 3' partes no traducidas de los clones para eliminar codones de iniciacion de traduccion alternativos inapropiados extra potenciales u otras secuencias que pueden interferir con o reducir la expresion, bien en el nivel de transcripcion o traduccion.
Alternativamente, los sitios de union de ribosoma de consenso se pueden insertar inmediatamente 5' del codon de inicio para mejorar la expresion.
[0022] Un "vector viral" se refiere a un vector que comprende alguno o todos los siguientes: genes vfricos que codifican un producto genico, secuencias de control y secuencias de embalaje vfricas.
[0023] Un "vector parvoviral" se define como un parvovirus recombinantemente producido o partfcula parvoviral que comprende un polinucleotido para entregar en una celula huesped, bien in vivo, ex vivo o in vitro.
Ejemplos de vectores parvovirales incluyen por ejemplo, vectores de virus adeno-asociados.
Aquf, una construccion de vector parvoviral se refiere al polinucleotido que comprende el genoma vfrico o parte del mismo, y un transgen.
[0024] La capacidad de adaptacion de una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima al uso de codon de una celula huesped se puede expresar como fndice de adaptacion de codon (CAI).
El fndice de adaptacion de codon se define aquf como una medicion de la adaptacion relativa del uso de codon de un gen hacia el uso de codon de genes expresados altamente en una celula huesped particular u organismo.
La capacidad de adaptacion relativa (w) de cada codon es la proporcion del uso de cada codon, a aquel del codon mas abundante para el mismo aminoacido.
El fndice CAI se define como la media geometrica de estos valores de capacidad de adaptacion relativos.
Los codones no sinonimos y codones de terminacion (dependiendo del codigo genetico) se excluyen.
Los valores CAI varian de 0 a 1, con valores mas altos que indican una proporcion mas alta de los codones mas abundantes (ver Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; tambien ver: Jansen et al, 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51).
[0025] El termino "indicador" (o gen reportero o protefna) se usa principalmente para referirse a secuencias de nucleotidos que codifican protefnas de marcador visibles, tales como (GFP), eGFP, otras protefnas fluorescentes, luciferasa, fosfatasa alcalina segregada (SEAP), GUS y similar, al igual que marcadores nptll y similares
Descripcion detallada de la invencion
[0026] La presente invencion se refiere al uso de parvovirus, en particular dependovirus tal como humano infeccioso o AAV sfmico y sus componentes (por ejemplo, un genoma de parvovirus) para uso como vectores para introduccion y/o expresion de acidos nucleicos en celulas mamfferas, preferiblemente celulas humanas.
En particular, la invencion se refiere a mejoras en la productividad de tales vectores parvovirales cuando se ha producido en las celulas de insecto.
[0027] La productividad en este contexto abarca mejoras en las valoraciones de produccion y mejoras en la calidad del producto resultante, por ejemplo un producto que ha mejorado una proporcion total:completa (una medida del numero de partfculas que comprende acido nucleico).
Es decir, el producto final puede tener una proporcion aumentada de partfculas llenas, donde llenas implica que la partfcula comprende acido nucleico.
[0028] Virus de la familia Parvoviridae son virus de ADN pequeno.
La familia Parvoviridae se puede dividir entre dos subfamilias: la Parvovirinae, que infecta los vertebrados y la Densovirinae, que infecta invertebrados, incluyendo insectos.
Los miembros de la subfamilia Parvovirinae se refieren aquf como los parvovirus e incluyen el genero Dependovirus. Como se puede deducir del nombre de su genero, los miembros del Dependovirus son unicos en el hecho de que estos normalmente requieren coinfeccion con un virus auxiliar tal como adenovirus o virus herpes para infeccion productiva en el cultivo celular.
El genero Dependovirus incluye AAV, que infecta normalmente seres humanos (por ejemplo, serotipos 1, 2,3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4), y virus relativos que infectan otros animales de sangre caliente (por ejemplo, bovino, canino, equino y virus ovinos adeno-asociados).
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Otra informacion en parvovirus y otros miembros del Parvoviridae esta descrita en Kenneth I. Bernas, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in Fields Virology (3d Ed. 1996).
Por conveniencia, la presente invencion es posteriormente ejemplificada y descrita aquf por referencia para AAV.
Sin embargo, se entiende que la invencion no esta limitada a AAV pero puede igualmente aplicarse a otros parvovirus.
[0029] La organizacion genomica de todos los serotipos AAV conocidos es muy similar.
El genoma de AAV es una molecula de ADN monocatenaria, lineal que es menor de aproximadamente 5,000 nucleotidos (nt) en longitud.
Las secuencias repetidoras terminales invertidas (ITR) flanquean las secuencias de nucleotidos codificacntes unicas para las protefnas de replicacion no estructurales (rep) y protefnas estructurales (VP).
Las protefnas de vasopresina (VP1; -2 y -3) forman la capsida.
Los terminales 145 nt son autocomplementarios y son programados de modo que un duplex intramolecular estable energeticamente que forma una horquilla en forma de T se puede formar.
Estas estructuras de horquilla funcionan como un origen para replicacion de ADN vfrico, que sirven como cebadores para el complejo de polimerasa de DNA celular.
La siguiente infeccion wtAAV en celulas mamfferas de los genes Rep (es decir Rep78 y Rep52) se expresa del P5 promotor y el P19 promotor, respectivamente y ambas protefnas Rep tienen una funcion en la replicacion del genoma vfrico.
Un evento de empalme en los Rep ORF produce la expresion de cuatro Protefna Reps reales (es decir, Rep78; Rep68; Rep52 y Rep40).
[0030] Sin embargo, se ha demostrado que el ARNm no empalmado, que codifica protefnas Rep78 y Rep52, en celulas mamfferas son suficientes para la produccion de vector AAV.
Tambien en las celulas de insecto, las protefnas Rep78 y Rep52 bastan para la produccion de vector AAV.
[0031] Un "recombinante parvoviral o vector AAV" (o "vector rAAV" ) aquf se refiere a un vector que comprende una o mas secuencias polinucleotidas de interes, genes de interes o "transgenes" que es/son flanqueados por al menos una secuencia de repeticion de terminal parvoviral o AAV invertido (ITR). Preferiblemente, el transgen(s) es/son flanqueados por ITR, uno a cada lado del transgen(s).
Tales vectores rAAV se pueden replicar y empaquetar en partfculas vfricas infecciosas en caso de existir en una celula huesped de insecto que exprese productos geneticos AAV rep y cap (es decir, protefnas AAV Rep y Cap). Cuando un vector rAAV se incorpora en un constructo de acidos nucleicos mayor (por ejemplo en un cromosoma o en otro vector tal como un plasmido o baculovirus usado para la clonacion o transfeccion), luego el vector rAAV es tfpicamente referido como un "pro-vector" que puede ser "salvado" por replicacion y encapsidacion en presencia de las funciones de embalaje AAV y funciones auxiliares.
[0032] La invencion se refiere a un metodo para la produccion de un virion (rAAV) parvoviral recombinante, que comprende un vector (rAAV) parvoviral recombinante, en una celula de insecto.
[0033] En un primer aspecto, la invencion se refiere a un metodo para la produccion de un virion parvoviral recombinante que incluye las etapas de: (a) proporcionar una celula de insecto que comprende uno o mas constructos de acidos nucleicos que comprenden: (i) una secuencia de nucleotidos que comprende un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion terminal invertida parvoviral; (ii) un primer casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna Rep parvoviral que esta operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de la expresion de transmision de la protefna Rep en la celula de insecto; (iii) un segundo casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina capsida parvoviral que esta operativamente enlazada a un segundo promotor que es capaz de la expresion de transmision de la proteina capsida en la celula de insecto; (b) cultivo de la celula definida en (a) bajo una condicion propicia para la expresion de la proteina Rep y capsida; y, (c) opcionalmente, recuperacion del virion parvoviral recombinante.
Preferiblemente, en la celula de insecto, los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en un constructo de acidos nucleicos unico.
[0034] Preferiblemente, los primeros y segundos casetes de expresion, en caso de existir en la cantidad equimolar en una celula de insecto producen una proporcion de niveles de ARNm que codifica la protefna Rep contra el ARNm que codifica la proteina capsida de al menos aproximadamente 0.5, al menos aproximadamente 0.75, al menos aproximadamente 1.0, al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 2.0, al menos aproximadamente 5.0 o al menos aproximadamente 10.0.
Los niveles de ARNm que codifican Rep y capsida son preferiblemente determinados por transcripcion inversa cuantitativa PCR, transferencia northern u otros medios para cuantificacion de ARN conocidos en la tecnica.
[0035] Preferiblemente, la proporcion de los niveles de ARNm que codifican Rep y capsida se producen en la celula de insecto en el momento de 24, 30, 36, 40,44 o 46 horas despues de la transfeccion a 72, 66, 60, 54, 52 o 50 horas despues de la transfeccion.
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Mas preferiblemente la proporcion de los niveles de ARNm que codifican Rep y capsida son al menos producidos en la celula de insecto 2 o 1 hora alrededor de 48 horas despues de la transfeccion.
El marco de lectura puede ser capaz de la codificacion de mas de una protefna, por ejemplo dos, tres o cuatro protefnas.
[0036] Alternativamente preferidos los primeros y segundos casetes de expresion, en caso de existir en la cantidad equimolar en una celula de insecto producen una proporcion de niveles de Protefna Rep contra proteina capsida de al menos aproximadamente 0.5, al menos aproximadamente 0.75, al menos aproximadamente 1.0, al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 2.0, al menos aproximadamente 5.0 o al menos aproximadamente 10.0.
Los niveles de proteina Rep y capsida son preferiblemente determinados usando anticuerpos de referencia contra las proteinas Rep y capsida en un inmunoensayo cuantitativo (por ejemplo ELISA o transferencia Western cuantitativa).
Preferiblemente, la proporcion de los niveles de proteina Rep y capsida se producen en la celula de insecto en el momento de 24, 30, 36, 40,44 o 46 horas despues de la transfeccion a 72, 66, 60, 54, 52, o 50 horas despues de la transfeccion.
Mas preferiblemente la proporcion de los niveles de proteina Rep y capsida se producen en la celula de insecto 2 o 1 horas alrededor de 48 horas despues de la transfeccion.
Los anticuerpos de referencia adecuados para cuantificacion de niveles de proteina AAV Rep y capsida son p. ej Anti-AAV-rep raton monoclonal, clon 303.9 o anti-AAV VP1/VP2/VP3, raton monoclonal, clon B1 obtenible de PROGEN Biotechnik GmbH.
[0037] En el metodo de la invencion, los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en un constructo de acidos nucleicos unico.
Una de las ventajas de ambos casetes de expresion que estan presentes en un constructo de acidos nucleicos unico es que las celulas de insecto transfectado expresaran ambas Protefna Rep y proteina capsida.
Solo la expresion de ambas Protefna Rep y proteina capsida en una celula de insecto dara lugar a la formacion de viriones parvovirales.
Otra ventaja es que la proporcion requerida minima de la expresion de la Protefna Rep contra la proteina capsida se puede controlar cuando los primeros y segundos casetes de expresion son en una construccion unica.
[0038] Es una forma de realizacion de la invencion que otro constructo de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un Protefna Rep tambien puede estar presente en la celula.
[0039] En un metodo de la invencion, la secuencia de nucleotidos del primer casete de expresion (ii) puede preferiblemente comprender solo una codificacion de secuencias de nucleotidos que comprenden el marco de lectura abierto al menos una de las protefnas Rep78 y Rep 68.
Es decir, la protefna Rep o protefnas seran codificadas por un marco de lectura abierto unico, no por dos o mas marcos de lectura abiertos.
Para poner otra via, el primer casete de expresion tfpicamente no tendra dos o mas marcos de lectura abiertos separados que codifican las mismas o diferentes Protefna Reps.
Para la evitar la duda, sin embargo, un marco de lectura abierto unico puede ser capaz de la codificacion de mas de una protefna, por ejemplo dos, tres o cuatro protefnas.
[0040] Todo lo anterior se puede aplicar igualmente a las VP1, VP2 y VP3 protefnas, es decir dos o todas aquellas protefnas pueden convenientemente todas ser codificadas por un marco de lectura abierto unico.
[0041] Tfpicamente, en un metodo de la invencion, al menos unas secuencias de nucleotidos que comprenden el marco de lectura abierto que codifica las VP1, VP2 y VP3 proteinas capsidas o al menos un marco de lectura abierto que incluye una codificacion de secuencias de nucleotidos que comprende el marco de lectura abierto en al menos una de la s protefnas Rep78 y Rep68 no comprende un intron artificial (o una secuencia derivada a partir de un intron artificial).
Es decir, al menos marcos de lectura abiertos usados para codificar Rep o protefnas de vasopresina no comprenderan un intron artificial.
Por intron artificial se entiende un intron que no se producirfa naturalmente en un virus adeno-asociado Rep o secuencia Cap, por ejemplo un intron que ha sido disenado para permitir un empalme funcional dentro de una celula de insecto.
Un intron artificial en este contexto por lo tanto abarca intrones de celula de insecto tipo salvaje.
Un casete de expresion de la invencion puede comprender una secuencia de intron truncada nativa (por nativa se entiende una secuencia de origen natural en un virus adeno-asociado) tales secuencias no se destinan a incluirse en el significado de intron artificial tal y como se define aquf.
[0042] En la invencion, una posibilidad es que ninguna secuencia de nucleotidos que comprenda el marco de lectura abierto que codifica las proteinas capsidas VP1, VP2 y VP3 y/o ningun marco de lectura abierto que comprenda la codificacion de secuencias de nucleotidos que comprenden al menos una de las protefnas Rep78 y Rep68 comprende un intron artificial.
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[0043] En una forma de realizacion preferida de la invencion, la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen esta tambien en el mismo constructo de acidos nucleicos como primeros y segundos casetes de expresion. Una ventaja de la misma es, que todas las celulas transfectadas comprenden cada una de las tres secuencias de nucleotidos, que se necesitan para la produccion de virion parvoviral.
[0044] Ademas, los presentes inventores descubrieron que la mayor proporcion de protefna Rep:protefna capsida, mayor sera la proporcion de virion completo vs. virion vacfo.
El termino "virion completo" se refiere a una partfcula de virion que comprende un vector parvoviral.
El termino "virion vacfo" se refiere a una partfcula de virion que no comprende un vector parvoviral.
En una forma de realizacion preferida de la invencion, la proporcion de virion completo vs. virion vacfo es al menos 1:100 mas preferiblemente al menos 1:10 e incluso mas preferiblemente al menos 1:1.
Aun mas preferiblemente, ningunos viriones vacfos se pueden detectar y de la forma mas preferible no estan presentes viriones vacfos.
El experto en la tecnica sabra determinar la proporcion de virion completo vs virion vacfo, por ejemplo por la division del numero de copias de gen por (capsida total - numero de copias de genoma), ya que por virion habra solo una copia presente en el genoma.
Inversamente, la mayor proporcion protefna Rep:protefna capsida, la menor proporcion de viriones totales vs viriones vacfos (es decir, viriones llenos+vacfos).
El experto en la materia sabra como determinar tal proporcion.
Por ejemplo, la proporcion de viriones vacfos vs. capsidas totales se puede determinar por la division de la cantidad de copias de genoma (es decir numero de copias de genoma) por la cantidad de partfculas parvovirales total (es decir numero de partfculas parvovirales), donde la cantidad de copias de genoma por ml se mide por PCR cuantitativo y la cantidad de partfculas parvovirales totales por ml se mide con un enzimoinmunoanalisis, por ejemplo de Progen.
En una forma de realizacion preferida de la invencion, la proporcion de viriones totales vs. viriones vacfos es inferior a 100:1, mas preferiblemente menos de 10:1 e incluso mas preferiblemente menos de 1:1.. Aun mas preferiblemente, ningun virion vacfo puede ser detectado y de la forma mas preferible ningun virion vacfo esta presente.
[0045] En una forma de realizacion preferida, la proporcion de expresion del Rep contra la proteina capsida se regula por uno o mas de los siguientes: (a) el primer promotor es fuerte igualmente o mas fuerte que el segundo promotor, como se ha determinado por la expresion de gen reportero (por ejemplo luciferasa o SEAP), o transferencia Northern; (b) la presencia de mas y/o elementos intensificadores mas fuertes en el primer casete de expresion en comparacion con el segundo casete de expresion; (c) la secuencia de nucleotidos codificante para la protefna Rep parvoviral tiene un fndice de adaptacion de codon mas alto en comparacion con la secuencia de nucleotidos codificante para la proteina capsida; (d) optimizacion de temperatura de la protefna Rep parvoviral; y/o (e) protefnas Rep variantes con una o mas alteraciones en la secuencia de aminoacidos en comparacion con una protefna Rep tipo salvaje correspondiente y donde uno o mas de la alteracion de aminoacido produce el aumento en la actividad de la funcion Rep como se ha evaluado por la deteccion de la produccion AAV aumentada en las celulas de insecto. Los metodos para la generacion, seleccion y/o seleccion de variantes de protefnas Rep con actividad aumentada de la funcion Rep como se ha evaluado por la deteccion de la produccion aAv aumentada en las celulas de insecto se pueden obtener por adaptacion a celulas de insecto de los metodos descritos en la US20030134351 para obtener protefnas Rep variantes con funcion aumentada respecto a la produccion AAV en celulas mamfferas.
La variante de Protefna Reps con una o mas alteraciones en la secuencia de aminoacidos en comparacion con una protefna tipo salvaje correspondiente Rep se entienden aquf para incluir Protefna Reps con una o mas sustituciones de aminoacidos, inserciones y/o deleciones en la secuencia de aminoacidos variante en comparacion con la secuencia de aminoacidos de una protefna Rep tipo salvaje correspondiente.
[0046] El primer promotor es igualmente fuerte o mas fuerte que el segundo promotor significa que en caso de mas secuencias de nucleotidos que codifican una Protefna Rep que las secuencias de nucleotidos que codifican una proteina capsida, se puede utilizar igualmente un promotor fuerte, ya que la expresion de Protefna Rep luego aumentara en comparacion con la expresion de proteina capsida, mientras que en caso de cantidades similares de secuencias de nucleotidos que codifican Rep y codifican proteina capsida, un promotor mas fuerte se puede utilizar para la expresion de Protefna Rep que para la expresion de proteina capsida.
La fuerza del promotor se puede determinar por la expresion que se obtiene bajo condiciones que se usan en el metodo de la invencion.
En una forma de realizacion preferida, el primer promotor o el segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en un Promotor PolH, promotor p10, promotor de protefna basica, un promotor inducible o un promotor deltaE1 o un Promotor E1, o cualquier otro promotor de gen de Baculovirus tardfo o muy tardfo.
Mas preferiblemente, el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en un Promotor PolH, promotor p10 o promotor de protefna basica y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un Promotor E1, o cualquier otro promotor de gen de baculovirus temprano o tardfo.
Preferiblemente, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor PolH o un promotor 4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70.
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En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un 4xHsp27 EcRE+minimal Hsp70 promotor y el segundo promotor es un Promotor PolH.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un Promotor PolH y el segundo promotor es un p10, un deltaEI o un Promotor E1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un Promotor PolH y el segundo promotor es un deltaE1 o un Promotor E1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un promotor p10 y el segundo promotor es un deltaE1 o un Promotor E1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un Promotor PolH y el segundo promotor es un Promotor PolH.
De la forma mas preferible, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un Promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1.
[0047] Un "elemento intensificador" o "intensificador" se entiende que define una secuencia que intensifica la actividad de un promotor (es decir aumenta el fndice de transcripcion de una secuencia aguas abajo del promotor) que, a diferencia de un promotor, no posee actividad promotora, y que puede normalmente funcionar sin tener en cuenta su ubicacion con respecto al promotor (es decir aguas arriba o abajo del promotor).
Los elementos intensificadores son bien conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitativos de elementos intensificadores (o partes de los mismos) que podrfan ser usados en la presente invencion incluyen potenciadores de baculovirus y elementos intensificadores encontrados en celulas de insecto.
Se prefiere que el elemento intensificador aumente en una celula la expresion de ARNm de un gen, al que el promotor esta operativamente enlazado, por al menos 25%, mas preferiblemente al menos 50%, aun mas preferiblemente al menos 100% y de la forma mas preferible al menos 200% en comparacion con la expresion de ARNm del gen en ausencia del elemento intensificador. La expresion de ARNm se puede determinar por ejemplo por RT-PCR cuantitativo.
[0048] Aquf se prefiere usar un elemento intensificador para mejorar la expresion de la protefna Rep parvoviral.
Asf, en otra forma de realizacion preferida, el primer casete de expresion comprende al menos un elemento intensificador de baculovirus y/o al menos un elemento sensible ecdisona.
Preferiblemente el elemento intensificador es seleccionado del grupo que consiste en hr1, hr2, hr3, hr4 y hr5.
[0049] La optimizacion de codon de la protefna Rep parvoviral se discute con mas detalle de aquf en adelante.
[0050] La optimizacion de temperatura de la protefna Rep parvoviral se refiere al uso de la condicion optima con respecto a la temperatura a la que la celula de insecto crecera y Rep esta en funcionamiento.
Una protefna Rep puede por ejemplo ser activa optimamente a 37°C, mientras que una celula de insecto puede crecer optimamente a 28°C.
Una temperatura a la que la protefna Rep es activa y la celula de insecto crece puede ser 30°C.
En una forma de realizacion preferida, la temperatura optimizada es mas del 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34 o 35°C y/o menos de 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31,30 o 29°C.
[0051] Como se entendera por la persona experta en la tecnica, la proporcion virion completo:virion vacfo tambien se puede mejorar por la expresion Cap atenuada, por ejemplo mediante un promotor mas debil, en comparacion con la expresion Rep moderada a alta.
[0052] Preferiblemente un constructo de acidos nucleicos de la invencion, es un vector compatible con celula de insecto.
Por "vector compatible con la celula de insecto" o "vector" se entiende una molecula de acido nucleico capaz de la transformacion productiva o transfeccion de un insecto o celula de insecto.
Los vectores biologicos ejemplares incluyen plasmidos, moleculas lineales de acido nucleico y virus recombinantes. Cualquier vector se puede emplear en tanto que sea compatible con la celula de insecto.
El vector se puede integrar en el genoma de celulas de insecto pero la presencia del vector en la celula de insecto no necesita ser permanente y los vectores episomicos transitorios tambien se incluyen.
Los vectores se pueden introducir por cualquier medio conocido, por ejemplo por tratamiento qufmico de las celulas, electroporacion o infeccion.
En una forma de realizacion preferida, el vector es un baculovirus, un vector vfrico o un plasmido.
En una forma de realizacion mas preferida, el vector es un baculovirus, es decir el constructo de acidos nucleicos es un vector de expresion de baculovirus.
Los vectores de expresion de baculovirus y metodos para su uso son descritos por ejemplo en Summers y Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. En Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97152; King, L. A. and R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.
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H. Freeman and Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4,745,051; US2003148506; and WO 03/074714.
[0053] El numero de constructos de acidos nucleicos empleado en la celula de insecto para la produccion del vector (rAAV) parvoviral recombinante no es limitativo en la invencion.
Por ejemplo, uno, dos, tres o mas constructos separados se pueden emplear para producir rAAV en las celulas de insecto conforme a los metodos de la presente invencion.
Si se emplean dos constructos, una construccion puede comprender la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen que se flanquea por al menos una secuencia ITR parvoviral y la otra construccion puede luego comprender un primero y un segundo casete de expresion.
Si tres constructos son empleados, un constructo puede comprender la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen que se flanquea por al menos una secuencia ITR parvoviral, otro constructo puede comprender los primeros y segundos casetes de expresion y todavfa otro constructo puede comprender una secuencia de nucleotidos adicional que codifica una protefna Rep, opcionalmente bien el codon optimizado, AT optimizado o GC optimizado, para minimizar o prevenir la recombinacion, como se describe de ahora en adelante.
[0054] Una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas Rep parvovirales, se entiende aquf como una secuencia de nucleotidos que codifica las protefnas Rep no estructurales que se requieren y son suficientes para la produccion dle vector parvoviral en las celulas de insecto tal como las protefnas Rep78 o Rep68, y/o el Rep52 o Rep40.
La secuencia de nucleotidos de parvovirus es preferiblemente a partir de un dependovirus, mas preferiblemente de un virus humano o sfmico adeno-asociado (AAV) y de la forma mas preferible a partir de un AAV que infecta normalmente avseres humanos (por ejemplo, serotipos 1, 2,3A, 3B, 4, 5, y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4). Un ejemplo de una secuencia de nucleotidos que codifica protefnas parvovirus Rep se da en SEQ ID N.° 5, que representa una parte del genoma de secuencia AAV serotipo 2 que codifica las protefnas Rep.
La Rep78 secuencia codificante comprende nucleotidos 11 - 1876 y la Rep52 secuencia codificante comprende nucleotidos 683 - 1876, representada tambien separadamente en la sEc ID No.5 y 7.
Se entiende que los pesos moleculares exactos de las protefnas Rep78 y Rep52, al igual que las posiciones exactas de los codones de iniciacion de traduccion pueden diferir entre parvovirus diferentes.
Sin embargo, la persona experta sabra identificar la posicion correspondiente en la secuencia de nucleotidos de otros parvovirus que AAV-2.
[0055] En una forma de realizacion preferida, el primer casete de expresion comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos de una protefna Rep parvoviral52 o 40 y/o una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos de una protefna Rep parvoviral78 o 68.
Preferiblemente, las protefnas Rep parvovirales son protefnas Rep de virus adeno-asociado (AAV).
[0056] En una forma de realizacion preferida, la invencion se refiere a una celula de insecto que comprende no mas de un tipo de secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica una protefna Rep parvoviral.
Preferiblemente el marco de lectura abierto unico codifica una o mas de las protefnas Rep parvovirales, mas preferiblemente el marco de lectura abierto codifica todas las protefnas Rep parvovirales, de la forma mas preferible el marco de lectura abierto codifica la protefna en toda su longitud Rep 78 donde preferiblemente al menos ambas protefnas Rep 52 y Rep 78 se pueden expresar en la celula de insecto.
Se entiende aquf que la celula de insecto puede comprender mas de una copia del tipo unico de secuencia de nucleotidos, por ejemplo en un vector episomico multicopia, pero que estos son copias multiples de esencialmente una y la misma molecula de acido nucleico, o al menos moleculas de acido nucleico que codifican una y la misma Rep secuencia de aminoacidos, por ejemplo moleculas de acido nucleico que solo diferen entre sf debido a la degeneracion del codigo genetico.
La presencia de solo un tipo unico de molecula de acido nucleico que codifica las protefnas Rep parvovirales evita la recombinacion entre las secuencias homologas como pueden estar presentes en diferentes tipos de vectores que comprenden Rep secuencias, que pueden dar lugar a constructos de expresion Rep defectuosos que afecten a (la estabilidad de) niveles de produccion parvovirales en las celulas de insecto.
[0057] En una forma de realizacion alternativa de la invencion, el primer casete de expresion comprende mas de una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna Rep parvoviral.
Se prefiere que la secuencia de nucleotidos de (ii) comprenda un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleotidos que codifican al menos una de las protefnas Rep78 y Rep68.
Preferiblemente, las secuencias de nucleotidos son del mismo serotipo.
Mas preferiblemente, las secuencias de nucleotidos diferen entre sf en que estas pueden ser bien codon optimizado, AT optimizado o GC optimizado, para minimizar o prevenir la recombinacion.
Preferiblemente, el primer casete de expresion comprende dos secuencias de nucleotidos que codifican una protefna Rep parvoviral, es decir, una primera secuencia de nucleotidos y una segunda secuencia de nucleotidos. Preferiblemente, la diferencia en el primer y la segunda secuencia de nucleotidos codificante para las secuencias de aminoacidos comunes de una protefna Rep parvoviral se maximiza (es decir, la identidad de nucleotido se minimiza) por uno o mas de: a) cambio de la preferencia codonica de la primera secuencia de nucleotidos codificante para la secuencia de aminoacidos comun Rep parvoviral; b) cambio de la preferencia codonica de la segunda secuencia de
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nucleotidos codificante para la secuencia de aminoacidos comun Rep parvoviral; c) cambio del contenido GC de la primera secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos comun; y d) cambio del contenido GC de la segunda secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos comun.
La optimizacion de codon se puede realizar basandose en el uso de un codon de la celula de insecto usada en el metodo de la invencion, preferiblemente Spodoptera frugiperda, como puede ser descubierta en una base de datos de uso de codon (ver por ejemplo
http://www.kazusa.or.jp/codon/).
Los programas informaticos adecuados para la optimizacion de codon estan disponibles para la persona experta (ver por ejemplo Jayaraj et al., 2005, Nucl. Acido Res. 33(9):3011-3016; y en internet).
Alternativamente, las optimizaciones pueden hacerse a mano, usando la misma base de datos de uso de codon.
[0058] Una secuencia de nucleotidos del primer casete de expresion que codifica una protefna Rep52 parvoviral se puede definir como una secuencia de nucleotidos:
a) que codifica un polipeptido que incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID No: 6
b) que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de cualquier SEC ID del n° 1 - 5;
c) la cadena complementaria de la cual hibrida a una secuencia de molecula de acido nucleico de (a) o (b);
d) secuencias de nucleotidos la secuencia de las cuales difiere de la secuencia de una molecula de acido nucleico de (c) debido a la degeneracion del codigo genetico.
[0059] Una secuencia de nucleotidos del primer casete de expresion que codifica una protefna Rep78 parvoviral se puede definir como una secuencia de nucleotidos:
a) que codifica un polipeptido que incluye una secuencia de aminoacidos que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 88, 89, 90, 95, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoacidos de la SEC ID No: 8
b) que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 81, 82, 85, 90, 95, 97, 98, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleotidos de posiciones 11 - 1876 de la SEC ID No: 7
c) la cadena complementaria de la cual hibrida a una secuencia de molecula de acido nucleico de (a) o (b);
d) secuencias de nucleotidos la secuencia de las cuales difiere de la secuencia de una molecula de acido nucleico de (c) debido a la degeneracion del codigo genetico.
Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos codifica protefnas parvovirus Rep que se requieren y son suficientes para la produccion de vector parvoviral en las celulas de insecto.
[0060] La eliminacion de sitios de iniciacion de traduccion falsa posible en las secuencias codificantes de protefna Rep, diferentes de los sitios de iniciacion de traduccion Rep78 y Rep52, de otros parvovirus la entendera bien un experto en la tecnica, como sera la eliminacion de sitios de empalme putativo que se puede reconocer en las celulas de insecto.
[0061] En una forma de realizacion preferida, el codon iniciador para traduccion de la protefna Rep78 parvoviral es un codon iniciador suboptimo.
El codon iniciador suboptimo es preferiblemente un codon iniciador que proporciona salto de exon parcial.
Salto de exon parcial se entiende aquf que significa que al menos una parte de los ribosomas no inician la traduccion en el codon iniciador suboptimo de la protefna Rep78 pero en un codon iniciador mas aguas abajo, por lo cual preferiblemente el codon iniciador mas aguas abajo es el codon iniciador de la Rep52 protefna.
El codon iniciador suboptimo efectua preferiblemente un salto de exon parcial en la expresion de la secuencia de nucleotidos en una celula de insecto.
Preferiblemente, el codon iniciador suboptimo efectua el salto de exon parcial en una celula de insecto para producir en la celula de insecto una proporcion molar de Rep78 a Rep52 en el rango de 1:10 a 10:1,1:5 a 5:1, o 1:3 a 3:1, preferiblemente en alrededor de 20 - 40 horas despues de la infeccion, mas preferiblemente en alrededor de 30 - 40 horas despues de la infeccion, utilizando una expresion de baculovirus.
La racion molar de la Rep78 y Rep52 se puede determinar mediante metodo de transferencia Western, preferiblemente utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce un epftopo comun tanto de Rep78 como de Rep52 o usanndo por ejemplo un raton anti-rep anticuerpo (303.9, Progen, Germany; dilution 1:50).
[0062] El termino "codon de initiacion suboptimo" aquf no solo se refiere al codon de inicio de trinucleotido en sf mismo sino tambien a su contexto.
Asf, un codon iniciador suboptimo puede consistir en un codon ATG "optimo" en un contexto suboptimo, por ejemplo un contexto no Kozak.
Sin embargo, mas preferidos son los codones de iniciacion suboptima donde el codon de inicio de trinucleotido mismo es suboptimo, es decir no es ATG.
Suboptimo se entiende aquf que significa que el codon es menos eficaz en la iniciacion de traduccion en un contexto identico de otro modo en comparacion con el codon ATG normal.
Preferiblemente, la eficiencia de codon suboptimo es inferior a 90, 80, 60,40 o 20% de la eficiencia del codon ATG normal en un contexto identico de otro modo.
Los metodos para la comparacion de la eficiencia relativa de la iniciacion de traduccion son conocidos de por sf para la persona experta.
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Los codones de iniciacion suboptima preferidos se pueden seleccionar de ACG, TTG, CTG y GTG.
Mas preferido es ACG.
Una secuencia de nucleotidos que codifica rotefna Rep parvovirus se entiende aquf como una secuencia de nucleotidos que codifica las proteinas no estructurales Rep que se requieren y son suficientes para la produccion de vector parvoviral en las celulas de insecto tales como las protefnas Rep78 y Rep52.
[0063] Tambien es posible reemplazar otros ATG en la secuencia con un codon diferente que codifica metionina de modo que la posibilidad menor de la iniciacion de traduccion de tal ATG.
[0064] Varias modificaciones de la secuencia de nucleotidos de codificacion tal como se ha definido anteriormente, incluyendo por ejemplo las secuencias parvovirales de tipo salvaje, para la expresion apropiada en las celulas de insecto se consigue por aplicacion de tecnicas de ingenierfa geneticas bien conocidas tales como las descritas por ejemplo en Sambrook y Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Varias otras modificaciones de las regiones de codificacion se conocen por el experto en la materia, lo que podrfa aumentar el rendimiento de las protefnas de codificacion. Estas modificaciones se incluyen en el campo de la presente invencion.
[0065] Una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna (Cap) capsida parvoviral se entiende aqui como que comprende las secuencias de nucleotidos que codifican una o mas de las tres proteinas capsidas parvovirales, Vpl; -2 y -3.
La secuencia de nucleotidos de parvovirus es preferiblemente a partir de un dependovirus, mas preferiblemente de un virus humano o sfmico adeno-asociado (AAV) y de la forma mas preferible de un AAV que infecta normalmente seres humanos (por ejemplo, serotipos 1,2,3A, 3B, 4, 5 y 6) o primates (por ejemplo, serotipos 1 y 4).
Ejemplos de una secuencia de nucleotidos que codifica proteinas capsidas de parvovirus se da en SEQ ID N.° 20,22 y 24.
[0066] En una forma de realizacion preferida la secuencia de nucleotidos de (iii) comprende un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleotidos que comprenden las proteinas capsidas VP1, VP2 y VP3.
Las secuencias codificantes de proteina capsida pueden estar presentes en varias formas.
Por ejemplo las secuencias codificantes separadas para cada una de las proteinas capsidas VP1; -2 y -3 se pueden usar, por lo cual cada una de las secuencias codificantes esta operativamente enlazada a las secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
Mas preferiblemente, sin embargo, el segundo casete de expresion comprende una secuencia de nucleotidos que comprende un marco de lectura abierto unico que codifica todos los tres (AAV) parvoviral VP1, VP2 y VP3 proteinas capsidas, donde el codon iniciador para la traduccion de la VP1 proteina capsida es un codon iniciador suboptimo que no es ATG como por ejemplo descrito por Urabe et al. (2002; supra) y en WO2007/046703.
Un codon iniciador suboptimo para la VP1 proteina capsida puede ser tal como se ha definido anteriormente para la proteina Rep78.
Los codones de iniciacion suboptima mas preferidos para la VP1 proteina capsida se pueden seleccionar de ACG, TTG, CTG y GTG, de los cuales CTG y GTG son mas preferidos.
La secuencia de nucleotidos comprendida en el segundo casete de expresion para la expresion de las proteinas capsidas puede comprender ademas una o mas modificaciones como se describe en WO2007/046703.
Varias otras modificaciones de regiones de codificacion de vasopresina las conoce el experto en la materia que podrfa bien aumentar la produccion de vasopresina y virion o tener otros efectos deseados, tal como tropismo alterado o reducir la antigenicidad del virion.
Estas modificaciones estan dentro del campo de la presente invencion.
[0067] En una forma de realizacion preferida, la expresion de VP1 se aumenta en comparacion con la expresion de VP2 y VP3.
La VP1 expresion se puede aumentar por suplementacion de VP1, por introduccion en la celula de insecto de un vector de insecto unico que comprende las secuencias de nucleotidos para el VP1 como ha sido descrito en la WO 2007/084773.
[0068] En el contexto de la invencion "al menos una secuencia de nucleotido de repeticion terminal invertida parvoviral" se entiende que significa una secuencia palfndroma, que comprende secuencias dispuestas simetricamente, complementarias en su mayorfa tambien referidas como regiones "A", " B" y " C".
Las funciones ITR como un origen de replicacion, un sitio con un papel "cis" en la replicacion, es decir, siendo un sitio de reconocimiento para protefnas de replicacion de actuacion trans tal como por ejemplo Rep 78 (o Rep68) que reconocen el palfndromo y secuencias especfficas internas al palfndromo.
Una excepcion a la simetrfa de la secuencia ITR es la "D" region del ITR.
Es unico (sin un complemento dentro de un ITR).
Mellar el ADN monocatenario ocurre en la juntura entre las regiones A y D.
Es la region donde se inicia la nueva sfntesis de ADN.
La D region yace normalmente a un lado del palfndromo y proporciona direccionalidad al paso de replicacion de acido nucleico.
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Un parvovirus que replica en una celula mamffera tfpicamente tiene dos secuencias ITR.
Sin embargo, es posible para el ingeniero un ITR, de modo que los sitios de union esten en ambos hilos de las regiones A y D se situan simetricamente, en cada lado del palfndromo.
En un molde de ADN circular bicatenario (por ejemplo, un plasmido), la replicacion de acido nucleico Rep78- o Rep68-asistida luego procede en ambas direcciones y un ITR unico basta para la replicacion parvoviral de un vector circular. Asf, una secuencia de nucleotidos ITR se puede usar en el contexto de la presente invencion. Preferiblemente, sin embargo, se usan dos o incluso otro numero de ITR regulares.
De la forma mas preferible, se usan dos secuencias ITR.
Un ITR parvoviral preferido es un ITR AAV.
Por razones de seguridad puede ser deseable una construccion de un vector (rAAV) parvoviral recombinante que es incapaz de propagar adicionalmente despues de la introduccion inicial en una celula en presencia de un segundo AAV.
Tal mecanismo de seguridad para limitar la propagacion de vector indeseable en un receptor se puede proporcionar usando rAAV con un ITR quimerico como se describe en US2003148506.
[0069] El termino "flanqueado" respecto a una secuencia que se flanquea por otro elemento(s) aquf indica la presencia de uno o mas de los elementos flanqueantes aguas arriba y/o abajo, es decir, 5' y/o 3', relativamente a la secuencia.
El termino "flanqueado" no se destina a indicar que las secuencias son contiguas necesariamente.
Por ejemplo, puede haber secuencias de intervencion entre el acido nucleico que codifica el transgen y un elemento flanqueante.
Una secuencia que se "flanquea" por otros dos elementos (por ejemplo ITR), indican que un elemento esta localizado 5' a la secuencia y el otro esta localizado 3' a la secuencia; sin embargo, puede haber secuencias de intervencion entre ellos.
En una forma de realizacion preferida una secuencia de nucleotidos de (i) se flanquea en cada lado por secuencias de nucleotidos terminales invertidas de repeticion parvoviral.
[0070] En las formas de realizacion de la invencion, la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen (que codifica un producto genico de interes) que se flanquea por al menos una secuencia ITR parvoviral preferiblemente se vuelve incorporada en el genoma de un vector (rAAV) parvoviral recombinante producido en la celula de insecto. Preferiblemente, el transgen codifica un producto genico de interes para la expresion en una celula mamffera. Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen se flanquea por dos secuencias de nucleotidos ITR (AAV) parvoviral y donde el transgen esta localizado entremedias de dos secuencias de nucleotidos ITR (AAV) parvoviral.
Preferiblemente, la secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico de interes (para la expresion en la celula mamffera) sera incorporada en el vector (rAAV) parvoviral recombinante producido en la celula de insecto si esta situada entre dos ITR regulares o se localiza en cada lado de un disenado iTr con dos D regiones.
[0071] Las secuencias AAV que se pueden utilizar en la presente invencion para la produccion de un virion AAV recombinante en las celulas de insecto se pueden derivar del genoma de cualquier serotipo AAV.
Generalmente, los serotipos AAV tienen secuencias genomicas de homologfa significativa en los niveles de aminoacido y de acido nucleico, proporcionan un conjunto identico de funciones geneticas, producen viriones que son esencialmente ffsicamente y funcionalmente equivalentes, y se replican y ensamblan por mecanismos practicamente identicos.
Para la secuencia genomica de los varios serotipos AAV y una vision de conjunto de las similitudes genomicas ver por ejemplo el numero de registro GenBank U89790, numero de registro GenBank J01901, numero de registro GenBank AF043303, numero de registro GenBank AF085716 Chlorini et al. (1997, J. Vir. 71: 6823-33); Srivastava et al. (1983, J. Vir.45:555-64); Chlorini et al. (1999, J. Vir. 73:1309-1319); Rutledge et al. (1998, J.Vir. 72:309-319); y Wu et al. (2000, J. Vir. 74: 8635-47). Serotipos AAV 1, 2, 3,4 y 5 son una fuente preferida de secuencias de nucleotidos AAV para usar en el contexto de la presente invencion.
Preferiblemente las secuencias ITR AAV para usar en el contexto de la presente invencion son derivadas de AAV1, AAV2 y/o AAV4.
Asimismo, las Rep (Rep78/68 y Rep52/40) secuencias codificantes son preferiblemente derivadas de AAV1, AAV2 y/o AAV4.
Las secuencias codificantes para las VP1, VP2 y VP3 proteinas capsidas para usar en el contexto de la presente invencion pueden sin embargo ser tomadas de cualquiera de los 42 serotipos conocidos, mas preferiblemente de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9 o partfculas tipo AAV recien desarrolladas obtenidas por por ejemplo tecnicas de redistribucion de capsida y bibliotecas de capsida AAV o de ITR recien disenados, desarrollados o evolucionados.
[0072] AAV Rep y secuencias ITR estan particularmente conservadas entre mas serotipos.
Las Rep78 proteinas de varios serotipos AAV son por ejemplo mas del 89% identicas y la identidad de secuencia de nucleotidos totales en el nivel de genoma entre AAV2; AAV3A, AAV3B y AAV6 es alrededor de 82% (Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virol., 73(2):939-947). Ademas, las secuencias Rep e ITR de muchos serotipos AAV se conocen por complementar eficazmente de forma cruzada (es decir, sustituto funcionalmente) las secuencias correspondientes de otros serotipos en la produccion de partfculas AAV en celulas mamfferas.
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La US2003148506 informa que AAV Rep y secuencias ITR eficaz tambien complementan eficientemente de forma cruzada otro AAV Rep y secuencias ITR en las celulas de insecto.
[0073] Las protefnas de vasopresina AAV se conocen por determinar la tropicidad celular del virion AAV.
Las secuencias de codificacion de protefna de vasopresina estan menos conservadas significativamente que las Protefna Rep y genes entre serotipos AAV diferentes.
La capacidad de las secuencias Rep y ITR para complementar de forma cruzada secuencias correspondientes de otros serotipos permite la produccion de partfculas rAAV pseudotipadas que comprenden las proteinas capsidas de un serotipo (por ejemplo; AAV3) y las secuencias Rep y/o ITR de otro serotipo AAV (por ejemplo, AAV2).
Tales partfculas rAAV pseudotipadas son una parte de la presente invencion.
[0074] Las "AAV" secuencias modificadas tambien se pueden usar en el contexto de la presente invencion, por ejemplo para la produccion de vectores rAAV en las celulas de insecto.
Tales secuencias modificadas por ejemplo incluyen secuencias con al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o mas nucleotidos y/o identidad de secuencia de aminoacidos (por ejemplo, una secuencia con aproximadamente 75-99% de identidad de secuencia de nucleotidos) a un AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AaV7, AAV8 o AAV9 ITR, Rep o vasopresina se puede usar en lugar de
secuencias de tipo salvaje AAV, ITR, Rep o de vasopresina.
[0075] Aunque similar a los otros serotipos AAV en muchos aspectos, AAV5 difiere de otros serotipos AAV humanos y sfmicos mas del otros serotipos humanos y sfmicos conocidos.
En vista de ello, la produccion de rAAV5 puede diferir de la produccion de otros serotipos en las celulas de insecto. Donde metodos de la invencion se emplean para producir rAAV5, se prefiere que uno o mas constructos que comprendan, colectivamente en el caso de un constructo, una secuencia de nucleotidos que incluye un AAV5 iTr, una secuencia de nucleotidos que comprenda una secuencia AAV5 Rep codificante (es decir una secuencia de nucleotidos comprende un AAV5 Rep78).
Tales secuencias ITR y Rep se pueden modificar como se desea para obtener una produccion eficaz de rAAV5 o vectores pseudotipados rAAV5 en las celulas de insecto.
Por ejemplo, el codon de inicio de las secuencias Rep puede ser modificado, sitios de empalme de vasopresina se pueden modificar o eliminar y/o el codon de inicio VP1 y nucleotidos cercanos se pueden modificar para mejorar la produccion de vectores rAAV5 en la celula de insecto.
[0076] La secuencia de nucleotidos comprende el transgen tal y como se define aquf arriba puede asf comprender una secuencia de nucleotidos que codifica al menos un "producto genico de interes" para la expresion en una celula mamffera, situada de manera que sera incorporada en un vector (rAAV) parvoviral recombinante replicado en la celula de insecto.
En el contexto de la invencion se entiende que una celula de mamffero preferida particularmente donde el "producto genico de interes" debe ser expresado, es una celula humana.
Cualquier secuencia de nucleotidos se puede incorporar para una expresion tardfa en una celula mamffera transfectada con el vector (rAAV) parvoviral recombinante producido conforme a la presente invencion.
La secuencia de nucleotidos puede por ejemplo codificar una protefna, esta puede expresar un agente de ARNi, es decir una molecula de ARN que es capaz de la interferencia de ARN tal como por ejemplo un ARNhc (hairpinARN corto) o un ARNsi (interferencia corta ARN). "ARNsi" significa un ARN de interferencia pequeno que es un ARN bicatenario de longitud corta que no es toxico en celulas mamfferas (Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-98; Caplen et al., 2001, Proc. Natl. Acad.Sci.EE.UU 98: 9742-47). En una forma de realizacion preferida, la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen puede comprender dos secuencias de codificacion de nucleotidos, cada codificacion un producto genico de interes para la expresion en una celula mamffera.
Cada una de las dos secuencias de nucleotidos que codifican un producto de interes esta localizada de manera que sera incorporada en un vector (rAAV) parvoviral recombinante replicado en la celula de insecto.
[0077] El producto de interes para la expresion en una celula mamffera puede ser un producto genico terapeutico.
Un producto genico terapeutico puede ser un polipeptido o una (ARNsi) molecula de ARN, u otro producto genico que, cuando se ha expresado en una celula objetivo, proporciona un efecto terapeutico deseado tal como por ejemplo ablacion de una actividad no deseada, por ejemplo la ablacion de una celula infectada, o la complementacion de un defecto genetico, por ejemplo causando una deficiencia en una actividad enzimatica.
Los ejemplos de productos geneticos de polipeptido terapeutico incluyen cFTR Factor IX, lipoprotefna-lipasa, (LPL preferiblemente LPL S447X; ver WO 01/00220), apolipoprotefna A1, glucuronosiltransferasa de difosfato de uridina (UGT), protefna de interaccion con el regulador GTPase de la retinitis pigmentosa (RP-GRIP) y citocinas o interleuquinas como por ejemplo IL-10, porfobilingeno desaminasa (PBGD), un factor neurotrofico tal como factor neurotrofico derivado de lfnea celular glial (GDNF) y alanina:glioxilato aminotransferasa (AGT).
[0078] Alternativamente o ademas como otro producto genico, la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen tal y como se define aquf arriba puede comprender ademas una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que sirve como una protefna marcadora para valorar la transformacion y expresion celular.
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Protefnas de marcador adecuado para este proposito son por ejemplo la protefna GFP fluorescente y la timidina quinasa HSV de genes marcadores seleccionables (para la seleccion en el medio HAT), higromicina bacteriana B fosfotransferasa (para la seleccion en la higromicina B), Tn5 fosfotransferasa de aminoglicosido (para la seleccion en G418) y dihidrofolato reductasa (DHFR) (para la seleccion en el metotrexato), CD20, el gen de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad.
Las fuentes para obtener estos genes marcadores y metodos para su uso se proporcionan en Sambrook y Russel, supra. Ademas, la secuencia de nucleotidos que comprende el transgen tal y como se define aquf arriba puede comprender otra secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido que puede servir como un mecanismo de fallo de seguridad que permite polimerizar un sujeto de celulas transducidas con el vector (rAAV) parvoviral recombinante de la invencion, si se cree necesario.
Tal secuencia de nucleotidos, frecuentemente referida como un gen suicida, codifica una protefna que es capaz de la conversion de un profarmaco en una sustancia toxica que es capaz de matar las celulas transgenicas donde la protefna se expresa.
Los ejemplos adecuados de tales genes suicidas incluyen por ejemplo el gen E.coli de citosina deaminasa o uno de los genes de timidina quinasa de virus herpes simplex, citomegalovirus y virus Varicella-Zoster, en cuyo caso ganciclovir se puede utilizar como profarmaco para matar las celulas transgenicas en el sujeto (ver por ejemplo Clair et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemoter. 31: 844-849).
[0079] En otra forma de realizacion uno de los productos geneticos de interes pueden ser una protefna AAV.
En particular, una protefna Rep, tal como Rep78 o Rep68, o un fragmento funcional del mismo.
Una secuencia de nucleotidos que codifica un Rep78 y/o un Rep68, si esta presente en el genoma de un vector (rAAV) parvoviral recombinante de la invencion y expresado en una celula mamffera transducida con el vector, permite la integracion del vector (rAAV) parvoviral recombinante en el genoma de la celula de mamffero transducida. La expresion de Rep78 y/o Rep68 en una celula de mamffero transducida rAAV o infectada puede proporcionar una ventaja para ciertos usos del vector (rAAV) parvoviral recombinante, lo que permite la expresion a largo plazo o permanente de cualquier otro producto genico de interes introducido en la celula por el vector.
[0080] En los vectores (rAAV) parvoviral recombinantes de la invencion la al menos una secuencia(s) de nucleotido que codifica un producto genico de interes para la expresion en una celula mamffera, preferiblemente esta/estan operativamente enlazadas a al menos una secuencia de control de expresion compatible con la celula mamffera, por ejemplo, un promotor.
Muchos de estos promotores se conocen en la tecnica (ver Sambrook y Russel, 2001, supra).
Los promotores constitutivos que son en terminos generales expresados en muchos tipos de celula, tal como el promotor CMV pueden ser utilizados.
Sin embargo, mas preferidos seran los promotores que son, inducibles de tejido especffico, especifico de tipo celular o especffico de ciclo celular.
Por ejemplo, para la expresion especffica de hfgado un promotor se puede seleccionar de un promotor <1 -anti- tripsina (AAT), un promotor de globulina de union de hormona de tiroides, un promotor de albumina, un promotor LPS (globlina de union de tiroxina), un promotor hfbrido HCR-ApoCII, un promotor hfbrido HCR-hAAT, un AAT promotor combinado con el elemento intensificador de gen de albumina de raton (Ealb) y un promotor de apolipoprotefna E.
Otros ejemplos incluyen el promotor E2F para tumor selectivo y, en particular, expresion selectiva de tumor de celula neurologica (Parr et al., 1997, Nat.Med. 3:1145-9) o el IL-2 promotor para usar en celulas mononucleares de sangre (Hagenbaugh et al., 1997, J Exp Med; 185: 2101-10).
[0081] AAV es capaz de infectar un numero de celulas mamfferas.
Ver, por ejemplo, Tratschin et al. (1985, Mol.Cell Biol. 5:3251-3260) y Grimm et al. (1999, Hum.Gene Ther. 10:2445 2450). Sin embargo, la transduccion AAV de fibroblastos sinoviales humanos es significativamente mas eficaz que en celulas murinas similares, Jennings et al., Arthritis Res, 3:1 (2001) y la tropicidad celular de AAV difiere de entre los serotipos. Ver, por ejemplo, Davidson et al. (2000, Proc.Natl.Acad.Sci.EE.UU, 97:3428-3432), que discute las diferencias entre AAV2, AAV4 y AAV5 respecto al tropismo de celula CNS mamffera y eficiencia de transduccion.
En una forma de realizacion preferida, una celula huesped de la invencion es cualquier celula mamffera que se puede infectar por un virion parvoviral, por ejemplo, pero no limitado a una celula muscular, unas celulas hepaticas, una celula nerviosa, una celula glial y una celula epitelial.
En una forma de realizacion preferida una celula huesped de la invencion es una celula humana.
[0082] Preferiblemente, en la construccion, la secuencia de nucleotidos que codifica una protefna Rep parvoviral y/o una proteina capsida parvoviral esta operativamente enlazada a las secuencias de control de expresion para la expresion en una celula de insecto.
Estas secuencias de control de expresion al menos incluiran un promotor que es activo en las celulas de insecto.
Las tecnicas conocidas por un experto en la tecnica para los genes extranjeros de expresion en las celulas huesped de insecto pueden utilizarse para la practica de la invencion.
La metodologfa para ingenierfa molecular y expresion de polipeptidos en las celulas de insecto se describe, por ejemplo, en Summers and Smith. 1986.
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A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull.No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. En Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L.A. y R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L.K. Miller, V.A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman and Richardson, C.D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; US 4,745,051; US2003148506; y WO 03/074714.
Los promotores adecuados para la transcripcion de las secuencias de nucleotidos comprendidas en la primera y la segunda construccion de la invencion incluyen por ejemplo el poliedro (PolH), p10; p35, IE-1 o promotores 0IE-1 y otros promotores descritos en las referencias anteriores.
[0083] El constructo de acidos nucleicos que comprende al menos los primeros y/o segundos casetes de expresion, puede comprender ademas una secuencia de control de expresion que comprende una novena secuencia de nucleotidos de SEC.
ID N°: 9 o una secuencia de nucleotidos sustancialmente homologa para SEC.
ID N°: 9, aguas arriba del codon iniciador de la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna Rep parvoviral y/o codon iniciador de la secuencia de nucleotidos que codifica la proteina capsida parvoviral VP1.
Una secuencia con identidad sustancial a la secuencia de nucleotidos de SEC.
ID N°: 9 y que ayudara a aumentar la expresion de la protefna Rep parvoviral es por ejemplo una secuencia que tiene al menos de 60%, 70%, 80% o 90% de identidad a la novena secuencia de nucleotidos de SEQ ID N.°: 9.
[0084] La celula de insecto puede ser cualquier celula que se adecua a la produccion de protefnas heterologas. Preferiblemente la celula de insecto permite para replicacion de vectores baculovirales y se pueden mantener en el cultivo.
Mas preferiblemente la celula de insecto tambien permite la replicacion de vectores parvovirales recombinantes, incluyendo vectores rAAV.
Por ejemplo, la lfnea celular usada puede ser de Spodoptera frugiperda, Lfneas celulares de Drosophila o lfneas celulares de mosquito, por ejemplo, lfneas celulares derivadas Aedes albopictus.
Las celulas de insecto preferidas o lfneas celulares son celulas de las especies de insecto que son susceptibles de infeccion de baculovirus, incluyendo por ejemplo S2 (CRL-1963 ATCC), Se301; SeIZD2109, SeUCR1, Sf9; Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1; Tn368, HzAm1; Ha2302, Hz2E5, High Five (Invitrogen, CA, EE.UU) y expresSF+® (US 6,103,526; Protein Sciences Corp., CT, USA).
Una celula de insecto preferida segun la invencion es una celula de insecto para la produccion de vectores parvovirales recombinantes.
[0085] El uno o mas constructos de acidos nucleicos del metodo de la invencion pueden estar integrados de forma estable en el genoma de la celula de insecto.
Un tecnico en la materia sabe como introducir de forma estable una secuencia de nucleotidos en el genoma de insecto y como identificar una celula con tal secuencia de nucleotidos en el genoma.
La incorporacion en el genoma se puede asistir por, por ejemplo, el uso de un vector que comprende las secuencias de nucleotidos altamente homologas para regiones del genoma de insecto.
El uso de secuencias especfficas, tales como transposones, es otra via para introducir una secuencia de nucleotidos en un genoma.
[0086] Las condiciones de crecimiento para celulas de insecto en el cultivo y produccion de productos heterologos en las celulas de insecto en el cultivo se conocen bien en la tecnica y se describen por ejemplo en las referencias citadas anteriores en ingenierfa molecular de celulas de insectos (ver tambien WO2007/046703).
[0087] En una forma de realizacion preferida del metodo de la invencion, el virion parvoviral recombinante se recupera.
La recuperacion preferiblemente comprende la etapa de purificacion de afinidad de (viriones que comprenden el) vector (rAAV) parvoviral recombinante que utiliza un anticuerpo anti-AAV, preferiblemente un anticuerpo inmovilizado.
El anticuerpo anti-AAV es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
Un anticuerpo especialmente adecuado es un anticuerpo de camelido monocatenario o un fragmento del mismo como por ejemplo obtenible de camellos o llamas (ver por ejemplo Muyldermans, 2001, Biotechnol. 74: 277-302).
El anticuerpo para purificacion de afinidad de rAAV preferiblemente es un anticuerpo que especfficamente enlaza un epftopo en una proteina capsida AAV, por lo cual preferiblemente el epftopo es un epftopo que esta presente en la proteina capsida de mas de un serotipo AAV.
Por ejemplo el anticuerpo se puede elevar o seleccionar basandose en enlace especffico para AAV2 capsida pero al mismo tiempo tambien este puede tambien especfficamente enlazar con capsidas AAV1, AAV3 y AAV5.
[0088] En un segundo aspecto, la invencion se refiere a un constructo de acidos nucleicos que comprende uno o mas casetes de expresion de la invencion como se ha definido aquf arriba.
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En una forma de realizacion preferida, el constructo de acidos nucleicos de la invencion comprende un primero y un segundo casete de expresion de la invencion y opcionalmente una secuencia de acidos nucleicos de (i). Preferiblemente, el primer promotor en el constructo de acido nucleico de la invencion es un promotor p10 y el segundo promotor es un Promotor PolH o un promotor 4xHsp27 EcRE+mfnimo Hsp70.
Mas preferiblemente, el primer promotor esta operativamente enlazado con un intensificador, preferiblemente un intensificador HR1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un promotor 4xHsp27 EcRE+mfnimo Hsp70 y el segundo promotor es un promotor PolH.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acido nucleico de la invencion es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor p10, un deltaE1 o un E1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o E1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un E1.
En otra forma de realizacion, el primer promotor en el constructo de acidos nucleicos de la invencion es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor PolH.
En otras formas de realizacion, cualquier otra combinacion del primer promotor y el segundo promotor son parte de la invencion.
El primer promotor se puede seleccionar del grupo que consiste en un Promotor PolH, promotor p10, promotor de protefna basica, un promotor inducible o un promotor deltaE1 o un Promotor E1, o cualquier otro promotor de gen de baculovirus tardfo o muy tardfo.
El segundo promotor se puede seleccionar del grupo que consiste en un Promotor PolH, promotor p10, promotor de protefna basica, un promotor inducible o un promotor deltaE1 o un Promotor E1, o cualquier otro promotor de gen de baculovirus tardfo o muy tardfo.
Mas preferiblemente, el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en un Promotor PolH, promotor p10 o promotor de protefna basica y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un Promotor E1, o cualquier otro promotor de gen de baculovirus temprano o tardfo.
[0089] En una forma de realizacion preferida el primer casete de expresion comprimido en el constructo de acidos nucleicos de la invencion, comprende un elemento intensificador tal como se ha definido anteriormente.
[0090] En un tercer aspecto, la invencion se refiere a una celula de insecto tal como se ha definido anteriormente.
[0091] En un cuarto aspecto, la invencion se refiere a un equipo que comprende (a) un constructo de acidos nucleicos que comprende el primer y segundo casete de expresion tal como se ha definido anteriormente; y (b) un constructo de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un sitio de clonacion multiple para un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion terminal invertida parvoviral, cuyo transgen esta operativamente enlazado a un promotor capaz de dirigir la expresion del transgen en una celula huesped.
[0092] En una forma de realizacion preferida, el constructo de acidos nucleicos (b) comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion terminal invertida parvoviral, cuyo transgen esta operativamente enlazado a un promotor capaz de dirigir la expresion del transgen en una celula huesped.
[0093] El equipo puede comprender ademas celulas de insecto y una secuencia de acidos nucleicos que codifica funciones auxiliares de baculovirus para la expresion en la celula de insecto.
[0094] En otro aspecto la invencion se refiere a un lote de viriones parvovirales producido en los metodos descritos anteriormente de la invencion.
Un "lote de viriones parvoviral" aquf se define como todos los viriones parvovirales que se producen en el mismo ciclo de produccion, opcionalmente por el contenedor de celulas de insecto.
En una forma de realizacion preferida, el lote de viriones parvovirales de la invencion comprende una proporcion virion completo:virion total como se ha descrito anteriormente y/o una proporcion virion completo: vacfo como se ha descrito anteriormente.
[0095] En este documento y en sus reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los aspectos seguidos a la palabra se incluyen, pero los aspectos no especfficamente mencionados no se excluyen.
Ademas, la referencia a un elemento por el artfculo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que mas de uno de los elementos esten presentes, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos.
El artfculo indefinido "uno" o "una" asf normalmente significa "al menos uno".
[0096] Los ejemplos siguientes ilustran la invencion:
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Ejemplos Ejemplo 1
1.1 Materiales y metodos
1.1.1 Generacion de baculovirus recombinante
[0097] Los constructos siguientes fueron generados:
1.1.1.1 Construccion de pVD118(new)
[0098] PVD118 (new) es un vector de control que incluye un casete de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos de Rep78 bajo el control del promotor p10 y un casete de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos de genes Cap bajo el control del poliedro promotor (PolH o pPH). PVD118 (new) fue construido como se muestra en la figura 1.
Antes del plasmido final pVD118(new) se podrfa hacer el predecesor pFastBac doble Rep78/ACG y pVD118 (lot#1) fue construido.
En resumen, el plasmido REP-ACG/PSC (solicitud de patente WO2007148971 aquf tambien referido como pVD88) pVD88 fue digerido con salientes Spel* Xbal y 5' salientes se hicieron romos.
El 2057bp fragmento fue aislado a partir de un gel de agarosa, purificado y ligado en el con Smal linealizado pFastBac doble (Invitrogen), dando como resultado pFastBac doble Rep78/ACG.
Luego, este plasmido fue digerido con BstZ17I y SnaBI y el fragmento 2537bp p10 Rep78/ACG fue aislado y ligado en el BstZ17I linealizado pVD84, generando pVD118 (lot#1).
Sin embargo, la orientacion del casete de expresion Rep78/ACG fue incorrecta y por lo tanto eliminada mediante la realizacion de una digestion con NheI* B1pI.
Despues de producir los salientes 5' romos, el fragmento de vector 12431bp fue aislado y purificado de gel. Posteriormente, el 2057bp fragmento purificado de REP-ACG/PSC fue ligado en el vector y la mezcla de transformacion fue transformada para celulas competentes qufmicamente TOP10 (Invitrogen) y colocada en placas que contienen ampicilina.
El analisis de restriccion con NaeI*SacI fue realizado en el ADN aislado de cultivos de minipreparacion.
Los clones correctos proporcionan fragmentos con un tamano de 2204bp y 12292bp.
1.1.1.2 Construccion de pVD118 (new) + HR1
[0099] PVD118 (new) + HR1 es lo mismo que pVD118, con la adicion de un hr1 intensificador que esta situado entremedias del p10 y promotor de poliedro y fue construido como se muestra en la figura 2.
Brevemente, un PCR realizado en ADN vfrico AcMNPV (Protein Sciences Corporation, Meriden, USA) con cebadores HR1-F w 5 ' -gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3 (SEQ ID N.°: 10) y H R 1-R v 5 ' -
gtatacgatcgattattgctccaatactag-3 (SEC ID No:11) resulto en un producto de 904bp que se clona al vector de pCRII- blunt-TOPO (Invitrogen).
Despues de la digestion con BstZ17I el fragmento 898bp fue aislado de gel, purificado y ligado en el vector pVD118(new) que se abrio con BstZ17I y defosforilado.
Las digestiones de control de clones correctos con SpeI*EcoNI resultaron en fragmentos de 1269bp y 14125bp.
1.1.1.3 Construccion de pVD84 (+p10 Rep) (=pVD165)
[0100] PVD165 es un vector de control que incluye un casete de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos de Rep78 donde el codon de inicio ha sido mutado en ACG bajo el control del promotor p10 y un casete de expresion que comprende la secuencia de nucleotidos de genes Cap bajo el control del promotor PolH.
Los casetes de expresion estan en direccion opuesta en el plasmido. Pvd165 fue construido como se muestra en la figura 3.
Brevemente, un PCR realizado en pVD118 (new) con cebadores poliA Fw 5'-agatct gtagtggctatggcagggc-3 (SEC ID No:12) y p10 Rv 5'-agatct cccggg acggacctttaattcaacccaac-3 (SEQ ID N.°: 13) resulto en un producto de 2566bp que fue clonado al vector (Invitrogen) pCRII-blunt-TOPO.
Despues de la digestion con Bg 11I el fragmento 2541bp fue aislado de gel, purificado y ligado en el pVD84 vector que se abrio con Bg 11I y defosforilado.
Las digestiones de control de clones correctos con SpeI*XbaI resultaron en fragmentos de 1269bp y 11810bp.
1.1.1.4 Construccion de pVD165 + HR1
[0101] PVD165 + HR1 es lo mismo que pVD165, con la adicion de un hr1 intensificador aguas abajo del promotor p10 y fue construido como se muestra en la figura 4.
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Brevemente, un PCR realizado en ADN vfrico AcMNPV con cebadores HR1-Fw 5'-gtatacgtatgacact atcgatgttgac-3 (SEQ ID N.°: 10) y HR1-Rv 5'-gtatacgatcgattattgctccaatactag-3' (SEQ ID N.°: 11) resulto en un producto de 904bp que fue clonado al (Invitrogen) vector pCRII-blunt-TOPO.
Despues de la digestion con BstZ17I el 898bp fragmento fue aislado del gel, purificado y ligado en el pVD165 vector que se abrio con SmaI y defosforilado.
Las digestiones de control de clones correctos con ClaI resultaron en fragmentos de 875bp, 1184bp, 4160bp y 9180bp.
1.1.1.5 Construccion de pVD165 con promotor inducible aguas arriba Cap (pVD165 + 4xEcRE CAP)
[0102] PVD165 + 4xEcRE tapa es similar al pVD165, pero comprende un promotor inducible en vez del promotor poliedro (pPH). PVD165 + 4xEcRE CAP fue construida como se muestra en la figura 5.
Brevemente, el promotor inducible, que comprende 4 EcRE consecutivos, un promotor mfnimo hsp70 (Poels et al.Insect Biochem Mol Biol 2004,34(5):451-458) y parte de la secuencia codificante de CAP, fue sintetizada y ligada en el pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen).
Despues de la digestion con BstZ17I y EcoNI el 375bp fragmento fue aislado de gel, purificado y ligado en el pVD165 vector que se abrio con BstZ17I y EcoNI.
Las digestiones de control de clones correctos con PmeI*EcoRV resultaron en fragmentos de 2554bp y 12116bp.
1.1.1.6 Construccion de pVD165 con promotor inducible aguas arriba de Rep (pVD165 + 4*EcRE Rep78-52)
[0103] PVD165 + 4*EcRE Rep78 es similar al pVD165, pero comprende un promotor inducible en vez del promotor p10. PVD165 + 4*EcRE Rep78 fue construido como se muestra en la figura 6.
Brevemente, el promotor inducible que consiste fuera de 4 EcRE consecutivos y un promotor mfnimo hsp70 fue sintetizado y ligado en el pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen).
Despues de la digestion con BstZ17I y SpeI el 290bp fragmento fue aislado de gel, purificado y ligado en el vector pVD165 que se abrio con SmaI y SpeI.
Las digestiones de control de clones correctos con SpeI*Bg1II resultaron en los fragmentos de 298bp, 2376bp y 11954bp.
1.1.1.7 Construccion de pVD190 construccion (deltaIE1 CAp + pPolh Rep)
[0104] DeltaIE1 Cap + pPolh Rep es similar al pVD165, pero comprende un promotor delta IE1 en vez del pPH promotor y un pPromotor PolH en vez de del promotor p10.
DeltaIE1 Cap + pPolh Rep fue construido como se muestra en la figura 7 y 8.
Aquf, un vector precursor fue construido de la siguiente manera.
Un PCR realizado en pFBDSLR (Urabe et al. Human gene therapy. 2002,13(16):1935-1943) con cebadores BstZ17I- deltaIE1 Fw: 5'-ggtcc gtatacgacgataacgccgttggtggcg-3 (SEC ID No:14) y AflII-delta IE1 Rv: 5'- cgacttaagacggcgaattctgc agatggc-3 (SEQ ID N.°: 15) resulto en un producto de 181 bp que fue clonado al vector de pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen).
Despues de la digestion con BstZ17I*Af1 II el 165bp fragmento fue aislado de gel, purificado y ligado en el pVD165 + 4xEcRE vector Cap que se abrio con BstZ17I y Af1 II.
El plasmido resultante es pVD165 + CAP deltaIE1 y la digestion de control con BstZ17I*Af1II deberfa suponer los fragmentos 165bp y 14374bp.
Posteriormente, el promotor de polihedrina fue clonado delante del Rep casete de expresion en pVD165 + deltaIE1 Cap. Aquf, un PCR con cebadores SmaI-pPolh Fw: 5'-tctcccgggagatcatggaga taattaaaatgataac-3 (SEC ID No:16) y SpeI-pPolh Rv: 5'- gttactagtgagctcgtcgac-3 (SEC ID No:17) fue realizado en pVD88.
Esto genero un producto PCR de 198bp que fue clonado al vector de pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen).
Despues de la digestion con SpeI*SmaI el 188bp fragmento fue aislado de gel, purificado y ligado en el vector pVD165 + deltaIE1 Cap que se abrio con SpeI y SmaI.
Finalmente, esto resulto en el constructo pVD165 + deltaIE1 CAP.
1.1.1.8 Construccion del constructo p10-Cap-pPolh-Rep
[0105] El constructo p10 Cap + pPolh Rep es similar al constructo delta-IE1-Cap-pPolh-Rep, pero comprende un promotor p10 en vez del promotor delta-IE1 delante del casete de expresion Cap y fue construido como se muestra en la figura 9.
Un PCR realizado en pFastBac doble con cebadores BstZ17I-p10 Fw: 5'-agtatacggacctttaattcaac-3' (SEC ID No:18) y AflII-p10 Rv: 5'-cgacttaagagcgggccgctttcgaatc-3' (SEQ ID N.°: 19) resulto en un producto de 171 bp que fue clonado al vector pCRII-blunt-TOPO (Invitrogen).
Despues de la digestion con BstZ17I*AflII el 160bp fragmento fue aislado de gel, purificado y ligado en el constructo delta-IE1-Cap-pPolh-Rep que fue abierto con BstZ17I y AflII.
1.1.1.9 Construccion de pVD194 (Rep78/CTG(delta ATG))
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[0106] Un plasmido rep con un CTG codon de inicio sin algunos sitios ATG internos fue primero construido por la sintetizacion del gen necesario segun la secuencia expuesta en SEQ ID N.°: 31.
El gen rep fue luego eliminado del plasmido pVD88 usando enzimas de restriccion RsrII y Xbal.
El gen sintetizado fue luego ligado en el plasmido pVD88 usando sitios de restriccion RsrII y Xbal para proporcionar pVD195. PVD195 fue luego digerido con BglII., dando como resultado fragmentos 9297bp y 2231bp.
Los salientes 5' fueron luego llenados de Klenow y luego digeridos con SexAI.
Esto produce fragmentos 9297bp, 1372 y 859bp.
El 859bp fragmento luego se aislo.
El vector necesario fue generado digiriendo pVD165 con SpeI para dar un 14501bp fragmento lineal.
Los 5' salientes fueron llenados de Klenow y luego digeridos con SexAI para producir fragmentos 13600bp y 901 bp.
El fragmento 13600bp fue aislado.
El 859bp BglII(Klenow)*SexAI fragmento fue luego ligado en pVD165 (SpeI(Klenow)*SexAI) para producir pVD194 (ver Fig. 10).
Una digestion de control con SexAI*XmaI deberfa suponer fragmentos de 13435bp y 1029bp
1.1.1.10 Construccion de pVD84
[0107] Para convertir el sitio de inicio del vector de expresion de baculovirus pFBAAV1VPm11 (Urabe et al., 2002, Hum.Gene Ther. 13: 1935-1943) de ACG a GTG un PCR fue realizado utilizando los cebadores siguientes:
La secuencia de cebador directo contiene un sitio de BamHI (cebador AMT #169 SEC ID NO:29)
5'- TTAGGATCCTGTTAAGGTGGCTGCCGACGG -3
La secuencia de cebador inverso contiene un sitio StuI (cebador AMT #158 SEC ID NO:30)
5'- GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC -3 sitio de inicio
Sitio de inicio
Cebador directo Cebador inverso AMT plasmid# (Bac- toBac) AMTplasmid# (PSC)
GTG
169 158 pVD63 pVD84
[0108] El PCR que usa cebadores #169 y #158 se realizo y el producto PCR (250bp) fue purificado utilizando el equipo de purificacion PCR (Qiagen Lot#11879372) y cortado con enzimas de restriccion BamHI y StuI.
El vector de expresion de baculovirus fue tambien digerido con BamHI y StuI.
La defosforilacion siguiente del vector con SAP (Promega Lot#17501504), tanto el inserto (Cap con sitio de inicio GTG) como el vector fueron purificados en el gel.
Despues del ligamiento de vector e inserto, fueron transformados en celulas competentes qufmicamente DH5( (Invitrogen Lot#1241753) y estriados sobre placas LB que contienen ampicilina.
El ADN de pVD63 (Cap/ sitio de inicio GTG) fue purificado y examinado para identificar usando analisis de secuencias por BaseClear y restriccion.
[0109] Para clonar el gen Cap con el GTG sitio de inicio en el vector de expresion de baculovirus pPSC10 (Protein Sciences) fue cortado de pVD63 con SmaI y AvrII y ligado en el vector de expresion defosforilado que se abrio con EcoRV y XbaI.
Posteriormente, la mezcla de ligamiento fue transformada en celulas competentes qufmicamente DH10® (invitrogen lot# 1268527) y estriadas sobre placas LB de ampicilina.
Despues del aislamiento de minipreparacion de ADN utilizando el equipo de minipreparacion Qiaprep Spin (Qiagen lot #12180218) se selecciono una minipreparacion (clon #13) por analisis de restriccion con SphI.
Con este clon ADN (pVD84) fue purificado con el equipo midiprep SNAP (solucion de Invitrogen Lot#1256921 y columna Lot#1259367).
La identidad de pVD84 fue controlada por analisis de secuencias alrededor del codon de inicio realizado por BaseClear y por analisis de restriccion con BamHI y SphI (SEC ID NO:28).
1.1.1.11 Produccion de baculovirus recombinante
[0110] Recombinante Bac.VD118(new), Bac.VD118(new)+HR1; Bac.VD165, Bac.VD165+HR1, Bac.VD165+4xEcRE tapa, Bac.VD165+4*EcRE Rep78; Bac.VD190 y Bac.VD194 (p0) fueron generados con el Protein sciences system (Protein Sciences Corporation, Meriden, USA).
El Baculovirus recombinante fue amplificado por la dilucion de estos 1:100 en 2x106 celulas SF+ por ml.
Tres dfas despues de la infeccion las celulas fueron centrifugadas y se recupero el sobrenadante que contenfa el virus. La amplificacion de pasajes siguientes fue realizada de la misma manera.
1.1.2 Produccion rAAV
[0111] Los lotes rAAV fueron producidos segun Urabe et al., 2002 (supra), pero con la excepcion de que dos baculovirus recombinantes fueron usados en vez de tres.
Un baculovirus albergo un constructo de expresion bajo el control del promotor CMV y se flanquea por ITR AAV.
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El otro baculovirus es el Rep-Cap baculovirus que albergo dos casetes de expresion, uno para el gen de replicacion AAV y uno para la capsida AAV.
La expresion de la replicacion o gen capsida bajo el control del promotor inducible fue regulada por adicion de 0.001 - 1 uM Ponasterone A al medio de cultivo.
Los experimented de produccion diferentes rAAV1 fueron realizados con existencias de baculovirus Bac.VD43 p5 con el transgen LPL bajo control del promotor CMV y pasajes diferentes (p3, p4 o p5) del Rep/Cap baculovirus.
En cada experimento la rAAV1 produccion estandar (Bac.VD88:Bac.VD84:Bac.VD43 con proporcion 5:1:1) se llevo como un control.
1.1.3 Determinacion completa/total de partfcula AAV
[0112] Para determinar la proporcion de capsidas totales frente a completas, la cantidad de copias de genoma (gc) se divide por la cantidad de partfculas AAV totales.
La cantidad de GC/ml se midio por ensayo Q-PCR y la cantidad de partfculas AAV totales se determino con un enzimoinmunoanalisis de Progen (ver debajo).
Para la mezcla de reaccion Q-PcR SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosysttems, #4309155) se uso segun las instrucciones del productor (25 pl volumen total; programa PCR: 10 min 95°C, 40 ciclos de 15 seg 95°C y 1 min 60°C) usando uno de los siguientes conjuntos de cebador:
Pr59 AATGGGCGGTAGGCGTGTA CMV SEQ ID N.°: 26
pr60 AGGCGAT CT GACGGTT CACT AA CMV SEQ ID N.°: 27
[0113] La proporcion se compara con la proporcion obtenida bajo las condiciones de produccion estandar, utilizando una 5:1:1 proporcion en volumen de Bac.Rep, Bac.Cap y Bac.ITR.
1.1.4 Analisis de electrotransferencia
[0114] Tres dfas despues, las celulas de produccion rAAV fueron lisadas anadiendo 0.1V 10 x TRIS tampon de lisis (1.5M NaCl, 0.5M tRiS, 0.01M MgCl, 1% Triton X-100, pH8.5, filtro esterilizado) e incubadas en hielo durante 30 minutos.
ADN y ARN desnudos fue degradado por incubacion con benzonasa a 37°C durante 15 minutos.
El lisado celular fue centrifugado (1,900 x g; 15 min; 4°C).
El tampon de muestra NuPage LDS (4x; Invitrogen) fue adicionado a una muestra del sobrenadante y fue cargado sobre un gel 4-12% Bis-Tris (120V).
Las protefnas fueron transferidas sobre una membrana PVDF (BioRad) durante 30 minutos, 10V (transferencia semiseca).
Inmunoqufmica Western fue realizada por el bloqueo de la membrana con el tampon de bloqueo Superblock-PBS (PIERCE) e incubacion posterior con raton anti-Rep (303.9, Progen, Germany; dilution 1:50) y conejo anti-raton HRP (DAKO, dilucion 1:500).
Las protefnas fueron visualizadas por coloracion quimioluminiscente con lumi-luz mas sustrato de transferencia Western (Roche).
1.1.5 Total rAAV1 partfcula ELISA
[0115] La cantidad total de rAAV1 partfculas (tp) hecha en cada produccion se determino con el AAV1 equipo de titulacion de ELISA (Progen, Heidelberg, Alemania) y se realizo segun el protocolo suministrado por el fabricante, pero con la excepcion de que todas las muestras y controles fueron pre-diluidos en el volumen de lisado crudo (CLB).
Brevemente, el CLB fue hecho por la cosecha de expressSF+ celulas despues de tres dfas, anadiendo 10X tampon de lisis y la incubacion durante 1h a 28°C.
Despues del tratamiento con benzonasa durante 1h a 37°C, el lisado fue centrifugado a 1900g y el sobrenadante fue almacenado a 4°C.
Para determinar las rAAV1 partfculas totales en el lisado crudo de cada produccion las muestras fueron pre-diluidas 50-pliegues en CLB, esta es la dilucion de inicio.
Luego las diluciones extra de 250,1250 y 6250-pliegues se hicieron en el CLB.
La lfnea estandar fue tambien diluida en el CLB.
Las muestras de produccion con Bac.VD190 fueron solo unos 50 y 100 pliegues diluidos, debido a los niveles de expresion bajos de las proteinas capsida.
1.1.6 Analisis de partfcula total usando HPLC
[0116] Las materias primas AAV-1 desconocidas estan inyectadas en el sistema de HPLC, dando como resultado un valor maximo en el cromatograma.
Este valor maximo se puede integrar por Chemstation-software y representa la cantidad de partfculas totales inyectadas.
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Una materia prima concentrada AAV-1 fue valorada para su cantidad de partfculas totales por mililitro por microscopfa electronica y ajustada en el metodo.
Usando este estandar como un calibrador, la cantidad de partfculas totales del desconocido pueden ser calculadas. Ademas, cuando se inyecta una cantidad particular de copias genomicas (que aproximadamente representa la cantidad de partfculas completas) en el rango de lo estandar, la proporcion de partfculas completas y vacfas puede ser estimada.
1.2 Resultados
Proporcion de partfcula AAV completa: vacfa mejora tras el uso de dos sistemas baculovirus, en particular con una expresion de protefna alta Rep y expresion de protefna Cap moderada
[0117] Tres constructos fueron investigados en detalle, pVD165; pVD190 y pVD194.
[0118] Para determinar la proporcion total/completa para partfculas rAAV1 producidas con Bac.VD165 la concentracion de partfcula total en los lisatos crudos fue determinada en dos experimentos independientes.
Los resultados de estos ELISA y las proporciones totales/completas correspondientes se muestran en la tabla 1.
Tabla 1: la proporcion total/completa de rAAV1 producida con la materia prima de baculovirus Bac.VD165.
La concentracion de partfcula total se determino con la partfcula total AAV1 ELISA.
La concentracion de partfcula completa se determino por Q-PCR. Las proporciones totales/completas pueden solo __________________ser en comparacion con el control producido en el mismo experimento__________________
Bac.VD165
Bac.VD43 Concentracion de partfcula Total (TP/ml) Concentracion de partfcula completa (GC/ml) Proporcion total/completa (TP/GC)
#1
Control 7.07E+12 2.05E+10 345
1:1 4.91E+11 2.24E+09 219
5:1 8.3E+11 5.0E+09 166
#2
Control 3.19E+13 1.99E+10 1603
1:1 6.32E+11 6.33E+08 998
5:1 1.30E+12 1.10E+09 1182
[0119] La proporcion total/completa para las 1:1 producciones es en ambos experimentos 1.6 veces mejorada en comparacion con el control.
Para la produccion 5:1 la proporcion total/completa es 2.1 y 1.4 veces mejor en comparacion con el control.
En conclusion, la proporcion total/completa se mejora para las rAAV1 partfculas producidas con Bac.VD165.
[0120] En Bac.VD190, el casete de expresion Cap esta bajo control del OIPromotor E1 debil.
Esto puede suponer una expresion de capsida inferior que en las producciones realizadas con el otro Rep/Cap baculovirus o en la situacion de control, porque en todas aquellas condiciones la expresion CAP se induce por el promotor de polihedrina fuerte.
Para probar esta hipotesis de dos experimentos diferentes realizados con Bac.VD190 la concentracion de partfcula total fue determinada.
Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: proporcion total/completa de rAAV1 producida con la materia prima de baculovirus Bac.VD190.
La concentracion de partfcula total fue determinada con la partfcula ELISA total AAV1.
La concentracion de partfcula completa fue determinada por Q-PCR.
Las proporciones totales/completas pueden solo ser en comparacion con el control producido en el mismo
experimento
Bac.VD190: Bac.VD43
Concentracion de partfcula Total (TP/ml) Concentracion de partfcula completa (GC/ml) Proporcion total/completa (TP/GC)
#1
Control 3.19E+13 1.99E+10 1603
1:1 8.6E+10 5.97E+09 14
5:1 3.62E+11 1.8E+09 201
#2
Control 6.11E+12 4.03E+10 152
1:1 3.75E+11 1.74E+09 216
5:1 3.44E+11 3.12E+09 110
Los resultados de produccion # 1 (tabla 2) muestran que las proporciones totales/completas obtenidas por las producciones 1:1 y 5:1 fueron 114 y 8 veces mejoradas en comparacion con el control, respectivamente.
En la produccion # 2, la proporcion total/completa es 1.4 veces inferior o 1.4 veces mas alta para la 1:1 o 5:1 produccion.
En conclusion, la proporcion total/completa parece tambien estar mejorada para las partfculas rAAV1 producidas
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con Bac.VD190 (como fue observada para Bac.VD165)._________________________________________________
[0121] Para Bac.VD194, el analisis de electrotransferencia se efectuo para determinar la expresion Rep y Cap.
Por consiguiente, tres dfas despues las celulas fueron infectadas con 2 proporciones de baculovirus diferentes (es decir 1:1 y 9:1, con 5:1:1 para los tres componentes de control) lisatos celulares fueron cosechados y sometidos al analisis de electrotransferencia.
Como se muestra en la figura 11A, la expresion CAP es baja en la produccion con la proporcion 1:1 de baculovirus, pero la produccion con la proporcion 9:1 es comparable a los tres componentes de control.
Sin embargo, para las producciones de proporcion 1:1 y 9:1, la expresion Rep se reduce espectacularmente en comparacion con los tres componentes de control.
La Figura 11B, sin embargo, muestra que la produccion de virus fue superior en las producciones con Bac.VD194.
El hecho de que la produccion sea mas alta, pero la expresion CAP sea inferior indica un total mas favorable: proporcion completa.
Nuevamente, la conclusion es que los dos sistemas de componentes con cantidades equimolares Rep y Cap, en particular con expresion alta Rep y Cap moderada, lleva a una proporcion inferior total:parcial (es decir, un porcentaje superior de partfculas rellenadas).
Ejemplo 2
Materiales y metodos
[0122] Tres matraces de agitacion (todos cultivados a 28°C antes de la infeccion) fueron inoculados con inoculo P5 4 mL Bac.VD43,4 mL Bac.VD84 y 20 mL Bac.VD88.
Los agitadores fueron incubados durante el 72 horas de produccion vinca a tres temperaturas diferentes (26, 28 y 30°C).
[0123] El tratamiento de lisis de todos los matraces de agitacion se efectuo dentro de 1 incubador de agitacion utilizando 0.9% (v/v) Triton X-100.
Despues de la adicion de tampon de lisis, los agitadores fueron incubados durante 30 minutos a un valor de ajuste de 28°C, la benzonasa fue anadida (16 pL por 400 mL) y los agitadores fueron incubados durante 1 hora a un valor de ajuste de 37°C.
Despues del tratamiento de benzonasa, todos los matraces de agitacion fueron colocados para aclaramiento vfrico durante toda la noche a 29°C, seguidos de almacenamiento a 4°C durante maximo 3 dfas.
[0124] Fuera de cada incubador de agitacion, 200 ml de volumen lisado crudo fue procesado en una columna de afinidad de 1 mL utilizando un caudal de 1 mL/min.
Despues del lavado, el producto fue eluido utilizando PBS, pH 3.5.
Resultados
[0125] Las concentracion de celulas en proceso de los matraces de agitacion usados para el estudio de temperatura se muestran en la tabla 1.
Un aumento de temperatura correlaciona con una reduccion de concentracion de celulas total y viabilidad en el momento de la cosecha.
La viabilidad obtenida a 28°C fue comparable a los resultados obtenidos con el sistema de biorreactor de onda.
Tabla 1: producciones de agitacion de recuentos de celula en proceso
Matraz de coctelera (Lote N°)
Antes de la infeccion Antes de la adicion del tampon de lisis
Celula Total conc. (#/ml) Viabilidad (%) Celula Total conc. (#/ml) Viabilidad (%)
Temperatura de infeccion de matraz de agitacion 26°C (Lote N° 0078)
1.89x106 99.5 2.74x106 85.7
Temperatura de infeccion de matraz de agitacion 28°C (Lote N° 0078)
1.89x106 99.5 2.51 X106 74.9
Temperatura de infeccion de matraz de agitacion 30°C (Lote N° 0078)
1.89x106 99.5 2.42 X106 61.0
[0126] Los resultados de la prueba de las masas lisadas crudas y eluatos de los matraces de agitacion se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: proporcion total:completa de partfculas rAAV producidas a temperaturas diferentes.
Matraz de agitacion (Lote N°)
Partfculas Totales (TP/ml) metodo de HPLC Q-PCR CLB (GC/ml) Eluato Q-PCR (GC/ml) Proporcion total:completa (TP/GC)
Matraz de agitacion 26°C (Lote N° 0078)
6.14x1012 1.28x101U 5.52x1010 111
Matraz de agitacion 28°C (Lote N° 0078)
6.58 X1012 2.00x101U 1.43x1011 46
Matraz de agitacion 30°C (Lote N° 0078)
7.24x1012 3.94x1010 1.73 X1011 42
Discusion y conclusion:
[0127] Aumentar la temperature durante la produccion rAAV en celulas SF+, aumenta ligeramente la cantidad total 10 de partfculas rAAV que se producen, pero aumenta la cantidad de partfculas completas que se producen mas, conduciendo a una proporcion disminuida total:completa.

Claims (13)

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    1. Metodo para la produccion de un virion parvoviral recombinante, donde el metodo comprende los pasos de:
    (a) proporcionar una celula de insecto que comprende uno o mas constructos de acidos nucleicos que comprenden:
    (i) una secuencia de nucleotidos que comprende un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos terminales invertidas de repeticion parvoviral;
    (ii) un primer casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna Rep parvoviral que esta operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de dirigir la expresion de la protefna Rep en la celula de insecto;
    (iii) un segundo casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina capsida parvoviral que esta operativamente enlazada a un segundo promotor que es capaz de dirigir la expresion de la proteina capsida en la celula de insecto;
    (b) cultivo de la celula definida en (a) bajo una condicion propicia para la expresion de la proteina Rep y capsida;
    y,
    (c) opcionalmente recuperacion del virion parvoviral recombinante;
    donde los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en un constructo de acidos nucleicos unico, donde los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en la cantidad equimolar en la celula de insecto, donde el primer promotor es seleccionado del grupo que consiste en un promotor PolH, promotor p10 o promotor basico y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un promotor E1.
  2. 2. Un metodo, segun la reivindicacion 1, donde la proporcion de expresion de la proteina Rep contra la proteina capsida se regula por uno o mas de lo siguiente:
    (a) la presencia de mas elementos intensificadores y/o mas fuertes en el primer casete de expresion en comparacion con el segundo casete de expresion;
    (b) la secuencia de nucleotidos que codifica la protefna Rep parvoviral tiene un fndice de adaptacion de codon mas alto en comparacion con la secuencia de nucleotidos que codifica la proteina capsida; y/o
    (c) optimizacion de la temperatura de la protefna Rep parvoviral.
  3. 3. Metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, donde la secuencia de nucleotidos de (iii) comprende un marco de lectura abierto que comprende las secuencias de nucleotidos que codifican las proteinas capsidas VP1, VP2 y VP3.
  4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia de nucleotidos de (ii) comprende un marco de lectura abierto que comprende unas secuencias de nucleotidos que codifican al menos una de las proteinas Rep78 y Rep68.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, donde la secuencia de nucleotidos de (ii) comprende un marco de lectura abierto que comprende secuencias de nucleotidos que codifican al menos una de las proteinas Rep78 y Rep 68.
  6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde al menos un marco de lectura abierto que comprende unas secuencias de nucleotidos que codifican las proteinas capsidas VP1, VP2 y VP3 o al menos un marco de lectura abierto que comprende un marco de lectura abierto que comprende unas secuencias de nucleotidos que codifican al menos una de las proteinas Rep78 y Rep68 no comprende un intron artificial.
  7. 7. Metodo, segun la reivindicacion 6, donde ningun marco de lectura abierto que comprende las secuencias de nucleotidos que codifican las proteinas capsidas VP1, VP2 y VP3 y/o ningun un marco de lectura abierto que comprende las secuencias de nucleotidos que codifican al menos una de las proteinas Rep78 y Rep68 comprende un intron artificial.
  8. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el primer casete de expresion comprende al menos un elemento intensificador de baculovirus y/o al menos un elemento que reacciona a la ecdisona.
  9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, donde el elemento intensificador se selecciona del grupo que consiste en hr1, hr2, hr3, hr4 y hr5.
  10. 10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la secuencia ITR parvoviral, protefna Rep parvoviral y/o protefna Cap parvoviral provienen de un virus adeno-asociado (AAV).
  11. 11. Constructo de acidos nucleicos que comprende un primer y un segundo casete de expresion tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, donde:
    (a) el primer promotor es un promotor PolH y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o E1;
    (b) el primer promotor es un promotor p10 y el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un E1; y donde el primer casete de expresion opcionalmente comprende un elemento intensificador.
  12. 12. Celula de insecto tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, donde la celula de insecto comprende uno o mas constructos de acidos nucleicos que comprenden:
    (i) una secuencia de nucleotidos que comprende un transgen que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion terminal invertida parvoviral;
    5 (ii) un primer casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protefna Rep
    parvoviral que esta operativamente enlazada a un primer promotor que es capaz de dirigir la expresion de la protefna Rep en la celula de insecto;
    (iii) un segundo casete de expresion que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina capsida parvoviral que esta operativamente enlazada a un segundo promotor que es capaz de dirigir la 10 expresion de la proteina capsida en la celula de insecto;
    donde los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en un constructo de acidos nucleicos unico, donde los primeros y segundos casetes de expresion estan presentes en la cantidad equimolar en la celula de insecto, donde el primer promotor esta seleccionado del grupo que consiste en un promotor PolH, promotor p10 o promotor basico y donde el segundo promotor es un promotor deltaE1 o un promotor E1.
    15
  13. 13. Un equipo que comprende
    (a) un constructo de acidos nucleicos que comprende el primer y segundo casete de expresion tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-10; y
    (b) un constructo de acidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un sitio de
    20 clonacion multiple para un transgen, que se flanquea por al menos una secuencia de nucleotidos de repeticion
    terminal invertida parvoviral, donde el transgen esta operativamente enlazado a un promotor capaz de dirigir la expresion del transgen en una celula huesped.
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Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2929031T3 (es) * 2008-02-19 2022-11-24 Uniqure Ip Bv Optimización de la expresión de las proteínas rep y cap parvovirales en células de insecto
EP3792348A3 (en) 2010-03-11 2021-06-23 uniQure IP B.V. Mutated rep encoding sequences for use in aav production
WO2011112090A2 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Method for identifying variant rep protein encoding nucleic acids
EP2480678B1 (en) * 2010-09-02 2014-02-12 Molmed SpA Stable production of lentiviral vectors
CN102492692B (zh) * 2011-12-16 2013-07-10 西南大学 增强子Hr3
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
SG11201503289XA (en) 2012-11-15 2015-05-28 Univ Singapore Univariant extrinsic initiator control system for microbes and an in vitro assembly of large recombinant dna molecules from multiple components
EA036394B1 (ru) 2013-10-24 2020-11-05 ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В. Псевдотипированный вектор на основе аденоассоциированного вируса aav-5 для генной терапии неврологических заболеваний
IL259321B2 (en) 2014-03-17 2023-10-01 Univ Washington Preparations and methods for increasing gene expression in frogs
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
CN107106689A (zh) 2014-11-05 2017-08-29 沃雅戈治疗公司 用于治疗帕金森病的aadc多核苷酸
MX2017006216A (es) 2014-11-14 2018-08-29 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y métodos para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ela).
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
EA035747B1 (ru) 2014-11-28 2020-08-05 ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В. Днк-примеси в композиции, содержащей парвовирусный вирион
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
CN108064292B (zh) 2014-12-24 2021-05-04 尤尼克尔生物制药股份有限公司 RNAi诱导的亨廷顿蛋白基因抑制
CN114480502A (zh) 2015-03-02 2022-05-13 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
EP3384035A4 (en) 2015-12-02 2019-08-07 Voyager Therapeutics, Inc. ASSAYS FOR DETECTION OF NEUTRALIZING ANTIBODIES OF VAA
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
MX2018012663A (es) 2016-04-16 2019-07-08 Univ Florida Metodos para aumentar la capacidad de actividad biológica del virus adenoasociado recombinante producido mediante el sistema baculovirus.
KR20230079511A (ko) * 2016-04-21 2023-06-07 바이로베크 인코포레이티드 곤충 세포에서의 aav 생산, 및 이를 위한 방법 및 조성물
US11326182B2 (en) 2016-04-29 2022-05-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
EP3831281A1 (en) 2016-08-30 2021-06-09 The Regents of The University of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
JP2019534018A (ja) * 2016-11-07 2019-11-28 スパーク セラピューティクス インコーポレイテッドＳｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｒａｂエスコートタンパク質の力価アッセイ
WO2018109207A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Uniqure Ip B.V. Immunoadsorption
EP3619308A4 (en) 2017-05-05 2021-01-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT FOR HUNTINGTON'S MORBUS
CA3061652A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
EA202090260A1 (ru) 2017-07-10 2020-05-08 ЮНИКЬЮРЕ АйПи Б.В. Средства и способы для генотерапии aav у человека
JP7229989B2 (ja) 2017-07-17 2023-02-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 軌道アレイガイドシステム
KR20200044793A (ko) 2017-08-03 2020-04-29 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
EP3688014A4 (en) 2017-09-29 2020-09-16 Massachusetts Eye and Ear Infirmary PRODUCTION OF ADENO-ASSOCIATED VIRUSES IN INSECT CELLS
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
CN111527201A (zh) * 2017-12-29 2020-08-11 优尼科Ip有限公司 修饰的病毒载体及其制备和使用方法
BR112020014625A2 (pt) 2018-01-17 2020-12-08 Meiragtx Uk Ii Limited Proteína de capsídeo de raav modificada para terapia gênica
WO2019195701A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of making and using combinatorial barcoded nucleic acid libraries having defined variation
CA3098566A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Zhuchun WU Systems and methods of spectrophotometry for the determination of genome content, capsid content and full/empty ratios of adeno-associated virus particles
CA3098565A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Claire G. ZHANG Scalable clarification process for recombinant aav production
US20190365852A1 (en) * 2018-05-30 2019-12-05 Academia Sinica Recombinant baculoviruses and uses thereof
WO2019241486A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
WO2019241535A2 (en) 2018-06-14 2019-12-19 Regenxbio Inc. Anion exchange chromatography for recombinant aav production
CA3107462A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing gene therapy formulations
JP2021533757A (ja) 2018-08-10 2021-12-09 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 組換えａａｖ生成のためのスケーラブルな方法
CA3112007A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Uniqure Ip B.V. Rnai induced c9orf72 suppression for the treatment of als/ftd
CN110964749A (zh) * 2018-09-29 2020-04-07 普莱柯生物工程股份有限公司 一种在杆状病毒表达系统中高效表达外源蛋白的方法及其应用
EP3861113A1 (en) 2018-10-04 2021-08-11 Voyager Therapeutics, Inc. Methods for measuring the titer and potency of viral vector particles
SG11202103425YA (en) 2018-10-05 2021-05-28 Voyager Therapeutics Inc Engineered nucleic acid constructs encoding aav production proteins
JP2022514112A (ja) 2018-10-15 2022-02-09 リジェネクスバイオ インコーポレイテッド 複製欠損型ウイルスベクター及びウイルスの感染性を測定するための方法
EP3867389A1 (en) * 2018-10-15 2021-08-25 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
US11702673B2 (en) 2018-10-18 2023-07-18 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods of enhancing biological potency of baculovirus system-produced recombinant adeno-associated virus
CA3119721A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Ip B.V. A companion diagnostic to monitor the effects of gene therapy
WO2020104295A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Ip B.V. Rnai induced reduction of ataxin-3 for the treatment of spinocerebellar ataxia type 3
EP3883582A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 uniQure IP B.V. Method and means to deliver mirna to target cells
WO2020104480A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Uniqure Biopharma B.V. Adeno-associated virus vectors for expressing fviii mimetics and uses thereof
SG11202107645RA (en) 2019-01-18 2021-08-30 Voyager Therapeutics Inc Methods and systems for producing aav particles
US11718834B2 (en) 2019-02-15 2023-08-08 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing recombinant AAV
TW202102526A (zh) 2019-04-04 2021-01-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 重組腺相關病毒及其用途
HUE064411T2 (hu) 2019-04-11 2024-03-28 Regenxbio Inc Méretkizárásos kromatográfiás módszerek rekombináns adeno-asszociált víruskészítmények jellemzésére
US20220143115A1 (en) 2019-04-19 2022-05-12 Regenxbio Inc. Adeno-Associated Virus Vector Formulations and Methods
TW202106708A (zh) 2019-04-24 2021-02-16 美商銳進科斯生物股份有限公司 全人類轉譯後修飾之抗體治療劑
US20220243225A1 (en) 2019-04-29 2022-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING BACULOVIRAL INFECTED INSECT CELLS (BIICs) IN BIOREACTORS
WO2021005223A1 (en) 2019-07-10 2021-01-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of epilepsy
KR20220081971A (ko) 2019-07-15 2022-06-16 메이라지티엑스 유케이 Ii 리미티드 관절염 질환 치료용 변형된 aav 캡시드 단백질
WO2021021661A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
US20220290182A1 (en) 2019-08-09 2022-09-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
WO2021041485A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2021053018A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Uniqure Ip B.V. Targeting misspliced transcripts in genetic disorders
WO2021099394A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antisense oligonucleotides and their use for the treatment of cancer
KR20220107222A (ko) 2019-11-28 2022-08-02 리젠엑스바이오 인크. 마이크로디스트로핀 유전자 치료 작제물 및 이의 용도
CA3163576A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Novel compositions and methods for producing recombinant aav
US20230160892A1 (en) * 2020-03-24 2023-05-25 Academia Sinica Recombinant viruses, insect cells and their uses in viral detection and vaccination
CN115867647A (zh) 2020-04-02 2023-03-28 优尼科生物制药有限公司 新型细胞系
CA3169087A1 (en) 2020-04-02 2021-10-07 David Johannes Francois DU PLESSIS Dual bifunctional vectors for aav production
EP4133074A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 uniQure IP B.V. Gene constructs for silencing angiopoietin-like 3 (angptl3) and uses thereof
AU2021305665A1 (en) 2020-07-10 2023-02-23 Centre National De La Recherche Scientifique Methods and compositions for treating epilepsy
EP4192514A1 (en) 2020-08-06 2023-06-14 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
WO2022060915A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized lanadelumab and administration thereof
WO2022060916A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Regenxbio Inc. Vectorized antibodies for anti-viral therapy
WO2022076711A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Adeno-associated viruses for ocular delivery of gene therapy
WO2022076750A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns or muscle delivery
AU2021371307A1 (en) 2020-10-28 2023-06-01 Regenxbio, Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α ANTIBODIES FOR OCULAR INDICATIONS
WO2022094157A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Regenxbio Inc. Vectorized anti-cgrp and anti-cgrpr antibodies and administration thereof
US20230390418A1 (en) 2020-10-29 2023-12-07 Regenxbio Inc. Vectorized factor xii antibodies and administration thereof
AU2021369833A1 (en) 2020-10-29 2023-06-08 Regenxbio Inc. Vectorized tnf-alpha antagonists for ocular indications
EP4263841A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 REGENXBIO Inc. Method of producing a recombinant adeno-associated virus particle
WO2022147087A1 (en) 2020-12-29 2022-07-07 Regenxbio Inc. Tau-specific antibody gene therapy compositions, methods and uses thereof
US20240084329A1 (en) 2021-01-21 2024-03-14 Regenxbio Inc. Improved production of recombinant polypeptides and viruses
CN112852882A (zh) * 2021-02-04 2021-05-28 中吉智药(南京)生物技术有限公司 一种杆状病毒感染昆虫细胞生产aav基因药物的系统及方法
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
EP4301768A2 (en) 2021-03-03 2024-01-10 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2022188797A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Engineered crispr/cas13 system and uses thereof
WO2022207899A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Uniqure Biopharma B.V. Methods for producing single insect cell clones
WO2022214635A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Stichting Vu Nucleic acid molecules for compensation of stxbp1 haploinsufficiency and their use in the treatment of stxbp1-related disorders
WO2022232141A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Regenxbio Inc. Microdystrophin gene therapy administration for treatment of dystrophinopathies
WO2022235614A2 (en) 2021-05-04 2022-11-10 Regenxbio Inc. Novel aav vectors and methods and uses thereof
WO2022241030A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Regenxbio Inc. Treatment of duchenne muscular dystrophy and combinations thereof
CA3219847A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Sander Jan Hendrik Van Deventer Adeno-associated virus vectors modified to bind high-density lipoprotein
JP2024523445A (ja) 2021-06-21 2024-06-28 ユニキュアー バイオファーマ ビー．ブイ． α－シヌクレインをサイレンシングするための遺伝子構築物及びその使用
US20240287545A1 (en) 2021-06-21 2024-08-29 Uniqure Biopharma B.V. Improved lysis procedures
WO2023283962A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 Huigene Therapeutics Co., Ltd. Modified aav capsid for gene therapy and methods thereof
AU2022313258A1 (en) 2021-07-19 2024-02-08 New York University Auf1 combination therapies for treatment of muscle degenerative disease
EP4392434A1 (en) * 2021-08-26 2024-07-03 uniQure biopharma B.V. Insect cell-produced high potency aav vectors with cns-tropism
CN113897396B (zh) * 2021-09-18 2022-08-30 劲帆生物医药科技（武汉）有限公司 一种用于在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及其应用
CN118202060A (zh) 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
WO2023060113A1 (en) 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
WO2023060272A2 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023060269A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for targeted delivery
EP4423285A1 (en) 2021-10-28 2024-09-04 RegenxBio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
WO2023147374A2 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Voyager Therapeutics, Inc. Baculovirus expression system
TW202346590A (zh) 2022-03-13 2023-12-01 美商銳進科斯生物股份有限公司 經修飾之肌肉特異性啟動子
WO2023183623A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Regenxbio Inc. Dominant-negative tumor necrosis factor alpha adeno-associated virus gene therapy
TW202404993A (zh) 2022-04-11 2024-02-01 美商特納亞治療股份有限公司 具經工程化蛋白殼之腺相關病毒
WO2023198745A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of apoe
WO2023198702A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of c9orf72
WO2023198663A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of snca
WO2023198662A1 (en) 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Novel systems for nucleic acid regulation
WO2023201277A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses for cns tropic delivery
WO2023215807A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Regenxbio Inc. VECTORIZED ANTI-TNF-α INHIBITORS FOR OCULAR INDICATIONS
AR129215A1 (es) 2022-05-03 2024-07-31 Regenxbio Inc Anticuerpos anti-complemento y agentes del complemento vectorizados y administración de estos
CN114736929B (zh) * 2022-05-16 2023-06-09 睿征医药科技(武汉)有限公司 一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物、方法及应用
CN114736928B (zh) * 2022-05-16 2023-06-27 睿征医药科技(武汉)有限公司 一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用
WO2023239627A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Regenxbio Inc. Methods for recombinant aav production
WO2024017990A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods and compositions for treating chronic pain disorders
WO2024044725A2 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Regenxbio Inc. Recombinant adeno-associated viruses and uses thereof
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2024081746A2 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Regenxbio Inc. Engineered nucleic acid regulatory elements and methods and uses thereof
WO2024143440A1 (ja) * 2022-12-28 2024-07-04 富士フイルム株式会社 アデノ随伴ウイルスの製造方法、およびベクターのセット
WO2024146935A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Intravenous administration of antisense oligonucleotides for the treatment of pain

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6723551B2 (en) * 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
AU2002360355B2 (en) 2001-11-09 2005-07-07 Government Of The United States Of America, Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
AU2006304997B2 (en) * 2005-10-20 2012-03-01 Uniqure Ip B.V. Improved AAV vectors produced in insect cells
EP1981548A4 (en) * 2006-01-20 2010-03-24 Univ North Carolina ENHANCED PRODUCTION OF INFECTIOUS VECTORS OF PARVOVIRUS IN INSECT CELLS
EP3705577A1 (en) 2006-06-21 2020-09-09 uniQure IP B.V. Aav vectors with improved rep coding sequences for production in insect cells
CN101522903B (zh) * 2006-08-24 2013-07-31 威洛克有限公司 具有重叠开放阅读框的基因在昆虫细胞中的表达及其方法和组合物
ES2929031T3 (es) * 2008-02-19 2022-11-24 Uniqure Ip Bv Optimización de la expresión de las proteínas rep y cap parvovirales en células de insecto

Also Published As

Publication number Publication date
US9260724B2 (en) 2016-02-16
EP3257937B1 (en) 2022-08-03
CN102007209B (zh) 2013-11-13
CA2715924C (en) 2021-01-12
IL207671A (en) 2015-04-30
EP3257937A1 (en) 2017-12-20
US20140127801A1 (en) 2014-05-08
US20110136227A1 (en) 2011-06-09
US8642314B2 (en) 2014-02-04
AU2009215987B2 (en) 2015-01-22
EA201070970A1 (ru) 2011-02-28
ES2929031T3 (es) 2022-11-24
WO2009104964A1 (en) 2009-08-27
JP2011512156A (ja) 2011-04-21
IL207671A0 (en) 2010-12-30
EA020969B1 (ru) 2015-03-31
CA2715924A1 (en) 2009-08-27
EP2250256A1 (en) 2010-11-17
AU2009215987A1 (en) 2009-08-27
CN102007209A (zh) 2011-04-06
EP2250256B1 (en) 2017-08-02

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