KR20230079511A - 곤충 세포에서의 aav 생산, 및 이를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

곤충 세포에서의 aav 생산, 및 이를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

시험관내에서 곤충 세포에서 아데노-연관 바이러스(AAV)를 생산하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 재조합 바큘로바이러스 벡터는 AAV 캡시드 유전자 발현 카세트(Cap); AAV Rep 유전자 발현 카세트(Rep); 및 AAV 발현 카세트에서 시작 코돈으로부터 최대 약 4kb에 위치된 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함한다. Cap, Rep 및 hr을 포함하는 재조합 바큘로바이러스를 보유하는 곤충 세포에서의 바큘로바이러스 및 AAV의 생산 수준은 Cap 및 Rep를 포함하지만, hr을 포함하지 않는 대조군에 비해서 더 높다. 추가로, Cap, Rep 및 hr을 포함하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서의 바큘로바이러스 및 AAV 생산 수준은 세포의 연속 계대에 걸쳐서 비교적 안정한 반면, 바큘로바이러스 및 AAV 생산 수준은 Cap 및 Rep를 포함하지만, hr을 포함하지 않는 재조합 바큘로바이러스를 포함하는 곤충 세포의 연속 계대보다 감소한다.

Description

곤충 세포에서의 AAV 생산, 및 이를 위한 방법 및 조성물 {AV PRODUCTION IN INSECT CELLS, METHODS AND COMPOSITIONS THEREFOR}
선행 출원에 대한 참조
본 출원은 2016년 4월 21일자로 출원된 미국 가출원 제62/325,817호에 대한 이익 및 우선권을 주장한다. 출원 제62/325,817호는 이의 전문이 참고로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
본 개시내용의 부분인 서열 목록은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 형태 및 문서화된 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독 가능한 형태로 기록된 서열 목록 정보는 문서화된 서열 목록과 동일하다. 서열 목록의 주제는 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
도입부
제1 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus: AAV)-매개된 유전자 요법 약물의 승인으로, 큰 큐모의 AAV 벡터 제조 기술에 대한 요구가 점점 커지고 있다(
Figure pat00001
). 현재 몇몇 AAV 생산 기술이 존재한다. 전통적인 방법은 삼중 또는 이중 플라스미드를 사용한 HEK293 세포 또는 다른 포유동물 세포주의 형질주입을 활용한다. 이 방법은 AAV의 낮은 수율을 갖고, 이의 부착성 세포에 대한 요구로 인해서 규모 확대가 어렵다(Xiao, X., Li, J. & Samulski, R. J., J. Virol. 72, 2224-2232, 1998). 또 다른 AAV 생산 방법은 단순 포진 바이러스(HSV)를 활용하여 포유동물 세포를 감염시키는 것이다. 이 방법은 충분한 HSV 시드 스톡을 생성하는 데 있어서의 어려움에 의해서 방해받고, 또한 낮은 AAV 생산성을 갖는다(Booth, M.J., et al., Gene Ther. 11, 829-837, 2004).
곤충 세포에서 AAV 벡터 생산을 위한 바큘로바이러스-기반 방법은 다른 계와 비교할 때 상당히 증가된 AAV 생산 수율을 갖는다(Urabe, M., et al., Human Gene Therapy 13, 1935-1943, 2001; Chen, H., Mol. Ther. 16, 924-930, 2008; Chen, H., Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e57, 2012; 미국 특허 제8,945,918호(첸(Chen)). 그러나, 재조합 바큘로바이러스는 다회의 계대에 걸쳐서 불안정하고, 이는 AAV 생산에서의 감소로 이어질 수 있다. 따라서 다회의 계대 후에도 AAV 벡터의 생산을 높은 수율로 유지시킬 수 있는 AAV 생산계에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
바큘로바이러스 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 다핵 다각체병 바이러스(multiple nuclear polyhedrosis virus)(AcMNPV) 게놈은 hr1 내지 hr5로 지정된 5개의 "상동성 영역"(hr)을 포함한다(Cochran, M.A., and Faulkner, P., J. Virol. 45, 961-970, 1983; Guarino, L.A. and Summers, M.D., J. Virol. 60, 214-223, 1986). 이들 5개의 영역은 인핸서로서 기능할 수 있다(Guarino, L.A., et al., J. Virol. 60, 224-229, 1986). hr1 내지 hr5의 서열은 보고되어 있고(Guarino, L.A. and Summers, M.D., J. Virol. 60, 214-223, 1986; Guarino, L.A., et al., J. Virol. 60, 224-229, 1986), 본 명세서에 제시되어 있다. hr은 약 400개의 염기 쌍 내지 최대 약 1,000개의 염기 쌍 길이일 수 있다. AcMNPV hr의 서열의 예는 다음과 같다.
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
hr1 내지 hr4 서열은 문헌[Guarino, L.A., et al., J. Virol. 60, 224-229, 1986]에 존재한다. hr5 서열은 문헌[Guarino, L.A. and Summers, M.D., J. Virol. 60, 214-223, 1986]에 존재한다. hr2에 대한 다른 서열은 문헌[Aslanidi, G., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 106, 5059-5064, 2009], 및 [Ayres, M.D., et al., Virology 202, 586-605, 1994]에 보고되어 있다.
또한, 곤충 바이러스에서의 hr 중에서의 서열 다양성이 보고되어 있다. AcMNPV hr과 64%만큼 낮은 동일성을 갖는 서열은 봄빅스 모리(Bombyx mori) 핵 다각체병 바이러스로부터의 hr 서열로서 인식되어 왔다(Majima, K., et al., J. Virol. 67, 7513-7521, 1993).
바큘로바이러스 hr은 AAV2 시스-작용 Rep-결합 요소(RBE)를 통해서 작용하여 AAV Rep 및 Cap 유전자를 보유하는 곤충 세포주에서 AAV 생산을 향상시킬 수 있다고 보고되어 있다(Aslanidi, G., et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 106, 5059-5064, 2009). 이 연구는 일시적인 형질주입 검정에서 AAV rep 유전자의 발현을 시험하였고, rep에 대한 상류에서 hr2 및 RBE를 보유하는 작제물로의 형질주입 시 증가된 전사를 보고하였다. 연구자들은 피드-포워드 루프(feed-forward loop)를 제안하였는데, 여기서 AAV rep 및 cap 유전자 둘 모두의 전사는 트랜스-작용 바큘로바이러스 발현 벡터-암호화된 극초기 트랜스-조절인자 1(immediate-early trans-regulator 1: IE-1)에 의해서 유도된다. 이들의 모델에서, 산물 중 하나(Rep 단백질)가 RBE와 상호작용하여 구출/증폭을 유도하고, 더 양호한 전사를 매개한다.
바큘로바이러스 hr 서열은 또한 연속식-캐스케이드 곤충-세포 생물반응기에서 재조합 바큘로바이러스를 안정화시킨다고 보고되어 있다(Pijlman, G. P., et al., Biotechnol. Bioeng. 87, 743-753, 2004). 그러나, 바큘로바이러스계에서 AAV 바이러스 생산성을 향상시키는 hr 서열은 보고되어 있지 않다.
본 발명자들은 시험관내에서 곤충 세포에서 바큘로바이러스-기반계에서 아데노-연관 바이러스(AAV) 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법을 개발하였다. 이 조성물 및 방법은 AAV Rep-결합 요소(RBE)를 갖지 않지만, 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함하는 벡터를 사용한다. 다양한 구성에서, AAV 게놈을 포함하는 바큘로바이러스 게놈을 보유하는 곤충 세포주의 안정성은 다회의 계대에 걸쳐서 유지될 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터를 포함하는 곤충 세포에서의 AAV 생산은 hr을 포함하지 않는 벡터에 비해서 향상될 수 있다. 더욱이, 본 개시의 벡터를 포함하는 곤충 세포주는 반복적인 계대 후에도 AAV 생산의 높은 역가를 안정하게 유지시킬 수 있다.
다양한 실시형태에서, 본 교시는 벡터를 포함한다. 다양한 구성에서, 벡터는 바큘로바이러스 또는 플라스미드, 예컨대, 예를 들어 그러나 제한 없이 바크미드(bacmid) 셔틀 벡터일 수 있다(Luckow, V., et al., J. Virol. 67, 4566-4579, 1993). 다양한 구성에서, 벡터는 AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트 및 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함할 수 있다. 다양한 구성에서, hr은 AAV 발현 카세트의 시작 코돈으로부터 최대 약 4kb에 위치될 수 있다. 다양한 구성에서, hr은 삽입체일 수 있다. 다양한 구성에서, hr은 AAV 발현 카세트의 시작 코돈으로부터 최대 약 0.5kb, 약 1kb, 약 1.5kb, 약 2kb, 약 2.5kb, 약 3kb, 약 3.5kb, 약 4kb 또는 약 4.5kb에 위치될 수 있다. 다양한 구성에서, 삽입된 hr 영역은 Rep 발현 카세트의 시작 코돈으로부터 최대 약 4kb에 위치될 수 있다. 다양한 구성에서, 삽입된 hr 영역은 Cap 발현 카세트의 시작 코돈으로부터 최대 약 4kb에 위치될 수 있다. 다양한 구성에서, 벡터는 바이러스, 예컨대 바큘로바이러스, 예컨대, 제한 없이 아우토그라파 칼리포니카 다핵 다각체병 바이러스(AcMNPV)로부터의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구성에서, 벡터는 hr을 포함하도록 변형된 이미 기술된 벡터일 수 있다(Chen, H., Mol. Ther. 16, 924-930, 2008; Chen, H., Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e57, 2012; 미국 특허 제8,945,918호(첸)).
다양한 구성에서, AAV Cap 발현 카세트 및 AAV Rep 발현 카세트는 이미 기술된 바와 같을 수 있고(Chen, H., Mol. Ther. 16, 924-930, 2008; Chen, H., Molecular Therapy-Nucleic Acids 1, e57, 2012; 미국 특허 제8,945,918호(첸)), hr은 바큘로바이러스, 예컨대, AcMNPV로부터의 hr1, hr2, hr3, hr4 또는 hr5일 수 있다. 일부 구성에서, hr은 AcMNPV hr2일 수 있다. 일부 구성에서, hr은 AcMNPV hr과 서열 동일성을 공유하는 hr일 수 있고, 예를 들어, 제한 없이, AcMNPV로부터의 hr, 또 다른 곤충 바이러스로부터의 hr, 또는 AcMNPV hr, 예컨대, hr2와 적어도 64% 서열 동일성, 적어도 65% 서열 동일성, 적어도 70% 서열 동일성, 적어도 75% 서열 동일성, 적어도 80% 서열 동일성, 적어도 85% 서열 동일성, 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 또는 그 초과의 서열 동일성을 공유하는 인공 hr 서열일 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 Rep 결합 요소(RBE)를 배제할 수 있고, AAV는 hr을 포함하지만 RBE를 포함하지 않는 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 5'에서 3' 순서로, Cap 발현 카세트, Rep 발현 카세트, 및 바큘로바이러스 상동성 영역을 포함할 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 5'에서 3' 순서로, Rep 발현 카세트, Cap 발현 카세트, 및 바큘로바이러스 상동성 영역을 포함할 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 5'에서 3' 순서로 Cap 발현 카세트, 바큘로바이러스 상동성 영역, 및 Rep 발현 카세트를 포함할 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 5'에서 3' 순서로 Rep 발현 카세트, 바큘로바이러스 상동성 영역, 및 Cap 발현 카세트를 포함할 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 5'에서 3' 순서로 바큘로바이러스 상동성 영역, Cap 발현 카세트, 및 Rep 발현 카세트를 포함할 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시의 벡터는 5'에서 3' 순서로 바큘로바이러스 상동성 영역, Rep 발현 카세트, 및 Cap 발현 카세트를 포함할 수 있다.
다양한 구성에서, hr 영역은 Rep 발현 카세트와 Cap 발현 카세트 사이에 위치될 수 있다. 다양한 구성에서, Rep 발현 카세트 및 Cap 발현 카세트는 헤드-투-헤드(5'에서 5') 배향, 테일-투-테일(3'에서 3') 배향, 또는 헤드-투-테일(5'에서 3') 배향으로 존재할 수 있다.
다양한 구성에서, 본 교시는 곤충 세포주, 예컨대, 예를 들어 제한 없이, 상기에 기술된 벡터를 포함하는 Sf9 세포, Tni Pro 세포, 또는 E4a 세포를 포함한다. 다양한 구성에서, 본 교시는 곤충 세포주, 예컨대, 제한 없이, Sf9 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 교시는 시험관내에서 바큘로바이러스를 성장시키는 방법을 포함한다. 다양한 구성에서, 이들 방법은 곤충 세포의 배양물을 제공하는 단계, 곤충 세포를 AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트, 및 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함하는 벡터로 감염 또는 형질주입시키는 단계, 및 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 다양한 구성에서, hr은 AAV 발현 카세트로부터 최대 약 4kb에 존재할 수 있다. 다양한 구성에서, hr은 Rep 발현 카세트로부터 최대 약 4kb에 존재할 수 있다. 다양한 구성에서, hr은 Cap 발현 카세트로부터 최대 약 4kb에 존재할 수 있다. 다양한 양상에서, 생성된 세포주는 반복적으로 계대될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 교시는 시험관내에서 AAV를 성장시키는 방법을 포함한다. 이들 방법에서, AAV Cap 카세트, AAV Rep 카세트 및 hr을 포함하는 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포, 예컨대, 예를 들어 제한 없이, Sf9 세포, Tni Pro 세포, 또는 E4a 세포를 감염 또는 형질주입시킬 수 있다(또는 공-감염 또는 공-형질주입시킬 수 있다). 이어서, 감염된(또는 형질주입된) 세포는 시험관내에서 성장되어, 바큘로바이러스 및 AAV를 생산하는 세포주를 형성할 수 있다. 이러한 세포주는 AAV의 생산을 거의 또는 전혀 손실하지 않으면서 다회의 계대 동안, 예를 들어 적어도 3계대, 적어도 4계대, 적어도 5계대, 적어도 6계대, 적어도 7계대, 적어도 8계대, 적어도 9계대, 또는 적어도 10계대 동안 반복적으로 계대될 수 있다. 다양한 구성에서, AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트 및 본 교시의 hr을 포함하는 벡터를 포함하는 곤충 세포주로부터의 AAV 생산은 예를 들어, 7계대 후에, 7계대 후에 AAV Cap 발현 카세트 및 AAV Rep 발현 카세트를 포함하지만 hr을 포함하지 않는 벡터를 포함하는 곤충 세포주의 것보다 적어도 2-배 더, 적어도 3-배 더, 또는 적어도 4-배 더 높을 수 있다. 다양한 구성에서, AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트 및 본 교시의 hr을 포함하는 벡터를 포함하는 곤충 세포주로부터의 AAV 생산은 예를 들어, 8계대 후에, 8계대 후에 AAV Cap 발현 카세트 및 AAV Rep 발현 카세트를 포함하지만 hr을 포함하지 않는 벡터를 포함하는 곤충 세포주의 것보다 적어도 2-배 더, 적어도 3-배 더, 또는 적어도 4-배 더 높을 수 있다. 다양한 구성에서, AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트 및 본 교시의 hr을 포함하는 벡터를 포함하는 곤충 세포주로부터의 AAV 생산은 예를 들어, 9계대 후에, 9계대 후에 AAV Cap 발현 카세트 및 AAV Rep 발현 카세트를 포함하지만 hr을 포함하지 않는 벡터를 포함하는 곤충 세포주의 것보다 적어도 2-배 더, 적어도 3-배 더, 또는 적어도 4-배 더 높을 수 있다. 다양한 구성에서, AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트 및 본 교시의 hr을 포함하는 벡터를 포함하는 곤충 세포주로부터의 AAV 생산은 예를 들어, 10계대 후에, 10계대 후에 AAV Cap 발현 카세트 및 AAV Rep 발현 카세트를 포함하지만 hr을 포함하지 않는 벡터를 포함하는 곤충 세포주의 것보다 적어도 2-배 더, 적어도 3-배 더, 또는 적어도 4-배 더 높을 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 교시는 시험관내에서 바큘로바이러스를 성장시키는 방법을 포함한다. 이들 방법에서, AAV Cap 및 AAV Rep 카세트를 포함하는 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 시험관내에서 곤충 세포, 예컨대, 예를 들어 제한 없이, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터의 Sf9 세포, 또는 시험관내에서 또 다른 곤충으로부터의 세포, 예컨대, 예를 들어 제한 없이, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터의 Tni Pro 세포 또는 에스티마 아크레아(Estima acrea)로부터의 E4a 세포를 감염 또는 형질주입시킬 수 있다(또는 공-감염 또는 공-형질주입시킬 수 있다). 다양한 구성에서, 세포는 AAV의 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR), 예컨대, 제한 없이, AAV5의 ITR들 사이의 이식유전자로 공-감염될 수 있다. 일부 구성에서, 이식유전자는 리포터 유전자, 예컨대, 예를 들어 제한 없이, 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다. 감염된(또는 형질주입된) 세포는 시험관내에서 성장되어, 바큘로바이러스를 생산하는 세포주를 형성할 수 있다. 이러한 세포주는 반복적으로 계대될 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 20%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 30%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 40%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 50%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 60%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 70%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 80%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 90%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P7에서 총 바큘로바이러스의 역가의 100%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P10에서 총 바큘로바이러스의 역가의 적어도 20%일 수 있다. 다양한 구성에서, AAV 유전자, 예컨대, Cap 유전자 또는 Rep 유전자를 포함하는 바큘로바이러스의 역가는 벡터가 hr을 포함하는 경우 계대 P10에서 총 바큘로바이러스의 역가의 5% 초과일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 교시는 시험관내에서 AAV를 성장시키는 방법을 포함한다. 이들 방법에서, hr을 포함하는 본 교시의 벡터를 포함하는 곤충 세포는 성장되고, 시험관내에서 반복적으로 계대될 수 있다. 일부 구성에서, hr을 갖지 않는 대조군 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 계대 7(P7)에서의 AAV의 상대적인 수율은 hr을 갖는 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 AAV 수율의 60% 미만일 수 있다. 일부 구성에서, hr을 갖지 않는 대조군 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 계대 7(P7)에서의 AAV의 상대적인 수율은 hr을 갖는 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 AAV 수율의 50% 미만일 수 있다. 일부 구성에서, hr을 갖지 않는 대조군 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 계대 7(P7)에서의 AAV의 상대적인 수율은 hr을 갖는 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 AAV 수율의 40% 미만일 수 있다. 일부 구성에서, hr을 갖지 않는 대조군 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 계대 7(P7)에서의 AAV의 상대적인 수율은 hr을 갖는 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 AAV 수율의 30% 미만일 수 있다. 일부 구성에서, hr을 갖지 않는 대조군 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 계대 7(P7)에서의 AAV의 상대적인 수율은 hr을 갖는 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 AAV 수율의 20% 미만일 수 있다. 일부 구성에서, hr을 갖지 않는 대조군 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 계대 10(P10)에서의 AAV의 상대적인 수율은 hr을 갖는 벡터를 보유하는 곤충 세포주로부터의 AAV 수율의 20% 미만일 수 있다.
본 교시는 제한 없이, 하기 양상을 포함한다.
1. 바큘로바이러스 벡터로서,
AAV Cap 발현 카세트; AAV Rep 발현 카세트; 및 AAV 발현 카세트의 시작 코돈으로부터 최대 약 4kb에 위치된 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함하는, 바큘로바이러스 벡터.
2. 제1 양상에 있어서, 5'에서 3' 순서로, 상기 Cap 발현 카세트, 상기 Rep 발현 카세트, 및 상기 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함하는, 벡터.
3. 제1 양상에 있어서, 5'에서 3' 순서로, 상기 Rep 발현 카세트, 상기 Cap 발현 카세트, 및 상기 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함하는, 벡터.
4. 제1 양상에 있어서, 5'에서 3' 순서로, 상기 Cap 발현 카세트, 상기 바큘로바이러스 상동성 영역(hr) 및 Rep 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
5. 제1 양상에 있어서, 5'에서 3' 순서로, 상기 Rep 발현 카세트, 상기 바큘로바이러스 상동성 영역(hr) 및 Cap 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
6. 제1 양상에 있어서, 5'에서 3' 순서로, 상기 바큘로바이러스 상동성 영역(hr), 상기 Cap 발현 카세트 및 상기 Rep 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
7. 제1 양상에 있어서, 5'에서 3' 순서로, 상기 바큘로바이러스 상동성 영역(hr), 상기 Rep 발현 카세트 및 상기 Cap 발현 카세트를 포함하는, 벡터.
8. 제1 양상에 있어서, 상기 hr 영역은 상기 Rep 발현 카세트와 상기 Cap 발현 카세트 사이에 존재하되, 상기 Rep 발현 카세트 및 상기 Cap 발현 카세트는 헤드 투 헤드(5'에서 5') 배향으로 존재하는, 벡터.
9. 제1 양상 내지 제9 양상 중 어느 하나에 있어서, 상기 바큘로바이러스 상동성 영역은 hr2 서열인, 벡터.
10. 제1양상 내지 제9양상 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 Rep 결합 요소(RBE)가 배제된, 벡터.
11. 제1 양상 내지 제10 양상 중 어느 하나에 따른 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 곤충 세포주.
12. 제11 양상에 있어서, 상기 세포는 제2 벡터를 더 포함하되, 상기 제2 벡터는 AAV ITR에 의해서 플랭킹된(flanked) 이식유전자를 포함하는, 곤충 세포주.
13. 제11 양상 또는 제12 양상에 따른 곤충 세포의 배양물을 제공하는 단계, 및 상기 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 생체내에서 바큘로바이러스를 성장시키는 방법.
14. 제13 양상에 있어서, 상기 세포를 인큐베이션시키는 상기 단계는 상기 세포를 계대하는 단계를 포함하되, 계대 7에서의 AAV 생산 수율은 AAV Cap 발현 카세트 및 AAV Rep 발현 카세트를 포함하지만 바큘로바이러스 hr을 포함하지 않는 대조군 곤충 세포주와 비교할 때 적어도 2-배 더 큰, 방법.
15. 제13 양상에 있어서, 상기 AAV Cap 발현 카세트를 포함하는 바큘로바이러스의 계대 7에서의 역가는 총 바큘로바이러스 역가의 21.5% 초과(총 BV에 대해서는 gp64의 qPCR 및 AAV에 대해서는 Cap의 qPCR에 의해서 측정되는 경우)인, 방법.
16. 곤충 세포의 배양물을 제공하는 단계, 상기 곤충 세포를 제1 양상 내지 제10 양상 중 어느 하나에 따른 바큘로바이러스 벡터로 감염 또는 형질주입시키는 단계, 및 상기 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는, 시험관내에서 AAV를 성장시키는 방법.
17. 제16 양상에 있어서, 상기 곤충 세포로부터의 AAV의 P7에서의 수율은 hr을 갖지 않는 바큘로바이러스 벡터를 포함하는 곤충 세포로부터의 AAV의 P7에서의 수율보다 적어도 50% 더 큰, 방법.
18. 제16 양상에 있어서, 상기 바큘로바이러스 hr을 포함하는 세포로부터의 AAV의 P7에서의 상기 수율은 hr을 갖지 않는 바큘로바이러스 벡터를 포함하는 세포로부터의 AAV의 수율보다 적어도 20% 더 큰, 방법.
19. 제16 양상에 있어서, 상기 바큘로바이러스 벡터는 Rep 결합 요소(RBE)가 배제된, 방법.
20. 하기 단계를 포함하는, 시험관내에서 AAV를 생산하는 방법:
제1 양상 내지 제10 양상 중 어느 한 항의 벡터 및 AAV ITR에 의해서 플랭킹된 이식유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 곤충 세포 배양물을 성장시키는 단계.
21. AAV Cap 발현 카세트, AAV Rep 발현 카세트, 및 AAV 발현 카세트의 시작 코돈의 최대 약 4kb에 위치된 바큘로바이러스 상동성 영역(hr)을 포함하는, 시험관내에서 곤충 세포에서 AAV를 생산하기 위한 Rep 결합 요소(RBE)를 갖지 않는 바큘로바이러스 벡터.
도 1은 AAV8 캡시드 유전자와 AAV2 rep 유전자 사이에 hr2 서열을 포함하는, 본 교시의 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 도시한 도면.
도 2는 AAV8 Cap 유전자, 및 AAV2 rep 유전자와 젠타마이신 내성(GmR) 유전자 사이에 hr2 서열을 포함하는, 본 교시의 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 도시한 도면.
도 3은 AAV9 Cap 유전자, 및 AAV2 rep 유전자와 젠타마이신 내성(GmR) 유전자 사이에 hr2 서열을 포함하는, 본 교시의 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 도시한 도면.
도 4는 AAV6 Cap 유전자, 및 AAV2 rep 유전자와 젠타마이신 내성(GmR) 유전자 사이에 hr2 서열을 포함하는, 본 교시의 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 도시한 도면.
도 5는 AAV1 Cap 유전자, 및 AAV2 rep 유전자와 젠타마이신 내성(GmR) 유전자 사이에 hr2 서열을 포함하는, 본 교시의 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 도시한 도면.
도 6은 AAV5 Cap 유전자, 및 AAV2 rep 유전자와 젠타마이신 내성(GmR) 유전자 사이에 hr2 서열을 포함하는, 본 교시의 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드를 도시한 도면.
도 7은 바큘로바이러스 셔틀 플라스미드 V372-pFB-CMV-GFP-SV40pA-full ITR에서 2개의 ITR에 의해서 플랭킹된 GFP 발현 카세트를 도시한 도면.
도 8은 hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스(rBV)에 의한 비교 AAV 생산 수율을 도시한 도면.
도 9a 내지 h는 계대 3 내지 계대 10으로부터의 hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 비교 재조합 바큘로바이러스(rBV) 역가를 나타낸 도면.
도 10a 내지 e는 계대 3 내지 계대 10, 또는 AAV 균주들 사이에서 계대 10에서의 hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스들(rBV) 간의 비교 AAV 생산 수율을 나타낸 도면.
도 11A 및 B는 hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 세포에서 AAV 캡시드 단백질의 웨스턴 블롯 발현을 도시한 도면.
도 12A 및 B는 hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 세포에서 AAV rep 단백질의 웨스턴 블롯 발현을 도시한 도면.
본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 통상의 기술자에게 널리 공지된 실험실 기술을 활용하고, 실험실 매뉴얼(예컨대 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Spector, D. L. et al., Cells: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998; Nagy, A., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold Spring Harbor, NY, 2003 및 Harlow, E., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1999])에서 찾아볼 수 있다. 본 설명 및 임의의 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 단수 형태는 마찬가지로 복수 형태를 포함하도록 의도된다.
하기 물질 및 방법이 또한 본 교시의 다양한 양상에서 사용된다.
곤충 세포 배양물
스포돕테라 프루기페르다 Sf9 세포, 트리코플루시아 니 세포 및 에스티마 아크레아 세포를 28℃에서 100단위/㎖ 페니실린 및 100mg/㎖ 스트렙토마이신(메디아테크(Mediatech))이 보충된 ESF921 배지(익스프레션 시스템즈(Expression Systems) 중에서 코닝 저장병 중에서 배양하였다. 유지를 위해서 세포 밀도가 8 x 106개 세포/㎖에 도달되면 세포를 1:4로 분할하였다.
플라스미드 작제 및 재조합 바큘로바이러스 생성
hr2 서열을 바큘로바이러스 게놈으로부터 PCR 증폭시키고, 플라스미드 V053-pFBD-inRepOpt-inCap8 내에 클로닝시켜 V059-pFBD-inRepOpt-hr2-inCap8을 생성하였다. 코작 서열을 포함시키기 위해서, 플라스미드 V059를 BstZ17I 및 AgeI로 절단하여 BstZ17I-AgeI 단편을 제거하고, V150-pFB-inCap8-inRep-코작으로부터의 VP1 시작 코돈의 상류에 코작 서열을 갖는 BstZ17I-AgeI 단편으로 대체하여 V277-pFB-inCap8-hr2-inRep-코작을 생성하였는데, 여기서 hr2는 Rep와 Cap 발현 카세트 사이에 위치된다. hr2 서열을 Rep 발현 카세트의 polyA 서열 이후의 또 다른 위치 내에 삽입하기 위해서, hr2 서열을 V277로부터의 PCR 프라이머 3205F(5'-GCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGT-3' 서열번호 7) 및 3206R(5'-GGCCTACGTAGTTTTACACGTAGAATTCTACTCGT-3' 서열번호 8)로 PCR 증폭시켰다. pc 프로모터 서열을 V150로부터의 프라이머 3065F(5'-ATTTGACTTGGTCAGGGCCG-3' 서열번호 9) 및 3204R(5'-GAATTCTACTCGTAAAGCCCAGTTGACATAAGCCTGTTCG-3' 서열번호 10)로 증폭시켰다. 이들 hr2 및 pc 프로모터 PCR 단편을 프라이머 3065F 및 3206R을 사용하여 제2 PCR 반응을 통해서 함께 연결하였다. 연결된 PCR 단편을 BsrGI 및 SnaBI로 소화시키고, V150, V212, V195, V188 및 V146의 BsrGI 및 SnaBI 부위 내에 결찰시켜 각각 V288-pFB-inCap8-inRep-hr2, V289-pFB-inCap9-inRep-hr2, V290-pFB-inCap6-inRep-hr2, V291-pFB-inCap1-inRep-hr2 및 V295-pFB-inCap5-inRep-hr2를 생성하였다. hr 서열 삽입체를 갖는 플라스미드의 예를 도 1 내지 6에 도시한다.
GFP 단편을 PCR 증폭시킴으로써 플라스미드 pFB-CMV-GFP를 작제하고, 이어서 이것을 V032-pFB-CMV-SV40pA의 다수의 클로닝 부위 내에 클로닝시켰다(도 7).
플라스미드를 사용하여 제조사의 프로토콜(인비트로젠(Invitrogen))에 따라서 바크미드를 생성하였다. 간략하면, 플라스미드를 2ng/ul의 농도로 희석시키고, 2ul의 플라스미드 DNA를 사용하여 DH10Bac 수용성 세포(competent cell)를 형질전환시켰다. 인큐베이션 2일 후, 백색 집락을 선별하고, 미니프렙 바크미드 DNA를 제조하였다. 미니프렙 바크미드 DNA를 사용하여 Sf9 세포를 형질주입시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다.
플라크 정제 및 재조합 바큘로바이러스의 계대
생성된 재조합 바큘로바이러스를 균질한 클론을 얻기 위해서 플라크 정제하였다. 간략하면, Sf9 세포를 2㎖ ESF921 배지 중에서 1.5e+6개 세포/웰의 세포 밀도로 6-웰 플레이트 상에 플레이팅하고, 28℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 바큘로바이러스를 각각 1㎖ 부피로 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 및 10-7로 희석시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 웰로부터 제거하고, 각각의 희석물 250㎕를 첨가하여 28℃에서 1시간 동안 Sf9 세포를 감염시켰다. 인큐베이션 후, 3㎖의 1% 아가로스 오버레이(42℃로 냉각됨)를 웰에 첨가하였다. 아가로스가 고화된 경우, 2㎖의 ESF921 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 28℃에서 5 내지 7일 동안 인큐베이션시켰다. 양호하게 형성된 플라크를 선별하고, 계대를 위한 곤충 세포를 감염시키는 데 사용하였다.
플라크 정제된 재조합 바큘로바이러스를 계대하기 위해서, 곤충 세포를 약 1moi의 바이러스로 3일 동안 28℃에서 감염시키고, 상청액을 수거하였다. 수거된 바이러스를 사용하여 새로운 곤충 세포를 다시 감염시키고, 계대 10까지 계속하였다.
재조합 바큘로바이러스 및 AAV 벡터의 실시간 정량분석 PCR(qPCR) 정량분석
재조합 바큘로바이러스 및 AAV의 역가를 결정하기 위해서, qPCR 방법을 사용하였다. 1 플라크-형성 단위(pfu)는 바이러스의 약 20개의 게놈 카피를 포함하는 것으로 경험적으로 결정되었다. 간략하면, 수거된 바이러스를 qPCR 희석 완충제 중에서 희석시키고, 95℃까지 30분 동안 가열하여 바이러스 입자를 파괴하였다. 이어서, 처리된 바이러스 샘플을 CHROMO4(상표명) 시스템(바이로-라드 래보러토리스, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)에서 공지된 표준품과 함께 검정하였다. Ct 값을 pfu로 변환시키고, 바큘로바이러스 계대 및 AAV 생산을 설명하는 데 사용하였다.
AAV 벡터 생산 및 정량분석
재조합 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 감염시켜 AAV 벡터를 생산하였다. 간략하면, hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않으면서 Rep 및 Cap 유전자를 함유하는 재조합 바큘로바이러스 10moi를 3일 동안 28℃에서 AAV ITR에 의해서 플랭킹된 GFP 마커 유전자를 함유하는 재조합 바큘로바이러스 5moi로 공-감염시켰다. 세포 펠릿을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해서 수집하였다. 세포 펠릿을 초음파처리에 의해서 SF9 용해 완충제(50mM 트리스(Tris)-HCl, pH7.8, 50mM NaCl, 2mM MgCl2, 1% 사코실(Sarkosyl), 1% 트리톤(Triton) X-100, 및 140단위/㎖ 벤조나제) 중에서 용해시켰다. 8000rpm에서 20분 동안의 원심분리에 의해서 세포 잔해를 제거하였다. 투명해진 용해물을 하기와 같이 AAV 생산성의 정량분석을 위해서 사용하였다: 용해물을 qPCR 희석 완충제로 희석시키고, DNase I 효소와 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 오염된 DNA를 파괴하였다. 100mM EDTA의 존재 하에서 95℃에서 30분 동안 가열함으로써 DNase I 효소를 불활성화시켰다. 처리된 AAV 샘플을 추가로 희석시키고, 크로모(Chromo)4 qPCR 기계에서 검정하였다. Ct 값을 AAV 벡터 게놈 카피로 변환하였다.
웨스턴 블롯 분석
rep 및 cap 유전자를 함유하는 재조합 바큘로바이러스를 사용하여 Sf9 세포를 3일 동안 감염시키고, 3,000rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 세포 펠릿을 수거하였다. 약 2 x 106개의 세포를 갖는 세포 펠릿을 먼저 300ul의 PBS 완충제 중에 재현탁하고, 이어서 100ul의 4xLDS 샘플 완충제와 함께 보텍싱하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 95℃에서 5분 동안 가열하고, 이어서 20초 동안 초음파 처리하여 게놈 DNA를 전단시켰다. 가벼운 원심분리 후, 이어서 용해물을 10% SDS-겔 상에 로딩하여 단백질을 분리하였다. 이어서 단백질을 겔로부터 나이트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 5% 탈지유로의 차단 후, 막을 rep 또는 cap 단백질에 대한 특이적인 항체로 프로빙하였다. 제1 항체에 대한 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)와 커플링된 제2 항체를 사용하여 색 매트릭스 반응을 통해서 rep 또는 cap 단백질을 검출하였다.
실시예
설명을 비롯한 본 교시가 임의의 청구범위 또는 양상을 제한하는 것으로 의도되지 않는 실시예에 제공된다. 과거형으로 구체적으로 제시되지 않는 한, 실시예는 예언적 및 실제적 실시예일 수 있다. 하기 비제한적인 실시예는 본 교시를 추가로 예시하기 위해서 제공된다. 본 개시내용에 비추어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 교시의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 개시된 구체적인 실시형태에서 다수의 변화가 행해질 수 있고, 비슷하거나 또는 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예 1
본 실시예는 본 교시의 셔틀 벡터를 예시한다.
이 플라스미드(도 1)에서, hr2 서열은 AAV8 캡시드 유전자 카세트와 AAV2 rep 유전자 카세트 사이에 위치된다. 이 벡터는 헤드-투-헤드 배향으로 Cap 및 Rep 유전자를 포함한다. 이 셔틀 플라스미드를 사용하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하였고, 그 다음 이것을 사용하여 곤충 세포에서 AAV8을 생산하였다.
실시예 2
본 실시예는 본 교시의 셔틀 벡터를 예시한다.
이 플라스미드(도 2)에서, hr2 서열은 AAV2 rep 유전자 카세트와 젠타마이신 내성(GmR) 사이에 위치된다. 벡터는 또한 AAV8 캡시드 유전자 카세트를 포함한다. Cap 및 Rep 유전자는 헤드-투-테일 배향으로 존재한다. 이 플라스미드를 사용하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하였고, 그 다음 이것을 사용하여 곤충 세포에서 AAV8을 생산하였다.
실시예 3
본 실시예는 본 교시의 셔틀 벡터를 예시한다.
이 플라스미드(도 3)에서, hr2 서열은 AAV2 rep 유전자 카세트와 젠타마이신 내성(GmR) 사이에 위치된다. 벡터는 또한 AAV9 캡시드 유전자 카세트를 포함한다. Cap 및 Rep 유전자는 헤드-투-테일 배향으로 존재한다. 이 플라스미드를 사용하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하였고, 그 다음 이것을 사용하여 곤충 세포에서 AAV9를 생산하였다.
실시예 4
본 실시예는 본 교시의 셔틀 벡터를 예시한다.
이 플라스미드(도 4)에서, hr2 서열은 AAV2 rep 유전자 카세트와 젠타마이신 내성(GmR) 사이에 위치된다. 벡터는 또한 AAV6 캡시드 유전자 카세트를 포함한다. Cap 및 Rep 유전자는 헤드-투-테일 배향으로 존재한다. 이 플라스미드를 사용하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하였고, 그 다음 이것을 사용하여 곤충 세포에서 AAV6을 생산하였다.
실시예 5
본 실시예는 본 교시의 셔틀 벡터를 예시한다.
이 플라스미드(도 5)에서, hr2 서열은 AAV2 rep 유전자 카세트와 젠타마이신 내성(GmR) 사이에 위치된다. 벡터는 또한 AAV1 캡시드 유전자 카세트를 포함한다. Cap 및 Rep 유전자는 헤드-투-테일 배향으로 존재한다. 이 플라스미드를 사용하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하였고, 그 다음 이것을 사용하여 곤충 세포에서 AAV1을 생산하였다.
실시예 6
본 실시예는 본 교시의 셔틀 벡터를 예시한다.
이 플라스미드(도 6)에서, hr2 서열은 AAV2 rep 유전자 카세트와 젠타마이신 내성(GmR) 사이에 위치된다. 벡터는 또한 AAV5 캡시드 유전자 카세트를 포함한다. Cap 및 Rep 유전자는 헤드-투-테일 배향으로 존재한다. 이 플라스미드를 사용하여 재조합 바큘로바이러스(rBV)를 생성하였고, 그 다음 이것을 사용하여 곤충 세포에서 AAV5를 생산하였다.
실시예 7
본 실시예는 hr 서열이 AAV 생산의 수율을 향상시키는 것을 예시한다.
이들 실험에서, hr2 서열을 플라스미드 V277(도 1)에서 Rep와 Cap 발현 카세트 사이 또는 플라스미드 V289(도 3) 및 V295(도 6)에서 Rep 발현 카세트의 poly A 서열 이후 중 어느 하나에 클로닝시키고, 재조합 바큘로바이러스를 제조하였다. 이들 재조합 바큘로바이러스를 사용하여 AAV 생산을 위해서 GFP 유전자를 갖는 재조합 바큘로바이러스로 Sf9 세포를 공감염시켰다. 결과를 도 8에 나타낸다. 데이터는, hr2 서열이 hr2 서열 및 AAV 항원형의 위치와 무관하게 AAV 생산성을 향상시킴을 나타낸다. AAV 생산성의 증가는 hr을 갖지 않는 대조군에 비해서 2- 내지 4-배 범위였다.
실시예 8
본 실시예는 hr 서열이 AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 재조합 바큘로바이러스의 안정성을 향상시킨다는 것을 예시한다.
이들 실험에서, hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스의 안정성을 추가로 분석하기 위해서, 재조합 바큘로바이러스의 플라크 정제 및 계대를 여러번 사용하였다. gp64 유전자(본 교시의 모든 재조합 바큘로바이러스에 존재함)에 상응하는 한 쌍의 qPCR 프라이머--gp64F(5'-CCCTCTGTGTACTTGGCTCTAACG-3' 서열번호 11) 및 gp64R(5'-CGGTGAAACGCAAAGTCGAGCACCG-3' 서열번호 12)--를 사용하여 총 바큘로바이러스 역가를 결정하였다. Rep 및 Cap 발현 카세트를 포함하는 바큘로바이러스의 경우, Rep 서열에 상응하는 한 쌍의 qPCR 프라이머--Rep2F(5'-ATTCATGCTCCACCTCAACC-3' 서열번호 13) 및 Rep2R(5'-GCCGTCTGGATCATGACTTT-3' 서열번호 14)--를 사용하여 이들 바큘로바이러스의 역가를 결정하였다. Cap1-Rep(도 5), Cap6-Rep(도 4), Cap9-Rep(도 3) 및 Cap8-Rep(도 2)를 갖는 재조합 바큘로바이러스를 이들 실험을 위해서 선택하였다. 각각의 계대를 위해서, 총 바큘로바이러스 pfu를 gp64 프라이머를 사용하여 결정하고, 100%로 설정하였다. 각각의 계대를 위한 특정 바큘로바이러스를 총 바큘로바이러스의 백분율로서 설정된 Rep 프라이머를 사용하여 결정하였다. 결과를 hr2 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스(rBV) 역가에 대해서 도 9a 내지 h에 나타낸다. 도 9a는 hr2 서열을 갖지 않는 AAV1 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV-inCap1-inRep(Cap1 V188) 보유 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9b는 rBV-inCap1-inRep-hr2(hr2 서열을 갖는 AAV1 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 Cap1 V291)를 보유하는 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9c는 hr2 서열을 갖지 않는 AAV6 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV 보유 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9d는 hr2 서열을 갖는 AAV6 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV-inCap6-inRep(Cap6 V195)를 보유하는 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9e는 hr2 서열을 갖지 않는 AAV9 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV-inCap9-inRep (Cap9 V212) 보유 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9f는 hr2 서열을 갖는 AAV9 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV-inCap9-inRep-hr2(Cap9 V289) 보유 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9g는 hr2 서열을 갖지 않는 AAV8 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV-Cap8-inRep(Cap8 V150) 보유 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. 도 9h는 hr2 서열을 갖는 AAV8 캡시드 및 AAV2 rep 유전자를 발현시키는 rBV-inCap8-inRep-hr2(Cap8 V288) 보유 세포에서 gp64 및 rep2 qPCR 프라이머를 사용하여 결정된 rBV 역가를 나타낸다. rBV를 생산하고, Sf9 세포(도 9a 내지 d), Tni pro 세포(도 9e 내지 f), 및 E4a 세포(도 9g 내지 h)에서 계대하였다. 데이터는, 바큘로바이러스가 hr2 서열을 함유하지 않은 경우에는 특정 바큘로바이러스 역가가 계대 수의 증가에 따라서 감소된 반면(도 9a, 도 9c, 도 9e 및 도 9g), 바큘로바이러스가 발현 카세트 근처에 hr2 서열을 함유한 경우에는 특정 바큘로바이러스 역가가 더 적게 감소하였음을 나타낸다(도 9b, 도9d, 도 9f 및 도 9h). 이러한 변화는 SF9(도 9a 내지 9d), Tni Pro(도 9e 내지 f), 또는 E4a 세포(도 9g 내지 h)가 숙주 세포인지에 관계없이 사실이었다. 계대 P10에 의해서, AAV Cap1 또는 AAV Cap 6을 갖는 바큘로바이러스는 벡터가 hr을 함유하지 않은 경우에는 총 rBV 역가의 10% 미만이었지만(도 9a, 도 9c, 도 9e, 및 도 9g), AAV Cap1 또는 AAV Cap 6을 갖는 바큘로바이러스는 벡터가 hr2를 함유한 경우에는 총 rBV 역가의 약 20%였다(도 9b, 도 9d, 도 9f, 도 9h).
실시예 9
본 실시예는 hr 서열이 AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 재조합 바큘로바이러스(rBV)의 AAV 생산성을 향상시킨다는 것을 예시한다.
이들 실시예에서, 계대 3 내지 계대 10의 hr 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 rBV를 사용하여 Sf9, Tni Pro 및 E4a 세포주를 GFP를 함유하는 rBV로 공감염시켜 AAV 벡터를 생산하였다. 공감염 3일 후, 세포 펠릿을 수거하고, AAV 생산 수율을 결정하였다. 도 10a 내지 d에 나타낸 바와 같이, Sf9 세포에서의 AAV1(도 10a), Sf9 세포에서의 AAV6(도 10b), Tni pro 세포에서의 AAV9(도 10c) 및 E4a 세포에서의 AAV8(도 10d)의 생산 수율은 바큘로바이러스 벡터가 hr2 서열을 포함한 경우에는 계대 3 내지 10에 걸쳐서 유지되었다. 이에 반해서, AAV1, AAV6, AAV9, 및 AAV8의 생산 수율은 rBV에서 hr2가 존재하지 않은 경우에는 계대 3 내지 10에 걸쳐서 극적으로 감소되었다. 이러한 관찰을 추가로 확인하기 위해서, Sf9 세포를 hr2 서열을 갖는 계대 10 rBV(V290, V288 및 V289) 또는 hr2 서열을 갖지 않는 것(V195, V150 및 V212)으로 공감염시켜 AAV6(V195 및 V290), AAV8(V150 및 V288) 및 AAV9 (V212 및 V289) 벡터를 생산하였다. 이 결과는 hr2 서열을 갖지 않는 rBV로 감염된 것보다 hr2를 함유하는 rBV로 감염된 Sf9 세포로부터 실질적으로 더 높은 AAV 생산 수율을 나타낸다(도 10e)(hr+ rBV V290, V288 및 V289와 hr- rBV V195, V150 및 V212의 비교).
실시예 10
본 실시예는 AAV rep 및 cap 발현이 다회의 계대를 통해서 rBV 안정성과 직접적으로 상관관계가 있다는 것을 예시한다.
이들 실험에서, 웨스톤 블롯을 수행하여 rep 및 cap 단백질의 발현 수준을 결정하였다. 도 11A 및 B는 각각 계대 3 내지 계대 10의 hr2 서열을 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스 rBV-inCap6-inRep(V195)(도 11A) 및 hr2 서열을 갖는 rBV-inCap6-inRep-hr2(V290)(도 11B)로 감염시킨 후 AAV6 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 발현을 예시한다. M, 단백질 크기 마커; 레인 1 내지 8, 세포 용해물을 계대 3 내지 10의 rBV로 감염된 Sf9 세포로부터 제조하였다.
도 12A 및 B는 Sf9 세포를 hr2 서열을 갖지 않는 재조합 바큘로바이러스 rBV-inCap8-inRep(V150)(도 12A) 및 hr2 서열을 갖는 rBV-inCap8-inRep-hr2(V288)(도 12B)로 감염시킨 후 AAV2 rep 단백질 REP78 및 REP52의 발현을 예시한다. M, 단백질 크기 마커; 레인 1 내지 5, 세포 용해물을 계대 6 내지 10의 rBV로 감염된 Sf9 세포로부터 제조하였다. 도 11 및 도 12에서의 결과는 hr 서열을 갖는 rBV가 hr 서열을 갖지 않는 rBV에 비해서, 후기 계대를 비롯하여 다수의 계대에 걸쳐서 더 높은 수준의 rep 및 cap 단백질을 발현시킨다는 것을 나타낸다.
모든 인용된 문헌은 각각 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 출원인은 임의의 참고 문헌의 저자가 제시한 임의의 결론에 이의를 제기할 권한을 갖는다.
SEQUENCE LISTING <110> Virovek, Inc <120> AAV production in insect cells, methods and compositions therefor <130> WO 2017/184879 <140> PCT/US2017/028660 <141> 2017-04-20 <150> US 62/325,817 <151> 2016-04-21 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 880 <212> DNA <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 1 atcgatgatt gaccccaaca aaagatttat aattaatcat aatcacgaac aacaacaagt 60 caatgaaaca aataaacaag ttgtcgataa aacattcata aatgacacag caacatacaa 120 ttcttgcata ataaaaattt aaatgacatc atatttgaga ataacaaatg acattatccc 180 tcgattgtgt tttacaagta gaattctacc cgtaaagcga gtttagtttt gaaaaacaaa 240 tgacatcatt tgtataatga catcatcccc tgattgtgtt ttacaagtag aattctatcc 300 gtaaagcgag ttcagttttg aaaacaaatg agtcatacct aaacacgtta ataatcttct 360 gatatcagct tatgactcaa gttatgagcc gtgtgcaaaa catgagataa gtttatgaca 420 tcatccactg atcgtgcgtt acaagtagaa ttctactcgt aaagccagtt cggttatgag 480 ccgtgtgcaa aacatgacat cagcttatga ctcatacttg attgtgtttt acgcgtagaa 540 ttctactcgt aaagcgagtt cggttatgag ccgtgtgcaa aacatgacat cagcttatga 600 gtcataatta atcgtgcgtt acaagtagaa ttctactcgt aaagcgagtt gaaggatcat 660 atttagttgc gtttatgaga taagattgaa aagcgtgtaa aatgtttccc gcgcttggca 720 caactattta caatgcggcc aagttataaa agattctaat ctgatatgtt ttaaaacacc 780 tttgcggccc gagttgtttg cgtacgtgac tagcgaagaa gatgtgtgga ccgcagaaca 840 gatagtaaaa caaaacccta gtattggagc aataatcgat 880 <210> 2 <211> 990 <212> DNA <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 2 tgagcaaaac acaaccggca aattctcggc ggccgtttgg gaatgcggaa taattgccat 60 atgtaaatga tgtcatcggt tctaactcgc tttacgagta gaattctacg tgtaaaacat 120 aatcaagaga tgatgtcatt tgtttttcaa aactgaactc aagaaatgat gtcatttgtt 180 tttcaaaact gaactggctt tacgagtaga attctacttg taaaacacaa tcgagagatg 240 atgtcatatt ttgcacacgg ctctaattaa actcgcttta cgagtaaaat tctacttgta 300 acgcatgatc aagggatgat gtcattggat gagtcatttg tttttcaaaa ctaaactcgc 360 tttacgagta gaattctact tgtaaaacac aatcaaggga tgatgtcatt atacaaatga 420 tgtcatttgt ttttcaaaac taaactcgct ttacgggtag aattctactt gtaaaacagc 480 aactcgaggg atgatgtcat cctttactcg atgattataa acgtgtttat gtatgactca 540 tttgtttttc aaaactaaac tcgctttacg agtagaattc tacttgtaac gcacgatcaa 600 gggatgatgt catttatttg tgcaaagctc gatgtcatct tttgcacacg attataaaca 660 caatccaaat aatgactcat ttgttttcaa aactgaactc gctttacgag tagaattcta 720 cttgtaaaac acaatcaagg gatgatgtca ttttcaaaat gatgtcattt gtttttcaaa 780 actaaactcg ctttacgagt agaattctac ttgtaaaaca caatcaaggg atgatgtcat 840 tttaaaaatg atcatttgtt tttcaaaact aaactcgctt tacgagtaga attctacgtg 900 taaaacacaa tcaagggatg atgtcattta ctaaataaaa taattattta aataaaactg 960 ttttttattg tcaaatacac attgattcac 990 <210> 3 <211> 684 <212> DNA <213> Autographa californica nucleopolyhedrovirus <400> 3 acgcgtagaa ttctacttgt aaagcaagtt aaaataagcc gtgtgcaaaa atgacatcag 60 acaaatgaca tcatctacct atcatgatca tgttaataat catgttttaa aatgacatca 120 gcttatgact aataattgat cgtgcgttac aagtagaatt ctactcgtaa agcgagttta 180 gttttgaaaa caaatgagtc atcattaaac atgttaataa tcgtgtataa aggatgacat 240 catccactaa tcgtgcgtta 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californica nucleopolyhedrovirus <400> 6 ttgaaaattt attgcctaat attatttttg tcagttcgtt gtcatttatt aatttggatg 60 atgtccattt gtttttaaaa ttgaactggc tttacgagta gaattctacg cgtaaaacac 120 aatcaagtat gagtcataag ctgatgtcat gttttgcaca cggctcataa ccgaactggc 180 tttacgagta gaattctact tgtaacgcac gatcgagtgg atgatggtca tttgtttttc 240 aaatcgagat gatgtcatgt tttgcacacg ggctcataaa ctgctttacg agtagaattc 300 tacgtgtaac gcacgatcga ttgatgagtc atttgttttg caatatgata tcatacaata 360 tgactcattt gtttttcaaa accgaacttg atttacgggt agaattctac tcgtaaagca 420 caatcaaaaa gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tctcggcttt acgagtagaa 480 ttctacgtgt aaaacacaat caagaaatga tgtcatttgt tataaaaata aaagctgatg 540 tcatgttttg cacatggctc ataactaaac tcgctttacg ggtagaattc tacgcgtaaa 600 acatgattga taattaaata attcatttgc aaagctatac gttaaatcaa acggacgtta 660 tggaattgta taatattaaa tatgcaattg atccaacaaa taaaattata atagagcaag 720 tcgac 725 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 gctttacgag tagaattcta 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Claims (2)

  1. 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 생산을 위한 바큘로바이러스 벡터로서,
    AAV Cap 발현 카세트;
    AAV Rep 발현 카세트; 및
    AAV 발현 카세트의 시작 코돈으로부터 최대 약 4kb에 위치된 바큘로바이러스 상동성 영역2(hr2)을 포함하되, 상기 벡터는 Rep 결합 요소(RBE), RBE를 포함하는 반전 말단 반복부(ITR) 및 RBE를 포함하는 프로모터를 갖지 않는 것인, 바큘로바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 hr2 영역은 상기 Rep 발현 카세트와 상기 Cap 발현 카세트 사이에 존재하되, 상기 Rep 발현 카세트 및 상기 Cap 발현 카세트는 헤드 투 헤드(5'에서 5') 배향으로 존재하는, 바큘로바이러스 벡터.
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