JP2019514352A - 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 - Google Patents
昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019514352A JP2019514352A JP2018549544A JP2018549544A JP2019514352A JP 2019514352 A JP2019514352 A JP 2019514352A JP 2018549544 A JP2018549544 A JP 2018549544A JP 2018549544 A JP2018549544 A JP 2018549544A JP 2019514352 A JP2019514352 A JP 2019514352A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- aav
- baculovirus
- expression cassette
- rep
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 5
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 170
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 117
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 110
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 19
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 abstract description 28
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 abstract description 16
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 abstract description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 137
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 56
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 22
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 19
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 17
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 101710141347 Major envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 11
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 10
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 10
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 9
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 8
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 description 8
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 7
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 4
- 101150077194 CAP1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100245221 Mus musculus Prss8 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 2
- 101710180451 CD-NTase-associated protein 6 Proteins 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 101000932966 Pseudomonas aeruginosa CD-NTase-associated protein 8 Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100524319 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100524324 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep78 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 101150045064 gp64 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- -1 t Species 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14051—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/14052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14144—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2750/14152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
本出願は、2016年4月21日出願の米国仮出願第62/325,817号に対して利益および優先権を主張する。同出願第62/325,817号はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の一部である配列表は、コンピュータ可読形式と、ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列を含む書面での配列表とを含む。コンピュータ可読形式で記録された配列表情報は、書面での配列表と同一である。配列表の主題は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
最初のアデノ随伴ウイルス(AAV)媒介遺伝子治療薬の承認を得て、AAVベクターを大規模に製造する技術への要望が高まっている(Yla−Herttuala,S., Mol.Ther.20,1831−1832,2012)。現在、AAVを生成するためのいくつかの技術がある。従来の方法は、三重または二重のプラスミドによるHEK293細胞または他の哺乳動物細胞株のトランスフェクションを利用している。この方法はAAVの収率が低く、それが接着細胞を必要とするためにスケールアップが難しい(Xiao,X., Li,J.& Samulski,R.J., J.Virol.72,2224−2232,1998)。AAVを生成するための別の方法は、哺乳動物細胞を感染させるために単純ヘルペス(Herpes Simplex)ウイルス(HSV)を利用する。この方法は、HSV種を十分に生成する上での困難によって妨げられ、AAV生産性も低い(Booth,M.J.,ら,Gene Ther. 11,829−837,2004)。
hr1:ATCGATGATT GACCCCAACA AAAGATTTAT AATTAATCAT AATCACGAAC AACAACAAGT CAATGAAACA AATAAACAAG TTGTCGATAA AACATTCATA AATGACACAG CAACATACAA TTCTTGCATA ATAAAAATTT AAATGACATC ATATTTGAGA ATAACAAATG ACATTATCCC TCGATTGTGT TTTACAAGTA GAATTCTACC CGTAAAGCGA GTTTAGTTTT GAAAAACAAA TGACATCATT TGTATAATGA CATCATCCCC TGATTGTGTT TTACAAGTAG AATTCTATCC GTAAAGCGAG TTCAGTTTTG AAAACAAATG AGTCATACCT AAACACGTTA ATAATCTTCT GATATCAGCT TATGACTCAA GTTATGAGCC GTGTGCAAAA CATGAGATAA GTTTATGACA TCATCCACTG ATCGTGCGTT ACAAGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCCAGTT CGGTTATGAG CCGTGTGCAA AACATGACAT CAGCTTATGA CTCATACTTG ATTGTGTTTT ACGCGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCGAGTT CGGTTATGAG CCGTGTGCAA AACATGACAT CAGCTTATGA GTCATAATTA ATCGTGCGTT ACAAGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCGAGTT GAAGGATCAT ATTTAGTTGC GTTTATGAGA TAAGATTGAA AAGCGTGTAA AATGTTTCCC GCGCTTGGCA CAACTATTTA CAATGCGGCC AAGTTATAAA AGATTCTAAT CTGATATGTT TTAAAACACC TTTGCGGCCC GAGTTGTTTG CGTACGTGAC TAGCGAAGAA GATGTGTGGA CCGCAGAACA GATAGTAAAA CAAAACCCTA GTATTGGAGC AATAATCGAT(配列番号1)
hr2:TGAGCAAAAC ACAACCGGCA AATTCTCGGC GGCCGTTTGG GAATGCGGAA TAATTGCCAT ATGTAAATGA TGTCATCGGT TCTAACTCGC TTTACGAGTA GAATTCTACG TGTAAAACAT AATCAAGAGA TGATGTCATT TGTTTTTCAA AACTGAACTC AAGAAATGAT GTCATTTGTT TTTCAAAACT GAACTGGCTT TACGAGTAGA ATTCTACTTG TAAAACACAA TCGAGAGATG ATGTCATATT TTGCACACGG CTCTAATTAA ACTCGCTTTA CGAGTAAAAT TCTACTTGTA ACGCATGATC AAGGGATGAT GTCATTGGAT GAGTCATTTG TTTTTCAAAA CTAAACTCGC TTTACGAGTA GAATTCTACT TGTAAAACAC AATCAAGGGA TGATGTCATT ATACAAATGA TGTCATTTGT TTTTCAAAAC TAAACTCGCT TTACGGGTAG AATTCTACTT GTAAAACAGC AACTCGAGGG ATGATGTCAT CCTTTACTCG ATGATTATAA ACGTGTTTAT GTATGACTCA TTTGTTTTTC AAAACTAAAC TCGCTTTACG AGTAGAATTC TACTTGTAAC GCACGATCAA GGGATGATGT CATTTATTTG TGCAAAGCTC GATGTCATCT TTTGCACACG ATTATAAACA CAATCCAAAT AATGACTCAT TTGTTTTCAA AACTGAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCAAGG GATGATGTCA TTTTCAAAAT GATGTCATTT GTTTTTCAAA ACTAAACTCG CTTTACGAGT AGAATTCTAC TTGTAAAACA CAATCAAGGG ATGATGTCAT TTTAAAAATG ATCATTTGTT TTTCAAAACT AAACTCGCTT TACGAGTAGA ATTCTACGTG TAAAACACAA TCAAGGGATG ATGTCATTTA CTAAATAAAA TAATTATTTA AATAAAACTG TTTTTTATTG TCAAATACAC ATTGATTCAC(配列番号2)
hr3:ACGCGTAGAA TTCTACTTGT AAAGCAAGTT AAAATAAGCC GTGTGCAAAA ATGACATCAG ACAAATGACA TCATCTACCT ATCATGATCA TGTTAATAAT CATGTTTTAA AATGACATCA GCTTATGACT AATAATTGAT CGTGCGTTAC AAGTAGAATT CTACTCGTAA AGCGAGTTTA GTTTTGAAAA CAAATGAGTC ATCATTAAAC ATGTTAATAA TCGTGTATAA AGGATGACAT CATCCACTAA TCGTGCGTTA CAAGTAGAAT TCTACTCGTA AAGCGAGTTC GGTTTTGAAA AACAAATGAC ATCATTTCTT GATTGTGTTT TACACGTAGA ATTCTACTCG TAAAGTATGT TCAGTTTAAA AAACAAATGA CATCATTTTA CAGATGACAT CATTTCTTGA TTATGTTTTA CAAGTAGAAT TCTACTCGTA AAGCGAGTTT AGTTTTAAAA AACAAATGAC ATCATCTCTT GATTATGTTT TACAAGTAGA ATTCTACTCG TAAAGCGAGT TTAGTTTTGA AAAACAAATG ACATCATCTC TTGATTATGT TTTACAAGTA GAATTCTACT CGTAAAGCGA GTTTAGTTTT GAAAAACAAA TGACATCATC CCTTGATCAT GCGTTACAAG TAGAATTCTA CTCGTAAAGC GAGTTGAATT TTGATTACAA TATT(配列番号3)
hr4左:ATGCATATAA TTGTGTACAA AATATGACTC ATTAATCGAT CGTGCGTTAC AAGTAGAATT CTACTGGTAA AGCAAGTTCG GTTGTGAGCC GTGTGCAAAA CATGACATCA TAACTAATCA TGTTTATAAT CATGTGCAAA ATATGACATC ATCCGACGAT TGTGTTTTAC AAGTAGAATT CTACTCGTAA AGCGAGTTTA AAAATTTTGT GACGTCAATG AAACAACGTG TAATATTTTT TACAATATTT AAGTGAAACA TTATGACTTC CAATAATTTT GTGGATGTGG ATACGTTTGC AAGACAATTG ATTACAGATA AATGTAGTGC TCTAATCGAA AGATGCGGAT CTGTTGCCGG CAAACATTTT AGAGATTAGT AGAGAAAGGC CAGAGACAAG TATTTTGAGG TGCCAACTCA AAAAAACTAT GAATACATTA AAAAATTATT TTTACGAACA AAATATATGG ACGATTCGAT AGATTATAAA GATTTTAACA GACGCATCCT ATTGATAGTT TTTAAATTCG CTTTAAACAA GAGCACCAAC TACTTTCCAT CGTACTAAAG AGATCATCGA GGTGGCCATT AAACGTTTAA ACAAAATTAA CCCCGATTTA AAGAGTTCTC CGCGCAATGC TTCAGCATTA CAAATGAATG TTTGGAAAAT CTAGA(配列番号4)
hr4右:AACTGGCTTT ACGAGTAGAA TTCTACTTGT AAAACACAAT CAAGAAATGA TGTCATTTTT GTACGTGATT ATAAACATGT TTAAACATGG TACATTGAAC TTAATTTTTG CAAGTTGATA AACTAGATTA ATGTATGACT CATTTGTTTG TGCAAGTTGA TAAACGTGAT TAATATATGA CTCATATGTT TGTGCAAAAA TGGTGTCATC GTACAAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCGAGG GATGATGTCA TTTGTAGAAT GATGTCATTT GTTTTTTCAA AACCGAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCGAGG GATGATGTCA TTTGTAGAAT GATGTCATCG TACAAACTCG CTTTACGAGT AGAATTCTAG TAAAACAC(配列番号5)
hr5:TTGAAAATTT ATTGCCTAAT ATTATTTTTG TCAGTTCGTT GTCATTTATT AATTTGGATG ATGTCCATTT GTTTTTAAAA TTGAACTGGC TTTACGAGTA GAATTCTACG CGTAAAACAC AATCAAGTAT GAGTCATAAG CTGATGTCAT GTTTTGCACA CGGCTCATAA CCGAACTGGC TTTACGAGTA GAATTCTACT TGTAACGCAC GATCGAGTGG ATGATGGTCA TTTGTTTTTC AAATCGAGAT GATGTCATGT TTTGCACACG GGCTCATAAA CTGCTTTACG AGTAGAATTC TACGTGTAAC GCACGATCGA TTGATGAGTC ATTTGTTTTG CAATATGATA TCATACAATA TGACTCATTT GTTTTTCAAA ACCGAACTTG ATTTACGGGT AGAATTCTAC TCGTAAAGCA CAATCAAAAA GATGATGTCA TTTGTTTTTC AAAACTGAAC TCTCGGCTTT ACGAGTAGAA TTCTACGTGT AAAACACAAT CAAGAAATGA TGTCATTTGT TATAAAAATA AAAGCTGATG TCATGTTTTG CACATGGCTC ATAACTAAAC TCGCTTTACG GGTAGAATTC TACGCGTAAA ACATGATTGA TAATTAAATA ATTCATTTGC AAAGCTATAC GTTAAATCAA ACGGACGTTA TGGAATTGTA TAATATTAAA TATGCAATTG ATCCAACAAA TAAAATTATA ATAGAGCAAG TCGAC(配列番号6)
1.バキュロウイルスベクターであって、
AAV Cap発現カセット、AAV Rep発現カセット、およびAAV発現カセットの開始コドンから最大で約4kbに位置するバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、バキュロウイルスベクター。
2.5’から3’への順に、Cap発現カセット、Rep発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、態様1に記載のベクター。
3.5’から3’への順に、Rep発現カセット、Cap発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、態様1に記載のベクター。
4.5’から3’への順に、Cap発現カセット、バキュロウイルス相同領域(hr)、およびRep発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
5.5’から3’への順に、Rep発現カセット、バキュロウイルス相同領域(hr)、およびCap発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
6.5’から3’ への順に、バキュロウイルス相同領域(hr)、Cap発現カセット、およびRep発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
7.5’から3’への順に、バキュロウイルス相同領域(hr)、Rep発現カセット、およびCap発現カセットを含む、態様1に記載のベクター。
8.hr領域がRep発現カセットとCap発現カセットとの間にあり、かつRep発現カセットとCap発現カセットとが頭−頭(5’−5’)配向にある、態様1に記載のベクター。
9.バキュロウイルス相同領域がhr2配列である、態様1〜9のいずれか1態様に記載のベクター。
10.ベクターがRep結合エレメント(RBE)を含まない、態様1〜9のいずれか1態様に記載のベクター。
11.細胞を含む昆虫細胞株であって、態様1〜10のいずれか1態様に記載のベクターを含む、昆虫細胞株。
12.細胞が第2のベクターをさらに含み、上記第2のベクターがAAV ITRに隣接される導入遺伝子を含む、態様11に記載の昆虫細胞株。
13.in vitroでバキュロウイルスを増殖させる方法であって、態様11または態様12に記載の昆虫細胞の培養物を用意すること、およびこの細胞をインキュベートすることを含む、方法。
14.細胞をインキュベートすることが細胞を継代培養することを含み、および継代7でのAAV生成収率がAAV Cap発現カッセットと、AAV Rep発現カセットとを含むがバキュロウイルスhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む対照昆虫細胞株と比較して少なくとも2倍大きい、態様13に記載の方法。
15.AAV Cap発現カセットを含むバキュロウイルスの継代7での力価が総バキュロウイルス力価(総バキュロウイルスについてはgp64のqPCRによって、AAVについてはCapのqPCRによって測定される)の21.5%を上回る、態様13に記載の方法。
16.in vitroでAAVを増殖させる方法であって、昆虫細胞の培養物を用意すること、この昆虫細胞を態様1〜10のいずれか1態様に記載のバキュロウイルスベクターで感染することまたはトランスフェクトすること、およびこの細胞をインキュベートすることを含む、方法。
17.昆虫細胞由来のAAVの継代7での収率がhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞由来のAAVの継代7での収率よりも少なくとも50%大きい、態様16に記載の方法。
18.バキュロウイルスhrを含む細胞由来のAAVの継代7での収率がhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む細胞由来のAAVの収率よりも少なくとも20%大きい、態様16に記載の方法。
19.バキュロウイルスベクターがRep結合エレメント(RBE)を含まない、態様16に記載の方法。
20.in vitroでAAVを生成する方法であって、態様1〜10のいずれか1態様に記載のベクター、およびAAV ITRに隣接される導入遺伝子を含むベクターを含む昆虫細胞培養物を増殖させることを含む、方法。
21.in vitroで昆虫細胞においてAAVを生成するためのRep結合エレメント(RBE)を含まないバキュロウイルスベクターであって、AAV Cap発現カセット、AAV Rep発現カセット、およびAAV発現カセットの開始コドンから最大で約4kbに位置するバキュロウイルス相同領域(hr)を含む、バキュロウイルスベクター。
ハスモンヨトウ(Spodoptera frugiperda)Sf9細胞、キンウワバ(Trichoplusia ni)細胞およびEstima acrea細胞を、Corningストレージボトル中の100単位/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシン(Mediatech)を補充したESF921培地(Expression Systems)中で、28℃で培養した。細胞密度が8×106細胞/mLに達したならば、細胞を維持のために1:4に分けた。
hr2配列をバキュロウイルスゲノムからPCR増幅し、プラスミドV053−pFBD−inRepOpt−inCap8中にクローン化して、V059−pFBD−inRepOpt−hr2−inCap8を作製した。kozak配列を組み入れるために、プラスミドV059をBstZ171とAgelで切断してBstZ171−Agelフラグメントを除去し、BstZ171−AgelフラグメントをV150−pFB−inCap8−inRep−kozakからのVP1開始コドンの上流のkozak配列と置き換えて、hr2がRep発現カセットとCap発現カセットとの間に位置するV277−pFB−inCap8−hr2−inRep−kozakを作製した。hr2配列をRep発現カセットのポリA配列の後の別の部位に挿入するために、hr2配列を、V277からのプライマー3205F(5’−GCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGT−3’配列番号7)および3206R(5’−GGCCTACGTAGTTTTACACGTAGAATTCTACTCGT−3’配列番号8)でPCR増幅した。pcプロモーター配列を、V150からのプライマー3065F(5’−ATTTGACTTGGTCAGGGCCG−3’配列番号9)および3204R(5’−GAATTCTACTCGTAAAGCCCAGTTGACATAAGCCTGTTCG−3’配列番号10)で増幅した。これらのhr2およびpcプロモーターPCRフラグメントを、プライマー3065Fおよび3206Rでの2回目のPCR反応によって結合した。結合したPCRフラグメントを、BsrGIおよびSnaBIで消化し、V150、V212、V195、V188、およびV146のBsrGI部位およびSnaBI部位にライゲートして、それぞれ、V288−pFB−inCap8−inRep−hr2、V289−pFB−inCap9−inRep−hr2、V290−pFB−inCap6−inRep−hr2、V291−pFB−inCap1−inRep−hr2、およびV295−pFB−inCap5−inRep−hr2を作製した。hr配列挿入を有するプラスミドの例を、図1〜6に図示する。
均質クローンを得るために、生成した組換えバキュロウイルスをプラーク精製した。手短に言うと、Sf9細胞を、2mLのESF921培地中で1.5e+6細胞/ウェルの細胞密度で6ウェルプレート上に播種し、28℃で30分間、インキュベートした。バキュロウイルスを、1mL容量で10−2、10−3、10−4、10−5、10−6、および10−7にそれぞれ希釈した。インキュベーション終了時に、培地をウェルから除去し、250μLの各希釈液を添加して、28℃で1時間、Sf9細胞を感染した。インキュベーション終了時に、3mLの1%のアガロースオーバーレイ(42℃まで冷却)をウェルに添加した。アガロースが凝固すると、2mLのESF921培地を各ウェルに添加し、プレートを28℃で5〜7日間インキュベートした。十分に形成されたプラークを選び、継代のために昆虫細胞を感染するのに用いた。
組換えバキュロウイルスとAAVの力価を決定するために、qPCR法を用いた。1プラーク形成単位(pfu)がウイルスの約20ゲノムコピーを含むことが、経験的に決定された。手短に言うと、収集したウイルスをqPCR希釈緩衝液中で希釈し、95℃に30分間加熱してウイルス粒子を破壊した。処理したウイルス試料を次いで、既知の標準とともにCHROMO4(商標)システム(Bio−Rad Laboratories inc.,Hercules,CA)中でアッセイした。Ct値をpfuに変換し、これを用いて、バキュロウイルス継代培養とAAV生成を誘導した。
組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞を感染させ、AAVベクターを生成した。手短に言うと、hr2配列を有するまたは有しないRep遺伝子およびCap遺伝子を含有する10moiの組換えバキュロウイルスを、AAV ITRに隣接されるGFPマーカー遺伝子を含有する5moiの組換えバキュロウイルスとともに28℃で3日間同時感染させた。細胞ペレットを、3000rpmで10分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理によってSf9溶解緩衝液(50mMのTris−HCl、pH7.8、50mMのNaCl、2mMのMgCl2、1%のSarkosyl、1%のTriton X−100および140単位/mLのベンゾナーゼ)中で溶解した。細胞破壊片を、8000rpmで20分間の遠心分離によって除去した。透明溶解液を、次のようにAAV生産性の定量のために用いた:溶解液を、qPCR希釈緩衝液で希釈し、混入しているDNAを、デオキシリボヌクレアーゼI酵素と37℃で1時間インキュベートすることによって破壊した。デオキシリボヌクレアーゼI酵素を、100mMのEDTAの存在下で、95℃で30分間、加熱することによって不活性化した。処理したAAV試料をさらに希釈し、Chromo4 qPCR装置でアッセイした。Ct値を、AAVベクターゲノムコピーに変換した。
rep遺伝子およびcap遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを用いて3日間Sf9細胞を感染し、細胞ペレットを、3,000rpmで10分間の遠心分離により収集した。約2×106細胞を含む細胞ペレットを300μLのPBS緩衝液中に最初に再懸濁し、次いで100μLの4×LDS試料緩衝液とともにボルテックスして、細胞を溶解した。溶解物を95℃で5分間加熱し、次いで20秒間、超音波処理して、ゲノムDNAをせん断した。短時間の遠心分離の後、溶解物を次いで10%SDS−ゲル上にロードして、タンパク質を分離した。タンパク質を次いで、ゲルからニトロセルロース膜に移した。5%脱脂乳でのブロッキング後に、膜をrepタンパク質またはcapタンパク質に対する特異的抗体を用いて探索した。第1の抗体に対し西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と結合された第2の抗体を用いて、カラー・マトリックス反応によりrepタンパク質またはcapタンパク質を検出した。
本発明の教示は、いずれの特許請求の範囲または態様を限定することを意図しない実施例に記載の説明を含む。具体的に過去形で示されない限り、実施例は仮想例または実際例であり得る。以下の非限定例は、本発明の教示をさらに例示するために提供される。本開示の観点から、多くの変更が開示された特定の実施形態においてなされ、および本発明の教示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をさらに得られることを当業者は理解する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
本実施例はhr配列がAAV生成収率を高めることを例示する。
本実施例は、hr配列がAAV rep遺伝子とcap遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスの安定性を高めることを例示する。
本実施例は、hr配列がAAVrep遺伝子とcap遺伝子を含有する組換えバキュロウイルス(rBV)のAAV生産性を高めることを例示する。
本実施例は、AAV repとcapの発現が多数継代を通してrBV安定性と直接相関することを例示する。
Claims (21)
- AAV Cap発現カセット、
AAV Rep発現カセット、および
AAV発現カセットの開始コドンから最大で約4kbに位置するバキュロウイルス相同領域(hr)
を含むバキュロウイルスベクター。 - 5’から3’への順に、前記Cap発現カセット、前記Rep発現カセット、および前記バキュロウイルス相同領域(hr)を含む、請求項1に記載のベクター。
- 5’から3’への順に、前記Rep発現カセット、前記Cap発現カセット、および前記バキュロウイルス相同領域(hr)を含む、請求項1に記載のベクター。
- 5’から3’への順に、前記Cap発現カセット、前記バキュロウイルス相同領域(hr)、および前記Rep発現カセットを含む、請求項1に記載のベクター。
- 5’から3’への順に、前記Rep発現カセット、前記バキュロウイルス相同領域(hr)、および前記Cap発現カセットを含む、請求項1に記載のベクター。
- 5’から3’への順に、前記バキュロウイルス相同領域(hr)、前記Cap発現カセット、および前記Rep発現カセットを含む、請求項1に記載のベクター。
- 5’から3’への順に、前記バキュロウイルス相同領域(hr)、前記Rep発現カセット、および前記Cap発現カセットを含む、請求項1に記載のベクター。
- 前記hr領域が前記Rep発現カセットと前記Cap発現カセットとの間にあり、かつ前記Rep発現カセットおよび前記Cap発現カセットが頭−頭(5’−5’)配向にある、請求項1に記載のベクター。
- 前記バキュロウイルス相同領域がhr2配列である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のベクター。
- 前記ベクターがRep結合エレメント(RBE)を含まない、請求項1〜9のいずれか1項に記載のベクター。
- 細胞を含む昆虫細胞株であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のベクターを含む、昆虫細胞株。
- 前記細胞が第2のベクターをさらに含み、前記第2のベクターがAAV末端逆位配列(ITR)に隣接される導入遺伝子を含む、請求項11に記載の昆虫細胞株。
- in vitroでバキュロウイルスを増殖させる方法であって、
請求項11または請求項12に記載の昆虫細胞の培養物を用意すること、および
前記細胞をインキュベートすること
を含む、方法。 - 前記細胞をインキュベートすることが前記細胞を継代培養することを含み、および継代7でのAAV生成収率がAAV Cap発現カッセットとAAV Rep発現カセットとを含むがバキュロウイルスhrを含まないバキュロウイルスベクターを含む対照昆虫細胞株と比較して少なくとも2倍大きい、請求項13に記載の方法。
- 前記AAV Cap発現カセットを含むバキュロウイルスの継代7での力価が総バキュロウイルス力価の21.5%を上回る、請求項13に記載の方法。
- in vitroでAAVを増殖させる方法であって、
昆虫細胞の培養物を用意すること、
前記昆虫細胞を請求項1〜10のいずれか1項に記載のバキュロウイルスベクターで感染するまたはトランスフェクトすること、および
前記細胞をインキュベートすること
を含む、方法。 - 前記昆虫細胞からのAAVの継代7での収率が前記hrを有しないバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞からのAAVの継代7での収率よりも少なくとも50%大きい、請求項16に記載の方法。
- 前記バキュロウイルスhrを含む細胞からのAAVの継代7での収率が前記hrを有しないバキュロウイルスベクターを含む細胞からのAAVの収率よりも少なくとも20%大きい、請求項16に記載の方法。
- 前記バキュロウイルスベクターがRep結合エレメント(RBE)を含まない、請求項16に記載の方法。
- in vitroでAAVを生成する方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載のベクター、およびAAV ITRに隣接される導入遺伝子を含むベクターを含む昆虫細胞培養物を増殖させることを含む、方法。
- in vitroで昆虫細胞においてAAVを生成するためのRep結合エレメント(RBE)を有しないバキュロウイルスベクターであって、
AAV Cap発現カセット、
AAV Rep発現カセット、および
AAV発現カセットの開始コドンから最大で約4kbに位置するバキュロウイルス相同領域(hr)
を含む、バキュロウイルスベクター。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2023191698A JP2024016212A (ja) | 2016-04-21 | 2023-11-09 | 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662325817P | 2016-04-21 | 2016-04-21 | |
US62/325,817 | 2016-04-21 | ||
PCT/US2017/028660 WO2017184879A1 (en) | 2016-04-21 | 2017-04-20 | Aav production in insect cells, methods and compositions therefor |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023191698A Division JP2024016212A (ja) | 2016-04-21 | 2023-11-09 | 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019514352A true JP2019514352A (ja) | 2019-06-06 |
Family
ID=60116385
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018549544A Pending JP2019514352A (ja) | 2016-04-21 | 2017-04-20 | 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 |
JP2023191698A Pending JP2024016212A (ja) | 2016-04-21 | 2023-11-09 | 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2023191698A Pending JP2024016212A (ja) | 2016-04-21 | 2023-11-09 | 昆虫細胞中でのaav生成、方法およびその組成物 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11414676B2 (ja) |
EP (1) | EP3445381A4 (ja) |
JP (2) | JP2019514352A (ja) |
KR (2) | KR20180134846A (ja) |
CN (1) | CN108699567B (ja) |
AU (1) | AU2017254652B2 (ja) |
CA (1) | CA3012699C (ja) |
IL (1) | IL261665B2 (ja) |
RU (1) | RU2739596C2 (ja) |
WO (1) | WO2017184879A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3215191A4 (en) | 2014-11-05 | 2018-08-01 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease |
SG11201703419UA (en) | 2014-11-14 | 2017-05-30 | Voyager Therapeutics Inc | Modulatory polynucleotides |
CN107109407A (zh) | 2014-11-14 | 2017-08-29 | 沃雅戈治疗公司 | 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法 |
US11697825B2 (en) | 2014-12-12 | 2023-07-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the production of scAAV |
CA2999279A1 (en) | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Goleini Inc. | Targeted expression of chloride channels and methods of use thereof |
CN110214187B (zh) | 2016-05-18 | 2024-01-30 | 沃雅戈治疗公司 | 调节性多核苷酸 |
JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
AU2020229886A1 (en) | 2019-02-28 | 2021-09-09 | Benitec IP Holdings Inc. | Compositions and methods for treating oculopharyngeal muscular dystrophy (OPMD) |
EP3953377A1 (en) | 2019-04-10 | 2022-02-16 | Prevail Therapeutics, Inc. | Gene therapies for lysosomal disorders |
CN114026115A (zh) | 2019-04-10 | 2022-02-08 | 普利维尔治疗公司 | 用于溶酶体病症的基因疗法 |
JP2023519138A (ja) * | 2020-04-02 | 2023-05-10 | ユニキュアー バイオファーマ ビー.ブイ. | 新規細胞株 |
CN112695057B (zh) | 2020-05-11 | 2022-04-26 | 广东珩达生物医药科技有限公司 | Sars-cov-2抗原多肽及其重组腺相关病毒和在制备疫苗中的应用 |
WO2022035903A2 (en) | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Prevail Therapeutics, Inc. | Gene therapies for lysosomal disorders |
KR20230066360A (ko) | 2020-08-10 | 2023-05-15 | 프리베일 테라퓨틱스, 인크. | 신경퇴행성 장애를 위한 유전자 요법 |
CN112553257B (zh) | 2020-12-03 | 2022-02-11 | 武汉枢密脑科学技术有限公司 | 一种重组腺相关病毒的制备方法、系统及重组杆粒 |
CN112852880B (zh) * | 2021-01-28 | 2022-12-06 | 中吉智药(南京)生物技术有限公司 | 一种基于诱导型昆虫细胞生产aav基因药物的方法 |
WO2023129940A1 (en) | 2021-12-30 | 2023-07-06 | Regel Therapeutics, Inc. | Compositions for modulating expression of sodium voltage-gated channel alpha subunit 1 and uses thereof |
CN114736928B (zh) * | 2022-05-16 | 2023-06-27 | 睿征医药科技(武汉)有限公司 | 一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用 |
CN114736929B (zh) * | 2022-05-16 | 2023-06-09 | 睿征医药科技(武汉)有限公司 | 一种用于昆虫细胞中产生重组杆状病毒的组合物、方法及应用 |
WO2023250362A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Regel Therapeutics, Inc. | Genetic regulatory elements and uses thereof |
WO2024047587A1 (en) | 2022-08-31 | 2024-03-07 | Regel Therapeutics, Inc. | Cas-phi compositions and methods of use |
WO2024076940A1 (en) | 2022-10-04 | 2024-04-11 | Eli Lilly And Company | Gene therapy for trem2-associated diseases and disorders |
US20240156988A1 (en) | 2022-11-11 | 2024-05-16 | Eli Lilly And Company | Synthetic nucleic acids including astrocyte-directed promoter constructs and methods of using the same |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010114948A2 (en) * | 2009-04-02 | 2010-10-07 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (raav) vectors |
JP2011512156A (ja) * | 2008-02-19 | 2011-04-21 | アムステルダム モレキュラー セラピューティクス ビー.ブイ. | 昆虫細胞におけるパルボウイルスrep及びcapタンパク質の発現の最適化 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1570121A (zh) * | 2003-07-25 | 2005-01-26 | 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 | 高效生产重组腺病毒伴随病毒的病毒载体、细胞系、方法及其组成的生产系统 |
CN101405033A (zh) * | 2006-01-20 | 2009-04-08 | 北卡罗来纳大学教堂山分校 | 增强感染性细小病毒载体在昆虫细胞中的生产 |
CN101506369B (zh) | 2006-06-21 | 2014-02-12 | 尤尼克尔生物制药股份有限公司 | 具有经修饰的用于在昆虫细胞中产生aav的aav-rep78翻译起始密码子的载体 |
ES2385679T3 (es) * | 2006-08-24 | 2012-07-30 | Virovek, Inc. | Expresión de células de insecto de genes con marcos de lectura abiertos superpuestos, métodos y composiciones de éstos |
EP3093345B8 (en) * | 2007-07-26 | 2019-07-24 | UniQure IP B.V. | Baculoviral vectors comprising repeated coding sequences with differential codon biases |
-
2017
- 2017-04-20 EP EP17786644.9A patent/EP3445381A4/en active Pending
- 2017-04-20 JP JP2018549544A patent/JP2019514352A/ja active Pending
- 2017-04-20 AU AU2017254652A patent/AU2017254652B2/en active Active
- 2017-04-20 CA CA3012699A patent/CA3012699C/en active Active
- 2017-04-20 CN CN201780010098.0A patent/CN108699567B/zh active Active
- 2017-04-20 IL IL261665A patent/IL261665B2/en unknown
- 2017-04-20 KR KR1020187023233A patent/KR20180134846A/ko not_active IP Right Cessation
- 2017-04-20 WO PCT/US2017/028660 patent/WO2017184879A1/en active Application Filing
- 2017-04-20 RU RU2018128968A patent/RU2739596C2/ru active
- 2017-04-20 KR KR1020237018089A patent/KR20230079511A/ko not_active Application Discontinuation
-
2018
- 2018-08-24 US US16/112,149 patent/US11414676B2/en active Active
-
2023
- 2023-11-09 JP JP2023191698A patent/JP2024016212A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011512156A (ja) * | 2008-02-19 | 2011-04-21 | アムステルダム モレキュラー セラピューティクス ビー.ブイ. | 昆虫細胞におけるパルボウイルスrep及びcapタンパク質の発現の最適化 |
WO2010114948A2 (en) * | 2009-04-02 | 2010-10-07 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (raav) vectors |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BIOTECH. BIOENG., 2004, VOL. 87, NO. 6, PP. 743-753, JPN6021001157, ISSN: 0004426603 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL261665B2 (en) | 2023-11-01 |
RU2018128968A (ru) | 2020-05-21 |
WO2017184879A1 (en) | 2017-10-26 |
EP3445381A1 (en) | 2019-02-27 |
CN108699567B (zh) | 2024-02-13 |
JP2024016212A (ja) | 2024-02-06 |
US11414676B2 (en) | 2022-08-16 |
EP3445381A4 (en) | 2019-10-02 |
RU2018128968A3 (ja) | 2020-07-21 |
US20180371495A1 (en) | 2018-12-27 |
AU2017254652A1 (en) | 2018-08-09 |
CN108699567A (zh) | 2018-10-23 |
AU2017254652B2 (en) | 2022-12-01 |
IL261665A (en) | 2018-10-31 |
RU2739596C2 (ru) | 2020-12-28 |
CA3012699A1 (en) | 2017-10-26 |
CA3012699C (en) | 2023-11-21 |
KR20230079511A (ko) | 2023-06-07 |
KR20180134846A (ko) | 2018-12-19 |
IL261665B1 (en) | 2023-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2739596C2 (ru) | Продуцирование aav в клетках насекомых, способы и композиции для этого | |
US10480010B2 (en) | Baculovirus expression systems | |
US9879282B2 (en) | Expression in insect cells of genes with overlapping open reading frames, methods and compositions therefor | |
US10767192B2 (en) | Baculovirus system for the expression of a gene therapy vector | |
Wu et al. | A recombinant baculovirus efficiently generates recombinant adeno-associated virus vectors in cultured insect cells and larvae | |
TWI802584B (zh) | 具有經修飾之磷脂酶區域的腺相關病毒(aav) | |
EP3693466B1 (en) | Method and system for preparing recombinant adeno-associated virus, and recombinant bacmid | |
US20200407696A1 (en) | Baculovirus expression system | |
US11708585B2 (en) | Method, system and recombinant bacmid for preparation of recombinant adeno-associated virus | |
Hashemzadeh et al. | Designing two individual AcMNPV polyhedrin-plus Bac-to-Bac expression system in order to express GFP and CPV-VP2 in insect cells | |
CN117646033A (zh) | 一种dna聚合酶过表达的杆状病毒表达载体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200331 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20210115 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210413 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20210413 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210921 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220121 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220121 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220121 |
|
C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20220215 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220325 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20220329 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20220422 |
|
C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C211 Effective date: 20220426 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220712 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20230221 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230808 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230908 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231006 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20231110 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240311 |