CN108699567B - 昆虫细胞中的aav产生、其方法和组合物 - Google Patents

昆虫细胞中的aav产生、其方法和组合物 Download PDF

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Abstract

公开了用于在体外在昆虫细胞中产生腺相关病毒(AAV)的组合物和方法。重组杆状病毒载体包含AAV衣壳蛋白基因表达盒(Cap)、AAV Rep基因表达盒(Rep)和杆状病毒同源区(hr)，所述杆状病毒同源区位于距离AAV表达盒中的起始密码子高达约4kb处。与包含Cap和Rep但没有hr的对照相比，携带包含Cap、Rep和hr的重组杆状病毒的昆虫细胞中杆状病毒和AAV的产生水平更高。此外，在用包含Cap、Rep和hr的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中，杆状病毒和AAV产生的水平在细胞连续传代中相对稳定，而在包含含有Cap和Rep但没有hr的重组杆状病毒的昆虫细胞的连续传代中，杆状病毒和AAV产生的水平下降。

Description

昆虫细胞中的AAV产生、其方法和组合物
对现有申请案的引用
本申请要求2016年4月21日提交的美国临时申请62/325,817的权益和优先权。申请62/325,817以引用的方式整体并入本文。
通过引用并入序列表的
序列表是本公开的一部分，包括计算机可读形式和包含核苷酸和/或氨基酸序列的书面序列表。以计算机可读形式记录的序列表信息与书面序列表相同。序列表的主题以引用的方式整体并入本文
引言
随着第一种腺相关病毒(AAV)介导的基因治疗药物的批准，对大规模AAV载体制造技术的需求不断增加(S.,Mol.Ther.20,1831-1832,2012)。目前有几种生产AAV的技术。传统方法利用三重质粒或双重质粒转染HEK293细胞或其他哺乳动物细胞系。该方法的AAV产率低，并且由于其对贴壁细胞的需要而难以扩大规模(Xiao,X.,Li,J.&Samulski,R.J.,J.Virol.72,2224-2232,1998)。另一种生产AAV的方法利用单纯疱疹病毒(HSV)感染哺乳动物细胞。该方法受到产生足够的HSV种子储备的困难的阻碍，并且还具有低AAV生产力(Booth,M.J.等,Gene Ther.11,829-837,2004)。
与其他系统相比，用于昆虫细胞中AAV载体产生的基于杆状病毒的方法具有显著增加的AAV产生产率(Urabe,M.等,Human Gene Therapy 13,1935-1943,2001；Chen,H.,Mol.Ther.16,924-930,2008；Chen,H.,Molecular Therapy–Nucleic Acids 1,e57,2012；Chen的美国专利8,945,918)。然而，重组杆状病毒在多次传代中会不稳定，导致AAV产生下降。因此，对AAV生产系统存在未满足的需求，该AAV生产系统在多次传代后也能够维持以高产率产生AAV载体。
杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒(AcMNPV)基因组包含称为hr1-hr5的5个“同源区”(hr)(Cochran,M.A.和Faulkner,P.,J.Virol.45,961-970,1983；Guarino,L.A.和Summers,M.D.,J.Virol.60,214-223,1986)。这5个区域可以起增强子的作用(Guarino,L.A.等,J.Virol.60,224-229,1986)。已经报道了hr1-hr5的序列(Guarino,L.A.和Summers,M.D.,J.Virol.60,214-223,1986；Guarino,L.A.等,J.Virol.60,224-229,1986)并且在本文中阐述。hr的长度可以是从约400个碱基对至高达约1,000个碱基对。AcMNPV hr序列的实例如下。
hr1：ATCGATGATT GACCCCAACA AAAGATTTAT AATTAATCAT AATCACGAAC AACAACAAGTCAATGAAACA AATAAACAAG TTGTCGATAA AACATTCATA AATGACACAG CAACATACAA TTCTTGCATAATAAAAATTT AAATGACATC ATATTTGAGA ATAACAAATG ACATTATCCC TCGATTGTGT TTTACAAGTAGAATTCTACC CGTAAAGCGA GTTTAGTTTT GAAAAACAAA TGACATCATT TGTATAATGA CATCATCCCCTGATTGTGTT TTACAAGTAG AATTCTATCC GTAAAGCGAG TTCAGTTTTG AAAACAAATG AGTCATACCTAAACACGTTA ATAATCTTCT GATATCAGCT TATGACTCAA GTTATGAGCC GTGTGCAAAA CATGAGATAAGTTTATGACA TCATCCACTG ATCGTGCGTT ACAAGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCCAGTT CGGTTATGAGCCGTGTGCAA AACATGACAT CAGCTTATGA CTCATACTTG ATTGTGTTTT ACGCGTAGAA TTCTACTCGTAAAGCGAGTT CGGTTATGAG CCGTGTGCAA AACATGACAT CAGCTTATGA GTCATAATTA ATCGTGCGTTACAAGTAGAA TTCTACTCGT AAAGCGAGTT GAAGGATCAT ATTTAGTTGC GTTTATGAGA TAAGATTGAAAAGCGTGTAA AATGTTTCCC GCGCTTGGCA CAACTATTTA CAATGCGGCC AAGTTATAAA AGATTCTAATCTGATATGTT TTAAAACACC TTTGCGGCCC GAGTTGTTTG CGTACGTGAC TAGCGAAGAA GATGTGTGGACCGCAGAACA GATAGTAAAA CAAAACCCTA GTATTGGAGC AATAATCGAT(SEQ ID NO:1)
hr2：TGAGCAAAAC ACAACCGGCA AATTCTCGGC GGCCGTTTGG GAATGCGGAA TAATTGCCATATGTAAATGA TGTCATCGGT TCTAACTCGC TTTACGAGTA GAATTCTACG TGTAAAACAT AATCAAGAGATGATGTCATT TGTTTTTCAA AACTGAACTC AAGAAATGAT GTCATTTGTT TTTCAAAACT GAACTGGCTTTACGAGTAGA ATTCTACTTG TAAAACACAA TCGAGAGATG ATGTCATATT TTGCACACGG CTCTAATTAAACTCGCTTTA CGAGTAAAAT TCTACTTGTA ACGCATGATC AAGGGATGAT GTCATTGGAT GAGTCATTTGTTTTTCAAAA CTAAACTCGC TTTACGAGTA GAATTCTACT TGTAAAACAC AATCAAGGGA TGATGTCATTATACAAATGA TGTCATTTGT TTTTCAAAAC TAAACTCGCT TTACGGGTAG AATTCTACTT GTAAAACAGCAACTCGAGGG ATGATGTCAT CCTTTACTCG ATGATTATAA ACGTGTTTAT GTATGACTCA TTTGTTTTTCAAAACTAAAC TCGCTTTACG AGTAGAATTC TACTTGTAAC GCACGATCAA GGGATGATGT CATTTATTTGTGCAAAGCTC GATGTCATCT TTTGCACACG ATTATAAACA CAATCCAAAT AATGACTCAT TTGTTTTCAAAACTGAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCAAGG GATGATGTCA TTTTCAAAATGATGTCATTT GTTTTTCAAA ACTAAACTCG CTTTACGAGT AGAATTCTAC TTGTAAAACA CAATCAAGGGATGATGTCAT TTTAAAAATG ATCATTTGTT TTTCAAAACT AAACTCGCTT TACGAGTAGA ATTCTACGTGTAAAACACAA TCAAGGGATG ATGTCATTTA CTAAATAAAA TAATTATTTA AATAAAACTG TTTTTTATTGTCAAATACAC ATTGATTCAC(SEQ ID NO:2)
hr3：ACGCGTAGAA TTCTACTTGT AAAGCAAGTT AAAATAAGCC GTGTGCAAAA ATGACATCAGACAAATGACA TCATCTACCT ATCATGATCA TGTTAATAAT CATGTTTTAA AATGACATCA GCTTATGACTAATAATTGAT CGTGCGTTAC AAGTAGAATT CTACTCGTAA AGCGAGTTTA GTTTTGAAAA CAAATGAGTCATCATTAAAC ATGTTAATAA TCGTGTATAA AGGATGACAT CATCCACTAA TCGTGCGTTA CAAGTAGAATTCTACTCGTA AAGCGAGTTC GGTTTTGAAA AACAAATGAC ATCATTTCTT GATTGTGTTT TACACGTAGAATTCTACTCG TAAAGTATGT TCAGTTTAAA AAACAAATGA CATCATTTTA CAGATGACAT CATTTCTTGATTATGTTTTA CAAGTAGAAT TCTACTCGTA AAGCGAGTTT AGTTTTAAAA AACAAATGAC ATCATCTCTTGATTATGTTT TACAAGTAGA ATTCTACTCG TAAAGCGAGT TTAGTTTTGA AAAACAAATG ACATCATCTCTTGATTATGT TTTACAAGTA GAATTCTACT CGTAAAGCGA GTTTAGTTTT GAAAAACAAA TGACATCATCCCTTGATCAT GCGTTACAAG TAGAATTCTA CTCGTAAAGC GAGTTGAATT TTGATTACAA TATT(SEQ IDNO:3)
hr4左：ATGCATATAA TTGTGTACAA AATATGACTC ATTAATCGAT CGTGCGTTACAAGTAGAATT CTACTGGTAA AGCAAGTTCG GTTGTGAGCC GTGTGCAAAA CATGACATCA TAACTAATCATGTTTATAAT CATGTGCAAA ATATGACATC ATCCGACGAT TGTGTTTTAC AAGTAGAATT CTACTCGTAAAGCGAGTTTA AAAATTTTGT GACGTCAATG AAACAACGTG TAATATTTTT TACAATATTT AAGTGAAACATTATGACTTC CAATAATTTT GTGGATGTGG ATACGTTTGC AAGACAATTG ATTACAGATA AATGTAGTGCTCTAATCGAA AGATGCGGAT CTGTTGCCGG CAAACATTTT AGAGATTAGT AGAGAAAGGC CAGAGACAAGTATTTTGAGG TGCCAACTCA AAAAAACTAT GAATACATTA AAAAATTATT TTTACGAACA AAATATATGGACGATTCGAT AGATTATAAA GATTTTAACA GACGCATCCT ATTGATAGTT TTTAAATTCG CTTTAAACAAGAGCACCAAC TACTTTCCAT CGTACTAAAG AGATCATCGA GGTGGCCATT AAACGTTTAA ACAAAATTAACCCCGATTTA AAGAGTTCTC CGCGCAATGC TTCAGCATTA CAAATGAATG TTTGGAAAAT CTAGA(SEQID NO:4)
hr4右：AACTGGCTTT ACGAGTAGAA TTCTACTTGT AAAACACAAT CAAGAAATGATGTCATTTTT GTACGTGATT ATAAACATGT TTAAACATGG TACATTGAAC TTAATTTTTG CAAGTTGATAAACTAGATTA ATGTATGACT CATTTGTTTG TGCAAGTTGA TAAACGTGAT TAATATATGA CTCATATGTTTGTGCAAAAA TGGTGTCATC GTACAAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTA CTTGTAAAAC ACAATCGAGGGATGATGTCA TTTGTAGAAT GATGTCATTT GTTTTTTCAA AACCGAACTC GCTTTACGAG TAGAATTCTACTTGTAAAAC ACAATCGAGG GATGATGTCA TTTGTAGAAT GATGTCATCG TACAAACTCG CTTTACGAGTAGAATTCTAG TAAAACAC(SEQ ID NO:5)
hr5：TTGAAAATTT ATTGCCTAAT ATTATTTTTG TCAGTTCGTT GTCATTTATT AATTTGGATGATGTCCATTT GTTTTTAAAA TTGAACTGGC TTTACGAGTA GAATTCTACG CGTAAAACAC AATCAAGTATGAGTCATAAG CTGATGTCAT GTTTTGCACA CGGCTCATAA CCGAACTGGC TTTACGAGTA GAATTCTACTTGTAACGCAC GATCGAGTGG ATGATGGTCA TTTGTTTTTC AAATCGAGAT GATGTCATGT TTTGCACACGGGCTCATAAA CTGCTTTACG AGTAGAATTC TACGTGTAAC GCACGATCGA TTGATGAGTC ATTTGTTTTGCAATATGATA TCATACAATA TGACTCATTT GTTTTTCAAA ACCGAACTTG ATTTACGGGT AGAATTCTACTCGTAAAGCA CAATCAAAAA GATGATGTCA TTTGTTTTTC AAAACTGAAC TCTCGGCTTT ACGAGTAGAATTCTACGTGT AAAACACAAT CAAGAAATGA TGTCATTTGT TATAAAAATA AAAGCTGATG TCATGTTTTGCACATGGCTC ATAACTAAAC TCGCTTTACG GGTAGAATTC TACGCGTAAA ACATGATTGA TAATTAAATAATTCATTTGC AAAGCTATAC GTTAAATCAA ACGGACGTTA TGGAATTGTA TAATATTAAA TATGCAATTGATCCAACAAA TAAAATTATA ATAGAGCAAG TCGAC(SEQ ID NO:6)
hr1-hr4序列来自Guarino,L.A.等,J.Virol.60,224-229,1986。hr5序列来自Guarino,L.A.和Summers,M.D.,J.Virol.60,214-223,1986。hr2的其他序列报道于Aslanidi,G.等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106,5059-5064,2009和Ayres,M.D.等,Virology 202,586-605,1994。
此外，已经报道了昆虫病毒中hr之间的序列多样性。与AcMNPV hr具有低至64％同一性的序列已被认为是来自家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒的hr序列(Majima,K.等,J.Virol.67,7513-7521,1993)。
据报道，杆状病毒hr可以通过AAV2顺式作用Rep-结合元件(RBE)起作用，以增强携带AAV Rep和Cap基因的昆虫细胞系中的AAV产生(Aslanidi,G.等,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 106,5059-5064,2009)。该研究在瞬时转染测定中测试了AAV rep基因的表达，并且报道了用携带rep上游的hr2和RBE的构建体转染后转录提高。研究人员提出了一种前馈环，其中AAV rep和cap基因的转录由反式作用杆状病毒表达载体编码的即刻早期反式调节因子1(IE-1)诱导。在他们的模型中，一种产物(Rep蛋白)与RBE相互作用以诱导拯救/扩增并且介导更多的转录。
还报道了杆状病毒hr序列在连续级联昆虫细胞生物反应器中稳定重组杆状病毒(Pijlman,G.P.等,Biotechnol.Bioeng.87,743-753,2004)。然而，还没有关于在杆状病毒系统中增强AAV病毒生产力的hr序列的报道。
发明内容
本发明人开发了用于增强体外昆虫细胞中基于杆状病毒的系统中的腺相关病毒(AAV)产生的组合物和方法。所述组合物和方法使用不具有AAV Rep结合元件(RBE)但包含杆状病毒同源区(hr)的载体。在各种构造中，携带包含AAV基因组的杆状病毒基因组的昆虫细胞系的稳定性可以在多次传代中维持。
在各种构造中，与不包含hr的载体相比，包含本教义的载体的昆虫细胞中的AAV产生可以增强。此外，包含本教义的载体的昆虫细胞系即使在重复传代后也可以稳定地维持高滴度的AAV产生。
在各种实施方案中，本教义包括载体。在各种构造中，载体可以是杆状病毒或质粒，诸如，例如但不限于杆状病毒质粒穿梭载体(bacmid shuttle vector)(Luckow,V.等,J.Virol.67,4566-4579,1993)。在各种构造中，载体可以包含AAV Cap表达盒、AAV Rep表达盒和杆状病毒同源区(hr)。在各种构造中，hr可以位于距离AAV表达盒的起始密码子高达约4kb处。在各种构造中，hr可以是插入物。在各种构造中，hr可以位于距离AAV表达盒的起始密码子高达约0.5kb、约1kb、约1.5kb、约2kb、约2.5kb、约3kb、约3.5kb、约4kb或约4.5kb处。在各种构造中，插入的hr区可以位于距离Rep表达盒的起始密码子高达约4kb处。在各种构造中，插入的hr区可以位于距离Cap表达盒的起始密码子高达约4kb处。在各种构造中，载体可以包含来自病毒诸如杆状病毒的序列，诸如但不限于苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV)。在一些构造中，载体可以是先前描述的修饰成包含hr的载体(Chen,H.,Mol.Ther.16,924-930,2008；Chen,H.,Molecular Therapy–Nucleic Acids 1,e57,2012；Chen的美国专利8,945,918)。
在各种构造中，AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒可以如先前所述(Chen,H.,Mol.Ther.16,924-930,2008；Chen,H.,Molecular Therapy–Nucleic Acids 1,e57,2012；Chen的美国专利8,945,918)，并且hr可以是来自杆状病毒诸如AcMNPV的hr1、hr2、hr3、hr4或hr5。在一些构造中，hr可以是AcMNPV hr2。在一些构造中，hr可以是与AcMNPV hr享有序列同一性的hr，并且可以是例如但不限于来自AcMNPV的hr、来自另一种昆虫病毒的hr，或与AcMNPV hr诸如hr2享有至少64％序列同一性、至少65％序列同一性、至少70％序列同一性、至少75％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或更高序列同一性的人工hr序列。
在各种构造中，本教义的载体可以排除Rep结合元件(RBE)，并且可以使用包含hr但不包含RBE的载体在昆虫细胞中产生AAV。
在各种构造中，本教义的载体可以按5'至3'的顺序包含Cap表达盒、Rep表达盒和杆状病毒同源区。
在各种构造中，本教义的载体可以按5'至3'的顺序包含Rep表达盒、Cap表达盒和杆状病毒同源区。
在各种构造中，本教义的载体可以按5'至3'的顺序包含Cap表达盒、杆状病毒同源区和Rep表达盒。
在各种构造中，本教义的载体可以按5'至3'的顺序包含Rep表达盒、杆状病毒同源区和Cap表达盒。
在各种构造中，本教义的载体可以按5'至3'序列包含杆状病毒同源区、Cap表达盒和Rep表达盒。
在各种构造中，本教义的载体可以按5'至3'序列包含杆状病毒同源区、Rep表达盒和Cap表达盒。
在各种构造中，hr区可以位于Rep表达盒与Cap表达盒之间。在各种构造中，Rep表达盒和Cap表达盒可以是处于头对头(5'至5')取向、尾对尾(3'至3')取向或头对尾(5'到3')取向。
在各种构造中，本教义包括昆虫细胞系，诸如，例如但不限于包含本文所述的载体的Sf9细胞、Tni Pro细胞或E4a细胞。在各种构造中，本教义包括昆虫细胞系，诸如但不限于Sf9细胞。
在一些实施方案中，本教义包括体外生长杆状病毒的方法。在各种构造中，这些方法包括提供昆虫细胞的培养物，用包含AAV Cap表达盒、AAV Rep表达盒和杆状病毒同源区(hr)的载体感染或转染昆虫细胞，并且孵育细胞。在各种构造中，hr可以是距离AAV表达盒高达约4kb。在各种构造中，hr可以是距离Rep表达盒高达约4kb。在各种构造中，hr可以是距离Cap表达盒高达约4kb。在各个方面，可以重复传代所得的细胞系。
在一些实施方案中，本教义包括体外生长AAV的方法。在这些方法中，包含AAV Cap盒、AAV Rep盒和hr的杆状病毒可以用于感染或转染(或共感染或共转染)昆虫细胞，诸如，例如但不限于Sf9细胞、Tni Pro细胞或E4a细胞。然后可以体外生长感染的(或转染的)细胞，从而形成产生杆状病毒和AAV的细胞系。这样的细胞系可以重复传代多代，几乎没有或没有AAV产生的损失，例如至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代、或至少10代。在各种构造中，来自包含本教义的包含AAV Cap表达盒、AAV Rep表达盒和hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生可以例如在7代后，比包含AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒但7代后没有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生高至少2倍、高至少3倍或高至少4倍。在各种构造中，来自包含本教义的包含AAV Cap表达盒、AAV Rep表达盒和hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生可以例如在8代后，比包含AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒但8代后没有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生高至少2倍、高至少3倍或高至少4倍。在各种构造中，来自包含本教义的包含AAV Cap表达盒、AAV Rep表达盒和hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生可以例如在9代后，比包含AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒但9代后没有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生高至少2倍、高至少3倍或高至少4倍。在各种构造中，来自包含本教义的包含AAVCap表达盒、AAV Rep表达盒和hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生可以例如在10代后，比包含AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒但10代后没有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产生高至少2倍、高至少3倍或高至少4倍。
在一些实施方案中，本教义包括体外生长杆状病毒的方法。在这些方法中，包含AAV Cap盒和AAV Rep盒的杆状病毒载体可以用于体外感染或转染(或共感染或共转染)昆虫细胞，诸如，例如但不限于来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞，或来自另一种昆虫的体外细胞，诸如，例如但不限于来自粉纹夜蛾的Tni Pro细胞或来自Estimaacrea的E4a细胞。在各种构造中，细胞可以用AAV的末端反向重复序列(ITR)诸如但不限于AAV5的ITR之间的转基因共感染。在一些构造中，转基因可以是报告基因，诸如，例如但不限于编码绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的基因。感染的(或转染的)细胞可以在体外生长，从而形成产生杆状病毒的细胞系。这样的细胞系可以重复传代。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少20％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少30％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少40％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少50％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少60％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少70％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少80％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P7代时总杆状病毒滴度的至少90％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒的滴度可以是在第P7代时总杆状病毒滴度的100％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以是第P10代时总杆状病毒滴度的至少20％。在各种构造中，当载体包含hr时，包含AAV基因诸如Cap基因或Rep基因的杆状病毒滴度可以大于第P10时总杆状病毒滴度的5％。
在一些实施方案中，本教义包括体外生长AAV的方法。在这些方法中，包含本教义的包含hr的载体的昆虫细胞可以体外生长并且重复传代。在一些构造中，来自携带没有hr的对照载体的昆虫细胞系的第7代(P7)时的AAV的相对产率可以小于来自携带具有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产率的60％。在一些构造中，来自携带没有hr的对照载体的昆虫细胞系的第7代(P7)时的AAV的相对产率可以小于来自携带具有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产率的50％。在一些构造中，来自携带没有hr的对照载体的昆虫细胞系的第7代(P7)时的AAV的相对产率可以小于来自携带具有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产率的40％。在一些构造中，来自携带没有hr的对照载体的昆虫细胞系的第7代(P7)时的AAV的相对产率可以小于来自携带具有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产率的30％。在一些构造中，来自携带没有hr的对照载体的昆虫细胞系的第7代(P7)时的AAV的相对产率可以小于来自携带具有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产率的20％。在一些构造中，来自携带没有hr的对照载体的昆虫细胞系的第10代(P10)时的AAV的相对产率可以小于来自携带具有hr的载体的昆虫细胞系的AAV产率的20％。
本教义包括但不限于以下方面。
1.一种杆状病毒载体，所述杆状病毒载体包含：
AAV Cap表达盒；AAV Rep表达盒；以及杆状病毒同源区(hr)，所述杆状病毒同源区位于距离AAV表达盒的起始密码子高达约4kb处。
2.根据方面1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含Cap表达盒、Rep表达盒和杆状病毒同源区(hr)。
3.根据方面1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含Rep表达盒、Cap表达盒和杆状病毒同源区(hr)。
4.根据方面1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含Cap表达盒、杆状病毒同源区(hr)和Rep表达盒。
5.根据方面1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含Rep表达盒、杆状病毒同源区(hr)和Cap表达盒。
6.根据方面1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含杆状病毒同源区(hr)、Cap表达盒和Rep表达盒。
7.根据方面1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含杆状病毒同源区(hr)、Rep表达盒和Cap表达盒。
8.根据方面1所述的载体，其中hr区位于Rep表达盒与Cap表达盒之间，并且其中Rep表达盒和Cap表达盒处于头对头(5'至5')取向。
9.根据方面1至8中任一项所述的载体，其中杆状病毒同源区是hr2序列。
10.根据方面1至9中任一项所述的载体，其中载体不包含Rep结合元件(RBE)。
11.一种昆虫细胞系，所述昆虫细胞系包括包含根据方面1至10中任一项所述的载体的细胞。
12.根据方面11所述的昆虫细胞系，其中细胞还包含第二载体，所述第二载体包含侧接有AAV ITR的转基因。
13.一种体外生长杆状病毒的方法，所述方法包括：提供根据方面11或方面12所述的昆虫细胞培养物，并且孵育细胞。
14.根据方面13所述的方法，其中孵育细胞包括使细胞传代，并且其中与包含含有AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒但没有杆状病毒hr的杆状病毒载体的对照昆虫细胞系相比，第7代时的AAV产率高至少2倍。
15.根据方面13所述的方法，其中包含AAV Cap表达盒的杆状病毒在第7代时的滴度大于总杆状病毒滴度的21.5％(通过对于总BV的gp64和对于AAV的Cap的qPCR所测量)。
16.一种体外生长AAV的方法，所述方法包括：提供昆虫细胞培养物，用根据方面1至10中任一项所述的杆状病毒载体感染或转染昆虫细胞，并且孵育细胞。
17.根据方面16所述的方法，其中来自昆虫细胞的AAV的P7时的产率比来自包含不具有hr的杆状病毒载体的昆虫细胞的AAV的P7时的产率高至少50％。
18.根据方面16所述的方法，其中来自包含杆状病毒hr的细胞的AAV的P7时的产率比来自包含不具有hr的杆状病毒载体的细胞的AAV产率高至少20％。
19.根据方面16所述的方法，其中杆状病毒载体不包含Rep结合元件(RBE)。
20.一种体外产生AAV的方法，所述方法包括生长昆虫细胞培养物，所述昆虫细胞培养物包含如方面1至10中任一项所述的载体和包含侧接有AAV ITR的转基因的载体。
21.一种用于在体外在昆虫细胞中产生AAV的不具有Rep结合元件(RBE)的杆状病毒载体，所述杆状病毒载体包含：AAV Cap表达盒；AAV Rep表达盒；以及杆状病毒同源区(hr)，其位于AAV表达盒的起始密码子的高达约4kb处。
附图简述
图1示出了本教义的杆状病毒穿梭质粒，其包含位于AAV8衣壳蛋白基因与AAV2rep基因之间的hr2序列。
图2示出了本教义的杆状病毒穿梭质粒，其包含AAV8Cap基因和位于AAV2rep基因与庆大霉素抗性(GmR)基因之间的hr2序列。
图3示出了本教义的杆状病毒穿梭质粒，其包含AAV9Cap基因和位于AAV2rep基因与庆大霉素抗性(GmR)基因之间的hr2序列。
图4示出了本教义的杆状病毒穿梭质粒，其包含AAV6Cap基因和位于AAV2rep基因与庆大霉素抗性(GmR)基因之间的hr2序列。
图5示出了本教义的杆状病毒穿梭质粒，其包含AAV1Cap基因和位于AAV2rep基因与庆大霉素抗性(GmR)基因之间的hr2序列。
图6示出了本教义的杆状病毒穿梭质粒，其包含AAV5Cap基因和位于AAV2rep基因与庆大霉素抗性(GmR)基因之间的hr2序列。
图7示出了在杆状病毒穿梭质粒V372-pFB-CMV-GFP-SV40pA-全ITR中侧接有两个ITR的GFP表达盒。
图8示出了具有或不具有hr2序列的重组杆状病毒(rBV)的比较AAV产率。
图9A-H示出了从第3代至第10代的具有或不具有hr2序列的比较重组杆状病毒(rBV)滴度。
图10A-E示出了从第3代至第10代，或在AAV株之间的第10代时的具有或不具有hr2序列的重组杆状病毒(rBV)之间的比较AAV产率。
图11A-B示出了用具有和不具有hr2序列的重组杆状病毒感染的细胞中AAV衣壳蛋白的蛋白质印迹表达。
图12A-B示出了用具有和不具有hr2序列的重组杆状病毒感染的细胞中AAV rep蛋白的蛋白质印迹表达。
具体实施方式
本文所述的方法和组合物利用技术人员熟知的实验室技术，并且可以在实验室手册中找到，诸如Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001；Spector,D.L.等,Cells:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1998；Nagy,A.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual(第三版),Cold Spring Harbor,NY,2003以及Harlow,E.,Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1999。除非上下文另外指示，否则如在本说明和任何所附权利要求中所使用，单数形式“一个/一种”和“所述”还意图包括复数形式。
以下材料和方法也用于本教义的各个方面。
昆虫细胞培养物
在28℃下，用补充有100个单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素(Mediatech公司)的ESF921培养基(Expression Systems公司)，在康宁储藏瓶中培养草地夜蛾Sf9细胞、粉纹夜蛾细胞和Estima acrea细胞。一旦细胞密度达到8x 106个细胞/毫升并且维持，细胞以1:4分裂。
质粒构建和重组杆状病毒产生
从杆状病毒基因组PCR扩增hr2序列并且克隆到质粒V053-pFB D-inRepOpt-inCap8中以产生V059-pFBD-inRepOpt-hr2-inCap8。为了包含kozak序列，用BstZ17I和AgeI切割质粒V059以除去BstZ17I-AgeI片段，并且用来自V150-pFB-inCap8-inRep-kozak的VP1起始密码子上游的kozak序列替换BstZ17I-AgeI片段以产生V277-pFB-inCa p8-hr2-inRep-kozak，其中hr2位于Rep表达盒与Cap表达盒之间。为了将hr2序列插入Rep表达盒的聚A序列之后的另一个位置，用来自V277的引物3205F(5’-GCTTTACGAGTAGAATTCTACGTGT-3’SE Q ID NO:7)和3206R(5’-GGCCTACGTAGTTTTACACGTAGAATT CTACTCGT-3’SEQ ID NO:8)PCR扩增hr2序列。用来自V150的引物3065F(5’-ATTTGACTTGGTCAGGGCCG-3’SEQ ID NO:9)和3204R(5’-GAATTCTACTCGTAAAGCCCAGTTGACATAAGCCT GTTCG-3’SEQ ID NO:10)扩增pc启动子序列。这些hr2和pc启动子PCR片段通过用引物3065F和3206R的第二次PCR反应来连接在一起。将连接的PCR片段用BsrGI和SnaBI消化并且连接到V150、V212、V195、V188和V146的BsrGI和SnaBI位点以分别产生V288-pFB-inCap8-inRep-hr2、V289-pFB-inCap9-inRep-hr2、V290-pFB-in Cap6-inRep-hr2、V291-pFB-inCap1-inRep-hr2和V295-pFB-inCap5-inRep-hr2。具有hr序列插入的质粒的实例示于图1–6中。
通过PCR扩增GFP片段来构建质粒pFB-CMV-GFP，然后将其克隆到V032-pFB-CMV-SV40pA的多克隆位点(图7)。
根据制造商的方案(Invitrogen)将质粒用于产生杆状病毒质粒。简而言之，将质粒稀释至2ng/ul的浓度，并且使用2ul的质粒DNA来转化DH10Bac感受态细胞。孵育2天后，挑取白色菌落并且制备小量制备的杆状病毒质粒DNA。将小量制备的杆状病毒质粒DNA用于转染Sf9细胞以产生重组杆状病毒。
重组杆状病毒的噬斑纯化和传代
将产生的重组杆状病毒噬斑纯化以便获得同源克隆。简而言之，将Sf9细胞铺放在6孔板上，其中细胞密度为2ml ESF921培养基中的1.5e+6个细胞/孔，并且在28℃下孵育30min。将杆状病毒各自稀释至1ml体积中的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7。在孵育结束时，从孔中除去培养基并且加入250μl的每种稀释物以在28℃下感染Sf9细胞1小时。在孵育结束时，向孔中加入3ml的1％琼脂糖覆盖层(冷却至42℃)。当琼脂糖固化时，向每个孔中加入2ml的ESF921培养基，并且将板在28℃下孵育5至7天。挑取形成良好的噬斑并且用于感染昆虫细胞进行传代。
为了使噬斑纯化的重组杆状病毒传代，将昆虫细胞用约1moi的病毒在28℃感染3天，并且收获上清液。收获的病毒再次用于感染新鲜的昆虫细胞，依此类推直到第10代。
重组杆状病毒和AAV载体的实时定量PCR(qPCR)定量
为了确定重组杆状病毒和AAV的滴度，使用qPCR方法。根据经验确定，一个噬斑形成单位(pfu)包含约20个病毒的基因组拷贝。简而言之，将收获的病毒在qPCR稀释缓冲液中稀释，并且加热至95℃持续30min以破坏病毒颗粒。然后在CHROMO4TM系统(Bio-RadLaboratories公司,Hercules,CA)中连同已知标准物来测定处理过的病毒样品。将Ct值转换为pfu并且用于指导杆状病毒传代和AAV产生。
AAV载体产生和定量
使用重组杆状病毒来感染昆虫细胞以产生AAV载体。简而言之，10moi的含有具有或不具有hr2序列的Rep基因和Cap基因的重组杆状病毒与5moi的含有侧接有AAV ITR的GFP标记基因的重组杆状病毒在28℃下共感染3天。通过在3000rpm下离心10min收集细胞沉淀。通过超声，将细胞沉淀裂解在SF9裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.8、50mM NaCl、2mMMgCl2、1％十二烷基肌氨酸钠水溶液、1％Triton X-100和140个单位/毫升全能核酸酶)中。通过在8000rpm下离心20min除去细胞碎片。澄清的裂解物用于如下定量AAV生产力：用qPCR稀释缓冲液稀释裂解物，并且通过与DNA酶I酶在37℃下孵育1小时来破坏污染的DNA。通过在100mM EDTA存在下在95℃下加热30分钟，使DNA酶I酶失活。将处理过的AAV样品进一步稀释并且在Chromo4qPCR机器中测定。将Ct值转换为AAV载体基因组拷贝。
蛋白质印迹分析
使用含有rep基因和cap基因的重组杆状病毒来感染Sf9细胞3天，并且通过在3,000rpm下离心10min收获细胞沉淀。首先将具有约2x 106个细胞的细胞沉淀重悬于300ul的PBS缓冲液中，然后用100ul的4×LDS样品缓冲液涡旋以裂解细胞。将裂解物在95℃下加热5min，然后超声20秒以剪切基因组DNA。在短暂离心后，然后将裂解物上样到10％SDS-凝胶上以分离蛋白质。然后将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂乳封闭后，用针对rep蛋白或cap蛋白的特异性抗体探测膜。与针对第一抗体的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体用于通过彩色基质反应检测rep蛋白或cap蛋白。
实施例
本教义包括实施例中提供的描述，所述实施例不旨在限制任何权利要求或方面的范围。除非以过去时特别呈现，否则一个实施例可以是预言或实际的实施例。提供以下非限制性实施例以进一步说明本教义。根据本公开，本领域的技术人员应了解可在不脱离本教义的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例1
该实施例示出了本教义的穿梭载体。
在该质粒(图1)中，hr2序列位于AAV8衣壳蛋白基因盒与AAV2rep基因盒之间。载体包含处于头对头取向的Cap基因和Rep基因。该穿梭质粒用于产生重组杆状病毒(rBV)，所述重组杆状病毒进而用于在昆虫细胞中产生AAV8。
实施例2
该实施例示出了本教义的穿梭载体。
在该质粒(图2)中，hr2序列位于AAV2rep基因盒与庆大霉素抗性(GmR)之间。载体还包含AAV8衣壳蛋白基因盒。Cap基因和Rep基因处于头对尾取向。该质粒用于产生重组杆状病毒(rBV)，所述重组杆状病毒进而用于在昆虫细胞中产生AAV8。
实施例3
该实施例示出了本教义的穿梭载体。
在该质粒(图3)中，hr2序列位于AAV2rep基因盒与庆大霉素抗性(GmR)之间。载体还包含AAV9衣壳蛋白基因盒。Cap基因和Rep基因处于头对尾取向。该质粒用于产生重组杆状病毒(rBV)，所述重组杆状病毒进而用于在昆虫细胞中产生AAV9。
实施例4
该实施例示出了本教义的穿梭载体。
在该质粒(图4)中，hr2序列位于AAV2rep基因盒与庆大霉素抗性(GmR)之间。载体还包含AAV6衣壳蛋白基因盒。Cap基因和Rep基因处于头对尾取向。该质粒用于产生重组杆状病毒(rBV)，所述重组杆状病毒进而用于在昆虫细胞中产生AAV6。
实施例5
该实施例示出了本教义的穿梭载体。
在该质粒(图5)中，hr2序列位于AAV2rep基因盒与庆大霉素抗性(GmR)之间。载体还包含AAV1衣壳蛋白基因盒。Cap基因和Rep基因处于头对尾取向。该质粒用于产生重组杆状病毒(rBV)，所述重组杆状病毒进而用于在昆虫细胞中产生AAV1。
实施例6
该实施例示出了本教义的穿梭载体。
在该质粒(图6)中，hr2序列位于AAV2rep基因盒与庆大霉素抗性(GmR)之间。载体还包含AAV5衣壳蛋白基因盒。Cap基因和Rep基因处于头对尾取向。该质粒用于产生重组杆状病毒(rBV)，所述重组杆状病毒进而用于在昆虫细胞中产生AAV5。
实施例7
该实施例示出了hr序列增强AAV的产率。
在这些实验中，将hr2序列克隆到质粒V277(图1)中的Rep表达盒与Cap表达盒之间，或克隆到质粒V289(图3)和V295(图6)中的Rep表达盒的poly A序列之后，并且制备重组杆状病毒。这些重组杆状病毒用于与携带GFP基因的重组杆状病毒共感染Sf9细胞以用于AAV产生。结果示于图8中。数据表明hr2序列增强AAV生产力，而与hr2序列的位置和AAV血清型无关。与缺乏hr的对照相比，AAV生产力的增加范围为2至4倍。
实施例8
该实施例示出了hr序列增强含有AAV rep基因和cap基因的重组杆状病毒的稳定性。
在这些实验中，为了进一步分析具有或不具有hr2序列的重组杆状病毒的稳定性，使用多次重组杆状病毒的噬斑纯化和传代。使用对应于gp64基因(存在于本教义的所有重组杆状病毒中)的一对qPCR引物(gp64F(5’-CCCTCTGTGTACTTGGCTCTAACG-3’SEQ ID NO:11)和gp64R(5’-CGGTGAAACGCAAAGTCGAGCACCG-3’SEQ ID NO:12))来确定总杆状病毒滴度。对于包含Rep表达盒和Cap表达盒的杆状病毒，使用对应于Rep序列的一对qPCR引物(Rep2F(5’-ATTCATGCTCCACCTCAACC-3’SEQ ID NO:13)和Rep2R(5’-GCCGTCTGGATCATGACTTT-3’SEQID NO:14))来确定这些杆状病毒的滴度。选择携带Cap1-Rep(图5)、Cap6-Rep(图4)、Cap9-Rep(图3)和Cap8-Rep(图2)的重组杆状病毒用于这些实验。对于每次传代，用gp64引物确定总杆状病毒pfu，并且设定为100％。使用设定为总杆状病毒百分比的Rep引物确定每次传代的特异性杆状病毒。对于具有或不具有hr2序列的重组杆状病毒(rBV)滴度的结果示于图9A-H中。图9A示出了在携带不具有hr2序列的表达AAV1衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV-inCap1-inRep(Cap1V188)的细胞中用gp64引物和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9B示出了在携带rBV-inCap1-inRep-hr2(具有hr2序列的表达AAV1衣壳蛋白和AAV2rep基因的Cap1V291)的细胞中用gp64引物和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9C示出了在携带不具有hr2序列的表达AAV6衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV的细胞中用gp64引物和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9D示出了在携带具有hr2序列的表达AAV6衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV-inCap6-inRep(Cap6V195)的细胞中用gp64引物和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9E示出了在携带不具有hr2序列的表达AAV9衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV-inCap9-inRep(Cap9V212)的细胞中用gp64引物和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9F示出了在携带具有hr2序列的表达AAV9衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV-inCap9-inRep-hr2(Cap9V289)的细胞中用gp64和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9G示出了在携带不具有hr2序列的表达AAV8衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV-Cap8-inRep(Cap8V150)的细胞中用gp64和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。图9H示出了在携带具有hr2序列的表达AAV8衣壳蛋白和AAV2rep基因的rBV-inCap8-inRep-hr2(Cap8V288)的细胞中用gp64和rep2qPCR引物确定的rBV滴度。在Sf9细胞(图9A-D)、Tni pro细胞(图9E-F)和E4a细胞(图9G-H)中产生和传代rBV。数据表明，当杆状病毒不含有hr2序列时，特异性杆状病毒滴度随着传代次数的增加而降低(图9A、图9C、图9E和图9G)，而当杆状病毒在rep表达盒附近含有hr2序列时，特异性杆状病毒滴度降低较少(图9B、图9D、图9F和图9H)。无论SF9(图9A-9D)、Tni Pro(图9E-F)或E4a细胞(图9G-H)是否是宿主细胞，这些变化都成立。通过传代P10时，当载体不含hr时，具有AAV Cap1或AAV Cap6的杆状病毒低于总rBV滴度的10％(图9A、图9C、图9E和图9G)，但是当载体含有hr2时，具有AAV Cap1或AAV Cap 6的杆状病毒是总rBV滴度的约20％(图9B、图9D、图9F、图9H)。
实施例9
该实施例示出了hr序列增强含有AAV rep基因和cap基因的重组杆状病毒(rBV)的AAV生产力。
在这些实验中，从第3代至第10代的具有或不具有hr序列的rBV用于与含有GFP的rBV共感染Sf9、Tni Pro和E4a细胞系以产生AAV载体。共感染三天后，收获细胞沉淀并且确定AAV产生产率。如图10A-D所示，当杆状病毒载体包含hr2序列时，Sf9细胞中的AAV1(图10A)、Sf9细胞中的AAV6(图10B)、Tni pro细胞中的AAV9(图10C)和E4a细胞中的AAV8(图10D)的产生产率在第3-10代中维持。相反，在rBV中不存在hr2的情况下，AAV1、AAV6、AAV9和AAV8的产生产率在第3-10代中急剧下降。为了进一步证实这一观察结果，用具有hr2(V290、V288和V289)或不具有hr2(V195、V150和V212)序列的第10代rBV共感染Sf9细胞以产生AAV6(V195和V290)、AAV8(V150和V288)和AAV9(V212和V289)载体。结果显示，来自用含有hr2的rBV感染的Sf9细胞的AAV产生产率显著高于用不具有hr2序列的rBV感染的那些(图10E)(将hr+rBV V290、V288和V289与hr-rBV V195、V150和V212比较)。
实施例10
该实施例示出了通过多次传代，AAV rep和cap表达直接与rBV稳定性相关。
在这些实验中，进行蛋白质印迹以确定rep蛋白和cap蛋白的表达水平。图11A-B分别示出了用从第3代至第10代的不具有hr2序列的重组杆状病毒rBV-inCap6-inRep(V195)(图11A)和具有hr2序列的重组杆状病毒rBV-inCap6-inRep-hr2(V290)(图11B)感染Sf9细胞后，AAV6衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的表达。M，蛋白质大小标记；泳道1至8，由用第3代至第10代的rBV感染的Sf9细胞制备的细胞裂解物。
图12A-B示出了用不具有hr2序列的重组杆状病毒rBV-inCap8-inRep(V150)(图12A)和具有hr2序列的重组杆状病毒rBV-inCap8-inRep-hr2(V288)(图12B)感染Sf9细胞后，AAV2rep蛋白REP78和REP52的表达。M，蛋白质大小标记；泳道1-5，由用第6代至第10代的rBV感染的Sf9细胞制备的细胞裂解物。图11和图12中的结果表明，与缺乏hr序列的rBV相比，具有hr序列的rBV在多次传代(包括后续传代)中表达更高水平的rep蛋白和cap蛋白。
所有引用的参考文献各自均以引用的方式整体并入。申请人保留质疑任何参考文献作者提出的任何结论的权利。

Claims (18)

1.一种用于产生腺相关病毒(AAV)的杆状病毒载体，其包含：
携带人工内含子的AAV Cap表达盒；
携带人工内含子的AAV Rep表达盒；以及
杆状病毒同源区2(hr2)，其位于距离AAV表达盒的起始密码子0.5-4.5kb处；
其中所述载体不包含Rep结合元件(RBE)。
2.根据权利要求1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含所述Cap表达盒、所述Rep表达盒和所述杆状病毒同源区2(hr2)。
3.根据权利要求1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含所述Rep表达盒、所述Cap表达盒和所述杆状病毒同源区2 (hr2)。
4.根据权利要求1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含所述Cap表达盒、所述杆状病毒同源区2 (hr2)和所述Rep表达盒。
5.根据权利要求1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含所述Rep表达盒、所述杆状病毒同源区2 (hr2)和所述Cap表达盒。
6.根据权利要求1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含所述杆状病毒同源区2(hr2)、所述Cap表达盒和所述Rep表达盒。
7.根据权利要求1所述的载体，其按5'至3'的顺序包含所述杆状病毒同源区2 (hr2)、所述 Rep表达盒和所述Cap表达盒。
8.根据权利要求1所述的载体，其中所述hr2区位于所述Rep表达盒与所述Cap表达盒之间，并且其中所述Rep表达盒和所述Cap表达盒处于头对头(5'至5')取向。
9.一种昆虫细胞系，其包括包含根据权利要求1-8中任一项所述的载体的细胞。
10.根据权利要求9所述的昆虫细胞系，其中所述细胞还包含第二载体，所述第二载体包含侧接有AAV ITR的转基因。
11.一种体外生长杆状病毒的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求9或权利要求10所述的昆虫细胞系的培养物；以及
孵育所述细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述孵育所述细胞包括使所述细胞传代，并且其中与包含含有AAV Cap表达盒和AAV Rep表达盒但没有杆状病毒hr2的杆状病毒载体的对照昆虫细胞系相比，第7代时的AAV产生产率高至少2倍。
13.根据权利要求11所述的方法，其中包含所述AAV Cap表达盒的杆状病毒在第7代时的滴度大于总杆状病毒滴度的21.5％。
14.一种体外生长AAV的方法，所述方法包括：提供昆虫细胞培养物；
用根据权利要求1-8中任一项所述的杆状病毒载体感染或转染所述昆虫细胞；以及
孵育所述细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中来自所述昆虫细胞的AAV的P7时的所述产率比来自包含不具有所述hr2的杆状病毒载体的昆虫细胞的AAV的P7时的所述产率高至少50％。
16.根据权利要求14所述的方法，其中来自包含所述杆状病毒hr2的细胞的AAV的P7时的所述产率比来自包含不具有所述hr2的杆状病毒载体的细胞的AAV的所述产率高至少20％。
17. 一种体外产生AAV的方法，所述方法包括生长昆虫细胞培养物，所述昆虫细胞培养物包含如权利要求1-8中任一项所述的载体和包含侧接有AAV ITR的转基因的载体。
18.一种用于在体外在昆虫细胞中产生AAV的不具有Rep结合元件(RBE)的杆状病毒载体，所述杆状病毒载体包含：
携带人工内含子的AAV Cap表达盒；
携带人工内含子的AAV Rep表达盒；以及
杆状病毒同源区(hr2)，其位于距离AAV表达盒的起始密码子0.5-4.5kb处。
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