CN117070518A - 一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒。所述表达盒，包括：从5’端至3’端可操作连接的：人工构建序列；缺少首个翻译起始密码子的重叠开放阅读框；所述人工构建序列包含相互独立的第一启动子和第二启动子；所述第一启动子与第二启动子之间不含有所述首个翻译起始密码子的完整序列。本发明还公开了包含该表达盒的核酸分子、重组杆状病毒载体以及包括该载体的昆虫细胞。本发明通过在单个表达盒中设置两个启动子，分别用来驱动重叠阅读框的蛋白的表达以及调节不同蛋白的相对表达时间和表达强度，不仅提高了昆虫细胞中rAAV载体生产的效率，还提高了生产的rAAV的质量。

Description

一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及应用。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV的基因组是一条单链线性DNA，约4700bp，包括上下游两个开放阅读框(ORF)：Rep和Cap，位于分别由145个核苷酸组成的2个T形反向末端重复序列(ITR)之间，如图1所示。ITR的作用是充当病毒复制起点和包装信号，Rep基因参与病毒复制和整合，编码病毒复制蛋白，Cap基因负责编码病毒三个衣壳蛋白。重组腺相关病毒(rAAV)由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。随着第一种重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因治疗药物的批准，对大规模AAV载体制造技术的需求不断增加(Yla-Herttuala S.,2012,Mol Ther,20:1831-1832)。
目前，生产rAAV的体系主要有两大类：一种是利用哺乳动物细胞(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞等)的常规生产体系；另一种是利用昆虫细胞的生产体系。其中，利用昆虫细胞的生产体系利用携带rAAV载体基因组、Rep蛋白和Cap蛋白的杆状病毒表达载体(Baculovirus expression vectors,BEVs)感染Sf9昆虫细胞，从而产生rAAV病毒。借助Sf9细胞可以大量表达重组蛋白的特点，该系统使用含有rAAV基因组以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆虫杆状病毒转导Sf9细胞，使rAAV在Sf9细胞中组装，最终达到大规模生产rAAV的目的。
在该生产体系中，启动子起着重要作用。选择的外源基因置于天然启动子的控制下，然后在感染周期中表达，在细胞裂解过程中释放蛋白质。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸(RNA)合成中，启动子可以和决定转录开始的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，其包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。启动子本身并无编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像一面旗帜，其核心部分是非编码区上游的RNA聚合酶结合位点。目前，BEVS中最常用的启动子有多角体pol H(polyhedrin)启动子和p10启动子，此外还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一外源基因在不同启动子控制下，表达水平有很大差异。
为了达到最大表达水平，大多数利用极晚期启动子来驱动外源基因的表达。虽然当需要大量重组蛋白时，这种方法通常是成功的，但在某些情况下，使用表达较早或较弱的替代启动子可能有利于最终蛋白质的质量和产量。在快速表达过程中发生聚集的蛋白质和需要高级翻译后修饰的蛋白质也被证明可以使用早期启动子的持续稳定表达中获得理想的产物。
立即早期和早期启动子在病毒DNA复制之前被激活。立即早期启动子(IE)由宿主细胞RNA聚合酶II转录，也利用宿主的转录因子。立即早期和早期启动子的结构组织与晚期和极晚期杆状病毒启动子有很大不同，而是更类似于其他真核启动子的结构。杆状病毒立即早期启动子最显着的特征是保守的CAGT基序，其作为转录起始位点并在调节下游基因表达中起重要作用。在某些情况下，立即早期启动子包含一个TATA样基序和/或一个起始序列。该区域被宿主RNA聚合酶II识别，并允许在感染后马上转录立即早期病毒基因。IE1启动子是一种立即早期启动子，是最常用于杆状病毒表达的组成型启动子，因为它在所有时间阶段以及未感染的昆虫细胞中都具有活性。39k启动子是一种早期启动子，它被IE1蛋白反式激活。当与IE1蛋白共表达时，39k启动子也可以暂时使用。
晚期启动子由识别保守的(A/G/T)TAAG晚期/极晚期启动子基序的病毒RNA聚合酶转录。转录起始于该基序内的第二个核苷酸，并且它的存在是启动子活性必需的。调查晚期启动子中TAAG基序功能的研究表明，该序列中的突变破坏了启动子转录活性。极晚期启动子转录活性在感染后18～24小时达到峰值，并超过晚期启动子活性。在感染后24h时，极晚期启动子在细胞中的转录水平超过其他所有的启动子。
P10蛋白在感染周期的极晚期高水平表达，被认为在病毒释放所需的包涵体成熟和细胞裂解中发挥作用。Weyer和Possee首次将p10基因ATG上游101个核苷酸定义为p10启动子序列，并建议将其用于外源蛋白的表达。从那时起，p10启动子被广泛应用于BEVS中生产蛋白质，比如花椰菜花叶病毒基因1和人白介素2的生产。p10也可以用来连接其他启动子用于共表达。
在AAV昆虫细胞生产体系中，针对Cap蛋白，Urabe等人将VP1的起始密码子AUG替换为次优起始密码子ACG，构建一个单一的多顺反子mRNA，该多顺反子mRNA不需要剪接即可表达所有三种AAV2的VP蛋白(Urabe等,2002,Hum Gene Ther,13:1935-1943)。然而AAV的血清型众多且与日俱增，Urabe等人的改造方法并不适用于所有血清型，例如Urabe等人使用ACG作为VP1衣壳蛋白起始密码子的杆状病毒系统中产生的AAV5颗粒具有不佳的感染性。在中国专利CN106544325A提供的方法中使用不同的次优起始密码子CTG加强VP1的表达，尽管这种设计提高了AAV5颗粒的感染性，但这种方法在调节VP1/VP2/VP3相对含量方面缺乏灵活性；同时，该方法似乎也缺乏血清型特异性序列调整所必须的灵活性。在中国专利CN101522903A提供的方法中通过将包含有polH启动子序列的人工内含子插入到VP1的开放阅读框中，利用两个启动子分别表达VP1和VP2/VP3，该设计虽然也能实现VP1/VP2/VP3在同一阅读框中表达，但该方法同样不能有效调节VP1/VP2/VP3相对量，且在不同血清型中VP1/VP2/VP3的相对表达量差异较大，导致生产效率较低。
针对Rep蛋白的表达，Urabe等人构建了含有Rep78和Rep52两个独立的表达盒，并插入在同一个杆状病毒载体中。其中，Rep52使用了polH启动子，Rep78则使用了相对polH启动子启动活性较弱的deltaIE1启动子(Urabe等,2002,Hum Gene Ther,13:1935-1943)。然而，立即早期启动子deltaIE1在杆状病毒感染早期活跃，Rep78蛋白在昆虫细胞中早期大量表达可能会对重组杆状病毒的产量产生负面影响(Urabe等,2006，Journal of Virology80.4:1874-1885)。同时，有研究发现，Urabe等人开发的AAV Rep蛋白表达方法存在杆状病毒载体传代不稳定的问题(Kohlbrenner等，2005，Mol.Ther.12：1217-25)。为了解决两个独立Rep表达框固有的传代不稳定性这一问题，中国专利CN 103849629 A公开了一种昆虫细胞中产生AAV的方法，将AAV Rep78蛋白的翻译起始密码子替换成ACG，该密码子被扫描核糖体部分跳过以使翻译起始也可发生在更下游的Rep52蛋白的起始密码子上，该方法虽然能实现在同一阅读框的Rep78和Rep52蛋白的表达，显著地提高了在昆虫细胞中生产rAAV载体的稳定性，但在调节Rep52/Rep78蛋白相对含量方面缺乏灵活性。而Rep52/Rep78蛋白的高化学计量比可能是rAAV高产率的关键因素(Xiao,Xiao等，1998，Journal of Virology72.3(1998):2224-2232.)。在中国专利CN 113897396 A公开的一种在昆虫细胞生产AAV的方法中，发明人通过构建含有内含子调控序列的Rep表达盒实现了在同一阅读框的Rep78和Rep52蛋白的表达，不仅提高了在昆虫细胞中生产rAAV载体的稳定性，而且，通过调整内含子剪接效率灵活调节Rep52/Rep78蛋白相对含量，但是在控制两者的相对表达时间和相对表达强度方面缺乏灵活性。
因此，在昆虫细胞中使用杆状病毒的大规模生产rAAV载体仍然需要进一步提高。许多研究表明，更早的启动子可能更有效地产生一些外源蛋白，特别是那些需要大量翻译后加工和/或分泌的蛋白，因为当最晚的启动子最活跃时，宿主细胞对外源蛋白的加工过程可能受到损害。对于复杂的病毒颗粒，不同蛋白质的需要量可能不同。通过使用在不同的感染阶段具有活性的不同杆状病毒启动子，可以实现对目标蛋白表达时间和表达量的控制(Bruder等，Viruses 2022,14,2670)。但不同启动子之间协同作用的机理尚不明确。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒，其目的在于通过构建含有Rep78/68蛋和Rep52/40蛋白(或VP1和VP2/3蛋白)同一重叠开放阅读框的表达盒，并用不同的启动子对不同蛋白的表达进行协同控制，从而更好地控制Rep78和Rep52蛋白为代表的不同蛋白的相对表达时间和相对强度，利用重叠开放阅读框来表达蛋白，不仅保证了在昆虫细胞中生产rAAV载体的稳定性，而且提高了生产的rAAV的产量和质量。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒，其特征在于，包括：
从5’端至3’端可操作连接的：
人工构建序列；
缺少首个翻译起始密码子的重叠开放阅读框；
所述人工构建序列包含相互独立的第一启动子和第二启动子；所述第一启动子与第二启动子之间不含有所述首个翻译起始密码子的完整序列。
优选地，所述基因为细小病毒Rep基因，所述第一启动子用于驱动Rep78/68蛋白和Rep52/40蛋白的表达；所述第二启动子用于额外驱动Rep52/40蛋白的表达。
优选地，所述基因为细小病毒Cap基因，所述第一启动子用于驱动VP1蛋白和VP2/3蛋白的表达；所述第二启动子用于额外驱动VP2/3蛋白的表达。
优选地，所述人工构建序列还包括内含子，所述内含子用于在转录后加工过程中，通过选择性剪接作用，使得所述人工构建序列中形成所述首个翻译起始密码子。
作为进一步优选地，所述内含子位于ATG的任意两个核苷酸之间。
作为进一步优选地，所述第一启动子在所述内含子的5’端之前。
作为更进一步优选地，所述第二启动子在所述内含子内。
优选地，所述第二启动子在所述第一启动子的5’端之前。
优选地，第一启动子先于第二启动子有活性。
作为进一步优选地，第一启动子为deltaIE1、IE1、39K或p6.9，第二启动子为polH或p10。
优选地，第一启动子为p10，第二启动子为polH。
按照本发明的另一方面，还提供了一种包括第一表达盒的核酸分子，所述第一表达盒为上述表达盒。
优选地，还包括第二表达盒，所述第一表达盒和第二表达盒分别用于编码细小病毒Cap基因和细小病毒Rep基因。
优选地，还包括外源基因。
作为进一步优选地，在所述外源基因的两端有AAV反向末端重复序列。
作为进一步优选地，所述外源基因为报告基因，所述报告基因为氯霉素乙酰转移酶编码基因、β-半乳糖苷酶编码基因、β-葡萄糖醛酸酶编码基因、海肾荧光素酶编码基因、碱性磷酸酶编码基因、萤火虫荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和红色荧光蛋白编码基因中的至少一种。
作为进一步优选地，其特征在于，所述外源基因为编码药物多肽的基因，所述药物多肽为脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素和干扰素中的至少一种。
按照本发明的另一方面，还提供了一种包括上述表达盒的重组杆状病毒载体。
优选地，所述重组杆状病毒载体为昆虫细胞相容性载体。
按照本发明的另一方面，还提供了一种包括上述重组杆状病毒载体的昆虫细胞。
优选地，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于通过在单个表达盒中设置两个启动子，分别用来驱动重叠阅读框的蛋白的表达以及调节不同蛋白的相对表达时间和表达强度。本发明能更好地控制Rep基因中Rep78/68蛋白和Rep52/40蛋白的相对表达时间和更大范围的相对表达强度，以及Cap基因中VP1蛋白和VP2/3蛋白的相对表达时间和更大范围的相对表达强度。这样不仅提高了昆虫细胞中rAAV载体生产的效率，还提高了生产的AAV的质量。
附图说明
图1为野生型AAV中Cap基因和Rep基因表达调控示意图；
图2为实施例1-4中RepA-D基因表达盒I表达调控示意图；
图3为实施例1中Cap基因表达盒表达调控示意图；
图4为实施例5-8中RepI-IV基因表达盒II表达调控示意图；
图5为对比例中Rep1-4基因表达盒III表达调控示意图；
图6为实施例1-4中重组杆状病毒载体AcRepA-D表达Rep蛋白的Western Blot检测图；
图7为实施例5-8中重组杆状病毒载体AcRepI-IV表达Rep蛋白的Western Blot检测图；
图8为对比例中重组杆状病毒载体AcRep1-4表达Rep蛋白的Western Blot检测图；
图9为验证例1中构建体CRI-0、CRI-1和CRI-2感染sf9细胞的生长动力学曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为便于理解，在本具体实施方式中出现的术语定义如下：
术语“多核苷酸”：由单核苷酸构成的生物大分子，本发明提到的多核苷酸分子可以是脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)分子，也可以是核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)分子。本领域技术人员已知，RNA序列与DNA序列基本相似或具有一定程度的序列同一性，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)可被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
术语“可操作连接”：是指多核苷酸(或多肽)序列以功能性关系的连接。当两段核苷酸序列置于功能性关系时，这两段核苷酸序列是“可操作连接”的。例如，转录调控序列(例如启动子)如果影响某基因编码序列的转录，则其与该基因编码序列可操作连接。
术语“表达盒”：是指包含引入宿主细胞时可操作连接的编码序列和调控序列的核酸构建体，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。表达盒应理解为包括允许转录开始的启动子、目的基因开放阅读框和转录终止子。通常，启动子序列置于目的基因上游，与目的基因的距离与表达控制相容。“表达盒”可能是多段核酸构建体，也可能是一段核酸构建体。
术语“开放阅读框”(Open Reading Frame,ORF)：是结构基因的正常核苷酸序列，具有编码蛋白质或多肽的潜能，从起始密码子开始，结束于终止密码子，其间不存在使翻译中断的终止密码子。在一条mRNA链上，核糖体从起始密码子开始翻译，沿着mRNA序列合成多肽链并不断延伸，遇到终止密码子时，多肽链的延伸反应终止。
术语“载体”：是指设计用于转运、转移和/或存储遗传物质，以及表达遗传物质和/或将遗传物质整合到宿主细胞染色体DNA中的核酸分子，例如质粒载体、粘粒载体、人工染色体、噬菌体载体和其他病毒载体。载体通常由至少三个基本单元组成，即复制源、选择标记和多克隆位点。
术语“内含子”：又称间隔顺序，指一个基因或mRNA分子中无编码作用的片段，是真核生物细胞DNA中的间插序列。内含子序列被转录在mRNA前体中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟mRNA分子中。根据剪接过程为自发还是要经过剪接体的加工，将内含子分为自剪接内含子和剪接体内含子。自剪接内含子是一种特殊的内含子，是一种核酶，可以通过自身作用被切除，来离开mRNA。本发明涉及的内含子是剪接体内含子，这类内含子的剪除要有剪接体的帮助，内含子序列两端有剪接供体序列和剪接受体序列，是切断和重接位点处两旁的序列。剪接体是由核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)和蛋白质因子动态组成的核糖核蛋白复合体，剪接体识别mRNA前体的剪接位点并催化剪接反应，将内含子完全剪除，上下游RNA序列再重新连接。
本发明提到的内含子可以是天然内含子，也可以是经过人工改造、且在昆虫细胞内具有剪接活性的内含子；但其来源不局限于昆虫细胞。
术语“AAV血清型”：自腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)被发现以来，目前已经从腺病毒、人或灵长类动物和一些哺乳动物分离出超过100种AAV血清型或突变体，其中被应用的主要是AAV1-9。不同血清型的rAAV载体主要区别为衣壳蛋白的不同。不同的AAV血清型在感染效率和组织特异性方面存在一定的差异。
所有已知腺相关病毒血清型的基因组结构非常相似，AAV是单链DNA病毒，基因组结构简单，全长约4.7kb，如图1所示。其基因组中包含rep基因表达盒、cap基因表达盒和位于基因组两端的AAV反向末端重复序列(inverted terminal repeats，ITR)。ITR是基因组两端的125个核苷酸的回文结构，能形成一个自我互补的倒T型发卡结构，是DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的顺式作用元件。ITR序列之间为病毒编码区，rep基因表达盒、cap基因表达盒位于其中。
AAV作为缺陷型病毒，在没有辅助病毒的存在下不能够独立复制，因此AAV只能定点整合在宿主细胞染色体中，呈潜伏状态。在辅助病毒存在的情况下，rep基因表达量增加可以将整合在宿主细胞染色体中的AAV基因组拯救出来，大量复制得到AAV DNA，单链的rAAV基因组在VP衣壳蛋白的作用下被包装成具有感染性的病毒粒子。
术语“Cap基因”：由氨基酸序列重叠组成，用于编码结构性的VP衣壳蛋白，其包含3个重叠开放阅读框，分别编码VP1、VP2、VP3三种类型的亚基，VP1、VP2和VP3含有不同的起始密码子，共用一个终止密码子，VP1和VP2共享VP3序列。VP1的N端具有一个保守的磷脂酶A2序列，该序列与病毒从体内逃逸有关，并对其感染性至关重要；VP2蛋白对于组装或者感染并非比必不可少；VP3蛋白的核心由保守的β-桶基序组成，决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异。野生型AAV中三种蛋白的正确比例为6:6:54，约为1:1:10。
术语“Rep基因”：用于编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四个重叠的多功能蛋白，Rep78和Rep68蛋白参与AAV的复制及整合，可以和ITR中的特定序列结合；Rep52和Rep40蛋白具有解旋酶和ATP酶的活性，在参与单链基因组的复制同时也参与病毒的装配。无论是在哺乳动物细胞中，还是在昆虫细胞中，编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA足以满足制备rAAV的需求。
术语“相对表达含量”：不同蛋白质的表达量的相对比例。例如Rep78/Rep52蛋白的相对表达含量的提高，可能意味着Rep78蛋白表达量的提高，也可能意味着Rep52蛋白表达量的降低。
术语“启动子”：是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
术语“实心率”：以AAV载体为例，实心AAV为携带目的基因的AAV载体。而空壳AAV载体为不携带目的基因的AAV载体，由特定血清型的AAV蛋白外壳组成，通常是由生产过程中的病毒包装不完全所产生。基因治疗产品纯化过程中必须将其最小化，因为这些病毒衣壳不包含DNA，当将它们输注给患者时，一方面会竞争细胞表面有限的受体数量；另一方面对基因治疗无益处，还有可能引起副反应；再者，空壳AAV含量增加会导致给药剂量增大，给药剂量越高，发生严重副反应的风险就越高，对于包含不完整拷贝治疗基因的AAV也是如此。
实心率是指的实心AAV在制备出的AAV载体中所占的比例。实心率越高，说明实心AAV的比例越大，证明制备获得的AAV载体的质量就越高。
本发明的一个方面，提供了一种用于在细胞、尤其是昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒，包括：
从5’端至3’端可操作连接的：
人工构建序列；
缺少首个翻译起始密码子的重叠开放阅读框；
所述人工构建序列包含相互独立的第一启动子和第二启动子；且所述第一启动子与第二启动子之间不含有所述首个翻译起始密码子的完整序列。
在一些实施例中，所述人工构建序列中还包括内含子，所述内含子位于翻译起始密码子ATG之间，例如位于AT和G之间，或者位于A和TG之间；内含子用于在转录后加工过程中，通过选择性剪接作用，使得所述人工构建序列中形成所述首个翻译起始密码子，使得重叠开放阅读框能够顺利表达。
在一些实施例中，第二启动子在第一启动子之前(即在第一启动子的5’端之前)，第一启动子在内含子之前；在另一些实施例中，第一启动子在内含子之前，第二启动子包含在内含子之内。
第一启动子用来表达重叠开放阅读框编码的所有蛋白，而第二启动子用来调整这些蛋白的相对表达时间和相对表达含量/表达强度。在一些实施例中，表达盒所编码的基因为细小病毒Rep基因；本发明的两个启动子可以用来调整不同Rep蛋白的相对表达时间和相对表达含量/表达强度。此外，由于Rep40蛋白与Rep52蛋白起到的功能类似，Rep68蛋白也与Rep78蛋白起到的功能类似；所以第一启动子可以用来驱动Rep68和/或Rep78蛋白的表达，也可以用来驱动Rep40蛋白和/或Rep52蛋白的表达；而第二启动子则用来额外驱动Rep40蛋白和/或Rep52蛋白的表达。
在另一些实施例中，表达盒所编码的基因为细小病毒Cap基因；本发明的两个启动子可以用来调整不同Cap蛋白的相对表达时间和相对表达含量/表达强度。此外，第一启动子用来驱动VP1蛋白的表达，也可以用来驱动VP2/3蛋白的表达；而第二启动子则用来额外驱动VP2/3蛋白的表达。
在一些实施例中，第一启动子先于第二启动子有活性；例如第一启动子可以为deltaIE1、IE1、39K或p6.9等早晚期启动子，第二启动子为p10或polH等极晚期启动子。
在另一些实施例中，第一启动子与第二启动子可以几乎同时产生活性，例如第一启动子为p10，第二启动子为polH。
由于启动子部分非关键位点的变异对其功能并无影响，所以第一启动子和第二启动子的序列也可能与上述启动子的原始序列有部分位点的差异。
Rep基因的表达盒可以与Cap基因的表达盒以及两端含有AAV反向末端重复序列的外源基因的序列可以整合入不同的杆状病毒载体，也可以整合进同一个重组杆状病毒载体。在一些实施例中，Rep基因的表达盒与Cap基因的表达盒可以均使用上述表达盒，也可以有一个使用上述表达盒。。
在一些实施例中，外源基因为报告基因；例如氯霉素乙酰转移酶编码基因、β-半乳糖苷酶编码基因、β-葡萄糖醛酸酶编码基因、海肾荧光素酶编码基因、碱性磷酸酶编码基因、萤火虫荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和红色荧光蛋白编码基因等。
在另一些实施例中，所述外源基因为编码药物多肽的基因；所述药物多肽为脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素和干扰素等。
在一些实施例中，昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞等。
实施例1
步骤一：构建Rep基因表达盒I及含有Rep基因表达盒I的重组杆状病毒载体
参见图2，其中，内容A为Rep基因表达盒IDNA链示意图；内容B为由第一启动子驱动转录后加工过程中内含子没有发生剪接时Rep52蛋白翻译表达的示意图；内容C为由第一启动子驱动转录后加工过程中内含子发生剪接后Rep78蛋白翻译表达的示意图；内容D为由第二启动子驱动转录后Rep78蛋白翻译表达的示意图。该基因表达盒从5’至3’端依次包括第一启动子序列、腺嘌呤核苷酸(A)、内含子5’端供体序列、第二启动子序列、内含子3’端受体序列、胸腺嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(TG)和仅缺少Rep78蛋白翻译起始密码子ATG的编码AAV血清2型Rep蛋白的核苷酸序列。用来编码Rep蛋白的重叠开放阅读框核苷酸序列如SEQID No.1所示，其整体用来编码Rep78蛋白，而用来编码Rep52蛋白的部分如SEQ ID No.2所示。其在Rep78翻译起始密码子与Rep52翻译起始密码子之间存在多个核苷酸的突变，用来消除这段区域内可能存在的翻译起始位点。其中，本实施例以deltaIE1作为第一启动子序列，以polH作为第二启动子序列。将上述序列通过人工直接合成或重叠延伸PCR扩增连接起来获得构建物RepA，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
将该构建物克隆到pFastBac载体上，制备转移质粒；将上述转移质粒转化DH10Bac菌株中，通过Tn7转座酶介导的基因转座反应，获得含有RepA的重组杆状病毒载体AcRepA。
步骤二：构建Cap基因表达盒
构建包含AAV血清8型Cap基因的Cap8表达盒：参照中国专利(CN202111105263.5)实施例3所述方法构建Cap基因表达盒。参见图3，该Cap8表达盒从5’至3’依次包括p10启动子、人工构建序列和仅缺少VP1蛋白翻译起始密码子ATG的编码AAV血清8型VP蛋白的核苷酸序列。其中，所述人工构建序列中包含翻译起始密码子ATG，且包含两个内含子可变剪接位点；编码AAV血清8型VP蛋白的氨基端存在至少一个核苷酸的突变，用来消除编码序列内可能存在的剪切位点。将上述序列通过人工直接合成或重叠延伸PCR扩增连接起来获得构建物Cap8表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
步骤三：重组AAV杆粒的构建
本实施例构建用于在昆虫细胞中生产AAV病毒的重组AAV杆粒的方法参照此前申请专利CN112553257A中的实施例1，包括如下步骤：
(1)构建包含AAV必需功能元件Cap和Rep基因表达盒的同源重组载体；然后通过Red同源重组在大肠杆菌中将该同源重组载体中的必需功能元件插入到杆状病毒基因组中必需基因Ac135(116492...117391)的C端，获得包含有Cap和Rep基因表达盒的重组杆状病毒载体，编号为Bac-Cap-Rep。
(2)构建包含ITR核心元件(ITR-GOI)的同源重组载体。ITR核心元件编号为I-G-1，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。本实施例中ITR核心元件中的GOI采用了红色荧光蛋白mcherry基因表达盒，即由miniEf1a启动子控制mcherry表达，便于检测rAAV的活性。
(3)用上述步骤(2)中构建的穿梭载体转化含有Bac-Cap-Rep重组杆粒的感受态细胞，然后通过Red同源重组在大肠杆菌中将该同源重组载体中的必需功能元件插入到杆状病毒基因组中必需基因Ac98(88502...88464)的C末端，最终得到包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号为Bac-Cap-Rep-ITR-GOI。
步骤四：AAV重组杆状病毒的制备
将步骤三中制备的重组AAV杆粒转染宿主细胞系培养获得AAV重组杆状病毒，具体步骤如下：
抽提上述重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV，大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显的细胞病变效应(CPE)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液，其中含有大量BEV，即为第0代BEV(P0)，同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV-P0以感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72h后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀，上清液标记为第1代BEV-P1，细胞则标记为用BEV-P0包装的rAAV。
实施例2-4
实施例2-4分别以39K、p6.9和p10替换实施例1中的deltaIE1作为第一启动子序列，其他步骤与实施例1相同，获得构建物RepB、RepC和RepD，重组杆状病毒载体AcRepB、AcRepC和AcRepD，以及后续的重组AAV杆粒和AAV重组杆状病毒。RepB-RepD的核苷酸序列如SEQ ID No.6-8所示。
实施例5
步骤一：构建Rep基因表达盒II及含有Rep基因表达盒II的重组杆状病毒载体
参见图4所示，其中，内容A为Rep基因表达盒IIDNA链示意图；内容B为由第一启动子驱动转录后加工过程中内含子没有发生剪接时Rep52蛋白翻译表达的示意图；内容C为由第一启动子驱动转录后加工过程中内含子发生剪接后Rep78蛋白翻译表达的示意图；内容D由第二启动子驱动转录后加工过程中第一内含子剪接供体与剪接受体发生剪接后Rep52蛋白翻译表达的示意图；在第一启动子与第二启动子间插入有TAA翻译终止序列，由第二启动子驱动转录后加工过程中在内含子没有发生剪接或第二内含子剪接供体与剪接受体发生剪接的情况下，蛋白翻译会提前终止，不会产生Rep78蛋白。该基因表达盒从5’至3’端依次包括第二启动子序列、第一内含子5’端供体序列、第一启动子序列、腺嘌呤核苷酸(A)、第二内含子5’端供体序列、内含子3’端受体序列、胸腺嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(TG)和仅缺少Rep78蛋白翻译起始密码子ATG的编码AAV血清2型Rep蛋白的核苷酸序列。其中，本实施例以deltaIE1作为第一启动子序列，以polH作为第二启动子序列。将上述序列通过人工直接合成或重叠延伸PCR扩增连接起来获得构建物RepI，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
将该构建物克隆到pFastBac载体上，制备转移质粒；将上述转移质粒转化DH10Bac菌株中，通过Tn7转座酶介导的基因转座反应，获得含有RepI的重组杆状病毒载体AcRepI。
步骤二至步骤四则与实施例1相同。
实施例6-8
实施例6-8分别以39K、p6.9和p10替换实施例5中的deltaIE1作为第一启动子序列，其他步骤与实施例5相同，获得构建物RepII、RepIII和RepIV(其核苷酸序列如SEQ IDNo.10-12所示)，重组杆状病毒载体AcRepII、AcRepIII和AcRepIV，以及后续的重组AAV杆粒和AAV重组杆状病毒。
对比例1-4
步骤一：构建Rep基因表达盒III及含有Rep基因表达盒III的重组杆状病毒载体参照中国专利(CN202111105263.5)实施例6所述方法构建Rep基因表达盒III。参见图5，其中，内容A为Rep基因表达盒IIIDNA链示意图；内容B为在转录后加工过程中内含子没有发生剪接时Rep52蛋白翻译表达的示意图；内容C为在转录后加工过程中内含子发生剪接后Rep78蛋白翻译表达的示意图。该基因表达盒从5’至3’端依次包括启动子序列、腺嘌呤核苷酸(A)、内含子5’端供体序列、内含子3’端受体序列、胸腺嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(TG)和缺少Rep78蛋白翻译起始密码子ATG的编码AAV血清2型Rep蛋白的核苷酸序列。其中，对比例1-4分别以deltaIE1、39K、p6.9和polH作为启动子序列。将上述序列通过人工直接合成或重叠延伸PCR扩增连接起来获得构建物Rep1-4，其核苷酸序列如SEQ ID No.13-16所示。
将该构建物克隆到pFastBac载体上，制备转移质粒；将上述转移质粒转化DH10Bac菌株中，通过Tn7转座酶介导的基因转座反应，获得分别含有Rep1-4的重组杆状病毒载体AcRep1-4。
步骤二至步骤四则与实施例1相同。
实验结果验证
为便对于对实验结果进行说明，将按本发明实施例1-6和对比例构建的重组AAV杆粒(Bac-Cap-Rep-ITR-GOI)，根据其对应的Cap基因表达盒、Rep基因表达盒和ITR核心元件分别按表1进行编号。本实施例构建的7种不同重组AAV杆粒均包含Cap基因表达盒、Rep基因表达盒和ITR核心元件；其中，重组AAV杆粒CRI-0为含有Rep4基因表达盒的对照杆粒，Rep4基因表达盒中Rep78/52蛋白是由单一的极晚期强启动子polH驱动表达。具体如表1所示。
表1实施例和对比例中构建的7种不同重组AAV杆粒的组成元件列表
验证例1检测Rep蛋白(Rep78、Rep52)表达情况，具体操作步骤如下：
抽提上述重组杆状病毒载体DNA转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒BEV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV，大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显的细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液，其中含有大量BEV，即为第0代BEV(P0)，同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV-P0以感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72小时后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀，上清液标记为第1代BEV-P1。继续扩大培养，将制备得到的BEV-P1以感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72小时后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，收集细胞沉淀进行Western Blot检验Rep蛋白(Rep78、Rep52)的表达情况。
图6-8分别为实施例1-8及对比例1-4中含有Rep基因表达盒的重组杆状病毒载体的Rep蛋白(Rep78、Rep52)Western Blot检测图。
图6为包含有Rep基因表达盒I的重组杆状病毒载体AcRepA-D的Rep蛋白(Rep78、Rep52)Western Blot检测图，其中1-4泳道分别表征AcRepA-D。由图6看出，上述重组杆状病毒载体都能够产生Rep78和Rep52蛋白，且Rep52蛋白的表达量显著高于Rep78蛋白。Rep52与Rep78的高化学计量比可能是rAAV高产率的关键因素，在构建体AcRepA、AcRepB、AcRepC和AcRepD中本发明人通过在内含子序列中插入第二启动子用于相对增强Rep52蛋白的表达。
图7为包含有Rep基因表达盒II的重组杆状病毒载体AcRepI、AcRepII、AcRepIII和AcRepIV的Rep蛋白(Rep78、Rep52)Western Blot检测图，其中1-4泳道分别表征AcRepI-IV。在构建体AcRepI、AcRepII、AcRepIII和AcRepIV中通过插入的第二启动子驱动转录后加工过程中第一内含子剪接供体与剪接受体发生剪接作用增强Rep52蛋白的表达。
图8为对比例中包含有Rep基因表达盒III的重组杆状病毒载体AcRep1-4，其中泳道1-4分别表征对比例中AcRep1-4。由图看出，上述重组杆状病毒载体都能够产生Rep78和Rep52蛋白。在构建体AcRep1、AcRep2、AcRep3、和AcRep4中Rep78/52蛋白是通过单一的启动子驱动表达的，其中，AcRep1、AcRep2和AcRep3分别使用deltaIE1、39K和p6.9启动子驱动Rep78/52蛋白在杆状病毒立即早期、延迟早期和晚期的表达，Rep78蛋白的早期表达对AAV基因组的复制和包装可能是有利的；然而相对于极晚期启动子(p10或polH)，deltaIE1、39K和p6.9较低的启动子强度导致Rep52蛋白量不足，这不利于rAAV高产率，于是增强Rep52蛋白的表达量是必要的。
验证例2生长动力学分析
立即早期启动子deltaIE1在杆状病毒感染早期活跃，Rep78蛋白在昆虫细胞中早期大量表达可能会对重组杆状病毒的产量产生负面影响(Urabe等,2006，Journal ofVirology 80.4:1874-1885)。为了比较上述实施例和对比例中含有不同Rep基因表达盒的重组杆状病毒的生长动力学，将上述重组杆状病毒以感染复数(MOI＝0.5)感染Sf9细胞。在感染后24、48、72和96h采集感染细胞培养物的上清液，采用荧光定量PCR(qPCR)的方法测定第2代BEV-P2的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示。使用对应于gp64基因的一对引物(Q-GP64-F:AACTTGGACATTACCCCGCC和Q-GP64-R：CCGTTGTACGCATACGCCTG)来测定BEV滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virus genomes)表示，实验结果如图9所示。在构建体CRI-0、CRI-1和CRI-2中Rep78蛋白分别在极晚期、立即早期和延迟早期表达。由图9可以看出，CRI-0、CRI-1和CRI-2的病毒滴度没有明显的差异，表明在CRI-1和CRI-2构建体中Rep78蛋白的早期表达对杆状病毒复制影响较小。在Urabe等人设计Rep表达盒中deltaIE1单独驱动Rep78蛋白的表达，在CRI-1中deltaIE1启动子驱动的rep基因通过内含子剪接作用部分转录翻译成Rep78蛋白，部分转录翻译成Rep52蛋白，导致其相对更低的Rep78蛋白表达量，可能是其降低对杆状病毒复制的影响原因。
验证例3重组AAV病毒粒子的纯化及其rAAV病毒的滴度、病毒颗粒的实心率检测
本验证例采用Q-PCR检测收获的rAAV病毒的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virusgenomes)表示。rAAV滴度的检测使用靶向ITR序列的一对引物(Q-ITR-F:GGAACCCCTAGTGATGGAGTT和Q-ITR-R:CGGCCTCAGTGAGCGA)。具体操作如下：按照实施例1步骤四的操作继续扩大培养，直至用BEV-P2的种毒按照感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞进行rAAV的包装，包装体积为300mL～400mL。感染3天后监测细胞活性，活性低于50％后，收取细胞培养物，取收获的混液500μl(细胞和上清的混液)到1.5ml EP管中，液氮和37度水浴反复冻融4次。取0.1μl Benzonase加入到500μl混液中，混匀37度水浴1h，再95度水浴10min。2500g离心10min，收集上清于新的1.5ml EP管中。取200μl上清加入10μl 10％SDS溶液使其终浓度为0.5％SDS。再加入1.2μl Proteinase K(工作浓度112μg/ml)，终体积约为210μl，55度水浴1h。短暂离心后95度水浴10min。混匀后从中取出5μl样品加入145μlddH2O使终体积为150μl；混匀后再从中取出10μl样品加入90μl ddH2O使终体积为100μl，取2μl作为Q-PCR模板测量病毒样品的滴度，实验结果如表2。
本发明采用分析型超速离心技术(Analytical Ultracentrifugation，简写为AUC)检测重组腺相关病毒(rAAV)实心率(完整衣壳：总衣壳)
采用分析型超速离心技术中沉降速率分析方法，样品在离心机中被高速旋转，样品中各组分均向样品池底部移动，不同组分的运动速率(即沉降系数)不同，在离心过程中降至底部的时间不同，在此过程中扫描样品分布状态，通过分析其随时间的变化过程，获得不同组分的沉降性质。样品各组分的沉降系数取决于分子量、分子形状和构象。一般采用AUC表征rAAV的实心率。
将收取的细胞培养物用亲和层析柱(AVIPure AAV8 Resin)进行纯化。取400μl纯化的rAAV样品，将其稀释至OD230＝0.90的稀释倍数后上样，记录各峰的沉降系数和峰面积百分比，其中，空壳病毒沉降系数在55S～65S，实心病毒的沉降系数在80S～110S，65S～80S为partial部分，大于110S为聚体。将沉降系数在20S～150S的峰进行归一化处理，获得各峰的峰面积百分比，以此结果汇报病毒样品的空实心率，实验结果如表2。
表2利用7种不同重组AAV杆粒生产的rAAV病毒粒子的滴度和实心率检测结果
由表2可以看出，利用重组AAV杆粒CRI-1、CRI-2、CRI-5和CRI-6生产的rAAV病毒粒子的滴度均高于对照杆粒CRI-0，其实心率显著高于对照杆粒CRI-0；相较于对照杆粒CRI-0，在杆粒CRI-1、CRI-2、CRI-5和CRI-6中Rep78蛋白的早期表达以及更高的Rep52/Rep78比可能是其高滴度和高实心率的关键因素。利用重组AAV杆粒CRI-3和CRI-4生产的rAAV病毒粒子的滴度均低于对照杆粒CRI-0，但其实心率均高于对照杆粒CRI-0；杆粒CRI-0、CRI-3和CRI-4分别使用polH、p6.9和p10晚期启动子驱动Rep78蛋白的表达，其中polH启动子活性最强，相较于对照杆粒CRI-0，在杆粒CRI-3和CRI-4中较低的Rep78蛋白的表达和更高的Rep52/Rep78比可能是其相对低滴度和高实心率的原因。提高病毒颗粒实心率对rAAV产物是有益的，因此可以使用更少的颗粒来获得每千克相似量的基因组拷贝，同时有利于建立稳定的下游纯化工艺。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒，其特征在于，包括：
从5’端至3’端可操作连接的：
人工构建序列；
缺少首个翻译起始密码子的重叠开放阅读框；
所述人工构建序列包含相互独立的第一启动子和第二启动子；所述第一启动子与第二启动子之间不含有所述首个翻译起始密码子的完整序列。
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述基因为细小病毒Rep基因，所述第一启动子用于驱动Rep78/68蛋白和Rep52/40蛋白的表达；所述第二启动子用于额外驱动Rep52/40蛋白的表达。
3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述基因为细小病毒Cap基因，所述第一启动子用于驱动VP1蛋白和VP2/3蛋白的表达；所述第二启动子用于额外驱动VP2/3蛋白的表达。
4.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述人工构建序列还包括内含子，所述内含子用于在转录后加工过程中，通过选择性剪接作用，使得所述人工构建序列中形成所述首个翻译起始密码子。
5.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述内含子位于ATG的任意两个核苷酸之间。
6.如权利要求4所述的表达盒，其特征在于，所述第一启动子在所述内含子的5’端之前。
7.如权利要求5所述的表达盒，其特征在于，所述第二启动子在所述内含子内。
8.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述第二启动子在所述第一启动子的5’端之前。
9.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，第一启动子先于第二启动子有活性。
10.如权利要求9所述的表达盒，其特征在于，第一启动子为deltaIE1、IE1、39K或p6.9，第二启动子为polH或p10。
11.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，第一启动子为p10，第二启动子为polH。
12.一种核酸分子，其特征在于，包含第一表达盒，所述第一表达盒为权利要求1-11中任意一项所述的表达盒。
13.如权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，还包括第二表达盒，所述第一表达盒和第二表达盒分别用于编码细小病毒Cap基因和细小病毒Rep基因。
14.如权利要求12所述的核酸分子，其特征在于，还包括外源基因。
15.如权利要求14所述的核酸分子，其特征在于，在所述外源基因的两端有AAV反向末端重复序列。
16.根据权利要求14所述的核酸分子，其特征在于，所述外源基因为报告基因，所述报告基因为氯霉素乙酰转移酶编码基因、β-半乳糖苷酶编码基因、β-葡萄糖醛酸酶编码基因、海肾荧光素酶编码基因、碱性磷酸酶编码基因、萤火虫荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和红色荧光蛋白编码基因中的至少一种。
17.根据权利要求14所述的核酸分子，其特征在于，所述外源基因为编码药物多肽的基因，所述药物多肽为脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素和干扰素中的至少一种。
18.一种包括权利要求1-11任意一项所述表达盒的重组杆状病毒载体。
19.如权利要求18所示的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述重组杆状病毒载体为昆虫细胞相容性载体。
20.一种包括如权利要求18或19中任意一项所述重组杆状病毒载体的昆虫细胞。
21.如权利要求20所述的昆虫细胞，其特征在于，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞。
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