CN117265008A - 一种用于生产重组细小病毒的组合物及应用 - Google Patents
一种用于生产重组细小病毒的组合物及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于生产重组细小病毒的组合物及应用。所述组合物包括：用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的第一表达盒；用于翻译产生细小病毒Cap蛋白的第二表达盒；以及，转基因序列和转基因序列两端的AAV反向末端重复序列；所述第一表达盒包括用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的重叠开放阅读框，以及在感染早期至晚期持续驱动所述Rep蛋白的表达的第一启动子。本发明通过在第一表达盒中设置不同转录起始时间的启动子来控制Rep蛋白的表达时间和强度，从而提高昆虫细胞中rAAV载体生产的效率以及生产的rAAV的质量。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种用于生产重组细小病毒的组合物及应用。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于细小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。AAV的基因组是一条单链线性DNA，约4700bp，包括上下游两个开放阅读框(ORF)：Rep和Cap，位于分别由145个核苷酸组成的2个T形反向末端重复序列(ITR)之间。ITR的作用是充当病毒复制起点和包装信号，Rep基因参与病毒复制和整合，编码病毒复制蛋白，Cap基因负责编码病毒三个衣壳蛋白。
重组腺相关病毒(rAAV)由于具有宿主范围广、免疫原性低、安全性高、可介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。随着第一种重组腺相关病毒(rAAV)介导的基因治疗药物的批准，对大规模AAV载体制造技术的需求不断增加(Yla-Herttuala S.,2012,Mol Ther,20:1831-1832)。
目前，生产rAAV的体系主要有两大类：一种是利用哺乳动物细胞(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞等)的常规生产体系；另一种是利用昆虫细胞的生产体系。其中，利用昆虫细胞的生产体系利用含有腺相关病毒ITR包装元件、Rep基因和Cap基因的杆状病毒表达载体(Baculovirus expression vectors,BEVs)感染Sf9昆虫细胞，从而产生rAAV病毒。借助Sf9细胞可以大量表达重组蛋白的特点，使rAAV在Sf9细胞中大量组装，最终达到大规模生产rAAV的目的。
在rAAV昆虫细胞生产体系中，针对Cap蛋白，Urabe等人将VP1的起始密码子AUG替换为次优起始密码子ACG，构建一个由polH(polyhedrin)启动子转录的单一的多顺反子mRNA，该多顺反子mRNA不需要剪接即可表达所有三种AAV2的VP蛋白(Urabe等,2002,HumGene Ther,13:1935-1943)。在中国专利CN101522903A提供的方法中通过将包含有polH启动子序列的人工内含子插入到VP1的开放阅读框中，利用两个polH启动子分别表达VP1和VP2/VP3，该设计虽然也能实现VP1/VP2/VP3在同一阅读框中表达。
针对Rep蛋白的表达，Urabe等人构建了含有Rep78和Rep52两个独立的表达盒，并插入在同一个杆状病毒载体中。其中，Rep52使用了polH启动子，Rep78则使用了相对polH启动子启动活性较弱的deltaIE1启动子(Urabe等,2002,Hum Gene Ther,13:1935-1943)。有研究发现，Urabe等人开发的AAV Rep蛋白表达方法存在杆状病毒载体传代不稳定的问题(Kohlbrenner等，2005，Mol.Ther.12：1217-25)。为了解决两个独立Rep表达框固有的传代不稳定性这一问题，中国专利CN 103849629 A公开了一种昆虫细胞中产生AAV的方法，将AAV Rep78蛋白的翻译起始密码子替换成ACG，该密码子被扫描核糖体部分跳过以使翻译起始也可发生在更下游的Rep52蛋白的起始密码子上，该方法能实现在同一阅读框的Rep78和Rep52蛋白的表达，显著地提高了在昆虫细胞中生产rAAV载体的稳定性。在中国专利CN113897396 A公开的一种在昆虫细胞生产AAV的方法中，发明人通过构建含有内含子调控序列的Rep表达盒实现了在同一阅读框的Rep78和Rep52蛋白的表达，不仅提高了在昆虫细胞中生产rAAV载体的稳定性，而且，通过调整内含子剪接效率灵活调节Rep52/Rep78蛋白相对含量。
在上述技术方案中，Rep78/52和VP1/2/3蛋白使用单一类型的启动子转录，使得它们仅在感染的特定时期翻译表达。例如，Urabe等人使用deltaIE1启动子驱动Rep78蛋白的转录，deltaIE1启动子虽然在感染早期表现出较高的活性，但在感染晚期活性较低，Rep78蛋白在晚期的低表达可能不利于rAAV的包装；中国专利CN103849629A提供的技术方案中，Rep78/52蛋白由极晚期启动子驱动转录，使得Rep78蛋白在晚期翻译表达，而Rep78蛋白的早期表达可能是有利于rAAV基因组的复制。在rAAV生产体系中，如何利用启动子还有进一步改善的需求。
选择的外源基因置于天然启动子的控制下，然后在感染周期中表达，在细胞裂解过程中释放蛋白质。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。在核糖核酸合成中，启动子可以和决定转录开始的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，其包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。启动子本身并无编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像一面旗帜，其核心部分是非编码区上游的RNA聚合酶结合位点。目前，最常用的启动子有多角体pol H启动子和p10启动子，此外还有碱性启动子以及少数早期启动子。同一外源基因在不同启动子控制下，表达水平有很大差异。
立即早期和早期启动子在病毒DNA复制之前被激活。立即早期启动子(IE)由宿主细胞RNA聚合酶II转录，也利用宿主的转录因子。立即早期和早期启动子的结构组织与晚期和极晚期杆状病毒启动子有很大不同，而是更类似于其他真核启动子的结构。杆状病毒立即早期启动子最显着的特征是保守的CAGT基序，其作为转录起始位点并在调节下游基因表达中起重要作用。在某些情况下，立即早期启动子包含一个TATA样基序和/或一个起始序列。该区域被宿主RNA聚合酶II识别，并允许在感染后马上转录立即早期病毒基因。IE1启动子是一种立即早期启动子，是最常用于杆状病毒表达的组成型启动子，因为它在所有时间阶段以及未感染的昆虫细胞中都具有活性。39k启动子是一种早期启动子，它被IE1蛋白反式激活。当与IE1蛋白共表达时，39k启动子也可以暂时使用。
晚期启动子由识别保守的(A/G/T)TAAG晚期/极晚期启动子基序的病毒RNA聚合酶转录。转录起始于该基序内的第二个核苷酸，并且它的存在是启动子活性必需的。调查晚期启动子中TAAG基序功能的研究表明，该序列中的突变破坏了启动子转录活性。p6.9启动子是晚期启动子，在感染后12小时开始高表达，通常用于表达严重依赖宿主细胞蛋白质量控制系统的蛋白。
极晚期启动子转录活性在感染后18～24小时达到峰值，并超过晚期启动子活性。在感染后24h时，极晚期启动子在细胞中的转录水平超过其他所有的启动子。P10蛋白在感染周期的极晚期高水平表达，被认为在病毒释放所需的包涵体成熟和细胞裂解中发挥作用。polh启动子是极晚期强启动子，在感染后20小时开始高表达，广泛用于杆状病毒表达载体系统。
为了达到最大表达水平，大多数利用极晚期启动子来驱动外源基因的表达。虽然当需要大量重组蛋白时，这种方法通常是成功的，但在某些情况下，使用表达较早或较弱的替代启动子可能有利于最终蛋白质的质量和产量，因为当最晚的启动子最活跃时，宿主细胞对外源蛋白的加工过程可能受到损害。对于复杂的病毒颗粒，不同蛋白质的需要量可能不同。在重组腺相关病毒的生产体系中如何利用启动子，实现对病毒的包装和生产，从而进一步提高rAAV载体生产的效率以及生产的AAV的质量，尚存在研究的空间。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种用于表达包含重叠开放阅读框的基因的表达盒及应用，其目的在于通过优化第一表达盒和第二表达盒上的启动子的功能，从而更好地控制Rep蛋白和Cap蛋白的表达时间和强度，提高了生产的rAAV的产量和质量。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于生产重组细小病毒的组合物，其特征在于，包括：
用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的第一表达盒；
用于翻译产生细小病毒Cap蛋白的第二表达盒；
以及，转基因序列和转基因序列两端的AAV反向末端重复序列；
所述第一表达盒包括用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的重叠开放阅读框，以及在感染早期至晚期持续驱动所述Rep蛋白的表达的第一启动子。
优选地，所述第一表达盒包括用于编码细小病毒Rep78蛋白和/或Rep68蛋白的核苷酸序列，还包括用于编码细小病毒Rep52蛋白和/或Rep40蛋白的核苷酸序列。
优选地，所述第二表达盒包含用于编码细小病毒VP1和VP2/3衣壳蛋白的核苷酸序列。
优选地，所述第一启动子是由立即早期启动子、早期启动子或晚期启动子，
与极晚期启动子串联而成的融合启动子。
作为进一步优选地，所述第一启动子是由deltaIE1、IE1、39K或p6.9，
与p10或polh串联而成的融合启动子。
优选地，所述第二表达盒包括用于翻译产生细小病毒Cap蛋白的重叠开放阅读框；
以及在感染晚期驱动，或者在感染早期至晚期持续驱动所述Cap蛋白的表达的第二启动子。
作为进一步优选地，所述第二启动子是由立即早期启动子、早期启动子或晚期启动子，
与极晚期启动子串联而成的融合启动子。
作为更进一步优选地，所述第二启动子是由deltaIE1、IE1、39K或p6.9，
与p10或polh串联而成的融合启动子。
优选地，所述转基因序列为报告基因或编码药物多肽蛋白的基因。
作为进一步优选地，所述报告基因为氯霉素乙酰转移酶编码基因、β半乳糖苷酶编码基因、β葡萄糖醛酸酶编码基因、海肾荧光素酶编码基因、碱性磷酸酶编码基因、萤火虫荧光素酶编码基因、绿色荧光蛋白编码基因或红色荧光蛋白编码基因。
作为进一步优选地，所述药物多肽蛋白为脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素或干扰素等。
按照本发明的另一方面，还提供了一种包括上述组合物的载体分子。
按照本发明的另一方面，还提供了一种包括上述组合物的昆虫细胞。
优选地，所述昆虫细胞为草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞。
按照本发明的另一方面，还提供了一种上述昆虫细胞生产的重组腺相关病毒。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于通过在第一表达盒中设置不同转录起始时间的启动子来控制Rep蛋白的表达时间和强度，并优选在第二表达盒中设置晚期启动子或极晚期启动子控制Cap蛋白的表达时间和强度，经验证能够提高昆虫细胞中rAAV载体生产的效率以及生产的rAAV的质量。
附图说明
图1本发明实施例构建的Cap基因表达盒结构示意图；
图2为本发明实施例和对比例构建的Rep基因表达盒结构示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为便于理解，在本具体实施方式中出现的术语定义如下：
术语“表达盒”：是指包含引入宿主细胞时可操作连接的编码序列和调控序列的核酸构建体，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。表达盒应理解为包括允许转录开始的启动子、目的基因开放阅读框和转录终止子。通常，启动子序列置于目的基因上游，与目的基因的距离与表达控制相容。“表达盒”可能是多段核酸构建体，也可能是一段核酸构建体。
术语“载体”：是指设计用于转运、转移和/或存储遗传物质，以及表达遗传物质和/或将遗传物质整合到宿主细胞染色体DNA中的核酸分子，例如质粒载体、粘粒载体、人工染色体、噬菌体载体和其他病毒载体。载体通常由至少三个基本单元组成，即复制源、选择标记和多克隆位点。
术语“Cap基因”：由氨基酸序列重叠组成，用于编码结构性的VP衣壳蛋白，其包含3个重叠开放阅读框，分别编码VP1、VP2、VP3三种类型的亚基，VP1、VP2和VP3含有不同的起始密码子，共用一个终止密码子，VP1和VP2共享VP3序列。VP1的N端具有一个保守的磷脂酶A2序列，该序列与病毒从体内逃逸有关，并对其感染性至关重要；VP2蛋白对于组装或者感染并非比必不可少；VP3蛋白的核心由保守的β桶基序组成，决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异。野生型AAV中三种蛋白的正确比例为6:6:54，约为1:1:10。
术语“Rep基因”：用于编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四个重叠的多功能蛋白，Rep78和Rep68蛋白参与AAV的复制及整合，可以和ITR中的特定序列结合；Rep52和Rep40蛋白具有解旋酶和ATP酶的活性，在参与单链基因组的复制同时也参与病毒的装配。无论是在哺乳动物细胞中，还是在昆虫细胞中，编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA足以满足制备rAAV的需求。
术语“相对表达含量”：不同蛋白质的表达量的相对比例。例如Rep78/Rep52蛋白的相对表达含量的提高，可能意味着Rep78蛋白表达量的提高，也可能意味着Rep52蛋白表达量的降低。
术语“内含子”：DNA分为编码区和非编码区；其中，编码区包含外显子和内含子，外显子和内含子都会被转录到mRNA前体hnRNA中，当hnRNA进行剪接变为成熟的mRNA时，内含子被切除，而外显子保留。因此，内含子无编码蛋白质的功能。在转录的过程中，DNA上的内含子也会被转录到前体RNA中，但前体RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行翻译前被切除。
术语“启动子”：是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子的一般结构包括核心元件和上游调控元件。核心元件又包括转录起始点和TATA框，主要作为RNA聚合酶结合并起始转录的位点，上游调控元件能够通过与对应的反式作用因子相结合改变转录的效率。
术语“融合启动子”：是指将两个特性不同的启动子的核心元件进行串联成一个启动子，从而增强启动子的功能，例如提高启动子的活性，或延长蛋白转录的时间。
术语“实心率”：以AAV载体为例，实心AAV为携带目的基因的AAV载体。而空壳AAV载体为不携带目的基因的AAV载体，由特定血清型的AAV蛋白外壳组成，通常是由生产过程中的病毒包装不完全所产生。基因治疗产品纯化过程中必须将其最小化，因为这些病毒衣壳不包含DNA，当将它们输注给患者时，一方面会竞争细胞表面有限的受体数量；另一方面对基因治疗无益处，还有可能引起副反应；再者，空壳AAV含量增加会导致给药剂量增大，给药剂量越高，发生严重副反应的风险就越高，对于包含不完整拷贝治疗基因的AAV也是如此。
实心率是指的实心AAV在制备出的AAV载体中所占的比例。实心率越高，说明实心AAV的比例越大，证明制备获得的AAV载体的质量就越高。
本发明提供了一种用于生产重组细小病毒的组合物及载体分子，包括第一表达盒，第二表达盒；
以及，外源基因和外源基因两端的AAV反向末端重复序列；
所述第一表达盒包括用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的重叠开放阅读框；所述重叠开放阅读框用于编码细小病毒Rep78蛋白和/或Rep68蛋白，以及用于编码细小病毒Rep52蛋白和/或Rep40蛋白；在一些实施例中，所述重叠开放阅读框中用于翻译Rep78/Rep68蛋白的核酸序列的起始密码子为次优密码子ACG，使得翻译起始也可发生在更下游的Rep52蛋白的起始密码子上；在另一些实施例中，Rep78/Rep68蛋白的核酸序列中被插入了人工内含子，编码Rep52/Rep40蛋白的核酸序列不在该人工内含子内，当人工内含子通过剪接去除时形成成熟的Rep78/Rep68 mRNA，而Rep52/Rep40mRNA由位于人工内含子内的额外的启动子转录获得；在另一些实施例中，所述第一表达盒包含有剪切活性的内含子，通过内含子的选择性剪接作用使得所述重叠开放阅读框既能转录形成Rep52/Rep40 mRNA，也能转录形成Rep78/Rep68 mRNA。
所述第二表达盒包含用于编码细小病毒VP1和VP2/3衣壳蛋白的核苷酸序列，用于翻译产生细小病毒Cap蛋白。
所述第一表达盒包括在感染早期至晚期持续驱动所述Rep蛋白的表达的第一启动子。
所述第一启动子为融合启动子，由转录起始时间不同的两个启动子的核心元件串联而成，从而驱动Rep蛋白能在所述两个启动子的转录起始后持续表达；在一些实施例里，所述两个启动子分别为立即早期启动子、早期启动子或晚期启动子，以及极晚期启动子。例如，所述两个启动子分别为deltaIE1、IE1、39K或p6.9，与p10或polh。
所述第二表达盒也可以采取重叠开放阅读框的方式来构建，所述重叠开放阅读框用于编码细小病毒VP1衣壳蛋白，以及用于编码细小病毒VP2/3衣壳蛋白；在一些实施例中，所述重叠开放阅读框中用于翻译VP1蛋白的核酸序列的起始密码子为次优密码子ACG，使得翻译起始也可发生在更下游的VP2/VP3蛋白的起始密码子上；在另一些实施例中，VP1蛋白的核酸序列中被插入了人工内含子，编码VP2/3蛋白的核酸序列不在该人工内含子内，当人工内含子通过剪接去除时形成成熟的VP1 mRNA，而VP2/3mRNA由位于人工内含子内的额外的启动子转录获得；在另一些实施例中，所述第一表达盒包含有剪切活性的内含子，通过内含子的选择性剪接作用使得所述重叠开放阅读框既能转录形成VP2/3mRNA，也能转录形成VP1mRNA。
所述第二表达盒既可以包括单一启动子也可以包括融合启动子，当包括单一启动子时，该启动子为晚期启动子序列或极晚期启动子序列，从而驱动Cap蛋白能在晚期持续表达；当包括融合启动子时，该融合启动子由立即早期启动子、早期启动子或晚期启动子，与极晚期启动子串联而成。例如，所述两个启动子分别为deltaIE1、IE1、39K或p6.9，与p10或polh。
该载体分子可在草地贪夜蛾细胞、粉纹夜蛾细胞、果蝇细胞或蚊子细胞等昆虫细胞中表达，并用于生产具有表达外源基因功能的重组腺相关病毒。例如可以用于生产氯霉素乙酰转移酶、β半乳糖苷酶、β葡萄糖醛酸酶、海肾荧光素酶、碱性磷酸酶、萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白等报告性蛋白，也可以用于生产脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素或干扰素等药物多肽蛋白。
该组合物、载体分子或者包括该组合物或载体分子的细胞可以用于生产重组腺相关病毒。
实施例1
步骤一：构建Rep基因表达盒
参照中国专利(CN202111105263.5)所述方法构建含有AAV血清2型Rep重叠开放阅读框基因的表达盒。本实施例构建的Rep表达盒为核酸构建物deltaIE1-p10-Rep。所述构建物deltaIE1-p10-Rep使用含有deltaIE1和p10启动子核心序列的融合启动子deltaIE1-p10(SEQ NO.1)驱动Rep蛋白在杆状病毒感染立即早期至极晚期持续表达。其中，deltaIE1为早期启动子，p10为极晚期启动子。
Rep基因表达盒中还含有内含子剪接调控序列用于调控Rep表达盒中Rep78和Rep52的表达。
步骤二：构建Cap基因表达盒
参照中国专利(CN202111105263.5)所述方法构建含有AAV血清9型Cap重叠开放阅读框基因的表达盒。本实施例构建的Cap表达盒为核酸构建物pH-Cap(SEQ NO.2)。所述构建物pH-Cap使用启动子polH(SEQNO.3)驱动Cap蛋白在杆状病毒感染晚期大量表达。
Cap基因表达盒中还含有内含子剪接调控序列用于调控Cap表达盒中VP1、VP2和VP3蛋白的表达。
步骤三：重组AAV杆粒的构建
本实施例构建用于在昆虫细胞中生产AAV病毒的重组AAV杆粒的方法参照此前申请专利CN112553257A中的实施例1，包括如下步骤：
(1)构建包含AAV必需功能元件Cap和Rep基因表达盒的同源重组载体；然后通过Red同源重组在大肠杆菌中将该同源重组载体中的必需功能元件插入到杆状病毒基因组中必需基因Ac135(116492...117391)的C端，获得包含有Cap和Rep基因表达盒的重组杆状病毒载体，编号为Bac-Cap-Rep。
(2)构建包含ITR核心元件(ITR-GOI)的同源重组载体。ITR核心元件编号为I-G-1。本实施例中ITR核心元件中的GOI采用了红色荧光蛋白mcherry基因表达盒，即由miniEf1a启动子控制作为转基因序列的mcherry表达，便于检测rAAV的活性。
(3)用上述步骤(2)中构建的穿梭载体转化含有Bac-Cap-Rep重组杆粒的感受态细胞，然后通过Red同源重组在大肠杆菌中将该同源重组载体中的必需功能元件插入到杆状病毒基因组中必需基因Ac98(88502...88464)的C末端，最终得到包含生产rAAV所必需的功能蛋白组分和ITR核心元件的重组杆状病毒基因组的重组杆粒，编号为Bac-Cap-Rep-ITR-GOI。
步骤四：AAV重组杆状病毒的制备
将步骤三中制备的重组AAV杆粒转染宿主细胞系培养获得AAV重组杆状病毒，具体步骤如下：
抽提上述重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒BEV和rAAV。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV，大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显的细胞病变效应(CPE)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液，其中含有大量BEV，即为第0代BEV(P0)，同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV-P0以感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72h后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀，上清液标记为第1代BEV-P1，细胞则标记为用BEV-P0包装的rAAV。
实施例2
以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，在所述步骤一中以融合启动子39K-p10(SEQ NO.4)取代融合启动子deltaIE1-p10获得核酸构建物39K-p10-Rep。所述构建物39K-p10-Rep使用含有39K和p10启动子核心序列的融合启动子39K-p10，驱动Rep蛋白在杆状病毒感染早期至极晚期持续表达；其中，39K为早期启动子。
实施例3
以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，在所述步骤一中以融合启动子p6.9-p10(SEQ NO.5)取代融合启动子deltaIE1-p10获得核酸构建物p6.9-p10-Rep。所述构建物p6.9-p10-Rep使用含有p6.9和p10启动子核心序列的融合启动子p6.9-p10，驱动Rep蛋白在杆状病毒感染晚期至极晚期持续表达；其中，p6.9为晚期启动子。
实施例4
以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，在所述步骤一中以融合启动子39K-p10取代融合启动子deltaIE1-p10，在所述步骤二中以融合启动子p6.9-pH(SEQ NO.6)取代启动子polH获得核酸构建物p6.9-pH-Cap。所述构建物p6.9-pH-Cap使用含有p6.9和pH启动子核心序列的融合启动子p6.9-pH，驱动Cap蛋白在杆状病毒感染晚期至极晚期持续表达。
实施例5
以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，在所述步骤二中以融合启动子p6.9-pH取代启动子polH获得核酸构建物p6.9-pH-Cap。
实施例6
以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，在所述步骤二中以融合启动子39K-pH(SEQ NO.7)取代启动子polH获得核酸构建物39K-pH-Cap。所述构建物39K-pH-Cap使用含有39K和pH启动子核心序列的融合启动子39K-pH，驱动Cap蛋白在杆状病毒感染早期至极晚期持续表达。
实施例1、实施例5与实施例6构建的Cap基因表达盒的结构从下至上如图1所示。
对比例
以所述的相同步骤重复实施例1，区别在于，在所述步骤一中，以启动子p10(SEQNO.8)取代融合启动子deltaIE1-p10获得核酸构建物p10-Rep。所述构建物p10-Rep(SEQNO.9)使用p10启动子驱动Rep蛋白在杆状病毒感染晚期大量表达。
对比例、实施例3、实施例2和实施例1构建的Rep基因表达盒的结构从下至上如图2所示。
实验结果验证
为便于实施例和对比例进行对比验证，归纳实施例和对比例中构建的重组AAV杆粒使用的Cap基因表达盒、Rep基因表达盒和ITR核心元件的类型具体如表1所示。
表1实施例和对比例中构建的7种不同重组AAV杆粒的组成元件列表
实验结果验证重组AAV病毒粒子的纯化及其rAAV病毒的滴度、病毒颗粒的实心率检测
本验证例采用Q-PCR检测收获的rAAV病毒的滴度，滴度单位用VG/ml(VG,virusgenomes)表示。rAAV滴度的检测使用靶向ITR序列的一对引物(Q-ITR-F:GGAACCCCTAGTGATGGAGTT和Q-ITR-R:CGGCCTCAGTGAGCGA)。具体操作如下：在实施例1步骤四的基础上继续扩大培养，直至用BEV-P2的种毒按照感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞进行rAAV的包装，包装体积为300mL～400mL。感染3天后监测细胞活性，活性低于50％后，收取细胞培养物，取细胞和上清的混液500μl到1.5ml EP管中，液氮和37度水浴反复冻融4次。取0.1μl Benzonase加入到500μl混液中，混匀37度水浴1h，再95度水浴10min。2500g离心10min，收集上清于新的1.5ml EP管中。取200μl上清加入10μl 10％SDS溶液使其终浓度为0.5％SDS。再加入1.2μl Proteinase K(工作浓度112μg/ml)，终体积约为210μl，55度水浴1h。短暂离心后95度水浴10min。混匀后从中取出5μl样品加入145μl ddH2O使终体积为150μl；混匀后再从中取出10μl样品加入90μl ddH2O使终体积为100μl，取2μl作为Q-PCR模板测量病毒样品的滴度，实验结果如表2。
本验证例采用分析型超速离心技术(Analytical Ultracentrifugation，简写为AUC)检测重组腺相关病毒(rAAV)实心率(完整衣壳：总衣壳)
采用分析型超速离心技术中沉降速率分析方法，样品在离心机中被高速旋转，样品中各组分均向样品池底部移动，不同组分的运动速率(即沉降系数)不同，在离心过程中降至底部的时间不同，在此过程中扫描样品分布状态，通过分析其随时间的变化过程，获得不同组分的沉降性质。样品各组分的沉降系数取决于分子量、分子形状和构象。本验证例采用AUC表征rAAV的实心率。
将收取的细胞培养物用亲和层析柱(AVIPure AAV8 Resin)进行纯化。取400μl纯化的rAAV样品，将其稀释至OD230＝0.90的稀释倍数后上样，记录各峰的沉降系数和峰面积百分比，其中，空壳病毒沉降系数在55S～65S，实心病毒的沉降系数在80S～110S，65S～80S为partial部分，大于110S为聚体。将沉降系数在20S～150S的峰进行归一化处理，获得各峰的峰面积百分比，以此结果汇报病毒样品的空实心率，实验结果如表2。
表2利用7种不同重组AAV杆粒生产的rAAV病毒粒子的滴度和实心率检测结果
由表2可以看出，利用重组AAV杆粒实施例1和实施例2生产的rAAV病毒粒子的滴度和实心率均显著高于对照杆粒对比例，实施例1和实施例2分别使用含有deltaIE1和39K的融合启动子驱动Rep78/52蛋白在杆状病毒感染早期至极晚期持续表达，Rep蛋白早期表达可能更有利于AAV基因组的复制和包装，从而提高了rAAV生产的效率和质量；利用重组AAV杆粒实施例1生产的rAAV病毒粒子的滴度和实心率均略高于对照杆粒对比例，实施例1使用含有p6.9的融合启动子驱动Rep78/52蛋白在杆状病毒感染晚期至极晚期持续表达，晚期启动子和极晚期启动子在启动时间接近，可能对AAV基因组的复制和包装的贡献作用有限；利用重组AAV杆粒实施例4生产的rAAV病毒粒子的滴度高于杆粒实施例2，相较于杆粒实施例2，杆粒实施例4使用含有p6.9的融合启动子驱动Cap蛋白在杆状病毒感染晚期至极晚期持续表达，Cap蛋白的提前表达增加了rAAV包装的时间，可能有利于获得更高的rAAV生产滴度。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于生产重组细小病毒的组合物，其特征在于，包括：
用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的第一表达盒；
用于翻译产生细小病毒Cap蛋白的第二表达盒；
以及，转基因序列和转基因序列两端的AAV反向末端重复序列；
所述第一表达盒包括用于翻译产生细小病毒Rep蛋白的重叠开放阅读框，以及在感染早期至晚期持续驱动所述Rep蛋白的表达的第一启动子。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一表达盒包括用于编码细小病毒Rep78蛋白和/或Rep68蛋白的核苷酸序列，还包括用于编码细小病毒Rep52蛋白和/或Rep40蛋白的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二表达盒包含用于编码细小病毒VP1和VP2/3衣壳蛋白的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一启动子是由立即早期启动子、早期启动子或晚期启动子，
与极晚期启动子串联而成的融合启动子。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述第一启动子是由deltaIE1、IE1、39K或p6.9，
与p10或polh串联而成的融合启动子。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第二表达盒包括用于翻译产生细小病毒Cap蛋白的重叠开放阅读框；
以及在感染晚期驱动，或者在感染早期至晚期持续驱动所述Cap蛋白的表达的第二启动子。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述第二启动子是由立即早期启动子、早期启动子或晚期启动子，
与极晚期启动子串联而成的融合启动子。
8.一种包括如权利要求1-7中任意一项所述组合物的载体分子。
9.一种包括如权利要求1-7中任意一项所述组合物的昆虫细胞。
10.利用权利要求9所述的昆虫细胞生产的重组腺相关病毒。
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| US20230159951A1 (en) * | 2020-04-02 | 2023-05-25 | Uniqure Biopharma B.V. | Dual bifunctional vectors for aav production |
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2023
- 2023-09-11 CN CN202311168952.XA patent/CN117265008A/zh active Pending
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| Title |
|---|
| "如何优化昆虫杆状病毒系统重组蛋白表达", pages 4, Retrieved from the Internet <URL:https://www.souhu.com/a/590929188_121124565> * |
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