CN115997006A - 用于产生aav的双双功能载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于产生重组细小病毒基因治疗载体的核酸构建体的新组合。特别地，本发明涉及一种优选不超过两种构建体的组合，第一构建体表达细小病毒Cap和Rep蛋白两者，而第二构建体至少包含侧翼为ITR的转基因并且任选地再次包含Cap蛋白的表达盒。所述核酸构建体优选是用于在昆虫细胞中产生rAAV的杆状病毒载体。

Description

用于产生AAV的双双功能载体

技术领域

本发明涉及医学、分子生物学和基因治疗领域。本发明涉及在细胞中产生蛋白质，其中在杆状病毒载体中使用重复的不完全回文/同源重复序列。特别地，本发明涉及可用于基因治疗的细小病毒载体的生产，并且涉及提高细小病毒载体生产率的病毒复制酶(Rep)蛋白的表达的改进。

背景技术

杆状病毒表达系统作为真核克隆和表达载体的用途是众所周知的(King,L.A.,and R.D.Possee,1992,“The baculovirus expression system”,Chapman and Hall,United Kingdom；O’Reilly,D.R.,et al.,1992.Baculovirus Expression Vectors:ALaboratory Manual.New York:W.H.Freeman)。所述杆状病毒表达系统的优点尤其在于，所表达的蛋白几乎总是可溶的、正确折叠的和生物活性的。另外的优点包括蛋白质表达水平高，生产速度更快，适合于大蛋白质的表达和适合于大规模生产。然而，在昆虫细胞生物反应器中使用杆状病毒系统大规模或连续生产异源蛋白时，生产水平的不稳定性是一个主要障碍。这种效应至少部分是由于杆状病毒DNA中重复同源序列之间的重组。

杆状病毒表达系统还成功地用于生产重组腺相关病毒(rAAV)载体(Urabe etal.,2002,Hum.Gene Ther.13:1935–1943；US 6,723,551和US 20040197895)。AAV可被认为是人类基因治疗最有前景的病毒载体之一。迄今为止，两个平台已经成为能够递送研究和临床级AAV材料的主要生产系统。在这两种情况下，将包含复制酶(Rep，DNA复制和包装蛋白)和衣壳(Cap，结构蛋白)编码基因的表达盒与侧翼为AAV2反向末端重复序列(ITR)的待包装转基因一起递送至生产细胞。一种方法依赖于质粒瞬时化学转染HEK293细胞以递送这些组分并产生AAV。在第二种方法中，杆状病毒表达载体(BEV)将所述组分递送到无脊椎动物细胞的悬浮培养物中。虽然基于哺乳动物细胞的rAAV生产系统能够生产高滴度的AAV材料，但是其不太适合放大。这主要是由于质粒生产的高成本和需要使HEK293细胞既能适应悬浮生长又能适应AAV生产，并且甚至随后的产量与昆虫细胞的不是一个量级。相反，BEV生产系统为rAAV生产提供了一个更可扩展的平台，因为杆状病毒一旦产生并被鉴定，就可以在接种以生产AAV之前与悬浮生长的昆虫细胞一起扩增。通常，基于每细胞的产率与悬浮昆虫细胞和粘附的HEK293细胞相当。

用于在昆虫细胞中产生rAAV的最常用的方法是通过三种分离的杆状病毒的共感染，即TripleBac系统。这些杆状病毒分别包含Rep、Cap和转基因(Trans)表达盒。在rAAV生产过程中使用三种杆状病毒共感染的主要缺点是可能发生非同时感染。通过产生每种都含有双表达盒的杆状病毒载体，在此称作DuoBac系统(其中每种载体含有Cap和Rep或Cap和Trans，图1)，可以减少rAAV生产所需的不同杆状病毒载体的数量，从而提高同时感染的机会。这种工艺复杂性的降低具有几个潜在的好处：1.降低污染的风险；2.粗裂解物体积(CLB)中平均较高的AAV产率；3.更强健的杆状病毒MOI应答；4.增加了与放大的兼容性；5.由于少要求一种种子病毒，降低了商品成本；和6.降低AAV批次的总/全比率。产生所有这些优点是因为成功生产AAV所需的分子组分更可能在正确的时间存在于细胞中。

对于在昆虫细胞中使用杆状病毒的AAV生产，优化Cap和Rep蛋白在时间和量上的表达对于所生产的AAV的数量和质量是非常重要的。先前观察到，早期Rep78表达(复制Rep)和晚期Rep52表达(包装Rep)提高了生产的AAV的质量(US8697417)。通过使用在不同感染阶段变得有活性的不同杆状病毒启动子，可以实现对表达时间的控制(Chaabihi,H.,et al.,1993,J Virol 67(5),2664-71；Hill-Perkins,M.S.and Possee,R.D.,1990,J Gen Virol71(4),971-6；Pullen,S.S.and Friesen,P.D.,1995,J Virol 69(1),156-65)。立即早期(IE)启动子在杆状病毒感染的早期，在感染后立即有活性，但此后下降。P10和多角体蛋白启动子都是强启动子，但是非常迟的启动子，其中在感染后20-24小时观察到峰值表达。通过分开Rep52和Rep78表达盒，并用不同的启动子控制它们的表达，本发明人更好地控制Rep蛋白的个体强度和时间，从而提高生产的AAV的质量。另外，在申请WO2002/148971中，本发明人通过使用Rep78和Rep52蛋白的单一编码序列显著提高了rAAV载体在昆虫细胞中产生的稳定性，其中对于Rep78蛋白使用了次优起始密码子，其被扫描中的核糖体部分地略过以允许翻译起始也发生在下游的Rep52蛋白起始密码子处。在WO2002/014445中，通过使用Rep52和Rep78的单独表达盒，再次提高了昆虫细胞中rAAV载体生产的稳定性，其中重复的编码序列在密码子偏性(codon bias)不同以减少同源重组。

衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)的化学计量需要尽可能接近1:1:10的自然比例。VP1含有磷脂酶A2活性，一旦衣壳进入细胞，VP1对于内体逃逸是必需的。如果该比值落在其最佳值之外，则衣壳的效力将较低，例如，低VP1通常导致较差的感染性(如在细胞进入和转基因表达中所测量的)，但是产生较高滴度的AAV(以GC/mL计)。所选择的衣壳启动子和VP1起始密码子的组合一起对该比率产生最大的影响并需要以针对各个AAV血清型进行优化。混合不同的启动子强度和VP1起始密码子可以改变产生的衣壳的VP1:2:3比率，从而改变其效力(Bosma,B.,et al.,2018,Gene Ther 25(6),415-424)。国际专利申请WO2002/084773公开了一种在昆虫细胞中产生rAAV的方法，其中通过相对于VP2和VP3补充VP1来增加感染性病毒颗粒的产生。补充可以通过将包含表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的衣壳载体引入昆虫细胞中，并且另外将表达VP1的核苷酸序列引入昆虫细胞中来实现，所述核苷酸序列可以在相同的衣壳载体上，也可以在不同的载体上。

过去，含有双表达盒的杆状病毒构建体围绕AAV血清型1(W02002/104964)设计。虽然这些构建体显示出改进的总/全比和正常衣壳化学计量，但是病毒产率比TripleBacAAV1产量低大约三倍。降低产率的一个解释可能是由于使用单个Rep表达盒，其中表达的时机以及Rep52和Rep78的比率不是最佳的。这可能导致颗粒中高的外源(非AAV)DNA包囊化和低的产率。因此，仍然需要改进重组细小病毒基因治疗载体如rAAV的质量和数量的手段和方法。

发明简述

在第一方面，本发明涉及包含一或多种核酸构建体的细胞，所述一或多种核酸构建体包含：i)第一表达盒，其包含与与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种；ii)第二表达盒，其包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种；iii)第三表达盒，其包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第三启动子；以及，iv)核苷酸序列，其包含侧翼有至少一个细小病毒反向末端重复序列的转基因，其中，所述第一和第二表达盒中的至少一个与所述第三表达盒存在于第一核酸构建体上，并且其中，在用所述一或多种核酸构建体转染所述细胞时，所述第一启动子先于所述第二和第三启动子有活性。优选地，包含侧翼有细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列存在于第二核酸构建体上。优选地，所述第二核酸构建体还包含第四表达盒，所述第四表达盒包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第四启动子，其中第一启动子先于第二、第三和第四启动子有活性，其中任选地，第三和第四启动子是相同的，并且其中任选地，由第三和第四表达盒中的核苷酸序列编码的细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白是相同的。

在一个优选实施方案中，所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种以及所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种包含共同氨基酸序列，所述共同氨基酸序列包含所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种中从第二个氨基酸到最C端氨基酸的氨基酸序列，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种与所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少90％相同，并且其中编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有小于90％的相同性。优选地，所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种和所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少99％相同，优选100％相同。进一步优选的是，与编码所述细小病毒Rep52和40中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列对于所述细胞具有改善的密码子使用偏向性，或者其中与编码所述细小病毒Rep78和68中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列对于所述细胞具有改善的密码子使用偏向性，其中更优选地，编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列的密码子适应指数之差至少为0.2。

在一个实施方案中，第一启动子是组成型启动子。

在一个实施方案中，第二、第三和第四启动子中的至少一个是诱导型启动子。优选地，诱导型启动子是在病毒感染周期的后期被诱导的病毒启动子；优选是在病毒转染或感染细胞至少24小时后被诱导的病毒启动子。

在一个实施方案中，第一和第二核酸构建体中的至少一种稳定地整合在所述细胞的基因组中。

在优选的实施方案中，所述细胞是昆虫细胞，并且其中至少第一和第二核酸构建体之一是昆虫细胞相容性载体，优选杆状病毒载体。优选在昆虫细胞中，a)第一启动子选自deltaEl启动子和El启动子；和b)第二、第三和第四启动子选自polH启动子和P10启动子。更优选在昆虫细胞中，至少一个表达盒包含至少一种杆状病毒增强子元件和/或至少一种蜕皮激素应答元件，其中增强子元件优选选自hr1、hr2、hr2.09、hr3、hr4、hr4b和hr5，优选选自hr2.09、hr4b和hr5。

在一个实施方案中，所述编码mRNA的核苷酸序列包含完整的细小病毒p19启动子，所述mRNA在细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种。

在一个优选实施方案中，所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种，所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种，所述细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白以及所述至少一种细小病毒反向末端重复序列来自腺相关病毒(AAV)。在一个实施方案中，第一核酸构建体是DuoBac CapRep6(SEQIDNO.10)，第二核酸构建体是DuoBac CapTrans1(SEQIDNO.12)，其中第一和第二构建体优选以3:1摩尔比存在。

在第二方面，本发明涉及一种在细胞中产生重组细小病毒病毒体的方法，包括以下步骤：a)在产生重组细小病毒病毒体的条件下培养本文定义的细胞；和b)回收所述重组细小病毒病毒体。优选地，在该方法中，细胞是昆虫细胞和/或其中细小病毒病毒体是AAV病毒体。在优选的方法中，步骤b)中重组细小病毒病毒体的回收包括使用固定化的抗细小病毒抗体亲和纯化病毒体或用标称孔径为30-70nm的过滤器过滤中的至少一种，所述抗细小病毒抗体优选单链骆驼抗体或其片段。

在第三方面，本发明涉及如本文所定义的核酸构建体，具体涉及如本文所定义的第一和第二核酸构建体。

在第四方面，本发明涉及包含至少一种如本文所定义的第一和第二核酸构建体的套组试剂盒(kit of parts)。

发明详述

定义

除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本领域技术人员将认识到许多类似于或等效于本文所述的方法和材料，其可用于实施本发明。实际上，本发明完全不限于该方法。

在本文件及其权利要求书中，在其非限制性意义上使用短语“包含”及其变化形式来表示包括在单词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，不定冠词“一”或“一个”对元素的引用不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且仅存在一个元素。不定冠词“一”或“一个”因此通常是指“至少一个”。

本文所用术语“和/或”表示所述情况中的一种或多种可以单独发生，或者与所述情况中的至少一种组合发生，直到与所有所述情况一起发生。

这里所用的“至少”一个特定值是指该特定值或更多。例如，“至少2个”被理解为与“2个或更多个”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。

词语“约”或“大约”当与数值结合使用时(例如约10)，优选意味着该值可以是该给定值的(10的)0.1％或更少的值。本文中所述的物质作为药物的用途也可解释为所述物质在制备药物中的用途。类似地，当一种物质用于治疗或用作药物时，它也可用于制备治疗用药物。本文所述的用作药物的产品可用于治疗方法，其中所述治疗方法包括施用所述产品以供使用。

术语“同源性”、“序列相同性”等在此可互换使用。本文将序列相同性定义为两个或多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两个或多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“相同性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关度，视情况而定，由这些序列串之间的匹配确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代基与第二个多肽的序列进行比较而确定的。“相同性”和“相似性”可以通过已知的方法容易地计算。

“序列相同性”和“序列相似性”可以通过使用全局或局部比对算法比对两个肽或两个核苷酸序列来确定，这取决于两个序列的长度。类似长度的序列优选地使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)进行比对，全局比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而基本上不同长度的序列优选地使用局部比对算法(例如Smith Waterman)进行比对。然后可以将序列称作“基本相同的”或“基本相似”，当它们(当通过例如使用缺省参数的节目间隙或最佳匹配而最佳对齐时)共享至少某个最小百分比的序列相同性(如下所定义)。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在它们的整个长度(全长)上对两个序列进行比对，使匹配的数量最大并且使GAP的数量最小。当两个序列具有相似长度时，全局比对适合用于确定序列相同性。通常，使用GAP缺省参数，其中GAP产生罚值＝50(核苷酸)/8(蛋白质)和GAP延伸罚值＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，所用的缺省评分矩阵是NWGAPDNA，对于蛋白质，缺省评分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89,915-919)。序列比对和百分比序列相同性得分可以使用计算机程序来确定，例如可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,CA 92121-3752 USA获得的GCG Wisconsin Package 10.3版本，或使用开源软件，诸如程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或“Water”(使用局部SmithWaterman算法)在EmbossWIN版本2.10.0中，使用与上述GAP相同的参数，或者使用缺省设置(&#8216；Needle&#8217；以及水#8216；水#8217；对于蛋白质和DNA比对，缺省缺口开放罚分为10.0，缺省缺口延伸罚分为0.5；缺省评分矩阵是蛋白质的Blossum62和DNA的dNAfull)。当序列具有显著不同的全长时，优选使用局部比对，例如使用SmithWaterman算法的那些。

或者，百分比相似性或同一性可以通过使用诸如FastA、BLAST等算法对照公共数据库进行搜索来确定。因此，本发明的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”以对公共数据库执行搜索，以例如识别其它家族成员或相关序列。这样的可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(版本2.0)来执行搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序进行，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序进行BLAST蛋白搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有间隙的比对，如Altschul等，(1977)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述，可以使用有间隙的BLAST。当使用BLAST和带缺口的BLAST程序时，可以使用相应程序的缺省参数(例如，BLASTX和BLASTN)。参见美国国家生物技术信息中心的主页，其网址为：http：ncbi.nlm.nih.gov/。

本文所用术语“选择性杂交”、“选择性杂交”和类似术语用来描述杂交和洗涤的条件，其中至少66％，至少70％，至少75％，至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，优选至少95％，更优选至少98％或更优选至少99％彼此同源的核苷酸序列通常保持彼此杂交。也就是说，这样的杂交序列可以共享至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％或更优选至少99％的序列相同性。

优选的是，这种杂交条件的非限制性例子是在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，接着在约50℃，优选约55℃，优选约60℃，甚至更优选约65℃在1X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。

高度严格的条件包括，例如，在约68℃在5×SSC/5×Denhardt’s溶液/0％SDS中杂交，和在0.2×SSC/0.1％SDS中室温洗涤。或者，洗涤可以在42℃下进行。

本领域技术人员将知道应用严格和高度严格杂交条件的条件。关于这些条件的其它指导在本领域中是容易获得的，例如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；和Ausubel et al.(eds.),Sambrook and Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rdedition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York 1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)。

当然，仅与polyA序列(例如mRNA的3'末端poly(A)片段)或T(或U)的互补延伸部分杂交的多核苷酸不包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为这样的多核苷酸将与任何含有poly(A)片段或其互补序列的核酸分子(例如，实际上任何双链cDNA克隆)杂交。

“核酸构建体”或“核酸载体”在这里被理解为是指使用重组DNA技术产生的人造核酸分子。术语“核酸构建体”因此不包括天然存在的核酸分子，尽管核酸构建体可以含有天然存在的核酸分子(的部分)。“载体”是用于将外源核酸序列(即DNA或RNA)转移到宿主细胞中的核酸构建体(通常为DNA或RNA)。术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够影响基因在与这些序列相容的宿主细胞或宿主生物体中表达的核苷酸序列。这些表达载体通常包括至少一个“表达盒”，其是能够影响编码待表达产物的序列的表达的功能单元，并且其中所述编码序列可操作地连接至适当的表达控制序列，所述适当的表达控制序列至少包括适当的转录调节序列和任选的3'转录终止信号。也可以存在影响表达所必需的或有助于影响表达的其它因素，例如表达增强子元件。表达载体将被导入合适的宿主细胞中，并且能够影响编码序列在宿主细胞的体外细胞培养物中的表达。该表达载体将适用于病毒载体，特别是重组AAV载体，在本发明的宿主细胞或生物体中复制。

如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”指起控制一个或多个编码序列转录作用的核酸片段，并且位于编码序列转录起始位点转录方向的上游，并通过以下的存在进行结构鉴定：DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活物蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接调节启动子转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理或发育调节的启动子，例如通过施用化学诱导剂或生物实体调节。

术语“报道分子”可以与标记物互换使用，不过它主要用于指可见标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶。

术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，是指由氨基酸链组成的分子，而不涉及特定的作用模式、大小、三维结构或来源。

术语“基因”是指包含区域(转录区域)的DNA片段，该区域在细胞中转录成RNA分子(例如mRNA)，可操作地连接到合适的调节区域(例如启动子)。基因通常包括几个可操作连接的片段，例如启动子、5'前导序列、编码区和包含多腺苷酸化位点的3'-非翻译序列(3'-末端)。“基因的表达”指这样的过程，其中可操作地连接到适当调节区域特别是启动子的DNA区域被转录成具有生物学活性的RNA，即能够被翻译成具有生物学活性的蛋白质或肽。

术语“同源的”当用于表示给定(重组)核酸或多肽分子与给定宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，理解为意味着在本质上核酸或多肽分子是由宿主细胞或相同物种，优选相同品种或菌株的生物体产生的。如果与宿主细胞同源，则编码多肽的核酸序列通常(但不是必需的)可操作地连接到另一(异源)启动子序列上，如果适用的话，连接到其自然环境中的另一(异源)分泌信号序列和/或终止子序列上。可以理解，调节序列、信号序列、终止子序列等也可以与宿主细胞同源。在本文中，仅使用“同源”序列元件就可以构建“自克隆的”遗传修饰的生物体(GMO's)(自克隆在本文中如欧洲指令98/81/EC附件II中所定义)。当用于表示两个核酸序列的相关性时，术语“同源”是指一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交程度可取决于许多因素，包括序列之间的相同性量和杂交条件，如温度和盐浓度，如后面讨论的。

术语“异源的”和“外源的”当用于核酸(DNA或RNA)或蛋白质时是指不是作为它存在于其中的生物体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的天然存在的一部分的核酸或蛋白质，或在不同于其天然被发现的细胞或基因组或DNA或RNA序列的一个或多个位置中发现。异源和外源核酸或蛋白对于导入它们的细胞不是内源的，而是从另一个细胞获得的，或者是合成或重组产生的。通常，尽管不是必需的，但是这些核酸编码通常不由其中转录或表达所述DNA的细胞产生的蛋白质，即外源蛋白质。类似地，外源RNA编码所述外源RNA存在其中的细胞中通常不表达的蛋白质。异源/外源核酸和蛋白质也可以被称作外来核酸或蛋白质。本领域技术人员会认识到对表达其的细胞是外来的任何核酸或蛋白质在本文被术语异源或外源核酸或蛋白质所涵盖。术语异源和外源也适用于核酸或氨基酸序列的非天然组合，即其中至少两个组合序列彼此是外源的组合。

如本文使用的，当提及生物体使用时，术语“非天然存在的”意指该生物体具有在所提及物种的天然存在的品系，包括所提及物种的野生型品系中通常未发现的至少一种遗传改变。遗传改变包括例如引入编码蛋白质或酶的可表达核酸的修饰、其它核酸添加、核酸缺失、核酸取代、或生物的遗传材料的其它功能破坏。此类修饰包括例如关于所提及物种的异源或同源多肽的编码区及其功能片段。另外的修饰包括例如其中修饰改变基因或操纵子表达的非编码调控区。对编码酶的核酸分子或其功能片段的遗传修饰可以对从其天然存在的状态改变的非天然存在的生物赋予生物化学反应能力或代谢途径能力。

如本文使用的，术语“可操作地连接”指多核苷酸(或多肽)元件在功能关系中的键合。当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系内时，它是“可操作地连接的”。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则它与编码序列是可操作地连接的。可操作地连接的意指被连接的DNA序列通常是邻接的，并且在有必要连接两个蛋白质编码区时，是邻接的且在读码框中

“表达盒”是指包含表达控制序列和待表达的核酸序列的核酸序列。

“表达控制序列”或“调节控制序列”是指调节与其可操作连接的核苷酸序列表达的核酸序列。

当表达控制序列控制和调节核苷酸序列的转录和/或翻译时，表达控制序列与核苷酸序列“可操作地连接”。因此，表达控制序列可包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子、内含子的剪接信号和终止密码子。

术语“表达控制序列”预期最少包括其存在设计为影响表达，并且还可以包括另外的有利组分的序列。例如，前导序列和融合配偶体序列是表达控制序列。该术语还可以包括核酸序列的设计，使得从序列中去除框内和框外的不期望的、潜在的起始密码子。它还可以包括核酸序列的设计，使得去除不期望的潜在剪接位点。它包括指导多聚A尾添加的序列或多聚腺苷酸化序列(pA)，所述多聚A尾即在mRNA的3'端处的一串腺嘌呤残基，被称为多聚A序列的序列。它还可以被设计为增强mRNA稳定性。实现转录和翻译稳定性的表达控制序列例如启动子、以及实现翻译的序列例如Kozak序列，在昆虫细胞中是已知的。表达控制序列可以具有此类性质，以便调节它与之可操作地连接的核苷酸序列，使得达到较低的表达水平或较高的表达水平。

术语“全病毒体”涉及病毒体颗粒，其包含封装侧翼为反向末端重复(ITR)序列的转基因DNA的细小病毒结构/衣壳蛋白(VP1:2:3)。术语“空病毒体”是指不包含细小病毒基因组物质的病毒体颗粒。在本发明的优选实施方案中，全病毒体与空病毒体的比率为至少1：50，更优选至少1：10，甚至更优选至少1：1。更优选地，不能检测到空病毒体，最优选地，不存在空病毒体。本领域技术人员将知道如何确定全病毒体与空病毒体的比率，例如通过将基因拷贝数除以具有组装AAV衣壳数的总颗粒(或总组装衣壳:基因组拷贝数)，因为每个病毒体将只存在一个基因组拷贝。本领域技术人员将知道如何确定这样的比率。例如，空病毒体与总衣壳的比率可以通过基因组拷贝的量(即，基因组拷贝数)除以总细小病毒颗粒的量(即，细小病毒颗粒数)，其中每毫升的基因组拷贝的量通过定量PCR测定，每毫升的总细小病毒颗粒的量通过酶免疫测定法(例如来自Progen)测定。

本文所用的术语“TripleBac”指用于在昆虫细胞中产生rAAV的杆状病毒载体系统，其需要共感染三种分离的杆状病毒载体，即分别针对Rep、Cap和Trans表达盒中的每一个的三种不同的杆状病毒载体。本文所用的术语“DuoBac”系统是指仅使用两种不同杆状病毒载体的系统，其中一种载体包括两个表达盒，例如，包括Cap和Rep表达盒或包括Cap和Trans盒。本文所用的术语“DuoDuoBac”是指使用两种不同的杆状病毒载体的系统，每种载体包括至少两种不同的表达盒，例如，一种载体包括Cap和Rep盒，而另一种载体包括Cap和Trans盒。

具体实施方式

细小病毒即AAV结构蛋白和非结构蛋白之间的表达动力学和比例对于从生产平台，特别是使用杆状病毒和昆虫细胞平台输出的载体的产量和质量是重要的。载体质量与全病毒体与空病毒体之间的比率密切相关，这有助于载体本身的效价。

本发明人通过包括1)使用两种DuoBac载体，即Cap-Rep杆状病毒载体和Cap-Trans杆状病毒载体(称作“DuoDuoBac”AAV生产，参见图1)，2)优化启动子/VP1起始密码子组合，和3)将单Rep表达盒替换为双Rep表达盒中的一或多种进一步优化在昆虫细胞中从杆状病毒载体产生rAAV。使用其中Cap-Rep杆状病毒载体与Cap-Trans杆状病毒载体结合的DuoDuoBac系统的优点是在AAV生产过程中实现了对Cap：Rep比的更多控制。以前的TripleBac AAV生产实验表明，改变Cap：Rep杆状病毒接种比例会影响总/全比例和AAV产量(以GC/mL计)。

本发明人已经发现，在rAAV生产期间增加Rep的量抑制了衣壳的形成和总/全比率，同时增加Cap的量增加了总/全比率以及产量。如上所述，本领域技术人员将知道，总/全比率是可用于表征AAV批处理的一个参数。本文所用的总/全比率是指DNA填充的AAV颗粒(以GC/mL表示)与AAV颗粒总数(以VP/mL表示)的比率。因此，较低的总/全比率意味着每全颗粒较少的空颗粒，反之亦然。降低所产生的AAV的总/全比可能对AAV产物是有益的，因为可以使用更少的颗粒来获得每千克相似量的基因组拷贝。低的总/全比也导致更均匀的产物分布，这有利于建立稳健的下游工艺。另外，由于减少了用于接种的杆状病毒的数量，因此可以探索更高的Cap：Rep比率，其通常不能接种在TripleBac系统中。在TripleBac系统中，接种的杆状病毒数量的减少意味着加入生产培养物中的总杆状病毒体积也较低。本领域已知不希望向AAV产物中添加高接种量。首先，因为大量杆状病毒难以健壮地产生，其次，因为大量杆状病毒添加到AAV生产中会抑制生产。据信这尤其是由于在生产培养物中加入了大量的用过的培养基。

在第一方面，因此，本发明提供了包含一种或多种核酸构建体的细胞，所述一种或多种核酸构建体包含：i)第一表达盒，所述第一表达盒包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种；ii)第二表达盒，其包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子，所述mRNA在细胞中的翻译产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种；iii)第三表达盒，包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第三启动子；以及，iv)核苷酸序列，其包含侧翼有至少一个细小病毒反向末端重复序列的转基因，其中，所述第一和第二表达盒中的至少一个与所述第三表达盒存在于第一核酸构建体上，并且其中，在用所述一种或多种核酸构建体转染所述细胞时，所述第一启动子先于所述第二和第三启动子有活性。所述细胞优选为昆虫细胞，如下面所定义的。编码其翻译产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种或细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的mRNA的核苷酸序列优选为如下文所述的核苷酸序列。编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列优选为如下文所述的核苷酸序列。包含侧翼有一个或多个细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列将在下面进一步详细描述。因此，第一核酸构建体优选为包含第一、第二和第三表达盒中的每一个的单一类型的核酸构建体。在一个实施方案中，第一核酸构建体不包含侧翼有一个或多个细小病毒反向末端重复序列的转基因。

因此，在一个实施方案中，包含侧翼有细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列存在于第二核酸构建体上。第二核酸构建体优选不同于第一核酸构建体。

在优选的实施方案中，第二核酸构建体还包含第四表达盒，其包含可操作地连接到编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的第四启动子，其中第一启动子先于第二，第三和第四启动子有活性。优选地，由第三和第四表达盒中的核苷酸序列编码的细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白是相同的。第三和第四启动子可以是相同的或它们可以是不同的启动子。在本发明的构建体中作为第一、第二、第三和/或第四启动子应用的合适启动子将在下面更详细地描述。

复制酶蛋白

细小病毒尤其是AAV复制酶，即Rep蛋白，是由rep基因盒编码的非结构蛋白。由于内源P19启动子，该基因产生具有不同长度的两种重叠的信使核糖核酸(mRNA)。这些mRNA各自可以剪接掉或不剪接掉，以最终生成四种Rep蛋白，Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78/68和Rep52/40对于ITR依赖性AAV基因组或转基因复制和病毒颗粒组装是重要的。Rep78/68充当病毒复制起始蛋白并充当病毒基因组的复制酶(Chejanovsky,N.,Carter,B.J..Mutation of a consensus purine nucleotide consensus binding site in theadeno-associated virus rep gene generates a dominant negative phenotype forDNA replication,J Virol.,1990,64:1764–1770,Hong,G.,Ward,P.,Berns,K.I.,Invitro replication of adeno-associated virus DNA,Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:4673–4677.Ni.T-H.,et al.,In vitro replication of adeno-associated virusDNA,J Virol.,1994,68:1128–1138)。Rep52/40蛋白是具有3'到5'极性的DNA解旋酶，并且在将病毒DNA包装到空衣壳内的过程中起关键作用，在其中它们被视为包装马达复合物的部分(The Rep52 Gene Product of Adeno-Associated Virus Is a DNA Helicase with3′-to-5′Polarity；Smith and Kotin,J.Virol.,1998,4874–4881,DNA helicase-mediated packaging of adeno-associated virus type 2 genomes into preformedcapsids.King,J.A.,et al.,EMBO J.,2001,20:3282-3291)。为了在昆虫细胞平台中从杆状病毒载体产生AAV，Rep68和Rep40两者的存在不是先决条件(Urabe等人，2002)。

根据本发明，所述细胞包含第一核酸构建体，所述第一核酸构建体至少包含用于表达细小病毒Rep蛋白的第一和第二表达盒。第一表达盒包括与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子，所述mRNA在细胞中的翻译产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种。

在一个优选的实施方案中，第一表达盒包括与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子，所述mRNA在细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种。因此，应当理解，编码细小病毒Rep78和/或68蛋白的核苷酸序列编码细小病毒Rep78和/或68蛋白的开放阅读框，该开放阅读框不具有影响部分外显子跳跃从而使得Rep52和/或40蛋白也从该mRNA翻译的次优(suboptimal)翻译起始(参见下文)。用于本发明的编码其在细胞中的翻译产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的mRNA的合适核苷酸序列可定义为核苷酸序列：a)其编码包含与SEQ ID NO.18的氨基酸序列具有至少50，60，70，80，88，89，90，95，97，98或99％序列相同性的氨基酸序列的多肽；b)其与SEQ ID NO.19的11-1876位的核苷酸序列具有至少50，60，70，80，81，82，85，90，95，97，98或99％的序列相同性；c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交；和d)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而不同于(c)的核酸分子的序列。应当理解，这些Rep78/60编码序列可以编码或不编码次优翻译起始。

因此，第一核酸构建体还包括用于表达细小病毒Rep52和/或40蛋白的第二表达盒。第二表达盒包括与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子，所述mRNA在细胞中的翻译产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种。

在优选的实施方案中，第二表达盒包括与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子，所述mRNA在细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种。因此可以理解，编码细小病毒Rep52和/或40蛋白的核苷酸序列不是也编码细小病毒Rep78和/或68蛋白的较大编码序列的一部分。优选编码其在细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的mRNA的核苷酸序列包含开放阅读框，所述开放阅读框由从所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的翻译起始密码子到最C-端氨基酸的氨基酸序列组成，更优选地，所述开放阅读框是编码mRNA的核苷酸序列中包含的唯一开放阅读框。编码其在细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的mRNA的合适核苷酸序列可定义为核苷酸序列：a)其编码包含与SEQ ID NO.20的氨基酸序列具有至少50，60，70，80，88，89，90，95，97，98或99％序列相同性的氨基酸序列的多肽；b)其与SEQ ID NO:21-25中任一个的核苷酸序列具有至少50，60，70，80，81，82，85，90，95，97，98或99％序列相同性；c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交；和d)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而不同于(c)的核酸分子序列。

优选地，所述核苷酸序列编码在昆虫细胞中产生细小病毒载体所需和足够的细小病毒Rep蛋白。

在一个实施方案中，Rep蛋白编码序列中除了Rep78和Rep52翻译起始位点之外的可能的假翻译起始位点被消除。在一个实施方案中，从Rep蛋白编码序列中删除昆虫细胞中可被识别的推定剪接位点。这些位点的消除将被本领域技术人员充分理解。

在另一个实施方案中，所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种和所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种包含共同氨基酸序列，所述共同氨基酸序列包含细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的从第二个氨基酸到最C-端氨基酸的氨基酸序列，其中细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种和细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列是至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同，且其中编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列以及编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列小于90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、60％相同。

在一个实施方案中，与编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的细胞密码子使用偏向性。或者其中与编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码细小病毒Rep78和68蛋白中至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的细胞密码子使用偏向性。在另一个实施方案中，编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列之间的密码子适应指数之差至少为0.2。

编码共同氨基酸序列的核苷酸序列对宿主细胞密码子使用的适应性可表示为密码子适应性指数(CAI)。优选地，密码子使用适于在其中表达具有共同氨基酸序列的Rep蛋白的昆虫细胞。通常这将是草地贪夜蛾属(Spodoptera)的细胞，更优选草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。因此，密码子使用优选适于草地贪夜蛾或苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)感染的细胞。密码子适应指数在本文中定义为基因的密码子使用针对高度表达的基因的密码子使用的相对适应性的测量。每个密码子的相对适应性(w)是每个密码子的使用/对于相同氨基酸最丰富的密码子的使用的比率。CAI指数定义为这些相对适应性值的几何平均值。排除非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)。CAI值范围从0到1，其中值越高指示最丰富密码子的比例越高(Sharp和Li，1987，Nucleic AcidsResearch 15:1281-1295；还参见：Kim等人，Gene.1997，25 199:293-301；zur Megede等人，Journal of Virology，2000，74:2628-2635)。

优选地，编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列的密码子适应指数之差至少为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7或0.8，其中更优选地，编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列的CAI为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0。

因此，在另一个实施方案中，所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种和所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种包含共同氨基酸序列，所述共同氨基酸序列包含所述细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的从第二个氨基酸到最C-端氨基酸的氨基酸序列，其中细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种与细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少90％相同，并且其中编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列和编码细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有小于90％相同性，且与编码细小病毒Rep78和68蛋白中至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的细胞密码子使用偏向性，或者其中与编码细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码细小病毒Rep78和68蛋白中至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的细胞密码子使用偏向性，其中优选地，编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列的密码子适应指数之差至少为0.2。细小病毒Rep蛋白的密码子优化将在下文中更详细地讨论。

细小病毒Rep蛋白的温度优化是指使用关于昆虫细胞生长和Rep发挥功能两者的温度的最佳条件。Rep蛋白可以例如在37℃具有最佳活性，而昆虫细胞可以在28℃最佳生长。Rep蛋白有活性且昆虫细胞生长的温度可以是30℃。在一个优选实施方案中，最佳温度大于27、28、29、30、31、32、33、34或35℃和/或小于37、36、35、34、33、32、31、30或29℃。

正如本领域技术人员所会理解的，与中至高Rep表达相比，全病毒体:空病毒体比率也可以通过减弱(例如通过较弱的启动子)Cap表达来提高。

在一个实施方案中，编码其在细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的mRNA的核苷酸序列包含完整的细小病毒p19启动子，正如例如存在于编码细小病毒Rep78和68蛋白的天然细小病毒核苷酸序列中。

在一个实施方案中，第一核酸构建体中的第一和第二表达盒被优化以在(昆虫)细胞中获得所需的Rep78与Rep52的摩尔比。优选地，第一核酸构建体在(昆虫)细胞中产生1：10至10：1，1：5至5：1或1：3至3：1的Rep78与Rep52的摩尔比。更优选地，第一核酸构建体产生Rep78与Rep52的摩尔比为至少1：2，1：3，1：5或1：10。Rep78和Rep52的摩尔比可以通过蛋白质印迹法测定，优选使用识别Rep78和Rep52共同表位的单克隆抗体，或者使用例如小鼠抗Rep抗体(303.9，Progen，德国；稀释1：50)。

Rep78与Rep52的所需摩尔比可通过选择第一和第二表达盒中的启动子来获得，如下文进一步描述的。可选择地或组合地，Rep78与Rep52的所需摩尔比可以通过使用降低细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的稳态水平的手段来获得。

因此，在一个实施方案中，编码细小病毒Rep78和68蛋白中至少一种的mRNA的核苷酸序列包括影响细小病毒Rep78和68蛋白中至少一种的降低的稳态水平的修饰。降低的稳态条件例如可以通过截短调节元件或上游启动子(Urabe等，Dong等人，上文)，加入蛋白质降解信号肽如PEST或泛素化肽序列，将起始密码子替换为更次优密码子，或通过引入如WO2002/024998中所述的人工内含子来实现。

在优选的实施方案中，编码细小病毒Rep78和68蛋白中至少一种的核苷酸序列包括以次优翻译起始密码子开始的开放阅读框。次优起始密码子优选是影响部分外显子跳跃的起始密码子。此处部分外显子跳跃被理解为意味着至少部分核糖体不在Rep78蛋白的次优起始密码子处起始翻译，而是可以在更下游的起始密码子处起始，其中更下游的(第一)起始密码子优选为Rep52蛋白的起始密码子。或者，编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的核苷酸序列包括以次优翻译起始密码子开始并且没有更下游的起始密码子的开放阅读框。当核苷酸序列在昆虫细胞中表达时，次优起始密码子优选影响部分外显子跳跃。

术语“次优起始密码子”这里不仅指三核苷酸的起始密码子本身，而且指其上下背景。因此，次优起始密码子可以由在次优背景(例如非Kozak背景)下的“最优”ATG密码子组成。然而，更优选的是次优起始密码子，其中三核苷酸起始密码子本身是次优的，即不是ATG。在此，次优被理解为意味着与正常ATG密码子相比，该密码子在其它相同背景中启动翻译的效率较低。优选地，次优密码子的效率低于正常ATG密码子在其它相同背景下的效率的90％、80％、60％、40％或20％。用于比较翻译起始的相对效率的方法对于本领域技术人员来说是已知的。优选的次优起始密码子可以选自ACG、TTG、CTG和GTG。更优选ACG。编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列在此被理解为编码在昆虫细胞中产生细小病毒载体所需和足够的非结构Rep蛋白如Rep78和Rep52蛋白的核苷酸序列。

衣壳蛋白

编码细小病毒衣壳(CAP)蛋白的核苷酸序列在此被理解为包含编码三种细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3中的一种或多种的核苷酸序列。细小病毒核苷酸序列优选来自依赖病毒(dependovirus)，更优选来自人或猴腺相关病毒(AAV)，最优选来自通常感染人(例如，血清型1，2，3a，3b，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13)或灵长类(例如血清型1和4)的AAV，其核苷酸和氨基酸序列列于Lubelski等人的US2017356008中，其全文通过引用并入本文。因此，如Lubelski等人的US2017356008所公开的，根据本发明的核酸构建体可包含AAV衣壳蛋白的完整开放阅读框。或者，该序列可以是人造的，例如，该序列可以是杂合形式或可以是密码子优化的，例如通过AcMNPV或Spodoptera frugiperda的密码子使用优化。例如，衣壳序列可以包含AAV1的VP2和VP3序列，而其余的VP1序列部分为AAV5。优选的衣壳蛋白是AAV5或AAV8，如SEQ ID NO.26所提供的，如Lubelski等人US2017356008所列。因此，在优选的实施方案中，AAV衣壳蛋白是根据本发明修饰的AAV血清型5或AAV血清型8衣壳蛋白。更优选地，AAV衣壳蛋白是根据本发明修饰的AAV血清型5衣壳蛋白。可以理解，衣壳蛋白的确切分子量以及翻译起始密码子的确切位置可以在不同的细小病毒之间不同。然而，本领域技术人员将知道如何从除AAV5以外的其它细小病毒中鉴定核苷酸序列中的相应位置。或者，编码AAV衣壳蛋白的序列是人工序列，例如作为定向进化实验的结果。这可以包括通过DNA改组，易错PCR，生物信息学合理设计，位点饱和诱变产生衣壳文库。所得的衣壳基于现有的血清型，但是含有改善这些衣壳特征的多种氨基酸或核苷酸改变。得到的衣壳可以是现有血清型的不同部分的组合，“改组的衣壳”或包含完全新颖的改变，即一个或多个氨基酸或核苷酸的添加、缺失或取代，这些改变按组组织或分布在基因或蛋白质的整个长度上。参见例如Schaffer and Maheshri；Proceedings of the 26th Annual International Conferenceof the IEEE EMBS San Francisco,CA,USA；September 1-5,2004,pages 3520-3523；Asuri et al.,2012,Molecular Therapy 20(2):329-3389；Lisowski et al.,2014,Nature 506(7488):382-386，通过引用并入本文。

在本发明的优选实施方案中，编码VP1衣壳蛋白的开放阅读框以非规范翻译起始密码子开始，所述非规范翻译起始密码子选自：ACG，ATT，ATA，AGA，AGG，AAA，CTG，CTT，CTC，CTA，CGA，CGC，TTG，TAG和GTG。优选地，非规范翻译起始密码子选自GTG，CTG，ACG和TTG，更优选地，非规范翻译起始密码子是CTG。

用于表达AAV衣壳蛋白的本发明核苷酸序列还优选包括编码AAV VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的至少一种修饰，所述修饰选自VP1开放阅读框的核苷酸位置12的G，核苷酸位置21的A，核苷酸位置24的C，其中核苷酸位置与野生型核苷酸序列的核苷酸位置相对应。“潜在/可能的假起始位置”或“潜在/可能的假翻译起始密码子”这里被理解为是指位于衣壳蛋白编码序列中的框内ATG密码子。消除其它血清型的VP1编码序列中可能的用于翻译的假起始位点将被本领域技术人员很好地理解，消除可在昆虫细胞中被识别的推定剪接位点也将被本领域技术人员理解。例如，重组AAV5不需要第12位核苷酸修饰，因为该核苷酸T不产生假ATG密码子。编码细小病毒衣壳蛋白的核苷酸序列的具体例子在SEQ ID NO.27-29中给出。编码本发明细小病毒Cap和/或Rep蛋白的核苷酸序列也可由它们分别与SEQIDNO.27-29和21-25的核苷酸序列在温和的或优选严格的杂交条件下杂交的能力定义。

衣壳蛋白编码序列可以以各种形式存在。例如可以使用衣壳蛋白VP1、-2和-3中的每一个的分离的编码序列，由此每一个编码序列可操作地连接到表达控制序列以在昆虫细胞中表达。更优选地，然而，第二表达盒包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含编码所有三种细小病毒(AAV)VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的单个开放阅读框，其中VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是次优起始密码子，所述次优起始密码子不是ATG，如Urabe等，(2002，上文)和W02002/046703中所述。VP1衣壳蛋白的次优起始密码子可以如上对于Rep78蛋白所定义。VP1衣壳蛋白的更优选的次优起始密码子可以选自ACG、TTG、CTG和GTG，其中CTG和ACG是最优选的。

在另一个实施方案中，第二表达盒包含核苷酸序列，该核苷酸序列包含编码所有三种细小病毒(AAV)VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的单个开放阅读框，其中用于VP1衣壳蛋白翻译的起始密码子是ATG，其中核苷酸序列中所编码的编码VP1衣壳蛋白的mRNA包含与VP1衣壳蛋白的开放阅读框不符合阅读框的替代起始密码子(如在WO2019/016349中描述)。优选地，替代起始密码子选自CTG，ATG，ACG，TTG，GTG，CTC和CTT，其中ATG是优选的。优选地，AAV衣壳蛋白是AAV5血清型衣壳蛋白。优选在该实施方案中，所述核苷酸序列包括以包含所述VP1的ATG翻译起始密码子的替代起始密码子开始的替代开放阅读框，由此优选地，替代起始密码子之后的替代开放阅读框编码最多20个氨基酸的肽。

包含在用于表达衣壳蛋白的第二表达盒中的核苷酸序列可进一步包含一个或多个如W02002/046703中所述的修饰。VP编码区的各种进一步修饰对于本领域技术人员是已知的，其可以增加VP和病毒体的产量，或者具有其它所需的作用，例如改变的向性或降低病毒体的抗原性。这些修饰在本发明的范围内。

在一个实施方案中，与VP2和VP3的表达相比，VP1的表达增加。VP1的表达可以通过补充VP1，通过将包含VP1核苷酸序列的单一载体导入昆虫细胞来增加，如在WO2002/084773中所述。

典型地，在本发明的方法中，至少一个包含编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的开放阅读框或至少一个包含包含编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框。在一个实施方案中，VP1、VP2和VP3衣壳蛋白或包含含有编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框的至少一个开放阅读框不包含人工内含子(或衍生自人工内含子的序列)。也就是说，用于编码Rep或Vp蛋白的至少一个开放阅读框将不包含人工内含子。人工内含子是指在腺相关病毒Rep或Cap序列中天然不存在的内含子，例如被工程化以允许在昆虫细胞内功能性剪接的内含子。因此，本文中的人工内含子包括野生型昆虫细胞内含子。本发明的表达盒可包含天然截短的内含子序列(天然是指天然存在于腺相关病毒中的序列)-这些序列不打算落在本文定义的人工内含子的含义内。

在本发明中，一种可能性是没有包含编码VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的开放阅读框和/或没有包含编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框包含人工内含子。

启动子

优选地，本发明编码AAV蛋白的核苷酸序列可操作地连接到表达控制序列以在昆虫细胞中表达。这些表达控制序列将至少包括在昆虫细胞中有活性的启动子。

适合用作第三和/或第四启动子，用于控制编码细小病毒衣壳蛋白的本发明核苷酸序列的转录的启动子例如是多面体启动子(polH)，如SEQ ID NO:30所示的polH启动子，及其缩短版本SEQ ID NO.31，如Lubelski等人US2017356008所公开的。然而，在昆虫细胞中具有活性并可根据本发明选择的其它启动子是本领域已知的，例如多面体蛋白(polH)启动子，P10启动子，P35启动子，4×Hsp27EcRE+最小HSP70启动子，deltaEl启动子，El启动子或IE-1启动子，以及上述参考文献中所述的其它启动子。在一个实施方案中，用于转录本发明编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的启动子是P10或polH。在另一个实施方案中，用于转录本发明编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的启动子是P10。在另一个实施方案中，用于转录本发明编码AAV衣壳蛋白的核苷酸序列的启动子是polH。

上述启动子也可用作第一和第二启动子，用于控制编码细小病毒Rep蛋白的本发明核苷酸序列的转录。在一个实施方案中，第一启动子是组成型启动子。本文所用术语“启动子”或“转录调节序列”是指具有控制一个或多个编码序列转录功能的核酸片段，并且位于编码序列转录起始位点转录方向的上游，并通过以下的存在进行结构鉴定：DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点，转录起始位点和任何其它DNA序列，包括但不限于转录因子结合位点，阻遏物和激活物蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的直接或间接调节启动子转录量的任何其它核苷酸序列。“组成型”启动子是在大多数组织中在大多数生理和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是生理上或发育上受调节的启动子，例如通过施用化学诱导剂调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特定类型的组织或细胞中具有活性。“隐蔽启动子(cryptic promoter)”是一种可被激活的被表观遗传沉默的启动子。

在一个优选的实施方案中，Rep78与Rep52蛋白的表达比例由以下的一或多种调节：(a)第二个启动子比第一个启动子强，例如由报道基因表达(例如荧光素酶或SEAP)或Northern印迹确定；(b)与第一表达盒相比，在第二表达盒上游存在核苷酸间隔区或更多和/或更强的增强子元件；(c)编码细小病毒Rep52蛋白的核苷酸序列与编码Rep78蛋白的核苷酸序列相比具有更高的密码子适应指数；(d)细小病毒Rep蛋白的温度优化；和与相应的野生型Rep蛋白相比在氨基酸序列中具有一个或多个改变的变体Rep蛋白，并且其中所述一个或多个氨基酸改变导致Rep功能活性的增加，如通过检测昆虫细胞中AAV产量的增加而评估的。通过检测昆虫细胞中AAV产量的增加而评估的具有增加的Rep功能活性的变体Rep蛋白的生成、选择和/或筛选方法可以通过描述于US20030134351中的适应于昆虫细胞的方法而获得，所述方法用于在哺乳动物细胞中获得相对于AAV产量具有增加的功能的变体Rep蛋白。与相应的野生型Rep蛋白相比，在氨基酸序列中具有一个或多个改变的变体Rep蛋白在这里被理解为包括与相应的野生型Rep蛋白的氨基酸序列相比，在变体氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失的Rep蛋白。

第二启动子比第一启动子强意味着编码Rep52蛋白的核苷酸序列比编码Rep78蛋白的核苷酸序列表达更多。可以使用同样强的启动子，因为与Rep78蛋白的表达相比，Rep52蛋白的表达将增加。启动子的强度可以通过在用于本发明方法的条件下获得的表达来确定。在一个实施方案中，第二、第三和第四启动子中的至少一个是诱导型启动子，优选选自polH和P10。在另一个实施方案中，诱导型启动子是在病毒感染周期的后期被诱导的病毒启动子，优选在病毒转染或感染细胞至少24小时后被诱导的病毒启动子。

在一个实施方案中，第一启动子选自deltaEl启动子或El启动子；并且，第二、第三和第四启动子选自polH启动子或P10启动子。在另一个实施方案中，第一启动子是deltaEl，第二启动子是polH。

在同一杆状病毒构建体上使用相同的杆状病毒启动子两次以驱动分离的AAV基因可导致启动子之间的竞争。这种竞争将导致Cap和Rep基因的表达降低，从而降低AAV产量。表达盒内相似元件的紧密接近可能增强这种效果。表达通过使用更强的起始密码子或交换驱动衣壳蛋白的启动子(例如polH到p10)，可以改善减弱的基因的表达。因此，在优选的实施方案中，第一、第二和第三启动子是不同的启动子，更优选地，第一、第二、第三和第四启动子是不同的启动子。

增强子

“增强元件”或“增强子”旨在定义增强启动子活性(即提高启动子下游序列的转录速率)的序列，其与启动子相反，不具有启动子活性，并且通常发挥功能而不管其相对于启动子的位置如何(即，启动子的上游或下游)。增强子元件在本领域中是众所周知的。可用于本发明的增强子元件(或其部分)的非限制性例子包括在昆虫细胞中发现的杆状病毒增强子和增强子元件。优选的是，与不存在增强子元件时基因的mRNA表达相比，增强子元件在细胞中增加与启动子可操作连接的基因的mRNA表达至少25％，更优选至少50％，甚至更优选至少100％，最优选至少200％。mRNA的表达可以通过例如定量RT-PCR来测定。

这里优选使用增强子元件来增强细小病毒Rep蛋白的表达。因此，在一个实施方案中，至少一个表达盒包含至少一种杆状病毒增强子元件和/或至少一种蜕皮激素应答元件，其中增强子元件优选选自hr1，hr2，hr3，hr4和hr5。优选所述增强子元件对杆状病毒立即早期蛋白(IE1)或其剪接变体(IE0)有反应，例如杆状病毒同源区(hr)增强子元件，其中优选所述杆状病毒是Autographa californica多壳核多角体病毒。IE1是高度保守的67kDa DNA结合蛋白，其在质粒转染试验中反式激活杆状病毒早期基因启动子并支持晚期基因表达(参见例如Olson等，2002，J Virol.，76：9505-9515)。AcMNPV IE1具有有助于启动子反式激活和DNA结合的可分离结构域。该582残基磷蛋白的N-末端一半含有残基8-118和168-222的转录刺激结构域。IE1与约28bp的不完整回文(28-mer)结合，该回文在分散于AcMNPV基因组中的多个同源区域(hr)内构成重复序列。hr 28-聚体是IE1-介导的增强子和来源特异性复制功能所需的最小序列基序。

在一个实施方案中，hr增强子元件是除hr2-0.9 US 2012/100606 A1)外的hr增强子元件。在一个进一步的实施方案中，hr增强子元件选自hr1、hr3、hr4b和hr5，其中hr4b和hr5是优选的，其中hr4b是最优选的。在一个替代实施方案中，hr增强子元件是变体hr增强子元件，例如非天然存在的设计元件。变体hr增强子元件优选包含hr 28聚体序列CTTTACGAGTAGAATTCTACGCGTAAAA(SEQ ID NO.32)的至少一个拷贝，和/或其中至少18、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸与序列CTTTACGAGTAGAATTCTACGCGTAAAA(SEQ ID NO.32)相同，且优选结合杆状病毒IE1蛋白，更优选结合AcMNPV IE1蛋白的序列的至少一个拷贝。变体hr增强子元件进一步优选地在功能上定义为当变体元件可操作地连接到包含可操作地连接到polH启动子的报道基因的表达盒时，a)在非诱导条件下，具有变体元件的盒产生比包含hr2-0.9元件代替变体元件、在其它方面相同的表达盒更少的报道分子转录物，或者具有变体元件的盒产生的报道分子转录物的量是由包含hr4b元件代替变体元件、在其它方面相同的表达盒产生的1/1.1、1/1.2、1/1.5、1/2、1/5或1/10；并且b)在诱导条件下，具有变体元件的盒产生的报道分子转录物的量是由包含hr4b或hr2-0.9元件代替变体元件、在其它方面相同的表达盒产生的至少50、60、70、80、90或100％。非诱导条件应理解为其中在其中测试盒的细胞中不存在IE1蛋白的条件，并且诱导条件应理解为其中存在足够的IE1蛋白，以用包含hr4b或hr2-0.9元件的参考盒获得最大报道分子表达的条件。变体hr增强子元件与杆状病毒IE1蛋白的结合可以通过使用如例如由Rodems和Friesen(J Virol.1995；69(9):5368-75)描述的迁移率变化测定进行测定。

病毒载体

本发明涉及细小病毒，特别是依赖病毒如感染性人或猿AAV及其组分(例如细小病毒基因组)，用作在哺乳动物细胞，优选人细胞中引入和/或表达核酸的载体的用途。特别地，本发明涉及当在昆虫细胞中产生时，此类细小病毒载体的生产率的改善。

本文中的生产率包括生产效价的改进和所得产物的质量的改进，例如提高了总/全比(包含核酸的颗粒数的量度)的产物。也就是说，最终产物可以具有增加比例的填充颗粒，其中填充意味着该颗粒包含核酸。

“细小病毒载体”定义为重组产生的细小病毒或细小病毒颗粒，其包含待在体内、离体或在体外递送到宿主细胞内的多核苷酸。细小病毒载体的实例包括例如腺伴随病毒载体。在本文中，细小病毒载体构建体指包含病毒基因组或其部分和转基因的多核苷酸。细小病毒科(Parvoviridae)的病毒是小DNA病毒。细小病毒科可以分为两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染无脊椎动物包括昆虫的浓病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒并且包括依赖病毒属(Dependovirus)。如从它们的属名可以推断的，依赖病毒属的成员是独特的，因为它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒的共感染用于细胞培养物中的生产性感染。依赖病毒属包括AAV，其通常感染人(例如血清型1、2、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13)或灵长类动物(例如血清型1和4)，以及感染其它温血动物的有关病毒(例如，牛科动物、犬科动物、马科动物和羊科动物的腺伴随病毒)。关于细小病毒和细小病毒科的其它成员的进一步信息在Kenneth I.Berns，"Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,"FieldsVirology中的第69章(第3版1996)中进行描述。为方便起见，本发明在本文中通过提及AAV进行进一步例示且描述，然而应理解，本发明并不限于AAV，而是可以同样地应用于其它细小病毒。因此，在一个实施方案中，细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种，细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种，细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白和至少一个细小病毒反向末端重复序列来自AAV，优选感染人的血清型。

所有已知AAV血清型的基因组组构是非常相似的。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。反向末端重复(ITR)侧接关于非结构复制(Rep)蛋白和结构病毒颗粒(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白(VP1、-2和-3)形成衣壳。末端145nt ITR是自互补的，并且这样组构，使得可以形成能量上稳定的分子内双链体，其形成T形发夹。这些发夹结构充当病毒DNA复制的起点，充当细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中的野生型(wt)AAV感染之后，Rep基因(即Rep78和Rep52)分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两种Rep蛋白在病毒基因组的复制和包装中均具有功能。Rep ORF中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已显示了，哺乳动物细胞中的编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA足以用于AAV载体产生。同样在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白足以用于AAV载体产生。三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3由来自p40启动子的单个VP读码框表达。哺乳动物细胞中的wtAAV感染依赖于两个剪接受体位点的交替使用和关于VP2的ACG起始密码子的次优利用的组合的衣壳蛋白产生。

“重组细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)在本文中指包含一种或多种目的多核苷酸序列、目的基因或“转基因”的载体，所述转基因的侧翼为至少一种细小病毒或AAV反向末端重复序列(ITR)。优选地，转基因的侧翼为ITR，在转基因的每一侧上一个。当存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，此类rAAV载体可以复制并包装到感染性病毒颗粒内。当rAAV载体掺入更大的核酸构建体内(例如，染色体中、或者另一种载体例如用于克隆或转染的质粒或杆状病毒中)时，那么rAAV载体通常被称为“原载体”，其在AAV包装功能和必要的辅助功能的存在下，可以通过复制和衣壳化进行“拯救”。

优选(ii)的核苷酸序列包括含有编码Rep78和Rep68蛋白中至少一种的核苷酸序列的开放阅读框。优选地，所述核苷酸序列属于相同的血清型。更优选地，核苷酸序列彼此不同之处在于它们可以是密码子优化的，AT优化的或GC优化的，以最小化或防止重组。优选地，第一表达盒包括编码细小病毒Rep蛋白的两个核苷酸序列，即第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。优选地，编码细小病毒Rep蛋白的共同氨基酸序列的第一和第二核苷酸序列的差异被最大化(即，核苷酸相同性通过以下一或多种最小化：a)改变编码细小病毒Rep共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的密码子偏向性；b)改变编码细小病毒Rep共有氨基酸序列的第二核苷酸序列的密码子偏向性；c)改变编码共同氨基酸序列的第一核苷酸序列的GC-含量；和d)改变编码共同氨基酸序列的第二核苷酸序列的GC-含量。密码子优化可基于用于本发明方法中的昆虫细胞，优选Spodoptera frugiperda的密码子使用来进行，如可在密码子使用数据库中找到(参见例如，http：///kazusa.or。jp/codon/)。用于密码子优化的合适的计算机程序对于本领域技术人员是可用的(参见，例如Jayaraj等，1995，Nucl.AcidsRes.33(9):3011-3016；和在互联网上)。或者，可以使用相同的密码子使用数据库手动进行优化。

转基因

在一个实施方案中，本发明涉及一种细胞，其中包含侧翼为细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列存在于第二核酸构建体(即不同于第一核酸构建体)上。在优选的实施方案中，包含侧翼为细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列存在于第二核酸构建体(即不同于第一核酸构建体)上。

在本发明的上下文中，“至少一个细小病毒反向末端重复核苷酸序列”应理解为意指回文序列，其包含大部分互补的、对称排列的序列，也被称为"A"、"B"和"C"区。ITR充当复制起点，在复制中具有“顺式”作用的位点，即作为用于反式作用复制蛋白例如如Rep 78(或Rep68)的识别位点，其识别回文以及对于回文内部的特定序列。ITR序列的对称性的一个例外是ITR的"D"区。它是独特的(在一个ITR内没有互补体)。单链DNA的切口在A区和D区之间的连接处发生。它是其中新的DNA合成起始的区域。D区通常位于回文的一侧，并且对核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的细小病毒通常具有两个ITR序列。然而，能够设计这样的ITR，使得在A区和D区的两条链上的结合位点对称地定位，在回文的每一侧上一个。在双链环状DNA模板(例如质粒)上，Rep78或Rep68辅助的核酸复制随后在两个方向上进行，并且单个ITR足以用于环状载体的细小病毒复制。因此，一种ITR核苷酸序列可以用于本发明的上下文中。然而，优选地，使用两种或另一偶数数目的常规ITR。最优选地，使用两种ITR序列。优选的细小病毒ITR是AAV ITR。更优选地，使用AAV2 ITR。出于安全原因，可能期望构建重组细小病毒(rAAV)载体，其在第二AAV的存在下最初引入细胞内之后无法进一步繁殖。如US2003148506中所述，可以通过使用具有嵌合ITR的rAAV来提供用于限制接受者中不期望的载体繁殖的此类安全机制。

关于在本文中侧翼为另一种元件的序列的术语“侧翼为”指示相对于序列在上游和/或下游，即5'和/或3'的一种或多种侧翼元件的存在。术语“侧翼为”并非预期指示序列必须是邻接的。例如，在编码转基因的核酸和侧翼元件之间可能存在插入序列。“侧翼”为两种其它元件(例如ITR)的序列指示一种元件定位于序列的5'，而另一种元件定位于序列的3'；然而，两者之间可能存在插入序列。在一个优选的实施方案中，(iv)的核苷酸序列在任一侧上侧翼为细小病毒反向末端重复核苷酸序列。

在本发明的实施方案中，包含侧翼为至少一个细小病毒ITR序列的转基因(编码目的基因产物或包含靶向目的基因的核苷酸序列)的核苷酸序列，优选变得掺入昆虫细胞中产生的重组细小病毒(rAAV)载体的基因组内。优选地，转基因编码用于在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物。优选地，包含转基因的核苷酸序列侧翼为两个细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列，并且其中所述转基因定位于两个细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列之间。优选地，编码目的基因产物(用于在哺乳动物细胞中表达)的核苷酸序列将掺入昆虫细胞中产生的重组细小病毒(rAAV)载体内，如果它定位于两个常规ITR之间、或者定位于用两个D区改造的ITR的任一侧上。

可以在本发明中用于在昆虫细胞中产生重组AAV病毒体的AAV序列可以衍生自任何AAV血清型的基因组。一般地，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平上具有显著同源性的基因组序列，提供一组相同的遗传功能，并且产生在物理和功能上基本等价的病毒体，并且通过实际上相同的机制复制且组装。关于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的概述，参见例如GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chlorini等人(1997，J.Vir.71:6823-33)；Srivastava等人(1983，J.Vir.45:555-64)；Chlorini等人(1999，J.Vir.73:1309-1319)；Rutledge等人(1998，J.Vir.72:309-319)；以及Wu等人(2000，J.Vir.74:8635-47)。任何AAV血清型都可以用作AAV核苷酸序列的来源用于本发明的上下文中。优选地，用于本发明的上下文中的AAVITR序列衍生自AAV1、AAV2、AAV4和/或AAV7。同样地，Rep(Rep78/68和Rep52/40)编码序列优选地衍生自AAV1、AAV2、AAV4和/或AAV7。然而，编码用于本发明的上下文中的VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的序列可以取自已知的42种血清型中的任一种，更优选取自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8.AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13或通过例如衣壳改组技术和AAV衣壳文库获得的新近开发的AAV样颗粒，或者取自新近且合成设计、开发或进化的衣壳，例如Anc-80衣壳。

AAV Rep和ITR序列在大多数血清型中是特别保守的。各种AAV血清型的Rep78蛋白是例如多于89％相同的，并且在AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之间在基因组水平上的总核苷酸序列相同性为82％左右(Bantel-Schaal等人，1999，J.Virol.，73(2):939-947)。此外，已知许多AAV血清型的Rep序列和ITR在哺乳动物细胞中的AAV颗粒产生方面有效地交叉互补(即功能上取代)来自其它血清型的相应序列。US2003148506报道了AAV Rep和ITR序列还有效地交叉互补昆虫细胞中的其它AAV Rep和ITR序列。

已知AAV衣壳蛋白(也称为VP蛋白)决定AAV病毒粒子的细胞向性。VP蛋白编码序列的保守性明显低于不同AAV血清型中的Rep蛋白和基因。Rep和ITR序列交叉互补其它血清型的相应序列的能力允许产生假型rAAV颗粒，其包含一种血清型(例如AAV3)的衣壳蛋白以及另一种AAV血清型(例如AAV2)的Rep和/或ITR序列。此类假型rAAV颗粒是本发明的部分。

修饰的"AAV"序列也可以用于本发明的上下文中，例如用于昆虫细胞中的rAAV载体产生。此类修饰的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13 ITR、Rep或VP具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多的核苷酸和/或氨基酸序列相同性的序列(例如，具有约75-99％的核苷酸序列相同性的序列)，可以用于代替野生型AAV ITR、Rep或VP序列。

尽管在许多方面与其它AAV血清型相似，但AAV5与其它人和猿AAV血清型的区别大于其它已知的人和猿血清型。鉴于此，rAAV5的产生可以不同于昆虫细胞中的其它血清型的产生。当本发明的方法用于产生rAAV5时，优选的是一种或多种构建体(在多于一种构建体的情况下共同地)包括包含AAV5 ITR的核苷酸序列，包含AAV5 Rep编码序列的核苷酸序列(即核苷酸序列包含AAV5 Rep78)。此类ITR和Rep序列可以根据需要进行修饰，以获得在昆虫细胞中的rAAV5或假型rAAV5载体的高效生产。例如，可以修饰Rep序列的起始密码子，可以修饰或消除VP剪接位点，和/或可以修饰VP1起始密码子和附近的核苷酸，以改善昆虫细胞中的rAAV5载体产生。

典型地，感兴趣的基因产物，包括ITR，其长度为5000个核苷酸(nt)或更短。在另一个实施方案中，过大的DNA分子，即超过5000nT的长度，可以通过使用本发明所述的AAV载体在体外或体内表达。过大DNA在此被理解为超过5.5kbp的最大AAV包装极限的DNA。因此，产生能够产生通常由大于5.0kb的基因组编码的重组蛋白的AAV载体也是可行的。

包含如上文定义的转基因的核苷酸序列因此可以包含编码目的基因产物的核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达)或靶向目的基因的核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中沉默所述目的基因)，并且可以这样定位，使得它将掺入昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体内。在本发明的上下文中，应理解，“目的基因产物”将在其中表达或沉默的特别优选的哺乳动物细胞是人细胞。可以掺入任何核苷酸序列，用于在用按照本发明产生的重组细小病毒(rAAV)载体转染的哺乳动物细胞中的稍后表达。核苷酸序列可以例如编码蛋白质，或者它可以表达RNAi试剂，即能够进行RNA干扰的RNA分子，例如shRNA(短发夹RNA)或siRNA(短干扰RNA)。"siRNA"意指其为短长度双链RNA的小干扰RNA，其在哺乳动物细胞中是无毒的(Elbashir等人，2001，Nature 411:494-98；Caplen等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9742-47)。在一个优选的实施方案中，包含转基因的核苷酸序列可以包含两种编码核苷酸序列，其各自编码用于在哺乳动物细胞中表达的一种目的基因产物。编码目的产物的两种核苷酸序列各自这样定位，使得它将掺入昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体内。

用于在哺乳动物细胞中表达的目的产物可以是治疗性基因产物。治疗性基因产物可以是多肽或RNA分子(si/sh/miRNA)，或当在靶细胞中表达时提供所需疗效的其它基因产物。所需的疗效可以是例如不期望活性(例如VEGF)的消除、遗传缺陷的互补、导致疾病的基因的沉默、酶促活性的缺陷的恢复或任何其它疾病缓解效应。治疗性多肽基因产物的实例包括但不限于生长因子、形成凝血级联的部分的因子、酶、脂蛋白、细胞因子、神经营养因子、激素和治疗性免疫球蛋白及其变体。治疗性RNA分子产物的实例包括有效沉默疾病的miRNA，所述疾病包括但不限于聚谷氨酰胺疾病、血脂异常或肌萎缩侧索硬化(ALS)。

可以使用按照本发明产生的重组细小病毒(rAAV)载体治疗的疾病并无特别限制，除一般具有遗传原因或基础外。例如，可以用所公开的载体治疗的疾病可以包括但不限于急性间歇性卟啉病(AIP)、年龄相关性黄斑变性、阿尔茨海默氏病、关节炎、巴顿病、卡纳万病、1型瓜氨酸血症、Crigler Najjar、充血性心力衰竭、囊性纤维化、杜兴氏肌营养不良、血脂异常、I型糖原贮积病(GSD-I)、血友病A型、血友病B型、遗传性肺气肿、纯合型家族性高胆固醇血症(HoFH)、亨廷顿氏病(HD)、莱伯氏先天性黑蒙症、甲基丙二酸血症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTC)、帕金森氏病、苯丙酮尿症(PKU)、脊髓性肌萎缩、瘫痪、威尔逊氏病、癫痫、庞贝氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、泰-萨克斯病、高草酸尿症9PH-1)、脊髓小脑性共济失调1型(SCA-1)、SCA-3、u-肌营养不良蛋白、戈谢氏II型或III型、致心律失常性右室心肌病(ARVC)、法布里病、家族性地中海热(FMF)、丙酸血症、脆性X染色体综合征、瑞特综合征、尼曼-皮克二氏病和克拉伯病。待表达的治疗性基因产物的实例包括N-乙酰氨基葡糖苷酶、α(NaGLU)、Treg167、Treg289、EPO、IGF、IFN、GDNF、FOXP3、因子VIII、因子IX和胰岛素。

可替代地或除作为另一种基因产物之外，包含如上文定义的转基因的核苷酸序列可以进一步包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽充当选择标记物蛋白质以评价细胞转化和表达。用于此目的的合适的标记物蛋白质是例如荧光蛋白GFP、以及可选择标记物基因HSV胸苷激酶(用于在HAT培养基上的选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于在潮霉素B上的选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于在G418上的选择)和二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于在氨甲蝶呤上的选择)、CD20、低亲和力神经生长因子基因。用于获得这些标记物基因的来源及其使用方法在Sambrook和Russel，同上中提供。此外，包含如上文定义的转基因的核苷酸序列可以包含编码多肽的进一步的核苷酸序列，所述多肽可以充当故障安全机制，其允许从用本发明的重组细小病毒(rAAV)载体转导的细胞治愈对象，如果认为有必要的话。此类核苷酸序列，经常被称为自杀基因，编码能够将前药转换成有毒物质的蛋白质，所述有毒物质能够杀死蛋白质在其中表达的转基因细胞。此类自杀基因的合适实例包括例如大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因，或者来自单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶基因之一，在这种情况下，更昔洛韦可以用作前药以杀死对象中的转基因细胞(参见例如Clair等人，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31:844-849)。

如上定义的核苷酸序列包括例如野生型细小病毒序列的用于在昆虫细胞中的适当表达的各种修饰，通过应用众所周知的基因工程技术来实现，如例如在Sambrook和Russell(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York中描述的。编码区的各种进一步修饰是技术人员已知的，其可以增加编码蛋白质的产率。这些修饰在本发明范围内。

细胞

根据本发明的细胞可以是适于生产异源蛋白的任何细胞。优选地，所述细胞是昆虫细胞，更优选地，所述昆虫细胞允许用于杆状病毒载体的复制，并可保持在培养物中。更优选地，昆虫细胞还允许重组细小病毒载体，包括rAAV载体的复制。草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、果蝇属(Drosophila)细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生的细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自对杆状病毒感染敏感的昆虫物种的细胞，包括例如S2(CRL-1963，ATCC)、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、Ha2302、Hz2E5、High Five(Invitrogen，CA，USA)和

(US 6,103,526；Protein Sciences Corp.，CT，USA)。根据本发明的优选昆虫细胞是用于产生重组细小病毒载体的昆虫细胞。

本领域普通技术人员知道如何将核苷酸序列稳定地引入昆虫基因组内，以及如何鉴定在基因组中具有此类核苷酸序列的细胞。例如，可以通过使用包含与昆虫基因组的区域高度同源的核苷酸序列的载体来帮助掺入基因组内。特定序列例如转座子的使用是将核苷酸序列引入基因组内的另一种方式。掺入基因组内可以通过一个或多个步骤。提及术语“整合的”对于本领域技术人员已知也意指“稳定整合的”。

在一个实施方案中，提供了根据本发明的细胞，其中所述第一和第二核酸构建体中的至少一种稳定整合在所述细胞的基因组中。在一个实施方案中，第一核酸构建体稳定地整合在细胞基因组中。在另一个实施方案中，第二核酸构建体稳定地整合在细胞基因组中。在又一个实施方案中，第一和第二核酸构建体稳定地整合在细胞基因组中。

用于培养中的昆虫细胞的生长条件、以及培养中的昆虫细胞中的异源产物生产是本领域众所周知的，并且例如在上文引用的关于昆虫细胞的分子改造的参考文献中进行描述(也参见WO2007/046703)。

“昆虫细胞相容性载体”或“载体”应理解为能够生产性转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。可以采用任何载体，只要它是昆虫细胞相容的。载体可以整合到昆虫细胞基因组内，但昆虫细胞中的载体的存在无需是永久的，并且也包括瞬时附加型载体。可以通过任何已知的手段，例如通过细胞的化学处理、电穿孔或感染来引入载体。在一个优选的实施方案中，载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在一个更优选的实施方案中，载体是杆状病毒，即核酸构建体是杆状病毒表达载体。杆状病毒表达载体及其使用方法例如在以下中进行描述：Summers和Smith，1986，“AManual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures”，Texas Agricultural Experimental Station Bull.No.7555，College Station，Tex.；Luckow，1991，In Prokop等人，“Cloning and Expression of Heterologous Genes inInsect Cells with Baculovirus Vectors'Recombinant DNA Technology andApplications”，97-152；King和Possee，1992，“The baculovirus expression system”，Chapman和Hall，United Kingdom；O'Reilly，Miller和Luckow，1992，“BaculovirusExpression Vectors:A Laboratory Manual”，New York；Freeman和Richardson，1995，“Baculovirus Expression Protocols”，Methods in Molecular Biology，第39卷；US 4,745,051；US2003148506；以及WO 03/074714。

用于产生重组细小病毒(rAAV)载体的昆虫细胞中使用的核酸构建体的数目在本发明中不受限制。然而，在优选的实施方案中，在昆虫细胞中使用不超过两种核酸构建体来生产重组细小病毒(rAAV)载体。优选地，两种核酸构建体是如上文所定义的第一和第二核酸构建体。优选地，第一核酸构建体是Rep-Cap构建体，其因此优选地包含第一、第二和第三表达盒，其中第一和第二表达盒分别编码Rep78/68蛋白和Rep52/40蛋白，且第三表达盒编码Cap蛋白。第二核酸构建体是Trans构建体或Cap-Trans构建体，因此至少包括包含侧翼为至少一个细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列。

然而，在优选的(DouDuoBac)实施方案中，第二核酸构建体优选还包括Cap蛋白的表达盒，即第四表达盒。在优选的DouDuoBac实施方案中，第一核酸构建体包含：i)第一表达盒，其包含可操作地连接到编码细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的核苷酸序列的dEl启动子；ii)第二表达盒，其包含与编码细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的核苷酸序列可操作地连接的polH启动子；和iii)第三表达盒，其包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，优选编码AAV5 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的polH启动子，其中更优选VP1起始密码子为ACG。第二核酸构建体包含侧翼为细小病毒反向末端重复序列的转基因，并且进一步包含可操作地连接到编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，优选编码AAV5 VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列的polH启动子的第四表达盒，其中更优选VP1起始密码子为ACG。在该实施方案中，第四表达盒因此优选地与第三表达盒相同。优选在该实施方案中，第二和第一核酸构建体以5：1至1：10的摩尔比存在于细胞中和/或转染入细胞中，优选摩尔比为1：1-1：8，更优选1：2-1：6，最优选1：3-1：5。例如，第一核酸构建体可以是DuoBac CapRep6(SEQIDNO.10)，第二核酸构建体可以是DuoBac CapTrans1(SEQIDNO.12)，其中第一和第二构建体优选以3：1摩尔比存在。因此可以理解，“Trans”在第二个构建体中，可以是两个ITR之间的任何目的基因。

编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列在此被理解为编码在昆虫细胞中产生细小病毒载体所需的和足以产生细小病毒载体的非结构Rep蛋白如Rep78或Rep68和/或Rep52或Rep40蛋白的核苷酸序列。细小病毒核苷酸序列优选来自依赖病毒，更优选来自人或猴腺相关病毒(AAV)，最优选来自通常感染人(例如血清型1，2，3a，3b，4，5，6，8和9)或灵长类(例如血清型1和4)的AAV。编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的例子如SEQ ID NO:33所示，其描述了AAV血清型-2序列基因组的编码Rep蛋白的一部分。Rep78编码序列包括核苷酸11-1876，Rep52编码序列包括核苷酸683-1876，也分别在SEQ ID NO.33和19中描述。可以理解，Rep78和Rep52蛋白的确切分子量以及翻译起始密码子的确切位置可以在不同的细小病毒之间不同。然而，本领域技术人员将知道如何从除AAV-2以外的其它细小病毒中鉴定核苷酸序列中的相应位置。

优选本发明的核酸构建体是昆虫细胞相容性载体。“昆虫细胞相容性载体”或“载体”被理解为足以在昆虫细胞产生细小病毒载体，如Rep78或Rep68和/或Rep52或Rep40蛋白中。细小病毒核苷酸序列优选来自依赖病毒，更优选来自人或猴腺相关病毒(AAV)，最优选来自通常感染人的AAV(例如，血清型1，2，3a，3b，4，5和6)或灵长类(例如血清型1和4)。编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的例子如SEQ ID NO.33和19所示。

因此，在另一个实施方案中，细胞为昆虫细胞，并且其中所述第一和第二核酸构建体中的至少一种是昆虫细胞相容性载体，优选杆状病毒载体，且至少一个表达盒包含至少一个杆状病毒增强子元件和/或至少一个蜕皮激素(ecdysone)应答元件，其中增强子元件优选选自hr1，hr2，hr2.09，hr3，hr4，hr4b和hr5。在优选的实施方案中，本发明涉及一种昆虫细胞，其包含不超过一种类型的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含编码细小病毒Rep蛋白的单一开放阅读框。优选地，单个开放阅读框编码一种或多种细小病毒Rep蛋白，更优选地，开放阅读框编码所有细小病毒Rep蛋白，最优选地，开放阅读框编码全长Rep78蛋白，优选地从中至少Rep52和Rep78蛋白两者可以在昆虫细胞中表达。这里应当理解，昆虫细胞可以包含多于一个拷贝的单一类型的核苷酸序列，例如在多拷贝附加体载体中，但是这些基本上是一种相同核酸分子的多个拷贝，或者至少是编码一种相同Rep氨基酸序列的核酸分子，例如仅由于遗传密码的简并性而彼此不同的核酸分子。只有编码细小病毒Rep蛋白的单一类型核酸分子的存在避免了同源序列之间的重组，这可能存在于包含Rep序列的不同类型载体中，这可能导致影响昆虫细胞中细小病毒生产水平(其稳定性)的缺陷Rep表达构建体。

方法

另一方面，本发明提供了一种在细胞中生产重组细小病毒病毒体的方法，包括以下步骤：a)在产生重组细小病毒病毒体的条件下培养本文定义的细胞；和b)回收重组细小病毒病毒体。

回收优选包括使用抗AAV抗体，优选固定化抗体亲和纯化包含重组细小病毒(rAAV)载体的病毒体的步骤。抗AAV抗体优选为单克隆抗体。特别合适的抗体是单链骆驼抗体或其片段，例如可从骆驼或骆驼获得(参见例如Muyldermans，2001，Biotechnol.74:277-302)。用于亲和纯化rAAV的抗体优选是特异性结合AAV衣壳蛋白上的表位的抗体，其中表位优选是存在于多于一种AAV血清型的衣壳蛋白上的表位。例如抗体可以基于与AAV2衣壳的特异性结合而被产生或选择，但同时它也可以特异性结合AAV1、AAV3和AAV5衣壳。

在一个实施方案中，细胞是昆虫细胞和/或其中细小病毒病毒体是AAV病毒体。

在另一个实施方案中，其中步骤b)中重组细小病毒病毒体的回收包括使用固定化的抗细小病毒抗体亲和纯化病毒体或用标称孔径为30-70nm的过滤器过滤中的至少一种，所述抗细小病毒抗体优选单链骆驼抗体或其片段。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种在细胞中产生重组细小病毒病毒体的方法，包括以下步骤：

a)在产生重组细小病毒病毒体的条件下培养本文定义的细胞；以及，

b)回收重组细小病毒病毒体，

其中在步骤b)中回收重组细小病毒病毒体包括使用固定化的抗细小病毒抗体亲和纯化病毒体或用标称孔径为30-70nm的过滤器过滤中的至少一种，所述抗细小病毒抗体优选单链骆驼抗体或其片段。

在另一方面，本发明涉及在本发明的上述方法中产生的一批细小病毒病毒体。“一批细小病毒病毒体”本文定义为在同一轮生产中，任选地每容器昆虫细胞中产生的所有细小病毒病毒体。在一个优选的实施方案中，本发明的一批细小病毒病毒体包括如上所述的全病毒体:总病毒体比率和/或如上所述的全病毒体:空病毒体比率。

构建体和试剂盒

在另一个方面，本发明提供如本文所定义的第一核酸构建体。

在一个实施方案中，提供了如本文所定义的第二核酸构建体。

在另一个方面，本发明提供了一种包括至少一种如本文所定义的第一核酸构建体和一种如本文所定义的第二核酸构建体的套组试剂盒。该试剂盒可进一步包含昆虫细胞和/或本文所定义的核苷酸序列和/或编码杆状病毒辅助功能的核酸序列以在昆虫细胞中表达。

本发明的优点

本发明的发明人以两种方式进一步优化了诱导型质粒载体(表达细小病毒复制酶蛋白)的设计。

首先，通过考察备选杆状病毒启动子在调节AAV基因表达中的用途。迄今为止，多面体启动子(polH)是在AAV生产中，在BEV设定中最广泛研究的启动子(van Oers,M.M.,etal.,J Gen Virol.2015 Jan；96(Pt 1):6-23)。尽管已经报道了可供选择的晚期启动子，例如P10，与polH共享宿主因子(Ghosh,S.,et al.,J Virol.1998 Sep；72(9):7484-93)，据报道其它杆状病毒启动子表现出不同的诱导强度和时间分布(Dong,Z.Q.et al.,J BiolEng.2018 Dec 4；12:30；Lin,C.H&Jarvis,D.L.,J Biotechnol.2013 May 10；165(1):11-7；Martinez-Solis,M.,et al.,PeerJ.2016 Jun 28；4:e2183)。然而，迄今为止还没有报道过它们在昆虫细胞中产生AAV的潜在用途。

其次，在本研究中还探索了对宿主细胞非常有毒的AAV Rep表达的更严格的调节。杆状病毒同源区(hr)2或hr2.09增强子序列与polH的联合使用已经成为可诱导的OneBac平台的默认分子设计(Aslanidi,G.,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Mar 31；106(13):5059-64)。在此，我们检查了可供选择的杆状病毒启动子与其它杆状病毒hr的组合在用于更新OneBac平台，特别是OneBac Cap Trans的目的中的潜在用途。通过研究不同的杆状病毒启动子和增强子，也在不同的分子构象中，我们的目的是优化AAV基因(Cap、Rep)的表达，其最终能够带来稳定和健壮的AAV生产平台，产生具有高滴度的高质量AAV批次。

因此，本发明提供了具有相似或不同表达强度和时间谱的可选择的和非保守的杆状病毒启动子(p10，39K，p6.9，pSEL120)的用途，以产生调节野生型(WT)单盒或裂盒AAVRep或其它AAV基因表达的诱导型表达构建体。这使得能够产生诱导型质粒载体构建体，其具有在重组杆状病毒反式激活时不易发生顺式反式启动子竞争的优点。另外，本发明提供的新的非/hr2-0.9杆状病毒hr增强子在非诱导条件下泄漏较少，从而提供了更紧密地调节来自诱导型质粒载体构建体的毒性Rep蛋白的优点。

本发明的其它优点包括与OneBac和昆虫细胞平台相比，AAV生产产量和质量提高；当关闭时，产生诱导型启动子不表达毒性AAV基因，例如Rep，这允许更活性和稳定的AAV包装细胞；以及将分裂盒Rep AAV设计适配成诱导型质粒载体。

附图说明

图1：在TripleBacAAV生产中，在expresSF+昆虫细胞中共感染三种杆状病毒，包括Rep、Cap和转基因盒。相反，在DuoBac方法中，Cap和Rep盒组合在一个杆状病毒基因组上，并与含有转基因盒的分离的杆状病毒共同感染到expresSF+昆虫细胞中。在DuoDuoBac生产过程中，Cap-Rep和Cap-Trans表达盒组合在两种杆状病毒上，并在expresSF+细胞中共感染。

图2：实施例中使用的Cap-Rep和Cap-Trans DuoBac杆状病毒构建体以及使用的单表达盒杆状病毒的表达盒和方向的示意图。

图3：在BacCap2或BacCap3 DuoBac AAV产物的CLB中测定的病毒滴度。以5％CaP-Rep杆状病毒储备和1％转基因储备的体积比进行生产。用构建体DuoBac CapRep2、3、4和7获得高滴度，而从DuoBac CapRep1和6获得低滴度。

图4：wtAAV5和AAV2/5 DuoBac产物的总/全比。在由所有DuoBac构建体产生的AAV中观察到低的总/全比(<2)。这些总全率明显低于通常在TripleBac AAV生产中观察到的总全率(>5总/全，表2)。

图5：SDS PAGE凝胶电泳用由DuoBac CapRep 1-5制备的纯化的AAV材料。由于产率低，不包括构建体DuoBac CapRep6。DuoBac CapRep3和DuoBac CapRep7显示1：1：10的正确衣壳化学计量，而DuoBac CapRep2，4和5显示次优衣壳化学计量(DuoBac CapRep2、4、5的低VP1，在DuoBac CapRep1的情况下非常高VP1)。

图6：DuoBac构建体DuoBac CapRepL-6产生的AAV的GC/IP。产生的AAV的感染性反映了DuoBac构建体的VP123衣壳化学计量。这里，低VP1导致对DuoBac CapRep2、4和5的低感染性(高GC/IP)，而高或正常VP1导致对DuoBac CapRep3和1的高感染性(低GC/IP)。

图7：SDS PAGE凝胶电泳用DuoBac和TripleBac生产方法制备的纯化的AAV材料。在切换到DuoBac方法(泳道1-2，11，13相对泳道5-10，12，14)之后，维持AAV的理想衣壳VP1、2、3蛋白化学计量为1：1：10。

图8：DuoBac和TripleBac AAV产物之间的总/全比的比较。

图9：SDS PAGE凝胶电泳用纯化的DuoDuoBac和TripleBac生产AAV。当比较用DuoDuoBac和TripleBac方法制备的AAV时，观察到相似的1：1：10的VP123化学计量。

图10：从用DuoDuoBac或TripleBac生产方法生产的AAV获得的基因组AAV DNA进行甲醛凝胶电泳。使用DuoDuoBac以不同Rep:Cap比产生的AAV具有封装到AAV颗粒中的相似基因组DNA。DuoDuoBac AAV片段与TripleBac生产后发现的DNA片段匹配。主条带长2.4kb，代表转基因的一个拷贝。

实施例

在所给出的实施例中，发明人旨在检查使用双表达盒(例如，Bac.Cap-Trans和Bac.Cap-Rep或Bac.Trans和Bac.Cap-Rep)对产物质量和载体产量的影响。在实施例1中，发明人表征了双Rep-Cap盒的分子优化对wtAAV5和AAV2/5产量和产物质量的影响。在实施例2中，发明人用优化的wtAAV5 Cap-Rep和转基因杆状病毒(DuoBac)生产wtAAV5，并将其与用三重感染生产的wtAAV5进行比较。在实施例3中，发明人外推DuoBac产率相对于三元BAC系统具有更大的生产规模。最后，在实施例4中，发明人检查了使用Cap-Trans和Cap-Rep双杆状病毒(DuoDuoBac)的各种组合对质量和载体产量的影响，并将其与三重感染wtAAV5产物进行比较。

简言之，Cap-Rep DuoBac构建体(DuoBac CapRep 1-7)包括以下物质的组合：

在多面体蛋白(POLH)或P10启动子和Rep盒的控制下的Cap盒(wtAAV5或AAV2/5)。这里，Rep盒是分体式设计，Rep52和Rep78分别由polH和dlEl启动子控制。DuoBacCapTrans1将受POLH启动子控制的wtAAV5 Cap盒与BacTrans4转基因盒结合。对于DuoBac和TripleBac AAV生产也需要单表达盒构建体。这些构建体总是保持相同，是BacCap1或BacCap2，(wtAAV5)和BacRep1，裂-Rep盒。图2总结了盒设计中所用的方向，而表1a和1b总结了每个构建体所用的不同启动子/起始密码子组合。

表1A:CAP-Rep DuoBac启动子/每个构建体的起始密码子组合。

表1B:CAP-Trans DuoBac转基因和CAP启动子/起始密码子组合

细胞培养和杆状病毒扩增

将expresSF+昆虫细胞保持在28℃，135rpm的摇瓶中的SF-900II SFM培养基(GIBCO)中。为每个实施例的生产产生新鲜杆状病毒。这里，将expresSF+细胞以3ul储备/mL昆虫细胞的浓度接种到冷冻杆状病毒储备中。感染开始72小时后，通过以1900×g离心细胞15分钟并保存细胞上清液，收获新鲜杆状病毒。

AAV的生产和纯化

通过将expresSF+昆虫细胞与包括双表达盒(CaP-Rep和CaP-Trans)或单表达盒(CaP，Rep，Trans)或双表达盒(CaP-Rep)和单(Trans)表达盒的新鲜扩增的重组杆状病毒的各种组合体积共感染来产生AAV材料。具体比例在实施例中描述。28℃孵育72小时后，在裂解缓冲液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl，1mM MgCl₂，1％Triton X-100，pH＝8.5)中裂解细胞1小时。接下来，基因组DNA用苯甲酰酶(Merck)在37℃消化1小时，之后将细胞碎片以1900×g沉淀15分钟(粗裂解物样品)。将上清液在4℃保存，直到纯化开始。然后通过与AVBSepharose(GE Health)分批结合从粗裂解物(CLB)中纯化AAV。简而言之，AVB Sepharose树脂在0.2M HPO₄缓冲液pH＝7.5中洗涤，然后将澄清的粗裂解物加入树脂中，并在室温(RT)下在以85rpm摇动的培养器中培养2小时。在0.2M HPO₄ pH＝7.5缓冲液中再次洗涤树脂。接着，加入0.2M甘氨酸pH＝2.5从树脂中洗脱结合的病毒。通过加入0.5M Tris-HCl pH＝8.5，洗脱病毒的pH立即被中和，并在-20℃保存，直到进一步使用。

用Q-PCR滴定和用A260/A280或HPLC测定总/全比

粗裂解物和纯化的AAV批料的病毒效价通过Q-PCR测定。用对转基因启动子区特异的引物对Q-PCR进行操作。Q-PCR在Applied Biosystems 7500 fast Q-PCR系统上运行。纯化的AAV批料的总/全比用UV/VIS分光光度法测定。将1ul 10％SDS与100ul纯化的AAV混合，并在75℃孵育10分钟。热处理后，在纳米液滴上测量260和280nm处的吸光度。使用Sommeret al.2003所述的计算计算AAV材料的总/全比。或者，通过HPLC测量总颗粒。这里，将纯化的AAV材料装载到尺寸排阻柱上。通过积分衣壳峰曲线下的面积来确定总颗粒。随后通过将总颗粒除以通过Q-PCR测量的病毒滴度来计算总/全比。

纯化的AAV批料的总蛋白凝胶

将纯化的AAV批料稀释在补充有10％的β-巯基乙醇(Bio-Rad)的4X Laemmli样品缓冲液(BioRad)中，在95℃加热5分钟，并装载在4-20％的

TGX Stain-Free凝胶(BioRad)上。在TGS缓冲液(Biorad)中于200伏电泳35分钟后，通过将凝胶在UV光下曝光5分钟并在Chemidoc触摸成像仪(Biorad)上使条带可视化来显影凝胶染色。HelaRC32中感染性病毒的测定

通过基于限制性稀释的感染性滴度测定法测定单个感染性颗粒所需的基因组拷贝数(GC/IP)。简而言之，稳定表达AAV衍生的Rep和Cap蛋白的HelaRC32(ATCC)细胞用一系列AAV稀释液以10的复数转导，并在wtAd5:HeLaRC32 MOI为50的条件下感染或不感染wt腺病毒5(wtAD5)。板在37℃温育48小时，通过使用载体基因组特异性引物探针组的Q-PCR，评价孔中是否存在载体基因组DNA。根据Spearman-Karber方法[5]计算每个接种载体基因组的感染颗粒数。

用基因组AAV DNA进行甲醛凝胶电泳

用PCR纯化Nucleospin试剂盒(Machery Nagel)从纯化的AAV批中分离基因组AAVDNA。电泳前，将500ng AAV基因组DNA在甲醛加载缓冲液(1ml 20xMOPS，3.6ml 37％甲醛，2ml 5mg/ml Orange G在67％蔗糖中，用MQ至10ml)中于95℃变性10分钟，并立即置于冰上。接下来，样品在添加了6.6％甲醛的1×MOPS(40mM MOPS，10mM NaAc，1mM EDTA，pH＝8.0)中制备的1％琼脂糖凝胶上运行。然后将样品在100伏下在补充有6.6％甲醛流动缓冲液的1xMOPS中运行2小时。运行后，用SYBR金(Thermofisher)染色DNA，并在Chemidoc TouchImager(Biorad)上显现条带。

实验(DoE)方法的设计

为了研究上游生物过程变量对DuoBac和TripleBac系统的总:全比率的影响，对两项研究进行了实验设计(DoE)方法学和分析。这两项研究使用稍微不同的方法进行，但是在这两项研究中在摇床烧瓶中引入实验变量的情况下，使用类似的方法进行AAV纯化。另外，对于这两项研究，对于每个实验条件，对纯化的样品进行两种类型的分析：使用QPCR来确定载体基因组拷贝数(GC)，而使用SEC-HPLC来确定颗粒的总量，而不管含量如何。随后使用这两个量度来计算总:全率，表示总AAV衣壳相对于含有基因组拷贝的全衣壳的比例。两项研究之间的差别在随后的两部分中描述。

DoE DuoBac系统：设计空间和实验平台

借助于中心复合设计(CCD)，在表2所列的DuoBac介导的SF+细胞的转导期间引入实验变量。这总共产生了17个实验条件(“生产培养物”)，具有三个重复中点。

表2：用于DuoBac转导系统的设计空间

因素	低	中	高
				BacTrans5(％vol.)	0.33	1	3
DuoBac CapRep3(％vol.)	0.33	1	3
				<![CDATA[VCD在TOI(x10<sup>6</sup>VC/mL)]]>	1	1.45	1.9

使用摇摆运动生物反应器(Biowapu-Biostat，Sartorius)在10L波浪袋(Flexsafe，Sartorius)中产生扩增的杆状病毒和种子细胞。在整个研究中使用的培养基是SF900 II培养基(ThermoFisher)。所有孵育的设定如下:T＝28℃；在25rpm和8°角下搅拌；DO＝50％；气流速度为0.2L/min。使用一个专用生物反应器以5L的工作体积和1.2×10⁶VC/ml(反应器A)的初始VCD扩增细胞。在接种反应器A18.5小时后，以0.8×10⁶VC/ml的浓度和5.25L的工作体积接种两个生物反应器(反应器B和C)。15.75ml杆状病毒工作种子病毒(WSV)在细胞接种18小时后加入反应器B和C以分别扩增杆状病毒BacTrans5和DuoBacCapRep3。培养另外48小时后，收集所有反应器。所得材料(细胞和杆状病毒)用于制备AAV生产培养物。

对于生产培养物，在转导以控制TOI处的VCD和培养基组成之前进行新鲜培养基交换步骤。这种培养基交换包括在300g下温和离心每个种子培养物，弃去上清液并将细胞重悬在新鲜培养基中以在TOI达到目标VCD。生产培养组合物按表2所述进行。

70小时后，通过连续的裂解(加入10％V/V的10X裂解缓冲液，37℃，135rpm孵育60分钟)、苯甲酰酶处理(每毫升加入10单位苯甲酰酶，37℃和135rpm孵育60分钟)、澄清(室温下4100g离心15分钟)和过滤(真空下通过0.22pm瓶盖过滤器过滤)步骤终止转导。将滤液在室温孵育12小时以使外来病毒灭活。使用分批结合亲和层析纯化剩余的滤液方案包括(1)在pH7.5的0.2M磷酸盐缓冲液中制备AVB Sepharose HP树脂(1:1体积比)；(2)以40rpm向40ml的滤液中加入250PL-树脂悬浮液并温育4小时；(3)在4100g离心树脂5分钟；(4)用pH7.5的0.2M磷酸盐缓冲液洗涤沉淀；(5)在培养4分钟期间用500ul 0.5M甘氨酸/HCIpH2.5提取沉淀；(6)使用台式离心机离心用过的沉淀；(7)用200ul Tris/HCl pH8.5缓冲液中和上清液；和(8)用0.22uM PVDF注射器过滤器过滤中和的洗脱液。纯化的材料用于QPCR和SEC-HPLC分析以确定总的比率。

结果

实施例1：wtAAV5和AAV2/5 Cap-Rep DuoBac构建体的表征

昆虫细胞中AAV的产生通常通过共感染包括Rep、Cap和Trans盒的三种杆状病毒来进行。为了提高所有三种组分同时存在于细胞中的统计学机会，将Cap和Rep表达盒移至单个杆状病毒(图1)。为了考察在双重感染条件下产生的wtAAV5和AAV2/5的质量和数量是否可以得到改善，发明人将单个Rep表达盒替换为分开的Rep表达盒，并优化Cap的启动子/VP1起始密码子组合。引入分离的Rep盒可以更好地控制Rep52和Rep78的时机和表达强度。此外，优化衣壳的VP123比率对于产生感染性AAV是必要的。

构建体DuoBac CapRep1-7(表1A和图1)被设计成优化wtAAV5和AAV2/5Cap的表达，并用从分离的Rep盒表达的Rep平衡它们。为了评估这些变化对AAV载体产量和质量的影响，用治疗相关的转基因(BacTrans4)进行DuoBac生产。在expresSF+昆虫细胞(50ml)中产生AAV，其中含有5％新鲜扩增的Cap-Rep杆状病毒和1％新鲜扩增的转基因杆状病毒。在生产之后，纯化病毒，并对所得AAV材料进行几次分析。在粗裂解物上测定病毒滴度(通过Q-PCR)。在纯化的AAV上测定总/全比(通过HPLC/Q-PCR)和衣壳化学计量(通过SDS-page凝胶)。1个感染颗粒所需的基因组拷贝数(gc/IP)通过HelaRC32细胞中的感染性测定来确定。

图3总结了在wtAAV5和AAV2/5 DuoBac产物的粗裂解物中测得的病毒滴度。用构建体DuoBac CapRep2、5和7获得高病毒产率(>1×10¹¹gc/ml)，而用构建体DuoBacCapRep 1和6观察到相对低的产率。纯化的病毒批料的总/全比通过将总颗粒/ml(通过HPLC测定)除以基因组拷贝/ml(通过Q-PCR测定)来测定。通常，所有DuoBac构建体都观察到低的总/全比(<2.0)(图4)。该观察结果与通常在通常低于5的TripleBac AAV生产中观察到的总/全比(参见实施例2)形成显著对比。纯化的AAV的衣壳化学计量通过SDS-PAGE凝胶电泳测定(图5，由于病毒产率低，不能测定DuoBac CapRep6的衣壳化学计量)。衣壳的化学计量依赖于使用哪个DuoBac构建体。DuoBac CapRep3和7显示1：1：10的正确衣壳化学计量，而DuoBacCapRep2、4和5显示次优衣壳化学计量(DuoBac CapRep2，4和5的低VP1，在DuoBac CapRep1的情况下非常高VP1)。这些变化可能对AAV感染性的影响通过HelaRC32中的限制性稀释感染性试验来确定(图6)。AAV感染性结果反映了衣壳的化学计量结果。此处，由于衣壳中的正常或高VP1，DuoBac CapRep1、3和6表现出高感染性(低gc/IP)。而DuoBac CapRep2、4和5(高gc/IP)由于衣壳中VP1的量低而表现出降低的感染性。表3总结了来自这些实验的数据。

表3：用DuoBac构建体DuoBac CapRep 1-7生产的AAV的质量参数汇总。

从这些结果可以看出，启动子竞争对wtAAV5 DuoBac构建体的病毒效价有显著影响(Polh Rep+polH Cap＝wtAAV5，DuoBac CapRep1和6的低效价)，但对于AAV2/5(Polh Rep+Polh Cap＝对于AAV2/5，DuoBac CapRep3的高滴度)而言更少。在wtAAV5盒前引入P10启动子提高了效价(DuoBac CapRep2)，但是导致次优的VP123化学计量。在VP1(双ATG)之前引入更强的起始密码子拯救VP123的化学计量并产生高滴度(DuoBac CapRep7)。这表明，平衡Cap VP1的启动子类型和引发强度对于产生具有正确AAV衣壳化学计量的高滴度是必要的。而且，通过将Rep和Cap组合在同一杆状病毒上，降低了工艺复杂性。这种组合AAV基因也导致总/全比的明显改善。实施例2将考察DuoBac AAV产量与TripleBac AAV产量的比较。

实施例2：AAV5 DuoBac(Bac.Cap-Rep和Bac.Transgene)和Triple BAC(Bac.Cap、Bac.Rep、Bac.Transgene)的比较AAV生产

前述实施例表明，通过将Cap和Rep盒组合在同一杆状病毒上并在分子上优化Cap盒，我们能够产生改进的AAV产物。该实施例比较了由DuoBac和TripleBac方法产生的AAV。为了比较两个生产系统，将DuoBac(DuoBac CapRep7：CapwtAAV5-Rep)的产量与TripleBacAAV的产量(BacCap1 wtAAV5，BacRep1)在载体产量和质量方面进行比较。报告基因和两个治疗相关的转基因都用于AAV生产(BacTrans1、3和4)。为了进行AAV生产，用多个体积比的新鲜扩增的杆状病毒储液接种expresSF+昆虫细胞(50mL或2.5L)。接种体积为培养体积的1-5％。在生产之后，纯化病毒，并对材料进行几次分析。在粗裂解物和纯化的AAV上测定病毒滴度(通过Q-PCR以gc/mL计)。在纯化的AAV材料上测定总/全比(通过A260/A280)和VP123比(通过SDS-PAGE凝胶)。

表4总结了50mL的生产结果，而表5总结了2.5L的生产结果。在50mL和2.5L规模下，DuoBac生产在病毒产量和总/全比上都优于TripleBac生产。根据生产中所用的接种量或转基因，与同等的TripleBac生产相比，用DuoBac CapRep 7在CLB中的效价(以gc/mL计)提高了4-10倍。用相似的因子增加从产物纯化的总基因组拷贝。令人感兴趣的是，用DuoBac方法也提高了总/全比。这里，所使用的转基因似乎影响该参数改善的量，但是在DuoBac生产中总/全比率始终得到改善(取决于用于生产的转基因盒，大约2-8倍)。VP123衣壳蛋白的表达在DuoBac和TripleBac AAV产物之间是相同的(图7)，保持理想的化学计量为1∶1∶10。

通过在同一杆状病毒上组合Cap和Rep表达盒来降低工艺复杂性，导致产量和总/全率的明显提高(图8)，同时保持AAV的理想VP蛋白化学计量。尽管在此没有研究，但是由于从三个变量减少到两个变量，所以很可能可以用DuoBac工艺来改进工艺稳健性(批到批变化)。

表4：50ml DuoBac与TripleBac生产结果的比较

体积比50ml生产	gc/ml粗裂解物	总gc	总/全比率
				DuoBac CapRep7∶BacTrans4 5∶1	5,30E+11	2,65E+13	1,5
BacCap1∶BacRep1∶BacTrans4 1∶1∶1	6,10E+10	3,05E+12	2,4
				BacCap1∶BacRep1∶BacTrans4 1∶5∶1	2,70E+10	1,35E+12	1,4
BacCap1∶BacRep1∶BacTrans4 5∶5∶1	1,5e11	7,50E+12	2,1

表5：2.5升DuoBac与TripleBac生产结果的比较

实施例3：DuoDuoBac(Bac.Cap-Rep和Bac.Cap-Trans)与TripleBac AAV(Bac.Cap，Bac.Rep Bac.Transgene)的比较

以前的研究表明，TripleBac AAV产物的Cap：Rep杆状病毒接种比例直接影响AAV产物的总/全比和效价产量。此处，Rep杆状病毒接种量的增加导致衣壳产量和总/全率的降低。相反，增加的Cap杆状病毒接种比率增加了总/全比率和产量。通过在Rep和转基因杆状病毒上引入Cap盒，从而产生双DuoBac方法或DuoDuoBac方法(图1)，我们在AAV生产过程中具有更多控制细胞中Cap：Rep比的自由度。也将允许我们探索在TripleBac AAV工艺中不可能达到的CAP：Rep生产比率(特别是高CAP比率)(由于抑制AAV生产的接种量太高)。

在这个实施例中，我们的目的是研究在昆虫细胞感染期间改变CAP：Rep比率对AAV质量和产量的影响，这是通过改变DuoBac CapTrans1与DuoBac CapRep6的接种比率来实现的。将DuoDuoBac AAV生产与TripleBac AAV生产进行比较。在expresSF+昆虫细胞中以50mL规模进行AAV生产。接种体积为每种杆状病毒培养体积的1-5％。生产后，用AVB Sepharose纯化病毒。在粗裂解物和纯化的AAV中测定病毒滴度(通过Q-PCR测定的gc/mL)。在纯化的AAV上测定总/全比(A260/A280)和衣壳组成(SDS-PAGE凝胶)。此外，通过甲醛凝胶电泳也研究了包装入AAV颗粒中的基因组DNA。

表6总结了DuoDuoBac和TripleBac AAV生产的结果。对于DuoDuoBac产物，它列出了所使用的接种条件以及获得与TripleBac AAV产物相似比率所需的等效接种条件。在所有测试的DuoDuoBac AAV产物中，粗裂解物中的载体产率与测试的TripleBac产物的6-7E+11相比落在7E+11至1.4E+12gc/mL之间，这意味着对于最佳的DuoDuoBac条件观察到2倍的效价增加。与TripleBac产物相比，所有DuoDuoBac产物的总/全比率降低。当比较DuoDuoBac产物时，通常观察到当Rep越高时，总/全比率越低。虽然存在较高的总/全比与CAP的增加有关。测试的最佳条件是1：3的DuoBac CapTrans1与DuoBac CapRep6共感染，导致CLB中的平均滴度为2E+12gc/mL，总/全比为约5。与最接近的TripleBac等价物(5：5：1比率)相比，效价提高了2倍(1.2E+12比6E+11)，而总/全比率提高了约4倍(1.5V 6)。当比较DuoDuoBac和TripleBac产物之间衣壳蛋白VP-1、-2和-3的表达时，对于所有测试条件观察到相似的化学计量为1：1：10(图9)。这表明在Rep和转基因杆状病毒上引入Cap盒并不改变最佳比例，保持在1：1：10。而且，包装到AAV颗粒中的基因组DNA在DuoDuoBac和TripleBac产物之间是相似的(图10)。分离自两种产物的基因组AAV DNA在甲醛凝胶上产生相同的条带模式。主条带长2.4kb，代表BacTrans4转基因的一个拷贝。

总之，与TripleBac相比，DuoDuoBac方法使用宽范围的Bac.Cap-Rep与Bac.Cap-Trans接种比率产生了改进的载体产率和总全比。在AAV生产过程中改变生产细胞中Cap：Rep比率的增加的自由度(由于存在两个Cap表达盒和用于感染的杆状病毒种子数量的减少)允许控制和优化生产的AAV的总/全比率。我们观察到，Rep的增加导致产率和总/全比稍微低一些，而CAP的增加导致总/全比更高一些。与TripleBac相比，DuoDuoBac的生产使产量和总/全比的变化最小化。另外，DuoDuoBac AAV生产允许我们探索用TripleBac方法不能实际达到的CAP：Rep比。由DuoDuoBac工艺提供的这种扩大的操作空间可以潜在地允许开发更稳健的AAV生产工艺。

表6:50ml DuoDuoBac与TripleBac生产结果的比较。

实施例4：DuoDuoBac(Bac.Cap-Rep和BacCap-Trans)与DuoBac AAV(Bac.Cap、Bac.Rep、Bac.Transgene)的比较

4.1细胞培养和杆状病毒扩增

在如上所述的条件下，在SF-900II SFM培养基中培养expresSF+昆虫细胞。如上所述产生新鲜杆状病毒接种物。

4.2在1L摇瓶中的DOE研究

4.2.1 DOE设计

使用中心复合设计(CCD)来研究两个因素(两种扩增杆状病毒的体积感染比率在0.33-3％的范围内)及其相互作用。使用Design Expert 11(Statease，Minneapolis MN)和JMP 15(Sas Institute Inc.，Cary，NC)进行统计学分析。使用可旋转的CCD(A＝414)和三个中心点产生二次响应表面模型。将过滤的粗裂解物中的基因组拷贝效价和总颗粒与基因组拷贝(tp/gc)之比设定为应答。仅统计学显著的模型术语(p<0.1)包括在每个模型中，并且通过逐步回归选择，同时保持模型层次。

4.2.2 AAV的生产和纯化

扩增的杆状病毒和种子细胞(预培养)在28℃，135rpm的1L摇瓶中产生。在整个研究中使用的培养基是SF900II培养基(Thermofisher)。根据预培养物的VCD，将计算出的培养物体积加入到每1L摇瓶中，以达到目标接种细胞密度1.3×10⁶VC/ml，最终工作体积为400ml。根据需要，向每个摇瓶中加入另外的SF900II培养基以使培养体积达到400ml。在28℃和135rpm下在1L摇瓶中进行细胞扩增。接种15-21小时后，按照DOE设计以体积感染比加入扩增的杆状病毒接种物池。感染后，将温度设定点提高到30℃，并在135rpm下继续培养68-76小时。此后，通过加入10％(v/v)的10X裂解缓冲液(Lonza)收获培养物。裂解开始30分钟后，温度设定点升高到37℃。当达到温度设定点时，加入苯甲酰酶(9单位/ml)，然后将培养物再温育60分钟。通过在4100g和室温(20-25℃)下离心15分钟，然后通过0.2pm膜过滤器过滤，进行粗裂解体的澄清。然后用来自Cytiva的AVB Sepharose HP树脂纯化过滤的体积。用0.2M甘氨酸/HCl pH2.4缓冲液洗脱产物，随后用60mM Tris pH8.5中和。随后通过QPCR(以确定载体基因组拷贝数，粗裂解物中的GC浓度)和SEC-HPLC(以确定总AAV颗粒的总量)分析纯化的样品。表7中的结果显示，在两种杆状病毒的宽范围感染比率上，DuoDuoBac系统获得的载体产率高于可比的DuoBac系统。

表7.两种杆状病毒的不同体积感染比率对DuoBac和DuoDuoBac在1L摇瓶中产生的AAV载体产量和总全比的影响。

4.3在2L搅拌罐生物反应器中的生产

4.3.1 AAV的生产和纯化

在28℃，135rpm的1L摇瓶中产生扩增的杆状病毒和种子细胞(预培养)。在整个研究中使用的培养基是SF900II培养基(Thermofisher)。对于杆状病毒的每种组合，使用两个2L搅拌罐反应器(STR，UnivisionSU，Satorious)一式两份地进行rAAV生产。基于预培养的VCD，将计算出的培养物体积加到2L STR上，以达到0.5×10⁶VC/ml的目标接种细胞密度，最终工作体积为2L。根据需要，向2L STR中加入另外的SF900II培养基以使培养体积达到2L。在28℃下在2L STR中进行细胞扩增。使用100-300rpm的搅拌速度，溶解氧(DO)保持在30％，通过覆盖层的连续固定空气流为0.2L/min，通过喷射器以0-150COM的流量添加氧。接种43-48小时后，以表8所示的体积感染比率加入扩增的杆状病毒接种物池。感染后，将温度设定点提高到30℃，并使用上述设定继续培养。

感染后68-76小时通过加入10％(v/v)的10X裂解缓冲液(Lonza)收获培养物。裂解开始30分钟后，温度设定点升高到37℃。当达到温度设定点时，加入苯甲酰酶(9单位/ml)，然后将培养物再温育60分钟。通过在4100g和室温(20-25℃)下离心15分钟，然后通过0.2pm膜过滤器过滤，进行粗裂解体的澄清。然后使用填充有来自Cytiva的AVB Sepharose HP树脂的柱纯化过滤的体积。用0.2M甘氨酸/HCl 2M尿素pH2.4缓冲液洗脱产物，随后用60mMTris 2M尿素pH8.5中和。然后将中和的洗脱液加载到5mL Mustang Q膜(PALL)上。使用60mMTris 150mM NaCl 2M尿素pH 8.5缓冲液进行产物洗脱，然后使用Planova 35N过滤器(0.01m²)纳米过滤。最后，用含5％蔗糖的磷酸盐缓冲盐水(MERCK)渗滤产物，并浓缩至所需体积。

随后通过QPCR(以确定载体基因组拷贝数，粗裂解液中的GC浓度)、SEC-HPLC(以确定总AAV颗粒的总量)、FIX效价测定和HelaRC32中的感染性测定来分析纯化的样品。表8显示，至少在载体产量、效价和感染性方面，DuoDuoBac系统(BacCapTrans1+BacCapRep6)优于可比的DuoBac系统(BacCapRep6+BacTrans4)。

表8.用DuoBac或DuoDuoBac在2L罐生物反应器中生产的AAV载体的各种性质的比较。

参考文献：

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Claims (22)

1.一种包含一或多种核酸构建体的细胞，所述一或多种核酸构建体包含：

i)第一表达盒，其包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种；

ii)第二表达盒，其包含与编码mRNA的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译产生细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种；

iii)第三表达盒，其包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第三启动子；以及，

iv)核苷酸序列，其包含侧翼为至少一个细小病毒反向末端重复序列的转基因，

其中，所述第一和第二表达盒中的至少一个和所述第三表达盒存在于第一核酸构建体上，并且其中，在用所述一或多种核酸构建体转染所述细胞后，所述第一启动子先于所述第二和第三启动子有活性。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述包含侧翼为细小病毒反向末端重复序列的转基因的核苷酸序列存在于第二核酸构建体上。

3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述第二核酸构建体还包含第四表达盒，所述第四表达盒包含与编码细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第四启动子，其中第一启动子先于第二、第三和第四启动子有活性，其中任选地，所述第三和第四启动子是相同的，并且其中任选地，由第三和第四表达盒中的核苷酸序列编码的细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白是相同的。

4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种以及所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种包含共同氨基酸序列，所述共同氨基酸序列包含所述细小病毒Rep52和40蛋白中至少一种的从第二个氨基酸到最C端氨基酸的氨基酸序列，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种与所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少90％相同，并且其中编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有小于90％的相同性。

5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种和所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列至少99％相同，优选100％相同。

6.根据权利要求4或5所述的细胞，其中与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的针对所述细胞的密码子使用偏向性，或者与编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列相比，其中编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列具有改善的针对所述细胞的密码子使用偏向性，其中优选地，编码所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列与编码所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种的共同氨基酸序列的核苷酸序列的密码子适应指数之差至少为0.2。

7.根据前述权利要求任一项所述的细胞，其中第一启动子是组成型启动子。

8.根据前述权利要求任一项所述的细胞，其中第二、第三和第四启动子中的至少一种是诱导型启动子。

9.根据权利要求8所述的细胞，其中所述诱导型启动子是在病毒感染周期的后期被诱导的病毒启动子，优选是在病毒转染或感染细胞至少24小时后被诱导的病毒启动子。

10.根据前述权利要求任一项所述的细胞，其中所述第一和第二核酸构建体中的至少一种稳定整合在所述细胞的基因组中。

11.根据前述权利要求任一项所述的细胞，其中所述细胞是昆虫细胞，并且其中所述第一和第二核酸构建体中的至少一种是昆虫细胞相容性载体，优选杆状病毒载体。

12.根据权利要求11所述的细胞，其中：

a)所述第一启动子选自deltaEl启动子和El启动子；和

b)所述第二、第三和第四启动子选自polH启动子和p10启动子。

13.根据权利要求11或12所述的细胞，其中至少一个表达盒包含至少一个杆状病毒增强子元件和/或至少一个蜕皮激素应答元件，其中优选地所述增强子元件选自hr1、hr2、hr2.09、hr3、hr4、hr4b和hr5。

14.根据前述权利要求任一项所述的细胞，其中所述编码mRNA的核苷酸序列包含完整的细小病毒p19启动子，所述mRNA在所述细胞中的翻译仅产生细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种。

15.根据前述权利要求中任一项所述的细胞，其中所述细小病毒Rep78和68蛋白中的至少一种，所述细小病毒Rep52和40蛋白中的至少一种，所述细小病毒VP1、VP2和VP3衣壳蛋白以及所述至少一种细小病毒反向末端重复序列来自腺相关病毒(AAV)。

16.根据权利要求4-15中任一项所述的细胞，其中第一核酸构建体是DuoBac CapRep6(SEQ ID NO.10)且第二核酸构建体是DuoBac CapTransl(SEQ ID NO.12)，且其中优选地第一和第二构建体以3:1摩尔比存在。

17.一种在细胞中产生重组细小病毒病毒体的方法，包括以下步骤：

a)在产生重组细小病毒病毒体的条件下培养权利要求1-16中任一项所定义的细胞；和

b)回收所述重组细小病毒体。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞和/或其中所述细小病毒病毒体是AAV病毒体。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中步骤b)中所述重组细小病毒病毒体的回收包括使用固定化的抗细小病毒抗体亲和纯化病毒体或用标称孔径为30-70nm的过滤器过滤中的至少一种，所述抗细小病毒抗体优选单链骆驼抗体或其片段。

20.权利要求1-15中任一项所定义的第一核酸构建体。

21.权利要求2-15中任一项所定义的第二核酸构建体。

22.一种套组试剂盒，其至少包含权利要求1-15中任一项所定义的第一核酸构建体和权利要求2-15中任一项所定义的第二核酸构建体。

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