CN112852880B - 一种基于诱导型昆虫细胞生产aav基因药物的方法 - Google Patents

一种基于诱导型昆虫细胞生产aav基因药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，所述方法包括：(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。该方法不需要使用携带外源基因的杆状病毒，因此不会带来因杆状病毒大量复制扩增所带来的外源基因丢失的问题，有利于获得稳定的AAV产物，进一步简化AAV生产步骤，提高生产效率，实现AAV的大规模化高效生产并降低成本。

Description

一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法。
背景技术
基因治疗的基本原理是运用重组DNA的技术，将具有正常基因及其表达所需的序列导入到病变细胞或体细胞，对DNA分子进行纠正或修复，从而达到治疗目的。相比于其他药物，基因治疗的优势在于从根本上解决问题。根据市场调研机构Fortune BusinessInsights发布的报告，2019年基因治疗市场规模为36.1亿美元，预计到2027年将达到356.7亿美元，预测期内的年均复合增长率(CAGR)为33.6％。目前，基因药物的病毒类载体主要是腺相关病毒(AAV)和慢病毒两大类，这两类载体根据各自的特点，分别用于不同的基因疗法和适应症。
全球已有多款获批的遗传性疾病AAV载体基因疗法。Uniqure，诺华，SparkTherapeutics等重要机构在市场获得了先机。除此之外，也有一些重要制药企业的候选疗法处于临床阶段。2012年，欧盟委员会(EC)批准了西方世界首个基因治疗药物Glybera，该药来自荷兰生物技术公司UniQure，用于治疗一种极其罕见的遗传性疾病--脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)，其高达100万美元的定价创造了昂贵现代医药的新纪录。Glybera也是目前已经上市的唯一利用杆状病毒昆虫细胞生产的AAV载体的基因治疗药物。此外，Luxturna是由Spark(罗氏子公司)研发的一款基因疗法，于2017年12月获得美国FDA批准上市，Luxturna使用AAV2携带RPE65基因，采用在视网膜下腔直接注射的方法将病毒导入眼球中，用于治疗Leber先天性黑蒙2型(LCA2)的患者。
未来几年将有十多款基因治疗的新药上市，基因治疗创新药物的发展离不开病毒载体生产技术的进步。目前基因药物高昂的价格与病毒载体的生产成本较高有密切关系，尤其是腺相关病毒载体。国际上除UniQure、Biomarin等少数企业利用杆状病毒昆虫系统解决临床级AAV载体生产问题外，大多数药企和CDMO平台仍然用传统的293T细胞质粒转染的方式生产，无法实现规模化生产以有效降低AAV的生产成本。利用杆状病毒昆虫细胞生产AAV是解决临床级病毒大规模生产的重要手段。
目前，利用杆状病毒昆虫系统生产AAV问题的基本原理，如图1所示：将腺相关病毒的包装组分Rep,Cap和目的基因序列，分别克隆到三个杆状病毒载体上，利用三个杆状病毒感染昆虫sf9细胞，包装得到AAV。为了进一步简化流程，提高操作的稳定性，一种改进方法原理如图2所示：将腺相关病毒的包装组分Rep,Cap整合到昆虫sf9细胞的基因组上，构建成诱导型细胞系，然后将目的基因的序列克隆到杆状病毒载体上，利用杆状病毒载体感染昆虫sf9细胞并诱导Rep,Cap表达，包装生产AAV。这两种方法均在如下技术问题：
(1)该两种方法，都利用携带外源基因的杆状病毒感染昆虫sf9细胞，然而携带了外源基因的杆状病其传代不稳定，外源基因会丢失，造成生产过程不稳定。杆状病毒是复制型病毒，作为生产AAV的原料，要大量复制扩增，扩增3-4代，外源基因就会丢失。生产时需要反复检测。一旦丢失，要重新扩增。
(2)Rep,Cap蛋白有细胞毒性，如果持续表达，将不利于昆虫sf9细胞的大量扩增和培养，难以实现AAV的规模化生产和降低成本。此外，现有技术方法仍存在生产步骤不够简化及生产效率低等问题。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，该方法不需要使用携带外源基因的杆状病毒，解决携带外源基因的杆状病毒在大量复制扩增过程中容易丢失外源基因的问题，有利于获得稳定的AAV产物，并进一步简化AAV生产步骤，提高生产效率，实现AAV的大规模化高效生产并降低生产成本。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，所述方法包括：
(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；
(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；
(3)大量扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒，感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。
根据本发明的较佳实施例，步骤(1)中，Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒中分别含有早期启动子和筛选标签。
所述早期启动子驱动筛选标签表达，以确保最终筛选得到同时包含Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒三个质粒的稳转细胞株。
根据本发明的较佳实施例，步骤(2)中，分别将所述三个质粒逐一通过转染进入Sf9昆虫细胞中，每转染完一种质粒后，利用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到可生产AAV的Sf9稳转细胞株。
根据本发明的较佳实施例，步骤(1)中，Rep基因质粒为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Rep intron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、G2P(GFP-2A-puro，GFP和puromycin双标记)筛选标签、IEter转录终止序列、p10晚期启动子、及表达Rep蛋白的Rep intron表达盒基因序列。
根据本发明的较佳实施例，步骤(1)中，Cap基因质粒为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap intron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、BSD筛选标签、IEter转录终止序列、pH晚期启动子、及表达Cap蛋白的Cap intron表达盒基因序列。
根据本发明的较佳实施例，步骤(1)中，目的基因质粒为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-Target Gene，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、Neo筛选标签、IEter转录终止序列、及表达Target Gene的腺相关病毒基因组序列。
根据本发明的较佳实施例，步骤(1)中，所述目的基因Target Gene为密码子优化的SMN1基因或编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列；其中，密码子优化的SMN1基因序列如SEQ ID No:12所示，所述编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列如SEQ ID No:13或SEQID No:14所示。
筛选时，质粒中早期启动子IE可驱动Puro筛选标签、BSD筛选标签、Neo筛选标签表达(这些筛选标签实为抗生素抗性基因)，使细胞获得抗性，而能够在具有相应抗生素的培养基中存活下来，从而筛选出成功在Sf9昆虫细胞的基因组中同时转入了Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒三种质粒的稳转细胞株。
可理解的，所述相应抗生素为Puromycin、Blasticidin、G418。
根据本发明的较佳实施例，步骤(3)中，步骤(3)中，所述不携带外源基因的杆状病毒为空的Baculovirus杆状病毒；用空的Baculovirus杆状病毒感染所述稳转细胞株，使细胞进入晚期的病毒样效应，激活晚期启动子p10和polyhedrin，驱动Rep基因和Cap基因的表达，在细胞中包装产生AAV。
根据本发明的较佳实施例，还包含步骤(4)，将经诱导表达Rep基因和Cap基因的Sf9昆虫细胞，进行反复冻融、裂解细胞，释放出AAV病毒颗粒，最后经亲和层析纯化，得到AAV病毒产品。
第二方面，本发明提供一种用于生产携带目的基因腺相关病毒的稳转细胞系的制备方法，其包含如下步骤：
步骤S1：分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；
其中，Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒分别含有早期启动子和筛选标签；Rep基因质粒和Cap基因质粒中还含有晚期启动子；
步骤S2：分别将Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒逐一通过转染进入Sf9细胞中，每次转染完一种质粒后，采用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到同时包含Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒三个质粒的存活细胞，该存活细胞为生产AAV的稳转细胞株。
根据本发明较佳实施例，步骤S1中，Rep基因质粒中含有IE早期启动子和Puro筛选标签；Cap基因质粒含有IE早期启动子和BSD筛选标签；目的基因质粒分别含有IE早期启动子和Neo筛选标签。
根据本发明较佳实施例，步骤S2中，用Rep基因质粒转染Sf9细胞后，采用抗生素Puromycin进行筛选，选出存活的Sf9细胞；用Cap基因质粒转染所述Sf9细胞后，用抗生素Blasticidin进行筛选，选出存活的Sf9细胞；用目的基因质粒转染所述Sf9细胞后，用抗生素G418进行筛选，选出存活的Sf9细胞，为生产AAV的稳转细胞株。
(三)有益效果
本发明技术效果包括以下几个方面：
(1)通过转染方式获得包含Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒的稳转细胞株，可以进一步简化AAV生产步骤，提高生产效率，实现AAV的规模化生产和降低成本。
(2)本发明中，只需用不携带外源的杆状病毒对Sf9稳转细胞株进行感染和诱导，全程不需要使用携带外源基因的杆状病毒，因此不会带来因杆状病毒大量复制扩增所带来的外源基因丢失的问题，有利于获得稳定的AAV产物。
(3)本发明的基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，在对Sf9稳转细胞株进行大量扩增培养时，有细胞毒性的Rep、Cap蛋白不会表达，只有在需要生产AAV时，使用不携带外源的杆状病毒感染稳转细胞使晚期启动子p10和polyhedrin才会被激活，驱动Rep、Cap基因表达，包装AAV颗粒。因此，Rep、Cap蛋白不会对Sf9稳转细胞株的大量扩增和培养产生抑制。
附图说明
图1为现有技术中一种生产AAV的原理图。
图2为现有技术中另一种生产AAV的原理图。
图3为本发明生产AAV的原理图。
图4为使用空的Baculovirus感染诱导Sf9稳转细胞株前后，Western Blot检测稳转细胞株Rep、Cap蛋白的表达情况。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
如图3所示，为本发明生产携带目的基因的AAV(AAV基因药物)的方法原理图，即分别构建Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒，然后将三种质粒分别通过转染的方式进入Sf9细胞中，通过抗生素结合筛选标签，筛选出三种质粒均成功转染到昆虫sf9细胞基因组上的稳转株细胞，在需要生产AAV时，只需将这个细胞系扩增起来，用不携带外源基因的杆状病毒去感染，使sf9细胞进入病毒样状态晚期启动子激活，Rep,Cap和目的基因表达，即可大量生产AAV。该方法可以避免使用携带外源基因的杆状病毒在大量复制扩增过程中，外源基因易丢失的问题。
现以目的基因为GFP为例，对本发明方案、可实现性和技术效果进行说明。实施方法如下：
一、需构建的质粒
要构建的AAV包装质粒包括Rep基因质粒、Cap基因质粒和GFP基因质粒，分别记录为：
Rep基因质粒：pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Rep intron-sv40；
Cap基因质粒：pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap intron-sv40；
GFP基因质粒：pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-GFP。
Rep基因质粒包含pBSK商业化载体序列，HR5增强子，早期启动子IE，筛选标签G2P(GFP-2A-puro,即GFP和puromycin双标记)，IE ter为转录终止序列，p10晚期启动子，及表达Rep蛋白的Rep intron表达盒基因序列。
Cap基因质粒包含pBSK商业化载体序列，HR5增强子，早期启动子IE，筛选标签BSD，IE ter为转录终止序列，pH晚期启动子，及表达Cap蛋白的Cap intron表达盒基因序列。
GFP基因质粒包含pBSK商业化载体序列，HR5增强子，早期启动子IE，筛选标签Neo，IE ter为转录终止序列，及表达GFP的腺相关病毒基因组序列。
其中，pBSK为商业化载体(Stratagene 212205)，HR5序列为SEQ ID No:1，IE序列为SEQ ID No:2，G2P序列为SEQ ID No:3，IEter序列为SEQ ID No:4，p10序列为SEQ ID No:5，Rep intron序列为SEQ ID No:6，BSD序列为SEQ ID No:7，pH序列为SEQ ID No:8，Capintron序列为SEQ ID No:9，Neo序列为SEQ ID No:10，AAV-GFP序列为SEQ ID No:11。
HR5为增强子，IE为早期启动子，用于驱动筛选标签表达，pH和p10均为晚期启动子，用于驱动Rep、Cap蛋白的表达。
二、质粒的构建过程
(一)Rep基因质粒记录为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Rep intron-sv40，其构建步骤如下：
(1)将pBSK质粒用限制性内切酶KpnI和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK载体片段；
将HR5-IE-G2P-IE ter基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和KpnI/XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用KpnI和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收HR5-IE-G2P-IE ter基因片段。
(2)将胶回收试剂盒分别回收的pBSK载体片段和HR5-IE-G2P-IE ter基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应15min。
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克100s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter质粒，进行KpnI和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，获得pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter质粒。
(5)将pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter质粒用限制性内切酶XbaI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter载体片段，将回收后的pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter载体片段用碱性磷酸酶(CIAP)于37℃进行反应30min，再于65℃热失活15min，获得pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter CIAP载体片段。
(6)将HR5-p10-Rep intron-sv40基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和NheI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用NheI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收HR5-p10-Rep intron-sv40基因片段。
(7)将胶回收试剂盒分别回收的pBSK-HR5-IE-G2P-IE ter CIAP载体片段和HR5-p10-Rep intron-sv40基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应20min。
(8)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(9)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Rep intron-sv40质粒，进行NheI和BglII双酶切鉴定后进行测序鉴定，获得pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Repintron-sv40质粒。
(二)Cap基因质粒记录为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap intron-sv40，其构建步骤如下：
(1)将pBSK质粒用限制性内切酶KpnI和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK载体片段；
将HR5-IE-BSD-IE ter基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和KpnI/XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用KpnI和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收HR5-IE-BSD-IE ter基因片段。
(2)将胶回收试剂盒分别回收的pBSK载体片段和HR5-IE-BSD-IE ter基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应20min。
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡70min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养16h。
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-HR5-IE-BSD-IE ter质粒，进行KpnI和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，获得pBSK-HR5-IE-BSD-IEter质粒。
(5)将pBSK-HR5-IE-BSD-IE ter质粒用限制性内切酶XbaI和NotI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK-HR5-IE-BSD-IE ter载体片段。
(6)将HR5-pH-Cap9 intron-sv40基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基XbaI和NotI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用XbaI和NotI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收HR5-pH-Cap9 intron-sv40基因片段。
(7)将胶回收试剂盒分别回收的pBSK-HR5-IE-BSD-IE ter载体片段和HR5-pH-Cap9 intron-sv40基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应20min。
(8)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养14h。
(9)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap9 intron-sv40质粒，进行NheI和NotI双酶切鉴定后进行测序鉴定，获得pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap9intron-sv40质粒。
(三)GFP基因质粒记录为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-GFP，其构建步骤如下：
(1)将pBSK质粒用限制性内切酶KpnI和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK载体片段；
将HR5-IE-Neo-IE ter基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基和KpnI/XhoI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用KpnI和XhoI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收HR5-IE-Neo-IE ter基因片段。
(2)将胶回收试剂盒分别回收的pBSK载体片段和HR5-IE-Neo-IE ter基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应20min。
(3)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴4min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡70min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养16h。
(4)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-HR5-IE-Neo-IE ter质粒，进行KpnI和XhoI双酶切鉴定后进行测序鉴定，获得pBSK-HR5-IE-Neo-IE ter质粒。
(5)将pBSK-HR5-IE-Neo-IE ter质粒用限制性内切酶XhoI和XbaI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收pBSK-HR5-IE-Neo-IE ter载体片段。
(6)将AAV-CMV-GFP基因片段进行PCR扩增，5’端和3’端分别加上保护碱基是SalI和XbaI酶切位点，将扩增得到的PCR片段利用SalI和XbaI于37℃进行双酶切1h，琼脂糖电泳后切胶回收AAV-CMV-GFP基因片段。
(7)将胶回收试剂盒分别回收的pBSK-HR5-IE-Neo-IE ter载体片段和AAV-CMV-GFP基因片段，采用T4 DNA连接酶连接，室温反应20min。
(8)将连接产物转化至大肠杆菌：取连接产物转化感受态DH5a，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热休克80s，立刻冰浴5min，加入无抗生素的LB培养液37℃振荡60min，用无菌玻璃涂布器将菌液均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养16h。
(9)挑取单克隆菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养液中，37℃振荡16h；用质粒提取试剂盒提取质粒pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-GFP质粒，进行NheI和BglII双酶切鉴定后进行测序鉴定，获得pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-GFP质粒。
三、转染及筛选稳转细胞株
将上述构建的三种质粒，通过转染进入Sf9细胞中，通过抗生素配合筛选标签筛选出将上述三种质粒成功整合到Sf9昆虫细胞基因组的细胞系，具体步骤如下：
(1)、将昆虫细胞Sf9以2x10^6/孔铺一块35mm平皿，27℃培养1h，使细胞贴壁。
(2)、取Rep基因质粒2μg用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，取8μl Cellfectin II转染试剂用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，稀释的转染试剂加入稀释的质粒中，轻弹混匀，室温静置15min。
(3)、将转染试剂质粒混合物加入贴壁的Sf9细胞中，于27℃培养6h后换成新鲜的培养基。
(4)、转染后24h，Sf9细胞换成含有8μg/ml Puromycin的培养基，继续于27℃培养，每三天换新鲜的8μg/ml Puromycin的培养基，直至细胞不再出现死亡，存活的细胞均为抗Puromycin的细胞，至此获得成功转入Rep基因质粒的Sf9细胞系。
(5)、将步骤(4)中获得的成功转入Rep基因质粒的Sf9细胞系以2x10^6/孔铺一块35mm平皿，27℃培养1h，使细胞贴壁。
(6)、取Cap基因质粒2μg用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，取8μl CellfectinII转染试剂用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，稀释的转染试剂加入稀释的质粒中，轻弹混匀，室温静置15min。
(7)、将转染试剂质粒混合物加入贴壁的已成功转入Rep基因质粒的Sf9细胞系中，于27℃培养6h后换成新鲜的培养基。
(8)、转染后24h，Sf9细胞换成含有25μg/ml Blasticidin的培养基，继续于27℃培养，每三天换新鲜的25μg/ml Blasticidin的培养基，直至细胞不再出现死亡，存活的细胞均为抗Blasticidin的细胞，至此获得已成功转入Rep基因质粒+Cap基因质粒的Sf9细胞系。
(9)、将步骤(8)中获得的已成功转入Rep基因质粒+Cap基因质粒的Sf9细胞系以2x10^6/孔铺一块35mm平皿，27℃培养1h，使细胞贴壁。
(10)、取GFP基因质粒2μg用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，取8μl CellfectinII转染试剂用Grace培养基稀释至100μl，轻弹混匀，室温静置5min，稀释的转染试剂加入稀释的质粒中，轻弹混匀，室温静置15min。
(11)、将将转染试剂质粒混合物加入贴壁的已成功转入Rep基因质粒+Cap基因质粒的Sf9细胞系中，于27℃培养6h后换成新鲜的培养基。
(12)、转染后24h，Sf9细胞换成含有100μg/ml G418的培养基，继续于27℃培养，每三天换新鲜的100μg/ml G418的培养基，直至细胞不再出现死亡，存活的细胞均为抗G418的细胞，至此获得诱导性产AAV的Sf9细胞系，即稳转细胞株。
四、病毒包装体系的验证
用三个诱导表达包装腺相关病毒(AAV)的质粒瞬时转染sf9昆虫细胞，通过筛选标签筛选出基因组中整合了三种质粒的sf9细胞系，整合后的sf9细胞系，用空的Baculovirus进行诱导，诱导前后的细胞用PBS反复冻融裂解，验证AAV包装体系。
采用Western Blot验证诱导前后的sf9稳转细胞中包装蛋白Rep,Cap的表达情况。以293T细胞中转染Rep,Cap的载体质粒作为阳性对照；以野生型293T细胞和Sf9细胞作为阴性对照。
结果如图4所示，整合了三个质粒的sf9细胞系在杆状病毒诱导前Rep、Cap蛋白都没有表达，而被空的Baculovirus诱导后，sf9稳转细胞中Rep、Cap蛋白表达明显。此结果说明了，诱导型系统避免诱导前Rep、Cap蛋白大量表达带来的细胞毒性(避免其毒性抑制sf9稳转细胞的扩增培养、减少稳转株细胞裂解液中Rep、Cap蛋白的含量，有利于AAV颗粒的纯化过程)，诱导后能有效表达Rep、Cap包装蛋白，是利用昆虫系统生产AAV的理想系统。
五、利用sf9稳转细胞，完成1升细胞体积的AAV小试生产及纯化的情况，具体方法如下：
(1)、将整合的产AAV-GFP的sf9稳转细胞系进行扩增，以2x10^7/皿，铺20皿150mm细胞培养皿的细胞，在27℃昆虫细胞培养箱中静置2h，使细胞贴壁。
(2)、用已经测好基因组滴度的不带外源基因的杆状病毒，按照MOI1感染sf9稳转细胞系，感染后72h后收集细胞，每皿用2ml的PBS垂悬后冻于-80℃。
(3)、在-80℃和37℃反复冻融3次裂解细胞，释放出AAV病毒。
(4)、用50U/ml的核酸酶于37℃消化1h。
(5)、将消化好的料液置于4℃离心机中10000rpm离心20min。
(6)、用5mlAAVX对料液进行层析纯化，流速1.5ml/min，用1xPBS平衡至电导、pH稳定。
(7)、将离心澄清的料液上样，流速1.5ml/min。
(8)、上完样品后再用1xPBS清洗AAVX柱子，清洗至电导、pH稳定后，用1xPBS+1MNacl以1.5ml/min清洗柱子至电导、pH稳定后，再次用1XPBS清洗柱子。
(9)、用50mM的柠檬酸和150M的NaCl，以1.5ml/min进行洗脱，洗脱后的样品由于pH较低，用1/10体积的1.5MTris pH8.8进行稀释。
(10)、用100mM柠檬酸和300mM的Nacl进行CIP，CIP后用1xPBS将电导和PH冲洗至稳定。
(11)、产出的病毒量是平均1*10^5vg/细胞。
上述实施例是以目的基因为GFP为例所进行的说明。在实际生产应用制备AAV基因药物时，根据治疗需求携带不同的目的基因，以达到基因修复或产生特定蛋白质等的治疗目的。因而，在上述实施例的基础上，目的基因质粒可以用通式pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-CMV-Target Gene来表示，其中，Target Gene可以是各种目的基因，例如Target Gene是SMN1基因(如SEQ ID No:12所示)时，可以生产出治疗脊肌萎缩症的AAV基因药物，或者Target Gene是编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列(SEQ ID No:13或SEQ ID No:14所示序列，前者编码可溶性胞外区ACE21-620片段，后者编码可溶性胞外区ACE21-740的片段)，均可使细胞表达可溶性ACE2蛋白到胞外(ACE2蛋白可与冠状病毒S蛋白特异结合)，由此制得拮抗SARS-CoV感染的AAV基因药物。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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Figure BDA0002921869390000171
Figure BDA0002921869390000181
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Figure BDA0002921869390000301
序列表
<110> 中吉智药（南京） 生物技术有限公司
<120> 一种基于诱导型昆虫细胞大规模生产AAV基因药物的方法
<141> 2021-01-27
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 482
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
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cgcgtaaaac acaatcaagt atgagtcata agctgatgtc atgttttgca cacggctcat 60
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tttgtttttc aaatcgagat gatgtcatgt tttgcacacg gctcataaac tcgctttacg 180
agtagaattc tacgtgtaac gcacgatcga ttgatgagtc atttgttttg caatatgata 240
tcatacaata tgactcattt gtttttcaaa accgaacttg atttacgggt agaattctac 300
ttgtaaagca caatcaaaaa gatgatgtca tttgtttttc aaaactgaac tcgctttacg 360
agtagaattc tacgtgtaaa acacaatcaa gaaatgatgt catttgttat aaaaataaaa 420
gctgatgtca tgttttgcac atggctcata actaaactcg ctttacgggt agaattctac 480
gc 482
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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ggaggccata gcccacactg tgcccttcta cgggtgcgta aactggacca atgagaactt 1320
tcccttcaac gactgtgtcg acaagatggt gatctggtgg gaggagggga agatgaccgc 1380
caaggtcgtg gagtcggcca aagccattct cggaggaagc aaggtgcgcg tggaccagaa 1440
atgcaagtcc tcggcccaga tagacccgac tcccgtgatc gtcacctcca acaccaacat 1500
gtgcgccgtg attgacggga actcaacgac cttcgaacac cagcagccgt tgcaagaccg 1560
gatgttcaaa tttgaactca cccgccgtct ggatcatgac tttgggaagg tcaccaagca 1620
ggaagtcaaa gactttttcc ggtgggcaaa ggatcacgtg gttgaggtgg agcatgaatt 1680
ctacgtcaaa aagggtggag ccaagaaaag acccgccccc agtgacgcag atataagtga 1740
gcccaaacgg gtgcgcgagt cagttgcgca gccatcgacg tcagacgcgg aagcttcgat 1800
caactacgca gacaggtacc aaaacaaatg ttctcgtcac gtgggcatga atctgatgct 1860
gtttccctgc agacaatgcg agagaatgaa tcagaattca aatatctgct tcactcacgg 1920
acagaaagac tgtttagagt gctttcccgt gtcagaatct caacccgttt ctgtcgtcaa 1980
aaaggcgtat cagaaactgt gctacattca tcatatcatg ggaaaggtgc cagacgcttg 2040
cactgcctgc gatctggtca atgtggattt ggatgactgc atctttgaac aataaatgat 2100
ttaaatcagg tatggctgcc gatggttatc ttccagattg gctcgaggac actctctctg 2160
atctagagcc tgcagtctcg aggcatgcgg taccaagctt gtcgagaagt actagaggat 2220
cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct ttaaaaaacc tcccacacct 2280
ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt gttaacttgt ttattgcagc 2340
ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 2400
actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggatc 2458
<210> 7
<211> 399
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atggccaagc ctttgtctca agaagaatcc accctcattg aaagagcaac ggctacaatc 60
aacagcatcc ccatctctga agactacagc gtcgccagcg cagctctctc tagcgacggc 120
cgcatcttca ctggtgtcaa tgtatatcat tttactgggg gaccttgtgc agaactcgtg 180
gtgctgggca ctgctgctgc tgcggcagct ggcaacctga cttgtatcgt cgcgatcgga 240
aatgagaaca ggggcatctt gagcccctgc ggacggtgcc gacaggtgct tctcgatctg 300
catcctggga tcaaagccat agtgaaggac agtgatggac agccgacggc agttgggatt 360
cgtgaattgc tgccctctgg ttatgtgtgg gagggctaa 399
<210> 8
<211> 92
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60
gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa at 92
<210> 9
<211> 2704
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atggctgccg atggttatct tccagtaagt actccctatc agtgatagag atctatcatg 60
gagataatta aaatgataac catctcgcaa ataaataagt attttactgt tttcgtaaca 120
gttttgtaat aaaaaaacct ataaatattc cggattattc ataccgtccc accatcgggc 180
gcgaaggggg agacctgtag tcagagcccc cgggcagcac acactgacat ccactccctt 240
cctattgttt caggattggc tcgaggacaa ccttagtgaa ggaattcgcg agtggtgggc 300
tttgaaacct ggagcccctc aacccaaggc aaatcaacaa catcaagaca acgctcgagg 360
tcttgtgctt ccgggttaca aataccttgg acccggcaac ggactcgaca agggggagcc 420
ggtcaacgca gcagacgcgg cggccctcga gcacgacaag gcctacgacc agcagctcaa 480
ggccggagac aacccgtacc tcaagtacaa ccacgccgac gccgagttcc aggagcggct 540
caaagaagat acgtcttttg ggggcaacct cgggcgagca gtcttccagg ccaaaaagag 600
gcttcttgaa cctcttggtc tggttgagga agcggctaag acggctcctg gaaagaagag 660
gcctgtagag cagtctcctc aggaaccgga ctcctccgcg ggtattggca aatcgggtgc 720
acagcccgct aaaaagagac tcaatttcgg tcagactggc gacacagagt cagtcccaga 780
ccctcaacca atcggagaac ctcccgcagc cccctcaggt gtgggatctc ttacaatggc 840
ttcaggtggt ggcgcaccag tggcagacaa taacgaaggt gccgatggag tgggtagttc 900
ctcgggaaat tggcattgcg attcccaatg gctgggggac agagtcatca ccaccagcac 960
ccgaacctgg gccctgccca cctacaacaa tcacctctac aagcaaatct ccaacagcac 1020
atctggagga tcttcaaatg acaacgccta cttcggctac agcaccccct gggggtattt 1080
tgacttcaac agattccact gccacttctc accacgtgac tggcagcgac tcatcaacaa 1140
caactgggga ttccggccta agcgactcaa cttcaagctc ttcaacattc aggtcaaaga 1200
ggttacggac aacaatggag tcaagaccat cgccaataac cttaccagca cggtccaggt 1260
cttcacggac tcagactatc agctcccgta cgtgctcggg tcggctcacg agggctgcct 1320
cccgccgttc ccagcggacg ttttcatgat tcctcagtac gggtatctga cgcttaatga 1380
tggaagccag gccgtgggtc gttcgtcctt ttactgcctg gaatatttcc cgtcgcaaat 1440
gctaagaacg ggtaacaact tccagttcag ctacgagttt gagaacgtac ctttccatag 1500
cagctacgct cacagccaaa gcctggaccg actaatgaat ccactcatcg accaatactt 1560
gtactatctc tcaaagacta ttaacggttc tggacagaat caacaaacgc taaaattcag 1620
tgtggccgga cccagcaaca tggctgtcca gggaagaaac tacatacctg gacccagcta 1680
ccgacaacaa cgtgtctcaa ccactgtgac tcaaaacaac aacagcgaat ttgcttggcc 1740
tggagcttct tcttgggctc tcaatggacg taatagcttg atgaatcctg gacctgctat 1800
ggccagccac aaagaaggag aggaccgttt ctttcctttg tctggatctt taatttttgg 1860
caaacaagga actggaagag acaacgtgga tgcggacaaa gtcatgataa ccaacgaaga 1920
agaaattaaa actactaacc cggtagcaac ggagtcctat ggacaagtgg ccacaaacca 1980
ccagagtgcc caagcacagg cgcagaccgg ctgggttcaa aaccaaggaa tacttccggg 2040
tatggtttgg caggacagag atgtgtacct gcaaggaccc atttgggcca aaattcctca 2100
cacggacggc aactttcacc cttctccgct gatgggaggg tttggaatga agcacccgcc 2160
tcctcagatc ctcatcaaaa acacacctgt acctgcggat cctccaacgg ccttcaacaa 2220
ggacaagctg aactctttca tcacccagta ttctactggc caagtcagcg tggagatcga 2280
gtgggagctg cagaaggaaa acagcaagcg ctggaacccg gagatccagt acacttccaa 2340
ctattacaag tctaataatg ttgaatttgc tgttaatact gaaggtgtat atagtgaacc 2400
ccgccccatt ggcaccagat acctgactcg taatctgtaa aagcttgtcg agaagtacta 2460
gaggatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2520
acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat 2580
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 2640
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 2700
gatc 2704
<210> 10
<211> 795
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60
ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120
gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180
caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420
atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480
gaacatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac 540
ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600
ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660
atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gaacttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720
ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780
gacgagttct tctga 795
<210> 11
<211> 2722
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180
ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240
atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300
ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360
aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420
tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480
ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540
agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600
ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660
caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720
cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780
ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840
gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900
ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960
tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020
attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080
aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140
caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200
ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260
ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320
cgattgaatt catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 1380
tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 1440
atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 1500
cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 1560
accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 1620
gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 1680
gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 1740
tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 1800
agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 1860
tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 1920
ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 1980
atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 2040
tgtacaagta agtcgagaga tctacgggtg gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct 2100
cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa aattaagttg 2160
catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg gggtggtatg 2220
gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt gggaaccaag 2280
ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat 2340
tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca ggctcagcta 2400
atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg tctccaactc 2460
ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac 2520
cactgctccc ttccctgtcc ttctgatttt gtaggtaacc acgtgcggac cgagcggccg 2580
caggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 2640
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 2700
cgagcgcgca gctgcctgca gg 2722
<210> 12
<211> 885
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atggccatga gctccggagg aagcggcgga ggagtgcccg aacaagagga ctccgtgctg 60
tttcgtagag gcaccggcca gagcgatgac tccgacatct gggacgacac cgctttaatc 120
aaggcctacg acaaggccgt ggctagcttc aagcacgctt taaagaatgg cgacatctgc 180
gagaccagcg gcaagcccaa gaccaccccc aagagaaaac ccgccaagaa gaataagagc 240
cagaagaaga acaccgccgc ctctttacag cagtggaaag tcggcgacaa gtgcagcgcc 300
atctggagcg aggacggatg catctacccc gccaccatcg ccagcatcga cttcaagagg 360
gagacttgtg tggtggtgta cactggttac ggcaatcgtg aggagcagaa tctgagcgat 420
ttactgtccc ccatctgtga ggtcgccaac aatatcgagc agaacgccca agaaaacgag 480
aacgagagcc aagttagcac cgacgagagc gagaactctc gttcccccgg caacaagtcc 540
gacaacatca aacccaagtc cgccccttgg aactcctttc tgcctccccc ccctcctatg 600
cccggcccta gactgggacc cggtaagccc ggtttaaaat tcaacggtcc ccctcctcct 660
cctcctcccc cccctcccca tttactgagc tgttggctgc cccctttccc cagcggacct 720
cccatcatcc ccccccctcc ccccatctgc cccgatagcc tcgacgatgc cgacgcttta 780
ggcagcatgc tgatcagctg gtacatgagc ggctaccaca ccggctacta catgggcttt 840
cgtcagaatc agaaggaggg tcgttgctcc cactctttaa actga 885
<210> 13
<211> 1863
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540
gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600
gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080
tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140
tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320
aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
taa 1863
<210> 14
<211> 2223
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540
gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600
gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080
tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140
tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320
aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920
tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980
cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040
tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100
gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160
agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220
taa 2223

Claims (6)

1.一种基于诱导型昆虫细胞生产AAV基因药物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；其中Rep基因质粒和Cap基因质粒含有晚期启动子；
Rep基因质粒为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Rep intron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、G2P筛选标签、IEter转录终止序列、p10晚期启动子、及表达Rep蛋白的Rep intron表达盒基因序列；
Cap基因质粒为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap intron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、BSD筛选标签、IEter转录终止序列、pH晚期启动子、及表达Cap蛋白的Cap intron表达盒基因序列；
目的基因质粒为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-Target Gene，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、Neo筛选标签、IEter转录终止序列、及表达Target Gene的腺相关病毒基因组序列；
其中，HR5的序列为SEQ ID NO:1，IE的序列为SEQ ID NO:2，G2P的序列为SEQ ID NO:3，IEter序列为SEQ ID No:4，p10序列为SEQ ID No:5，Repintron序列为SEQ ID No:6，BSD序列为SEQ ID No:7，pH序列为SEQ ID No:8，Capintron序列为SEQ ID No:9，Neo序列为SEQID No:10；
(2)将构建的三个质粒整合到Sf9昆虫细胞基因组上，得到可生产AAV的稳转细胞株；
(3)扩增、培养所述稳转细胞株；在需要生产AAV时，用不携带外源基因的杆状病毒感染所述稳转细胞株，以诱导稳转细胞株中的晚期启动子激活并驱动Rep基因和Cap基因表达，包装生产AAV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，分别将所述三个质粒逐一通过转染进入Sf9昆虫细胞中，每转染完一种质粒后，利用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到包含Rep基因质粒、Cap基因质粒及目的基因质粒三个质粒的稳转细胞株，用于生产AAV。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目的基因Target Gene为密码子优化的SMN1基因或编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列；其中，密码子优化的SMN1基因序列如SEQ ID No:12所示，所述编码可溶性胞外区ACE2蛋白的基因序列如SEQ ID No:13或SEQID No:14所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述不携带外源基因的杆状病毒为空的Baculovirus杆状病毒，用空的Baculovirus杆状病毒感染所述稳转细胞株，使细胞进入晚期的病毒样效应，激活晚期启动子，驱动Rep基因和Cap基因的表达，在细胞中包装产生AAV；
所述方法还包含步骤(4)：将经诱导表达Rep基因和Cap基因的Sf9昆虫细胞，进行反复冻融、裂解细胞，释放出AAV病毒颗粒，最后经亲和层析纯化，得到AAV病毒产品。
5.一种用于生产携带目的基因腺相关病毒的稳转细胞系的制备方法，其包含如下步骤：
步骤S1：分别构建用于包装腺相关病毒的Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒；Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒分别含有早期启动子和筛选标签；Rep基因质粒和Cap基因质粒中还含有晚期启动子；
Rep基因质粒为pBSK-HR5-IE-G2P-IEter-HR5-p10-Rep intron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、G2P筛选标签、IEter转录终止序列、p10晚期启动子、及表达Rep蛋白的Rep intron表达盒基因序列；
Cap基因质粒为pBSK-HR5-IE-BSD-IEter-HR5-pH-Cap intron-sv40，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、BSD筛选标签、IEter转录终止序列、pH晚期启动子、及表达Cap蛋白的Cap intron表达盒基因序列；
目的基因质粒为pBSK-HR5-IE-Neo-IEter-AAV-Target Gene，其包含pBSK商业化载体序列、HR5增强子、IE早期启动子、Neo筛选标签、IEter转录终止序列、及表达Target Gene的腺相关病毒基因组序列；
其中，HR5的序列为SEQ ID NO:1，IE的序列为SEQ ID NO:2，G2P的序列为SEQ ID NO:3，IEter序列为SEQ ID No:4，p10序列为SEQ ID No:5，Repintron序列为SEQ ID No:6，BSD序列为SEQ ID No:7，pH序列为SEQ ID No:8，Capintron序列为SEQ ID No:9，Neo序列为SEQID No:10；
步骤S2：分别将Rep基因质粒、Cap基因质粒和目的基因质粒逐一通过转染进入Sf9细胞中，每次转染完一种质粒后，采用与该质粒中筛选标签相应的抗生素进行筛选，选出存活的细胞，用于下一种质粒的转染，最终得到同时包含Rep基因质粒、Cap基因质粒、目的基因质粒三个质粒的存活细胞，该存活细胞为生产AAV的稳转细胞株。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，用Rep基因质粒转染Sf9细胞后，采用抗生素Puromycin进行筛选，选出存活的Sf9细胞；用Cap基因质粒转染所述Sf9细胞后，用抗生素Blasticidin进行筛选，选出存活的Sf9细胞；用目的基因质粒转染所述Sf9细胞后，用抗生素G418进行筛选，选出存活的Sf9细胞，为生产AAV的稳转细胞株。
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