CN114369619A

CN114369619A - 基因敲除用报告载体和载体系统及应用

Info

Publication number: CN114369619A
Application number: CN202111567233.6A
Authority: CN
Inventors: 许傲天; 白晓; 张起起; 刘伟志
Original assignee: Beijing Mgga Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Mgga Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-04-19

Abstract

本发明涉及分子生物学及遗传学技术领域，具体涉及一种基因敲除用报告载体和载体系统及应用。本发明的基因敲除用的报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列‑转录终止序列‑sgRNA2靶序列元件。本发明的载体系统的制备方法简单、筛选方便，快速建立基因敲除纯合子的方法通过非同源重组的方法来实现基因敲除的目的，可高效地获得突变纯合子，且筛选效率高，操作简单，可获得大量纯合子细胞，且可进行大片段的敲除，降低经济成本及时间成本。

Description

基因敲除用报告载体和载体系统及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传学技术领域，具体涉及一种基因敲除用报告载体和载体系统及应用。

背景技术

基因敲除技术是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。

目前CRISPR/Cas9有个极大的优势就是在DNA的特定位置制造双链切口，来激活细胞的DNA修复，进而实现基因定点InDel突变、小片段的缺失、编码基因和非编码基因(lncRNA、microRNA)的靶向基因敲除。而本方法不仅仅可以实现上述基因编辑成果，还可实现大片段的基因敲除。

使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除时，sgRNA的敲除活性对敲除效率有较大的影响。此外，为了获得基因敲除的纯合子细胞(以下简称“纯合子”)，还需要对经过基因敲除的细胞进行筛选。目前，常用的筛选方法之一是使用含有报告基因的报告载体进行初步筛选，例如PX458载体。但是，现有的报告载体，只能筛选出转染阳性的细胞，不能反映sgRNA是否有活性，导致获得目的细胞效率低，工作量、时间长。

CN105950656A公开了一种快速获得基因敲除细胞株的方法，使用了SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN质粒对敲除效率进行验证，该质粒上含有一个萤火虫荧光素酶表达基因和一个被目的基因隔断的不表达海肾荧光素酶表达基因，对目的基因进行有效切割之后，海肾荧光素酶表达基因发生同源重组使得海肾荧光素酶高效表达，通过表达量即可鉴定敲除效率。但是，在常见的肿瘤细胞系、终末分化的细胞等细胞内的SSA修复效率极低，远小于非同源重组修复效率，而细胞基因组被切割后主要采用的是非同源重组修复机制，因此SSA方法并不能真实反映细胞染色体DNA修复的真实情况，所以SSA筛选纯合子的效率也相对较低，此外，SSA重组方法中，仅有1个sgRNA有效，其转染的细胞即可表达荧光，不能反映两个sgRNA同时发挥作用的情况，不利于用于对基因进行片段删除的基因编辑的筛选工作。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的筛选效率低，筛选细胞不能真实反应CRISPR/Cas9活性的问题，提供一种基因敲除用报告载体、载体系统、应用及建立基因敲除纯合子的方法。本发明所述载体系统中所使用的sgRNA1、sgRNA2有活性时，报告载体中的荧光蛋白表达元件才能有效表达，所述载体系统的制备方法简单、筛选方便，所述的快速建立基因敲除纯合子的方法通过非同源重组的方法来实现基因敲除的目的，可高效地获得突变纯合子，且筛选效率高，操作简单，可获得大量纯合子细胞，且可进行大片段的敲除，降低经济成本及时间成本。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种基因敲除用的报告载体，该报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件。

本发明第二方面提供一种载体系统，该载体系统包括表达载体和报告载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2；

所述报告载体为如前所述的报告载体。

本发明第三方面提供一种如前所述的载体系统在建立基因敲除细胞株中的应用。

本发明第四方面提供一种建立基因敲除纯合子的方法，所述方法包括：

(i)细胞转染：将如前所述的载体系统转染目标细胞，得到转染后的目标细胞；

(ii)阳性单克隆筛选：将所述转染后的目标细胞进行阳性单克隆筛选，得到阳性单克隆；

(iii)筛选纯合子：将所述阳性单克隆进行PCR鉴定，得到基因敲除纯合子。

图15为本发明的原理图。本发明的报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件，若sgRNA1、sgRNA2或Cas9蛋白任意一个不能够发生作用(即，不具有敲除活性)，则报告载体中的转录终止序列将终止转录，报告载体上的荧光蛋白表达元件不能被转录，细胞无法表达荧光蛋白。只有当Cas9蛋白与sgRNA1、sgRNA2同时能够发生作用(即，具有敲除活性)的情况下，报告载体的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件中的转录终止序列被切除，在细胞自身的非同源末端连接的DNA修复机制下，载体中的启动子与后面的荧光表达元件直接连接进而启动荧光表达元件的转录，可成功表达GFP荧光蛋白。由于sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件中的两个sgRNA靶序列分别为敲除目标基因上sgRNA1和sgRNA2的靶序列，因此可以通过观察GFP荧光来判断Cas9蛋白、sgRNA1和sgRNA2是否都能够发生作用(即是否具有敲除活性)。本发明的建立基因敲除纯合子的方法通过使用上述载体系统转染目标细胞，流式分选GFP荧光阳性的单克隆细胞即分选出基因组上的最有可能成功基因敲除的细胞，进而高效获得纯合子突变细胞。具体地，本发明获得的有益效果至少包括：

(1)本发明的载体系统和建立基因敲除纯合子的方法使用范围广泛，可以获得稳定的基因敲除细胞株，且可在多种细胞中进行基因敲除及纯合子筛选；

(2)通过观察细胞GFP荧光，可快速直观的判断是否敲除成功，极大的提高了工作效率；

(3)由于本发明的特殊工作原理，可快速筛选得到敲除目标基因的细胞，进而可高效获得纯合子，实现了高效敲除：在293T细胞中转染后获得的纯合子比例可达90％以上，在A549细胞中转染后获得的纯合子的比例可达50％以上；

(4)本发明利用CRISPR/Cas9可以制造双链切口的工作原理和非同源重组的特殊工作原理，通过针对敲除目标基因上不同的靶序列设计、使用两个sgRNA，可实现对敲除目标基因的大片段删除；

(5)由于本发明的报告载体中含有sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件，故只有在两个sgRNA均有发生作用的情况下报告载体上的荧光表达元件才可以正常表达，因此本发明可同时检测2个sgRNA的活性，可极大降低工作量。而以往的CRISPR/Cas9基因敲除技术中，如SSA方法中仅可检测1个sgRNA，且无法有效进行大片段删除的富集和分选。

附图说明

图1为实施例1步骤(2)中sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的电泳图，M：15000DNA marker，1：sgRNA1表达载体，2：为sgRNA2表达载体。

图2为实施例1步骤(3)中报告骨架载体pIRES-EGFP(T1)的PCR扩增产物电泳图。M:15000DNAmarker，1：阴性对照(灭菌水)，2：pIRES-EGFP(T1)的PCR产物。

图3为实施例1步骤(3)中T2的的PCR扩增产物电泳图。M:2000DNAmarker，1：T2的PCR产物，2：阴性对照(灭菌水)。

图4为实施例1步骤(3)中CMV-sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2 target-IRES-GFP报告载体的质粒图谱。

图5为实施例1步骤(3)中CMV-sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列-IRES-GFP报告载体中sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列的测序结果，通过snapgene进行序列比对分析。

图6为实施例1步骤(4)中转染48h后的A549细胞(实验组)以及空白对照组的GFP荧光图。A为实验组GFP荧光，B为实验组明场，C为空白对照组GFP荧光，D为空白对照组明场。

图7为实施例1步骤(5)(a)中转染48h后的A549细胞(实验组)以及空白对照组的阳性效率分析结果。A为空白对照组，B为实验组。

图8为实施例1步骤(5)(b)中的PCR验证电泳图。M：2000DNA marker，1:空白对照组，2：实验组，3：以无菌水为模板的PCR阴性对照。

图9为实施例1步骤(6)中，扩大培养后的A549细胞单克隆的PCR鉴定电泳图，M：2000DNA marker，WT：空白对照组，1-23分别为23个单克隆的PCR产物，“—”表示以无菌水为模板的PCR阴性对照。

图10为实施例1步骤(6)中，扩大培养后的A549细胞单克隆的PCR产物测序结果，利用snapgene进行序列比对分析。A为敲除成功的单克隆的分析结果，B为未敲除成功的单克隆的分析结果。

图11为实施例2步骤(4)中转染48h后的293T细胞(实验组)以及空白对照组的GFP荧光图。A为实验组GFP荧光，B为实验组明场，C为空白对照组GFP荧光，D为空白对照组明场。

图12为实施例2步骤(5)(a)中转染48h后的293T细胞(实验组)以及空白对照组的GFP流式分析结果。A为对照组，B为实验组。

图13为实施例2步骤(6)中扩大培养后的293T单克隆细胞的PCR鉴定电泳图，WT：空白对照，1-33：分别为33个单克隆的PCR产物，“—”表示以无菌水为模板的PCR阴性对照。

图14为实施例2步骤(6)中扩大培养后的293T细胞单克隆的PCR产物测序结果使用snapgenne软件进行序列比对分析。A为敲除成功的单克隆的分析结果，B为未敲除成功的单克隆的分析结果。

图15为本发明的原理图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

未作特殊说明的情况下，本发明述及的各种表达元件或序列以5’至3’的顺序示出和连接。

本发明中，所述sgRNA指的是识别目标基因上不同靶序列的sgRNA，即向导RNA，所述sgRNA含有识别序列和骨架序列。

本发明中，所述sgRNA1靶序列和sgRNA2靶序列指的是敲除目标基因上两个不同的靶点，分别可以被sgRNA1和sgRNA2识别。本发明中，所述sgRNA1靶序列和sgRNA2靶序列的获得方法为本领域常用的方法，在此不再赘述。

本发明第一方面提供一种基因敲除用高效筛选的报告载体，该报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件。

本发明中，所述报告载体指的是：可以指示CRISPR/Cas9系统是否具有切割DNA双链作用的报告载体。

本发明的一些实施方式中，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子和CAG启动子中的至少一种。

本发明中，所述转录终止序列可以为本领域常用的可以终止转录的序列，例如可以为转录终止信号序列PolyA和/或WPRE。本发明的一些实施方式中，所述转录终止序列为PolyA。

本发明中，所述转录终止序列如PolyA、WPRE为本领域常用序列，在此不再赘述。

本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白表达元件含有IRES序列和荧光蛋白编码基因。

本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白编码基因为GFP基因、RFP基因、Mcherry基因和YFP基因的至少一种。

本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白表达元件为IRES-GFP表达元件。

本发明中，所述报告载体中使用的“载体”(即报告骨架载体)可选用本领域已知的各种载体，例如市售的pIRES-EGFP(Clontech公司)质粒等。优选的情况下，本发明中所述报告载体中使用的“载体”为含有启动子和IRES-GFP表达元件的质粒，其中，所述启动子优选为CMV启动子、EF1a启动子或CAG启动子，进一步优选CMV启动子或EF1a启动子。进一步优选的，所述报告载体含有CMV启动子、IRES-GFP元件与位于CMV启动子和IRES-GFP元件之间的sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件。

本发明中，所述报告载体的构建可以为本领域常用的方法，例如可以为重叠PCR法将载体和sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件连接。

本发明中，为了防止元件间距离太近，从而影响切割后的修复，各元件之间由一些碱基序列进行间隔，所述碱基序列的选择没有特殊限定，只要能将各元件间隔开即可，为本领域技术人员公知，在此不再赘述。例如，sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件中，sgRNA1靶序列、转录终止序列、sgRNA2靶序列之间由一些碱基序列进行间隔。

本发明一些优选的实施方式中，所述报告载体通过在pIRES-EGFP(Clontech公司)载体的CMV启动子与IRES-GFP元件之间插入sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件制得的。

本发明中，所述sgRNA1靶序列或sgRNA2靶序列可以为各种针对目标基因、能够通过CRISPR/Cas9实现目标基因基因敲除的序列。以敲除STAT1基因(也即靶基因为STAT1基因)为例(STAT1基因组序列为NCBI NG_008294.1)，sgRNA1靶序列可以如SEQ ID NO:3所示；sgRNA2靶序列可以如SEQ ID NO:4所示。

本发明第二方面提供一种基因敲除用的载体系统，该载体系统包括表达载体和报告载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2；

所述报告载体为如前所述的报告载体。本发明中，可以采用本领域常规的方法来构建所述表达载体，例如，所述Cas9、sgRNA1、sgRNA2可以在同一个表达载体中表达，也可以在不同表达载体中表达。优选的情况下，所述Cas9、sgRNA1、sgRNA2分别在三个表达载体中表达。

本发明中，所述表达载体中使用的“载体”可以为本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒如Clontech公司的pIRES-EGFP，Clontech公司的pEGFP-C1质粒等。

优选的情况下，本发明中所述表达载体中使用的“载体”为质粒。

当所述Cas9、sgRNA1、sgRNA2分别在三个表达载体中表达时，所述载体包括Cas9表达载体、sgRNA1表达载体、sgRNA2表达载体。

本发明的一些实施方式中，所述Cas9表达载体可以通过商购获得，优选为PX330(ADDGENE Plasmid#42230)、PX165(ADDGENE Plasmid#48137)、PX459(ADDGENE Plasmid#62988)中的至少一种。

本发明的一些实施方式中，所述sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体中使用的“载体”为含有sgRNA骨架序列的质粒，可以通过商购或者自行合成得到。优选的情况下，所述sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体中使用的“载体”通过以下方法得到：将合成的U6-sgRNA骨架序列的DNA序列(SEQ ID NO:11)克隆到PUC-18T载体(博迈德公司)上，得到PUC-sgRNA质粒。

本发明中，所述表达载体可以采用本领域常规的技术手段来构建，例如，可以采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与具有相同核酸内切酶的粘性末端的双链DNA片段连接，或者与通过一对引物(oligo)直接退火生成的具有粘性末端的双链DNA片段连接，获得所述表达载体。

本发明的一些实施方式中，以sgRNA1表达载体的构建为例，所述sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的构建方法为：根据sgRNA1靶序列设计一对引物sgRNA1F和sgRNA1R，进行引物退火得到退火产物(具有粘性末端的双链DNA片段)，将退火产物与经过酶切的含有sgRNA骨架序列的线性质粒相连。以敲除STAT1基因(也即靶基因为STAT1基因)为例，sgRNA1F的序列可以如SEQ ID NO：5所示，sgRNA1R的序列可以如SEQ ID NO：6所示，sgRNA1的识别序列可以如SEQ ID NO:9所示；sgRNA2F的序列可以如SEQ ID NO：7所示，sgRNA2R的序列可以如SEQ ID NO：8所示，sgRNA2的识别序列可以如SEQ ID NO:10所示。

本发明中，本领域技术人员可以通过本领域常规技术手段选择sgRNA1、sgRNA2的识别序列并设计sgRNA1F和sgRNA1R、sgRNA2F和sgRNA2R。

本发明第三方面提供如前所述的载体系统在建立基因敲除细胞株中的应用。

本发明的一些实施方式中，所述应用为在快速建立基因敲除细胞株中的应用。

本发明的一些实施方式中，所述应用为在快速建立基因敲除纯合子中的应用。

(ii)阳性单克隆筛选：将所述转染后的目标细胞进行阳性单克隆筛选，得到目标阳性单克隆；

本发明中，所述基因敲除纯合子指的是等位基因均发生敲除的单克隆细胞。

本发明中，所述细胞转染的方法和条件可以为本领域常规选择，本领域技术人员可以根据实际情况对细胞转染的方法和条件进行调整，在此不再赘述。优选的情况下，所述细胞转染的方式可以为电穿孔转染法、脂质体介导法、磷酸钙法或病毒介导法。

本发明中，所述阳性单克隆指的是表达荧光的单克隆细胞。

本发明的一些实施方式中，步骤(ii)中，所述阳性单克隆筛选可以为本领域的常规技术手段，例如可以为将所述转染后的目标阳性细胞用流式细胞仪进行阳性单克隆筛选。

本发明的一些实施方式中，所述步骤(iii)还包括：将所述阳性单克隆进行PCR鉴定前先进行扩大培养。

本发明的一些优选的实施方式中，步骤(ii)为：将所述转染后的目标细胞通过流式细胞仪进行单克隆分选，将得到的单克隆细胞在96孔板进行培养，每5-7天显微镜下观察，待单克隆生长至50-90％，挑选出单克隆细胞在24孔板进行扩大培养后，通过PCR鉴定，得到基因敲除纯合子。

本发明中，所述目标细胞可以为各种需要进行基因敲除的细胞，例如以为A549细胞、293T细胞或HEK293K细胞。

本发明的一些实施方式中，所述载体系统适用于敲除各种靶基因，如STAT1基因、STAT2基因。

本发明的发明人发现，敲除STAT2基因的细胞用在包装病毒中时，能够稳定高效地包装病毒如慢病毒、高效扩增病毒如腺病毒，病毒滴度更高。进一步优选的情况下，敲除STAT2基因的HEK293细胞用在包装病毒中时，能够进一步提高产毒量以及病毒回收率。因此，本发明还涉及采用本发明的载体系统敲除STAT2基因的方法在提高细胞产毒量中的应用。另一方面，本发明还涉及采用本发明的载体系统敲除HEK293细胞的STAT2基因的方法在提高细胞产毒量中的应用。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，除非特别说明，所用产品均购自正规化学或生物试剂供应商，所用方法均为本领域常用方法。

以下实施例中，除非特殊说明，采用、合成的序列均委托博迈德公司合成，测序均委托博迈德公司进行。

以下实施例中，除非特殊说明，所用细胞培养基为含10％FES的DMEM培养基。

抗性(Amp+，氨苄青霉素)LB培养基的成分配比为：蛋白胨10g/L、酵母浸液5g/L、氯化钠10g/L、Amp+100ug/ml。当抗性(Amp+)LB培养基为固体时，还含有15g/L的琼脂。

PUC-sgRNA质粒通过以下方法制备：合成U6-sgRNA骨架序列的DNA序列(SEQ IDNO.:11)，通过PCR克隆将该DNA序列克隆到PUC18-T载体(购自博迈德公司)上，得到PUC-sgRNA质粒。

U6-sgRNA骨架序列的DNA序列

GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTGTCTTCAACACAAGAAGACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGgATcc(SEQ IDNO.:11)

sgRNA1表达载体、sgRNA2表达载体、报告载体的转化按照以下方法进行：

(1)细菌转化

准备工作(提前～30min):从-80℃冰箱取出储存在EP管中的感受态细胞Trans-T1(购自北京全式金)(每管为100μL)，置于冰上融化(约15min)后，每管分出一半(50μL)到一个新EP管；打开42℃和37℃两个水浴锅；取抗性(Amp+)LB固体培养基放入37℃培养箱预热。

每管感受态细胞Trans-T1(50μL)分别进行如下操作：加入10μL质粒(即sgRNA1表达载体或sgRNA2表达载体或报告载体)，冰上放置10min，放入42℃水浴锅内，热击40s，快速转移至冰上放置2min，加入500μL无抗生素LB培养基，置于37℃水浴锅内1h，12,000rpm离心2min，弃上清，500μL LB培养基重悬后涂板于抗性(Amp+)LB固体培养基，放入37℃培养箱过夜。

(2)测序鉴定

准备适量EP管，每管加入1mL抗性(Amp+)LB液体培养基。每块细菌培养板挑5个正常大小的单菌落，分别放入上述EP管内，放入37℃振荡培养箱，225rpm，16h，将菌液送测序鉴定，选取测序正确克隆的菌落进行提质粒。

(3)提质粒

将步骤(2)中测序正确的单克隆进行扩大培养，然后使用质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取步骤质粒，用超微量分光光度计(购自Denovix公司，型号为DS-11FX)检测质粒浓度和纯度，质粒A260/A280、A260/A230均在1.8～2.0范围即为鉴定合格，-80℃保存备用。

实施例1

该实施例用以说明本发明的载体系统及筛选方法，以敲除目标基因为STAT1基因为例。

(1)敲除目标基因鉴定引物设计

根据敲除目标基因(STAT1基因组序列NCBI NG_008294.1)设计表1中的引物序列。

表1

SEQ ID NO.:1:STAT1F(5＇-3＇)	GGTCCCCTGTTGACTTTTCCCCCTTCAGAG
		SEQ ID NO.:2:STAT1R(5＇-3＇)	CAGAAGCAAGGCAAGGTGGAGTCTAGTTCC

(2)构建sgRNA1和sgRNA2表达载体

(a)sgRNA引物退火(sgRNA primers annealling)

根据STAT1基因组序列设计两个sgRNA靶点，即sgRNA1靶序列(SEQ ID NO：3，TCATTGGCAGCGTGCTCCCTAGG)和sgRNA2靶序列(SEQ ID NO：4，CGTAATCTTCAGGTATGACCTGG)，根据两个靶序列分别设计一对引物，所述引物序列如表2所示。

表2

按照表3分别在PCR管中配制反应体系，将反应体系放入PCR仪，95℃变性2分钟后缓慢退火(每8s下降0.1℃)90min，分别得到sgRNA1退火产物和sgRNA2退火产物。

表3

(b)连接

将PUC-sgRNA质粒用BbsI进行酶切获得线性PUC-sgRNA质粒。

按照表4所示在PCR管中分别配制反应体系(连接体系)，置于室温1h，分别得到线性PUC-sgRNA质粒与sgRNA1退火产物的连接产物、线性PUC-sgRNA质粒与sgRNA2退火产物的连接产物(即sgRNA1表达载体、sgRNA2表达载体)。其中，sgRNA1表达载体含有sgRNA1的识别序列(SEQ ID NO：9，AGGGAGCACGCTGCCAATGA)，sgRNA2表达载体含有sgRNA2的识别序列(SEQID NO：10，CGTAATCTTCAGGTATGACC)。

表4

(c)sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体的转化与质粒提取

分别将sgRNA1表达载体和sgRNA2表达载体进行细菌转化、挑选单克隆、送样测序鉴定，根据送样测序结果，选择测序正确的克隆进行摇菌，提取sgNRA1表达载体和sgRNA2表达载体的质粒，如图1所示，质粒大小与预期相符。

(3)构建CMV-sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列-IRES-GFP载体(即报告载体)

将报告骨架载体pIRES-EGFP(购自Clontech公司)(T1)的菌液与含有sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件(通过博迈德公司全基因合成，序列为SEQ ID NO.:12)的载体(委托博迈德公司构建，使用的“载体”为PUC-18T)(T2)菌液分别通过PCR扩增(T1和T2的正向引物和反向引物如表5所示)，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果分别如图2和图3所示。

sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件：

TGCACCTAGGGAGCACGCTGCCAATGATGTTTCATTTGCCACCATCCGTTTTCATGACCTCTAGTCTAGAGGATCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCA CCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAG GGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGG AGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCG AGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCAT ATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAG GCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTACGTAATCTTCAGGTATGACCTGGTTTTTGTATTTTAGTTGAGTCGACTGAAGATCTTGATAACTCGAGC(SEQ ID NO：12)

下划线处依次分别为sgRNA1靶序列的反向互补序列(为了和细胞基因组上的靶序列保持一致，此处显示靶序列的互补序列)、PolyA、sgRNA2靶序列，各序列之间由一些碱基序列进行间隔，防止元件间靠得太近影响切割后的修复。

表5

通过图2(M泳道为15000DNA marker)可以看出，T1在4900bp处有单一条带，与预期大小相符。通过图3(M泳道为2000DNA marker)可以看出，T2在632bp处有单一条带(sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件)，与预期大小相符。将PCR产物纯化后(使用天漠生物的纯化试剂盒，货号：TD407-200)，采用重叠PCR方法连接，得到报告载体，报告载体的完整载体图谱见图4，其中，载体中具有按照5’-3’方向依次连接的以下主要元件序列，每个元件序列间有间隔的序列：

KanR

TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAGTGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCACCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCCGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCTGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGCCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCAT(SEQ ID NO.:17)；

CMV启动子

CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT

(SEQ ID NO.:18)；

sgRNA1靶序列的反向互补序列

CCTAGGGAGCACGCTGCCAATGA(SEQ ID NO.:19)

下划线处为PAM序列的反向互补序列。

PolyA

GGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATT(SEQ ID NO.:20)

sgRNA2靶序列

CGTAATCTTCAGGTATGACCTGG(SEQ ID NO.:4)

下划线处为PAM序列。

IRES

ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTACACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATA

(SEQ ID NO.:21)

GFP

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO.:22)

将报告载体转化并涂板后，挑取单克隆菌落，送测序鉴定(报告载体中sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列测序结果经过snapgene序列比对结果如图5所示。测序正确的单克隆与质粒图谱一致)。将测序正确单克隆摇菌扩大培养后，提取报告载体(即CMV-sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列-IRES-GFP载体)的质粒。

(4)细胞转染

(a)准备待转染细胞：转染前一天将A549细胞(购自中国科学院细胞库，TCHu150)种6孔板，确保转染当天密度在80％左右，转染前需更换新鲜细胞培养基。

(b)按照表6配制转染体系，将A管溶液加入B管内，混匀，室温静置10min，然后逐滴(约0.04mL/s)加入待转染细胞，37℃、5％CO₂培养箱培养，4-6小时后更换新鲜的细胞培养基继续培养，得到转染细胞(实验组)。同时将未转染的A549细胞放入37℃、5％CO₂培养箱，作为空白对照组。

表6

(c)转染后48h显微镜观察细胞状态，镜下观察空白对照组的荧光情况，结果显示观察不到任何荧光(如图6C所示)，说明实验成立；镜下观察实验组的荧光情况，实验组细胞出现GFP荧光表达(如图6A所示)，说明转染至细胞的Cas9、sgRNA1和sgRNA2能够发生作用，报告载体在Cas9、sgRNA1和sgRNA2的作用下，PolyA序列(转录终止信号序列)被切除，在细胞内的DNA非同源重组修复机制作用下，报告载体上的CMV启动子与IRES-GFP元件连接，报告基因(即GFP基因)表达。由于报告载体上sgRNA1和sgRNA2的靶序列就是目的基因上的靶序列，因此STAT1基因被敲除的概率较大。

(5)流式分析及流式分选单克隆细胞

待步骤(4)中的转染48h后的转染细胞进行消化并调整细胞密度至2-3×10⁶个/mL，用流式细胞仪进行阳性效率分析(以未转染的A549细胞为空白对照组)、阳性细胞库建立和单克隆分选。

(a)阳性效率分析的结果如图7所示，可以得知，转染细胞中分选出的GFP荧光阳性细胞(即阳性细胞)占所有转染细胞的34.12％，说明在所有转染细胞中，cas9、sgRNA1、sgRNA2在34.12％的细胞内具有活性。

(b)阳性细胞库PCR验证

取一部分阳性细胞库中的细胞(实验组)，以及未转染的A549细胞(空白对照组)，分别离心1000×g，5min，弃上清，分别进行基因组提取(天根基因组提取试剂盒)；

以上述基因组为模板，以步骤(1)引物分别进行PCR扩增。(PCR体系如表7所示，PCR程序如表8所示)；

表7

表8

将实验组和空白对照组的PCR扩增产物分别通过1.5％琼脂糖凝胶电泳，以灭菌水作阴性对照，结果如图8所示。通过图8可以看出，空白对照组在STAT1基因的相应位置(约906bp)有单一条带，阴性对照没有条带，而实验组在下方906bp、730bp位置的各有一条带。电泳结果可初步证明阳性细胞库中有细胞发生基因片段的缺失。

(c)单克隆分选及扩大培养

通过流式细胞仪分选96个单克隆至96孔板(加有细胞培养基)中，放入37℃、5％CO₂培养箱培养，每5-7天将96孔板放显微镜下观察，同时补充新鲜细胞培养基100ul/孔。由于96孔板中单克隆并未全部生长，待有生长的单克隆长至96孔板底面积的50-90％，将生长的单克隆(23个单克隆)进行消化，并传代至24孔细胞培养板，继续扩大培养单克隆长至24孔板底部面积的50-90％，得到扩大培养的单克隆。

(6)纯合子筛选

步骤(5)(c)中扩大培养的单克隆(23个)(实验组)按照与步骤(5)(b)相同的方法进行基因组提取和PCR扩增(以未转染的A549细胞作为空白对照组)。

PCR鉴定：将实验组和空白对照的PCR扩增产物分别通过1.5％琼脂糖凝胶电泳，以灭菌水作阴性对照，结果如图9所示。其中12个单克隆的PCR产物的电泳条带(730bp)低于空白对照的条带(906bp)(即敲除成功的单克隆)，说明存在STAT1基因的大片段敲除；另11个单克隆的PCR产物的电泳条带(906bp)与空白对照的条带一致(906bp)，说明不存在STAT1基因的大片段敲除，这可能是由流式细胞仪分选过程中的细胞间发生粘连、筛选条件不够优化、分选或单克隆细胞进行了同源重组修复导致的，属于正常的误差范围。

所有23个单克隆的PCR产物送测序后，根据测序结果进一步鉴定。图10为测序结果，对测序结果进行分析，23个单细胞克隆测序结果显示，敲除成功的12单克隆的PCR产物的测序结果发现片段缺失而且缺失碱基数均不是3的倍数，均造成基因的移码突变，判定均为纯合子缺失，为敲除成功纯合子，其余11个单克隆的PCR测序结果显示未敲除成功；纯合子的概率达到(12/23)x100％＝52％。

纯合子概率＝(敲除成功的单克隆数/总的生长克隆数)x100％

实施例2

按照实施例1的方法对293T细胞(购自中国医学科学院细胞库，GNHu17)中的STAT1基因进行敲除。

其中，步骤(5)(c)中，96孔板中有33个单克隆有生长，待生长至50-90％后，将生长的单克隆进行消化(33个单克隆)，并传代至两个24孔细胞培养板，继续培养。

步骤(4)中293T细胞转染后48h(实验组)的荧光情况如图11所示，通过图11A可以看出实验组有GFP荧光，说明Cas9、sgRNA1和sgRNA2能够发生作用(从图11C可以看出，空白对照组没有GFP荧光，实验成立)；步骤(5)中293T细胞转染后48h(实验组)，通过流式分析阳性效率(步骤(5)(a))，结果如图12所示。通过图12可以看出，293T细胞中分选出的GFP荧光阳性细胞为84.7％，说明在所有转染细胞中，cas9、sgRNA1和sgRNA2在84.7％的细胞内具有活性。

步骤(6)中，33个单克隆PCR扩增产物的电泳检测结果如图13所示。通过图13可以看出，在挑取的33个单细胞克隆中有30个单克隆发生了片段缺失，说明存在STAT1基因的敲除，为敲除成功的单克隆；所有33个单克隆的PCR产物进行测序分析，结果如图14所示。通过snapgene软件分析显示，敲除成功的30个单克隆发现片段缺失而且缺失碱基数均不是3的倍数，均造成基因的移码突变，判定均为纯合子缺失，为敲除成功纯合子；其余3个单克隆的PCR测序结果显示未敲除成功；(这可能是由流式细胞仪分选过程中的细胞间发生粘连、筛选条件不够优化、分选或单克隆细胞进行了同源重组修复导致的，属于正常的误差范围)；纯合子概率达到(30/33)x100％＝91％。

通过实施例1和实施例2的结果可以看出，使用本发明的方法和载体系统，可以实现基因的高效敲除。在293T细胞中转染后获得的纯合子比例可达90％以上，在A549细胞中转染后获得的纯合子的比例可达50％以上。两种细胞中纯合子的比例不同主要由于不同的细胞转染的效率不同、DNA修复机制不尽相同，以及多种修复机制所占比重不同。此外，A549细胞在进行流式分选时，易发生粘连，导致分选出的非GFP阳性细胞较多，而且非GFP阳性细胞是未进行基因编辑的细胞，这些细胞DNA没有Cas9切割，不需要DNA的修复，在生长成单克隆的时候比较容易生长，上述原因均有可能导致A549细胞的纯合子比例较低，但是本发明的方法相比于常规方法能够提高A549细胞纯合子筛选效率。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京镁伽科技有限公司

<120> 基因敲除用报告载体和载体系统及应用

<130> I72549BMG

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 1

ggtcccctgt tgacttttcc cccttcagag 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 2

cagaagcaag gcaaggtgga gtctagttcc 30

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 3

tcattggcag cgtgctccct agg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 4

cgtaatcttc aggtatgacc tgg 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized

<400> 5

accgtcattg gcagcgtgct ccct 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 6

aaacagggag cacgctgcca atga 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 7

accgcgtaat cttcaggtat gacc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 8

aaacggtcat acctgaagat tacg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 9

agggagcacg ctgccaatga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 10

cgtaatcttc aggtatgacc 20

<210> 11

<211> 411

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 11

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccaaggtc gggcaggaag agggcctatt 60

tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga taattagaat 120

taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa agtaataatt 180

tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt 240

aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccgc 300

tgtcttcaac acaagaagac acgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 360

tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt tttttggatc c 411

<210> 12

<211> 632

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 12

tgcacctagg gagcacgctg ccaatgatgt ttcatttgcc accatccgtt ttcatgacct 60

ctagtctaga ggatcccggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc 120

tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt 180

tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg 240

ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg 300

cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc 360

ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac caggctcagc taatttttgt 420

ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc 480

aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga accactgctc 540

ccttccctgt ccttctgatt ttacgtaatc ttcaggtatg acctggtttt tgtattttag 600

ttgagtcgac tgaagatctt gataactcga gc 632

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 13

ggtatgacct ggtttttgta ttttagttga gtcgactgaa gatcttgata actcgagc 58

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 14

cagcgtgctc cctaggtgca actgcagaat tcgaagcttg a 41

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 15

tgcacctagg gagcacgctg cca 23

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 16

tattttagtt gagtcgactg aagatcttga taactcgagc 40

<210> 17

<211> 816

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 17

ttagaaaaac tcatcgagca tcaagtgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat 60

accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca 120

taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc 180

tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac 240

tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca 300

gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc accaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg 360

cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgcc gttaaaagga caattacaaa caggaatcga 420

atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata 480

ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc tgggatcgca gtggtgagta accatgcatc 540

atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt 600

tagcctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa 660

caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac 720

attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg 780

cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcat 816

<210> 18

<211> 508

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 18

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480

acggtgggag gtctatataa gcagagct 508

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 19

cctagggagc acgctgccaa tga 23

<210> 20

<211> 483

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 20

gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60

gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120

ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180

acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240

ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300

ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360

ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420

tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg 480

att 483

<210> 21

<211> 553

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 21

acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 60

ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 120

cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 180

tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 240

gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 300

aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 360

aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 420

taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtacac atgctttaca tgtgtttagt 480

cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 540

cacgatgata ata 553

<210> 22

<211> 720

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> This sequence is synthesized.

<400> 22

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims

1.一种基因敲除用的报告载体，其特征在于，该报告载体含有启动子、荧光蛋白表达元件与位于启动子和荧光蛋白表达元件之间的sgRNA1靶序列-转录终止序列-sgRNA2靶序列元件。

2.根据权利要求1所述的报告载体，其中，所述启动子为CMV启动子、EF1a启动子和CAG启动子中的至少一种；

和/或，所述转录终止序列为PolyA和/或WPRE；

和/或，所述荧光蛋白表达元件含有IRES序列和荧光蛋白编码基因。

3.根据权利要求2所述的报告载体，其中，所述荧光蛋白编码基因为GFP基因、RFP基因、Mcherry基因和YFP基因的至少一种。

4.根据权利要求3述的报告载体，其中，所述报告载体含有CMV启动子、IRES-GFP元件与位于CMV启动子和IRES-GFP元件之间的sgRNA1靶序列-PolyA-sgRNA2靶序列元件。

5.一种基因敲除用的载体系统，其特征在于，该载体系统包括表达载体和报告载体，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1和sgRNA2；

所述报告载体为权利要求1-4中任意一项所述的报告载体。

6.根据权利要求5所述的载体系统，其中，所述表达载体包括sgRNA1表达载体、sgRNA2表达载体和Cas9表达载体。

7.权利要求5或6所述的载体系统在建立基因敲除细胞株中的应用。

8.一种建立基因敲除纯合子的方法，其特征在于，该方法包括：

(i)细胞转染：将权利要求5或6所述的载体系统转染目标细胞，得到转染后的目标细胞；

9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(ii)中，所述阳性单克隆筛选包括：将所述转染后的目标阳性细胞用流式细胞仪进行阳性单克隆筛选。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述目标细胞为A549细胞或293T细胞；

和/或，所述敲除目标基因为STAT1基因。