CN116083488A - 基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学及遗传学领域，公开了基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用。所述方法包括：(1)将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中，得到阳性细胞库；(2)将阳性细胞库中的阳性细胞进行纯合子细胞筛选，得到纯合子细胞；(3)将表达载体II转至纯合子细胞中，进行对筛选标记基因表达盒无痕切割，得到纯合子克隆。本发明的系统和方法使用范围广泛，可以获得稳定的基因编辑的细胞株，且适用于多种细胞。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传学领域，具体涉及一种基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统是来自于细菌与古细菌的一种免疫形式，CRISPR(ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)为规律间隔成簇短回文重复序列，Cas(CRISPR-associated genes)为CRISPR相关基因，自1987年首次发现该序列之后，CRISPR/Cas系统迅速被科研人员所利用，并成为目前最主流的基因编辑工具。例如，可以通过CRISPR/Cas系统诱发同源重组修复(homology-directedrepair，HDR)，利用HDR可以通过具有同源序列的内源或外源DNA模板进行重组的机制，引入带有基因编辑序列的供体质粒(donorplasmid)，供体质粒还可带有筛选标记，其通常被引入到基因组的内含子中，以便对基因编辑成功的细胞进行筛选。由于内含子不会影响mRNA正常转录，现有技术通常在内含子中插入筛选标记后并不将其去除。然而，内含子在基因转录翻译中起调控作用，插入内含子中的序列可能对细胞产生未知的遗传影响，且稳定的筛选标记使细胞带有了荧光或抗生素的抗性，限制对该细胞进行其它改造和检测的手段。有研究通过在筛选标记的上下游插入同方向的loxp序列，在得到编辑后克隆通过导入Cre重组酶来切除筛选标记。该技术中虽然切除了绝大部分筛选标记，但是由于Cre-loxp系统自身特点，会在原位点留下一个34bp的loxp序列。Cre-loxp系统虽然较未切除筛选标记的方法有所改进但是仍未做到真正的无痕编辑。
目前通过CRISPR系统进行精确基因编辑的方法包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(ABE)和先导编辑器(PrimeEditor，PE)。CBE与ABE只能完成特定的四种碱基转换，不能完成碱基的插入，而且有研究发现CBE或ABE编辑后诱发了大量非靶向突变。并且CBE存在一定几率错误编辑的情况并可能引入碱基插入或缺失。PE系统复杂，获得编辑成功克隆的概率很低。另外，三种编辑器均涉及将Cas9和相关酶构建成融合蛋白，由于融合蛋白较大，三种编辑器均较难以完成向细胞内递送，进一步限制了其成功率。并且，碱基编辑器对单碱基编辑精准性并不尽如人意。
因此，亟需一种具有较高基因编辑成功率的无痕基因编辑系统和方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种基因编辑方法、基因编辑方法得到的细胞、基因编辑系统及其应用。本发明的方法能够实现对目标细胞的无痕基因编辑，并且操作简单，更适用于细胞系的构建。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种进行基因编辑的方法，所述方法包括：
(1)将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中，得到阳性细胞库；
(2)将阳性细胞库中的阳性细胞进行纯合子细胞筛选，得到纯合子细胞；
(3)将表达载体II转至纯合子细胞中，进行对筛选标记基因表达盒无痕切割，得到纯合子克隆；
其中，所述表达载体I能够表达Cas9和sgRNA1；
所述表达载体II能够表达sgRNA2-1、sgRNA2-2和Cas9；
所述sgRNA1能够和Cas9结合对细胞的基因组中外显子N和外显子N+1之间的内含子M进行切割；
所述供体质粒含有外显子N’和内含子M’的同源臂，所述外显子N’的序列包括基因编辑后的外显子N上发生了基因编辑处的序列，所述内含子M’的序列为在内含子M的sgRNA1的靶点中插入有筛选标记基因表达盒的序列；
所述sgRNA2-1、sgRNA2-2能够和Cas9结合对内含子M’上的筛选标记基因表达盒序列进行切割
本发明第二方面提供一种通过如前所述的方法得到的细胞。
本发明第三方面提供一种基因编辑系统，所述系统包括如前所述的表达载体I、表达载体II和供体质粒。
本发明第四方面提供如前所述的系统在无痕基因编辑中的应用。
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在基因内含子上寻找sgRNA的靶点以及sgRNA的靶序列，进而设计sgRNA序列，sgRNA能够与内含子的靶序列结合并引导核酸内切酶Cas9切割DNA双链产生双链断裂。产生双链断裂后，通过细胞自身同源重组修复途径将供体质粒上的带有基因编辑和筛选标记基因表达盒的同源臂由双链断裂处整合至基因组中。为了获得“无痕”编辑的克隆，本发明根据整合至基因组中的筛选标记基因表达盒及其上下游序列设计了两个sgRNA，分别命名为sgRNA2-1与sgRNA2-2，通过sgRNA2-1、sgRNA2-2及核酸内切酶Cas9切除整合至基因组上的筛选标记，断裂的DNA链通过非同源末端连接的修复方式修复为DNA双链，以达到无痕编辑的目的。
本发明的一些优选的实施方式中，所述方法的原理为：首先在基因内含子上设计sgRNA序列，另设计具有筛选标记的供体质粒，通过细胞自身同源重组修复途径将供体质粒上的带有基因编辑和筛选标记基因表达盒的同源臂由双链断裂处整合至基因组中。后在筛选标记前后共设计两个sgRNA，通过这2个sgRNA及核酸内切酶Cas9切除整合至基因组上的筛选标记，断裂的DNA链通过非同源末端连接的修复方式修复为DNA双链，以达到无痕编辑的目的。
通过上述技术方案，本发明获得的有益效果至少包括：
(1)本发明的系统和方法使用范围广泛，可以获得稳定的基因编辑(例如基因点突变或敲入序列)的细胞株，且适用于多种细胞；
(2)使用双链DNA形式的供体质粒作为同源修复模板，可以导入片段较大的筛选标记，如荧光蛋白基因GFP、mCherry等或抗生素抗性蛋白基因PuroR、HygR等；
(3)本发明选择在内含子中设计sgRNA1的靶点，可以避免修复过程中可能引入的碱基插入或缺失造成外显子基因突变；
(4)本发明中使用的供体质粒较小，便于向细胞内递送；
(5)本发明可以实现无痕期初筛选标记基因表达盒，达到无痕编辑的目的，避免导致未知的转录或剪切错误。
附图说明
图1是实施例步骤(1)中的质粒胶图结果，1、2、3泳道分别为sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体；
图2是实施例步骤(6)中的纯合子、杂合子峰图对比图结果，A为突变纯合子峰图，B为突变杂合子峰图；
图3是实施例步骤(2)中构建的供体质粒的质粒图谱，A为pEASY-Blunt-AGE1-EF1α-GFP-T2A-HygR为供体质粒的质粒图谱，B为pEASY-Blunt-AGE1-EF1α-GFP-T2A-PuroR供体质粒的质粒图谱；
图4是实施例步骤(3)中的转染后继续培养24h后的荧光观察结果，A为明场，B为暗场；
图5是实施例步骤(7)中的转染后继续培养48h后的荧光观察结果，A为明场，B为暗场；
图6是实施例步骤(7)中的点突变测序结果序列比对图结果；
图7是实施例步骤(7)中的点突变测序结果纯合子峰图结果；
图8是实施例步骤(7)中的菌液PCR扩增胶图结果；
图9是实施例步骤(7)中的切除表达盒后的测序鉴定结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中，所述sgRNA的靶点指的是sgRNA和Cas9结合对基因组序列进行切割使得基因组序列断裂的位置。例如，所述sgRNA1的靶点指的是sgRNA1和Cas9结合对内含子M切割后M断裂的位置。
本发明中，所述sgRNA的靶序列指的是能够被sgRNA识别的序列。例如，所述sgRNA1的靶序列可以是内含子M上能够被sgRNA1识别的序列。
本发明第一方面提供一种进行基因编辑的方法，所述方法包括：
(1)将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中，得到阳性细胞库；
(2)将阳性细胞库中的阳性细胞进行纯合子细胞筛选，得到纯合子细胞；
(3)将表达载体II转至纯合子细胞中(以进行对筛选标记基因表达盒的无痕切割)，得到纯合子克隆；
其中，所述表达载体I能够表达Cas9和sgRNA1；
所述表达载体II能够表达sgRNA2-1、sgRNA2-2、Cas9；
所述sgRNA1能够和Cas9结合对细胞的基因组中外显子N和外显子N+1之间的内含子M进行切割；
所述供体质粒含有外显子N’和内含子M’的同源臂，所述外显子N’的序列包括基因编辑后的外显子N上发生了基因编辑处的序列，所述内含子M’的序列为在内含子M的sgRNA1的靶点中插入有筛选标记基因表达盒的序列；
所述筛选标记基因表达盒的序列从5’端至3’端依次含有以下元件：序列NNNNGG、启动子、荧光蛋白基因、2A肽基因、抗性蛋白基因；
所述sgRNA2-1、sgRNA2-2能够和Cas9结合对内含子M’上的筛选标记基因表达盒序列进行切割。
本发明中，sgRNA1的靶点位于细胞的基因组中外显子N和外显子N+1之间的内含子M中的任意位置。经sgRNA1和Cas9作用后，内含子M被截断(断裂)，产生双链断裂后，通过细胞自身同源重组修复途径将供体质粒上的带有基因编辑和筛选标记基因表达盒的同源臂由双链断裂处整合至基因组中。
根据本发明，sgRNA2-1和sgRNA2-2的靶点位于筛选标记基因表达盒两端，能够切除整合至基因组中的筛选标记基因表达盒，实现无痕编辑。根据本发明的一种实施方式，所述sgRNA2-1的靶点位于筛选标记基因表达盒的下游(3’端)；所述sgRNA2-2的靶点位于筛选标记基因表达盒的上游(5’端)。
序列NNNNGG中，N指的是任意碱基(A、C、G或T)。
本发明中，所述sgRNA1、sgRNA2-1、sgRNA2-2的设计操作与选择参考现有sgRNA设计流程，或参考https://zlab.bio/guide-design-resources。本发明中，可以采用根本领域常规的方法来构建所述表达载体I，例如，所述Cas9和sgRNA1可以在同一个表达载体中表达，也可以在不同表达载体中表达。优选的情况下，所述Cas9与sgRNA1在不同表达载体中表达，所述表达载体I包括sgRNA1表达载体和Cas9表达载体。
本发明中，可以采用根本领域常规的方法来构建所述表达载体II，例如，所述Cas9和sgRNA2-1、sgRNA2-2可以在同一个表达载体中表达，也可以在不同表达载体中表达。本发明中，当sgRNA2-1、sgRNA2-2在不同表达载体中表达时，表达sgRNA2-1的表达载体称为sgRNA2-1表达载体；表达sgRNA2-2的表达载体称为sgRNA2-2表达载体。优选的情况下，所述Cas9、sgRNA2-1、sgRNA2-2在不同表达载体中表达，所述表达载体II包括sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体和Cas9表达载体。
本发明中，所述Cas9表达载体可以为本领域常用载体，例如可以为eSpCas9质粒(金斯瑞公司)。
本发明的一些实施方式中，所述表达载体所使用的“载体”可以为本领域常用于构建Cas9、sgRNA1、sgRNA2表达载体的“载体”。
应当理解的是，本发明中，所述sgRNA表达载体含有sgRNA骨架序列和sgRNA识别序列。其中，sgRNA表达载体含有的sgRNA骨架序列经过转录后可以与Cas9蛋白结合，该序列为本领域常规技术选择，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不再赘述；所述sgRNA表达载体含有的sgRNA识别序列经过转录后能够识别sgRNA的靶序列。
本发明中，所述sgRNA表达载体的构建可以为本领域常规方法，例如可以合成sgRNA序列，然后经由酶切连接将sgRNA片段连入相应载体。
本发明的一些实施方式中，sgRNA1表达载体的制备方法为：先设计sgRNA1的靶序列，然后根据sgRNA1的靶序列设计一对引物sgRNA1F和sgRNA1R，进行引物退火得到sgRNA1退火产物(具有粘性末端的双链DNA片段)，将退火产物与经过酶切的含有sgRNA骨架序列的线性质粒相连，得到sgRNA1表达载体，所述sgRNA1表达载体含有sgRNA1识别序列。优选的情况下，所述sgRNA1的靶序列为SEQ ID NO.3，所述sgRNA1F的序列为SEQ ID NO.6，所述sgRNA1R的序列为SEQ ID NO.7。其中，所述sgRNA1识别序列为SEQ ID NO.12。优选的情况下，所述线性质粒通过以下制备方法制得：合成U6-sgRNA骨架序列的DNA序列(SEQ IDNO.1)，通过PCR克隆将该序列克隆到的PUC18-T载体上，将得到的质粒命名为PUC-sgRNA质粒，对PUC-sgRNA质粒进行线性化，得到线性质粒。
本发明的一些实施方式中，sgRNA2-1表达载体的制备方法为：先设计sgRNA2-1的靶序列，然后根据sgRNA2-1的靶序列设计一对引物sgRNA2-1F和sgRNA2-1R，进行引物退火得到sgRNA2-1退火产物(具有粘性末端的双链DNA片段)，将退火产物与经过酶切的含有sgRNA骨架序列的线性质粒相连，得到sgRNA2-1表达载体，所述sgRNA2-1表达载体含有sgRNA2-1识别序列。优选的情况下，所述sgRNA2-的靶序列为SEQ ID NO.4，所述sgRNA2-1F的序列为SEQ ID NO.8，所述sgRNA2-1R的序列为SEQ ID NO.9。其中，所述sgRNA2-1识别序列为SEQ ID NO.13。优选的情况下，所述线性质粒通过以下制备方法制得：合成U6-sgRNA骨架序列的DNA序列(SEQ ID NO.1)，通过PCR克隆将该序列克隆到的PUC18-T载体上，将得到的质粒命名为PUC-sgRNA质粒，对PUC-sgRNA质粒进行线性化，得到线性质粒。
本发明的一些实施方式中，sgRNA2-2表达载体的制备方法为：先设计sgRNA2-2的靶序列，然后根据sgRNA2-2的靶序列设计一对引物sgRNA2-2F和sgRNA2-2R，进行引物退火得到sgRNA2-2退火产物(具有粘性末端的双链DNA片段)，将退火产物与经过酶切的含有sgRNA骨架序列的线性质粒相连，得到sgRNA2-2表达载体，所述sgRNA2-2表达载体含有sgRNA2-2识别序列。优选的情况下，所述sgRNA2-2的靶序列为SEQ ID NO.5，所述sgRNA2-2F的序列为SEQ ID NO.10，所述sgRNA2-2R的序列为SEQ ID NO.11。其中，所述sgRNA2-2识别序列为SEQ ID NO.14。优选的情况下，所述线性质粒通过以下制备方法制得：合成U6-sgRNA骨架序列的DNA序列(SEQ ID NO.1)，通过PCR克隆将该序列克隆到的PUC18-T载体上，将得到的质粒命名为PUC-sgRNA质粒，对PUC-sgRNA质粒进行线性化，得到线性质粒。
本发明中，为了防止元件间距离太近，从而影响切割后的修复，各元件之间由一些碱基序列进行间隔，所述碱基序列的选择没有特殊限定，只要能将各元件间隔开即可，为本领域技术人员公知，在此不再赘述。
本发明的一些实施方式中，所述sgRNA1的靶点与待编辑位点相差1-20bp。
本发明的一些实施方式中，所述sgRNA2-1的靶序列由5’-3’端依次为sgRNA1的靶序列中sgRNA1靶点下游的3个碱基与筛选标记基因表达盒3’末端的17个碱基组成。
本发明的一些实施方式中，所述sgRNA2-2的靶序列由5’-3’端依次为sgRNA1的靶序列中靶点上游的17个碱基和筛选标记5’末端3个碱基。
本发明的一些实施方式中，所述启动子为EF1α、CMV启动子、EF1a启动子和CAG启动子中的至少一种。
本发明的一些实施方式中，所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白(GFP)和/或红色荧光蛋白(RFP)。
本发明的一些实施方式中，所述抗性蛋白基因为PuroR、HygR、Zeocin、KanR中的至少一种。
本发明的一些实施方式中，所述2A肽基因为P2A、T2A、E2A、F2A的至少一种。
本发明的一些实施方式中，所述外显子N’包括基因编辑后的外显子N上发生了基因编辑处的序列，也即外显子N’的序列至少包括基因编辑产生的目标序列的片段(只要包含了基因编辑处的序列或包括待编辑位点即可)，可以理解，也可以包括基因编辑后的外显子N全长序列。所述基因编辑为点突变或敲入。应当理解的是，当所述基因编辑为点突变时，所述外显子N’的序列与外显子N的序列相比较，区别在于外显子N’的序列中含有点突变；当所述基因编辑为敲入时，所述外显子N’的序列与外显子N的序列相比较，区别在于外显子N’的序列中含有敲入序列。
以sgRNA靶点位置为中心，上下游各选择80-120bp长度作为同源臂，同源臂需覆盖点突变或敲入位点，两端同源臂之间为-EF1α-GFP/mCherry-T2A-PuroR/HygR-筛选标记基因表达盒序列，EF1α片段5’端添加3个随机碱基和一个NGG序列。通过overlap PCR等方法将上下游同源臂及筛选标记基因表达盒进行连接并连接到质粒载体上。分别构建不同荧光筛选或不同抗性基因的两种供体质粒用于筛选纯合子。
本发明的一些实施方式中，为了提高转染效率，步骤(1)中，转染时所述目标细胞的汇合度为70-80％。
本发明的一些时候方式中，步骤(1)还包括：将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中后进行阳性细胞筛选。
本发明中，所述阳性细胞筛选可以为本领域常规技术选择。例如，当所述供体质粒上的抗性蛋白基因为PuroR时，所述筛选可以为嘌呤霉素阳性细胞筛选。
本发明的一些实施方式中，为了获得纯合子克隆，所述供体质粒可以为2个，即供体质粒1、供体质粒2，所述供体质粒1、2含有不同的抗性蛋白基因。优选的情况下，所述阳性细胞筛选为根据供体质粒1、2上的抗性蛋白基因依次进行筛选。例如，当所述供体质粒1上的抗性蛋白基因为PuroR而供体质粒2上的抗性蛋白基因为HygR时，所述筛选可以为先进行嘌呤霉素阳性细胞筛选，再进行潮霉素B阳性细胞筛选。
本发明的一些实施方式中，步骤(1)还包括：对阳性细胞筛选得到的细胞分单克隆继续培养。
本发明中，步骤(2)中，所述纯合子细胞筛选可以为本领域常规技术选择，例如可以药物筛选方法及流式细胞筛选方法等。
本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述纯合子细胞筛选包括：于基因编辑的位点上下游设计鉴定引物，上游或下游鉴定引物距基因编辑的位点(点突变或敲入)300-400bp，提取纯合子细胞的gDNA，以纯合子细胞的gDNA为模板，利用鉴定引物进行PCR扩增，对扩增得到的基因片段进行Sanger测序，测序结果与待编辑进行比对，鉴定是否发生基因编辑，根据测序结果中读出的碱基序列判定出编辑成功的纯合子克隆，编辑成功的纯合子克隆在测序结果中体现为序列读出为编辑后序列，信号峰形图单一且清晰，无套峰和杂峰。对发生基因编辑的纯合子细胞通过有限稀释等方式分选单克隆培养，得到纯合子单克隆，进行扩大培养。
本发明的一些实施方式中，步骤(3)还包括：将表达载体II转至纯合子细胞中后对细胞进行荧光阴性细胞筛选。
本发明的一些实施方式中，步骤(3)包括：将纯合子细胞扩大培养，转染sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体与Cas9表达载体，转染后通过流式细胞分选荧光阴性细胞扩大培养，并进而分选单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养后在目标细胞基因组(插入筛选表达标记的位置)上下游再次设计引物，扩增相应基因片段，Sanger测序找出切除筛选标记后且无其它插入缺失突变的克隆，即为最终需要的无痕编辑的纯合子克隆。
本发明中，所述荧光阴性细胞筛选可以为本领域常规技术选择，例如通过流式细胞仪进行分选。
本发明的一些实施方式中，所述目标细胞为RPE细胞、293T细胞和A549细胞中的至少一种，优选为RPE细胞。
本发明的一些优选的实施方式中，所述目标细胞为RPE细胞，所述外显子N的序列如SEQ ID NO.26所示；所述内含子M的序列如SEQ ID NO.27所示；所述外显子N’的序列如SEQ ID NO.28所示；
所述表达载体I包括sgRNA1表达载体和Cas9表达载体，其中，所述sgRNA1表达载体含有sgRNA的骨架序列和sgRNA1的识别序列，所述sgRNA1的识别序列如SEQ ID NO.12所示；
所述表达载体II包括sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体和Cas9表达载体，其中，所述sgRNA2-1表达载体含有sgRNA的骨架序列和sgRNA2-1的识别序列，所述sgRNA2-1的识别序列如SEQ ID NO.13所示，所述sgRNA2-2表达载体含有sgRNA的骨架序列和sgRNA2-2的识别序列，所述sgRNA2-2的识别序列如SEQ ID NO.14所示。
GGCGACCACGGTGTCTTCAAAAGCCCCGTCAGGGTTGGCTTCCTGGGGCCGGACCGACTGTGGGTCAGTTTGCACCAGCGCTCTGGAATCGAGTTACGCGCGAAAGGGCAGAGTTTCTGGAGGAAACCGCAGCCTCTCAACCGCTGACCGGGTCTCAGAAGGCCCCCGGCAGGGCCGCTTGGCGGGAACTGACCACGCGCCAGTCAGGCTCTCCAGGGACCTGCGCAGGCGCGTGTGGGCGGAGTCGTGCGCAGGGGGCGGGGCTTCGGGAAGGAGCCACAGAGAGGGCGGGGCGTAGGACCTGCGCTTCGGGGGTGGAGTCGGAGCGGCGCGGCGGCGGTCATGCGGGACGCGGATGCAGACGCAGGCGGAGGCGCTGACGGCGGGGATGGCCGGGGTGGCCACAGCTGCCGCGGGGGCGTGGACACAGCCGCAGCTCCGGCCGGTGGAGCTCCCCCAGCGCACGCGCCAGGTCCGGGCAGAGACGCCGCGTCTGCGGCCAGGGGGTCAGG(SEQ IDNO.26)
GTATCCTTTCCGAGCTGGGGGCTGCTTGCGGCGGAGCGAGGGCTGGACTCGGGGAGAAGGAAAGGAGGGCGGGCGGGGGGCCGACGGAAAGGGTAGCAGGGGGGGACCGGGGCTGGCGTATACGGTCAGAGGTGGTCGGAGGAGGGGAAGACATTGAAATGGAGGGAGAAGCTCTGCTAACGGTGGCCTGGGCGAGGTAAGGAGTGAAGGGGGTGACACTAGGCAGGGTGACCTGAGAGGGGGCTTCAGAGGAGCAAGAAGGCCTGAGACATAGGCAAGATCGTATCAGATGGCACCTTAACCGAATGACCCCCAG(SEQ ID NO.27)
CGGCGACCACGGTGTCTTCAAAAGCCCCGTCAGGGTTGGCTTCCTGGGGCCGGACCGACTGTGGGTCAGTTTGCACCAGCGCTCTGGAATCGAGTTACGCGCGAAAGGGCAGAGTTTCTGGAGGAAACCGCAGCCTCTCAACCGCTGACCGGGTCTCAGAAGGCCCCCGGCAGGGCCGCTTGGCGGGAACTGACCACGCGCCAGTCAGGCTCTCCAGGGACCTGCGCAGGCGCGTGTGGGCGGAGTCGTGCGCAGGGGGCGGGGCTTCGGGAAGGAGCCACAGAGAGGGCGGGGCGTAGGACCTGCGCTTCGGGGGTGGAGTCGGAGCGGCGCGGCGGCGGTCATGCGGGACGCGGATGCAGACGCAGGCGGAGGCGCTGACGGCGGGGATGGCCGGGGTGGCCACAGCTGCCGCGGGGGCGTGGACACAGCCGCAGCTCCGGCCGGTGGAGCTCCCCCAGCGCACGCGCCAGGTCCGGGCAGAGACGCCGCGTCTGCGGCCAGGGGGTCAGGT(SEQ IDNO.28)
本发明第二方面提供通过如前所述的方法得到的细胞。
本发明第三方面提供一种基因编辑系统，所述系统包括：表达载体I、表达载体II和供体质粒。其中，对所述系统的进一步限定如表达载体I、供体质粒、表达载体II的进一步限定如本发明第一方面所述，在此不再赘述。
本发明第四方面提供如前所述的系统在无痕基因编辑中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，除非特别说明，所用产品均购自正规化学或生物试剂供应商，所用方法均为本领域常用方法。以下实施例中，除非特殊说明，采用、合成的序列均委托博迈德公司合成，测序均委托博迈德公司进行。以下实施例中，除非特殊说明，所用细胞培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
抗性(Amp+，氨苄青霉素)LB培养基的成分配比为：蛋白胨10g/L、酵母浸液5g/L、氯化钠10g/L、Amp+100ug/ml。当抗性(Amp+)LB培养基为固体时，还含有15g/L的琼脂。
PUC-sgRNA质粒通过以下方法制备：合成U6-sgRNA骨架序列的DNA序列(SEQIDNO.1)，通过PCR克隆将该DNA序列克隆到PUC18-T载体(购自博迈德公司)上，得到PUC-sgRNA质粒，该质粒含有sgRNA的骨架序列。
U6-sgRNA骨架序列的DNA序列
GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTGTCTTCAACACAAGAAGACACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGGATCC(SEQ ID NO.1)
pEASY-Blunt载体序列
AGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCAGAATTAACCCTCACTAAAGGGACTAGTCCTGCAGGTTTAAACGAATTGGCCCTTAAGGGCCAATTCGCGGCCGCTAAATTCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTATACGTACGGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCGGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAATGTCAGGCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAG(SEQ ID NO.2)
靶向内含子sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体、报告载体的转化按照以下方法进行：
(1)细菌转化
准备工作(提前～30min)：从-80℃冰箱取出储存在EP管中的感受态细胞Trans-T1(购自北京全式金)(每管为100μL)，置于冰上融化(约15min)后，每管分出一半(50μL)到一个新EP管；打开42℃和37℃两个水浴锅；取抗性(Amp+)LB固体培养基放入37℃培养箱预热。
每管感受态细胞Trans-T1(50μL)分别进行如下操作：加入10μL待转化质粒，冰上放置10min，放入42℃水浴锅内，热击40s，快速转移至冰上放置2min，加入500μL无抗生素LB培养基，置于37℃水浴锅内1h，12,000rpm离心2min，弃上清，500μL LB培养基重悬后涂板于抗性(Amp+)LB固体培养基，放入37℃培养箱过夜。
(2)测序鉴定
准备适量EP管，每管加入1mL抗性(Amp+)LB液体培养基。每块细菌培养板挑5个正常大小的单菌落，分别放入上述EP管内，放入37℃振荡培养箱，225rpm，16h，将菌液送测序鉴定，选取测序正确克隆的菌落进行提质粒。
(3)提质粒
将步骤(2)中测序正确的单克隆进行扩大培养，然后使用质粒小提中量试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取步骤质粒，用超微量分光光度计(购自Denovix公司，型号为DS-11FX)检测质粒浓度和纯度，质粒A260/A280、A260/A230均在1.8～2.0范围即为鉴定合格，-80℃保存备用。
实施例1
该实例利用本发明所示系统及筛选方法，对RPE细胞(人视网膜色素上皮细胞，购自中国科学院细胞库，GNHu45)进行无痕编辑，构建AGE1基因(Gene ID:852136)c.65C>G突变的RPE细胞。
(1)sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体的构建
使用pUC-sgRNA载体分别构建sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体。具体步骤如下：
(a)sgRNA引物退火
根据目标基因(Gene ID:852136)的序列设计sgRNA1的靶序列(SEQ ID NO.3，GGGACCGGGGCTGGCGTATACGG)，sgRNA2-1的靶序列(SEQ ID NO.4，CCGGGGCTGGCGTATACGGTTGG)，sgRNA2-2的靶序列(SEQ ID NO.5，GGCCGCATTGAATTCGACAGAGG)，并根据上述靶序列分别设计并合成一对引物，引物合成序列如表1所示。
表1
| SEQ ID NO.6: sgRNA1 F(5＇-3＇) | ACCGGGGACCGGGGCTGGCGTATA |
| SEQ ID NO.7:sgRNA1 R(5＇-3＇) | AAACTATACGCCAGCCCCGGTCCC |
| SEQ ID NO.8:sgRNA2-1 F(5＇-3＇) | ACCGGGGCTGGCGTATACGGTTGG |
| SEQ ID NO.9:sgRNA2-1 R(5＇-3＇) | AAACCCAACCGTATACGCCAGCCC |
| SEQ ID NO.10:sgRNA2-2 F(5＇-3＇) | ACCGGGCCGCATTGAATTCGACAG |
| SEQ ID NO.11:sgRNA2-2 R(5＇-3＇) | AAACCTGTCGAATTCAATGCGGCC |
(b)sgRNA引物退火
按照表2分别在PCR管中配制反应体系，将反应体系放入PCR仪，反应条件为95℃变性2分钟后缓慢退火(每8s下降0.1℃)90min，分别得到sgRNA1退火产物、sgRNA2-1退火产物和sgRNA2-2退火产物。
表2
(c)sgRNA表达载体的构建
将PUC-sgRNA质粒用BbsI进行酶切获得线性PUC-sgRNA质粒。按照表3所示在PCR管中分别配制连接体系，置于室温1h，分别得到线性PUC-sgRNA质粒与sgRNA1退火产物的连接产物、线性PUC-sgRNA质粒与sgRNA2-1退火产物的连接产物及线性PUC-sgRNA质粒与sgRNA2-2退火产物的连接产物(即sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体和sgRNA2-2表达载体)。其中，sgRNA1表达载体含有sgRNA1的识别序列(SEQ ID NO.12，GGGACCGGGGCTGGCGTATA)，sgRNA2-1表达载体含有sgRNA2-1的识别序列(SEQ ID NO.13，GGGCTGGCGTATACGGTTGG)，sgRNA2-2表达载体含有sgRNA2-2的识别序列(SEQ ID NO.14，GGCCGCATTGAATTCGACAG)。
表3
室温连接1h，将得到的连接产物分别转化至Trans1-T1感受态细胞、挑选单克隆、送样测序鉴定，选取测序正确的克隆，分别得到sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体。(如图1所示，从左至右分别为：sgRNA1表达载体、sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体)。
(2)供体质粒的构建
(a)以步骤(1)(a)中设计的sgRNA1的靶点位置为中心，于供体质粒上游同源臂5’端设计上游引物F1，下游同源臂3’设计下游引物R1。引物如表4所示：
表4
采用基因组提取试剂盒(购自天根公司)提取RPE细胞的gDNA(基因组DNA)，以RPE细胞的gDNA为模板扩增F1与R1间目标片段，使用诺唯赞2×Phanta Flash Master Mix(DyePlus)(P520)作为扩增酶，扩增反应体系与条件如下：
配制体系如下所示：
反应条件如表5所示：
表5
扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的条带，胶回收产物连接pEASY-Blunt载体(购自全式金，序列如SEQ ID NO.：2所示)，转化Trans1-T1感受态细胞。第二天挑单菌落于500μl抗性LB培养基中，37℃恒温200rpm摇菌3h，取1μl菌液做菌液PCR鉴定，阳性菌液送测鉴定，得到含有同源臂的质粒。
(b)根据预编辑位点设计突变引物F2、R2(如表6所示)，通过反向PCR将突变位点引入含有同源臂的质粒中。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小是否正确，随后，用DpnⅠ酶37℃消化PCR产物2h，反应产物转化至Trans1-T1感受态细胞中。第二天挑单克隆菌测序鉴定，引入突变成功的单菌落克隆进行下一步构建。
表6
(c)筛选标记基因表达盒的插入
对步骤(b)得到的单菌落克隆进行质粒提取，将提取的质粒分为两份，分别插入不同的筛选标记基因表达盒，构建得到pEASY-Blunt-AGE1-EF1α-GFP-T2A-PuroR和pEASY-Blunt-AGE1-EF1α-GFP-T2A-HygR两个供体质粒(委托博迈德公司构建)，两个供体质粒的完整载体图谱见图3，其中，供体质粒中主要元件序列如下所示：
Hygro
ATGAAGAAGCCCGAACTCACCGCTACCAGCGTTGAAAAATTTCTCATCGAGAAGTTCGACAGTGTGAGCGACCTGATGCAGTTGTCGGAGGGCGAAGAGAGCCGAGCCTTCAGCTTCGATGTCGGCGGACGCGGCTATGTACTGCGGGTGAATAGCTGCGCTGATGGCTTCTACAAAGACCGCTACGTGTACCGCCACTTCGCCAGCGCTGCACTACCCATCCCCGAAGTGTTGGACATCGGCGAGTTCAGCGAGAGCCTGACATACTGCATCAGTAGACGCGCCCAAGGCGTTACTCTCCAAGACCTCCCCGAAACAGAGCTGCCTGCTGTGTTACAGCCTGTCGCCGAAGCTATGGATGCTATTGCCGCCGCCGACCTCAGTCAAACCAGCGGCTTCGGCCCATTCGGGCCCCAAGGCATCGGCCAGTACACAACCTGGCGGGATTTCATTTGCGCCATTGCTGATCCCCATGTCTACCACTGGCAGACCGTGATGGACGACACCGTGTCCGCCAGCGTAGCTCAAGCCCTGGACGAACTGATGCTGTGGGCCGAAGACTGTCCCGAGGTGCGCCACCTCGTCCATGCCGACTTCGGCAGCAACAACGTCCTGACCGACAACGGCCGCATCACCGCCGTAATCGACTGGTCCGAAGCTATGTTCGGGGACAGTCAGTACGAGGTGGCCAACATCTTCTTCTGGCGGCCCTGGCTGGCTTGCATGGAGCAGCAGACTCGCTACTTCGAGCGCCGGCATCCCGAGCTGGCCGGCAGCCCTCGTCTGCGAGCCTACATGCTGCGCATCGGCCTGGATCAGCTCTACCAGAGCCTCGTGGACGGCAACTTCGACGATGCTGCCTGGGCTCAAGGCCGCTGCGATGCCATCGTCCGCAGCGGGGCCGGCACCGTCGGTCGCACACAAATCGCTCGCCGGAGCGCAGCCGTATGGACCGACGGCTGCGTCGAGGTGCTGGCCGACAGCGGCAACCGCCGGCCCAGTACACGACCGCGCGCTAAGGAGGTAGGTCGAGTTTAA(SEQ ID NO.19)
Puro
TCAGGCACCGGGCTTGCGGGTCATGCACCAGGTGCGCGGTCCTTCGGGCACCTCGACGTCGGCGGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTTGCGGGGCGCGGAGGTCTCCAGGAAGGCGGGCACCCCGGCGCGCTCGGCCGCCTCCACTCCGGGGAGCACGACGGCGCTGCCCAGACCCTTGCCCTGGTGGTCGGGCGAGACGCCGACGGTGGCCAGGAACCACGCGGGCTCCTTGGGCCGGTGCGGCGCCAGGAGGCCTTCCATCTGTTGCTGCGCGGCCAGCCGGGAACCGCTCAACTCGGCCATGCGCGGGCCGATCTCGGCGAACACCGCCCCCGCTTCGACGCTCTCCGGCGTGGTCCAGACCGCCACCGCGGCGCCGTCGTCCGCGACCCACACCTTGCCGATGTCGAGCCCGACGCGCGTGAGGAAGAGTTCTTGCAGCTCGGTGACCCGCTCGATGTGGCGGTCCGGATCGACGGTGTGGCGCGTGGCGGGGTAGTCGGCGAACGCGGCGGCGAGGGTGCGTACGGCCCTGGGGACGTCGTCGCGGGTGGCGAGGCGCACCGTGGGCTTGTACTCGGTCAT(SEQ ID NO.20)
T2A
AGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGTAGACTTCCTCTGCCCTC(SEQ ID NO.21)
CopGFP
GGCGAAGGCGATGGGGGTCTTGAAGGCGTGCTGGTACTCCACGATGCCCAGCTCGGTGTTGCTGTGCAGCTCCTCCACGCGGCGGAAGGCGAACATGGGGCCCCCGTTCTGCAGGATGCTGGGGTGGATGGCGCTCTTGAAGTGCATGTGGCTGTCCACCACGAAGCTGTAGTAGCCGCCGTCGCGCAGGCTGAAGGTGCGGGCGAAGCTGCCCACCAGCACGTTATCGCCCATGGGGTGCAGGTGCTCCACGGTGGCGTTGCTGCGGATGATCTTGTCGGTGAAGATCACGCTGTCCTCGGGGAAGCCGGTGCCCACCACCTTGAAGTCGCCGATCACGCGGCCGGCCTCGTAGCGGTAGCTGAAGCTCACGTGCAGCACGCCGCCGTCCTCGTACTTCTCGATGCGGGTGTTGGTGTAGCCGCCGTTGTTGATGGCGTGCAGGAAGGGGTTCTCGTAGCCGCTGGGGTAGGTGCCGAAGTGGTAGAAGCCGTAGCCCATCACGTGGCTCAGCAGGTAGGGGCTGAAGGTCAGGGCGCCTTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGGTCATGCGGCCCTGCTTGGGGGTGCCCTCTCCGCCGCCCACCAGCTCGAACTCCACGCCGTTCAGGGTGCCGGTGATGCGGCACTCGATCTCCAT(SEQ ID NO.22)
EF1a
CTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCC(SEQ IDNO.23)
(3)细胞转染
细胞转染前一天将RPE细胞(人视网膜色素上皮细胞，购自中国科学院细胞库，GNHu45)进行传代铺板，待第二天细胞汇合度70-80％时进行细胞转染，转染所用试剂为lip3000，转染所用质粒为sgRNA1表达载体、Cas9表达载体(pCDNA3.1-cas9，购自苏州镁伽科技有限公司)与步骤(2)获得的两个供体质粒经质粒大提获得高纯度无内毒素的质粒，转染体系如表7所示，转染后24h观察GFP荧光，能观察到荧光说明细胞转染成功(如图4所示)。
表7
(4)嘌呤霉素阳性细胞库筛选
转染后48h消化细胞，传代培养，待细胞贴壁后使用换用含2μg/ml嘌呤霉素的培养基处理细胞，维持药物筛选压力1-2周，期间每2-3天更换新的培养基，得到稳定耐药的细胞作为这一阶段的阳性细胞库。
(5)潮霉素B阳性细胞库筛选
嘌呤霉素筛选阳性细胞库扩大培养后，消化细胞，传代培养，待细胞贴壁后换用含550μg/ml潮霉素B的培养基处理细胞，维持药物筛选压力2-3周，期间每2-3天更换新的培养基，得到稳定耐药的阳性细胞，通过有限稀释法分单克隆继续培养，得到单克隆细胞即为纯合子细胞。
(6)嘌呤霉素、潮霉素B双耐药细胞库分选单克隆与编辑效果鉴定
将该细胞库用有限稀释法分单克隆继续培养，得到单克隆细胞，采用基因组提取试剂盒(购自天根公司)提取单克隆细胞的gDNA。设计鉴定引物F3,R3，如表8所示。以单克隆细胞gDNA为模板，使用鉴定引物F3、R3进行PCR扩增，扩增目的片段，扩增产物交于测序公司进行测序，测序结果显示待编辑位点C碱基成功突变为G碱基，且测序峰图显示峰型单一，无杂峰和套峰，说明为纯合子克隆(如图2所示)。
表8
| SEQ ID NO.24:F 3(5＇-3＇) | ATGGATTTTTATACTACTGAT |
| SEQ ID NO.25:R 3(5＇-3＇) | GTCCTTTTTGGCCAATTTTA |
(7)sgRNA2-1、sgRNA2-2结合Cas9蛋白切除筛选标记基因表达盒
用sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体、Cas9表达载体转染步骤(6)筛选得到的纯合子克隆，转染体系如表9所示。
表9
转染后继续培养48h，48h后应用流式细胞仪分选出GFP阴性细胞(如图5所示)，这些阴性细胞扩大培养并分选单克隆继续培养。因DNA双链断裂后，NHEJ修复方式会造成小片段插入或缺失，所以使用表8引物，扩增片段，通过测序找到与插入表达盒之前的待编辑序列一致的修复后克隆，这里通过，细胞提取基因组(天根基因组提取试剂盒)后连接T载体(康润生物)后挑菌，菌液PCR(引物如表10所示)，将胶图(图8)阳性的对应产物，送测序，测序结果如图9所示(该过程参考康润生物公司，T载体连接试剂盒说明书进行操作)。
同时鉴定其待编辑位点是否是C>G纯合子，采用表8引物，进行PCR扩增，扩增产物送测序，测序结果比对，如图7所示。
至此，得到了无痕编辑的C>G突变的纯合子克隆细胞，占比50％，如图6所示。
表10
| SEQ ID NO.29:F 3(5＇-3＇) | TGTAAAACGACGGCCAGT |
| SEQ ID NO.30:R 3(5＇-3＇) | CAGGAAACAGCTATGAC |
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中，得到阳性细胞库；
(2)将阳性细胞库中的阳性细胞进行纯合子细胞筛选，得到纯合子细胞；
(3)将表达载体II转至纯合子细胞中，进行对筛选标记基因表达盒的无痕切割，得到纯合子克隆；
其中，所述表达载体I能够表达Cas9和sgRNA1；
所述表达载体II能够表达sgRNA2-1、sgRNA2-2和Cas9；
所述sgRNA1能够和Cas9结合对细胞的基因组中外显子N和外显子N+1之间的内含子M进行切割；
所述供体质粒含有外显子N’和内含子M’的同源臂，所述外显子N’的序列包括基因编辑后的外显子N上发生了基因编辑处的序列，所述内含子M’的序列为在内含子M的sgRNA1的靶点中插入有筛选标记基因表达盒的序列；
所述筛选标记基因表达盒的序列从5’端至3’端依次含有以下元件：序列NNNNGG、启动子、荧光蛋白基因、2A肽基因、抗性蛋白基因；
所述sgRNA2-1、sgRNA2-2能够和Cas9结合对内含子M’上的筛选标记基因表达盒序列进行切割。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述启动子为EF1α、CMV启动子、EF1a启动子和CAG启动子中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述荧光蛋白基因为绿色荧光蛋白和/或红色荧光蛋白；
和/或，所述抗性蛋白基因为PuroR、HygR、Zeocin、KanR中的至少一种；
和/或，所述2A肽基因为P2A、T2A、E2A、F2A的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述基因编辑为点突变或敲入；
和/或，步骤(1)还包括：将表达载体I、供体质粒转染至目标细胞中后进行阳性细胞筛选。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，步骤(3)还包括：将表达载体II转至纯合子细胞中后对细胞进行荧光阴性细胞筛选。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述目标细胞为RPE细胞、293T细胞和A549细胞中的至少一种，优选为RPE细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述目标细胞为RPE细胞，所述外显子N的序列如SEQ ID NO.26所示；
所述内含子M的序列如SEQ ID NO.27所示；
所述外显子N’的序列如SEQ ID NO.28所示；
所述表达载体I包括sgRNA1表达载体和Cas9表达载体，其中，所述sgRNA1表达载体含有sgRNA的骨架序列和sgRNA1的识别序列，所述sgRNA1的识别序列如SEQ ID NO.12所示；
所述表达载体II包括sgRNA2-1表达载体、sgRNA2-2表达载体和Cas9表达载体，其中，所述sgRNA2-1表达载体含有sgRNA的骨架序列和sgRNA2-1的识别序列，所述sgRNA2-1的识别序列如SEQ ID NO.13所示，所述sgRNA2-2表达载体含有sgRNA的骨架序列和sgRNA2-2的识别序列，所述sgRNA2-2的识别序列如SEQ ID NO.14所示。
8.一种通过权利要求1-7中任意一项所述的方法得到的细胞。
9.一种基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括：表达载体I、表达载体II和供体质粒；
其中，所述表达载体I能够表达Cas9和sgRNA1；
所述表达载体II能够表达sgRNA2-1、sgRNA2-2和Cas9；
所述sgRNA1能够和Cas9结合对细胞的基因组中外显子N和外显子N+1之间的内含子M进行切割；
所述供体质粒含有外显子N’和内含子M’的同源臂，所述外显子N’的序列包括基因编辑后的外显子N上发生了基因编辑处的序列，所述内含子M’的序列为在内含子M的sgRNA1的靶点中插入有筛选标记基因表达盒的序列；
所述筛选标记基因表达盒的序列从5’端至3’端依次含有以下元件：序列NNNNGG、启动子、荧光蛋白基因、2A肽基因、抗性蛋白基因；
所述sgRNA2-1、sgRNA2-2能够和Cas9结合对内含子M’上的筛选标记基因表达盒序列进行切割。
10.权利要求9所述的系统在无痕基因编辑中的应用。
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