CN105602935B - 一种新型线粒体基因组编辑工具 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型线粒体基因组编辑工具，属于基因组工程领域。本发明构建的mtCRISPR/Cas9系统主要包括两部分：进入线粒体的gRNA和定位于线粒体的Cas9核酸酶。其中，本发明构建的mt‑gRNA有两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列组成；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列组成。mt‑gRNA与mtCas9核酸酶结合后，作用于线粒体基因组，靶向断裂目标序列。此外，第二种mt‑gRNA作用效率高于第一种。经验证，本发明构建的mtCRISPR/Cas9系统作用效率高、特异性强。
Description
技术领域
本发明属于基因组工程领域，具体地说，涉及一种新型线粒体基因组编辑工具。
背景技术
随着测序技术的不断发展，我们从中获得了越来越多的遗传信息。但如此庞大的信息又该如何应用？研究人员试图通过对特定靶向基因的破坏或敲除，来研究它们的相关功能，而实现这一目的的技术称为基因组编辑技术。此外，该技术还可应用于疾病的治疗和预防。目前，常用的基因组编辑技术主要包括以下三种：锌指蛋白技术(Zinc FingerProteins，ZFPs)、转录激活因子样效应因子(Transcription activator-like effectors，TALEs)技术、CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术。它们的大致原理都是通过对靶向DNA造成双链断裂(Double strand breaks，DSBs)，进而引发细胞内固有的非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重组(homologous recombination，HR)两种修复机制对断裂处进行修复。其中，易出错的NHEJ可以在DSBs处引入插入或缺失突变，这种突变不可人为控制。另一种修复机制HR，通过提供的单链或双链寡核苷酸模板对DSBs处进行精确修复，可人为控制。三种技术在作用机制与具体操作方式上又有所不同：
锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)与转录激活子样效应因子核酸酶(tran-scription activator-like effector nulease，TALEN)这两种人工核酸内切酶，都是通过DNA识别域与非特异性核酸内切酶FokI融合而成。其中，ZFN的锌指模块识别三联体碱基，序列识别上灵活性小、设计成本昂贵等问题都限制了它的发展。随后出现的TALEN在结构上较之ZFN更加优化，其DNA结合域中的各单元与靶向DNA序列一一对应，组装更为简单，特异性也更高，并于2012年被《Science》评为年度十大科技突破之一。2013年，一种源自细菌适应性免疫系统，由RNA介导Cas9蛋白剪切的全新基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统出现，在全球刮起了一阵CRISPR旋风，并被《Science》评为2013年度十大科技突破之一。较之ZFN、TALEN，CRISPR/Cas9系统在构建上更为简单，且成本低、作用效率高，极易广泛普及。经过近两年的发展，现已成功用于细菌、酵母、线虫以及多种模式动物、模式植物中，同时区别于ZFN、TALEN，成功的实现了对RNA的剪切编辑。作为新型的基因组编辑技术，为靶向突变目的基因，研究靶向基因间的相互作用，以及人类遗传疾病的最终治疗提供了强大的技术支持。
目前来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)，经人工改造后的CRISPR/Cas9系统应用最广泛。其作用机制如下：首先，gRNA与Cas9蛋白形成的复合物在间隔序列(spacer)的指导下，与靶向序列结合。间隔序列一般为20bp，靶向DNA与之同源的序列称为原型间隔区(protospacer)。紧邻原型间隔区的下游，存在一小段序列，即原型间隔序列相邻基序(Protospacer adiacent motifs，PAM)。PAM一般为2-5个碱基，且来自不同物种的CRISPR/Cas系统，其PAM不同。化脓链球菌中的PAM为NGG，N为任意碱基。因此，CRISPR/Cas9系统的特异性由20bp的原型间隔区和3bp的PAM共同决定。接着，识别靶向序列后，通过Cas9核酸酶进行剪切。Cas9蛋白存在两个核酸功能域，即RuvC-like和HNH。RuvC-like结构域剪切原型间隔区所在单链，即非互补链(Non-complementary)，作用位置为PAM上游3-8nt处。而HNH结构域剪切另一条单链，即互补链(complementary)，作用位置为PAM上游3nt处。两个结构域共同作用，在靶向位置处产生DSBs，进而引发细胞内的固有修复机制(NHEJ、HR)，对DNA损伤部分进行修复，从而引入突变(如图1所示)。
线粒体是存在于大多数真核生物(包括植物、动物、真菌和原生生物)细胞中的细胞器，有“细胞中的能量工厂”之称。它主要通过氧化磷酸化以三羧酸循环腺苷(ATP)的形式为细胞活动提供能量。同时，还参与诸如铁硫簇的生物合成、钙稳态调节、细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并且拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
线粒体基因组，又称线粒体DNA(mtDNA)。长度一般为几万至数十万碱基对，人类mtDNA为16,569bps，共编码2个rRNA、13个mRNA、22个tRNA。基因排列紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。mtDNA表现为母系遗传，突变率高，是细胞核内DNA的10倍左右。且mtDNA突变是导致人类线粒体遗传病及衰老性疾病的重要原因。研究表明，它与衰老及神经退行性病变如阿尔茨海默症、帕金森氏病等老年化疾病有关，同时也与肿瘤的形成密切相关。截至目前，已鉴定出超过500多个致病性突变来自mtDNA。而因缺乏对mtDNA相关序列的精确改造能力，现在对于这类疾病的治疗仍无有效手段。
本发明，是继Michal Minczuk等将ZFN运用于mtDNA编辑(Michal Minczuk etal.，2006)及Sandra R Bacman等将TALEN首次作用于mtDNA(Sandra R Bacman et al.，2013)后，基于人工改造的CRISPR/Cas9系统的一种新型线粒体基因组编辑工具。迄今为止，国内外还未有报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种高效、精确的线粒体基因组编辑工具。
本发明基于对CRISPR/Cas9系统的改造，进而实现了对线粒体靶向基因的高效、精确编辑。该系统主要包括两部分：进入线粒体的向导RNA(mt-guide RNA，mt-gRNA)和定位于线粒体的Cas9核酸酶(mito Cas9，mtCas9)。
所述进入线粒体的向导RNA包括以下两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列(Target sequence)和gRNA骨架(gRNA scaffold)序列三部分组成的RNA(如图2A所示)；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列(Geng Wang et al.，2012)或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列四部分组成的RNA(如图2B、2C所示)。
所述进入线粒体的向导RNA，其RNA线粒体定位引导序列可以为RP(RNase P，RP)序列(Geng Wang et al.，2010)，也可以是其他能够跨膜进入线粒体基质内，并能引导gRNA进入线粒体的序列。
所述编码第一种mt-gRNA的DNA序列，以RP序列作为RNA线粒体定位引导序列为例，可通过两条带有RP序列和靶向目标序列的互补寡核苷酸链经退火后，由BbsI限制性酶切位点或其它合适的限制性酶切位(如BsaI)连入编码gRNA骨架的DNA片段中。相应互补寡核苷酸链结构如下：
其中，CACC、CAAA为BbsI(或者BsaI)酶切后产生的连入载体所需粘性末端；编码RP序列的核苷酸序列为：TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
所述编码第二种mt-gRNA的DNA序列，编码以RP序列为例的RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA(22种)序列、靶向目标序列的DNA片段。通过一对含RP序列的正向引物和含靶向目标序列的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由BbsI限制性酶切位点或其它合适的限制性酶切位点(如BsaI)连入编码gRNA骨架的DNA片段中。以线粒体编码的tRNA-Leul为例：
正向序列F-Leul：
5’-CAGAAGACCTCACCATGTCTCCCTGAGCTTCAGGGAGGGAGAAATAAGGCCTACTTCAC-3’
反向序列R-Leul：
5’-CAGAAGACCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGTTCGGTAAGCATTAGG-3’
其中，横线部分为BbsI限制性酶切位点；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
所述靶向目标序列，为mtDNA中的任意一段目标核苷酸序列。其结构如下：5’-Nx-NGG-3’，其中N为A、C、G、T任意碱基，16≤X≤30，且X一般为20。
所述gRNA骨架，由反式激活CRISPR RNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)、CRISPR RNA(crRNA)嵌合结构，优化融合为一条单链RNA后所得。其中，类似发夹结构的RNA部分，用以招募Cas9核酸酶。这个复合体在gRNA的指导下，通过Cas9蛋白两个核酸功能域：RuvC-like和HNH，对靶向位置的DNA双链进行剪切，造成DSBs。
所述两种mt-gRNA的转录均由U6启动子启动，U6启动子与编码gRNA骨架DNA片段的核苷酸序列中间插入两个BbsI限制性酶切位点，用以同时连入编码RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列的DNA片段或编码RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列或其他额外间隔序列、靶向目标序列的DNA片段中任意一种结构，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。其中，U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第1-233位核苷酸所示，BbsI双酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第237-258位核苷酸所示，编码gRNA骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第259-334位核苷酸所示，U6终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第335-340位核苷酸所示。
所述定位于线粒体的Cas9核酸酶，可通过线粒体前导肽信号(Mitochondriatargeting sequence，MTS)与Cas9核酸酶的N端融合，使其定位于线粒体(如图3A所示)。也可通过融合在其N端的MTS与融合在其N端或者C端等其他位置的强出核信号(Nuclearexport signal，NES)共同作用，NES可使Cas9核酸酶更多地分布于细胞核外，从而使mtCas9核酸酶更好地定位于线粒体中(如图3B、3C所示)。
其中，启动子可为CBh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；MTS可为人鸟氨酸氨甲酰基转移酶(Homo sapiens ornithine carbamoyltransferase，OTC)的线粒体前导肽信号，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；NES可为HIV-1 rev结构域中的强出核信号，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；Cas9编码序列为人源化Cas9的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；Poly A可为含牛生长素多聚腺苷酸(bGH PloyA)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述两种mt-gRNA，均与上述定位于线粒体的Cas9核酸酶分别连接在一个表达载体中。
本发明的另一个目的是提供一种用于线粒体基因组高效、精确编辑的试剂盒。该试剂盒主要包括：mtCRISPR/Cas9系统的表达载体，以及引入上述第二种mt-gRNA所需的全部引物对。
所述表达载体中，编码mt-gRNA的DNA序列，通过一对含RNA线粒体引导序列的正向引物和含靶向目标序列的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由BbsI限制性酶切位点或其他合适的限制性酶切位点(如BsaI)连入编码gRNA骨架的DNA片段中，并由U6启动子启动，所述U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第1-233位核苷酸所示，BbsI双酶切位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第237-258位核苷酸所示，编码gRNA骨架的核苷酸序列如SEQ IDNO.1中第259-334位核苷酸所示，U6终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第335-340位核苷酸所示。
所述表达载体中，定位于线粒体的Cas9核酸酶，其表达模块结构，由N端依次为：CBh启动子、人鸟氨酸氨甲酰基转移酶(Homo sapiens ornithine carbamoyltransferase，OTC)的线粒体前导肽信号MTS、HIV-1 rev结构域中的强出核信号NES、人源化Cas9的编码序列以及含牛生长素多聚腺苷酸(bGH PloyA)(如图3B所示)。其中，MTS的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，NES的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
所述第二种mt-gRNA，由RP序列、线粒体编码的任意一种tRNA(22种)序列或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架四部分组成。其中，线粒体编码的22种tRNA分别为tRNA-Phe、tRNA-Val、tRNA-Leul、tRNA-Ile、tRNA-Gln、tRNA-Met、tRNA-Trp、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Serl、tRNA-Asp、tRNA-Lys、tRNA-Gly、tRNA-Arg、tRNA-His、tRNA-Ser2、tRNA-Leu2、tRNA-Glu、tRNA-Thr、tRNA-Pro。
本试剂盒包含引入上述22种tRNA所需的全部引物对，即引入22种tRNA的全部正向引物序列和相对应的反向引物序列结构。该反向引物序列中包含靶向目标序列，可灵活应用。
相关引物序列具见表1：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 对应ID |
| F-Phe | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GGTTTATGTAGCTTACCTCCTC | SEQ ID NO.9 |
| R-Phe | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGTTTATGGGGTGATGTG | SEQ ID NO.10 |
| F-Val | CAGAAGACCTCACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GCAGAGTGTAGCTTAACACAAA | SEQ ID NO.11 |
| R-Val | CAGAAGACCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCAGAGCGGTCAAGTTAA | SEQ ID NO.12 |
| F-Leul | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GGAGAAATAAGGCCTACTTCAC | SEQ ID NO.13 |
| R-Leul | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGTTCGGTAAGCATTAGG | SEQ ID NO.14 |
| F-Ile | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GAGAAATATGTCTGATAAAAGA | SEQ ID NO.15 |
| R-Ile | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAGAAATAAGGGGGTTTA | SEQ ID NO.16 |
| F-Gln | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GCTAGGACTATGAGAATCGAAC | SEQ ID NO.17 |
| R-Gln | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAGGATGGGGTGTGATAG | SEQ ID NO.18 |
| F-Met | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GAGTAAGGTCAGCTAAATAAGC | SEQ ID NO.19 |
| R-Met | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAGTACGGGAAGGGTATA | SEQ ID NO.20 |
| F-Trp | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GAGAAATTTAGGTTAAATACAG | SEQ ID NO.21 |
| R-Trp | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAGAAATTAAGTATTGCA | SEQ ID NO.22 |
| F-Ala | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GTAAGGACTGCAAAACCCCACT | SEQ ID NO.23 |
| R-Ala | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAGGGCTTAGCTTAATTAAAG | SEQ ID NO.24 |
| F-Asn | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GCTAGACCAATGGGACTTAAAC | SEQ ID NO.25 |
| R-Asn | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAGATTGAAGCCAGTTGATTA | SEQ ID NO.26 |
| F-Cys | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GAAGCCCCGGCAGGTTTG | SEQ ID NO.27 |
| R-Cys | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAGCTCCGAGGTGATTTTC | SEQ ID NO.28 |
| F-Tyr | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GTGGTAAAAAGAGGCCTAACCC | SEQ ID NO.29 |
| R-Tyr | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTAAAATGGCTGAGTGAAG | SEQ ID NO.30 |
| F-Serl | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GCAAAAAAGGAAGGAATCGAAC | SEQ ID NO.31 |
| R-Serl | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAAAAAGTCATGGAGGCCAT | SEQ ID NO.32 |
| F-Asp | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GAAGGTATTAGAAAAACCATTT | SEQ ID NO.33 |
| R-Asp | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTAAGATATATAGGATTTAGCC | SEQ ID NO.34 |
| F-Lys | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GCACTGTAAAGCTAACTTAGCA | SEQ ID NO.35 |
| R-Lys | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCACTGTAAAGAGGTGTTGG | SEQ ID NO.36 |
| F-Gly | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GACTCTTTTAGTATAAATAGTA | SEQ ID NO.37 |
| R-Gly | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTACTCTTTTTTGAATGTT | SEQ ID NO.38 |
| F-Arg | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GTGGTATATAGTTTAAACAAAA | SEQ ID NO.39 |
| R-Arg | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTGGTAAATATGATTATCAT | SEQ ID NO.40 |
| F-His | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GGTAAATATAGTTTAACCAAAA | SEQ ID NO.4I |
| R-His | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGTAAATAAGGGGTCGTA | SEQ ID NO.42 |
| F-Ser2 | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GGAGAAAGCTCACAAGAACTGC | SEQ ID NO.43 |
| R-Ser2 | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGAGAAAGCCATGTTGTTAGA | SEQ ID NO.44 |
| F-Leu2 | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GACTTTTAAAGGATAACAGCTA | SEQ ID NO.45 |
| R-Leu2 | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTACTTTTATTTGGAGTTGCA | SEQ ID NO.46 |
| F-Glu | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GTATTCTCGCACGGACTAC | SEQ ID NO.47 |
| R-Glu | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTCTTGTAGTTGAAATACAA | SEQ ID NO.48 |
| F-Thr | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GGTCCTTGTAGTATAAACTAAT | SEQ ID NO.49 |
| R-Thr | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTGTCCTTGGAAAAAGGTT | SEQ ID NO.50 |
| F-Pro | CA<u>GAAGACCT</u>CACCATG<u>TCTCCCTGAGCTTCAGGGAG</u>GTCAGAGAAAAAGTCTTTAACT | SEQ ID No.51 |
| R-Pro | CA<u>GAAGACCT</u>AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAGAGAATAGTTTAAATTAGA | SEQ ID No.52 |
注：横线部分为Bbsl限制性酶切位点；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
本发明的新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统。具有如下优点：
首先，本发明将源自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、经人工改造后作用于核基因组的CRISPR/Cas9系统，特异性的引入线粒体中，目前国内外尚未见报道。
其次，虽然CRISPR/Cas9系统的靶向切割特异性由gRNA与靶向DNA结合的20bp和其3’端PAM的NGG共同决定(N为A、C、G、T任意碱基)。但研究证实，这20bp的特异性主要由靠近PAM的10-12bp碱基决定，而5’端的8-10bp碱基，则在错配情况下不影响gRNA对靶位点的识别，甚至5个碱基不匹配的情况下仍可以发生DSBs。同时，在庞大的核基因组中，平均每8个碱基就存在一个PAM，这就大大增加了非特异性剪切的可能。本发明特异的将CRISPR/Cas9系统运用于线粒体基因组编辑中，人类mtDNA只有16,569bps，这将大大降低CRISPR/Cas9非特异性剪切的可能，即大大降低了脱靶效应(off target effect)，使得此构建简单、作用高效的基因组编辑技术得到充分利用。
此外，本发明独特构建的第二种mt-gRNA，在其进入线粒体后，由RNA酶将中间的tRNA部分剪切，使靶向目标序列曝露，更好的与靶向目标序列结合，从而较第一种mt-gRNA进一步提高了靶向剪切效率。同时，切落后的tRNA序列片段或者其他额外间隔序列片段，也可能为后续的mtDNA修复提供模板。
最后，本发明构建的新型线粒体基因组编辑工具mtCRISPR/Cas9系统，可为线粒体损伤修复机制等方面的研究、甚至是线粒体遗传病的最终攻克提供强有力的技术支持。
附图说明
图1为人工CRISPR/Cas9系统的作用原理示意图。
图2为本发明mtCRISPR/Cas9系统中mt-gRNA的转录模块示意图。其中，图2A为第一种mt-gRNA的转录模块示意图；图2B、2C为第二种mt-gRNA的转录模块示意图。
图3为本发明mtCRISPR/Cas9系统中定位于线粒体的Cas9核酸酶的三种表达模块示意图，分别如图3A、3B、3C所示。
图4为本发明mtCRISPR/Cas9系统中的mtCas9蛋白与线粒体共定位。其中，图4A为免疫荧光实验证明两种蛋白表达模块均可使mtCas9蛋白与线粒体共定位；图4B通过核(Nu)、质(Cyto)、线粒体(Mito)组分分离，经Westem Blot再次验证两种蛋白表达模块均可使mtCas9蛋白与线粒体共定位。其中，Flag标记mtCas9蛋白、Lamin-B为细胞核标志物、GAPDH为细胞质标志物、VDAC为线粒体标志物。
图5为本发明mtCRISPR/Cas9系统中mt-gRNA可进入线粒体的实时荧光定量PCR检测结果。其中，图5A为mt-gRNA跨膜进入线粒体；图5B为在线粒体中，第二种mt-gRNA的tRNA-Leul被剪切。
图6为本发明mtCRISPR/Cas9系统所选的mtDNA靶向目标序列T1、T2在核基因组中的活性检测。其中，图6A为T1靶向目标序列在相关质粒作用下的剪切效率测序结果；图6B为T2靶向目标序列在相关质粒作用下的剪切效率测序结果；图6C为CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2两质粒的相关单克隆测序比对结果。
图7为本发明mtCRISPR/Cas9系统的实时荧光定量PCR活性检测。其中，图7A为人的线粒体DNA结构示意图，T1为Common Deletion范围内一段靶向目标序列，IS-F/IS-R与CD-F/CD-R为实时荧光定量PCR涉及的两对引物；图7B为mtCRISPR/Cas9系统相关质粒作用于T1靶向目标序列后，相应Common Deletion、Copy Number变化情况。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不限定本发明。在本发明的基础上，所做的同类型改进(如构建缺刻型mtCRISPR/Cas9n、mtCas9后串联荧光蛋白等)，均属本发明要求保护的范围。
实施例1
一种新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统的构建。1.1mtCas9蛋白表达模块的构建：
定位于线粒体的Cas9核酸酶，可通过MTS与Cas9核酸酶的N端融合后，使其定位于线粒体(如图3A所示)。也可通过融合在其N端的MTS与融合在其N端或者C端等其他位置的NES共同作用，NES可使Cas9核酸酶更多地分布于细胞核外，从而使mtCas9更好地定位于线粒体中(如图3B、3C所示)。
本实施例构建的两种mtCas9蛋白表达模块，分别如图3A、3B所示。其中，启动子为CBh，MTS为人鸟氨酸氨甲酰基转移酶(Homo sapiens omithine carbamoyltransferase，OTC)的线粒体前导肽信号，NES为HIV-1 rev结构域中的强出核信号，Cas9编码序列为人源化Cas9的编码序列，Poly A为含牛生长素多聚腺苷酸(bGH PloyA)。同时为了便于实验验证，本实施例在构建mtCas9蛋白表达模块时，在人源化Cas9编码序列前添加了Flag标签(同类蛋白标签，如HA、His等均可)，并在pX335(Addgene质粒#42335)的基础上，对质粒进行改造。
pX335中hSpCas9n蛋白表达模块结构为：CBh-HA-NLS-hSpCas9n-NLS-bGH polyA。具体构建策略如下：
1.1.1构建含野生型Cas9的质粒：
通过两步PCR的方法将hSpCas9n nickase结构域RuvC-like I中的丙氨酸(A)突变为天冬氨酸(D)，进而得到可以同时切割DNA双链的野生型Cas9。
具体步骤如下：1)以pX335质粒为模板，分别用F1/R1、F2/R2引物对进行PCR扩增，得产物A、B；2)对A、B进行胶回收，并以此为混合模板用F1/R2引物对进行第二次PCR扩增，得产物C；3)对纯化后的产物C及pX335质粒，做AgeI/BgLII双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到含有野生型Cas9的质粒，即CBh-HA-NLS-hSpCas9-NLS-bGH polyA。
相关引物序列具见表2：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 对应ID |
| F1 | GTTGGTTGGTGGGGTATTAATG | SEQ ID NO.53 |
| R1 | GGTGCCGATATCCAGGCCGATGCTGTACTTCT | SEQ ID NO.54 |
| F2 | TCGGCCTGGATATCGGCACCAACTCTGTGG | SEQ ID NO.55 |
| R2 | GTCTGTGGAAGAAGCTGTCGTC | SEQ ID NO.56 |
1.1.2去除Cas9 C端的核定位信号(NLS)：
通过一步PCR扩增的方法去除Cas9 C端的核定位信号，得到如下Cas9蛋白表达模块结构：CBh-HA-NLS-hSpCas9-bGH polyA。
具体步骤如下：1)以上述含野生型Cas9的质粒为模板，用F3/R3进行PCR扩增(R3带有EcoRI酶切位点，如表3横线部分所示)；2)PCR产物纯化；3)对纯化后的PCR产物及含野生型Cas9的质粒，做BsmI/EcoRI双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到质粒中Cas9蛋白表达模块结构如下：CBh-HA-NLS-hSpCas9-bGH polyA。
相关引物序列具见表3：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 对应ID |
| F3 | CCAAAGTGGAAAAGGGCAAGT | SEQ ID NO.57 |
| R3 | CCG<u>GAATTC</u>TTAGTCGCCTCCCAGCTGAGAC | SEQ ID NO.58 |
1.1.3去除Cas9 N端核定位信号(NLS)的同时引入MTS-Flag或MTS-NES-Flag结构：
通过两步PCR扩增的方法去除Cas9 N端NLS的同时引入MTS-Flag或MTS-NES-Flag结构，得到如下两种Cas9蛋白表达模块结构：CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGHpolyA和CBh-MTS-NES-Flag-hSpCas9-bGH polyA，即为mtCas9蛋白的两种表达模块结构。
首先，含CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGH polyA结构的质粒构建：
具体步骤如下：1)以本实验室已构建成功，含有MTS的质粒为模板，用F4/R4引物对进行PCR扩增(F4带有AgeI酶切位点，R4的5’端带有Flag标签，如表4横线部分所示)，得产物D；2)同时以上述步骤1.1.2中构建的质粒为模板，用F5/R2引物对进行PCR扩增(F5的5’端带有Flag标签，如表4横线部分所示)，得产物E；3)对D、E进行胶回收，并以此为混合模板用F4/R2引物对进行第二次PCR扩增，得产物F；4)对纯化后的产物F及上述步骤1.1.2中构建的质粒，做AgeI/BglII双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到质粒中的Cas9蛋白表达模块结构如下：CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGH polyA，即为第一种mtCas9蛋白表达模块结构。
相关引物序列具见表4：
同理，含CBh-MTS-NES-Flag-Cas9-bGH polyA结构的质粒构建：
具体步骤如下：1)以本实验室已构建成功，含有MTS-NES的质粒为模板，用F4/R6引物对进行PCR扩增(F4带有AgeI酶切位点，R6的5’端带有Flag标签，如表4横线部分所示)，得产物G；2)同时以上述步骤1.1.2中构建的质粒为模板，用F5/R2引物对进行PCR扩增(F5的5’端带有Flag标签，如表4横线部分所示)，得产物H；3)对G、H进行胶回收，并以此为混合模板用F4/R2引物对进行第二次PCR扩增，得产物I；4)对纯化后的产物I及上述步骤1.1.2中构建的质粒，做AgeI/BgLII双酶切，分别以此为插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。最终，得到质粒中的Cas9蛋白表达模块结构如下：CBh-MTS-NES-Flag-hSpCas9-bGH polyA，即为第二种mtCas9蛋白表达模块结构。将此质粒命名为mtCRISPR/Cas9。后续实施例所用mtCRISPR/Cas9系统中的mtCas9表达模块均为此结构。
相关引物序列具见表5：
1.2mt-gRNA的构建：
本发明中进入线粒体的向导RNA包括以下两种：1、由RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列(Target sequence)和gRNA骨架(gRNA scaffold)序列三部分组成的RNA(如图2A所示)；2、由RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列(22种)或其它额外间隔序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列四部分组成的RNA(如图2B、2C所示)。其中，本实施例所用的RNA线粒体定位引导序列为RP(RNase，RP)序列。
1.2.1第一种mt-gRNA的构建：
所述编码第一种mt-gRNA的DNA序列中编码RP序列、靶向目标序列的DNA片段，可通过两条同时含有RP序列和靶向目标序列的互补寡核苷酸链经退火后，由BbsI限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中。
相关引物序列具见表6：
注：CACC、CAAA为连入载体所需粘性末端；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
具体步骤如下：1)F-oligo/R-oligo引物对退火，95℃、5分钟；2)限制性内切酶BbsI酶切mtCRISPR/Cas9质粒，2小时后胶回收；3)以胶回收片段为载体、退火引物为插入片段进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。
最终，构建完成了第一种同时带有RP序列、靶向目标序列，作用于线粒体基因组的mtCRISPR/Cas9系统。
1.2.2第二种mt-gRNA的构建：
所述编码第二种mt-gRNA的DNA序列中编码RP序列、线粒体中任意一种tRNA(22种)序列、靶向目标序列的DNA片段，可通过一对含RP序列的正向引物和含靶向目标序列的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由BbsI限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中。
以线粒体编码的tRNA-Leul为例，相关引物序列具见表7：
注：横线部分为BbsI限制性酶切位点；斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸序列；N为A、C、G、T任意碱基，20个N为一段靶向目标序列。
具体步骤如下：1)以HEK293细胞的基因组为模板，用F-Leul/R-Leul引物对做PCR扩增；2)PCR产物纯化；3)对纯化后的PCR产物及mtCRISPR/Cas9质粒，分别做BbsI单酶切，分别以胶回收的酶切产物为插入片段及载体进行连接、转化、挑单克隆鉴定、鉴定正确样品测序。
最终，构建完成了第二种同时带有RP序列、tRNA-Leul序列、靶向目标序列，作用于线粒体基因组的mtCRISPR/Cas9系统。
实施例2
一种新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统中mtCas9蛋白与线粒体共定位。
2.1免疫荧光实验分析mtCas9蛋白与线粒体的共定位：
具体步骤如下：
细胞间内操作：1)将盖玻片放入六孔板中，植入适当密度的HEK293细胞。次日分别瞬时转染含两种蛋白表达模块，即：CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGHpolyA和CBh-MTS-NES-Flag-hSpCas9-bGHpolyA的质粒，分别命名为MTS-Cas9、MTS-NES-Cas9；2)细胞培养至合适时间后，取出细胞，PBS洗涤细胞两次，再加入提前用培养基稀释混匀的线粒体特异性染料Mito Tracker，静置20分钟。
细胞间外操作：1)细胞固定：取出细胞，PBS洗涤细胞两次，细胞片自然晾干，加入1ml以冰预冷4％多聚甲醛固定15分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；2)细胞透化：加入1ml含0.2％TritonX-100的PBS透化处理10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟；3)封闭：加1ml含5％脱脂奶粉的PBS室温孵育30分钟；4)一抗孵育：将Parafilm膜放在湿盒内，取出盖玻片放在Parafilm膜上，加100μl含5％脱脂奶粉的PBS稀释的一抗到盖玻片上，4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟；5)二抗孵育：加100ul含5％脱脂奶粉的PBS稀释的二抗到盖玻片上，室温避光孵育1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟；6)DAPI染核：加DAPI溶液染细胞核，室温避光孵育2分钟；7)加去离子水漂洗去盐2次，每次5分钟。8)封片：取10ul封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，四周用指甲油封住。9)用Leica TCS SP5共聚焦荧光显微镜对蛋白定位进行检测。
经免疫荧光实验证明两种蛋白表达模块均可使mtCas9蛋白与线粒体共定位，结果如图4A所示。
2.2线粒体分离验证mtCas9蛋白与线粒体的共定位：
瞬时转染含两种蛋白表达模块，即：CBh-MTS-Flag-hSpCas9-bGHpolyA和CBh-MTS-NES-Flag-hSpCas9-bGHpolyA，分别命名为MTS-Cas9、MTS-NES-Cas9的质粒于HEK293细胞中，24小时后收细胞，差速离心分离细胞核(Nu)、细胞质(Cyto)、线粒体(Mito)，并保存各组分。利用蛋白免疫印迹(Westem Blot)法，进一步验证mtCas9蛋白与线粒体的共定位。
线粒体分离的具体步骤如下：1)收一盘长满的150mm细胞培养皿的细胞分装至1.5ml离心管中，1000g离心5分钟，弃上清；2)PBS洗涤一次，1000g离心5分钟，弃上清，置于冰上；3)加6倍体积的CHM溶液，吹打混匀，冰上静置10分钟；4)1ml注射器研磨细胞30次后加入1/3体积的CHM-蔗糖溶液，颠倒混匀，冰上静置2分钟；5)1000g、4℃离心10分钟，取上清于新1.5ml离心管中，此时沉淀为细胞核，标记Nu并保存；6)置于新离心管中的溶液，重复步骤5)两次；7)所得上清继续离心，5000g、4℃离心10分钟，此时上清为细胞质，沉淀为线粒体，收集细胞质，标记Cyto并保存；8)含线粒体的离心管，加入800ml蔗糖-Mg2+溶液，5000g、4℃离心10分钟，共三次。所得沉淀即为较纯线粒体，标记Mito并保存。
通过Westem Blot，再次验证了两种蛋白表达模块均可使mtCas9蛋白与线粒体共定位，结果如图4B所示(注：Lamin-B为细胞核标志物、GAPDH为细胞质标志物、VDAC为线粒体标志物)。
所需溶液配方具见表8：
实施例3
一种新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统中的mt-gRNA可跨膜进入线粒体。
本发明中进入线粒体的向导RNA包括两种，具体构建方法如实施例1中1.2所述。本实施例所用质粒的mt-gRNA通过第二种带有tRNA-Leul的构建方式构建，其中选择的靶向序列为线粒体4977bp普通缺失(Common Deletion)范围内的一段，命名为T1(作用位置如图7A所示，T1的核苷酸序列如SEQ ID NO.74中第7-26位核苷酸所示)，此质粒命名为mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1。
验证步骤：1)将mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1转染到HEK293细胞中，24h后收取细胞，分离线粒体组分，并提取总RNA(Total-RNA)和线粒体RNA(Mito-RNA)；2)利用反向引物18S-Rn、12S-Rn、g-Rn分别逆转录Total-RNA和Mito-RNA两样品中的18S rRNA、12S rRNA、mt-gRNA为cDNA；3)利用18S-F/18S-R(103bp)、12S-F/12S-R(110bp)、g-F/R-Leul-T1(99bp)、F-Leul/R-Leul-T1(316bp)四对引物，对相应cDNA样品进行实时荧光定量PCR检测，结果如图5A、5B所示。
相关引物序列具见表9：
注：横线部分为BbsI限制性酶切位点、斜体下划线部分为编码RP序列的核苷酸序列、粗体部分为T1靶向目标序列。
数据分析：
1)mt-gRNA跨膜进入线粒体：
通过18S-F/18S-R(内参)-即18S，12S-F/12S-R-即12S，g-F/R-Leul-T1-即mt-gRNA三对引物检测。结果如图5A所示，比较Total-RNA与Mito-RNA，12S在Mito-RNA中较Total-RNA有所富集，表明本实验在Mito-RNA样品中成功的提取了线粒体RNA。同时，mt-gRNA也在Mito-RNA中较Total-RNA有所富集，则表明mt-gRNA成功的跨膜进入了线粒体。
2)在线粒体中，第二种mt-gRNA的tRNA-Leul被剪切：
通过g-F/R-Leul-T1(内参)-即mt-gRNA，F-Leul/R-Leul-T1-即mt-gRNA-ΔLeul两对引物检测。g-F位于tRNA-Leul序列后/T1之前、R-Leul-T1位于T1处，以g-F/R-Leul-T1引物对为内参，均一化mt-gRNA总量。且F-Leul/R-Leul-T1引物对可同时引入RP序列、tRNA-Leul序列和T1靶向目标序列，因为该结构的mt-gRNA进入线粒体后，中间的tRNA-Leul会被RNA酶剪切，被剪切后的mt-gRNA无法通过本对引物进行检测。
结果如图5B所示，Mito-RNA样品中的mt-gRNA-ΔLeul较Total-RNA样品中的有所降低。综合图5A所示结果，共同表明mt-gRNA可跨膜进入线粒体，且第二种mt-gRNA在进入线粒体后中间部分的tRNA会被剪切。
实施例4
一种新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统所选的mtDNA靶向目标序列T1、T2在核基因组中的活性检测：
由于线粒体缺乏完善的DNA修复系统，修复能力较弱，无法通过常规的观察套峰情况来判断该基因组编辑工具是否对靶向目标序列起到了DSBs的作用。因此，为了验证所选的mtDNA靶向目标序列活性，我们首先把一段大小为143bp(含图7A所示的T1、T2两个靶向目标序列，T1的核苷酸序列如SEQ ID NO.74中第7-26位核苷酸所示，T2的核苷酸序列如SEQID NO.74中第123-142位核苷酸所示)的mtDNA序列克隆到pEGFP-N1载体后，在HEK293细胞中构建稳定细胞系，使这段mtDNA序列整合到核基因组中，并将此细胞系命名为C1。
在C1中，瞬时转染CRISPR/Cas9(只含Cas9、不含靶向序列)、mtCRISPR/Cas9(只含mtCas9、不含靶向序列)和分别带有T1、T2靶向目标序列的系列质粒(具见表10)。48小时后，收细胞提取基因组，通过F7/R7引物对做常规PCR，PCR产物用反向引物R-Seq测序。
T1、T2靶向目标序列对应系列质粒具见表10：
注：CRISPR/Cas9只含Cas9、不含靶向序列；mtCRISPR/Cas9只含mtCas9、不含靶向序列；“tRNA-”表示靶位点前带有tRNA-Leul；“RP-”表示该RNA为mt-gRNA。因此，T1系列质粒对应上表可命名为：CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-tRNA-T1、CRISPR/Cas9-RP-T1、CRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1、mtCRISPR/Cas9-T1、mtCRISPR/Cas9-tRNA-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1，T2系列质粒标记同理。
测序结果如图6A、6B所示。其中，长方形框内分别为T1、T2靶向目标序列，contral为未转染质粒的C1阴性对照。
图6A、6B所示测序结果综合分析：
1)Cas9或mtCas9单独作用时：
T1、T2靶向目标序列处，contral、CRISPR/Cas9、mtCRISPR/Cas9均无套峰。表明，CRISPR/Cas9系统与mtCRISPR/Cas9系统对DNA的剪切编辑，均需Cas9(mtCas9)和gRNA(mt-gRNA)两部分共同作用；
2)Cas9与gRNA共同作用时：
T1靶向目标序列处，CRISPR/Cas9-T1、CRSIPR/Cas9-tRNA-T1均有套峰，且CRISPR/Cas9-T1强于CRISPR/Cas9-tRNA-T1。表明，gRNA的5’端添加一段较长序列后对Target的靶向剪切作用有一定影响。T2靶向目标序列处现象相同。
3)Cas9与mt-gRNA共同作用时：
T1靶向目标序列处，CRISPR/Cas9-RP-T1、CRSIPR/Cas9-RP-tRNA-T1均有套峰，但较之CRISPR/Cas9-T1、CRSIPR/Cas9-tRNA-T1减弱。表明，RP序列可将gRNA带入线粒体中，但不彻底。T2靶向目标序列处现象相同。
4)mtCas9与gRNA共同作用时：
T1靶向目标序列处，mtCRISPR/Cas9-T1、mtCRSIPR/Cas9-tRNA-T1均有微弱套峰，T2靶向目标序列位置处，mtCRISPR/Cas9-T2有微弱套峰出现、而mtCRSIPR/Cas9-tRNA-T1无套峰。表明，mtCas9在线粒体中的定位为动态过程，gRNA的5’端添加一段较长序列后会对Target的靶向剪切作用有一定影响，且GC含量高的靶向目标序列剪切作用效率相对较低(T1靶向序列GC含量40％、T2靶向序列GC含量55％)
5)mtCas9与mt-gRNA共同作用时：
T1靶向目标序列处，mtCRISPR/Cas9-RP-T1、mtCRSIPR/Cas9-RP-tRNA-T1均无套峰。表明，mtCRISPR/Cas9系统可专一的作用于线粒体基因组，而非核基因组。T2靶向目标序列处现象相同。
综上所述，T1、T2是两个有效的线粒体靶向目标序列，并且mtCas9与mt-gRNA的组合(mtCRSIPR/Cas9系统)可特异性的切割线粒体基因组DNA而不影响核基因组DNA。
此外，针对效率相对较高的CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2。对其基因组的PCR产物进行TA克隆后，挑取10-15个单克隆再次测序。与理论序列比对结果如图6C所示(+：插入碱基，D：删除碱基)。
相关引物序列具见表11：
实施例5
一种新型线粒体基因组编辑工具，即mtCRISPR/Cas9系统的活性检测。
上述实施例4已表明，所选择的mtDNA靶向目标序列T1、T2均有效。因此本实施例继续选择其中的T1靶向目标序列，进一步证明mtCRISPR/Cas9系统针对线粒体DNA的剪切活性。
mtDNA4977bp(8469-13447)缺失是mtDNA中常见的一种大片段缺失，称为普通缺失(Common Deletion)。本实施侧选择的T1靶向目标序列即位于Common Deletion范围内(如图7A所示)。根据本发明涉及的两种mt-gRNA结构，采用tRNA-Leul，同时构建了四个含有T1靶向目标序列的相关质粒，分别为：1)mtCas9与gRNA组合：mtCRISPR/Cas9-T1、mtCRISPR/Cas9-tRNA-T1；2)mtCas9与mt-gRNA组合：mtCRISPR/Cas9-RP-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1(相关质粒标记含义具见表10)。通过IS-F/IS-R、CD-F/CD-R、18S-F/18S-R三对引物进行实时荧光定量PCR检测。观察相应质粒作用后，mtDNA的Common Deletion和拷贝数(CopyNumber)变化情况，以此验证mtCRISPR/Cas9系统的剪切活性。
相关引物序列具见表12：
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 对应ID |
| IS-F | GATTTGGGTACCACCCAAGTATTG | SEQ ID NO.78 |
| IS-R | AATATTCATGGTGGCTGGCAGTA | SEQ ID NO.79 |
| CD-F | ACCCCCATACTCCTTACACTATTCC | SEQ ID NO.80 |
| CD-R | AAGGTATTCCTGCTAATGCTAGGCT | SEQ ID NO.81 |
| 18S-F | TAGAGGGACAAGTGGCGTTC | SEQ ID NO.65 |
| 18S-R | CGCTGAGCCAGTCAGTGT | SEQ ID NO.66 |
注：IS-F/IS-R扩增mtDNA相关片段；CD-F/CD-R引物对特异性扩增发生CommonDeletion的mtDNA相关片段(Heike Koch et al.，2001)；18S-F/18S-R扩增18S rRNA相关片段。
具体操作如下：1)相关质粒如实施例1所述方式构建；2)在HEK293细胞中，瞬时转染mtCRISPR/Cas9(只含mtCas9、不含靶向目标序列)、mtCRISPR/Cas9-T1、mtCRISPR/Cas9-tRNA-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1五个质粒，48小时后，收细胞并提取基因组；3)以IS-F/IS-R、CD-F/CD-R、18S-F/18S-R三对引物，分别对上述5个样品进行实时荧光定量PCR检测，每个样品做三个重复。
数据分析：
1)以IS-F/IS-R(内参)、CD-F/CD-R两对引物检测，相关质粒作用后mtDNA的CommomDeletion情况(如图7B左所示)：与mtCRISPR/Cas9相比，mtCRISPR/Cas9-T1、mtCRISPR/Cas9-tRNA-T1两样品中的Common Deletion情况与之相近，而mtCRISPR/Cas9-RP-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1两样品中的Common Deletion情况则有不同程度的增加，且mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1样品中的Common Deletion增加程度高于mtCRISPR/Cas9-RP-T1样品。
2)以18S-F/18S-R(内参)、IS-F/IS-R两对引物检测，相关质粒作用后mtDNA的拷贝数(Copy Number)情况(如图7B右所示)：与mtCRISPR/Cas9相比，mtCRISPR/Cas9-T1、mtCRISPR/Cas9-tRNA-T1两样品中的Copy Number情况与之相近，mtCRISPR/Cas9-RP-T1、mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1两样品中的Copy Number情况则有不同程度的降低，且mtCRISPR/Cas9-RP-tRNA-T1样品中的Copy Number降低程度低于mtCRISPR/Cas9-RP-T1样品。
上述结果表明：1)本发明所构建的mtCRISPR/Cas9系统可特异性地作用于mtDNA；2)作用于同一靶向目标序列时，含第二种mt-gRNA结构的mtCRISPR/Cas9系统作用效率高于含第一种mt-gRNA结构的mtCRISPR/Cas9系统；3)再次证明RP序列可将mt-gRNA引入线粒体中，且mtCRISPR/Cas9系统发挥剪切作用时，mtCas9、mt-gRNA两者缺一不可。
Claims (6)
1.一种线粒体基因组编辑工具，其特征在于，所述线粒体基因组编辑工具是基于对CRISPR/Cas9系统改造而成的mtCRISPR/Cas9系统，所述mtCRISPR/Cas9系统主要包括两部分：进入线粒体的向导RNA和定位于线粒体的Cas9核酸酶，所述进入线粒体的向导RNA是第一种mt-gRNA或者第二种mt-gRNA；
其中，所述第一种mt-gRNA的序列依从上游到下游的顺序包括：RNA线粒体定位引导序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列；
所述第二种mt-gRNA的序列依从上游到下游的顺序包括：RNA线粒体定位引导序列、线粒体编码的任意一种tRNA序列、靶向目标序列和gRNA骨架序列；所述RNA线粒体定位引导序列为RNase P序列；
所述定位于线粒体的Cas9核酸酶是通过线粒体前导肽信号与Cas9核酸酶的N端融合后构建而成的；所述线粒体前导肽信号是人鸟氨酸氨甲酰基转移酶的线粒体前导肽信号MTS。
2.如权利要求1所述的线粒体基因组编辑工具，其特征在于，所述定位于线粒体的Cas9核酸酶是在Cas9核酸酶N端或者C端融合强出核信号后再在其N端融合线粒体前导肽信号后构建而成的。
3.如权利要求1所述的线粒体基因组编辑工具，其特征在于，编码所述第一种mt-gRNA的DNA序列的构建步骤包括：编码所述RNA线粒体定位引导序列的DNA片段、编码所述靶向目标序列的DNA片段通过两条带有所述线粒体引导序列和所述靶向目标序列的互补寡核苷酸链经退火后，由BbsI限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中，所述互补寡核苷酸链的核苷酸序列如SEQ ID No.63和SEQ ID No.64所示。
4.如权利要求1所述的线粒体基因组编辑工具，其特征在于，编码所述第二种mt-gRNA的DNA序列的构建步骤包括：编码所述RNA线粒体定位引导序列的DNA片段、线粒体编码22种tRNA中的任意一种的DNA片段、编码靶向目标序列的DNA片段，通过一对含线粒体定位引导序列的正向引物和含靶向目标序列的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由BbsI限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中，所述引物对共计22对，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9-SEQ ID NO.52所示。
5.如权利要求1所述的线粒体基因组编辑工具，其特征在于，编码所述第二种mt-gRNA的DNA序列的构建步骤包括：由合适的酶切位点将编码所述RNA线粒体定位引导序列的DNA片段、编码所述靶向目标序列的DNA片段，通过克隆技术，连入编码gRNA骨架的DNA片段中。
6.一种用于线粒体基因组编辑的试剂盒，其特征在于，主要包括以下部分：
1)如权利要求1-4中任一项所述的mtCRISPR/Cas9系统表达载体：
所述表达载体中，编码mt-gRNA的DNA序列，通过一对含RNA线粒体引导序列的正向引物和含靶向目标序列的反向引物，经PCR扩增、纯化回收后，由BbsI限制性酶切位点或其他合适的限制性酶切位点连入编码gRNA骨架的DNA片段中，并由U6启动子启动，所述U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第1-233位核苷酸所示，BbsI双酶切位点的核苷酸序列如SEQID NO.1中第237-258位核苷酸所示，编码gRNA骨架的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第259-334位核苷酸所示，U6终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中第335-340位核苷酸所示；
所述表达载体中，定位于线粒体的Cas9核酸酶，其表达模块结构，由N端依次为：CBh启动子、人鸟氨酸氨甲酰基转移酶的线粒体前导肽信号MTS、HIV-1rev结构域中的强出核信号NES、人源化Cas9的编码序列以及含牛生长素多聚腺苷酸，其中，MTS的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；NES的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码Cas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
2)如权利要求1-2，4-5中任一项所述编码所述第二种mt-gRNA的DNA片段，所需的全部引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.52所示。
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