CN103409464B - 一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，具体为一种质粒pCMV‑RBE‑TK1‑N2‑EF1α‑hFIXml及其构建方法和应用。该质粒含CMV启动子‑RBE元件‑TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架。该质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。使用该表达质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响，提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。

Description

一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建方法和应用。

背景技术

自然界有许多天然的转基因事件，其中有一些事件在进化历程中被证明是安全的。在人类基因组有大量转座子的痕迹和转座子的作用位点。但是，人类基因组最具有意义的是19号染色体有一个AAV病毒的整合位点AAVS1（adeno-associated virus integrationsite1），其为基因组中AAV病毒基因组的整合位点（Future Virol. 2010 Sep 1;5(5):555-574.）。自然情况下，AAV仅仅整合在AAVS1；在离体选择条件下，超过75%的AAV ITR（inverted terminal repeat）附加的基因可以在rep蛋白指导下整合在AAVS1.

到目前为止我们已知AAV感染不与任何疾病相关，并且最近的研究发现AAV感染的细胞具有一定的抗病毒感染和抗肿瘤发生特性。重要的是这种结论是以成年人大于90%的AAV感染率为前提得出的，具有高度可靠性。

Rep蛋白和介导整合的顺式元件，位于AAV ITR或位于P5启动子内的16bp RBE（repbinding element），已经得到较为深刻的研究，可以构成可靠的定点整合转基因系统（HumGene Ther. 2010 ;21(6):728-38. Gene Ther. 2009 ;16(5):589-95. J Mol Biol.2006 ;358(1):38-45.）。

发明内容

本发明的目的在于提高一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用。

本发明提供的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架。具体的，该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因的筛选标记；RBE元件TK1基因的筛选标记序列采用常规分子生物学方法制备，并插入pN2-EF1α-hFIXml质粒的位点Kpn I和Not I之间，得到pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒，其序列见SEQ.ID.NO5所示。

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒和rep表达质粒pRC（J. Mol. Biol. 2006;385:38-45）共转染哺乳动物细胞，可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。携带有RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；Neo正筛选基因可以用G418筛选获获得整合细胞；RBE元件位于TK1基因和启动子之间，用阿昔洛韦筛选可去除没有RBE参与的非定点整合细胞；最后获得定点整合于AAVS1位点稳定表达人凝血因子IX的细胞。

本发明提出的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建方法，具体步骤为：

(1）构建pCMV-TK1重组质粒

将合成的携带XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通过DNA重组技术插入经XbaI和AflⅡ双酶切的pcNDA3.1(-)-MYC-HIS载体(Invitrogen)，获得pCMV-TK1质粒；TK1基因DNA片段见SEQ.ID.NO1所示；

(2）扩增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段

以质粒pCMV-TK1为模板，用含Nhe I-RBE的上游引物（SEQ. ID.NO2）和含Sal I的下游引物（SEQ. ID.NO3）扩增获得Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I DNA片段；

(3）构建pN2-EF1α-hFIXml重组质粒

合成含启动子EF1α的人凝血因子FIX小基因（下文简称hFIXml）的DNA片段（下文简称“hFIXml双链DNA片段”），其5’ 端增加KpnI粘性酶切位点，在3’ 端增加NotI粘性酶切位点（SEQ.ID.NO4）；合成的携带KpnI和NotI粘性末端的hFIXml双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经KpnI和NotI双酶切的pEGFP-N2（Clontech），得到pN2-EF1α-hFIXml重组质粒；

(4）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒

“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和SalⅠ双酶切的pN2-EF1α-hFIXml重组质粒，获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒（SEQ.ID.NO5）；

上述构建的pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒可以作进一步的应用：

（5）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒用Apl I消化，补平后连接获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS质粒，可用于在MCS位点插入重组基因；

（6）建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系

合成的hFIX表达质粒pN2-EF1α-hFIXml-CMV-RBE-TK1和pRC质粒共同转染原代培养的成细胞，使用阿昔洛韦（aciclovir，ACV）和G418共同筛选，得到定点整合hFIX的亚细胞系。

使用该表达质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞，一方面正负双重筛选可以防止细胞随机突变导致的非整合细胞耐药对转基因细胞群纯净度的影响，提高表达效率；另一方面可以有效预防插入突变导致的基因突变和癌蛋白表达风险。通过常规分子生物学方法取代人类凝血因子IX表达框架可以构建表达其它基因的具有定点整合以及正负筛选的质粒。

本发明在筛选基因表达序列和启动子之间设计插入RBE整合元件；使用pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒和pRC共转染人类细胞，通过G418和阿昔洛韦双重筛选不仅可以去除非整合适应突变细胞，还可以去除非定点整合细胞。非定点整合细胞因为表达TK1而被阿昔洛韦杀死，通过RBE介导定点整合的细胞因为整合破坏了CMV启动子与TK1的连接关系，不表达TK1，不受阿昔洛韦影响。

本发明的构建方法，采用常规分子生物学方法，所有中间产物和最后产品均已DNA测序认定。采用pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml与pRC共转染HEK293细胞，经过G418和阿昔洛韦筛选，可以获得定点整合于AAVS1位点，稳定表达hFIX的细胞系。

附图说明

图1：质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml结构示意图。质粒全长：9361 bp，主要元件：CMV启动子（1-585），RBEitr 整合元件（597-612），TK1基因（613-1743），EF1a启动子（2010-3196），hFIXml基因（3510-6027），Neomycin基因（7257-8051）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。

实施例1：pCMV-TK1重组质粒的构建

1. 1 TK1基因扩增（PCR）及纯化

根据TK1 CDS序列（GenBank: V00470.1 ，310..1440，1131bp）设计特异性引物（见附录），同时，在5'和3'端分别加入酶切位点BamHI和HindⅢ。以HSV基因组为模板，两步法扩增出目的条带。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于克隆TK1 CDS的DNA序列：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收TK1 DNA片段。

1. 2 pCMV-TK1重组质粒构建

将扩增出的TK1片段酶切连接到pcDNA3.1(-)-MYC-HIS载体上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。

A. 双酶切反应

按照下表所示配制酶切体系，用于双酶切1. 1中扩增出的TK1 DNA序列：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段，并测量其浓度：载体片段浓度为47ng/μl，TK1基因片段浓度为188ng/μl。

B. 酶切后连接

按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段与载体的连接：

将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。

C. 转化感受态菌及涂板筛选

使用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌。

将连接液转化感受态大肠杆菌，于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

D. 纯化菌落鉴定

挑取C中30个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

E. pCMV-TK1重组质粒小量制备及双酶切鉴定

挑取D中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测得浓度为574ng/μl。重组质粒pCMV_TK1为6549bp。

按照下表所示配制酶切体系，用于双酶切鉴定重组质粒pCMV_TK1：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切40 min。

配制浓度为0.8%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

F. pCMV_TK1重组质粒测序

送10ul质粒于Invitrogen公司测序。

实施例2：“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段扩增

根据重组质粒pCMV-TK1序列设计特异性引物（见附录），以扩增出-TK1-BGH polyA-片段，同时，在5' 端加入NheI酶切位点和16bp的RBE序列，在3' 端加入SalI酶切位点。以重组质粒pCMV-TK1为模板，两步法扩增出目的条带。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于扩增-Nhe-RBE-TK1-BGHpoly A-Sal- 片段：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。

送10ul质粒于Invitrogen公司测序。

实施例3：pN2-EF1α-hFIXml重组质粒的构建

3.1 PCR扩增-KpnI-EF1α-hF-Not I-片段

根据EF1α启动子序列设计上游引物，并在目的片段5’端加上KpnI酶切位点，根据hFml序列设计下游引物，并在目的片段3’端加上NotI酶切位点，引物见附录，扩增出Kpn-EF1α promoter-hFml-Not片段，送测序。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于扩增目的序列：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。

送30ul质粒于Invitrogen公司测序。

3.2 pN2-EF1α-hFIXml重组质粒的构建

将扩增出的“-Kpn I-EF1α-hFIXml-Not I-”片段酶切连接到pEGFP-N2载体上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。

A.pT-EF1α-hFIXml重组质粒构建

由于“-Kpn I-EF1α-hFIXml-Not I-”片段的NotI酶切位点保护碱基仅设计3核苷酸，酶切效率不高，故先连接到T载体上后再做双酶切。

a.DNA A-Tailing反应

根据下表所示配制加“A”反应液，用于3.1中扩增出的"-Kpn I-EF1α-hFIXml-NotI-"片段3'末端加“A”：

放置72℃水浴锅中反应20min。冰中静置2min。

b.T载体连接反应

根据下表所示配制T载体连接反应体系，用于A-Tailing DNA的"-Kpn I- EF1α-hFIXml-Not I-"片段与T载体的连接：

加入5ul（等量）的Solution I。16℃保温瓶中反应30min。

c.转化感受态菌及涂板筛选

使用CaCl₂法制备感受态大肠杆菌。

将全量（10ul）连接液转化感受态大肠杆菌，于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

d.纯化菌落鉴定

挑取C中20个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

e.pT- EF1α-hFIXml重组质粒小量制备

挑取d步骤中菌落PCR鉴定出的阳性克隆5#，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测得浓度为398ng/μl。重组质粒pT-EF1α-hFIXml约为6.7kb。

B. pN2-EF 1α-hFIXml重组质粒构建

a. 分步法双酶切反应

按照下表所示配制酶切体系，用于第一步分步双酶切3.1中扩增出的"-Kpn I-EF1α-hFIXml-Not I-"片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切8h。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

按照下表所示配制酶切体系，用于第二步分步双酶切回收产物片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

b. 酶切后连接

按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段与载体的连接：

将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。

c. 转化感受态菌及涂板筛选

使用CaCl2法制备感受态大肠杆菌。

将连接液转化感受态大肠杆菌，于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

d. 纯化菌落鉴定

挑取c中20个菌落划线于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

e.pN2- EF1α-hFIXml重组质粒小量制备及双酶切鉴定

挑取d步骤中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测定浓度。

实施例4：p CMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml构建

将扩增出的-NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI-片段分步双酶切连接到pN2-EF1α-hFIXml重组质粒上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。

4.1 分步法双酶切反应

按照下表所示配制酶切体系，用于第一步分步实施例2中扩增出的"-Nhe I-RBE-TK1-BGH poly A-Sal I-"片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切8h。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

按照下表所示配制酶切体系，用于第二步分步双酶切回收产物片段：

将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。

4.2 酶切后连接

按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段与载体的连接：

将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。

4.3 转化感受态菌及涂板筛选

根据CaCl₂方法制备感受态大肠杆菌（本实验室大量制备，于-70℃中冻存，可直接取用）。

连接液转化感受态大肠杆菌，于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。

4.4纯化菌落鉴定

挑取4.3中20个菌落划线于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。（引物见附录2）

按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：

按照下表所示程序进行PCR反应：

配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。

4.5 pCMV-TK1-N2-EF1α-hFIXml重组质粒小量制备

挑取4.4中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen 质粒的小量抽提试剂盒抽提质粒,测定浓度。重组质粒pCMV-TK1-N2-EF1α-hFIXml为9361bp。

4.6 pCMV_TK1-N2-EF1α-hFIXml重组质粒测序

送10ul质粒于Invitrogen公司测序。

实施例5：p CMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS构建

在FIXml基因片段两端经点突变引入新的酶切位点，如Asc I、Pac I、Pvu I、Spe I或SwaI，从而可以替换其他基因片段以供研究应用。

实施例6：hFIX基因定点整合系统修饰细胞系建立

在六孔板中接种HEK293细胞，第二天细胞密度达到90%转染。pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml 2 ug+pRep 0.4 ug/孔，使用invitrogen公司的Lipofecamin Reagent进行转染。转染4小时后清洗细胞，换新鲜培养液。转然后24小时将细胞悬浮起来，进行适当稀释，转移至5cm培养皿中，添加含有600ug/ml 的G418和500ng/ml阿昔洛韦（aciclovir，ACV）的培养液进行筛选，筛选14天后可以得到TK1和Neo基因稳定整合的细胞克隆。

引物

<110> 复旦大学

<120> 一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒及其构建方法和应用

<130> 001

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1131

<212> DNA

<213>

<400> 1

atggcttcgt accccggcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60

ggccatagca accgacgtac ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120

cgcctggagc agaaaatgcc cacgctactg cgggtttata tagacggtcc tcacgggatg 180

gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggtt cgcgcgacga tatcgtctac 240

gtacccgagc cgatgactta ctggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc 300

tacaccacac aacaccgcct cgaccagggt gagatatcgg ccggggacgc ggcggtggta 360

atgacaagcg cccagataac aatgggcatg ccttatgccg tgaccgacgc cgttctggct 420

ccccatatcg ggggggaggc tgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc 480

ttcgaccgcc atcccatcgc cgccctcctg tgctacccgg ccgcgcgata ccttatgggc 540

agcatgaccc cccaggccgt gctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc 600

acaaacatcg tgttgggggc ccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc 660

cagcgccccg gcgagcggct tgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttacggg 720

ctgcttgcca atacggtgcg gtatctgcag ggcggcgggt cgtggcggga ggattgggga 780

cagctttcgg ggacggccgt gccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca 840

cgaccccata tcggggacac gttatttacc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc 900

aacggcgacc tgtacaacgt gtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt 960

cccatgcacg tctttatcct ggattacgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg 1020

ctgcaactta cctccgggat ggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cataccgacg 1080

atctgcgacc tggcgcgcac gtttgcccgg gagatggggg aggctaactg a 1131

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> "NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI"片段扩增的上游引物

<400> 2

ttagctagcg agcgagcgag cgcgcatggc ttcgtacccc ggccatc 47

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> "NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI"片段扩增的下游引物

<400> 3

cgcgtcgacc catagagccc accgcatccc cagcatgcct gc 42

<210> 4

<211> 4032

<212> DNA

<213> KpnI -EF1α-hFIXml -NotI 片段序列

<400> 4

ggtaccgtga ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga 60

gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa 120

ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta 180

tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca 240

ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt 300

gccttgaatt acttccacgc ccctggctgc agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg 360

ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt 420

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cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga 540

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cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga 660

ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc 720

ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg 780

cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga 840

gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga 900

aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt 960

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tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc 1200

ctgcagcccg ggggatccat gcagcgcgtg aacatgatca tggcagaatc accaggcctc 1260

atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacaggttt gtttcctttt 1320

ttaaaataca ttgagtatgc ttgcctttta gatatagaaa tatctgatgc tgtcttcttc 1380

gctaaatttt gattacatga tttgacagca atattgaaga gtctaacagc cagcacgcag 1440

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tagatcgaca atgcttatga tgcatttatg tttaataaac actgttcagt tcatgatttg 1560

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gtctgatttt aagatatatg acatttcaag gtttcagaag tatgtaatga ggtgtgtctc 1800

taatttttta aattatatat cttcaattta aagttttagt taaaacataa agattaacct 1860

ttcattagca agctgttagt tatcaccaaa gcttttcatg gattaggaaa aaatcatttt 1920

gtctctatgt caaacatctt ggagttgata tttggggaaa cacaatactc agttgagttc 1980

cctaggggag aaaagcaagc ttaagaattg acataaagag taggaagtta gctaatgcaa 2040

catatatcac tttgtttttt cacaactaca gtgactttat gtatttccca gaggaaggca 2100

tacagggaag aaattatccc atttggacaa acagcatgtt ctcacaggaa gcatttatca 2160

cacttacttg tcaactttct agaatcaaat ctagtagctg acagtaccag gatcaggggt 2220

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gtcagctgga ccataattag gcttctgttc ttcaggagac atttgttcaa agtcatttgg 2340

gcaaccatat tctgaaaaca gcccagccag ggtgatggat cactttgcaa agatcctcaa 2400

tgagctattt tcaagtgatg acaaagtgtg aagttaaccg ctcatttgag aactttcttt 2460

ttcatccaaa gtaaattcaa atatgattag aaatctgacc ttttattact ggaattctct 2520

tgactaaaag taaaattgaa ttttaattcc taaatctcca tgtgtataca gtactgtggg 2580

aacatcacag attttggctc catgccctaa agagaaattg gctttcagat tatttggatt 2640

aaaaacaaag actttcttaa gagatgtaaa attttcatga tgttttcttt tttgctaaaa 2700

ctaaagaatt attcttttac atttcagttt ttcttgatca tgaaaacgcc aacaaaattc 2760

tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa gggaaccttg 2820

agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt tttgaaaaca 2880

ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt gagtccaatc 2940

catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt tggtgtccct 3000

ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag aatggcagat 3060

gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt actgagggat 3120

atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca tgtggaagag 3180

tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgaggc tgtttttcct gatgtggact 3240

atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc acccaatcat 3300

taatgacttc actcgggttg ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat tcccttggca 3360

ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta atgaaaaatg 3420

gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg tcgcaggtga 3480

acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc gaattattcc 3540

tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat gacattgccc ttctggaact 3600

ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt tgcattgctg acaaggaata 3660

cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa gagtcttcca 3720

caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg accgagccac 3780

atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg gcttccatga 3840

aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg aagtggaagg 3900

gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga aaggcaaata 3960

tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactgggtt aaggaaaaaa caaagctcac 4020

ttaagcggcc gc 4032

<210> 5

<211> 9361

<212> DNA

<213> p CMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml 重组质粒序列

<400> 5

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgagc 600

gagcgagcgc gcatggcttc gtaccccggc catcaacacg cgtctgcgtt cgaccaggct 660

gcgcgttctc gcggccatag caaccgacgt acggcgttgc gccctcgccg gcagcaagaa 720

gccacggaag tccgcctgga gcagaaaatg cccacgctac tgcgggttta tatagacggt 780

cctcacggga tggggaaaac caccaccacg caactgctgg tggccctggg ttcgcgcgac 840

gatatcgtct acgtacccga gccgatgact tactggcagg tgctgggggc ttccgagaca 900

atcgcgaaca tctacaccac acaacaccgc ctcgaccagg gtgagatatc ggccggggac 960

gcggcggtgg taatgacaag cgcccagata acaatgggca tgccttatgc cgtgaccgac 1020

gccgttctgg ctccccatat cgggggggag gctgggagct cacatgcccc gcccccggcc 1080

ctcaccctca tcttcgaccg ccatcccatc gccgccctcc tgtgctaccc ggccgcgcga 1140

taccttatgg gcagcatgac cccccaggcc gtgctggcgt tcgtggccct catcccgccg 1200

accttgcccg gcacaaacat cgtgttgggg gcccttccgg aggacagaca catcgaccgc 1260

ctggccaaac gccagcgccc cggcgagcgg cttgacctgg ctatgctggc cgcgattcgc 1320

cgcgtttacg ggctgcttgc caatacggtg cggtatctgc agggcggcgg gtcgtggcgg 1380

gaggattggg gacagctttc ggggacggcc gtgccgcccc agggtgccga gccccagagc 1440

aacgcgggcc cacgacccca tatcggggac acgttattta ccctgtttcg ggcccccgag 1500

ttgctggccc ccaacggcga cctgtacaac gtgtttgcct gggccttgga cgtcttggcc 1560

aaacgcctcc gtcccatgca cgtctttatc ctggattacg accaatcgcc cgccggctgc 1620

cgggacgccc tgctgcaact tacctccggg atggtccaga cccacgtcac cacccccggc 1680

tccataccga cgatctgcga cctggcgcgc acgtttgccc gggagatggg ggaggctaac 1740

tgacttaagt ttaaaccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 1800

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 1860

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 1920

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 1980

tgcggtgggc tctatgggtc gacggtaccg tgaggctccg gtgcccgtca gtgggcagag 2040

cgcacatcgc ccacagtccc cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aaccggtgcc 2100

tagagaaggt ggcgcggggt aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt 2160

cccgagggtg ggggagaacc gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc 2220

aacgggtttg ccgccagaac acaggtaagt gccgtgtgtg gttcccgcgg gcctggcctc 2280

tttacgggtt atggcccttg cgtgccttga attacttcca cgcccctggc tgcagtacgt 2340

gattcttgat cccgagcttc gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta 2400

aggagcccct tcgcctcgtg cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt 2460

gcgaatctgg tggcaccttc gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta 2520

aaatttttga tgacctgctg cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg 2580

ccaagatctg cacactggta tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc 2640

gtcccagcgc acatgttcgg cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg 2700

ggggtagtct caagctggcc ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc 2760

cccgccctgg gcggcaaggc tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc 2820

gcttcccggc cctgctgcag ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc 2880

gggtgagtca cccacacaaa ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga 2940

ctccacggag taccgggcgc cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac 3000

gtcgtcttta ggttgggggg aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt 3060

ggagactgaa gttaggccag cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt 3120

tgagtttgga tcttggttca ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc 3180

atttcaggtg tcgtgaggaa ttcctgcagc ccgggggatc catgcagcgc gtgaacatga 3240

tcatggcaga atcaccaggc ctcatcacca tctgcctttt aggatatcta ctcagtgctg 3300

aatgtacagg tttgtttcct tttttaaaat acattgagta tgcttgcctt ttagatatag 3360

aaatatctga tgctgtcttc ttcgctaaat tttgattaca tgatttgaca gcaatattga 3420

agagtctaac agccagcacg caggttggta agtactggtt ctttgttagc taggttttct 3480

tcttcttcat ttttaaaact aaatagatcg acaatgctta tgatgcattt atgtttaata 3540

aacactgttc agttcatgat ttggtcatgt aattcctgtt agaaaacatt catctccttg 3600

gtttaaaaaa attaaaagtg ggaaaacaaa gaaatagcag aatatagtga aaaaaaataa 3660

ccacattatt tttgtttgga cttaccactt tgaaatcaaa atgggaaaca aaagcacaaa 3720

caatggcctt atttacacaa aaagtctgat tttaagatat atgacatttc aaggtttcag 3780

aagtatgtaa tgaggtgtgt ctctaatttt ttaaattata tatcttcaat ttaaagtttt 3840

agttaaaaca taaagattaa cctttcatta gcaagctgtt agttatcacc aaagcttttc 3900

atggattagg aaaaaatcat tttgtctcta tgtcaaacat cttggagttg atatttgggg 3960

aaacacaata ctcagttgag ttccctaggg gagaaaagca agcttaagaa ttgacataaa 4020

gagtaggaag ttagctaatg caacatatat cactttgttt tttcacaact acagtgactt 4080

tatgtatttc ccagaggaag gcatacaggg aagaaattat cccatttgga caaacagcat 4140

gttctcacag gaagcattta tcacacttac ttgtcaactt tctagaatca aatctagtag 4200

ctgacagtac caggatcagg ggtgccaacc ctaagcaccc ccagaaagct gactggccct 4260

gtggttccca ctccagacat gatgtcagct ggaccataat taggcttctg ttcttcagga 4320

gacatttgtt caaagtcatt tgggcaacca tattctgaaa acagcccagc cagggtgatg 4380

gatcactttg caaagatcct caatgagcta ttttcaagtg atgacaaagt gtgaagttaa 4440

ccgctcattt gagaactttc tttttcatcc aaagtaaatt caaatatgat tagaaatctg 4500

accttttatt actggaattc tcttgactaa aagtaaaatt gaattttaat tcctaaatct 4560

ccatgtgtat acagtactgt gggaacatca cagattttgg ctccatgccc taaagagaaa 4620

ttggctttca gattatttgg attaaaaaca aagactttct taagagatgt aaaattttca 4680

tgatgttttc ttttttgcta aaactaaaga attattcttt tacatttcag tttttcttga 4740

tcatgaaaac gccaacaaaa ttctgaatcg gccaaagagg tataattcag gtaaattgga 4800

agagtttgtt caagggaacc ttgagagaga atgtatggaa gaaaagtgta gttttgaaga 4860

agcacgagaa gtttttgaaa acactgaaag aacaactgaa ttttggaagc agtatgttga 4920

tggagatcag tgtgagtcca atccatgttt aaatggcggc agttgcaagg atgacattaa 4980

ttcctatgaa tgttggtgtc cctttggatt tgaaggaaag aactgtgaat tagatgtaac 5040

atgtaacatt aagaatggca gatgcgagca gttttgtaaa aatagtgctg ataacaaggt 5100

ggtttgctcc tgtactgagg gatatcgact tgcagaaaac cagaagtcct gtgaaccagc 5160

agtgccattt ccatgtggaa gagtttctgt ttcacaaact tctaagctca cccgtgctga 5220

ggctgttttt cctgatgtgg actatgtaaa ttctactgaa gctgaaacca ttttggataa 5280

catcactcaa agcacccaat cattaatgac ttcactcggg ttgttggtgg agaagatgcc 5340

aaaccaggtc aattcccttg gcaggttgtt ttgaatggta aagttgatgc attctgtgga 5400

ggctctatcg ttaatgaaaa atggattgta actgctgccc actgtgttga aactggtgtt 5460

aaaattacag ttgtcgcagg tgaacataat attgaggaga cagaacatac agagcaaaag 5520

cgaaatgtga ttcgaattat tcctcaccac aactacaatg cagctattaa taagtacaac 5580

catgacattg cccttctgga actggacgaa cccttagtgc taaacagcta cgttacacct 5640

atttgcattg ctgacaagga atacacgaac atcttcctca aatttggatc tggctatgta 5700

agtggctggg gaagagtctt ccacaaaggg agatcagctt tagttcttca gtaccttaga 5760

gttccacttg ttgaccgagc cacatgtctt cgatctacaa agttcaccat ctataacaac 5820

atgttctgtg ctggcttcca tgaaggaggt agagattcat gtcaaggaga tagtggggga 5880

ccccatgtta ctgaagtgga agggaccagt ttcttaactg gaattattag ctggggtgaa 5940

gagtgtgcaa tgaaaggcaa atatggaata tataccaagg tatcccggta tgtcaactgg 6000

gttaaggaaa aaacaaagct cacttaagcg gccgcgactc tagatcataa tcagccatac 6060

cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 6120

acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 6180

ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 6240

tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta aggcgtaaat tgtaagcgtt aatattttgt 6300

taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg 6360

gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt 6420

ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct 6480

atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt 6540

gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa 6600

agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc 6660

tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc 6720

tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6780

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6840

aataatattg aaaaaggaag agtcctgagg cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca 6900

gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 6960

caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 7020

aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc 7080

cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta 7140

tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt 7200

tggaggccta ggcttttgca aagatcgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 7260

ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 7320

atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 7380

aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag 7440

acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 7500

acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 7560

tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 7620

ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 7680

agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 7740

atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg 7800

aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 7860

gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 7920

cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 7980

tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 8040

agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc 8100

atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt 8160

ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca 8220

ccctaggggg aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat 8280

gacggcaata aaaagacaga ataaaacgca cggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg 8340

ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt ggggccaata 8400

cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct 8460

cgcagccaac gtcggggcgg caggccctgc catagcctca ggttactcat atatacttta 8520

gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 8580

tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 8640

aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 8700

aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 8760

tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 8820

gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 8880

cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 8940

acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 9000

cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 9060

cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 9120

aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 9180

gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 9240

atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 9300

tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgccatgca 9360

t 9361

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213>

<400> 6

gctctagaat ggcttcgtac cccggccatc 30

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213>

<400> 7

gcccttaagt cagttagcct cccccatctc c 31

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213>

<400> 8

ttagctagcg agcgagcgag cgcgcatggc ttcgtacccc ggccatc 47

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213>

<400> 9

cgcgtcgacc catagagccc accgcatccc cagcatgcct gc 42

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213>

<400> 10

ctagcgctac cggactcaga tc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213>

<400> 11

gcctggtgat tctgccatga tc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213>

<400> 12

gtgaggctcc ggtgcccgtc 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213>

<400> 13

ggccatcttt ccgctcacgc aac 23

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213>

<400> 14

ttaggtaccg tgaggctccg gtgcccgtc 29

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213>

<400> 15

cccgcggccg cttaagtgag ctttgttttt tccttaatcc agttg 45

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213>

<400> 16

ctctcccacc cacttccaac g 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213>

<400> 17

ggggagaacc gtatataagt gcag 24

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213>

<400> 18

aatcaccagg cctcatcacc atc 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213>

<400> 19

ctgcgtgctg gctgttagac tc 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213>

<400> 20

accgacgccg ttctggctcc tc 22

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213>

<400> 21

ccggaagggc cccaagcacg atg 23

Claims (3)

1.一种含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架的质粒，记为pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其特征在于该质粒含有一个由CMV启动子RBE元件TK1基因组成的筛选标记；其序列为SEQ ID NO.5所示。

2.一种如权利要求1所述的含RBE顺式元件、正负筛选元件的人凝血因子IX表达框架的质粒的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）构建pCMV-TK1重组质粒

将合成的携带XbaI和AflⅡ粘性末端的TK1基因DNA片段，通过DNA重组技术插入经XbaI和AflⅡ双酶切的pcNDA3.1(-)/myc-His A载体，获得pCMV-TK1质粒；TK1基因DNA片段见SEQID NO.1所示；

（2）扩增“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”片段

以质粒pCMV-TK1为模板，用含Nhe I-RBE的上游引物和含Sal I的下游引物扩增获得Nhe I-RBE-TK1-BGHpA-Sal I DNA片段；所述上游引物为SEQ ID NO.2所示，所述下游引物为SEQ ID NO.3所示；

（3）构建pN2-EF1α-hFIXml重组质粒

合成含启动子EF1α的人凝血因子FIX小基因的DNA片段，其5’端增加KpnI粘性酶切位点，在3’端增加NotI粘性酶切位点；合成的携带KpnI和NotI粘性末端的hFIXml双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经KpnI和NotI双酶切的pEGFP-N2，得到重组质粒，记为pN2-EF1α-hFIXml；

（4）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒

“NheI-RBE-TK1-BGHpA-SalI”双链DNA片段，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和SalⅠ双酶切的pN2-EF1α-hFIXml重组质粒，获得表达质粒，记为pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml，其序列为SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1所述的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml在建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系中的应用，其特征在于具体步骤为：

（1）构建pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS

pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒用Apl I消化，补平后连接获得pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-MCS质粒，用于在MCS位点插入重组基因；

（2）建立hFIX基因定点整合系统修饰细胞系

合成的hFIX表达质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml和pRC质粒共同转染原代培养的成细胞，使用阿昔洛韦和G418共同筛选，得到hFIX基因定点整合系统修饰细胞系。