CN103667346B - 一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用，该质粒的序列如SEQ？ID？NO.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。该质粒和rep表达质粒共高压注射哺乳动物体内可用于外源基因定点整合于人类19号染色体上的AAVS1特定位点以表达人类凝血因子IX。使用该表达质粒可以稳定表达人类凝血因子IX，且加大了整合系统在肝中的整合效率，从而实现更高的表达量和更长的表达时间。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒及其构建和应用。
背景技术
在自然界的许多天然的转基因事件中，有一些事件在长期进化过程中被证明是安全的。其中，人类基因组最具有意义的是其19号染色体上有一个被称之为AAV病毒的整合位点AAVS1（adeno-associatedvirusintegrationsite1）。自然情况下，AAV仅仅整合在AAVS1；在体外实验条件下，也有超过75%的AAVITR（invertedterminalrepeat）附加的基因可以在rep蛋白指导下整合在AAVS1。
迄今为止，国内外的一系列研究成果都未发现任何已知人类疾病与AAV感染相关。此结论的重要性在于：该结论是以成年人大于90%的AAV感染率为前提得出的，具有高度可靠性，而AAV结构中的关键成分Rep蛋白和介导整合的顺式元件——位于AAVITR或位于P5启动子内的核心元件16bpRBE（repbindingelement），已经多次体内、外实验证实，可以构成可靠的定点整合转基因系统（HumGeneTher.2010;21(6):728-38.GeneTher.2009;16(5):589-95.JMolBiol.2006;358(1):38-45.）。
然而，单纯的含有此16bpRBE的定点整合转基因系统还存在着体外介导整合的效率尚可，体内介导整合的效率不高、基因表达产物的量有待进一步提高的缺点（GeneTher.2009;16(5):589-95.）。而hAAT启动子和HCR（hepaticlocuscontrolregion）元件可以增加以上定点整合转基因系统的体内表达效率（MolTher.2001;3(6):948-57.MolTher2000;1(6):522-32.JSurgRes.1994;56(6):510-17.）。因此，将定点整合系统所需核心元件和肝特异性调控元件（hAAT启动子、HCR元件）结合起来构建一个新的转基因表达系统，则可以在提供定点整合、保证安全的前提下提高转基因的表达效率。
发明内容
本发明描述了一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的构建和应用。
本发明所述的pRBE-HCR-hAAT-hFIXml，序列如SEQIDNO.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。
所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml的构建方法，是将hAAT启动子和HCR调控元件插入去除了CMV启动子的pRBE-CMV-FIXml的位点NheI和BglⅡ之间得到pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
构建方法具体包括以下步骤：
1）pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体获得
以pRBE-CMV-FIXml为模板，引物两端分别加入了酶切位点BglII、NheI，以这两引物扩增不含CMV启动子的质粒骨架；PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化；
2）hAAT片段扩增及pT-hAAT的构建
以人基因组DNA为模板，用含NheI的上游引物和含BglⅡ的下游引物扩增获得NheI-hAAT-BglⅡDNA片段，将此片段用NheI和BglⅡ酶切后连接于T载体，得到pT-hAAT；
3）HCR片段扩增
以人基因组DNA为模板，用含SpeI的上游引物和含SpeI的下游引物扩增获得SpeI-HCR-SpeIDNA片段；
4）pT-HCR-hAAT构建
用NheI酶切T-hAAT，用DNA凝胶回收试剂盒纯化，与用SpeI酶切回收的HCR片段连接后，获得pT-HCR-hAAT；
5）HCR-hAAT片段的PCR扩增
以pT-HCR-hAAT为模板，用含NheI的上游引物和含BglⅡ的下游引物扩增获得NheI-HCR-hAAT-BglⅡDNA片段；
6）pRBE-HCR-hAAT-hFIXml构建
“NheI-HCR-hAAT-BglⅡ”双链DNA片段进行NheⅠ和BglⅡ双酶切，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和BglⅡ双酶切的pRBE-CMV-FIXml重组质粒，获得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
本发明还公开了pRBE-HCR-hAAT-hFIXml用于将外源基因hFIXml定点整合于人染色体的AAVS1特定位点，使哺乳动物体内稳定表达hFIX的用途。
本发明的优点在于在筛选基因表达序列和启动子之间设计插入肝特异性控制元件和RBE整合元件。该质粒和rep表达质粒共高压注射哺乳动物体内可用于外源基因定点整合于人类19号染色体上的AAVS1特定位点以表达人类凝血因子IX。特点为：携带的RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；hAAT肝特异性启动子和HCR肝特异性控制元件可以提高质粒在肝中的表达量并延长其表达时间，最后定点整合于染色体上AAVS1位点。使用该表达质粒可以稳定表达人类凝血因子IX，且加大了整合系统在肝中的整合效率，从而实现更高的表达量和更长的表达时间。
附图说明
图1：pRBE-HCR-hAAT-hFIXml示意图。全长：7620bp；主要元件：hAAT启动子（1-344），HCR调控元件（345-771），RBEitr整合元件（785-801），hFIXml基因（811-3610）。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。本发明所述的制备工艺，采用常规分子生物学方法，所有中间产物和最后产品均已经DNA测序认定。
实施例1：pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体获得及纯化
根据pRBE-CMV-FIX序列（GeneTher.2009;16(5):589-95.JMolBiol.2006;358(1):38-45.）设计特异性引物（见表1-引物），同时，在5′和3′端分别加入酶切位点BglII和NheI。以pRBE-CMV-FIX为模板，扩增出目的条带。
表1-引物
按照下表所示配制PCR反应体系，用于克隆pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体序列：
| 成分 | 体积 |
| ddH2O | 72μl |
| PCR Buffer | 10μl |
| dNTP | 2μl |
| Mg2+ | 8μl |
| Forward Primer（TEST-Bgl II） | 2μl |
| Reverse Primer（TEST-Nhe I） | 2μl |
| Template | 3μl(～100ng) |
| KOD plus neo | 1μl |
| 合计 | 100μl |
按照下表所示程序进行PCR反应：
配制浓度为0.5%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收片段。
实施例2：“NheI-hAAT-BglII”片段扩增
以人基因组DNA（AmpFlSTR标准DNA，AppliedBiosystems，USA）为模板，用含NheI的上游引物和含BglII的下游引物扩增获得NheI-hAAT-BglII的DNA片段。按照下表所示配制PCR反应体系，用于扩增-NheI-hAAT-BglII-片段：
| 成分 | 体积 |
| ddH2O | 2μl |
| Buffer | 20μl |
| dNTP | 2.5μl |
| Forward Primer（hAAT-F） | 1μl |
| Reverse Primer（hAAT-R） | 1μl |
| Template | 1μl |
| HS Taq | 25μl |
| 合计 | 50μl |
按照下表所示程序进行PCR反应：
配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。
送10ul纯化产物于Invitrogen公司测序，hAAT片段序列如SEQIDNO.15所示。
实施例3：“SpeI-HCR–SpeI”片段扩增
以质粒人基因组DNA（AmpFlSTR标准DNA，AppliedBiosystems，USA）为模板，用含SpeI的上游引物和含SpeI的下游引物扩增获得SpeI-HCR-SpeIDNA片段。按照下表所示配制PCR反应体系，用于扩增-SpeI-HCR-SpeI-片段：
| 成分 | 体积 |
| ddH2O | 14.3μl |
| Buffer | 2μl |
| dNTP | 0.4μl |
| Forward Primer（F-Spe I） | 0.4μl |
| Reverse Primer（R-Spe I） | 0.4μl |
| Mg+ | 1.6μl |
| Template | 0.5μl |
| Taq | 0.4μl |
| 合计 | 20μl |
按照下表所示程序进行PCR反应：
配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。
送10ul纯化产物于Invitrogen公司测序,HCR片段序列如SEQIDNO16所示。
实施例4：pT-HCR-hAAT质粒的构建
将扩增出的“-SpeI-HCR–SpeI-”片段酶切连接到单酶切的pT-hAAT载体上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。
4.1T载体连接反应
根据下表所示配制T载体连接反应体系，用于″hAAT″片段与T载体（pMD18-T，购自TaKaRa大连有限公司）的连接：
| 成分 | 体积 |
| pMD18-T vector | 1μl |
| DNA溶液 | 2μl |
| ddH2O | 2μl |
| 合计 | 5μl |
加入5ul（等量）的SolutionI。16℃保温瓶中反应30min。
4.2转化感受态菌及涂板筛选
使用CaCl2法制备感受态大肠杆菌。
将全量（10ul）连接液转化感受态大肠杆菌，于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。
4.3菌落PCR鉴定
挑取4.2中20个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。
按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：
| 成分 | 体积 |
| ddH2O | 14.7μl |
| Buffer | 2.0μl |
| dNTP | 0.4μl |
| Mg2+ | 1.6μl |
| Forward Primer(hAAT-F) | 0.4μl |
| Reverse Primer(hAAT-R) | 0.4μl |
| Template | 0.1μl |
| Taq | 0.4μl |
| 合计 | 20μl |
按照下表所示程序进行PCR反应：
配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
4.4pT-hAAT重组质粒小量制备
挑取d步骤中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen公司的质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，测定浓度，并送测序。重组质粒pT-hAAT约为3.4kb。测序正确的质粒保留备用。
4.5pT-HCR-hAAT重组质粒构建
a.分步法酶切反应
按照下表所示配制酶切体系，用于第一步单酶切″-SpeI-HCR-SpeI-″片段：
| 成分 | 体积 |
| Buffer4 | 20μl |
| BSA | 2μl |
| Spe I | 5μl |
| Plasmid/Fragment | 21μl |
| ddH2O | 152μl |
| 合计 | 200μl |
将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。
配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。
按照下表所示配制酶切体系，用于第二步单酶切pT-hAAT载体：
| 成分 | 体积 |
| Buffer2 | 20μl |
| BSA | 2μl |
| Nhe I | 5μl |
| Plasmid/Fragment | 21μl |
| ddH2O | 152μl |
| 合计 | 200μl |
将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。
配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。
b.酶切后连接
按照下表所示配制连接体系，用于酶切后目的片段与载体的连接：
| 成分 | 体积 |
| Vector | 2μl |
| HCR | 2μl |
| Solution I | 5μl |
| ddH2O | 1μl |
| 合计 | 10μl |
将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。
c.转化感受态菌及涂板筛选
挑取b中20个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。
d.菌落PCR鉴定
挑取c中20个菌落划线于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。
按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：
| 成分 | 体积 |
| ddH2O | 14.7μl |
| Buffer | 2.0μl |
| dNTP | 0.4μl |
| Mg2+ | 1.6μl |
| Forward Primer(HA-F) | 0.4μl |
| Reverse Primer(HA-R) | 0.4μl |
| Template | 0.1μl |
| Taq | 0.4μl |
| 合计 | 20μl |
按照下表所示程序进行PCR反应：
配制浓度为2%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
e.pT-HCR-hAAT重组质粒小量制备
挑取d步骤中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen公司的质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，测定浓度并送测序。测序正确（正向连接）的保留备用。
实施例5：pRBE-HCR-hAAT-hFIXml构建
将上述4.5e中的pT-HCR-hAAT质粒双酶切连接到pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子后的片段上，转化感受态菌，涂板筛选阳性克隆。
5.1分步法双酶切反应
按照下表所示配制酶切体系：用于pT-HCR-hAAT质粒双酶切：
| 成分 | 体积 |
| Buffer2 | 20μl |
| BSA | 2μl |
| Bgl II | 8μl |
| Spe I | 8μl |
| Plasmid | 30μl |
| ddH2O | 132μl |
| 合计 | 200μl |
将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。
配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段（HCR-hAAT）。
按照下表所示配制酶切体系，用于pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子后片段的双酶切：
| 成分 | 体积 |
| Buffer2 | 20μl |
| BSA | 2μl |
| Bgl II | 8μl |
| Nhe I | 8μl |
| Fragment | 21μl |
| ddH2O | 157μl |
| 合计 | 200μl |
将上述体系放置在37℃烘箱中酶切过夜。
配制浓度为0.5%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
使用AxyPrep凝胶回收试剂盒纯化上述酶切片段。
5.2酶切后连接
按照下表所示配制连接体系，用于双酶切后目的片段（HCR-hAAT）与载体（pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子后的片段）的连接：
| 成分 | 体积 |
| Vector | 2μl |
| HCR-hAAT | 2μl |
| Solution I | 5μl |
| ddH2O | 1μl |
| 合计 | 10μl |
将上述体系放置在16℃保温盒中反应4小时。
5.3转化感受态菌及涂板筛选
根据CaCl2方法制备感受态大肠杆菌（本实验室大量制备，于-70℃中冻存，可直接取用）。
连接液转化感受态大肠杆菌并涂布于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养15小时。
5.4菌落PCR鉴定
挑取5.3中20个菌落划线于卡那霉素抗性LB固体培养基上，37℃倒置培养4小时。使用菌落PCR方法鉴定并筛选出阳性克隆。（引物见表1）
按照下表所示配制PCR反应体系，用于菌落PCR鉴定：
| 成分 | 体积 |
| ddH2O | 73μl |
| Buffer | 10μl |
| dNTP | 2μl |
| Mg2+ | 8μl |
| Forward Primer(HH5-F) | 2μl |
| Reverse Primer(HH5-R) | 2μl |
| Template | 1μl |
| Taq | 2μl |
| 合计 | 100μl |
按照下表所示程序进行PCR反应：
配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，以120V电压进行恒压电泳。
5.5pRBE-HCR-hAAT-hFIXml重组质粒小量制备
挑取5.4中菌落PCR鉴定出的阳性克隆，于卡那霉素抗性的LB液体培养基中培养。使用Axygen公司的质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，测定浓度。重组质粒pRBE-HCR-hAAT-hFIXml为8000bp。
5.6pRBE-HCR-hAAT-hFIXml重组质粒测序
送10ul质粒于Invitrogen公司测序，pRBE-HCR-hAAT-hFIXml重组质粒序列如SEDIDNO.17所示，其结构如图1。
实施例6：尾静脉液压法在转基因小鼠中导入外源基因
使用6～8周龄的携带AAVS1位点的转基因小鼠，pRBE-HCR-hAAT-hFIXml25μg+pRC25μg溶解于2.5毫升Ringer’s溶液中，用27号针头7秒内将2.5ml溶液注入小鼠尾静脉。在接下来的固定时间点内采用眼球后静脉丛取血法采集小鼠血样，用ELISA法检测小鼠血浆中人凝血因子IX浓度。结果显示：在实验观察期的240天时间内，该质粒在转基因小鼠体内的人凝血因子IX的浓度一直维持在正常人的1%以上的水平，远高于先前的报道（GeneTher.2009;16(5):589-95.）。由于该质粒可以将外源基因定点整合于人染色体的AAVS1特定位点，从而最大限度地防止了使用病毒性载体引起的机体功能基因的断裂、插入突变等潜在性的风险，在有安全性需求的基因缺陷性疾病的治疗上展示出极大的临床应用潜力。
Claims (3)
1.一种pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒，其特征在于，该质粒的序列如SEQIDNO.17所示，其含有hAAT启动子、RBE元件和HCR调控元件。
2.一种制备权利要求1所述pRBE-HCR-hAAT-hFIXml质粒的方法，其特征在于，hAAT启动子和HCR调控元件插入去除了CMV启动子的pRBE-CMV-FIXml质粒的位点NheI和BglⅡ之间得到pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)pRBE-CMV-FIXml去CMV启动子载体获得
以质粒pRBE-CMV-FIXml为模板，引物两端分别加入了酶切位点BglII、NheI，以这两引物扩增不含CMV启动子的质粒骨架；PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化；
2)hAAT片段扩增及pT-hAAT的构建
以人基因组DNA为模板，用含NheI的上游引物和含BglⅡ的下游引物扩增获得NheI-hAAT-BglⅡDNA片段，将此片段用NheI和BglⅡ酶切后连接于T载体，得到质粒pT-hAAT；
3)HCR片段扩增
以人基因组DNA为模板，用含SpeI的上游引物和含SpeI的下游引物扩增获得SpeI-HCR-SpeIDNA片段；
4)pT-HCR-hAAT质粒构建
用NheI酶切pT-hAAT，用DNA凝胶回收试剂盒纯化，与用SpeI酶切回收的HCR片段连接后，获得pT-HCR-hAAT；
5)HCR-hAAT片段的PCR扩增
以pT-HCR-hAAT为模板，用含NheI的上游引物和含BglⅡ的下游引物扩增获得NheI-HCR-hAAT-BglⅡDNA片段；
6)pRBE-HCR-hAAT-hFIXml构建
“NheI-HCR-hAAT-BglⅡ”双链DNA片段进行NheⅠ和BglⅡ双酶切，通过DNA重组技术插入经NheⅠ和BglⅡ双酶切的pRBE-CMV-FIXml重组质粒，获得pRBE-HCR-hAAT-hFIXml。
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Granted publication date: 20160120 Termination date: 20181217 |