CN105483152A - 具有免疫作用的质粒 - Google Patents

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Abstract

描述了用于转染真核和原核细胞的重组质粒；所述质粒具有介于7和12千碱基的长度，并包含编码免疫球蛋白的重链的序列；特别地，它们可用于：-转染原核或真核细胞(间接体内)的过程，所述原核或真核细胞可接种于高等生物以诱导预防性或治疗性免疫应答；-基因(genic)免疫方法学中直接接种(体内)于高等生物的方案，以诱发预防性或治疗性免疫应答。

Description

具有免疫作用的质粒
本申请是申请日为2007年07月13日、申请号为200780029708.8、发明名称为“具有免疫作用的质粒”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有免疫作用的质粒。
背景技术
质粒来源的DNA可通过已知方法用于转染原核和真核细胞。为此目的构建的质粒一般由具有编码某个蛋白的遗传物质的插入单元的骨架构成，所述蛋白可提供或可不提供其自身的生物学活性。
所述质粒可以是商业来源的，其中携带特异性的部分根据在所述质粒所指定的生物体中待重建的某个特性被引入已经知道和使用或自发产生(即通过组装选择的遗传物质的片段)的结构构建体。
质粒合成是对于获得需要的细胞性能的目的具有基本重要性的操作。质粒决定转染和转基因蛋白合成的效率，并且也决定转染的安全性，并由此在最终的分析中决定转染细胞的蛋白表达的综合效率。
质粒是遗传数据的载体，遗传数据影响宿主细胞的细胞周期，并因此影响容纳(hosts)这些转染的细胞的生物体的生命周期：向质粒中引入的数据越多，在转染过程中遇到的风险越大。
质粒的特征在于所包含的数据的特异性：其复杂性越小，则其越易合成，其使用越安全。
质粒执行转染细胞群体的能力，这或多或少自发地取决于细胞的类型和执行转染的接触/温育实验条件。质粒对特定细胞群体的选择性越强，其在安全条件下的用途越大。
执行转染的条件对其成功具有决定作用：待转染细胞的均质性和浓度、温育时间和条件、使用特异性和选择性方法监控现象的可能性构成了决定操作成功的极其重要的因素。
在使用质粒在患者体内转染待注射细胞的特异性情况下，对所述细胞的操作要极其小心，因为它们必须重新插入患者，并且不能有危险和致命的间接现象：操作必须要少，方法的安全性越高，结果的可重现性越大。
由上所述，必然得出，使用具有降低的大小的质粒，特别是如果与具有有限操作的方法结合，是用于预防性和治疗性目的的转染中优选的条件。
在自体转染方法中使用编码免疫原性表位的质粒是可用于在一些病理学中诱导特异性免疫应答的系统之一，所述病理学的特征在于出现感染媒介(infectingagent)，或在于自发的或诱导的细胞突变(致癌作用)，并且选择的细胞或细胞系的凋亡过程具有修饰。
WO90/09804描述了基因工程设计免疫球蛋白，其在所述免疫球蛋白的可变区或结合结构域表达预定的肽表位。
WO00/61766描述了端粒酶(telomerases)来源的肿瘤抗原，其可用于产生针对端粒酶和因此针对肿瘤自身的T细胞介导的应答。
WO00/64488描述了编码嵌合的免疫球蛋白重链的质粒，pNγlVH62质粒，其是通过将鼠VH62基因亚克隆至含有编码人类γl恒定区的序列的pNγl质粒获得的。此质粒可通过在可变区的任何互补性决定区域(complementaritydeterminingregions)引入异源表位进行修饰。因此，公开了其在用于诱导免疫应答的方法中的应用。
但是，如果将pNγlVH62质粒注射至人类，此质粒含有有害的部分。此外，此质粒的大小使其获得非常低的转染产率(transfectionyield)。
发明内容
本发明的目标体现为用于转染真核和原核细胞的重组质粒，其具有介于7和12千碱基(kbase)的长度，并包含编码免疫球蛋白的重链的序列。本发明的进一步目标体现为前述质粒用于在人类或动物生物体中诱导免疫应答的药物制剂或疫苗制备的用途或治疗性处理的用途。
特别地，所描述和要求保护的是用于构建质粒的碱基序列，所述质粒可用于：
-转染原核或真核细胞(间接体内(exvivo))的过程，所述原核或真核细胞可接种于高等生物以诱导预防性或治疗性免疫应答(特别是用具有序列SEQIDNO.1的质粒1)；
-基因免疫方法学中直接接种(directinoculation)(体内)于高等生物的方案，以诱发预防性或治疗性免疫应答(特别是用具有序列SEQIDNO.2的质粒2)。
还描述了可使用所述质粒治疗的病理学特性(profile)。
附图简述
图1显示质粒1的图谱。
图2显示质粒2的图谱。
图3显示质粒CDR的表位插入模型示意图。
图4显示具有本发明所述质粒编码的抗原性表位的蛋白质的假想结构。
图5显示质粒的限制图谱。
图6显示通过PCR测试从间接体内转染的淋巴细胞扩增质粒。
具体实施方案
本发明人现在开发了包含编码免疫球蛋白的重链的序列的质粒，当用于在人类或动物生物体中体内或间接体内诱导免疫应答时，所述质粒不存在pNγ1VH62质粒的缺点。特别地，所开发的质粒具有更好的安全特性，并在转染至细胞时显示增加的产率。
这些质粒具有介于7和12千碱基、优选地介于8和12千碱基、更优选地介于9和11千碱基和甚至更优选地介于9和10千碱基的长度，并且在它们被转染至淋巴细胞时能够表达免疫球蛋白的重链。
根据一个优选的实施方案，这些质粒表达嵌合的免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链优选地包含鼠可变区和人类恒定区(优选地Igγ1)。
所述鼠可变区优选地是产生自成年高免疫小鼠脾细胞的杂交瘤62的VH区(Zanetti等人.J.Immunol.，1983，131:2452)，下文称作VH62区。VH62杂交瘤62分泌具有抗甲状腺球蛋白(anti-thyroglobulin)活性的单克隆抗体。
Igγ1区基因优选地克隆自载体pNγ1。
所述质粒可进一步含有淋巴细胞特异性启动子(优选地大约50bp)，或病毒来源的启动子(优选地CMV启动子，以及优选地大约742bp)。
本发明的质粒优选地还包含多聚腺苷酸化序列AATAAA。
优选的是本发明的质粒不表达对β内酰胺抗生素特别是氨苄青霉素的抗性和/或不包含SV40的复制起点。
因此，所述质粒优选地含有大肠杆菌(Escherichiacoli)的复制起点，优选地PBR322。此外，所述质粒优选地表达对新霉素的抗性。
本申请进一步提供了一种重组质粒，所述重组质粒具有序列SEQIDNO.1或与SEQIDNO.1至少90％同源、优选地至少95％同源的序列。
本申请还提供了一种重组质粒，所述重组质粒具有序列SEQIDNO.2或与SEQIDNO.2至少90％同源、优选地至少95％同源的序列。
在本发明进一步的实施方案中，所述质粒的特征在于其可含有至少一个编码抗原性表位的序列。在本发明的另一些实施方案中，所述质粒的特征在于所述抗原性表位可选自p540(ILAKFLHWL)、p572(RLFFYRKSV)、pY572(YLFFYRKSV)、p865(RLVDDFLLV)和pNP(ASNENMETM)。
本发明的优选质粒是质粒1和2。
质粒1长9727bp(SEQIDNO.1和图1)，质粒2长10004bp(SEQIDNO.2和图2)。所述的两种质粒均编码嵌合的免疫球蛋白重链。
两种质粒间的唯一结构差异是由特异性启动子确定的，其在质粒1的情况下为50bp的淋巴细胞特异性启动子，在质粒2的情况下为大小742bp的病毒启动子。
所述质粒的骨架由pSV2neo表示，其为一种含有新霉素抗性基因和复制起点PBR322的细菌来源的DNA。
编码重免疫球蛋白链的基因序列主要由以下区域组成：
-大约2.5kb的鼠可变区(VH62)，其最初克隆自分泌具有抗甲状腺球蛋白活性的单克隆抗体的小鼠杂交瘤(杂交瘤62)(Sollazzo等人，Eur.J.Immunol.，1989)；
-产生自pNγ1载体(HybritechCorporation，SanDiego，CA)的人类Igγ1恒定区。
质粒1的免疫球蛋白启动子是VH62的完整部分，而质粒2的病毒启动子产生自质粒phMGFP(Promega，WI，USA)。新霉素抗性基因还赋予对卡那霉素的抗性，以用于原核细胞的选择性生长。
多聚腺苷酸化序列位于所述质粒的位置5178:5183，在人类恒定区之后。所述序列如下：AATAAA。细菌复制的起点是大肠杆菌的，位于位置8324:9264。
本发明的质粒的特殊特征是所编码的蛋白的决定互补性的区域(CDR)可进行诱变，以向其中引入具有抗原性能的表位(5至25个氨基酸残基)(Gerloni等人NatureBiotechnology1997)。所述性能使得使用相关质粒诱导特异性免疫应答成为可能，所述诱导是通过用自发转染的细胞接种物间接体内转染，或通过体内直接接种(基因免疫)。
因此，本发明的一个目标是使用本发明的质粒制备用于DNA疫苗接种，特别是用于在人类或动物生物体中诱导免疫应答的药物制剂。此外，本发明的另一个目标是含有至少一种如本发明所述的质粒以及药学可接受赋形剂和/或辅佐剂的制剂。
本发明的制剂可用于预防性或治疗性目的。
本发明的制剂可特别地用于受或曾受以下侵害的人类或动物生物体：
-属于癌和/或腺瘤和/或肉瘤和/或脂瘤和/或实体瘤和/或腹水瘤家族的肿瘤，前列腺或胰腺、肾或肺癌。优选地，在此情况下，所述生物体受或曾受在表面上具有至少一个抗原性表位的肿瘤细胞的存在的侵害，所述抗原性表位的编码序列包含在所述质粒中。
-细菌、病毒、真菌和/或寄生物感染。
本发明的进一步目标是在人类或动物生物体中诱导免疫应答的方法。
所述方法包括间接体内转染原核和/或真核细胞，将所述原核和/或真核细胞随后接种于所述人类或动物生物体。优选地，所述转染细胞属于淋巴细胞(lymphocytes)家族，并且优选地采自所述人类或动物生物体的外周血管。可选地，所述方法包括将质粒体内接种于所述人类或动物生物体。
本发明进一步提供了在人类或动物生物体中诱导免疫应答的方法，其包括用本发明的质粒和/或本发明的制剂间接体内转染原核和/或真核细胞，和将所述原核和/或真核细胞随后接种于所述人类或动物生物体。优选地，待转染的细胞可属于淋巴细胞家族。更优选地，所述细胞可采自所述人类或动物生物体的外周血管。在一些实施方案中，所述质粒具有序列SEQIDNO.1或与SEQIDNO.1至少90％同源、优选地至少95％同源的序列
本发明进一步提供了在人类或动物生物体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述人类或动物生物体体内接种本发明的质粒和/或本发明的制剂。在一些实施方案中，所述质粒具有序列SEQIDNO.2或与SEQIDNO.2至少90％同源、优选地至少95％同源的序列。
将所述质粒或所述原核和/或真核细胞接种于所述人类或动物生物体优选地是通过注射或跨黏膜施用执行的。
本发明的质粒编码的蛋白质像所有免疫球蛋白一样拥有3个CDR，CDR1具有用于插入肽序列的限制位点AfiIII，CDR2具有Ncol位点，CDR3具有Acc65I位点。
因此可以向所述CDR插入不同的肽序列，所述肽序列能够诱发体液型(由B细胞介导)和细胞介导型(由T细胞CD4和CD8介导)两种类型的不同免疫应答；例如，可以在每个CDR上插入至少一个序列，总共三个序列，所述序列能够诱发不同免疫应答；可以进一步在每个CDR上插入一个或多个序列，所述序列任选地彼此融合。
向CDR插入抗原性表位的实例显示于图3。
优选用于本发明目的的抗原性表位是：
-肿瘤抗原，如例如端粒酶的抗原和甚至更优选地p540(ILAKFLHWL)、p572(RLFFYRKSV)、pY572(YLFFYRKSV)和p865(RLVDDFLLV)；
-产生自传染性微生物的抗原，如例如流感病毒(influenzavirus)的抗原，优选地表位pNP(ASNENMETM)。
由质粒1和2编码的(encodedby)转基因产物是分子量为大约156.000道尔顿的蛋白质(图4)。所编码的重区(heavyregion)本质上是嵌合的：部分人类的(恒定区)和部分鼠的(可变区)。不过，鼠部分含有与人类可变区80％同源的序列。
前述质粒的重要特征是不存在氨苄青霉素抗性基因，但存在卡那霉素抗性基因，这提供了其在可能对β内酰胺抗生素过敏的受治疗者中的安全应用。另一个有利因素是卡那霉素是在37℃(所述质粒的培养条件)下稳定24-48小时的抗生素，而氨苄青霉素仅稳定3-4小时，因此允许培养产率更高(更廉价的生产)和更稳定的质粒。
前述质粒还完全没有“无用”序列(例如序列SV40或基因组物质的片断(piece))，其可代表与宿主细胞基因组同源的更大风险，因而有在细胞本身中整合的更大风险。
质粒的限制图谱分析
通过用限制酶进行消化获得的限制图谱是确定质粒的同一性要考虑的第一标准。特别地，图5中显示的图谱以严格的(exclusive)方式鉴定了质粒1和2。还接连显示了质粒1消化后的片段在琼脂糖凝胶上运行(与已知大小的标准(1Kb梯)平行)的图像，以确定其精确大小。质粒1的序列显示为SEQIDNO.1，而质粒2的序列显示为SEQIDNO.2。
质粒的生物表征
前文已经表明转染方法中编码免疫原性表位的质粒是可用于在一些病理学中诱导特异性免疫应答的系统之一，所述病理学的特征在于出现感染媒介，或在于自发的或诱导的细胞突变(致癌作用)，并且选择的细胞或细胞系的凋亡(apoptotic)过程具有修饰。
所述质粒的进一步用途是体内直接注射(directinjection)至具有免疫能力的生物体中，以诱导针对外源性质的蛋白质和病原性微生物的免疫应答(Tang等人，Nature1992，Ulmer等人，Science1993，Gerloni等人，NatureBiotechnology1997)。在此领域中，已证明使用功能基因接种诱导体液应答(由抗体介导)和细胞介导的应答(由CD4和CD8型的T-淋巴细胞介导)有效治疗或预防感染和癌起源的病理学。
因此，全世界的疫苗学家现在已采用基因免疫的概念，他们使用编码产生自细菌、病毒和寄生物以及自不同类型的肿瘤的抗原的质粒，以诱发特异性和保护性免疫应答。治疗或预防HIV、疱疹、流感、禽流感、SARS、乙型和丙型肝炎和不同类型的癌的临床试验目前正在进行中。
有待在体内使用的质粒的基本组成是编码感兴趣的抗原(或其片断)的基因、指导所述抗原的转录的启动子序列(一般产生自巨细胞病毒，CMV)、确保其翻译的多聚腺苷酸化区。
此外，同用于在细菌细胞中扩增质粒的复制起点一起的还有编码抗生素抗性的基因，以确保细菌群体的选择和消除培养过程中的污染。
DNA疫苗的另一个固有性质是细菌来源的质粒含有非甲基化胞嘧啶以及鸟嘌呤残基的序列(CpG)。这些CpG单元能够增加质粒本身的免疫能力，并因此充当佐剂。
将核酸直接接种至体细胞看起来是模拟天然感染诱导的免疫，并提供不同的优点，包括可以廉价、容易和快速的方式产生和检验所述质粒。此外，所述质粒比常规的疫苗稳定得多，并可以冻干物保存。
所述质粒通常通过肌内或皮内路径进行体内接种，但是也可使用其它路径，如口、阴道、静脉内、腹膜内和皮下路径。所述质粒于各种稀释剂中施用，所述稀释剂包括蒸馏水、盐水或糖溶液、生理缓冲液、等渗化合物(isotonicisingcompounds)、防腐剂或低温防护物质(如果冻干过程是必需的)。
免疫方案中使用的质粒剂量因情况不同而有所差异，但是一般说来，使用每次给药25至200μg的量，3次给药/注射，每次间隔三周。
因此本发明的进一步目标由两个重组质粒组成，所述质粒的特征在于分别对应于SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的序列，或与SEQIDNO.1和SEQIDNO.2至少90％同源、优选地95％同源的序列。这些质粒具有降低但适合所述目的的大小，和合适的、可重复的、安全的和有效的转染方法。
所述质粒的用途具有特异的特征：
-生产过程中的最佳产率，因为如果降低大小(amplitude)，测量含量的质粒更加容易生产，并产生更好的产率；
-细胞培养物的最佳稳定性，因为质粒含有抗生素卡那霉素的抗性基因，卡那霉素在37℃下稳定24-48小时(与氨苄青霉素在相同温度下仅稳定4-6小时相反)，所述细菌培养物的稳定性因此显著增加，这对产量无疑是有利的；
-高效率的自发转染(渗透入细胞的能力)，因为所含的分子大小和更小的空间体积，其为其中正视自发转染的使用的方案中不容忽视的细节；
-如果预先安排与氨苄青霉素的过敏反应，治疗的受治疗者无诱导过敏反应的可能性，因为所述质粒不含有氨苄青霉素抗性基因，其在存在该抗生素时不生长；
-整合至宿主细胞基因组的低可能性(如果不是没有)，因为转染使用的质粒的量极小，使得实际可忽略整合的风险(因此降低的在宿主细胞中诱导致癌突变的可能性)；
-定向整合至宿主细胞基因组的低可能性(如果不是没有)，因为质粒不含有可能与细胞自身的基因组具有同源性的外源序列(extraneoussequence)(如SV40)，所述外源序列代表更高的整合风险；
-基因免疫方案中使用所述质粒进行体内直接注射的高灵活性。事实上，通过将核苷酸序列中B细胞特异性的启动子置换为具有更广泛表达的病毒启动子(CMV)，所述质粒的用途通过简单的间接体内转染扩大至在高等生物中直接接种的用途。
本发明的进一步目标由使用间接体内转染方法，而不使用可能促进该过程的任何物理或化学手段构成。所述方法不诱导转染细胞的功能性的扰乱，并且不诱导其遗传转化。所述方法的特征在于将其余的外周血的颗粒(corpuscular)和体液部分与待转染的特异性细胞材料分离，其可使用比普通的离心方法具有更少的操作的过程获得：使用单采血液成分术(apheresis)使得分离大量的淋巴细胞成为可能，其可用于以对患者无痛并且对于实验目的有用得多的方式执行转染。事实上：
-其不会用重力或机械冲击扰乱细胞的功能性；
-其允许采集大量细胞以用于所述过程和保存作为后期治疗性监控阶段的参照；
-其不会使患者的功能和结构资源或其凝血或修复过程枯竭；
-其不会增加生物材料和/或患者污染的任何风险。
本发明的一个目标是由通过采用下列形式的自发过程，使用所述质粒影响所选细胞的间接体内转染而构成：
1.将来源于患者的外周血转移至能够直接将剩余的颗粒组分和血清与淋巴细胞家族分离(单采血液成分术过程)的仪器；
2.分离大量适合下文所述的处理应用的淋巴细胞；然后转移分离的淋巴细胞，用PBS(不含Ca++和Mg++)洗涤并进一步离心；
3.用锥虫蓝(trypanblue)1:1稀释，通过血球计和显微镜对淋巴细胞进行计数，以确保它们保留了至少90％的活力；
4.将淋巴细胞以大约20x106个细胞/ml的浓度重悬于PBS(不含Ca++和Mg++)，并重新分成小份至具有U-形孔的平板中，其中加入了25μg具有SEQIDNO.1所示序列的质粒；
5.将具有转染孔的平板在温育器中于37℃和5％CO2下温育30-90分钟；
6.将合适小份的用质粒处理的细胞转移至合适的培养基中，让其温育一夜；
7.检查细胞活力保持在认为合适的阈值(通常70％)之上，计算待转移至患者的剂量；
8.将含有要重新施用至患者的剂量的合适体积的转染细胞转移至静脉输液袋(通常具有数千至数千万个细胞的差异)；
9.在意在引起针对在表面表达所述质粒中含有其表位的蛋白的细胞免疫应答的治疗范围内，向患者接种袋中含有的血液，通过使用具有SEQIDNO.1所示序列的质粒进行转基因。
作为上述方法的替代，要转染的淋巴细胞的分离还可通过基于离心的经典方法执行；那样的话，上文条目1和条目2中描述的单采血液成分术处理可置换为以下：
1.将来源于患者的外周血转移至试管，加入含菲可(Ficoll)的缓冲液，离心，直至淋巴细胞层积为明显的条带；
2.转移分离的淋巴细胞，用PBS(不含Ca++和Mg++)洗涤并进一步离心。
使用上文所述降低大小的质粒和所选细胞群体使得从所述过程获得优势成为可能，如减少的血液和其淋巴细胞组分的操作时间、减少的温育时间、基本可重复的过程产率、在所述过程的不同步骤实现高度自动化的可能性和在分离的设备内直接执行转染过程的可能性，其不需要在设备自身以外的工作环境中采用无菌条件，而这是操作意在用于人类施用的生物体液所需要的。
本发明的一个目标由以下构成：使用所含大小和特征在于所述序列的质粒，使用具有减少的操作的分离待转染的材料的方法，所述转染条件在治疗的患者中诱导针对引起感染或突变的媒介的免疫应答，其中序列和构象水平的特异性印迹包含在所述质粒表示的遗传物质中。
本发明的进一步目标由在其中执行质粒和细胞温育的设备的用途构成，其特征在于存在其中容纳所需体积的细胞的空间、通过其插入针以储存质粒溶液的端口(port)和通过其实现转染细胞的取样的任选的其它端口。
在本发明的典型应用中，具有SEQIDNO.1所示序列的质粒用于通过单采血液成分术方法从血液中分离的淋巴细胞群体；这些转染的细胞在于生物体液使用的普通条件下温育之后被注射回患者，以诱导免疫类型的应答。
在本发明的进一步应用中，按所述方法构建的质粒用于在所述条件下转染通过单采血液成分术或离心从患者采集的淋巴细胞群体，所述患者受胰腺或前列腺、肺、肾或皮肤肿瘤侵害，或受一些其它类型的腺瘤性或癌性或其它肿瘤形式(无论是实体瘤或腹水瘤形式)侵害，以在患者自身中诱导仅针对在表面表达包含在所述质粒中的蛋白组分的癌细胞的选择性免疫应答，和通过这些造成表达淋巴细胞，用作APC(呈递抗原的细胞)。
在本发明的进一步应用中，SEQIDNO.1所示的质粒进行了改良，将用于淋巴细胞的启动子置换为病毒来源的启动子(CMV)。所述置换产生了大小稍微大一些(300bp)的质粒(如SEQIDNO.2所示)，并用于通过直接肠胃外(肌内、皮内、皮下或静脉内)施用或跨黏膜施用(通过鼻、口、肠或阴道黏膜)在生物体中诱导免疫应答。
对所述质粒进行以下能力的评估：
1.自发转染人类淋巴细胞的能力；
2.在间接体内注射转染细胞时在实验小鼠中诱导免疫应答的能力；
3.在基因免疫方案中，在直接注射质粒2时在实验小鼠中诱导免疫应答的能力。
下列实例仅意在作为本发明的非限制性说明。
质粒1根据下列方案构建：
1.质粒PSV2neo的改良
-质粒PSV2neo用限制酶AhdI和XmnI消化，以除去氨苄青霉素抗性区段(ampr)。
-PSV2neo(除去ampr)用BsmBI和HindIII消化，以除去复制起点SV40(SV40)
-PSV2neo(除去ampr和sv40)用AatII和BstBI消化。此过程结束时，得到含有大肠杆菌(E.Coli)复制起点和新霉素/卡那霉素抗性基因的2737碱基对片段。从琼脂糖凝胶分离此片段，在柱上纯化，并保持于4℃，直至后续使用。
2.质粒γ1Vh62的改良
-质粒γ1VH62用限制酶Fsel和BamHI消化，以除去编码人类基因组DNA的4787碱基对区段
-由此产生的质粒(除去DNA基因组)环化(circularised)，具有10721碱基对的新大小。其用AatII和BstBI消化，纯化含有可变和恒定区的片段以用于后续连接反应
3.最终的质粒1的构建
-产生自第1段的质粒PSV2neo(除去ampr和sv40)用AatII和BstBI消化。
-产生自第2段的改良质粒γ1VH62(除去DNA基因组)用AatII和BstBI消化。
-由此消化的所述两个改良质粒连接，并用于转染有能力的大肠杆菌细胞。
从所述大肠杆菌细胞中提取的质粒DNA然后通过PCR、限制图谱和测序用于鉴定测试。
4.最终的质粒2的构建
-质粒1用DraII和BclI消化，以除去其中包含的免疫球蛋白启动子
-通过相同的消化从质粒phMGFP除去病毒启动子CMV
-通过PCR，向无启动子的质粒1添加启动子CMV，以获得质粒2。
下列实施例仅意在作为本发明的非限制性说明。
实施例1.
将一小份大约50ml来自患者的外周血(已加入合适小份的抗凝血剂)转移至50ml管中，以缓冲液1:1稀释，加入20ml的菲可-帕克TM(Ficoll-PaqueTM)，离心于2000rpm下执行20分钟。
离心后，收集包含于界面条带的淋巴细胞，将其转移至新的管，在PBS(不含Ca++和Mg++)中洗涤3次，通过离心回收。
一小份淋巴细胞在锥虫蓝(trypanblue)中1:1稀释，在血球计中用显微镜计数，以确定其活力(至少90％)。
计数后，将淋巴细胞按20X106个细胞/ml的浓度重悬于PBS，分成小份至具有U-形底的孔的平板中。然后加入25μg具有SEQIDNO.1所示序列的质粒，将所述平板置于温育器中于37℃和5％CO2下60-90分钟。
然后将所述细胞在合适的培养基中稀释至1X106个细胞/ml的浓度，置于温育器内的烧瓶中，于37℃和5％CO2下放置一夜。确认细胞活力高于70％后，将所述细胞在盐水溶液中洗涤两次，然后计算含有待接种剂量的总细胞的数量，其对应于10,000至1亿不等的大量细胞，然后将后者重悬于静脉内施用袋中，所述袋然后用于接种患者。
使用前通过提取DNA和mRNA在巢式PCR测试中对一小份转染的淋巴细胞进行检验，以便评估已发生的淋巴细胞转染，并对其进行定量，甚至进行估计。
图6显示PCR测试的来自用质粒DNA转染的人类淋巴细胞的DNA的扩增。梯是用于确定扩增片段的大小的参照。数字指扩增的细胞的数量，天然指未用DNA转染的淋巴细胞(阴性对照)。该图显示了已发生的患者的淋巴细胞的转染，并首先表示其特异性，因为没有从未接受转染的淋巴细胞中扩增出片段。
实施例2.
从用编码抗原性序列的DNA转染的淋巴细胞能够在接种于实验动物后诱发免疫应答和SEQIDNO.1所示的本发明质粒编码能够诱发TCD4淋巴细胞部分的细胞应答的表位的假设出发，为了确认DNA转染的淋巴细胞的生物学活性，设计了实验以验证所述淋巴细胞在体内的免疫原性，其设计如下文所述。
-4只C57/B16小鼠接种5,000个转染了质粒的鼠淋巴细胞，如本发明包含的方案所述。接种是在尾静脉中静脉内执行的；
-接种后14天，处死小鼠，脾细胞用于存在转染使用的质粒编码的表位下的增殖测试；
-所述脾细胞与参考表位培养72小时，然后向其中加入含氚的timidine(tritiatedtimidine)(一种能够显示细胞增殖的放射性同位素)；
-18小时后，收获细胞，使用β计数器装置测量放射性。增殖用刺激指数(SI)表示，其计算为存在特异性表位时的放射性计数除以存在无关表位(非特异性增殖)时的放射性计数。常规地，大于3的SI被视为阳性。
表I：通过向实验动物接种用相关质粒转染的淋巴细胞诱导免疫应答的实例。特异性肽指结合入本发明质粒的DNA编码的表位，对照肽具有无关的序列。
上述实验显示了用质粒DNA转染的淋巴细胞免疫时在小鼠中诱导的特异性免疫应答，证明了其在用于体内测试时的明确生物学性能。
实施例3.
-使用具有SEQIDNO.2所示序列的质粒，将于100μl盐水溶液中稀释的100μgDNA肌内接种于10只C57/B16小鼠的四头肌(组A)。免疫方案由被三周的间隔分开的共3次注射组成。另一组10只C57/B16用相同方式进行免疫，使用CDR为空白(不含任何表位)的相同质粒(组B)作为疫苗接种的特异性对照；
-最后一次接种后14天，处死小鼠，脾细胞用于细胞毒性测试，与用转染使用的质粒编码的表位(NP)冲激(pulse)的细胞进行比较。特异性表位是流感病毒A/PR8的核蛋白的细胞毒性序列；
-所述脾细胞与参考表位培养5天，然后用作细胞毒性测试的效应(effectric)细胞；
-细胞毒性测试在于测量用表位NP冲激的细胞(EL-4)释放的放射性(51Cr)，其被来自免疫小鼠的效应细胞杀伤；细胞毒性表示为某个效应:靶(E:T)比率下的裂解百分比，其计算为用所述肽冲激的细胞释放的放射性的量除以未冲激的细胞释放的放射性的量(特异性细胞毒性)。
表II：用质粒DNA#2免疫的动物中由特异性TCD8细胞介导的细胞毒性的实例。
上述实验显示了用质粒DNA免疫时小鼠中诱导的特异性免疫应答，证明了其在用于体内测试时的明确生物学性能。

Claims (12)

1.一种重组质粒，其特征在于它由序列SEQIDNO.1构成。
2.一种制剂，其含有如权利要求1所述的质粒以及药学可接受赋形剂和/或辅佐剂。
3.如权利要求1所述的质粒用于制备在人类或动物生物体中诱导免疫应答的药物制剂的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述人类或动物生物体受或曾受属于癌和/或腺瘤和/或肉瘤和/或脂瘤和/或实体瘤和/或腹水瘤家族的肿瘤、前列腺或胰腺、肾或肺癌侵害。
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述人类或动物生物体受或曾受细菌、病毒、真菌和/或寄生物感染侵害。
6.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述制剂是用于预防性目的。
7.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述生物体受或曾受在表面上具有至少一个抗原性表位的肿瘤细胞的存在的侵害，所述抗原性表位的编码序列包含在所述质粒中。
8.如权利要求1所述的质粒和/或如权利要求2所述的制剂用于制备在人类或动物生物体中诱导免疫应答的药物的用途，所述药物在被施用时，间接体内转染原核和/或真核细胞，并且所述原核和/或真核细胞随后接种于所述人类或动物生物体。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于待转染的细胞属于淋巴细胞家族。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于所述细胞采自所述人类或动物生物体的外周血管。
11.如权利要求1所述的质粒和/或如权利要求2所述的制剂用于制备在人类或动物生物体中诱导免疫应答的药物的用途，所述药物在被施用时被体内接种于所述人类或动物生物体。
12.如权利要求8-11中任一项所述的用途，其中所述质粒或原核和/或真核细胞向所述人类或动物生物体的接种是通过注射或跨黏膜施用执行的。
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