ES2377466T3 - Plásmido con acción inmunológica - Google Patents

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Abstract

Un plásmido recombinante que tiene la secuencia SEC ID Nº 1.

Description

Plásmido con acción inmunológica
5 El objeto de la presente invención está representado mediante un plásmido recombinante utilizable para la transfección de células eucariotas y procariotas, que tienen la secuencia SEC ID Nº 1. Un objeto adicional de la invención está representado mediante el uso del plásmido mencionado anteriormente para la preparación de una formulación farmacéutica, o de una vacuna o un tratamiento terapéutico, para inducir una respuesta inmunitaria en un organismo humano.
En particular, se describe y se reivindica una secuencia de bases que se usan para la construcción de un plásmido que puede usarse:
-
en un proceso de transfección de células procariotas o eucariotas (ex vivo) que pueden inocularse en 15 organismos superiores para inducir una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica (por medio del plásmido 1 que tiene la secuencia SEC ID Nº 1);
También se proporciona una descripción de un perfil de patologías que pueden tratarse con los plásmidos descritos.
Estado de la técnica
Puede usarse ADN de origen plasmídico para la transfección de células procariotas y eucariotas a través de métodos conocidos. Los plásmidos construidos para este fin están constituidos generalmente por un esqueleto que tiene unidades insertadas de material genético que codifican cierta proteína que puede estar o no provista de su
25 propia actividad biológica.
Los plásmidos pueden ser de origen comercial, en los que una parte que porta la especificidad se introduce en una construcción estructural que ya se conoce y se usa, o generarse de forma autónoma, es decir, ensamblando fragmentos de material genético seleccionado en base a cierto perfil a reconstruir en el organismo al que está destinado el plásmido.
La síntesis de un plásmido es una operación de importancia fundamental para el fin de obtener las propiedades celulares deseadas. Los plásmidos determinan la eficacia de la transfección y de la síntesis de la proteína transgénica, y también la seguridad de la transfección y, por lo tanto, en el análisis final la eficacia resultante de la
35 expresión proteica de la célula transfectada.
Un plásmido es un vector de datos genéticos que influyen en el ciclo celular de la célula huésped y, por consiguiente, el ciclo vital del organismo que aloja a estas células transfectadas: cuantos más datos se hayan introducido en el plásmido, más riesgos se corren durante la transfección.
Un plásmido se caracteriza por la especificidad de los datos contenidos: cuanto menos complejo sea, más fácil será su síntesis y más seguro será su uso.
Un plásmido ejerce la capacidad de transfectar una población celular de forma más o menos espontánea
45 dependiendo del tipo de célula y las condiciones experimentales de contacto/incubación en las que se realiza la transfección. Cuanto más selectivo sea un plásmido para una población celular específica, más utilizable es en condiciones de seguridad.
Las condiciones en las que se realiza la transfección son decisivas para el éxito de la misma: la homogeneidad y la concentración de las células a transfectar, el tiempo y las condiciones de incubación, la posibilidad de monitorizar el fenómeno con métodos específicos y selectivos constituyen un corolario extremadamente importante para el éxito de la operación.
En el caso específico en el que un plásmido se usa para transfectar células a inyectar in vivo en pacientes, dichas
55 células deben manipularse con extremo cuidado en la medida en que deben reinsertarse en el paciente, y no se pueden permitir fenómenos de riesgo y colaterales fatales: cuanto menos manipulación sea necesaria, mayor será la seguridad del método y más reproducible será el resultado.
A partir de lo anterior, es inevitable que el uso de un plásmido de dimensiones reducidas, especialmente si se combina con un método con manipulación limitada, sea una condición preferida en la transfección usada con fines profilácticos y terapéuticos.
El uso de un plásmido que codifica epítopos inmunógenos en un método de transfección autóloga es uno de los sistemas que pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria específica en algunas patologías caracterizadas
65 por la aparición de agentes infecciosos, o por mutación celular espontánea o inducida (carcinogénesis), con modificación del ciclo apoptótico de una célula o línea celular seleccionada.
El documento WO 90/09804 describe inmunoglobulinas manipuladas genéticamente para expresar un epítopo peptídico predefinido en la región variable o en el dominio de unión de la inmunoglobulina.
5 El documento WO 00/61766 describe antígenos tumorales obtenidos de telomerasis que pueden usarse para generar una respuesta mediada por células T contra telomerasis y, por consiguiente, contra el propio tumor.
El documento WO 00/64488 describe un plásmido que codifica cadena pesada quimérica de una inmunoglobulina, el plásmido pNγ1VH62, que se obtiene subclonando el gen murino VH62 en el plásmido pNγ1, que contiene una
10 secuencia que codifica una región constante γ1 humana. Este plásmido puede modificarse mediante la introducción de epítopos heterólogos en cualquiera de las regiones determinantes de la complementariedad de la región variable. Por lo tanto, se describe su uso en un método para inducir una respuesta inmunitaria.
Sin embargo, el plásmido pNγ1VH62 contiene partes que serán perjudiciales si este plásmido se inyectara en seres 15 humanos. Además, las dimensiones de este plásmido son tales que se obtiene un rendimiento de transfección muy bajo.
Descripción de la invención
20 Los inventores de la presente invención han desarrollado actualmente un plásmido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina que no presenta las desventajas del plásmido pNγ1VH62 cuando se usa para inducir una respuesta inmunitaria in vivo o ex vivo en un organismo humano. En particular, los plásmidos desarrollados tiene un mejor perfil de seguridad y muestran un mayor rendimiento cuando se transfectan en células.
25 Este plásmido tiene una longitud de 9727 pb y es capaz de expresar la cadena pesada de inmunoglobulina cuando se transfectan en linfocitos.
El plásmido expresa una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina, que comprende preferiblemente una región 30 variable murina y una región constante humana, preferiblemente Igγ1.
La región variable murina es la región VH del hibridoma 62 obtenido de esplenocitos de un ratón adulto hiperinmunizado (Zanetti et al., J. Immunol., 1983, 131: 2452), denominada en lo sucesivo en este documento región VH62.
35 El hibridoma 62 de VH62 secreta un anticuerpo monoclonal con actividad anti-tiroglobulina.
El gen de la región Igγ1 se clona del vector pNγ1.
40 El plásmido contiene además un promotor específico para células linfocíticas, preferiblemente de aproximadamente 50 pb.
El plásmido de la invención también comprende la secuencia de poliadenilación AATAAA.
45 El plásmido de la invención no expresa resistencia a antibióticos betalactámicos y en particular a ampicilina, y/o no comprende un origen de replicación de SV40.
Por consiguiente, el plásmido contiene un origen de replicación de Escherichia coli, que es PBR322. Además, el plásmido expresa resistencia a neomicina. 50 El plásmido de la invención es el plásmido 1 que tiene una longitud de 9727 pb (SEC ID Nº 1 y figura 1).
El plásmido descrito codifica una cadena pesada quimérica de inmunoglobulina.
55 El esqueleto del plásmido está representado mediante pSV2neo, un ADN de origen bacteriano que contiene el gen para resistencia a neomicina y el origen de replicación PBR322.
La secuencia genética que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina está compuesta por:
60 -una región variable murina (VH62) de aproximadamente 2,5 kb, originalmente clonada a partir de un hibridoma de ratón (hibridoma 62) que secreta un anticuerpo monoclonal con actividad anti-tiroglobulina (Sollazzo, et. al., Eur. J. Immunol., 1989);
-
una región constante de Igγ1 humana que se obtiene del vector pNγ1 (Hybritech Corporation, San Diego, CA).
El promotor de inmunoglobulina del plásmido 1 es una parte integrante de VH62. El gen para la resistencia a neomicina también otorga una resistencia a kanamicina para el crecimiento selectivo en células procariotas.
La secuencia de poliadenilación está en la posición 5178:5183 del plásmido y sigue a la región constante humana. 5 La secuencia es la siguiente: AATAAA. El origen de replicación bacteriano es de Escherichia coli y está situado en la posición 8324:9264.
La característica particular del plásmido de la invención es que las regiones que determinan la complementariedad (CDR) de la proteína codificada pueden mutagenizarse con el fin de introducir epítopos en su interior (de 5 a 25 restos de aminoácidos) con propiedades antigénicas (Gerloni et al Nature Biotechnology 1997). Dichas propiedades hacen posible usar el plásmido en cuestión para inducir una respuesta inmunitaria específica por medio de una transfección ex vivo con el inóculo de células transfectadas de forma espontánea.
Por consiguiente, un objeto de la presente invención es el uso de un plásmido de la invención para la preparación de
15 una formulación farmacéutica para la vacunación con ADN, en particular para inducir una respuesta inmunitaria en un organismo humano. Además, otro objeto de la invención es una formulación que contiene al menos el plásmido de acuerdo con la invención junto con excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables.
La formulación de la invención puede usarse para fines profilácticos o terapéuticos.
La formulación de la invención puede usarse en particular en un organismo humano que está o estuvo afectado por:
-
tumores pertenecientes a la familia de carcinomas y/o adenomas y/o sarcomas y/o lipomas y/o tumores sólidos y/o ascíticos, por carcinoma de próstata o pancreático, renal o pulmonar. Preferiblemente, en este 25 caso dicho organismo está o estuvo afectado por la presencia de células tumorales que tienen en la superficie
al menos un epítopo antigénico, cuya secuencia codificante está contenida en el plásmido.
-
infecciones bacterianas, víricas, fúngicas y/o parasitarias. Un objeto adicional de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmunitaria en un organismo humano. Dicho método comprendía la transfección de células procariotas y/o eucariotas ex vivo y la posterior inoculación de dichas células procariotas y/o eucariotas en dicho organismo humano. Preferiblemente, dichas células transfectadas pertenecen a la familia de linfocitos y se toman preferiblemente de los vasos periféricos de dicho organismo humano. La inoculación de las células procariotas y/o eucariotas en dicho organismo humano se realiza preferiblemente por medio de administración por inyección o transmucosal.
35 La proteína codificada por los plásmidos de la invención, como todas las inmunoglobulinas, posee 3 CDR, CDR1 con un sitio de restricción utilizable para la inserción de secuencias peptídicas AfiIII, CDR2 con un sitio para Ncol y CDR3 con un sitio para Acc65I.
Es posible, por lo tanto, insertar en ellas diversas secuencias peptídicas capaces de provocar diversas respuestas inmunitarias tanto de tipo humoral (mediadas por células B) como del tipo mediado por células (mediado por células T CD4 y CD8); por ejemplo, es posible insertar al menos una única secuencia en cada CDR, para un total de tres secuencias capaces de provocar diversas respuestas inmunitarias; es posible además insertar una o más secuencias, opcionalmente fusionadas entre sí, en cada CDR.
45 Un ejemplo de inserción de epítopos antigénicos en las CDR se muestra en la figura 2.
Los epítopos antigénicos para los fines de la presente invención son: antígenos tumorales de telomerasis que son p540 (ILAKFLHWL), y pY572 (YLFFYRKSV)
El producto transgénico codificado por el plásmido 1 es una proteína con un peso molecular de aproximadamente
156.000 daltons (figura 3). La región pesada codificada es de naturaleza quimérica: parte humana (la región constante) y parte murina (la región variable). Sin embargo, la parte murina contiene secuencias homólogas al 80% con las regiones variables humanas.
55 Características importantes del plásmido mencionado anteriormente son la ausencia del gen para resistencia a ampicilina y la presencia del gen para resistencia a kanamicina que posibilita el uso seguro del mismo en sujetos con alergias potenciales a los antibióticos betalactámicos. Otro factor ventajoso es que la kanamicina es un antibiótico estable a 37ºC (condiciones de cultivo del plásmido) durante 24-48 horas, mientras que la ampicilina es estable solamente durante 3-4 horas, permitiendo por consiguiente un rendimiento de cultivo del plásmido que es mayor (producción menos cara) y más estable.
El plásmido mencionado anteriormente también está desprovisto de secuencias “inútiles” (por ejemplo la secuencia SV40 o pedazos de material genómico) que representarían mayores riesgos de homología con el genoma de la célula huésped y, por lo tanto, mayores riesgos de integración en la propia célula.
65 Análisis del mapa de restricción del plásmido El mapa de restricción obtenido mediante digestión con enzimas de restricción es el primer criterio a considerar para definir la identidad de un plásmido. En particular, el mapa mostrado en la figura 4 identifica de manera exclusiva al plásmido 1. También se muestra en sucesión una imagen de los fragmentos del plásmido 1 después de la digestión, el desplazamiento en gel de agarosa en paralelo con un patrón de dimensión conocida (“escalera” [ladder] de 1 Kb)
5 para determinar su dimensión exacta. La secuencia del plásmido 1 se muestra en la SEC ID Nº 1.
Caracterización biológica del plásmido
Ya se ha indicado anteriormente que un plásmido que codifica epítopos inmunógenos en un método de transfección es uno de los sistemas que pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria específica en algunas patologías caracterizadas por la aparición de agentes infecciosos, o por una mutación celular espontánea o inducida (carcinogénesis), con modificación del ciclo apoptótico de una célula o línea celular seleccionada.
Un uso adicional para dicho plásmido es la inyección directa in vivo en organismos inmuno-competentes para inducir
15 una respuesta inmunitaria contra proteínas de una naturaleza extraña y microorganismos patógenos (Tang et al., Nature 1992, Ulmer et al., Science 1993, Gerloni et al., Nature Biotechnology 1997). En este campo, con la inoculación de genes funcionales, se demostró la inducción de respuestas humorales (mediadas por anticuerpos) y respuestas mediadas por células (mediadas por linfocitos T de tipo CD4 y CD8) eficaces en el tratamiento o la prevención de patologías de origen infeccioso y canceroso.
Por consiguiente, el concepto de inmunización génica es adoptado actualmente por vacunólogos en todo el mundo, que usan plásmidos que codifican antígenos obtenidos de bacterias, virus y parásitos y también de diversos tipos de tumores para provocar respuestas inmunitarias específicas y protectoras. Actualmente hay ensayos clínicos en curso para la terapia o profilaxis de VIH, herpes, gripe, gripe aviar, síndrome respiratorio agudo grave, hepatitis B y
25 C y carcinomas de diversos tipos.
Los componentes esenciales de un plásmido a usar in vivo son el gen que codifica el antígeno (o pedazos del mismo) de interés, una secuencia promotora (normalmente obtenida de citomegalovirus, CMV) que guía la transcripción del antígeno y una región de poliadenilación que asegura la traducción del mismo.
Además, junto con el origen de replicación para la amplificación del plásmido en células bacterianas, también hay un gen que codifica resistencia a antibióticos para asegurar la selección de la población bacteriana y para eliminar la contaminación durante el cultivo.
35 Otra propiedad intrínseca de las vacunas de ADN es que los plásmidos de origen bacteriano contienen secuencias de citosina no metilada junto con restos de guanosina (CpG). Estas unidades de CpG tienen la capacidad de aumentar la capacidad inmunógena de los propios plásmidos y, por lo tanto, funcionan como adyuvantes.
La inoculación directa de ácidos nucleicos en células somáticas parece imitar la inmunidad inducida por infecciones naturales y ofrece diversas ventajas, incluyendo la posibilidad de producir y ensayar dichos plásmidos de manera económica, fácil y rápida. Además, los plásmidos son mucho más estables que las vacunas convencionales y pueden conservarse como liofilizados.
El plásmido se inocula habitualmente in vivo por vía intramuscular o intradérmica, aunque otras vías tales como las
45 vías oral, vaginal, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea son aplicables. Los plásmidos se administran en diversos diluyentes que incluyen agua destilada, solución salina o soluciones glucosadas, tampones fisiológicos, compuestos de isotonicidad, sustancias conservantes o crioprotectoras en caso de que los procesos de liofilización sean necesarios.
La dosis de plásmido usada en los protocolos de inmunización varía de un caso a otro pero, por norma general, se usan cantidades de 25 a 200 μg por dosis con 3 dosis/inyecciones a intervalos de tres semanas.
El objeto de la presente invención está, por lo tanto, constituido por un plásmido recombinante caracterizado por una secuencia correspondiente a la SEC ID Nº 1. Este plásmido tiene dimensiones que son reducidas pero adecuadas
55 para el fin y un método de transfección que es adecuado, reproducible, seguro y eficaz.
El uso de dicho plásmido tiene características específicas:
-
rendimiento óptimo en el proceso de producción, en la medida en que un plásmido de contenido medido es más sencillo de producir y da origen a mejores rendimientos de producción si tiene una amplitud reducida;
-
estabilidad óptima del cultivo celular, dado que el plásmido contiene el gen para resistencia al antibiótico kanamicina estable a 37ºC durante 24-48 horas (frente a ampicilina estable solamente durante 4-6 horas a la misma temperatura) la estabilidad del cultivo bacteriano aumenta por consiguiente de forma significativa, con
65 indudables ventajas en términos de rendimiento;
-
alta eficacia de transfección espontánea (capacidad de penetración en la célula) debido a dimensiones moleculares limitadas y menor volumen estérico, un detalle no despreciable en el caso de protocolos en los que está previsto el uso de transfección espontánea;
5 -la ausencia de la posibilidad de reacciones anafilácticas que puedan ser inducidas en los sujetos tratados, si están predispuestos a una reacción alérgica a ampicilina, en la medida en que el plásmido, que no posee el gen para resistencia a ampicilina, no crece en presencia de ese antibiótico;
-
baja, si no nula, posibilidad de integración en el genoma de la célula huésped en la medida en que la cantidad mínima de plásmido usada para la transfección hace prácticamente despreciable el riesgo de integración (por consiguiente, posibilidad reducida de inducción de mutaciones oncógenas en la célula huésped);
-
baja, si no nula, posibilidad de integración directa en el genoma de la célula huésped en la medida en que el plásmido no posee secuencias externas (tales como SV40) que podrían tener homologías con el genoma de 15 la propia célula y representar mayores riesgos de integración;
Un objeto adicional de la presente invención está constituido por el uso de un método de transfección ex vivo sin el uso de medio físico o químico alguno que pudiera facilitar el proceso. Dicho método no induce alteraciones en la funcionalidad de las células transfectadas y no induce transformación genética de las mismas. El método se caracteriza por la separación del material celular específico a transfectar del resto de la parte corpuscular y de fluido de la sangre periférica, obtenible con procesos con menos manipulación que los métodos de centrifugado normales: el uso de aféresis hace posible separar un gran número de células linfocíticas en las cuales realizar transfección de una manera que sea indolora para el paciente y mucho más útil para fines experimentales. De hecho:
25 -no altera la funcionalidad de las células con choques gravitacionales o mecánicos;
-
permite la recogida de gran número de células, que se usarán para el proceso y para mantenerlas almacenadas como referencia para la posterior fase de monitorización terapéutica;
-
no agota los recursos funcionales y estructurales del paciente o sus procesos de coagulación o reparación;
-
no añade ningún riesgo de contaminación del material biológico y/o del paciente.
Un objeto de la presente invención está constituido por el uso de un plásmido como se ha descrito para realizar la
35 transfección ex vivo de células seleccionadas por medio de un proceso espontáneo con la adopción de las siguientes modalidades:
1.
transferencia de la sangre periférica originaria de un paciente a un instrumento capaz de separar directamente la familia de linfocitos del resto de la fracción corpuscular y del suero (proceso de aféresis);
2.
aislamiento de una cantidad de células linfocíticas adecuada para la aplicación del tratamiento descrito en lo sucesivo en este documento; a continuación transferencia de los linfocitos aislados y lavado con PBS (sin Ca++ ni Mg++) y centrifugado adicional;
3.
dilución 1:1 con azul triptano y recuento de los linfocitos mediante hemocitómetro y microscopio para verificar que han conservado al menos el 90% de la vitalidad;
45 4. re-suspensión de los linfocitos a una concentración de aproximadamente 20 x 106 células/ml en PBS (sin Ca++ ni Mg++) y división de nuevo de una alícuota en placas con pocillos en forma de U, donde se añaden 25 μg de un plásmido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1;
5.
incubación de las placas con los pocillos de transfección en una incubadora durante 30-90 minutos a 37ºC y el 5% de CO2;
6.
transferencia de una alícuota adecuada de células tratadas con plásmido a un medio de cultivo adecuado y dejar incubar durante una noche;
7.
verificación de que la viabilidad celular se mantiene por encima del umbral que se considera que es apropiado (típicamente el 70%) y cálculo de la dosis a transferir al paciente;
8.
transferencia a una bolsa de fleboclisis de un volumen adecuado de células transfectadas que contiene la
55 dosis a administrar de nuevo al paciente (típicamente variable desde pocos miles a varias decenas de millones de células);
9. en el alcance del tratamiento diseñado para generar una respuesta inmunitaria contra las células que expresan en la superficie las proteínas cuyos epítopos están contenidos en el plásmido, inoculación en el paciente de la sangre contenida en la bolsa, transgenizada por medio del uso del plásmido que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1.
Como alternativa al método descrito anteriormente, al aislamiento de los linfocitos a transfectar también puede realizarse mediante un método clásico basado en el centrifugado; en ese caso el tratamiento de aféresis descrito anteriormente en el punto 1 y el punto 2 puede sustituirse por el siguiente:
1.
transferencia de la sangre periférica originaria de un paciente a tubos de ensayo, adición de tampón con
Ficoll y centrifugado hasta que los linfocitos se estratifiquen en una banda inconfundible;
2.
transferencia de los linfocitos aislados y lavado con PBS (sin Ca++ ni Mg++) y centrifugado adicional.
El uso del plásmido de dimensiones reducidas y una población seleccionada de células como se ha descrito
5 anteriormente hace posible obtener ventajas del proceso, tales como un tiempo reducido para la manipulación de la sangre y de su fracción linfocítica, un tiempo de incubación reducido, un rendimiento del proceso sustancialmente reproducible, la posibilidad de aplicar un alto grado de automatización a las diversas etapas del proceso y la posibilidad de realizar el proceso de transfección directamente dentro de un dispositivo aislado que no requiere la adopción de condiciones estériles del ambiente de trabajo fuera del propio dispositivo, que son requeridas por la manipulación de fluidos biológicos previstos para administración al ser humano.
Un objeto de la presente invención está constituido por el uso de un plásmido de dimensión limitada y caracterizado por la secuencia descrita, con un método de aislamiento del material al transfectar con manipulación reducida, con condiciones de transfección descritas para inducir respuestas inmunitarias en los pacientes tratados contra el agente
15 responsable de la infección o la mutación, cuya huella específica a nivel secuencial y conformacional está contenida en el material genético representado en el plásmido.
Un objeto adicional de la presente invención está constituido por el uso de un dispositivo en el cual realizar la incubación del plásmido con las células, caracterizado por la presencia de un espacio en el cual alojar el volumen deseado de células, un orificio a través del cual insertar una aguja para depositar una solución del plásmido y otro orificio opcional a través del cual realizar el muestreo de las células transfectadas.
En una aplicación típica de la presente invención, el plásmido con la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 se usa en una población de células linfocíticas separadas de la sangre mediante el método de aféresis; estas células
25 transfectadas, después de la incubación en las condiciones normales usadas para fluidos biológicos, se vuelven a inyectar en un paciente para inducir un tipo de respuesta inmunitaria.
En una aplicación adicional de la presente invención, el plásmido construido como se ha descrito se usa en las condiciones descritas para transfectar una población de células linfocíticas recogidas por medio de aféresis o centrifugado de un paciente afectado por un tumor del páncreas, o de próstata, pulmón, riñón o piel, o afectado por algún otro tipo de tumor adenomatoso o carcinomatoso u otra forma tumoral, de forma sólida o ascítica, para inducir en el propio paciente una respuesta inmunitaria selectiva solamente contra las células cancerosas, que expresan de forma superficial la fracción proteica contenida en el plásmido y por aquellas a las que se les hace expresar los linfocitos, usadas como APC (células que presentan el antígeno).
35 Los plásmidos descritos se evaluaron para:
1.
la capacidad de transfectar de forma espontánea linfocitos humanos;
2.
la capacidad de inducir una respuesta inmunitaria en ratones de laboratorio cuando se les inyectan células transfectadas ex vivo;
Los siguientes ejemplos pretenden ser puramente ilustraciones no limitantes de la invención.
45 El plásmido 1 se construyó de acuerdo con el siguiente protocolo:
1. Modificación del plásmido PSV2 neo
-
El plásmido PSV2 neo se digirió con las enzimas de restricción AhdI y XmnI para retirar el segmento de resistencia a ampicilina (ampr)
-
PSV2 neo (ampr menos) se digirió con BsmBI y HindIII para retirar el origen de replicación de SV40 (SV40)
-
PSV2 neo (ampr y SV40 menos) se digirió con AatII y BstBI. Al final de este proceso se obtuvo un fragmento
55 de 2737 pares de bases que contenía el origen de replicación de E. coli y el gen de resistencia a neomicina/kanamicina. Este fragmento se aisló a partir de gel de agarosa, se purificó en una columna y se mantuvo a 4ºC hasta el posterior uso.
2. Modificación del plásmido γ1Vh62
-
El plásmido γ1VH62 se digirió con las enzimas de restricción Fsel y BamHI para retirar el segmento de 4787 pares de bases que codifica ADN genómico humano
-
El plásmido obtenido de este modo (ADNgenómico menos) se circularizó con la nueva dimensión de 10721 65 pares de bases. Se digirió con AatII y BstBI y el fragmento que contenía la región variable y constante se purificó para la posterior reacción de ligamiento
3. Construcción del plásmido final 1
-
El plásmido PSV2 neo (ampry SV40 menos) obtenido del pase 1 se digirió con AatII y BstBI.
5 -El plásmido modificado γ1VH62 (ADNgenómico menos) obtenido del pase 2 se digirió con AatII y BstBI.
-
Los dos plásmidos modificados digeridos de este modo se unieron juntos y se usaron para transfectar células competentes de E. coli.
-
El ADN plasmídico extraído de las células de E. coli se usó a continuación para los ensayos de identificación por medio de PCR, mapa de restricción y secuenciación.
Los siguientes ejemplos pretenden ser puramente una ilustración no limitante de la invención.
15 Ejemplo 1.
Una alícuota de aproximadamente 50 ml de sangre periférica originaria de un paciente, con la adición de una alícuota adecuada de anticoagulante, se transfiere a tubos de 50 ml, se diluye a 1:1 con tampón, se añaden 20 ml de Ficoll-PaqueTM y se realiza centrifugado durante 20 minutos a 2000 rpm.
Después del centrifugado, los linfocitos, contenidos en la banda de interfaz, se recogen y se transfieren a un nuevo tubo y se lavan 3 veces en PBS (sin Ca++ ni Mg++) con recuperación mediante centrifugado.
Una alícuota de linfocitos se diluye a 1:1 en azul de triptano y se cuenta en un hemocitómetro con el microscopio 25 para determinar su vitalidad (al menos el 90%).
Después del recuento, los linfocitos se resuspenden a una concentración de 20 x 106 células por ml en PBS y se dividen en alícuotas en placas provistas con pocillos con bases en forma de U. A continuación se añaden 25 μg de un plásmido, que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1, y la placa se introduce en una incubadora durante 60-90 minutos a 37ºC y el 5% de CO2.
Las células se diluyen a continuación a una concentración de 1 x 106 células por ml en medio de cultivo adecuado, se colocan en matraces dentro de una incubadora y se dejan durante una noche a 37ºC y el 5% de CO2. Después de verificar que la vitalidad celular es superior al 70%, las células se lavan dos veces en solución salina, a
35 continuación se calcula el número de células totales que contienen la dosis a inocular, correspondiente a un número de células variable de 10.000 a 100 millones y estas últimas se resuspenden a continuación en una bolsa de administración intravenosa, que a continuación se usa para la inoculación en el paciente.
Una alícuota de los linfocitos transfectados se ensaya antes del uso por medio de la extracción de ADN y ARNm en un ensayo de PCR anidada de tal manera que se evalúe la transfección de linfocitos que se ha producido y se de una cuantificación de los mismos, aunque sea aproximada.
La figura 6 muestra la amplificación con un ensayo de PCR del ADN de linfocitos humanos transfectados con ADN plasmídico. La “escalera” es la referencia para la determinación de la dimensión de los fragmentos amplificados. Los
45 números se refieren al número de células amplificadas, y “virgen/vírgenes” (Naïve) significa linfocitos no transfectados con ADN (control negativo). La figura demuestra la transfección de los linfocitos del paciente que ha tenido lugar, y por encima de todo denota su especificidad, en la medida en que no se amplifica ningún fragmento de linfocitos no sometidos a transfección.
Ejemplo 2.
Procediendo a partir de la suposición de que los linfocitos transfectados con un ADN que codifica secuencias antigénicas son capaces de provocar una respuesta inmunitaria después de la inoculación en animales de laboratorio y que el plásmido de la presente invención, mostrado en la SEC ID Nº 1, codifica un epítopo capaz de
55 provocar una respuesta celular por parte de los linfocitos T CD4, para verificar la actividad biológica de los linfocitos transfectados con ADN, se planificó un experimento para la verificación de la inmunogenicidad de dichos linfocitos in vivo, diseñado como se describe en lo sucesivo en este documento.
-
a 4 ratones C57/B16 se les inocularon 5.000 linfocitos murinos transfectados con el plásmido como se ha descrito en el protocolo contenido en la presente invención. La inoculación se realizó por vía intravenosa en la vena caudal;
-
14 días después de la inoculación, los ratones fueron sacrificados y las células del bazo se usaron en un ensayo de proliferación en presencia del epítopo codificado por el plásmido usado para la transfección; 65 -los esplenocitos se cultivaron durante 72 horas con el epítopo de referencia, y a continuación se les añadió
timidina tritiada (un radioisótopo capaz de mostrar la proliferación celular);
-
después de 18 horas, las células se recogieron y la radiactividad se midió con un contador de partículas beta. La proliferación se expresó como índice de estimulación (SI), que se calcula dividiendo los recuentos 5 radiactivos en presencia del epítopo específico por los recuentos radiactivos en presencia de un epítopo no
correlacionado (proliferación no específica). Convencional, un SI de más de 3 se considera positivo.
El experimento descrito anteriormente muestra una respuesta inmunitaria específica inducida en ratones cuando se inmunizan con linfocitos transfectados con el ADN plasmídico, demostrando una clara propiedad biológica de los 10 mismos cuando se usan en un ensayo in vivo.
LISTA DE SECUENCIAS 15 <110> European Patent and Investments
<120> Plásmidos que tienen acción inmunológica
<130> 06fb47e 20
<160> 1
<170> Patentln versión 3.3 25 <210> 1
<211> 9727
<212> ADN
<213> Artificial 30 <220>
<223> plásmido que tiene acción inmunológica
<400> 1

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un plásmido recombinante que tiene la secuencia SEC ID Nº 1.
    5 2. Una formulación que contiene el plásmido de acuerdo con la reivindicación 1, junto con excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables.
  2. 3. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un organismo humano, uso que comprende tomar linfocitos de los vasos periféricos de dicho organismo humano;
    10 transfectar ex vivo dichos linfocitos con dicho plásmido; e inocular los linfocitos transfectados en dicho organismo humano.
  3. 4. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho organismo humano está o estuvo
    afectado por tumores pertenecientes a la familia de carcinomas y/o adenomas y/o sarcomas y/o lipomas y/o tumores 15 sólidos y/o ascíticos, por carcinoma de próstata o pancreático, renal o pulmonar.
  4. 5. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho organismo humano está o estuvo afectado por infecciones bacterianas, víricas, fúngicas y/o parasitarias.
    20 6. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho organismo humano está o estuvo afectado por la presencia de células tumorales que tienen en la superficie al menos un epítopo antigénico, cuya secuencia codificante está contenida en dicho plásmido.
    Figura 2. Representación esquemática de un modelo de inserción de epítopos en las CDR del plásmido
    Figura 3. Estructura hipotetizada de una proteína con epítopos antigénicos que es codificada por el plásmido descrito.
    Figura 1. Mapa del plásmido 1
    1-2483 pb Segmento que codifica la región variable vh62
    2484-5077 pb Segmento que codifica la región constante γ1
    6943-7737 pb Segmento que codifica el gen para resistencia a neomicina 10 9324-9267 pb origen de replicación de E. coli
    Figura 4. Mapa de restricción del plásmido
    Enzima de restricción
    Fragmentos originados Plásmido 1
    EcoRI
    2,5 kb + 7,2 kb
    XbaI
    1 kb + 8,7 kb
    BamHI
    9,7 kb
    HindIII
    0,5 kb + 2,4 kb + 4,9 kb + 1,9 kb
    Figura 5. Amplificación, por medio de ensayo de PCR del plásmido, de linfocitos transfectados ex vivo.
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