DE69023900T4

DE69023900T4 - Gentechnologisch veränderte immunglobuline.

Info

Publication number: DE69023900T4
Application number: DE69023900T
Authority: DE
Inventors: Maurizio La Jolla Ca 92037 Sollazzo; Maurizio La Jolla Ca 92037 Zanetti
Original assignee: University of California; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; University of California Berkeley
Priority date: 1989-02-24
Filing date: 1990-02-23
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2010-02-24
Also published as: ES2082850T3; DE69023900T2; EP0460076B1; US5658762A; JP3357890B2; EP0460076A4; JPH04503605A; ATE130765T1; US5583202A; WO1990009804A1; EP0460076A1; US5508386A; CA2047244C; DE69023900D1; JP2001190295A; CA2047244A1; JP3355351B2; DK0460076T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung kann nach ihren bevorzugten Ausführungsformen die Anwendung rekombinanter DNA-Technologie (DNA-Rekombinationstechnologie) umfassen, um natürliche oder synthetisch abgeleitete Immunoglobulinmoleküle genetisch zu verändern bzw. zu manipulieren, ihnen neue Epitope zu verleihen, um so neue Einheiten zu erzeugen, die in vitro und in vivo angewandt werden können in einer Vielzahl von Mitteln bzw. für viele Zwecke, wie zur Immunisierung gegen Pathogene und z.B. um Toleranz gegen Antigene aufzubauen. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die Epitope eingefügt in die sogenannte variable Domäne mit schwerer oder leichter Kette eines gegebenen Immunoglobulinmoleküls. So kommen bei der vorliegenden Erfindung bekannte rekombinante DNA-Technologien zum Tragen, was dazu beiträgt, neue Immunoglobulineinheiten zu erzeugen, die ihre Funktionalität bewahren durch mechanistische Lokalisation an spezielle Zelltypen über die sogenannten konstanten Domänen aber sonst angewandt werden, um eine neue Lokalisierung einer spezeillen antigenen Determinante oder eines Epitops zu ergeben.

Hintergrund der Erfindung

Rekombinante DNA-Technologie hat derzeit den Punkt erreicht, wo sie im Prinzip in der Lage ist, die ausreichende Methodolgie zu liefern, um DNA-Sequenzen zu identifizieren, isolieren und charakterisieren, sie zum Einbau in operative Expressionsvektoren zu konfigurieren und solche Vektoren verschiedentlich in rekombinante Wirte zu transfizieren, so daß derartige Wirte angeregt werden in ihrer Fähigkeit, das durch die DNA-Sequenz kodierte Polypeptid zu bilden. Offensichtlich sind viele Variationen möglich bei der Methodologie, die mit rekombinanter DNA-Technologie verbunden ist, und besondere Mittel sind nicht ohne erfinderische Leistung. Nichtsdestoweniger sind aus der veröffentlichten Literatur allgemein Methoden bekannt, die für den Fachmann die erforderlichen geistigen Voraussetzungen liefern, die rekombinate DNA-Technologie zur Erzeugung von Polypeptiden aus einem vorgegebenen rekombinanten Wirtssystem anzuwenden.
Immunoglobuline (Igs) sind die Haupteffektoren der humoralen Immunität, eine Eigenschaft, die verbunden ist mit ihrer Fähigkeit, Antigene verschiedener Arten zu binden. Im Hinblick auf die Unzahl von Antigenen zu einem speziellen Wirtsorganismus, kann angenommen werden, daß eine ähnliche Anzahl oder mehr Immunoglobuline existieren, die Bindungsstellen besitzen, die in der Lage sind, spezifisch mit jedem Antigen zu reagieren. Diese Bindungsstellen sind in der sogenannten variablen Region des Immunoglobulins lokalisiert und werden als Idiotyp bezeichnet. Außerdem sind Immunoglobulinmoleküle einzigartig in ihrer Fähigkeit, sich in bestimmten Zelltypen lokalisieren zu können, vermutlich durch eine gegenseitige Erkennung von bestimmten Rezeptoren, die sich auf der Zellmembran befinden. Immunoglobuline zeigen eine zweite allgemeine Eigenschaft, durch die sie als endogene Modulatoren der Immunantwort wirken. Igs und ihre idiotypischen Determinanten sind verwendet worden zur Immunisierung auf der B- und/oder T-Zellebene gegen eine Vielfalt von exogenen Antigenen. In vielen Fällen ist die Immunität, die sie hervorrufen, vergleichbar mit derjenigen, die durch das Antigen selbst hervorgerufen wird. Obwohl man das diesem Phänomen zugrunde liegende Prinzip verstanden hat, ist wenig bekannt bezüglich der molekularen Basis und der minimalen Strukurerfordernisse für die Immunogenität von Igs-Molekülen und die Wechselwirkung zwischen solchen Regionen, die für eine solche Immunogenität verantwortlich sein können, und den Regionen, von denen angenommen wird, daß sie die Lokalisierung eines gegebenen Immunoglobulinmolküls mit einem speziellen Zell/Rezeptot- Typ liefern.
In den letzten Jahren ist ein großer Fortschritt gemacht worden in dem Bemühen, die immunogenen Eigenschaften, Struktur und Genetik von Immunoglobulinen zu verstehen. Siehe Jeske et al., Fundamental Immunology, Paul, Verl. Raven Press, New York (1984), S. 131 und Kabat, Journal Immunology, 141, 525 (1988).
Zunächst wurde die Antigenität der sogenannten variablen (V) Domäne von Antikörpern gezeigt. Oudin et al., Academy of Sciences D 257, 805 (1963) und Kunkel et al., Science 140, 1218 (1963). Später zeigten weitere Forschungen die Existenz von diskreten Bereichen von Variabilität innerhalb von V Regionen und führten den Begriff von hypervariablen (HV) oder komlementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) ein. Wu et al., J. Ex. Med. 132, 211 (1970). Viele Untersuchungen haben seitdem gezeigt, daß die immunogene Eigenschaft von Ig-Molekülen vermutlich in erster Linie bestimmt wird durch die in den CDRs enthaltene Aminosäuresequenz Davie et al., Ann. Rev. Immunol. 4, 147 (1986). Die GB-A-2 188 638 und die EP-A-266 663 beschreiben chimäre Antikörper.
Die grundlegende Immunoglobulin- oder Antikörper-Struktureinheit ist gut bekannt. Das Molekül besteht aus schweren und leichten Ketten, die durch Disulfidbindungen kovalent zusammengehalten werden. Die schweren Ketten sind auch kovalent in einem Grundteil über Disulfidbindungen verbunden und dieser Teil wird häufig als sogenannte konstante Region bezeichnet, von der angenommen wird, daß sie dafür verantwortlich ist, daß ein gegebenes Immunoglobulinmolekül gegenseitig erkennbar ist für eine bestimmte Sequenz, die sich auf der Oberfläche bestimmter Zellen findet. Es gibt fünf bekannte Hauptklassen von konstanten Regionen, die die Klasse des Immunoglobulinmoleküls bestimmen und als IgG, IgM, IgA, IgD und IgE bezeichnet werden. Die N-terminalen Regionen der sogenannten schweren Ketten verzweigen sich nach außen in einem bildlichen Sinn, so daß sie insgesamt eine Y-förmige Struktur ergeben. Die leichten Ketten binden sich kovalent an die Y-Zweige der beiden schweren Ketten. In den Bereichen der Y-Zweige der schweren Ketten liegt eine Domäne mit einer Länge von etwa 100 Aminosäuren, die variabel ist und daher spezifisch für spezielle antigene Epitope, die zu dem speziellen Immunoglobulinmolekül gehören.
Auf die Y-Zweige, die die variablen Domänen enthalten, die die antigenen Epitope beherbergen, richtet sich die besondere Beachtung der vorliegenden Erfindung.
Früher haben Forscher vollständige CDRs von Immunoglobulinen untersucht und manipuliert zur Bildung von chimären Molekülen, von denen Funktionalität berichtet wird. Beispielhaft wird hingewiesen auf Jones et al., Nature, 321, 522 (1986) wo von einem V-Region Maus/Mensch chimären Immunoglobulinmolekül berichtet wird. Diese Untersuchung führte so zu einem im wesentlichen vollständigen CDR-Ersatz, wie offensichtlich auch die Untersuchung, von der berichtet wird von Verhoyer et al., Science 239, 1534 (1988); Riechmann et al., Nature 332,323 (1988) und von Morrison, Sciences 229, 1202 (1985). Siehe auch EP-A-125 023, veröffentlicht am 14. November 1984.
Unterstützt durch die oben zusammengefaßten erfolgreichen Untersuchtungen, die vermutlich zu funktionellen chimären Molekülen führten, war das Ziel der vorliegenden Untersuchungen, die varialbe Region, die in den N-terminalen Y-Zweigen ethalten ist, weiter zu erforschen. Es war ein Ziel der vorliegenden Untersuchungen, diese variablen Regionen zu manipulieren durch Einführung oder Substitution von neuen Determinanten oder Epitopen, um so neue Immunoglobulinmoleküle zu erzeugen, die möglicherweise die Lokalisationsfunktionalität bewahren und noch funktionelle heterologe Epitope enthalten. Auf diese Weise könnten die neuen Immunoglobulinmoleküle angewandt werden zur Verwendung im Organismus an fremden Stellen, wodurch sie in ortsspezifischer Weise Immunität verleihen. Ein Problem, dem sich die Forscher im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu dieser Zeit gegenüber gestellt sahen, lag in der Tatsache, daß sich in einer Region der Y-Verzweigung Epitope befanden. Daher war es schwierig, vorherzusagen, ob irgendeine Manipulation der variablen Region möglich wäre, ohne die Wechselwirkung von schweren Ketten mit den entsprechenden leichten Ketten zu zerstören und, wenn sich dies als folgenlos erwiese, ob das erhaltene Molekül seine Funktionalität bewahren würde, bezogen auf das neue Epitop, in Kombinatoin mit der konstanten Region des zugrundeliegenden Immunoglobulinmoleküls. So war es, selbst wenn das Problem, wo zu experimentieren wäre, überwunden wäre, nicht möglich, vorherzusagen, ob man erfolgreich solche neuen bifunktionellen Immunoglobulinmoleküle erzeugen könnte.
Die vorliegenden Untersuchungen und die Erfindung beruhen auf dem erfolgreichen Ausgangs-Experiment zur Bildung von modellhaften neuen Immunoglobulinmolekülen, von denen es sich gezeigt hat, daß sie vollständig funktionell sind aufgrund ihrer Fähigkeit, sich auf bestimmeten Zell/Rezeptor-Stellen zu lokalisieren und die spezifische Reaktivität der eingeführten antigenen Determinante oder des Epitops zu bewahren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Herstellung von neuen Immunoglobulinmolekülen, bei denen in die N-terminale variable Region ein neues Epitop eingeführt ist, das sich üblicherweise nicht in dem Immunoglobulinmolekül findet, das als Ausgangsmolekül verwendet worden ist, wobei diese Epitope spezifische Reaktivität bewahren. Vorzugsweise ist eine solche Reaktivität gekennzeichnet durch die Fähigkeit des Epitops, eine antigene Antwort zu stimulieren. Alternativ kann eine solche Reaktivität eine andere biologische Funktionaltät zeigen, wie Liganden- oder Rezeptorbindung.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich so auf neue Immunoglobulinmoleküle mit mindestens einem neuen heterologen Epitop, das in der N-terminalen variablen Domäne davon enthalten ist, wobei das neue Immunoglobulinmolekül seine Funktionalität bezüglich seiner C-terminalen konstanten Domäne der schweren Kette, die spezifisch ist für einen speziellen Zell/Rezeptortyp, bewahrt hat, und eine neue spezifische epitope in vitro und in vivo Reaktivität besitzt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend als wesentlichen pharmazeutischen Wirkstoff ein neues Immunoglobulin, besonders solche, in Form eines verabreichbaren pharmazeutischen Impfstoffs.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Verfahren zum Aufbau von Toleranz für bestimmte Antigene, einschließlich solchen, die mit Autoimmunerkrankungen verbunden sind, oder zur Verminderung der Hypersenstivität gegenüber Allergenen, oder zur Verleihung von aktiver oder passiver Immunität gegen bestimmte pathogene Antigene, durch Verabreichung eines neuen Immunoglobulinmoleküls, wie oben definiert, an ein Wesen, das dies benötigt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf neue rekombinante Mittel und Methoden, die geeignet sind zur Herstellung, Identifizierung und Verwendung der neuen Immunoglobulinmoleküle, umfassend DNA-Isolate, die für diese kodieren, Vektoren, die operativ solche DNA beherbergen, Wirte bzw. Empfänger, die mit solchen Vektoren transfiziert sind, Kulturen, enthaltend solche wachsenden Wirte und die geeigneten Verfahren zur Herstellung aller oben angegebenen rekombinanten Aspekte.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird hier besonders im Datail beschrieben für die Herstellung von vorteilhaften neuen Immunoglobulin-Einheiten. Diese Beschreibung ist angegeben, so wie sie durchgeführt wurde, unter Anwendung von rekombinanter DNA- Technologie. Weiter sind hier im Detail Verfahren angegeben, durch die man ein gegebenes Immunoglobulin untersuchen kann, um sicherzustellen, daß es die erforderliche Funktionalität zeigt, die es mit seinem Ausgangs-Immunoglobulin gemeinsam hat, und speziell bezüglich seiner neuen epitopen antigenen Aktivität. Wenn er diese Information bezüglich der speziellen neuen Immunoglobulinmoleküle, wie oben beschrieben, hat, zusammen mit den allgemein bekannten Verfahren und Techniken, weiß der Fachmann genau, wie er rekombinante Expressionsvektoren zur Herstellung von anderen neuen Immunoglobulinmolekülen aufbauen muß, die unter die vorliegende Erfindung fallen, zur hier beschriebenen Verwendung. So braucht der Fachmann, nachdem der Ausgangsversuch zur erfolgreichen Herstellung eines neuen Immunoglobulinmoleküls hier beschrieben worden ist, nicht die genauen Details zu befolgen, um die Erfindung zu wiederholen. Stattdessen kann der Fachmann aus dem vorliegenden, relevanten Stand der Technik, bekannte Verfahren zur Herstellung noch anderer neuer Immunoglobulinmoleküle, die ebenfalls in den allgemeinen Rahmen der Erfindung fallen, entnehmen.

1. Legenden der Figuren

Fig. 1 ist ein Diagramm, das den Aufbau des pNy1NANP Expressionsvektors zeigt.
Fig. 2 ist ein SDS-PAGE des y1NANP und WT rekombinanten Ig.
Fig. 3 zeigt die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem monoklonalem Antikörper Sp-3B4 an manipuliertem Antikörper y1NANP.
Fig. 4 ist ein Western Blot der Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper Sp-3-B4 an manipulierten Antikörper y1NANP und Lokalisierung des manipulierten (NANP)&sub3;-Epitops in der H-Kette.
Fig. 5 zeigt Ergebnisse der Kreuz-Hemmung von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper Sp3-B4, das an synthetisches Peptid (NANP)&sub3; (Tafel A) oder manipulierten Antikörper y1NANP (Tafel B) gebunden ist durch y1NANP Ig oder Peptid (NANP)&sub3;.

2. Allgemeine Methoden und Definitionen

"Expressionsvektor" umfaßt Vektoren, die in der Lage sind, darin enthaltene DNA-Sequenzen zu exprimieren, wenn solche Sequenzen operativ an andere Sequenzen gebunden sind, die in der Lage sind, ihre Expression zu bewirken. Es ist zu verstehen, wenn es auch nicht immer ausdrücklich gesagt wird, daß sich diese Vektoren in dem Wirtsorganismus entweder als Episome oder als integraler Teil der Chromosomen-DNA replizieren können. "Operativ" oder grammatikalische Äquivalente, bedeutet, daß die jeweiligen DNA-Sequenzen operativ sind, d.h. für ihre vorgesehenen Zwecke wirken. Insgesamt ist "Expressionsvektor" eine gegebene funktionelle Definition, und irgendeine DNA- Sequenz, die in der Lage ist, die Expression einer speziellen darin enthaltenen DNA-Sequenz zu bewirken, fällt unter diesen Ausdruck, wenn er auf die spezielle Sequenz angewandt wird. Alllgmein liegen Expressionsvektoren, die von Wert sind für rekombinante DNA-Techniken, in Form von "Plasmiden" vor, die als kreisförmige Doppelstrang-DNA-Schleifen bezeichnet werden, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und Vektor" austauschbar verwendet, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form von Vektoren ist. Die Erfindung soll jedoch auch solche anderen Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalente Funktionen erfüllen und die später bekannt werden.
Neben der Neuheit der vorliegenden Erfindung, umfassend die Einführung von neuen Epitopen durch Repositionierung und Vermehrung eines Eltern-Immunoglobulins, ist es verständlich, daß die neuen Immunoglobuline nach der vorliegenden Erfindung sich sonst in zulässiger Weise von den Eltern unterscheiden können, bezüglich eines Unterschieds in einer oder mehreren Aminosäuren von der Eltern-Einheit, sofern solche Unterschiede nicht zu einer Zerstörung der Art der Ausgangsaktivität oder Biofunktionalität der neuen Einheit führen.
"Rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit oben angegebenen Vektoren transfiziert sind.
Ein äußeres Trägermedium wird angewandt, um die Wirtszellen zu unterstützen, und umfaßt solche bekannten oder vorstellbaren Medien, die die Zellen in der Wachstumsphase unterstützen oder sie in lebensfähigem Zustand halten können, so daß sie ihre Rekombinationsfunktion ausüben können. Siehe z.B. ATCC Media Handbook, Hrsg. Cote et al., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1984). Ein das Wachstum unterstützendes Medium für beispielsweise Säugetierzellen enthält vorzugsweise einen Serumzusatz, wie fetales Kälberserum, oder eine andere ergänzende Komponente, wie sie üblicherweise angewandt wird, um Zellwachstum und -teilung zu erleichtern, wie Hydrolysate von tierischem Fleisch oder Milch, Gewebe- oder Organextrakte, mazerisierte Blutgerinnsel oder ihre Extrakte usw.. Andere geeignete Komponenten von Medien umfassen z.B. Transferrin, Insulin und verschiedene Metalle.
Die hier beschriebenen Vektoren und Methoden sind geeignet zur Anwendung in Wirtszellen in einem weiten Bereich von prokariontischen und eukariontischen Organismen.
Wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist "Epitop" eine Einheit, die eine spizifische epitope Reaktivität auslösen kann, vorzugsweise spezifische antigene Reaktivität oder domänenbindende Funktionalität.
"Heterolog", in Bezug auf das neue Epitop für ein gegebenes Immunoglobulinmolekül, bezeichnet das Vorhandensein von (mindestens einem) solchen Epitop in der N-terminalen Domäne eines Immunoglobulins, das diese(s) Epitop(e) normalerweise in seinem nativen Zustand nicht enthält.und/oder nicht selbst das ganze oder einen Teil des CDR eines Immunoglobulins ausmacht. Daher enthält die Kette (eine) heterologe Epitop-Sequenz(en). Derartige heterologe Epitop-Sequenzen sollen die klassischen antigenen Epitope umfassen, sowie rezeptorartige bindende Domänen oder bindende Regionen, die als Rezeptorstellen wirken, wie die menschliche CD4 bindende Domäne für HIV, hormonale rezeptorbindende Liganden, Retinoidrezeptor und Liganden oder Rezeptoren, die die Zellhaftung vermitteln.
"Chimär" bedeutet hier Immunoglobuline, enthaltend das/die heterologe(n) Epitop(e), die sonst aus Teilen bestehen können, die von Immunoglobulinen von mehr als einer Spezies genommen sind. Daher kann ein chimäres Ausgangs-Immunoglobulin eine hybride schwere Kette besitzen, die aufgebaut ist, aus Teilen, die sowohl von entsprechenden menschlichen als auch von nichtmenschlichen Immunoglobulinen stammen.
Neben der obigen Diskussion und den verschiedenen Verweisen auf Lehren der Literatur wird auf Standard-Handbücher der Molekularbiologie verwiesen, die Definitionen und Methoden und Mittel zur Durchführung von Grundtechniken enthalten, die die vorliegende Erfindung umfaßt. Siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1982 und die verschiedenen dort angegebenen Literaturstellen und insbesondere Colowick et al., Methods in Enzymology, Bd. 152, Academic Press, Inc. (1987).
Die obige Beschreibung und die folgenden experimentellen Details erläutern die von den Forschern im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu Beginn angewandte Methodologie zur Identifizierung und Charakterisierung und Herstellung spezieller Immunoglobuline. Der Fachmann wird erkennen, daß durch Bereitstellung der vorliegenden Information, einschließlich dem Notwendigen bezüglich der Lokalisierung und dem Aufbau der das Epitop enthaltenden Domäne eines gegebenen Immunoglobulins, und wie es manipuliert werden kann zur Bildung der neuen Immunoglobuline. Es ist daher nicht erforderlich, diese Details in allen Punkten zu wiederholen, um die Arbeiten durchführen zu können. Stattdessen können alternative, zuverlässige und bekannte Methoden angewandt werden; z.B. können die zugrunde liegenden DNA-Sequnzen, die für ein ein spezielles neues Immunoglobulin kodieren, synthetisiert werden zur Entwicklung in ähnlichen oder anderen geeigneten operativen Expressionsvektoren und Kultursystemen. So dient die vorliegende Offenbarung neben der Bereitstellung der tatsächlich angewandten Details dazu, die Reproduktion der speziellen angegebenen Immunoglobuline und anderer sowie von Fragmenten davon zu ermöglichen, wie einzelner Ketten zur in vitro Zusammenstellung unter Anwendung von Maßnahmen im Rahmen des fachmännischen Könnens unter Ausnutzung der vorliegenden Offenbarung. Alle derartigen Maßnahmen fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

3. Beschreibung der besonders bevorzugten Ausführungsformen

Proteintechnologie wurde angewandt, um ein fremdes Epitop in das CDR3 der H-Kette eines chimären Maus/Mensch-Antikörpers (Cy162) einzuführen. Dieses Epitop besteht aus drei Kopien des Tetrapeptids Asn-Ala-Asn-Pro (NANP). Das Tetrapeptid kommt natürlich als eine 37 in Tandem -Anordnung wiederholte Sequenz in dem Plasmodium falciparum circumsporozoite (CS) Protein vor, durchsetzt mit vier Sequenz-wiederholungen der Varianten- Sequenz Asn-Val-Asp-Pro [Dame et al., Science 225, 593 (1984)]. Bei dem hier beschriebenen Aufbau ist das Epitop flankiert von Val und Pro Resten an jedem Ende [VP (NANP)&sub3; VP). Das Experiment bestätigte, daß das (NANP)&sub3;-Epitop in die HV-Region einer Wirts-H-Kette (VH) eingeführt werden konnte, ohne die Rahmenfaltung des Ig-Moleküls zu verändern, d.h. seine moekulare Anordnung mit der leichten (L) Kette, und es wies nach, daß die antigenen immunogenen Eigenschaften des rekombinanten Ig- Moleküls exprimiert wurden. Es ist bekannt, daß das CDR3 von VH-Regionen von Antikörpern häufig das strukturelle Korrelat eines immunodominanten Idiotops ist [Davis et al., Ann. Rev. Immunol., 4, 147 (1986)], was anzeigt, daß das CDR3 sich an der Oberfläche des Moleküls befindet. Darüberhinaus steht fest, daß wegen der Rekombination der variablen-Ungleichheit-verbindenden (VDJ) Regionen, sowie N-Additionsmechanismen [Tonegawa, Nature, 302, 575 (1983); Miller et al., Immunol. Today, 7, 36 (1986)] das CDR3 in der Länge beträchtlich variieren kann (von 3 bis 19 Aminosäuren) [Kabat et al., Proteins of Immunological Interest, US Dept. of Health and Human Service NIH (1987)], was einen hohen Grad an Plastizität auf der strukturellen Ebene bedeutet. Ferner ist das für diese Untersuchung ausgewählte (NANP)&sub3;- Epitop verhältnismäßig kurz, repetitiv und von erwiesener Immunogenität bei Mäusen und Menschen [ood et al., Ann. Rev. Immunol. 6, 663 (1988)].

4. Beispiele

Beispiel I

Die Bildung von Hybridom 62 und und B10H2 und die Reinigung von mAb 62 und 109,3 (anti-2,4-Dinitrophenol) sind beschrieben worden [Zanetti et al., J. Immunol. 131, 2452 (1983) und Glotz et al., J. Immunol. 137, 223 (1986)].
Es wurde eine DNA-Bibliothek aufgebaut aus nach Größe gewählten 2-2,5-kb Eco RI-Fragmenten von Hybridom 62 genomer DNA. Fragmente wurden von niedrig schmelzender Agarose eluiert und in denλgt10-Vektor eingebunden [Huynh et al., DNA Cloning Techniques 1, 49 (1985)]. Nach dem Einbinden und Packen wurden 5 x 10&sup4; plaquebildende Einheiten ausgewählt durch Replikat- Hybridisierung mit JH [Sakano et al., Nature 286, 676 (1980)] und pSAPC15 [Brodeur et al., Eur. J. Immunol. 14, 922 (1984)] Sonden. Es wurden vier Klone isoliert und plaque-gereinigt; die 2,3-kb EcoRi Einfügung von einem von ihnen wurde subkloniert in pEMBL18-Vektor [Dente et al., DNA Cloning Techniques 1, 101 (1985)]. Die für VHB10H2 kodierende Sequenz wurde bestimmt durch Klonen der CDNA von dem Eltern-Hybridom durch Primer- Verlängerung der Poly(A) RNA mit einem synthetischen Oligonucleotid (5'GGGGCCAGTGGATAGAC3'), das sich anlagert an dem 5'- Ende der CH1-Region. Das gleiche Nucleotid wurde angewandt als Sonde zum Screening der Bibliothek nach Markierung des 5'-Endes durch Kinase mit ³²P-ATP. Die Nucleotid-Sequenz von beiden Klonen wurde bestimmt nach der Dideoxy-Methode an beiden Strängen nach Subklonen von geeigneten Restriktionsfragmenten in den pEMBL18-Vektor.
Plasmid pNy162, enthaltend DNA, die für C1,62 Antikörper kodiert, wurde aufgebaut durch Subklonen in der richtigen Orientierung des 2,3-kb EcoRI DNA-Fragments, enthaltend die VH62 Neuordnung, in die einzige EcoRI-Stelle des pNy1 Sollazo et al., Focus 10, 64 (1988) Vektors (ein von PSV abgeleiteter Vektor, der ein menschliches y1-Gen beherbergt). Dieser Vektor kodiert für ein menschliches y1-Gen unterhalb der EcoRI-Stelle. Er enthält auch ein Neomycinresistenz-Gen unter der Kontrolle des SV40 Promotors zur Selektion von stabilen transformanten Zellen. Transfektomzellen wurden aufgebaut durch Einführung der Plasmide pNy162 und pNy1CHA, einem chimären Konstrukt, das für einen Antikörper kodiert, dem Id62* fehlt, und Ig-Bindung in J558L Maus durch Elektrophorese.
*Der Ausdruck "Id62" bedeutet "Idiotyp 62", was eine Laborbezeichnung ist für den Idiotyp des Antikörpers, der durch das in Beispiel I beschriebene Hybridom "62" erzeugt worden ist. Der Ausdruck "Ig-Bindung" bezeichnet eine Immunoglobulin-Bindung.
Diese Zellinie ist eine H- Ketten-Mangelvariante von Myeloma J558 [Morrison et al., Science 229, 229 (1985)] und enthält die Neuordnung für eineλ1 leichte (L) Kette. Kurz gesagt, wurden 3 x 10&sup6; Zellen in 1 ml Dulbeccos modifiziertem minimalem essentiellen Medium (DMEM), enthaltend 10 µg Plasmid mit Überhelix DNA, 17 ms bei 650 V/cm in einer Zell-Porator-Vorrichtung (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) gepulst. Nach dem Pulsen wurden die Zellen wieder in 10 ml DMEM, ergänzt mit 10 mM Hepes-Puffer, 2 mM L-Glutamin, Penicillin (50 µg/ml), Streptomycin (50 µg/ml) und 10 ml fetalem Kälberserum, (cDMEM) suspendiert und 48 h bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 10% CO&sub2; inkubiert. Die Zellen wurden dann erneut in 20 ml cDMEM suspendiert und ein Anteil (2 ml) wurde in 20 ml cDMEM, enthaltend 1,2 mg/ml G418 (Gibco, Grand Island, NY), suspendiert, auf eine 96-Loch Mikrotiterplatte aufgebracht und 14 Tage gezüchtet. Die Überstände der Neomycin-resistenten Kolonien (stabile Transformanten) wurden getestet mit Hilfe eines Festphasen-Radioimmunoassays (RIA) und enzymgebundenen Immunosrbensassays (ELISA).
Das Vorhandensein von Id62 in dem Überstand von J558L Zellen, transfiziert mit pNy162-Vektor wurde untersucht durch Konkurrenzhemmung bei ELISA. Dadurch wird die Hemmung (%) der Bindung von Meerrettichperoxidas (HP)-konjugiertem mAb62 (Ligand) an anti-Id62-Antikörper, als Überzug auf einer 96-Loch Polyvinyl- Mikrotiterplatte (Dynatech, Alexandria, VA) gemessen [Zanetti et al., J. Immunol. 131, 2452 (1983)]. Der Überstand von J558L- Zellen, transfiziert mit pNy1CHA-Plasmid, und gereinigte mAB 62 und 109,3 (einem IgG1, x anti-2,4-Dinitrophenol) dienten als Kontrollen [Zanetti et al., J. Immunol. 131, 2452 (1983)]. Eine zweite Methode, um auf Id62 Expression zu testen war durch Western Blot [Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 4350 (1979)]. Kurz gesagt wurden etwa 5 µg Antikörper Cy162, gereinigt durch Affinitätschromatographie auf einer anti-Human- Ig-Sepharose-48-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden), der Elektrophorese auf einem 10% Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Das Gel wurde dann auf ein 0,45 M Nitrocellulose-Papier (Millipore, Bedford, MA) aufgebracht (blotted) und mit ¹²&sup5;I- markiertem durch Affinität gereinigtem syngenen anti-Id62- Antikörper als Sonde untersucht [Zanetti et al., J. Immunol. 135, 1245 (1985)]. Antikörper 62 und 109,3 dienten als positive bzw. negative Kontrolle. Das Filter wurde ein erstes Mal 24 h bei -70ºC mit einem Verstärker-Schirm (screen) belichtet. Um die Co-Expression der menschlichen C-Region auf der H-Kette des chimären Cy162-Antikörpers zu zeigen, wurde das Nitrocellulose- Papier erneut mit ¹²&sup5;I-markiertem Ziegen-anti-Human-Ig- Antikörper als Sonde untersucht und 2 h bei 70ºC belichtet.
Sequenz-Daten sind allgemein zugänglich von EMBL/Gene Bank Data Library unter der Zugangs Nr. Y00744.
Der y1NANP-Antikörper, der das Malaria-CS immonodominante B- Zellen-Epitop NANP in dem CDR3 seiner H-Kette enthält, wurde wie folgt manipuliert (antigenisiert):
Fig. 1 ist ein Diagramm, das den Aufbau des pNy1NANP-Expressionsvektors zeigt. In Tafel A: (a) das produktiv umgelagerte VH- Gen der Hybridom-Zellinie 62, isoliert aus einer nach Größe selektierten Lambda gt10 Bibliothek und subkloniert in pBluescript (öffentlich zugänglich von Stratagene, San Diego, CA) ist unten beschrieben; (b) die Restrikionsstelle Kpn I/Asp718 der Polybinder-Region wurde weggelassen durch Kpn I Abbau, gefüllt mit T4 Polymerase und eingebunden, was zu dem Plasmid pH62Δk führt; (c) pH62Δk wurde als eine Matrix zur ortsspezifischen Mutagenese verwendet, um eine einzigartige Asp718 Restriktionsstelle in CDR3 des VH-Gens einzuführen. Das synthetische Oligonucleotid (5'CAAGAAAGGTACCCTACTCTC 3'), das für einen bp Einsatz (TAC) kodiert, wurde an die uracylierte komplementäre Einzelstrang-Matrix gebunden und verlängert; (d) komplemantäre synthetische Oligonudeotide
(5'GTACCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCA 3' 3'GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTCATG 5')
wurden gebunden und subkloniert in die einzigartige Asp718 Stelle des pH62k. Der Aufbau wurde verifiziert durch Sequenz- Analyse unter Verwendung eines 15mer Primers entsprechend dem 5'- Ende von VH62-Gen (5'GACGTGAAGCTGGTG 3'); (e) das 2,3-kb- Eco-Ri-Fragment, enthaltend das manipulierte VHNANP-Gen wurde subkloniert oberhalb der Human-y1-C-Region in den 15-kb pNy1- Vektor. Das pNy1NANP-Konstrukt wurde durch Elektrophorese in J558L-Zellen eingebaut, anschließend in Gegenwart von G418 gezüchtet. Resistene Klone wurden zur Ig-Bildung ausgesucht (screened) durch ein enzymgebundenes Sandwich-Immunosorbensassay (ELISA) unter Verwendung von Ziegen-anti-Human- Antikörpern, immobilisiert auf Mikrotiter-Vertiefungen, als "einfangende" Antikörper und mit Meerrettichperoxidase (HP) konjugierte Ziegen-anti-human-Ig (Sigma) als "abgebenede" Antikörper. Klone, die > 2-5 µg Ig/ml Protein 10&sup6; Zellen bilden, wurden expandiert und der Antikörper aus Kultur-Überständen gereinigt. Die in Tafel A illustrierten Sequenz-Modifikationen sind im Detail in Tafel B gezeigt. Angewandte Abkürzungen: Asp - Asp 718; B - Bam HI; RI - Eco RI; Fr - Rahmenregion (framework); CDR - komplementaritätsbestimmende Region; neo - Neomycin-(G418)-Resistenz; amp - Ampicillin-Resistenz.
Das Restriktionsfragment, das für das VH-Gen eines monoklonalen Mäuse-Antikörpers gegen Thyroglobulin kodiert (mAb 62) wurde wie in Fig. 1 gezeigt modifiziert. Ein synthestisches Doppelstrang-DNA-Fragment, das für drei Kopien des NANP-Tetramers (NANP)&sub3; kodiert und herausragende Asp718 Enden enthält, wurde in den Rahmen zwischen Pro 95 und Tyr 96 der für VH62K kodierenden Region eingefügt. Das pH62NANP-Konstrukt wurde verifiziert durch Dideoxy-Sequenzbestimmung. Das für das manipulierte VH kodierende RI-Restriktionsfragment wurde in den pNY&sub1;-Expressionsvektor subkloniert, oberhalb der Human-y1- konstanten (C) Region, um das pNY&sub1;NANP-Konstrukt zu erhalten. Dieses Plasmid wurde durch Elektrophorese in die J558L-Zellinie von Mäusen, einer H-Ketten-Defekt-Variante von Myelom J558, die die Neuordnung für eine Lambda-l-L-Kette enthält, übertragen [Morrison et al., Science 229, 1202 (1985)].
Transfektom-Zellen wurden gezüchtet subkloniert und ausgesucht zur Ausscheidung des manipulierten (antigenisierten) Ig- Moleküls unter Anwendung eines enzymgebundenen Sandwich-Immunosorbensassays (ELISA) mit Ziegen-anti-Human-Antikörpern. Klone, die 2-5 µg Ig/ml Protein 10&sup6; Zellen bilden, wurden expandiert und das chimäre Protein wurde gereinigt durch Affintätschromatographie über eine Sepharose 4B-Protein-A-Säule. Das gereinigte Ig-Molekül wurde analysiert durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen.
Fig. 2 ist ein SDS-PAGE des y1NANP und WT rekombinanten Ig. 5 g mit Protein-A gereinigter Antikörper wurden auf ein 7,5% Polyacrylamidgel unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgebracht. Das Gel wurde mit Comassie-Blau angefärbt. Die Einfügung zeigt die Auflösung in schwere (H) und leichte (L) Ketten des manipulierten (antigenisierten) Antikörpers y1NANP durch Elektrophorese auf einem 10% Polyacrylamidgel unter reduzierenden (5% β-Mercaptoethanol) Bedingungen.
Fig. 2 zeigt, daß der nicht-reduzierte y1NANp chimäre Antikörper ein scheinbares Molekulargewicht von 160 kD besitzt, was eine korrekte H&sub2;L&sub2;-Anordnung zur Bildung eines tetrameren Ig- Proteins nahelegt. Wenn der y1NANP Antikörper verglichen wurde mit dem Wildtyp (WT) Ig, einem chimären Antikörper, ohne den (NANP)&sub3;-Einsatz, gereinigt von Kultur-Überstand von J558L- Zellen, transfiziert mit pNY&sub1;62, wurde ein geringer Unterschied in der Größe beobachtet aufgrund des Vorhandenseins des eingefügten Epitops. Das Molekulargewicht des y1NANP-Antikörpers liegt jedoch im Bereich eines tetrameren Komplexes. Beide Präparate zeigten auch einen Fleck in der Region unterhalb der 160 kD Bande, was einen gewissen Abbau und/oder nicht korrekt zusammengesetzte Proteinprodukte nahelegt. Unter reduzierenden Bedingungen war der manipulierte (antigenisierte) y&sub1;NANP-Antikörper entsprechend auf getrennt in eine H- und eine L-Kette (Fig. 2, kleines Bild). Wie durch ELISA von NP-40 Lysaten bestimmt, hatten Transfektom-Zellen, die den Y&sub1;NANP-Antikörper ausscheiden, etwa die gleichen Cytoplasmagehalte an H-Zellen, wie Zellen, die das WT Ig produzieren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, daß die Einfügung von 15 Aminosäuren in das CDR3 von VH62 die Wechselwirkung zwischen VH- und VL-Polypeptidketten nicht nennenswert veränderte noch die Anordung und Ausscheidung (Sekretion) des tetrameren (H&sub2;L&sub2;) Ig-Moleküls.
Um zu bestimmen, ob der manipulierte (antigenisierte) Y&sub1;NANP- Antikörper tatsächlich das (NANP)&sub3;-Epitop in einer immunologisch zugänglichen Form exprimiert, wurden Festphasen Radioimmunoassay- (RIA) und Western Blot-Verfahren angewandt und ein monoklonaler Antikörper der Maus (Sp3-B4), gebildet gegen P.falciparum und spezifisch das NANP-Epitop.
Fig. 3 zeigt die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem monoklonalem Antikörper Sp-3-B4 an manipulierten (antigenisierten) Antikörper y1NANP. Monoklonaler Maus-Antikörper (mAb) Sp3-B4, ein IgG2a,k-Antikörper gebildet durch Immunisierung mit dem P. falciparum Parasiten und Umsetzung mit dem repetitiven Epitop NANP. Spezifisch für das NANP-Epitop könnte irgendein anti- Malaria-Antikörper als Werkzeug verwendet und über analoge Verfahren hergestellt werden. Vertiefungen von Polyvinyl-Mikrotiterplatten wurden überzogen durch Trocknen bei 37ºC mit 5 g/ml Lösung in 0,9% NaCl von gereinigtem y1NANP Ig (ausgefüllte Romben), WT (ausgefüllte Dreiecke), (NANP)&sub3; synthetischem Peptid (ausgefüllte Quadrate), einem 16mer synthetischen Peptid (YYCARKAYSHGMDYW), umfassend das CDR3 der VH-Region von Prototyp Antikörper 52 (offene Quadrate) und dem 15mer synthetischen Peptid YPQVTRGDVFTMPED des zellhaftenden Moleküls Vitronectin (offene Rauten). Der ¹²&sup5;I-markierte Antikörper Sp3-B4 (20 x 10&sup4; cpm/50µl) wurde über Nacht bei +4º0 inkubiert. Nach extensivem Waschen, wurde die gebundene Radioaktivität mit einem γ-Zähler gezählt. Der Test wurde dreifach durchgeführt.
Die Ergebnisse der direkten RIA Bindung (Fig. 3) zeigten, daß ¹²&sup5;I-markierter mAb Sp3-B4 sowohl das synthetische Peptid (NANP)&sub3; als auch den rekombinanten y1NANP-Antikörper, immobilisiert auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, gebunden hat. Die Bindung an y1NANP-Antikörper kann jedoch als effektiver angesehen werden; in molaren Werten betrug das abgeschätzte Verhältnis von Peptid zu Antikörper etwa 50 zu 1, unter der Annahme, daß der Antikörper zwei Kopien des (NANP)&sub3;-Epitops pro Ig-Molekül exprimiert. Keine Bindung tat ein sowohl mit dem WT Ig als auch zwei irrelevanten synthetischen Peptiden, eines entsprechend der CDR3-Sequenz von Prototyp VH62 und das andere den Resten YPQVTRGDVFTMPED von Vitronectin.
Fig. 4 ist eine Western Blot Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper Sp3-B4 an manipuliertes (antigenisiertes) (NANP)&sub3;-Epitop in der H-Kette. 10 Mg gereinigtes y1NANP Ig, rekombinantes WT Ig, nativer monoklonaler Antikörper 62 und monoklonale Human-γ-Globuline(HGG) (Cohn Fraktion II, Miles) wurden auf eine 10% SDS-PAGE aufgebracht und Elektrophorese bei 150 V unter nicht-reduzierenden Bedingungen (linke Tafel) und reduzierenden Bedingungen (rechte Tafel) unterworfen. Die aufgetrennten Proteine oder Polypeptidketten wurden von dem Gel auf 0,45-µm Nitrocellulosepaoier übertragen. Nach dem Aufbringen (blotting) wurde das Filter mit 10% Lösung von Trockenmilch in 0,9% NaCl zwei Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Das Blatt wurde dann über Nacht bei +4º0 inkubiert durch Schütteln mit ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper Sp3-B4 (40 x 10&sup4; cpm/ml) in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,3, enthaltend 1% Rinderserumalburnin und 1% Tween 20. Nach der Inkubation wurde das Filter extensiv gewaschen, getrocknet und auf Kodak XAR-5 Film bei -70ºC 18 h belichtet. Die Bindung an y1NANP Ig, rekombinantes WT Ig, Antikörper 62 und HGG in RIA mit der gleichen ¹²&sup5;I- markierten Sonde (10&sup5;cpm/50 µl) betrug 10 560; 420 360 bzw. 330 cpm.
Die Western Blot Analyse (Fig. 4) zeigte, daß ¹²&sup5;I-markierter mAb Sp3-B4 spezifisch Antikörper y1NANP sowohl in der nicht- reduzierten (linke Tafel) als auch in der reduzierten (rechte Tafel) Form bindet. Im letzteren Falle tritt, wie erwartet, die Bindung an der H- aber nicht an der L-kette auf, was bestätigt, daß der manipulierte (antigenisierte) y1NANP-Antikörper das (NANP)&sub3;-Epitop an der H-Kette enthält. Keie Bindung trat auf bei kontrollen für die H- und L-Kette und die menschliche C-Region.
Ein Kreuz-Hemmungsassay wurde angewandt, um die relative Wirksamkeit des manipulierten (antigenisierten) y1NANP-Antikörpers zur Expression des (NANP)&sub3;-Epitops zu bestimmen. Das synthetische Peptid (NANP)&sub3; und der Äntikörper y1NANP wurden angewandt, um die Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem mAb Sp3-B4 an entweder das (NANP)&sub3;-Peptid oder den y1NANP-Antikörper, immobilisiert auf Mikrotiterplatten, zu hemmen.
Fig. 5 zeigt Ergebnisse der Kreuz-Hemmung der Bindung von ¹²&sup5;I- markiertem led Antikörper Sp3-B4 an synthetisches Peptid (NANP)&sub3; (Tafel A) oder manipulierten (antigenisierten) Antikörper y1NANP (Tafel B) durch y1NANP Ig oder Peptid (NANP)&sub3;. Eine feste Menge von ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper Sp3-B4 (Sonde) wurde mit (Vol./Vol.) abnehmenden Mengen der verschiedenen Inhibitoren, verdünnt in phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,3, enthaltend 1% Rinderserumalbumin und 1% Tween, vermischt. Das Gemisch wurde über Nacht unter Schütteln bei +4º0 inkubiert. 50 µl jedes Gemischs wurden inkubiert in einzelnen Vertiefungen einer Polyvinyl-Mikrotiterplatte, die überzogen waren mit entweder synthetischem Peptid (NANP)&sub3; (Tafel A) oder gereinigtem manipuliertem (antigenisiertem) y1NANP Ig (Tafel B). Die Bedingungen des Überziehens sind im Detail in der Legende zu Fig. 4 angegeben. Es wurden die folgenden Inhibitoren verwendet: gereinigtes y1NANP Ig, WT Ig, und synthetische Peptide (NANP)&sub3; , CDR3 und Vitronectin. Der Prozentsatz der Hemmung wurde wie folgt berechnet: [(mittlere Bindung der Sonde allein) - (mittlere Bindung der in Gegenwart des Inhibitors inkubierten Sonde)]/(mittlere Bindung der Sonde allein) x 100. Die Tests wurden doppelt durchgeführt.
Fig. 5 zeigt, daß sowohl das Peptid als auch der manipulierte (antigenisierte) Anikörper die Bindung an beide physikalische Formen des (NANP)&sub3;-Epitops, d.h. das synthetische Peptidals auch das von dem Antikörper stammende, wirksam hemmten. Während jedoch der y1NANP-Antikörper etwa 4-mal wirksamer war als das Peptid selbst (Tafel A), bezüglich der Hemmung des synthetischen Peptids, war er etwa 150-mal wirksamer als das Peptid bei der Hemmung der Bindung des manipulierten (antigenisierten) Ig (Tafel B). Das WT Ig und Kontroll-Peptide (CDR3 und Vitronectin) führten zu keiner Hemmung. So scheint es, verglichen mit dern synthetischen Peptid, daß das von dem y1NANP-Antikörper stammende (NANP)&sub3;-Epitop eine dreidimensionale Konfiguration annimmt, die immunologisch diejenige des aktiven CS-Proteins besser nachahmt.
Um zu bestimmen, ob der rekombinante manipulierte (antigenisierte) y1NANP-Antikörper angewandt werden kann, um anti-NANP- Antikörper zu induzieren, wurden in vivo Versuche mit Kaninchen durchgeführt. Zwei Kaninchen wurden mit dem manipulierten (antigenisierten) y1NANP-Antikörper immunisiert und zwei erhielten das WT Ig. Wie in Tabelle I (auf den Seiten 25 und 26) angegeben, bildeten beide mit dem y1NANP-Antikörper immunisierte Kaninchen anti-NANP-Antikörper, die durch ELISA und RIA nachgewiesen werden konnten. Nach Auffrischungs-Immunisierungen stieg der Titer bei beiden Kaninchen; der maximale Titer betrug 1/3200 am 70. Tag. Wichtig war, daß dieses Antiserum positiv war, wenn es durch indirekte Fluoreszenz an P. falciparum Sporozoiten getestet wurde, was zeigt, daß das durch das y1NANP Ig exprimierte Epitop tatsächlich das native Antigen nachahmt. Sera von Kontroll-Kaninchen, die mit WT Ig immunisiert worden waren, reagierten weder mit dem auf Vertiefungen von Mikrotiterplatten immobiliserten (NANP)-Peptid noch mit dem Parasiten. Kaninchen von beiden Gruppen erzeugten eine anti-Human-Antwort, bestimmt durch Agglutination von roten Blutkörperchen, die mit Human-γ-Globulin überzogen waren. Kaninchen-Antisera wurden untersucht durch direkte Immunofluoreszenz an P. falciparem (Stamm Indochina III), getrocknet auf Glasplättchen in Gegenwart von 10% fetalem Rinderserum.
In vitro Untersuchungen unter Ausnutzung der Bindungsstellen eines NANP-spezifischen monoklonalen Antikörpers als Sonde für die Wechselwirkung der Protein-Oberfläche und in vivo, die zeigten, daß Kaninchen, die mit dem auf gebauen Ig-Molekül immunisiert worden waren, anti-NANP-Antikörper bilden, die mit dem Plasmodium-Antigen reagieren, zeigen, daß das von dem manipulierten (antigenisierten) Ig exprimierte (NANP)&sub3;-Epitop sowohl antigen als auch immunogen ist.
Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Sporozoiten-Invasion der Leberzellen zu hemmen, unter Anwendung eines in vitro Hemm-Tests für die Sporozoiten-Invasion (ISI). (Hollingdale et al., Journal of Immunology 132:909 (1984)). Kurz gesagt, wurde Serum von DIG-Fraktionen in Reihe verdünnt und zu Hep62-A16-Zellkulturen zugesetzt. Sporozoiten wurden mit den Zellkulturen inkubiert. Die Anbindung und das Eindringen von P. falciparum und P. vivax wurden bestimmt in fixierten Kulturen nach dem Anfärben mit spezies-spezifischen monoklonalen Antikörpern. Kontroll-Kulturen erhielten entweder Serum oder Ig Fraktion von Kaninchen, die mit chimären Wildtyp (WT) Protein immunisiert worden waren. Die ISI-Aktivität der Ig- Fraktion von Kaninchen, die mit y1NANP immunisiert worden waren, war vergleichbar mit der ISI-Aktivität von gereinigtem Ig, hervorgerufen durch (NANP)&sub3;-Peptid, gekuppelt an Tetanustoxoid in Kaninchen, eine weitere Stütze für die Immunogenität der vorhandenen Epitope.
Fünf Gruppen von Mäusen von unterschiedlichem MHC (112) Haplotyp (C57BL/6-H2b, BALB/cH2b, C3H/He-H2k und SJL-H2S) wurden intraperitoneal (i.p.) immunisiert mit 50 Mg y1NANP in Alaun. Auffrischungsinjektionen wurden 30 Tage später verabreicht. Serumproben wurden 10 Tage nach der Auffrischungsinjektion entnommen. Kontrolltiere des gleichen Haplotyps wurden mit dem Wildtyp chimären Protein immunisiert. Das Immunisierungs-Schema ist unten angegeben:
Tag -2: Blutentnahme vor der Immunisierung
Tag 0: Immunisierung
Tag 29: Blutentnahme nach der Immunisierung
Tag 30: 1. Auffrischung
Tag 40: Blutentnahme nach der 1. Auffrischung
Tag 80: Blutentnahme vor der 2. Auffrischung und 2. Auffrischung
Tag 90: Blutentnahme nach der 2. Auffrischung
Sera wurden 10 Tage nach der 2.Auffrischungs-Immunisierung entnommen. Serumproben von experimentellen und Vergleichs- Gruppen wurden durch ELISA auf Mikrotiterplatten untersucht, die mit K K(NANP)&sub3;** (5 µg/ml) überzogen waren, und als Kontrolle andere Peptide, auf der Grundlage von Aminosäuresequenzen von Vitronectin und den CDR&sub2;- und CDR&sub3;-Domänen der Eltern-Antikörper, die nicht mit NANP verwandt sind.
** Der Ausdruck "K K(NANP)&sub3;" bezieht sich auf das Überzugsmaterial auf den Mikrotiterplatten, die bei den beschriebenen ELISA-Assays verwendet wurden. Die Mikrotiterplatten sind mit "K K(NANP)&sub3;" überzogen, welches drei Kopien des NANP-Antigens und Lysin (K) ist.
In Tabelle II sind die Antikörper-Titer für die einzelnen Mause innerhalb jedes Stammes angegeben. Die angegebenen Daten zeigen, daß das manipulierte (antigenisierte) y1NANP eine humorale anti-y1NANP Antwort bei Tieren mit unterschiedlichem MCH-Haplotyp hervorrufen kann. Tabelle II Relative Antikörper-Titer Immunisierung Maus
Fünf Mäuse von jedem Stamm wurden entweder mit y1NANP oder dem Wildtyp Protein immunisiert. Die relativen Antikörper-Titer für jede Maus sind als Kehrwert der Serum-Verdünnungen angegeben.
(NANP, immunisiert mit y1NANP ; WT, immunisiert mit Wildtyp chimärem Protein).

Beispiel II

Zur Erzeugung von CD4-artigen Antikörpern, y1CD4 genannt, wurden Methoden, analog den in Beispiel I im Detail beschriebenen angewandt. Kurz gesagt, wurde der für y1CD4-Antikörper kodierende Vektor, umfassend Aminosäurereste 42 bis einschließlich 49 von Human-CD4, transplantiert in die Region des VH62-Gens, in J558L-Zellen transfiziert. Ausgewählte Zellen wurden ausgesiebt zur Antikörperbildung und y1CD4-Antikörper wurden gereinigt von Isolaten, die 30 bis 40 µg Antikörper pro ml Kulturüberstand ausscheiden. SDS-PAGE von y1CD4 unter nichtreduzierenden Bedingungen zeigte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 160 kD. Unter reduzierenden Bedingungen trennte sich dieses Protein korrekt in H- und L-Ketten auf, was zeigt, daß der Einbau der heterologen CD4-Sequenz die Anordnung der H- und L-Ketten nicht hemmt.
Um das Vorhandensein der CD4-Sequenz in y1CD4 zu bestätigen, wurde ein Festphasen Radioimmunoassay (RIA) angewandt. Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden überzogen mit 5 µg/ml y1CD4. Mit y1NANP überzogene Vertiefungen wurden als Vergleich verwendet. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern zu CD4 (OKT4, Ortho Pharmaceuticals, Rahway, New Jersey) wurde als primärer Antikörper verendet, gefolgt von ¹²&sup5;I-markiertem Ratten-anti-Maus sekundärern Antikörper. Wie in Tabelle III gezeigt, bindet OKT40 stark und spezifisch an y1CD4. Die Western Blot Analyse bestätigte die durch RIA erhaltenen Ergebnisse und zeigte ferner, daß das von OKT40 erkannte Epitop in der H-Kette von y1CD4 liegt. Eine mangelnde Bindung von anderen Antikörpern, insbesondere OKT4A, schloß die Möglichkeit aus, daß Reste 42 bis 49 von CD4 die Ig-bindende Stelle von CD4 umfassen. Tabelle III Antikörper
Die Beobachtung, daß die VH-Region eines Antikörper-Moleküls manipuliert (antigenisiert) werden kann, um 15 Aminosäurereste, enthaltend ein Epitop eines nicht verwandten Moleküls, zu exprimieren, zeigt daß die VH/CH-Polypeptid-Kette, enthaltend das fremde Epitop, korrekt zusammengefügt ist mit der endogenen L-Kette unter Bildung eines (H&sub2;L&sub2;) Tetramers, so scheint es, daß der Einbau dieses Epitops in das CDR3 toleriert wird und die gesamte Ig Rahmenfaltung nicht angreift. Aufgrund der vorliegenden Untersuchungen kann, solange das rekombinante Epitop stereochemisch mit den angrenzenden CD-Resten verträglich ist, dieses eingefügt oder für ein CDR substituiert werden, und es kann erwartet werden, daß es an der Oberfläche des Moleküls liegt, obwohl nicht ausgeschlossen werden kann, daß die hier angegebenen Ergebnisse auf der Art des Epitops selbst beruhen. Bei dem oben beschriebenen Konstrukt ist die (NANP)&sub3;-Sequenz auf beiden Seiten flankiert von den Aminosäuren Val und Pro. Möglicherweise trägt das dazu bei, das eingefügte Epitop zu stabilisieren, indem es an jedem Ende verankert wird. Die große Verzweigung an dem Cß-Atom und die C -Methylgruppe des Val-Restes können die Hauptkette (sterisch) behindern, indem sie ihre Flexibilität verringern; die Seitenkette von Pro ergreift die Hauptkette, indem sie sich zu dieser zurückwellt, was zur Bildung einer nahezu steifen Seitenkette führt.
In anderen Worten: Weder die molekulare Umgebung noch die globuläre Faltung vin Ig modifiziert die immunologische Struktur des (NANP)&sub3;-Epitops. Vom biologischen Standpunkt aus kann das in ein Ig-Molekül manipulierte (NANP)&sub3;-Epitop als ein Idiotop a la carte angesehen werden, das in das CDR3 einer Wirts-VH-Domäne eingebaut ist. Bezogen auf das, was über die Immunogenität von Idiotypen bekannt ist, und die vorhersehbaren Folgen der Einführung von Immunität über das Idiotyp-Netzwerk [Jerne Ann. Immunol. (Paris) 125, 373 (1974); Cozenave et al., PNAS 74, 5122 (1977); Urbain et al., PNAS 74, 5126 (1977); Bona et al., J. Exp. Med. 153, 951 (1981)], führt dies zu dem Schluß, daß eine Immunantwort mit vorbestimmter Epitop-Spezifität in molekularen Angaben diktiert und in vitro vorhergesagt werden kann. Diese Strategie kann angewandt werden, um ein B- Zellepitop T-unabhängig zu machen, was seine Eignung nicht nur für Analysen der Struktur und Funktion von Epitopen und Igs ergibt, sondern auch zur Entwicklung von neuen Antikörper-Impfstoffen führt, z.B. als Alternative zu Impfstoffen auf Peptid- Basis. Die Herstellung von Impfstoffen kann erreicht werden, unter Anwendung bekannter Methoden, die für Immunoglobuline als solche entwickelt worden sind. Tabelle I Induzierung von Antikörpern zu NANP in mit manipulierten (antigenisiertem) y1NANP-Antikörpera immunisierten Kaninchen Kaninchen Nr. Immunogen Tage nach der Immunisierung
a Erwachsene weiße Kaninchen wurden subkutan an verschiedenen Punkten des Rückens mit 50 µg rekombinanten y1NANP oder dem WT-Antikörper, emulgiert in vollständigen Freunds Adjuvans (CFA), immunisiert. Auffrischungsinjektionen von 500 µg des gleichen Immunogens in unvollständigem Freunds Adjuvans wurden in monatlichen Intervallen (gekennzeichnet durch *) verabreicht. Sera wurden an den angegebenen Tagen entnommen und auf die Reaktionsfähigkeit mit dem synthetischen (NANP)&sub3;-Peptid durch Festphasen ELISA und RIA untersucht. Kurz gesagt, wurden zweifache Reihenverdünnungen von einzelnen Sera in phosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,3, enthaltend 1% Rinderserumalbumin und 1% Tween 20, über Nacht bei +4ºC inkubiert, auf Mikrotiterplatten, die mit dem (NANP)&sub3;-Peptid, 5 µg/ml in 0,9% Salzlösung, überzogen waren. Nach der Inkubation wurden die Platten gewaschen und mit entweder einem mit Meerrettichperoxidase konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen Ig oder ¹²&sup5;I-amrkiertem Protein A (Amersham) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließemd wurden die Platten gewaschen und die gebundenen Antikörper bestimmt unter Anwendung einer Bio-Rad (Richmond, CA) ELISA Ablesevorrichtung oder einem -Zähler. Die Bindung der präimmunen Sera wurde als Bezugs-Hintergrundwert angesehen. Der Titer wurde bestimmt aus der mittleren Bindung von drei Proben nach Abzug der Hintergrund-Bindungswerte und ist angegeben als Kehrwert der Sera-Verdünnung.
Die vorausgehende Beschreibung befaßt sich im Detail mit spezifischen Methoden, die angewandt werden können zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Nachdem zunächst die spezifischen Methoden im Detail beschrieben worden sind, die angewandt wurden zur Identifizierung, Isolierung, Charakterisierung, Herstellung und Verwendung der Immunoglobuline, und eine weitere Beschreibung bezüglich spezieller Modell-Einheiten, weiß der Fachmann hinreichend, wie alternative zuverlässige Methoden durchzuführen sind, um die gleiche Information zu erreichen und diese Information auf andere intraspezies- und interspezies-verwandte Immunoglobuline auszudehnen. So detailliert der obige Text zu sein scheint, sollte er jedoch nicht als Beschränkung des gesamten Rahmens angesehen werden, sondern der Umfang der vorliegenden Erfindung sollte nur durch die Konstruktion der angefügten Ansprüche bestimmt werden.

Claims

1. Immunoglobulinmolekül mit wenigstens einem antigenen Epitop, das nicht vom Immunoglobulinmolekül hergeleitet ist, innerhalb seiner N-terminalen variablen Domäne, welches Immunoglobulinmolekül für einen bestimmten Zell/Rezeptor-Typ spezifische Funktionalität hinsichtlich seiner C-terminalen konstanten Region der schweren Ketten bewahrt hat, wobei das antigene Epitop eine Antikörperantwort auslösen kann.

2. Immunoglobulin nach Anspruch 1 als Produkt rekombinanter DNA-Technologie.

3. Schwere Kette eines Immunoglobulins, welche in ihrer N- terminalen variablen Domäne wenigstens ein antigenes Epitop enthält, das nicht von einem Immunoglobulinmolekül stammt, wobei das antigene Epitop eine Antikörperantwort auslösen kann.

4. Schwere Kette nach Anspruch 3 als Produkt rekombinanter DNA-Technologie.

5. Schwere Kette nach Anspruch 3 in einer nicht mit ihrer komplementären schweren Kette verbundenen Form.

6. Schwere Kette nach Anspruch 5 in einer nicht mit ihrer assoziierten leichten Kette verbundenen Form.

7. Schimäres Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 1.

8. Schimäres Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 7, aufgebaut aus einer hybriden schweren Kette, die aus sowohl von menschlichen als auch nicht-menschlichen Spezies ausgewählten Sequenzen zusammengesetzt ist.

9. Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 1, worin das antigene Eptitop das Tetrapeptid Asn-Ala-Asn-Pro ist und in der dritten komplementaritätsbestimmenden Region seiner schweren Kette enthalten ist.

10. Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 9, worin das Tetrapeptid in Tripelform vorliegt.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als wesentlichen Wirkstoff ein Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 1 enthält.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, geeignet für die Verabreichung an ein menschliches Wesen.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11 in Form eines verabreichbaren Impfstoffs.

14. DNA-Molekül, das ein rekombinantes DNA-Molekül oder ein CDNA-Molekül ist, welche für ein Immunoglobulinmolekül nach Anspruch 1 kodieren.

15. DNA-Molekül nach Anspruch 14, welches für die schwere Kette des Immunoglobulins kodiert.

16. DNA-Molekül nach Anspruch 14 als synthetisches Produkt.

17. Expressionsvektor, welcher für ein Immunoglobulin gemäß Anspruch 14 oder 15 kodierende DNA aktiv beherbergt.

18. Rekombinante Wirtszelle, transfiziert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 17.

19. Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulinmoleküls nach Anspruch 1 durch Expression transfizierender DNA, die für das Immunoglobulinmolekül kodiert, in einer rekombinanten Wirtszelle.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die DNA für die schwere Kette des Immunoglobulinmoleküls kodiert.

21. Verwendung eines Immunoglobulinmoleküls nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Aufbau einer Toleranz für oder zur Verleihung aktiver oder passiver Immunität gegen ein Antigen oder zur Verminderung der Hypersensibilität gegenüber Allergenen.

22. Verwendung nach Anspruch 21, worin das Immunoglobulinmolekül ein Wirkstoff in einem verabreichbaren pharmazeutischen Impfstoff ist.