JP3357890B2 - 遺伝的に工作されたイムノグロブリン - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の分野】本発明の好適な実施態様は、組換えＤＮ
Ａ技術を用いて天然の、または合成イムノグロブリン分
子を遺伝的に工作して、それに新規なエピトープを与
え、たとえば病原菌に対する免疫を付与する、あるいは
抗原に対する耐性を構築する等、インビボおよびインビ
トロで種々の手段で利用可能な新規物質を初めて製造す
ることに関する。好ましい実施態様ではエピトープを特
定のイムノグロブリンのいわゆるＬ鎖またはＨ鎖可変部
に挿入する。すなわち、本発明では既知の組換えＤＮＡ
技術の助けを借りて、いわゆる定常部を介して特定の細
胞型（セルタイプ）に機構的に局在化する機能は維持し
ているが、新たな特定の抗原決定基またはエピトープを
局在化させるよう機能的に開発された新規なイムノグロ
ブリン物質を初めて製造する。
Ａ技術を用いて天然の、または合成イムノグロブリン分
子を遺伝的に工作して、それに新規なエピトープを与
え、たとえば病原菌に対する免疫を付与する、あるいは
抗原に対する耐性を構築する等、インビボおよびインビ
トロで種々の手段で利用可能な新規物質を初めて製造す
ることに関する。好ましい実施態様ではエピトープを特
定のイムノグロブリンのいわゆるＬ鎖またはＨ鎖可変部
に挿入する。すなわち、本発明では既知の組換えＤＮＡ
技術の助けを借りて、いわゆる定常部を介して特定の細
胞型（セルタイプ）に機構的に局在化する機能は維持し
ているが、新たな特定の抗原決定基またはエピトープを
局在化させるよう機能的に開発された新規なイムノグロ
ブリン物質を初めて製造する。
【０００２】
【発明の背景】今日では、組換えＤＮＡ技術は、基本的
に、ＤＮＡ配列を決定し、単離し、特性化し、さらに操
作可能な発現ベクターに挿入することにより、これらベ
クターで様々な組換え宿主をトランスフェクションし、
それら宿主の、ＤＮＡ配列がコードするポリペプチドの
産生能力を利用するために、ＤＮＡを組立てることが可
能な程度にまで到達した。明らかに、組換えＤＮＡ技術
に関する方法論には多くの変法があり、特殊な方法は発
明的な機能なしにはあり得ない。それにもかかわらず、
これらの方法は公知文献によって一般的に知られてお
り、当業者が必要な知的能力を利用してＤＮＡ組換え技
術を実行し、特定の組換え宿主系からポリペプチドを産
生することができる。
に、ＤＮＡ配列を決定し、単離し、特性化し、さらに操
作可能な発現ベクターに挿入することにより、これらベ
クターで様々な組換え宿主をトランスフェクションし、
それら宿主の、ＤＮＡ配列がコードするポリペプチドの
産生能力を利用するために、ＤＮＡを組立てることが可
能な程度にまで到達した。明らかに、組換えＤＮＡ技術
に関する方法論には多くの変法があり、特殊な方法は発
明的な機能なしにはあり得ない。それにもかかわらず、
これらの方法は公知文献によって一般的に知られてお
り、当業者が必要な知的能力を利用してＤＮＡ組換え技
術を実行し、特定の組換え宿主系からポリペプチドを産
生することができる。
【０００３】イムノグロブリン（Ｉｇ）類は体液免疫の
主なエフェクターであり、その１つの性質は種々のタイ
プの抗原と結合する能力と関係している。特定の宿主生
物に対する無数の抗原に鑑みて類似数またはそれ以上
の、各抗原と特異的に反応し得る結合部位を含有するイ
ムノグロブリンが存在することが分かる。これらの結合
部位はいわゆるイムノグロブリンの可変部に位置し、イ
デオタイプと言われている。さらに、イムノグロブリン
分子はおそらく細胞膜に存在するある種のレセプターの
相互認識手段によって、ある種の細胞型に局在化し得る
点で特異的である。イムノグロブリンは第２の一般的な
性質を有し、それにより免疫応答の内因性モジュレータ
ーとして作用する。Ｉｇ類およびそれらのイデオタイプ
的な決定基は種々の外因性抗原に対するＢ−および／ま
たはＴ−細胞レベルの免疫に用いられてきた。多くの場
合、これらが引き起こす免疫は抗原そのものによって惹
起される免疫に匹敵する。この状況の根底に横たわる理
論は理解し得るが、Ｉｇ分子の免疫原性における分子基
盤および最小限必要な構造、およびそのような免疫原性
に与る領域と、特定の細胞／レセプター型を有する特定
のイムノグロブリン分子の局在化を与える領域との相互
反応に関しては殆んど知られていない。過去数年間に、
イムノグロブリンの免疫原性、構造および遺伝を理解す
る上でかなりの進歩が得られた。ジェスクら(Jeske, et
al.), Fundamental Imunology, Paul.ed., Raven Pres
s, New York, (1984) p131; カバット(Kabat), Journal
Imunology 141; 525 (1988)。
主なエフェクターであり、その１つの性質は種々のタイ
プの抗原と結合する能力と関係している。特定の宿主生
物に対する無数の抗原に鑑みて類似数またはそれ以上
の、各抗原と特異的に反応し得る結合部位を含有するイ
ムノグロブリンが存在することが分かる。これらの結合
部位はいわゆるイムノグロブリンの可変部に位置し、イ
デオタイプと言われている。さらに、イムノグロブリン
分子はおそらく細胞膜に存在するある種のレセプターの
相互認識手段によって、ある種の細胞型に局在化し得る
点で特異的である。イムノグロブリンは第２の一般的な
性質を有し、それにより免疫応答の内因性モジュレータ
ーとして作用する。Ｉｇ類およびそれらのイデオタイプ
的な決定基は種々の外因性抗原に対するＢ−および／ま
たはＴ−細胞レベルの免疫に用いられてきた。多くの場
合、これらが引き起こす免疫は抗原そのものによって惹
起される免疫に匹敵する。この状況の根底に横たわる理
論は理解し得るが、Ｉｇ分子の免疫原性における分子基
盤および最小限必要な構造、およびそのような免疫原性
に与る領域と、特定の細胞／レセプター型を有する特定
のイムノグロブリン分子の局在化を与える領域との相互
反応に関しては殆んど知られていない。過去数年間に、
イムノグロブリンの免疫原性、構造および遺伝を理解す
る上でかなりの進歩が得られた。ジェスクら(Jeske, et
al.), Fundamental Imunology, Paul.ed., Raven Pres
s, New York, (1984) p131; カバット(Kabat), Journal
Imunology 141; 525 (1988)。
【０００４】最初に、抗体のいわゆる可変部（Ｖ）の免
疫原性が証明された。オウディンら（Oudin, et al.),
Academy of Sciences D 257, 805 (1963)およびカンケ
ルら(Kunkel, et al.), Science, 140, 1218 (1963)。
次いで、Ｖ領域内に可変性が区別される領域（エリア）
のあることが指摘され超可変性（ハイパーバライアビリ
ティー；ＨＶ）または相補性決定領域（Comprementarit
y-determining region：ＣＤＲ）という観念が挿入され
た。ウら(Wu. et al.), Ｊ．Exp. Med., 132, 211 (197
0)。以後、多くの研究がＩｇ分子の免疫原性は、おそら
くＣＤＲに含まれているアミノ酸配列により第一義的に
決定されるだろうと示唆した。デヴィーら(Davie, et.
al.), An. Rev. Immunol., 4: 147 (1986)。
疫原性が証明された。オウディンら（Oudin, et al.),
Academy of Sciences D 257, 805 (1963)およびカンケ
ルら(Kunkel, et al.), Science, 140, 1218 (1963)。
次いで、Ｖ領域内に可変性が区別される領域（エリア）
のあることが指摘され超可変性（ハイパーバライアビリ
ティー；ＨＶ）または相補性決定領域（Comprementarit
y-determining region：ＣＤＲ）という観念が挿入され
た。ウら(Wu. et al.), Ｊ．Exp. Med., 132, 211 (197
0)。以後、多くの研究がＩｇ分子の免疫原性は、おそら
くＣＤＲに含まれているアミノ酸配列により第一義的に
決定されるだろうと示唆した。デヴィーら(Davie, et.
al.), An. Rev. Immunol., 4: 147 (1986)。
【０００５】基本的なイムノグロブリンまたは抗体構造
単位は良く知られている。分子はジスルフィド結合によ
って共有結合的に結合したＨ鎖およびＬ鎖からなる。Ｈ
鎖はまた、塩基部分がジスルフィド結合によって共有結
合的に結合しており、この部分は、特定のイムノグロブ
リン分子が特定の細胞表面に見いだされるある配列を相
互認識する部分と考えられており、しばしばいわゆる定
常部と呼ばれる。イムノグロブリン分子のクラスを決定
する５つの主要な定常部クラスがあり、それらはＩｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。いわ
ゆるＨ鎖のＮ末端領域は、描写的な意味で、外側に枝状
をとり全体でＹ字型を示している。Ｌ鎖は２本のＨ鎖の
Ｙ枝に共有結合的に結合している。Ｈ鎖のＹ枝領域には
長さ約１００アミノ酸のドメインがあり、これらは可変
であり、したがって、その特定のイムノグロブリン分子
に関連する特定の抗原決定基に特異的である。
単位は良く知られている。分子はジスルフィド結合によ
って共有結合的に結合したＨ鎖およびＬ鎖からなる。Ｈ
鎖はまた、塩基部分がジスルフィド結合によって共有結
合的に結合しており、この部分は、特定のイムノグロブ
リン分子が特定の細胞表面に見いだされるある配列を相
互認識する部分と考えられており、しばしばいわゆる定
常部と呼ばれる。イムノグロブリン分子のクラスを決定
する５つの主要な定常部クラスがあり、それらはＩｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。いわ
ゆるＨ鎖のＮ末端領域は、描写的な意味で、外側に枝状
をとり全体でＹ字型を示している。Ｌ鎖は２本のＨ鎖の
Ｙ枝に共有結合的に結合している。Ｈ鎖のＹ枝領域には
長さ約１００アミノ酸のドメインがあり、これらは可変
であり、したがって、その特定のイムノグロブリン分子
に関連する特定の抗原決定基に特異的である。
【０００６】本発明の目的は、特に注目される抗原決定
基を有する可変部（ドメイン）を含有するＹ枝（Ｙブラ
ンチ）に関する。
基を有する可変部（ドメイン）を含有するＹ枝（Ｙブラ
ンチ）に関する。
【０００７】先行技術の研究者らはイムノグロブリンの
全ＣＤＲ類を研究し操作してキメラ分子を製造しそれら
の機能を報告している。たとえばジョーンズら[Jones e
t al, Nature, 321: 522 (1986)]がＶ領域のマウス−ヒ
トキメライムノグロブリン分子を製造したことが注目さ
れる。この研究では、バーホイエンら[Verhoyen, eta
l., Science 239: 1534, (1988)]、リーチマンら[Riech
mann et al., Nature 332: 323 (1988)]、およびモリソ
ン[Morrison, Science 229: 1202 (1985)]が明確に報告
したように実質上全ＣＤＲの置換を行なっている。欧州
特許出願公開（No.125023A、１９８４年１１月１４日公
開）をも参照。
全ＣＤＲ類を研究し操作してキメラ分子を製造しそれら
の機能を報告している。たとえばジョーンズら[Jones e
t al, Nature, 321: 522 (1986)]がＶ領域のマウス−ヒ
トキメライムノグロブリン分子を製造したことが注目さ
れる。この研究では、バーホイエンら[Verhoyen, eta
l., Science 239: 1534, (1988)]、リーチマンら[Riech
mann et al., Nature 332: 323 (1988)]、およびモリソ
ン[Morrison, Science 229: 1202 (1985)]が明確に報告
したように実質上全ＣＤＲの置換を行なっている。欧州
特許出願公開（No.125023A、１９８４年１１月１４日公
開）をも参照。
【０００８】本発明は、上記の機能的なキメラ分子を得
ることに成功した研究例を足掛かりにして、Ｙ枝のＮ末
端に含有される可変部のさらなる開発を目的としてい
る。これら可変部を操作して新規な抗原決定基またはエ
ピトープを導入し、局在化機能は保持したまま、異種
（ヘテロローガス）エピトープを含有し得る新規なイム
ノグロブリン分子を初めて製造することを目的とする。
このようにして本発明の新規なイムノグロブリン分子は
生物の異なる部位で作用し、その結果新規な部位特異的
なやり方で免疫特性を付与することができる。当時本研
究者らが直面していた問題は、Ｙ枝にエピトープ類がみ
とめられるという点であった。すなわち、Ｈ鎖と対応す
るＬ鎖との相互関係を破壊することなく可変部の操作が
可能か否かを予想することは困難であり、それが不適当
でないことが分かれば、得られる分子が新規なエピトー
プに関し、基礎となるイムノグロブリン分子の定常部と
共同して機能を保持するか否かを予測することは困難で
あった。すなわち、実験すべき箇所の問題を乗り越えた
としても、そのような新規で２機能性のイムノグロブリ
ン分子を成功裏に製造することが出来るか否かを予測す
ることは不可能であった。
ることに成功した研究例を足掛かりにして、Ｙ枝のＮ末
端に含有される可変部のさらなる開発を目的としてい
る。これら可変部を操作して新規な抗原決定基またはエ
ピトープを導入し、局在化機能は保持したまま、異種
（ヘテロローガス）エピトープを含有し得る新規なイム
ノグロブリン分子を初めて製造することを目的とする。
このようにして本発明の新規なイムノグロブリン分子は
生物の異なる部位で作用し、その結果新規な部位特異的
なやり方で免疫特性を付与することができる。当時本研
究者らが直面していた問題は、Ｙ枝にエピトープ類がみ
とめられるという点であった。すなわち、Ｈ鎖と対応す
るＬ鎖との相互関係を破壊することなく可変部の操作が
可能か否かを予想することは困難であり、それが不適当
でないことが分かれば、得られる分子が新規なエピトー
プに関し、基礎となるイムノグロブリン分子の定常部と
共同して機能を保持するか否かを予測することは困難で
あった。すなわち、実験すべき箇所の問題を乗り越えた
としても、そのような新規で２機能性のイムノグロブリ
ン分子を成功裏に製造することが出来るか否かを予測す
ることは不可能であった。
【０００９】本研究および発明は手掛かりとなる研究の
成功、モデルの調製、および新規なイムノグロブリン分
子の製造に基づいており、それら分子はある細胞／レセ
プター部位上に局在化し、導入された新規な抗原決定基
またはエピトープの特異的な反応性を保持する能力を有
する点で完全に機能的であることが分かった。
成功、モデルの調製、および新規なイムノグロブリン分
子の製造に基づいており、それら分子はある細胞／レセ
プター部位上に局在化し、導入された新規な抗原決定基
またはエピトープの特異的な反応性を保持する能力を有
する点で完全に機能的であることが分かった。
【００１０】
【発明の要約】本発明はＮ末端可変部に、出発物質とし
て用いたイムノグロブリン分子には通常見いだされない
新規なエピトープが導入され、そのエピトープは特異的
な反応性を保持している新規なイムノグロブリン分子の
製造に成功したことによる。好ましくは、そのような反
応性はエピトープの抗原応答刺激能力により特徴付けら
れる。または、そのような反応性は他の特異的な生物学
的機能、たとえばリガンドまたはレセプター結合、を反
映するものであってよい。
て用いたイムノグロブリン分子には通常見いだされない
新規なエピトープが導入され、そのエピトープは特異的
な反応性を保持している新規なイムノグロブリン分子の
製造に成功したことによる。好ましくは、そのような反
応性はエピトープの抗原応答刺激能力により特徴付けら
れる。または、そのような反応性は他の特異的な生物学
的機能、たとえばリガンドまたはレセプター結合、を反
映するものであってよい。
【００１１】このように、本発明は、そのＮ末端可変ド
メインに少なくとも１個の新規な異種エピトープを有す
る新規なイムノグロブリン分子に関し、該新規イムノグ
ロブリン分子は特定の細胞／レセプター型に対するＨ鎖
Ｃ末端定常ドメインの特異性を維持していると共に、イ
ンビトロおよびインビボで反応性の新規で特異的なエピ
トープを有するものである。
メインに少なくとも１個の新規な異種エピトープを有す
る新規なイムノグロブリン分子に関し、該新規イムノグ
ロブリン分子は特定の細胞／レセプター型に対するＨ鎖
Ｃ末端定常ドメインの特異性を維持していると共に、イ
ンビトロおよびインビボで反応性の新規で特異的なエピ
トープを有するものである。
【００１２】本発明はまた、必須医薬成分として本発明
の新規なイムノグロブリンを含有する医薬組成物に関
し、特に投与可能な医薬ワクチンに関する。
の新規なイムノグロブリンを含有する医薬組成物に関
し、特に投与可能な医薬ワクチンに関する。
【００１３】さらにまた本発明は上記で明らかにした新
規なイムノグロブリン分子を必要な個体に投与すること
により、自己免疫疾患の抗原等の抗原に対する耐性を構
築する、またはアレルゲンに対する過敏性のダウンレギ
ュレーション、またはある種の病原性抗原に対する能動
または受動免疫の付与、に有用な方法を提供するもので
ある。
規なイムノグロブリン分子を必要な個体に投与すること
により、自己免疫疾患の抗原等の抗原に対する耐性を構
築する、またはアレルゲンに対する過敏性のダウンレギ
ュレーション、またはある種の病原性抗原に対する能動
または受動免疫の付与、に有用な方法を提供するもので
ある。
【００１４】また、本発明は、本発明の新規なイムノグ
ロブリン分子の製造、同定および使用に有用な新規な組
換え技術および方法を提供するものであって、これに
は、それらをコードするＤＮＡの単離、該ＤＮＡを機能
的に含有するベクター、そのようなベクターでトランス
フェクションされた宿主、それら増殖宿主を含有する培
地を含み、さらに上記の組換えに関する全ての製造方法
を提供するものである。
ロブリン分子の製造、同定および使用に有用な新規な組
換え技術および方法を提供するものであって、これに
は、それらをコードするＤＮＡの単離、該ＤＮＡを機能
的に含有するベクター、そのようなベクターでトランス
フェクションされた宿主、それら増殖宿主を含有する培
地を含み、さらに上記の組換えに関する全ての製造方法
を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を、モデルの調
製、新規なイムノグロブリン物質の製造について特に詳
細に説明する。この説明は操作通り、組換えＤＮＡ技術
に関して記載されている。ここに述べた詳細な説明によ
り、特定のイムノグロブリンが、その出発物質であるイ
ムノグロブリンに普遍的に必要な機能と、特異的で新規
な抗原決定基の機能とを示すことを試験し得る手段が明
らかにされる。本明細書に記載の、特定の新規なイムノ
グロブリン分子に関する情報を当業者既知の一般的な方
法および技術と組合せることにより、当業者は、これも
また本発明の全範囲に包含され本明細書記載のごとく用
いられる新規なイムノグロブリン分子を製造するための
組換え発現ベクターを構築する方法を十分知ることがで
きる。本明細書では、新規なイムノグロブリン分子を成
功裏に調製する実験の手掛かりを記載しており、当業者
は本発明を再現する方法を逐次詳細に追随する必要はな
い。むしろ、当業者は本発明の総合的な範囲内で、既存
の関連技術や他の新規なイムノグロブリン分子の既知の
製造方法を用いることができる。
製、新規なイムノグロブリン物質の製造について特に詳
細に説明する。この説明は操作通り、組換えＤＮＡ技術
に関して記載されている。ここに述べた詳細な説明によ
り、特定のイムノグロブリンが、その出発物質であるイ
ムノグロブリンに普遍的に必要な機能と、特異的で新規
な抗原決定基の機能とを示すことを試験し得る手段が明
らかにされる。本明細書に記載の、特定の新規なイムノ
グロブリン分子に関する情報を当業者既知の一般的な方
法および技術と組合せることにより、当業者は、これも
また本発明の全範囲に包含され本明細書記載のごとく用
いられる新規なイムノグロブリン分子を製造するための
組換え発現ベクターを構築する方法を十分知ることがで
きる。本明細書では、新規なイムノグロブリン分子を成
功裏に調製する実験の手掛かりを記載しており、当業者
は本発明を再現する方法を逐次詳細に追随する必要はな
い。むしろ、当業者は本発明の総合的な範囲内で、既存
の関連技術や他の新規なイムノグロブリン分子の既知の
製造方法を用いることができる。
【００１６】一般的な方法および定義 「発現ベクター」はそれが含有するＤＮＡ配列を発現す
ることができるベクターであって、そのような配列はそ
の発現を可能ならしめる他の配列と機能的に結合してい
る。常には明確に述べていないが、これらの配列ベクタ
ーはエピソームとして、または染色体ＤＮＡに組み込ま
れた１部として、複製可能であることが暗示されてい
る。「機能的」という語句は文法上同等な意味におい
て、各ＤＮＡが使用可能である、すなわち、それらの意
図する目的において機能することを意味する。総括的
に、「発現ベクター」は機能的に定義され、そこに配置
された特定のＤＮＡ配列を発現させることができるＤＮ
Ａ配列はすべて、特定の配列に適用されると同様に、こ
の語句に包含される。一般に、組換えＤＮＡ技術で用い
られる発現ベクターは「プラスミド」の形であり、それ
は２本鎖の環状ＤＮＡループであってベクターの形では
染色体に結合しない。プラスミドが最も普通に用いられ
るベクターなので、本明細書では「プラスミド」および
「ベクター」という語句は互換性のある語句として用い
る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす他の
形態の発現ベクターおよび今後当該技術分野で知られる
であろうものをも包含する。
ることができるベクターであって、そのような配列はそ
の発現を可能ならしめる他の配列と機能的に結合してい
る。常には明確に述べていないが、これらの配列ベクタ
ーはエピソームとして、または染色体ＤＮＡに組み込ま
れた１部として、複製可能であることが暗示されてい
る。「機能的」という語句は文法上同等な意味におい
て、各ＤＮＡが使用可能である、すなわち、それらの意
図する目的において機能することを意味する。総括的
に、「発現ベクター」は機能的に定義され、そこに配置
された特定のＤＮＡ配列を発現させることができるＤＮ
Ａ配列はすべて、特定の配列に適用されると同様に、こ
の語句に包含される。一般に、組換えＤＮＡ技術で用い
られる発現ベクターは「プラスミド」の形であり、それ
は２本鎖の環状ＤＮＡループであってベクターの形では
染色体に結合しない。プラスミドが最も普通に用いられ
るベクターなので、本明細書では「プラスミド」および
「ベクター」という語句は互換性のある語句として用い
る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす他の
形態の発現ベクターおよび今後当該技術分野で知られる
であろうものをも包含する。
【００１７】親のイムノグロブリンの再配置または増大
等の手段によって新規なエピトープを導入することに関
する本発明の新規性とは別に、本発明の新規なイムノグ
ロブリンは親の物質と１またはそれ以上のアミノ酸が異
なっており、そのような差異が新規物質の基本的な活性
または生体−機能を破壊しない限り、任意に異なってい
てよいことは容易に理解できるであろう。
等の手段によって新規なエピトープを導入することに関
する本発明の新規性とは別に、本発明の新規なイムノグ
ロブリンは親の物質と１またはそれ以上のアミノ酸が異
なっており、そのような差異が新規物質の基本的な活性
または生体−機能を破壊しない限り、任意に異なってい
てよいことは容易に理解できるであろう。
【００１８】「組換え宿主細胞」は上記定義のベクター
でトランスフェクション（形質転換）された細胞を指
す。
でトランスフェクション（形質転換）された細胞を指
す。
【００１９】宿主細胞の維持には外因性の支持培地を用
い、それには増殖期の細胞を支持するか、それらを生存
状態に維持し組換え法で付与された機能を発揮するよう
にするために既知または考案された培地が含まれる［た
とえばＡＴＣＣ メディアハンドブック(Media Handboo
k)コートら編集(Cote et al.) American Type Culture
Collection, Rockville, MD (1984)］。哺乳類細胞のた
めの増殖支持培地は、たとえば、好ましくは、ウシ胎仔
血清等の血清補充物質、または細胞増殖および分化の促
進に用いられる他の補充成分、たとえば、動物の肉また
はミルクの加水分解産物、組織または器官抽出物、ふや
かした血塊またはその抽出物等を含有する。他の適当な
培地成分には、たとえばトランスフェリン、インシュリ
ンおよび各種の金属が含まれる。
い、それには増殖期の細胞を支持するか、それらを生存
状態に維持し組換え法で付与された機能を発揮するよう
にするために既知または考案された培地が含まれる［た
とえばＡＴＣＣ メディアハンドブック(Media Handboo
k)コートら編集(Cote et al.) American Type Culture
Collection, Rockville, MD (1984)］。哺乳類細胞のた
めの増殖支持培地は、たとえば、好ましくは、ウシ胎仔
血清等の血清補充物質、または細胞増殖および分化の促
進に用いられる他の補充成分、たとえば、動物の肉また
はミルクの加水分解産物、組織または器官抽出物、ふや
かした血塊またはその抽出物等を含有する。他の適当な
培地成分には、たとえばトランスフェリン、インシュリ
ンおよび各種の金属が含まれる。
【００２０】本明細書で開示したベクターおよび方法は
原核性および真核性の広範囲におよぶ宿主細胞に用いる
のに適する。
原核性および真核性の広範囲におよぶ宿主細胞に用いる
のに適する。
【００２１】本明細書中、「エピトープ」という語句は
特異的なエピトープ反応性をもたらし得る部分を指し、
好ましくは特異的な抗原反応性またはドメイン結合機能
の部分を指す。
特異的なエピトープ反応性をもたらし得る部分を指し、
好ましくは特異的な抗原反応性またはドメイン結合機能
の部分を指す。
【００２２】特定のイムノグロブリン分子のための新規
なエピトープに関して「異種の（ヘテロローガス）」な
る語句は、イムノグロブリン分子のＮ末端における（少
なくとも１個の）エピトープの存在を指し、Ｎ末端は、
天然状態では通常そのようなエピトープを含有していな
い、および／またはそれらのエピトープ自身でイムノグ
ロブリンのＣＤＲの全部または一部を構成しないもので
ある。したがって、鎖は異種のエピトープ配列（類）を
含有する。そのような異種のエピトープ配列にはＨＩＶ
のためのヒトＣＤ４結合ドメイン、ホルモンレセプター
結合リガンド、レチノイドレセプターおよびリガンド、
または細胞付着を触媒するレセプター等のレセプター様
結合ドメインまたは結合領域と同様、古典的な抗原性エ
ピトープが含まれるであろう。
なエピトープに関して「異種の（ヘテロローガス）」な
る語句は、イムノグロブリン分子のＮ末端における（少
なくとも１個の）エピトープの存在を指し、Ｎ末端は、
天然状態では通常そのようなエピトープを含有していな
い、および／またはそれらのエピトープ自身でイムノグ
ロブリンのＣＤＲの全部または一部を構成しないもので
ある。したがって、鎖は異種のエピトープ配列（類）を
含有する。そのような異種のエピトープ配列にはＨＩＶ
のためのヒトＣＤ４結合ドメイン、ホルモンレセプター
結合リガンド、レチノイドレセプターおよびリガンド、
または細胞付着を触媒するレセプター等のレセプター様
結合ドメインまたは結合領域と同様、古典的な抗原性エ
ピトープが含まれるであろう。
【００２３】「キメラ」とは本明細書の、異種のエピト
ープを含有する本明細書のイムノグロブリンを指し、そ
れはまた少なくとも１種以上のイムノグロブリンから得
た部分で構成されていてもよい。従って、本発明の出発
物質キメライムノグロブリンは対応するヒトおよび非ヒ
トイムノグロブリンの部分で構成されたハイブリッドＨ
鎖を有するものであってもよい。
ープを含有する本明細書のイムノグロブリンを指し、そ
れはまた少なくとも１種以上のイムノグロブリンから得
た部分で構成されていてもよい。従って、本発明の出発
物質キメライムノグロブリンは対応するヒトおよび非ヒ
トイムノグロブリンの部分で構成されたハイブリッドＨ
鎖を有するものであってもよい。
【００２４】上記の議論および既存の様々な文献の記述
に加えて、定義および方法、並びに本発明に包含される
基礎的な技術を行なうための手段を載せた標準的なテキ
ストブックを参照することができる。たとえば、マニア
ティスら(Maniatis, et al.)のMolecular Cloning, A L
aboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory,
New York (1982)およびこのテキストブックに記載され
ている引用文献、とりわけコロヴィックら(Colowick, e
t al.)の Methods in Enzymology Vol. 152, Academic
Press, Inc., (1987)を参照することができる。本明細
書に記載の文献はすべて本明細書で引用している。
に加えて、定義および方法、並びに本発明に包含される
基礎的な技術を行なうための手段を載せた標準的なテキ
ストブックを参照することができる。たとえば、マニア
ティスら(Maniatis, et al.)のMolecular Cloning, A L
aboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory,
New York (1982)およびこのテキストブックに記載され
ている引用文献、とりわけコロヴィックら(Colowick, e
t al.)の Methods in Enzymology Vol. 152, Academic
Press, Inc., (1987)を参照することができる。本明細
書に記載の文献はすべて本明細書で引用している。
【００２５】上記の記述および以下の実験に関する詳細
な記述では、最初に本発明者らが同定および特性化、な
らびに特定のイムノグロブリンの調製に用いた方法を記
載している。当業者は特定のイムノグロブリンのエピト
ープ含有ドメインの局在化および作製の手段を提供する
ことにより、本発明の新規なイムノグロブリンの製造方
法を理解し得るであろう。したがって、本実験を再現す
るために、努力して細部までも繰返す必要はまったくな
い。むしろ、別の、信頼できる既知の方法を採用するこ
とを選択してもよく、たとえば、類似範囲内の、または
他の適当な操作可能な発現ベクターと培地システムを開
発するために本発明の特定の新規なイムノグロブリンを
コードするＤＮＡ配列を合成してもよい。すなわち、実
際に使用した詳細な部分の提供に加えて、本明細書は、
本開示の恩恵に浴する当業者間の技術を用いて、開示し
た特異的なイムノグロブリンまたは他のイムノグロブリ
ン、およびそのフラグメントであって、たとえばインビ
トロで集合させるためのフラグメント等の再生産を可能
ならしめるものである。そのような手段はすべて本発明
の可能性および発明の範囲内である。
な記述では、最初に本発明者らが同定および特性化、な
らびに特定のイムノグロブリンの調製に用いた方法を記
載している。当業者は特定のイムノグロブリンのエピト
ープ含有ドメインの局在化および作製の手段を提供する
ことにより、本発明の新規なイムノグロブリンの製造方
法を理解し得るであろう。したがって、本実験を再現す
るために、努力して細部までも繰返す必要はまったくな
い。むしろ、別の、信頼できる既知の方法を採用するこ
とを選択してもよく、たとえば、類似範囲内の、または
他の適当な操作可能な発現ベクターと培地システムを開
発するために本発明の特定の新規なイムノグロブリンを
コードするＤＮＡ配列を合成してもよい。すなわち、実
際に使用した詳細な部分の提供に加えて、本明細書は、
本開示の恩恵に浴する当業者間の技術を用いて、開示し
た特異的なイムノグロブリンまたは他のイムノグロブリ
ン、およびそのフラグメントであって、たとえばインビ
トロで集合させるためのフラグメント等の再生産を可能
ならしめるものである。そのような手段はすべて本発明
の可能性および発明の範囲内である。
【００２６】特に好ましい態様の記述 マウス／ヒトキメラ抗体（Ｃγ1６２）のＨ鎖のＣＤＲ
３への外来エピトープの導入にはタンパク質工学を用い
た。このエピトープはテトラペプチド(Asn-Ala-Asn-Pr
o)（ＮＡＮＰ）の３個のコピーで構成されている。テト
ラペプチドは天然では３７タンデムリピートとして熱帯
性マラリア原虫［Plasmodium falciparum circumsporoz
oite (CS)］タンパク質に見られ、変異配列 Asn-Val-As
p-Proの４つの繰返しと共に拡散されて存在する。［ダ
ームら(Dame et al.) Science 225 : 593 (1984)］。本
明細書記載の構築において、エピトープは両者でValお
よびProと接している。（ＶＰ（ＮＡＮＰ）3ＶＰ）。実
験の結果、（ＮＡＮＰ）3エピトープはＩｇ分子の折り
畳み構造、すなわちＬ鎖との分子結合、に変化をもたら
すことなく宿主Ｈ鎖のＨＶ領域（ＶH）に挿入され得た
ことが証明され、さらに組換えＩｇ分子の抗原性および
免疫原性が発現されたことが決定された。抗体のＶH領
域のＣＤＲ３はしばしば免疫優勢イデオトープと構造上
関連していることが知られており、［デイヴィら(Davi
e, et al.) Ann. Rev. Immunol. 4, 147 (1986)］、こ
のことはＣＤＲ３が分子表面に存在することを示唆して
いる。さらに、可変−多様−結合領域(variable-divers
ity-joining; VDJ)の組換えにより、Ｎ付加機構［トネ
ガワ(Tonegawa), Nature 302, 575 (1983); ミラー(Mil
ler et al.) Immunol. Today 7, 36 (1986)］と同様、
ＣＤＲ３はその長さ（３−１９アミノ酸）が変化し得る
ことが確かめられ［カバットら(Kabat, et al.) Protei
ns of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health
and Human ServiceNIH (1987)］、構造レベルでの高度
の可塑性が暗示された。第２に本研究のために選択され
た（ＮＡＮＰ）3エピトープは比較的短く、反復性であ
ってマウスおよびヒトにおいて免疫原性が証明されてい
る［グッドら(Good et al.) Ann. Rev. immunol. 6, 63
3(1988)］。
３への外来エピトープの導入にはタンパク質工学を用い
た。このエピトープはテトラペプチド(Asn-Ala-Asn-Pr
o)（ＮＡＮＰ）の３個のコピーで構成されている。テト
ラペプチドは天然では３７タンデムリピートとして熱帯
性マラリア原虫［Plasmodium falciparum circumsporoz
oite (CS)］タンパク質に見られ、変異配列 Asn-Val-As
p-Proの４つの繰返しと共に拡散されて存在する。［ダ
ームら(Dame et al.) Science 225 : 593 (1984)］。本
明細書記載の構築において、エピトープは両者でValお
よびProと接している。（ＶＰ（ＮＡＮＰ）3ＶＰ）。実
験の結果、（ＮＡＮＰ）3エピトープはＩｇ分子の折り
畳み構造、すなわちＬ鎖との分子結合、に変化をもたら
すことなく宿主Ｈ鎖のＨＶ領域（ＶH）に挿入され得た
ことが証明され、さらに組換えＩｇ分子の抗原性および
免疫原性が発現されたことが決定された。抗体のＶH領
域のＣＤＲ３はしばしば免疫優勢イデオトープと構造上
関連していることが知られており、［デイヴィら(Davi
e, et al.) Ann. Rev. Immunol. 4, 147 (1986)］、こ
のことはＣＤＲ３が分子表面に存在することを示唆して
いる。さらに、可変−多様−結合領域(variable-divers
ity-joining; VDJ)の組換えにより、Ｎ付加機構［トネ
ガワ(Tonegawa), Nature 302, 575 (1983); ミラー(Mil
ler et al.) Immunol. Today 7, 36 (1986)］と同様、
ＣＤＲ３はその長さ（３−１９アミノ酸）が変化し得る
ことが確かめられ［カバットら(Kabat, et al.) Protei
ns of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health
and Human ServiceNIH (1987)］、構造レベルでの高度
の可塑性が暗示された。第２に本研究のために選択され
た（ＮＡＮＰ）3エピトープは比較的短く、反復性であ
ってマウスおよびヒトにおいて免疫原性が証明されてい
る［グッドら(Good et al.) Ann. Rev. immunol. 6, 63
3(1988)］。
【００２７】
【実施例】実施例１ ハイブリドーマ６２およびＢ１０Ｈ２の製造、およびｍ
Ａｂ６２および１０９．３（抗−２，４−ジニトロフェ
ノール）の精製は既述の方法で行なった［ザネッティら
(Zanetti et al., J. Immunol. 131, 2452 (1983);クロ
ッツら(Clotz et al.), J. Immunol. 137, 223 (198
6)。
Ａｂ６２および１０９．３（抗−２，４−ジニトロフェ
ノール）の精製は既述の方法で行なった［ザネッティら
(Zanetti et al., J. Immunol. 131, 2452 (1983);クロ
ッツら(Clotz et al.), J. Immunol. 137, 223 (198
6)。
【００２８】ハイブリドーマ６２のゲノムＤＮＡからサ
イズ選択された２−２．５Kb ＥcoＲＩ断片からＤＮＡ
ライブラリーを構築した。断片を低融点アガロースで溶
出させ、λgt１０ベクターに結合させた（ライゲーショ
ン）［Huynh et al., DNA Cloning Techniques 1, 49
(1985)。ライゲーションとパッケージングの後、５ｘ１
０4プラーク形成単位をＪHプローブ［サカノら(Sakano
et al.), Nature 286,676(1989)］およびｐＳＡＰＣ１
５プローブ［ブロデュアら(Brodeur et al.),Eur. J. I
mmunol. 14, 922 (1984)］を用いてレプリケートハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングした。４つのク
ローンを単離しプラークを精製した：その１つを形成し
ている２．３kbＥcoＲＩ挿入体をｐＥＭＢＬ１８ベクタ
ー［デンテら(Dente, et al. DNA Cloning Techniques
1, 101 (1985)］にサブクローニングした。親ハイブリ
ドーマから得たｃＤＮＡを、poly(A)+ＲＮＡをＣＨ１領
域の５’末端とアニーリングする合成オリゴヌクレオチ
ド（５’ＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３’）を
用いるプライマー伸長によりクローニングしてＶ HＢ１
０Ｈ２コード配列を決定した。同じオリゴヌクレオチド
をキナーゼで32Ｐ−ＡＴＰにより５’−末端標識し、ラ
イブラリーのスクリーニング用プローブとして用いた。
両クローンのヌクレオチド配列は、適当な制限断片をｐ
ＥＭＢＬ１８ベクターにサブクローニングした後、両鎖
についてジデオキシ法で決定した。
イズ選択された２−２．５Kb ＥcoＲＩ断片からＤＮＡ
ライブラリーを構築した。断片を低融点アガロースで溶
出させ、λgt１０ベクターに結合させた（ライゲーショ
ン）［Huynh et al., DNA Cloning Techniques 1, 49
(1985)。ライゲーションとパッケージングの後、５ｘ１
０4プラーク形成単位をＪHプローブ［サカノら(Sakano
et al.), Nature 286,676(1989)］およびｐＳＡＰＣ１
５プローブ［ブロデュアら(Brodeur et al.),Eur. J. I
mmunol. 14, 922 (1984)］を用いてレプリケートハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングした。４つのク
ローンを単離しプラークを精製した：その１つを形成し
ている２．３kbＥcoＲＩ挿入体をｐＥＭＢＬ１８ベクタ
ー［デンテら(Dente, et al. DNA Cloning Techniques
1, 101 (1985)］にサブクローニングした。親ハイブリ
ドーマから得たｃＤＮＡを、poly(A)+ＲＮＡをＣＨ１領
域の５’末端とアニーリングする合成オリゴヌクレオチ
ド（５’ＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３’）を
用いるプライマー伸長によりクローニングしてＶ HＢ１
０Ｈ２コード配列を決定した。同じオリゴヌクレオチド
をキナーゼで32Ｐ−ＡＴＰにより５’−末端標識し、ラ
イブラリーのスクリーニング用プローブとして用いた。
両クローンのヌクレオチド配列は、適当な制限断片をｐ
ＥＭＢＬ１８ベクターにサブクローニングした後、両鎖
についてジデオキシ法で決定した。
【００２９】Ｃ１，６２抗体をコードするＤＮＡを含有
するプラスミドｐＮγ1６２はＶH６２リアレンジメント
を含有する２．３kbＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を、ｐＮ（γ
１）［サラゾら(Sallazo, et al.), Focus 10, 64(198
8)］ベクター（ヒトγ１遺伝子を有するＰＳＶ誘導ベク
ター）の単一のＥｃｏＲＩ部位に適当な方向性でサブク
ローニングすることで構築した。このベクターはヒトγ
１遺伝子をＥｃｏＲＩ部位の下流に含有する。これはま
た安定な形質転換体の選択のためのネオマイシン耐性付
与遺伝子を、ＳＶ４０プロモーターのコントロール下で
有する。形質転換体は、プラスミドｐＮ（γ１）６２お
よびｐＮ（γ１）ＣＨＡ（Ｉｄ６２およびＩｇ結合を欠
く抗体をコードするキメラ構築物）をＪ５８８Ｌマウス
に電気穿孔法で導入することにより構築した。このセル
ライン（細胞系）はミエローマ（骨髄腫）Ｊ５５８のＨ
鎖欠損変異体［モリソンら（Morrison et al.），Scien
ce229, 229（1985）］でありλ１Ｌ鎖のリアレンジメン
トを担持している。超らせんＤＮＡ１０μｇを含有する
ダルベッコの改良最少培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌに約３×
１０6個の細胞を入れ、セルポレーター装置［Cell Port
or（Bethesda Research Laboratories, Bethesda, M
D）］で６５０Ｖ／ｃｍにおいて１７分間パルス処理し
た。パルス処理の後、細胞を１０ｍＭヘペス（Hepes）
バッファー、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５
０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）および１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（ｃ
ＤＭＥＭ）１０ｍｌに再懸濁し、３７℃で４８時間、Ｃ
Ｏ2雰囲気下でインキュベーションした。次いで、細胞
をｃＤＭＥＭ２０ｍｌに再懸濁しその１部（２ｍｌ）を
１．２ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Gibco, Grand Island, N
Y）２０ｍｌで希釈し、９６ウェルのマイクロタイター
プレートに撒き、１４日間培養した。ネオマイシン耐性
コロニー（安定な形質転換体）の上清を固相ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）と、酵素−結合イムノソーベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。
するプラスミドｐＮγ1６２はＶH６２リアレンジメント
を含有する２．３kbＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を、ｐＮ（γ
１）［サラゾら(Sallazo, et al.), Focus 10, 64(198
8)］ベクター（ヒトγ１遺伝子を有するＰＳＶ誘導ベク
ター）の単一のＥｃｏＲＩ部位に適当な方向性でサブク
ローニングすることで構築した。このベクターはヒトγ
１遺伝子をＥｃｏＲＩ部位の下流に含有する。これはま
た安定な形質転換体の選択のためのネオマイシン耐性付
与遺伝子を、ＳＶ４０プロモーターのコントロール下で
有する。形質転換体は、プラスミドｐＮ（γ１）６２お
よびｐＮ（γ１）ＣＨＡ（Ｉｄ６２およびＩｇ結合を欠
く抗体をコードするキメラ構築物）をＪ５８８Ｌマウス
に電気穿孔法で導入することにより構築した。このセル
ライン（細胞系）はミエローマ（骨髄腫）Ｊ５５８のＨ
鎖欠損変異体［モリソンら（Morrison et al.），Scien
ce229, 229（1985）］でありλ１Ｌ鎖のリアレンジメン
トを担持している。超らせんＤＮＡ１０μｇを含有する
ダルベッコの改良最少培地（ＤＭＥＭ）１ｍｌに約３×
１０6個の細胞を入れ、セルポレーター装置［Cell Port
or（Bethesda Research Laboratories, Bethesda, M
D）］で６５０Ｖ／ｃｍにおいて１７分間パルス処理し
た。パルス処理の後、細胞を１０ｍＭヘペス（Hepes）
バッファー、２ｍＭ−Ｌ−グルタミン、ペニシリン（５
０μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍ
ｌ）および１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（ｃ
ＤＭＥＭ）１０ｍｌに再懸濁し、３７℃で４８時間、Ｃ
Ｏ2雰囲気下でインキュベーションした。次いで、細胞
をｃＤＭＥＭ２０ｍｌに再懸濁しその１部（２ｍｌ）を
１．２ｍｇ／ｍｌＧ４１８（Gibco, Grand Island, N
Y）２０ｍｌで希釈し、９６ウェルのマイクロタイター
プレートに撒き、１４日間培養した。ネオマイシン耐性
コロニー（安定な形質転換体）の上清を固相ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）と、酵素−結合イムノソーベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。
【００３０】ｐＮ（γ１）６２ベクターでトランスフェ
クションされたＪ５５８Ｌ細胞の上清におけるＩｄ６２
の存在をＥＬＩＳＡの競合的阻害法で試験した。これに
より西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰ）標識ｍＡｂ６
２（リガンド）と、９６ウェルポリビニルマイクロタイ
タープレート（Dynatech, Alexandria, VA）を被覆する
抗Ｉｄ６２抗体との結合の阻害（％）が求められた［ザ
ネッティら（Zanettiet al.），J. Immunol. 131, 2452
（1983）］。ｐＮ（γ１）ＣＨＡプラスミドで形質転換
されたＪ５５８Ｌ細胞の上清と精製ｍＡｂ６２および１
０９．３（ＩｇＧ1，ｘ抗２，４−ジニトロフェノー
ル）を対照として用いた［ザネッティら（Zanetti et a
l.），J. Immunol. 131, 2452（1983）］。Ｉｄ６２の
発現を試験する第２の方法はウエスタンブロット法であ
る［トゥビンら（Towbin et al.），Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 71, 4350（1979）］。すなわち、抗ヒトＩｇ
セファロース４Ｂカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweede
n）でアフィニティークロマト精製した約５μｇの抗体
ｃ（γ１）６２を還元条件下、１０％ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。次い
で、ゲルを０．４５Ｍニトロセルロースペーパー（Mill
ipore, Bedford, MA）にブロットし125Ｉ標識アフィニ
ティー精製した同系の抗Ｉｄ６２抗体［Zanetti et a
l., J. Immunol. 135, 1245（1985）］でプローブし
た。抗体６２および１０９．３はそれぞれ正対照および
負対照として用いた。最初、フィルターを−７０℃で２
４時間、強化スクリーンに暴露した。キメラｃ（γ１）
６２抗体のＨ鎖のヒトＣ領域の同時発現を示すためにニ
トロセルロースペーパーを再度125Ｉ標識ヤギ抗ヒトＩ
ｇ抗体でプローブし７０℃で２時間暴露した。
クションされたＪ５５８Ｌ細胞の上清におけるＩｄ６２
の存在をＥＬＩＳＡの競合的阻害法で試験した。これに
より西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰ）標識ｍＡｂ６
２（リガンド）と、９６ウェルポリビニルマイクロタイ
タープレート（Dynatech, Alexandria, VA）を被覆する
抗Ｉｄ６２抗体との結合の阻害（％）が求められた［ザ
ネッティら（Zanettiet al.），J. Immunol. 131, 2452
（1983）］。ｐＮ（γ１）ＣＨＡプラスミドで形質転換
されたＪ５５８Ｌ細胞の上清と精製ｍＡｂ６２および１
０９．３（ＩｇＧ1，ｘ抗２，４−ジニトロフェノー
ル）を対照として用いた［ザネッティら（Zanetti et a
l.），J. Immunol. 131, 2452（1983）］。Ｉｄ６２の
発現を試験する第２の方法はウエスタンブロット法であ
る［トゥビンら（Towbin et al.），Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 71, 4350（1979）］。すなわち、抗ヒトＩｇ
セファロース４Ｂカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweede
n）でアフィニティークロマト精製した約５μｇの抗体
ｃ（γ１）６２を還元条件下、１０％ドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。次い
で、ゲルを０．４５Ｍニトロセルロースペーパー（Mill
ipore, Bedford, MA）にブロットし125Ｉ標識アフィニ
ティー精製した同系の抗Ｉｄ６２抗体［Zanetti et a
l., J. Immunol. 135, 1245（1985）］でプローブし
た。抗体６２および１０９．３はそれぞれ正対照および
負対照として用いた。最初、フィルターを−７０℃で２
４時間、強化スクリーンに暴露した。キメラｃ（γ１）
６２抗体のＨ鎖のヒトＣ領域の同時発現を示すためにニ
トロセルロースペーパーを再度125Ｉ標識ヤギ抗ヒトＩ
ｇ抗体でプローブし７０℃で２時間暴露した。
【００３１】配列データはＥＭＢＬ／Gene Bank Data L
ibraryから、受託番号No.Y00744の下で一般に得られ
る。
ibraryから、受託番号No.Y00744の下で一般に得られ
る。
【００３２】そのＨ鎖のＣＤＲ３内にマラリアＣＳ免疫
優勢Ｂ−細胞エピトープＮＡＮＰを担持するｙ1ＮＡＮ
Ｐ抗体を以下のようにして工作（抗原性化）した。
優勢Ｂ−細胞エピトープＮＡＮＰを担持するｙ1ＮＡＮ
Ｐ抗体を以下のようにして工作（抗原性化）した。
【００３３】図１はｐＮｙ１ＮＡＮＰ発現ベクターの構
築を示す。パネルＡにおいて、（ａ）は、後述のごと
く、サイズ選択したλｇｔ１０ライブラリーから単離
し、ｐBluscript（Stratagene, San Diego, CAから一般
に入手可能）にサブクローニングしたハイブリドーマセ
ルライン６２の、生産的に再配列（リアレンジメント）
したＶH遺伝子を示す。（ｂ）はポリリンカー領域の制
限部位Ｋｐｎ Ｉ／Ａｓｐ７１８をＫｐｎＩ消化によっ
て欠失させ、Ｔ４ポリメラーゼで充填しライゲーション
することによる、プラスミドｐＨ６２ΔＫの構築を示
す。（ｃ）ではプラスミドｐＨ６２ΔＫを部位特異的突
然変異における鋳型として用い、ＶH遺伝子のＣＤＲ３
の単一のＡｓｐ７１８制限部位に導入する。３ｂｐ挿入
体（ＴＡＣ）をコードする合成オリゴヌクレオチド
（５’ＣＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＣＴＣ
３’）をウラシル化した１本鎖相補的鋳型にアニーリン
グし伸長させた。（ｄ）は相補的な合成オリゴヌクレオ
チド： （5'GTACCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCA 3' 3'GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTCATG 5'） のアニーリングおよびｐＨ６２Ｋの単一のＡｓｐ７１８
部位へのサブクローニングを示す。構築はＶH６２遺伝
子の５’末端（５’ＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧ
３’）に対応する１５量体プライマーを用いて配列決定
することで証明した。（ｅ）は工作したＶHＮＡＮＰ遺
伝子を担持する２．３ｋｂＥCOＲＩ断片の１５ｋｂのｐ
Ｎｙ１ベクターのヒトｙ１Ｃ領域上流へのサブクローニ
ングを示す。ｐＮｙ１ＮＡＮＰ構築物をＪ５５８Ｌ細胞
にエレクトロポーレーションし、Ｇ４１８の存在下で培
養した。耐性クローンを、マイクロタイターウェルに固
定化したヤギ抗ヒト抗体を抗体の捕獲に、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇ（Sigma）
を抗体の検出（revealing）に用いるサンドイッチ酵素
結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で、Ｉｇ
生産に関してスクリーニングした。＞２−５μｇ Ｉｇ
／ｍｌのタンパク質を産生しているクローンの１０6細
胞を増幅し培地上清から抗体を精製した。パネルＡで図
示した配列の装飾をパネルＢで詳細に示している。略語
は以下の通りである。Asp - Asp 718; B -Bam HI; RI -
Eco RI; FR - フレームワーク領域（framework regio
n）；CDR -相補性決定領域（complementarity-determin
ing region）；neo - ネオマイシン耐性（neomycin（G4
18）resistance）；amp - アンピシリン耐性（ampicill
inresistance）。
築を示す。パネルＡにおいて、（ａ）は、後述のごと
く、サイズ選択したλｇｔ１０ライブラリーから単離
し、ｐBluscript（Stratagene, San Diego, CAから一般
に入手可能）にサブクローニングしたハイブリドーマセ
ルライン６２の、生産的に再配列（リアレンジメント）
したＶH遺伝子を示す。（ｂ）はポリリンカー領域の制
限部位Ｋｐｎ Ｉ／Ａｓｐ７１８をＫｐｎＩ消化によっ
て欠失させ、Ｔ４ポリメラーゼで充填しライゲーション
することによる、プラスミドｐＨ６２ΔＫの構築を示
す。（ｃ）ではプラスミドｐＨ６２ΔＫを部位特異的突
然変異における鋳型として用い、ＶH遺伝子のＣＤＲ３
の単一のＡｓｐ７１８制限部位に導入する。３ｂｐ挿入
体（ＴＡＣ）をコードする合成オリゴヌクレオチド
（５’ＣＡＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＣＴＣ
３’）をウラシル化した１本鎖相補的鋳型にアニーリン
グし伸長させた。（ｄ）は相補的な合成オリゴヌクレオ
チド： （5'GTACCCAATGCAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCA 3' 3'GGTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTTTACGTTTGGGTCATG 5'） のアニーリングおよびｐＨ６２Ｋの単一のＡｓｐ７１８
部位へのサブクローニングを示す。構築はＶH６２遺伝
子の５’末端（５’ＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧ
３’）に対応する１５量体プライマーを用いて配列決定
することで証明した。（ｅ）は工作したＶHＮＡＮＰ遺
伝子を担持する２．３ｋｂＥCOＲＩ断片の１５ｋｂのｐ
Ｎｙ１ベクターのヒトｙ１Ｃ領域上流へのサブクローニ
ングを示す。ｐＮｙ１ＮＡＮＰ構築物をＪ５５８Ｌ細胞
にエレクトロポーレーションし、Ｇ４１８の存在下で培
養した。耐性クローンを、マイクロタイターウェルに固
定化したヤギ抗ヒト抗体を抗体の捕獲に、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇ（Sigma）
を抗体の検出（revealing）に用いるサンドイッチ酵素
結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で、Ｉｇ
生産に関してスクリーニングした。＞２−５μｇ Ｉｇ
／ｍｌのタンパク質を産生しているクローンの１０6細
胞を増幅し培地上清から抗体を精製した。パネルＡで図
示した配列の装飾をパネルＢで詳細に示している。略語
は以下の通りである。Asp - Asp 718; B -Bam HI; RI -
Eco RI; FR - フレームワーク領域（framework regio
n）；CDR -相補性決定領域（complementarity-determin
ing region）；neo - ネオマイシン耐性（neomycin（G4
18）resistance）；amp - アンピシリン耐性（ampicill
inresistance）。
【００３４】チログロブリンに対するネズミモノクロー
ナル抗体（ｍＡｂ６２）のＶH遺伝子をコードする制限
断片を図１記載のように修飾した。ＮＡＮＰテトラマー
の３コピー（ＮＡＮＰ）3とＡｓｐ７１８突出末端をコ
ードする２本鎖合成ＤＮＡ断片をＶH９６コード領域の
ｐｒｏ９５とＴｙｒ９６の間の枠内に挿入した。ｐＨ６
２ｄＮＡＮＰ構築物はジデオキシ配列決定法で確認し
た。工作されたＶHをコードするＥｃｏＲＩ断片をｐＮ
Ｙ1発現ベクターのヒトｙ1定常（Ｃ）領域の上流に挿入
しｐＮｙ1ＮＡＮＰ構築物を得た。この構築物を電気穿
孔法でネズミＪ５５８Ｌ細胞系、ラムダー１Ｌ鎖のリア
レンジメントを有するミエローマＪ５５８のＨ鎖欠損変
異体［モリソンら（Morrisonn et al.），Science, 22
9, 1202,（1985）］に導入した。
ナル抗体（ｍＡｂ６２）のＶH遺伝子をコードする制限
断片を図１記載のように修飾した。ＮＡＮＰテトラマー
の３コピー（ＮＡＮＰ）3とＡｓｐ７１８突出末端をコ
ードする２本鎖合成ＤＮＡ断片をＶH９６コード領域の
ｐｒｏ９５とＴｙｒ９６の間の枠内に挿入した。ｐＨ６
２ｄＮＡＮＰ構築物はジデオキシ配列決定法で確認し
た。工作されたＶHをコードするＥｃｏＲＩ断片をｐＮ
Ｙ1発現ベクターのヒトｙ1定常（Ｃ）領域の上流に挿入
しｐＮｙ1ＮＡＮＰ構築物を得た。この構築物を電気穿
孔法でネズミＪ５５８Ｌ細胞系、ラムダー１Ｌ鎖のリア
レンジメントを有するミエローマＪ５５８のＨ鎖欠損変
異体［モリソンら（Morrisonn et al.），Science, 22
9, 1202,（1985）］に導入した。
【００３５】形質転換体細胞を培養、サブクローンし、
ヤギ抗ヒトＩｇ抗体を用い、サンドイッチ酵素結合イム
ノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で、工作（抗原性
化）されたＩｇ分子の分泌に関してスクリーニングし
た。２−５μｇ／ｍｌのタンパク質を産生しているクロ
ーンの１０6細胞を選択して増幅し、キメラタンパク質
をセファロース４Ｂ−プロテインＡカラムを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーで精製した。精製Ｉｇ分
子は還元および非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。
ヤギ抗ヒトＩｇ抗体を用い、サンドイッチ酵素結合イム
ノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で、工作（抗原性
化）されたＩｇ分子の分泌に関してスクリーニングし
た。２−５μｇ／ｍｌのタンパク質を産生しているクロ
ーンの１０6細胞を選択して増幅し、キメラタンパク質
をセファロース４Ｂ−プロテインＡカラムを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーで精製した。精製Ｉｇ分
子は還元および非還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。
【００３６】図２はｙ１ＮＡＮＰとＷＴ組換えＩｇのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥである。プロテインＡ精製した抗体５ｇ
を非還元条件下、７．５％ポリアクリルアミドゲルに負
荷した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。挿入図
は、還元条件下（５％βメルカプトエタノール）で工作
（抗原性化）された抗体ｙ１ＮＡＮＰを電気泳動すると
Ｈ鎖およびＬ鎖に分離することを示している。
ＤＳ−ＰＡＧＥである。プロテインＡ精製した抗体５ｇ
を非還元条件下、７．５％ポリアクリルアミドゲルに負
荷した。ゲルをクーマシーブルーで染色した。挿入図
は、還元条件下（５％βメルカプトエタノール）で工作
（抗原性化）された抗体ｙ１ＮＡＮＰを電気泳動すると
Ｈ鎖およびＬ鎖に分離することを示している。
【００３７】図２は非還元ｙ１ＮＡＮＰキメラ抗体の見
掛けの分子量が１６０ｋＤであり適当なＨ2Ｌ2集合を果
たしてテトラマーＩｇタンパク質を与えていることを示
す。ｙ1ＮＡＮＰ抗体を野生型（ＷＴ）Ｉｇと比較する
と、ｐＮｙ1６２でトランスフェクションされたＪ５５
８Ｌ細胞の培養上清から精製された（ＮＡＮＰ）3挿入
体を欠くキメラ抗体は、挿入されたエピトープの存在に
よって、わずかに大きさが異なることが認められた。し
かしながらｙ1ＮＡＮＰ抗体の分子量は十分、テトラマ
ーコンプレックスの範囲内である。両標品は１６０ｋＤ
バンドの下方に斑点を示しているが、これらは分解およ
び／または非適正に集合したなんらかのタンパク質産物
があることを示唆している。還元条件下、工作（抗原性
化）されたｙ1ＮＡＮＰ抗体は適切にＨ鎖とＬ鎖に分離
した（図２、挿入図）。ＮＰ４０ライゼートのＥＬＩＳ
Ａによって決定されたように、ｙ1ＮＡＮＰ抗体を分泌
する形質転換細胞は、ＷＴＩｇを産生する細胞とほぼ同
様の細胞質濃度のＨ鎖を分泌した。総合すると、これら
の結果はＶH６２のＣＤＲ３への１５アミノ酸の導入
は、ＶHおよびＶLポリペプチド鎖の相互反応、ならびに
テトラマー（Ｈ2Ｌ2）Ｉｇ分子の集合および分泌に感知
できるほどの変化をもたらさなかったことを示してい
る。
掛けの分子量が１６０ｋＤであり適当なＨ2Ｌ2集合を果
たしてテトラマーＩｇタンパク質を与えていることを示
す。ｙ1ＮＡＮＰ抗体を野生型（ＷＴ）Ｉｇと比較する
と、ｐＮｙ1６２でトランスフェクションされたＪ５５
８Ｌ細胞の培養上清から精製された（ＮＡＮＰ）3挿入
体を欠くキメラ抗体は、挿入されたエピトープの存在に
よって、わずかに大きさが異なることが認められた。し
かしながらｙ1ＮＡＮＰ抗体の分子量は十分、テトラマ
ーコンプレックスの範囲内である。両標品は１６０ｋＤ
バンドの下方に斑点を示しているが、これらは分解およ
び／または非適正に集合したなんらかのタンパク質産物
があることを示唆している。還元条件下、工作（抗原性
化）されたｙ1ＮＡＮＰ抗体は適切にＨ鎖とＬ鎖に分離
した（図２、挿入図）。ＮＰ４０ライゼートのＥＬＩＳ
Ａによって決定されたように、ｙ1ＮＡＮＰ抗体を分泌
する形質転換細胞は、ＷＴＩｇを産生する細胞とほぼ同
様の細胞質濃度のＨ鎖を分泌した。総合すると、これら
の結果はＶH６２のＣＤＲ３への１５アミノ酸の導入
は、ＶHおよびＶLポリペプチド鎖の相互反応、ならびに
テトラマー（Ｈ2Ｌ2）Ｉｇ分子の集合および分泌に感知
できるほどの変化をもたらさなかったことを示してい
る。
【００３８】工作（抗原性化）されたｙ1ＮＡＮＰ抗体
が実際に免疫学的に許容し得る形の（ＮＡＮＰ）3エピ
トープを発現するか否かを調べるために固相ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット法をP. far
ciparumに対して惹起され、ＮＡＮＰ特異的ネズミモノ
クローナル抗体（ＳＰ３−Ｂ４）を用いて行なった。
が実際に免疫学的に許容し得る形の（ＮＡＮＰ）3エピ
トープを発現するか否かを調べるために固相ラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット法をP. far
ciparumに対して惹起され、ＮＡＮＰ特異的ネズミモノ
クローナル抗体（ＳＰ３−Ｂ４）を用いて行なった。
【００３９】図３は125Ｉ標識モノクローナル抗体ＳＰ
−３−Ｂ４の工作（抗原性化）されたｙ１ＮＡＮＰ抗体
に対する結合を示す。ネズミモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）ＳＰ３−Ｂ４、ＩｇＧ２ａ，Ｋ、熱帯マラリア熱原
虫による免疫によって産生され、反復エピトープＮＡＮ
Ｐと反応性。ＮＡＮＰエピトープ特異的な、あらゆる抗
マライナル抗体を手段として用い同様の方法で生産され
る。ポリビニルマイクロタイターウエルを精製ｙ１ＮＡ
ＮＰＩｇ（黒色菱形）、ＷＴ（黒色三角）、（ＮＡＮ
Ｐ）3合成ペプチド（黒色四角）、プロトタイプ抗体６
２のＶH領域のＣＤＲ３を包含する１６mer合成ペプチド
（ＹＹＣＡＲＫＡＹＳＨＧＭＤＹＷ）（白色四角）、お
よび細胞接着分子ビトロネクチン（vitronection）の１
５mer合成ペプチド（ＹＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰＥ
Ｄ）（白色菱形）の０．９％ＮａＣｌ中５ｇ／ｍｌ溶液
中で３７℃で乾燥することによりコート（被覆）した。
125Ｉ標識抗体ＳＰ３−Ｂ４（２０×１０4ｃｐｍ／５０
μｌ）を＋４℃で一夜インキュベーションした。十分に
洗浄した後、結合した放射能をガンマカウンターで計測
した。試験は３回行なった。
−３−Ｂ４の工作（抗原性化）されたｙ１ＮＡＮＰ抗体
に対する結合を示す。ネズミモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）ＳＰ３−Ｂ４、ＩｇＧ２ａ，Ｋ、熱帯マラリア熱原
虫による免疫によって産生され、反復エピトープＮＡＮ
Ｐと反応性。ＮＡＮＰエピトープ特異的な、あらゆる抗
マライナル抗体を手段として用い同様の方法で生産され
る。ポリビニルマイクロタイターウエルを精製ｙ１ＮＡ
ＮＰＩｇ（黒色菱形）、ＷＴ（黒色三角）、（ＮＡＮ
Ｐ）3合成ペプチド（黒色四角）、プロトタイプ抗体６
２のＶH領域のＣＤＲ３を包含する１６mer合成ペプチド
（ＹＹＣＡＲＫＡＹＳＨＧＭＤＹＷ）（白色四角）、お
よび細胞接着分子ビトロネクチン（vitronection）の１
５mer合成ペプチド（ＹＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰＥ
Ｄ）（白色菱形）の０．９％ＮａＣｌ中５ｇ／ｍｌ溶液
中で３７℃で乾燥することによりコート（被覆）した。
125Ｉ標識抗体ＳＰ３−Ｂ４（２０×１０4ｃｐｍ／５０
μｌ）を＋４℃で一夜インキュベーションした。十分に
洗浄した後、結合した放射能をガンマカウンターで計測
した。試験は３回行なった。
【００４０】直接ＲＩＡ結合の結果（図３）は125Ｉ標
識ｍＡｂＳＰ３−Ｂ４がマイクロタイタープレートに固
定化された合成ペプチド（ＮＡＮＰ）3、および組換え
ｙ１ＮＡＮＰ抗体の両者と結合することを示した。しか
しながら、抗体ｙ１ＮＡＮＰへの結合の方が効率的であ
ると考えられる；抗体に対するペプチドの比率は抗体が
Ｉｇ分子あたり（ＮＡＮＰ）3エピトープを２コピー発
現すると仮定して、モル比で約５０：１と算定された。
ＷＴＩｇまたは２個の無関係な合成ペプチド、１つはプ
ロトタイプＶH６２のＣＤＲ３配列に１つはビトロネク
チンのＹＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰＥＤ残基に相当す
る、のいずれの間にも結合は起きなかった。
識ｍＡｂＳＰ３−Ｂ４がマイクロタイタープレートに固
定化された合成ペプチド（ＮＡＮＰ）3、および組換え
ｙ１ＮＡＮＰ抗体の両者と結合することを示した。しか
しながら、抗体ｙ１ＮＡＮＰへの結合の方が効率的であ
ると考えられる；抗体に対するペプチドの比率は抗体が
Ｉｇ分子あたり（ＮＡＮＰ）3エピトープを２コピー発
現すると仮定して、モル比で約５０：１と算定された。
ＷＴＩｇまたは２個の無関係な合成ペプチド、１つはプ
ロトタイプＶH６２のＣＤＲ３配列に１つはビトロネク
チンのＹＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰＥＤ残基に相当す
る、のいずれの間にも結合は起きなかった。
【００４１】図４は125Ｉ標識抗体ＳＰ３−Ｂ４のＨ鎖
内の工作（抗原性化）された（ＮＡＮＰ）3エピトープ
への結合を示す。１０μｇの精製ｙ１ＮＡＮＰ、組換え
ＷＴＩｇ、天然のモノクローナル抗体６２、およびポリ
クローナルヒトガンマグロブリン（ＨＧＧ）（Cohn fra
ction II, Miles）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し
非還元条件下（左パネル）、および還元条件下（右パネ
ル）、１５０Ｖで電気泳動した。解離したタンパク質ま
たはポリペプチド鎖をゲルから０．４５μｍのニトロセ
ルロースペーパーに移した。ブロッティングの後、０．
９％ＮａＣｌ中１０％ドライミルク溶液で室温において
２時間ブロックした。次いでシートを、１％ウシ血清ア
ルブミンと１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化
食塩水（ｐＨ７．３）中、125Ｉ標識抗体ＳＰ３−Ｂ４
（４０×１０4ｃｐｍ／ｍｌ）と一緒に振とうさせなが
ら＋４℃で一夜インキュベーションした。インキュベー
ション後、フィルターを十分に洗浄し、乾燥しコダック
ＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で１８時間暴露した。同
じ125Ｉ標識プローブ（１０5ｃｐｍ／５０μｌ）による
ＲＩＡにおける、ｙ１ＮＡＮＰＩｇ、組換えＷＴＩｇ、
抗体６２およびＨＧＧに対する結合は、それぞれ１０，
５６０；４２０；３６０；３３０ｃｐｍであった。
内の工作（抗原性化）された（ＮＡＮＰ）3エピトープ
への結合を示す。１０μｇの精製ｙ１ＮＡＮＰ、組換え
ＷＴＩｇ、天然のモノクローナル抗体６２、およびポリ
クローナルヒトガンマグロブリン（ＨＧＧ）（Cohn fra
ction II, Miles）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し
非還元条件下（左パネル）、および還元条件下（右パネ
ル）、１５０Ｖで電気泳動した。解離したタンパク質ま
たはポリペプチド鎖をゲルから０．４５μｍのニトロセ
ルロースペーパーに移した。ブロッティングの後、０．
９％ＮａＣｌ中１０％ドライミルク溶液で室温において
２時間ブロックした。次いでシートを、１％ウシ血清ア
ルブミンと１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝化
食塩水（ｐＨ７．３）中、125Ｉ標識抗体ＳＰ３−Ｂ４
（４０×１０4ｃｐｍ／ｍｌ）と一緒に振とうさせなが
ら＋４℃で一夜インキュベーションした。インキュベー
ション後、フィルターを十分に洗浄し、乾燥しコダック
ＸＡＲ−５フィルムに−７０℃で１８時間暴露した。同
じ125Ｉ標識プローブ（１０5ｃｐｍ／５０μｌ）による
ＲＩＡにおける、ｙ１ＮＡＮＰＩｇ、組換えＷＴＩｇ、
抗体６２およびＨＧＧに対する結合は、それぞれ１０，
５６０；４２０；３６０；３３０ｃｐｍであった。
【００４２】ウエスタンブロット分析（図４）は125Ｉ
標識ｍＡｂＳＰ３−Ｂ４が抗体ｙ１ＮＡＮＰ抗体と、非
還元（左パネル）および還元（右パネル）形で特異的に
結合することを示している。後者において、予測どお
り、結合がＨ鎖（Ｌ鎖でなく）において起こり、このこ
とにより工作（抗原性化）されたｙ１ＮＡＮＰ抗体が
（ＮＡＮＰ）3エピトープをＨ鎖に有することが示され
た。ＨおよびＬ鎖の対照およびヒトＣ領域との結合は起
こらなかった。
標識ｍＡｂＳＰ３−Ｂ４が抗体ｙ１ＮＡＮＰ抗体と、非
還元（左パネル）および還元（右パネル）形で特異的に
結合することを示している。後者において、予測どお
り、結合がＨ鎖（Ｌ鎖でなく）において起こり、このこ
とにより工作（抗原性化）されたｙ１ＮＡＮＰ抗体が
（ＮＡＮＰ）3エピトープをＨ鎖に有することが示され
た。ＨおよびＬ鎖の対照およびヒトＣ領域との結合は起
こらなかった。
【００４３】工作されたｙ1ＮＡＮＰ抗体の（ＮＡＮ
Ｐ）3エピトープ発現に関する相対的な効率を評価する
ために交差阻害アッセイを用いた。合成ペプチド（ＮＡ
ＮＰ）3と抗体ｙ1ＮＡＮＰとを用いて125Ｉ標識ｍＡｂ
Ｓｐ３−Ｂ４と、マイクロタイタープレートに固定化
した（ＮＡＮＰ）3ペプチドまたはｙ1ＮＡＮＰ抗体のい
ずれかとの結合の阻害を調べた。
Ｐ）3エピトープ発現に関する相対的な効率を評価する
ために交差阻害アッセイを用いた。合成ペプチド（ＮＡ
ＮＰ）3と抗体ｙ1ＮＡＮＰとを用いて125Ｉ標識ｍＡｂ
Ｓｐ３−Ｂ４と、マイクロタイタープレートに固定化
した（ＮＡＮＰ）3ペプチドまたはｙ1ＮＡＮＰ抗体のい
ずれかとの結合の阻害を調べた。
【００４４】図５は125Ｉ標識抗体Ｓｐ３−Ｂ４の合成
ペプチド（ＮＡＮＰ）3（パネルＡ）または工作（抗原
性化）されたｙ1ＮＡＮＰ（パネルＢ）のｙ１ＮＡＮＰ
Ｉｇまたはペプチド（ＮＡＮＰ）3による交差阻害を示
す。一定量の125Ｉ標識抗体Ｓｐ３−Ｂ４プローブを１
％ウシ血清アルブミンと１％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有す
るリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．３）に希釈した種々の
阻害物質の、容量比（ｖ／ｖ比）による漸減量と混合し
た。揺動しながら、混合物を＋４℃で一夜インキュベー
ションした。各混合物５０μｌをそれぞれ、合成ペプチ
ド（ＮＡＮＰ）3（パネルＡ）また精製した工作（抗原
性化）ｙ1ＮＡＮＰＩｇ（パネルＢ）でコートしたポリ
ビニルマイクロタイタープレート上でインキュベーショ
ンした。コーティングの条件は図４の説明に記載した通
りである。以下の阻害物質を用いた。精製ｙ1ＮＡＮ
Ｐ、ＷＴ Ｉｇおよび合成ペプチド（ＮＡＮＰ）3、Ｃ
ＤＲ３およびビトロネクチンである。阻害％は以下のよ
うにして計算した。［（プローブ単独の平均結合）−
（阻害物質の存在下でインキュベーションした場合のプ
ローブの平均結合）］÷（プローブ単独の平均結合）×
１００。試験は２回繰返した。
ペプチド（ＮＡＮＰ）3（パネルＡ）または工作（抗原
性化）されたｙ1ＮＡＮＰ（パネルＢ）のｙ１ＮＡＮＰ
Ｉｇまたはペプチド（ＮＡＮＰ）3による交差阻害を示
す。一定量の125Ｉ標識抗体Ｓｐ３−Ｂ４プローブを１
％ウシ血清アルブミンと１％Ｔｗｅｅｎ２０とを含有す
るリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．３）に希釈した種々の
阻害物質の、容量比（ｖ／ｖ比）による漸減量と混合し
た。揺動しながら、混合物を＋４℃で一夜インキュベー
ションした。各混合物５０μｌをそれぞれ、合成ペプチ
ド（ＮＡＮＰ）3（パネルＡ）また精製した工作（抗原
性化）ｙ1ＮＡＮＰＩｇ（パネルＢ）でコートしたポリ
ビニルマイクロタイタープレート上でインキュベーショ
ンした。コーティングの条件は図４の説明に記載した通
りである。以下の阻害物質を用いた。精製ｙ1ＮＡＮ
Ｐ、ＷＴ Ｉｇおよび合成ペプチド（ＮＡＮＰ）3、Ｃ
ＤＲ３およびビトロネクチンである。阻害％は以下のよ
うにして計算した。［（プローブ単独の平均結合）−
（阻害物質の存在下でインキュベーションした場合のプ
ローブの平均結合）］÷（プローブ単独の平均結合）×
１００。試験は２回繰返した。
【００４５】図５はペプチドおよび工作（抗原性化）さ
れた抗体が、２つの生理的形態、すなわち、合成ペプチ
ドおよび生成抗体の（ＮＡＮＰ）3エピトープの結合を
効率良く阻害したことを示す。しかしながら、ｙ1ＮＡ
ＮＰは、合成ペプチドとの結合阻害において、ペプチド
自身よりも約４倍以上有効であった（パネルＡ）が、工
作（抗原性化）されたＩｇとの結合の阻害においてペプ
チドよりも約１５０倍以上有効であった（パネルＢ）。
ＷＴ Ｉｇおよび対照ペプチド（ＣＤＲ３およびビトロ
ネクチン）は何らの阻害をもたらさなかった。すなわ
ち、合成ペプチドと比較すると、ｙ1ＮＡＮＰ抗体に関
係した（ＮＡＮＰ）3エピトープは免疫学的な意味か
ら、活性なＣＳプロテインの３次元立体配置に、より似
通っていると思われる。
れた抗体が、２つの生理的形態、すなわち、合成ペプチ
ドおよび生成抗体の（ＮＡＮＰ）3エピトープの結合を
効率良く阻害したことを示す。しかしながら、ｙ1ＮＡ
ＮＰは、合成ペプチドとの結合阻害において、ペプチド
自身よりも約４倍以上有効であった（パネルＡ）が、工
作（抗原性化）されたＩｇとの結合の阻害においてペプ
チドよりも約１５０倍以上有効であった（パネルＢ）。
ＷＴ Ｉｇおよび対照ペプチド（ＣＤＲ３およびビトロ
ネクチン）は何らの阻害をもたらさなかった。すなわ
ち、合成ペプチドと比較すると、ｙ1ＮＡＮＰ抗体に関
係した（ＮＡＮＰ）3エピトープは免疫学的な意味か
ら、活性なＣＳプロテインの３次元立体配置に、より似
通っていると思われる。
【００４６】組換え工作（抗原性化）ｙ1ＮＡＮＰ抗体
を抗ＮＡＮＰ抗体の誘導に利用できるかどうかを調べる
ためにウサギでインビボ実験を行なった。２匹のウサギ
を工作（抗原性化）したｙ1ＮＡＮＰ抗体で免疫し、２
匹の対照にはＷＴＩｇを与えた。
を抗ＮＡＮＰ抗体の誘導に利用できるかどうかを調べる
ためにウサギでインビボ実験を行なった。２匹のウサギ
を工作（抗原性化）したｙ1ＮＡＮＰ抗体で免疫し、２
匹の対照にはＷＴＩｇを与えた。
【００４７】下記の表２および関連する記載に示すよう
に、最初の接種から３０日という早期に、ｙ1ＮＡＮＰ
抗体で免疫した２匹のウサギがＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ
の両方で検出可能な抗体を産生していた。ブースター接
種の後、両方のウサギの力価が上昇し、最大値は７０日
目の１／３２００であった。重要なことは、この抗血清
はマラリア原虫スポロゾイトによる間接免疫蛍光法で試
験すると陽性であり、ｙ1ＮＡＮＰＩｇにより発現され
たエピトープが天然の抗原と全く同様の疑似作用をする
ことを示した。ＷＴＩｇを接種された対照ウサギからの
血清はマイクロタイターウェルに固定化された（ＮＡＮ
Ｐ）3ペプチド、あるいは原虫のいずれとも反応しなか
った。ヒトガンマグロブリンで被覆した赤血球の凝集に
より測定した結果、両群のウサギには抗ヒト応答が産生
していた。ウサギ抗血清を１０％ウシ胎児血清の存在
下、スライドガラス上で乾燥したマラリア原虫（P. fal
ciparum strain Indochina III）を用いて直接免疫蛍光
法で試験した。
に、最初の接種から３０日という早期に、ｙ1ＮＡＮＰ
抗体で免疫した２匹のウサギがＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ
の両方で検出可能な抗体を産生していた。ブースター接
種の後、両方のウサギの力価が上昇し、最大値は７０日
目の１／３２００であった。重要なことは、この抗血清
はマラリア原虫スポロゾイトによる間接免疫蛍光法で試
験すると陽性であり、ｙ1ＮＡＮＰＩｇにより発現され
たエピトープが天然の抗原と全く同様の疑似作用をする
ことを示した。ＷＴＩｇを接種された対照ウサギからの
血清はマイクロタイターウェルに固定化された（ＮＡＮ
Ｐ）3ペプチド、あるいは原虫のいずれとも反応しなか
った。ヒトガンマグロブリンで被覆した赤血球の凝集に
より測定した結果、両群のウサギには抗ヒト応答が産生
していた。ウサギ抗血清を１０％ウシ胎児血清の存在
下、スライドガラス上で乾燥したマラリア原虫（P. fal
ciparum strain Indochina III）を用いて直接免疫蛍光
法で試験した。
【００４８】ＮＡＮＰ特異的モノクローナル抗体の結合
部位をタンパク質表面相互作用のプローブとして用いて
行ったインビトロ実験、および工作されたＩｇ分子を用
いて免疫したウサギのインビボ実験で、マラリア原虫抗
原と反応性の抗ＮＡＮＰ抗体が産生され、このことは工
作（抗原性化）されたＩｇによって発現された（ＮＡＮ
Ｐ）3エピトープが抗原性および免疫性であることを証
明するものである。
部位をタンパク質表面相互作用のプローブとして用いて
行ったインビトロ実験、および工作されたＩｇ分子を用
いて免疫したウサギのインビボ実験で、マラリア原虫抗
原と反応性の抗ＮＡＮＰ抗体が産生され、このことは工
作（抗原性化）されたＩｇによって発現された（ＮＡＮ
Ｐ）3エピトープが抗原性および免疫性であることを証
明するものである。
【００４９】マラリア原虫の肝臓細胞への侵入に対する
抗体の阻害活性をインビトロマラリア原虫侵入（ＩＳ
Ｉ）テストにより試験した。[ホリンダールら（Holling
dale,et al.）, Journal of Immunology 132:909 (198
4)]。簡単に述べると、ＤＩＧフラクションの血清を連
続希釈しHep62-A16細胞培養に加えた。スポロゾイトを
細胞培養と一緒にインキュベーションした。固定化培養
を種特異的なモノクローナル抗体で染色した後、P.falc
iparumおよびP.vivaxの付着および侵入を調べた。対照
培養には野生型［ＷＴ］キメラタンパク質で免疫したウ
サギから得た血清またはＩＧ画分を与えた。ｙ１ＮＡＮ
Ｐで免疫したウサギのＩＧ画分のＩＳＩ活性は、ウサギ
内で、破傷風毒素と結合した（ＮＡＮＰ）3ペプチドに
よって引き起こされた精製ＩｇのＩＳＩ活性に匹敵する
ものであり、これもまた本発明のエピトープの免疫原性
を示すものである。
抗体の阻害活性をインビトロマラリア原虫侵入（ＩＳ
Ｉ）テストにより試験した。[ホリンダールら（Holling
dale,et al.）, Journal of Immunology 132:909 (198
4)]。簡単に述べると、ＤＩＧフラクションの血清を連
続希釈しHep62-A16細胞培養に加えた。スポロゾイトを
細胞培養と一緒にインキュベーションした。固定化培養
を種特異的なモノクローナル抗体で染色した後、P.falc
iparumおよびP.vivaxの付着および侵入を調べた。対照
培養には野生型［ＷＴ］キメラタンパク質で免疫したウ
サギから得た血清またはＩＧ画分を与えた。ｙ１ＮＡＮ
Ｐで免疫したウサギのＩＧ画分のＩＳＩ活性は、ウサギ
内で、破傷風毒素と結合した（ＮＡＮＰ）3ペプチドに
よって引き起こされた精製ＩｇのＩＳＩ活性に匹敵する
ものであり、これもまた本発明のエピトープの免疫原性
を示すものである。
【００５０】異なるＭＨＣ（Ｈ２）ハプロタイプ（単相
群）（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈ２b、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｈ２d、
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ−Ｈ２KおよびＳＪＬ−Ｈ２S）のマウスに
ミョウバン中のｙ１ＮＡＮＰ５０μｇを腹腔内投与
（ｉ．ｐ．）した。３０日後にブースター注射した。ブ
ースター注射の１０日後に血清試料を採取した。同じ血
清ハプロタイプの対照動物に野生型（ＷＴ）キメラタン
パク質を接種した。免疫法の概略は以下のとおりであ
る。
群）（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｈ２b、ＢＡＬＢ／ｃ−Ｈ２d、
Ｃ３Ｈ／Ｈｅ−Ｈ２KおよびＳＪＬ−Ｈ２S）のマウスに
ミョウバン中のｙ１ＮＡＮＰ５０μｇを腹腔内投与
（ｉ．ｐ．）した。３０日後にブースター注射した。ブ
ースター注射の１０日後に血清試料を採取した。同じ血
清ハプロタイプの対照動物に野生型（ＷＴ）キメラタン
パク質を接種した。免疫法の概略は以下のとおりであ
る。
【００５１】 −２日： 免疫処置前採血 ０日： 免疫処置 ２９日： 免疫処置後の採血 ３０日： 第１回ブースター ４０日： 第１回ブースター後採血 ８０日： 第２回ブースター前採血および第２回ブースター ９０日： 第２回ブースター後採血 第２回ブースター処置後１０日目に血清を採取した。実
験群および対照群から得た血清試料をＫ Ｋ（ＮＡＮ
Ｐ）3（５μｇ／ｍｌ）でコーティングしたマイクロタ
イタープレート上で、ビトロネクチン、およびＮＡＮＰ
に無関係な親抗体のＣＤＲ2およびＣＤＲ3ドメイン、の
アミノ酸配列に基づく他のペプチドを対照として用いて
ＥＬＩＳＡ法で試験した。各種の個々のマウスの抗体価
を表１に示す。データは、工作（抗原性化）されたｙ１
ＮＡＮＰが種々のＭＨＣ−ハプロタイプの動物で抗ＮＡ
ＮＰ体液性免疫を惹起し得ることを示している。
験群および対照群から得た血清試料をＫ Ｋ（ＮＡＮ
Ｐ）3（５μｇ／ｍｌ）でコーティングしたマイクロタ
イタープレート上で、ビトロネクチン、およびＮＡＮＰ
に無関係な親抗体のＣＤＲ2およびＣＤＲ3ドメイン、の
アミノ酸配列に基づく他のペプチドを対照として用いて
ＥＬＩＳＡ法で試験した。各種の個々のマウスの抗体価
を表１に示す。データは、工作（抗原性化）されたｙ１
ＮＡＮＰが種々のＭＨＣ−ハプロタイプの動物で抗ＮＡ
ＮＰ体液性免疫を惹起し得ることを示している。
【００５２】
【表１】
【００５３】各種のマウス５匹をｙ１ＮＡＮＰまたは野
生型（ＷＴ）タンパク質のいずれかで免疫処置した。各
マウスの相対抗体力価は血清希釈度の逆数として得られ
る（ＮＡＮＰ、ｙ１ＮＡＮＰで免疫処置；ＷＴ、野生型
キメラタンパク質で免疫処置）。
生型（ＷＴ）タンパク質のいずれかで免疫処置した。各
マウスの相対抗体力価は血清希釈度の逆数として得られ
る（ＮＡＮＰ、ｙ１ＮＡＮＰで免疫処置；ＷＴ、野生型
キメラタンパク質で免疫処置）。
【００５４】実施例２ ＣＤ４様抗体、ｙ１ＣＤ４と称する、の製造法は実施例
１で用いた方法と同様である。簡単に述べると、ＶH６
２遺伝子領域に接続されたヒトＣＤ４の４２から４９ア
ミノ酸残基［ＳＦＬＴＫＧＰＳ］を含有するｙ１ＣＤ４
抗体をコードするベクターをＪ５５８Ｌ細胞にトランス
フェクションした。選択した細胞を抗体の産生に関して
スクリーニングし、ｙ１ＣＤ４抗体を培養上清ｍｌ当り
３０〜４０μｇの抗体を分泌する単離体から精製した。
非還元条件下におけるｙ１ＣＤ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥは
見掛けの分子量約１６０ｋＤを示していた。還元条件
下、このタンパク質は正しくＨ−およびＬ−鎖に分離
し、異種のＣＤ４配列がＨ−およびＬ−鎖の集合を妨げ
ないことが示された。
１で用いた方法と同様である。簡単に述べると、ＶH６
２遺伝子領域に接続されたヒトＣＤ４の４２から４９ア
ミノ酸残基［ＳＦＬＴＫＧＰＳ］を含有するｙ１ＣＤ４
抗体をコードするベクターをＪ５５８Ｌ細胞にトランス
フェクションした。選択した細胞を抗体の産生に関して
スクリーニングし、ｙ１ＣＤ４抗体を培養上清ｍｌ当り
３０〜４０μｇの抗体を分泌する単離体から精製した。
非還元条件下におけるｙ１ＣＤ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥは
見掛けの分子量約１６０ｋＤを示していた。還元条件
下、このタンパク質は正しくＨ−およびＬ−鎖に分離
し、異種のＣＤ４配列がＨ−およびＬ−鎖の集合を妨げ
ないことが示された。
【００５５】ｙ１ＣＤ４中のＣＤ４配列の存在を確認す
るために、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行な
った。マイクロタイターウェルを５μｇ／ｍｌのｙ１Ｃ
Ｄ４でコーティングした。ｙ１ＮＡＮＰでコーティング
したウエルを対照とした。ＣＤ４に対する一連のモノク
ローナル抗体（ＯＫＴ４、Ortho Pharmaceutical, Rath
way, New Jersey）を一次抗体として用い、125Ｉ標識ラ
ット抗マウスを第２抗体として用いた。表２に示すよう
に、ＯＫＴ４Ｄはｙ１ＣＤ４と強力かつ特異的に結合し
た。ウエスタンブロット分析により、ＲＩＡの結果を確
認するとともに、さらに、エピトープがｙ１ＣＤ４のＨ
−鎖のＯＫＴ４Ｄ残基によって認識されることを示し
た。他の抗体、特にＯＫＴ４Ａによる結合の欠如はＣＤ
４の残基４２から４９にＣＤ４のＩｇ結合部位が含まれ
るという可能性を除くものである。
るために、固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行な
った。マイクロタイターウェルを５μｇ／ｍｌのｙ１Ｃ
Ｄ４でコーティングした。ｙ１ＮＡＮＰでコーティング
したウエルを対照とした。ＣＤ４に対する一連のモノク
ローナル抗体（ＯＫＴ４、Ortho Pharmaceutical, Rath
way, New Jersey）を一次抗体として用い、125Ｉ標識ラ
ット抗マウスを第２抗体として用いた。表２に示すよう
に、ＯＫＴ４Ｄはｙ１ＣＤ４と強力かつ特異的に結合し
た。ウエスタンブロット分析により、ＲＩＡの結果を確
認するとともに、さらに、エピトープがｙ１ＣＤ４のＨ
−鎖のＯＫＴ４Ｄ残基によって認識されることを示し
た。他の抗体、特にＯＫＴ４Ａによる結合の欠如はＣＤ
４の残基４２から４９にＣＤ４のＩｇ結合部位が含まれ
るという可能性を除くものである。
【００５６】
【表２】
【００５７】抗体分子のＶH領域を工作（抗原性化）
し、関係のない分子のエピトープを含む１５アミノ酸残
基を発現させることができるという観察は異種エピトー
プを含有するＶH／ＣHポリペプチド鎖が適正に内因性Ｌ
鎖と集合して（Ｈ2Ｌ2）テトラマーを形成したことを示
し、このエピトープのＣＤＲ３への挿入が認容され、全
体のＩｇ折り畳み構造に影響しなかったことを示してい
る。本明細書記載の結果がエピトープ自身の性質による
ということを除外することはできなかったが、本研究に
基づき、組換えエピトープは、それが立体化学的に隣接
するＣＤＲ残基と適合する限り、挿入し、またはＣＤＲ
と置き換え、分子の表面に暴露されることを期待でき
る。本明細書記載の構築において（ＮＡＮＰ）3配列は
両端でアミノ酸ＶａｌおよびＰｒｏと隣接している。こ
れが挿入されたエピトープの各端でアンカーとなり安定
化に役立っているのかもしれない。Ｖａｌ残基のＣβ原
子およびＣγメチル基位置での大きい分枝は主鎖の柔軟
性を減少することにより阻害するかもしれない；Ｐｒｏ
の側鎖は主鎖の方へ曲がってそれを捕えるほとんど硬直
した側鎖を形成しているかもしれない。
し、関係のない分子のエピトープを含む１５アミノ酸残
基を発現させることができるという観察は異種エピトー
プを含有するＶH／ＣHポリペプチド鎖が適正に内因性Ｌ
鎖と集合して（Ｈ2Ｌ2）テトラマーを形成したことを示
し、このエピトープのＣＤＲ３への挿入が認容され、全
体のＩｇ折り畳み構造に影響しなかったことを示してい
る。本明細書記載の結果がエピトープ自身の性質による
ということを除外することはできなかったが、本研究に
基づき、組換えエピトープは、それが立体化学的に隣接
するＣＤＲ残基と適合する限り、挿入し、またはＣＤＲ
と置き換え、分子の表面に暴露されることを期待でき
る。本明細書記載の構築において（ＮＡＮＰ）3配列は
両端でアミノ酸ＶａｌおよびＰｒｏと隣接している。こ
れが挿入されたエピトープの各端でアンカーとなり安定
化に役立っているのかもしれない。Ｖａｌ残基のＣβ原
子およびＣγメチル基位置での大きい分枝は主鎖の柔軟
性を減少することにより阻害するかもしれない；Ｐｒｏ
の側鎖は主鎖の方へ曲がってそれを捕えるほとんど硬直
した側鎖を形成しているかもしれない。
【００５８】言い換えると、分子環境のみならずＩｇの
球状ホールディングのいずれも（ＮＡＮＰ）3エピトー
プの免疫学的構造を変化させなかった。生物学的見地か
ら、Ｉｇ分子に工作し挿入された（ＮＡＮＰ）3エピト
ープはホストＶHドメインのＣＤＲ３に好みにより（ア
ラカルト）挿入して構築されたイデオートと見ることが
できる。イデオタイプの免疫原性および免疫について起
こり得る事象であるイデオタイプネットワークを介する
免疫の誘導に関する既知文献［ジェルネ（Jerne）Ann.
Immunol（Paris）125, 373（1974）；コツェナーブら
（Cozenave et al.）, PNAS 74, 5122（1977）；アーバ
インら（Urbain, et al.）,PNAS 74, 5126（1977）；ボ
ナら（Bona et al.）, J. Exp. Med. 153, 951（198
1）］に基づいて、これらの結果は予め決定されたエピ
トープ特異性の免疫応答が分子用語（モレキュラーター
ム）で表わされ、インビトロで予測し得ることを示して
いる。この方法を利用してＢ−細胞エピトープをＴ−非
依存性にし、それがエピトープおよびＩｇ類の構造およ
び機能の分析のみならず、新規な抗体ワクチン、たとえ
ばペプチドを基盤とするワクチンに代わるもの、の開発
に有用であることを証明することができる。ワクチンの
製造はイムノグロブリン用に開発された、既知の広範囲
に及ぶ方法をそのまま用いることができる。
球状ホールディングのいずれも（ＮＡＮＰ）3エピトー
プの免疫学的構造を変化させなかった。生物学的見地か
ら、Ｉｇ分子に工作し挿入された（ＮＡＮＰ）3エピト
ープはホストＶHドメインのＣＤＲ３に好みにより（ア
ラカルト）挿入して構築されたイデオートと見ることが
できる。イデオタイプの免疫原性および免疫について起
こり得る事象であるイデオタイプネットワークを介する
免疫の誘導に関する既知文献［ジェルネ（Jerne）Ann.
Immunol（Paris）125, 373（1974）；コツェナーブら
（Cozenave et al.）, PNAS 74, 5122（1977）；アーバ
インら（Urbain, et al.）,PNAS 74, 5126（1977）；ボ
ナら（Bona et al.）, J. Exp. Med. 153, 951（198
1）］に基づいて、これらの結果は予め決定されたエピ
トープ特異性の免疫応答が分子用語（モレキュラーター
ム）で表わされ、インビトロで予測し得ることを示して
いる。この方法を利用してＢ−細胞エピトープをＴ−非
依存性にし、それがエピトープおよびＩｇ類の構造およ
び機能の分析のみならず、新規な抗体ワクチン、たとえ
ばペプチドを基盤とするワクチンに代わるもの、の開発
に有用であることを証明することができる。ワクチンの
製造はイムノグロブリン用に開発された、既知の広範囲
に及ぶ方法をそのまま用いることができる。
【００５９】
【表３】
【００６０】ａ：成熟白兎の背部の数箇所に、完全フロ
インドのアジュバント（ＣＦＡ）に懸濁した５０μｇの
組換えｙ１ＮＡＮＰまたはＷＴ抗体を皮下注射し、感染
させた。１ヶ月おきに、不完全フロインドアジュバント
に懸濁した同じ免疫原５０μｇを用いてブースター注射
を行なった（＊で示した）。記載の日に血清を採取し、
合成（ＮＡＮＰ）3ペプチドとの反応性を固相ＥＬＩＳ
ＡおよびＲＩＡにより試験した。簡単に述べると、各血
清の、１％ウシ血清アルブミンおよび１％Ｔｗｅｅｎ２
０を含有するリン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．３中連続２
倍希釈液を、０．９％ＮａＣｌ中５μｇ／ｍｌ（ＮＡＮ
Ｐ）3ペプチドで被覆したマイクロタイタープレート上
において、＋４℃で一夜インキュベーションした。イン
キュベーション後、プレートを洗浄し、西洋ワサビ標識
ヤギ抗ウサギＩｇまたは125Ｉ標識プロテインＡ（Amers
ham）のいずれかと室温で１時間インキュベーションし
た。次いで、プレートを洗浄し結合した抗体をＢｉｏ−
Ｒａｄ（Richmond, CA）ＥＬＩＳＡリーダーまたはガン
マカウンターで計測した。免疫前血清の結合を対照バッ
クグラウンド値（reference background）とした。力価
は３試料に関して得たバックグラウンド結合を差し引い
た後の値の平均値として求め、血清濃度の逆数として表
わした。
インドのアジュバント（ＣＦＡ）に懸濁した５０μｇの
組換えｙ１ＮＡＮＰまたはＷＴ抗体を皮下注射し、感染
させた。１ヶ月おきに、不完全フロインドアジュバント
に懸濁した同じ免疫原５０μｇを用いてブースター注射
を行なった（＊で示した）。記載の日に血清を採取し、
合成（ＮＡＮＰ）3ペプチドとの反応性を固相ＥＬＩＳ
ＡおよびＲＩＡにより試験した。簡単に述べると、各血
清の、１％ウシ血清アルブミンおよび１％Ｔｗｅｅｎ２
０を含有するリン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．３中連続２
倍希釈液を、０．９％ＮａＣｌ中５μｇ／ｍｌ（ＮＡＮ
Ｐ）3ペプチドで被覆したマイクロタイタープレート上
において、＋４℃で一夜インキュベーションした。イン
キュベーション後、プレートを洗浄し、西洋ワサビ標識
ヤギ抗ウサギＩｇまたは125Ｉ標識プロテインＡ（Amers
ham）のいずれかと室温で１時間インキュベーションし
た。次いで、プレートを洗浄し結合した抗体をＢｉｏ−
Ｒａｄ（Richmond, CA）ＥＬＩＳＡリーダーまたはガン
マカウンターで計測した。免疫前血清の結合を対照バッ
クグラウンド値（reference background）とした。力価
は３試料に関して得たバックグラウンド結合を差し引い
た後の値の平均値として求め、血清濃度の逆数として表
わした。
【００６１】以上、本発明の実施に用い得る具体的な方
法を詳細に述べた。イムノグロブリンの同定、単離、特
性化、調製および使用において初めて用いた本発明方法
が具体的に記載されており、さらに特定のモデル物質も
開示されているので、当業者は同じ情報を得、その情報
を他の種内および種間の関連イムノグロブリンに拡張す
るための、他の信頼し得る方法を工夫する方法を知るこ
とができる。上記のごとく、本明細書において詳しい内
容が見られるが、それは本発明の全範囲を限定するもの
ではなく、本発明範囲は特許請求の範囲の法的解釈によ
ってのみ、支配されるものである。
法を詳細に述べた。イムノグロブリンの同定、単離、特
性化、調製および使用において初めて用いた本発明方法
が具体的に記載されており、さらに特定のモデル物質も
開示されているので、当業者は同じ情報を得、その情報
を他の種内および種間の関連イムノグロブリンに拡張す
るための、他の信頼し得る方法を工夫する方法を知るこ
とができる。上記のごとく、本明細書において詳しい内
容が見られるが、それは本発明の全範囲を限定するもの
ではなく、本発明範囲は特許請求の範囲の法的解釈によ
ってのみ、支配されるものである。
【００６２】 配列表 出願人氏名：プロジェンテック ソサイテ ユーロピーネ デ テクノロジー バイオメディカルズ ホールディング エス．エー． 発明の名称：遺伝的に工作されたイムノグロブリン 整理番号：１００５４０２ 出願日：平成１２年１２月 ５日 優先権主張の国名：アメリカ合衆国 優先日：１９８９年 ２月２４日 優先権番号：３１６１４４ 配列の数：５ 配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GGGGCCAGTG GATAGAC 配列番号：２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： CAAGAAAGGT ACCCTACTCT C 配列番号：３ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GTACCCAATG CAAACCCAAA TGCAAACCCA AATGCAAACC CA 配列番号：４ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GGTTACGTTT GGGTTTACGT TTGGGTTTAC GTTTGGGTCA TG 配列番号：５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列： GACGTGAAGC TGGTG
【図１】 ｐＮｙ１ＮＡＮＰ発現ベクターの構築図であ
る。
る。
【図２】 ｙ１ＮＡＮＰおよびＷＴ組換えＩｇのＳＤＳ
−ＰＡＧＥである。
−ＰＡＧＥである。
【図３】 工作された抗体ｙ１ＮＡＮＰに対する125Ｉ
標識モノクロナール抗体Ｓｐ３−Ｂ４の結合を示す図で
ある。
標識モノクロナール抗体Ｓｐ３−Ｂ４の結合を示す図で
ある。
【図４】 工作された抗体ｙ１ＮＡＮＰに対する125Ｉ
標識抗体Ｓｐ３−Ｂ４のウエスタンブロット結合を示す
図および工作された（ＮＡＮＰ）3エピトープのＨ鎖内
での局在を示す図である。
標識抗体Ｓｐ３−Ｂ４のウエスタンブロット結合を示す
図および工作された（ＮＡＮＰ）3エピトープのＨ鎖内
での局在を示す図である。
【図５】 125Ｉ標識抗体Ｓｐ−３−Ｂ４と、合成ペプ
チド（ＮＡＮＰ）3（パネルＡ）または工作された抗体
ｙ１ＮＡＮＰ（パネルＢ）との結合の、ｙ１ＮＡＮＰＩ
ｇまたはペプチド（ＮＡＮＰ）3による交差阻害を示す
図である。
チド（ＮＡＮＰ）3（パネルＡ）または工作された抗体
ｙ１ＮＡＮＰ（パネルＢ）との結合の、ｙ１ＮＡＮＰＩ
ｇまたはペプチド（ＮＡＮＰ）3による交差阻害を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ０７Ｋ 19/00 37/08 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ソラッツォ，マウリジオ アメリカ合衆国カリフォルニア 92037 ラ・ジョラ、ダウリング・ドライブ 6266番 (56)参考文献 英国特許出願公開2188638（ＧＢ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，1985年９月20日，Ｖ ｏｌ．229，1202−1207 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 39/395 C07K 16/00 - 16/46 C07K 19/00 C12N 5/00 - 5/28 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 そのＮ末端可変部のＣＤＲに少なくとも
１個の免疫原性の異種エピトープを有し、特定の細胞／
レセプター型に特異的なＨ鎖のＣ末端定常領域に関する
機能性を保持しており、該エピトープに対する特異的な
反応性を誘導する能力を有するイムノグロブリン分子を
コードする組換えＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子である
ＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 該イムノグロブリンのＨ鎖をコードする
請求項１のＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 合成産物としての請求項１のＤＮＡ分
子。 - 【請求項４】 請求項１または２で定義されたイムノグ
ロブリンをコードするＤＮＡを機能的に有する発現ベク
ター。 - 【請求項５】 請求項４の発現ベクターでトランスフェ
クションされた組換え宿主細胞。 - 【請求項６】 そのＮ末端可変部のＣＤＲに少なくとも
１個の免疫原性の異種エピトープを有し、特定の細胞／
レセプター型に特異的なＨ鎖のＣ末端定常領域に関する
機能性を保持しており、該エピトープに対する特異的な
反応性を誘導する能力を有するイムノグロブリン分子を
コードするＤＮＡでトランスフェクションされた組換え
宿主細胞で該ＤＮＡを発現させることからなるイムノグ
ロブリン分子の製造方法。 - 【請求項７】 該ＤＮＡが該イムノグロブリン分子のＨ
鎖をコードしている請求項６の製造方法。
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