JPH05508779A - リンパ球機能関連抗原３のｃｄ２結合ドメイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

リンパ　３のＣＤ２Ａドメイン 本発明は、リンパ球機能関連抗原３　（ｒＬＦＡ−３Ｊ　”）のＣＤ２結合ドメ インを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および該ポリペプチドを発 現するための組換えＤＮＡ配列に関する。本発明に従って、該ＤＮＡ配列、およ びこれらのＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子によって形質転換された単細胞の 宿主が調製され得、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインを有するタンパク質および ポリペプチドを生産するのに使用され得る。本発明のペプチド、ポリペプチド、 およびタンパク質はＣＤ２とＬＦＡ−３との間の相互作用の研究、診断および治 療用の組成物、抗体のスクリーニング法あるいは精製法、および本発明の他の方 法に有用である。 光朋ヱｌ虹最 Ｔ−Ｕンバ球は、標的細胞および抗原提示細胞と相互作用することによって、免 疫反応において重要な役割を果たしている。Ｔ−リンパ球に仲介された標的細胞 の死滅は、細胞溶解性Ｔ−リンパ球の標的細胞への付着を包含する多段階の作用 である。はとんどの抗原に対する免疫反応の開始は、ヘルパーＴ−リンパ球の抗 原提示細胞への付着を包含する。 Ｔ−リンパ球と標的細胞および抗原提示細胞とのこれらの相互作用は非常に特異 的であり、Ｔ−リンパ球表面にある多数の特異的抗原レセプターの１つによって 、標的細胞または抗原提示細胞上の抗原を認識することに依存する。 Ｔ−リンパ球と他の細胞とのレセプター−抗原相互作用は、例えば抗原−レセプ ター複合体であるＣＤ３およびアクセサリ−分子であるＣＤ４、ＬＦＡ−１、Ｃ Ｄ８、およびＣＤ２のような、種々のＴ−リンパ球表面タンパク質によって促進 される。Ｔ−リンパ球と他の細胞との相互作用は、ＩｃＡＭ−１、ＭＨＣクラス Ｉおよび■、およびＬＦＡ−３のような標的細胞または抗原提示細胞の表面で発 現するアクセサリ−分子に依存し、それ故にこのアクセサリ−分子は、１〜９７ ３球の作用において一定の役割を担っている。 一般的な仮説では、Ｔ−リンパ球、および標的細胞あるいは抗原提示細胞上のア クセサリ−分子は、細胞間付着を仲介するために互いに相互作用する。従って、 これらのアクセサリ−分子は、リンパ球／抗原提示細胞、およびリンパ球／標的 細胞の間の相互作用の効率を高めると考えられ、また細胞での付着に基づく病理 （例えば、病理学的炎症を引き起こすリンパ球／内皮細胞相互作用）およびリン パ球再循環に重要であると考えられている。アクセサリ−分子はまた、リンパ球 の活性化にも関連している。 アクセサリ−分子に仲介される細胞−細胞間の相互作用の重要な例には、　ＣＤ ２　（Ｔ−リンパ球アクセサリ−分子）とＬＦＡ−３（標的細胞アクセサリ−分 子）との間の特異的な相互作用がある。ＣＤ２／ＬＦＡ−３結合は、Ｔ−リンパ 球の機能的応答の開始を含む、多くの重要な細胞−細胞間反応の本質であると考 えられる　（Ｄｕｓｔ　ｉｎら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、、１６５．　ｐｐ、６７ ７−９２　（１９８７）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｎ＋ｍｕｎ ｏＬ、、　５−１ｐｐ、２２３−５２　（１９８７））　。 細胞−細胞付着におけるＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体の重要性は、Ｔ−ＩＪンパ球 球面面上ＣＤ２に精製ＬＦ＾−３が結合すること（Ｄｕｓｔ　ｉｎら、Ｌ−り旦 、基０１．出、　ｐｐ、　６７７−９２　（１９８７））　、Ｔ−リンパ球から 精製したＣＤ２が細胞表面のＬＦＡ−３に結合し、モしてＬＦＡ−３に特異的な モノクローナル抗体（ｒＭＡｂｓＪ　）のＬＦＡ−３への結合を阻害すること（ ５ｅｌｖａｒａｊら、Ｎａｔｕｒｅ、　３２６．　ｐｐ、　４００−４０３　（ １９Ｂ？））、およびＬＰＡ−３を発現するヒト赤血球のＣＤ２を発現する細胞 へのロゼツト形成が抗ＬＦＡ−３のＭＡｂｓおよび抗ＣＤ２のＭＡｂｓによって 阻害されること（例えば、５ｅｅｄら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．　ｐｐ、　３３６５−６９　（１９Ｂ？）参照）の知 見により指摘されている。 ＬＦＡ−３は、単球、顆粒球、Ｔ−リンパ球、赤血球、Ｂ−リンパ芽球細胞系、 胸腺上皮細胞および血管内皮細胞を含む広範囲にわたる細胞の表面に見い出され るもので、種々のトリンパ球相互作用においてその果たす役割をさらに明確にす るための、相当な数の研究の主題になっている。ＬＦＡ−３の２種の天然の形態 が同定されている。ＬＦＡ−３の一つの形態（「トランスメンブランＬＦ＾−３ 」）はトランスメンブラン疎水性ドメインによって細胞膜に固定される。この形 態のＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡは、クローニングされ配列決定されている （例えば、Ｗａｌｌｎｅｒら、ムーム１，１回＋Ｌ＋’　！ｊｉ、　Ｉ）り、　 ９２３−３２　（１９８７）参照）。ＬＦＡ−３のもう一方の形態は、フォスフ ァチジルイノシトール（ｒＰＩＪ　）含有糖脂質に共有結合を介して細胞膜に固 定される。後者の形態は、ｒＰＩ結合ＬＦＡ−３Ｊと称され、この形態のＬＦＡ −３をコードするｃＤＮＡもクローニングされ、配列決定されている（　Ｗａｌ 　１ｎｅｒら、ＰＣＴ特許出願Ｎｏ　９０１０２１８１）。　ＬＦＡ−３遺伝子 のＤＮＡ配列およびＬＦＡ−３の両方の形態の一次アミノ酸配列は決定されてい るが、ＬＦＡ−３とそのレセプターであるＣＤ２との間の相互作用の事実上の部 位は、まだ同定されていない。ＣＤ２とＬＦＡ−３との間の特異的な相互作用を より理解し、それによってＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体の形成に依存する細胞的お よび免疫学的な過程に効果を及ぼし調節するために、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ド メインを同定する必要がある。そのような情報はまた、診断用および治療用の組 成物、タンパク質の精製、抗体の同定と精製、お、よびＬＦＡ−３と他のタンパ ク質との比較的および構造的研究を含む他の種々の適用に有用である。 及五旦ＭＪＬ’ 本発明は、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインを同定し、モしてＬＦＡ−３のＣＤ ２結合領域を限定するヌクレオチド配列、およびこれらの配列によってフードさ れるＣＤ２結合ポリペプチドを提供することにより前述の必要性に取り組む。本 発明は、アミノ酸配列、Ｘｌ−Ｘ２−　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１）　Ａｓｎ　 Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ− Ｙ：ここで Ｘ、は水素あるいはメチオニル、 ｘ２はもし存在するならば、以下のアミノ酸配列（ＳＥｏ　１ＯＮＯ：５）　す るいは該配列のカルボキシ末端からの１から７７個までのアミノ酸からなる、該 配列の一部分を有するポリペプチドＶａｌ　入１ａ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　入ｓｐ　 入１ａＹはヒドロキシル、あるいは以下のアミノ酸配列（ＳＥｏ　１ＯＮＯ＋３ ３）あるいは該配列の７ミノ末端からの１から３２までのアミノ酸からなる、該 配列の一部分を有するポリペプチド：およびそのアナログならびに誘導体である ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドはＣＤ２に結合し得る。 別の実施態様においては、本発明のポリペプチドは以下のアミノ酸配列、　Ｘｌ −Ｘ２−　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋ｌ）　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ−Ｙ；ここでＸ、は水素または メチオニル、 ｘ２はもし存在するならば、以下のアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０・２）ある いは該配列のカルボキシ末端からの１から５０個までのアミノ酸配列からなる、 該配列の一部分を有するポリペプチド’　Ｐｈａ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎ工ｌ ｅ　ＴｙｒＰｈａ　Ｌｙｓ； Ｙはヒドロキシル、あるいは以下のアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０＋３）ある いは該配列のアミノ末端からの１から１０個までのアミノ酸からなる、該配列の 一部分を有するポリペプチド；Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ａｓ ｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ；およびそのアナログならびに誘導体であ るポリペプチドを提供し、該ポリペプチドはＣＤ２に結合し得る。 本発明はまた、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列 を含む組換え分子、これらのＤＮＡ配列および分子によって形質転換された宿主 、および該ポリペプチドを組換えにより合成的に、あるいは半合成的に生産する 方法を提供する。 本発明のポリペプチドは、特定の細胞の表面にＣＤＺが存在するか否かによって 特徴づけられる病気の診断に有用であり、ＬＦＡ−３／ＣＤ２複合体の形成に依 存する病態の治療に有用である。 本発明のポリペプチドおよびそれらをコードするＤＮＡ配列はまた、組換えある いは合成による融合タンパク質を調製するのに用いられ得、該融合タンパク質は 上述のＬＦＡ−３の機能的ＣＤ２結合ドメインあるいはポリペプチド、およびＬ ＰＡ−３以外のタンパク質あるいはポリペプチドの他のドメインを含有する。 この融合タンパク質のＣＤ２結合ドメイン部分は、他のポリペプチドを、ＣＤ２ を発現する細胞（ＣＤ２”細胞）の特異的な標的にし得る。これらの融合タンパ ク質をコードするＤＮＡ配列も、本発明の一部である。 本発明のそのような融合タンパク質の一つの例は、上述のように機能的ＣＤ２結 合ドメインを含むＬＰＡ−３の一部分を含有する新規な融合タンパク質であり、 イム／グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域の少な（とも一部分に融合される。意外に も、本発明のＬＦＡ−３−Ｉｇ融合タンパク質は、Ｔ−リンパ球活性化および末 梢血リンパ球の分裂増殖を抑制する。 本発明のさらなる局面では、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、例 えば可溶性ＣＤ２のようなＣＤ２分子を溶液中でまたはＴ−リンパ球あるいは他 のＣＤ２発現細胞の表面上で標識するために使用し得る。本発明のポリペプチド および融合タンパク質は、例えば組換えＤＮＡ技術を用いて生成された融合タン パク質中の、ＬＦＡ−３に結合するＣＤ２ドメインを含むあらゆるタンパク質、 ポリペプチド、あるいはペプチドを標識するために使用し得る。 本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＣＤ２あるいはＬＦＡ−３に結 合するＣＤ２のドメインを含む任意の他のポリペプチドあるいはタンパク質の複 合体を精製するための、アフィニティークロマトグラフィーに使用し得る。 本発明はさらに、ＣＤ２結合ドメインを欠（改変された型（変異体）のＬＦＡ− ３タンパク質、およびそのような「欠失変異」体ＬＦＡ−３をコードするＤＮＡ 配列を提供する。上述のＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインを欠く変異タンパク質 は、インビボあるいはインビトロで、ＬＦＡ−３上のＣＤ２結合ドメイン以外の エピトープまたＩｔ部位を認識する抗体あるいは他の分子を生成させ、あるいは 結合させるために使用し得る。 米発明のＣＤ２結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の単量体形態に加えて、 多量体形態もまた本発明により得ることが可能である。そのような形態はＣＤ２ に対する親和性を高め、ＣＤｚ／１ＦＡ−ｓ１合体のより効果的な多量体化によ り免疫性を高め、および／または、例えばＴ−細胞活性化の刺激のようなＴ−リ ンパ球機能的応答を開始する能力を高める。さらに、そのような多量体形態は、 ＣＤ２の競合的結合においてより効果的であり得、そのことにより多量体形態は 免疫抑制剤としてより有用で、診断薬あるいは試薬としてより鋭敏である。 さらに本発明は、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質を認識する抗体を 意図している。本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質に対するポリクロー ナルおよびモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドあるいは融合タンパク 質で動物を免疫することにより得られる。 低分子量（一般的に１０００ダルトンより小さい）のＣＤ２／ＬＰＡ−３複合体 形成の阻害剤もまた、本発明によって提供される。そのような「分子量の小さい 」阻害剤は、合成的方法によってインビトロで生産され得、本発明のポリペプチ ドのアミノ酸配列の部分を含有し得、あるいは本発明のポリペプチドおよび融合 タンパク質のＣＤ２に対する結合特異性を模倣し得る高次構造を有する、全くの 非ペプチジル有機分子で有り得る。 本発明はさらに、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインの存在あるいは非存在を知る ことが望まれる、診断上ならびに治療上の使用に供する方法、組成物、およびキ ットを提供する。 」ｉ旦！！星凰皿 図１（図ＩＡと図ＩＢは同時に用いられる）は、トランスメンブ５７ＬＦＡ−３ 表面（７）７ミ／酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯ）およびヌクレオチド配列 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋９）を示し、下線はＬＦＡ−３１７１細胞外領域ででき る欠失を示している。ＭＳ３、ＭＳ４、ＭＳ５、ＭＳ６、ＭＳ？、Ｍ２Ｓ、ＭＳ ９、ＭＳ０、Ｍ［ｔｌ、ＭＳ２、ＭＳ３、ＭＳ４、ＭＳ５、ＭＳ６、Ｍ２Ｏ，Ｍ ９１゜およびＭ９２で示される部分は各々ループアウトして、１７個の別々の欠 失変異をコードする組換え遺伝子を産生ずる。哺乳動物細胞における欠失変異体 の発現により、天然のＬＦＡ−３タンパク質に存在するアミノ酸セグメントを欠 く変異したＬＦＡ−３表面タンパク質が生成された。例えば、ＣＨＯにおけるＭ Ｓ７として示される欠失変異の発現（これは図１のＬＦＡ−３ＤＮＡのＭ５７領 域を欠失させたものである）により、ＣＤ２に結合しない変異体ＬＦＡ−３を得 る。アミノ末端メチオニン（Ｍｅｔ）は、ブレＬＦＡ−３の２８個のアミノ酸か らなるシグナルペプチド配列の７ミノ末端残基であることを表すために、−２８ と示す。成熟ＬＦＡ−３の７ミノ末端残基はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり 、＋ｌと示す。 図２（図２Ａ、２Ｂ、　２Ｃ１２Ｄ、　２Ｅ、２Ｆ、　２Ｇ、２）！、　２１． ２Ｊ、　２に、　２Ｌ、２Ｍ、および２Ｎは、同時に用いられる）は、欠失変異 Ｍ５７（図２Ａおよび２Ｂ）　、　ＭＳ５　（図２０および２Ｄ）　、ＭＳ３　 （図２Ｅおよび２Ｆ）、ＭＳ４　（図２Ｇおよび２Ｈ）　、ＭＳ５　（図２１お よび２Ｊ）　、ＭＳ６　（図２におよび２Ｌ）、およびＭＳ８（図２Ｍおよび２ Ｎ）によりコードされたＬＦＡ−３の変異形態を発現する、トランスフェクトさ れたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析による免疫蛍光フローサイトメトリーの結果を示 しでいる。トランスフェクトされた細胞を、抗ＬＦＡ−３ポリクローナル抗血清 である２０２（図２Ａ、２Ｇ、　２Ｅ、２Ｇ、　２１．２に、　２Ｍの破線）、 抗ＬＦＡ−３ＭＡｂであるＴＳ２／９　（図２Ｂ、　２Ｄ、　２Ｆ、　２Ｈ，２ Ｊ、　２Ｌ。 ２Ｎの破線）、あるいは抗ＬＦＡ−３ＭＡｂである７Ａ６（図２８．２Ｄ、　２ Ｆ。 ２Ｈ，２Ｊ、　２Ｌ、２Ｎの点線）と反応させた。各分析において、コントロー ルのピーク（実線）は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）複合ヤギ抗 マウスＩｇＧあるいはヤギ抗つサギＩｇＧ結合のバックグラウンドレベルでの細 胞集団を示す。 図３（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは同時に用いられる）は、ジャーカプト細胞結合 実験の結果を示す。光学顕微鏡写真はＣＤ２を発現するジャーカット細胞と正常 ＣＩ（Ｏ細胞（陰性コントロール）との混合（図３Ａ）　、ＭＳ７／ＣＨＯ細胞 との混合（図３Ｂ）、およびＰＩ結合ＬＦＡ−３を発現するＰ２４／ＣＨＯ細胞 （陽性コントロール）との混合（図３Ｃ）を表す。 図４は、ＭＳ？／ＣＨＯ細胞において合成されるＬＦＡ−３遺伝子転写物のノー ザンゲル分析を示す。ＣＨＯ陰性コントロール細胞（レーン１）　、Ｍ５７／Ｃ ＨＯ細胞（レーン２）、およびＭ２Ｓ、　３／ＣＩＯ陽性コントロール細胞（レ ーン３）からのｍＲＮＡサンプルを含むフィルターを、プラスミドｐＬＦＡ３Ｍ Ｓ４のＮｏｔｌ制限フラグメントでプローブした。この制限プラスミドはＬＦＡ −３ｃＤＮＡ配列（図１１８）の１位から１５３位のおよび１８４位から１０４ ０位のヌクレオチドを含有し、ニックトランスレージジンにより３２ｐで標識さ れている。 図５は、１２５■で表面を標識したＭＳ　？／ＣＨＯ細胞（レーン１から４）、 正常ＣＨＯ細胞（陰性コントロール）（レーン５から７）、およびＰ２４／Ｃ■ ０細胞（陽性コントロール）（レーン８から１１）からのタンパク質の興なる免 疫沈降を示すオートラジオグラフィーを示している。表面を標識した細胞の溶解 産物を抗ＬＦＡ−３ＭＡｂであるＴＳ２／９　（レーンＺ、５．９）　、抗ＬＰ Ａ−３ＭＡｂである７Ａ６（レーン３．６．１０）、あるいは抗ＬＦＡ−３ポリ クローナル抗血清である２０２（レーン４．７．１１）と反応させた。抗体沈降 タンパク質を、オートラジオグラフィーに先だって５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上で電気泳動する。 図６（図６Ａおよび６Ｂは同時に用いられる）は、トランスメンブランＬＦＡ− ３のアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）およびヌクレオチド配列（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：９）を示し、下線はＬＰＡ−３の細胞外領域における欠失を示 す。Ｍｌｏｏ、ＭＩＯＩ、およびＭＩＯ２で示される部分はそれぞれ、ループア ウトして３個の別々の欠失変異体をコードする組換え遺伝子を産生じた。 図７（図７Ａ、　７Ｂ、　７Ｃおよび７Ｄは同時に用いられる）は、ＣＤ２を発 現するジャーカット細胞結合実験の結果を示しており、その実験でジャーカット 細胞は、（ａ）正常ＣＨＯ細胞、（ｂ）Ｍ１００／ＣＨＯ細胞、（ｃ）ＭＩＯ１ ／ＣＨＯ細胞、あるいは（ｄ）Ｍ１０２／ＣＨＯ細胞と混合された。 図８（図８Ａ、　８Ｂ、および８Ｃは同時に用いられる）は、ＬＦＯ８／Ａｆｆ ｉＧｅｌ−１０ビーズ（後述の実施例８を嘗照）によるジャーカット細胞結合を 示している。ＬＦＯ８／Ａｆｆ　１Ｇｅｌ−１０ビーズは、ジャーカット細胞と 混合し、細胞−ビーズ結合を顕微鏡で観察した（図８Ａおよび８Ｂ）。比較のた めに（陰性コントロール）、Ｂ型肝炎由来の非ＬＦＡ−３ペプチド（すなわち、 ｒＭＸＣＯｌｌ、（５ＥＱＩｔ）　ＮＯ：４） ｋ　ＬＹ！！　Ｐｒｏ　入！！ｐ　ＬａｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔ ｈｒ　Ｇｌｕ　Ａ！ＩＰ　ＬＹ！！　Ｖａｌ　Ｖａｌ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ 　入ｒｇをＡｆｆｉｇｅｌ−１０ビーズに固定し、ビーズをジャーカット細胞と る。 図９は、Ｐ１結合ＬＦＡ−３のアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）およ びヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）を示しており、下線はヌクレ オチド配列内でできる内部欠失、および対応する変異体であるＰ］結合ＬＦＡ− ３タンパク質を示す。Ｐ１Ｎ３と称するＤＮＡ領域は、ループアウトすることに よりＰＩ結合ＬＦＡ−３のＮ末端に８９アミノ酸を含むが、その後に続＜７１ア ミノ酸を欠く変異タンパク質をコードする組換え遺伝子を産生ずる。欠失変異体 ＰＩＭ３（これは、図９に示すＰＩ結合ＬＦＡ−３のＤＮＡでＰＩＭ３領域を欠 失させたもの）のＣＨＯ細胞における発現により、ＣＤ２結合ドメインを保持す るＰＩ結合ＬＦＡ−３の変異形態を得た。 図１０（図１０ＡおよびＩＯＢは同時に用いられる）は、欠失変異体ＰＩＭ３に よりコードされたＰ！結合ＬＦＡ−３の変異形態を発現するトランスフェクトさ れたＣ１１０細胞のＦＡＣ３分析による蛍光免疫フ細胞（Ｐ２Ｎ２．２５．２細 胞）は、抗ＬＦＡ−３ＭＡｂであるＴＳ２／９によつて認識され（図１ＯＡ、破 Ｉり　、ＰＩ−Ｐ（、Ｃ処理により細胞表面から容易に遊離される（図１ＯＡ、 点線）表面タンパク質を発現１した。 図１０Ｂは、変異ＰＩ結合タンパク質の発現のために増殖された、トランスフェ クトされたＣＨＯ細胞（Ｐ　１Ｍ２．２５．２．１００．１２細胞）を用いた同 様の分析結果を示す。これらの細胞は、ＭＡｂ　７Ａ６によって認識され（図ｉ ｏｓ、破線）　、Ｐｌ−ＰＬＯ処理により細胞表面から容易に遊離される（図１ ０Ｂ、点線）タンパク質を、自身の細胞表面に産生じた。各分析において、コン トロールノヒーク（実線）は、ＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ結合のバックグ ラウンドレベルでの細胞渠団を示す。 図１１は、ＬＦＡ３ＴＩＰの二量体の図解であり、このＬＦＡ−３−１ハ融合タ ンパク質の種々のドメインを示している。この図に示されるようにｒＬＦＡ−３ Ｊは、成熟ＬＦＡ−３のアミノ末端からの９２個のアミノ酸を示している。「） 」は、分子間ジスルフィド結合を形成する２個のシスティンを含有する、ＩｇＧ １ヒンジ領域の１０個のアミノ酸を示している。各ジスルフィド結合は、横書き の２個のＳＳとして示される。ｒＣ，２ＪおよびｒＣＨ３Ｊは、ヒトＩｇＧ１分 子においてヒンジ領域より下位のＦｃ領域に存在する２種の定常ドメインを示し ている。 図１２は、ブレＬＦＡ３ＴＩＰ　（すなわち、ＬＦＡ−３（アミノ酸＋１位から ＋９２位）と２８アミノ酸からなる／グナル配列）のアミノ酸配列（ＳＥｏ　１ ０　ＮＯ：４３）およびヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２）、およ び融合タンパク質の種々のドメインを示している。図１２のヌクレオチド配列も また、発現プラスミドであるｐｓＡＢ１５２におけるＤＮＡ配列挿入断片と同一 である。 −１３は、非還元下（レーンｌおよび２）および還元下（レーン３および４）条 件における５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルでのウェスタンプロット分析の写真である。１ ノーン１および３は高分子量マーカーである（ＢＲＩ４．　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）ｏ　Ｌ／−ン２および４は実施例１３に記載の方 法で精製されたＬＦＡ３ＴＩＰを含有する。 図１４（図１４Ａおよび１４Ｂは同時に用いられる）は、Ｒ−フィコエリトリン 複合抗ヒトＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２を加えたＬＦＡ３ＴＩＰとインキュベートし たジャーカット細胞のＦＡＣ３分析による免疫蛍光フローサイトメトリー（点線 ）であり、それぞれＦＪＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉ（＋Ｌ）　Ｆ（ａｂ’ ）２を加えた抗ＣＤ２　ＭＡｂであるＴＳ２７１ｇ存在下で実施したもの（図１ ４Ａの小さな点線）、あるいはＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　Ｆ （ａｂ’）２を加えた抗ＣＤ２腹水液Ｔ１１１（図１４Ａの破線）　、Ｔ１１２ 　（図１４８の破線）またはＴ１１３　（図１４Ｂの小さな点ｇＡ）存在下で実 施した結果である。 図１５は、Ｔ−細胞への３Ｈ−チミジン取り込みによって測定される、Ｔ−細胞 活性化に対するヒト同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイをそれぞれ抗ＬＦ Ａ−３ＭＡｂであるＩｇＧ（黒塗り四角）　、ＬＦＡ３ＴＩＰ　（黒塗り丸）、 および非特異的ヒ）　ＩｇＧ１　（黒塗り三角）存在下で行った結果を示してい る。 図１６ハ、選択したタンパク質によるＴ−細胞活性化の抑制に対するＭＬＲアフ セイの結果を示している。ｒ　７Ａ６ＪおよびｒｌＥ６」はＬＦＡ−３のＣＤ２ 結合ドメインに特異的な抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）である。 ｒＴＳ２／１８Ｊは抗ＣＤ２　ＭＡｂである。「ＬＦＡ３１ｇＧＡＪおよびｒ　 ＬＦＡ３１ｇＧ７２ＡＪは、精製度が異なる、すなわち各々７５％および５０％ であるＬＦＡ３ＴＩＰｌｉ製物である。ｈｌｇＧは非特異的ヒトＩｇＧである。 ｒＰＩ−ＬＦＡ３Ｊは、多量体のＰＩ結合ＬＦＡ−３である。ｒＣＤ４−１ｇＧ Ｊは、ＩｇＧのＦｃ領域部分に融合したＣＤ４タンパク質の一部分からなる融合 タンパク質である。ｒ　ｍｏｃｋＪは、ＬＦＡ３ＴＩＰをコードするＤＮＡ配列 を欠く発現ベクターｐｓＡＢ１３２でトランスフェクトされたＣＯＳ？細胞から 精製された「偽（モック）Ｉｌ製物」を示している。 図１７は、３Ｈチミジンの取り込みによって測定されるＰＢＬ増殖の結果を示し ている。ＰＢＬ増殖はそれぞれ、ＬＦＡ３ＴＩＰ　（黒塗り四角）、ヒトＩｇＧ 　（黒塗り丸）、およびこのアッセイに使用されるＬＦＡ３ＴＩＰをともに用い て精製される夾雑物質（「コンタミネーション」と表示）を含有する「偽調製物 」　（黒塗り三角）の存在下で測定される。 図１８は、３Ｈ−チミジンの取り込みによって測定される、０ＫＴ３（抗ＣＤ３ 　ＭＡｂと表示）依存ＰＢＬ増殖アッセイの結果を示している。　ＰＢＬ増殖は それぞれ、３ＨＭ　０ＫＴ３（ＯにＴ３）、ＬｎＭあるいは１０ｎＭのＬＰＡ３ ＴＩＦを加えた３ＨＭ　０ＫＴ３　（ＯＫＴ３＋ＬＦ＾３ＴＩＰと表示）　、１ ＨＭあるいはｌｏｎＭのヒトＩｇＧ１を加えた３ＨＭ　０ＫＴ３　（ＯにＴ３＋ ｂ　［ｇＧｌと表示）、あるいは０ＫＴ３の存在しない培地（培地と表示）の存 在下で測定する。 図１９は、最適以下のＰＨＡ刺激濃度（０，１ハｇ／ｍｌ）　、および最適のＰ ＨＡ刺激濃度（１ハｇ／ｍｌ）での、植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）依存ＰＢＬ 増殖アッセイの結果を示している。ＰＢＬ増殖は、図示されているようにＰＨＡ のみの存在下、およびＰＨＡとさらにＰ■結合ＬＦＡ−３（＋Ｐ［ＬＦＡ−３と 表示）、単量体の可溶性ＬＦＡ−３（＋ｗ＋ｏｎ　ＬＦＡ−３と表示）　、ＣＤ ２結合に関連するＬＦＡ−３の１０個のアミノ酸からなるＭＳ？領域を欠＜　Ｌ ＦＡ−３−ＩｇＧ融合タンパク質（＋Ｍ５７１ｇＧと表示）、抗ＬＦＡ−３１Ｅ ６　ＭＡｂ　（＋ＩＥ６と表示）、抗ＣＤＺ　ＴＳ２／ＩＩＩ　ＭＡｂ　（＋Ｔ Ｓ２／ｉｌｌと表示）、および完全な長さのＩ、ＦＡ−３−１ｇ１％！に合タン パク質（＋ＦＬ　Ｉ　ｇＧと表示）をそれぞれ加えた存在下で測定される。 添加される分子はそれぞれ、５ハｇ／ｍｌで存在していた。 １１旦！凰工凰ユ 本発明のポリペプチド、組成物、および方法は、次のようなアミノ酸配列、Ｘｌ −Ｘ２−　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１）　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ−Ｙを有するポリペプチドによ り特徴づけられる。；ここで Ｘ、は水素あるいはメチオニル ｘ２はもし存在するならば、以下のアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：５）ある いは該配列のカルボキシ末端からの１から７７個までのアミノ酸からなる、該配 列の一部分を有するポリペプチドＹはとドロキシル、あるいは以下のアミノ酸配 列（ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：３３）または該配列のアミノ末端からの１から３２個ま でのアミノ酸からなる、該配列の一部分を有するポリペプチド：５ａａｒ　Ｌａ ｕ　Ｔｈｒ　工１ｍ　Ｔｙｒ　入ｓｎ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　５ａｒＳａｒ　Ａｓｐ 　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ 　ｋｓｎ　工：ｔ＠ＴｈｒＡＳｐ　Ｔｈｒ　Ｍａｔ　Ｌｙ！ｉ　ｐｈａ　Ｐｈａ 　Ｌａｕ　ＴＹＴ　Ｖａｌ；およびそれらのアナログならびに誘導体であるポリ ペプチドによって特徴づけられ、該ポリペプチドはＣＤ２に結合し得る。 別の実施態様においては、本発明のポリペプチドは以下のアミノ酸配列、Ｘｌ− Ｘ２−　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ）　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｌｅ ｕＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ−Ｙを有し；ここでＸ、は水素また はメチオニル、 ｘ２はもし存在するならば、以下のアミノ酸配列（ＳＥｏ　１ＯＮＯ＋２）ある いは該配列のカルボキン末端からの１から５０個までのアミノ酸からなる、該配 列の一部分を有するポリペプチドＹはヒドロキシル、あるいは以下のアミノ酸配 列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：３）または該配列のアミン末端からの１から１０個まで のアミノ酸からなる、該配列の一部分を有するポリペプチド；Ｓａｒ　Ｌｅｕ　 Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ；および、 それらのアナログならびに誘導体であり、該ポリペａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇ ｌｕ、ａｓｐ、ａｌｎ、ａｓｎ、ｓａｒ、ｔｈｒ：プチドはＣＤ２に結合し得る 。 好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列表のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の２ ９位から１２０位のアミノ酸、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯの２９位から１０８位 のアミノ酸、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０の４８位から１０８位のアミノ酸、およ びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアのアミノ酸配列を有する。 本明細書および特許請求の範囲を通して、アミノ酸およびその残基に用いられる 省略形は一般的に許容されている命名法の形式に従うものであり、α−アミノ酸 およびＬ−シリーズのそれらの残基に関連する。 誘導体化されたアミノ酸は、天然あるいは非天然のアミノ酸であり、通常生じる 側鎖あるいは末端基は化学反応によって改変される。そのような改変には例えば 、γ−カルボキシル化、β−ヒドロキシル化、硫酸化、スルフォニル化、リン酸 化、アミド化、エステル化、ｔ−ブトキシカルボニル化、Ｎ−アセチル化、カル ボベンゾキシル化、トシル化、ベンジル化、および当業者に公知の他の改変が含 まれる。 誘導体化されたポリペプチドは、１個以上のアミノ酸誘導体を含有するポリペプ チドである。 本発明のポリペプチドのアナログは例えば、アミノ酸の置換、付加あるいは削除 、あるいはＤ−アミノ酸の利用によって特徴づけられる。本発明のポリペプチド の好ましい置換は、当業者に認識されている同類アミノ酸置換である。例えば、 以下のグループの一つに属するアミノ酸が同類変化の代表的なものである。 車のル＃めベゴ墨Ｖ春鱈辻　太スＬλＨ寥りめ４１１ベゴ某Ｖ尤ａｙｓ、　ｓｅ ｒ、　ｔｙｒ、　ｔｈｒ；　ｖａｌ、　ｉｌｅ、　ｌｅｕ、　ｍａｔ、　ａｌａ 、　ｐｈａ；　ｌｙｓ。 ａｒｇ、　ｈｉｓ；　ａｎｄ　ｐｈａ、ｔｙｒ、　ｔｒｐ、　ｈｉｓ例えば、Ｇ ｒａｎｔｈａＩＩｌ、　５Ｃ１ｅｎＣｅ、　１８５．　ｐｐ、　８６２−６４　 （１９７４）、Ｄａｙｈｏｆｆ、ｂ＋　Ａ目、ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ ｅ　ｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｌ　１９７８、＾ｒｇｏｓ、　 ＥＭＢＯＪ、、　Ｌ、　ｐｐ、　７７９−７８５　（１９８９）を参照。 本発明のすべてのアナログおよび誘導体は、ここで述べられるＣＤ２結合ポリペ プチドの生物学的活性に類似の活性によって特徴づｉｌられると理解されるべき である。従って、これらのアナログおよび誘導体は、診断、治療および予防のた めの組成物、化合物お、よび方法において、本発明のポリペプチドと同じ様式で 使用され得る。 本発明のポリペプチドの産生は、当業者に既知の種々の方法によって行われ得る 。例えば、特異的なエンドペプチダーゼを１１′、＋ソベブチダーゼ、エドマン 分解、あるいはその両方と組み合わせて用いるタンパク質分解により、完全なト ランスメンブラン１．ＦＡ−３あるいはＰＩ結合・ＬＦＡ−３分子から、これら のポリペプチドを誘導し得る。次に完全なＬＦＡ−３分子は、従来の方法を用い て天然資源から精製され得る。あるいは完全な長さのＬＦＡ−３あるいは切り型 のＬＦＡ−３を、既知の組換えＤＮＡ技法によりｃＤＮＡから生産し得る（Ｗａ ｌｌｎｅｒらに与えられた米国特許策４、９５６．２１１１号参照）。 好ましくは、本発明のポリペプチドは直接的に生産され、出発物質としての多量 のＬＦＡ−３の必要性を排除する。これは従コニドするＤＮＡ配列のみが形質転 換された宿主中で発現する既知の組換えＤＮＡ技法によって行われ得る。 本発明の所望のＬＦＡ−３ポリペプチドをコードする遺伝子は、所望のポリペプ チドのアミノ酸配列に基づいて設計し得る。 次に遺伝子の合成に標準的な方法が適用し得る。例えば、アミノ酸に基づき翻訳 （バックトランスレート）された遺伝子を産生ずるために、このアミノ酸配列を 使用し得る。本発明のＬＦＡ−３をコードし得るヌクレオチド配列を含有するＤ ＮＡオリゴマーを単一工程で合成し得る。あるいは、所望のポリペプチドの一部 分をコードする数個のより小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次にこれらを連 結し得る。好ましくは、本発明のＬＦＡ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列は、数個の別々のオリゴヌクレオチドとして合成され、その後連結される。 個々のオリゴヌクレオチドは、一般的に相捕的な連結のために５゛あるいは３° に突出部を有する。 一旦連結されると、好ましい遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼによって認識さ れる配列（クローニングベクターあるいは発現ベクターへの直接的な連結のため の固有の制限部位を含む）、使用する宿主の発現システムを考慮した好ましいコ ドン、および転写されたときに安定で効率的な翻訳ＲＮＡを生産する配列によっ て特徴づけられる。適切な連結は、ヌクレオチドの配列決定、制限マツピング、 および適切な宿主内での生物学的に活性なポリペプチドの発現により確認される 。 本発明に従うＤＮＡ配列の一つの実施態様は、成熟ＬＦＡ−３の１位かち７０位 のアミノ酸、すなわち図１における９４位から３（１３位のヌクレオチドをコー ドする核酸配列を含む。別の好ましい実施態様は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）核 酸配列：　ＡＡＴＡＧＧＧＴＴＴ　ＡＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＧＧＴ を含み、これは成熟［、ＦＡ−３の５１位から６０位のアミノ酸をコードする。 しかしながら、本発明の好ましいＤＮＡ配列は、ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１０１７ ）２９位から１２０位のアミノ酸、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１０ノ２９位から１０ ８位（７）７ミ／酸、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０ノ４８位から１０８位（７）ア ミノ酸、およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアのアミノ酸配列を有するポリペプチドを フードする。本発明の最も好ましいＤＮＡ配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１０の １から１２０位のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。この配列は 動物細胞で用いられると、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０＝１０の２９位から１２０位のア ミノ酸のアミノ酸配列を有するポリペプチドの産生、分泌、および成熟を可能に する。 遺伝子コードの同義性によって、多くの他のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子 もまた本発明のポリペプチドをコードすることができるということが当業者には 理解される。このような同義性配列は本発明に包含される。 本発明はまた、前述のＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子に関する。本発明の組 換えＤＮＡ分子は、本発明の該ＬＦＡ−３ポリペプチドの発現をそれによって形 質転換された宿主において指示し得る。本発明のＬＦＡ−３ポリペプチドをフー ドするＤＮＡ配列ハ、そのような発現のための発現制御配列に作動可能に連結さ れなければならない。用語「作動可能に連結された」は、ここで用いられている ように、コーディング配列の転写および翻訳が制御配列によって指示されるよう にベクター内で位置を決めることを意味している。 本発明のＬＦＡ−３ポリペプチドの発現を指示し得る組換えＤＩＪＡ分子を構築 するために、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を多種類のベクター を用いて、その中に挿入および発現し得る。さらに、それぞれの特異的発現ベク ター内で、これらのＤＮＡ配列の挿入のための種々の部位を選択し得る。これら の部位は通常、その部位を切断する制限エンドヌクレアーゼによって示される。 それらは、当業者には公知である。しかしながら、本発明に有用な発現ベクター は、選択したＤＮＡフラグメントの挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を 必ずしも必要としないと考えられている。その代わり他の手段によって、この発 現ベクターをフラグメントと接合し得る。 発現ベクター、および、とりわけ選択したＤＮＡフラグメントの挿入および発現 制御配列のために選択する部位は種々の因子によって決定される。これらの因子 には、例えば、特定の制限酵素に感受性の多くの部位、発現するポリペプチドの 大きさ、宿主細胞の酵素によるタンパク質分解性や精製の間除去することが困難 な宿主細胞のタンパク質により発現したポリペプチドの汚染あるいは結合に対す る所望のポリペプチドの感受性、ベクター配列に関する開始コドンおよび停止コ ドンの位置のような発現特性、および当業者に公知の他の因子が含まれる。ベク ターおよびＤＮＡ配列のための挿入部位の選択は、これらの因子のバランスによ って決定され、すべての選択肢が特定の場合おいて同等に有効というわけではな い。 真核宿主に有用な発現ベクターには例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウィルス 、アデノウィルス、およびサイトメガロウィルス由来の発現制御配列を含有する ベクター、およびｐＶＬ９４１のような昆虫細胞内で特に有用なベクターが含ま れる。有用な細菌用発現ベクターには、既知の細菌プラスミド、例えば、ｅｏｌ Ｅ１％ｐｃＲ１，ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含むＥ、　ｃ ｏｌ　Ｉ由来のプラスミド、ＲＰ４のようなより広い宿主域のプラスミド、例え ばＮＭ９８９およびλｇｔシリーズのような多数のλフアージ誘導体、例えばＭ １３および他の繊維状−重鎖ＤＮＡファージのような他のＤＮＡファージ、およ び例えば９０２ＭシリーズおよびλＺａｐベクターのような市販されている高発 現ベクターが含まれる。有用な哺乳動物細胞発現ベクターには、例えば９ＮＵＴ が含まれる。酵母に有用なベクターには例えば、２μプラスミドおよびその誘導 体が含まれる。 そのような発現ベクターはまた、クローニングされるＤＮＡ配列の発現を制御し あるいは調節するためにベクター中に挿入される本発明のＤＮＡ配列に作動可能 に連結され得る、少なくとも一つの発現制御配列によって特徴づけられる。有用 な発現制御配列の例には、已システム、匣システム、Ｉａｃシステム％ＬＪＬシ ステム、ニジステム、■ニジステム、λファージの主要なオペレーターおよびプ ロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、例えばＰｈｏＳのような酵 母酸性フォスファターゼを例とする酵母の解糖プロモーター、酵母交配因子のプ しモーター、およびポリオーマ、アデノウィルス、レトロウィルス、およびシミ アンウィルスから誘導されたプロモーターである例えばＳＶ４０の初期および後 期プロモーター、メタロチオネインプロモーターのような真核細胞プロモーター 、および原核細胞あるいは真核細胞、およびそれらのウィルス、あるいはそれら の組み合わせの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列が含まれる 。 本発明の組換えＤＮＡ分子はまた、本発明のＤＮＡ配列の枠組内で融合される他 のＤＮＡコーディング配列を包含する。このような構造は、例えば、ＬＦＡ−３ ポリペプチドの最初のアミノ酸をコードするヌクレオチドに直接に融合されるＡ ＴＧ開始コドンによって特徴づけられる。この構築物は、ｆ−Ｍｅｔポリペプチ ドを産生じ得る。しかしながら、形質転換された宿主において、開始メチオニン は発現の間に切断あるいはそれに引き続いて取り除かれ得ると理解される。ある いは、細菌または真核生物のシグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、本発明の ＬＦＡ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５°末端に融合し得る。これ により発現産物は、宿主細胞内で特定の細胞下部のコンパートメントに分泌され 、かつ標的となり得る。はとんどのシグナル配列は、その標的機能を終えた後宿 主細胞によって除かれ、従って、所望のポリペプチドの精製後に除去する必要が ない。 多（のシグナル配列は、それらをコードするＤＮＡと同様に、当業者には公知で ある。本発明のＬＦＡ−４ポリペプチドをコードする配列に融合し、枠組内にあ るこのようなシグナル配列ＤＮＡのターンバク質は、標準的な分子生物学の技法 によって得られる。 あるいは、本発明のＩ、ＦＡ−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、宿主 細胞ポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列の組織内連結による融合タンパ ク質として発現され得る。融合タンパク質の発現には、宿主細胞による分解に対 する抵抗性の増加、宿主細胞ポリペプチドの活性あるいは抗原性に基づく同定の 容易さ、および宿主細胞ポリペプチドの物理的あるいは免疫学的特性に基づく精 製の容易さなどのいくつかの利点がある。 本発明はまた、上述の組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主にも関する 。これらの組換えＤＮＡ分子により形質転換され、そして本発明のＬＦＡ−３ポ リペプチドの発現に用いられ得る有用な宿主には、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　５Ｇ −９３６、Ｅ、ｅｏｌｆ　ＦｉＢ−１０１、Ｅ、ｃｏｌｆ　Ｗ３１１０、Ｅ、ｃ ｏｌｉ　Ｘ１７７６、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ２２８２、Ｅ、ｃｏｌｒ　ＤＨｌｓＥ、 ｃｏｌｉ　ＤＨ５−ａ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＲＣＩのようなＥ、ｃｏＩＩの菌株、 ニｄｏｒｒｒｏｎａｓの菌株、ＢａＣ目１ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｊｓのようなりａ ｃｊｌｌｕｓの菌株、５ｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓの菌株、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　 ｃｅｓの菌株、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト組繊細胞のような動 物細胞、昆虫細胞（例エバ、鉦弧」お二１１１匡吐鎚（ＳＦ９））　、および組 織培養の植物細胞などの既知の真核あるいは原核の宿主が含まれ得る。 本願で特許請求をするポリペプチドにとって好ましい宿主は、ＣＨＯ細胞である 。 すべての宿主／発現ベクターの組み合わせが、本発明のＬＦＡ−３ポリペプチド をコードするＤＮＡ配列を発現する際に、等しい効率で機能するわけではない。 しかしながら、特定の宿主／発現ベクターの組み合わせの選択は、本発明の範囲 からはずれることなく、本願に記載されている原則を考慮して当業者によってな される。例えば、選択は多くの因子のバランスに基づいて行われるべきである。 これらの因子には例えば、宿主とベクターの適合性、ＤＮＡ配列によってフード されるポリペプチドの宿主細胞に対する毒性、ベクターのコピー数およびコピー 数をコントロールする能力、抗生物質マーカーのようなベクターによってコード される他のタンパク質の発現、所望のタンパク質の回収の容易さ、ＤＮＡ配列お よび該ＤＮＡ配列に作動可能に連結される発現制御配列の発現特性、生物学的な 安全性、コストおよび所望のポリペプチド発現後の改変に必要な折りたたみ、形 態、その他のあらゆるものが含まれる。 組換えＤＮＡ技術は、２０個より多いアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチ ドを生産する好ましい方法であるが、本発明に包含される、約２０個より少ない アミノ酸を育する短いポリペプチドは従来の化学合成技法によって好ましく産生 される。 合成によって生産される本発明のポリペプチドは極めて高い収率で得ることがで き、精製も容易にし得るという利点がある。 本発明の好ましい実施態様においては、このポリペプチドは液相あるいは固相に おけるポリペプチド合成によって合成ミノ酸を除くため）、あるいは手技による エドマン分解法によ葛分解（Ｎ末端アミノ酸を除くため）を受ける。ポリペプチ ドの適切な折りたたみは、Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋｅｎｔのｒｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎ ｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓＪ 　、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　ＢｉｏｃｈｅＬ、■、　ｐｐ、　９５７−８９　（１ ９８ｇ）に記載されているように、ジスルフィド架橋形成に好都合な酸化条件下 で行われ得る。この方法によって産生されたポリペプチドは次に、当業者に広く 知られた分離技法によって、好ましくは逆相ＨＰＬＣを用いて精製し得る。液相 合成法の使用は、例えばチロシンのＯ−スルフェートエステルなどの、特定の誘 導体化されたアミノ酸を伸長ポリペプチド鎖に直接付加するのに有利である。こ れにより、次に続く本発明のポリペプチドの任意の残基を改変するための誘導工 程の必要性が除かれる。 本発明のポリペプチドの生物学的活性、ずなわちＬＦＡ−３／ＣＤ２相互作用を ブロックする能力は、ＬＦＡ−３ポリペプチド発現細胞のＣＤ２発現細胞に対す る結合を視覚的に（増幅して〉評価することを可能とする単純な細胞結合アッセ イを用いてアッセイし得る。ジャーカット細胞は、ＣＤ２″′甚質（後述の実施 例を参照）として好ましい。本発明の可溶性ポリペプチドの結合特性は、例えば ３５３などを用いてポリペプチドを放射能標識し、次に標識ポリペプチドをＣＤ ２ゝ細胞と接触させるような既知の数種の方法でアッセイし得る。酵素標識、あ るいは５ｅｅｄらにより記述された（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｅｔ、　ＵＳＡ、　８４．　ｐｐ、　３３６５−６９　（１９１１７））　、ロ ゼッティングアッセイも使用し得る。 本発明の別の実施態様においては、融合タンパク質およびそれをコードするＤＮ Ａ配列が提供される。これらの融合タンパク質は、本発明のＣＤ２結合ポリペプ チドのアミノ酸配列ニよって特徴づけられるアミノ末端領域、およびＬＦＡ−３ 以外のタンパク質あるいはポリペプチドドメインを含有するカルボキシ末端領域 を有する。そのようなドメインには例えば、イムノグロブリンのＦｃ領域が含ま れる。 本発明の好ましい融合タンパク質において、本発明のＣＤ２結合ポリペプチドは イムノグロブリンのＰｃ領域の少なくとも１つの部分に融合する。これらの融合 タンパク質において、ＣＤ２結合ポリペプチドはアミノ末端部分を形成し、モし てＦｃ領域はカルボキシ末端部分を形成する。 これらの融合タンパク質において、このＰｃ領域は好ましくはヒンジ領域、およ びＣＨ２および０Ｍ３ドメインに限定される。 より好ましくは、本発明の融合タンパク質におけるＦｃＱ域はヒンジ領域部分お よびＣＨ２およびＣＨ３ドメインに限定され、このヒンジ領域部分は分子間ジス ルフィド架橋を形成し得る。 例えば、図１２を参照。 本発明の有用なＬＦＡ−３−！ｇ融合タンパク質の例として、ＬＦＡ３ＴＩＰ　 （ＬＦＡ−３＜９２）Ｉｇ（ｉとも称される）が挙げられ、これは発現プラスミ ドｐｓＡＢ１５２　（後述）を含むＣ０Ｓ７細胞によって細胞培養培地中に分泌 される。ＬＦＡ３ＴＩＰは、ＬＦＡ−３の成熟形態のアミノ末端からの９２個の アミノ酸に融合させたヒトＩｇＧ１のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣ，３定常 ドメインからなる（図１１参照）。融合タンパク質であるＬＦＡ３ＴＩＰは、Ｌ ＦＡ−３の機能的ＣＤ２結合ドメインζおよびＦｃ結合タンパク質であるプロテ ィンＡにょっ−ｃｔａｔＡされる充分なＩｇＧのＦｃ領域部分を含む。ＬＦＡ３ ＴＩＰはＣＤ２に結合し得、Ｔ−細胞活性化を抑制し得る。 本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質を、ポリペプチドのＣＤ２結合ドメ インとＣＤ２との複合体の形成に基づいて、ＣＤ２あるいはＣＤ２発現細胞を選 択的に単離する方法に使用し得ることは明らかである。 本発明の他の実施態様においては、ＬＦＡ−３−１ｇ融合タンパク質のような本 発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＣＤ２あるいはＣＤ２のＬＦＡ− ３結合ドメインを含むポリペプチドを発現する細胞をＩ議するために使用し得る 。例えば、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、ＣＤ２”細胞に結合 されたポリペプチドまたは融合タンパク質の検出、あるいはＬＦＡ−３のＣＤ２ 結合ドメインを含むポリペプチドの検出を可能にする「リポータ−分子」に連結 し得る。本発明に例示された融合タンパク質のイムノグロブリンＦｃａ酸部分の 存在によって、そのような融合タンパク質は例えば、”Ｊ、Ｆｃ領域に特異的な 酵素連結２次抗体、あるいは酵素連結分子に基づくビオチンーストレブタビジン （ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）により抗原に結合するイムノグロブリンを検出す るために、通常イムノグロブリンに連結あるいは結合する、同じ「リポータ−分 子」に結合し得る。従って、本発明のＬＦＡ−３−１ｇ融合タンパク質は、Ｆｃ のカルボキシ末端部分によってそのようなリポータ−分子に連結あるいは結合し 得る。さらに、そのようなリポータ−分子は、本発明のポリペプチドあるいは融 合タンパク質がＣＤ２またはＣＤ２のＬＦＡ−３ドメインに結合する前あるいは 後に、該ポリペプチドまたは融合タンパク質に連結または結合し得る。 本発明のさらなる実施態様において、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク 質は、ＣＤ２、あるいはＣＤ２のり、ＦＡ−３結合領域を含む細胞あるいは分子 の存在を検出し、あるいは不在を示唆する診断上の応用にも使用し得る。 本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は治療用の組成物にも用いられ得、 この組成物はＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体の形成が病理状態の原因であるとき、そ のような複合体形成を阻害するものである。あるいは、ＣＤ２／ＬＦＡ−３複合 体の形成に依存する１以上のＴ−リンパ球の機能的応答の開始においてＬＦＡ− ３の役割を模倣させて治療的にも用いられ得る（例えば、Ｄｕｓｔｆｎら、Ｊ、 Ｅｘ　、Ｍｅｄ、、１６５．　Ｉ）Ｉ）、６７７−９２　（１９１１７）、Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒら、匡Ｒａｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　”４．　ｐｐ、　２２３−５ ２　（１９１！？）参照）。例えば、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク 質は、急性あるいは慢性の炎症、自己免疫疾患、および全身性紅斑性狼蒼あるい は尋常性狼蒼、間接リウマチおよび甲状腺炎のような疾患の治療を含む免疫変調 の治療に使用し得る。さらに本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、Ｔ −細胞活性化の抑制、あるいは末梢血リンパ球増殖の抑制に使用し得る。 これらの局面において、細胞−細胞付着に関する分子は、その分子が同じタンパ ク質の単量体形態で存在するよりも多量体形態で存在するときに一般に細胞から の特定の応答をより効果的にに引き出すと認識されている。細胞表面付着タンパ ク質の多量体形態はインビボで、例えばエフェクター細胞がその表面で特定の結 合タンパク質を何回、何千とコピーし次に標的細胞上のリガンドの多数のコピー に結合するような典型的な状況を益々模倣するようである。多数の表面分子が結 合に関わるとき、それらは共同的に作用し、その結果ある細胞の他の細胞に対す る親和性は個々の分子の結合親和性の単なる総計以上のものになる。従って、本 発明の重要な局面は、本願に開示のＣＤ２結合ポリペプチドの多量体形態の調製 および使用に関する。 タンパク質単量体から多量体形態を形成する種々の方法は当業者に公知である。 このような方法には、例えばグルタルアルデヒドのような架橋剤の使用（例えば 、Ｒｅｌｃｈｌｉｎ％ＭｅｔｈＯｄＳＥｎｚｍｏ１１．７０．　ｐｐ、　１５９ −６５　（１９８０））を含む。もしポリペプチドあるいは複数のポリペプチド にチオール残基が存在するならば、この基はポリペプチドあるいは複数のポリペ プチドが多量体形態になるための分子間ジスルフィド結合を形成するために酸化 し得る。チオール残基あるいはチオール反応性基は、イミ／チオレン、あるいは アミン反応性基およびチオール反応性基を含むＮ−スクシニミジル−３−（２− ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような、ヘテロニ官能性ｉｍ剤 を用いて、ポリペプチドに取り入れられる。次にタンパク質のカップリングが直 接に、あるいはホモニ官能性架橋剤によって形成されるジスルフィド結合によっ て行われ得る（例えばミ５ｒｉｎｉｖａｓａｃｈａｒら、旧ｏｃｈｅｔ−，２ｇ 、　ｐｐ、２５０１−０９　（１９８９＞、Ｒａｍａｋｒｊｓｈｎａｎら、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅ５６．　４４．　ｐｐ、２０１−０８　（１９８４）、Ｌａ＋ａ ｂｅｒｔら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２６０．　ｐｐ、　１２０ ３５−４１　（１９８５）参照）。分子間ジスルフィド結合形成の有効性は無論 、ポリペプチド（天然に生じた、あるいは上述の銹導によって生じたもの）に存 在する宵月なチオールの数、およびそ−のようなジスルフィド結合により得られ る多量体形態の親和性に逆効果であるかどうかにより、限定される。 （以下余白） ポリペプチドまたはタンパク質が、糖タンパク質におけるよ−うに炭水化物基を 育するならば、そのような基の１１部分は、１つの分子を他の分子に連結させる 反応において使用され得る（例、Ｌｉａｏら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｍ、、　２ ４Ｌ　ｐｐ、８２４７−５３　（１９７３）；　Ｍｏｒｏｎｅｙら、　１１２９ に旦！、、２６、　ｐｐ、８３９０−９８　（１９ｇ？＞）　。 本発明の他の多量体形態のＣＤ２−結合ポリペプチドは、例えば、ＰＣＴ特許出 願ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１８５９号に記載されているようなホスファチジルイノ シトール（°Ｐ１°）結合配列、または例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／１Ｔｓ ９１１００５６７号に記載されているようなｃ４結合タンパク質の配列を結合さ せることにより産生され得る。疎水性Ｐ

【アンカーは、複数の活性ＣＤ２結合ド メインまたは多量体形態のＰＩ結合ＬＦＡ−３を示すミセルを形成するのに使用 され得、その中で複数の単量体は（他のリビドまたは膜が存在しない）各単量体 のＰＩ結合配列間の疎水性相互作用によって互いに会合される。後者の場合、多 量体形態のＰ！結合ＬＦＡ−３分子は、通常、六量体である。しかし、他のポリ マー形態（例えば、６−１２個の会合した単量体）も観察されている。あるいは 、本発明のポリペプチドをフードするＤＮＡ挿入断片の下流側にあるＰ■結合配 列をフードするＤＮＡセグメントを結合させ、この構築物で適切な哺乳動物宿主 細胞をトランスフェクトすると、（ＰＩアンカーが結合した）その表面にＣＤ２ 結合ポリペプチドの多数のコピーを示す細胞培養物が提供される。 あるいは、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質の単量体の多数のコピー は、他の分子、基質または粒子に結合され得る。ＬＰＯＢをＡｆｆｉｇｅｌ−１ ０ビーズ（以下を参照）に結合す子の形成および使用は、本発明の範囲内である 。 さらに、本発明はまた、多量体形態のＬＦＡ−３−１ｇ融合タンパク質を含む。 そのような多量体は１８分子のＦｃ領域またはその一部分を用いて生成され得、 その１８分子は通常、ｒｇＭ五量体おドは、ＩｇＭ五量体およびＩｇＡ二量体を 形成し、安定化させるのに必要であることが理解される。あるいは、ＬＦＡ−３ −１ｇ融合タンパク質の多量体は、例えば、プロティンＡのよウニ、１８分子の Ｆｃ領域に対して親和性を存するタンパク質を用いることにより形成され得る。 例えば、ＬＦＡ３ＴＩＰのような複数のＬＦＡ−３−Ｉｇ融合タンパク質は、プ ロティンＡ−アガロースピーズに結合して、結合したＬＦＡ−３−１ｇ融合タン パク質の多機能ＣＤ２結合ドメインで表面が覆われる、アガロースビーズを形成 し得る。 他の実施態様では、本発明はＣＤ２に結合し得る多量体タンパク質を提供し、そ れらには、（ａ）本願に記載の２個以上のＣＤ２結合ポリペプチド、（ｂ）本願 に記載の２個以上のＣＤ２結合融合タンパク質、または（ｃ）１個以上のＣＤ２ 結合ポリペプチドおよび１個以上のＣＤ２結合融合タンパク質が含まれる。 本発明のポリペプチドはまた、ＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体の形成を介して細胞− 細胞間付着を抑制するのに有用な、低分子量（すなわち、通常単量体の分子量が １０００ダルトン未満）のペプチジルを含まないまたは部分的にペプチジルを含 むＣＤ２結合分子を設計するのにも用いられ得る。本願で提供されるポリペプチ ド−１こ基づいて、ＣＤ２に結合する能力を有し、アミノ酸以外の部分からなり 、全体的に合成方法を用いて生成され得る、そのように小さな分子が設計され得 る。治療または診断用の薬剤としてのそのような小さな分子の使用もまた、本発 明の範囲内にある。 本発明の他の実施態様は、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインを認識する抗体を得 るための、ＣＤ２結合ポリペプチドおよび融合タンパク質の使用を含む。ＬＦＡ −３のＣＤ２結合ドメインに高度に特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）お よびポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質を用い て得ることができる。 特定の抗原に対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗血清を得るため の方法は、当該技術分野において公知である。ＭＡｂｓを産生ずるには、継代細 胞系（典型的には、ミエローマ細胞系）を特定の抗原、すなわち、この場合はＬ ＦＡ　−３のＣＤ２結合ドメインで免疫した哺乳動物（例えば、ウサギ）からの リンパ球（通常は、肺臓細胞）に融合される。このような融合物は通常ハイブリ ドーマ、すなわち、免疫化抗原の単一エピトープに特異的な抗体分子を産生ずる ７％イブリッド細胞の継代可能なりローンを生成する（一般に、ＫｏｈＩｅｒら 、口■■、　ｌ、　ｐｐ、　４９５−９７　（１９７５）を参照のこと）。効果 的な免疫化には、ＣＤ２結合ドメインを含むポリペプチドが重合されるかまたは 誘導され、そしてアジ二バントと混合されなげればならない。 −また、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメイシに対する抗体を産生ずるクローンを同 定するために、融合物から生成されるハイブリドーマの非常に多数のクローンを スクリーニングできることが必要である。例えば、このようなスクリーニングに は、ハイブリドーマ培養物の上清の、ＣＤ２発現細胞がＬＰＡ−３発現細胞に結 合するのを阻害する能力をアッセイすることが含まれ得る。ハイブリドーマをス クリーニングして、ＬＦＡ−３を産生ずるＭＡｂｓを調べるために使用されてい るアッセイは、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインに特異的なＭＡｂｓを産生する ハイブリドーマの一次スクリーニンイングとして適用される（例えば、Ｓａｎｃ ｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、　ｒｏｃ、Ｎ　ｔｌ、　ａ　、Ｓｃｏ、Ｕ　、　ＩＵ 、ｐｐ、７４８９−９３（１９８２）を参照のこと）。 本発明の、および本願で記載されているようなＬＦＡ−３遺伝子の欠失変異形態 のＣＤ２結合ポリペプチドをコードするＤＮＡもまた、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合 ドメインをコードする他のＤＮＡ配列を検出し単離するために、プラス／マイナ スプローブとして使用され得る。 成熟ＬＰＡ−３の少なくとも＋５１位から＋６０位のアミノ酸、成熟ＬＦＡ−３ の少なくとも＋４１位から＋５０位のアミノ酸または成熟［、ＦＡ−３の少なく とも＋３１位から＋４０位のアミノ酸を欠失する、（および好ましくは３領域全 てを欠失する）、欠失変異形態のＬＦＡ−３タンパク質は、ＬＦＡ−３のＣＤ２ 結合ドメイン内にあるエピトープ以外のＬＦＡ−３のエピトープを認識する抗体 のポリクローナル抗血清を明確にするために使用され得る。このような変異体は 、例゛えば、Ｍ５７、ＭＳ５、Ｍ２Ｓ、ＰＩＭ３お−よびＭＩＱ（１，ならびに その組合せからなる群から選択され得る。例えば、ポリクローナル抗ＬＦＡ−３ 抗血清は、ＭＳ？またはＭＩＯ（ｌ欠失変異体を含む変異ＬＦＡ−３遺伝子によ ってコードされる変異形態のＬＦＡ−３タンパク質とともにブレインキュベート され得る（図１および図６）。このポリクローナル抗体は、変異体ＬＦＡ−３タ ンパク質上のＬＰＡ−３エピトープを認識し、結合する。しかし、ＣＤ２結合ド メインが存在しないため、ポリクローナル抗血清におけるこのエピトープに対す る抗体は結合しない。形成される複合体の沈降により、ＣＤ２結合ドメインのエ ピトープに特異的な抗血清に残存するあらゆる抗体が増加する。 本発明のＣＤ２結合ドメインポリペプチドおよび融合タンパク質は、薬学上有用 な組成物および混合物を調製するための従来方法を用いて、薬学組成物として調 剤され得る。そのような組成物は、少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリ ヤーを含むのが好ましい０例えば、Ｒｅ１ｎｔＯ°ｓ　Ｐｈａｒｖａｃｅｕｔｉ ｃ虹」」ｌＫ競、（ＥＪ、　Ｍａｒｔｉｎ＞を参照のこと。本発明の薬学組成物 は、活性ポリペプチドに加えて、通常、塩化ナトリウム、マンニトールまたはン ルビトールのような等張圧を調整するための薬学的に受容可能な化合物と共に、 薬学的に受容可能な緩衝液、好ましくはリン酸緩衝溶液を含む。本発明の薬学的 に受容可能な組成物および方法は、本発明による薬学上有効な量のポリペプチド によって特徴づけられる。 ＬＦＡ−３−１ｇ融合タンパク賀を含む、本発明の薬学組成物および混合物は、 例えば、Ｔ−リンパ球の活性化を抑制または末梢血リンパ球の増殖を抑制するた めに、使用され得る（以下を参照のこと）。 本願で使用されている用語「混合物」には、本発明の少なくとも１つのポリペプ チドおよび少なくとも１つの他の薬学的活性剤を含む単一投与形態、ポリペプチ ドおよび他の活性剤が別々であるが同時に投与される複投与形態、または２つの 成分が別々であるが連続して投与される複投与形態が含まれる。あるいは、本発 明のポリペプチドと他の活性剤は、単一複合体化分子の形態であり得る。２つの 成分による複合体は、当該技術分野に公知の標準的な架橋技術により成し遂げら れ得る。単一分子また、組換え融合タンパク質の形態をとり得る。 本発明の薬学組成物および混合物は、ポーラスとしてまたは連続注入による静脈 注射、筋肉注射、皮下注射、皮肉注射、関節的注射、経口または非経口による投 与を含む、任意の薬学的に受容可能な投与形態で、患者に投与され得るが、これ らには限定されない。 薬学上有効な投与量を決定するための方法は、当業者により公知である。投与量 および投与速度は、特定の組成物、治療の目的、すなわち、治療または予防、投 与法および治療する医師の判断などの様々な要因に依存し得る。 本発明はまた、生物学的試料におけるＣＤ２タンパク質の濃度またはＣＤ２発現 細胞の検出を決定す冬ための、ＣＤ２結合ポリベプーチドおよび融合タンパク質 、ｉたはこれらを含む組成物の生物分析的な使用に関する。これらのポリペプチ ドおよび組成物は、従来のアッセイに使用される試薬と同様の方法で使用され得 る。さらに、本発明のポリペプチドは、ＣＤ２またはＣＤ２発現細胞の存在を検 出し、およびその濃度を測定するために設計された診断用キットにおいて使用さ れ得る。 本発明がより理解されるために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示 のみを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。 爽胤五上 ＬＦＡ−３゛　におする　の− ＣＤ２結合ドメインをＬＦＡ−３タンパク賃上にマツピングするために、ｔＦＡ −３遺伝子の一連の欠失変異体を、オリゴヌクレオチドのへテロ二本鎖化により 、部位特異的な変異誘発を用いて系統的に生じさせた。トランスメンブランをコ ードするｃＤＮＡを単離して配列決定しくＷａｌｌｎｅｒら、米国特許第４．９ ５６．２１１１号）、およびトランスメンブランＬＦＡ−３をコードするｃＤＮ Ａを有するバクテリオファージを、アメリカンタイプカルチャーコレクション、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　（受託番号第７５１０７号）に寄託 した。トランスメンブランＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡを含むブラスミ　ド ｐＨ７１６−６をＢｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃ ｈｕｓｅｔｔｓ）から得、すべての欠失変異体を調製するのに用いた。プラスミ ドｐ［Ｉ７１６−６の構築は、本願に参考のために援用したＰＣＴ特許公開！０ ８Ｂ１０９８２０号に記載されている。プラスミドｐＨ７１６−６は、ＬＦＡ− ３をコードするｃＤＮＡ挿入断片省含み１ＬＦＡ−３のコーディング配列の５゛ 末端付近に単一の迦Ｒ１部位、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの５゛末端に隣接して単一の 石旧部位、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡの３゛末端に隣接して単一のｌＬＬ！１ｄ　ｌ　 ＋　１部位、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡから１１１２ｂｐ離れ、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡを はさむ２つの１ｊ１１部位、および単一の論１部位を含む。トランスメンブラン ＬＦＡ−３のコーディング領域全体を含むｐ■７１６−６のｅ　ＤＮＡ挿入断片 を図１・に示す。 この手法では、それぞれが３０ｂｐの長さをもつ、１７個のＬＦＡ−３コーディ ング配列を欠失用に選択した。各々の目的とされる欠失用に、目的とされた欠失 のすぐ上流側（５°から）の相補的な１５個の塩基と、目的とされた欠失のすぐ 下流側（３°から）の相補的な１５個の塩基とから構成される、３０塩基のアン チセンスオリゴヌクレオチド（３０１体）を合成した。特定の合成オリゴヌクレ オチドとＬＦＡ−３ＤＮＡのストランドとをパイプリダイスサセると、３０ｂｐ の特定の配列がループアウトしたヘテロ二本鎖ができた。この変異誘発手法によ り、ヘテロ二本鎖の複製産物のいくつかは、ヘテロ二本鎖形成によりループアフ トした５ｏｂｐａ域を欠失する欠失変異体を含んでいた。 図１に示される１７個の欠失変異体を生成するのに使用される合成オリゴヌクレ オチドを、以下の表に示す。 （Ｌ＜’Ｆ−仙ｌ ！！！１　Ｆ−３ヌクレオチドに　・　ｍ５ＥＱより　ＮＯ：１３　１０９−１ ２３＋１５４−１６８　Ｍ５３ＳＥＱより　ＮＯ：１４　１：１９−１５３＋１ ８４−１９８　Ｍ５４ＳＥＱ　より　ＮＯ：１５　１６９−１８３＋２１４−２ ２８　Ｍ５５ＳＥＱより　Ｎ０＝１６　１９９−２１：Ｉ＋２４４−２５８　Ｍ ５６ＳＥＱより　ＮＯ：１７　２２９−２４３４２７４−２８８　Ｍ５７ＳＥＱ 　より　ＮＯ：１８　２５９−２７３＋３ｏ４−３１８　Ｍ５ａＳＥＱより　Ｎ Ｏ：’１９　２８９−３０３＋３３４−３４８　Ｍ５９ＳＥＱより　ＮＯ：２０ 　３１９−３３３＋３６４−３７８　Ｍ６０ＳＥＱより　Ｎ０＝２１　３４９− ３６３＋３９４−４０８　Ｍ６１ＳＥＱより　ＮＯ：２２　３”７９−３９３＋ ４２４−４３８　Ｍ６２ＳＥＱより　ＮＯ：２３　４０９−４２３＋４５４−４ ６８　Ｍ６３ＳＥＱ　ＸＤ　ＮＯ：２４　４３９−４５３＋４８４−４９８　Ｍ ６４ＳＥＱより　Ｎ０＝２５　４６９−４８３＋５４４−５２８　Ｍ６５ＳＥＱ より　ＮＯ：２６　４９９−５１３＋５４４−５５８　Ｍ６６ＳＥＱより　ＮＯ ：２７　５２９−５４３＋５７４−５８８　Ｍ９０ＳＥＱより　ＮＯ：２８　５ ５９−５７３＋６０４−６１８Ｍ５Ｈ５ＥＱ　より　ＮＯ：２９　５８９−６０ ３−１−６３４−６４８　Ｍ９２（し゛人下乍白） 各ヘテロ二本鎖につき、プラスミドｐＨ７１６−６（１００μｇ）ノ１つ−（Ｄ 試料を、１Ｌ１１ｄｌｌｌ　（２１０−Ｌ　二ｙト、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＥｃｏＲＩ　（３００ユニツト、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ ｄ　Ｂ４ｏ１ａｂｓ）または旦ａｍＨＩ　（３００ユニツト、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかで消化した。ｐＨＴ１６−６　（１００μ ｇ）の他の試料を、社：ａｌ　（３００ユニツト、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）で消化することにより直線化した。 消化産物を、ＴＡＥ緩衝液（４０■Ｍのトリス／酢酸、ｆｍＭのＥＤＴＡ。 ｐＨ８，ｏ）中の１％（ｖ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動にかけ、次いで各 消化産物からの所望のフラグメントをゲルから電気溶出したＣＭａｎｉａｔｉｓ ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　ａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａ ｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９ｇ２））　ｏ　５ｃａｌ で消化した場合には、直線化されたｐＨ７１６−６が、ゲルから電気溶出され、 ｐＨ７１６−６をＨｉｎｄｌｌｌ／ｌ１ＱＲ１または！ＬＬｌｌＬｄＩＩ夏／ｌ ｕ旧で消化した場合に　゛は、それぞれの場合において産生された２つの制限フ ラグメントのうち大きい方が電気溶出された。 Ｓｅａ　Ｉで直線化されたｐＨＴ１６−６ＤＮＡ　（１０１００ｎの試料を、単 離されたＨｉｎｄｌｌｌ／シｍＲ■または旧」ｄｌｌｌ／ｌｕ旧制限フラグメン ト（１００ｎｇ）の試料および予めＡＴＰでリン酸化した１７個のアンチセンス オリゴヌクレオチドのうちの１つの６ピコモルと混合した（Ｍａｎｉａｔｉｓら 、前出）。図１を参照すると、１５２ＲＩ制限部位は、Ｍ５６Ｍ域内にあるので 、し１目１／ＬＬＱＲＩの大きな制限フラグメントは、領域Ｍ５３、Ｍ５４、Ｍ ２ＳおよびＭｇ６の欠失を生じさせるのには使用できなかった。従って、この手 法においては、１Ｌｎｄｌ　！　ｌ／Ｂａｇ■Ｉの大きな制限フラグメントを、 これらの４つの欠失を生じさせるために使用した。 ＼テロ二本鎖を形成するため！己、合成オリゴヌクレオチド、シ」Ｉで直線化し たｐＨＴ７１６−６、および旧１ｄｌｌ＋／扛遼Ｒ１または旧１ｄｌ＋１／ＩＬ ｕＨＩのいずれかによるｐＨ７１６−６の大きなフラグメントを、１０ｈＭのＮ ａＣ１，８０ｍＭのＭｇＣｌ２．６．５ｍＭのトリス／Ｃ１、ｐＨ７，６中で混 合し、３分間沸騰させて変性した。変性ＤＮＡを、３７°Ｃで１時間、次いで、 ４℃で１時間、最後に０℃で１０分間アニーリングした。 アニーリング後、ヘテロ二本鎖における間隙を埋め、アニーリングしたＤＮＡに 以下の構成成分を加えることにより単一反応混合物中で７ラグメントを連結し、 所定の最終濃度または量にした：　ＡＴＰ　（２０ｍＭ）　；　ｄＡＴＰ％ｄ丁 ＴＰ％ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ　（それぞれ１０＋Ｍ）　；クレノー（ＤＮＡポリ メラーゼ■の大きなフラグメント、２．５ユニツト、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）　；　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２００ユニツト、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　ｏ次いで、この混合物を１５℃で一昼夜インキュ ベートした。 インキコベーション後、埋め込んだ／連結混合物のそれぞれの半分を用いて、１ ００μｌのＬ赳■ＪＡ２２１を形質転換するのに用いた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、 前出）。形質転換された細胞のコロニーを、アンピシリン（５０μｓ／ｍｌ）を 補給したＬＢプレート上で選択した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出）。 欠失を生じさせるために、プローブとしてヘテロ二本鎖に用いた特定のオリゴヌ クレオチドによる形質転換体のコロニーをスクリーニングして特定の欠失の存在 を調べた。 プローブとして用いるために、各オリゴヌクレオチド（８０ｐｍｏｌ）の試料を 、標準手法により”Ｐ−ＡＴＰを用いて標識した。 標撫オリゴヌクレオチドを、ｚＭｔｙ：ｚ酢酸アンモニウムで沈降させた（Ｍａ ｎｔａｔｉｓら、前出）。標識プローブを、ハイブリダイゼーシゴン混合物の最 終活性が約５　ｘ　１１０５ＣＰ／＋ａｌとなるように、ハイブリダイゼータ１ ン緩衝液に加えた。ハイブリダイゼーシヨンは、ニトロセルロースフィルター上 で、６０℃で約８時間行った。６０℃の０．５　ｘ　ＳＳＣ緩衝液中でフィルタ ーを洗浄後、オートラジオグラフィーを行い、陽性コロニーを測定した（Ｍａｎ ｆａｔｉｓら、前出）。所望の欠失変異体の生成は、ハイブリダイゼーシッン結 果により陽性と測定されたコロニー中のプラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列分析（Ｍ ａｘａｍおよびＧｌｌｂｅｒｔ％ｉｎ　勤尤匝。 ’　ｍ　（ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏ１ｄａｖｅ、編）、ｆｊ、　ｐｐ、　４ ９９−５６０　（１９８０））することにより確認した。 これらの手法によりプラスミドが産生され、各プラスミドは、上記および図１に 示した３０ｂｐを欠失した配列の１つを含んでいた。ＬＦＡ−３コーディング配 列中にＭＳ７欠失を含むプラスミドは、プラスミドｐＬＦＡ３ＭＳ？−４Ａと名 付けた。 裏１ｕ１主 プ　スミドの 実施例１に従ってＬＰＡ−３コーディング配列から３０ｂｐセグエントを連続し て欠失させてｉｌ＆Ｉしたプラスミドを、発現ベクターを構成するために用いた 。Ｍ５４、Ｍ２Ｓ、Ｍ２Ｓ、Ｍ５７、Ｍ５Ｓ、Ｍ２ＳおよびＭｇ２をそれぞれ欠 失したセグメント（図１を参照）を有する１００μｇのプラスミドを、１ｍｌエ ンドヌクレアーゼ（１００ユニット、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｏｉｌａｂｓ 、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｅｈｕｓｅｔｔｓ）で消化した。ＭＳ？、Ｍ ｇ３およびＭＡ５について、５′末端の突出を標準的なりレノ−（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｆｏｌａｂｓ）反応混合物（ＭａｎｉａｔｉＳら、前出）を用い て埋め、平滑末端を有する制限フラグメントを生成した。このフラグメントを、 電気溶出により、０．７％のＴＡＥアガロースゲルから精製した。 次いで、ゲルで精製し平滑末端化したＮｏｔｌフラグメントを、１５℃で一昼夜 Ｔ４リガーゼを用いて、真核発現ベクターｐＢＧｇ６８ＰＹ　（Ｄａｉｌｅｙら 、４．　１４．　ｐＩ）、７３９−４９　（１９８５））　のＳｍａ　１部位に 個々にクローニングした。Ｍ５４、Ｍ２Ｓ、ＭＳＢおよびＭＳ＋１のＮｏｔ　Ｉ フラグメントを上記のようにゲル精製し、Ｎｏｔｌ消化の発現ベクターＰＭＤＲ ９０２に連結した。得られた連結体を用いてＥ、ｃＱＩＬ　ＪＡ２２１を形質転 換し、所望の挿入断片を宵する組換えプラスミドを含む形質転換体の陽性コロニ ーを、上記のように、コロニーハイブリダゼーシ璽ンによって同定した。ベクタ ー中のＭ５７、Ｍｇ３およびＭ６５挿入断片の配向を、七ＡＲ１消化により確認 した。正しく配向する挿入断片に対しては、消化によって５６００．４０００、 およびＺｏｏ　ｂｐのフラグメントが生じ、それらのフラグメントは０．７％の アガロースゲル上で分離される。Ｍ５４、Ｍｇ５、ＭＳＢおよびＭ５ｇ挿入断片 を含むプラスミドでは、配向は、−１Ｉ消化分析により決定し、ここで正しい配 向は、６５９９ｂｐ、　１１８５ｂｐおよび５０６ｂｐの７ラグメントを生成し た。　すべての７ラグメントを、ＤＮＡ配列決定により証明した（Ｍａｘａ■お よびＧ１１ｂｅｒｔ、前出）０ ＬＦＡ−３のＭｇ４、Ｍ２Ｓ、ＭＳＢおよびＭＳＢの欠失変異体をコードするＤ ＮＡを有する組換え発現プラスミードを、１）Ｊ−１１により直線化し、Ｊ、　 Ｂａｒｓｏｕｔａの公開されたプロトコル（射θユ旦１０一旦お口、、、　、Ｂ 、　ｐｐ、　２９３−３００　（１９９０））に従って、チャイニーズハムスタ ーの卵巣（（ＨＯ）細胞にエレクトロポレーションを行った。Ｍ５７、Ｍｇ３お よびＭ６Ｓ欠失変異体をコードするＤＮＡを有するプラスミドをＮｒｕｌを用い て直線化し、上記のようにＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションを行った。但し 、Ｎｒｕ［で消化した１９℃ｇのＤＮＡは、ＥｃｏＲＩで消化した１μｇのＳＶ ２　ＤＮＡ　（ＤＨＰＲ’）および超音波破壊した３８０μｇのサケの精子ＤＮ Ａと共に、−２０”Ｃで一昼夜エタノール沈降させた。ＣＥＩＯ細胞（１ｘ　１ ０７）を、ＢｉｏＲａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓａｒを用いて、２８０ボルトで、 共沈篩させたＤＮＡでエレクトロポレーションを行った。 エレクトロポレーション後、細胞を、アルファ″ＭＥＭ、　１０％の胎児ウシ血 清（ＦＣＳ）　、４ｍＭのし一グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン中 の２つの１００ｍｍプレートにまき、次いで３７℃で４８時間インキュベートし た。そのプレート中の細胞を、アルファーＭＥＭ、　１０％のＦＣＳ、　４ｍＭ のし一グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンの入った５つのｔｏ（１＋ ＋箇プレートに分配し、３７℃で５日間インキュベートした。次いで、この細胞 に、ＭＳ？、Ｍｇ３およびＭ６５ニ対しテ２００ｎＭｆ）　メトトレキセート、 Ｍ５４、Ｍ２Ｓ、ＭＳＢおよびＭＳＢに対して５０ｎＭのメトトレキセートを補 給したアルファー完全培地を供給した。各プレートを９０％集密にし、次いでｓ 　ＦＡＣＳ　（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ ｏｒｔｅｒ　）によりアッセイし、ＬＦＡ−３欠失変異体でトランスフェクトし たＣＨＯ培ｌＩ物のいくつかが、変異形態のし′ＦＡ−ｓを発現したか否かを決 定した。 案ｍ トランスフェクトされた　の 実施ｇｑ２において調製され、メトトレキセートの存在下で９０％集密にした、 トランスフェクトされたｃ■ｏ細胞を、バンク７、　（ＩＩＡＮＸｓ）　ＢＳＳ 培地（Ｃａ”およびＭｇ”を含まない、ｐＨ７，０）　７２回すすぎ、ハンクス （Ｃａ”およびＭｇ”を含まない、５＋ａＭのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）培地で 取り出した。約２　ｘ　１０５個の細胞を、冷えた（０℃〉洗浄緩衝液（ＰＢＳ 、　Ｏ，Ｌ％ＣＤ　ＮａＨｚ、０．５％〕ｆｙ　’ｙ血清アルブミ７　（ＢＳＡ ）　、ｐ１１７．２）の１００μｌ溶液中に再懸濁し、−次抗体を加えた。−次 抗体は、抗ＬＦＡ−３Ｍａｂ　ＴＳ２／９腹水（例えば、Ｄａｎａ　Ｆａｒｂｅ ｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ がら入手した、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、Ｐ　ｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃａ ｄ、　Ｓｃｌ　ＵＳＡ、７９、　ｐｐ、　７４８９−９３　（１９８２）を参照 のこと）；抗ＬＦＡ−３ＭＡｂ　７Ａ６　（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｔ ｉｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡから入手した、１．６ｕ　ｇ／ｍｌ）　；または抗ＬＦ Ａ−３ポリクローナルウサギ抗血清２０２　（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ。 から入手した）のいずれかであった。すべての−次抗体が、ＣＤ２のＬＦＡ−３ への結合を阻害することは公知である。使用される一次抗体の量は、通常、１と ２μｌとの間であった。細胞を、０℃で４５分間インキコベートし、洗浄緩衝液 で２回洗浄した。 次いで、フルオレセインで標識した二次抗体を加え、混合物を、０℃で３０分間 インキュベートした。モノクローナル抗体で分析する場合には、二次抗体は、フ ルオレセイン（ＤＴＡＦ）Ｍ結合ｔ、タアフィニティー精製ぎれたヤギ抗マウ２ Ｆ（ａｂ）２１８Ｇ（Ｈ＋Ｌ）　（Ｊａｅｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｙｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　Ｃ Ａ）であり、ポリクローナルウサギ抗血清２０２で使用する場合には、二次抗体 は、フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋ Ｌ）　（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、　Ｐｅｎｎ ５ｙｌｖａｎｉａ）であった〇二次抗体でインキュベーション後、細胞に３００ μｌのＦＣＳを重ね、洗浄緩衝液で２回洗浄し、３００μｍのＬ　ｘ　ＰＢＳ中 に再懸濁し、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　２０５２チユーブに移し、セルンー ターで読み取った。 図２を参照すると、ＦＡＣＳ分析により、欠失変異体Ｍ５７（図２ＡおＪ−び２ Ｂ）　、ＭＡ５（図２０および２　Ｄ）　、Ｍｇ３　（図２　Ｅおよび２Ｆ）、 Ｍ５４（図２Ｇおよび２Ｈ）、Ｍ２Ｓ（図２Ｉおよび２Ｊ）、ＭＳＢ（図２にお よび２Ｌ）、およびＭＳＢ（図２Ｍおよび２Ｎ）を含む発現ベクターでトランス フェクトされた細胞は、抗ＬＦＡ−３ポリクローナル抗血清２ｏ２（図２Ａ、２ Ｃ，２Ｅ、２Ｇ、２　ｒ、２に、２Ｍ）によって認識された表面タンパク賃を発 現した。しかし、抗ＬＦＡ−３ＭＡｂｓ　ＴＳ２／９および７Ａ６は、ＭＡ５お よびＭ５３欠失変異を有するトランスフェクタントのみに結合し、Ｍ５７、Ｍ５ ４、Ｍ２Ｓ、ＭＳＢまたはＭ５１１領域を欠失するトランスフェクタントには結 合しなかった（図２Ｄ、２Ｆと、図２Ｂ、２Ｈ，２Ｊ、２Ｌ、２Ｎとを比較する こと）。これらの結果より、それぞれ、欠失変異体Ｍ５４、Ｍ２Ｓ、ＭＳＢ、Ｍ Ｓ？およびＭ５Ｓ（図１を参照のこと）において、ＬＦＡ−３タンパク質から欠 失゛された、Ｍ５４、Ｍ２Ｓ、Ｍ２Ｓ、Ｍｓ７ｉよびＭ５ｇセグメントは、ＬＦ Ａ−３分子のＣＤ２認職において重要であることが示された。 裏立五エ ジャー力・・ト　Ａアーセイ Ｍ５７欠失変異体をトランスフェクトされたｃＨｏ細胞（”Ｍ５？／Ｃｌ１ｌＯ ゛細胞）、ＰＩ結合ＬＦＡ−３を発現させるプラスミドｐ２４（Ｗａｌｌｎｅｒ ら、ＰＣＴ特許出願Ｗ０９０１０２１８１を参照のこと）でトランスフェクトさ れたＣＩＯ細胞（”Ｐ２４／Ｃ■０”細胞、正の調節）、および正常ＣＨＯ細胞 （陰性のコントロール）をテストすることにより、これらの細胞の、ＣＤ２を発 現させるジャーカット細胞を結合する能力を調べた。 Ｍ５７／ＣＩ（０細胞、Ｐ２４／Ｃ■０細胞、およびＣＨＯ細胞（１ｘ　１０５ ）を６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の別々のウェルに添加し、ＲＰＭＩ完 全培地で２回洗浄した。Ｄｒ、　Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　（Ｄａｎ ａ　Ｆａｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃ ｈｕｓｅｔｔｓ）からの寄贈のジャーカット細胞（ＣＤ２”）を、ＲＰＭ　Ｉ、 １０＄ＦＣＳ１４　ｍＭ　Ｌ−グＡｔ９ミン溶液で３回洗浄し、その後、５　ｘ 　１０’の細胞を、各々のウェルに添加して０°Ｃで４時間インキュベートした 。その後、ＲＰＭＩでウェルを３回穏やかに洗浄し、顕微鏡を用いて４０倍およ び１００倍の倍率で、細胞−細胞結合を調べた。 図３を参照すると、ＰＩ結合ＬＦＡ−３を発現させる、陽性のコントロール細胞 は、ＣＤ２を発現させるジャーカット細胞を結合したく図３Ｃ）が、それに対し て、ＭＳ７７ＣＯＯ細胞は、トランスフェクトされなかった（ＦＬＡ−３−）Ｃ ＩＩＯ細胞（図３Ａ）と同様、ジャーカット細胞を結合できなかった（図３Ｂ） 。 実」１匠」− Ｍ５７ＣＯか゛のｍＲＮＡの　ノーザンブロ・・トモツクローナル抗体、すなわ ちＭＡｂｓ　ＴＳ２／９および７Ａ６がＭ５７／Ｃｌｌｌ０細胞に結合できなか ったのは、変異体ＬＦＡ−３遺伝子の非効率的な発現よりもむしろ、ＭＳ？　Ｃ Ｄ２結合領域を欠いた表面ＬＦＡ−３変異体によるということを、さらに確認す るために、Ｍ５７／ＣＨＯ細胞のｍＲＮＡを、ノーザンプロットにより分析した 。 １００■プレート上の約１　ｘ　１０７のＭＳ？／Ｃｌｌ０細胞からのＲＮＡを 、次のように単離した：増殖培地を取り出し、２■ｌの抽出緩衝液（５０ｗＭ　 Ｔｒｉｓ−ＣＩ　＜ｐＨ７，５）、１％ＳＤＳ、　５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、使用直 前に１００μｇ／膳！プロテイナーゼＫを添加）を添加した。プレートを穏やか に振りながら３７℃で２０分間インキュベートした。粘性の細胞溶解産物が生じ 、これを５０■ｌの試験管に収集した。同容量のフェノール：クロロホルム：エ ーテル（５０：５０：１）ヲ添７［し、混合物を短時間ボルテブクスによって攪 拌した。混合物を最高速度で１５秒間、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ミキサ ー（にｉｎｅ■ａｔｉｃａ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）でホモジェナイズする ことにより、ＤＮＡを剪断した。混合物を１５菖ｌのコレックス（Ｃｏｒｅｘ） チューブに注入し、４℃で１０分間、１０，０００　ｒｐｍで遠心分離した。 遠心分離した後、水相を回収し、ＮａＣ１を添加して０．２５Ｍにした後、１容 量のイソプロパツールを添加した。この混合液を１０分間、ドライアイス上に載 置し、解凍して４℃で１５分間、１０、Ｇｏｏ　ｒｐ鳳で遠心分離した。 クスによって攪拌した。１２　Ｍ　ＬｉＣ１０，９■ｌを添加しく２．８Ｍにし て）、懸濁液を４°Ｃで少なくとも４時間放置した。溶液中に５Ｓ　ＲＮＡおよ びＤＮＡが残存し、その他のＲＮＡ画分は沈澱した。この溶液を、４°Ｃで少な くとも１５分間、１０．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。 このベレットを、３６０μｌの蒸留水に再懸濁して、工・ノペンドルフ（Ｅｐｐ ｅｎｄｏｒｆ）チューブに移した。４０μｍの３Ｍ　ＮａＡｃ（ｐＨ５，２）お よび１■ｌのエタノールを添加し、その後、混合液を一７０℃で５分間冷却し、 −２０℃で１５分間冷却し、遠心分離し、エタノールですすぎ、４００μｌの０ ．３Ｍ　ＮａＡｃに再懸濁した。エタノール（１■ｌ）を添加し、懸濁を反復し た。遠心分離後に回収されたＲＮＡを、１００μｌの蒸留水に再懸濁した。 ＲＮＡ　１０Ｍｇを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動させ、 ジェネスクリーン（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ）ニトロセルロース膜（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に移して３２ｐ標識したプローブにハイブリダイ ズさせた。コントロールとして、Ｍ２Ｓ、　３／ＣＨＯ細胞系（組換え可溶性Ｌ ＦＡ−３を発現する、Ｂｉｏｇｅｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手〉から抽出したＲＮＡを、同一ノーサンプロ ット上で分析した。ノーザンプロット分析（図４）は、Ｍ５７７ＣＨＯ細胞中で ＭＳ７　ＲＮＡが効率的に合成されたことを示した。 裏凰透１ −３　の　。 Ｍ５７／ＣＨＯ細胞の表面上に発現された変異体ＬＦＡ−３中の特異抗体詰合ド メインの欠失を証明す菖ために、ＭＳ７７ＣＨＯ）ランスフェクタント、トラン スフェクトされていないＣＩＯ細胞、およびＰ２４／ＣＨＯトランスフェクトン ト（Ｐｌ結合ＬＦＡ−３を発現する）を１２５１で表面標識し、表面膜を界面活 性剤で破壊した後、３つの一次抗体調製物（すなわち、ポリクローナル抗血清２ ０２、輩Ａｂ　ＴＳ２／９、およびＭＡｂ　７Ａ６）の各々を用いてＬＦＡ−３ を免疫沈降させた。 Ｓ　ｍＭ　ＥＤＴＡを補給したＰＢＳ”　（すなわち、ｃａ４４およびＭｇ−を 含有しないＰＢＳ）に懸濁した、Ｍ５７／ＣＨＯ細胞、正常Ｃｌｌ０細胞１．お よびＰ２４／Ｃ■Ｏ細胞の約１０７（各々）をＰＢＳ”で３回洗浄し、０．５■ ｌのＰＢＳに再懸濁した。洗浄した細胞を、前もって５０Ｍｇの１．３．４．６ −テトラクロロ−３α、６α−ジフエニルグリコールリル（■０ｄｏ−Ｇｅｎ、 　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｌｏ−Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ｌ１ｌｉ ｎｏｉｓ）の１００μＩ　ＣＢＣ１ａ溶液でコートしたガラスチューブ（１２ｘ 　７５　ｍｍ２）に添加し、窒素中で乾燥させた。使用直前に、チューブをＰＢ Ｓですすぎ、その後、１２５ヨード（１ｍｃｉ）を添加して、チューブを、１０ 分毎にかきまぜながら３０分間氷上でインキュベートした。 インキユベートした後、ヨード化した細胞を、１０■ｌのアルファーＭＥＭ、　 １０％ＦＣＳ、４　ｄ　Ｌ−グルタミンに添加した。細胞を遠心分離し、５　ｍ ｌの同一の培地で２回洗浄し、その後、１　ｍｌのＰＢＳに再懸濁して、再び遠 心分離した。その後、洗浄した細胞を、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、 エタノール中でｔ７　ｍｇ／ｍｌ）を２（１■ｌ含む１　ｍｌのＤＯＣ緩衝液（ ２０＋＊Ｍ　Ｔｒｉｓ／Ｃ１，、ｐｌｉ？、３；　５０　ｍＭ　ＮａＣ１，，０ ，５％デオキシ−コル＃　（ＤＯＣ）　、　０．５％ＮＰ４０）への樽懸濁によ って溶解させ、その後、氷上で３０分藺インキコベートした。その後、溶解産物 を４°Ｃで１０分間微小遠心し、＋′Ｉ標識した表面分子を含む上溝を取り出し た。 上述のヨード化で得た溶解産物を、５０μｌのプロティンＡ−セファロースに接 触させて室温で１時間ロッカー上でインキュベートすることにより、前もって澄 ませた。各々の試料に対して溶解産物１００μ】を取り出し、３００μｌのＤＯ Ｃ緩衝液と混合した。この混合液を、遠心分離し、得られた、澄んだ上清を、別 のチューブに移した。 一次抗体を、澄んだ上清の各々の試料に添加した：ポリクローナル抗ＬＦＡ−３ 抗血清２０２を、最終濃度４０μｇ／ｍｌで用いた；Ｍａｂｓ　ＴＳ２／９．７ Ａ６、およびコントロールのモノクローナル抗体であるＭＯＰＣ−２１（ＩｇＧ １、ＬＦＡ−３に特異的ではない）を５μｇ／＋ｗｌで用いた。１００μｌのＤ ＯＣおよび２μｍのプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦを添加し、混合液を２５℃の室 温で２時間、または４℃で一晩、ロッカー上でインキュベートした。 インキュベートした後、３０μｌのプロティンＡ−セファロース（ポリクローナ ル抗血清２０２試料用）または、１５μｌの抗マウスＩｇＧ−アガロース（Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）（ＭＡｂ試料用）を試料に添加し、その後 、室温で２時間ロッカー上でインキュベートした。その後、混合液を２分間遠心 分離して、上滑を注意深く取り出し、廃棄した。その後、１ｍｌのＤＯＣ緩衝液 を添加し、ベレットをボルテｌクスによる攪拌によって再懸濁した二その後、再 懸濁した物質をＤ″ｏｃ緩衝液で３回洗浄した。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析用の試料を調製するために、３０μ ｌのＳＤＳ試料緩衝液を添加し、試料を６５℃で１５分間加熱した。その後、試 料を２分間遠心分離し、上溝を取り出して電気泳動のために保存した。１５μｍ の上清を、変性用の１０−２０％グラジェントポリアクリルアミドゲル（Ｄａｆ ｉｅｈｉ　５ｙｓｔｅ＋＊、　Ｅｎｐｒｏｔｅｅｈ）に流し、オートラジオグラ フィーを実施することにより、免疫沈降された表面タンパク質を同定した。 図５は、Ｍ５７／ＣＨ０１正常Ｃ）１０．およびＰ２４／Ｃ１ｌ［Ｏ細胞からの 抗体沈降ＬＦＡ−３表面タンパク質を示す、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのオ ートラジオグラフである。このゲルは、ＴＳ２／９．７Ａ６、およびポリクロー ナル抗血清２０２が、ＰＩ結合ＬＦＡ−３を発現させるＣＨＯ細胞から、ＬＦＡ −３を沈降させたことを示した（レーン９．１０．１１）。対照的に、ポリクロ ーナル抗血清２０２だけが、欠失変異体ＭＳ７　ＬＦＡ−３遺伝子を発現させる ＭＳ？／ＣＨＯ細胞から、ＬＦＡ−３表面タンパク質を沈降させた（レーン４） 。 支敷匠工亙主塁Ｉ Ｍ５７欠失変異体（図１参照）において取り出した１ｏアミノ酸領域は、Ｎ結合 のグリコジル化部位に隣接しているが、これを含んではいない。ＭＳ７欠失の領 域が直接ＣＤ２結合に含まれるのか、あるいは、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメイ ン中で高次構造変化を引き起こすことによって間接的にＣＤ２結合を破壊させる のかを決定するために、２つの追加実験を実施した。 −まず、３つの大きな欠失変異体を産生じた。その各々は、本来のＬＦＡ−３分 子に比べて５９のアミノ酸の範囲を欠いていた。 欠失した領域は、図６に下線で示され、これらをＭｌｏｏ、Ｍｌｏｌ、およびＭ ｌｏｌと命名した。この実験の目的は、大きなＭｌｏｌおよびＭ１０２欠失に固 有の高次構造変化は、ＭＳ？領域（図１参照）の認識を変えるのかどうかを決定 すること、および、ＣＤ２結合ドメイン全体がＭ１００領域内に含まれていると いうことを示すことであった。 次に、アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＱニア）　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｖ ａｔ　ＴｙｒＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅ ｕ　Ｔｈｒ　ｒｌｅ　Ｔｙｒ　（成熟ＬＰＡ−３のアミノ酸＋ｓｏ−＋ａｓ　＜ 図１参照））を有する合成オリゴペプチドであるＬＰ０１を単離して固体基質に 固定し、その後、ジャーカット細胞ロゼッテイングアツセイで用いることにより 、ＣＤ２発現細胞が、ＬＦＡ−３の、単離されたＭ５７領域を認識するかどうか を決定したく図１参照）。 クレオチド配列を示し、Ｍｌｏｏ、Ｍｌｏｌ、およびＭｌｏｌと命名された３つ の領域を下線で示す。これら３つの領域を、ＬＦＡ−３ｃＤＮＡから欠失させる ことにより、３つの大きな欠失変異体の発成より下流（３°から）の１５塩基に 相補的な配列から成る３ｏ塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。 大きな欠失変異体を産生ずるために使用した合成オリゴヌクレオチドを以下に示 す。 ｆＪ！Ｌｌａｊヌクレオチドに　・　たセグメント５ＥＱ　ＸＤ　Ｎｏ：３０　 １０９−１２３＋３０４−３１　ＭｌＯＯ５ＥＱより　ＮＯ：３１　２８９−３ ０３＋４８４−４９８　ＨｌｏｌＳＥＱ　より　ＮＯ：３２　４６９−４８３＋ ６３４−６４８　Ｍ１０２Ｚｏｏ　ｎｇのＬＦＡ−３ｃＤＮＡを用いた以外は、 実施例１で述べたようニヘテロ二本鎖化を行った。６５℃で１　ｘ　ｔｏ’のＣ ＰＭ／ｍｌ　３２Ｐ−ＡＴＰＩ　−Ｊ−−セ処理のオリゴヌクレオチドを用いて コロニーハイブグダイゼーションを実施し、５０℃で０．Ｓｘ　ＳＳＣで洗浄し た。ムｃｉＲ＋消化、および、０．７％ＴＡＥアガロースゲル上における２９０ ０　ｂｐおよび５００　ｂｐフラグメントの単離によって、陽性の部分をスＡ− ３ｃＤＮＡを切り出すことにより、発現ベクターを構築した。 真核発現プラスミドＰＭＤＲ９０２（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉ ｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｅｂｕｓｅｔｔｓより入手）をｓａμｇずつ、５０ユニツ トの１！；ＬＬＩで消化し、欠失変異体Ｍ１００．　ＭＩＯｌ、およびＭｌｏｌ を含む、単離したし１１フラグメント（０，０６ｐＩａｌ）を０．０２　ｐｏｏ ｌ　ＰＭＤＲ９０２ＤＮＡに連結し、連結した産生物を用いて￥ＬＩＬＬ　ＪＡ Ｚ２１を形質転換した。 各々ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０．　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１およびＳＥＱ　１ ０　ＮＯ：３２の配列を育するオリゴヌクレオチド１ｇ、１９および２０をプロ ーブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションにより、陽性のクローンをス クリーニングした。ハ」１１制限分析によって挿入断片の配向を決定し、それに よって、２０．７％ＴＡＥアガロースゲル上に約６５９９．１７＄７および５０ ０　ｂｐのバンドを生成して正確に配向した構築物を得た。上述のようなりＮＡ 配列分析によって配列を確認した。Ｍｌｏｏ、ＭＩＯＩおよびＭＩＯＺの欠失変 異体を含む、得うレタ組換工発現フラスミトを各々、ｐＰＭＤＲＭｌｏｏ−４、 ｐＰＭＤＲＭｌｏｌ−１およびｐＰＭＤＲＭ１０２−８と命名した。実施例２と 同様に、得られた発現プラスミドをＣ［ＩＯ細胞にエレクトロポレーシッンを行 った細胞を、２ＳｎＭおよび５０　ｎＭメトトレキセートを含ム培地に分離した 点が実施例２と異なる。 Ｍ１００／ＣＨＯ５ＭＩＯＩ／ＣＨＯおよびＭ１０２／ＣＨＯ）ランスフェクタ ントを、上述の実施例４で述べたように、ジャーカット細胞結合アッセイに供し た。結果を図７に示す。ＭＩＯＩ／ＣＨＯ細胞（図７Ｃ）およびＭ１０２／ＣＨ Ｏ（図７Ｄ）は、ＬＦＡ−３の、元来のＭＳ’ｊＣＤ２結合領域を有する表面タ ンパク質を表し、ジャーカッ）／ＣＨＯ細胞結合の凝集特性を示した。ＣＩ（０ コントロール細胞（図７Ａ）およびＭ１００／　Ｃｌ１Ｏ細胞（図７Ｂ）は、こ のような凝集を示さず、このことは、ジャーカット細胞によって認識されるＣＨ Ｏ細胞表面上の表面構造がないことを示している。 ８ペプチドへのジ　−カ・・　ト　ム 脱イオン水２ｍｇ／■ｌ中の、１．４　ｍｇの合成ペプチドＬＦσ８（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯニア）またはコントｏ−ルｃＤＢ型肝炎ペプチドＭＸＣ−０１（ＳＥ Ｑｌｏ　ＮＯ＋４）を、以下のプロトフルに従って、１００μｍのアガロースＩ ルビーズ（＾ｆｆ１−Ｇｅｌ　１０．　Ｂｉｏｉａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）に結合した＝１００μｍのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ　１０スラ リーを小さなブーフナ−漏斗に移して溶媒を除いた。冷たい（４℃）脱イオン水 ３ベツド容量でビーズを洗浄し、７００μｌのＬＦＯ８溶液に移し、その後、４ °Ｃで４時間ロッカー上でインキュベートした。ＬＰ０１の結合前および後に上 清について撮ったスペクトルは、８０％の結合効率が達成されたことを示した。 結合後、ＬＦＯ８ビーズ、またはＭＸＣ−０１ビーズをエタノールアミン／ＨＣ Ｉ（９３１Ｍ、　ｐ［＋７．９）とともに穏やかに振りながら一晩４°Ｃでイン キュベートすることにより、未反応の結合部位をブロックした。その後、ブロッ クしたビーズを、０．５　Ｍ　ＮａＣ１を補給したＰＢＳで３回洗浄し、１０％ ＦＣＳを補給したＰＢＳで３回洗浄した。 ジャーカプト細胞（２ｘ　ｔｏ５）を、ＲＰＭＩ、４　ｙａＭ　Ｌ−グルタミン 、１０％ＰＢＳＴ　２回洗浄し、２．５または１５　μｌ＋７）ＬＦＯ８／Ａｆ ｆｉ−Ｇｅｔ　１（１”−ズ、またはＭＸＣ−０１／Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　１Ｇビ ーズとあわせて、最終容量２０μ］にした。混合液を室温で３０または６０分間 インキコベートした。インキュベートした後、９６ウエルの平底プレート（Ｃｏ ｒｎｆｎｇ）中の２０ＱｔｔｌのＲＰＭ　Ｉに細胞を移し、４０倍および１００ 倍の倍率で顕微鏡で観察した。図８Ａおよび８Ｂは、ＬＰＯ８／Ａｆｆｉｇｅｌ ビーズをジャーカット細胞に接触させた、特徴的な結果を示し、この接触の結果 、コートしたビーズがジャーカット細胞の表面に結合した。図８０は、ジャーカ ット細胞の表面に結合できなかったＭＸＣ−０１／Ａｆｆ　ｉｇｅ＋ビーズの、 特徴的な結果を示す。 支敷五ｌ友【正Ｕ 本来のＬＦＡ−３ＯＮ末端の８９アミノ酸を有するＣＨＯ細胞上にＰ１結合表面 ポリペプチドを供給する、別の欠失変異体を調製した。図９を参照すると、ＰＩ 結合ＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡから欠失されたヌクレオチドを下線をつけ た領域、Ｐ　１Ｍ３で示す。上述（実施例１）と同様のへテロ二本鎖欠失変異誘 発法を用ｔ）て、ＰＩＭ３ヌクレオチドを欠失させた。この場合、５°−３°配 列（ＳＥｏ　１０　ＮＯ＋１ｌ）ＴＡＡＴＧＧＡＴＴＧ　ＣＴＡＡＧＡＡＡＧＡ 　ＡＣＴＴＣＡＴＧＧＴを有する３０塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド（オ リゴヌクレオチド３２０．０３）を、欠失変異誘発に用いた。 ＰＩ結合ＬＦＡ−３をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドｐ２４（１００ｎｇ ）を、Ｎｏｔｌで消化し、大きな制限フラグメント（ＰＩ結合ＬＦＡ−３コーデ ィング配列を欠く）を単離した。ざらにｐ２４　ＤＮＡをＳｅａ　＋で直線化し た。大きなｉｌｌ制限フラグメントおよびＳｃａ　Ｉで直線化したＤＮＡを変性 し、オリゴヌクレオチド３２０．０３と混合し、実施例１で述べたように、再ア ニーリングさせた。アニーリングの後、ヘテロ二本鎖内の隙間を充満し、フラグ メントを実施例１で述べたように連結した。 その後、充満し、連結したヘテロ二本鎖をＬ！ｔｉ１ｉＪＡ２２１Ｊこ形質転換 し、上述のように、６０°Ｃで３２Ｐ＃Ｉ識の３２０．０３第１ノゴヌクレオチ ド（１ｘ　１０’　ｃｐ冒／璽ｌ）を用いたコロニー／）イブリダイゼーシ１ン により、形質転換体をスクリーニングした。ハイブリダイゼーションフィルター を６５℃で０．５Ｘ　ＳＳＣ中で洗浄し、陽性コロニーをオートラジオグラフィ ーによって同定した。 陽裡コロニーの各々から、ブラ反ミドＤＮＡを単離し、凪１で消化した。プラス ミドのうちのひとつであるｐＰ＋Ｍ３−６を、Ｎｏｔｌで消化すると、２６４８ および６４０　ｂｐのフラグメントが生成され、これにより、ｐＰＩＭ３−６が 、ＰＩ結合ＬＦＡ−３コーディング配列において所望のＰ２Ｎ２が欠失されたこ とを確認した。 ｐＰＩＭ３−６の６４０　ｂｐ　Ｎｏｔｌフラグメントを、発現ベクターＰＭＤ Ｒ９０２（Ｄｒ、　Ｍ、Ｄ、　Ｒｏｓａ、　Ｂｉｏｇｅｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｃａ ｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕａｅｔｔｓの寄贈）のｌｉ部位にクローニ ングし、これを用いて■ＬＬＪＡ２２１細胞を形質転換した。プローブとして３ ２ｐ標識した３２０、０３オリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリダイゼ ーションにより、形質転換体をスクリーニングした。その後、陽性のコロニーか らのプラスミドを単離し、ｐｖｕｌｌを用いた制限酵素分析により、ＤＮＡ挿入 断片の配向を決定した。組換えプラスミドｐＰＭＤＲＭ３−１０は、６３９９． １６３４および４９５１）ｐの加４＋１フラグメントを含み、このことは、この プラスミドが、変異した、ＰＩ結合ＬＦＡ−３遺伝子をＰＭＤＲ９０２ベクター 中における発現に適切な配向で含むことを示す。 Ｐ、１Ｍ３の 上述のように、ｐＰＭＤＲＭ３−１０をＣＨＯＤＨＦＦＩ−細胞にエレクトロポ レーシヨンを行い、２５および５０　ｎＭメトトレキセートで増幅した。集密増 殖のプレートからの細胞を、上述のように、ＭＡｂｓＴＳ２／９および７Ａ６を 用いたＦＡＣ３によりアッセイした。Ｐ２Ｎ２．２５．２と命名した細胞系中に 発現した、ＬＦＡ−３のＰＩＭ３欠失変異体形態は、ＣＤ２／ＬＦ＾−３？Ｊ！ 合体の形成産生に関与するエピトープを表し元。 Ｐ２Ｎ２．２５．２細胞主のＴＳ２／９および７Ａ６によって認識されたタンパ ク質が、ＰＩが結合されているかどうかを決定するために、Ｐ２Ｎ２．２５．２ 細胞の表面上に発現したタンパク質の、ホス７アチジルイノシトール特異性ホス ホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣＳＢｆｏｇｅｎ。 Ｉｎｃ、から入手）処理による遊離可能性をテストした。Ｐ［Ｍ３．２５．２か らの細胞を、２枚の１００閣ｌ培養プレート間で７０パーセントの集密度まで増 殖し、上述のように、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）を補給したＰＢＳで取り出した。これ らの細胞の１／３を、１０％ＦＣ３，Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペンストレッ プミックス（ＩＸ）、および２５　ｎＭメトトレキセートを補給した１００μｌ のアルファーＭＥＭ中で、３７℃で４５分間、ＰＩ−ＰＬＣ（Ｉ　Ｂ　１；　Ｂ ｉｏｇｅｎ、　Ｉｎｃ、）で処理した。その後、細胞を、１５秒間エッベンドル フ微小遠心分離器で遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、　０．５％ＢＳＡ、 　０．１％アジ化ナトリウム、ｐＨ１，２）中で２回洗浄した。その後、洗浄し た細胞を、Ｆ　ＩＴＣ標識のヤギ抗マウスＩｇＧ（血清からの１＝５０の希釈） を含むＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。その後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗 浄し、３００μＩのＦ’ＢＳに再懸濁し、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５２ チューブへ移してＦＡＣ５分析した。 図１Ｏを参照すると、Ｐ２Ｎ２．２５．２の細胞は、細胞表面上に、ＴＳ２７９ によって認識され（図１　ＯＡ、破線）、旦つ、ＰＩ−ＰＬＣ処理によって細胞 表面から遊離可能な（図１（ＩＡ、点線）、タンパク質を発現する。クローンＰ ＩＭ３．２５．２の細胞中に発現するＰＩＭ３タンハク質は、ＣＤ２／ＬＦＡ− ３’ａ合体形成をブｏ　’ｙりするＭＡｂ　ＴＳ２／９に形成に必要な高次構造 要件を含むと結論づけられた。 ＰｒＭ３変異体［、ＦＡ−３タンパク質の発現を増加させるために、５０．１０ ０および２００　ｎＭのメトトレ牛セード中のｌ０ＸＦＣＳを補給したアルファ ーＭＥＭ中で、Ｐ２Ｎ２．２５．２クローンを増幅した。細胞を、９６ウエルマ イクロタイタープレート上に２０細胞／ｍｌの濃度でブレーティングし、Ｐ２Ｎ ２．２５．２で述べたように、集密状態になるまで増殖しく１２から１７日間） 、次のＰＡＣＳ分析のために１０Ｏｒａｍプレートになるまで拡大した。ＬＦＡ −３の、ＰＩＭ３変異体形態の発現を、７Ａ６　ＭＡｂ　（図１０Ｂ、破線）を 用いてモニターした点がＰ［Ｍ３．２５．２の場合と異なる。ＰＡＣＳ分析の結 果は、増幅された細胞系であるＰ２Ｎ２．２５．２．１００．１２が、ＰＩ結合 ＬＰＡ−３のＰＩＭ３変異体形態を約１０倍多い量で発現したことを示した。Ｐ ２Ｎ２．２５．２．１００．１２細胞をＰＩ−ＰＬＣ”ｌ？処理すると、ＰＩＭ ３変異体ＬＦＡ−３（図１０Ｂ、点線）の約８０％が遊離した。 爽胤匠旦 プラスミドＳＡ　４の ｐｓＡＢ１４４は、ＣＨ１領域およびヒンジ部のアミノ末端部分の第１のシステ ィン以外の、ヒトＩｇＧ１定常部配列を含む。ヒト！ｇＧＩＨ鎖定常部を、部分 的む１Ａヒト繊維芽細胞ゲノムライブラリー（ＥＭＢＬ１５ＸＳＤｒ、　Ｍａｒ ｋ　Ｐａ５ｅｋからの贈物）から単離した。ライブラリー１）ＮＡを、Ｌｌｄｌ ｌｒおよびＰＩ３１１で開裂した。約３　ｋｂに対応するＤＮＡフラグメントを 、−ｄｌｌ＋および出ｃｌｌを用いてｐｓｐａｓを開裂することにより産生した 、ｐｓＰ６ｓ（Ｐｒｏ＠ａｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の ベクターフラグメントに結合した。得られたプラスミドをｐＡＢｌと命名した。 プラスミドｐＡＢ１を、ＩｇＧＩＨ鎖定常領域を−コードするＤＮＡの源として 月いた。 ＩｇＧＩＨ鎖領域のｃＤＮＡコピーを単離するために、プラスミド’／ＣＡＭＩ −１ｇＧ１（ｐｓＡＢ１３３としても知られている）によって一過的にトランス フェクトされているＣＯ３７細胞から、ＲＮＡを調製した。 プラスミドＶＣＡＭ１−１　ｇＧ　１　（Ｄ構築は、ＰＣＴ特許出願Ｗ０９０／ １３３００ｉ、：記載されている。ＲＮＡを逆転写することにより、プライマー として逆転写酵素およびランダムな六量体を用いてｃＤＮＡを産生じた。４２℃ で３０分経過後、９５℃で５分間反応物をインキュベートして、逆転写酵素反応 を終了させた。その後、ＰＧＩ２（ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ１１、　桓Ｌ」、　ｐｐ、１４． １−１４１５（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ；　１９ａ９）を参照の こと）によりｃＤＮＡを増幅した。この時、以下のキナーゼ処理のプライマーを 用いた： 上記のキナーゼ処理のプライマーは、５ａ１１部位、および−：： ５’　ＧＴＡＡＡＴＧＡＧＴ　ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧ　ＣＣ入Ａを含み、これは 、ＩｇＧＩＨ鎖定常領域のカルボキシ末端リシンをコードし、その後には凪１部 位がある。 ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動、およびガラスピーズ溶 出によって精製することにより、プラスミドｐＨＮＯ３中にクローニングした。 プラスミドｐＮＮＯ３は、合成ポリリンカー配列を市販のプラスミドｐｔｌｃ８ （Ｐｈａｒ＋＋ａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ￥） から、制限エンドヌクレーアーゼ消化によって取り出し、合成ポリリンカー配列 を以下の新規な合成配列（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３７）に置換することにより構築 した。 精製されたＰＣＲ増幅のｃＤＮＡフラグメントをｐＮＮＯ３に連結した。 このｐＮＮＯ３は、論ＲＶで開裂し、脱リン酸化し、低融解アガロースゲル電気 泳動により精製したものである。連結反応を用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＪＡ２２１を 形質転換し、得られたコロニーをスクリーニングして、約７０Ｑ　ｂｐの挿入断 片を含むプラスミドを検出した。正確な挿入断片の同定を、ＤＮＡ配列分析によ って確認し、プラスミドをｐｓＡ８１４４と命名した。 プラスミド５Ａ１４９の プラスミドｐｓＡＢ１４９を以下のように構築した。ＬＦＡ３をコードするプラ スミドｐＨ７１６−６に、オリゴヌクレオチド３２Ｇ−０４および３２０−Ｏ５ を用いたＰＣＲ増幅を施した。オリゴヌクレオチド３２０−０４は、Ｎｏｔ１部 位、および以下のＬＦＡ−３シグナル配列の１位から７位のアミノ酸に対応する ヌクレオチドを含む。 オリゴヌクレオチド３２０−Ｏ５は、ＬＦＡ−３の８６−９２のアミノ酸に対応 し、以下の５Ｕ１１部位（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０）を含む：５’　ＡＡＧＴ ＣＧＡＣＡＴ　ＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡ　ＣＴＴＣＡＴ。 増幅したＤＮＡフラグメントを、ｐＮＮＯ３のベクターフラグメントに連結し、 瞼ＲＶによって開裂した。 パ邦上ｌΔ直！ 凪Ｉフラグメントが発現ベクターに挿入され得るように、ｐＪＯＤ−３（Ｂａｒ ｓｏｕ冒、Ｊ、、ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅｌ　ｉｏ　、、主、ｐｐ、２９３−３０ ０（１９９０））を改変することにより、アデノウィルス主要後期プロモーター から下流に単一のＮｏｔ１部位を挿入した。プラスミドＤＮＡをＮｏｔｌ開裂す ることにより、ｐＪＯＤ−３を直線化した。ムングビーン（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ ）ヌクレアーゼを用いて突出した（　ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）　５’末端を平滑 末端化し、低融解温度アガロースゲル電気泳動によって、直線化したＤＮＡフラ グメントを精製した。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、このＤＮＡフラグメント を再連結した。 その後、連結した分子を、ＬｉＱｕｊＡ２２１に形質転換した。コロニーをスク リーニングして、１１ｇ１１部位がないことを確認した。得られたベクターをｐ ＪＯＤ−５ΔＮｏｔｌと命名した。むユＩを用いてｐＪＯＤ−８ΔＮｏｔｌを１ ｍｌ化し、仔ウシアルカリホスファターゼを用いて５′末端を脱リン酸化した。 低融解温度アガロースゲル電気泳動により、直線化したＤＮＡフラグメントを精 製し、リーン酸化したオリゴヌクレオチρＡＣＥ１７５の存在下で連結した。 リン酸化したオリゴヌクレオチドＡＣＥ１７５は以下の配列を有する：　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：４１）　ＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ、連結混合物を、Ｌ並 ｌｊ、　ＪＡ２２１に形質転換し、コロニーをスクリーニングして、し１ｌ部位 を有するプラスミドの存在を確認した。所望のプラスミドをｐＭＤＲ９０１と命 名した。 ＤＨＦＲｃＤＮＡノ転写を制御するＳＶ４０プロモーター中の５Ｖ４０ｚンハン サーの２つの反復物を欠失させるために、ｐＭＤＲ９０１およびｐＪＯＤΔｅ− ｔＰＡ（Ｂａｒｓｏｕｍ、　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　９．　 ｐｐ、　２９３−３００（１９９０））の両方を、Ａａｔｌｌおよびわ１１［１ で開裂した。ｐＭＤＲ９０１からの２５７８　ｂｐ　Ａ１１Ｉｌ−ＬＵＩＩＩフ ラグメントおよびｐＪＯＤΔｅ−ｔＰＡからの５４２４　ｂｐ　Ａａｔｌｌ−石 ＩＩ＋フラグメントを、低融解温度アガロースゲル電気泳動によって単離し、そ れらを連結した。 Ｌｉ９ＬｕＪＡ２２１への形質転換の後、得られたプラスミド、ｐＭＤＲ９０２ を４１１１１した。その後、アデノウィルス主要後期プロモーターを含む、ｐＭ ＤＲ９０２のｌ、ＨＲＩ−Ｎｏｔｌフラグメントを排除し、それを、ヒトサイト メガロウィルス即時プロモーターおよびエンハンサ−を含むプラスミドｐｃＭＶ −Ｂ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）か らの８３９　ｂｐ　七ＡＲＩ−１ｇ＋７ラグメントで置換することにより、ｐｓ ＡＢ１３２を産生じた〇（以下余白） 四人Ｕシ匡口」腋 −ｐｓＡＢ１４４を５ａｉｌおよびＬ区■を用−いて開裂し、６９３ｂｐのフラ グメントを単離した。ｐｓＡＢ１４９を５ａｌｌおよびＮｏｔｌを用いて開裂し 、３６５ｂｐのフラグメントを単離した。２つのフラグメントを、Ｋｏｔｌを用 いて開裂し、そして仔ウシアルカリホスファターゼで脱リン酸化した５“部位を 有するｐｓＡＢ１３２に連結した。得られたプラスミドｐｓＡＢ１５Ｚは、［、 ＦＡ−３シグナル配列、成熟ＬＦＡ−３のアミノ末端の９２アミノ酸、ＩｇＧ１ のヒンジ領域のｌＯアミノ酸、およびＩｇＧ１のＣ８２およびＣ１，Ｉ３定常部 をコードするＤＮＡ配列を含有していた（図１２参照）。ｐｓＡＢ１５２で形質 転換したＥ、ｅｏｌｉ　ＪＡ２２１は、Ａｒ５ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ （受託番号５＄７２０）Ｊこ寄託されている。 びすｙヨ五へ１及 実施例１に記載のように、プラスミドｐＬＦＡ３Ｍ５７−４Ａは、３０ｂｐのＭ Ｓ？領域が欠失したり、ＦＡ−３をコードするＤＮＡ配列（すなわち、ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：９のヌクレオチド２４４−２７３）を含有する。このｐＬＦ＾３Ｍ Ｓ？−４Ａのコーディング配列を、シグナル配列およびＬＦＡ−３のＭ５７欠失 変異体の最初の８２個のアミノ酸をコードするＤＮＡを増幅させるために、オリ ゴヌクレオチド３２０−０４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ｇ）およびオリゴヌクレ オチド３２０−Ｏ５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０＞を用いてＰＣＲ増幅に供した 。ＰＣＲ増幅したＤＮＡを、低溶融温度アガロースゲル電気泳動で精製した。 精製し、ＰＣＢ増幅したＤＮＡを次に、プラスミドｐＮＮＯ３のＥｃｏＲＶ部位 に連結した。連結したＤＮＡをＬ工立Ｕ、ＪＡ２２１に形質転換させ、得られた 形質転換体を、約３００ｂｐの挿入断片を含有するプラスミードを得るため（Ｎ ｏｔ　Ｉ消化によう）スクリーニングした。所望の挿入断片の同定をＤＮＡ配列 分析により確認した。約３００ｂｐの挿入断片を含有する所望のプラスミドをｐ ＮＮＭ５７−１４と命名した。 １１互１づｐ」１区 プラスミドｐＮＮＭ５７−１４を凪！およびＳａｌ　＋を用いて開裂し、３１　 ｏｂｐの断片を、低溶融温度アガロースゲル電気泳動で単離した。この断片およ びｐｓＡＢ１４４の６９３ｂｐのＳａ　Ｉ　ｒ−４匹！断片（前出参照）を、Ｎ ｏｔｌ消化し、仔ウシアルカリホスファターゼ処理したｐｓＡＢ１３２　（前出 参照）に連結させた。連結反応混合物をＬｓｏｌｉ　ＪＡ２２１を形質転換する のに用いて、形質転換体コロニーをＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７の配列を有するγ −３２Ｐ−ＡＴＰ標識されたオリゴヌクレオチドを用いてハイブリダイゼーシヨ ンすることによりスクリーニングした。ｐｓＡＢ１３２中の挿入断片の所望の配 向を、６９１３および２０２９ｂｐのフラグメントをＰｖｕｌｌで消化して同定 することにより確認した。得られたプラスミドをｐＭ５７１ｇ−５と命名した。 ＤＮＡ配列分析により、９Ｍ５７１ｇ−５が、ＬＦＡ−３シグナル配列、ＬＦＡ −３のＭＳ７欠失変Ｘ体の最初の８２個のアミノ酸、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域 の１０個のアミノ酸、およびＩｇＧ１のＣ１２およびＣｌ４３定常部をコードす るＤＮＡ配列を含有することが確認された。 ＬＦＡ−３−１ｇ融合タンパク質、ＬＦＡ３ＴＩＰ　（ＬＦＡ−３（９２）Ｉｇ Ｇとも称される）を生産するために、プラスミドｐｓＡＢｌｓ２　ＤＮＡを、以 下のよ−うにエレクトロポレーションｌ’＝よりｃｏｓフ細胞にトランスフェク トした。Ｉ）ＳＡＢ１５２　ＤＮＡの一部分である４つの各２００μｇの７リコ ノトそれぞれを、３ｓｅｒｇの超音波処理したサケ精子ＤＮＡを用いてエタノー ル沈澱させた。ＤＮＡをベレット状にして、０．８ｍｌのｌ　Ｘ　ＨＥＢＳ　（ ２０ｍＭのヘヘｘ　／ｐｉ（７，（１５，１３７ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣ Ｉ、　０．７＋Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，６ｇＭデキストロース）中に再懸濁した。 ４つの集密Ｔ１５０フラスコ（８Ｘ１０７細胞）のＣＯＳ？細胞を、ＤＭＥＭ（ Ｇｉｂｃｏ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）　、１０％の ウシ胎児血清、４ｍＭのグルタミン中でのトリプンン処理により取り圧した。各 フラスコの細胞をそれぞれ１５ｍ１のコーニング（Ｃｏｒｎ　ｉｎｇ）ポリプロ ピレンチューブに移して、ＩＥＣ遠心機で１１００Ｏｒｐで４分間室温にてベレ ット状にした。培地を吸引して、細胞をＩ）ＮＡ−１（ＥＢＳ溶液中に再懸濁し て、Ｂｊｏ−Ｒａｄ　（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　ルクト ロポレーシコンキュベットに移した。キニベットをＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　 Ｐｕ、１ｓｅｒにセットして、２８０ボルトおよび９６０ａＦｄキヤパシタンス にてパルスした。細胞を１０＋ｅｌのＤＭＥＭ培地中に再懸濁して、上述のよう にＩＥｃ遠心機でベレット状にした。全ての細胞をＤＭＥＭ培地の２リツトルの 細胞培養器に接種して、培地をＬＦＡ３ＴＩＰタンパク質を精製するため７２時 間後に採取した。 トランスフェクトしたＣ０Ｓ７の培養培地中に分泌されたＬＦＡ３ＴＩＰの濃度 をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｆｉｓｈｅｒ　９６平底ウエルプレート（Ｃｏｒ ｎｉｎｇ　２５１１０）を、Ｉ　Ｘ　ＰＢＳで５ｇｇ／ｍｌに希釈した５０μｍ のヤギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉ＋ｓｍｕｎｏ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔａｒｏｖｅ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｆａ、　Ｃａｔａ ｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、１０９−００５−０１１８）でコート−した。これらのプレ ートを４ｔで一晩インキユベートした。 プレートを翌日ｄ）！２０で６回洗浄して、１５０μＩ／ウエルのブロック緩衝 液（ＩＸＰＢＳ中２％の正常ヤギ血清）でブロックした。 緩衝液を室温で２時間インキュベーションした後除去し、ならし培地を希釈度が 異なる希釈液に添加した。標準曲線を描くフントロールとして、ヒトＩｇＧ全体 の段階希Ｒ液ＣＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔ　 Ｇｒｏｖｅ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｏ、　０９ ９−０００−６０３）を同じプレートに入れた。室温での１時間−のインキ−ベ ージ・ン後、プレートを、ＩＸＰＢＳ中□、０１％のＴｖｅｅｎ　２０で４回洗 浄し、Ｆｃフラグメントに特異的であるアルカリホスファターゼ結合抗ヒｌ−１ ｇＧの１　：　５０００の血清希釈液（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｆａ、　Ｃａｔ ａｌ。 ｇｕｅ　Ｎｏ、　１０９−（１５５−０９８）を、５０μｍ／ウェルで各つｓ　 ）ｋに添加した。１時間後、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ　２０で６回洗浄 した。 プレートを、ｔｏ％ジェタノールアミン、ｐＨ９，６中１０＋＋＋ＭのＣａ２′ 、Ｍｇ２＋、の１：ＩＧの希釈液、および５ｌｇ／厘ｌの４−二トロフェニルホ スフェート（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａ ｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ、　ｃａｔａｌｏｇｕｅ　 ｎｏ、　７３８−３５２）を含有する溶液を用いて発色させた。反応を３Ｎ　Ｎ ａＯＨを用いて停止させ、プレートをＭｉｃｒｏｄｅｖｊｃｅｓマイクロプレー トリーダーの上テ４０５ｎＭで読み取った。 に≦　転　させたｃＨｏ、からのＥ、ＦＡ３ＴｒＰの生組換えＩ、ＦＡ３ＴＩＰ 発現ベクターを以下のように構築し、ＣＨＯ細胞中に安定に保持し、ＬＦＡ３Ｔ ＩＰの継続発現を得た。 ｐｓＡＢ１５２の配列をコードするＬＦＡ３ＴＩＰを含有するＬ区！フラグメン トを低溶融温度アガロースゲル電気泳動で精製した。フラグメントを発現プラス ミドｐＭＤＲ９０２のＮｏｔｌクローニング部位へ連結させた（実施例１１参照 ）。得られた連結反応物をｌｉｆ　ＪＡ２２１を形質転換するのに用いて、所望 の正しく配向された挿入断片を含有するコロニーを、田、目で消化した６５９９ ．２０５８、および４ｇ７ｂｐのフラグメントの存在により同定した。ｐＭＤＲ ９０２の正しい挿入断片の同定はＤＮＡ配列分析により確認した。 得られた組換え発現プラスミドをｐＭＤＲ（９２）Ｉｇ−３と命名した。 組換え発現プラスミドｐＭＤＲ（９２）　Ｉｇ−３を、Ｊ、　Ｂｓｒｓｏｕｍが 発表したプロトコル（ＤＮＡ　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、主、　ｐｐ、　２９３− ３００（１９９０））に基づいて、以下の点を変えて、Ｃｌ１Ｏ細胞にエレクト ロポレーションを行った。５０Ｍｇのむ、ｔＩｌ消化したプラスミドＤＮＡおよ び３ｓｅｒｇの超音波処理したサケ精子ＤＮＡをエレクトポレーションプロトコ ルに用いた。加えて、細胞を、２５またはＳＯｎＭのメトトレキセート（ＭＴＸ ）を補充したアルファー完全培地で選択し分泌されたＬＰＡ３ＴＩＰの発現レベ ルを測定するために、クローンを平底９６ウエルマイクロタイタープレートに移 して、集密になるまで増殖させ、ＥＬＩＳＡによりアッセイした（下記参照）。 ２５ｇＭのＭＴＸ、　ＬＦＡ３ＴＩＰ、　２５．１１の存在下で増殖させた１つ のクローンが培地１ｍｌ当り５−１０ＭｇのＬＦＡ３ＴＩＰを発現した。このク ローンを拡大して、さらに増幅させた。５０または１１００ｎのＭＴＸを補充し た完全培地を用いて９ｂウエルプレートの１ウェル当り１細胞を接種することに より増殖を取り行った。クローンを集密になるまで増殖させ、ＥＬＩＳＡにより アッセイした。２つのクローンである、ＬＦＡ３ＴＩＰ、　２５．１１．５０． 　ＩＯＡおよびＬＦＡ３ＴＩＰ、　２５．１１、５０．５Ｂは高いレベル（すな わち、培地１ｍ１当り５０−６０８ｇ）ＬＦＡ３ＴＩＰ）のＬＦＡ３ＴＩＰを分 泌した。それらをさらに研究および精製するために拡大させた。 ｐＭＤＲ（９２）　Ｉｇ−３を有するＣＩＯ細胞の培養物の培地（すなわち、な らし培地）に分泌されたＬＦＡ３ＴＩＰの濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。 ｒｗ＋ｗｕｌｏｎ　２プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ｃｂａｎｔｉｌｌｙ、　 Ｖｉｒｇｉｎｉａ）のウェルをそれぞれ、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム／炭酸水 素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６中で２５Ｍｇ／ｍｌに希釈したＳｏｕ　１（７ ）抗ＬＦＡ３ＴＳ２／９　ＭＡｂを用いた抗ＬＦＡ３　ＭＡｂ　ＴＳ２／９　（ Ｄｒ、　Ｔｉｍｏｔｈｙ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ寄贈）で被膜し、パラフィルムで覆 い、−晩室温でインキュベートした。翌日プレートを脱イオン水で６回洗浄し、 ２ミクロンフィルターで濾過した、１５０μＩ／ウエルのブロック緩衝液（ＩＸ ＰＢＳ中５％のウシ胎児血清）でブロックした。緩衝液を２時間の室温でのイン キュベーション後取り除き、ならし培地を様々な希釈度の希釈液に添加した。標 準曲線を描くコントロールとして、ＬＦＡ−３の段階希釈液（ウェル毎に５０μ ］）をも含ませた。典型的には、最も濃いＬＰＡ−３標準を含有するウェルは、 ＩｘＰＢＳ中１０ｎｇのＬＦＡ−３を含有する５Ｏｉｔ　１（７）ＬＦＡ−３溶 液ヲ含有していた。ＪＸＰＢＳで希釈したブロック緩衝液を陰性コントロールと した。試料およびコントロールを室温で１時間イン−キュベートした。 次にプレートを脱イオン水で６回洗浄した。各ウェルを、１　ｘ　ＰＢＳ中５％ ウシ胎児血清によるウサギポリクローナル抗ＬＦＡ−３抗血清（例えば、前出の 抗血清２０２）の１：５０００希釈液を５０μｍ人れた。室温で１時間後、ポリ クローナル抗ＬＦＡ−３抗血清を除去して、ウェルをＩＸＰＢＳ中０．０５％の Ｔｗａｅｎ−２０の溶液で４回洗浄した。次に各ウェルを、２％の全マウス血清 を含有するブＯ−／り緩衝液（Ｃａｐｐｅｌ、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　 ５ｏｉｌ−１３８０）中に１：１０，０００で希釈された５０μｌのＨＲＰヤギ 抗ウサつＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　Ｐｅ ｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ；　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　１１１−０３５−０４ ５）で満たした。 プレートを次に室温で５０〜６０分間インキュベートした。 ＨＲＰヤギ抗ウサつＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）溶液を除去して、ウェルを１×ＰＢＳ中 ０．０５％のＴｖｅｅｎ−２０で６回洗浄した。次いで、ｓｏμｍのＨＲＰ基質 緩衝液を各ウェルに室温で添加した。ＨＲＰ基質緩衝液を下記のように調製した ：　ＤＭＳＯ（Ａｌｄｒｉｃｈ）中４２ｍＭの３．３°、５゜５°−テトラメチ ルヘンジジン（ＴＭＢ）　０．５１１．　（ＩＣＮ　１ｍｌｕｎＯｂｉＯ１ｏｇ ｉｃａｌｓ、　Ｌｉ５ｌｅ、　５ｏｕｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ、　Ｃａｔａｌｏ ｇｕｅ　Ｎｏ、　９１１０５０１）を、５０■ｌの基質緩衝液（０，１Ｍの酢酸 ナトリウム／クエン酸、ｐＨ４，９）に徐々に添加して：続けて７．３μｌの３ ０％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ、　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　Ｎｏ、　ト１００９）を 添加した。 各ウェルの青色の発色をマイクロタイタープレートリーダーの上で６５０ｎｍで 観察した。７〜１０分後、５０μｌの２Ｎの硫酸を添加して発色を止めた。得ら れた黄色をマイクロタイタープレートリーダーの上で４５０ｎｍで読−み取った 。ブランクとして陰性コントロールのウェルを用いた。 ｌ旦匹旦主産 ＬＦＡ−３（Ｍ５７１ｇＧ）の１０アミノ酸Ｍ５７領域を欠失しているＬＦＡ３ ＴＩＰからなる融合タンパク質を、実質的に、ＬＦＡ３ＴＩＰに対して上述した ように生産した。 冥１１乳１」− 旺Ａ３ＴＩＰ二五鼠 ＣＯＳ？　（ｐｓＡＢ１５２）ならし培地をＡＭＩＣＯＮ　５ＩＹ３０スパイラ ルカートリツジシステム（ＡＭＩＣＯＮ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓａｃｈ ｕｓｅｔｔｓ）を用いて１０倍に濃縮した。濃縮物を４×５０■ｌずつのアリコ ツトに分けて、アリフット当り２００μｌのプロティンＡセファロース４Ｂ（Ｓ ＩＧＭＡ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて一晩４℃でバ ッチ吸着させた。ビーズを１１０００ｒｐ＋で臨床遠心機でペレット状にし、あ わせて、直径５■のカラムにパックした。樹脂を、５００５ＭのＮａＣ１を補充 した２０＋＋ｌのＰＢＳ、続いて２０鴎ｌのＰＢＳで洗浄した。結合タンパク質 を、１５μｌのＩＭのヘペス、ｐＨ７，８を入れたチューブ中に、５０ｍＭのグ リシン、２５０＋ｓＭのＮａＣ１（ｐＨ３，０）を用いて、１５０μｌの画分に 溶離させた。各画分のｌＯμｌを１２％の非還元５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた 。溶離されたタンパク質を含有する画分をプールして、ＰＢＳで発色させる５ｕ ｐｅｒｏｓｅ−１２ゲル濾過クロマトグラフイー　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫ Ｂ、　Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）に供した。 ピークのタンパク質画分のうち１０μｌのアリコツト（２８Ｇｎｏ＋で−０，０ ，を測定することにより決定）を、非還元条件下で１２％の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲ ルにかけた。そして、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、およびウェスタンブロッティ ング分析で測定した（Ｔｏｖｂｉｎら、江ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．　ｐｐ、　４３５０−５４　（１９７９）；　Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　ｐｐ、　４７４ −５１０　（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 １９８８）等参照）、低濃度の夾雑タンハク質を伴ったＬＦＡ３ＴＩＰを含有す る画分をプールし、ＹＭ３０　Ｃａｎｔｒｉｃｏｎ　（ＡＭＩＣＯＮ、　Ｄａｎ ｖｅｒｓ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）にて濃縮した。ＬＰＡ−３をウサギ 抗ＬＦＡ−３ポリクローナル抗血清２０２（前出の実施例３参照）および、ホー スラデイシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｉｓ ｓｏｕｒｉ）で標識したヤギ抗ウサギＩｇＧを用いてウェスタンプロットの上で 検出した。プロットをＡ■ｅｒｓｈａｍＥＣＬ検出キット（ＲＰＮ　２１０６． 　Ａｍｅｒｓｈａｎ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ。 １１１ｉｎｏｉｓ）を用いて発色させた。最終プールを非還元条件下で１２％の ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけて、精製度を評定した。ＵＶ吸収スペクトルを行っ て濃度を測定した。プロティンＡで精製した全ての調製物には１つの夾雑物質が 含有されていた。それはおそらく培地のウシ胎児血清中に存在する、ウシＩｇＧ で、ＬＦＡ３ＴＩＰと共に精製されるものと思われる。 ＬＦＡ３ＴＩＰの精製度を変性および変性していない５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（図１ ３）により測定した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果は、プラスミドｐＳＡＢ１５２ を有するＣＯＳ？細胞の培養培地から精製したＬＦＡ３ＴＩ！’が、ジスルフィ ド結合より連結された、２つの単量体のＬ）’Ａ−３−１ｇ融合タンパク質の二 量体として細胞培地に存在することを示した− ＬＦＡ３ＴＩＰが細胞の培養培地で見いだされる事実は、Ｌ、ＦＡ−３と同様に 、単一ペプチド配列が正常に機能し、すなわち、単一ペプチドが、細胞膜を越え てＬＦＡ３ＴＩＰタンパク質を分泌する過程テ、ＬＦＡ３ＴＩＰのＬＦＡ−３ド メインのアミノ末端領域から切断されることを示唆する。 触１１鉦１１証 Ｍ５７１ｇＧを、実質的に、ＬＦＡ３ＴＩＰに対して上述したように、ならし培 地から精製した。同様な夾雑物質が観察された。 ジャーカット細胞を、ｌｘ　１０’細胞／チユーブの割合でい（つかのエッペン ドルフ（［：ｐｐ６ｎｄｏｒｆ）チューブに移した。細胞をエフペンドルフマイ クロ遠心機で１０秒間ヘレット状にして、培地を吸引して除去し、ベレットを１ ００μｌのＬＦＡ３ＴＩＦまたは抗ＣＤ２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）　ＴＳ ２／１８中に（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ　Ｓｅｔ、ＵＳＡ、７９．　ｐｐ、７４８９−７４９３　（１９８２））、両 者ともＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、　０．１％ＮａＮ３．０．５％　ＢＳＡ　ｐＨ ７，２）中で１０μｇ／ｍｌとして、再懸濁した。細胞を氷の上で３０分間イン キュベートして、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌの適切な２次抗体を 用いてインキュベートして、ジャーカ９．．ト細胞に結合するＭＡｂｓを検出し た。Ｆ！ＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　Ｆ（ａｂ’）２　（Ｊａｃｋ ｓｏｎ　［ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を抗ＣＤ２　’ＭＡｂであるＴＳ２／ １　Ｂを検出するのに用いた。また、Ｒ−フィフェリトリン結合”ＡＰヤギ抗ヒ トＩｇＯＦ（ａｂ’）２０ａ−ｃｋｓｏｎ　ＩＩｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ＞を ジャーカット細胞に結合するＩ、ＦＡ３ＴＩＰを検出するのに用いた。ＦＩＴＣ ヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｆ（ａｈ’＞２をＦＡＣ５緩衝液に１：５０の濃度になる ように希釈して、Ｒ−フィコエリトリン結合ＡＰヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’ ）２をＰＡＣＳ緩衝液に１；２０で希釈した。細胞を３０分間水の上でインキュ ベートして、２回洗浄し、３００μｌのＩＸＰＢＳ中に再懸濁して、蛍光をセル ソーターで検出した。 競合を調べるため、ジャーカット細胞を上述のようにエッペンドルフチューブ内 でベレット状にし、ＦＡＣ３ＡＣ３緩衝液中１フ８ キ１ベートして、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次にベレットを、抗ＣＤ２　 ＭＡｂ含有腹水液：　Ｔｉｔ，、Ｔｌｌ□またはＴｌ１３（全てＤｒ。 Ｅｌｌｉｓ　Ｒｅ１ｎｈｅｒｚ．　Ｄａｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ，　Ｂｏｓｔｏｎ。 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ寄贈）のに１００希釈液（ＦＡＣＳ緩衝液中）の１ ００μｌ中に再懸濁した。細胞を氷の上で３０分間インキュベートして、２回洗 浄して、Ｒ−フィフエリトリン結合ＡＰヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆ（ａｂ’）２の１ ＝２０の希釈液中に再懸濁して、結合ＬＦＡ３ＴＩＰを検出した。氷の上での３ ０分間のインキュページラン後、細胞を２回洗浄して、３００μｌのＩＸＰＢＳ 中に再懸濁して、セルソーターで分析した。 ＴＳ２／１ｇモノクローナル抗体および腹水液Ｔｌｌ，中のモノクローナル抗体 は、ＣＤ２のＬＦＡ−３結合ドメインに特異的である。よって、これらの抗体は ジャーカプト細胞の表面上のＣＤ２分子に結合して、ＬＦＡ３ＴＩＰが結合する 同じ部位を占めると思われる。 従一つで、ジャーカット細胞を最初に過剰のＴＳ２／１８　ＭＡｂまたはＴｌｌ □腹水液を用いてインキュベートすると、Ｒ−フィフェリトリン結合ＬＦＡ３Ｔ ＩＰが分子に結合し得ることが期待できるドメインが、あるにしても、はとんど ないと思われる。図１４Ａに示すように、ＴＳＺ／Ｉｌｌ　ＭＡＲまたはＴｌｌ ，Ｉｌｌ水液のいずれかでジャーカット細胞をプレインキコベートすると、ＬＦ Ａ３ＴＩＰで標識した細胞はほとんどない。発色されていないコントロールの細 胞とほぼ同定される１つが観察された。対照的に、丁５２７１ｇまたはＴｌｌ， 腹水液のいずれかを用いないと、ＬＦＡ３ＴＩＰはジャーカット細胞に結合し、 細胞をかなりの割合で標識した（図１４Ａ）。 Ｔｌｌ。およびＴ１１３腹水液に存在するＭＡｂｓはＣＤ２に特異的であるが、 ＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体形成に含まれるＣＤ２のエピトープとは異なるエピト ープを認識する。図１４８に示すように、Ｔｌ１２またはＴ１１３腹水液のいず れかを用いてのジャーカット細胞をあらかじめインキュベートすると、ＬＦＡ３ ＴＩＰがジャーカット細胞と結合するのを妨げなかった。図１４Ａおよび１４Ｂ に示す結果は、ＬＦＡ３ＴＩＦが機能性ＣＤ２結合ドメインＬＦＡ−３を有する ことを示している。 叉１」ＬＬｌ 見論巳りととＪし【駆 ＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体の形成およびＴ細胞活性化の機能７ノセイは、混合リ ンパ球反応（“ＭＬＲ”）である（参照Ｘｒｅｎｓｋｙら、ＬＪｍｍｕｎｏｌ． 、　１３１（２）、　ｐｐ．　６１１−６１６　（１９１１３）；　Ｂｒａｄｌ ｅｙ，　−ＭｉｘｅｄＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅｓ−、　ｉｎ　 ５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉ＋＊ｍｕｎｏ ｌｏ　（ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ編）、　ｐＩ）、　１６２−１６４ 　（Ｗ．Ｈ、　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ。Ｓａｎ　Ｆｒａｎｅｉｓｃｏ　１９ ８０）等）。このアッセイは、１９７１球（応答細胞）が非増殖の同種の末梢血 リンパ球（ＰＢＬｓ）　（刺激細胞）中にアロ抗原を認識する時の、ＰＢＬｓの 集団中における１９７１球の活性化に基づくものである。 そのような活性化は、細胞と細胞との付着に起因して生じ、１９７８球上のＣＤ ２分子が、同種のＴ’ＢＬｓ上のＬＦＡ−３分子に結合することにより部分的に 媒介される。 ＰＢＬｓを、フィコール−Ｐａｑｕｅ濃度勾配（ＰｈａｒｍａｃＬａ．　Ｐｉｓ ｃａｔａｗａｙ．　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ．　ｃａｔａｌｏｇ　ｎｏ．　１７− ０８４０−０２）で、同種のヒトドナー２人から得た３０■ｌの血液から精製し た。血液を１＝２の割合でＲＰＭＩ培地で希釈し、２：１の割合（３０■ｌの血 液：　１５ｍ１のフィコール）でフィコール濃度勾配にのせた。細胞を５ｏｒｖ ａｌｌ　ＲＴａｏｏｏ遠心機で１８００ｒｐｍにて２０℃で３０分間濃度勾配を 通して遠心分離機にかけた。ＰＢＬｓを含有する界面をＳｈｌ容量のポリプロピ レン遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ　２５３３１）に回収して、ＲＰＭＩ培地で上を覆 った。＊胞を１４００ｒｐ＋ｗ、４℃で１５分間、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＴ５００ ０の遠心分離機にかけてベレット状にした。ベレット状の細胞を５０論ｌのＲＰ ＭＩで２回洗浄して、上述のようにベレット状にした。 ＰＢＬｓをＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭｌ．　１０％　Ｈｙｃｌｏｒ＋ｅ　ＦＣＳ ，　４ｙｐＭのグルタミン、Ｐｅｎ−５ｔｒａｐ）中に再懸濁して３ＸＩＯ’細 胞／＋ｓｌの濃度にした。刺激細胞を生産するために、ドナーの１つから採取し たＰＢＬｓをガンマ細胞照射機で２０００ｒａｄｓで照射し、最終濃度を３ｘ１ ０６細胞／ｍｌにした。 抗体またはＬＰＡ３ＴＩＰ試料を図１５に示す濃度でポリスチレン９６丸底ウエ ルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　２５８５０）に添加した。　ＭＡｂｓおよびＬＦ Ａ３ＴＩＰ両方で用いられた最も高い濃度は５ａｇｅｍ　ｌであった。全ての希 釈およびインキュベーシ璽ンをＲＰＭＩ完全培地で行った。反応細胞（非照射） および照射した刺激細胞を、それぞれウェル毎の最終濃度が１．５ＸＩＯ’細胞 になるように、ｌ：１の割合でウェルに添加して、プレートを５日間３７℃でイ ンキュベートした。５日目に、細胞を１μＣｉ［メチル−３ｕ］チミジン（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ，　Ｂｏｓｔｏｎ，　Ｍａｓｓａｃｈｕｓ ｅｔｔｓ．　ＮＥＴ−０２７）ヲ用いて１５時間パルスして、Ｔｏ■ｔｅｃｈ　 ９６ウエルハーベスターの上に採取した。照射しなかった１９７８球集団の増殖 を、３トチミジンを細胞に導入することにより測定すると、１９７８球増殖中に 標識されたチミジンの取り込みが行われたことが示された。このＭＬＲアッセイ を用いて、様々なＭａｂｓおよびＣＤ２結合分子が、ＣＤ２／ＬＦＡ−３複合体 形成およびＴ細胞活性化に与える影響を調べた。 抗ＬＦＡ−３　ＭＡｂ　ＩＦ５　（ハイブリドーマＩＥ６−２Ｃ１２，　ＡＴＣ Ｃ受託番号ＨＢ　１０６９３により生産）はＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインに 特異的である。図１５に示すように、ＩＦ５　ＭＡｂｓがＭＩＪアッセイｌこ存 在するときは、Ｔ細胞活性化の眉量依存抑制が観察された。この結果は、ＩＦ６ 　ＭＡｂｓがＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインに結合して、ＣＤ２／ＬＦＡ−３ 複合体が刺激および反応細胞間に形成されるのを防ぎ、それにより、反応細胞集 団においてのＴ細胞の活性化を抑制するという見方と一致する。 −ＬＦＡ３ＴＩＰは、ＭＬＲアフセイにお６て、Ｔ細胞活性化の類似した用量依 存抑制を示した（図１５参照）。ＩＥ６　ＭＡｂｓまたはＬＦＡ３ＴＩＰのＩｇ Ｇ部分が、観察されたＴ細胞活性化の抑制に寄与する可能性を排除するため、非 特異的ヒトＩｇＧ１　（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆ。 ｒｄ、ＩＬ）をＭＬＲアッセイで試験した。図１５に示すように、非特異的ヒト ＩｇＧは、ＬＦＡ３ＴＩＰまたはＩＥ６　ＭＡｂｓに見られたようなＴ細胞活性 化の用量依存抑制を示さなかった。 これらの結果を組み合わせると、ＭＬＲアッセイにおけるＴ細胞活性化において ＬＦＡ３ＴＩＰの抑制活性はＬＦＡ−３ドメインにあり、融合タンパク質のＩｇ Ｇドメインにはないことが示される。 の　のＴ　活性イの　ル活性 ＬＦＡ３ＴＩＰおよびｌＥ６　ＭＡｂｓに加えて、以下の分子を、ＭＬＲアッセ イにおけるＴ細胞活性化の抑制活性について調べたニアＡ６ＭＡｂ　（ＬＦＡ− ３のＣＤ２結合ドメインに特異的なＭＡｂ、ハイブリドーマＩＡ６−２Ｅ５．　 ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ　１０６９５により生産）　、ＴＳ２／１８　（抗ＣＤ２ 　ＭＡｂ、　Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄら、前出）　、ｈｌｇＧ　（非特異 的ヒト　１ｇＧ１）　、ＰＩ−ＬＦＡ３　（各ＰＩ−ＬＦＡ−３単量体（７）Ｐ １７ンカー領域における分子間の疎水性相互作用により形成された多量体ＰＩ結 合ＬＦＡ−３）　、およびＣＤ４−１ｇＧ！融合タンパク質（ＬＦＡ３ＴＩＦに 類似しているが、ＣＤ４の一部分からなるアミノ末端領域を含有、ＰＣＴ出願Ｗ ０８９１０１９４０等参照）。 これらの分子の各抑制活性の比較を９１５の棒グラフに示す。 図１６の”ＬＦＡ３１ｇＯＡ−および”ＬＦＡ３１ｇＧ７２Ａ−は精製度の異な る、すなわちそれぞれの精製度が７５％および５０％であるＬＦＡ３ＴＩＰの悶 ｔｊＩ：”物である。コントａ−ルとしそ、ベクターＤＮＡのみを用いてトラン スフェクトしたＣ０Ｓ７細胞（すなわちＤＩＩＩＡ挿入断片をコードしないＬＦ Ａ３Ｔ［Ｐ）から精製した「偽（モック）」調製物を添加して、Ｔ細胞活性化に 対する抑制活性が条件づけられたＣＯ３７細胞ならし培地に含まれる非特異的抑 制因子に起因するものでないことを示した。偽調製物は実施例１３で述べるよう に、ＬＦＡ３ＴＩＰと共に精製されて、おそらく増殖培地のウシ胎児血清に存在 するウシＩｇＧであると思われる夾雑物質を含む。全てのＭＬＲアッセイを、分 子の調製物をそれぞれ０．１μｇタンパク質／１１の濃度でアッセイした以外は 全て上°述のようにして行った。 ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメイン（７Ａ６およびＩＥ６）またはＣＤ２のＬＦＡ −３結合ドメイン（ＴＳ２／１Ｂ）を認識するＭＡｂｓは、Ｔ細胞活性化におい てかなりの抑制活性を示した。ＬＦＡ３ＴＩＰのＴ細胞活性化を抑制する能力は 精製度が増すにつれ増大していった（精製度５０％のＬＦＡ３１ｇＧ７２Ａを精 製度７５％のＬＦＡ３　［ｇＧＡと比較）。非特異的ヒ）　ＩｇＧ１およびＣＤ ４−１ｇＧ１融合タンパク質はＴ細胞活性化を抑制しなかった。 ＰＩ結合ＬＦＡ−３の多量体形態もまた、Ｔ細胞活性化を抑制しなかった。多量 体Ｐ１１結ＬＦＡ−３における複数のＣＤ２結合部位にもかかわらず、多量体の この型はヒト同種のＭＬＲを抑制も増強もしないようだ。 叉１１髭組 ■月１凰７−＝ｔ　ｄ ヒ）　ＰＢＬＳを、上述のようにフィコール−Ｐａｑｕｅ濃度勾配で、２０１１ のヒトドナー血液から単離した。精製したＬＦＡ３ＴＩＰを、図１７に示す濃度 で、９６ウ工ルポリスチレン丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　２５１ｔ ＳＱ）に添加した。次にＰＢＬｓ　（ｌｘ　１０５）を各ウェルに添加して、プ レートを３日間３７℃でインキュベートした。全ての希釈をＲＰＭＩ完全培地で 取り行った（実施例１５参照）。細胞を３日後１μＣ１／ウェル［メチル−３旧 チ°ミジンを用いて１５時間パルスして、Ｔｏｍｔｅｃｈ　９６ウエル自動ハー ベスターテ採取した。コントロールとして、ＰＢＬ増殖を、増殖培地のみ、およ び非特異的ヒトＩｇＧ１を補充した増殖培地で測定した。 図１７で示すように、ＬＦＡ３ＴＩＰｇ製物はＰＢＬｓの増殖を抑制した。 非特異的ヒ）ＩｇＧ１は、ＰＢＬ増殖を抑制しなかった。 実施例１５で述べたように偽調製物からのＬＦＡ３ＴＩＰ調製物内の主な夾雑物 質をもアッセイした。実施例１３および１５で述べたように、この夾雑物質はお そらく増殖培地からのウシＩｇＧと思われる。図１７は、非特異的ヒトＩｇＧ１ と同様に、夾雑物質もまたＰＢＬｓの増殖を抑制しなかったことを示している。 ＰＨＡおよび０ＫＴ３ＰＢＬ 次に０ＫＴ３依存（すなわち抗ＣＤ３依存）Ｔ細胞増殖を抑制するＬＦＡ３ＴＩ Ｐの能力を評定した。ＰＢＬｓを上述のように１人の健康体のヒトのドナーから 単離した。０ＫＴ３依存ＰＢＬ増殖、１×ｌＯ５ドナＰＢＬｓのアリコツトを、 ３ｎｇ／ｍｌの０ＫＴ３　（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　 Ｒａｒｉｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）のみで、またＬＦＡ３ＴＩＰ　（１ ｎＭおよび１０ｎＭ）もしくは精製したヒトＩｇＧ１　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ ＋５ｉｃａｌ　Ｃｏ、。 Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）　（ｌｎＭおよびＩＱｎＭ）の存在下 で、２日間−インキユベートした。細胞のｉつの７リフツトを０ＫＴ３なしの培 地のみでインキュベートした。次いで細胞を上述のように［メチル−３１（］チ アミノを用いてパルスした。この実験の結果を図１８に示す。 図１８の結果はＬＦＡ３ＴＩＰが、適切でない特異性を有するコントロールヒト ＩｇＧ１よりも、０ＫＴ３依存ＰＢＬ増殖を抑制するにおいて、かなり効果的で あることを示している。図１７の結果と合わせると、このことは、ＰＢＬ増殖を 抑制するＬＦＡ３ＴＩＰの能力は主に、ＣＤ２結合ドメインを含有する９２アミ ノ酸ＬＦＡ−３領域にあり、ＬＦＡ３ＴＩＰのＩｇＧ部分にはないことを示して いる。 さらに、ＬＦＡ３ＴＩＰおよび様々な他のＣＤ２結合分子、並びにＭ５７１３Ｇ の持つ植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）依存ＰＢＬ増殖を抑制する能力を、ＰＨＡ の濃度が最適下限および最適である両方の場合において、評定した。 このアブセイでは、ｌＸＩＯ３ドナー細胞（ヒトＰＢＬｓ）をＰＨＡ　（Ｆｆｓ ｈｅｒ）を用いてＱ、Ｉまたはｌ−Ｏｔ１ｇ／ｍｌで単独、または以下のものの いずれかの存在下でインキユベートした二２１結合ＬＦＡ−３（−ＰＩＬＦＡ− ３”、ｆａｌ　１ｎｅｒら、ＰＣＴ特許出願１０９０１０２１８１）　、単量体 可溶性ＬＦＡ−３（ＳＥｏ　１０　ＮＯ：１０のアミノ酸２９−ＩＦＮからなる °ｇ。 ｎ　ＬＦＡ−３−）　、ＬＦＡ３ＴＩＰ、　Ｍ５７１ｇＧ　（実施例１１参照） 、全長の可溶性ＬＦＡ−３−１ｇＧ融合タンパク質（ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域 並びにＣＨ２およびＣＨ３ドメインの部分へ融合される、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ｌＯのアミノ酸２９−１８１からなる”ＦＬｌｇＧ”）、抗ＣＤ２　ＭＡｂ　（ ＴＳ２／１Ｂ、Ｔ、　Ｓｐｒｉｎｇａｒ寄贈）、またはハイブリドーマＩＥ６− ２Ｃ１２（ＡＴＣＣＩＴＢ　１０５９３）より生産された抗ＬＦＡ−３ＭＡｂ　 （ｌＥ６）。ＦＬＩｇＧは２μｇ／＋ｓ　ｌの濃度であり：他のタンパク質は全 て５μｇ／ｍｌの濃度であった。 次いで細胞を上述のように［メチル−３ａｊチミジンを用いてパルスした。結果 を図１９に示す。 図１９に示すように、ＰＨＡを最適下限の濃度（すなわち０．１μｇ／ｒｓｌ） でヒトＰＢＬｓを用いてインキユベートすると、Ｐ！結合１．ＦＡ−３（ＰＩＬ ＦＡ−３）のみがＰＢＬ増殖を刺激し得た。Ｍ５７１ｇＧ、単量体可溶性ＬＦ＾ −３およびＦＬＩｇＧは、最適下限のＰ［ＩＡ刺激されたＴ細胞増殖に対して効 力はなかった。ＭＡｂ　ｌＥ６およびＭＡｂ　ＴＳ２／１８は、増殖を８０−９ ０％抑制し、　ＬＦＡ３ＴＩＰは７０％抑制した。 ＰＨＡがＰＢＬ増殖を刺激する最適レベルで存在する時、ＬＦＡ３ＴＩＰ、　Ｍ Ａｂ　ＩＥ６およびＭＡｂ　ＴＳ２／１８はＴ細胞増殖をそれぞれ４１％、２６ ％、および２０％ずつ抑制した。 図１９の結果は、ＬＦＡ−３のＣ８４結合ドメインを含有する、Ｎ末端９２アミ ノ酸で規定された、ＬＦＡ−３の領域がＰＨＡ依存ＰＢＬ増殖を抑制し得るが、 ＭＳ７１ｇＧ中においてのように、Ｃ８４結合ドメインの部分が欠如していたり 、またはＰ１結合ＬＦＡ−３中においてのように、他のＬＦＡ−３アミノ酸配列 、単量体のＬＦＡ−３もしくはＦＬＩｇＧが存在すると、Ｐ）ＩＡ依存ＰＢＬ増 殖を抑制するＬＦＡ−３のＣ８４結合ドメインの能力は減少せしめられることを 示している。 よって、結果は、ＬＦＡ３ＴＩＰによるＰＢＬ増殖の抑制は、そのＬＦＡ−３ド メインに起因することを示している。 ２結合ポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドのフラグメーントおよびア ナログもまた、本発明の別の実施態様において有用であると理解される。本明細 書を考慮して自明であるそのような実施態様および他の実施態様の全ては、本質 的に予期されるものであり、以下の特許請求項で定義される本発明の範囲内に含 まれるものである。 （以下余白） 配列表 ジ璽ン８１．２５ ｈｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌの情報：（１）配列の特色； （＾）長さ＝１０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 ＜Ｃ＞鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー８直鎖状 ＜１ｉｔ）ハイポセティカル配列＝Ｎ。 （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｚの情 報：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：５０アミノ酸 （Ｂ）ｆｆｉ二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポａジー：直鎖状 （ｉＨ）ハイボセティカル配列＝Ｎ。 （ｉｖ）アンチセンス１０ （Ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３の情報 ：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）環二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）へイボセティカル配列：Ｎ。 （Ｚ）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：５ｆ）情報；（ｉ１配列の特色： （Ａ）長さニア７アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：ＨＯ（ｉ　ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｓ：Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　 ＶａＩ　Ｌａｕ　τｒｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　にｉｎ　Ｌｙｍ　＾ｓｐ　Ｌｙｅ　 ＶａＩ　Ａｌａ　ＧｌｕＳｏ　５５　６０ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報：（＋）配列の特色： （＾）長さ＝３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ Ｃｘｌ＞配列：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：６：鮎τＡＧＧは買＾＝１島に屁πｉπ Ｏαπ　３０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアの情報：（１）配列の特色： （＾）長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、？：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の情 報：（＋）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉＨ）ハイボセティカル配列二ＮＯ （ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｌ）配列＋　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８＋（２）ＳＥＱ　ｔｏ　Ｎｏ・９の情 報：＜＋＞配列の特色： （＾）長さ：　１０４０塩基対 ＜Ｂ）豐：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｌｉｔ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１０．．７５９ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９＋（２）ｓＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌｏの 情報：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ＝２５０アミノ酸 （Ｂｌ型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ）配列の橿ａ：タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：Ｍｓｅ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｃ１ｙ　 Ｓａｔ　Ａｍｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　Ｖａｎ　 Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１１の情報：（ｉ）配列の特色： （＾）長さ＝８６３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ＋）ハイボセティカル配列：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （１ｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１Ｂ、、７３？ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２の情報：（ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２４０アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｌｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｃ２：５＊ｒ　Ｓａｒ　Ａｊｐ　Ｇｌｕ 　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　にｌｕ　Ｍｅｅ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｇｎ 　Ｉｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐｌｏｏ　１０５　１１０ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３の情報：（＋＞配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ＋）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｊ　ｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４ の情報：（＋）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）豐：ｔ１＆酸 ＣＣ＞鎖の数ニ一本鎖 （ド）アンチセンス＝ＮＯ （Ｘ］）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４：＾Ａ（７τ丁＾丁ＣＣＴＴＴｒＧ ＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴＡＣＡＴＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０Ｊ５の清報：（＋） 配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉＶ＞アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉクン６己 ＡＣＣＴＣＴＧＭＴ　ＴＣＡＧＡＴＴＴｒＴ　ＴＣＣＡτＡ（ＪＡＣ（２）ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ・１６の情報：（１）配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｌ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｉ　ｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１６・話ＡＡＴＡＡＡＣＣ　ＣＴＡＴｒ ＡＴｒＴｒ　ＣＣＡＧＴｒ（ｍｌ；Ｃ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　１１０：１７（７） 情報：＜＋）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌフ。 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ｇの情報：（＋）配列の特色： （Ａ）長さ；３０虐基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９の情報：（ｉ）配列の特色： （Ａ＞長さ＝３０塩基対 （Ｂ）型：槙駿 （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。 （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９：ＧＣτＡＴＣＡＧＴＡ　ＡＴＡｍ ＧＡＴＧ　ＡＴＧＴτＡ献バτ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０の情報：（ｉ） 配列の特色： （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤＮ０＋２６＋Ｔ丁にＴＣｃＡＡＧＡ　ＴＣＡＴＴ ＡＣσττ　丁ＡＣＡτＴＣＣＴＣ４ＣＦ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２フの情 報：（１）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｌｌ）ハイボセティカル配列＝ＮＯ（ｌｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｒｊ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　１１０二２フ。 τＡＡＴにＧ＾τ丁に　ＣＴＡＡＣ；′ｒｒｃｃＡ　ＴＣＴｒＡＡＡＡＴＡ　３ ０（夏ｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８：ＴＧＴＣＡＡＡＡＴＧ　ＡＴｒ ＧＡＭ；ＴＡＧ　ＡＣＴＧＴＡＴＴＴ？　３０（２）ＳＨＯＩＤ　ＮＯ：２９の 情報：（ｉ）配列の特色： （＾）長さ１０塩基対 ＣＢ）’Ｍ：＊酸 （Ｃｈｉｍｌの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｉ）ハイポセティカル配列＝ＮＯ（１ｖ）アンチセンス二Ｎρ。 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＭＯ：２９：ＴＣＴＴ（４ＴＣＡ　ＣＣＧｃＴ ｒＧｋＴＧ　ＴＴＧＴＡＴＴＡＡＡ　３０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０の情 報：（ｉ）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉｌ）ハイポセティカル配列：ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０：ＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴ　ＴＣＡτ ＣＡＴＡＣＡ　ＣＡＡＣＡＣＣＡτＡ　３０（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１の 情報：（ｉ）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （ｉＨ）ハイポセティカル配列：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｔ）ｌＥ１列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ３２の情報：（＋）配列の特色： （＾）長さ：３０塩基対 （ＢＪ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆ　ｉ）ハイポセティカル配列：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス＋Ｎ０ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２：（ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　１０　 ＮＯ：３ｆｆ：Ｓ＠ｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌ＊　丁ｙｒ　＾ｓｎ　ｔａｕ　Ｔ ｈｒ　Ｓｔｒ　Ｓａｔ：　ＡＪＰ　ＣＬｕ　１ｌｕｐ　Ｇｌｕ　τｙｒ　Ｇkｕ Ｌ　５　１０　１５ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｓ４の情報：（１）配列の特色： （Ａ）長さ：２４塩基対 （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０ （Ｂ）存在位置：６．．２３ （Ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３Ｓ の情報：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　１１０：１ｇの情報：（＋＞配列の特色： （Ａ）長さ＝２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｉｉ［）ハイボセティカル配列二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｊ６：（２）ＳＥｏ　１０　ＮＯ：３７ の情報：Ｔ（：ＣＴＣＧＡ（：ＣＴ　ＣＴＡｃＡＴＡＴＣＧ　ＡＴＴＣＣＡＴ（ ＪＡτＣＣ’ｒＣＡＣＡτＣＣＣＡＡτＣＣにＣに　ＣＣＣＧＣ１１T （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （１ｖ）アンチセンス二ＮＯ ＜８）存在位置：ｌＬ、３３ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３Ｂ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０＝３９の 情報：（ｉ）配列の特色： （＾）長さニアアミノ酸 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０ の情報：（＋）配列の特色： （＾）長さ：２６塩基対 ＜８）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｆｉｌ）ハイボセティカル配列：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：　５Ｅ（１１０ＮＯ：４θ・ＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴ　ＡＡＡＧＡ ＡＡＣＡＡ　ＣＴｒＣＡ丁（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１の情報：（ｉ）配列 の特色： （＾）長さ：１４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （ｉｉｌ）ハイポセティカル配列：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。 （ｘｉ）配列：　ＳＥｏ　１０　ＮＯ：４１：丁ｃｃＡｃｃｃｃｃｃ　ｃｃｃｃ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２の情報：（ｉ＋配列の特色： （Ａ）長さ：　１０５０塙基対 ＜Ｅ）盟：核酸 （Ｃ）ＩＩの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｆｆ）ハイボセティヵル配列：Ｎ。 （ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。 （ｉｚ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ ＣＢ）存在位置：　１．．１０４１ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２：Ｇｌｕ　にｌｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ 　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｖａｎ　ＶａＩＳａｒ　ＶａＬ　 Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｖａ１Ｌａｕ　Ｈａｓ　Ｇｉｎ　Ａｌｊｐ　Ｔｒｐ　Ｌａｕ　 Ｊｕｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕτｙｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｍ　Ｖａｌ　５ ｓｒ＾ｓｎ　Ｌｙｍ　＾１ａ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　＾ｌａ　Ｐｒｏ　工１・　ＧＬ ｕ　Ｌｙｍ　Ｔｈｒ　Ｉｌ・　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　Ａｉｍ　ＬｙｓＧｌｙ　（ｉｌ ｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　にｉｎ　Ｖａｌτｙ　Ｔｈｒ　ｔＪｕ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐτｙｒ　！’ｒｏ　５ａｒ　ｋｓｐ　 Ｉｌ＠　ＡＬＪＩ　Ｖａｎ　にｌｕ　Ｔｒｐ　ＧＬｕ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ 　に１ｎ　Ｐｒｏ　Ｇ撃■ Ａｇｎ　Ａｊｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 ｔａｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　ｈａ２９０　２９５　−’ 　３００ Ｐｈａ　ｌＪｕ　Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　 Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ａｒｇτｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ＧｌｙＡｉｎ　ＶＪＬＩ　Ｐ ｈａ　Ｓａｔ　Ｃｙｓ　Ｓｉｒ　Ｖａｎにａｔ　ＨＬｓ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｌａｕ 　Ｈｉｓ　Ａｘｎ　ＨＬｓτ芦０ｎ　ｏの　０リ　ロｎ　ロの ロ　ＯＬｌ″１ｒ−１ロｒｆ１ｕ’＋ｕ”＋　ロリｗ　ｒ−Ｉ　Ｆ＋　へ　α　 の ロヘ　ロロロロ ロＯＮ　０１４５　０ｒ′１　モ＝　。。　い　。　い　。 口１．ｏＬＩ＋Ｉａ）　ロロ リー　リ一　トへ　さへ　ωへ　ロ　の　色　−ＦＩＧ、２Ａ 黴尤！Ｖ橿 ＦＩＧ、　２Ｂ 蛍光雫化 ＦＩＧ、　２Ｃ ＦＩＧ、　２Ｄ 被′Ｌ字は 敷光　隼イ辺 りざ　ｋし　刈２　イＶ 頃″Ｌ挙作 ＦＩＧ、　２Ｈ 家；を第像 頃’ｉ！Ｐｉｔ 咬尤ψ位 像光学１扛 ＦＩＧ、　２Ｌ １０Ｑ１０’　＋０２１０３ 覚　Ｌ　輔ｐ（ｉ 咳　ヌ巳　単　イｂ− 覚′Ｌ早位 ＦＩＧ、　４ ＣＨＯＭ５７　Ｍ２Ｓ、３ ＦＩＧ、　５ ０ｎ　０００１口ｎ　ロ色 ロ　ロ　り　−ロ　ｒｆ１ｕ＋１い　ロψい　−−へ　べ　の ｒｎ　ｒ−＋　ｒｎ　＋　ｒ−ｔ−ｒ−１ｒｎｒ４ｒ４０　１　ロ　Ｌｎ　０　 １ｔ′１０　ｔｎ　０　Ｖ’ｒ−−Ｕ″Ｉ　−ψ　リ　さ　トω口 ＦＩＧ、　１０Ａ 吹尤学作 噴光１（ｋ ０口 呂　冨　呂　。　ロ　。　ｏ　ｏ　ロ　いい　ロ　い　ロ　い　。　ロ Ｖ）リドトロの。の−− ＮＲＲ ＦＩＧ、　１４Ａ ＦＩＧ、１４Ｂ 頃ル単体 ＦＩＧ、１５ ．ＬＩＧ／ＭＬ ＦＩＧ、　１７ ＦＩＧ、　１９ 要約書 ＬｐＡ−、ｓのＣＤ２結合ドメインを包酋するポリペプチドおよびタンパク質を 開示する。発現でそれらのポリペプチドおよびタンパク質をフードするＤＮＡ配 列、それらのポリペプチドおよびタンパク質を生産および使用する方法、並びに 治療用および診断用組成物をも開示する。ＣＤ２を結合し得な０欠失変異体およ びその使用方法をも開示する。加えて、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインおよび ＬＦＡ−３以外のタン、４り質の部分を含む融合タンノくり質、それらの融合タ ンノくり質をコードするＤＮＡ配列、それらの融合タンパク質を産生ずる方法、 並びにそれらの融合タンパク質の使用を開示する。 国際調査報告 国際調査報告 Ｌ１２９２０２０５０

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列Ｘ１−Ｘ２−（ＳＥＯＩＤＮＯ：１）【配列があります】を有 するポリペプチドであっ て、 Ｘ１が、水素またはメチオニルであり；Ｘ２が、存在するならは、下記の配列（ ＳＥＱＩＤＮＯ：５）あるいは該配列のカルボキシ末端からの１から７７個まで のアミノ酸からなる、該配列の一部分を有するポリペプチドであり、【配列があ ります】 Ｙが、ヒドロキシル、または下記の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）あるいは該配 列のアミノ末端からの１から３２個までのアミノ酸からなる、該配列の一部分を 有するポリペプチドであり、【配列があります】 およびそのアナログ並びに誘導体であり、該ポリペプチドはＣＤ２に結合し得る 、ポリペプチド。
2. ２．前記Ｘ２が、存在するならば、下記の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、あるい は該配列のカルボキシ末端からの１から５０個までのアミノ酸からなる、該配列 の一部分を有するポリペプチドであり、 【配列があります】 前記Ｙが、ヒドロキシル、または下記の配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）あるいは該 配列のアミノ末端からの１から１０個のアミノ酸からなる、該配列の一部分を有 するポリペプチドであり、【配列があります】 およびそのアナログならびに誘導体であり、該ポリペプチドがＣＤ２に結合し得 る、請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．前記ポリペプチドが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２９位−１２０位のアミノ酸 、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の２９位−１０８位のアミノ酸、ＳＥＩＤＮＯ：１０の ４８位−１０８位のアミノ酸、およびＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列を有す るポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
4. ４．アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）【配列があります】を有する、請 求項２に記載のポリペプチド。
5. ５．請求項１、２、３または４に記載のポリペプチドをコードする、単離された ＤＮＡ配列。
6. ６．（５′）（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）【配列があります】Ｔ（３′）を含む、Ｌ ＦＡ−３のＣＤ２結合ドメインをコードする、単離されたＤＮＡ配列。
7. ７．ｐＰＹＭ５７、ｐＰＭＤＲＭ５４−６、ｐＰＭＤＲＭ５５−９、ｐＰＭＤＲ Ｍ５６−Ｃ、ｐＰＭＤＲＭ５８−１５、ｐＰＹＭ６３−４、ｐＰＹＭ６５−８、 ｐＰＭＤＲＭ１００−４、ｐＰＭＤＲＭ１０１−１、ｐＰＭＤＲＭ１０２−８、 およびｐＰＭＤＲＭ３−１０のＤＮＡ挿入断片からなる群から選択される、ＬＦ Ａ−３のＣＤ２結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を含む、単離されたＤＮＡ 配列。
8. ８．請求項５、６または７に記載のＤＮＡ配列および発現制御配列を含む、組換 えＤＮＡ分子であって、該発現制御配列が作動可能に該ＤＮＡ配列に連結されて いる、組換えＤＮＡ分子。
9. ９．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸配列により特徴 付けられるアミノ末端領域を有し、およびＬＦＡ−３以外のタンパク質またはポ リペプチドのドメインを含むカルボキシ末端領域を有する、融合タンパク質。
10. １０．前記カルボキシ末端領域が少なくともイムノグロブリンのＦｃ領域の部分 を含む、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. １１．前記イムノグロブリンのＦｃ領域の部分がヒンジ領域並びにＣＨ２および ＣＨ３定常ドメインを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
12. １２．前記Ｆｃ領域の部分が分子間ジスルフィド結合を形成し得るヒンジ領域並 びにＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインの部分を含む、請求項１０に記載の融合タ ンパク質。
13. １３．前記融合タンパク質がＳＥＱＩＤＮＯ：４３の２９位から３４７位のアミ ノ酸である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
14. １４．請求項９から１３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、単離 されたＤＮＡ配列。
15. １５．請求項１４に記載のＤＮＡ配列および発現制御配列を含む組換えＤＮＡ分 子であって、該発現制御配列が作動可能に該ＤＮＡ配列に連結されている、組換 えＤＮＡ分子。
16. １６．プラスミドｐＳＡＢ１５２およびプラスミドｐＭＤＲ（９２）−Ｉｇ−３ からなる群から選択される、請求項１５に記載の組換えＤＮＡ分子。
17. １７．ＣＤ２に結合し得る多量体タンパク質であって、（ａ）請求項１から４の いずれかに記載の２つ以上のポリペプチド、（ｂ）請求項９から１３のいずれか に記載の２つ以上の融合タンパク質、または（ｃ）請求項１から４のいずれかに 記載の１つ以上のポリペプチドおよび請求項９から１３のいずれかに記載の１つ 以上の融合タンパク質を含む多量体タンパク質。
18. １８．請求項８、１５または１６に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿 主細胞を培養する工程を包含する、タンパク質の生産方法。
19. １９．請求項８、１５または１６に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿 主細胞。
20. ２０．ＣＤ２＋細胞、またはＣＤ２のＬＦＡ−３結合ドメインを含有するタンパ ク質を標識する方法であって、ＣＤ２＋細胞、またはＣＤ２のＬＦＡ−３結合ド メインを含有するタンパク質を、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチ ド、または請求項９から１３のいずれかに記載の融合タンパク質と共にインキュ ベートする工程を包含する、方法。
21. ２１．血清を含む、ＬＦＡ−３のＣＤ２結合ドメイン以外のＬＦＡ−３エピトー プを認識する抗ＬＦＡ−３抗体の溶液を清澄化する方法であって、抗体−タンパ ク質複合体を形成するのに適した条件下で、該抗ＬＦＡ−３抗体の溶液を、Ｍ５ ７、Ｍ５５、Ｍ５６、ＰＩＭ３、Ｍ１００、またはその組み合わせたものから選 択されるＬＦＡ−３欠矢変異体タンパク質と接触させ、そして該溶液から形成さ れたあらゆる抗体−タンパク質複合体を取り除く工程を包含する、方法。
22. ２２．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項９から１ ３のいずれかに記載の融合タンパク質をクロマトグラフィー用の基質に結合させ る工程、およびＬＦＡ−３／ＣＤ２複合体の形成に適した条件下で、ＣＤ２＋細 胞を含有する細胞懸濁液またはＣＤ２のＬＦＡ−３結合ドメインを有するタンパ ク質を含有する溶液を、該基質と接触させる工程を包含する、ＣＤ２＋細胞また はＣＤ２のＬＦＡ−３結合ドメインを有するタンパク質を単離するための、方法 。
23. ２３．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項９から１ ３のいずれかに記載の融合タンパク質、および薬学的に受容し得るキャリヤーを 含む、薬学的組成物。
24. ２４．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項９から１ ３のいずれかに記載の融合タンパク質を試薬として含む、ＣＤ２＋細胞またはＬ ＦＡ−３結合タンパク質の存在を検出するための診断用キット。
25. ２５．Ｔ細胞活性化を阻害するための、請求項１から４のいずれかに記載のポリ ペプチド、または請求項９から１３のいずれかに記載融合タンパク質の使用。
26. ２６．末梢血リンパ球の増殖を抑制するための、請求項１から４のいずれかに記 載のポリペプチド、または請求項１６から１９のいずれかに記載の融合タンパク 質の使用。
27. ２７．請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド、または請求項９から１ ３のいずれかに記載の融合タンパク質を哺乳動物に投与することを包含する、イ ンビボでＴリンパ球反応を開始させる方法。