HU211476A9

HU211476A9 - Cd2-binding domain of lymphocyte function associated antigen 3

Info

Publication number: HU211476A9
Application number: HU95P/P00680P
Authority: HU
Inventors: Margaret D Rosa; Barbara P Wallner; Glenn T Miller
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 1991-03-12
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1995-11-28
Also published as: EP0503648A1; JP2002037800A; DE69231135T2; ES2147178T3; EP0503648B1; ATE193724T1; DK0503648T3; SG47766A1; CA2081028C; AU660981B2; US5728677A; GR3034140T3; DE69231135D1; HK1014030A1; US5914111A; JP3520272B2; PT503648E; CA2081028A1; AU1754092A; JP2003089654A

Description

A találmány tárgyát a limfocita funkcióhoz kapcsolódó antigén 3 („LFA-3”) CD-2-höz kötődő doménjét tartalmazó polipeptidek és az ezeket a polipeptideket kódoló DNS szekvenciák, valamint az ezeket a polipeptideket expresszáló rekombináns DNS molekulák képezik. A találmány szerint egysejtes gazdaszervezetek készíthetők, amelyek a DNS szekvenciákkal és az ezeket a DNS szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS molekulákkal vannak transzformálva, és ezeket a sejteket arra használhatjuk, hogy az LFA-3 CD-2 kötő doménjét tartalmazó fehérjéket és polipeptideket állítsunk elő velük. A jelen találmány szerinti peptidek, polipeptidek és fehérjék jól használhatók a CD2 és LFA-3 közötti kölcsönhatások vizsgálatában, diagnosztikai és terápiás készítményekben, ellenanyag átvizsgálást vagy tisztítási módszerekben, valamint egyéb, a találmány szerinti módszerekben.

A T-limfociták fó szerepet játszanak az immunválaszban, azáltal, hogy kölcsönhatásba lépnek a megcélzott és az antigént bemutató sejtekkel. A célsejtek Tlimfociták által közvetített pusztulása egy többlépéses folyamat, amely magában foglalja citolitikus T-limfocitáknak a célsejtekhez való adhézióját. A legtöbb antigénnel szemben kialakuló immunválasz magában foglalja a segítő (helper) T-limfocitáknak az antigént bemutató sejtekhez való adhézióját.

A T-limfocitáknak ezek, a megcélzott és antigént bemutató sejtekkel való kölcsönhatásai erősen specifikusak, és függenek a megcélzott vagy antigént bemutató sejten található antigénnek a T-limfociták felszínén levő egy vagy több specifikus antigén receptor által való felismerésétől.

A T-limfocilák és egyéb sejtek receptor-antigén kölcsönhatását megkönnyítik a különböző T-limfocita felszíni fehérjék, azaz például a CD3 antigén-receptor komplex, és a CD4, LFA-1, CD8, CD2 járulékos molekulák. A T-limfociták és más sejtek kölcsönhatása is függ a járulékos molekuláktól, mint például az ICAM1, az I-es és Il-es MHC osztály és az LFA-3 molekuláktól, amelyek a megcélzott vagy antigént bemutató sejt felszínén expresszálódnak, és ennek következtében szerepet játszanak a T-limfociták akciójában. Egy általános hipotézis, hogy a T-limfocitákon és a megcélzott vagy antigént bemutató sejteken levő járulékos molekulák kölcsönhatásba lépnek egymással, így közvetítik az intercelluláris adhéziót. Ennek megfelelően ezekről a járulékos molekulákról az a vélemény alakult ki, hogy fokozzák a limfocita/antigént bemutató sejt és a limfocita/megcélzott sejt közötti kölcsönhatások hatékonyságát, és lényegesek a sejttapadás alapú patológiákban (ilyen például a leukocita/endoteliális sejt kölcsönhatás, amely kóros gyulladást eredményez) valamint a limfocita keringésben. A járulékos molekulák is részt vesznek a limfociták aktiválásában.

A járulékos molekulák által közvetített sejt-sejt kölcsönhatások egyik fontos példája a CD2 (egy T-limfocita járulékos molekula) és az LFA-3 (egy célsejt járulékos molekula) közötti specifikus kölcsönhatás. A CD2/LFA-3 kötődés lényegesnek tűnik számos fontos sejt-sejt reakcióban, beleértve a T-limfocita funkcionális válaszok iniciálását [Dustin és mtsai.: J. Exp. Med. 165, 677-92 (1987); Springer és mtsai.: Ann. Rév. Immunoi. 5, 223-52 (1987)]. ACD2/LFA-3 komplexnek a sejt-sejt tapadásban való fontosságát azok a megfigyelések is jelzik, hogy a tisztított LFA-3 kötődik a CD2-höz a T-limfociták felszínén [Dustin és mtsai.: J. Exp. Med. 165, 677-92 (1987)]; a T-limfocitákból tisztított CD2 kötődik az LFA-3-hoz a sejtek felszínén és gátolja az LFA-3-specifikus monoklonális ellenanyagok („MAb-ok”) LFA-3-hoz való kötődését [Selvaraj és mtsai.: Natúré 326, 400-403 (1987)], és az LFA-3at expresszáló humán eritrocitáknak a CD2-t expreszszáló sejtekhez való rozettálását gátolják az anti-LFA3 MAb-ok és az anti-CD2 MAb-ok [lásd például Seed és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84, 3365-69 (1987)].

Az LFA-3, amely megtalálható számos különböző sejt felszínén, mint például a monociták, granulociták, T-limfociták, eritrociták, B-limfoblasztoid sejtvonalak, timuszos epiteliális sejtek és vaszkuláris endoteliális sejtek felszínén, nagyszámú vizsgálat tárgya volt, amelyeknek az volt a célja, hogy tovább tisztázzák a szerepét a különböző T-limfocita kölcsönhatásokban. Az LFA-3-nak két természetes formáját azonosították. Az LFA-3 egyik formája („transzmembrán LFA-3”) a sejtmembránban van rögzítve egy transzmembrán hidrofób dómén révén. Az LFA-3 ezen formáját kódoló cDNS-t klónozták és szekvenálták [Wallner és mtsai.: J. Exp. Med. 166, 923-32 (1987)]. Az LFA-3 egy másik formája a sejtmembránhoz kötődik a foszfatidilinozitolt („Pl”) tartalmazó glikolipiddel képzett kovalens kötésen keresztül. Ez utóbbi formát „Pl-kapcsolt LFA-3” néven említik, és az LFA-3 ezen formáját kódoló cDNS-t is klónozták és szekvenálták [Wallner és mtsai.: WO 90/02 181 számú PCT bejelentés].

Jóllehet az LFA-3 gén DNS szekvenciáját és az LFA-3 mindkét formájának a primer aminosav szekvenciáját meghatározták, az LFA-3 és a receptora, a CD2 közötti kölcsönhatás aktuális pontját korábban nem határozták meg. Ahhoz, hogy jobban megértsük a CD2 és az LFA-3 közötti specifikus kölcsönhatást, szükség van arra, hogy azonosítsuk az LFA-3-οη a CD2-specifikus domént, és ezek után befolyásoljuk, módosítsuk azokat a celluláris és immunológiai folyamatokat, amelyek a CD2/LFA-3 komplex képződésétől függenek. Ez az információ hasznos lehet számos egyéb alkalmazásban is, beleértve a diagnosztikai és terápiás készítményeket, a fehérjetisztítást, az ellenanyagok azonosítását és tisztítását, valamint az LFA-3 és egyéb fehérjék összehasonlító és szerkezeti vizsgálatát.

A jelen találmány megoldást ad a fenti célkitűzésekre. azáltal, hogy azonosítjuk az LFR-3 CD2-kölö doménjét. és megadjuk azokat a nukleotid szekvenciákat. amelyek meghatározzák az LFA-3 CD2-kötö régióját, és az ezek által a szekvenciák által kódolt CD2 kötő polipeptideket. A jelen találmány tárgyát képezik az alábbi aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidek: X|-X₂-(I. számú szekvencia) Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly-Y, aholis:

HU 211 476 A9

Xj jelentése hidrogénatom vagy metionil csoport;

X₂ jelentése, ha jelen van, akkor egy olyan polipeptid, amely az alábbi aminosav szekvenciával, vagy annak egy részével rendelkezik, és tartalmazza az 5. számú szekvencia 1-77-es C-terminális aminosavait: Val Alá Gly Ser Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly Val Leu Ser Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu His Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys;

Y jelentése hidroxilcsoport vagy egy alábbi aminosav szekvencia, illetve annak egy része, amely a 33. számú szekvencia N-terminális 1-32-es aminosavait tartalmazza: Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val;

valamint ennek analógjai és származékai, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidek képesek a CD2höz kötődni.

Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát az alábbi aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidek képezik: X]-X₂-(l. számú aminosav szekvencia) Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly-Y, aholis:

Xj jelentése hidrogénatom vagy metionil-csoport;

X₂ jelentése, ha jelen van, egy olyan polipeptid, amely az alábbi aminosav szekvenciával, vagy annak egy részével rendelkezik, tartalmazza a 2. számú szekvencia 1-50 C-terminális aminosavait: Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys;

Y jelentése hidroxilcsoport vagy az alábbi aminosav szekvenciával vagy annak egy részével rendelkező polipeptid, amely a 3. számú szekvencia 1-10 Nterminális aminosavát tartalmazza: Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser;

valamint ennek analógjai és származékai, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidek képesek kötődni a CD2-höz.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fenti polipeptideket kódoló DNS szekvenciák, az ezeket a DNS szekvenciákat tartalmazó rekombináns molekulák, az ezekkel a DNS szekvenciákkal transzferált gazdaszervezetek, valamint a polipeptidek rekombináns úton, szintetikusan vagy félszintetikusan való előállításához szükséges molekulák és módszerek.

A jelen találmány szerinti polipeptidek jól használhatók azoknak a betegségeknek a diagnosztizálásában, amelyeket a CD2-nek adott sejtek felszínén való megléte vagy hiánya jellemez, és azoknak a kóros állapotoknak a kezelésében, amelyek az LFA-3/CD2 komplex képződésétől függenek.

A jelen találmány szerinti polipeptidek, és az ezeket kódoló DNS szekvenciák szintén használhatók rekombináns vagy szintetikus fúziós fehérjék előállítására, amelyek tartalmaznak egy funkcionális CD2-kötő domént vagy LFA-3 polipeptidet, a fenti meghatározás szerint, és egy másik domént egy LFA-3-tól eltérő fehérjéből vagy polipeptidből. A fúziós fehérjék CD2kötő dómén része lehetővé teszi, hogy az egyéb polipeptideket specifikusan CD2-t expresszáló (CD2⁺) sejtekhez irányítsuk. Az ezeket a fúziós fehérjéket expresszáló DNS szekvenciák szintén a jelen találmány tárgyát képezik.

Ilyen példák a jelen találmány szerinti fúziós fehérjékre azok az új fúziós fehérjék, amelyek egy funkcionális CD2-kötő domént tartalmazó LFA-3 részt tartalmaznak, az immunglobulin (lg) Fc régiójának legalább egy részéhez fúzionáltatva. A jelen találmány szerinti LFA-3-Ig fúziós fehérjék váratlanul gátolják a T-limfocita aktiválást és a perifériális vér limfociták szaporodását.

A jelen találmány tárgya továbbá, hogy a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék használhatók CD2 molekulák, például oldható CD2 jelölésére, oldatban vagy a T-limfociták vagy egyéb, CD2-t expresszáló sejtek felszínén. A jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék használhatók még bármely egyéb, az LFA-3-at kötő CD2 domént tartalmazó fehérje, polipeptid vagy peptid jelölésére, például egy rekombináns DNS technikával előállított fúziós fehérjében.

A jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék felhasználhatók még affinitáskromatográfiában is, CD2 vagy bármely egyéb polipeptid vagy fehérjekonjugátum tisztítására, amely az LFA-3-at kötő CD2 domént tartalmazza.

A találmány tárgyát képezik továbbá az LFA-3 fehérje azon megváltoztatott (mutáns) formái, amelyekből hiányzik a CD2 kötő dómén, valamint az LFA3 ilyen „deléciós mutáns” formáit kódoló DNS szekvenciák. A mutáns fehérjék, amelyekből a fenti meghatározás szerint hiányzik az LFA-3 CD2-kötő doménje, használhatók in vivő vagy in vitro, hogy ellenanyagokat vagy más molekulákat generáljunk vagy kössünk meg velük, amelyek a CD2-kötő doméntől eltérő epitopokat vagy helyeket ismernek fel az LFA-3 molekulán.

A jelen találmány szerinti CD2-kötő polipeptidek és fúziós fehérjék monomer formái mellett a találmány a multimer formák előállítását is lehetővé teszi. Ezeknek a formáknak lehet fokozott CD2 affinitásuk, fokozott immunogenitásuk és/vagy fokozott képességük a T-limfocita funkcionális válaszok iniciálására, azaz például a T-sejt aktiválás serkentésére a CD2/LFA-3 komplexek hatékonyabb vagy multiplikált formáin keresztül. Az ilyen multimer formák emellett hatékonyabbak lehetnek a CD2 kompetitív megkötésében, ezzel immunszuppresszánsként sokkal hasznosabbá téve őket, diagnosztikumként vagy reagensként pedig érzékenyebbé téve őket.

Emellett a jelen találmány azokra az ellenanyagokra is vonatkozik, amelyek felismerik a jelen találmány szerinti polipeptideket és fúziós fehérjéket. A jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék elleni poliklonális és monoklonális ellenanyagokat úgy állíthatjuk elő, hogy egy állatot a jelen találmány szerinti polipeptidekkel vagy fúziós fehérjékkel immunizálunk.

HU 211 476 A9

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a CD2/LFA-3 komplex képződését gátló alacsony molekulasúlyt! (általában 1000 daltonnái kisebb molekulasúlyú) inhibitorok. Az ilyen „kis molekulájú” inhibitorokat in vitro, szintetikus módszerekkel állíthatjuk elő, és a jelen találmány szerinti polipeptidek aminosav szekvenciájának részét tartalmazhatják, illetve lehetnek teljesen nem-peptid jellegű szerves molekulák, amelyeknek a konformációja képes utánozni a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék CD2kötő kötő specifitását.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a diagnosztikai és terápiás felhasználások módszerei, készítményei és kitjei, amelyekben az LFA-3 CD2-kötő doménjének jelenléte vagy hiánya szükséges.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat. Az

1. ábrán (az 1A. és 1B. ábra együtt) a transzmembrán

LFA-3 aminosav szekvenciája (1. számú szekvencia) és nukleotid szekvenciája (9. számú szekvencia) látható, aláhúzással jelezve az LFA-3 extracelluláris régiójában tett deléciókat. Az M53, M54, M55, M56, M57, M58, M59, M60, M61, M62, M63, M64, M65, M66, M90, M91 és M92 jelű régiókat kihurkoltuk, hogy olyan rekombináns géneket hozzunk létre, amelyek 17 különböző deléciós mutánst kódolnak. A deléciós mutánsok emlős sejtekben való expressziójával megváltozott LFA-3 felszíni fehérjék kaphatók, amelyekből hiányzik egy, a természetes LFA-3 fehérjében megtalálható aminosav szegment. Például az M57 jelű mutáns (azaz az 1. ábrán található LFA-3 DNS, amelyből az M57 régió ki van vágva) expressziója CHO sejtekben egy olyan LFA-3 mutánst eredményez, amely nem köti meg a CD2-t. Az N-terminális metionint (Met) -28-asnak jelezzük, jelezve ezzel, hogy ez a pre LFA-3 28 aminosavból álló szignálpeptid N-terminális csoportja. Az érett LFA-3 N-terminális aminosava egy fenilalanin (Phe), ennek sorszáma +1. A

2. ábrán (a 2A„ 2B„ 2C„ 2D„ 2E„ 2F„ 2G„ 2H„ 21.,

2J., 2K., 2L., 2M és 2N ábrák együtt) az M57-es deléciós mutáns (2A. és 2B. ábra), az M65-ös deléciós mutáns (2C. és 2D. ábra), az M63-as deléciós mutáns (2E. és 2F. ábra), az M54-es deléciós mutáns (2G és 2H. ábra), az M55-ös deléciós mutáns (21. és 2J. ábra), az M56-os deléciós mutáns (2K. és 2L. ábra) és az M58-as deléciós mutáns (2M. és 2N. ábra) által kódolt mutáns LFA3 fcrmákat expresszáló transzfektált CHO sejtek FACS-szal végzett immunfluoreszcenciás áramlási citometriai vizsgálatának eredményei láthatók. A transzfektált sejteket reagáltatjuk 202-es anti-LFA-3 poliklonális antiszérummal (szaggatott vonal, 2A., 2C., 2E„ 2G„ 21.. 2K„ 2M. ábrák), anti-LFA-3

Mab TS2/9-cel (szaggatott vonalak, 2B„ 2D„ 2F„ 2H„ 2J„ 2L„ 2N. ábrák) vagy antiLFA-3 M Ab 7A6-tal (pontozott vonalak, 2B„ 2D„ 2F„ 2H„ 2J„ 2L. és 2N. ábrák). Az egyes elemzésekben a kontroll csúcs (folyamatos vonal) jelenti azt a sejtpopulációt, amelynél a fluoreszcein-izotiocianáttal konjugált (FITC) kecske anti-egér vagy kecske anti-nyúl IgG kötés háttérszintet mutat. A

3. ábrán (a 3A„ 3B. és 3C. ábrák együtt) a Jurkat sejt kötési kísérlet eredményeit láthatjuk. A mikrofotográfiák olyan Jurkat sejteket mutatnak, amelyek CD2-t expresszálnak, normál CHO sejtekkel keverve (negatív kontroll) (3A. ábra), M57/CHO sejteket (3B. ábra) és P24/CHO sejteket, amelyek a Plhez kötött LFA-3-at expresszálják (pozitív kontroll) (3C. ábra). A

4. ábrán az M57/CHO sejtekben szintetizált LFA-3 gén átiratok Northern biot elemzése látható. A CHO negatív kontroll sejtekből (1. csík), az M57/CHO sejtekből (2. csík), és az M16.3/CHO pozitív kontroll sejtekből (3. csík) származó mRNS mintákat tartalmazó szűrőlapokat a pLFA3M54 plazmid NotI restrikciós fragmensével mint próbával vizsgáljuk át, amely tartalmazza az LFA-3 cDNS szekvencia (lásd 1. ábra) 1-153-as és 184— 1040-es nukleotidjait, nick-transzJációban ³²P-vel jelezve. Az

5. ábrán egy autoradiogram látható, amely a ¹²⁵I-vel felszínen jelzett M57/VHO sejtek (1-4 csíkok), normál CHO sejtek (negatív kontroll) (5-7 csíkok) és a P24/CHO sejtek (pozitív kontroll) (8-11 csíkok) differenciális immunprecipitációját mutatja. A felszínen jelzett sejtek lizátumait anti-LFA-3 MAb TS2/9-cel (2, 5,9 csík), anti-LFA-3 MAb 7A6-tal (3, 6, 10 csíkok) vagy 202-es anti-LFA-3 poliklonális antiszérummal (4, 7, 11 csíkok) reagáltatjuk. Az ellenanyaggal kicsapott fehérjéket elektroforézisnek vetjük alá SDS-poliakrilamid géleken, mielőtt autoradiográfiának vetjük alá. A

6. ábrán (a 6A. és 6B. ábrák együtt) a transzmembrán

LFA-3 aminosav szekvenciája (10. számú szekvencia) és nukleotid szekvenciája (9. számú szekvencia) látható, aláhúzással jelezve az LFA-3 extracelluláris régiójában levő deléciókat. Az Ml 00, Ml 01 és Ml02 régiókat kihurkol luk, hogy 3 különböző deléciós mutánst kódoló rekombináns géneket kapjunk. A

7. ábrán (7A., 7B„ 7C. és 7D. ábrák együtt) a Jurkat sejt kötő kísérletek eredményeit láthatjuk, amelyekben a CD2-t expresszáló Jurkat sejteket (a) normál CHO sejtekkel, (b) M100/CHO sejtekkel, (c) M101/CHO sejtekkel vagy (d) M102/CHO sejtekkel kevertük össze.A

8. ábrán (8A., 8B. és 8C. ábrák együtt) a Jurkat sejteknek az LF08/Affigel-10 gyöngyökhöz

HU 211 476 A9 való kötődése látható (lásd 8. példa). Az LF08/Affigel-10 gyöngyöket összekeverjük a Jurkat sejtekkel, majd a sejtek és a gyöngyök kötődését mikroszkóp alatt megfigyeljük (8A. és 8B. ábra). Összehasonlításképpen (negatív kontroll) egy hepatitisz B-ből származó nem-LFA-3 peptidet (azaz az „MXC 01,,-et (4. számú szekvencia: Thr Lys Pro Asp Leu Val Asp Lys Gly Thr Glu Asp Lys Val Val Asp Val Val Arg Asn) Affigel-10 gyöngyökhöz kötjük, a gyöngyöket Jurkat sejtekkel keverjük össze, majd a sejteknek a gyöngyökhöz való kötődését a 8C. ábrán mutatjuk be. A

9. ábrán a ΡΙ-hez kötött LFA-3 aminosav szekvenciája (12. számú szekvencia) és nukleotid szekvenciája (11. számú szekvencia) látható, aláhúzással jelezve a nukleotid szekvenciákban és a megfelelő ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3 fehérjében végrehajtott belső deléciót. A PIM3-mal jelzett DNS régiót kihurkoltuk, így egy olyan rekombináns gént kaptunk, amely egy olyan mutáns fehérjét kódol, amely tartalmazza a ΡΙ-hez kapcsolódó LFA-3 89 N-terminális aminosavát, de hiányzik belőle az ezt követő 71 aminosav. A PIM3 deléciós mutáns (azaz a 9. ábrának megfelelő ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3 DNS, amelyből a PIM3 régiót kihasítottuk) expressziója CHO sejtekben a ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3-nak egy olyan mutáns formáját eredményezi, amely megtartja a CD-2 kötő doménjét. A

10. ábrán (a 10A. és 10B. ábrák együtt) a PIM3 deléciós mutáns által kódolt, a ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3 mutáns formáját expresszáló, transzferált CHO sejtek FACS elemzéssel végzett immunfluoreszcenciás áramlási citometriás vizsgálatának eredményei láthatók. A transzfektált sejtek (PIM3.25.2 sejtek) egy olyan felszíni fehérjét expresszálnak, amelyiket felismeri a TS2/9 anti-LFA-3 MAb (10A. ábra, szaggatott vonal), és érzékeny a sejt felszínéről PI-PLC kezeléssel való felszabadításra (10A. ábra, pontozott vonal). A 10B. ábrán egy hasonló elemzés eredményei láthatók, amelyben a mutáns ΡΙ-hez kapcsolt fehéije expresszálására amplifikált, transzfektált CHO sejteket (PIM2.25.2.100.12 sejtek) használtunk. Ezek a sejtek egy olyan fehérjét termelnek a felszínükön, amelyet a MAb 7A6 felismer (10B., szaggatott vonal), és amelyek a sejt felszínéről való felszabadulásra érzékenyek a PI-PLC kezelés hatására (10B. pontozott vonal). Mindegyik elemzésben a kontroll (folyamatos vonal) egy olyan sejtpopulációt jelent, amely a FITC-vel konjugált kecske anti-egér IgG kötődés háttérszintjével rendelkezik. A

11. ábrán az LFA3TIP egy dimerjének a diagramját látjuk, amely az LFA-3-Ig fúziós fehérje különböző doménjeit ábrázolja. Amint ezen az ábrán látható, az „LFA-3” az érett LFA-3 92 N-terminális aminosavára vonatkozik. „H” jelentése az IgGl csuklórégió tíz aminosavára vonatkozik, amely két ciszteint tartalmaz, és ezzel két intermolekuláris hidat hoz létre. Mindegyik diszulfid hidat egy horizontális kettős SS jelzi. „Ch2” és „Ch3” a humán IgGl molekulában az Fc régióban levő két konstans domént jelzi a csuklórégió alatt. A

12. ábrán a preLFA3TIP aminosav szekvenciáját (43.

számú szekvencia) és nukleotid szekvenciáját (42. számú szekvencia) mutatja (azaz az LFA-3 szekvenciát (+1 - +92 aminosavak) és a 28 aminosavból álló szignálszekvenciát. A 12. ábrán látható nukleotid szekvencia is ugyanaz mint a pSAB 152 expressziós plazmidban található DNS szekvencia. A

13. ábrán látható fénykép nem-redukáló körülmények között (1-es és 2-es csíkok) és redukáló körülmények között (3-as és 4-es csíkok) között készített SDS-PAGE gélek Western biot elemzésének a képe. Az 1-es és 3-as csíkokban nagy molekulasúlyú markerek találhatók (BRL, Gaithersburg, Maryland). A 2-es és 4-es csíkok LFA3TIP-et tartalmaznak, amelyet a 13. példában leírtak alapján tisztítottunk. A

14. ábrán (a 14A. és 14B. ábrák együtt) FACS elemzéssel végzett immunfluoreszcenciás vizsgálat eredményei láthatók. A vizsgált rendszerek: Jurkat sejtek LFA3TIP plusz R-fikoeritrinnel konjugált anti-humán IgG F(ab’)2 (pontozott vonal) anti CD2 MAb TS2/18 plusz FITC-vel konjugált kecske antiegér IgG (H+L) F(ab’)2 jelenlétében (kis pontok a 14A. ábrán) vagy FITC-vel konjugált kecske anti-egér IgG (H+L) F(ab’)2, plusz vagy TI 11 anti-CD2 aszcitesz folyadék jelenlétében (szaggatott vonal a 14A. ábrán), vagy TI 12 jelenlétében (szaggatott vonal a 14B. ábrán), vagy TII3 jelenlétében (kis pontok a 14B. ábrán). A

15. ábrán humán T-sejt aktiválás vizsgálatára végzett allogén kevert limfocita reakció eredményei láthatók, amit ³H-timidinnek T-sejtekbe való beépülésével mérünk anti-LFA-3 MAb 1E6 (tele négyszögek), LFA3TIP (tele körök) és nemspecifikus humán IgGl (tele háromszögek) jelenlétében. A

16. ábrán T-sejt aktiválás gátlásának vizsgálatára kiválasztott fehérjékkel végzett MLR vizsgálatok eredményei láthatók. A „7A6” és „1E6” jelentése anti-LFA-3 monoklonális ellenanyag (MAb), amelyek az LFA-3 CD-2 kötő doménjére specifikusak. Az „LFA3IgGA” és az „LFA3IgG72A” jelentése LFA3TIP készítmény, amelyek csak a tisztaságuk fokában térnek el egymástól (azaz 75 illetve

HU 211 476 A9 százalékosak). AhlgG nemspecifikus humán IgG. A „PILFA3” jelentése multimer ΡΙ-hez kötött LFA-3. A „CD4-IgG” jelentése egy fúziós fehéije, amely a CD4 fehérjének egy részét tartalmazza, az IgG Fc régiójának egy részéhez fuzionáltatva. A „hamis” jelentése „hamis készítmény”, amelyet pSAB132 expressziós vektorral (ebből hiányzik az LFA3TIP-t kódoló DNS szekvencia) transzfektált COS7 sejtekből tisztítottunk. A

17. ábrán egy PBL proliferációs vizsgálat eredményei láthatók, amit ³H-timidin beépülésével mérünk. A PBL proliferációs vizsgálatot LFA3TIP (tele négyszögek), humán IgG (tele körök) és egy „hamis készítmény” jelenlétében végezzük. A „hamis készítmény” tartalmazza azt a szennyeződést („szennyeződés”), amely együtt tisztul az ebben a vizsgálatban használt LFA3TIP-vel (tele háromszögek). A

18. ábrán egy 0KT3 (anti-CD3 Mab) dependens PBL proliferációs vizsgálat eredményei láthatók, ³H-timidin beépülésével mérve. A PBL proliferációt 3 nmol/1 OKT3 (OKT3), 3 nmol/1 OKT3 plusz 1 nmol/1 vagy 10 nmol/1 LFA3TIP (OKT3+LFA3TIP), 3 nmol/1 OKT3 plusz 1 nmol/1 vagy 10 nmol/1 humán IgGl (OKT3+hIgGl), vagy tápközeg OKT3 nélkül (tápközeg) jelenlétében mérjük. A

19. ábrán láthatjuk egy fitohemagglutinin (PHA) dependens PBL proliferációs vizsgálat eredményeit, szuboptimális serkentő koncentrációjú (0,1 pg/ml) vagy optimális serkentő koncentrációjú (1 pg/ml) PHA jelenlétében. A PBL proliferációt úgy mérjük, mint azt akkor jeleztük, amikor csak PHA van jelen (PHA) valamint PHA plusz a következő anyagok vannak jelen: ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3 (+PILFA-3); monomer oldható LFA-3 (+mon LFA-3); LFA3TIP (+LFA3TIP); egy LFA-3-IgG fúziós fehérje, amelyről hiányzik a CD2 megkötésében részt vevő LFA-3 M57 régiójának 10 aminosava hiányzik (+M57IgG); anti-LFA-3 1E6 MAb (+1E6); anti CD2 TS2/18 MAb (+TS2/18); és egy teljes hosszúságú LFA3—lg fúziós fehérje (+FLIgG). Mindegyik hozzáadott molekula 5 pg/ml koncentrációban van jelen.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.

A jelen találmány szerinti polipeptideket, készítményeket és módszereket az X]-X2-(l. számú aminosav szekvencia) Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly-Y, aholis:

X, jelentése hidrogénatom vagy metionil csoport;

X₂ jelentése, ha jelen van, akkor egy olyan polipeptid, amely az alábbi aminosav szekvenciával, vagy annak egy részével rendelkezik, és tartalmazza az 5.

számú szekvencia 1-77-es C terminális aminosavait: Val Alá Gly Ser Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly Val Leu Ser Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gin Gin He Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu His Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys;

valamint ennek analógjai és származékai jellemzik, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidek képesek a CD2-höz kötődni.

Egy másik megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát az alábbi aminosav szekvenciával rendelkező polipeptidek képezik: X_rX₂-(l. számú aminosav szekvencia) Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly-Y, aholis:

Xi jelentése hidrogénatom vagy metionil-csoport;

A jelen találmány szerinti polipeptidek tartalmazzák a 10. aminosav szekvencia 29-120-as aminosavait, a 10. aminosav szekvencia 29-108-as aminosavait, a

10. aminosav szekvencia 48-108-as aminosavait és a 7. aminosav szekvenciát.

A leírásban és az igénypontokban az aminosavak és maradékaik jelölésére használt rövidítéseket a nevezéktan általánosan elfogadott szabályai szerint használjuk, amelyek az L-sorozatba tartozó a-aminosavakhoz és maradékaikhoz kötődnek.

Egy származékok aminosav egy természetes vagy nemtermészetes aminosav, amelyben a normális körülmények között előforduló oldalláncot vagy végcsoportot kémiai reakcióval módosítjuk. Ilyen módosítás például a gamma-karboxilezés, a hidroxilezés, szulfatálás, szulfonálás, foszforilezés, amidálás, észterezés, t-butoxi karbonilezés, N-acetilezés, karbobenzoxilezés, toxilezés, benzilezés és egyéb, a szakterületen ismert módosítás.

A derivatizált polipeptid egy olyan polipeptid, amely egy vagy több derivatizált aminosavat tartalmaz.

HU 211 476 A9

A jelen találmány szerinti polipeptidek analógjait például aminosav szubsztitúcióval, addícióval vagy delécióval lehet jellemezni, illetve D-aminosavak alkalmazásával. A jelen találmány szerinti polipeptidek szubsztitúciói közül azok előnyösek, amelyek a szakirodalomban konzervatívnak elismert aminosav helyettesítések. Például az alábbi csoportok egyikébe tartozó aminosavak konzervatív cserét jelentenek: ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; és phe, tyr, trp, his. [Grantham, Science 185, 862-64 (1974); Dayhoff in Atlas of Protein Sequence and Structure 5, (1978); Argos, EMBOJ. 8, 779-785(1989)].

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti összes analógot és származékot olyan biológiai aktivitások jellemzik, amelyek hasonlóak az itt ismertetett CD2-kötő polipeptidekhez. Ennek megfelelően ezeket az analógokat és származékokat használhatjuk készítményekben, kombinációkban és diagnosztikai módszerekben. terápiában és megelőzésben, ugyanúgy, mint a jelen találmány szerinti polipeptideket.

A jelen találmány szerinti polipeptideket számos különböző, a szakterületen ismert módszerrel előállíthatjuk. Például a polipeptidek származhatnak proteolízissel az intakt transzmembrán vagy PI-kapcsolt LFA3 molekulákból, specifikus endopeptidázokat alkalmazva exopeptidázokkal vagy Edman degradációval. vagy mindkettővel kombinálva. Ezzel szemben az intakt LFA-3 molekulákat tisztíthatjuk természetes forrásokból. szokványos módszerek alkalmazásával. Egy másik módszer szerint teljes hosszúságú vagy csonkított LFA-3-at ismert rekombináns DNS technikákkal állíthatunk elő, cDNS-eket alkalmazva [Wallner és mtsai., 4 956 281 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás].

A jelen találmány szerinti polipeptideket előnyösen közvetlenül állítjuk elő, ezzel elkerüljük azt, hogy kiindulási anyagként nagyobb LFA-3-ra legyen szükség. Ezt megtehetjük szokványos kémiai peptidszintézis technikákkal vagy jól ismert rekombináns DNS technikákkal, mikoris csak a kívánt polipeptideket kódoló DNS szekvenciákat expresszáljuk egy transzformált gazdaszervezetben.

A gént, amely a jelen találmány szerinti kívánt LFA-3 polipeptidet kódolja, a kívánt polipeptid aminosav szekvenciája alapján tervezhetjük meg. Ezután standard módszerek alkalmazhatók a gén szintetizálására. Például az aminosav szekvenciát használhatjuk egy gén készítésére. Egy DNS oligomert, amelynek nukleotid szekvenciája egy jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidet kódol, egyetlen lépésben megszintetizálhatunk. Egy másik módszer szerint számos kisebb oligonukleotidot szintetizálhatunk, amelyek a kívánt polipeptid részeit kódolják, majd összeligálhatjuk őket. Előnyösen egy, a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidet kódoló DNS szekvenciát számos különböző oligonukleotid formájában szintetizálunk meg, amelyeket később egymáshoz ligálunk. Az egyes oligonukleotidok általában 5’ vagy 3’ túlnyúló végeket tartalmaznak a komplementer összeállításhoz.

Ha egyszer összeállítottuk őket, akkor az előnyös géneket olyan szekvenciák jellemzik, amelyeket felismernek a restrikciós endonukleázok (beleértve az olyan egyedi restrikciós hasítási helyeket, amelyeket klónozáshoz, vagy egy expressziós vektorhoz lehet használni), a használandó gazdaszervezet expressziós rendszere által előnyben részesített kodonokat tartalmaz, és egy olyan szekvenciát, amely, ha átíródik, akkor stabil, hatékonyan átíródó RNS-t eredményez. Az összeállítás helyességét nukleotid szekvenálással, restrikciós térképezéssel és a biológiailag aktív polipeptidnek egy megfelelő gazdaszervezetben való expresszálásával lehet ellenőrizni.

Egy, a találmány szerinti DNS szekvencia nukleinsav szekvenciája az érett LFA-3 1-70-es aminosavait kódolja, azaz az 1. ábra szerinti 94-303-as nukleotidokat. Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a DNS szekvencia a 6. számú nukleinsav szekvenciát tartalmazza: AATAGGGTTT ΑΓΓΓΑGAC TGTGTCAGGT, amely az érett LFA-3 51-60as aminosavait kódolja. A jelen találmány szerinti előnyös DNS szekvenciák azonban olyan polipeptideket is kódolnak, amelyeknek aminosav szekvenciája a 10. számú szekvencia 29-120-as, 29-108-as és 48-108-as aminosav szekvenciáit tartalmazza, valamint a 7. számú szekvenciát. A jelen találmány szerinti legelőnyösebb DNS szekvencia egy olyan polipeptidet kódol, amelynek aminosav szekvenciája a 10. számú szekvencia 1-120-as aminosavait tartalmazza. Ez a szekvencia, ha állati sejtekben alkalmazzuk, akkor lehetővé teszi egy olyan polipeptid termelését, szekretálását és érését, amelynek aminosav szekvenciája a 10. számú szekvencia 29-120-as aminosavaiból áll.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a genetikai kód degeneráltsága miatt számos egyéb nukleotid szekvenciát tartalmazó DNS molekula is képes a jelen találmány szerinti polipeptidek kódolására. A jelen találmány ezekre a degenerált szekvenciákra is vonatkozik.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan rekombináns DNS molekulák, amelyek az előzőkben említett DNS szekvenciákat tartalmazzák. A jelen találmány szerinti rekombináns DNS molekulák képesek a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptid expresszálásának irányítására az általuk transzformált gazdaszervezetekben. Egy DNS szekvenciát, amely a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidet kódolja, az expresszáláshoz működés szempontjából össze kell kapcsolni egy expressziós kontroll szekvenciával. A „működés szempontjából összekapcsolt” szakkifejezés a továbbiakban azt jelenti, hogy a szekvenciát úgy helyezzük el egy vektorban, hogy a kódoló szekvencia transzkripcióját és transzlációját a kontroll szekvencia irányítsa.

Egy olyan rekombináns DNS molekula készítéséhez, amely képes a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidek expresszálását irányítani, az ezeket a polipeptideket kódoló DNS szekvenciákat számos különböző vektorba beépíthetjük és azokban expresszálhatjuk. Emellett, min7

HU 211 476 A9 den egyes specifikus expressziós vektorban különböző helyeket választhatunk ki ezeknek a DNS szekvenciáknak a beépítésére. Ezeket a pontokat általában azoknak a restrikciós endonukleázoknak a nevével jelöljük, amelyek hasítják őket. A szakterületen jártas szakember számára ezek jól ismertek. Az azonban nyilvánvaló, hogy egy, a jelen találmányban jól használható expressziós vektornak nem kell tartalmaznia a kiválasztott DNS fragmens beépítéséhez szükséges endonukleáz hasítási helyet. Ehelyett a vektort más módszerekkel lehet a fragmenshez kapcsolni.

Az expressziós vektor, és főleg a kiválasztott DNS fragmens beépítéséhez valamint egy expressziós kontroll szekvenciához való kapcsoláshoz kiválasztott hasítási helyet számos különböző faktor határozza meg. Ezek közé a faktorok közé tartozik például az egy adott restrikciós enzimre érzékeny hasítási helyek száma, az expresszálandó polipeptid mérete, a kívánt polipeptid érzékenysége gazdasejt enzimei által való proteoltiikus lebontásra, az expresszálandó polipeptid szennyeződése vagy kötődése a tisztítás során nehezen eltávolítható gazdasejt fehérjékhez, az expresszió jellemzői, azaz például a startés stopkodonok elhelyezkedése a vektor szekvenciákhoz viszonyítva, valamint egyéb, a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló faktorok. Egy DNS szekvenciához egy vektor és egy inszerciós hely megválasztását ezeknek a faktoroknak az egyensúlya határozza meg, és egy adott esetben nem mindegyik választási lehetőség lesz egyformán hatékony.

Az eukarióta gazdaszervezetekben jól használható expressziós vektorok közé tartoznak például azok a vektorok, amelyek az SV40, a szarvasmarha papillóma vírus, az adenovírus vagy a citomegalovírus expressziós kontroll szekvenciáját tartalmazzák, valamint azok a vektorok, amelyek főleg rovarsejtekben használhatók. Ilyen például a pVL941 vektor. A hasznos bakteriális expressziós vektorok közé tartoznak az ismert bakteriális plazmidok, mint például az Escherichia coli plazmidok, beleértve a colEl, pCRl, pBR322, pMB9 plazmidokat és származékaikat; a szélesebb gazdaspecifitású plazmidok, mint például az RP4, a lambda fág számos származéka, például az NM 989 és a lambda gt sorozat; egyéb DNS fágok, például az Ml3, valamint más fonalas egyszálú DNS fágok; a kereskedelmi forgalomban levő erős expressziós vektorok, például a pGEM sorozat és a lambda Zap vektorok. A használható emlőssejt expressziós vektorok közé tartozik például a pNUT. Az élesztőkben használható vektorok például a 2 μ-os plazmid és származékai.

Ezeket az expressziós vektorokat az is jellemzi, hogy legalább egy olyan expressziós kontroll szekvenciával rendelkeznek, amely működés szempontjából kapcsolódhat a vektorba beépített találmány szerinti szekvenciához, azzal a céllal, hogy a klónozott DNS szekvencia expresszióját kontrolláljuk és szabályozzuk. A hasznos expressziós kontroll szekvenciákra példakánt megemlíthetjük a malE rendszert, az OmpA rendszert, a lac rendszert, a trp rendszert, a tac rendszert, a trc rendszert, a lambda fág fő operátor és promoter régióit, az fd burokfehérje kontroll régióját, az élesztő glikolitikus promotereit, azaz például az élesztő savas foszfatázt (Pho5), az élesztő szexuális faktorok promotereit, és a poliómából, adenovírusból, retrovírusból és majomvírusból származó promotereket, azaz például az SV40 korai és késői promotereit, az eukarióta sejtek promotereit, mint például a metallotionein promotert és más szekvenciákat, amelyekről ismert, hogy ellenőrzik a prokarióta és eukarióta gének valamint vírusaik expresszióját. Az említett promoterek kombinációja is hasznos lehet.

A jelen találmány szerinti rekombináns DNS molekulák tartalmazhatnak más DNS szekvenciákat is, fúzionáltatva és leolvasási fázisban illesztve a jelen találmány szerinti DNS szekvenciákhoz. Az ilyen konstrukciókat például egy ATG startkodon jellemzi, amely közvetlenül az LFA-3 polipeptid első aminosavát kódoló nukleotidhoz van fuzionáltatva. Ezzel a konstrukcióval egy f-Met polipeptidet lehet előállítani. Az azonban nyilvánvaló, hogy az első metionin egy transzformált gazdaszervezetben lehasadhat az expresszió során, vagy később eltávolítható. Egy másik módszer szerint egy bakteriális vagy eukarióta szignálszekvenciát kódoló DNS szekvenciát fuzionáltathatunk egy, a jelen találmány szerinti KFA-3 polipeptidet kódoló DNS szekvenciához. Ez lehetővé teszi, hogy az expresszált termék vagy szekretálódjon, vagy egy specifikus szubcelluláris kompartmentbe irányuljon a gazdasejten belül. A legtöbb szignálszekvenciát a gazdasejt eltávolítja a célzási funkció végrehajtása után, ezáltal feleslegessé válik az eltávolítása a kívánt polipeptid tisztítása után. Számos szignálszekvencia, valamint az ezeket kódoló DNS szekvencia ismert a szakirodalomban. Az ilyen szignálszekvencia DNS-nek a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidet kódoló szekvenciával leolvasási fázisban való fúzióját standard molekuláris biológiai technikákkal érhetjük el.

Egy másik módszer szerint egy, a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidet kódoló DNS szekvenciát fúziós fehérjeként expresszálhatunk, egy gazdasejt polipeptidet kódoló második DNS szekvenciával leolvasási fázisban ligáivá. Egy fúziós fehérje expressziója számos előnnyel jár, azaz például a gazdasejt által való lebontással szembeni fokozott ellenállás, a gazdasejt polipeptid aktivitásán vagy antigén tulajdonságán alapuló azonosítás egyszerűsége, valamint a gazdasejt polipeptid fizikai vagy immunológiai tulajdonságán alapuló tisztítás egyszerűsége.

A találmány tárgyát képezik továbbá a fentiekben ismertetett rekombináns DNS molekulákkal transzformáit gazdaszervezetek. A hasznos gazdaszervezetek, amelyek ezekkel a rekombináns DNS molekulákkal transzformálhatok, és amelyeket a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptidek expresszálására használhatunk, lehetnek jól ismert eukarióta és prokarióta gazdaszervezetek, úgymint az Escherichia coli különböző törzsei, azaz például az Escherichia coli SG-936, az Escherichia coli HB101, az Escherichia coli W3110, az Escherichia coli XI776, az Escherichia coli X2282, az Escherichia coli DH1, az Escherichia coli DH-5alfa, az Escherichia coli MRC1; Pseudomonas törzsek, Ba8

HU 211 476 A9 cillus törzsek, például a Bacillus subtilis, Streptomyces törzsek, Saccharomyces törzsek, állati sejtek, azaz például a COS sejtek, CHO sejtek, BHK sejtek, humán szöveti sejtek; rovarsejtek [például a Spodoptera frugiperda (SF9)], valamint növényi szövettenyészetek sejtjei. Az igénypontokban szereplő polipeptidek előnyős gazdasejtjei a CHO sejtek.

Az nyilvánvaló, hogy nem mindegyik gazdasejt/expressziós vektor kombináció működik egyforma hatékonysággal a jelen találmány szerinti LFA-3 polipeptideket kódoló DNS szekvenciák expresszálásában. Azonban egy gazdasejt-expressziős vektor kombinációt a szakterületen jártas szakember az itt ismertetett elvek megfelelő megfontolása után megválaszthat, anélkül, hogy eltérne a jelen találmány oltalmi körétől. A választás például alapulhat számos faktor kiegyensúlyozásán. Ezek közé a faktorok közé tartozik például a gazdasejt és a vektor kompatibilitása, a DNS szekvencia által kódolt polipeptideknek a gazdaszervezetre gyakorolt toxicitása, a vektor kópiaszáma és az a képessége, hogy ezt a kópiaszámot szabályozni tudja, a vektor által kódolt egyéb fehérjék, úgymint az antibiotikum markerek expressziója, a kívánt polipeptid kinyerésének egyszerűsége, a DNS szekvenciák és a működés szempontjából hozzájuk kapcsolt expressziós kontroll szekvenciák expressziós jellemzői, a biológiai biztonság, a költségek, a térbeli szerkezet kialakítása, valamint bármely egyéb, a kívánt polipeptid expresszió után szükséges módosítása.

Jóllehet a rekombináns DNS technikák az előnyös módszerek a 20 aminosavnál többet tartalmazó találmány szerinti polipeptid előállítására, a jelen találmány szerinti rövidebb polipeptideket, amelyek 20 aminosavnál kevesebbet tartalmaznak, előnyösen szokványos szintetikus kémiai módszerekkel lehet előállítani. A jelen találmány szerinti szintetikus úton előállított polipeptidek előnyösen kiemelkedően magas kitermeléssel állíthatók elő és könnyen tisztíthatók.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a polipeptideket oldatban vagy szilárd fázison szintetizáljuk, majd adott esetben karboxipeptidázokkal emésztjük (a C-terminális aminosavak eltávolítása céljából) vagy manuális Edman degradációval bontjuk le (az N-terminális aminosavak eltávolítása céljából). A polipeptidek megfelelő térszerkezetének kialakulását oxidatív körülmények között érhetjük el, ami előnyben részesíti a diszulfid hidak kialakulását [S. B. H. Kent: „Chemical synthesis of polypeptides and proteins”, Ann. Rév. Biochem. 57, 957-89 (1988)]. Az így előállított polipeptideket a szakterületen széles körben ismert szeparációs technikákkal tisztíthatjuk, előnyösen fordított fázisú HPLC technikákat alkalmazhatunk. Az oldatban végzett szintézis alkalmazása előnyösen lehetővé teszi bizonyos derivatizált aminosavak hozzáadását a növekvő polipeptid lánchoz, azaz például a tirozin O-szulfát észterének hozzáadását. Ez szükségtelenné tesz egy következő derivatizálási lépést, a jelen találmány szerinti polipeptidek bármely csoportjának módosítására. A jelen találmány szerinti polipeptidek biológiai aktivitását, azaz például azt a képességüket, hogy blokkolni tudják az LFA-3/CD2 kölcsönhatást, egyszerű sejt kötődési vizsgálattal lehet mérni, amely lehetővé teszi az LFA-3 polipeptidet expresszáló sejtek CD2-expresszáló sejtekhez való kapcsolódásának vizuális (nagyítással) úton való értékelését. A Jurkat sejt az előnyös CD2⁺ szubsztrát (lásd példák). A találmány szerinti oldható polipeptidek kötődési tulajdonságait számos ismert módon vizsgálhatjuk, azaz például a polipeptid radioaktív izotópos jelölésével (például ³⁵S izotóppal), majd a jelzett polipeptidet kölcsönhatásba hozva a CD2⁺ sejtekkel. Az enzimes jelzést vagy a rozettálási vizsgálatokat is használhatjuk [Seed és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA54, 3365-69 (1987)].

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a fúziós fehérjék és az azokat kódoló DNS szekvenciák. Ezeknek a fúziós fehérjéknek az N-terminális régióját az jellemzi, hogy a jelen találmány szerinti CD2-kötő polipeptid aminosav szekvenciáját tartalmazzák, a Cterminális régió egy, az LFA-3-tól eltérő fehérje vagy polipeptid egy doménjét tartalmazza. Ilyen dómén például egy immunglobulin Fc régiója.

A jelen találmány szerinti előnyös fúziós fehérjékben a jelen találmány szerinti CD2-kötő polipeptideket egy immunglobulin Fc régiója legalább egy részéhez fuzionáltatjuk. Ezekben a fúziós fehérjékben a CD2kötő polipeptidek képezik az N-terminális részt, az Fc régió képezi a C-terminális részt.

Ezekben a fúziós fehérjékben az Fc régiót előnyösen a csuklórégióra és a C_H2 valamint a C_H3 doménekre korlátozzuk. Még előnyösebb, ha a jelen találmány szerinti fúziós fehérjékben az Fc régió a C_H2 valamint a C_h3 doménekre, valamint a csuklórégió egy részére korlátozódik, amely régió képes intermolekuláris diszulfid hidakat képezni (lásd például a 12. ábrát).

Egy, a jelen találmány szerinti hasznos LFA-3-Ig fúziós fehérje az LFA3TIP [szerepel még LFA3(92)IgG néven is], amelyet a pSAB152 expressziós plazmidot tartalmazó COS7 sejtek szekretálnak a sejttenyésztő közegbe (lásd a továbbiakban). Az LFA3TIP az érett LFA-3 N-terminális 92 aminosavát tartalmazza a humán IgGl csuklórégiójának egy részéhez és a C_H2 valamint C_H3 konstans doménekhez fuzionáltatva (lásd

11. ábra). A fúziós fehéije, az LFA3TIP, az LFA-3-nak egy funkcionális CD2-kötő doménjét tartalmazza, valamint az IgG-nek az Fc-kötő fehérje, a Protein A által felismerendő Fc régiójának egy elegendő részét. Az LFA3TIP képes a CD2-höz kötődni és gátolni a T-sejtek aktiválását.

Az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék olyan módszerekben használhatók, amelyekkel szelektíven izolálni lehet a CD2 vagy CD2-t expresszáló sejteket, ami ezen polipeptidek CD2-kötő doménje és a CD2 között létrejövő komplexen alapul.

A jelen találmány egy másik megvalósítási módjában a jelen találmány szerinti polipeptideket és fúziós fehérjéket, azaz az LFA-3-Ig fúziós fehérjéket a CD2-t expresszáló sejtek vagy a CD2 LFA-3 kötő doménjét tartalmazó polipeptidek jelzésére lehet használni. Pél9

HU 211 476 A9 dául a jelen találmány szerinti polipeptideket és fúziós fehérjéket konjugáltathatjuk egy „riporter molekulához”, ami lehetővé teszi a CD2⁺ sejtekhez vagy az LFA-3 CD2-kötő doménjét tartalmazó polipeptidekhez kötődő polipeptidek vagy fúziós fehérjék kimutatását. Annak következtében, hogy az immunglobulin Fc régiójának egy része jelen van a jelen találmány szerinti fúziós fehérjékben, az ilyen fúziós fehérjéket konjugáltathatjuk ugyanazokhoz a „riporter molekulákhoz”, amelyek általában immunglobulinokhoz konjugálódnak vagy kötődnek, azzal a céllal, hogy kimutassuk az antigénekhez kötődő immunglobulinokat, azaz például ¹²⁵I, enzimmel konjugált, Fc régió elleni szekunder ellenanyagok, vagy biotin-sztreptavidin alapú enzimkonjugált molekulák. Ennek megfelelően egy, a jelen találmány szerinti LFA-3-Ig fúziós fehérje konjugáltatható vagy hozzáköthető az ilyen riporter molekulákhoz, az Fc C-terminális részén keresztül. Emellett az ilyen riporter molekulák konjugáltathatók vagy hozzáköthetők a jelen találmány szerinti polipeptidekhez vagy fúziós fehérjékhez, mielőtt vagy miután a polipeptidek vagy a fúziós fehérjék kötődnek a CD2-höz vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjéhez.

A jelen találmány tárgya továbbá, hogy a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék használhatók diagnosztikai alkalmazásokban, hogy kimutassuk a CD2 vagy a CD2 LFA-3 kötő doménjét tartalmazó sejtek vagy molekulák jelenlétét vagy távollétét.

A jelen találmány szerinti polipeptidek vagy fúziós fehérjék használhatók gyógyászati készítményekben is, azzal a céllal, hogy gátoljuk a CD2/LFA-3 komplex kialakulását, amennyiben ez a kialakulás kóros állapothoz vezet. Egy másik módszer szerint használhatjuk őket terápiásán, hogy utánozzuk az LFA-3 szerepét a CD2/LFA-3 komplex képződésétől függő T-limfocita funkcionális válaszok iniciálásában [Dustin és mtsai.: J. Exp. Med. 165, 677-92 (1987); Springer és mtsai.: Ann. Rév. Immunoi. 5, 223-52 (1987)]. Például a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék használhatók akut és krónikus gyulladások, autoimmun betegségek kezelésére, valamint immunmodulációra, beleértve az olyan betegségek kezelését mint a szisztémás lupus erythematosus vagy lupus vulgáris, reumatóid artritisz és tiroiditisz. Emellett a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék használhatók arra, hogy gátoljuk a T-sejtek aktiválását vagy gátoljuk a perifériális vér limfociták szaporodását.

Ebből a szempontból az nyilvánvaló, hogy a sejtsejt tapadásban szerepet játszó molekulák általában sokkal hatékonyabbak egy bizonyos válasz kiváltásában a sejtekből, ha a molekulák multimer formában vannak jelen, mint hogy ha monomer formában vannak jelen ugyanazok a fehérjék. A sejtfelszíni adhéziós fehérjék multimer formái láthatóan sokkal jobban utánozzák az in vivő tipikus helyzetet, ahol például egy effektor sejt százával vagy ezrével mutatja be az adott adhéziós fehérjéket a felszínén, amelyek azután a célsejt felszínén több példányban jelenlevő ligandumhoz kötődnek. Ha több sejtfelszíni molekula vesz részt a kötődésben, akkor ezek szinergizálhatnak egymással, azaz egy sejtnek egy másikhoz való affinitása nagyobb, mint az egyes molekulák affinitásainak összege. Ennek megfelelően, a jelen találmány fontos tárgya az ismertetett CD2-kötő polipeptidek multimer formáinak előállítása és használata.

Számos módszer ismert a szakterületen fehérje monomerek multimer formáinak kialakítására. Ilyen módszer például keresztkötő ágensek (például glutáraldehid) alkalmazása [Reichlin: Methods in Enzymology 70, 159-65 (1980)]. Ha egy polipeptiden vagy polipeptideken tiolcsoportok találhatók, akkor ezek a csoportok oxidálhatók intermolekuláris diszulfid hidak kialakítására, aminek eredménye a polipeptid vagy polipeptidek multimer formája. Tiolcsoportok vagy tiol-reaktív csoportok vihetők be a polipeptidekbe, iminotiolán vagy heterobifunkcionális keresztkötők, mint például N-szukcinimidil-3-(2-piridiltio)-propionát (SPDP) alkalmazásával, amely egy amin-reaktív csoportot és egy tiolreaktív csoportot tartalmaz. A fehérjék kapcsolását azután diszulfidhidakon keresztül érhetjük el, amelyek vagy közvetlenül vagy homobifunkcionális keresztkötő ágenseken keresztül jönnek létre [Srinivasachar és mtsai.: Biochemistry 28, 2501-09 (1989); Ramakrishnan és mtsai.: Cancer Research 44, 201-08 (1984); Lambert és mtsai.: Journal of Biological Chemistry 260, 12035-41 (1985)]. A molekulák közötti diszulfidhidak képződésének hatékonyságát természetesen korlátozza a polipeptiden hozzáférhető tiolcsoportok száma (természetesen előforduló, vagy a fentiek szerint derivatizálással bevitt), valamint az, hogy az ilyen diszulfid kötés képződése kedvezőtlenül befolyásolja a keletkező multimer forma affinitását.

Ha a polipeptidek vagy fehérjék szénhidrát csoportokat tartalmaznak, mint például a glikoproteinekben, akkor az ilyen csoportok cukor egységeit lehet felhasználni az egyik molekulát a másikhoz kötő reakcióban [Liao és mtsai.: Journal of Biological Chemistry 248, 8247-53 (1973); Moroney és mtsai.: Biochemistry 26, 8390-98 (1987)].

A jelen találmány szerinti CD2-kötő polipeptidek egyéb multimer formáit úgy állíthatjuk elő, hogy egy foszfatidilinozitol („Pl”) kapcsoló szekvenciát kapcsolunk, mint például amilyet a PCT/US90/01859 PCT találmányi bejelentésben írnak le, vagy C4 kötő fehérje szekvenciákat, amilyet például a PCT/US91/OO567 számú PCT találmányi bejelentésben írnak le. A hidrofób Pl horgony használható micellák képzésére, amelyek számos különböző aktív CD2-kötő domént vagy a PI-kötött LFA-3 multimer formáit mutatják be, amelyekben a különböző monomerek az egyes monomerek PI-kötő szekvenciái közötti hidrofób kölcsönhatások révén kapcsolódnak egymáshoz (a hozzáadott lipidek vagy membrán távollétében). Ez utóbbi esetben a multimer PI-kapcsolt LFA-3 molekulák általában oktamerek; jóllehet más polimer formákat is megfigyeltek (azaz például 6-12 asszociálódott monomert). Egy másik módszer szerint, ha egy, a Pl kapcsoló szekvenciát kódoló DNS szegmentet egy olyan DNS inszert után kapcsolunk, amely a találmány szerinti polipeptidet kódolja, majd ezzel a konstrukcióval megfelelő emlős

HU 211 476 A9 gazdasejteket transzfektálunk, olyan sejtek tenyészetét kapjuk, amelyek a felszínükön a CD2-kötő polipeptid számos példányát mutatják be (Pl horgonnyal hozzákapcsolva).

Egy másik módszer szerint a jelen találmány szerinti polipeptidek és fúziós fehérjék monomerjeiből több példány kapcsolható egy másik molekulához vagy szubsztráthoz vagy részecskéhez. Csakúgy, mint az LF08-nak az Affigel-10 gyöngyökhöz való kötődése (lásd az alábbiakban), a több CD2-kötő domént tartalmazó molekulák, vegyületek vagy részecskék készítése is a jelen találmány oltalmi körébe tartozik.

Emellett a találmány tárgyát képezik az LFA-3-Ig fúziós fehérjék is. Ezeket a multimereket az lg molekulákból azoknak az Fc régióknak, vagy részeiknek felhasználásával készíthetjük, amelyek általában multivalensek, mint például az IgM pentamerek és az IgA dimerek. Az persze nyilvánvaló, hogy egy J lánc polipeptidre lehet szükség az IgM pentamerek és IgA dimerek előállítására és stabilizálására. Egy másik módszer szerint az LFA-3-Ig fúziós fehérjék multimerjei úgy állíthatók elő, hogy olyan fehérjét használunk, amelynek affinitása van az lg molekulák Fc régiójához, mint például a Protein A. Például számos különböző LFA-3-Ig fúziós fehérjét, úgymint az LFA3TIP-t kapcsolhatjuk a Protein A-agaróz gyöngyökhöz, így olyan agaróz gyöngyök készíthetők, amelyeknek a felszínét a hozzákapcsolt LFA-3-Ig fúziós fehérjék többfunkciós CD2-kötő doménjei borítják.

A találmány tárgyát képezik továbbá azok a multimer fehérjék, amelyek képesek a CD2-höz kötődni, azzal jellemezve, hogy az alábbi komponenseket tartalmazzák (a) két vagy több, az alábbiakban ismertetett CD2-kötő polipeptidet, (b) két vagy több, az alábbiakban ismertetett CD2-kötő fúziós fehérjét, vagy (c) egy vagy több CD2-kötő polipeptidet és egy vagy több CD2-kötő fúziós fehérjét.

A jelen találmány szerinti polipeptideket emellett arra is használhatjuk, hogy kis molekulasúlyú (azaz a monomer molekulasúlya általában 1000 daltonnál kevesebb) nem-peptid vagy csak részleges peptid-tulajdonságokkal rendelkező CD2-kötő molekulákat tervezzünk, amelyek jól használhatók a CD2/LFA-3 komplexen keresztül megvalósuló sejt-sejt tapadás meggátlásában. Az alábbiakban ismertetett polipeptidek alapján olyan kis molekulák tervezhetők, amelyeknek megvan az a képességük, hogy kötik a CD2-t és tartalmazhatnak aminosavtól eltérő egységeket, és teljesen szintetikus módszerekkel állíthatók elő. Ezeknek a kis molekuláknak mint terápiás vagy gyógyászati ágenseknek az alkalmazása szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.

A jelen találmány tárgya továbbá a CD2-kötő polipeptidek és fúziós fehérjék alkalmazása olyan ellenanyagok előállítására, amelyke felismerik az LFA-3 CD-2 kötő doménjét. A jelen találmány syerinti polipeptidek és fúziós fehérjék alkalmazásával mind a monoklonális mind a poliklonális ellenanyagokból előállítható olyan, amely nagyon specifikus az LFA-3 CD-2kötő doménjére.

Egy bizonyos antigén elleni monoklonális ellenanyagok és poliklonális antiszérum előállítási módszerei jól ismertek a szakirodalomban. A MAb-k előállításához egy örökéletű sejtvonalat (általában egy mielóma sejtvonalat) fuzionálattunk egy adott antigénnel (ebben az esetben az LFA-3 CD2-kötő doménjével) immunizált emlősből (például nyúlból) származó limfocitákkal (általában szplenocitákkal). Az ilyen fúziókkal általában hibridómák állíthatók elő, azaz a hidbrid sejtek örökéletű kiónjai, amelyek olyan ellenanyag molekulákat termelnek, amelyek az immunizáló antigén egyetlen epitopjára specifikus ellenanyag molekulákat termelnek [Kohler és mtsai.: Natúré 256, 495-97 (1975)]. A hatékony immunizáláshoz szükség lehet arra, hogy a CD2-kötő domént tartalmazó polipeptidet polimerizáljuk vagy derivatizáljuk és egy adjuvánssal keveijük össze.

Arra is szükség lehet, hogy a fúziókból származó számos potenciális hibridóma kiónt átvizsgáljuk, ahhoz hogy azonosítani tudjuk azokat a kiónokat, amelyek az LFA-3 CD2-kötő doménje elleni ellenanyagokat termelnek. Az ilyen vizsgálat például magában foglalja a hidridóma tenyészetek felülúszóinak átvizsgálását abból a szempontból, hogy képesek-e gátolni a CD2-t expresszáló sejteknek az LFA-3-at expresszáló sejtekhez való kötődését. Azok a vizsgálatok, amelyeket arra használtunk, hogy átvizsgáljuk a hibridómákat az LFA-3 MAb termelés szempontjából, használhatók primer szűrővizsgálatként azoknál a hibridómáknál, amelyek az LFA-3 CD2-kötő doménjére specifikus MAb-okat termelik [Sanchez-Madrid és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 7489-93(1982)].

A jelen találmány szerinti CD2-kötő polipeptideket és az LFA-3 gén deléciós mutáns formáit kódoló DNS, mint amelyet az alábbiakban ismertetünk, használható plusz/mínusz próbaként is más, az LFA-3 CD2-kötő doménjét kódoló DNS szekvenciák kimutatására és izolálására.

Az LFA-3 fehérje deléciós mutáns formái, amelyekből hiányzik az érett LFA-3-nak legalább a +52től a +60-as aminosavig terjedő része; vagy legalább a +41-tői a +50-es aminosavig terjedő része, vagy legalább a +31-tői a +40-es aminosavig tetjedő része; (előnyösen mindhárom régió hiányzik), használható azon ellenanyagok poliklonális antiszérumainak a tisztítására, amelyek felismerik az LFA-3-nak azokat az epitopjait, amelyek eltérnek az LFA-3 CD2-doménjében levő epitopoktól. Az ilyen mutánsokat választhatjuk például az alábbi csoportból: M57, M55, M56, PIM3 és M100, valamint ezek kombinációi. Például egy poliklonális anti-LFA-3 antiszérumot előinkubálhatunk az LFA-3 fehérjének egy mutáns formájával, amelyet az M57 vagy Ml00 deléciós mutánsokat tartalmazó mutáns LFA-3 gén kódol (1. és 6. ábra). A poliklonális ellenanyagok felismerik és kötődnek a mutáns LFA-3 fehérjén levő LFA-3 epitopokhoz. Mivel azonban a CD2-kötő dómén nincs jelen, a poliklonális antiszérumban az ez ellen az epitop elleni ellenanyagok nem fognak kötődni. A keletkező komplexek

II

HU 211 476 A9 kicsapása azt eredményezi, hogy az antiszérumban feldúsulnak azok az ellenanyagok, amelyek a CD2-kötő dómén epitopra specifikusak.

A jelen találmány szerinti CD2-kötő dómén polipeptideket és fúziós fehérjéket szokványos módszerekkel gyógyászati készítményként formulázhatjuk, így gyógyászatilag elfogadható készítményeket és kombinációkat kapunk. Az ilyen készítmények előnyösen legalább egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmaznak [Remington’s Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)]. A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények általában az aktív polipeptid mellett tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadható puffért, előnyösen foszfáttal puffereit sóoldatot egy gyógyászatilag elfogadható, az izotóniás nyomást biztosító vegyülettel, azaz például nátrium-kloriddal, mannittal vagy szorbittal együtt. A jelen találmány szerinti gyógyászatilag elfogadható készítményeket és eljárásokat a jelen találmány szerinti polipeptid gyógyászatilag hatékony mennyisége jellemzi.

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények és kombinációk, amelyek LFA-3-Ig fúziós fehérjéket tartalmaznak, használhatók például a T-limfociták aktiválásának gátlására vagy a perifériális vér limfocitái szaporodásának gátlására (lásd az alábbiakban).

A továbbiakban a „kombináció” szakkifejezés egy olyan egyszeri dózisformát jelent, amely legalább egy, a jelen találmány szerinti polipeptidet tartalmaz, valamint legalább egy másik gyógyászatilag aktív adalékanyagot, valamint egy többszörös dózisformát, amelyben a polipeptidet és a másik aktív adalékanyagot külön-külön, de egyidőben adjuk be, vagy egy olyan többszörös dózisformát, amelyben a két komponenst egymástól elkülönítve és egymás után adjuk be. Egy másik módszer szerint a jelen találmány szerinti polipeptidek és a többi aktív adalékanyag lehet egyetlen konjugált molekula formájában. A két komponens konjugációját a szakterületen jártas szakember számára jól ismert standard keresztkötési technikákkal végezhetjük el. Egyetlen molekula is felveheti egy rekombináns fúziós fehérje formáját.

A jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket és kombinációkat egy betegnek beadhatjuk bármely gyógyászatilag elfogadható dózisformában, beleértve, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, azokat, amelyeket intravénásán, bolus vagy folyamatos infúzió formájában, illetve intramuszkulárisan, szubkután, intrakután, intra-artikulárisan, orálisan vagy parenterálisan lehet beadni.

A szakterületen jártas szakember számára a gyógyászatilag hatékony dózis meghatározási módszerei jól ismertek. A dózis és a dózis-sebesség számos faktortól függ, mint például a specifikus összetételtől, a kezelés céljától, azaz például attól, hogy terápiáról vagy megelőzésről van szó, az adagolás módjától és a kezelőorvos megítélésétől.

A jelen találmány tárgya továbbá a CD2-kötő polipeptidek és fúziós fehérjék, vagy az ezeket tartalmazó készítmények alkalmazása bioanalitikai célokra, a CD2 fehérje koncentrációjának meghatározására, vagy a

CD2-t expresszáló sejtek kimutatására biológiai mintákban. Ezeket a polipeptideket és készítményeket hasonlóképpen lehet használni, mint a szokványos vizsgálatokban alkalmazott reagenseket. Emellett a találmány szerinti polipeptideket diagnosztikai kitekben használhatjuk, amelyeket arra terveznek, hogy kimutassák a CD2 vagy a CD2-t expresszáló sejtek jelenlétét és megmérjék azt.

Ahhoz, hogy ez a találmány jobban érthető legyen, az alábbi példákat adjuk meg. Ezek a példák csak szemléltető célúak, és semmiképp sem tekinthetők a jelen találmány oltalmi köre korlátozásának.

1. példa

Deléciós mutánsok készítése az LFA-3 génekben

Ahhoz, hogy az LFA-3 fehérje CD2-kötő doménjét feltérképezzük, az LFA-3 génből egy sorozat deléciós mutánst készítünk, tervezett módon, hely specifikus mutagenezissel, oligonukleotid heteroduplex módszer alkalmazásával. A transzmembránt kódoló cDNS-t izolálták és szekvenálták [Wallner és mtsai.: 4 956 281 számú amerikai egyesült államokbeli találmányi bejelentés), majd a transzmembrán LFA-3-at kódoló cDNS-t hordozó bakteriofágot az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland) helyeztük letétbe, 75 107 letéti számon. Egy plazmidot, jele pHT16-6, amely a transzmembrán LFA-3-at kódoló cDNS-t tartalmazza a Biogen, Inc.-tői kaptuk (Cambridge, Massachusetts), és az összes deléciós mutáns készítésénél ezt használtuk. A pHT16-6 plazmid készítését a WO 88/09 820 számú PCT találmányi publikációban ismertetik, amelyre a továbbiakban referenciaként hivatkozunk. A pHT16-6 plazmid egy olyan cDNS inszertet tartalmaz, amely LFA-3-at kódol, valamint tartalmaz egyetlen EcoRI hasítási helyet az LFA-3-at kódoló szekvencia 5' végéhez közel, valamint egyetlen BamHI hasítási helyet az LFA3 cDNS 5' végének közelében, egyetlen HindlII hasítási helyet az LFA-3 cDNS 3' végének közelében, két NotI hasítási helyet egymástól 1112 bázispár távolságban, amelyek közreveszik az LFA-3 cDNS-t, és egyetlen Seal hasítási helyet. A pHT16-6 cDNS inszertje, amely a transzmembrán LFA-3 teljes kódoló régióját tartalmazza, az 1. ábrán látható.

Ebben az eljárásban tizenhét LFA-3 kódoló szekvenciát választottunk ki a delécióhoz, mindegyik 30 bázispár méretű. Minden egyes javasolt delécióban egy 30 bázis méretű antiszensz oligonukleotidot szintetizálunk, amely tartalmazza a javasolt deléció előtti (5') komplementer 15 bázispárt és a javasolt deléció utáni (3') komplementer 15 bázispárt. Egy bizonyos szintetikus oligonukleotidnak az LFA-3 DNS egyik szálához való hibridizációja egy olyan heteroduplexet eredményez, amelyből egy 30 bp méretű specifikus szekvencia kihurkolódik. Ezzel a mutagenezis eljárással a heteroduplex replikációs termékei deléciós mutánsokat tartalmaznak, amelyekből a heteroduplex képződés következtében kihurkolódott a 30 bázispár méretű régió.

Az 1. ábrán bemutatott tizenhét deléciós mutáns készítésénél használt szintetikus oligonukleotidokat az alábbi táblázatban mutatjuk be:

HU 211 476 A9

Szekvencia	Az LFA-3 nukleotidokkal komplementer	Kivágott szegment
13. számú szekvencia	109-123+154-168	M53
14. számú szekvencia	139-153+184-198	M54
15. számú szekvencia	169-183+214-228	M55
16. számú szekvencia	199-213+244-258	M56
17. számú szekvencia	229-243+274-288	M57
18. számú szekvencia	259-273+304-318	M58
19. számú szekvencia	289-303+334-348	M59
20. számú szekvencia	319-333+364-378	M60
21. számú szekvencia	349-363+394-408	M61
22. számú szekvencia	379-393+424-438	M62
23. számú szekvencia	409-423+454—468	M63
24. számú szekvencia	439-453+484-498	M64
25. számú szekvencia	469-483+514-528	M65
26. számú szekvencia	499-513+544-558	M66
27. számú szekvencia	529-543+574-588	M90
28. számú szekvencia	559-573+604-618	M91
29. számú szekvencia	589-603+634-648	M92

Minden egyes heteroduplex esetében egy pHT16-6 mintát (100 pg) emésztünk Hindin enzimmel (210 egység, New England Biolabs), majd vagy EcoRI enzimmel (300 egység, New England Biolabs), vagy BamHI enzimmel (300 egység, New England Biolabs). Egy másik pHT16-6 mintát (100 gg) linearizálunk Seal enzimes emésztéssel (300 egység, New England Biolabs). Az emésztési termékeket 1 tömeg/térf%-os agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá TAE pufferben (40 mmol/1 TRIS-acetát, 1 mmol/1 EDTA pH = 8,0), majd minden egyes emésztésnél a kívánt fragmenst elektroelúcióval kinyerjük a gélből [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)]. Az Seal emésztés esetében a linearizált pHT16-6 plazmidot elektroelúcióval nyerjük ki a gélből; a pHT16-6 plazmid HindUI/EcoRl vagy HindΙΠ/BamHI emésztéseinél az egyes esetekben a keletkező két restrikciós fragmens közül a nagyobbat elektroelúcióval kinyerjük.

A Seal restrikciós enzimmel linearizált pHT16-6 DNS-ből 100 ng-ot keverünk össze 100 ng izolált HindlII/EcoRI vagy HindlII/BamHI restrikciós fragmenssel és 8 pikomóllal a tizenhét, korábban ATP-vel foszforilezett [Sambrook és mtsai.; Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)] antiszensz oligonukleotid közül eggyel. Amint az az 1. ábrán látható, mivel az EcoRI hasítási hely az M56 régióban található, a HindlII/EcoRI nagy restrikciós fragmens nem használható deléciók készítésére az M53, M54, M55 és M56 régiókban. Ezért a HindlII/BamHI nagy restrikciós fragmenst használjuk ebben az eljárásban ezen négy deléció készítésére.

Ahhoz, hogy heteroduplexek keletkezzenek, egy szintetikus oligonukleotidot, az Scal-gyel linearizált pHT16-6-ot és a pHT16-6 HindlII/EcoRI vagy HindlII/BamHI emésztésének nagy fragmensét keverjük össze 100 mmol/1 NaCl, 80 mmol/1 MgCl₂, 6,5 mmol/1 TRIS-HC1 pH = 7,6 összetételű oldatban, majd denaturálás céljából 3 percig forraljuk. A denaturált DNS-t 1 óra hosszat hagyjuk egymáshoz illeszkedni 37 ’C-on, majd 4 °C-on 1 óra hosszat, és végül 0 °C-on 10 percig.

Az egymáshoz való illesztés után a heteroduplexben levő lyukakat feltöltjük, majd a fragmenseket egyetlen reakcióelegyben összeligáljuk, az illeszkedett DNS-hez az alábbi komponenseket adva, hogy a jelzett végkoncentrációkat kapjuk: ATP (20 mmol/1); dATP, dTTP, dGTP, dCTP (mindegyik 10 mmol/1); Klenow (a DNS polimeráz I nagy fragmense, 2,5 egység, New England Biolabs); T4 DNS ligáz (200 egység, New England Biolabs). Az elegyeket azután éjszakán át 15 ’C-on inkubáljuk.

Az inkubálás után az egyes feltöltési/ligálási elegyek felét használjuk 100 μΐ Escherichia coli JA221 transzformálására [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)]. A transzformált sejteket 50 pg/ml ampicillinnel kiegészített LB lemezeken szelektáljuk [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA(1989)].

A transzformánsok telepeit átvizsgáljuk, hogy vane bennük egy bizonyos deléció. Ehhez telephibridizációt végzünk a heteroduplexben a deléció készítésére használt oligonukleotiddal mint próbával.

Próbaként való alkalmazáshoz az egyes oligonukleotidokból 80 pmol-t jelzünk ³²P-ATP-vel, standard eljárásokat alkalmazva. A jelzett oligonukleotidokat 2 mol/1 ammónium-acetáttal csapjuk ki [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)]. A jelzett próbát hozzáadjuk a hibridizációs pufferhez, annyit, hogy végső aktivitása körülbelül 5xlO⁵ cpm/ml legyen a hibridizációs elegyben. Ahibridizációkat nitrocellulóz szűrőlapokon végezzük, 60 ’C-on, körülbelül 8 óra hosszat. Miután a szűrőlapokat 0,5XSSC-ben mostuk 60 ’C-on, autoradiográfiát végzünk, és a pozitív telepeket megjelöljük [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)]. A kívánt deléciós mutációk keletkezését a plazmid DNS szekvencia elemzésével igazoljuk [Maxam és Gilbert: Methods in Enzymology 65, 499-560 (1980) (Grossman és Moldave, szerk.)], azokban a telepekben, amelyek pozitívnak bizonyultak a hibridizációs vizsgálatokban.

Ezekkel az eljárásokkal plazmidokat állítunk elő, ezek mindegyike az előzőkben listázott és az 1. ábrán bemutatott 30 bp méretű deléciók egyikét tartalmazza. Az LFA-3 kódoló szekvenciában az M57 deléciót tartalmazó plazmid jele pLFA3MS7-4A.

HU 211 476 A9

2. példa

Rekomibnáns expressziós plazmidok készítése

Az 1. példa szerint előállított plazmidokat, amelyekből hiányoznak az LFA-3-ból sikeresen kivágott 30 bp méretű szegmensek, használjuk expressziós vektorok készítésére. Az M54, M55, M56, M57, M58, M63 és M65 deletált szegmenteket tartalmazó plazmidokból 100 μg alikvot részeket emésztünk NotI restrikciós enzimmel (100 egység, New England Nuclear, Beverly, Massachusetts). Az M57, M63 és M65 esetében az 5' túlnyúló végeket feltöltjük, standard Klenow (New England Nuclear) reakcióelegyet használva [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2. Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)], hogy tompavégű restrikciós fragmenseket kapjunk. A fragmenseket 0,7%-os TAE agaróz gélekből tisztítjuk elektroelúcióval.

A gélből tisztított, tompavégű NotI fragmenseket azután egyenként klónozzuk a pBG368PY eukarióta expressziós vektor Smal hasítási helyére [Dailey és mtsai.: J. Virol. 54. 739-49 (1985)], T4 ligázt használva 15 °C-on éjszakán át. Az M54, M55, M56 és M58 NotI fragmenseit gélből tisztítjuk az előzőkben leírt módon, majd ligáljuk a Notl-gyel emésztett PMDR902 expressziós vektorba. A kapott ligáló elegyeket használjuk Escherichia coli JA221 transzformálására, majd a transzformánsok pozitív telepeit, amelyek a kívánt inszerteket tartalmazó rekombináns plazmidokat tartalmazzák, telephibridizálással azonosítjuk, az előzőkben leírt módon. A vektorban levő M57, M63 és M65 inszertek orientációját EcoRI emésztéssel ellenőrizzük, azaz a helyes orientációjú fragmensek esetében 6600, 4000 és 200 bázispár méretű fragmensek keletkeznek, amelyeket 0,7%-os agaróz gélen választunk el. Az M54, M55. M56 és M58 inszerteket tartalmazó plazmidok esetében az orientációt PvuII restrikciós enzimes elemzéssel határozzuk meg, mikoris a korrekt orientációjú inszertek esetében 6599, 1185 és 506 bázispár méretű fragmensek keletkeznek. Mindegyik fragmens szerkezetét DNS szekvenálással igazoljuk [Maxam és Gilbert, idézett mű].

Az M54, M55, M56 és M58 LFA-3 deléciós mutációkat kódoló DNS-t hordozó rekombináns expressziós plazmidokat AatlI restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd aranyhörcsög petefészek (CHO) sejtekbe elektroporáljuk [J. Barsoum: DNA Cell Bioi. 9, 293-300 (1990)]. Az M57, M63 és M65 deléciós mutációkat Nrul restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd CHO sejtekbe juttatjuk be elektroporációval, az előzőkben leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy 19 pg Nrul restrikciós enzimmel emésztett DNS-t éjszakán át -20 °C-on inkubálva etanollal kicsapunk 1 μg EcoRI restrikciós enzimmel emésztett SV2 DNS-sel (DHFR⁺) és 380 μg ultrahanggal felaprított heringsperma DNS-sel együtt. lxlO⁷ CHO sejtbe elektroporációval bejuttatjuk az együtt kicsapott DNS-t (280 Volt, BioRad Gene Pulser).

Az elektroporáció után a sejteket két, 100 mm átmérőjű lemezre visszük ki, amelyek összetétele alpha⁺MÉM, 10%-os borjúmagzat szérum (FCS), 4 mmol/1 L-glutamin, penicillin/sztreptomicin, majd 48 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. A lemezeken levő sejteket azután öt 100 mm átmérőjű sejtre osztjuk szét, amelyek összetétele alpha^- MÉM, 10% FCS, 4 mmol/1 L-glutamin, penicillin/sztreptomicin, majd öt napig 37 °C-on inkubáljuk. A sejteket azután alpha^- komplett táptalajjal tápláljuk, amelyet az M57, M63 és M65 esetében 200 nmol/1 metotrexáttal egészítettünk ki, míg az M54, M55, M56 és M58 esetében 50 nmol/1 metotrexáttal egészítettük ki. Mindegyik lemezt 90%os egybefüggésig növesztjük, majd FACS-szal (fluoreszcencia aktivált sejtszortírozó) határozzuk meg, annak meghatározására, hogy bármelyik, az LFA-3 deléciós mutánssal CHO tenyészet expresszálja-e az LFA3 mutáns formáit.

3. példa

A transzfektált sejtek FACS elemzése

A 2. példa szerint előállított transzfektált CHO sejtek, amelyeket metotrexát jelenlétében 90%-os egybefüggésig növesztettünk, kétszer mossuk HANKS BSS táptalajjal (Ca*⁴ és Mg⁺⁺ mentes, pH = 7,0), majd HANKS táptalajjal eltávolítjuk (Ca*⁴ és Mg⁺⁺ mentes, 5 mmol/1 EDTA, pH = 7,0). Körülbelül 2xl0⁵ sejtet szuszpendálunk 100 μΐ hideg (0 °C) mosópufferben [PBS, 0,1% NaN₃, 0,5% szarvasmarha szérumalbumin (BSA), pH = 7,2], majd egy primer ellenanyagot adunk hozzá. A primer ellenanyag vagy TS2/9 anti-LFA3 MAb aszcitesz folyadék [Sanchez-Madrid és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 7489-93 (1982)], amelyet a Dana Farber Cancer Inst.,-tól (Boston, Massachusetts) lehet beszerezni, vagy 7A6 anti-LFA-3 MAb (beszerezhető a Biogen Inc.-tői, Cambridge, MA; 1,6 pg/ml), vagy 202 anti-LFA-3 poliklonális nyúl antiszérum (beszerezhető a Biogen Inc.-tői). Az összes primer ellenanyagról ismert, hogy blokkolja a CD2 LFA3-hoz való tapadását. A használt primer ellenanyag mennyisége általában 1 és 2 μΐ. A sejteket 0 “C-on inkubáljuk 45 percig, majd kétszer mossuk mosópufferrel.

Ezután fluoreszceinnel jelzett szekunder ellenanyagot adunk hozzá, majd az elegyet 30 percig inkubáljuk 0 °C-on. A monoklonális ellenanyagokkal való elemzéshez a szekunder ellenanyag fluoreszceinnel konjugált (DTAF)-konjugált affinitás-tisztított kecske antiegér F(ab)₂ IgG (H+L) (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, CA); a 202 poliklonális nyúl antiszérumhoz a szekunder ellenanyag fluoreszcein izotiocianát (FITC) kecske anti-nyúl IgG (H+L) (Fisher Biotech, Pittsburgh, Pennsylvania).

A szekunder ellenanyaggal való inkubálás után a sejteket felülrétegezzük 300 μΐ FCS-sel, kétszer mossuk mosópufferrel, újra szuszpendáljuk 300 μΐ lxPBSsel, majd Falcon 2052 csövekbe visszük át, hogy sejtszortírozóval leolvashatók legyenek.

A 2. ábrán látható, hogy a FACS elemzések jelzik, hogy az M57 (2A. és 2B. ábrák), M65 (2C. és 2D. ábrák), M63 (2E. és 2F. ábrák), M54 (2G. és 2H. ábrák), M55 (21. és 2J. ábrák), M56 (2K. és 2L. ábrák), valamint M58 (2M. és 2N. ábrák) deléciós mutációkat tartalmazó expressziós vektorokkal transzfektált sejtek

HU 211 476 A9 egy olyan sejtfelszíni fehérjét expresszálnak, amelyet a 202 antiALFA-3 poliklonális antiszérum felismer (2A., 2C., 2E., 2G., 21., 2K., 2M.) felismer. Azonban a TS2/9 és 7A6 anti-LFA-3 MAb-ok csak azokhoz a transzfektánsokhoz kötődnek, amelyek az M65 és M63 deléciós mutánsokat tartalmazzák, és nem kötődnek azokhoz a transzfektánsokhoz, amelyekből hiányzik az M57, M54, M55, M56 vagy M58 régió (lásd a 2B., 2H., 2J., 2L., 2N. ábrák összehasonlítása a 2D.-vel és 2F.-fel). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az M54, M55, M56, M57 és M58 szegmensek, amelyeket kivágtunk az LFA-3 M54, M55, M56, M57 és M58 deléciós mutánsokból (lásd 1. ábra), fontosak voltak az LFA-3 molekula CD2 felismerése szempontjából.

4. példa

Jurkat sejtkötődési vizsgálat

Az M57 deléciós mutánssal transzfektált CHO sejteket („M57/CHO” sejtek), a p24 plazmiddal transzfektált CHO sejteket [Wallner és mtsai.: WO 90/02 181 számú PCT szabadalom), amelyek ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3-at expresszálnak („P24/CHO” sejtek, pozitív kontroll), valamint normál CHO sejteket (negatív kontroll) vizsgálunk meg abból a szempontból, hogy képesek-e CD2-t expresszáló Jurkat sejtekhez kötődni.

Az M57/CHO sejteket, a P24/CHO sejteket és a CHO sejteket (1 xlO⁵) hatlyukú lemez (Corning) különböző lyukaihoz adjuk hozzá, majd kétszer mossuk RPMI komplett táptalajjal. A Jurkat sejteket (CD2⁺), amelyeket Dr. Timothy Springer-től kaptunk (Dana Farber Cancer Inst., Boston, Massachusetts), háromszor mossuk RPMI, 10% FCS, 4 mmol/1 L-glutamin összetételű oldattal, majd 5xl0⁶ sejtet adunk az egyes lyukakhoz, majd 4 óra hosszat 0 ’C-on inkubáljuk. A sejteket azután óvatosan háromszor mossuk RPMIvel, majd mikroszkóp alatt 40X és 100X nagyítással vizsgáljuk a sejt-sejt kötődést.

A 3. ábrán látható, hogy míg a pozitív kontroll sejtek, amelyek ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3-at expresszálnak, megkötik a CD2-t expresszáló Jurkat sejteket (3C. ábra), az M57/CHO sejtek nem képesek megkötni a Jurkat sejteket (3B. ábra), csakúgy, mint a nem transzfektált (LFA-3^-) CHO sejtek (3A. ábra).

5. ábra

Az M57/CHO sejtekből származó mRNS Northern biot elemzése

Az M57/CHO sejtek mRNS-ét Northern blot-tal elemezzük, ami egy további megerősítése annak, hogy a monoklonális ellenanyagoknak, azaz a TS2/9 és 7A6 monoklonális ellenanyagoknak az M57/CHO sejtekhez való kötődésre való képtelensége inkább az LFA-3 felszíni mutáns következménye, amelyből hiányzik az M57 CD2-kötő régió, és nem az, hogy a mutáns LFA-3 gén nem expresszálódik hatékonyan.

100 mm átmérőjű lemezen levő körülbelül lxlO⁷M57/CHO sejtből az RNS-t az alábbiak szerint izoláljuk: a növesztő táptalajt eltávolítjuk, majd 2 ml extrakciós puffért (50 mmol/1 TRIS-HC1, pH = 7,5, 1% SDS, 5 mmol/1 EDTA, a 100 pg/ml proteináz K-t közvetlenül felhasználás előtt adjuk hozzá) adunk hozzá. A lemezeket 20 percig 37 ’C-on inkubáljuk enyhe rázatás közben. Viszkózus sejtlizátum keletkezik, ezt egy 50 ml-es tesztcsőben gyűjtjük össze. Azonos térfogatú fenol-kloroform-éter (50:50:1) elegyet adunk hozzá, majd a keveréket röviden összekeveijük. A keveréket egy Polutron mixerrel (Kinematica, Svájc) homogenizáljuk 15 másodpercig, a legnagyobb sebességi fokozattal, azzal a céllal, hogy összetörjük a DNS-t. A keveréket egy 15 ml-es Corex csőbe tesszük, majd 10 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 10 percig 4 ’C-on.

Centrifugálás után a vizes fázist összegyűjtjük, NaCl-t adunk hozzá 0,25 mol/1 koncentrációban, majd 1 térfogat izopropanolt adunk hozzá. Ezt a keveréket 10 percre szárazjégre tesszük, majd felolvasztjuk és 15 percig 10 000/perc fordulatszámk.al centrifugáljuk 4 ’C-on.

Az üledéket 2,9 ml desztillált vízben szuszpendáljuk, majd vortexeljük. 0,9 ml 12 mol/1 koncentrációjú LiCl-t adunk hozzá (2,8 mol/1 végkoncentráció eléréséig), majd hagyjuk hogy a szuszpenzió legalább négy óra hosszat álljon 4 ’C-on. Az 5S RNS és a DNS oldatban marad, a többi RNS frakció kicsapódik. Ezt az oldatot centrifugáljuk legalább 15 percig 10 000/perc fordulatszámmal 4 ’C-on.

Az üledéket 360 μΐ desztillált vízben szuszpendáljuk, majd egy Eppendorf csőbe tesszük át. 40 μΐ 3 mol/1 nátrium-acetátot (pH = 5,2) és 1 ml etanolt adunk hozzá, majd az elegyet 5 percig 70 ’C-on tartjuk, 15 percig -20 ’C-ra tesszük, centrifugáljuk, etanollal öblítjük, majd 400 μΐ 0,3 mol/1 koncentrációjú nátriumacetátban szuszpendáljuk. 1 ml etanolt adunk hozzá, majd a kicsapást megismételjük. A centrifugálás után kinyert RNS-t 100 μΐ desztillált vízben szuszpendáljuk.

Az RNS-ből 10 pg-ot elektroforézisnek vetünk alá 1%-os agaróz-formaldehid gélen, majd egy GeneScreen nitrocellulóz membránra visszük át (New England Nuclear) és egy ³²P-vel jelzett próbával hibridizáljuk. Kontrollként az M16.3/CHO sejtvonalból (amely rekombináns, oldódó LFA-3-at expresszál, beszerezhető a Biogen, Inc.,-tői, Cambridge, Massachusetts) extrahált RNS-t elemzünk ugyanazzal a Northern blottal. A Northern biot elemzés (4. ábra) azt mutatja, hogy az M57 RNS hatékonyan szintetizálódik az M57/CHO sejtekben.

6. példa

Az LFA-3 deléciós mutáns immunprecipitációja

Ahhoz, hogy igazoljuk a specifikus ellenanyag-kötő domének elvesztését az M57/CHO sejtek felszínén expresszált mutáns LFA-3-ban, M57/CHO transzfektánsokat, nem transzfektált CHO sejteket és P24/CHO transzfektánsokat (amelyek ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3-at expresszálnak) jelzünk ^,25I-vel a felszínükön, majd mind a három primer ellenanyag készítményt (azaz a 202 poliklonális antiszérumot, a TS2/9 és 7A6 MAbot) használjuk az LFA-3 immunprecipitálására, a sejtfelszíni membrán detergenssel való elroncsolása után.

Az M57/CHO sejtekből, a normál CHO sejtekből

HU 211 476 A9 és a P24/CHO sejtekből körülbelül 10⁷-et szuszpendálunk PBS*-ben (azaz Ca*⁴ és Mg⁺⁺ nélküli PBS), amelyet 5 mmol/1 EDTA-val egészítettünk ki, majd háromszor mossuk PBS*-ben és 0,5 ml PBS-ben mossuk. A mosott sejteket üvegcsövekbe tesszük (12x75 mm²), amelyeket előzőleg 100 μΐ CHCl₃-ban levő 50 μg l,3,4,6-tetraklór-3a,6a-difenilglikoluril oldattal borítottunk (Iodo-Gen, Pierce Bio-Research, Rockford, Illinois), majd nitrogénben szárítottunk. Közvetlenül felhasználás előtt a csöveket PBS-sel öblítjük, majd ¹²⁵I-t (1 mCi) adunk hozzá, majd a csöveket 30 percig jégen inkubáljuk, minden 10 percben megforgatva.

Inkubálás után a jódozott sejteket hozzáadjuk 10 ml alpha-MEM, 10% FCS, 4 mmol/1 L-glutamin összetételű oldathoz. A sejteket lecentrifugáljuk, kétszer mossuk 5-5 ml fenti táptalajjal, majd 1 ml PBS-ben szuszpendáljuk és újra centrifugáljuk. A mosott sejteket azután lizáljuk, 1 ml DOC pufferben (20 mmol/1 TRISHC1 pH = 7,3; 50 mmol/1 nátrium-klorid, 0,5% dezoxikolát (DOC); 0,5% NP40), amely 20 μΐ PMSF proteáz inhibitort tartalmaz (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, 17 mg/ml etanolban), majd 30 percig jégen inkubáljuk. A lizátumot azután 10 percig mikrocentrifugáljuk 4 ’C-on, majd a ^l25I-vel jelzett sejtfelszíni molekulákat tartalmazó felülúszókat eltávolítjuk.

Az előző jódozásokból származó lizátumokat előzetesen tisztítjuk, oly módon, hogy érintkezésbe hozzuk 50 μΐ protein A-Sepharose-zal és egy rázón inkubáljuk 1 óra hosszat, szobahőmérsékleten. Minden egyes mintából 100 μΐ lizátumot távolítunk el, majd 300 μΐ DOC pufferrel keverjük össze. Ezt az elegyet centrifugáljuk, és a kapott tisztított felülúszót egy új csőbe visszük át.

Primer ellenanyagot adunk mindegyik tisztított felülúszóhoz: a 202 poliklonális anti-LFA-3 antiszérumot 40 g/ml végkoncentrációban használjuk; a TS2/9, 7A6 monoklonális ellenanyagokat, valamint egy kontroll monoklonális ellenanyagot a MOPC-21-et (IgGl, nem specifikus az LFA-3-ra) 5 μ g/ml koncentrációban használjuk. 100 1 DOC-ot és 2 μΙ PMSF proteáz inhibitort adunk hozzá, majd a keverékeket rázón 2 óra hosszat inkubáljuk 25 ’C-on, vagy éj szakán át 4 ’C-on.

Inkubálás után 30 μΐ protein A-Sepharose-t (a 202 poliklonális antiszérum mintákhoz) vagy 15 μΐ antiegér IgG-agarózt (Sigma Chemical Co. ) (a MAb mintákhoz) adunk a mintákhoz, majd szobahőmérsékleten rázógépen inkubáljuk 2 óra hosszat. A keverékeket azután 2 percig centrifugáljuk és a felülúszókat óvatosan eltávolítjuk, majd elöntjük. Ezután 1 ml DOC puffért adunk hozzá, és az üledéket vortexeléssel szuszpendáljuk. A szuszpendált anyagot azután háromszor mossuk DOC pufferrel.

A minták poliakrilamid gélelektroforézissel való előkészítéséhez 30 μΐ SDS mintafelvivő puffért adunk hozzájuk, majd a mintát 15 percig 65 ’C-on tartjuk. A mintát azután 2 percig centrifugáljuk, majd a felülúszót megtartjuk az elektroforézishez. 15 μΐ felülúszót futtatunk egy 15-20%-os denaturáló gradiens poliakrilamid gélen (Daiichi system, Enprotech), majd autoradiográfiát végzünk hogy azonosítsuk a kicsapott sejtfelszíni fehérjéket.

Az 5. ábra egy SDS poliakrilamid gél autoradiogramja, amelyen ellenanyaggal kicsapott LFA-3 sejtfelszíni fehérjék láthatók M57/CHO, normál CHO és P24/CHO sejtekből. Ebből a gélből látható, hogy a TS2/9, a 7A6 és a 202 poliklonális ellenanyag kicsapja a ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3-at expresszáló CHO sejtekből származó LFA-3at (9-es, 10-es és 11-es csík). Ezzel szemben csak a 202 poliklonális antiszérum csapja ki az LFA-3 sejtfelszíni fehéijét az M57/CHO sejtekből, amelyek expresszálják az M57 deléciós mutáns LFA-3 gént (4-es csík).

7. és 8. példa

Az M57 deléciós mutánsban hiányzó 10 aminosavas régió (lásd 1. ábra) szomszédos az N-kapcsolt glikozilezési hellyel, de nem tartalmazza azt. Annak vizsgálatára, hogy az M57 deléció régiója közvetlenül részt vesz-e a CD2-kötésben, vagy közvetve elrontja a CD2 kötődését, azáltal, hogy konformációs változást okoz az LFA-3 CD2-kötó doménjében, két további kísérletet végeztünk.

Először három nagy deléciós mutánst készítünk, amelyekből mindegyikből hiányzik egy 59 aminosavból álló rész, a természetes LFA-3 molekulával összehasonlítva. A kivágott régiókat aláhúzással jelezzük a 6. ábrán, jelzésük pedig M100, M101 és M102. Ennek a kísérletnek az a célja, hogy meghatározzuk, vajon a nagy Ml01 és Ml02 deléciókban levő konformációs változások megváltoztatják-e az M57 régió felismerési régiót (lásd 1. ábra), valamint annak kimutatása, hogy a teljes CD2 kötő dómén benne van az Ml00 régióban.

Másodszor egy szintetikus oligopeptidet, jele LF08, készítettünk, amelynek aminosav szekvenciája (7. számú szekvencia): Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr [az érett LFA-3 +50 +65-ös aminosavai (lásd 1. ábra)], majd egy szilárd hordozóhoz rögzítettük és egy Jurkat sejt rozettáló vizsgálatban használtuk annak meghatározására, hogy a CD2-t expresszáló sejtek felismerik-e az LFA-3 izolált M57 régióját (lásd 1. ábra).

Nagy deléciós mutánsok készítése

A 6. ábrán a transzmembrán LFA-3 aminosav szekvenciája és nukleotid szekvenciája látható, amelyen aláhúzással jelöljük a három, M100, M101 és M102 régiót, amelyeket kivágtunk az LFA-3 cDNS-ből, így olyan géneket állítva elő, amelyek képesek a három nagy deléciós mutánst expresszálni.

Az 1. példában alkalmazott eljárást követve egy 30 bázisból álló antiszensz oligonukleotidot szintetizálunk, amely komplementer a kivágni szándékozott régiótól 5' és 3' irányban is 15-15 bázissal. A nagy deléciós mutációk készítésére használt szintetikus oligonukleotidokat az alábbiakban mutatjuk be:

Szekvencia	Az alábbi LFA-3 nukleotidokkal komplementer	Kivágott szegmens
30. számú szekv.	109-123+304-318	M100
31. számú szekv.	289-303+484-498	M101
32. számú szekv.	469-483-634-648	M102

HU 211 476 A9

A heteroduplexek előállítását az 1. példában leírtak alapján végezzük, azzal a különbséggel, hogy 200 ng LFA-3 cDNS-t használunk. A telephibridizálást lxlO⁶ cpm/ml ³²P-ATP-vel kinázolt oligonukleotidokkal végezzük 65 “C-on, majd 0,5xSSC-vel mossuk 60 °C-on. A pozitív telepeket EcoRI emésztéssel, valamint egy 2900 bp és egy 500 bp méretű fragmensnek 0,7%-os TAE agaróz gélen való izolálásával vizsgáljuk át.

Az expressziós vektorokat úgy készítjük, hogy az előzőek szerint előállított mutációs plazmidokból NotI enzimmel kivágjuk az LFA-3 cDNS-t. 50 pg PMDR902 eukarióta expressziós plazmidot (Biogen Inc., Cambridge, Massachusetts) 50 egység NotI restrikciós enzimmel emésztünk, majd az izolált NotI fragmenseket (0,06 pmol), amelyek az Ml00, Ml01 és Ml02 deléciós mutációkat tartalmazzák, 0,02 pmol PMDR902 DNS-sel ligáljuk, és a ligáló eleggyel Escherichia coli JA221 sejteket transzformálunk.

A pozitív telepeket telephibridizációval vizsgáljuk át. a 18-as, 19-es és 20-as oligonukleotidok próbaként való alkalmazásával, amelyeknek szekvenciája megfelel a 30. számú szekvenciának, a 31. számú szekvenciának és a 32. számú szekvenciának. Az inszertek orientációját PvuII restrikciós elemzéssel határozzuk meg, amely körülbelül 6559, 1737 és 500 bázispár méretű csíkokat eredményez 0,7%-os TAE agaróz gélen, a megfelelő orientációjú konstrukciók esetében. A kapott rekombináns expressziós plazmidokat, amelyek az M100, M101 és M102 deléciós mutációkat tartalmazzák, pPMDRM 100-4, pPMDRM 101-1 és pPMDRM 102-8 jelzéssel látjuk el. A kapott expressziós plazmidokat elektroporációval juttatjuk be CHO sejtekbe, a 2. példában leírtak alapján, azzal a különbséggel. hogy a sejteket 26 nmol/1 és 50 nmol/1 metotrexátot tartalmazó közegek között osztjuk meg.

Az M100/CHO, M101/CHO és M102/CHO transzfektánsokat Jurkat sejt kötődési vizsgálatnak vetjük alá, a 4. példában leírtak alapján. Az eredményeket a 7. ábrán mutatjuk be. Az Ml01/CHO sejtek (7C. ábra) és az M102/CHO sejtek (7D. ábra), amelyek egy olyan sejtfelszíni fehérjét expresszálnak, amely az LFA-3 érintetlen M57 CD2-kötő régiójával rendelkező sejtfelszíni fehérjével rendelkezik, a Jurkat/CHO sejtkötődési vizsgálatban összecsapódó tulajdonságokat mutatnak. A CHO kontroll sejtek (7A. ábra) és az M100/CHO sejtek (7B. ábra) nem mutatnak ilyen összecsapzódást, jelezve ezzel, hogy a CHO sejtek felszínéről hiányoznak azok a sejtfelszíni struktúrák, amelyeket a Jurkat sejtek felismernek.

Jurkat kötődés az immobilizált LF08 pepiidhez

Ionmentes vízben levő 1,4 mg szintetikus LF08 peptidet (7. számú szekvencia), vagy 2 mg/ml kontroll hepatitisz B MXC-01 peptidet (4. számú szekvencia) ΙΟΟμΙ agaróz gél gyöngyökhöz kapcsoljuk (Affi-Gel 10, BioRad, Richmond, Kalifornia), az alábbi leírás szerint: 100 μΐ Affi-Gel 10 iszapot egy kis Büchner tölcsérbe viszünk át, majd az oldószert leszívjuk. A gyöngyöket három ágytérfogatnyi hideg (4 ’C) ionmentes vízzel mossuk, majd 700 μΐ LF08 oldatba visszük át, és 4 óra hosszat 4 ’C-on inkubáljuk egy rázógépen. A felülúszóról az LF08-cal való kapcsolás előtt és után készített spektrum azt mutatja, hogy 80%os kapcsolási hatékonyságot sikerült elérni.

Kapcsolás után a nem reagált kapcsolási helyeket blokkoljuk, oly módon, hogy az LF08 vagy az MXC01 gyöngyöket etanolamin/HCl-lel (93 mmol/1, pH = 7,9) inkubáljuk 4 ’C-on, enyhe rázatás közben. A blokkolt gyöngyöket azután háromszor mossuk 0,5 mol/1 nátrium-kloriddal kiegészített PBS-sel, majd 10% FCS-sel kiegészített PBS-sel.

A Jurkat sejteket kétszer mossuk RPMI, 4 mmol/1 L-glutamin, 10% PBS összetételű oldattal, majd egyesítjük 2,5 vagy 15 μΐ LF08/Affi-Gel 10 gyöngyökkel vagy MXC-01/Affi-Gel 10 gyöngyökkel, 20 μΐ végtérfogatban. Az elegyet 30-60 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Az inkubálás után a sejteket 200 μΐ RPMI-be visszük át egy 96-lyukas laposfenekű lemezen (Corning), majd 40X vagy 100X nagyítással mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A 8A. és 8B. ábrák jellegzetes eredményeket mutatnak az LF08/Affigel gyöngyöknek a Jurkat sejtekkel való kapcsolódásáról, aminek az az eredménye, hogy a borított gyöngyök a Jurkat sejtek felszínéhez kapcsolódnak. A 8C. ábrán az MXC01 /Affigel gyöngyökkel kapott jellegzetes eredmények láthatók, amelyek azt mutatják, hogy nem képesek a Jurkat sejtek felszínéhez kötődni.

9. és 10. példa

Egy további deléciós mutánst készítettünk, amely olyan PI-kapcsolt sejtfelszíni polipeptidet eredményez a CHO sejtek felszínén, amely a természetes LFA-3 98 N-terminális aminosavát tartalmazza. A 9. ábrán a PIkapcsolt LFA-3-at kódoló cDNS-ből kivágott nukleotidokat az aláhúzott régió, a PIM3 mutatja. A PIM3 nukleotidokat az előzőkben ismertetett (1. példa) heteroduplex deléciós stratégiával vágjuk ki. Ebben az esetben egy 30 bázisból álló antiszensz oligonukleotidot (a 320.03-as oligonukleotidot) használjuk a deléciós mutagenezishez (8. számú szekvencia: TAATTGAATG CTAAGAAAGA ACTTCATGGT).

100 ng p24 plazmidot, amely a ΡΙ-hez kapcsolt LFA3-at tartalmazza, NotI enzimmel emésztünk, majd a nagy restrikciós fragmenst (amelyből hiányzik a ΡΙ-hez kapcsolt LFA-3-at kódoló szekvencia) izoláljuk. További p24 DNS-t linearizálunk Seal enzimmel. A nagy NotI restrikciós fragmenst és a Scal-gyel linearizált DNS-t denaturáljuk, összekeveijük a 320.03-as oligonukleotiddal, majd az 1. példában leírtak alapján hagyjuk újra egymáshoz illeszkedni őket. Az illeszkedés után a heteroduplexben levő lyukakat feltöltjük, majd a fragmenseket az 1. példában leírtak alapján ligáljuk.

A feltöltött, ligáit heteroduplexeket ezután Escherichia coli JA221-be transzformáljuk, és a transzformánsokat telephibridizálással vizsgáljuk át, ³²P-vel jelzett 320.03 oligonukleotidot használva (lxlO⁶ cpm/ml) 60 ’C-on az előzőkben leírt módon. A hibridizációs szűrőket 0,5XSSC-ben mossuk 65 ’C-on, majd a pozitív telepeket autoradiográfiával azonosítjuk. Minden egyes pozitív telepből plazmid DNS-t izolálunk, majd

HU 211 476 A9

NotI enzimmel emésztjük. Az egyik plazmid, a pPIM6 NotI restrikciós enzimmel való emésztésével 2648 és 640 bázispár méretű fragmenseket kapunk, ami igazolja, hogy a pPIM-6 tartalmazza a keresett PIM3 deléciót a PI-kapcsolt LFA-3-at kódoló szekvenciában.

A pPIM-6 640 bp méretű NotI fragmensét a PMDR902 expressziós vektor (Dr. M. D. Rosa ajándéka, Biogen, Inc., Cambridge, Massachusetts) NotI hasítási helyére klónozzuk, majd Escherichia coli JA221 sejtek transzformálására használjuk. A transzformánsokat telephibridizálással vizsgáljuk át, a ³²P-vel jelzett 320.3 oligonukleotidot használva próbaként. A pozitív telepekből származó plazmidokat azután izoláljuk, majd a DNS inszert orientációját restrikciós enzimes elemzéssel határozzuk meg, PvuII enzimet alkalmazva. A pPMDRM-3 rekombináns plazmid 6399, 1634 és 495 bázispár méretű Pvul! fragmenseket tartalmaz, jelezve ezzel, hogy ez a plazmid a mutált PI-kapcsolt LFA-3 gént a PMDR902 expressziós vektorban való expresszáláshoz megfelelő orientációban tartalmazza.

A P1M3 deléciós mutáns expressziója

A pPMDRM-3 plazmidot CHO DHFR“ sejtekbe juttatjuk be elektroporációval, majd 25 illetve 50 nmol/1 metotrexáttal amplifikáljuk, az előzőkben leírt módon. Az egybefüggő növekedést tartalmazó lemezekről származó sejteket FACS-szal elemezzük, TS2/9 és 7A6 MAb-okat használva, az előzőkben leírt módon. A sejtvonalban expresszált LFA-3 PIM3 deléciós mutánsa (PIM3.25.2-vel jelezzük), a CD2/LFA-3 komplex képződésben szerepet játszó epitopokat expresszál.

Annak meghatározására, hogy a TS2/9 és a 7A6 MAb-ok által felismert fehérje PI-kapcsolt-e, a PIM3.25.2 sejtek felszínén expresszált fehérjét megvizsgáljuk, hogy érzékeny-e a foszfatidilinozit-specifikus foszfolipáz C-vel (PI-PLC, beszerezhető a Biogen, Inc.-től) való kezelésre. A PIM3.25.2 sejteket 70%-os egybefüggő növekedésig szaporítjuk két 100 ram-es tenyésztő lemezen, majd 5 mmol/1 EDTA-val kiegészített PBS-sel távolítjuk el, az előzőkben leírt módon. Ezeknek a sejteknek az egyharmadát 45 percig PIPLC-vel kezeljük (1 μΐ; Biogen, Inc.) 37 ’C-on 100 μΐ alpha MEM-ben, amelyet 10% FCS-sel, 2 mmol/1 Lglutaminnal, IX penstrep mixszel és 25 nmol/1 metotrexáttal egészítettünk ki. A sejteket azután 15 másodpercig centrifugáljuk Eppendorf centrifugában, majd kétszer mossuk FACS pufferben (PBS, 0,5% BSA, 0,1% nátriumazid pH = 7,2). A mosott sejteket azután FACS pufferben szuszpendáljuk, amely FITC-vel jelzett kecske anti-egér IgG-t tartalmaz (l:50-es hígítás szérumból). A sejteket azután kétszer mossuk FACS pufferrel, 300 μΙ PBS-ben szuszpendáljuk és Falcon 2052 csövekbe visszük át FACS elemzéshez.

A 10. ábrán látható, hogy a PIM3.25.2 sejtek tisztán expresszálnak egy fehérjét a felszínükön, amelyet a TS2/9 felismer (10A. ábra, szaggatott vonal), és ez a fehérje a PI-PLC kezelés hatására fel is szabadul a sejt felszínéről (10A. ábra, pontozott vonal). Mivel a PIM3.25.2 klón sejtjeiben expresszált PIM3 fehérje a TS2/9 MAb (amely blokkolja a CD2/LFA-3 komplex képződését) által felismert LFA-3 epitopokat hordoz, ezért az a következtetésünk, hogy az érett LFA-3 89 N-terminális aminosava tartalmazza a CD2/LFA-3 komplex képződéséhez szükséges konformációs feltételeket.

Ahhoz, hogy az LFA-3 fehérje PIM3 mutánsának expresszióját fokozzuk, a PIM3.25.2 kiónt alpha* MEM-ben amplifikáljuk, amelyet 50, 100 és

200 nmol/1 metotrexátban levő 10% FCS-sel egészítünk ki. A sejteket 96-lyukas mikrotiter lemezekre szélesztjük, 20 sejt/ml koncentrációban, egybefüggő növekedésig szaporítjuk (12-17 nap), majd 100 mm-es lemezekre visszük a FACS elemzéshez (lásd a PIM3.25.2-nél), azzal az eltéréssel, hogy az LFA-3 PIM3 mutáns formáját a 7A5 MAb-bal követtük (10B. ábra, szaggatott vonal). A FACS elemzés eredményei azt mutatják, hogy az amplifikált sejtvonal, a PIM3.25.2.1OO.12, a PI-kapcsolt LFA-3 PIM3 mutáns formájából körülbelül tízszer többet expresszál. Ha a PIM3.25.2.100.12 sejteket PI-PLC-vel kezeljük, akkor az LFA-3 PIM3 mutánsoknak körülbelül 80%-a felszabadul (10B. pontozott vonal).

//. példa

A pSAB144 plazmid készítése

A pSAB 144 tartalmazza a humán IgG 1 konstans régió szekvenciáit, a C_H1 régió kivételével, valamint a csuklórégió N-terminális részének első cisztein aminosavát. A humán IgG 1 nehéz lánc konstans régiót egy részleges Sau3A humán fibroblaszt genomiális könyvtárból izoláltuk (EMBL/5X. Dr. Mark Pasek ajándéka). A könyvtár DNS-t HindlII és PvuII restrikciós enzimmel emésztjük. A körülbelül 3 kb méretű fragmenseket a pSP65 vektor fragmenséhez ligáljuk (Promega, Madison, Wisconsin), amelyet a pSP65 HindlII és HincII enzimekkel való emésztésével állítunk elő. A kapott plazmid jele pAB 1. A pAB 1 plazmidot használjuk az IgG 1 nehéz lánc konstans régiót kódoló DNS forrásaként.

Ahhoz, hogy az IgGl nehéz lánc régió egy cDNS kópiáját izoláljuk, RNS-t készítünk azokból a COS7 sejtekből, amelyeket ideiglenesen transzfektáltunk a VCAMl-IgGl plazmiddal (másik jelzése pSAB133). A VCAMl-IgGl készítését a WO 90/13 300 PCT szabadalmi bejelentésben írják le. Az RNS-t reverz transzkripcióba visszük cDNS előállítása céljából, reverz transzkriptázt és random hexamereket használva indító molekulaként. 30 perces, 42 ’C-on végzett inkubálás után a reverz transzkriptáz reakciót leállítjuk, oly módon, hogy a reakcióelegyet 5 percig 95 ’C-on tartjuk. AcDNS-t azután PCR-rel (polimeráz láncreakció) amplifikáljuk [Sambrook és mtsai.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Edn„ Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)], az alábbi, kinázozott indító molekulákat alkalmazva:

370-31:

(34. számú szekvencia):5'TCGTC GAC AAA ACT CAC ACATGCC (35. számú szekvencia): asp lys thr his thr cys amely egy Sáli hasítási helyet tartalmaz, és

HU 211 476 A9

370-32 (36. számú szekvencia):

5'GCAAATGAGT GCGGCGGCCG CCAA amely az IgGl nehéz lánc konstans régió C-terminális lizinjét kódolja, amelyet egy NotI hasítási hely követ.

A PCR-rel amplifikált cDNS-t agaróz gélelektroforézissel és üveggyöngy elúcióval tisztítjuk a pNN03 plazmidban való klónozáshoz. A pNN03 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy restrikciós enzimes emésztéssel eltávolítjuk a kereskedelmi forgalomban levő pUC8 plazmidból (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) a szintetikus polilinker szekvenciát, és a szintetikus polilinker szekvenciát az alábbi új szintetikus szekvenciával helyettesítjük (37. számú szekvencia):

GCGGCCGCGG TCCAACCACC AATCTCAAAG CTTGGTACCC GGGAATTCAG ATCTGCAGCA TGCTCGAGCT CTAGATATCG ATTCCATGGA TCCTCACATC CCAATCCGCG GCCGC.

A tisztított, PCR-rel amplifikált cDNS fragmenst pNN03-hoz Iigáljuk, amelyet EcoRV restrikciós enzimmel emésztettünk, defoszforileztünk és alacsony olvadáspontú agaróz gélen végzett elektroforézissel tisztítottunk. A ligálási reakcióelegyet használjuk Escherichia coli JA221 transzformálására, majd a kapott telepeket átvizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e egy körülbelül 700 bázispár méretű inszertet hordozó plazmidot. A helyes inszertet DNS szekvencia elemzéssel azonosítottuk, majd a plazmid a pSAB 144 jelzést kapta.

A pSAB149 plazmid készítése

A pS AB 149 plazmidot az alábbiak szerint állítjuk elő. Az LFA-3-at kódoló pHT16-6 plazmidot PCR amplifikálásnak vetjük alá a 320-04 és 320-05 oligonukleotidok alkalmazásával; a 320-04 oligonukleotid tartalmaz egy NotI hasítási helyet és az LFA-3 szignálszekvencia 1-7es aminosavainak megfelelő nukleotidokat:

38. számú szekvencia: 5' GAGGCGGCCG CC ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG

39. számú szekvencia: met val ala gly ser asp ala.

A 320-05-ös oligonukleotid megfelel az LFA-3 8692-es aminosavainak, és tartalmaz egy Sáli hasítási helyet (40. számú szekvencia): 5' AAGTCGACAT AAAGAAAGAA ClÍCAT. Az amplifikált DNS fragmenst a pNN03 vektorfragmensbe Iigáljuk, amelyet EcoRV-tel hasítottunk.

A pSABI32 készítése

A pJOD-s plazmidot [Barsoum, J.: DNA and Cell Bioi. 9, 293-300 (1990)] úgy módosítjuk, hogy egy NotI hasítási helyet illesztünk az adenovírus fő késői promotere után, oly módon, hogy a NotI fragmenseket be tudjuk illeszteni az expressziós vektorba. A pJOD-S plazmidot a plazmid DNS NotI hasításával linearizáljuk. A túlnyúló 5' végeket tompavéggé alakítjuk Mung Beán nukleáz alkalmazásával, majd a linearizált DNS fragmenst alacsony olvadáspontú agaróz gélen tisztítjuk. A DNS fragmenst T4 DNS ligázzal religáljuk. A ligáit molekulákat azután Escherichia coli JA221 törzsbe transzformáljuk. A telepeket megvizsgáljuk, hogy a bennük levő plazmidokból hiányzik-e a NotI hasítási hely. A kapott vektor jelzése pJOD-S delta NotI. A pJOD-8 delta Notl-et Sáli restrikciós enzimmel linearizáljuk, majd az 5' végeket defoszforilezzük, borjúbél alkalikus foszfatáz alkalmazásával. A linearizált DNS fragmenst alacsony olvadáspontú agaróz gélen tisztítjuk, majd foszforilezett A CE175 oligonukleotid jelenlétében Iigáljuk, amelynek szekvenciája az alábbi: (41. számú szekvencia) TCGACGCGGC CGCG. A ligáló elegyet Escherichia coli JA221 sejtekbe transzformáljuk, majd megvizsgáljuk, hogy a telepekben levő plazmid hordozza-e a NotI hasítási helyet. A kapott plazmid jele pNMDR901.

Ahhoz, hogy az SV40 promoterben - amely a DHFR cDNS transzkripcióját szabályozza - levő két SV40 fokozó ismétlődést kivágjuk, a pMDR901 és pJODdeltae-tPA [Barsoum: DNA and Cell Bioi., 9, 293-300 (1990)] plazmidokat AatlI és DralII enzimekkel hasítjuk. ApMDR901-ből származó 2578 bázispár méretű AatlI-DralII fragmenst és a pJODdeltae-tPAból származó 5424 bázispár méretű fragmenst alacsony olvadáspontú agaróz gélelektroforézissel izoláljuk, majd összeligáljuk őket. Az Escherichia coli JA221 sejtekbe való transzformálás után a kapott plazmidot, a pMDR902-t izoláljuk. A pSAB132 plazmidot azután úgy alakítjuk ki, hogy elimináljuk a pMDR EcoRI-NotI fragmensét, amely az adenovírus fő késői promoterét tartalmazza, majd a pCMV-B plazmidból (Clontech, Palo Alto, Kalifornia) származó 839 bázispár méretű EcoRI-NotI ffagmenssel helyettesítjük, amely a humán citomegalovírus közvetlen koreai promoterét és fokozó szekvenciáját tartalmazza.

A pSAB 152 készítése

A pSAB 144 plazmidot Sáli és NotI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a 693 bázispár méretű fragmenst izoláljuk. A pSAB 149 plazmidot Sáli és NotI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a 365 bázispár méretű fragmenst izoláljuk. A két fragmenst összeligálva kapjuk a pSAB 132 plazmidot, amelyet NotI restrikciós enzimmel emésztünk, és az 5' végét borjúbél alkalikus foszfatázzal defoszforilezzük. A kapott plazmid, a pSAB 152 tartalmazza az LFA-3 szignálszekvenciát kódoló LFA-3 szekvenciát, az érett LFA-3 92 N-terminális aminosavát, tíz aminosavat az IgGl csuklórégiójából és az IgGl C_h2 és C_H3 konstans doménjeit (lásd 12. ábra). A pSAB 152-vel transzformált Escherichia coli JA221 sejteket az American Type Culture Collection-nél helyezzük letétbe (Rockville, Maryland), 68 720 letéti számon.

A pNNM57-14 készítése

Amint azt az 1. példában említettük, a pLFA3M574A egy olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely egy 30 bázispár méretű, az M57 régióra (azaz a 9. számú szekvencia 244-273-as nukleotidjai) terjedő deléciót tartalmazó LFA-3-at kódol. A pLFA3M57-nek ezt a kódoló szekvenciáját PCR amplifikálásnak vetjük alá, a 320-04 oligonukleotidot (38. számú szekvencia) és a 320-05 oligonukleotidot (40. számú szekvencia) alkalmazva, azzal a céllal, hogy amplifikáljuk az LFA-3 M57 deléciós mutánsa szignálszekvenciáját és első 82

HU 211 476 A9 aminosavát kódoló DNS szekvenciát. ApCR-rel amplifikált DNS-t alacsony olvadáspontú agaróz gélelektroforézissel tisztítjuk.

A tisztított, PCR-rel amplifikált DNS-t azután a pNN03 plazmid EcoRV hasítási helyére ligáljuk. A ligáit DNS-t azután Escherichia coli JA221 sejtekbe transzformáljuk, és a kapott transzformánsokat átvizsgáljuk (NotI emésztéssel), hogy van-e bennük olyan plazmid, amely egy körülbelül 300 bázispár méretű inszertet tartalmaz. A keresett inszertet DNS szekvenciájának elemzésével azonosítjuk. A kapott plazmidot, amely a körülbelül 300 bázispár méretű inszertet tartalmazza, pNNM57-14 jelzéssel látjuk el.

Λ pNM57Ig-5 készítése

A pNNM57-14 plazmidot NotI és Sáli restrikciós enzimmel emésztjük, majd a 310 bázispár méretű fragmenst alacsony olvadáspontú agaróz gélelektroforézissel izoláljuk. Ezt a fragmenst és a pSAB144 plazmid (lásd fent) 693 bp méretű Sall-NotI fragmensét NotI restrikciós enzimmel emésztett, borjúbél alkalikus foszfatázzal kezelt pSAB132 plazmiddal (lásd fent) ligáljuk. A ligáló elegyet használjuk Escherichia coli JA221 transzformálására, majd a transzformáns telepeket hibridizálással vizsgáljuk át, egy y-³²P-ATP-vel jelzett oligonukleotidot használva erre a célra, amelynek szekvenciája a 17. számú szekvencia. A SAB132ben az inszert kívánt orientációját PvuII restrikciós enzimes emésztés után egy 6913 és egy 2029 bázispár méretű fragmens azonosításával igazoljuk. A kapott plazmid jelzése pM57Ig-5. A DNS szekvencia elemzése megerősítette, hogy a pMI57Ig egy olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely tartalmazza az LFA-3 szignálszekvenciát, az LFA-3 M57-es deléciós mutánsa első 82 aminosavát, a humán IgGl csuklórégiójának tíz aminosavát, és az IgGl C_H2 valamint C_H3 konstans doménjét.

72. példa

Az LFA3T1P előállítása tranziensen transzfektált

COS7 sejtekből

Ahhoz, hogy az LFA-3-Ig fúziós fehérjét, az LFA3TIP-et előállítsuk [amelyet LFA-(92)IgG jelzéssel is elláttak], a pSAB 152 plazmid DNS-t elektroporációval COS7 sejtekbe transzfektáljuk, az alábbiak szerint. A pSAB152 plazmid DNS-ből négy 200 μΐ-es alikvot részt etanollal kicsapunk, 350 pg ultrahanggal kezelt heringspermával együtt. A DNS-t kicsapjuk, majd 0,8 ml lxHEBS-ben (20 mmol/1 HEPES/pH = 7,05, 137 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 KC1, 0,7 mmol/1 Na₂HPO₄ 6 mmol/1 dextróz) oldjuk. 4 db egybefüggő növekedést mutató T150 lombikban levő COS7 sejteket (8xlO⁷ sejt) 10 borjúmagzat szérummal és 4 mmol/1 glutaminnal kiegészített DMEM-ben (Gibco, Gaithersburg, Maryland) oldott tripszinnel kezelve eltávolítjuk. Az egyes lombikokból származó sejteket 15 ml-es Corning polipropilén csövekbe visszük át, majd egy IEC centrifugában ülepítjük (1000/perc, 4 perc, szobahőmérséklet). A közeget leszívjuk, majd a sejteket DNA-HEBS oldatban szuszpendáljuk és BioRad (Richmond, Kalifornia) elektroporációs küvettába visszük át. A küvettákat egy Bio-Rad Gene Pulser-be tesszük, majd az elektroporációt 280 volt feszültség és 960 pFd kapacitás mellett végrehajtjuk. A sejteket 10 ml DMEM táptalajban szuszpendáljuk, majd az előzőkben leírt módon egy IEC centrifugában ülepítjük. Minden sejtet egy kétliteres sejtszaporítóba viszünk át (DMEM táptalajban), majd a tenyészközeget 72 óra elteltével kinyerjük, az LFA3TIP fehérje tisztításához.

A szekretált LFA3TIP-nek a transzfektált COS7 tenyésztő táptalajban levő koncentrációját ELISA-val határozzuk meg. Fisher 96-lyukas laposfenekű lemezeket (Corning 2580) 50 μΐ kecske anti-humán IgG-vel (H+L) borítunk (Jackson Immuno Research, West Grove, Pennsylvania, katalógusszám: 109-005-088), amelyet 5 pg/ml-re hígítunk lxPBS-ben. Ezeket a lemezeket éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. A lemezeket a következő napon hatszor mossuk desztillált vízzel, majd lyukanként 150 μΐ blokkpufferrel blokkoljuk (2%-os normál kecskeszérum lxPBS-ben). A puffért kétórás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után eltávolítjuk, majd különböző koncentrációjú kondicionált tápközeget adunk. Standard görbe készítéséhez kontrollként teljes humán IgG (Jackson Immuno Research, West Growe, Pennsylvania, katalógusszám: 099-000603) sorozathígítását is felvisszük ugyanarra a lemezre. Egyórás, szobahőmérsékleten történő inkubálás után a lemezeket négyszer mossuk 0,01% Tween 20 lxPBSben készített oldatával, majd alkalikus foszfatázzal konjugált, Fc-fragmensre specifikus anti-humán IgG (Jackson Immuno Research, West Growe, Pennsylvania, katalógusszám: 109-055-098) l:5000-es szérumhígítását adjuk az egyes lyukakhoz. Egy óra elteltével a lemezeket hatszor mossuk 0,1 % Tween 20-szal.

A lemezeket egy alábbi összetételű oldattal hívjuk elő: 10 mmol/1 Ca²⁺, Mg²⁺ 10%-os dietanolaminban készített oldatának 1:10 hígítása (pH = 9,6), plusz 5 mg/ml 4-nitro-fenil-foszfát (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, katalógusszám: 738-352). A reakciói 3 mol/1 nátrium-hidroxid hozzáadásával állítjuk le, majd 405 nm-en leolvassuk, egy Microdevices mikrotiter-lemez leolvasóval.

LFA3T1P előállítása stabilan transzformált CHO sejtvonalbó!

Rekombináns LFA3TIP expressziós vektort készítünk az előzőkben leírt módon, amely képes stabilan fennmaradni CHO sejtekben, és ezáltal az LFA3TIP folyamatos expressziója érhető el.

A pSAB152 LFA3TIP kódoló szekvenciáját tartalmazó NotI fragmenst alacsony olvadáspontú agaróz gélelektroforézissel tisztítjuk. A fragmenst a pMDR902 expressziós vektor (lásd 11. példa) NotI klónozó helyére ligáljuk. A kapott ligáló elegyet használjuk Escherichia coli JA221 transzformálására, majd azokat a telepeket, amelyek a kívánt, helyes orientációjú inszertet tartalmazzák, ügy azonosítjuk, hogy belőlük PvuII restrikciós enzimmel való emésztés hatására 6599, 2058 és 487 bázispár méretű fragmenseknek kell keletkezni. A pMDR902 vektorban levő helyes inszertet

HU 211 476 A9

DNS szekvencia elemzés alapján azonosítjuk. A kapott rekombináns expressziós vektor jele pMDR(92)Ig-3.

A pMDR(92)Ig-3 rekombináns expressziós vektort CHO sejtekbe juttatjuk be elektroporációval, J. Barsoum publikált leírása szerint [DNA Cell Bioi. 9, 293300 (1990)], az alábbi eltérésekkel: 50 μg AatlI restrikciós enzimmel emésztett plazmid DNS-t és 350 μg ultrahanggal kezelt heringsperma DNS-t használunk az elektroporációs leírásban. Emellett, a sejteket 25 vagy 50 nmol/1 metotrexáttal (MTX) kiegészített alpha komplett táptalajban választjuk ki.

A szekretált LFA3TIP expressziós szintjének meghatározásához a kiónokat egy laposfenekű, 96 lyukas mikrotiter lemezre visszük, amelyben a sejteket egybefüggő növekedésig szaporítjuk, majd ELISA-val vizsgáljuk (lásd a továbbiakban). Egy klón növekedett 25 nmol/1 MTX jelenlétében, ennek jele LEA3TIP.25.11, és ez 510 pg LFA3TIP-et expresszált egy ml tenyészközegben. Ezt a kiónt elszaporítjuk. Az amplifikálást úgy hajtjuk végre, hogy egy 96-lyukas lemezre 1 sejt per lyuk koncentrációban felvisszük a sejteket. A lyukak komplett táptalajt tartalmaznak, 50 vagy 100 nmol/1 MTX-szel kiegészítve. A kiónokat egybefüggő növekedésig szaporítjuk, majd ELISA-val vizsgáljuk. Két klón, az LFA3TIP.25.11.50.10A és az LFA3TIP.25.il.50.5B nagyobb mennyiségű LFA3TIP-et szekretál (azaz 5060 pg LFA3TIP per ml tenyészközeg), ezeket a további vizsgálatok és tisztítás céljára elszaporítjuk.

A szekretált LFA3TIP koncentrációját a pMDR(92)Ig-3 plazmidot hordozó CHO sejtek tenyészközegében (azaz a kondicionált közegben) ELISAval határozzuk meg.

Immulon 2 lemezek (Dynatech, Chantilly, Virginia) lyukait TS2/9 anti-LFA3 MAb-val (Dr. Timothy Springer ajándéka) borítjuk, oly módon, hogy 50 pl TS2/9 anti-LFA-3 MAb-ot, amelyet 0,05 mol/1 nátrium-karbonát/bikarbonát pufferben (pH = 9,6) 25 pg/ml-re hígítunk, Parafilmmel borítjuk, majd éjszakán át szobahőmérsékleten tartjuk. A következő napon a lemezeket hatszor mossuk ionmentes vízzel és lyukanként 150 pl blokkoló pufferrel blokkoljuk (5% borjúmagzat szérum lxPBS-ben), amelyet egy 2 mikronos szűrőn szűrtünk át. A puffért kétórás, szobahőmérsékleten végrehajtott inkubálás után eltávolítjuk, majd kondicionált tápközeget adunk hozzá, különböző hígításokban. Standard görbe készítéséhez kontrollként LFA-3 sorozathígítását (50 pl per lyuk) is felvisszük. Tipikus esetben a legtöményebb LFA-3 standardot tartalmazó lyuk 50 pl LFA-3 oldatot tartalmaz, amely 10 ng LFR-3-at tartalmaz lxPBS-ben. A negatív kontroll az lxPBS-ben hígított blokkpuffer. A mintákat és a kontrollokat egy óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk.

A lemezeket azután hatszor mossuk ionmentesített vízzel. Mindegyik lyukat azután nyúl poliklonális antiLFA-3 anti szérum (azaz például az előzőkben említett 202 antiszérum) l:5000-es hígításával töltjük fel (a hígítás lxPBS-ben oldott 5%-os borjúmagzat szérummal történik). Egy óra hosszat tartjuk szobahőmérsékleten, majd a poliklonális anti-LFA-3 antiszérumot eltávolítjuk, és a lyukakat négyszer mossuk lxPBS-ben készített 0,05% Tween-20 oldattal. Ezután mindegyik lyukat 50 pl HRP-kecske anti-nyúl IgG (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Growe, Pennsylvania; katalógusszám: 111-035-045) 1:10000es hígításával töltjük fel. A hígítást 2% teljes egérszérumot (Cappel, katalógusszám 5011-1380) tartalmazó blokkpufferrel végezzük. A lemezeket azután 50-60 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten.

A HRP-kecske anti-nyúl IgG(H-t-L) oldatot eltávolítjuk, majd a lyukakat hatszor mossuk 0,05% Tween20 lxPBS-ben készített oldatával. Ezután 50 pl HRPszubsztrát puffért adunk az egyes lyukakhoz, szobahőmérsékleten. A HRP szubsztrát puffért az alábbiak szerint állítjuk elő: 0,5 ml 42 mmol/1 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB), (ICN Immunobiologicals, Lisle, South Carolina, katalógusszám 980 501) DMSO-ban (Aldrich) készült oldatát lassan hozzáadjuk 50 ml szubsztrát pufferhez (0,1 mol/1 nátrium-acetát/citromsav pH = 4,9), majd hozzáadunk 7,3 pl 30%-os hidrogén-peroxidot (Sigma, katalógusszám: H-1009).

Az egyes lyukakban a kék szín kifejlődését 650 nm-en mérjük, mikrotiter-lemez leolvasóval. 7-10 perc elteltével a kifejlődést 50 μ] 1 mol/1 kénsav hozzáadásával állítjuk le. A kapott sárga színt 450 nm-en olvassuk le mikrotiter-lemez leolvasóval. A negatív kontroll lyukat használjuk a gép alapjelének beállítására.

Az M57IgG előállítása

Egy fúziós fehérjét, amely az LFA3TIP-nek egy olyan mutánsa, amelyből hiányzik az LFA-310 aminosavból álló M57-es régiója (M57IgG), lényegében az előzőkben az LFA3TIP-re ismertetett módszerrel állítunk elő.

13. példa

Az LFA3TIP tisztítása

A COS7 (pSAB152) kondicionált tenyészközeget tízszeresre töményítjük AMICON SÍ Y30 spirális cartridge rendszert alkalmazva (AMICON, Danvers, Massachusetts). A koncentrátumot 4x50 ml-es alikvot részekre osztjuk, majd éjszakán át 4 °C-on batch-abszorbciót végzünk alikvot részenként 200 μΐ Protein A Sepharose 4B-vel (SIGMA, St. Louis, Missouri). A gyöngyöket 1000/perc fordulatszámmal ülepítjük egy klinikai centrifugában, egyesítjük, majd egy 5 mm átmérőjű oszlopba töltjük. A gyantát 20 ml PBS-sel mossuk, amelyet 500 mmol/1 nátrium-kloriddal egészítettünk ki, majd tiszta PBS-sel mossuk. A megkötött fehérjéket 150 μΐ-es frakciókban eluáljuk 50 mmol/1 glicin, 250 mmol/1 NaCl (pH = 3,0) összetételű oldattal 15 μ] 1 mol/1 HEPES-t (pH = 7,8) tartalmazó csövekbe. Az egyes frakciókból 10 μΙ-t 12%-os nemredukáló SDS-poliakrilamid gélen futtatjuk. Az eluált fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd Superose-12 gélszűrő kromatográfiának vetjük alá, kifejlesztő oldószerként PBS-t alkalmazva (Pharmacia/LKB, Piscataway, New Jersey).

A fehérjecsúcsot tartalmazó frakciókból (meghatározása: az OD mérése 280 nm-en) 10 μΙ-es alikvot részeket futtatunk 12%-os SDS-poliakrilamid gélen,

HU 211 476 A9 nem-redukáló körülmények között, majd egyesítjük az LFA3TIP-et tartalmazó frakciókat, amelyekben alacsony a szennyező fehérjék koncentrációja (SDS-poliakrilamid gélek és Westem-blot elemzés alapján meghatározva) [Towbin és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 74, 4350-54 (1979); Antibodies: A Laboratory Manual 474-510 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)], és egy YM30 Centricon berendezéssel (AMICON, Danvers, Massachusetts) töményítjük. Az LFA-3-at Western-blotokon mutatjuk ki, 202 nyúl anti-LFA-3 poliklonális antiszérumot (lásd a 3. példát), valamint kecske anti-nyúl IgG-t használva, amelyet tormaperoxidázzal jeleztünk (Sigma, St. Louis, Missouri). A biotokat Amersham ECL kimutatási kittel hívjuk elő (RPN 2106, Amersham, Arlington Heights, Illinois). A végül egyesített oldatot 12%-os SDS-poliakrilamid gélen futtatjuk, nem redukáló körülmények között, tisztaságának megállapítására. Az UV abszorbciós spektrumot vesszük fel, a koncentráció meghatározására. Az összes, Protein A-val tisztított készítményről kiderült, hogy egyetlen szenynyezést tartalmaznak, ami a legnagyobb valószínűséggel szarvasmarha IgG, és ami a tenyésztő közeg borjúmagzat szérumában található, és ami együtt tisztul az LFA3TIP-pel.

Az LFA3TIP tisztaságát denaturáló és nem-denaturáló SDS poliakrilamid gélelektroforézissel határozzuk meg (13. ábra). Az SDS poliakrilamid gélelektroforézis eredményei azt mutatják, hogy az LFA3TIP, amely a pSAB 152 plazmidok hordozó COS7 sejtek tenyészközegéből tisztítható, a sejttenyésztő közegben két LFA3-Ig fúziós fehérje monomer dimerjeként található meg, melyeket diszulfid hidak kötnek össze.

Az a tény, hogy az LFA3TIP a sejttenyésztő közegben található, arra utal, hogy csakúgy mint az LFR-3 esetében, a szignálpeptid szekvencia normálisan működik, azaz a szignálpeptid lehasad az LFA3TIP LFA-3 doménje N-terminális régiójáról az LFA3TIP fehérjének a sejtmembránon keresztül történő szekréciója során.

Az M571gG tisztítása

Az M57IgG-t a kondicionált tenyészközegből ugyanúgy tisztítjuk, mint azt az előzőkben az LFA3TIP-re leírtuk. Hasonló szennyeződések figyelhetők meg.

14. példa

Az LEA3T1P kötődés FACS elemzése

Jurkat sejteket viszünk át számos Eppendorf csőbe, lxlO⁵ sejt/cső koncentrációban. A sejteket 10 másodpercig ülepítjük Eppendorf mikrocentrifugában, a közeget leszívjuk, majd az üledéket 100 μΐ LFA3TIP-ben vagy TS2/18 anti-CD2 monoklonális ellenanyagban (MAb) [Sanchez-Madrid és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 7489-93 (1982)] oldjuk, mindegyiket 10 μg/ml koncentrációban, FACS pufferben (PBS, 0,1% NaN₃, 0,5% BSA pH = 7,2). A sejteket jégen inkubáljuk 30 percig, kétszer mossuk FACS pufferrel, majd 100 μΐ megfelelő szekunder ellenanyaggal inkubáljuk, hogy kimutassuk a

Jurkat sejtekhez kötődő MAb-ket. A FITC-konjugált kecske anti-egér IgG (H+L) F(ab')₂-t (Jackson Immunoresearch) használjuk a TS2/18 anti-CD2 MAb kimutatására, és R-fikoeritrinnel konjugált AP kecske antihumán IgG F(ab')₂-t (Jackson Immunoresearch) használunk a Jurkat sejtekhez kötődő LFA3TIP kimutatására. A FITC kecske anti-egér IgG F(ab')₂-t 1:50 arányban hígítjuk FACS pufferben, majd az R fikokeritrinnel konjugált AP kecske anti-humán IgG F(ab')₂-t 1:20 arányban hígítjuk FACS pufferben. A sejteket 30 percig inkubáljuk jégen, kétszer mossuk, majd szuszpendáljuk 300 μΐ lxPBS-ben és a fluoreszcenciát a sejtosztályozóval mutatjuk ki.

A kompetíciós vizsgálatokhoz a Jurkat sejteket Eppendorf csövekben szuszpendáljuk, az előzőkben leírt módon, majd LFA3TIP-t adunk hozzá 10 pg/ml koncentrációban, FACS pufferben. A sejteket 30 percig inkubáljuk jégen, majd kétszer mossuk FACS pufferrel. A sejteket 30 percig jégen inkubáljuk, majd kétszer mossuk FACS pufferrel. Az üledékeket azután 100 μΐ 1:100 hígítású (FACS pufferben) anti-CD2 MAb-t tartalmazó aszcitesz-folyadékokban szuszpendáljuk: Tll], TI 1₂ vagy TI 1₃ (mindegyik Dr. Ellis Reinherz ajándéka, Dana Farber Cancer Institute, Boston, Massachusetts). A sejteket 30 percig inkubáljuk jégen, kétszer mossuk, majd újra szuszpendáljuk 1:20 hígításban R-fikoeritrinnel konjugált AP kecske anti-humán IgG F(ab')₂-ben, a megkötött LFA3TIP kimutatására. 30 perces jégen való inkubálás után a sejteket kétszer mossuk, majd újra szuszpendáljuk 300 μΙ lxPBS-ben, majd egy sejtosztályozóval elemezzük.

A TS2/18 monoklonális ellenanyagok és a Tűiben levő monoklonális ellenanyagok specifikusak a CD2 LFA-3-kötő doménjére. Tehát ezekről az ellenanyagokról elvárható, hogy kötődnek a Jurkat sejtek felszínén levő CD2 molekulákhoz, és ugyanazokat a helyeket foglalják el mint amelyekhez az LFA3TIP kötődik. Ennek megfelelően, amikor a Jurkat sejteket először feleslegben levő TS2/18 MAb vagy TI 1 j aszcitesz folyadékkal inkubáljuk, akkor várhatóan egyetlen dómén sem, vagy csak néhány dómén hozzáférhető az R-fikoeritrinnel konjugált LFA3TIP molekulák megkötődéséhez. Amint az a 14A. ábrán látható, ha a Jurkat sejteket vagy TS2/18 MAb-bal vagy Tll] aszcitesz folyadékkal előinkubáljuk, akkor csak néhány sejt jelölődik az LFA3TIP-pel. Afestetlen kontrollal közel azonos jel figyelhető meg. Ezzel szemben, akár a TS2/18 akár a Tll] aszcitesz folyadék távollétében az LFA3TIP kötődik a Jurkat sejtekhez, és a sejtek jelentős részét megjelöli ( 14A. ábra).

A Tll2 és Tll3 aszcitesz folyadékban jelenlevő MAb-ok specifikusak a CD2-re, de nem ugyanazokat az epitopokat ismerik fel, mint amelyek a CD2-nek a CD2/LFA-3 komplexképződésében játszanak szerepet. Amint a 14B. ábráról látható, ha a Jurkat sejteket TI 1₂vagy TI 13 aszcitesz folyadékkal előinkubáljuk, ez nem akadályozza meg, hogy az LFA3TIP kötődjön a Jurkat sejtekhez. A 14A. és 14B. ábrákon látható eredmények azt mutatják, hogy az LFA3TIP tartalmazza a funkcionális CD2-kötő dómén LFA-3-at.

HU 211 476 A9

75. példa

Kevert limfocita reakció

A CD2/LFA-3 komplex képződésének és a T-sejt aktiválásnak egy funkcionális vizsgálati módszere a kevert limfocita reakció („MLR”) [Krensky és mtsai.: J. Immunoi. 131 (2), 611-616 (1983); Bradley: „Mixed Lynphocyte Responses”, Selected Methods in Cellular Immunology (szerk. Mishell és Shiigi), 162-164 (W. H. Freeman & Co„ San Francisco, 1980)]. Ez a vizsgálat a T limfociták aktiválásán alapul perifériális vér limfociták („PBL-ek”) egy populációjában, mikor a T-limfociták („válaszoló sejtek”) felismerik az alloantigéneket nem szaporodó allogén PBL-ekben („serkentő sejtek”). Ez az aktiválás a sejt-sejt tapadás következtében lép fel, és részben a T-limfocitákon levő CD2 molekuláknak az allogén PBL-eken levő LFA-3 molekulákhoz való kötődése közvetíti.

A PBL-eket két allogén humán donor 30 ml véréből tisztítjuk Ficoll-Paque gradiensen (Pharmacia, Piscataway. New Jersey, katalógusszám: 17-0840-02). A vért 1:2 arányban hígítjuk RPMI közegben, majd Ficoll gradiensen felülrétegezzük 2:1 arányban (30 ml vér:15 ml Ficoll). A sejteket a gradiensen centrifugáljuk át Sorvall RT6000 centrifugával (1600/perc, 20 °C, 30 perc). A PBL-eket tartalmazó interface-t 50 ml-es polipropilén centrifugacsövekbe (Corning 25331) gyűjtjük, majd RPMI közeggel felülrétegezzük. A sejteket azután centrifugálással ülepítjük (Sorvall RT6000 centrifuga, 1400/perc, 4 °C, 15 perc). Az üledékben levő sejteket kétszer mossuk 50 ml RPMI-vel, majd az előzőkben leírt módon ülepítjük. A PBL-eket RPMI komplett táptalajban szuszpendáljuk (RPMI, 10% Hyclone FCS, 4 mmol/Ι glutamin, Pen-Strep) 3xl0⁶sejt/ml koncentrációban. A serkentő sejtek előállításához az egyik donortól származó PBL-eket 2000 rad-dal besugározzuk egy Gammacell Irradiator-ban, majd 3x10⁶ sejt/ml végkoncentrációt állítunk be.

Az ellenanyagokat vagy az LFA3TIP mintákat a 15. ábrán jelzett koncentrációban tesszük 96-lyukas, kerekfenekű polisztirol lemezekre (Corning 25850). Mind a MAb-ok mind az LFA3TIP esetében a legmagasabb használt koncentráció 5 pg/ml. Minden hígítást és inkubálást RPMI komplett táptalajban végzünk. A válaszoló sejteket (ezeket nem sugároztuk be) és a besugárzott serkentő sejteket 1:1 arányban adjuk a lyukakhoz, mindegyiknek Ι,όχΙΟ⁵ sejt/Iyuk a végkoncentrációja a lyukakban, és a lemezeket öt napig 37 °C-on inkubáljuk. Az ötödik napon a sejteket impulzusjelzésnek vetjük alá, 1 pCi [metil-³H)timidinnel (New England Nuclear, Boston, Massachusetts, NET-027) 15 órán át, majd egy Tomtech 96 lyukas harvesterrel nyerjük ki. A besugározatlan T-limfocita populáció szaporodását úgy mérjük, hogy meghatározzuk a ³H-timidin beépülését a sejtekbe, jelezve a jelzett timidin beépülését a T-limfocita szaporodás során. Ezt az MLR vizsgálatot használva, számos különböző MAb-ot és CD2kötő molekulát vizsgáltunk, abból a szempontból, hogy milyen hatással vannak a CD2/LFA-3 komplex képződésére és a T-sejtek aktiválására.

Az 1E6 anti-LFA-3 MAb (az 1E6-2C12 hibridómával előállítva, ATCC letéti száma HB 10693) specifikus az LFA-3 CD2-kötő doménjére. Amint az a 15. ábráról látható, ha MAb-ok vannak jelen az MLR vizsgálatban, akkor a T-sejt aktiválás dózisfüggő gátlása figyelhető meg. Ez az eredmény konzisztens azzal a véleménnyel, hogy az 1E6 MAb-ok kötődnek az LFA3 CD2-kötő doménjeihez, megakadályozzák, hogy CD2/LFA-3 komplexek keletkezzenek a serkentő és a válaszoló sejtek között, és ezáltal gátolják a T-sejtek aktiválódását a válaszoló sejtek populációjában.

Az LFA3TIP hasonló dózisfüggő módon gátolja a T-sejtek aktiválását az MLR vizsgálatban (lásd 15. ábra). Ahhoz, hogy kizárjuk annak a valószínűségét, hogy az 1E6 MAb-ok vagy az LFA3TIP IgG része hozzájárul a T-sejt aktiválás megfigyelt gátlásához, aspecifikus humán IgGl-et (Pierce, Rockford, IL) vizsgálunk az MLR vizsgálatban. Amint a 15. ábrán látható, az aspecifikus humán IgG nem mutatja a T-sejt aktiválás dózisfüggő gátlását, ami az LFA3TIP-nél vagy az 1E6 MAb-oknál megfigyelhető.

Ezeket az eredményeket összerakva azt láthatjuk, hogy az LFA3TIP-nek az MLR vizsgálatban a T-sejt aktiválásra kifejtett gátló hatása a fúziós fehérje LFA-3 doménjében gyökerezik, és nem az IgG doménjében.

Egyéb molekulák gátló aktivitása a T-sejt aktiválásra

Az LFA3TIP és 1E6 MAb-ok mellett az alábbi molekuláknak is megvizsgáltuk a T-sejt aktiválásra gyakorolt gátló hatását az MLR vizsgálatban: 7A6 MAb (az LFA-3 CD2-kötő doménjére specifikus MAb, amelyet a 7A6-2E5 hibridóma termel, ATCC letéti száma HB 10695), TS2/18 [anti-CD2 maB; Sanchez-Madrid és mtsai.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 79, 7489-93 (1982)]; hlgG (aspecifikus össz-humán IgGl), PI-LFA3 (multimer ΡΙ-kapcsolt LFA-3, amely intermolekuláris hidrofób kölcsönhatásban keletkezik az egyes PI-LFA-3 monomer Pl horgonyrégiójában), és egy CD4-IgGl fúziós fehérje (az LFA3TIP analógja, de a CD4 egy részét tartalmazó N-terminális régiót tartalmaz, lásd például a WO 89/01 940 számú PCT szabadalmi bejelentést).

Minden egyes említett molekula gátló aktivitásának az összehasonlítása a 16. ábra oszlopgrafikonján látható. A 16. ábrán látható „LFA3IgGA” és „LFA3IgG72A” jelzés az LFA3TIP-nek a tisztasági fokban eltérő készítményeit jelöli, azaz 75 vagy 50%os tisztaságot. Kontrollként egy „hamis” készítményt, amelyet csak a vektor DNS-sel (azaz amely vektor nem tartalmazza az LFA3TIP-et kódoló inszertet) transzfektált COS7 sejtekből tisztítottunk, adunk a rendszerhez, hogy igazoljuk, hogy a T-sejt aktiválás gátló aktivitása nem egy olyan aspecifikus inhibitorból származik, amely a kondicionált COS7 sejttenyésztó közegből származik. A hamis készítmény tartalmazza azt a szennyeződést, amely, amint azt a 13. példában megtárgyaltunk, együtt tisztul az LFA3TIP-vel, és valószínűleg szarvasmarha IgG, amely a szaporító közegben levő borjúmagzat szérumban található. Minden MLR vizsgálatot az előzőkben leírt módon hajtunk végre,

HU 211 476 A9 azzal az eltéréssel, hogy minden egyes molekula készítményét 0,1 gg fehérje/ml koncentrációban vizsgáljuk.

Azok a MAb-ok, amelyek felismerik az LFA-3 CD2kötő doménjét (7A6 és 1E6), vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjét (TS2/18) hasonló gátló hatással vannak a T-sejtek aktiválására. Az LFA3TIP-nek az a képessége, hogy gátolja a T-sejt aktiválását, fokozódik a tisztaság növekedésével (látható, ha összehasonlítjuk az LFA3IgG72A-t, 50%-os tisztaság; és az LFA3IgGA-t, 75%-os tisztaság). Az aspecifikus humán IgGl és a CD4-IgGl fúziós fehérje nem képes gátolni a T-sejtek aktiválását.

A PI-kapcsolt LFA-3 multimer formája szintén képtelen a T-sejtek aktiválásának gátlására. Annak ellenére, hogy többféle CD2-kötö hely található a multimer PI-kapcsolt LFA-3-οη, úgy tűnik, hogy az ilyen típusú multimer se nem gátolja, se nem serkenti a humán allogén MLR-t.

16. példa

PBL szaporodási vizsgálat

Humán PBL-eket izolálunk 20 ml humán donorvérből Ficoll-Paque gradiensen, az előzőkben leírt módon. A tisztított LFA3TIP-et 96 lyukas, kerekfenekű polisztirol szövettenyésztő lemezekre visszük (Corning 25850), a 17. ábrán jelzett koncentrációban. lxlO⁵PBL-t adunk minden egyes lyukhoz, majd a lemezeket 3 napig 37 °C-on inkubáljuk. Minden hígítást RPMI komplett táptalajban végzünk (lásd 15. példa). A sejteknek három nap elteltével lyukanként 1 gCi [metil³H]timidint adunk 15 óra időtartamra, majd Tomtech 96 lyukas automata harvesterrel kinyerjük. Kontrollként a PBL szaporodását mérjük csak szaporító tápközegben és mérjük nemspecifikus humán IgGl-gyei kiegészített szaporító tápközegben.

Amint az a 17. ábráról látható, az LFA3TIP készítmény gátolja a PBL-ek szaporodását. Az aspecifikus humán IgGl nem gátolja a PBL szaporodását.

Vizsgáljuk a fő szennyeződéseket is egy hamis készítményben, a 15. példában leírtak alapján. Amint a 13. és 15. példában említettük, ez a szennyezés valószínűleg szarvasmarha IgG, a szaporító tápközegből. A

17. ábrán látható, hogy ugyanúgy, mint az aspecifikus humán IgGl esetében, a szennyeződés szintén nem gátolja a PBL-ek szaporodását.

PHA és 0KT3 dependens PBS szaporodás

Ezután vizsgáljuk az LFA3TIP-nek azt a tulajdonságát, hogy gátolja-e az OKT3 dependens (azaz anti-CD2 dependens) T-sejt szaporodást. A PBL-eket az előzőkben leírt módon egy egészséges humán donorból izoláljuk. Az OKT3 dependens PBL szaporodáshoz lxlO⁵ donor PBL-t inkubálunk 2 napig csak 3 ng/ml 0KT3-mal (Ortho Pharmaceuticals, Raritan, New Jersey), valamint LFA3TIP jelenlétében (1 nmol/1 és 10 nmol/1), vagy tisztított humán IgGl jelenlétében (1 nmol/1 és 10 nmol/1, Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois). A sejtek egy alikvot részét csak a táptalajban inkubáljuk, OKT3 nélkül. A sejteket azután impulzusjelezzük [metil-³H]timidinnel, az előzőkben leírt módon. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 18. ábrán mutatjuk be.

A 18. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy az LFA3TIP jelentősen aktívabb mint az irreleváns specifitással rendelkező kontroll humán IgGl. Ami a 17. ábrán látható eredményeket illeti, ezek azt mutatják, hogy az LFA3TIP-nek az a képessége, hogy gátolja a PBL szaporodását, elsődlegesen a 92 aminosavas LFA-3 régióban található, amely a CD2-kötő domént tartalmazza, és nem az LFA3TIP IgG részében.

Vizsgáljuk emellett az LFA3TIP-nek és az egyéb különböző CD2-kötő molekuláknak, valamint az M57IgGnek azt a képességét, hogy gátolja a fitohemagglutinin (PHA) dependens PBL szaporodást, mind szuboptimális mind optimális PHA koncentráció mellett.

Ehhez a vizsgálathoz lxlO⁵ donorsejtet (humán PBL) inkubálunk 0,1 vagy 1,0 gg/ml PHA-val (Fisher), vagy egyedül, vagy PI-kapcsolt LFA-3 jelenlétében [„PILFA-3”, Wallner és mtsai.: WO 90/02 181 számú PCT szabadalmi bejelentés], monomer, oldható LFA-3 jelenlétében („mon LFA-3”, amely a 10. számú szekvencia 29-181-es aminosavait tartalmazza, lásd 11. példa), egy teljes hosszúságú oldható LFA-3-IgG fúziós fehérje jelenlétében („FLIgG”, amely a 10. számú szekvencia 29-181-es aminosavait tartalmazza a humán IgGl csuklórégiója egy részéhez és a C_H2, C_H3 doménjeihez fuzionáltatva), egy anti-CD2 MAb jelenlétében (TS2/18, T. Springer ajándéka), vagy egy antiLFA-3 MAb jelenlétében (11E6), amelyet az 1E62C12 hibridóma termel (ATCC HB 10 693). A FLIgG koncentrációja 2 pg/ml; az összes többi fehérje koncentrációja 5 μg/ml. A sejteket azután az előzőkben leírt módon [metil-³H]timidinnel impulzusjelezzük.

Amint az a 19. ábráról látható, ha PHA-t inkubálunk humán PBL-lel szuboptimális koncentrációban (azaz 0,1 μg/ml), csak a PI-kapcsolt LFA-3 (PILFA-3) képes serkenteni a PBL szaporodását. Az M57IgG, a monomer oldható LFA-3 és az FLIgG nincs hatással a szuboptimális PHA-val serkentett T-sejt szaporodására. Az 1E6 és TS2/18 MAb 80-90%-ban gátolja a szaporodást; az LFA3TIP 70%-ban gátolja a szaporodást.

Ha a PHA optimális szinten van jelen ahhoz, hogy serkentse a PBL szaporodását, akkor az LFA3TIP, az 1E6 és a TS2/18 MAb 41, 26 és 20%-ban gátolja a szaporodást.

A 19. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy az N-terminális 92 aminosav által meghatározott LFA-3 régió, amely tartalmazza az LFA-3 CD2-kötő doménjét, képes gátolni a PHL-dependens PBL szaporodást, de a CD2-kötő dómén egy részének hiánya, mint például az M57IgG-ben, vagy egy további LFA-3 aminosav szekvenciajelenléte, mint például a PI-kapcsolt LFA-3-ban, a monomer LFA-3-bán vagy a FLIgG-ben megszünteti az KFA-3 CD2-kötő doménjének azt a képességét, hogy gátolja a PHA-dependens PBL szaporodást.

A fentieket együtt értékelve, az eredmények azt mutatják, hogy a PBL szaporodás LFA3TIP-pel való gátlása az LFA-3 dómén következménye.

Az előző leírásból nyilvánvaló, hogy az előzőkben specifikusan említettek mellett számos különböző

CD2-kötő polipeptid, valamint azok fragmensei és analógjai hasznos megvalósítási módjai a jelen találmány24

HU 211 476 A9 nak. Minden ilyen megvalósítási mód, valamint az összes olyan megvalósítási mód, amely a kitanításból nyilvánvaló, specifikusan a találmány oltalmi körébe tartozik, az alább következő igénypontokban meghatározva.

Letétbe helyezések

A jelen találmány szerinti DNS szekvenciákat hordozó plazmidokat tartalmazó gazdasejteket a Budapesti Egyezmény alapján letétbe helyeztük az American Type Culture Collection-nél (ATCC), Rockville, Maryland, USA, 1995. március 5-én. A letétbe helyezett tenyészeteket az alábbiakban ismertetjük:

Plazmid	Gazda- sejt	Letéti szám	Leírás: (a plazmid az alábbi DNS-t tartalmazza:)
pPYM57	E.coli JA221	68 545	M57 deléciós mutáns
pPMDRM54-6 I	E.coli JA221	68 542	M54 deléciós mutáns
pPMDRM55-9	E.coli JA221	68 546	M55 deléciós mutáns
pPMDRM56-C	E.coli JA22)	68 551	M56 deléciós mutáns
pPMDRM58-l5	E.coli JA221	68 547	M58 deléciós mutáns
pPYM63-4	E.coli JA221	68 544	M63 deléciós mutáns
pPYM65-8	E.coli JA221	68 552	M65 deléciós mutáns
pPMDRMlOO-4	E.coli JA221	68 550	Ml 00 deléciós mutáns
pPMDRMl0l-l	E.coli JA221	68 543	MIOl deléciós mutáns
pPMDRMlO2-8	E.coli JA221	68 548	Μ102 deléciós mutáns
pPMDMR3-10	E.coli JA221	68 549	P1M3 deléciós mutáns

Egy, a jelen találmány szerinti plazmidot hordozó gazdasejtet helyeztünk letétbe a Budapesti egyezmény alapján az ATCC-nél 1991. október 1-jén, jelölése az alábbi:

Plazmid	Gazdasejt	Letéti szám	Leírás:
pSABl52	E.coli JA221	68 720	Hibrid DNS szekvencia, amely az LFA-3 szignál szekvenciát, az LFA-392 N-terminális aminosavát, IgGl csuklórégió 10 aminosavát, a C_H2ésC_H3 IgGl konstans doméneket kódolja.

Egy bakteriofág és egy baktérium törzset, amely egy ismertetett vektort hordoz, helyeztünk letétbe a Budapesti Egyezmény alapján az In Vitro International Inc.-nél, Linthicum, Maryland (USA), 1987. május 28án és 1988. május 24-én, IVI-10 133 valamint IVI10 170 letéti szám alatt. Ezeket a letéteket 1991. június 20-án átvittük az ATCC-hez. A letéteket az alábbiakban jellemezzük:

Jelölés	Letéti szám	Leírás
XHT16]XgtlO/LFA-3] E.coli, BG8	75 107	Teljes hosszúságú transzmembrán LFA-3-at kódoló DNS-t tartalmaz.

Az alábbi hibridóma sejtvonalakat, amelyekre az előzőkben hivatkoztunk, a Budapesti Egyezmény alapján 1991. március 5-én letétbe helyeztük az ATCC-nél:

Hibridóma:	Letéti szám	Ellenanyag
7A6-2E5	HB 10 695	7A6
1E6-2C12	HB 10 693	1E6

Az előzőkben a jelen találmány számos megvalósítási módját ismertettük, de nyilvánvaló, hogy az általunk ismertetett alap megvalósítási mód megváltoztatható, és léteznek más megvalósítási módok, amelyek hasznosítják a jelen találmány szerinti készítményeket és eljárásokat. Tehát az nyilvánvaló, hogy a jelen találmány oltalmi köre vonatkozik az összes alternatív megvalósítási módra és variációra, amelyeket az ismertetett specifikációk és a függelékben megadott igénypontok határoznak meg; a találmányt a példaként megadott specifikus megvalósítási módok nem korlátozzák.

Szekvenciák jegyzéke:

1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 10 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly 15 10

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 50 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val 5 5

HU 211 476 A9

Tyr	Gly	Asn	Val	Thr
10
Phe	His	Val	Pro	Ser	Asn	Val	Pro	Leu
15					20
Lys	Glu	Val	Leu	Trp
	25
Lys	Lys	Gin	Lys	Asp	Lys	Val	Alá	Glu
	30					35
Leu	Glu	Asn	Ser	Glu
		40
Phe	Arg	Alá	Phe	Ser	Ser	Phe	Lys
		45					50

3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 10 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia Ser Leu Thr He Tyr Asn Leu Thr Ser Ser 15 10

4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 20 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia

Thr Lys	Pro	Asp Leu	Val Asp
1		5
Thr Glu	Asp	Lys Val
10
Val Asp	Val	Val Arg	Asn
15			20
5. számú szekvenciavázlat

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 77 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia

Val	Alá	Gly	Ser	Asp	Alá	Gly	Arg	Alá
1				5
Leu	Gly	Val	Leu	Ser
10
Val	Val	Cys	Leu	Leu	His	Cys	Phe	Gly
15					20
Phe	Ile	Ser	Cys	Phe
	25
Ser	Gin	Gin	Ile	Tyr	Gly	Val	Val	Tyr
	30					35
Gly	Asn	Val	Thr	Phe
		40

His	Val	Pro 45	Ser	Asn	Val	Pro	Leu 50	His
Glu	Val	Leu	Trp	Lys
			55
Lys	Gin	Lys	Asp	Lys	Val	Alá	Glu	Leu
			60					65
Glu	Asn	Ser	Glu	Phe
				70
Arg	Alá	Phe	Ser	Ser	Phe	Lys
				75

6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: kétszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia

AATAGGGTTT ATTTAGAC TGTGTCAGGT 30

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 16 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia

Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val 1 5

Ser Gly Ser Leu Thr 10

Ile Tyr

8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia

TAATTGAATG CTAAGAAAGA ACTTCATGGT 30

9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 1040 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: kétszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia

HU 211 476 A9

CGACGAGCC ATG GTT GCT GGG AGC Met Val Alá Gly Ser 1 5

GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly

GTC

CTC

AGC

GTG

GTC

TGC

CTG

CAC

TGC

TTT

GGT

TTC

ATC

Val

Leu

Ser 15

Val

Cys

Leu 20

Leu

His

Cys

Phe

Gly 25

Phe

Ile

AGC

TGT

TTT

TCC

CAA

ATA

TAT

GGT

GTT

GTG

TAT

GGG

AAT

Ser

Cys

Phe

Ser 30

Gin

Ile

Tyr

Gly 35

Val

Tyr

Gly

Asn 40

GTA

ACT

TTC

CAT

GTA

CCA

AGC

AAT

GTG

CCT

TTA

AAA

GAG

GTC

Val

Thr

Phe

His

Val 45

Pro

Ser

Asn

Val

Pro 50

Leu

Lys

Glu

Val

CTA

TGG

AAA

CAA

AAG

GAT

AAA

GTT

GCA

GAA

CTG

GAA

AAT

Leu 55

Trp

Lys

Gin

Lys 60

Asp

Lys

Val

Alá

Glu 65

Leu

Glu

Asn

TCT

GAA

TTC

AGA

GCT

TTC

TCA

TCT

TTT

AAA

AAT

AGG

GTT

TAT

Ser

Glu 70

Phe

Arg

Alá

Phe

Ser 75

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg 80

Val

Tyr

TTA

GAC

ACT

GTG

TCA

GGT

AGC

CTC

ACT

ATC

TAC

AAC

TTA

ACA

Leu

Asp

Thr 85

Val

Ser

Gly

Ser

Leu 90

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu 95

Thr

TCA

GAT

GAA

GAT

GAG

TAT

GAA

ATG

GAA

TCG

CCA

AAT

ATT

Ser

Asp

Glu 100

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met 105

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile 110

ACT

GAT

ACC

ATG

AAG

TTC

TTT

CTT

TAT

GTG

CTT

GAG

TCT

CTT

Thr

Asp

Thr

Met

Lys 115

Phe

Leu

Tyr

Val 120

Leu

Glu

Ser

Leu

CCA

TCT

CCC

ACA

CTR

RCT

TGT

GCA

TTG

ACT

AAT

GGA

AGC

RTT

Pro 125

Ser

Pro

Thr

Leu

Thr 130

Cys

Alá

Leu

Thr

Asn 135

Gly

Ser

Ile

GAA

GTC

CAA

TGC

ATG

ATA

CCA

GAG

CAT

TAC

AAC

AGC

CAT

CGA

Glu

Val 140

Gin

Cys

Met

Ile

Pro 145

Glu

His

Tyr

Asn

Ser 150

His

Arg

GGA

CTT

ATA

ATG

TAC

TCA

TGG

GAT

TGT

CCT

ATG

GAG

CAA

TGT

Gly

Leu

Ile 155

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp 160

Cys

Pro

Met

Glu

Gin 165

Cys

AAA

CGT

AAC

TCA

ACC

AGT

ATA

TAT

TTT

AAG

ATG

GAA

AAT

GAT

Lys

Arg

Asn Ser 170

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe 175

Lys

Met

Glu

Asn

Asp 180

CTT

CCA

CAA

AAA

ATA

CAG

TGT

ACT

CTT

AGC

AAT

CCA

TTA

TTT

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile 185

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser 190

Asn

Pro

Leu

Phe

AAT

ACA

TCA

ATC

ATT

TTG

ACA

ACC

TGT

ATC

CCA

AGC

Asn 195

Thr

Ser

Ile Ile 200

Leu

Thr

Cys 205

Ile

Pro

Ser

HU 211 476 A9

AGC Ser

GGT Gly 210

CAT His

TCA AGA CAC

AGA Arg 215

TAT Tyr

GCA Alá

CTT ATA

CCC Pro 220

ATA Ile

CCA Pro

Ser

Arg

His

Leu

Ile

TTA

GCA

GTA

ATT

ACA

TGT

ATT

GTG

CTG

TAT

ATG

AAT

GGT

Leu

Alá

Val

Ile

Thr

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

225

230

235

ATT

CTG

AAA

TGT

GAC

AGA

AAA

CCA

GAC

AGA

ACC

AAC

TGG

AAT

Ile

Leu

Lys

Cys

Asp

Arg

Lys

Pro

Asp

Arg

Thr

Asn

Ser

Asn

240

245

250

TGATTGGTAA CAGAAGATGA AGACAACAGC ATAACTAAAT TATTTTAAAA 809 ACTAAAAAGC CATCTGATTT CTCATTTGAG TATTACAATT TTTGARCAAC 859 TGTTGGAAAT GTAACTTGAA GCAGCTGCTT TAAGAAGAAA TACCCACTAA 909 CAAAGAACAA GCATTAGTTT TGGCTGTCAT CAACTTATTA TATGACTAGG 959 TGCTTGCTTT TTTTGTCAGT AAATTGTTTT TACTGATGAT GTAGATACTT 1009 TTGTAAATAA ATGTAAATAT GTACACAAGT G 1040

10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 250 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia

Met Val Alá Gly Ser Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly 15 10

Val Leu Ser Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile 15 20 25

Ser Cys Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn 30 35 40

Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val 45 50

Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn 55 60 65

Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr 70 75 80

Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr 85 90 95

Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile 100 105 110

Thr Asp Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu 115 120

Pro Ser Pro Thr Leu Thr Cys Alá Leu Thr Asn Gly Ser Ile 125 130 135

Glu Val Gin Cys Met Ile Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg 140 145 150

HU 211 476 A9

Gly

Leu

Ile 155

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp 160

Cys

Pro

Met

Glu

Gin 165

Cys

Lys

Arg

Asn

Ser 170

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe 175

Lys

Met

Glu

Asn

Asp 180

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile 185

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser 190

Asn

Pro

Leu

Phe

Asn 195

Thr

Ser

Ile 200

Ile

Leu

Thr

Cys 205

Ile

Pro

Ser

Gly 210

His

Ser

Arg

His

Arg 215

Tyr

Alá

Leu

Ile

Pro 220

Ile

Pro

Leu

Alá

Val 225

Ile

Thr

Cys

Ile 230

Val

Leu

Tyr

Met

Asn 235

Gly

Ile

Leu

Lys

Cys

Asp

Arg

Lys

Pro

Asp

Arg

Thr

Asn

Ser

Asn

240 245 250

11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 863 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: kétszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia

GCGGCCGCCG 10

ACGAGCC ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG GGG CGG GCC CTG GGG 53

Met Val Alá Gly Ser Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly 1 5 10

GTC CTC AGC GTG GTC TGC CTG CTG CAC TGC TTT· GGT TTC ATC 95

Val Leu Ser Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe He

20 25

AGC TGT TTT TCC CAA CAA ATA TAT GGT GTT GTG TAT GGG AAT 137

Ser Cys Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn

35 40

GTA ACT TTC CAT GTA CCA AGC AAT GTG CCT TTA AAA GRG GTC 179

Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val

50

CTA TGG AAA AAA CAA AAG GAT ARA GTT GCA GAA CTG GAA AAT 221

Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn

60 65

TCT GAA TTC AGA GCT TTC TCA TCT TTT AAA AAT AGG GTT TAT 263

Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg Val Tyr

75 80

TTA GAC ACT GTG TCA GGT AGC CTC ACT ATC TAC AAC TTA ACA 305

Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr

90 95

HU 211 476 A9

TCA TCA GAT

GAA Glu 100

GAT Asp

GAG Glu

TAT Tyr

GAA Glu

ATG Met 105

GAA Glu

TCG Ser

CCA Pro

AAT Asn

ATT Ile 110

347

Ser

Ser Asp

ACT

GAT

ACC

ATG

AAG

TTC

TTT

CTT

TAT

GTG

CTT

GAG

TCT

CTT

389

Thr

Asp

Thr

Met

Lys

Phe

Leu

Tyr

Val

Leu

Glu

Ser

Leu

115

120

CCA

TCT

CCC

ACA

CTA

ACT

TGT

GCA

TTG

ACT

AAT

GGA

AGC

ATT

431

Pro

Ser

Pro

Thr

Leu

Thr

Cys

Alá

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile

125

130

135

GAA

GTC

CAA

TGC

ATG

ATA

CCA

GAG

CAT

TAC

AAC

AGC

CAT

CGA

473

Glu

Val

Gin

Cys

Met

Ile

Pro

Glu

His

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

140

145

150

GGA

CTT

ATA

ATG

TAG

TCA

TGG

GAT

TGT

CCT

ATG

GRG

CAA

TGT

515

Gly

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp

Cys

Pro

Met

Glu

Gin

Cys

155

160

165

AAA

CGT

AAC

TCA

ACC

AGT

ATA

TAT

TTT

AAG

ATG

GAA

AAT

GRT

557

Lys

Arg

Asn

Ser

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

170

175

180

CTT

CCA

CAA

AAA

ATA

CAG

TGT

ACT

CTT

AGC

AAT

CCA

TTA

TTT

599

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

Leu

Phe

185

190

AAT

ACA

TCA

ATC

ATT

TTG

ACA

ACC

TGT

ATC

CCR

AGC

641

Asn

Thr

Ser

Ile

Leu

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser

195

200

205

AGC

GGT

CAT

TCA

AGA

CAC

AGA

TAT

GCA

CTT

ATA

CCC

ATA

CCA

683

Ser

Gly

His

Ser

Arg

His

Arg

Tyr

Alá

Leu

Ile

Pro

Ile

Pro

210

215

220

TTA

GCA

GTA

ATT

ACA

TGT

ATT

GTG

CTG

TAT

ATG

AAT

GGT

725

Leu

Alá

Val

Ile

Thr

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

225

230

235

ATG TAT GCT TTT TAAAACAAAA TAGTTTGAAA ACTTGCATTG TTTTCCAAAG 777 Met Tyr Alá Phe

240

GTCAGAAAAT AGTTTAAGGA TGAAAATAAA GTTTGAAATT TTAGACATTT 827

GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAGC GGCCGC 863

12. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 240 aminosavmaradék (B) Típus: aminosav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia

Met Val Alá Gly Ser Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly 15 10

HU 211 476 A9

Val

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

15

20

25

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Ile

Tyr

Gly

Val

Tyr

Gly

Asn

30

35

40

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

45

50

Leu

Trp

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Alá

Glu

Leu

Glu

Asn

55

60

65

Ser

Glu

Phe

Arg

Alá

Phe

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

Val

Tyr

70

75

80

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

85

90

95

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

100

105

110

Thr

Asp

Thr

Met

Lys

Phe

Leu

Tyr

Val

Leu

Glu

Ser

Leu

115

120

Pro

Ser

Pro

Thr

Leu

Thr

Cys

Alá

Leu

Thr

Asn

Gly

Ser

Ile

125

130

135

Glu

Val

Gin

Cys

Met

Ile

Pro

Glu

His

Tyr

Asn

Ser

His

Arg

140

145

150

Gly

Leu

Ile

Met

Tyr

Ser

Trp

Asp

Cys

Pro

Met

Glu

Gin

Cys

155

160

165

Lys

Arg

Asn

Ser

Thr

Ser

Ile

Tyr

Phe

Lys

Met

Glu

Asn

Asp

170

175

180

Leu

Pro

Gin

Lys

Ile

Gin

Cys

Thr

Leu

Ser

Asn

Pro

Leu

Phe

185

190

Asn

Thr

Ser

Ile

Leu

Thr

Cys

Ile

Pro

Ser

195

200

205

Ser

Gly

His

Ser

Arg

His

Arg

Tyr

Alá

Leu

Ile

Pro

Ile

Pro

210

215

220

Leu

Alá

Val

Ile

Thr

Cys

Ile

Val

Leu

Tyr

Met

Asn

Gly

225

230

235

Met Tyr Alá Phe 240

13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia

CTCTTTTAAA GGCACATACA CAACACCATA 30

14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem

HU 211 476 A9 (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia AACTTTATCC TTTTGATTGC TTGGTACATG 30

15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia AGCTCTGAAT TCAGATTTTT TCCATAGGAC 30

16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia TAAATAAACC CTATTATTTT CCAGTTCTGC 30

17. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 17. számú szekvencia GTAGATAGTG AGGCTTTTAA AAGATGAGAA 30

18. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 18. számú szekvencia ATACTCATCT TCATCACCTG ACACAGTGTC 30

19. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 19. számú szekvencia GGTATCAGTA ATATTTGATG ATGTTAAGTT 30

20. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 20. számú szekvencia AGACTCAAGC ACATAGGCG ATTCCATTTC 30

21. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 21. számú szekvencia CAATGCACAA GTTAGAAGAA AGAACTTCAT 30

22. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 22. számú szekvencia CATGCATTGG ACTTCTGTGG GAGATGGAAC 30

23. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 23. számú szekvencia TCCTCGATGG CTGTTAATGC TTCCATTAGT 30

24. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 24. számú szekvencia CATAGGACAA TCCCAGTAAT GCTCTGGTAT 30

25. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 25. számú szekvencia TATACTGGTT GAGTTTGAGT ACATTATAAG 30

26. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

HU 211 476 A9 (xi)A szekvencia leírása: 26. számú szekvencia TTGTGGAAGA TCATTACGTT TACATTGCTC 30

27. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 27. számú szekvencia TAATGGATTG CTAAGTTCCA TCTTAAAATA 30

28. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői (A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 28. számú szekvencia TGTCAAAATG ATTGAAGTAC ACTGTATTT 30

29. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus : nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 29. számú szekvencia TCTTGAATGA CCGCTTGATG TTGTATTAAA 30

30. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 30. számú szekvencia ATACTCATCT TCATCATACA CAACACCATA 30

31. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 31. számú szekvencia CATAGGACAA TCCCATGATG ATGTTAAGTT 30

32. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 30 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 32. számú szekvencia TCTTGAATGA CCGCTTGAGT ACATTATAAG 30

33. számú szekvencia vázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 33 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 33. számú szekvencia

Ser	Leu	Thr	He	Tyr	Asn	Leu	Thr	Ser
1				5
Ser	Asp	Glu	Asp	Glu
10
Tyr	Glu	Met	Glu	Ser	Pro	Asn	He	Thr
15					20
Asp	Thr	Met	Lys	Phe
	25
Phe	Leu	Tyr	Val
	30

34. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 34. számú szekvencia TCGTC GAC AAA ACT CAC ACA TGC C 24

Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5

35. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 6 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 35. számú szekvencia Asp Lys Thr His Thr Cys 1 5

36. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 24 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 36. számú szekvencia GCAAATGAGT GCGGCGGCCG CCAA 24

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 115 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem

HU 211 476 A9 (xi) A szekvencia leírása: 37. számú szekvencia GCGGCCGCGG TCCAACCACC AATCTCAAAG CTTGGTRCCC GGGAATTCAG 5 0

ATCTGCAGCA TGCTCGAGCT CTAGATATCG ATTCCATGGA TCCTCACATC 100

CCAATCCGCG GCCGC 115

38. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 33 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egy szálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 38. számú szekvencia GAGGCGGCCG CC ATG GTT GCT GGG AGC GAC GCG 3 3

Met Val Alá Gly Ser Asp Alá 1 5

39. számú szekvenciavázlal (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 7 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 39. számú szekvencia

Met 1	Val	Alá	Gly	Ser 5	Asp	Alá
		ATG	GTT	GCT	GGG	AGC	GAC	GCG
		Met	Val	Alá	Gly	Ser	Asp	Alá
		1				5
GTC	CTC	AGC	GTG	GTC	TGC	CTG	CTG	CAC
Val	Leu	Ser	Val	Val	Cys	Leu	Leu	His
		15					20
AGC	TGT	TTT	TCC	CAA	CAA	ATA	TAT	GGT
Ser	Cys	Phe	Ser	Gin	Gin	Ile	Tyr	Gly
			30					35
GTA	ACT	TTC	CAT	GTA	CCA	AGC	AAT	GTG
Val	Thr	Phe	His	Val	Pro	Ser	Asn	Val
				45
CTA	TGG	AAA	AAA	CAA	AAG	GAT	AAA	GTT
Leu	Trp	Lys	Lys	Gin	Lys	Asp	Lys	Val
55					60
TCT	GAA	TTC	AGA	GCT	TTC	TCA	TCT	TTT
Ser	Glu	Phe	Arg	Alá	Phe	Ser	Ser	Phe
	70					75
TTA	GAC	ACT	GTG	TCA	GGT	AGC	CTC	ACT
Leu	Asp	Thr	Val	Ser	Gly	Ser	Leu	Thr
		85					90
TCA	TCA	GAT	GAA	GAT	GAG	TAT	GAA	ATG
Ser	Ser	Asp	Glu	Asp	Glu	Tyr	Glu	Met
			100					105

40. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 26 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 40. számú szekvencia 10 AAGTCGACAT AAAGAAAGAA CTTCAT 26

41. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 14 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 41. számú szekvencia 20 TCGACGCGGC CGCG 14

42. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 1050 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Szál: egyszálú (D) Topológia: lineáris (iii) Elméleti: nem; (iv) Antiszensz: nem (xi) A szekvencia leírása: 42. számú szekvencia

GGG Gly	CGG Arg	GCC Alá 10	CTG Leu	GGG Gly	36
TGC	TTT	GGT	TTC	ATC	78
Cys	Phe	Gly	Phe 25	Ile
GTT	GTG	TAT	GGG	AAT	120
Val	Val	Tyr	Gly	Asn 40
CCT	TTA	AAA	GAG	GTC	162
Pro 50	Leu	Lys	Glu	Val
GCA	GAA	CTG	GAA	AAT	204
Alá	Glu 65	Leu	Glu	Asn
AAA	AAT	AGG	GTT	TAT	246
Lys	Asn	Arg 80	Val	Tyr
ATC	TAC	AAC	TTA	ACA	288
Ile	Tyr	Asn	Leu 95	Thr
GAA	TCG	CCA	AAT	ATT	330
Glu	Ser	Pro	Asn	Ile

110

HU 211 476 A9

ACT GAT

ACC Thr

ATG Met

AAG Lys 115

TTC Phe

TTT Phe

CTT Leu

TAT Tyr

GTC Val 120

GAC Asp

AAA Lys

ACT Thr

CAC His

372

Thr

Asp

ACA

TGC

CCA

CCG

TGC

CCA

GCA

CCT

GAA

CTC

CTG

GGG

GGA

CCG

414

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Alá

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

125

130

135

TCA

GTC

TTC

CTC

TTC

CCC

CCA

AAA

CCC

AAG

GAC

ACC

CTC

ATG

456

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

140

145

150

ATC

TTC

CGG

ACC

CCT

GAG

GTC

ACA

TGC

GTG

GAC

GTG

498

He

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

155

160

165

AGC

CAC

GAA

GRC

CCT

GAG

GTC

AAG

TTC

AAC

TGG

TAC

GTG

GAC

540

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

170

175

180

GGC

GTG

GAG

GTG

CAT

AAT

GCC

AAG

ACA

AAG

CCG

CGG

GAG

582

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Alá

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

185

190

CAG

TAC

AAC

AGC

ACG

TAC

CGG

GTG

GTC

AGC

GTC

CTC

ACC

GTC

624

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

195

200

205

CTG

CAC

CAG

GAC

TGG

CTG

AAT

GGC

AAG

GAG

TAC

ARG

TGC

AAG

666

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

210

215

220

GTC

TCC

AAC

AAA

GCC

CTC

CCA

GCC

CCC

ATC

GAG

AAA

ACC

ATC

708

Val

Ser

Asn

Lys

Alá

Leu

Pro

Alá

Pro

He

Glu

Lys

Thr

He

225

230

235

TCC

AAA

GCC

AAA

GGG

CAG

CCC

CGA

GAA

CCA

CAG.

GTG

TAC

ACC

750

Ser

Lys

Alá

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

240

245

250

CTG

CCC

CCA

TCC

CGG

GAT

GAG

CTG

AAC

AAG

AAC

CAG

GTC

AGC

792

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

255

260

CTG

ACC

TGC

CTG

GTC

AAA

GGC

TTC

TAT

CCC

AGC

GAC

ATC

GCC

834

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

He

Alá

265

270

275

GTG

GAG

TGG

GAG

AGC

AAT

GGG

CAG

CCG

GAG

AAC

TAC

AAG

876

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

280

285

290

ACC

ACG

CCT

CCC

GTG

CTG

GAC

TCC

GAC

GGC

TCC

TTC

CTC

918

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

295

300

305

TAC

AGC

AAG

CTC

ACC

GTG

GAC

AAG

AGC

AGG

TGG

CAG

GGG

960

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gly

310

315

320

HU 211 476 A9

AAC Asn

GTC Val

TTC Phe

TCA Ser

TGC Cys 325

TCC Ser

GTG Val

ATG Met

CAT His

GAG Glu 330

GCT Alá

CTG Leu

CAC His

AAC Asn

1002

CAC

TAC

ACG

CAG

AAG

AGC

CTC

TCC

CTG

TCT

CCG

GGT

AAA

1041

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

335 340 345

TGAGTGCGG 1050

43. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 347 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 43. számú szekvencia

Met 1

Val

Alá

Gly

Ser 5

Asp

Alá

Gly

Arg

Alá 10

Leu

Gly

Val

Leu

Ser

Val

Cys

Leu

His

Cys

Phe

Gly

Phe

Ile

15

20

25

Ser

Cys

Phe

Ser

Gin

Ile

Tyr

Gly

Val

Tyr

Gly

Asn

30

35

40

Val

Thr

Phe

His

Val

Pro

Ser

Asn

Val

Pro

Leu

Lys

Glu

Val

45

50

Leu

Trp

Lys

Gin

Lys

Asp

Lys

Val

Alá

Glu

Leu

Glu

Asn

55

60

65

Ser

Glu

Phe

Arg

Alá

Phe

Ser

Phe

Lys

Asn

Arg

Val

Tyr

70

75

80

Leu

Asp

Thr

Val

Ser

Gly

Ser

Leu

Thr

Ile

Tyr

Asn

Leu

Thr

85

90

95

Ser

Asp

Glu

Asp

Glu

Tyr

Glu

Met

Glu

Ser

Pro

Asn

Ile

100

105

110

Thr

Asp

Thr

Met

Lys

Phe

Leu

Tyr

Val

Asp

Lys

Thr

His

115

120

Thr

Cys

Pro

Cys

Pro

Alá

Pro

Glu

Leu

Gly

Pro

125

130

135

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

140

145

150

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

155

160

165

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

170

175

180

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Alá

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

185 190

HU 211 476 A9

Gin 195	Tyr	Asn	Ser	Thr	Tyr 200	Arg	Val	Val	Ser
Leu	His 210	Gin	Asp	Trp	Leu	Asn 215	Gly	Lys	Glu
Val	Ser	Asn 225	Lys	Alá	Leu	Pro	Alá 230	Pro	Ile
Ser	Lys	Alá	Lys 240	Gly	Gin	Pro	Arg	Glu 245	Pro
Leu	Pro	Pro	Ser	Arg 255	Asp	Glu	Leu	Thr	Lys 260
Leu 265	Thr	Cys	Leu	Val	Lys 270	Gly	Phe	Tyr	Pro
Val	Glu 280	Trp	Glu	Ser	Asn	Gly 285	Gin	Pro	Glu
Thr	Thr	Pro 295	Pro	Val	Leu	Asp	Ser 300	Asp	Gly
Tyr	Ser	Lys	Leu 310	Thr	Val	Asp	Lys	Ser 315	Arg
Asn	Val	Phe	Ser	Cys 325	Ser 1	Val	Met	His	Glu 330
His 335	Tyr	Thr	Gin	Lys	Ser 340	Leu	Ser	Leu	Ser

Val 205	Leu	Thr	Val
Tyr	Lys 220	Cys	Lys
Glu	Lys	Thr 235	Ile
Gin	Val	Tyr	Thr 250
Asn	Gin	Val	Ser
Ser 275	Asp	Ile	Alá
Asn	Asn 290	Tyr	Lys
Ser	Phe	Phe 305	Leu
Trp	Gin	Gin	Gly 320
Alá	Leu	His	Asn
Pro	Gly	Lys

345

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Egy Xj-X₂ - (1. számú szekvencia) - Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly - Y aminosavszek- 40 venciájú polipeptid, amelyben:

X! jelentése hidrogénatom vagy metioni) csoport;

X₂ jelentése vegyértékkötés vagy egy olyan polipeptid, amely a

Val Alá Gly Ser Asp Alá Gly Arg Alá Leu Gly Val Leu 45 Ser Val Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe He Ser Cys Phe Ser Gin Gin He Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu His Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys 50 szekvencia (5. számú szekvencia) karboxi-terminális 1-77 aminosavaiból álló aminosavszekvenciát vagy annak egy részét tartalmazza;

Y jelentése hidroxicsoport vagy egy olyan polipeptid, amely a 55

Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr Ser Ser Asp Glu Asp

Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp Thr Met

Lys Phe Phe Leu Tyr Val szekvencia (33. számú szekvencia) amino-terminális 1-32 aminosavaiból álló aminosavszekvenciát vagy annak egy részét tartalmazza; 60 és a polipeptid egy olyan variánsa, amelyben az előző aminosavak közül egy vagy több konzervatív módon szubsztituált, deletált vagy derivatizált, és az említett polipeptid képes a CD2-höz kötődni.
2. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelyben X₂jelentése vegyértékkötés vagy egy olyan polipeptid, amely a

Phe Ser Gin Gin Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gin Lys Asp Lys Val Alá Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Alá Phe Ser Ser Phe Lys szekvencia (2. számú szekvencia) karboxi-terminális 1-50 aminosavaiból álló aminosavszekvenciát vagy annak egy részét tartalmazza;

Y jelentése hidroxicsoport vagy egy olyan polipeptid, amely a

Ser Leu Thr He Tyr Asn Leu Thr Ser Ser szekvencia (3. számú szekvencia) amino-terminális 110 aminosavaiból álló aminosavszekvenciát vagy annak egy részét tartalmazza; és a polipeptid egy olyan variánsa, amelyben az előző aminosavak közül egy vagy több konzervatív módon szubsztituált, deletált vagy derivatizált, és az említett polipeptid képes a CD2-höz kötődni.

HU 211 476 A9
3. Az 1. igénypont szerinti polipeptid a 10. számú szekvencia 29-120 aminosavai, a 10. számú szekvencia 29-108 aminosavai, a 10. számú szekvencia 48108 aminosavai és a 7. számú szekvencia aminosavai által meghatározott aminosavszekvenciájú polipeptidek által alkotott csoportból választva.
4. A 2. igénypont szerinti polipeptid, amely a Lys Asn Arg Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr He Thr aminosavszekvenciát (7. számú szekvencia) tartalmazza.
5. Egy izolált DNS szekvencia, amely egy, az 1., 2., 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet kódol.
6. Egy, az LFA-3 CD2-kötő doménjét kódoló izolált DNS szekvencia, amelynek szekvenciája:

(5') (6. számú szekvencia): AATAGGGlTl ATTTAGAC TGTGTCAGGT (3').
7. Egy, az LFA-3 CD2-kötő doménjét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó izolált DNS szekvencia a pPYM57. pPMDRM54-6, pPMDRM55-9, pPMDRM56-C. pPMDRM-15, pPYM63-4, pPYM65-8, pPMDRM 100-4, pPMDRM 101-1, pPMDRM 102-8 és pPMDRM3-10 DNS inszertumai által alkotott csoportból választva.
8. Egy, az 5., 6. vagy 7. igénypont szerinti DNS szekvenciát és egy expressziós kontroll szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekula, amelyben az az expressziós kontroll szekvencia működőképesen kapcsolódik a DNS szekvenciához.
9. Egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidek aminosavszekvenciáját tartalmazó aminoterminális régióval és egy, az LFA-3-tól eltérő fehérje vagy polipeptid egy doménjét tartalmazó karboxi-terminális régióval rendelkező fúziós fehérje.
10. A 9. igénypont szerinti fúziós fehérje, amelyben a karboxi-terminális régió egy immunglobulin Fc régiójának legalább egy részét tartalmazza.
11. A 10. igénypont szerinti fúziós fehérje, amelyben az immunglobulin Fc régiójának egy része egy csuklórégiót és a C_H2 és C_H3 konstans doméneket tartalmazza.
12. A 10. igénypont szerinti fúziós fehérje, amelyben az immunglobulin Fc régiójának egy része egy olyan csuklórégió egy részét tartalmazza, amely képes intermolekuláris diszulfidkötések kialakítására, és a C_h2 és C_h3 konstans doméneket.
13. A 12. igénypont szerinti fúziós fehérje, amely a 43. számú szekvencia 29-347 aminosavainak felel meg.
14. Egy, a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjét kódoló, izolált DNS szekvencia.
15. Egy, a 14. igénypont szerinti DNS szekvenciát és egy expressziós kontroll szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekula, amelyben az expressziós kontroll szekvencia működőképesen kapcsolódik a DNS szekvenciához.
16. A 15. igénypont szerinti rekombináns DNS molekula, a pSAB152 plazmid és a pMDR(92)Ig-3 plazmid által alkotott csoportból választva.
17. Egy CD2-höz kötődni képes multimer fehérje, amely (a) két vagy több, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidből, (b) két-vagy több, a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjéből vagy (c) egy vagy több, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidből és egy vagy több, a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjéből áll.
18. Eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy azt a lépést tartalmazza, mely szerint a 8., 15. vagy 16. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejtet szaporítunk.
19. A 8., 15. vagy 16. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejt.
20. Eljárás CD2⁺ sejtek, vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjét hordozó fehérjék jelzésére, azzal jellemezve, hogy az említett eljárás tartalmazza azt a lépést, melyben a CD2⁺ sejteket vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjét tartalmazó fehérjéket az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti polipepliddel, vagy a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjével inkubáljuk.
21. Eljárás oldatok tisztítására, beleértve az LFA-3 CD2-kötő doménjétől eltérő epitopokat felismerő antiLFA-3 ellenanyagokat tartalmazó szérumokat, azzal jellemezve, hogy tartalmazza azt a lépést, melyben az anti-LFA-3 ellenanyagok oldatát egy anti-LFA-3 deléciós mutáns fehérjével hozzuk érintkezésbe, amely fehérjét az alábbi csoportból választjuk: M57, M55, M56, PIM3, Ml00, vagy ezek kombinációja, olyan körülmények között, amelyek kedvezőek az ellenanyag-antitest komplex kialakulásához, majd az említett oldatból eltávolítunk minden keletkezett ellenanyag-fehérje komplexet.
22. Eljárás CD2⁺ sejtek, vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjét tartalmazó fehérjék izolálására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépést tartalmazza: egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet vagy a

9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjét egy kromatográfiás szubsztráthoz kapcsoljuk, majd a CD2⁺ sejteket tartalmazó sejtszuszpenziót, vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjét tartalmazó fehérjék oldatát érintkezésbe hozzuk az említett szubsztráttal, olyan körülmények között, amelyek kedveznek az LFA3/CD2 komplex kialakulásának.
23. Gyógyszerkészítmény, amely egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet vagy egy, a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjét és egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaz.
24. Diagnosztikai kit CD2⁺ sejtek vagy LFA-3-kötő fehérjék kimutatására, azzal jellemezve, hogy reagensként egy, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét vagy egy, a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjét tartalmaz.
25. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, vagy a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása T-sejt aktiválás gátlására.
26. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid, vagy a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása perifériális vér limfociták szaporodásának gátlására.
27. Eljárás T-limfocita válaszok kiváltására in vivő,

HU 211 476 A9 azzal jellemezve, hogy egy emlősállatnak az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet, vagy a 9-13. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet adjuk be.
28. Az 5., 6. vagy 7. igénypont szerinti DNS szekvenciát és egy expressziós kontroll szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekula, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS molekula lényegében ugyanaz, mint amit a 2. példában ismertettünk.
29. A 14. igénypont szerinti DNS szekvenciát és egy expressziós kontroll szekvenciát tartalmazó rekombináns DNS molekula, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS molekula lényegében ugyanaz, mint amit all. példában ismertettünk.
30. Eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépést tartalmazza: a 8., 15. vagy 16. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejtet szaporítjuk, amely módszer

5 lényegében azonos azzal, amelyet a 2. vagy 12. példában ismertettünk.
31. A 8., 15. vagy 16. igénypont szerinti rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt lényegében ugyanaz,

10 mint amelyet a 2. vagy 12. példában ismertettünk.
32. Eljárás CD2⁺ sejtek, vagy a CD2 LFA-3-kötő doménjét tartalmazó fehérjék jelzésére, azzal jellemezve, hogy az említett eljárás lényegében ugyanaz, mint amelyet a 14. példában ismertettünk.