PT1496939E

PT1496939E - ''ácido nucleico de cea modificado e vectores de expressão''

Info

Publication number: PT1496939E
Application number: PT03719662T
Authority: PT
Inventors: Mark Parrington; Linong Zhang; Beni Rovinski; Linda R Gritz; Trish Greenhalgh
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2003-04-09
Publication date: 2007-11-22
Also published as: ES2290449T3; DE60315628D1; CN1658899B; WO2003085087A8; US20070082391A1; AU2003223527A1; EP1864691A1; EP1496939B1; ATE369895T1; CN1658899A; WO2003085087A2; CY1109926T1; AU2003223527B2; EP1864691B1; EP1496939A4; WO2003085087A3; DE60315628T2; ATE517122T1; EP1496939A2; US7786278B2

Description

ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Ácido nucleico de CEA modificado e vectores de expressão"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a um ácido nucleico codificando um polipéptido e à utilização do ácido nucleico ou polipéptido na prevenção e/ou tratamento de cancro. Em particular, o presente invento refere-se a vectores melhorados para a inserção e expressão de genes estranhos codificando antigénios tumorais para utilização em tratamento imunoterapêutico de cancro.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Houve um tremendo aumento nos últimos anos no desenvolvimento de vacinas de cancro com antigénios associados a tumores (TAA) devido aos grandes avanços na identificação de moléculas baseadas no perfil de expressão de células tumorais primárias e normais com o auxilio de várias técnicas tais como os "mícroarrays" de alta densidade, SEREX, imuno-histoquimica (IHC), RT-PCR, hibridação in situ (ISH) e microscopia de captura laser (Rosenberg, Immunity, 1999; Sgroi et al., 1999; Schena et al., 1995; Offringa et al., 2000). Os TAA são antigénios expressos ou sobre-expressos por células tumorais e podem ser específicos de um ou de vários tumores por exemplo o antigénio CEA é expresso em cancros colorrectais, da mama e do pulmão. Sgroi et al. (1999) identificaram vários genes diferencialmente expressos em células de carcinomas invasivos e metastáticos com a utilização combinada de microdissecção de captura laser e “microarrays" de ADNc. Vários sistemas de distribuição como ADN ou vírus podem ser utilizados para vacinação terapêutica contra cancros humanos (Bonnet et al., 2000) e podem provocar respostas imunitárias e também quebrar a tolerância imunitária contra TAA. As células tumorais podem ser tornadas mais imunogénicas através da inserção de transgenes codificando moléculas co-estimuladoras das células T tais como B7.1 ou citoquinas IFNgama, IL-2, GM-CSF etc. A co-expressão de um TAA e de uma citoquina ou uma molécula co-estimuladora pode desenvolver uma vacina terapêutica eficaz 2 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ (Hodge et al., 95; Bronte et al., 1995; Chamberlain et al., 1996) .

Existe a necessidade na arte de reagentes e metodologias úteis na estimulação de uma resposta imunitária para prevenir ou tratar cancros. Os presentes inventos proporcionam reagentes e metodologias que superam muitas das dificuldades verificadas por outros na tentativa de tratar cancros tais como o cancro. Em particular, o presente invento proporciona uma nova sequência de codificação para CEA. Esta sequência nucleotidica, CEA(6D)-1,2, inclui modificações da sequência que eliminam a expressão de formas truncadas de CEA expressas a partir de tais vectores. Uma tal sequência modificada é desejada pelos peritos na arte para melhorar os protocolos de expressão e imunização para CEA.

SUMÁRIO DO INVENTO E aqui descrito um alvo imunogénico para administração a um paciente para prevenir e/ou tratar cancro. Em particular, tal como é aqui descrito, o alvo imunogénico é um antigénio tumoral CEA ("TA") e/ou um antigénio associado a angiogénese ("AA"). Numa concretização, o alvo imunogénico é codificado por uma sequência nucleotidica de CEA modificada (CEA (6D) — 1,2) que melhora a expressão de CEA em células transfectadas. É descrito que o TA e/ou o AA são administrados a um paciente como um ácido nucleico contido num plasmídeo ou noutro vector de distribuição, tal como um vírus recombinante. 0 TA e/ou o AA podem também ser administrados em combinação com um estimulador imunitário, tal como uma molécula co-estimuladora ou adjuvante. É proporcionado um vector de expressão compreendendo a sequência nucleotidica CEA (6D)-1,2 tal como ilustrada em SEQ ID NO:24.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura IA. Ilustração do plasmídeo p3'H6MCEA compreendendo a sequência de codificação de CEA com a modificação 6D sob o controlo do promotor parcial H6. B. Ilustração do plasmídeo pSEl544.9 (pUC18-mCEA repetição 1). 3 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ 3 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ Figura repetição 1 Figura repetição 1 Figura Figura repetição 2 Figura repetição 2 Figura repetições. Figura 2a) . 2. Ilustração do plasmídeo pSEl616.44 (pUC18-mCEA-modificada). 3. Ilustração do plasmídeo pSEl658.15 (p3'H6MCEA-modificada). 4. Ilustração do plasmídeo pBSmCEA. 5. Ilustração do plasmídeo pSEl686.1 (pUCl8 mCEA modificado). 6. Ilustração do plasmídeo pSE 1696.1 (pUC18 mCEA modificada). 7. Ilustração do plasmídeo p3'H6modMCEA-la e 2a 8. Ilustração do plasmídeo pNVQH6MCEA (6D Ia e

Figuras 9A-D. Comparação da sequência nucleotídica de CAP(6D) e CAP(6D)-1,2. As diferenças entre as sequências estão sublinhadas.

Figura 10. Análise de PCR para confirmar a presença de CAP(6D)-1,2 em ADN de NYVAC.

Figura 11. Immunoblot ilustrando a falta de CEA truncado em células expressando CAP(6D)-1,2.

DESCRIÇÃO DETALHADA O presente invento proporciona reagentes e metodologias úteis para tratamento e/ou prevenção de cancro.

Numa concretização, o presente invento refere-se à indução ou estimulação de uma resposta imunitária contra um ou mais antigénios tumorais ("TA") para prevenir e/ou tratar o cancro. É descrito como um ou mais TA podem ser combinados. É descrito como a resposta imunitária resulta da expressão de um TA numa célula hospedeira após a administração de um vector de ácido nucleico codificando o antigénio tumoral ou o próprio 4 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ antigénio tumoral na forma de um péptido ou polipéptido, por exemplo.

Tal como aqui se utiliza, um "antigénio" é uma molécula (tal como um polipéptido) ou uma porção desta que produz uma resposta imunitária num hospedeiro ao qual foi administrado o antigénio. A resposta imunitária pode incluir a produção de anticorpos que se ligam a pelo menos um epitopo do antigénio e/ou a criação de uma resposta imunitária celular contra células que expressem um epitopo do antigénio. A resposta pode ser uma estimulação da uma resposta imunitária corrente, por exemplo, causando uma maior produção de anticorpos, a produção de anticorpos com maior afinidade para o antigénio ou uma maior resposta celular (i.e., mais células T) . Um antigénio que produza uma resposta imunitária pode ser alternativamente referido como sendo imunogénico ou um imunogénio. Na descrição do presente invento, um TA pode ser referido como um "alvo imunogénico". TA inclui tanto antigénios associados a tumores (TAA) como antigénios específicos de tumores (TSA), onde uma célula cancerosa é a fonte do antigénio. Um TAA é um antigénio que é expresso à superfície de uma célula tumoral em quantidades maiores que as observadas em células normais ou um antigénio que é expresso em células normais durante o desenvolvimento fetal. Um TSA é um antigénio que é único para células tumorais e não é expresso em células normais. 0 TA inclui ainda TAA ou TSA, fragmentos antigénicos destes e versões modificadas que retêm a sua antigenicidade.

Os TA são tipicamente classificados em cinco categorias de acordo com o seu padrão de expressão, a sua função ou origem genética: antigénios de cancro dos testículos (CT) (i.e., MAGE, NY-ESO-1); antigénios de diferenciação de melanócitos (i.e., Melan A/MART-1, tirosinase, gplOO);

antigénios mutacionais (i.e., MUC-1, p53, CDK-4); antigénios "próprios" sobre-expressos (i.e., HER-2/neu, p53); e antigénios virais (i.e., HPV, EBV). Para fins de prática do presente invento, um TA adequado é qualquer TA que induza ou estimule uma resposta imunitária antitumoral num hospedeiro a quem foi administrado o TA. TA adequados incluem, por exemplo, gplOO (Cox et ai., Science 264: 716-719, 1994), MART-1/Melan A 5 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347-352, 1994), gp75 (TRP-1) (Wang et al.r J. Exp. Med. 186: 1131-1140, 1996), tirosinase (Wolfel et al., Eur. J. Immunol. 24: 759-764,

1994) ; WO 01/75117; WO 01/75016; WO 01/75007), NY-ESO-1 (WO 98/14464; WO 99/18206), proteoglicano de melanoma (Hellstrom et al., J. Immunol. 130: 1467-1472, 1983), família de antigénios MAGE (i.e., MAGE-1, 2, 3, 4, 6, 12, 51; Van der

Bruggen et al., Science 254: 1643-1647, 1991); Pat. U.S. N'° 6235525; CN 1319611), antigénios da família bage (Boel et al., Immunity 2: 167-175, 1995), antigénios da família GAGE (i.e., GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 182: 689-698,

1995) ; Pat. U.S. N.° 6013765), antigénios da família RAGE (i.e., RAGE-1; Gaugler et al., Immunogenetics 44: 323-330, 1996) ; Pat. U.S. N.° 5939526), N-acetilglucosaminil- transferase-V (Guilloux et al., J. Exp. Med. 183: 1173-1183, 1996), pl5 (Robbins et al., J. Immunol. 154: 5944-5950, 1995), β-catenina (Robbins et al., J. Exp. Med. 183: 1185-1192, 1996), MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 7976-7980, 1995), quinase 4 dependente de ciclina (CDK4) (Wolfel et al., Science 269: 1281-1284, 1995), p21-ras (Fossum et al., Int. J. Câncer 56: 40-45, 1994), BCR-abl (Bocchia et al., Blood 85: 2680-2684, 1995), p53 (Theobald et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 92: 11993-11997, 1995), pl85 HER2/neu (erb-Bl; Fisk et al., J. Exp. Med. 181: 2109-2117, 1995), receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) (Harris et al., Breast Câncer Res. Treat 29: 1-2, 1994), antigénios carcinoembrionários (CEA) (Kwong et al., J. Natl. Câncer Inst. 85: 982-990, 1995) Pat. U.S. Nos 5756103; 5274087; 5571710; 6071716; 5698530; 6045802; EP 263933; EP 346710; e EP 784483); mucinas mutadas associadas a carcinomas (i.e., produtos do gene MUC-1; Jerome et al., J. Immunol. 151: 1654-1662, 1993); produtos do gene EBNA de EBV (i.e., EBNA-1; Rickinson et al., Câncer Surveys 13: 53-80, 1992); proteínas E7 e E6 do papilomavírus humano (Ressing et al., J. Immunol. 154: 5934-5943, 1995); antigénio específico da próstata (PSA; Xue et al., The Prostate 30: 73-78, 1997); antigénio de membrana específico da próstata (PSMA; israeli, et al., Câncer Res. 54: 1807-1811, 1994); epítopos ou antigénios idiotípicos, por exemplo, idiotipos de imunoglobulina ou idiotipos do receptor das células T (Chen et al., J. Immunol. 153: 4775-4787, 1994); KSA (Patente U.S. N° 5348887), cinesina 2 (Dietz, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 275(3): 731-8, 7 de Set. de 6 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ 2000), ΗΙΡ-55, factor anti-apoptótico TGFh-l (Toomey, et al., Br. J. Biomed. Sei. 58(3): 177-83, 2001), proteína tumoral D52 (Bryne J.A., et al., Genomics 35: 523-532, 1996), H1FT, NY-BR-1 (WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87, NY-BR-96 (Scanlan, M. "Serologic and Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens", em Câncer Vaccines 2000, Câncer Research Institute, New York, NY), AAC2-1 ou AAC2-2, incluindo "de tipo selvagem" (i.e., normalmente codificadas pelo genoma, de ocorrência natural), versões modificadas e mutadas bem como outros fragmentos e derivados destes. Qualquer um destes TA pode ser utilizado sozinho ou em combinação uns com os outros num protocolo de co-imunização.

Em certos casos, pode ser benéfico co-imunizar pacientes com ambos TA e outros antigénios, tais como antigénios associados a angiogénese ("AA") Um AA é uma molécula imunogénica (i.e., péptido, polipéptido) associada a células envolvidas na indução e/ou no desenvolvimento continuado de vasos sanguíneos. Por exemplo, pode ser expresso um AA numa célula endotelial ("EC"), que é um componente estrutural primário dos vasos sanguíneos. Quando o cancro é cancro, é preferido que o AA se encontre dentro ou próximo dos vasos sanguíneos que alimentam um tumor. A imunização de um paciente contra um AA resulta de preferência numa resposta imunitária anti-AA através da qual os processos angiogénicos que ocorrem próximo ou dentro dos tumores são impedidos e/ou inibidos. AA exemplificativos incluem, por exemplo, o factor de crescimento endotelial vascular (i.e., VEGF; Bernardini, et al., J. Urol. 166(4): 1275-9, 2201; Starnes, et al., J.

Thorac. Cardiovasc. Surg. 122(3): 518-23, 2001), o receptor de VEGF (i.e., VEGF-R, flk-l/KDR; Starnes, et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 122(3): 518-23, 2001), receptores de EPH (i.e., EPHA2; Gerety, et al., Cell 4: 403-414, 1999), receptor do factor de crescimento epidérmico (i.e., EGFR; Ciardeillo, et al., Clín. Câncer Res. 7(10): 2958-70, 2001), factor de crescimento dos fibroblastos básico (i.e., bFGF; Davidson, et al., Clin. Exp. Metastasis 18(6): 501-7, 2000; Poon, et al., Am. J. Surg. 182(3): 298-304, 2001), factor de crescimento derivado das plaquetas (i.e., PDGF-B), factor de crescimento de células endoteliais derivado das plaquetas (PD-ECGF; Hong, 7 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ et al., J. Mol. Med. 8(2): 141-8, 2001), factores de crescimento transformantes (i.e., TGF-α; Hong, et al., J. Mol. Med. 8(2): 141-8, 2001), endoglina (Balza, et al., Int. J. Câncer 94: 579-585, 2001), proteínas Id (Benezra, R., Trends Cardiovasc. Med. 11(6): 237-41, 2001), proteases tais como uPA, uPAR e metaloproteinases da matriz (MMP-2, MMP-9; Djonov, et al., J. Pathol. 195(2): 147-55, 2001), óxido nítrico-sintetase (Am. J. Ophthalmol. 132(4): 551-6, 2001), aminopeptidase (Rouslhati, E., Nature Câncer 2: 84-90, 2002), trombospondinas (i.e., TSP-1, TSP-2; Alvarez, et ai., Gynecol. Oncol. 82(2): 273-8, 2001; Seki, et al., Int. J. Oncol. 19(2): 305-10, 2001), k-ras (Zhang, et al., Câncer Res. 61(16): 6050-4, 2001), Wnt (Zhang, et al., Câncer Res. 61(16): 6050-4, 2001), quinases dependentes de ciclinas (CDK; Drug Resist. Updat. 3(2): 83-88, 2000), microtúbulos (Timar, et al., Path. Oncol. Res. 7(2): 85-94, 2001), proteínas de choque térmico (i.e., HSP90 (Timar, supra)) factores de ligação à heparina (i.e., heparinase; Gohji, et al., Int. J. Câncer 95(5): 295-301, 2001), sintetases (i.e., ATP-sintetase, timidilato-sintetase), receptores de colagénio, integrinas (i.e., ανβ3, ανβ5, αΐβΐ, α2β1, α5β1), ο proteoglicano de superfície NG2, AAC2-1 (SEQ ID NO:1) ou AAC2-2 (SEQ ID NO:2), entre outros, incluindo versões "de tipo selvagem" (i.e., normalmente codificados pelo genoma, de ocorrência natural), modificadas e mutadas bem como outros fragmentos e derivados destes. Qualquer um destes alvos pode ser adequado na prática do presente invento, sozinho ou em combinação uns com os outros ou com outros agentes.

Em certas concretizações, é utilizada uma molécula de ácido nucleico codificando um alvo imunogénico. A molécula de ácido nucleico pode compreender ou consistir numa sequência nucleotídica codificando um ou mais alvos imunogénicos ou fragmentos ou derivados destes, tal como a contida numa inserção de ADN num Depósito ATCC. O termo "sequência de ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma sequência de adn ou de arn. O termo engloba moléculas formadas a partir de qualquer um dos análogos de bases conhecidos de ADN e ARN tais como, mas não limitado a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudo-isocitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 8 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilamino-metiluracilo, di-hidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1- metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2- metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6- metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metiléster de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina e 2,6-diaminopurina, entre outros.

Uma molécula de ácido nucleico isolada é uma que: 1) está separada de pelo menos 50 porcento das proteínas, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais se encontra naturalmente quando o ácido nucleico total é isolado a partir das células fonte; 2) não está ligada a todo ou a uma porção de um polinucleótido ao qual a molécula de ácido nucleico está ligada na natureza; 3) está operativamente ligada a um polinucleótido com o qual não está ligada na natureza; e/ou 4) não ocorre na natureza como parte de uma sequência polinucleotídica maior. De preferência, a molécula de ácido nucleico isolada do presente invento é substancialmente livre de qualquer ou quaisquer outras moléculas de ácido nucleico contaminantes ou de outros contaminantes que se encontrem no seu ambiente natural que interfeririam com a sua utilização na produção de um polipéptido ou a sua utilização terapêutica, em diagnóstico, profilática ou em investigação. Tal como aqui se utiliza, o termo "de ocorrência natural" ou "nativo" ou "verificado naturalmente" quando utilizados em relação a materiais biológicos tais como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células hospedeiras e semelhantes, referem-se a materiais que se encontram na natureza e não são manipulados pelo homem. De modo semelhante, "de ocorrência não natural" ou "não nativo" tal como aqui utilizado refere-se a um material que não se verifica na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem. 9 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ A identidade de duas ou mais moléculas de ácido nucleico ou polipeptidicas é determinada através da comparação das sequências. Tal como conhecido na arte, "identidade" significa o grau de parentesco das sequências entre moléculas de ácido nucleico ou polipéptidos tal como determinado pelas coincidências entre as unidades que constituem as moléculas (i.e., nucleótidos ou resíduos de aminoácidos). A identidade mede a percentagem de coincidências idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com os alinhamentos dos intervalos (se houver) abordados por um determinado modelo matemático ou programa de computador (i.e., um algoritmo). A identidade entre as sequências de ácido nucleico pode também ser determinada através da capacidade da sequência aparentada para hibridar com a sequência de ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico isolada. Na definição de tais sequências, os termos "condições altamente rigorosas" e "condições moderadamente rigorosas" referem-se a procedimentos que permitem a hibridação de cadeias de ácido nucleico cujas sequências são complementares e excluem a hibridação de ácidos nucleicos significativamente mal emparelhados. Exemplos de "condições altamente rigorosas" para a hibridação e lavagem são cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M a 65-68°C ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M e formamida a 50% a 42°C (ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Anderson et al.r "Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach" Cap. 4 (irl Press

Limited)). O termo "condições moderadamente rigorosas" refere-se a condições sob as quais é capaz de se formar um dúplex de ADN com um maior grau de emparelhamentos errados de bases do que poderia ocorrer sob "condições altamente rigorosas". Condições moderadamente rigorosas exemplificativas são cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M a 50-65°C ou cloreto de sódio 0,015 M, citrato de sódio 0,0015 M e formamida a 20% a 37-50°C. Como exemplo, condições moderadamente rigorosas de 50°C em ião sódio 0,015 M permitirão cerca de 21% de emparelhamentos errados. Durante a hibridação, podem ser incluídos na hibridação outros agentes e tampões de lavagem com o objectivo de reduzir a hibridação não específica e/ou de fundo. Exemplos são albumina de soro bovino a 0,1%, polivinilpirrolidona a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, dodecilsulfato de sódio a 0,1%, NaDodS04 (SDS), Ficoll, 10 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão sujeito a ultra-sons (ou outro ADN não complementar) e sulfato de dextrano, embora outros agentes adequados possam também ser utilizados. A concentração e os tipos destes aditivos podem ser mudados sem que o rigor das condições de hibridação seja substancialmente afectado. As experiências de hibridação são habitualmente realizadas a pH 6,8-7,4; no entanto, a condições de força iónica típicas, a taxa de hibridação é quase independente do pH.

Em concretizações preferidas do presente invento, são utilizados vectores para transferir uma sequência de ácido nucleico codificando um polipéptido para uma célula. Um vector é qualquer molécula utilizada para transferir uma sequência de ácido nucleico para uma célula hospedeira. Em certos casos, é utilizado um vector de expressão. Um vector de expressão é uma molécula de ácido nucleico que é adequada para transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácido nucleico que dirigem e/ou controlam a expressão das sequências de ácido nucleico transferidas. A expressão inclui, mas não se limita a processos tais como transcrição, tradução e processamento se estiverem presentes intrões. Os vectores de expressão compreendem tipicamente uma ou mais sequências flanqueadoras operativamente ligadas a uma sequência de ácido nucleico heteróloga codificando um polipéptido. As sequências flanqueadoras podem, por exemplo, ser homólogas (i.e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heterólogas (i.e., de espécies diferentes da espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbridas (i.e., uma combinação de sequências f lanqueadoras de mais de uma fonte) ou sintéticas.

Uma sequência flanqueadora é de preferência capaz de efectuar a replicação, transcrição e/ou tradução da sequência de codificação e está operativamente ligada a uma sequência de codificação. Tal como aqui se utiliza, o termo operativamente ligado refere-se a uma ligação de elementos polinucleotídicos numa relação funcional. Por exemplo, um promotor ou estimulador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afectar a transcrição da sequência de codificação. No entanto, uma sequência flanqueadora não necessita de ser necessariamente contígua à sequência de 11 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ codificação, desde que funcione correctamente. Assim, por exemplo, sequências intervenientes não traduzidas contudo transcritas podem estar presentes entre uma sequência promotora e a sequência de codificação e a sequência promotora pode ainda ser considerada operativamente ligada à sequência de codificação. De modo semelhante, uma sequência estimuladora pode estar situada a montante ou a jusante da sequência de codificação e afectar a transcrição da sequência.

Em certas concretizações, é preferível que a sequência flanqueadora seja uma região reguladora da transcrição que dirija uma expressão génica de elevado nível na célula alvo. A região reguladora da transcrição pode compreender, por exemplo, um elemento promotor, estimulador, silenciador, repressor ou combinações destes. A região reguladora da transcrição pode ser constitutiva, específica do tecido ou específica do tipo celular (i.e., a região dirige níveis maiores de transcrição num tipo de tecido ou célula em comparação com outro) ou regulável (i.e., que responde à interacção com um composto tal como tetraciclina). A fonte de uma região reguladora da transcrição pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, desde que a sequência flanqueadora funcione numa célula provocando a transcrição de um ácido nucleico dentro dessa célula. Uma ampla variedade de regiões reguladoras da transcrição pode ser utilizada na prática do presente invento.

Regiões reguladoras da transcrição adequadas incluem o promotor de CMV (i.e., o promotor inicial imediato de CMV); promotores de genes eucarióticos (i.e., o gene da ovalbumina da galinha indutível por estrogénio, os genes de interferão, o gene da tirosina-aminotransferase indutível por glucocorticóides e o gene da timidina-quinase); e os principais promotores iniciais e tardios dos genes de adenovírus; a região promotora inicial de SV40 (Bernoist e Chambon, Nature 290: 304-10, 1981); o promotor contido na repetição terminal longa (LTR) 3' do vírus do sarcoma de Rous (RSV) (Yamamoto, et al., Cell 22: 787-97, 1980); o promotor da timidina-quinase do vírus de herpes simples (HSV-TK) (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1444-45, 1981); as sequências reguladoras do gene da metalotioneína (Brinster et 12 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ al., Nature 296: 39-42, 1982); vectores de expressão procarióticos tais como o promotor da beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75: 3727-31, 1978); ou o promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25, 1983). As regiões de controlo da transcrição especificas do tecido e/ou do tipo celular incluem, por exemplo, a região de controlo do gene da elastase I que está activa nas células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38: 639-46, 1984; Ornitz et al., Cold Spríng Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409, 1986; MacDonald, Hepatology 7: 425-515, 1987); a região de controlo do gene da insulina que está activa nas células beta pancreáticas (Hanahan, Nature 315: 115-22, 1985); a região de controlo do gene da imunoglobulina que está activa em células linfóides (Grosschedl et al., Cell 38: 647-58, 1984; Adames et al.,

Nature 318: 533-38, 1985; Alexander et al., Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44, 1987); a região de controlo do virus do tumor mamário de ratinho em células testiculares, da mama, linfóides e mastócitos (Leder et al., Cell 45: 485-95, 1986); a região de controlo do gene da albumina no fígado (Pinkert et al., Genes and Devei. 1: 268-76, 1987); a região de controlo do gene da alfa-feto-proteína no fígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48, 1985; Hammer et al., Science 235: 53-58, 1987); a região de controlo do gene da alfa-l-antitripsina no fígado (Kelsey et al., Genes and Devei. 1: 161-71, 1987); a região de controlo do gene da beta-globina em células mielóides (Mogram et al., Nature 315: 338-40, 1985; Kollias et al., Cell 46: 89-94, 1986); a região de controlo do gene da proteína básica da mielina em oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al., Cell 48: 703-12, 1987); a região de controlo do gene da cadeia leve 2 da miosina no músculo-esquelético (Sani, Nature 314: 283-86, 1985); a região de controlo do gene da hormona libertadora gonadotrófica no hipotálamo (Mason et al., Science 234: 1372-78, 1986) e o promotor da tirosinase em células de melanoma (Hart, I., Semin. Oncol. 23(1): 154-8,

Fev. de 1996; Siders, et al., Câncer Gene Ther. 5(5): 281-91, Set-Out de 1998), entre outros. Outros promotores adequados são conhecidos na arte.

Tal como descrito acima, os estimuladores podem também ser sequências flanqueadoras adequadas. Os estimuladores são elementos do ADN de acção em eis, habitualmente com cerca de 13 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ 10-300 pb de comprimento, que actuam sobre o promotor aumentando a transcrição. Os estimuladores são tipicamente independentes da orientação e da posição, tendo sido identificadas sequências de codificação controladas tanto a 5' como a 3'. São conhecidas várias sequências estimuladoras disponíveis de genes de mamífero (i.e., globina, elastase, albumina, alfa-fetoproteína e insulina). De modo semelhante, o estimulador de SV40, o estimulador do promotor inicial de citomegalovírus, o estimulador de polioma e os estimuladores de adenovírus são úteis com sequências promotoras eucarióticas. Embora um estimulador possa ser unido no vector numa posição a 5' ou a 3' da sequência de codificação de ácido nucleico, situa-se tipicamente num local a 5' do promotor. Outros estimuladores adequados são conhecidos na arte e seriam aplicáveis ao presente invento.

Ao preparar reagentes do presente invento, as células podem necessitar de ser transfectadas ou transformadas. A transfecção refere-se à tomada de ADN estranho ou exógeno por uma célula e foi transfectada uma célula quando o ADN exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são bem conhecidas na arte (i.e., Graham et al., Virology 52: 456, 1973; Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory 1989; Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier, 1986); e Chu et al., Gene 13: 197, 1981). Tais técnicas podem ser utilizadas para introduzir uma ou mais porções de ADN exógeno em células hospedeiras adequadas. É descrito que a transfecção de uma célula resulta na transformação dessa célula. Uma célula está transformada quando existe uma mudança numa característica da célula, estando transformada quando foi modificada para conter um novo ácido nucleico. Após a transfecção, o ácido nucleico transfectado pode recombinar-se com o da célula integrando-se fisicamente num cromossoma da célula, pode ser mantido transientemente como elemento epissómico sem ser replicado ou pode replicar-se independentemente como um plasmídeo. Uma célula está estavelmente transformada quando o ácido nucleico é replicado com a divisão da célula. 14 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ São também descritos alvos imunogénicos isolados na forma de polipéptidos. Um polipéptido é considerado isolado quando: 1) foi separado de pelo menos 50 porcento dos polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais se encontra naturalmente quando isolado da célula fonte; 2) não está ligado (através de interacção covalente ou não covalente) a todo ou a uma porção de um polipéptido ao qual o "polipéptido isolado" está ligado na natureza; 3) está operativamente ligado (através de interacção covalente ou não covalente) a um polipéptido com o qual não está ligado na natureza; ou 4) não ocorre na natureza. De preferência, o polipéptido isolado é substancialmente livre de quaisquer outros polipéptidos contaminantes ou outros contaminantes que se encontram no seu ambiente natural que interfeririam com a sua utilização terapêutica, em diagnóstico, profiláctica ou em investigação.

Os polipéptidos imunogénicos alvo podem ser polipéptidos maduros, tal como aqui definido, e podem ou não ter um resíduo de metionina amino-terminal, dependendo do método através do qual são preparados. São ainda contemplados polipéptidos relacionados tais como, por exemplo, fragmentos, variantes (i.e., alélicas, de processamento), ortólogos, homólogos e derivados, por exemplo, que possuam pelo menos uma caracteristica ou actividade (i.e., actividade, antigenicidade) do alvo imunogénico. Estão também relacionados os péptidos, que se referem a uma série de resíduos de aminoácidos contíguos possuindo uma sequência correspondente a pelo menos uma porção do polipéptido da qual a sua sequência é derivada. Em concretizações preferidas, o péptido compreende cerca de 5-10 aminoácidos, 10-15 aminoácidos, 15-20 aminoácidos, 20-30 aminoácidos ou 30-50 aminoácidos. Numa concretização mais preferida, um péptido compreende 9-12 aminoácidos, adequados para apresentação às moléculas de MHC de Classe I, por exemplo.

Um fragmento de um ácido nucleico ou polipéptido compreende uma truncagem da sequência (i.e., nucleotídica ou polipeptídica) no terminal amino (com ou sem uma sequência líder) e/ou no terminal carboxilo. Os fragmentos podem também incluir variantes (i.e., alélicas, de processamento), ortólogos, homólogos e outras variantes possuindo uma ou mais 15 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ adições ou substituições ou deleções internas de aminoácidos em comparação com a sequência parental. Em concretizações preferidas, as truncagens e/ou deleções compreendem cerca de 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos ou mais. Os fragmentos polipeptidicos assim produzidos compreenderão cerca de 10 aminoácidos, 25 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, 60 aminoácidos, 70 aminoácidos ou mais. Tais fragmentos polipeptidicos podem compreender opcionalmente um resíduo de metionina amino-terminal. Será apreciado que tais fragmentos podem ser utilizados, por exemplo, para gerar anticorpos ou respostas imunitárias celulares aos polipéptidos imunogénicos alvo.

Uma variante é uma sequência possuindo uma ou mais substituições, deleções e/ou adições na sequência em comparação com a sequência objecto. As variantes podem ser de ocorrência natural ou construídas artificialmente. Tais variantes podem ser preparadas a partir das moléculas de ácido nucleico correspondentes. Em concretizações preferidas, as variantes possuem de 1 a 3, ou de 1 a 5, ou de 1 a 10, ou de 1 a 15, ou de 1 a 20, ou de 1 a 25, ou de 1 a 30, ou de 1 a 40, ou de 1 a 50, ou mais de 50 substituições, inserções, adições e/ou deleções de aminoácidos.

Uma variante alélica é uma das várias formas alternativas de ocorrência natural possíveis de um gene ocupando um dado locus num cromossoma de um organismo ou de uma população de organismos. Uma variante de processamento é um polipéptido gerado a partir de um de vários transcritos de ARN resultantes do processamento de um transcrito primário. Um ortólogo é um ácido nucleico ou sequência polipeptidica semelhante de outra espécie. Por exemplo, as versões de ratinho e humana de um polipéptido alvo imunogénico podem ser consideradas ortólogas uma da outra. Um derivado de uma sequência é um que é derivado de uma sequência parental, possuindo essas sequências substituições, adições, deleções ou variantes quimicamente modificadas. As variantes podem também incluir proteínas de fusão, que se referem à fusão de uma ou mais primeiras sequências (tais como um péptido) no terminal amino ou carboxilo de pelo menos uma outra sequência (tal como um péptido heterólogo). 16 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ "Semelhança" é um conceito relacionado com identidade, excepto que a semelhança se refere a uma medida de parentesco que inclui tanto coincidências idênticas como coincidências de substituições conservativas. Se duas sequências polipeptidicas têm, por exemplo, 10/20 aminoácidos idênticos e o restante são todas substituições não conservativas, então a percentagem de identidade e semelhança seria para ambas de 50%. Se no mesmo exemplo existirem cinco posições mais onde existam substituições conservativas, então a percentagem de identidade permanece 50%, mas a percentagem de semelhança seria de 75% (15/20). Portanto, em casos onde existem substituições conservativas, a percentagem de semelhança entre dois polipéptidos será maior que a percentagem de identidade entre estes dois polipéptidos.

As substituições podem ser conservativas ou não conservativas ou qualquer combinação destas. As modificações de aminoácidos conservativas na sequência de um polipéptido (e as correspondentes modificações às sequências nucleotídicas) podem produzir polipéptidos possuindo caracteristicas funcionais e químicas semelhantes às de um polipéptido parental. Por exemplo, uma "substituição de aminoácidos conservativa" pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo por um resíduo não nativo que tenha pouco ou nenhum efeito no tamanho, polaridade, carga, hidrofobicidade ou hidrofilicidade do resíduo de aminoácido nessa posição e, em particular, não resulta em menor imunogenicidade. Substituições de aminoácidos conservativas adequadas são mostradas na Tabela I. 17 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

Tabela ι

Resíduos Originais Substituições Exemplificativas Substituições Preferidas Ala Vai, Leu, Ile Vai Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg Ile Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu Leu Norleucina, Ile, Vai, Met, Ala, Phe Ile Lys Arg, Ácido 1,4-Diaminobutírico, Gin, Asn Arg Met Leu, Phe, Ile Leu Phe Leu, Vai, Ile, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Vai Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Um perito na arte será capaz de determinar as variantes adequadas do polipéptido utilizando técnicas bem conhecidas. Para identificação das áreas adequadas da molécula que podem ser mudadas sem destruir a actividade biológica (i.e., ligação a MHC, imunogenicidade), um perito na arte pode atingir áreas que se julguem ser importantes para essa actividade. Por exemplo, quando são conhecidos polipéptidos semelhantes com actividades semelhantes da mesma espécie ou de outras espécies, um perito na arte pode comparar a sequência de aminoácidos de um polipéptido com tais polipéptidos semelhantes. Ao efectuar tais análises, pode-se identificar 18 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ resíduos e porções das moléculas que são conservados entre péptidos semelhantes. Será apreciado que seria menos provável que mudanças em áreas da molécula que não são conservadas relativamente a tais polipéptidos semelhantes afectassem adversamente a actividade biológica e/ou a estrutura de um polipéptido. De modo semelhante, os resíduos necessários para a ligação a MHC são conhecidos e podem ser modificados para melhorar a ligação. No entanto, modificações que resultem em menor ligação a MHC não serão apropriadas na maioria das situações. Um perito na arte saberá também que, mesmo em regiões relativamente conservadas, pode-se substituir resíduos de ocorrência natural por aminoácidos quimicamente semelhantes ao mesmo tempo que se mantém a actividade. Portanto, mesmo áreas que possam ser importantes para a actividade biológica ou para a estrutura podem ser sujeitas a substituições de aminoácidos conservativas sem destruir a actividade biológica ou sem afectar adversamente a estrutura do polipéptido.

Outras variantes preferidas dos polipéptidos incluem as variantes de glicosilação em que o número e/ou o tipo de locais de glicosilação foi alterado em comparação com a sequência de aminoácidos objecto. Numa concretização, as variantes polipeptídicas compreendem um número maior ou menor de locais de glicosilação ligados em N que a sequência de aminoácidos objecto. Um local de glicosilação ligado em N caracteriza-se pela sequência Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado por x pode ser qualquer resíduo de aminoácido excepto prolina. A substituição dos resíduos de aminoácidos para criar esta sequência proporciona um potencial novo local para a adição de uma cadeia de hidratos de carbono ligada em N. Alternativamente, substituições que eliminem esta sequência removerão uma cadeia de hidratos de carbono ligada em N existente. É também proporcionado um rearranjo das cadeias de hidratos de carbono ligadas em N em que um ou mais locais de glicosilação ligados em N (tipicamente os que são de ocorrência natural) são eliminados e é criado um ou mais novos locais ligados em N. Para afectar a glicosilação ligada em 0 de um polipéptido, modificar-se-ia resíduos de serina e/ou treonina.

Variantes adicionais preferidas incluem variantes de cisteína, em que um ou mais resíduos de cisteína são 19 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ suprimidos ou substituídos por outro aminoácido (p. ex., serina) em comparação com o conjunto de sequências de aminoácidos objecto. As variantes de cisteína são úteis quando os polipéptidos têm de ser dobrados de novo numa conformação biologicamente activa tal como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. As variantes de cisteína têm geralmente menos resíduos de cisteína que a proteína nativa e têm tipicamente um número par para minimizar as interacções resultantes de cisteínas desemparelhadas.

Tal como também descrito, os polipéptidos isolados do presente invento incluem segmentos de polipéptidos de fusão que auxiliam na purificação dos polipéptidos. As fusões podem ser feitas no terminal amino ou no terminal carboxilo da variante polipeptídica objecto destes. As fusões podem ser directas sem qualquer molécula ligante ou adaptadora ou podem ser através de uma molécula ligante ou adaptadora. Uma molécula ligante ou adaptadora pode ter um ou mais resíduos de aminoácidos, tipicamente de cerca de 20 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos. Uma molécula ligante ou adaptadora pode também ser desenhada com um local de clivagem para uma endonuclease de restrição de ADN ou para uma protease para permitir a separação das porções fundidas. Será apreciado que uma vez construídos, os polipéptidos de fusão podem ser derivados de acordo com os métodos aqui descritos. Segmentos de fusão adequados incluem, entre outros, domínios de ligação a metais (p. ex., um segmento de poli-histidina), domínios de ligação a imunoglobulina (i.e., domínios de ligação a Proteína A, Proteína G, células T, células B, receptor de Fc ou anticorpo da proteína do complemento), domínios de ligação a açúcares (p. ex., domínios de ligação a maltose) e/ou um domínio "marcador" (i.e., pelo menos uma porção de α-galactosidase, um péptido marcador estrep, um péptido marcador T7, um péptido FLAG ou outros domínios que possam ser purificados utilizando compostos que se liguem ao domínio, tais como anticorpos monoclonais). Este marcador é tipicamente fundido com o polipéptido após expressão do polipéptido e pode servir como meio para purificação por afinidade da sequência do polipéptido de interesse a partir da célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser alcançada, por exemplo, através de cromatografia em coluna utilizando anticorpos contra o marcador como matriz de afinidade. Opcionalmente, o 20 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ marcador pode ser subsequentemente removido da sequência purificada do polipéptido de interesse através de vários meios tais como a utilização de certas peptidases para clivagem. Tal como descrito abaixo, podem também ser feitas fusões entre um TA e um componente co-estimulador tal como as quimiocinas CXC10 (IP-10), CCL7 (MCP-3) OU CCL5 (RANTES), por exemplo.

Um motivo de fusão pode estimular o transporte de um alvo imunogénico para um compartimento de processamento de MHC, tal como o retículo endoplasmático. Estas sequências, referidas como sequências de transdução ou transcitose, incluem sequências derivadas de tat de HIV (ver Kim et al., J. Immunol. 159: 1666, 1997), antennapedia de Drosophila (ver Schutze-Redelmeier et al., J. Immunol. 157: 650, 1996) ou a proteína period-1 humana (hPERl; em particular, SRRHHCRSKAKRSRHH).

Adicionalmente, o polipéptido ou variante deste pode ser fundido com um polipéptido homólogo para formar um homodímero ou a um polipéptido heterólogo para formar um heterodímero. Péptidos e polipéptidos heterólogos incluem, mas não se limitam a: um epítopo para permitir a detecção e/ou o isolamento de um polipéptido de fusão; uma proteína receptora transmembranar ou uma porção desta, tal como um domínio extracelular ou um domínio transmembranar e intracelular; um ligando ou uma porção deste que se ligue a uma proteína receptora transmembranar; uma enzima ou uma porção desta que seja cataliticamente activa; um polipéptido ou péptido que promova a oligomerização, tal como um domínio de fecho de leucina; um polipéptido ou péptido que aumente a estabilidade, tal como uma região constante de imunoglobulina; e um polipéptido que possua uma actividade terapêutica diferente da do polipéptido ou variante deste.

Pode ser vantajoso combinar uma sequência de ácido nucleico codificando um alvo imunogénico, polipéptido ou derivado deste com um ou mais componentes co-estimuladores tais como proteínas da superfície celular, citoquinas ou quimiocinas numa composição do presente invento. 0 componente co-estimulador pode ser incluído na composição como um polipéptido ou como um ácido nucleico codificando o polipéptido, por exemplo. Moléculas co-estimuladoras adequadas 21 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ incluem, por exemplo, polipéptidos que se ligam a membros da família CD28 (i.e., CD28, ICOS; Hutloff, et al., Nature 397: 263-265, 1999; Peach, et al., J. Exp. Med. 180: 2049-2058, 1994) tais como os polipéptidos de ligação a CD28 B7.1 (CD80; Schwartz, 1992; Chen et al., 1992; Ellis, et al., J. Iimunol. 156(8): 2700-9) e B7. 2 (CD86; Ellis, et al., J. Immunol. 156(8): 2700-9); polipéptidos que se ligam a membros da família das integrinas (i.e., LFA-1 (CDlla/CD18); Sedwick, et al., J. Immunol. 162: 1367-1375, 1999; Wulfing, et al.,

Science 282: 2266-2269, 1998; Lub, et al., Immunol. Today 16: 479-483, 1995) incluindo membros da família ICAM (i.e., ICAM-1, 2 ou 3); polipéptidos que se ligam a membros da família CD2 (i.e., CD2, molécula de activação dos linfócitos de sinalização (CDwl50 ou "SLAM"; Aversa, et al., J. Immunol. 158: 4036-4044, 1997)) tal como CD58 (LFA-3; ligando de CD2; Davis, et al., Immunol. Today 17: 177-187, 1996) ou ligandos SLAM (Sayos, et al., Nature 395: 462-469, 1998); polipéptidos que se ligam ao antigénio termoestável (HSA ou CD24; Zhou, et al., Eur. J. Immunol. 27: 2524-2528, 1997); polipéptidos que se ligam a membros da família de receptores de TNF (TNFR) (i.e., 4-1BB (CD137; Vinay, et al., Semin. Immunol. 10: 481-489, 1998), 0X40 (CD134; Weinberg, et al., Semin. Immunol. 10: 471-480, 1998; Higgins, et al., J. Immunol. 162: 486-493, 1999) e CD27 (Lens, et al., Semin. Immunol. 10: 491-499, 1998)) tais como 4-1BBL (ligando de 4-1BB; Vinay, et al., Semin. Immunol. 10: 481-48, 1998; DeBenedette, et al., J.

Immunol. 158: 551-559, 1997), factor-1 associado a TNFR (TRAF-1; ligando de 4-1BB; Saoulli, et al., J. Exp. Med. 187: 1849-1862, 1998; Arch, et al., Mol. Cell Biol. 18: 558-565, 1998), TRAF-2 (ligando de 4-1BB e 0X40; Saoulli, et al., J. Exp. Med. 187: 1849-1862, 1998; Oshima, et al., Int. Immunol. 10: 517-526, 1998; Kawamata, et al., J. Biol. Chem. 273: 5808-5814, 1998), TRAF-3 (ligando de 4-1BB e 0X40; Arch, et al., Mol. Cell Biol. 18: 558-565, 1998; Jang, et al., Biochem. Biohys. Res. Commun. 242: 613-620, 1998; Kawamata, S. et al., J. Biol. Chem. 273: 5808-5814, 1998), OX40L (ligando de 0X40; Gramaglia et al., J. Immunol. 161: 6510-6517, 1998), TRAF-5 (ligando de 0X40; Arch et al., Mol. Cell Biol. 18: 558-565, 1998; Kawamata et al., J. Biol. Chem. 273: 5808-5814, 1998) e CD70 (ligando de CD27; Couderc et al., Câncer Gene Ther. 5(3): 163-75). CD154 (ligando de CD40 ou "CD40L"; Gurunathan, et 22 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ al., J. Immunol. 161: 4563-4571, 1998; Sine et al., Hum. Gene Ther. 12: 1091-1102, 2001) podem também ser adequados.

Uma ou mais citoquinas podem também ser componentes co-estimuladores adequados ou "adjuvantes", como polipéptidos ou sendo codificados por ácidos nucleicos contidos dentro das composições do presente invento (Parmiani, et al., Immunol. Lett. 74(1): 41-4, 15 de Set. de 2000; Berzofsky, et al.,

Nature Immunol. 1: 209-219). Citoquinas adequadas incluem, por exemplo, a interleucina-2 (IL-2) (Rosenberg, et al., Nature Med. 4: 321-327, 1998), IL-4, IL-7, IL-12 (revisto por

Pardoll, 1992; Harries, et al., J. Gene Med. 2(4): 243-9, Jul-Ago de 2000; Rao, et al., J. Immunol. 156: 3357-3365, 1996), IL-15 (Xin, et al., Vaccine 17: 858-866, 1999), IL-16 (Cruikshank, et al., J. Leuk. Biol. 67(6): 757-66, 2000), IL-18 (J. Câncer Res. Clin. Oncol. 127(12): 718-726, 2001), GM-CSF (CSF (Disis, et al., Blood 88: 202-210, 1996), factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), ou interferão gama (INF-γ) . Outras citoquinas podem também ser adequadas para a prática do presente invento, tal como é conhecido na arte.

Podem também ser utilizadas quimiocinas. Por exemplo, mostrou-se que proteínas de fusão compreendendo CXCL10 (IP-10) e CCL7 (MCP-3) fundidas com um antigénio próprio de tumor induzem imunidade antitumoral (Biragyn, et al., Nature Biotech. 17: 253-258, 1999). As quimiocinas CCL3 (ΜΙΡ-Ια) e CCL5 (RANTES) (Boyer, et al., Vaccine 17(Sup. 2): S53-S64, 1999) podem também ser úteis na prática do presente invento. Outras quimiocinas adequadas são conhecidas na arte. É também conhecido na arte que os mecanismos imunitários supressores ou reguladores negativos podem ser bloqueados, resultando em respostas imunitárias aumentadas. Por exemplo, mostrou-se que tratamento com anti-CTLA-4 (Shrikant, et al., Immunity 14: 145-155, 1996; Sutmuller, et al., J. Exp. Med. 194: 823-832, 2001), anti-CD25 (Sutmuller, supra), anti-CD4 (Matsui, et al., J. Immunol. 163: 184-193, 1999), a proteína de fusão ILl3Ra2-Fc (Terabe, et al., Nature Immunol. 1: 515-520, 2000) e combinações destes (i.e., anti-CTLA-4 e anti- CD25, Sutmuller, supra) sobre-regula respostas imunitárias antitumorais e seria adequado na prática do presente invento. 23 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

Qualquer um destes componentes pode ser utilizado sozinho ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, mostrou-se que uma combinação de CD80, ICAM-1 e LFA-3 ("TRICOM") pode potenciar respostas imunitárias anticancerosas (Hodge, et al., Câncer Res. 59: 5800-5807, 1999). Outras combinações eficazes incluem, por exemplo, IL-12 + GM-CSF (Ahlers, et al., J. Irmunol. 158: 3947-3958, 1997; Iwasaki, et al., J. Immunol. 158: 4591-4601, 1997), IL-12 + GM-CSF + TNF-α; (Ahlers, et al., Int. Immunol. 13: 897-908, 2001), CD80 + IL-12 (Fruend, et al., Int. J. Câncer 85: 508-517, 2000; Rao, et al., supra) e CD86 + GM-CSF + IL-12 (Iwasaki, supra) . Um perito na arte estaria ciente de combinações adicionais úteis na realização do presente invento. Adicionalmente, o perito estaria ciente dos reagentes ou métodos adicionais que podem ser utilizados para modular tais mecanismos. Estes reagentes e métodos, bem como outros conhecidos dos peritos na arte, podem ser utilizados na prática do presente invento.

Podem também ser utilizadas estratégias adicionais para melhorar a eficiência da imunização baseada em ácidos nucleicos, incluindo, por exemplo, a utilização de replicões virais auto-replicantes (Caley, et al., Vaccine 17: 3124-2135, 1999; Dubensky, et al., Mol. Med. 6: 723-732, 2000; Leitner, et al., Câncer Res. 60: 51-55, 2000), optimização de codões (Liu, et al., Mol. Ther. 1: 497-500, 2000; Dubensky, supra; Huang, et al., J. Vírol. 75: 4947-4951, 2001), electroporação in vivo (Widera, et al., J. Immunol. 164: 4635-3640, 2000), incorporação de motivos estimuladores CpG (Gurunathan, et al., Ann. Rev. Immunol. 18: 927-974, 2000; Leitner, supra) sequências para direccionamento para as vias endocítica ou de processamento da ubiquitina (Thomson, et al., J. Virol. 72: 2246-2252, 1998; Velders, et al., J. Immunol. 166: 5366-5373, 2001), regímenes de iniciação-reforço (Gurunathan, supra; Sullivan, et al., Nature 408: 605-609, 2000; Hanke, et al., Vaccine 16: 439-445, 1998; Amara, et al., Science 292: 69-74, 2001) e a utilização de vectores de distribuição às mucosas tais como Salmonella (Darji, et al., Cell 91: 765-775, 1997; Woo, et al., Vaccine 19: 2945-2954, 2001). Outros métodos são conhecidos na arte, alguns dos quais são descritos abaixo.

Agentes quimioterapêuticos, radiação e compostos anti-angiogénicos ou outros agentes podem também ser utilizados no 24 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ tratamento e/ou prevenção de cancro utilizando alvos imunogénicos (Sebti, et al.r Oncogene 19(56): 6566-7327, Dez. de 2000). Por exemplo, no tratamento de cancro da mama metastático, agentes quimioterapêuticos úteis incluem a ciclofosfamida, doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, navelbina, capecitabina e mitomicina C, entre outros. Uma combinação de regímenes quimioterapêuticos mostrou-se também eficaz incluindo ciclofosfamida + metotrexato + 5-fluorouracilo; ciclofosfamida + doxorrubicina + 5-fluorouracilo; ou ciclofosfamida + doxorrubicina, por exemplo. Outros compostos tais como prednisona, um taxano, navelbina, mitomicina C ou vinblastina foram utilizados por várias razões. A maioria dos pacientes de cancro da mama possui tumores positivos para o receptor de estrogénio (ER+) e nestes pacientes a terapia endócrina (i.e., tamoxifeno) é preferida em relação à quimioterapia. Para tais pacientes, são preferidos o tamoxifeno ou, como terapia de segunda linha, as progestinas (acetato de medroxiprogesterona ou acetato de megestrol). Os inibidores da aromatase (i.e., aminoglutetimida e análogos desta tais como letrozole) diminuem a disponibilidade do estrogénio necessário para manter o crescimento tumoral e podem ser utilizados como terapia endócrina de segunda ou terceira linha em certos pacientes.

Outros cancros podem requerer diferentes regímenes quimioterapêuticos. Por exemplo, o cancro colorrectal metastático é tipicamente tratado com Camptosar (irinotecano ou CPT-11), 5-fluorouracilo ou leucovorina, sozinhos ou em combinação uns com os outros. Inibidores de proteinases e de integrinas tais como os inibidores de MMP marimastato (British Biotech), COL-3 (Collagenex), Neovastat (Aeterna), AG3340 (Agouron), BMS-275291 (Bristol Myers Squibb), CGS 27023A (Novartis) ou os inibidores da integrina Vitaxin (Medimmune), ou MED1522 (Merck KgaA) podem também ser adequados para utilização. Como tal, o direccionamento imunológico de alvos imunogénicos associados a cancro colorrectal pode ser efectuado em combinação com um tratamento utilizando esses agentes quimioterapêuticos. De modo semelhante, agentes quimioterapêuticos utilizados para tratar outros tipos de cancro são bem conhecidos na arte e podem ser combinados com os alvos imunogénicos aqui descritos. 25 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

Muitos agentes anti-angiogénicos são conhecidos na arte e seriam adequados para co-administração com as vacinas alvo imunogénicas (ver, por exemplo, Timar, et al., Pathology Oncol. Res. 7(2): 85-94, 2001). Tais agentes incluem, por exemplo, agentes fisiológicos tais como factores de crescimento (i.e., ANG-2, NK1, 2, 4 (HGF), factor de crescimento transformante beta (TGF-β)), citoquinas (i.e., interferões tais como IFN-α, β, γ, factor das plaquetas 4 (PF-4), PR-39), proteases (i.e., fragmento do colagénio xvm clivado AT-III (Endostatina)), fragmento da plasmina

HmwKallikrein-d5 (Angiostatina), protrombina-Fl-2, TSP-1), inibidores de proteases (i.e., inibidor tecidual de metaloproteases tal como TIMP-1, 2, ou 3; maspina; inibidores do activador do plasminogénio tais como PAI-1; factor derivado do epitélio pigmentado (PEDF)), Tumstatin (disponível em ILEX, Inc.), produtos de anticorpos (i.e., os anticorpos de ligação ao colagénio HUIV26, HUI77, XL313; anti-VEGF; anti-integrina (i.e., Vitaxin, (Lxsys))) e glicosidases (i.e., heparinase-I, III) . Agentes "quimicamente" ou fisiologicamente modificados conhecidos ou que se crê terem potencial anti-angiogénico incluem, por exemplo, vinblastina, taxol, cetoconazole, talidomida, dolestatina, combrestatina A, rapamicina (Guba, et al., Nature Med. 8: 128-135, 2002), CEP-7055 (disponível em

Cephalon, Inc.), ácido acético de flavona, Bay 12-9566 (Bayer Corp.), AG3340 (Agouron, Inc.), CGS 27023A (Novartis), derivados de tetraciclina (i.e., COL-3 (Collagenix, Inc.), Neovastat (Aeterna), bms-275291 (Bristol-Myers Squibb), 5-fu de dose baixa, metotrexato (MTX) de dose baixa, irsofladina, radicicol, ciclosporina, captopril, celecoxib, polissacárido sulfatados com D45152, proteína catiónica (Protamine), péptido catiónico-VEGF, Suramina (naftilureia polissulfonatada), compostos que interferem com a função ou a produção de VEGF (i.e., SU5416 ou SU6668 (Sugen), PTK787/ZE2584 (Novartis),

Distamicina A, Angiozima (ribozima), isoflavonóides, derivados de estaurosporina, genisteína, EMD121974 (Merck KcgaA), tirfostinas, isoquinolonas, ácido retinóico, carboxiamidotriazole, TNP-470, octreótido, 2-metoxiestradiol, aminosteróis (i.e., esqualamina), análogos de glutationa (i.e., N-acetil-L-cisteína), combrestatina A-4 (Oxigene), agentes bloqueadores do receptor de Eph (Nature 414: 933-938, 2001), Rh-Angiostatina, Rh-Endostatina (WO 01/93897), péptidos RGD cíclico, disintegrina de acutina, benzodiazepenos, Ac 26 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ anti-avb3 humanizado, Rh-PAl-2, amilorida, p-amidobenzamidina, Ac anti-uPA, Ac anti-uPAR, L-fenilalanin-N-metilamidas (i.e., Batimistato, Marimastato), AG3340 e minociclina. Muitos outros agentes adequados são conhecidos na arte e podiam ser utilizados na prática do presente invento. 0 presente invento pode também ser utilizado em combinação com métodos "não tradicionais" de tratar cancro. Por exemplo, foi recentemente demonstrado que a administração de certas bactérias anaeróbicas pode auxiliar no atraso do crescimento tumoral. Num estudo, Clostridium novyi foi modificado para eliminar um gene de toxina transportado num epissoma fágico e administrado a ratinhos com tumores colorrectais (Dang, et al., PNAS USA 98(26): 15155-15160, 2001). Mostrou-se que em combinação com quimioterapia, o tratamento causa necrose tumoral nos animais. Os reagentes e metodologias aqui descritos neste pedido podem ser combinados com tais metodologias de tratamento.

Os ácidos nucleicos codificando os alvos imunogénicos podem ser administrados a pacientes através de qualquer uma de várias técnicas disponíveis. Vários vectores virais que foram utilizados com sucesso para introdução de um ácido nucleico num hospedeiro incluem retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados (AAV), herpesvírus e poxvírus, entre outros. É compreendido na arte que muitos desses vectores virais estão disponíveis na arte. Os vectores do presente invento podem ser construídos utilizando técnicas recombinantes padrão amplamente disponíveis a um perito na arte. Tais técnicas podem ser encontradas em referências de biologia molecular vulgares tais como "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), "Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991, Academic Press, San Diego, CA), e "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA).

Os vectores retrovirais preferidos são derivados de lentivírus bem como derivados de retrovírus de murídeo ou de aves. Exemplos de vectores retrovirais adequados incluem, por exemplo, o vírus da leucemia de murídeo de Moloney (MoMuLV), o vírus do sarcoma de murídeo de Harvey (HaMuSV), o vírus do 27 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ tumor mamário de murídeo (MuMTV), SIV, BIV, HIV e vírus do Sarcoma de Rous (RSV). Vários vectores retrovirais podem incorporar múltiplas sequências de ácido nucleico exógenas. Uma vez que os retrovírus recombinantes são deficientes, requerem auxílio para produzir partículas de vector infecciosas. Este auxílio pode ser proporcionado, por exemplo, através de linhas celulares ajudantes codificando genes estruturais dos retrovírus. Linhas celulares ajudantes adequadas incluem ψ2, PA317 e PA12, entre outras. Os viriões do vector produzidos utilizando tais linhas celulares podem então ser utilizados para infectar uma linha celular de tecido, tal como células NIH 3T3, para produzir grandes quantidades de viriões retrovirais quiméricos. Os vectores retrovirais podem ser administrados através de método tradicionais (i.e., injecção) ou através de implantação de uma "linha celular produtora" na vizinhança da população de células alvo (Culver, K., et ai., Hum. Gene Ther. 5(3): 343-79, 1994; Culver, K., et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 685-90; Oldfield, E., Hum. Gene Ther. 4(1): 39-69, 1993). A linha celular produtora é modificada para produzir um vector virai e liberta partículas virais na vizinhança da célula alvo. Uma porção das partículas virais libertadas contacta com as células alvo e infecta essas células, distribuindo assim um ácido nucleico do presente invento à célula alvo. Após a infecção da célula alvo, ocorre a expressão do ácido nucleico do vector.

Os vectores adenovirais provaram ser especialmente úteis para transferência de genes para células eucarióticas (Rosenfeld, M., et al., Science 252(5004): 431-4, 1991; Crystal, R., et al., Nat. Genet. 8(1): 42-51, 1994), para o estudo da expressão de genes eucarióticos (Levrero, M., et al., Gene 101(2): 195-202, 1991), o desenvolvimento de vacinas (Graham, F. e Prevec, L., Biotechnology 20: 363-90, 1992) e em modelos animais (Stratford-Perricaudet, L., et al., Bone Marrow Transplant. 9(Supl. 1): 151-2, 1992; Rich, D., et al., Hum. Gene Ther. 4(4): 461-76, 1993). As vias experimentais para administração de Ad recombinante a diferentes tecidos in vivo incluíram a instilação intratraqueal (Rosenfeld, M., et al., Cell 68(1): 143-55, 1992), injecção nos músculos (Quantin, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89(7): 2581-4, 1992), injecção intravenosa periférica (Herz, J., e Gerard, 28 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ R., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(7): 2812-6, 1993) e inoculação estereotática no cérebro (Le Gal La Salle, G., et al.f Science 259(5097): 988-90, 1993), entre outras.

Os vírus adeno-associados (AAV) demonstram um elevado nível de infecciosidade, um amplo espectro de hospedeiros e especificidade na integração no genoma da célula hospedeira (Hermonat, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81(20): 6466-70, 1984). E o vírus de Herpes Simples de tipo-1 (HSV-1) é ainda outro sistema vector atractivo, especialmente para utilizar no sistema nervoso devido a sua propriedade neurotrópica (Geller, A., et al., Trends Neurosci. 14(10): 428-32, 1991; Glorioso, et al., Mol. Bíotechnol. 4(1): 87-99, 1995; Glorioso, et al., Annu. Rev. Microbiol. 49: 675-710, 1995) . O poxvírus é outro vector de expressão útil (Smith, et al., Gene 25(1): 21-8, 1983; Moss, et al., Biotechnology 20: 345-62, 1992; Moss, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992; Moss, et al., Science 252: 1662-1667, 1991). Poxvírus que se mostrou serem úteis incluem vacínia, NYVAC, avipox, varíola aviária, varíola dos canários, ALVAC, e ALVAC(2), entre outros. O NYVAC (vP866) foi derivado da estirpe de vacina

Copenhaga do vírus vacínia através da deleção de seis regiões não essenciais do genoma codificando factores de virulência conhecidos ou potenciais (ver, por exemplo, Patente U.S. Nos 5364773 e 5494807) . Os loci da deleção foram também modificados como loci recipientes para a inserção de genes estranhos. As regiões suprimidas são: o gene da timidina- quinase (TK; J2R); região hemorrágica (u; B13R+B14R); a região do corpo de inclusão de tipo A (ATI; A26L); o gene da hemaglutinina (HA; A56R); a região do gene do espectro de hospedeiros (C7L-K1L); e a subunidade grande da ribonucleótido-redutase (I4L). O NYVAC é uma estirpe do vírus vacínia geneticamente modificada que foi gerada através da deleção específica de dezoito quadros de leitura abertos codificando produtos génicos associados a virulência e ao espectro de hospedeiros. Mostrou-se que o NYVAC é útil para expressão de TA (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 6265189). O NYVAC (vP866), vP994, vCP205, VCP1433, placZH6H4Lreverse, 29 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ pMPC6H6K3E3 e pC3H6FHVB foram também depositados na ATCC segundo as disposições do Tratado de Budapeste, com os números de acesso VR-2559, VR-2558, VR-2557, VR-2556, ATCC-97913, ATCC-97912 e ATCC-97914, respectivamente.

Virus recombinantes baseados em ALVAC (i.e., ALVAC-1 e ALVAC-2) são também adequados para utilizar na prática do presente invento (ver, por exemplo, Patente U.S. N.° 5756103). O ALVAC(2) é idêntico ao ALVAC(1) excepto que o genoma de ALVAC (2) compreende os genes E3L e K3L de vacinia sob o controlo dos promotores de vacinia (Patente U.S. N.° 6130066; Beattie et al., 1995a, 1995b, 1991; Chang et ai., 1992; Davies et al., 1993). Foi demonstrado que tanto ALVAC(l) como ALVAC(2) são úteis na expressão de sequências de ADN estranho, tais como TA (Tartaglia et al., 1993 a, b; Pat. U.S. N.° 5833975) . O ALVAC foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, número de acesso ATCC VR-2547.

Outro vector de poxvírus útil é TROVAC. O TROVAC refere-se a um vírus da varíola aviária atenuado que era um isolado clonado por placas fágicas derivado da estirpe de vacina FP-1 de vírus da varíola aviária que está licenciado para vacinação de pintos com 1 dia de idade. O TROVAC foi igualmente depositado sob os termos do Tratado de Budapeste na ATCC, número de acesso 2553.

Vectores plasmídicos "não virais" podem também ser adequados na prática do presente invento. Os vectores plasmídicos preferidos são compatíveis com células hospedeiras bacterianas, de insecto e/ou de mamífero. Tais vectores incluem, por exemplo, PCR-II, pCR3 e pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSH (Stratagene, La Jolla, CA), pETl5 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Paio Alto, CA), pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alpha (pub. PCT n.° wo 90/14363) e pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY) bem como derivados do plasmídeo Bluescript® (um fagemídeo baseado em COLE-1 de elevado número de cópias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), plasmídeos de clonagem por PCR desenhados para clonagem de produtos de PCR amplificados com Taq (p. ex., estojo de 30 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ clonagem TOPO™ ΤΑ®, derivados do plasmídeo PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Vectores bacterianos podem também ser utilizados com o presente invento. Estes vectores incluem, por exemplo, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille calmette guérin (BCG) e Streptococcus (ver por exemplo, WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796 e WO 92/21376). Muitos outros vectores e sistemas de expressão plasmidicos não virais são conhecidos na arte e podem ser utilizados no presente invento.

Técnicas de distribuição de ácidos nucleicos adequadas incluem complexos de ADN-ligando, complexos de adenovirus-ligando-ADN, injecção directa de ADN, precipitação com CaP04, técnicas de biolistica, electroporação e sistemas de dispersão coloidal, entre outros. Os sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, contas e sistemas baseados em lipidos incluindo emulsões de óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. 0 sistema coloidal preferido deste invento é um lipossoma, que é uma vesícula de membrana artificial útil como veículo de distribuição in vitro e in vivo. ARN, ADN e viriões intactos podem ser encapsulados dentro do interior aquoso e ser distribuídos a células numa forma biologicamente activa (Fraley, R., et al., Trends Biochem. Sei. 6: 77, 1981). A composição do lipossoma é habitualmente uma combinação de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de elevada temperatura de transição de fase, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Outros fosfolípidos ou outros lipidos podem também ser utilizados. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, da força iónica e da presença de catiões bivalentes. Exemplos de lipidos úteis na produção de lipossomas incluem compostos de fosfatidilo, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidileolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, e cerebrósidos e gangliósidos. Particularmente úteis são os diacilfosfatidilgliceróis, onde a porção lipídica contém de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono e é saturada. Fosfolípidos ilustrativos incluem fosfatidileolina, dipalmitoílfosfatidileolina diestearoílfosfatidileolina. 31 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

Um alvo imunogénico pode também ser administrado em combinação com um ou mais adjuvantes para reforçar a resposta imunitária. Adjuvantes exemplificativos são mostrados na Tabela I abaixo: Tabela i Tipos de Adjuvantes Imunológicos Tipo de Adjuvante Exemplos Gerais Exemplos Específicos/Referências 1 Tipo Gel Hidróxido/fosfato de alumínio ("adjuvantes de alúmen") (Aggerbeck e Heron, 1995) Fosfato de cálcio (Relyveld, 1986) 2 Microbiano Dipéptido de muramilo (MDP) (Chedid et al., 1986) Exotoxinas bacterianas Toxina da cólera (CT), toxina instável de E. coli (LT) (Freitag e Clements, 1999) Adjuvantes baseados em endotoxinas Monofosforil-lípido A (MPL) (Ulrich e Myers, 1995) Outros bacterianos Oligonucleótidos CpG (Corral e Petray, 2000), sequências de BCG (Krieg, et al., Nature 374: 576), toxóide do tétano (Rice, et al., J. Immunol. 2001, 167: 1558-1565) 3 Particulado microesferas poliméricas biodegradáveis (Gupta et al., 1998) Complexos imunoestimuladores (ISCOM) (Morein e Bengtsson, 1999) Lipossomas (Wassef et al., 1994) 4 Emulsão de óleo Adjuvante incompleto de (Jensen et al., 1998) e adjuvantes Freund baseados em tensioactivos

Emulsões microfluidizadas MF59 (Ott et al., 1995) SAF (Allison e Biars, 1992) (Allison, 1999) Saponinas QS-21 (Kensil, 1996) 5 Sintéticos Derivados do péptido de Murabutida (Lederer, 1986) muramilo Threony-MDP (Allison, 1997) Copolímeros de blocos não iónicos L121 (Allison, 1999) Polifosfazeno (PCPP) (Paine et al., 1995) Polinucleótidos sintéticos Poli A:U, Poli I:C (Johnson, 1994)

Os alvos imunogénicos do presente invento podem também ser utilizados para gerar anticorpos para utilizar em ensaios de investigação ou para imunoterapia. Outras utilizações serão aparentes para um perito na arte. 0 termo "anticorpo" inclui fragmentos de anticorpo, tal como são conhecidos na arte, incluindo Fab, Fab2, anticorpos de cadeia simples (por exemplo 32 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

Fv), anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos humanos, produzidos através de vários métodos tais como são conhecidos na arte. Os métodos de preparação e utilização de vários tipos de anticorpos são bem conhecidos dos peritos na arte e serão adequados na prática do presente invento (ver, por exemplo, Harlow, et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al., "Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable Protocol No. 1", 1998; Kohler e Milstein, Nature 256: 495, 1975; Jones et al., Nature 321: 522-525, 1986; Ricchmann et al., Nature 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593— 596, 1992; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536, 1988;

Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581, 1991; Cole et al., "Monoclonal

Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, pág. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95, 1991; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morrison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826, 1996; Lonberg e Huszar, Intern. Rev.

Immunol. 13: 65-93, 1995; bem como as Pat. U.S. Nos 4816567; 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; e 5661016. Os anticorpos ou derivados destes podem também ser conjugados com porções terapêuticas tais como fármacos citotóxicos ou toxinas, ou fragmentos activos destes tais como a cadeia A da difteria, a cadeia A da exotoxina, a cadeia A do rícino, a cadeia A da abrina, a curcina, a crotina, a fenomicina, a enomicina, entre outros. Os agentes citotóxicos podem também incluir radioquímicos. Os anticorpos e seus derivados podem ser incorporados em composições do presente invento para utilizar in vitro ou in vivo.

Os ácidos nucleicos, as proteínas ou derivados destes representando um alvo imunogénico podem ser utilizados em ensaios para determinar a presença de um estado de doença num paciente, para fazer um prognóstico ou para determinar a eficácia de um quimioterapêutico ou de outro regímen de tratamento. Os perfis de expressão, efectuados tal como é conhecido na arte, podem ser utilizados para determinar o nível relativo de expressão do alvo imunogénico. O nível de expressão pode então ser correlacionado com níveis básicos para determinar se uma determinada doença está presente no 33 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ paciente, ο prognóstico do paciente ou se um determinado regimen de tratamento é eficaz. Por exemplo, se o paciente estiver a ser tratado com um determinado regimen quimioterapêutico, um menor nivel de expressão de um alvo imunogénico nos tecidos do paciente (i.e., no sangue periférico) pode indicar que o regimen está a diminuir a carga cancerígena nesse hospedeiro. De modo semelhante, se o nível de expressão estiver a aumentar, pode ser necessário utilizar outra modalidade terapêutica. Numa concretização, podem ser ligadas a um biochip sondas de ácido nucleico correspondentes a um ácido nucleico codificando um alvo imunogénico, tal como é conhecido na arte, para a detecção e quantificação da expressão no hospedeiro. É também possível utilizar ácidos nucleicos, proteínas, derivados destes ou anticorpos para estes como reagentes em ensaios de pesquisa de fármacos. Os reagentes podem ser utilizados para avaliar o efeito de um candidato a fármaco na expressão do alvo imunogénico numa linha celular ou numa célula ou tecido de um paciente. A técnica de perfis de expressão pode ser combinada com técnicas de pesquisa de elevada tiragem para permitir uma rápida identificação dos compostos úteis e monitorizar a eficácia do tratamento com um candidato a fármaco (ver, por exemplo, Zlokarnik, et al., Science 279: 84-8, 1998). Os candidatos a fármacos podem ser compostos químicos, ácidos nucleicos, proteínas, anticorpos ou derivados destes, de ocorrência natural ou derivados sinteticamente. Os candidatos a fármacos assim identificados podem ser utilizados, entre outras utilizações, como composições farmacêuticas para administração a pacientes ou para utilização em mais ensaios de pesquisa. A administração de uma composição do presente invento a um hospedeiro pode ser conseguida utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas dos peritos na arte. A composição ou composições podem ser processadas de acordo com métodos convencionais de farmácia para produzir agentes medicinais para administração a pacientes, incluindo humanos e outros mamíferos (i.e., uma "composição farmacêutica"). A composição farmacêutica é de preferência feita na forma de uma unidade de dosagem contendo uma dada quantidade de ADN, partículas de vectores virais, polipéptidos ou péptidos, por 34 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ exemplo. Uma dose diária adequada para um humano ou outro mamífero pode variar amplamente dependendo da condição do paciente e de outros factores, mas, uma vez mais, pode ser determinada utilizando métodos de rotina. A composição farmacêutica pode ser administrada oralmente, parentericamente, através de spray de inalação, rectalmente, intranodalmente ou topicamente em formulações de unidades de dosagem contendo transportadores, adjuvantes e veículos convencionais farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "transportador farmaceuticamente aceitável" ou "transportador fisiologicamente aceitável" tal como aqui se utiliza refere-se a um ou mais materiais de formulação adequados para se alcançar ou aumentar a distribuição de um ácido nucleico, polipéptido ou péptido como composição farmacêutica. Uma "composição farmacêutica" é uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nucleico ou polipéptido. Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz" referem-se cada um à quantidade de um ácido nucleico ou polipéptido utilizada para induzir ou aumentar uma resposta imunitária eficaz. É preferido que composições do presente invento proporcionem a indução ou o aumento de uma resposta imunitária antitumoral num hospedeiro que proteja o hospedeiro do desenvolvimento de um tumor e/ou permita que o hospedeiro elimine do corpo um tumor existente.

Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser qualquer uma de várias formas incluindo, por exemplo, uma cápsula, um comprimido, uma suspensão ou liquido entre outros. Os líquidos podem ser administrados através de injecção como uma composição com transportadores adequados incluindo solução salina, dextrose ou água. 0 termo parentérico tal como aqui se utiliza inclui a administração subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-esternal, infusão ou intraperitoneal. Supositórios para administração rectal do fármaco podem ser preparados através da mistura do fármaco com um excipiente não irritante adequado tal como manteiga de cacau e polietilenoglicóis que são sólidos às temperaturas vulgares mas líquidos à temperatura rectal. 0 regímen de dosagem para imunização de um hospedeiro ou para de outro modo tratar um distúrbio ou uma doença com uma 35 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ composição deste invento baseia-se numa variedade de factores, incluindo o tipo de doença, a idade, o peso, o sexo, a condição médica do paciente, a gravidade da condição, a via de administração e o composto particular empregue. Por exemplo, um vector de poxvirus pode ser administrado como uma composição compreendendo ΙχΙΟ6 partículas infecciosas por dose. Assim, o regimen de dosagem pode variar amplamente, mas pode ser determinado rotineiramente utilizando métodos padrão.

Pode também ser utilizado um regimen de iniciação-reforço (WO 01/30382 Al) no qual o imunogénio direccionado é inicialmente administrado num passo de iniciação numa forma seguido de um passo de reforço no qual o imunogénio direccionado é administrado noutra forma. As formas do imunogénio direccionado nos passos de iniciação e de reforço são diferentes. Por exemplo, se o passo de iniciação utilizou um ácido nucleico, o reforço pode ser administrado como um péptido. De modo semelhante, quando um passo de iniciação utiliza um tipo de virus recombinante (i.e., ALVAC), o passo de reforço pode utilizar outro tipo de vírus (i.e., NYVAC). Este método de iniciação-reforço da administração mostrou induzir fortes respostas imunológicas.

Embora as composições do presente invento possam ser administradas como o único agente farmacêutico activo, podem também ser utilizadas em combinação com uma ou mais combinações ou agentes (i.e., outros alvos imunogénicos, moléculas co-estimuladoras, adjuvantes). Quando administrados em combinação, os componentes individuais podem ser formulados como composições farmacêuticas separadas ao mesmo tempo ou a tempos diferentes ou os componentes podem ser combinados como uma composição simples.

Preparações injectáveis, tais como suspensões aquosas ou oleaginosas injectáveis estéreis, podem ser formuladas de acordo com métodos conhecidos utilizando agentes de dispersão ou humidificantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injectável pode também ser uma solução injectável estéril ou uma suspensão num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável. Veículos e solventes adequados que podem ser empregues são água, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio, entre outros. Por exemplo, pode 36 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ ser preparado um vector virai tal como um poxvírus em NaCl a 0,4%. Adicionalmente, são convencionalmente empregues óleos fixados estéreis como solvente ou meio de suspensão. Para este fim, pode ser empregue qualquer óleo fixado estéril, incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos gordos tais como ácido oleico encontram utilização na preparação de injectáveis.

Para administração tópica, pode ser administrada uma dose tópica adequada de uma composição quatro e de preferência duas ou três vezes ao dia. A dose pode também ser administrada com dias de intervalo durante os quais não é aplicada qualquer dose. As composições adequadas podem compreender de 0,001% a 10% p/p, por exemplo, de 1% a 2% em peso da formulação, embora possa compreender tanto como 10% p/p, mas de preferência não mais de 5% p/p, e de maior preferência de 0,1% a 1% da formulação. Formulações adequadas para administração tópica incluem preparações liquidas ou semi-liquidas adequadas para penetração através da pele (p. ex., linimentos, loções, unguentos, cremes ou pastas) e gotas adequadas para administração no olho, ouvido ou nariz.

As composições farmacêuticas podem também ser preparadas numa forma sólida (incluindo grânulos, pós ou supositórios).

As composições farmacêuticas podem ser sujeitas a operações farmacêuticas convencionais tais como esterilização e/ou podem conter adjuvantes convencionais, tais como conservantes, estabilizantes, agentes humidificantes, emulsionantes, tampões, etc. As formas de dosagem sólidas para administração oral podem incluir cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto activo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem podem também compreender, tal como na prática normal, substâncias adicionais que não diluentes inertes, p. ex., agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio. No caso das cápsulas, dos comprimidos e das pílulas, as formas de dosagem podem também compreender agentes de tamponamento. Os comprimidos e as pílulas podem adicionalmente ser preparados com revestimentos entéricos. As formas de dosagem líquidas para administração oral podem incluir emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis, 37 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ contendo diluentes inertes vulgarmente utilizados na arte, tais como água. Tais composições podem também compreender adjuvantes, tais como agentes humidificantes, edulcorantes, aromatizantes e perfumes.

As composições farmacêuticas compreendendo um ácido nucleico ou polipéptido do presente invento podem tomar qualquer uma de várias formas e podem ser administradas através de qualquer uma de várias vias. Em concretizações preferidas, as composições são administradas através de uma via parentérica (intradérmica, intramuscular ou subcutânea) para induzir uma resposta imunitária no hospedeiro. Alternativamente, a composição pode ser administrada directamente num nódulo linfático (intranodal) ou massa tumoral (i.e., administração intratumoral). Por exemplo, a dose pode ser administrada subcutaneamente nos dias 0, 7 e 14. Métodos adequados para imunização utilizando composições compreendendo TA são conhecidos na arte, tal como mostrado para p53 (Hollstein et al., 1991), p21-ras (Almoguera et al., 1988), HER-2 (Fendly et al., 1990), antigénios associados a melanoma (MAGE-1; MAGE-2) (van der Bruggen et al., 1991), p97 (Hu et al., 1988), e antigénio carcinoembrionário (CEA) (Kantor et al., 1993; Fishbein et al., 1992; Kaufman et al., 1991), entre outros.

Concretizações preferidas de composições administráveis incluem, por exemplo, ácidos nucleicos ou polipéptidos em preparações liquidas tais como suspensões, xaropes ou elixires. As preparações injectáveis preferidas incluem, por exemplo, ácidos nucleicos ou polipéptidos adequados para administração parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular ou intravenosa tais como suspensões ou emulsões estéreis. Por exemplo, um poxvirus recombinante pode estar em mistura com um transportador, diluente ou excipiente adequado tal como água estéril, solução salina fisiológica, glucose ou semelhantes. A composição pode também ser proporcionada na forma liofilizada para reconstituição, por exemplo, em tampão salino aquoso, isotónico. Adicionalmente, as composições podem ser co-administradas ou administradas sequencialmente com outros agentes antineoplásicos, antitumorais ou anticancerosos e/ou com agentes que reduzem ou aliviam os efeitos adversos dos agentes antineoplásicos, antitumorais ou anticancerosos. 38 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ É também proporcionado um estojo compreendendo uma composição do presente invento. 0 estojo pode incluir um recipiente separado contendo um transportador, diluente ou excipiente adequado. 0 estojo pode também incluir um agente anticanceroso, antitumoral ou antineoplásico adicional e/ou um agente que reduza ou alivie os efeitos adversos dos agentes antineoplásicos, antitumorais ou anticancerosos para co-administração ou administração sequencial. Adicionalmente, o estojo pode incluir instruções para a mistura ou combinação dos ingredientes e/ou a administração.

Ter-se-á uma melhor compreensão do presente invento e das suas muitas vantagens a partir dos seguintes exemplos, dados para fins de ilustração. EXEMPLOS Exemplo 1 Ά. Modificação da repetição 1 de mCEA(6D) A presença de formas truncadas de CEA em células após expressão de CEA recombinante foi documentada. Este estudo é exposto para gerar sequências de ácido nucleico codificando CEA que não resultam na expressão de CEA truncado após expressão nas células. A criação e expressão de uma nova sequência de ácido nucleico codificando CEA, CAP(6D)-1,2, é descrita abaixo. 0 plasmideo p3'H6MCEA foi obtido em Virogenetics, Inc. Este plasmideo contém o gene de MCEA com a modificação 6D sob o controlo do promotor parcial de H6 (Fig. IA) . 0 fragmento NruI-BamHI de 912 pb de p3'H6MCEA foi clonado em pUC18 para formar o plasmideo pSEl544.9 (pUC18-mCEA repetição 1; Fig. 1B).

Os Oligos purificados por OPC 7524-7526, 7528-7533, 7535-7537 e 7567-7568 foram sujeitos a quinases e ligados para criar dois fragmentos que foram ligados para resultarem numa repetição 1 de mCEA modificada sintética de 464 pb flanqueada pelos locais Accl e BamHI. Este fragmento sintético da repetição 1 modificada foi clonado em pSE1544.9 Accl-Bamhl 39 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ para criar pSEl616.44 (pUC18-mCEA-repetição 1 modificada; Fig. 2). O fragmento EcoRV-BamHI de 904 pb de pSEl616.44 foi clonado de novo em p3'H6MCEA EcoRV-BamRI para formar pSEl658.15 (p3'H6MCEA-repetição 1 modificada; Fig. 3). B. Modificação da repetição 2 de mCEA(6D)

Um fragmento da repetição 2 modificada sintética foi criado através da utilização de um método designado ligação de genes através de extensão de sobreposições (SOE) e clonado em pBluescript-SK+, gerando pBSmCEA (Fig. 4). Os oligos utilizados para a modificação da repetição 2 são mostrados abaixo (secção IV, B). Os dois clones diferentes (pBS-mCEA-3 e pBS-mCEA-8) continham várias mutações pontuais. O fragmento Bamhl-EcoRI de 697 pb de pBS-mCEA-3 foi clonado em pUC18 BamRl-EcoRI para criar pSEl671.8. O fragmento Spel-Bsu36l de 591 pb de pBSmCEA-8 foi clonado em pSEl671.8 Spel-Bsu36l, gerando o plasmideo designado pSEl681.1. Foram efectuadas duas mutagéneses por PCR de local, utilizando o estojo de mutagénese dirigida ao local Quikchange de Stratagene com os oligos 7751 (GGACGGTAGTAGGTGTATGATGGAGATATAG TTGGGTCGTCTGGGCC) e 7760 (CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC), para corrigir as duas mutações pontuais restantes pSE1681.1. O clone corrigido foi designado pSE1686.1 (pUC18 mCEA repetição 2 modificada; Fig. 5).

Tal como observado recentemente, um codão de Alanina estava ausente do terminal 5' da segunda repetição no plasmideo p3'H6MCEA que continha CEA. Para conservar a consistência da sequência de aminoácidos de CEA, o codão de Alanina presente no plasmideo pSEl686.1 contendo a segunda repetição de CEA modificada foi retirado. Isto foi alcançado utilizando OS oligos 7802 (CGTGACGACGATTACCGTGTATGAGCCACCAAAAC CATTCATAAC) e 7803 (GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTC ACG) e o estojo de mutagénese dirigida ao local Quikchange de Stratagene. O plasmideo resultante, pSEl696.1 (pUC18 mCEA repetição 2 modificada; Fig. 6) foi confirmado através de sequenciação. O fragmento Bsu36l-BamHI de 694 pb de pSEl696.1 foi clonado no local Bsu36l-Bamhl de Psel658.15 para combinar as 40 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ repetições 1 e 2 modificadas. O plasmideo regenerado foi designado p3'H6modMCEA-la&2a repetições (Fig. 7). C. Construção do plasmideo dador de ALVAC pNVQH6MCEA (6ϋ1^&2^) O fragmento Nrul/Xhol de 2,2 kb de p3'H6modMCEA-la&2a repetições foi clonado no local NruI/Xhol de pNVQH6LSP-18, gerando pNVQH6MCEA(6Dla&2a; Fig. 8). A sequência de CEA modificada ("CAP(6D)-1,2") contida em pNVQH6MCEA é mostrada na Fig. 9. D. Expressão de CEA modificada

Para testar a estabilidade da sequência CAP(6D)-1,2 após expressão numa célula, o gene juntamente com o promotor H6 flanqueador foi amplificado por PCR utilizando pNVQHôMCEA(6Dla & 2a) como molde e dois oligos (8034LZ: CTGGCGCGCCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG; e 8035LZ: CTGGTACCAGAAAAA CTATATCAGAGCAACCCCAAC). O produto de PCR foi então clonado num plasmideo dador de NYVAC TK designado pLZTKl contendo os genes marcadores LacZ e KlL. Este vector foi especificamente produzido para a criação do virus recombinante em NYVAC através da utilização do método de pesquisa azul/branco. Após a recombinação in vitro entre o plasmideo dador pLZTKlmCEA(6D1a& 2a) e NYVAC, a sequência estranha CAP(6D)-1,2 e os genes marcadores são integrados no genoma de NYVAC. As placas fágicas contendo NYVAC recombinante intermediário com LacZ e mCEA surgem a azul. Foram então realizados vários ciclos de purificação de placas fágicas. O segundo acontecimento de recombinação retirou os genes marcadores resultando nas placas fágicas brancas finais contendo recombinantes com apenas a sequência CAP(6D)-1,2 mas sem genes marcadores (Fig. 10).

As placas fágicas brancas recombinantes e as placas azuis foram apanhadas para confirmação da expressão da sequência CAP(6D)-1,2. A infecção foi efectuada utilizando o vírus das respectivas placas fágicas e as células foram colhidas três dias após a infecção para preparação de ADN celular ou de lisado celular. Para isolamento de ADN recombinante de NYVAC, foi utilizado o reagente DNAzol® (GibcoBRL). Foi corrida uma PCR (Condição de PCR: 95°C (5 min) ^ [95°C (30 s) - 49°C 41 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ (30 s) -> 72°C (1 min)] 30 ciclos -► 72°C (7 min) - 4°C) para confirmar a existência da sequência CAP(6D)-1,2 no genoma de NYVAC recombinante. Os iniciadores utilizados foram 7569LZ (5'ttggatccatggagtctccctcggcc 3' iniciador directo) e 7570LZ (5'ttggatccctatatcagagcaacccc 3' iniciador inverso), que podem amplificar a CAP(6D)-1,2 inteira de 2106 pb.

As placas fágicas brancas recombinantes finais PRBC-III-2, 3, 6, 8, 9 e 10 demonstraram todas a banda da sequência CAP(6D)-1,2 de 2,1 kb na PCR. A PRBC-III-N1 era uma placa azul com ambos os genes marcadores e a sequência CAP(6D)-1,2 ainda no genoma virai e a banda da sequência CAP(6D)-1,2 foi também amplificada na PCR. A banda de PCR proeminente amplificada a partir do ADN de vCP307 (contendo a CEA nativa integrada no genoma de ALVAC) era de CEA truncada a 1,2 kb com uma banda de CEA inteira muito esbatida. A amostra de apenas células (sem infecção virai) foi utilizada como controlo negativo e o plasmideo pLZTKIMCEA(6Dla&2a) foi um controlo positivo utilizado na reacção de PCR. Os resultados da PCR mostraram claramente a CAP(6D)-1,2 inteira no genoma virai recombinante sem outra forma truncada de CEA visivel. Este resultado indicou que CAP(6D)-1,2 tinha uma maior estabilidade relativamente à CEA nativa no genoma de ALVAC. A expressão proteica foi também ensaiada através de immunoblot para confirmar a ausência da proteína CEA truncada nas células expressando CAP(6D)-1,2 (Fig. 11). Para isolamento do lisado celular, as células foram primeiro lavadas com PBS seguido da adição de Tampão de Lise (Repórter Gene Assay; Boehringer Mannheim) e agitação durante 15 minutos. O lisado celular foi centrifugado a 13000 rpm e o sobrenadante foi recolhido para análise de Western blot. As amostras foram carregadas num gel de poliacrilamida a 10% e corridas a 125 volts. A proteína foi então transferida para uma membrana de filtro de PVDF (Immobilon-P, Millipore). Foi utilizado um anticorpo monoclonal de CEA de ratinho ligado a HRP (1:1000;

Fitzgerald) para detectar a expressão de mCEA com o melhoramento de um reagente de quimioluminescência (DNA Thunder™; NEN™ Life Science Products).

Todas as seis placas fágicas brancas recombinantes finais de CAP (6D) -1,2 (PRBC-III-2, 3, 6, 8, 9 e 10) e uma placa 42 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ fágica azul intermediária (pRBC-lII-Nl) mostraram apenas uma banda de CEA sem nenhuma outra forma truncada (Fig. 11) . Em contraste, a proteína das placas fágicas de vCP307 (ALVAC recombinante expressando CEA nativa) mostrou um produto de CEA claramente truncado a *60 kDa para além da CEA inteira. A exposição prolongada da película verificou a ausência de quaisquer polipéptidos de CEA truncados nos recombinantes de CAP(6D)-1,2. Foi utilizado CEF como controlo negativo.

Em conclusão, os recombinantes de CAP(6D)-1,2 foram gerados com o mCEA em vez do CEA nativo para prevenir a expressão de múltiplas versões de CEA. Provou-se que a CAP(6D)-1,2 expressa a partir de NYVAC recombinante era eficaz na eliminação da versão truncada de CEA tanto através de PCR como de Western blot.

Embora o presente invento tenha sido descrito em termos das concretizações preferidas, entende-se que ocorrerão aos peritos na arte variações e modificações. Portanto, pretende-se que as reivindicações anexas cubram todas essas variações equivalentes que estejam dentro do âmbito do presente invento tal como é reivindicado. 43 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID N0:1; sequência nucleotídica AAC2-1

AGCAGGACCGGGGCCTGTGTCGCTATGGGTTCCCCCGCCGCCCCGGAGGGAGCGCTGGGCTACGTCCGCGAGTTC

AC

TCGCCACTCCTCCGACGTGCTGGGCAACCTCAACGAGCTGCGCCTGCGCGGGATCCTCACTGACGTCACGCTGCT

GG

TTGGCGGGCAACCCCTCAGAGCACACAAGGCAGTTCTCATCGCCTGCAGTGGCTTCTTCTATTCAATTTTCCGGG

GC

CGTGCGGGAGTCGGGGTGGACGTGCTCTCTCTGCCCGGGGGTCCCGAAGCGAGAGGCTTCGCCCCTCTATTGGAC

TT

CATGTACACTTCGCGCCTGCGCCTCTCTCCAGCCACTGCACCAGCAGTCCTAGCGGCCGCCACCTATTTGCAGAT

GG

AGCACGTGGTCCAGGCATGCCACCGCTTCATCCAGGCCAGCTATGAACCTCTGGGCATCTCCCTGCGCCCCCTGG

AA

GCAGAACCCCCAACACCCCCAACGGCCCCTCCACCAGGTAGTCCCAGGCGCTCCGAAGGACACCCAGACCCACCT

AC

TGAATCTCGAAGCTGCAGTCAAGGCCCCCCCAGTCCAGCCAGCCCTGACCCCAAGGCCTGCAACTGGAAAAAGTA

CA

AGTACATCGTGCTAAACTCTCAGGCCTCCCAAGCAGGGAGCCTGGTCGGGGAGAGAAGTTCTGGTCAACCTTGCC cc

CAAGCCAGGCTCCCCAGTGGAGACGAGGCCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGTGAAGAAGGA cc cattcctggtccccagagcaggctctctccaactgctgccactgtgcagttcaaatgtggggotccagccagtac cc cctacctcctcacatcccaggctcaagacacctctggatcaccctctgaacgggctcgtccactaccgggagtga

AT ttttcagctgccagaactgtgaggctgtggcagggtgctcatcgggggctggactccttggttcctggggacgaa

GA caaaccctataagtgtcagctgtgccggtcttcgttccgctacaagggcaaccttgccagtcaccgtacagtgca

CA

CAGGGGAAAAGCCTTACCACTGCTCAATCTGCGGAGCCCGTTTTAACCGGCCAGCAAACCTGAAAACGCACAGCC

GC

ATCCATTCGGGAGAGAAGCCGTATAAGTGTGAGACGTGCGGCTCGCGCTTTGTACAGGTGGCACATCTGCGGGCG

CA

CGTGCTGATCCACACCGGGGAGAAGCCCTACCCTTGCCCTACCTGCGGAACCCGCTTCCGCCACCTGCAGACCCT

CA agagccacgttcgcatccacaccggagagaagccttaccactgcgacccctgtggcctgcatttccgocacaaga

GT caactgcggctgcatctgcgccagaaacacggagctgctaccaacaccaaagtgcactaccacattctcgggggg cc ctagctgagcgcaggcccaggccccacttgcttcctgcgggtgggaaagctgcaggcccaggccttgcttcccta

TC aggcttgggcataggggtgtgccaggccactttggtatcagaaattgccaccctcttaatttctcactggggaga gc aggggtggcagatcctggctagatctgcctctgttttgctggtcanaccctcttccccacaagccagattgtttc tg aggagagagctagctaggggctgggaaaggggagagattggagtcctggtctccctaagggaatagccctccacc

TG tggcccccattgcattcagtttatctgtaaaatataatttattgaggcctttgggtggcaccggggccttcattc

GA ttgcatttcccactcccctcttccacaagtgtgattaaaagtgaccagaaacacagaaggtgagatcacagctct

GC tggcagagattactagcccttggctctctcgtttgqcttgggtattttatattatttctgtcataacttttatct

TT agaattgttctttctcctgtttgtttgcttgttagtttgtttaaaatggaaaaaggggttctctgtgttctgccc

CT

GTAATTCTAGGTCTGGAACCTTTATTTGTTCTAGGGCAGCTCTGGGAACATGCGGGATTGTGGAATTGGGTCAGG

AA 44 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

CCCTCTCTGGTATTCTGGATGTTGTAGGTTCTCTAGCAGTCTAGAAATGGATACAGACATTTCTCTGTTCTTCAA

GG

GTGATAGGAACCATTATGTTGAGCCCAAAATGGAAGTAATAATAAATGCCTCCTGGAGGCTGTGGGTGTGGGGGA

TT

CTGTATCTGGATTCCGTATCACrCCAACTGGAGGCTGTGGGTGTGGGGGATTCTGTATCTGGATTCCGTATCACT

CC

AAGTGGAGGCTGGCAGGTTTTTCTGCAAGATGGTCCAGAATCTAAAATGTCCCATTAATCTGGTCACTTGGGTTT

GG

CTCTGCTGTATCCATCTATAGTGGTAGAGACCCACCAGGGCTCAAGTGGAGTCCATCATCCTCCCACGGGGGCCT

GT

TCTTAGTACTGAGTTGATCGCTCCATGGGGGAGAGATCAGACATTCCTTATCAGAGATGATGTGACCTTTTCTGA

CT

CTGCCCAGTCTCTATGAATGTTATGGCCTAGGGAAGAATCATGAAACTCTTTAGCTTGATTAGATGGTAAACAGT

GT

TAACCCATCCTTTACTACAGAGGCATATGGGTTTGAATGTTACCTGGGGTTCTCTCTATTGAGTTGAGCCCCTTC

TT

CCTTTAGTGGGTTTTGGACATCTTCTGGCAAGTGTCCAGATGCCAGAACCTTCTTTTCCTCTAGAAGGGATGGTG

CT

TGGTAACCTTACCTTTTAAAAGCTGGGTCTGTGACCTGGTCTTCCCATCCCTGCATTCCTGTCTGGAACCAGTGA

AT

GCATTAGAACCTTCCATAGGAAAAGAAAAGGGGCTGAGTTCCATTCTGGGTTTGCTGTAGTTTGGTTGGGATTAT

TG

TTGGCATTACAGATGTAAAAGATTGACTAGCCCATAGGCCAAAGGCCTGTTCTAGTTGACCAAGTTTCAAGTAGG

AT

TAAGAGGTTGGTTGAGGGGTGCAGTTTCTGGTGTAGGCCAGGTAGGTAGAAAGTGAGGAACAGGGTTGCCTCTTG

GC tgggtggagtctctgaaatgttagaagaagcgctgaagccttgattgatagttctgccccttgttgccctggggc

TT atctgattatgggacgagggtagaaagtaagaagcacttttgaatttgtggggtagaacttcaacaataagtcag

TT ctagtggctgtcgcctggggactagtgagaaagctactcttctccctcttccctctttctccccatggccccact

GC agaattaaagaaggaagaagggaaggcggaggagtctataagaaggaatcatgatttctatttagcagattggat

GG gcaggtggagaatgcctgggggtagaaatgttagatcttgcaacatcagatccttggaataaagaagcctctctg

CG

CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 45 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ SEQ ID Ν0:2; quadro de leitura aberto AAC2-2 atgggttcccccgccgccccggagggagcgctgggctacgtccgcgagttcactcgccactcctccgacgtgctgggcaacct caacgagctgcgcctgcgcgggatcctcactgacgtcacgctgctggttggcgggcaacccctcagagcacacaaggcagttc

TCATCGCCTGCAGrGGCTTCTTCTATTCAATTTTCCGGGGCCGTGCGGGAGTCGGGGTGGACGTGCTCTCTCTGCCCGGGGGT

CCCGAAGCGAGAGGCTTCGCCCCTCTATTGGACTTCATGTACACTTCGCGCCTGCGCCTCTCTCCAGCCACTGCACCAGCAGT

CCTAGCGGCCGCCACCTATTTGCAGATGGAGCACGTGGTCCAGGCATGCCACCGCTTCATCCAGGCCAGCTATGAACCTCTGG gcatctccctgcgccccctggaagcagaacccccaacacccccaacggcccctccaccaggtagtcccaggcgctccgaagga cacccagacccacctactgaatctcgaagctgcagtcaaggcccccccagtccagccagccctgaccccaaggcctgcaactg gaaaaagtacaagtacatcgtgctaaactctcaggcctcccaagcagggagcctggtcggggagagaagttctggtcaacctt gcccccaagccaggctccccagtggagacgaggcctccagcagcagcagcagcagcagcagcagcagtgaagaaggacccatt cctggtccccagagcaggctctctccaactgctgccactgtgcagttcaaatgtggggctccagccagtaccccctacctcct cacatcccaggctcaagacacctctggatcaccctctgaacgggctcgtccactaccgggaagtgaatttttcagctgccaga actgtgaggctgtggcagggtgctcatcggggctggactccttggttcctggggacgaagacaaaccctataagtgtcagctg tgccggtcttcgttccgctacaagggcaaccttgccagtcatcgtacagtgcacacaggggaaaagccttaccactgctcaat ctgcggagcccgttttaaccggccagcaaacctgaaaacgcacagccgcatccattcgggagagaagccgtataagtgtgaga

CGTOCGGCTCGCGCTTTGTACAGGTGGCACATCTGCGGGCGCACGTGCTGATCCACACCGGGGAGAAGCCCTACCCTTGCCCT acctgcggaacccgcttccgccacctgcagaccctcaagagccacgttcgcatccacaccggagagaagccttaccactgcga cccctgtggcctgcatttccggcacaagagtcaactgoggctgcatctgcgccagaaacacggagctgctaccaacaccaaag tgcactaccacattctcggggggccctag SEQ ID HO.: 3; 7524 atacccggaactccctaagccttctattagctccaataatagtaagcctgtcgaagacaaagatg SEQ ID HO.: 4; 7526 GCCTGTGTCCCCTAGACTCCAACTCAGCAACGGAAATAGAACTCTGACCCTGTTTAACGTGACCAGGAAC SEQ ID HO.: 5; 7528 acgtgctttacggacccgatgctcctacaatcagccctctamcacaagctatagatcaggggaaaatct SEQ ID HO.: 6; 7533 acgttaaacagggtcagagttctatttccgttgctgagttggagtctaggggacacaggcagggactggt

SEQ ID NO.: 7; 7S3S ctgatctatagcttgtgtttagagggctgattgtaggagcatcgggtccgtaaagcacgttgagaatcac SEQ ID NO.i 8; 7537

GATCCACTATTGTTCACGGTAATATTGGGAATGAACAGTTCCTGGGTGGACTGTTGGAAAGTG SEQ ID HO. : 9; 7567

GACACAGCAAGCTACAAATGCGAAACCCAAAATCCAGTCAGCGCCAGGAGGTCTGATTCAGTGATTCTCA SEQ ID HO.: 10; 7S6S TGAATCAGACCTCCTGGCGCTGACTGGATTTTGGGTTTCGCATTTGTAGCTTGCTGTGTCGTTCCTGGTC SEQ ID NO.: 11; 757$

OATCCTACACGTGCCAAGCTCACAATAGCGACACCGGACTCAACCGCACAACCGTGACGACGATTACCGTGTATG

CCGA SEQ ID MO.: 12; 7587 CATCCTCAACTGGGTTAGAATTGTTACTAGTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCGGCATACACGGTAATCGT SEQ ID NO. : 13; 7677

TTCTAACCCAGTTGAGGATGAGGACGCAGTTGCATTAACTTGTGAGCCAGAGATTCAAAATACCACTTATTTATG

GTGGG SEQ ID NO.: 14; 7678

GTCTAATGATAACCGCACATTGACACTCCTGTCCGTTACTCGCAATGATGTAGGACCTTATGAGTGTGGCATTCA

GAATG 46 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ SEQ XD ΝΟ.: 15; 7g79

TTTGTATGGCCCAGACGACCCAACTATATCTCCATCATACACCTACTACCGTCCCGGCGTGAACTTGAGCCTTTC

TTGCC SEQ ID HO.; 16; 7680

TGATGGAAACATTCAGCAGCATACTCAAGAGTTATTTATAAGCAACATAACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATAC

TTGCC SEQ ID NO.: 17; 7681

TAAAACAATAACTGTTTCCGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAA

GGATG SEQ ID HO.: 18; 7692

ATGTGCGGTTATCATTAGACAACTGCAAGCGTGGGCTAACCGGCAAACTTTGGTTATTGACCCACCATAAATAAG

TGGTA SEQ ID HO.: 19; 7683

GGTCGTCTGGGCCATACAAAACATTAAGGATAACAGGGTCGGAGTGATCAACGGATAATTCATTCTGAATGCCAC

ACTCA SEQ ID HO.: 20; 7684

GCTGCTGAATGTTTCCATCAATCAGCCAGGAGTACTGTGCAGGGGGGTTGGATGCTGCATGGCAAGAAAGGCTCA

AGTTC SEQ XD MO.: 21; 7685

CGGAAACAGTTATTGTTTTAACTGTAGTCCTGCTGTGACCACTGGCTGAGTTATTGGCCTGGCAAGTATAGAGTC

CGCTG SEQ ID NO.; 22; 7686

CCTCAGGTTCACAGGTGAAGGCCACAGCATCCTTGTCCTCCACGGGT SEP IDNO.i 23; CEA-CAP6D

ATGGAGTCTC CCTCGGCCCC TCCCCACAGA TGGTGCATCC CCTGGCAGAG GCTCCTGCTC ACAGCCTCAC TTCTAACCTT CTGGAACCCG CCCACCACTG CCAAGCTCAC TATTGAATCC ACGCCGTTCA ATGTCGCAGA GGGGAAGGAG GTGCTTCTAC TTGTCCACAA TCTGCCCCAG CATCTTTTTG GCTACAGCTG GTACAAAGGT GAAAGAGTGG ATGGCAACCG TCAAATTATA GGATATGTAA TAGGAACTCA ACAAGCTACC CCAGGGCCCG CATACAGTGG TCGAGAGATA ATATACCCCA ATGCATCCCT GCTGATCCAG AACATCATCC AGAATGACAC AGGATTCTAC ACCCTACACG TCATAAAGTC AGATCTTGTG AATGAAGAAG CAACTGGCCA GTTCCGGGTA TACCCGGAGC TGCCCAAGCC CTCCATCTCC AGCAACAACT CCAAACCCGT ggaggacaag GATGCTGTGG CCTTCACCTG TGAACCTGAG ACTCAGGACG CAACCTACCT GTGGTGGGTA AACAATCAGA GCCTCCCGGT CAGTCCCAGG CTGCAGCTGT CCAATGGCAA CAGGACCCTC ACTCTATTCA ATGTCACAAG AAATGACACA GCAAGCTACA AATGTGAAAC CCAGAACCCA GTGAGTGCCA GGCGCAGTGA TTCAGTCATC CTGAATGTCC TCTATGGCCC GGATGCCCCC ACCATTTCCC CTCTAAACAC ATCTTACAGA TCAGGGGAAA ATCTGAACCT CTCCTGCCAC GCAGCCTCTA ACCCACCTGC ACAGTACTCT TGGTTTGTCA ATGGGACTTT CCAGCAATCC ACCCAAGAGC TCTTTATCCC CAACATCACT GTGAATAATA GTGGATCCTA TACGTGCCAA GCCCATAACT CAGACACTGG CCTCAATAGG ACCACAGTCA CGACGATCAC AGTCTATGAG CCACCCAAAC CCTTCATCAC CAGCAACAAC TCCAACCCCG TGGAGGATGA GGATGCTGTA GCCTTAACCT GTGAACCTGA GATTCAGAAC ACAACCTACC TGTGGTGGGT AAATAATCAG AGCCTCCCGG TCAGTCCCAG GCTGCAGCTG TCCAATGACA ACAGGACCCT CACTCTACTC AGTGTCACAA GGAATGATGT AGGACCCTAT GAGTGTGGAA TCCAGAACGA ATTAAGTGTT GACCACAGCG ACCCAGTCAT CCTGAATGTC CTCTATGGCC CAGACGACCC CACCATTTCC CCCTCATACA CCTATTACCG TCCAGGGGTG AACCTCAGCC TCTCCTGCCA TGCAGCCTCT AACCCACCTG CACAGTATTC TTGGCTGATT GATGGGAACA TCCAGCAACA CACACAAGAG CTCTTTATCT CCAACATCAC TGAGAAGAAC AGCGGACTCT ATACCTGCCA GGCCAATAAC TCAGCCAGTG GCCACAGCAG GACTACAGTC AAGACAATCA CAGTCTCTGC GGAGCTGCCC AAGCCCTCCA TCTCCAGCAA CAACTCCAAA CCCGTGGAGG ACAAGGATGC TGTGGCCTTC ACCTGTGAAC CTGAGGCTCA GAACACAACC TACCTGTGGT GGGTAAATGG TCAGAGCCTC CCAGTCAGTC CCAGGCTGCA GCTGTCCAAT GGCAACAGGA CCCTCACTCT ATTCAATGTC 47 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

ACAAGAAATG ACGCAAGAGC CTATGTATGT GGAATCCAGA ACTCAGTGAG TGCAAACCGC AGTGACCCAG TCACCCTGGA TGTCCTCTAT GGGCCGGACA CCCCCATCAT TTCCCCCCCA GACTCGTCTT ACCTTTCGGG AGCGGACCTC AACCTCTCCT GCCACTCGGC CTCTAACCCA TCCCCGCAGT ATTCTTGGCG TATCAATGGG ATACCGCAGC AACACACACA AGTTCTCTTT ATCGCCAAAA TCACGCCAAA TAATAACGGG ACCTATGCCT GTTTTGTCTC TAACTTGGCT ACTGGCCGCA ATAATTCCAT AGTCAAGAGC ATCACAGTCT CTGCATCTGG AACTTCTCCT GGTCTCTCAG CTGGGGCCAC TGTCGGCATC ATGATTGGAG TGCTGGTTGG GGTTGCTCTG ATATAG SEP ID KO: 24; CAPSD-1.2

ATGGAGTCTC CCTCGGCCCC TCCCCACAGA TGGTGCATCC CCTGGCAGAG GCTCCTGCTC ACAGCCTCAC TTCTAACCTT CTGGAACCCG CCCACCACTG CCAAGCTCAC TATTGAATCC ACGCCGTTCA ATGTCGCAGA GGGGAAGGAG GTGCTTCTAC TTGTCCACAA TCTGCCCCAG CATCTTTTTG GCTACAGCTG GTACAAAGGT GAAAGAGTGG ATGGCAACCG TCAAATTATA GGATATGTAA TAGGAACTCA ACAAGCTACC CCAGGGCCCG CATACAGTGG TCGAGAGATA ATATACCCCA ATGCATCCCT GCTGATCCAG AACATCATCC AGAATGACAC AGGATTCTAC ACCCTACACG TCATAAAGTC AGATCTTGTG AATGAAGAAG CAACTGGCCA GTTCCGGGTA TACCCGGAAC TCCCTAAGCC TTCTATTAGC TCCAATAATA GTAAGCCTGT CGAAGACAAA GATGCCGTCG CTTTTACATG CGAGCCCGAA ACTCAAGACG CAACATATCT CTGGTGGGTG AACAACCAGT CCCTGCCTGT GTCCCCTAGA CTCCAACTCA GCAACGGAAA TAGAACTCTS ACCCTGTTTA ACGTGACCAG GAACGACACA GCAAGCTACA AATGCGAAAC CCAAAATCCA GTCAGCGCCA GGAGGTCTGA TTCAGTGATT CTCAACGT3C TTTACGGACC CGATGCTCCT ACAATCAGCC CTCTAAACAC AAGCTATAGA TCAGGGGAAA ATCTGAATCT GAGCTGTCAT GCCGCTAGCA ATCCTCCCGC CCAATACAGC TGGTTTGTCA ATGGCACTTT CCAACAGTCC ACCCAGGAAC TGTTCATTCC CAATATTACC GTGAACAATA GTGGATCCTA CACGTGCCAA GCTCACAATA GCGACACCGG ACTCAACCGC ACAACCGTGA CGACGATTAC CGTGTATGAG CCACCAAAAC CATTCATAAC TAGTAACAAT TCTAACCCAG TTGAGGATGA GGACGCAGTT GCATTAACTT GTGAGCCAGA GATTCAAAAT ACCACTTATT TATGGTGGGT CAATAACCAA AGTTTGCCGG TTAGCCCACG CTTGCAGTTG TCTAATGATA ACCGCACATT GACACTCCTG TCCGTTACTC GCAATGATGT AGGACCTTAT GAGTGTGGCA TTCAGAATGA ATTATCCGTT GATCACTCCG ACCCTGTTAT CCTTAATGTT TTGTATGGCC CAGACGACCC AACTATATCT CCATCATACA CCTACTACCG TCCCGGCGTG AACTTGAGCC TTTCTTGCCA TGCAGCATCC AACCCCCCTG CACAGTACTC CTGGCTGATT GATGGAAACA TTCAGCAGCA TACTCAAGAG TTATTTATAA GCAACATAAC TGAGAAGAAC AGCGGACTCT ATACTTGCCA GGCCAATAAC TCAGCCAGTG GTCACAGCAG GACTACAGTT AAAACAATAA CTGTTTCCGC GGAGCTGCCC AAGCCCTCCA TCTCCAGCAA CAACTCCAAA CCCGTGGAGG ACAAGGATGC TGTGGCCTTC ACCTGTGAAC CTGAGGCTCA GAACACAACC TACCTGTGGT GGGTAAATGG TCAGAGCCTC CCAGTCAGTC CCAGGCTGCA GCTGTCCAAT GGCAACAGGA CCCTCACTCT ATTCAATGTC ACAAGAAATG ACGCAAGAGC CTATGTATGT GGAATCCAGA ACTCAGTGAG TGCAAACCGC AGTGACCCAG TCACCCTGGA TGTCCTCTAT GGGCCGGACA CCCCCATCAT TTCCCCCCCA GACTCGTCTT ACCTTTCGGG AGCGGACCTC AACCTCTCCT GCCACTCGGC CTCTAACCCA TCCCCGCAGT ATTCTTGGCG TATCAATGGG ATACCGCAGC AACACACACA AGTTCTCTTT ATCGCCAAAA TCACGCCAAA TAATAACGGG ACCTATGCCT GTTTTGTCTC TAACTTGGCT ACTGGCCGCA ATAATTCCAT AGTCAAGAGC ATCACAGTCT CTGCATCTGG AACTTCTCCT GGTCTCTCAG CTGGGGCCAC TGTCGGCATC ATGATTGGAG TGCTGGTTGG GGTTGCTCTG ATATAG 48 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Aventis Pasteur, Limited Therion Biologics, inc. <120> Ácido nucleico de CEA modificado e Vectores de Expressão

< 130> P021352EP CLM < 140> EP 03719662.3 <141> 2003-04-09 <150> PCT/US03/10916 <151> 2003-04-09 <150> US 60/372,972 <151> 2002-04-09 <160> 33 <170> Patentln versão 3.1 < 210 > 1 <211> 3564

< 212 > ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: sequência nucleotídica AAC2-1" < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1663)..(1663) <223> n é incerto <400> 1 agcaggaccg gggcctgtgt cgctatgggt tcccccgccg ccccggaggg agcgctgggc 60 tacgtccgcg agttcactcg ccactcctcc gacgtgctgg gcaacctcaa cgagctgcgc 120 ctgcgcggga tcctcactga cgtcacgctg ctggttggcg ggcaacccct cagagcacac 180 49 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ aaggcagttc tcatcgcctg cagtggettc ttctattoaa ttttccgggg ccgtgcggga 240 gtcggggtgg acgtgctctc tctgcecggg ggtcccgaag cgagaggctt cgcccctcta 300 ttggacttca tgtacacttc gcgcctgcgc ctetetceag ccactgcacc agcagtccta 360 geggccgcca cctatttgca gatggagcac gtggtccagg catgccaccg cttcatccag 420 gccagctatg aacctctggg catctccctg cgccccctgg aagcagaacc cccaacaccc 480 ccaacggccc ctccaccagg tagtcccagg cgctccgaag gacacccaga cccacctact 540 gaatctcgaa gctgcagtca aggccccccc agtccagcca gcoctgaccc caaggcctgc 600 aactggaaaa agtacaagta catcgtgcta aactctcagg cctcccaagc agggagcctg 660 gtcggggaga gaagttctgg tcaaccttgc ccccaagcca ggctccccag tggagacgag 720 gcctccagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagtg aagaaggacc cattcctggt 780 ccccagagca ggctctctcc aactgctgcc actgtgcagt tcaaatgtgg ggctccagcc 840 agtaccccct acctcctcac atcccaggct caagacacct ctggatcacc ctctgaacgg 900 gctcgtccac taccgggagt gaatttttca gctgccagaa ctgtgaggct gtggcagggt 960 gctcatcggg ggctggactc cttggttcct ggggacgaag acaaacccta taagtgtcag 1020 ctgtgccggt cttcgttccg ctacaagggc aaccttgcca gtcaccgtac agtgcacaca 1080 ggggaaaagc cttaccactg ctcaatctgc ggagcccgtt ttaaccggcc agcaaacctg 1140 aaaacgcaca gccgcatcca ttcgggagag aagcegtata agtgtgagac gtgcggctcg 1200 cgctttgtac aggtggcaca tctgcgggcg cacgtgctga tccacaccgg ggagaageee 1260 taeecttgcc ctacctgcgg aacccgcttc cgccacctgc agaocotcaa gagccacgtt 1320 cgcatccaca ccggagagaa gccttaccac tgcgacccct gtggcetgca tttccggeac 1380 aagagtcaac tgcggctgca tctgcgccag aaacacggag ctgctaccaa caccaaagtg 1440 cactaccaca ttctcggggg gccctagotg agcgcaggcc caggccccac ttgcttcctg 1500 cgggtgggaa agctgcaggc ccaggccttg cttecetatc aggcttgggc ataggggtgt 1560 50

ΕΡ 1 496 939/PT gccaggccac tttggtatca gaaattgcca ccctcttaat ttctcactgg ggagagcagg 1620 ggtggcagat cctggctaga tctgcctctg ttttgctggt canaccctct tccccacaag 1680 ceagattgtt totgaggaga gagetagcta ggggctggga aaggggagag attggagtcc 1740 tggtctccct aagggaatag ccctccacct gtggccccca ttgcattcag tttatctgta 1800 aaatataatt tattgaggcc tttgggtggc accggggcct tcattcgatt gcatttcoca 1860 ctcccctctt coaoaagtgt gattaaaagt gaccagaaac acagaaggtg agatcacagc 1920 tetgotggca gagattacta gccottggct ctctcgtttg gcttgggtat tttatattat 1980 ttctgtcata aettttatct ttagaattgt tctttctcct gtttgtttgc ttgttagttt 2040 gtttaaaatg gaaaaagggg ttctctgtgt tctgcccctg taattctagg tctggaacct 2100 ttatttgttc tagggcagct ctgggaacat gcgggattgt ggaattgggt caggaaccct 2160 ctctggtatt otggatgttg taggttctot agcagtetag aaatggatac agacatttct 2220 ctgttcttoa agggtgatag gaaccafcbafc gttgagccca aaatggaagt aataataaat 2280 gcctcctgga ggctgtgggt gtgggggatt ctgtatctgg attccgtatc actccaactg 2340 gaggctgtgg gtgtggggga ttctgtatot ggattccgta teaetccaag tggaggctgg 2400 caggtttttc tgcaagatgg tccagaatct aaaatgtccc attaatctgg tcacttgggt 2460 ttggctctgc tgtatccatc tatagtggta gagacccacc agggctcaag tggagtccat 2520 catcctccca cgggggcctg ttcttagtac tgagttgatc gctccatggg ggagagatca 2580 gacattcctt atcagagatg atgtgacctt ttctgactct gcccagtctc tatgaatgtt 2640 atggcctagg gaagaatcat gaaactcttt agcttgatta gatggtaaac agtgttaacc 2700 catcctttac tacagaggca tatgggtttg aatgttacct ggggttctct ctattgagtt 2760 gagccccttc ttcctttagt gggttttgga catcttotgg caagtgtcca gatgccagaa 2820 ccttcttttc ctctagaagg gatggtgctt ggtaacctta ccttttaaaa gctgggtctg 2880 tgacctggtc ttcccatccc tgcattcctg tctggaacca gtgaatgcat tagaaccttc 2940 51 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ cataggaaaa gaaaaggggc tgagttccat tctgggtttg ctgtagtttg gttgggatta 3000 ttgttggcat tacagatgta aaagattgac tagcccatag gccaaaggcc tgttctagtt 3060 gaccaagttt caagtaggat taagaggttg gttgaggggt gcagtttctg gtgtaggcca 3120 ggtaggtaga aagtgaggaa cagggttgcc tcttggctgg gtggagtctc tgaaatgtta 3180 gaagaagcgc tgaagccttg attgatagtt ctgccccttg ttgccctggg gcttatctga 3240 ttatgggacg agggtagaaa gtaagaagca ‘cttttgaatt tgtggggtag aacttcaaca 3300 ataagtcagt tctagtgget gtcgcctggg gactagtgag aaagctactc ttctccctct 3360 tccctctttc tccccatggc cccactgcag aattaaagaa ggaagaaggg aaggcggagg 3420 agtctataag aaggaatcat gatttctatt tagcagafctg gatgggcagg tggagaatgc 3480 ctgggggtag aaatgttaga tcttgcaaca tcagatcctt ggaataaaga agcctctctg 3540 cgcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3564 < 210 > 2 <211> 1440

< 212 > ADN <213> desconhecido <22 0> <221> fonte < 2 2 3 > /note = "Descrição de sequência desconhecida: quadro de leitura aberto AAC2-2 " <400> 2 atgggttcce ccgecgeccc ggagggagcg ctgggctacg tcegcgagtt cactcgccac 60 tcctccgacg tgctgggcaa cctcaacgag ctgcgcctgc gcgggatcct cactgacgtc 120 acgctgctgg ttggcgggca acccctcaga gcacacaagg cagttctcat cgcctgcagt 180 ggcttcttct attoaatttt ccggggccgt gcgggagtcg gggtggacgt gctctctctg 240 cccgggggtc ccgaagcgag aggcttcgcc cctctattgg acttcatgta cactfccgcgc 300 360 ctgcgcetct ctccagceac tgcaccagca gtcctagcgg ccgccaccta fcttgcagatg 52

ΕΡ 1 496 939/PT gagcacgtgg tccaggcatg ccaccgcttc atccaggcca gctatgaacc tctgggcatc 420 tccctgcgce ccctggaagc agaaccccca aeacccccaa cggecectcc accaggtagt 480 cccaggcgct ccgaaggaca cccagaceca cctactgaat ctcgaagctg cagtcaaggc 540 ccccccagtc cagccagccc tgaccccaag gcctgcaact ggaaaaagta caagtacatc 600 gtgctaaact oteaggcctc ccaagcaggg agcctggtcg gggagagaag ttctggtaaa 660 ccttgccccc aagccaggct ccccagtgga gacgaggcct ccagcagcag cagcagcagc 720 agcagcagca gtgaagaagg acccattcct ggtccccaga gcaggctctc tccaactgct 780 gccactgtgc agttcaaatg tggggotcca gccagtacoo cctacctcct cacatcccag 840 gctcaagaca cctctggatc accctctgaa cgggctcgtc cactaccggg aagtgaattt 900 ttcagctgcc agaactgtga ggctgtggca gggtgctcat cggggctgga ctccttggtt 960 octggggaeg aagaeaaacc etataagtgt cagctgtgcc ggtettegtt ccgctacaag 1020 ggcaaecttg ccagtcatcg tacagtgcac acaggggaaa agocttacoa ctgctcaatc 1080 tgcggageec gttttaaecg gccagcaaac ctgaaaacgo acagccgcat ccattcggga 1140 gagaagccgt ataagtgtga gacgtgcggc tcgogctttg taoaggtggo acatctgcgg 1200 gcgcacgtgc tgatccacac oggggagaag ccctaccctt gccctacctg cggaacccgc 1260 ttccgceacc tgcagaccct caagagccac gttcgcatcc acaccggaga gaagccttac 1320 cactgcgacc cctgtggcct gcattteegg cacaagagtc aactgcggct gcatctgcgc 1380 cagaaacacg gagctgctac caacaccaaa gtgcactacc acattctcgg ggggccctag 1440 < 210 > 3 <211> 65

< 212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7524" < 4 0 0 > 3 atacccggaa ctccctaagc ettctattag ctccaataat agtaagootg tcgaagacaa 60 agatg 65 < 210 > 4 <211> 70

< 212 > ADN <213> Sequência artificial 53 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ <22 0> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7526" <400> 4 gcctgtgtcc cctagactcc aactcagcaa cggaaataga actctgaccc tgtttaacgt 60 gaccaggaac 70 < 210 > 5 <211> 70

< 212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7528" <400> 5 acgtgcttta cggacccgat gctcctaoaa tcagccctct aaacacaagc tatagatcag 60 gggaaaatct 70

< 210 > 6 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7533" <400> 6 acgttaaaca gggtcagagt tctatttccg ttgctgagtt ggagtctagg ggacaeaggc 60 agggactggt 70

<210> 7 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7535" < 4 0 0 > 7 ctgatctata gettgtgttt agagggotga ttgtaggagc atcgggtacg taaagcacgt 60 tgagaatcac 70

< 210 > 8 <211> 63 <212> ADN <213> Sequência artificial 54 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ <22 0> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7537 <400> 8 gatccactat tgttcacggt aatattggga atgaacagtt cctgggtgga ctgttggaaa 60 gtg 63

<210> 9 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7567 <400> 9 gacacagcaa gctacaaatg cgaaacccaa aatccagtca gcgccaggag gtctgattca 60 gtgattctca 70

<210> 10 <211> 70 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7568 < 4 0 0 > 10 tgaatcagac ctcctggcgc tgactggatt ttgggtttcg catttgtagc ttgctgtgtc 60 gttcotggto 70

<210> 11 <211> 79 <212> ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7576" < 4 0 0 > 11 gatcctacae gtgccaagct cacaatagog acaccggact caaccgcaca accgtgacga 60 cgattacegt gtatgccga 79

<210> 12 <211> 70 <212> ADN <213> desconhecido 55 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7587" <400> 12 catcctcaac tgggttagaa ttgttactag ttatgaatgg ttttggtggc tcggcataca 60 cggtaatcgt 70

<210> 13 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7677" < 4 0 0 > 13 ttctaaccca gttgaggatg aggacgcagt tgcattaact tgtgagcoag agattcaaaa 60 taccacttat ttatggtggg 80 <210> 14 <211> 80

< 212 > ADN <213> desconhecido < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7678" < 4 0 0 > 14 gtctaatgat aaccgcacat tgacactcct gtccgttact cgcaatgatg taggacctta 60 tgagtgtggc atteagaatg 80

<210> 15 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7679" <400> 15 tttgtatggc ccagacgacc caactatatc tccatcatac acctactacc gtcccggcgt 60 gaacttgagc ctttcttgcc $0

<210> 16 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido 56 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ < 2 2 Ο > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7680" < 4 0 0 > 16 tgatggaaac attcagcagc atactcaaga gttatttata agcaacataa ctgagaagaa 60 cagcggactc tatacttgcc 80

< 210 > 17 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7681" < 4 0 0 > 17 taaaacaata actgtttccg cggagctgcc caagccctce atotccagca acaactccaa 60 acccgtggag gacaaggatg 80

< 210 > 18 <211> 80 < 212 > ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7682" <400> 18 atgtgcggtt atcattagac aactgcaago gtgggotaac cggoaaactt tggttattga 60 cccaccataa ataagtggta 80

<210> 19 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7683" <400> 19 ggtcgtctgg gccatacaaa acattaagga taacagggtc ggagtgatca acggataatt 60 cattctgaat gccacactca 80

<210> 20 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido 57 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ <22 0> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7684" <400> 20 gctgctgaat gtttccatca atcagccagg agtactgtgc aggggggttg gatgctgcat 60 ggcaagaaag gctcaagttc 80

<210> 21 <211> 80 <212> ADN <213> desconhecido <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7685" <400> 21 cggaaacagt tattgtttta actgtagtcc tgctgtgacc aetggctgag ttattggcct 60 ggcaagtata gagtccgctg Θ0

<210> 22 <211> 47 <212> ADN <213> desconhecido < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: 7686" <400> 22 cctcaggttc acaggtgaag gccacagcat ccttgtcctc cacgggt 47

<210> 23 <211> 2106 <212> ADN <213> desconhecido < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência desconhecida: CEA-CAP6D" <400> 23 atggagtctc cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgctc 60 acagcctcac tLt-ctaacctt ctggaacccg cccaccactg ecaagotcac tattgaatcc 120 acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgcccaag 1B0 catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg teaaattata 240 ggatatgtaa taggaactca acaagctace ccagggeccg catacagtgg tcgagagata 300 atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattictac 360 accctacacg tcataaagfcc agatcttgtg aatgaagaag eaactggcca gttccgggta 420 tacccggagc tgcccaagcc ctecatctcc agcaacaact oeaaacocgt ggaggacaag 4B0 58 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ gatgctgtgg ccttcacctg tgaacctgag actcaggacg caacctacct gtggtgggta 540 aacaatcaga gcctccoggt cagtcccagg ctgoagctgt ccaatggcaa caggaccctc 600 actctattca atgtcacaag aaatgaeaca gcaagctaca aatgtgaaac ccagaaccca $60 gtgagtgcca ggcgcagtga ttcagtcatc ctgaatgtcc tctatggcco ggatgecccc 720 accatttccc etetaaacac atcttacaga tcaggggaaa atotgaaoct ctcctgccac 780 gcagcctcta acccacctgc acagtactct tggtttgtca atgggacttt ccagcaatcc 840 acccaagagc tctttatccc caacatcact gtgaataata gtggatccta tacgtgccaa 900 gcccataact cagacactgg cctcaatagg accacagtca cgacgatcac agtctatgag 960 ccacccaaac ccttcatcac cagcaacaac tccaaccccg tggaggatga ggatgctgta 1020 gccttaacct gtgaacctga gattcagaac acaacctacc tgtggtgggt aaataatcag 1080 agcctcccgg tcagtcccag gctgcagctg tccaatgaca acaggaccct cactctactc 1140 agtgtcacaa aggaccctat gagtgtggaa tccagaacga attaagtgtt 1200 gaccacagcg acccagtcat cctgaatgtc ctotatggcc cagacgaccc caccatttcc 1260 coctcataca octattaccg tccaggggtg aacctcagcc tctcctgcca tgcageotet 1320 aacccacctg cacagtattc ttggctgatt gatgggaaca tccagcaaca cacacaagag 1380 ctctttatct ccaacatcac tgagaagaac agcggactct atacctgcca ggccaataac 1440 tcagccagtg gccacagcag gactacagtc aagacaatca cagtctctgc ggagctgccc 1500 aagccctcca tctccagcaa caactccaaa ecogtggagg acaaggatgc tgtggccttc 1560 acctgtgaac ctgaggctca gaacacaacc taeetgtggt gggtaaatgg tcagagcctc 1620 ccagtcagtc ceaggctgca gctgtccaat ggcaacagga ccctcactct attcaatgtc 1680 acaagaaatg acgcaagagc ctatgtatgt ggaatccaga actcagtgag tgcaaaccgc 1740 agtgacccag tcaccctgga tgtcctctat gggccggaca cccccatcat ttccccccca 1800 gactcgtctt acctttcggg agcggacctc aacctctcct gccactcggc ctctaaccca 1860 59 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ tccccgcagt attcttggcg tatcaatggg ataccgcagc aacacaeaca agttetcttt atcgccaaaa tcacgccaaa taataacggg acctatgcct gttttgtctc taacttggct actggccgca ataattccat agtcaagagc atcacagtct ctgcatctgg aacttctcct ggbctctcag ctggggccac tgtcggcatc atgattggag tgctggttgg ggttgctctg atatag

<210> 24 <211> 2106 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: modificada (CAP(6D)-1,2) contida em pNVQH6MCEA" <400> 24 atggagtcte cctcggcccc tccccacaga tggtgcatcc cctggcagag gctcctgete acagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg ccaagctcac tatfcgaafccc acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac ttgtccacaa tctgccccag catcttttfcg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg atggcaaccg tcaaattata ggatatgtaa taggaactca acaagctacc ccagggccog catacagtgg tcgagagata atatacccca atgcatcect gctgatccag aacatcatcc agaatgacac aggattctac accctacacg tcataaagto agatcttgtg aatgaagaag caactggcca gttccgggta tacccggaac tccctaagcc ttetattage tccaataata gtaagcctgt cgaagacaaa gatgccgtcg cttttacatg cgagcccgaa actcaagacg caacatatct ctggtgggtg aacaaccagt ccctgcctgfc gtcccctaga ctccaactca gcaacggaaa tagaactctg accctgttta acgtgaccag gaacgacaca gcaagctaca aatgcgaaac ccaaaafccca gtcagcgcca ggaggtctga ttcagtgatt ctcaacgtgc tttacggacc cgatgcfccct 1920 1980 2040 2100 2106

Sequência CEA 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 60 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ acaatcagcc ctctaaacac aagctataga tcaggggaaa atctgaatct gagctgtcat 780 gccgctagca atcctcocgc ccaatacagc tggtttgtca atggcaettt ccaacagtcc 840 acccaggaac tgttcattcc caatattacc gtgaacaata gtggatccta eacgtgccaa 900 gctcacaata gcgacaccgg actcaaccgc acaaccgtga cgacgattac ogtgtatgag 960 ccaccaaaac cattcataac tagtaacaat tctaacccag ttgaggatga ggacgcagtt 1020 gcattaactt gtgagccaga gattcaaaat accacttatt tatggtgggt caataaecaa 1080 agtttgccgg ttagoccacg cttgeagttg tetaatgata accgcacatt gacactcctg 1140 tccgttactc goaatgatgt aggaccttat gagtgtggca ttcagaatga attatccgtt 1200 gatcactccg accctgttat ecttaatgtt ttgtatggcc cagacgaccc aactatatct 1260 ccatcataca cctactaccg tcccggcgtg aacttgagcc tttcttgcca tgoagcatcc 1320 aacceccctg cacagtacte ctggetgatt gatggaaaca ttcageagca tactoaagag 1380 ttatttataa gcaacataac tgagaagaac agcggactct atacttgcca ggccaataac 1440 tcagccagtg gtcacagcag gactacagtt aaaacaataa ctgtttccgc ggagetgccc 1500 aagccctcca tctccagcaa caactccaaa cccgtggagg acaaggatgc tgtggccttc 1560 acctgtgaae ctgaggctca gaacacaaoc tacctgtggt gggtaaatgg tcagagcoto 1620 ccagtcagtc ccaggctgca gctgtccaat ggcaacagga ccctcactct attcaatgtc 1680 acaagaaatg acgcaagagc cCatgtatgt ggaatccaga actcagtgag tgcaaaccgc 1740 agtgacccag tcaccetgga tgtcctctat gggccggaca cccccatcat ttccccccca 1800 gactegtctt acctttcggg agcggacctc aacctctcct geeactcgge ctctaaccca 1860 tcccegcagt attcttggcg tatcaatggg ataccgcagc aacacacaca agttctcttt 1920 atcgccaaaa tcaegccaaa taataacggg acctatgcct gttttgtetc taacttggot 1980 actggccgca ataattccat agtcaagagc atcacagtct ctgcatctgg aacttctcct 2040 ggtctctcag ctggggccao tgtcggcatc atgattggag tgctggttgg ggttgotctg 2100

<210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapíens <400> 25

Ser Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys Arg Ser Arg Hia His 61 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ

<210> 26 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7751" <400> 26 ggacggtagt aggtgtatga tggagatata gttgggtcgt ctgggcc 47

<210> 27 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7760" <400> 27 cagaatgaat tatccgttga tcactcc 27

<210> 28 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7802" <400> 28 cgtgacgacg attaccgtgt atgagccacc aaaaccattc ataac 45

<210> 29 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 7803" <400> 29 gttatgaatg gttttggtgg ctcatacacg gtaatcgtcg tcacg 45

<210> 30 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 8034LZ" <400> 30 ctggcgcgcc ttctttattc tatacttaaa aagtg 35 62 ΕΡ 1 496 939/ΡΤ <210> 31 <211> 36

< 212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Oligo 8035LZ" < 4 0 0 > 31 ctggtaccag aaaaactata tcagagcaac cccaac 36

<210> 32 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Iniciador directo 7569LZ" <400> 32 ttggatccat ggagtctccc tcggcc 26

<210> 33 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <221> fonte <223> /note = "Descrição de sequência artificial: Iniciador inverso 7570LZ" <400> 33 ttggatccct atatcagagc aacccc 26

Lisboa

Claims

ΕΡ 1 496 939/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Vector de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico CEA(6D)-1,2 tal como ilustrada em SEQ ID NO:24.
2. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 1 em que o vector é um plasmideo ou um vector virai.
3. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 2 em que o vector virai é seleccionado de entre o grupo que consiste em poxvírus, adenovirus, retrovirus, herpesvirus e virus adeno-associados.
4. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 3 em que o vector virai é um poxvirus seleccionado de entre o grupo que consiste em vacinia, NYVAC, avipox, variola de canários, ALVAC, ALVAC(2), variola aviária e TROVAC.
5. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 4 em que o vector virai é um poxvirus seleccionado de entre o grupo que consiste em NYVAC, ALVAC e ALVAC(2).
6. Vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda pelo menos um antigénio associado a tumores adicional.
7. Vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando um antigénio associado a angiogénese.
8. Vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando um componente co-estimulador.
9. Composição farmacêutica compreendendo um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 num transportador farmaceuticamente aceitável. ΕΡ 1 496 939/ΡΤ 2/2
10. Utilização de um vector de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para a preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de cancro.
11. Molécula de ADN isolada compreendendo a sequência CEA(6D)-1,2 ilustrada em SEQ ID NO:24.
12. Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 9 para a preparação de um medicamento para prevenção ou tratamento de cancro.
13. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 8 em que o componente co-estimulador é B7.1. Lisboa,