JPH04506666A - ワクチンアジュバントとしてのｌｆａ―３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチンアジュバントとしてのＬＦＡ−３１朋ｍ飢土肛 本発明は、リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）のワクチン混合物中のアジ ュバントとしての利用に関する。ＬＦＡ−３は、Ｔ−リンパ球の増殖を増大させ ることができるので、ワクチンの免疫原性成分に対する免疫応答を促進する。

ｌ五二！盈 免疫系は、病原性生物の感染に対応するために本来進化してきたものである。こ れを達成するために免疫系は、高度に分化されたエフェクター成分と複雑な調節 機構をもっている。

免疫応答は身体の単一の部分に限定されておらず、エフェクター細胞は、リンパ 系器官および種々の身体の部分の内部とそれらの間で移動している。細胞レベル では、病原体に対する免疫応答は、免疫系の種々の細胞間を連絡するｉ雑な系に よってきまる。種々の細胞間でのこの連絡の機構は、細胞対細胞の直接の接触に よって、あるいは分泌する細胞から離れても作用し得る可溶性の分泌されるメゾ イエイタ（サイトカイン＠）によってなされ得る。

免疫応答には一般に二つの面がある。すなわち、異種細胞もしくはウィルスに感 染した細胞を攻撃して殺す細胞毒性１゛細胞の作用を主として含む１嵐１監盃、 および、異種巨大分子物に対して特異的な抗体を分泌する形質細胞に８細胞を活 性化することを含む良喪良座玉とである。

Ｔ細胞は、両方の型の応答に中心的な役割を果たす。そのことは、＜１）細胞毒 性のＴ細胞性応答をする際に標的細胞と直接相互作用することによって、および （２）抗体応答の開始時に、異種巨大分子物を生産する抗原提供性細胞（ＡＰＣ ｓ）と相互作用することによってなされる。後者の場合、ＡＰＣｓがＢ細胞の時 、Ｂ細胞は、予め決定された特異性の抗体を分泌する形質細胞に活性化される。

ヘルパーＴ細胞と呼ばれるＴ細胞の分化したサブセットは、Ｂ細胞の抗体応答の 特異性の増大と「記憶」Ｂ細胞の発生に独特の役割を果たしている。「記憶」Ｂ 細胞は、異物抗原による新たな攻撃に対する追加（ａｎａｍｎｅｓＨｃ）反応も しくは二次反応にとって重要である。

標的細胞および抗原提供細胞とＴ細胞との相互作用は、高度に特異的で、Ｔ細胞 上の高度に特異的な受容体による、標的細胞あるいはＡＰＣ（あるいはＢ細胞） 上の表面抗原の認識によって決まる。この相互作用は、相互作用する細胞の表面 で発現される他の抗原、例えばＴ細胞上のＣＤ３として知られている抗原受容体 複合体あるいはＣＤ４、ＬＦＡ−１、ＣＤ８およびＣＤ２のような池のＴ細胞補 助分子、および抗原提供性細胞上のＬＦＡ−３、Ｉ　ＣＡＭ−１およびＭＨＣの ような補助分子によって容易になり得る。

１９７１球上の補助分子と標的細胞またはＡＰＣｓ　（あるいはＢ細胞）上の補 助分子との相互作用は、細胞間の接着の媒介に重要であり得、そしてリンパ球／ 　ＡＰＣおよびリンパ球／標的細胞の相互作用の効率を増大すると考えられる。

このように、補助分子の相互作用は、標的細胞を殺す細胞毒性Ｔ　’Ｊンバ球と Ｔ細胞性免疫応答（抗体応答を含む）とを一般に媒介するのに重要である。

例えば最近の研究で、ＣＤ２（Ｙリンパ球補助分子）と、１９２８球が標的細胞 へ接着するのを媒介するＬＦＡ−３（標的細胞補助分子）との間に特異的な相互 作用があることが示された。

この接着は、Ｔ　ｌ）ンパ球機能性応答の開始に必須である（Ｍ。

Ｌ、　Ｄｕｓｔｉｎら、　”Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎ ｃｔｉｏｎ−ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＡｎｔｆｇｅｎ−３Ｂｉｎｄｓ　Ｔｏ　ＣＤ ２　Ａｎｄ　Ｍｅｄｆａｔｅｓ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ ″、ムヱ」シ且ｕ４１６５．６７７−９２頁、１９８７年；　Ｓｐｒ！ｎｇｅｒ ら、　′Ｔｈｅ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔ ｅｄ　ＬＦＡ−１，ＣＤ２　ａｎｄ　ＬＦＡ−３ＭｏｒｅｃｕＩｅｓ　：　Ｃｅ １ｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　 Ｓｙｓｔｅｍ”、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ、、５．　２２３−２５２頁、１ ９８７年）。さらニ多量体ミセル形の精製ホスホイノシトールＪ結ＬＦＡ−３（ Ｐｌ−ＬＦＡ−３）　ｉｔ、１９７１球上のＣＤ２に結合し、インビトロで１９ ２８球の増殖を開始することが判明した（Ｍ、　Ｌ、　Ｄｕｓｔ　ｉｎら、　“ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＤ２　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔ ｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　。

ｒ　Ｍｕｌｔｊｍｅｒｉｃ　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｍｅｒ［ｃ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ ｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ａｎｔｊｇｅｎ　３”　、Ｌ」 ］且」ム世１．　１現、５０３−５１７頁、１９８９年）。

古典的なワクチン組成物は、個体もしくは動物に感染して衰弱させ得る生きた病 原体からの次の攻撃に対して予防的に免疫性を与えるために免疫系を活性化する ように設計される。

ワクチンは一般に２つの主要成分を含有している。第一の成分は、宿主の免疫系 が（自分自身でなく）異物として：ｊ！、識する免疫原である。この免疫原は、 通常、弱毒化されたウィルスあるいは細菌の病原体、または病原体由来のタンパ ク質もしくはポリペプチドである。第二の成分はアジュバントである。古典的な アジュバントは、例えばＡｌ（ＯＨ）３　（ミョウトンとして知られている）の ような単純な金属塩から、フロインドアジュバント、すなわち懸濁した結核菌を 含有する油中水の乳濁液のような複合体乳濁混合物にまでわたる。アジュ・イン ドは、免疫原がゆっ（り放出される貯蔵場所を形成することにより主として作用 している。このことにより、機能を複製する生物またはウィルスによる感染中に 、免疫系に与えられる持続的な攻撃を模倣する。アジュバントはまた、免疫系の 細胞を、アジュバントの生物分子自体および含有されている免疫原の両者に強く 感作する、過剰の異種生物分子（例えば結核ｍ）を含有している。この点につい て、アジュバントは特定の免疫原の免疫原性を強化する。

従来用いられているアジュバントには種々の欠点がある。

多くのアジュバントは、投与部位に炎症を起こし、不快感を与える。不活性化さ れたウィルスもしくは細菌源由来のアジュバントもまた毒性であり得、従って、 効力が強いにもかかわらず有用性が制限される。さらに、従来のワクチンは、免 疫系を無差別に刺激して、Ｂ　ＩＪンバ球、単球、好中球およびＴリンパ球を活 動させる。したがって、炎症を起こすことが少なく、毒性が低く、そして特定の 抗原にむけられる細胞（すなわちＴ　ＩＪンパ球およびＢ細胞）を、免疫系の応 答の樟的とする新しいワクチンが要求されている。

１豆Δ！１ 本発明は上記の従来のアジュバントの欠点を克服するものである。本発明の１つ は、ＬＦＡ−３および免疫原とを含み、ワクチン混合物を形成する組成物である 。アジュバントと免疫原の両者は、宿主動物内での免疫原に対する免疫応答を刺 激し増大させるのに充分な量で存在している。本発明の他の面は、ＬＦＡ−３ア ジュバント／免疫原理合物を宿主の動物に投与することを含む予防接種法である 。本発明の特に好ましい態様は、免疫原およびアジュバントとしてのＬＦＡ−３ ，そしてさらにＣＤ２以外のＴ細胞表面分子（例えばＣＤ３）またはＬＦＡ−３ が結合しているのと同一もしくは異なるＣＤ２のエピトープを認識するリガンド もしくは抗体（すなわちＴｉｔｓ）を含むコアジ１バンドを含有するワクチンで ある。ＣＤ２のエピトープの１つを認識する抗体の例としては、抗Ｔ１　ｈ、抗 Ｔ１１２、抗Ｔｉｔｓ、９．６、ＣＤ２．Ｉ、９−１．３５．１、Ｄ６１ｉおよ びＧＴ２が含まれる。本発明の組成物および方法は、投与部位における刺激およ び炎症と、アジュバントが原因の毒性の副作用とを実質的に回避する。さらに免 疫原の存在下でＬＦＡ−３を使用すると、Ｔ　’Ｊンパ球の繁殖が劇的に増大す るので、免疫原に対する細胞性免疫応答を強化しワクチンの効力を増大させる。

殴ｉユ１星呈五皿 図１は、単球を除去し各種の刺激を与えたヒト末梢血液のリンパ球（ＰＢＬｓ） が分泌する免疫グロブリンのレベルを示すグラフである。リンパ球は、一定量の 抗−ＴｉＩ４のみ、異なる濃度のＰＩ−ＬＦＡ−３のみ、または一定量の抗Ｔ１ １２および異なる１度のＰＩ−ＬＦＡ−３の組み合わせの存在下で７日間培養し た。

図２は、単球を除去し各種の刺激を与えたヒト末梢血液リンパ球による免疫グロ ブリンの分泌レベルを示すグラフである。リンパ球は、Ｐ　［−ＬＦＡ−３のみ （１０μｇ／ｍｌ）、異なる濃度の抗Ｔ１１２のみ、または一定量のＰＩ−ＬＦ Ａ−３（ＬＯμｇ／ｍｌ）および異なる濃度の抗Ｔ１１２もしくは同じイソタイ プのマウス骨髄腫免疫グロブリン（ＩｇＧ２ｓ）との組み合わせの存在下で７日 間培養した。

λ更二ｍ礼五 用いられるＬＦＡ−３は、宿主細胞と適合する限り、どの起源と形状のＬＦＡ− ３でも適切である。例えばヒトｌ、ＦＡ−３は、ヒトに使用するのを目的として 、本発明によるワクチンにアジュバントとして使用されるべきである。しかし本 発明では、交差反応性が不利な副作用なしで認められる場合にはＬＦＡ−３を交 差種に利用することを意図する。例えば、霊長類のＬＦＡ−３がヒト内で活性で あることが測定され、重大な副作用がなければ、この交差種利用は本発明の概念 に含まれる。用いるＬＦＡ−３の形状は、それ自体、宿主に対して毒性もしくは 免疫原性が限定されているべきである。好ましくは、ＬＦＡ−３は、完全なＬＦ Ａ−３分子であるかまたはＣＤ２に結合できる断片である。さらに好ましくは、 ＬＦＡ−３は、カルボキシ末端のホスファチジルイノ／トール連結を有する形状 である（　Ｐ　Ｉ−ＬＦＡ−３）。これについては、本願に援用され、そして係 属出願中で共通して譲渡されてしする、１９８８年８月２６日出願の米国特許第 ２３７．３０９号にすべて述べられている。さらに好ましいＬＦＡ−３は、多量 体ミセルの形態である。最も好ましくは、ＬＦＡ−３は８量体ミセルの形態のＰ ｉ−ＬＦＡ−３である。

ＬＦＡ〜３は、活性化された１９７７４球の増殖を促進するか、または、Ｔリン パ球細胞表面の受容体部位の架橋反応をもたらすのに充分に高い結合親和性をも たらすすべての形態であり得る。

ＬＦＡ−’３の一次アミノ酸配列゛の小さな変異は生じ得、そしてそのＬＦＡ− ３誘導体がＣＤ２受容体と結合する限り、本発明の範囲に含まれる。さらにアミ ノ酸の部位特異豹変具体、非天然のアミノ酸類、ペプチド構造類似体もしくはホ スホイノシトール類似体もＬＦＡ−３を増強するか、またはＬＡＦ−３分子の一 部を置換するのに使用し得る。可溶性の形状のＬＦＡ−３もまた使用し得る。

このような修飾は、ＬＦＡ−３アジ１ノ寸ントの生物学的安定性を改善したり、 またはＬＦＡ−３分子から形成されるＬＦＡ−３ミセルの構造を変えるのに利用 し得る。例えば、興なる疎水性部分力ｆＰＩ−ＬＦＡ−３のカルボキシ末端のホ スホイノシトール付加部分を置換するのに用いられる。あるいは、好ましくはＬ ＦＡ−３のカルボキシ末端に疎水性部分が結合したＬＦＡ−３誘導体は、多価ミ セルを形成し得る。しかしこのようなミセルの化学量論（ま、特定のＬＦＡ−３ 誘導体、および用いられる疎水性部分によって決まる。

その他の適切な疎水性部分としては例えばホスファチジルエタノールアミンがあ る。

あるいは、ＬＦＡ−３は、融合タンパク質、連結タンパク質および免疫接合体の ような接合体の形態であり得る。例えば組換え技術を用いて、ＬＦＡ−３を、免 疫原、コアシュバント、または例えばＣ４結合性タンパク質のドメイン、または ホスホイノ／トールに結合するゲルンリンのアミノ酸配列のような、ＬＦＡ−３ を凝集させるタンパク質配列に連結された融合タンパク質として発現させ得る。

またＬＦＡ−３は、公知の方法で化学的に免疫原に連結させて、免疫系に関して ２つの機能を有する単一分子として得る。組換え手法あるいは化学的に免疫原に 連結したＬＦＡ−３は、免疫原特異的Ｂ細胞と、その免疫原に連結されたＬＦＡ −３によって刺激されるＴ細胞との生産的な細胞間相互作用を刺激することによ って、その免疫原に対する抗体反応を著しく促進する。ＬＦＡ−３はまた、例え ば抗Ｔ１１３抗体もしくは抗ＣＤ３抗体がＬＦＡ−３と連結している場合のよう に抗体に連結している時、免疫接合体の形態であり得る。ＬＦＡり接合体の混合 物もまた使用し得る。使用される構造にかかわらず、ＬＦＡ−３はリンパ球の活 性化を増強するのに充分な時間、インビボで存在するべきである。

ＬＦＡ−３は、天然源もしくは組換え体源から実質的に純粋な形態で得ることが できる。例えば、Ｐｌ−ＬＦＡ−３は、単離され、精製され、そして上記の方法 （Ｓｐｒｉｎｇｅｒの１９８９年の文献）にしたがってミセルの形状に変換し得 る。選択は、本発明の範囲から逸脱することなく、通常用いられる単離と精製の 方法で行い得る。組換え体ＬＦＡ−３と組換え体ＰＩ一連結ＬＦＡ−３をコード する遺伝子をもっているプラスミドは、ブタベスト条約の協約下にあるＩｎ　Ｖ ｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに、受託番号ＩＶＩ−１０１３３および ｌＶ［−４（１１８０で寄託されている。

免疫原は、免疫原に対する免疫応答を誘発し得るすべての生物学的系であり得る 。免疫原は、天然源、ＭｔｌＪえ体源もしくは合成像またはその混合物に由来し 得る。さらに免疫源は実質的に純粋な形態で用い得るし、または生物分子の粗混 合物でもあり得る。免疫原はウィルス源もしくは細ｍｇから得ることができる。

例えば、免疫原は、尋常性ざ癒、カリエス、コレラ、淋病、ヘモフィルス園、ク レブシラ園、ラクトバシルス菌、らい病、はしか、髄膜炎、中耳炎、百日咳、風 疹、梅毒、赤痢菌、マラリア、口蹄疫、アデノウィルス、ＡＩＤＳ。

ＨＴＬＶ、　ＣＭＶ、　ｆ　７グ熱、ＧＥＶ、単純ヘルペス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝 炎、非Ａ非Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ラッサ熱、ハラインフルエン ザ、肺炎、パルボウィルス、ロタウィルスまたはＲＳＶの原因物質に由来し得る 。免疫原の細ｍ＃もしくはウィルス源は、一般に、熱もしくは化学的処理によっ て不活性化するかまたは弱毒化される。

宿主内で免疫応答を引き起こすのに必要なアジュバントと免疫原の雪には相互関 係があるが、通常のワクチンに一般に用いられる範囲内にある。例えばアジ１バ ントの使用量を増加させると免疫原の使用量を減らし得、またその逆のことも行 い得る。アジュバントの好ましい量は、１投回の投与量当り、約０．０５μｇと 約５．０ｍｇとの間である。より好ましくは約０８μｇと約２．０ｍｇとの間の 量が使用される。免疫原の好ましい量は、１回の投与量当り、約０．０５μｇと 約５ｍｇとの間である。より好ましくは約０．８μｇと約２ｍｇとの間が使用さ れる。当業者は、投与量がワクチンを受ける宿主と、その大きさ、重量、代謝な どによってきまることを理解する。免疫原を多量に投与すると悪寒、発熱などの 副作用を起こし得る。臨床上の利益がこれらの副作用よりまさる場合は、免疫原 の多量投与は本発明の範囲に含まれる。

本発明の組成物は、他の医薬的に重要なポリペプチドに対して使用されるのと類 似の方法と組成物を用いて調合し得る。

したがってアジュバントおよび免疫原は凍結乾燥された形態で貯蔵され、投与さ れる前に生理的に許容される賦形剤で還元される。あるいは、アジュバントと免 疫原は賦形剤中に貯蔵し得る。好ましい賦形剤は滅菌溶液である。好ましい賦形 剤にはリン酸緩衝生理食塩水のような滅菌緩衝液が含まれる。

賦形剤内でアジュバントと免疫原とを組み合わせる、混合物の免疫反応性を保持 するすべての方法が適切である。

賦形剤は、混合物の保存性もしくは効力を改善するのに用いられる保存剤などの 公知の添加物を含有し得る。適切な保存剤としては、例えばチメロサールが含ま れる。

ワクチン混合物はまた、リンパ球の活性化を刺激するＬＦＡ−３の能力を補充す る追加の物質をも含有し得る。例えば、ＬＦＡ−３と、Ｔ　’Ｊンパ球（もしく は他の細胞）の表面分子と反応性のコアシュハントとの組合わせを用い得る。宿 主免疫系が刺激されて、本発明のワクチンに対して非常に速く反応する。

したがってＬＦＡ−３と任意にコアシュバントを含有するワクチン混合物は、治 療に使用し得る。適切なコアシュバントは、免疫応答に関与する細胞の他の表面 分子もしくはこのような分子を認識するその断片、そのような細胞表面分子に対 する抗体（表面抗原に結合するｌ／１４とＦｕの抗体断片を含む）、またはその 混合物であり得る。好ましくは、これらの添加物質は、Ｔ細胞表面分子を認識す る抗体であり、最も好ましくは、ＬＦＡ−３が認識するのと同一もしくは異なる ＣＤ２のエピトープを認識する抗体である。最も好ましいコアシュバントは、Ｔ １１＋エピトープすなわちＬＦＡ−３が認識するのと同じＣＤ２エピトープを認 識する抗体（例えば抗Ｔｌｈ）：またはＴ１１２エピトープもしくはＴｌ１ａエ ピトープを認識する抗体（例えば抗Ｔ１１２もしくは抗Ｔ１１３であり、これら はＬＦＡ−３がＥｍするのと異なるＣＤ２エピトープを認識する）；またはそれ らの組合わせである。

本発明のワクチンの一回の投与の容積は、変化し得るが、一般に、従来のワクチ ンに通常用いられる範囲内にある。−回投与の容積は、好ましくは約０．１１と 約１．０ｍｌの間であり、さらに好ましくは約０．２ｍｌと約０．５ｍｌとの間 である。

本発明のアジュバント／免疫原混合物は、すべての都合のよい手段で投与し得る 。好ましい投与法には、皮下、腹腔内、筋肉内もしくは静脈内の注射が含まれる 。あるいは、この混合物は、生体拡散性移植物から放出させ得る。単一投与法を 用い得るし、あるいは、好ましくは数日間もしくは数週間にわたる一連の投与も 行い得る。

以下の実施例は、本発明を例示するのを目的とするものであり、本発明を限定す るものではない。

宜１」ロー 多量体ＰＩ−ＬＦＡ−３を下記の方法で単離した。ホスホイ／７トールを連結し た形態の［、ＦＡ−３＜ｐｒ４ＬＦＡ−３＞をコードするＬＦＡ−３のｃＤＮＡ で形質導入したＣＨＯ細胞を、ローラーボトル内でコラーゲンビーズ上に、１． ２ＸＩＯ’細胞／ｍｌまで増殖させた。ＤＭＥＭ培地中の、細胞で覆われたビー ズ１５０ｍ１を、３７℃で３ｏ分間、５０ｍｇのコラゲナーゼで処理した。細胞 を沈澱にし、ＬＯＱｍｌの調製培地で２回洗浄し、次にＳｈ＋ＩのＩＸＰＢＳ、 次いで５０ｍ１のダルベｌコの培地で洗浄した。細胞の沈澱物を、２０ｍ　ｌの ＰＢＳ、　２％ＮＰ４０，１単位／ｌｌ１ｌのトリプシン阻害剤、１ａ＋Ｍ　Ｐ ＭＳＦ中で４℃にて２時間インキュベートした。次に細胞を、７０．Ｉ　Ｔｉベ ックマン超遠心分離ローターを用いて、４℃にて７５分間、４０．００Ｏｒｐｍ で沈澱させた。上澄み液を、実質的にＤｕｓｔｆｎらの、よＬ旦ム二笠−一、土 、５０３〜５１７頁（１９８９年）に記載されているように、ＴＳ２／９アフィ ニティカラムに注入した。

我々は、１９７８球の産生を増大するＰＩ−ＬＦＡ−３の性能を以下の方法で評 価した。静脈穿刺によって採取したヒト全血を、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　Ｓｅｐ ａｒａｔｆｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＯＲＧＡＮＯＮ　ＴＥＫＮＩＫＡ）の上に置 いて、血漿、赤血球細胞および多形核細胞から、末稍血液ソンパ球（ＰＢＬｓ） を分離した。そのＰａＬをＲＰＭ＋−１５４０（ＣＩＢＣＯ）中に入れた。その 増殖培地は、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１０ ０単位ペニシリンＧ／ｒｎ　ｌ増殖培地１００μｇのストレプトマイシンＧ／１ ｒｒｌ増殖培地、および５．５ｘ　１０−５Ｍ　２−メルカプトエタノールとし た。

増殖培地中で懸濁された細胞を、組織培養物で処理したプラスチック皿〔ｃｏｓ ｒＡＲ，ｚ−米国、マサチューセッツ州、ケンブリッジ〕の上にのせ、３７℃で １サイクル当り１時間を２サイクルで培養し、単球を皿に付着させた。溶液中懸 濁したままになっている１９７８球と８９７８球を、ピペットで取出して、９６ ウ工ル組織培養皿の平底ウェルに移した。５０μｍの増殖培地のｌＸｌ０’個の 細胞を各ウェルに添加した。

上記の９６ウエル（すべて懸濁細胞が入っている）をグループ分けして、ホルボ ールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、抗Ｔ１１２　（米国、マサチューセ・ ンツ州、ボストンのＤａｎａ−ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｆｔｕｔｅ のε、Ｒｅ１ｎｂａｒｚ氏から譲渡された）、ＰＩ−ＬＦＡ−３、これら３ｐＪ の添加物の種々の混合物を添加したもの、またこれら添加物なしのコントロール を入れた。このように細胞添加物を添加しないコントロールと、細胞に加えて、 ＰＭＡ、抗Ｔ１１２、ＰＩ−Ｌ、ＦＡ−３、ＰＭＡと抗丁１１２、ＰＭＡとＰＩ −１，ＦＡ−３、ＰＩ−ＬＦＡ−３と抗ＴＩＬ２、ならびにＰＭＡと抗Ｔ１１２ とＰＩ−ＬＦＡ−３をそれぞれ添加したウェルとを同数づつ作製した。

ＰＭＡが入っているウェルについては、ホルボールミリステートアセテート（Ｐ ＭＡ）を含有する増殖培地の貯蔵溶液５０μｌを添加してウェル中のＰＭＡの最 終ａ度を０．６ｎｇ／ｍｌにした。

抗Ｔ　１１２が入っているウェルについては、増殖培地中に抗Ｔ１１２を含有す る貯蔵溶液５０μｍを用いて、抗Ｔｌ　ｔ２含有ウェルの最終希釈率をｌ　：１ ０００とした。抗体の貯蔵溶液は、抗ＴＬ１２を産生ずるハイブリドーマを腹腔 内に注射されたマウスから採取した腹水を１　：２５０に希釈することによって 調製した。採取した直後の腹水は約１　ｍｇ／ａｔの抗Ｔ１１２を含有していた 。

ＰＩ−ＬＦＡ−３が入っているウェルについては、ミセル状ＰＩ〜ＬＦＡ−３を 含有する増殖培地５０μｍを次にウェルに添加した。ＰＩ−ＬＦＡ−３の濃度を 変化させて、すなわち３　ｎｇ／ｍｌ、　３０ｎｇ／ｍｌおよび３００ｎｇ／ｍ ｌの濃度で、試験した。

各ウェルの全体積は２００μｌであった。ＰＭＡ、抗Ｔ１１２もしくはＰ　Ｉ− ＬＦＡ−３が特定のウェルから省略されている場合は、次に充分な増殖培地を加 えて全体積を２００μｌにした。

その溶液を３７℃で６６６時間インキュベートた。その時に、１マイクロキニー リーの〔３Ｈ〕−チミジンを含有する５０μｌの培地を各ウェルに添加し、その 溶液をさらに３７℃で６時間インキュベートした。

ウェルの内容物を、５ＫＡＴＲＯＮハーベスタ−（米国、バージニア州、スター リング、５ＫＡＴＲＯＮ　Ｉｎｃ、）の中で繰り返し洗浄し、それによって細胞 を自動的に溶解して、濾紙上の細胞のＤＮＡを集め、次いで濾紙を５ＫＡＴＲＯ Ｎβプレートシンチレーシヨンカウンターで測定した。１９７８球の増殖を、［ ３日］−チミジンの取込量を検出することによって直接測定した。

４つの試験結果を下記の表に示す。

カウント７分で測定した場合の最大のＴリンパ球増殖は、ＰＭＡ、抗Ｔ１１２お よびＰＩ−ＬＦＡ−３が共存している場合に生じた。Ｐｌ−ＬＦＡ〜３による１ ９７８球増大の始まりは、３０ｎｇ／ｍｌの濃度で生じた。この濃度では、濾紙 に付着した〔３Ｈ〕チミジンによるカウント７分の平均数は１９５，７７９であ った。ＰＩ−ＬＦＡ−３を省略したこと以外、記載したのと同じ対照試験から得 たカウント数は２０００カウント／分であった。

夫立五且 以下の実施例では、抗Ｔ１１３、抗ＴＬ１２　（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａ ｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国、マサチューセッツ州、ボストンのＥ、　Ｒ ｅｌｎｈｅｒｚ氏から譲渡された）、Ｐｉ−ＬＦＡ−３、およびこれらの種々の 組合わせの存在下でのリンパ球の増殖を試験した。

ＰＢＬを組織培養物で処理したプラスチック皿内で培養しなかったこと以外は実 施例１と同様にして、ＰＢＬを単離した。細胞を増殖培地に入れ、５０μｌの増 殖培地中１×１０５の細胞を、９６ウエルのＵ形底組織培養プレートの各ウェル に添加した。試験溶液を５０μｌずつの特定のウェルに加えて、指定の最終濃度 にした。対照のウェルは培地およびＰＢＬのみを含有していた。

試験ウェルには次のものを入れた。腹水で最終希釈率１　：９００に希釈した、 抗ＣＤ２モノクローナル抗体の抗Ｔ１１２と抗Ｔ１１３の組み合わせ、または抗 Ｔｌ１２およびＰ　Ｉ−ＬＦＡ−３、または抗Ｔｌ１３およびＰＩ−ＬＦＡ−３ 、または各化合物単独である。ＰＩ−ＬＦＡ−３（実施例１と同様にして調製） を０．０１５〜０．５μｇ／ｍｌの範囲で濃度を増大させて添加した。全ウェル を全て、増殖培地で最終体積１５０μｌにした。細胞を３７℃で３日間インキュ ベートし、その後、２０マイクロ牛ユーリー／ＩＩ＋１のＣ３Ｎ）−チミジン５ ０μｌを加えて細胞を３７℃で１２時間インキコベートした。この時点で細胞を 溶解し、実施例１と同様の方法で回収した。Ｔ　ｌ）ンパ球の増殖は、〔３Ｈ〕 −チミジンの取込量を検出することによって直接測定した。結果を次の表に示す 。

（以下余白） １　、＃１　のカウント　ＸＩＯづ ＰＩ−ＬＦＡ−３α−Ｔ１１２４３　α−Ｔｌ　１３　α−Ｔｌ　１２　緩衝液 ＬＣ虹　添加　添加　添加　添加 ０．５００　４０１　３２０　１９　４０．２５０　３７５　２４０　１３　４ ０．１２５　４１３　１９６　１１　６０．０６０　３６０　１３４　８　５ ０．０３０　３６８　６８　９　６ ０．０１５　２９０　２９　７　６ 培地、対照　９．ＯＯＯｃｐｍ ａ−Ｔ１１２＋ｓ＋緩衝液　２７０．ＯＯＯｃｐｍａ−７１１３または（！−Ｔ １１２＋緩衝液　５，０００ｃｐｍ上記の試験結果は、ＰＩ−ＬＦＡ−３を、抗 Ｔ１１３との組合わせで用いるかまたは抗Ｔｌｈと抗Ｔ１１２の両方との組合わ せで用いたときに、リンパ球の増殖が著しく増大することを示した。

支敷五立 以下の実施例では、抗Ｔ１１２とＰＩ−ＬＦＡ−３の存在下での抗体分泌に対す る、Ｔ細胞依存性のＢ細胞活性化作用を示す（図１および図２参照）。

ＰＢＬをＡｍｅｒｉｃａｎ赤十字（Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｂ ｌｏｏｄ　５ｅｒｖｉｃａＳ）から購入したバフィーコート細胞から実施例１に 記載した方法で単離した。リンパ球分離培地（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；米国 、ニューシャーシー州、ビスカタウエイ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）から単離し、 単球を除いて洗浄した後、細胞を増殖培地に入れ、９６ウ工ルＵ形底組織培養プ レートの各ウェルに、２ＸＩＯ５細胞を含有する５０μＩの増殖培地を添加した 。正の対照のウェルには（試験ウェルに対する添加と同じ体積にする意味での増 殖培地以外には）なにも添加しなかった。一つの試験における試験ウェルには（ 図１参照）、一定量の抗Ｔ１１２抗体のみを含有させるが（腹水での最終希釈率 １　：　９００）、または異なる量のＰＩ−ＬＦＡ〜３を組合わせて含有させた 。別の試験の試験ウェル（図２参照）には、一定量のＰ　［−ＬＦＡ−３（１０ ｕ　ｇ／ｍ　１）だけを含有させるか、または異なる量の抗Ｔ１１２抗体を組み 合わせた。負の対照ウェルには、抗Ｔ１１２抗体の免疫グロブリンと同じイソタ イプのマウス骨髄腫免疫グロブリン（１ｇＧａａ）を単独で、またはＰ　Ｉ−Ｌ ＦＡ−３と組み合わせて（１０μｇ／＋１）含有させた。添加物はすべて増殖培 地で溶解および／または希釈した。添加をすべて終えた後、各培養ウェルは２０ ０μｌの増殖培地を含有していた。細胞を、５％Ｃ０２大気中、７日間３７℃で インキュベートした。７日間経過後、１００μ】の調整培養培地の上澄液（すな わち細胞が入っていない）を取り除き、３試料をプールしアッセイするまで一２ ０°Ｃで保持した。ヒトのＩｇＧクラスおよび１ｇＭクラスに対する精製ヤギ抗 体（米国ペンシルバニア州マルバーン、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉａ＋ａ＋ｕｎｏｒｅ ｓｅａｒｃｈから購入）でコートしたマイクロタイターＥＬＩＳＡプレート上で 前記調整培地をインキュベートすることによって、その培地のＧとＭのクラスの ヒト免疫グロブリンをアッセイした。ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびヤギ抗ヒトＩｇＭ でコートしたＥＬＩＳＡプレートに結合している調製培養培地中に存在するヒト 免疫グロブリンは、ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびヤギ抗ヒトＩｇＭのアルカリホスフ ァターゼ接合体で検出した。

結合した酵素は、未着色の物質を着色生産物に変換することによって発色させた 。色の発色度は、培養物上澄液のヒト１ｇの貢と直接相関するが、Ｍｏ１ｅｃｕ ｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ　ＥＬＩＳＡ　ｒｅａｄｅｒを用 い、４０５ｎｍの波長で定量した。

単球が存在しない精製Ｔ細胞と８細胞の培養物は、７日間の培養期間中、免疫グ ロブリンを分泌した。添加物が存在しない場合、そのＩｇ分泌のレベルを「１０ ０％対照レベル」ト呼ヒ、そのプレート上の各試験培養物中のＩｇの量は、この １００％対照（添加物なし）レベルと関係する。図１に示す結果は、一定レベル の抗Ｔ１１２抗体および異なる量のＰＩ−ＬＦＡ−３の存在下で培養した単球除 去ＰＢＬは１ｇ産生が著しく促進されていることを示している。図２に示す結果 は、一定レベルのＰＩ−ＬＦＡ−３および異なる量の抗Ｔ１１２抗体の存在下で 培養した単球除去ＰＢＬは］ｇ産産生が著しく促進されていることを示している 。これらの結果は、Ｔ細胞依存性の８細胞による免疫グロブリン分泌の活性化の ための、Ｐ　Ｉ−ＬＦＡ−３を含有する組成物のアジュバントの性質を確認して いる。

Ｋ亘五工 とｈ　ＬＦＡ−３およびＢ型肝炎コア抗原を含有するワクチン混合物を試験して 、インビボモデル中のアジュバントとしてのＬＦＡ−３の影響を研究する。　Ｏ ，０１−１，Ｏａ＋ｇのミセル状ＰＩ−ＬＦＡ−３および０、０１−１．０ｍｇ のＢ型肝炎コア抗原（Ｂｉｏｇｅｎ　Ｉｎｃ、、米国、マサチューセッツ州、ケ ンブリッジ）を含有するワクチン混合物を、１ケ月間隔で３回、アカゲザルの筋 肉内に注射した。アカゲザルの対照群には、ＰＩ−１，ＦＡ−３、Ｂ型肝炎コア 抗原、および緩衝液をそｎそれ単独で注射した。サルから全血を次の時間に採取 した。すなわち免疫前、免疫中は一週間毎、および免疫後−年間は１ケ月間隔で 採取した。血清を凝固した全血液から取出し、Ｂ型肝炎コア抗原に対する抗体の 存在をＥＬ　Ｉ　ＳＡア。

セイで確認した。ＰＩ−ＬＦＡ−３のアジコバント活性は、対照群のサルから得 た血清の力価と比較した場合、抗Ｂ型肝炎コア抗原抗体の力価が大きいか、また はＰＩ−ＬＦＡ−３およびＢ型肝炎コア抗原の両者を受けているサル由来の血清 中にそのような抗体がより長時間存在することによって証明される。免疫された サルの中の細胞の免疫機能を評価するために、実施例１と同様の方法で、ヘパリ ンを添加した全血液からＰＢＬを単離し、マイクロタイター組織培養プレート中 、標準の組織培養条件下、Ｐ　Ｉ−ＬＦＡ−３の存在下および非存在下で０．０ ０１−０．１ｍｇのＢ型肝炎コア抗原とともにＰＢＬを培養することによって、 活性化された１９７３球の増殖をアッセイした。その増殖は、実施例１と同様に ３〜５日間の培養の後、　〔３Ｈ〕−チミジンの取込量によって測定した。アジ ユバントの効力の証拠が、対照群のアカゲザルの１９７３球の増殖に比べて、コ ア抗原とＰＩ−ＬＦＡ−３を受けているアカゲザルの１９７３球の増殖の方が増 大していることで証明されている。

案１１髭ｉ ヒトＣＤ２　（ｈ−ＣＤ２）　ｌ−ランスジェニックマウス（英国、ミルヒル、 ＤｉＩＩＩｉｔｒｉ　Ｋｉｏｕｓｓｉｓ氏から譲渡された）を、インビボでＴ　 １，１ンバ球の活性化を促進するＰＩ−１，ＦＡ−３の能力を測定するためにモ デル系として用いる。ヒトＣＤ２は、ヒトＴ細胞に対するのと同様の方法で、マ ウスＴ細胞にＴ細胞活性化シグナルを導入することが分かった。この試験では、 ｈ−ＣＤ２−　トランスジェニックマウスに、ＰＩ−ＬＦＡ−３およびオボアル ブミンの量を増大しながら、注射し、第１対照群のｈ−ＣＤ２−トランスジェニ ックマウスにはオボアルブミンだけを注射した。第２対照群のｈ−ＣＤ２−　ト ランスジェニックマウスにはＰＩ−ＬＦＡ−３だけを注射した。増大する投与を 行うための、０．１〜８μｇのＰＩ−ＬＦＡ−３と０゜１〜ＬＯＯμｇのオボア ルブミンを含有する０、１ｍｌ滅ｍ　ＰＢＳを、ｈ−ｃＤ２−トランスジェニッ クマウスに皮下注射する。対照マウスに・　は、０．１〜１００μｇのオボアル ブミンを含有するＯ、　１ｍｌ滅１１ＰＢｓかまたは０．１〜８ｔ１ｇのＰＩ− ＬＦＡ−３を含有する０、１ｍ１２１１２！ＩＰＢＳを注射する。ｈ−ＣＤ２　 トランスジェニックマウスのＬＦＡ−３活性についての別の対照として、非トラ ンスジェニック（正常）マウスの群を、上記と同じ成分で免疫化する。８〜１４ 日後、免疫性を評価するために、排出するリンパ節を取り出して、リンパ球の単 細胞懸濁液を単離する。そのリンパ球を、１０％の加熱不活性化ラン胎児血清、 ２ｍＭＬ−グルタミン、１００単位ベニンジンＧ／ｍｌ増Ｍ培地、１００μｇス トレプトマイシンＧ／ｍ　Ｉ増殖培地および５．５Ｘ　ｌｏ”Ｍ　２−メルカプ トエタノールのＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養する。得られた細胞を９６ウエ ルの組織培養皿の平底ウェルに移す。２　Ｘ　１０５個の細胞を含有する５０μ ｌの増殖培地を各ウェルに添加する。

０．１〜１００μｇ／ＩＩＩＩの範囲の増大する量のオボアルブミンを受けるウ ェルをグループ分けして、ウェルの最終容積を２００μｌにした。リンパ球を２ 〜５日間インキュベートし、そのときに、１マイクロキニ一リー／ｍｌの［３Ｈ ］−チミジンを含有する５０μｌの増殖培地を各ウェルに加える。その培養した リンパ球をさらに６時間インキュベートする。細胞を回収し、　〔３Ｈ］−チミ ジンの取り込み量を実施例１に記載したのと同様にして測定するａ さらに、抗オボアルブミン抗体反応を従来のＥＬＩＳＡ法を用いて測定する。免 疫する前と免疫の２週間後、マウスから採血し、その血液を凝固させ、吸引した 血清の段階希釈液を抗オボアルブミン活性についてアッセイする。

我々は、マウスに注射されたＰ　１−ＬＦＡ−３７オボアルブミンによって、オ ボアルブミンだけを注射したマウスよりも、著しく抗オボアルブミン免疫応答が 増大されることを見いだすと考えている。

闘　ロー　χロ　＜め ｋ　ｏＣ＆、Ｚロ　（− 果ｍ 免疫源と、アジユバントとしてのＣＤ２、すなわち１９２８球の表面受容体に結 合しうるＬＦＡ−３もしくはＬＦＡ−３の断片とを含有するワクチンが開示され ている。ＬＦＡ−３は、活性化されたＴ細胞の増殖を著しく促進し、その結果免 疫応答を増大し得ることが見出された。ＬＦＡ−３を免疫原性接種物とともに用 いる予防接種方法もまた開示されている。

国際調査報失 ｗｕＩｌｓｈｍａ＋＾＃Ｎ−Ｎ、、ＰＣＴ／ＵＳ９１１００５０８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（１）免疫原性成分、および（２）アジュバント成分とを含有しているワク チンであって、該アジュバントがＬＦＡ−３もしくはＣＤ２と結合し得るその断 片を含有しているワクチン。 ２．前記ＬＦＡ−３がＰＩ−ＬＦＡ−３である請求項１に記載のワクチン。 ３．前記ＰＩ−ＬＦＡ−３が多量体形である請求項２に記載のワクチン。 ４．前記ＬＦＡ−３がミセルの形態である請求項３に記載のワクチン。 ５．前記ＬＦＡ−３が接合体の形態である請求項１に記載のワクチン。 ６．請求項１に記載のワクチンであって、前記免疫原性成分が、尋常性ざ瘡、カ リエス、コレラ、淋疾、ヘモフィルス菌、クレブシラ菌、ラクトバシルス菌、ら い病、はしか、髄膜炎、中耳炎、百日咳、風疹、梅毒、赤痢菌、マラリア、口蹄 疫、アデノウイルス、ＡＩＤＳ、ＨＴＬＶ、ＣＭＶ、デング熱、ＧＢＶ、単純ヘ ルペス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ラッ サ熱、パラインフルエザ、肺炎、パルボウイルス、ロタウイルスおよびＲＳＶか らなる群の疾患の原因となる物質の弱毒化物質から選択される組成物を含有する 、ワクチン。 ７．前記ＬＦＡ−３成分と前記免疫原性成分が連結されている請求項１に記載の ワクチン。 ８．さらに、Ｔリンパ球の表面抗原に結合するポリペプチドもしくは抗体からな るコアジュバントを含有する請求項１に記載のワクチン。 ９．前記コアジュバントが、抗Ｔ１１１、抗Ｔ１１２もしくは抗Ｔ１１３である か、またはＣＤ２のエピープを認識するその断片である、請求項７に記載のワク チン。 １０．以下の（１）および（２）を哺乳類に接種することを包含する予防接種法 ： （１）疾患に対する免疫性を前記哺乳類に与え得る免疫原；および （２）主にＬＦＡ−３もしくはＣＤ２に結合し得るその断片からなるアジュバン トの、前記免疫原に対する哺乳類の免疫応答を促進するための有効量。 １１．前記ＬＦＡ−３がＰＩ−ＬＦＡ−３である、請求項９に記載の方法。 １２．前記Ｐｌ−ＬＦＡ−３が多量体の形態である、請求項１０に記載の方法。 １３．前記ＬＦＡ−３がミセルの形態である、請求項１１に記載の方法。 １４．前記ＬＦＡ−３が接合体の形態である請求項９に記載の方法。 １５．請求項９に記載の方法であって、前記免疫原性成分が、尋常性ざ瘡、カリ エス、コレラ、淋疾、ヘモフィルス菌、クレブシラ菌、ラクトバシルス菌、らい 病、はしか、髄膜炎、中耳炎、百日咳、風疹、梅毒、赤痢菌、マラリア、口蹄疫 、アデノウイルス、ＡＩＤＳ、ＨＴＬＶ、ＣＭＶ、デング熱、ＧＢＶ、単純ヘル ペス、Ａ型肝炎、Ｂ型抗炎、非Ａ非Ｂ型抗炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、ラッ サ熱、バラインフルエンザ、肺炎、パルボウイルス、ロタウイルスおよびＲＳＶ からなる群の疾患の原因である物質の弱毒化物質から選択される組成物を有する 、方法。 １６．前記ＬＦＡ−３が免疫原に直接連結されている請求項９に記載の方法。 １７．請求項９に記載の方法であって、前記哺乳類に、（３）Ｔリンパ球の表面 抗原に結合するポリペプチドもしくは抗体からなるコアジュバントをも接種する 、方法。 １８．前記コアジュバントが、抗Ｔ１１１、抗Ｔ１１２もしくは抗Ｔ１１３、ま たはＣＤ２のエピトープを認識するその断片である請求項１５に記載の方法。 １９．細菌もしくはウイルスの疾患に対する治療上の処置であって、該疾患を起 こす物質によって活性化されたＴリンパ球の増殖を促進するのに有効な量の以下 の（１）および（２）の組合わせを前記疾患にさらされた哺乳類に投与すること を包含する方法： （１）ＬＦＡ−３；および （２）抗Ｔ１１１、Ｔ１１２、Ｔ１１３、その断面もしくはその組み合わせ。