JPH05213995A

JPH05213995A - Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原のアミノ酸残基配列

Info

Publication number: JPH05213995A
Application number: JP3279035A
Authority: JP
Inventors: Carlo Ferrari; カルロ・フエラーリ; Giuseppe Colucci; ジユセツペ・コルツチ
Original assignee: KURONITO SpA; Clonit SpA
Current assignee: KURONITO SpA; Clonit SpA
Priority date: 1990-07-31
Filing date: 1991-07-30
Publication date: 1993-08-24
Anticipated expiration: 2015-01-17
Also published as: DE69100129T2; JP3000569B2; EP0469281A1; DK0469281T3; GB9016727D0; CA2048029A1; DE69100129D1; KR920002629A; ES2058992T3; EP0469281B1; ATE90689T1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】下記式ＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡのアミノ酸配列から成るＴ細胞刺激ポリペプチドに関す
る。【効果】上記ポリペプチドは、ＨＢｓＡｇのようなポリ
ペプチド免疫原に有効に連結し得る。Ｂ型肝炎ウイルス
の診断薬キット及びワクチンに利用される。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、式（Ｉ）ＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡ（Ｉ）のアミノ酸残基配列から成り、Ｂ型肝炎ウイルスの診断
薬キット及びワクチンに有用な、Ｔ細胞刺激ペプチドに
関する。抗エンベロープ抗体がウイルス粒子を中和する
ことができ、従ってＢ型肝炎ウイルス（以下ＨＢＶとす
る）感染に対する防護を与えることができることは公知
である。この事実に基づいて、Ｂ型肝炎表面抗原（以下
ＨＢｓＡｇとする）慢性保有者からの精製又は組換えＤ
ＮＡ技術による産生によるＨＢｓＡｇから成るワクチン
が開発されて、ＨＢＶ感染の予防に非常に有効であるこ
とが明らかにされた（ＷＯ−Ａ−８８１０３０１号及び
ＥＰ−Ａ−３５４１０９号参照）。充分な抗体応答は健
康な人の９０％以上で現行のＨＢｓＡｇワクチンにより
誘発されるのが普通であるが、無応答性のワクチン接種
者の割合は血液透析患者及び他の免疫無防備状態の人の
間では遥かに高く、この人々は更に、防御免疫応答を発
生するために投与の数を増加し、かつ免疫原の量を多く
することを必要とする。免疫原性能力を増強したワクチ
ンを産生する企図として、ＨＢＶエンベロープのプレＳ
配列、即ちＨＢｓＡｇ蛋白質の特定領域全体又は対応す
るアミノ酸残基配列を有するペプチドを、ＨＢｓＡｇを
基剤とするワクチンに封入することが提案されている。
いずれにしても、ＨＢｓＡｇはＴ細胞応答を刺激するに
は充分有効であり得ないことが明らかである。Ｔ細胞の
病因的重要性が高い根拠は、ＨＢＶ抗原を発現する自己
肝細胞は末梢血Ｔ細胞によりインビトロで溶解できるこ
と、及びこの現象はＨＢｓＡｇにより感作された単クロ
ーン抗体によって選択的に遮断できることの発見であ
る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞が細胞傷害及びウイ
ルス合成の部位の感染肝に存在することも近頃観察され
た。このようにＴ細胞の役割は慢性ＨＢＶ感染している
患者では特に明確であって、即ちこの種の患者ではイン
ビトロ末梢血Ｔ細胞応答は急性ＨＢＶ感染症を有する患
者が示すよりも劇的に低い。この差異は、検出可能な水
準のＴ細胞感作の出現が自己限定（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉ
ｔｅｄ）急性ＨＢＶ感染症の被験者の血清に由来するウ
イルス粒子のクリアランスと連関していると思われるの
で、重要な病因上の意味を有し得る。前記の見地から、
ＨＢｓＡｇ基剤ワクチンの能力を増強してＴ細胞応答を
刺激できるようにするためＨＢＶの他の成分の使用は、
特に慢性ＨＢＶ感染症の場合に望ましい。他方で、ＨＢ
Ｖヌクレオカプシド又はＢ型肝炎コア抗原（以下ＨＢｃ
Ａｇとする）は、もっと免疫原性の大きい抗ＨＢＶワク
チンの開発のための良い候補を意味し、何故ならばそれ
が非常に強力なＴ細胞免疫原であるからである。ＨＢｃ
Ａｇは慢性及び急性のＨＢＶ感染の場合肝臓内Ｔ細胞に
対する重要な感作抗原であって、感染肝実質細胞の免疫
攻撃に対する標的構造を表わすようである。ＨＢｃＡｇ
を用いるチンパンジーとウッドチャックの免疫処置はＨ
ＢＶ感染に対する完全な又は一部の防護を提供する。更
にＨＢｃＡｇは他の抗原に対する担体及びアジュバント
して機能することができる。ＨＢｃＡｇは、その完全な
アミノ酸配列中に、ＨＢｃＡｇの有効性を低下させるＴ
細胞抑制活性を有する残基が幾らかあることが知られて
いるため、それ自体ワクチン中に使用することができな
いことは自明である。ＵＳ−Ａ−４，８８２，１４５号
はＨＢｃＡｇのＴ細胞刺激アミノ酸残基配列から成るペ
プチドを開示している。特に前記特許には次のアミノ酸
残基配列の使用を開示している。ペプチド名称アミノ酸残基配列ｐ１−２０ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＴＶＥＬＬＳＦＬＰｐ２８−５２ＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨｐ７０−９４ＴＷＶＧＶＮＬＥＤＰＡＳＲＤＬＶＶＳＴＶＮＴＮＭＧｐ８５−１００ＶＶＳＹＶＮＴＮＭＧＬＫＦＲＱＬｐ８５−９６ＶＶＳＹＶＮＴＮＭＧＬＫｐ１００−１２０ＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＩＥＹＬＶｐ１００−１１０ＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦｐ１２０−１４０ＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬｐ１２０−１３１ＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡｐ１２９−１４０ＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬｐ１２５−１３６ＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮこれらはＨＢｃＡｇに対するマウスＴ細胞応答について
優れた特異性を提供することが判明した。式（Ｉ）ＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡ（Ｉ）を有し、ＨＢｃＡｇのアミノ末端から５０〜６９の位置
に対応するアミノ酸残基配列が、試験したヒト患者のほ
とんど全員にＴ細胞応答を引出すことができることがこ
こに判明したのは驚くに値する。従って、本発明は、基
本的に式（Ｉ）のアミノ酸残基配列（Ｉ）から成るＴ細
胞刺激ポリペプチドに関する。このＴ細胞刺激ポリペプ
チドは前記ポリペプチドを化学的に合成するか、又は前
記ポリペプチドを組換えＤＮＡ技術により調製する方法
により製造される。Ｔ細胞刺激ポリペプチドはＨＢＶ用
診断薬キット及びＨＢＶに対するワクチンに有用であ
る。本発明は更に、ポリペプチド免疫原に有効に連結し
た式（Ｉ）のＴ細胞刺激ポリペプチドから成る複合ポリ
ペプチド免疫原をも提供する。こうして式（Ｉ）のＴ細
胞刺激ポリペプチドはポリペプチド免疫原の免疫原性を
増強する。本発明は複合ポリペプチド免疫原の製造方法
をも提供し、その方法はＴ細胞刺激ポリペプチドをポリ
ペプチド免疫原に有効に連結することから成る。添付の
図面中、第１図〜第４図は、４人の代表的な患者の急性
ＨＢＶ感染症において、異なる時間（横座標）に２つの
他のＴ細胞を刺激するペプチドと対比して、ＨＢｃＡｇ
及び式（Ｉ）のペプチドに対する末梢血単核分裂（以下
ＰＢＭＣとする）反応（縦座標は刺激指数）の測定を説
明している。第５図及び第６図は、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅ
Ａｇ（即ちコア分子のカルボキシ末端の３９のアミノ酸
残基を欠くＨＢｃＡｇ欠失変異体）及びＨＢｃＡｇ（第
５図）又はＨＢｅＡｇ（第６図）のいずれかにより刺激
される末梢血Ｔ細胞から産生される２つの代表的多クロ
ーン性Ｔ細胞の合成ペプチドに対する増殖応答（刺激指
数）を説明している。第７図は、ペプチド５０〜６９を
用いて刺激した末梢血Ｔ細胞から産生される４つの代表
的多クローン性Ｔ細胞系（横座標）の無関係ペプチド２
０〜３４、ＨＢｃＡｇ及びペプチド５０〜６９に対する
増殖応答（縦座標ｃｐｍ×１０００）を説明している。
第８図は、５０〜６９のペプチド誘発によるＴ細胞分裂
反応のＨＬＡ制限を説明している。５０〜６９に特異的
な代表的ペプチド初回感作を受けた多クローン性Ｔ細胞
系に対し、刺激性ペプチドと一緒に抗ＨＬＡクラスＩ及
び抗ＨＬＡクラスＩＩのモノクローナル性抗体を添加
し、^３Ｈ−チミジン取込み反応を３日後に測定した。本
発明者は、急性ＨＢＶ感染症及び異なるＨＬＡハロタイ
プを有する患者の９５％以上で認識される、コア分子の
内部に式（Ｉ）に対応する免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏ
ｍｉｎａｎｔ）Ｔ細胞ペプチド（ＡＡ−５０〜６９）を
発見した。従って、本Ｔ細胞ペプチドは、既存の組換え
ＨＢＶエンベロープワクチンに対する免疫応答を増強
し、かつ無応答ワクチンのＨＢｓＡｇ粒子に対する寛容
（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を克服するため活用し得る。同
様に、細胞溶解性Ｔ細胞による認識に対し肝実質細胞表
面に発現されるコアエピトープを隠蔽することにより抗
ＨＢｃ抗体が感染した肝の死滅を阻害し得る可能性が示
唆されるのに鑑みて、式（Ｉ）のペプチド５０〜６９が
純粋なＴ細胞認識部位を表わすということが合成ワクチ
ンにそれを封入することについて関連があり得る。更
に、本発明の免疫優性Ｔ細胞ペプチドは、全合成ワクチ
ン、即ちＨＢｓＡｇを含まないワクチンの良好な候補を
意味する。本発明のアミノ酸配列５０〜６９は、抗ＨＬ
Ａ単クローン性抗体による遮断実験とペプチド−プライ
マーＴ細胞系の表現型解析によって示されるように、Ｈ
ＬＡクラスＩＩ分子によってペプチドフラグメントを認
識するＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に活性化すると思われ
る。このペプチドがＨＢｃＡｇ反応性の患者のほとんど
により認識されるという観察は、それが多数の異なるＨ
ＬＡ対立遺伝子と効率的に結合できる可能性を与える。
式（Ｉ）のＴ細胞刺激ポリペプチドはポリペプチド免疫
原に有効に連結して複合ポリペプチド免疫原を得る。式
（Ｉ）のポリペプチドのＴ細胞刺激機能及びそれと免疫
反応する抗体を誘発するポリペプチド免疫原の能力とは
両方とも複合ポリペプチド免疫原に保持されている。正
に、式（Ｉ）のポリペプチドの存在はポリペプチド免疫
原の免疫原性を増強している。式（Ｉ）のポリペプチド
はアミノ酸残基側鎖を介してポリペプチド免疫原に有効
に連結し得る。一つの官能基でジスルフィド連結を発生
し、他方ではペプチド連結を発生する異種二官能性試薬
が有用であって、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）が挙げられ
る。この試薬はその物自体と１つの蛋白質のシステイン
残基との間にジスルフィド連結と、もう１つの蛋白質の
リジンのアミノ基又は他の遊離アミノ基を介してアミド
連鎖をつくる。かようなジスルフィド／アミド形成試薬
は公知のものが様々ある。たとえばＩｍｍｕｎ．Ｒｅ
ｖ．（１９８２）６２：１８５を参照されたい。他の二
官能性カップリング剤はジスルフィド連結よりもむしろ
チオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤
の多くは市販で得られ、６−マレイミドカプロン酸、２
−ブロモ酢酸、２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド
−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸等の反応性
エステルが挙げられる。カルボキシル基をスクシンイミ
ド又は１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナ
トリウム塩と結合させて活性化することができる。特に
有用なカップリング剤はスクシンイミジル４−（Ｎ−マ
レイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラー
ト（ＳＭＣＣ）である。式（Ｉ）のボリペプチドは、ペ
プチド結合を介してポリペプチド免疫原に有効に連結し
得る。従って、そのアミノ酸配列が、式（Ｉ）のＴ細胞
刺激ポリペプチドの配列とポリペプチド免疫原の配列の
両方から成るポリペプチドを提供し得る。かような融合
蛋白質は化学合成又は組換えＤＮＡ技術により製造し得
る。式（Ｉ）のポリペプチドとポリペプチド免疫原は相
互に直接融合し得る。代りに、多数のスペーサー用アミ
ノ酸残基をその中間に提供し得る。かようなスペーサー
基としては１０個まで、たとえば５個までのアミノ酸残
基から成り得る。式（Ｉ）のポリペプチドのカルボキシ
末端をポリペプチド免疫原のアミノ末端に融合し得、又
はその逆もあり得る。換言すれば、式（Ｉ）のポリペプ
チドとポリペプチド免疫原は本発明の融合蛋白質におい
て頭一尾配置に並んでいる。式（Ｉ）のポリペプチドと
ポリペプチド免疫原は共有結合で連結する必要はない。
本発明のＴ細胞刺激ポリペプチドと問題の病原関連ポリ
ペプチドを有効に連結するもう１つの方法は、たとえば
リポソーム及びＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）のような
人工粒状構造の内部への包括が挙げられる。ワクチンの
有効成分を送達するビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）として
のリポソーム及びＩＳＣＯＭの使用はそれらの製造と同
様、技術上よく知られている。たとえば、リポソーム製
造については、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｔｅｃｈ，３：２３５〜２４１（１９８６）及
びＮｏｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：７５０４〜０８（１９８２）、
並びにＩＳＣＯＭ製造についてはＭｏｒｅｉｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ，３０８：４５７〜４６０（１９８７）及びＤ
ａｌｓｇａａｒｄ，Ａｒｃｈｇｅｓ．Ｖｉｒｕｓｆｏ
ｒｓｃｈ．，４４：２４３〜２５４（１９７４）を参照
されたい。このように、本発明のリポソーム及びＩＳＣ
ＯＭは、有効成分として、本発明のＴ細胞刺激ポリペプ
チド及び病原関連ポリペプチドを含む。ポリペプチド免
疫原は抗体誘発エピトープ、即ちＢ細胞エピトープから
成る。このエピトープはウイルス、細菌、真菌又は原生
動物の抗体誘発エピトープであり得る。それに対して抗
体産生が望まれるポリペプチド免疫原はどれも、式
（Ｉ）のＴ細胞刺激ポリペプチドに連結することができ
る。好ましい実施態様として、ポリペプチド免疫原は病
原関連免疫原であって、複合ポリペプチド免疫原は有効
量を動物に注射する場合、病原と免疫反応する抗体の産
生を誘発する能力を有する。特に重要な免疫原の例とし
ては、細菌たとえば、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉ
ｓ）、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｏｓａ）、パラチフスＡ
菌及びＢ菌（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｏｉｄＡａｎｄ
Ｂ）、ジフテリア菌（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ
ｅ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）、ボツリヌス菌
（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ガス壊疽菌（Ｃ．ｐｅｒ
ｆｒｉｎｇｅｎｓ）、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉ
ｓ）、ペスト菌（Ｐ．ｐｅｓｔｉｓ）、ウシの脳出血性
敗血症病原菌（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、コレラ菌
（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｅｅ）、
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、梅毒
病原体（Ｔ．ｐａｌｌａｄｉｕｍ）等から誘導される免
疫原、ウイルスたとえばポリオウイルス、アデノウイル
ス、パラインフルエンザウイルス、はしか、おたふくか
ぜ、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ウマの脳
脊髄炎ウイルス、豚コレラウイルス、ニューカッスル病
ウイルス、鶏痘ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ及びイ
ヌのジステンパーウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒト及び
サルの免疫不全ウイルス等から誘導される免疫原、リケ
ッチア免疫原たとえば発疹チフス及び発疹熱、並びに紅
斑熱群等がある。有用なポリペプチド免疫原はＢ型肝炎
ウイルス、インフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、
ポリオウイルス、単純疱疹ウイルス、狂犬病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス又は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａ
ｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のエピトープ
から成る。好ましいポリペプチド免疫原は、ＨＢｓＡｇ
又はＨＢｓＡｇのアミノ酸配列の一部分から成るポリペ
プチドである。本明細書で使用する場合、ＨＢｓＡｇと
は、天然に生じる繊維状及び球状の２２ｎｍの粒子であ
って、個々の腫瘍ポリペプチド及びそれらのグリコシル
化形態が粒子を構成するもの（たとえばｐ２５／ｇｐ２
８、ｐ３８／ｇｐ４２及びｇｐ３３／ｇｐ３６）、並び
にアミノ酸配列が個々の蛋白質及び糖蛋白質の部分に対
応する合成ポリペプチドを意味する。こうして、１つの
実施態様としては、病原関連免疫原は繊維状又は球状の
ＨＢｓＡｇである。もう１つの実施態様としては、病原
関連免疫原は３３ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎのＨＢｓＡｇ蛋
白質又は２５ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎのＨＢｓＡｇ蛋白質
である。又別の実施態様としては、ポリペプチド免疫原
は、アミノ末端位とカルボキシ末端位の中間に位置する
ＨＢｓＡｇのプレＳ領域の一部分に対応する合成ポリペ
プチドであって、それぞれ１〜２１、１６〜２７、３２
〜５３、５３〜７４、９４〜１０５、９４〜１１７、１
２０〜１４０、１２０〜１４５、１２８〜１３８、１３
３〜１３９、１３３〜１４０、１３３〜１４３、１３３
〜１４５、１３５〜１４３、１３５〜１４５、１３７〜
１４３、１３３〜１５１及び１５３〜１７１から成るグ
ループから選択される。更に別の実施態様としては、ポ
リペプチド免疫原はアミノ末端位とカルボキシ末端位の
中間に位置するＨＢｓＡｇのＳ領域の一部分に対応し、
それぞれ１１０〜１３７、１１７〜１３７、１２２〜１
３７及び１３５〜１５５から選択される。Ｔ細胞刺激ポ
リペプチド、融合蛋白質及び典型的にはポリペプチド免
疫原は合成ペプチドである。それらは化学合成により製
造し得、特にこの種のポリペプチドが短い程そのように
なる。ポリペプチドは単一のアミノ酸及び／又は２つ以
上のアミノ酸残基で予め形成されたペプチドから、所望
のポリペプチドの配列の順序に構築される。固相合成法
では、所望のアミノ酸配列は、不溶性レジンに結合され
ているＣ末端アミノ酸から逐次構築される。所望のポリ
ペプチドができた場合、それをレジンから切断する。溶
液相合成法でを使用する場合、所望のポリペプチドをＣ
末端アミノ酸から再び構築し得る。この酸のカルボキシ
基は適当な保護基により終始封鎖されたままであって、
合成の最後に除去される。固相又は溶液相のいずれの手
法を使用するとしても、反応系に添加する夫々のアミノ
酸は保護アミノ基と活性化カルボキシ基を有するのが典
型的である。側鎖官能基もやはり保護する。合成の各ス
テップの後で、アミノ保護基を除去する。側鎖官能基は
一般に合成の最後に除去する。ポリペプチドは組換えＤ
ＮＡ技術によっても製造し得る。そこで、ポリペプチド
をコード化するＤＮＡ配列を提供する。製造される発現
ベクターはＤＮＡ配列を取込み、かつ適当な宿主に与え
る場合ポリペプチドを発現する能力を有する。ＤＮＡ配
列はベクターの翻訳のスタートとストップのシグナルの
間に位置する。適宜な転写調節要素も提供し、特にＤＮ
Ａ配列に対するプロモーター及び転写終了部位である。
ＤＮＡ配列はペプチドの発現がベクターと適合性の宿主
に起ることができるような正しいフレーム内に提供す
る。適宜の宿主−ベクター系を使用し得る。ベクターは
プラスミドであり得る。その場合は、細菌宿主又は酵母
宿主を使用し得る。代りに、ベクターはウイルスベクタ
ーであり得る。これは、ペプチド発現を生起すために哺
乳動物細胞系の細胞トランスンフェクションに使用し得
る。複合ポリペプチド免疫原は中和抗体を生じることが
できる。従って、それはヒトに対するワクチンとして使
用し得る。予防接種は有効量の複合ポリペプチド免疫原
を患者に投与することにより達成される。従ってヒトに
は有効量の複合ポリペプチド免疫原を投与することによ
りポリペプチド免疫原に対してワクチン接種し得る。経
口経路、又は皮下、静脈内若しくは筋肉内のような非経
口経路を採用し得る。投与量は種々の要因たとえば複合
ポリペプチド免疫原の型、患者の容態及び治療の目的に
応じて変る。典型的には、経口又は非経口のいずれかの
経路により、１回の投与量につき１〜１，０００μｇ、
更に好ましくは１回の投与量につき１０〜１００μｇの
量で複合ポリペプチド免疫原を投与する。式（Ｉ）のＴ
細胞刺激ポリペプチドは０．０１〜１００μｇ／ｍｌ、
特に１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で使用することができ
る。予防接種の目的には、式（Ｉ）のポリペプチド又は
複合ポリペプチド免疫原を薬学的に許容し得る担体又は
希釈剤を用いて製剤化するのが典型的である。慣用の製
剤、担体、アジュバント及び希釈剤を使用し得る。これ
らは投与経路により決定されるのは勿論である。適当な
担体及び希釈剤には、フロインド不完全アジュバント
（ＩＦＡ）、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ
−デキストラン、ムラミルジペプチド、鉱油、中性油た
とえばミグリコール（ｍｉｇｌｙｃｏｌ）、植物油たと
えば落花生油、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）ポリオール又
はＲｉｂｉアジュバント系（ＧＢ−Ａ−２１８９１４１
号）が挙げられる。

【実施例】以下の実施例により本発明を説明する。実験方法１．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）応答試験急性Ｂ型肝炎の患者２３名（女子６名と男子１７名）に
ついて試験した。診断は、血清中のＩｇＭ抗ＨＢｃ抗体
の検出並びに黄疸及び急性肝炎の他の典型的症状の最近
の発症と連関して血清グルタミン酸ピルビン酸トランス
アミナーゼ（ＳＧＰＴ）活性の値の上昇（正常の上方水
準の少くとも１０倍）の発見を根拠にした。患者は全員
疾病から完全に回復し、トランスアミナーゼの正常化と
血清からのＨＢｓＡｇの浄化を生じた。対照実験をＨＢ
Ｖに以前に接触の形跡のない１３名の健康な対象者につ
いて実施した。即ち彼らはＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｇに対
する抗体（抗Ｈｓ）及びＨＢｃＡｇに対する抗体（抗Ｈ
Ｂｃ）について陰性であった。ＨＢｃＡｇに対するＴ細
胞応答の優れた（繊細な）特異性の検討には急性Ｂ型肝
炎の前記患者を選択した。何故ならばＨＢｃＡｇ及びＨ
ＢｅＡｇに対するＴ細胞応答の強い水準が、ＨＢＶ感染
の急性段階中でいつも検出可能なためである。本研究に
使用した、ＨＢｃＡｇ及びＨＢｅＡｇの１７個の合成ペ
プチド類似体の完全なリストを表１に示す。残基の重複
したペプチドは少ししかなかったけれども、Ｔ細胞エピ
トープの少くとも１つは各患者について確認された。１
人（表１の患者１２号）を除いて種々のＨＬＡプロタイ
プの患者全部が５０〜６９配列に対するＴ細胞応答の有
意水準を示したことは注目に値する。０．０１μｇ／ｍ
ｌのように低濃度のこのペプチドは数名の患者の末梢血
Ｔ細胞について刺激的であって、末梢血Ｔ細胞を１〜１
０μｇ／ｍｌの本発明ペプチドの存在下に培養する場合
一般的に最高の増殖を達成した。表１には、急性Ｂ型肝
炎の患者２１名のＨＢｃＡｇ合成ペプチドに対するＰＢ
ＭＣ応答を報告する。ＰＢＭＣ（２×１５^５細胞／ウェ
ル）を０．０１〜１００μｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度
のペプチドの存在下に培養した。

【表１】

【表２】注：＋＋＋は有意な分裂反応が１μｇ／ｍｌより低いペ
プチド濃度で得られたことを意味する。＋＋は有意な分
裂反応が１〜１０μｇ／ｍｌのペプチド濃度で得られた
ことを意味する。＋は試験濃度では全く分裂反応が得ら
れなかったことを意味する。Ｔ細胞及び非Ｔ細胞の精製
母集団を用いて行った分画実験で表１の結果を確認し、
かつ非分画ＰＢＭＣと精製Ｔ細胞（ＡＰＣとしての自己
照射非Ｔ細胞を用いて同時培養した）はコアペプチド類
似体５０〜６９を用いて刺激した場合に同様な用量−応
答曲線を描くことを示した。２．ＨＢＶ抗原の調製（ａ）ＨＢｃＡｇの組換え（ｒ）標品を、Ｕ．Ｓ．−
Ａ．−４，７１０，４６３号に記載のように、ＨＢｃＡ
ｇをコード化する遺伝子を有する組換えプラスミドを収
容する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ
１２菌株ＨＢ１０１の細菌抽出物から得た。Ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅＢｌｕｅ染色のＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲルの走査型デンシトメーター測定により定量した純度
は約９０％であった。（ｂ）ヒト細胞質ＨＢｃＡｇ（ｈＨＢｃＡｇ）をＭ．
Ａ．Ｐｅｔｉｔ及びＪ．Ｊ．Ｐｉｌｌｏｔ，Ｖｉｒｏ
ｌ．，６３：６４３（１９８６）の記載したように透析
時の患者の肝から精製した。このコア標品は、ＨＢｅＡ
ｇ／ＨＢｃＡｇ活性比＜０．０２で固相放射性免疫定量
により１：２の希釈度まで特異的に検出される高度のＨ
ＢｃＡｇ活性を有していた。（ｃ）コア分子のカルボキシル末端３９アミノ酸残基を
欠くＨＢｃＡｇ欠失遺伝子（ＨＢｅＡｇ）を大腸菌で産
生した。この抗原標品の純度は９９．８％であった。こ
れを本明細書中ｒＨＢｅＡｇとして表示する。３．合成ペプチドの調製コア領域及びプレコア領域にコード化されたペプチドの
完全配列に対応する、１０〜２０子の残基の長さのペプ
チド１７分子を多重ペプチド方式（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｓｔｅｍ）（ＬａＪｏｌｌａ
社、米国カリホルニア州）により合成した。抗原分子の
両親媒性領域及びＲｏｔｈｂａｒｄアルゴリズムを基本
とする構造的モチーフの存在を考慮に入れてペプチドを
設計した。この研究で使用し、コア及びプレコアで誘導
されるポリペプチドのＮＨ_２−末端からのアミノ酸の位
置で指示される合成ペプチドのアミノ酸配列は以下のも
のである：即ち１〜２１，２０〜３４，２８〜４７，３
８〜５４，５０〜５９，５０〜６４，５０〜６９，７０
〜８９，８２〜１０１，１００〜１１９，１１７〜１３
１，１２０〜１３９，１３１〜１４５，１４０〜１５
５，１５５〜１６９，１６９〜１８３，２０プレコア〜
２コアである。４．末梢血Ｔ細胞の単離新たにペパリン添加した血液からフィコール−ハイパッ
ク比重差遠心によりＰＢＭＣを分離した。Ｔ細胞及び非
Ｔ細胞は、２−アミノエチルイソチウロニウムプロミド
（ＡＥＴ，ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．モンタナ州）で処理したヒツジ赤
血球を用いてＰＢＭＣをロゼット化して単離した。Ｅロ
ゼット形成Ｔ細胞は、フィコール−ハイパック比重差法
により非ロゼット化（非Ｔ）細胞から分離した。Ｔ細胞
及び非Ｔ細胞の分画の純度は、赤血球浸透溶血の後で抗
ＣＤ３＋単クローン性抗体を用いる直接免疫蛍光法によ
り評価した。Ｔ細胞集団はＣＤ３＋細胞を９５％より多
く含有するが、非ロゼット化分画には３％より少いＣＤ
３＋細胞しか含有されなかった。単離した細胞集団は、
２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄニューヨーク
州）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲン
タマイシン及び１０％のヒトＡＢ陽性血清を補足したＲ
ＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ，ニューヨーク州）
（完全培地）の中に再懸濁し、１×１０^５細胞／ｍｌと
した。５．ＨＢｃＡｇ特異的Ｔ細胞系の単離別々の濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）のＨＢｃＡ
ｇ、ＨＢｅＡｇ又は合成ペプチドの存在下に９６ウェル
のプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサ
チューセッツ州）の丸底ウェル中で末梢血Ｔ細胞を培養
した。７日後、活性化Ｔ細胞をＩＬ２（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＩｔａｌｉａＳ．ｐ．
Ａ．，ミラノ）を添加して増殖させた。２０Ｕ／ｍｌの
ｒＩＬ２を補足した培地で、適宜のＨＢＶ抗原に加えて
照射（３０００ｒａｄ）自己末梢血Ｔ細胞を抗原提示
細胞（ＡＰＣ）として用いて培養系を更に５〜７日後に
再刺激した。この時点から、コロニーを７日ごとに再刺
激し、再刺激の中間に補足のＩＬ２−含有培地を与え
て、細胞濃度を３×１０^５〜１×１０^５細胞／ｍｌの間
に保持した。６．増殖反応測定法非分画の末梢血Ｔ細胞（２×１０^５細胞／ウェル）を、
異なる濃度（０．０１、０．１、１、１０、１００μｇ
／ｍｌ）の各ＨＢＶ抗原及び前記の合成ペプチドの存在
下に空気中ＣＯ_２５％の雰囲気中３７℃で７日間９６ウ
ェルのマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅマサチューセッツ州）で保温培養した。
選択した実験では、精製末梢血Ｔ細胞（１×１０^５細胞
／ウェル）を自己照射（３０００ｒａｄ）非Ｔ細胞
（１×１０^５細胞／ウェル）をＡＰＣに用いて保温培養
した。多クローン性Ｔ細胞系の検討では、Ｔ細胞をよく
洗浄して、ＩＬ２とＦＣＳ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ，ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ニューヨー
ク州）を除去した。続いて、別々の濃度のＨＢＶ抗原又
は合成ペプチドの存在下に完全培地中で１×１０^４細胞
／ウェルの自己照射（３０００ｒａｄ）末梢血Ｔ細胞
をＡＰＣに用いて５×１０^５細胞／ウェルを３日間保温
培養した。増殖反応測定法はすべて三重で行なって、採
取の１８時間前に^３Ｈ−チミジン（０．５ｕＣｉ／ウェ
ル；比活性２．０Ｃｉ／ｍＭ；ＡｍｅｒｓｈａｍＩｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，英国）を
添加した。結果は３回の反覆試験測定の毎分の平均計数
値として、刺激指数（ＳＩ）即ち抗原の存在下に得られ
る毎分の平均計数値と抗原の不存在下で得られる毎分の
平均計数値の比で表わす。ａ）１０名の患者で、自生ヌクレオチドカプシミド抗
原、即ち１．−ｂ項で調製したＨＢｃＡｇ及びＨＢｅＡ
ｇ並びに合成ペプチド類似体に応答する、末梢血Ｔ細胞
増殖を症状期及び回復期の間調べた。有意水準の増殖Ｔ
細胞応答の出現の時間は、コアペプチド類似体に対する
有意なＴ細胞応答の検出の時間と常に対応した。それは
刺激性配列がコア特異的Ｔ細胞の活性化に関与するヌク
レオチドカプシド処理の産生物を表わすことを示す（図
１）。ｂ）刺激性コアペプチドがヌクレオチドカプシド特異的
Ｔ細胞により認識されるコア分子の断片を実際上表わす
かどうかを更に研究するために、自生抗原（１．−ｂ項
参照）及びＩＬ２を用いる末梢血Ｔ細胞刺激により５名
の患者からＨＢｃＡｇ及びＨＢｅＡｇ特異的多クローン
性Ｔ細胞系を産生した。ＨＢｃＡｇ及びＨＢｅＡｇに対
し特異的に反応性であるが、他のＨＢＶ抗原（エンベロ
ープ抗原）にはそうでないＴ細胞系は、親末梢血Ｔ細胞
により認識される関連ペプチドの存在下に限り有意水準
の増殖を示した（図２）。相互補足実験（ｒｅｃｉｐｒ
ｏｃａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）では、関連合成ペプ
チドを用いる末梢血Ｔ細胞刺激により産生される多クロ
ーン性Ｔ細胞系は自生コア分子を認識することができ
（図３）、合成ペプチドにより表わされるアミノ酸配列
が自生コア分子の処理の後事実上入手できることが確か
められた。コアペプチドのＴ細胞認識は、ＨＬＡクラス
ＩＩ制限を受け、何故ならば多クローン性Ｔ細胞系のペ
プチド誘発増殖は抗ＨＬＡクラスＩＩ単クローン性抗体
（抗ＤＰ、抗ＤＲ及び抗ＤＱ）によって有意に阻害され
るが、抗ＨＬＡクラスＩ単クローン性抗体によっては阻
害されないためである（図４）。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、ＨＢｃＡｇ及び式（Ｉ）のペプチド
に対する末梢血単核増殖応答を、他の２つのＴ細胞刺激
ペプチドと対比して説明する。

【図２】第２図は、ＨＢｃＡｇ及び式（Ｉ）のペプチド
に対する末梢血単核増殖応答を、他の２つのＴ細胞刺激
ペプチドと対比して説明する。

【図３】第３図は、ＨＢｃＡｇ及び式（Ｉ）のペプチド
に対する末梢血単核増殖応答を、他の２つのＴ細胞刺激
ペプチドと対比して説明する。

【図４】第４図は、ＨＢｃＡｇ及び式（Ｉ）のペプチド
に対する末梢血単核増殖応答を、他の２つのＴ細胞刺激
ペプチドと対比して説明する。

【図５】第５図は、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ及び２つの
代表的合成ペプチドに対する増殖応答を説明する。

【図６】第６図は、ＨＢｃＡｇ、ＨＢｅＡｇ及び２つの
代表的合成ペプチドに対する増殖応答を説明する。

【図７】第７図は、ＨＢｃＡｇ、ペプチド５０〜６９及
び無関係ペプチドに対する増殖応答を説明する。

【図８】第８図は、５０〜６９ペプチド誘発Ｔ細胞増殖
のＨＬＡ制限を説明する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/13 8413−4Ｃ 39/145 8413−4Ｃ 39/205 8413−4Ｃ 39/21 8413−4Ｃ 39/245 8413−4Ｃ 39/29 ＡＣＳ 8413−4Ｃ 39/39 ＡＤＹ 8413−4ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/51 Ｃ１２Ｑ 1/70 8114−4ＢＧ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/576 Ｂ 9015−2ＪＣ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】本質的に式（Ｉ）：ＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡ（Ｉ）のアミノ酸配列から成る、Ｔ細胞刺激ポリペプチド。
【請求項２】ポリペプチド免疫原に有効に連結した、
請求項１に記載のＴ細胞刺激ポリペプチドからなる複合
ポリペプチド免疫原。
【請求項３】Ｔ細胞刺激ポリペプチドを、アミノ酸残
基側鎖を介してポリペプチド免疫原に有効に連結した、
請求項２に記載の免疫原。
【請求項４】Ｔ細胞刺激ポリペプチドをペプチド結合
を介してポリペプチド免疫原に有効に連結した、請求項
２に記載の免疫原。
【請求項５】Ｔ細胞刺激ポリペプチドをリポソーム又
は免疫刺激複合体の内部に包括することによりポリペプ
チド免疫原に有効に連結した、請求項２に記載の免疫
原。
【請求項６】ポリペプチド免疫原がウイルス、細菌、
真菌又は原生動物の抗体誘発エピトープから成る、請求
項２〜５のいずれか一項に記載の免疫原。
【請求項７】エピトープがＢ型肝炎ウイルス、インフ
ルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、ポリオウイルス、
単純疱疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルス又は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のエピトープである、請求項６
に記載の免疫原。
【請求項８】ポリペプチド免疫原がＨＢｓＡｇ又はＨ
ＢｓＡｇのアミノ酸配列の一部から成るポリプチドであ
る、請求項２〜５のいずれか一項に記載の免疫原。
【請求項９】請求項１に記載のＴ細胞刺激ポリペプチ
ドの製造方法であって、前記ポリペプチドを化学的に合
成すること、又は前記ポリペプチドを組換えＤＮＡ技術
により調製することから成る、前記方法。
【請求項１０】請求項２に記載の複合ポリペプチド免
疫原の製造方法であって、前記Ｔ細胞刺激ポリペプチド
をポリペプチド免疫原に有効に連結することから成る、
前記方法。
【請求項１１】薬学的に許容し得る担体若しくは希釈
剤及び請求項１に記載のＴ細胞刺激ポリペプチド又は請
求項２〜８のいずれか一項に記載の複合ポリペプチド免
疫原から成るワクチン。