ES2290449T3 - Acido nucleico de cea modificado y vectores de expresion. - Google Patents
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Abstract
Vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico CEA (6D)-1, 2 como se ilustra en la SEC. ID. nº: 24.
Description
Ácido nucleico de CEA modificado y vectores de
expresión.
La presente invención se refiere a un ácido
nucleico que codifica un polipéptido y a la utilización del ácido
nucleico o polipéptido para prevenir y/o tratar el cáncer. En
particular, la invención se refiere a vectores mejorados para la
inserción y expresión de genes extraños que codifican antígenos
tumorales para su utilización en el tratamiento inmunoterapéutico
del cáncer.
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Se ha producido un aumento importante en los
últimos años en el desarrollo de vacunas contra el cáncer con
antígenos asociados al tumor (TAA) debido a los grandes avances en
la identificación de moléculas basadas en las características de
expresión en los tumores primarios y en las células normales con
ayuda de varias técnicas tales como la microselección por alta
densidad, SEREX, inmunohistoquímica (IHC), RT-PCR,
hibridación in situ (ISH) y microscopía por captura con
láser (Rosenberg, Immnunity, 1999; Sgroi et al., 1999,
Schena et al., 1995, Offringa et al., 2000). Los TAA
son antígenos expresados o sobreexpresados por las células
tumorales y podrían ser específicos para uno o varios tumores, por
ejemplo el antígeno CEA se expresa en los cánceres colorrectal, de
mama y pulmonar. Sgroi et al. (1999) identificaron varios
genes expresados de manera diferenciada en células de carcinoma
invasivo y metastásico con la utilización combinada de
microdisección por captura con laser y microselecciones de ADNc.
Varios sistemas de administración como ADN o virus podrían
utilizarse para la vacunación terapéutica contra los cánceres
humanos (Bonnet et al., 2000) y pueden provocar respuestas
inmunitarias y también destrucción de la tolerancia inmunitaria
contra los TAA. Las células tumorales pueden resultar más
inmunógenas insertando transgenes que codifican moléculas
coestimulantes para linfocitos T tales como B7.1 o citocinas
IFNgamma, IL2, GM-CSF, etc. La coexpresión de TAA y
una citocina o una molécula coestimulante puede desarrollar la
vacuna terapéutica eficaz (Hodge et al., 95, Bronte et
al., 1995, Chamberlain et al., 1996).
Existe una necesidad en la técnica de reactivos
y metodologías útiles para estimular una respuesta inmunitaria
destinada a impedir o tratar los cánceres. La presente invención
proporciona dichos reactivos y metodologías que supera muchas de
las dificultadas encontradas por otros al intentar tratar cánceres
tales como el cáncer. En particular, la presente invención
proporciona una nueva secuencia de codificación para CEA. Esta
secuencia nucleotídica, CEA(6D)-1,2, incluye
las modificaciones de la secuencia que eliminan la expresión de las
formas truncadas de CEA como se expresa en los vectores de
expresión. Dicha secuencia modificada es deseada por los expertos
en la materia para mejorar los protocolos de expresión e
inmunización para CEA.
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En la presente memoria se describe una diana
inmunógena para la administración a un paciente para impedir y/o
tratar el cáncer. En particular, como se describe en la presente
memoria la diana inmunógena es un antígeno tumoral CEA ("TA")
y/o un antígeno asociado a la angiogénesis ("AA"). En una forma
de realización, la diana inmunógena es codificada por una secuencia
nucleotídica de CEA modificada (CEA(6D)-1,2)
que mejora la expresión de CEA en las células transfectadas. Se
describe que el TA y/o AA se administran a un paciente como un ácido
nucleico contenido en el plásmido u otro vector de administración,
tal como un virus recombinante. El TA y/o AA puede también
administrarse en combinación con un estimulante inmunitario, tal
como una molécula coestimulante o adyuvante. Se proporciona un
vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica CEA
(6D)-1,2 como se ilustra en la SEC. ID. nº: 24.
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Figura 1. A. Ilustración del plásmido p3'H6MCEA
que comprende la secuencia de codificación de CEA con la
modificación 6D bajo el control del activador H6 parcial. B.
Ilustración del plásmido pSE1544.9 (pUC18-mCEA
repetición 1).
Figura 2. Ilustración del plásmido pSE1616.44
(repetición 1 modificada por pUC18mCEA).
Figura 3. Ilustración del plásmido pSE1658.15
(repetición 1 modificada por p3'H6MCEA).
Figura 4. Ilustración del plásmido pBSmCEA.
Figura 5. Ilustración del plásmido pSE1686.1
(repetición 2 modificada por pUC18mCEA).
Figura 6. Ilustración del plásmido pSE1696.1
(repetición 2 modificada por pUC18mCEA).
Figura 7. Ilustración del plásmido
p3'H6modMCEA-repeticiones 1ª y 2ª.
Figura 8. Ilustración del plásmido PNVQH6MCEA
(6D1ª Y 2ª).
Figura 9A-D. Comparación de la
secuencia nucleotídica de CAP(6D) y CAP(6D)1,2.
Las diferencias entre las secuencias están subrayadas.
Figura 10. Análisis por PCR para confirmar la
presencia de CAP(6D)-1,2 en ADN NYVAC.
Figura 11. Inmunotransferencia que ilustra la
falta de CEA truncado en las células que expresan
CAP(6D)-1,2.
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La presente invención proporciona reactivos y
metodologías útiles para tratar y/o prevenir el cáncer.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona la inducción o aumento de una respuesta
inmunitaria contra uno o más antígenos tumorales ("TA") para
prevenir y/o tratar el cáncer. Se describe cómo pueden combinarse
uno o más TA. Se describe cómo la respuesta inmunitaria procede de
la expresión de un TA en una célula hospedadora después de la
administración de un vector de ácido nucleico que codifica el
antígeno tumoral o el propio antígeno tumoral en forma de péptido o
polipéptido, por ejemplo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"antígeno" es una molécula (tal como un polipéptido) o una
parte de ésta que produce una respuesta inmunitaria en un hospedador
al que se le ha administrado el antígeno. La respuesta inmunitaria
puede incluir la producción de anticuerpos que se unen a por lo
menos un epítopo del antígeno y/o la generación de una respuesta
inmunitaria celular contra las células que expresan un epítopo del
antígeno. La respuesta puede ser una mejora de una respuesta
inmunitaria actual, por ejemplo dando lugar a la producción de
anticuerpo aumentada, a la producción de anticuerpos con afinidad
aumentada para el antígeno o una respuesta celular aumentada (es
decir, aumento de linfocitos T). Un antígeno que produce una
respuesta inmunitaria puede calificarse alternativamente como que
es inmunógeno o como un inmunógeno. Al describir la presente
invención, un TA puede denominarse "diana inmunógena".
TA incluye tanto los antígenos asociados al
tumor (TAA) como los antígenos específicos para el tumor (TSA),
donde una célula cancerosa es la fuente del antígeno. Un TAA es un
antígeno que se expresa en la superficie de una célula tumoral en
cantidades mayores que las que se observan en las células normales o
un antígeno que se expresa en las células normales durante el
desarrollo fetal. Un TSA es un antígeno que es exclusivo de las
células tumorales y no se expresa en las células normales. TA
incluye además los TAA o los TSA, los fragmentos antigénicos de los
mismos y las versiones modificadas que conservan su
antigenicidad.
Los TAA se clasifican típicamente en cinco
categorías según su modelo de expresión, función u origen genético:
antígenos de cáncer de testículos (CT) (es decir, MAGE,
NY-ESO-1); antígenos de la
diferenciación de melanocitos (es decir, Melan
A/MART-1, tirosinasa, gp100); antígenos mutacionales
(es decir, MUC-1, p53, CDK-4);
"auto" antígenos sobreexpresados (es decir
HER-2/neu, p53); y, antígenos víricos (es decir,
HPV, EBV). Con objeto de poner en práctica la presente invención,
un TA adecuado es cualquier TA que provoque o mejore una respuesta
inmunitaria antitumoral en un hospedador al que se ha administrado
TA. Los TA adecuados incluyen, por ejemplo, gp100 (Cox et
al., Science, 264:716-719 (1994)),
MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp.
Med., 180:347-352 (1994)), gp75
(TRP-1) (Wang et al., J. Exp. Med.,
186:1131-1140 (1996)), tirosinasa (Wolfel et
al., Eur. J. Immunol., 24:759-764 (1994);
documento WO 01/75117; WO 01/75016; WO 01/75007,
NY-ESO-1 (documento WO 98/14464;
WO 99/18206), proteoglucano de melanoma (Hellstrom et
al., J. Immunol., 130:1467-1472 (1983)),
antígenos de la familia MAGE (es decir,
MAGE-1,2,3,4,6,12, 51; Van der Bruggen et
al., Science, 254:1643-1647 (1991);
patentes U.S. nº 6.235.525; CN 1319611), antígenos de la familia
BAGE (Boel et al., Immunity, 2:167-175
(1995)), antígenos de la familia GAGE (es decir,
GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp.
Med., 182:689-698 (1995); patente U.S. nº
6.013.765), antígenos de la familia RAGE (es decir,
RAGE-1; Gaugler et al.,
Immunogenetics, 44:323-330 (1996); patente
U.S. nº 5.939.526),
N-acetilglucosaminiltransferasa-V
(Guilloux et al., J. Exp. Med.,
183:1173-1183 (1996)), p15 (Robbins et al.,
J. Immunol. 154:5944-5950 (1995)),
\beta-catenina (Robbins et al., J. Exp.
Med., 183:1185-1192 (1996)),
MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 92:7976-7980 (1995)),
cinasa-4 dependiente de ciclina (CDK4) (Wolfel et
al., Science, 269:1281-1284 (1995)),
p21-ras (Fossum et al., Int. J. Cancer,
56:40-45 (1994)), BCR-abl (Bocchia et
al., Blood, 85:2680-2684 (1995)); p53
(Theobald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
92:11993-11997 (1995)), p185 HER2/neu
(erb-B1; Fisk et al., J. Exp. Med.,
181:2109-2117 (1995)), receptor del factor de
crecimiento epidérmico (EGFR) (Harris et al., Breast
Cancer Res. Treat., 29:1-2 (1994)), antígenos
carcinoembrionarios (CEA) (Kwong et al., J. Natl. Cancer
Inst., 85:982-990 (1995) patentes U.S. nº
5.756.103; nº 5.274.087; nº 5.571.710; nº
6.071.716; nº 5.698.530; nº 6.045.802; EP 263933; EP 346710; y, EP
784483); mucinas mutadas asociadas al carcinoma (es decir productos
génicos MUC-1; Jerome et al., J.
Immunol., 151:1654-1662 (1993)); productos
génicos de EBNA de EBV (es decir, EBNA-1;
Rickinson et al., Cancer Surveys,
13:53-80 (1992)); proteínas E7, E6 de papilomavirus
humano (Ressing et al., J. Immunol.,
154:5934-5943 (1995)); antígeno específico de la
próstata (PSA; Xue et al., The Prostate,
30:73-78 (1997)); antígeno membranario específico de
la próstata (PSMA; Israelí, et al., Cancer Res.,
54:1807-1811 (1994)); epítopos o antígenos
idiotípicos, por ejemplo idiotipos de inmunoglobulina o idiotipos
del receptor de linfocitos T (Chen et al., J.
Immunol., 153:4775-4787 (1994)); KSA (patente
U.S. nº 5.348.887), kinesina 2 (Dietz, et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 7 de septiembre de 2000;
275(3):731-8), HIP-55, factor
antiapóptico TGF\beta-1 (Toomey, et al.,
Br. J. Biomed Sci. 2001;
58(3):177-83), proteína tumoral D52 (Bryne J.
A., et al., Genomics, 35:523-532
(1996)), H1FT, NY-BR-1 (documento
WO 01/47959), NY-BR-62,
NY-BR-75,
NY-BR-85,
NY-BR-87,
NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and
Bioinformatic Approaches to the Identification of Human Tumor
Antigens, en Cancer Vaccines 2000, Cancer Research Institute,
Nueva York, NY), AAC2-1, o AAC2-2,
incluyendo el "tipo natural" (es decir normalmente codificado
por el genoma, natural), modificado, y las versiones mutadas así
como otros fragmentos y derivados de éstos. Alguno de estos TA
puede utilizarse solo o en combinación con otro en un protocolo de
coinmunización.
En determinados casos, puede ser beneficioso
para coinmunizar pacientes tanto con TA como con otros antígenos,
tales como los antígenos asociados al angiogénesis ("AA"). Un
AA es una molécula inmunógena (es decir, péptido, polipéptido)
asociada con las células implicadas en la inducción y/o desarrollo
continuado de los vasos sanguíneos. Por ejemplo, un AA puede
expresarse en una célula endotelial ("EC"), que es un
componente estructural principal de los vasos sanguíneos. Cuando el
cáncer es cáncer, se prefiere que el AA se encuentre dentro o cerca
de los vasos sanguíneos que aporta un tumor. La inmunización de un
paciente contra un AA preferentemente da como resultado una
respuesta inmunitaria anti-AA con lo que los
procesos angiógenos que se producen cerca o dentro de los tumores
se impiden y/o inhiben.
Los AA a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo,
el factor de crecimiento endotelial vascular (es decir, VEGF;
Bernardini, et al., J. Urol., 2001, 166(4):
1275-9; Starnes, et al. J. Thorac.
Cardiovasc. Surg., 2001, 122(3):
518-23), el receptor VEGF (es decir,
VEGF-R, flk-1/KDR; Starnes, et
al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 2001, 122(3):
518-23), los receptores de EPH (es decir, EPHA2;
Gerety, et al. 1999, Cell, 4:
403-414), el receptor del factor de crecimiento
epidérmico (es decir, EGFR; Ciardeillo, et al. Clin.
Cancer Res., 2001, 7(10):2958-70), el
factor de crecimiento de fibroblastos básico (es decir, bFGF;
Davidson, et al. Clin. Exp. Metastasis 2000,
18(6): 501-7; Poon, et al. Am. J.
Surg., 2001, 182(3):298-304), el factor
de crecimiento de células procedentes de plaquetas (es decir,
PDGF-B), el factor de crecimiento celular
endotelial procedente de plaquetas (PD-ECGF; Hong,
et al., J. Mol. Med., 2001,
8(2):141-8), los factores de crecimiento
transformantes (es decir, TGF-\alpha; Hong, et
al., J. Mol. Med., 2001,
8(2):141-8), endoglina (Balza, et al.
Int. J. Cancer; 2001, 94: 579-585), proteínas
Id (Benezra, R. Trends Cardiovasc. Med., 2001,
11(6):237-41), proteasas tales como uPA, uPAR
y metaloproteinasas de matriz (MMP-2,
MMP-9; Djonov, et al. J. Pathol.,
2001, 195(2):147-55), óxido nítrico sintasa
(Am. J. Ophthalmol., 2001,
132(4):551-6), aminopeptidasa (Rouslhalti, E.
Nature Cancer, 2: 84-90, 2002),
trombospondinas (es decir, TSP-1,
TSP-2; Álvarez, et al. Gynecol.
Oncol., 2001, 82(2):273-8; Seki, et
al. Int. J. Oncol., 2001,
19(2):305-10), k-ras (Zhang, et
al. Cancer Res., 2001,
61(16):6050-4), Wnt (Zhang, et
al. Cancer Res., 2001,
61(16):6050-4), cinasas dependientes de
ciclina (CDK; Drug Resist. Updat. 2000,
3(2):83-88), microtúbulos (Timar, et
al. 2001, Path Oncol. Res.,
7(2):85-94), proteínas del choque térmico
(es decir, HSP90 (Timar, supra)), factores de unión a la
heparina (es decir, heparinasa; Gohji, et al., Int. J.
Cancer, 2001, 95(5):295-301), sintasas
(es decir, ATP sintasa, timidilato sintasa), receptores de
colágeno, integrinas (es decir, \alpha\mu\beta3,
\alpha\mu\beta5, \alpha1\beta1, \alpha2\beta1,
\alpha5\beta1), el proteoglucano de superficie NG2,
AAC2-1 (SEC. ID. nº: 1), o AAC2-2
(SEC. ID. nº: 2), entre otros, incluyendo las versiones mutadas
modificadas naturales (es decir, codificadas normalmente por el
genoma natural) así como otros fragmentos y derivados de los mismos.
Cualquiera de estas dianas puede ser adecuada para poner en
práctica la presente invención ya sea sola o en combinación con otro
u otros
agentes.
agentes.
En determinadas formas de realización, se
utiliza una molécula de ácido nucleico que codifica una diana
inmunógena. La molécula de ácido nucleico puede comprender o estar
constituida por una secuencia nucleotídica que codifica una o más
dianas inmunógenas, o fragmentos o derivados de los mismos, tales
como los contenidos en una inserción de ADN en un depósito ATCC. La
expresión "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido
nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o de ARN. La
expresión comprende las moléculas formadas a partir de cualquiera de
los análogos básicos conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin
limitarse a 4-acetilcitosina,
8-hidroxi-N6-metiladenosina,
aziridinil-citosina, pseudoisocitosina,
5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo,
5-bromouracilo,
5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo,
5-carboxi-metilaminometiluracilo,
dihidrouracilo, inopina,
N6-iso-penteniladenina,
1-metiladenina,
1-metilpseudouracilo,
1-metilguanina, 1-metilinosina,
2,2-dimetil-guanina,
2-metiladenina, 2-metilguanina,
3-metilcitosina,
5-metilcitosina, N6-metiladenina,
7-metilguanina,
5-metilaminometiluracilo,
5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo,
beta-D-manosilqueosina,
5'-metoxicarbonil-metiluracilo,
5-metoxiuracilo,
2-metiltio-N6-isopenteniladenina,
éster metílico del ácido
uracil-5-oxiacético, ácido
uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina,
5-metil-2-tiouracilo,
2-tiouracilo, 4-tiouracilo,
5-metiluracilo, éster metílico del ácido
N-uracil-5-oxiacético,
ácido uracil-5-oxiacético,
pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y
2,6-diaminopurina, entre
otros.
otros.
Una molécula de ácido nucleico aislada es la
que: (1) se separa de por lo menos aproximadamente 50 por ciento de
proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales en los que se
encuentra en forma natural cuando el ácido nucleico completo se
aísla de las células de la fuente; (2) no se une a todo o a una
porción de un polinucleótido al que la molécula de ácido nucleico
está unida en la naturaleza; (3) está operativamente unida a un
polinucleótido al que no se une en la naturaleza; y/o (4) no se
produce en la naturaleza como parte de una secuencia
polinucleotídica mayor. Preferentemente la molécula de ácido
nucleico aislada de la presente invención está sustancialmente
exenta de cualquier o cualesquiera otra(s) molécula(s)
de ácido nucleico contaminante u otros contaminantes que se
encuentran en su medio natural que interferirían con su utilización
en la producción de polipéptidos o su utilización terapéutica, de
diagnóstico, profiláctica o de investigación. Tal como se utiliza en
la presente memoria, la expresión "que se produce en la
naturaleza" o "natural" o "hallado en la naturaleza"
cuando se utilizan junto con los materiales biológicos tales como
las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células huésped, y
similares, se refiere a materiales que se encuentran en la
naturaleza y no son manipulados por el hombre. Asimismo, "que no
se produce en la naturaleza" o "no natural" tal como se
utiliza en la presente memoria se refiere a un material que no se
encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente
o sintetizado por el hombre.
La identidad de dos o más ácidos nucleicos o
moléculas polipeptídicas se determina comparando las secuencias.
Como es conocido en la técnica, "identidad" significa el grado
de secuencia sin relación entre las moléculas de ácido nucleico o
polipéptidos determinado por la compatibilidad entre las unidades
que construyen las moléculas (es decir, restos de nucleótidos o de
aminoácidos). La identidad mide el porcentaje de compatibilidades
idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con
alineaciones gap (si existen) dirigidas por un modelo matemático
particular o un programa informático (es decir, un algoritmo). La
identidad entre las secuencias de ácido nucleico puede también
determinarse por la capacidad de la secuencia relacionada para
hibridarse con la secuencia de ácido nucleico o con la molécula de
ácido nucleico aislada. Al definir dichas secuencias, la expresión
"condiciones muy severas" y "condiciones moderadamente
severas" se refieren a los procedimientos que permiten la
hibridación de cadenas de ácidos nucleicos cuyas secuencias con
complementarias, y para excluir la hibridación de ácidos nucleicos
significativamente incompatibles. Ejemplos de "condiciones muy
severas" para la hibridación y lavado son el cloruro sódico
0,015 M, citrato sódico 0,0015 M a 65-68ºC o cloruro
sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y formamida al 50% a 42ºC
(véase por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989); Anderson et al., Nucleic Acid
Hybridisation: A Practical Approach cáp. 4 (IRL Press
Limited)). La expresión "condiciones moderadamente severas" se
refiere a las condiciones en las que un ADN doble con un grado
mayor de desemparejamiento de los pares de bases que podría
producirse en "condiciones muy severas" es capaz de formarse.
Las condiciones moderadamente severas a título de ejemplo son
cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M entre 50 y 65ºC o
cloruro sódico 0,015 M, citrato sódico 0,0015 M y formamida al 20%
entre 37 y 50ºC. A título de ejemplo, las condiciones moderadamente
severas de 50ºC en el ión sodio 0,015 M permitirán aproximadamente
el 21% de desemparejamiento. Durante la hibridación, pueden
incluirse otros agentes en la hibridación y los tampones de lavado
con objeto de reducir la hibridación no específica y/o de fondo.
Ejemplos son la albúmina de suero bovino al 0,1%,
polivinilpirrolidona al 0,1%, pirofosfato sódico al 0,1%,
dodecilsulfato sódico al 0,1%, NaDodSO_{4}, (SDS), ficoll,
solución de Denhardt, ADN del esperma de salmón sometido a
ultrasonidos (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano,
aunque pueden utilizarse también otros agentes adecuados. La
concentración y tipos de estos aditivos pueden cambiarse sin
afectar sustancialmente la severidad de las condiciones de
hibridación. Los experimentos de hibridación se realizan
normalmente a pH entre 6,8 y 7,4; sin embargo, a las condiciones de
fuerza iónica típicas, la velocidad de hibridación es casi
independiente del
pH.
pH.
En las formas de realización preferidas de la
presente invención, se utilizan vectores para transferir una
secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido para una
célula. Un vector es cualquier molécula utilizada para transferir
una secuencia de ácido nucleico a una célula huésped. En
determinados casos, se utiliza un vector de expresión. Un vector de
expresión es una molécula de ácido nucleico que es adecuada para la
transformación de una célula huésped y contiene secuencias de ácido
nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de las secuencias
de ácido nucleico transferidas. La expresión incluye, pero no se
limita a, procesos tales como transcripción, traducción y corte y
empalme, si están presentes los intrones. Los vectores de expresión
comprenden típicamente una o más secuencias flanqueantes
operativamente unidas a una secuencia de ácido nucleico heteróloga
que codifica un polipéptido. Las secuencias adyacentes pueden ser,
por ejemplo, homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que
la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta
de la especie de célula huésped o de la cepa), híbridas (es decir,
una combinación de secuencias adyacentes procedentes de más de una
fuente) o sintéticas.
Una secuencia adyacente puede preferentemente
efectuar la replicación, transcripción y/o traducción de la
secuencia de codificación y está operativamente unida a una
secuencia de codificación. Tal como se utiliza en la presente
memoria, la expresión operativamente unida se refiere a la unión de
los elementos del polinucleótido en una relación funcional. Por
ejemplo, un activador o potenciador está operativamente unido a una
secuencia de codificación si afecta la transcripción de la
secuencia de codificación. Sin embargo, una secuencia adyacente no
requiere necesariamente estar contigua a la secuencia de
codificación, con tal que funcione correctamente. Por lo tanto, por
ejemplo, la intervención de secuencias no traducidas todavía
transcritas puede estar presente entre una secuencia activadora y
la secuencia de codificación y la secuencia activadora puede incluso
considerarse operativamente unida a la secuencia de codificación.
Asimismo, una secuencia potenciadora puede estar situada corriente
arriba o corriente abajo de la secuencia de codificación y afectar
la transcripción de la secuencia.
En determinadas formas de realización, se
prefiere que la secuencia adyacente sea una zona reguladora de la
transcripción que dirija la expresión génica de alto nivel en la
célula diana. La zona reguladora de la transcripción puede
comprender, por ejemplo, un elemento activador, potenciador,
silenciador, represor, o combinaciones de los mismos. La zona
reguladora de la transcripción puede ser constitutiva, específica
para el tejido, específica para el tipo de célula (es decir, la
zona se dirige a niveles superiores de transcripción en un tipo de
tejido o célula en comparación con otro), o regulable (es decir,
sensible a la interacción con un compuesto tal como tetraciclina).
La fuente de una zona reguladora de transcripción puede ser
cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo
vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de
que la secuencia adyacente funcione en una célula produciendo la
transcripción de un ácido nucleico dentro de la célula. Puede
utilizarse una amplia variedad de zonas reguladoras de la
transcripción en la puesta en práctica de la presente
invención.
Las zonas reguladoras de la transcripción
adecuadas incluyen el activador CMV (es decir, precoz inmediato a
CMV); activadores de genes eucarióticos (es decir, el gen de
ovoalbúmina de pollo inducible por estrógeno, los genes de
interferón, el gen de tirosina aminotransferasa inducible por
glucocorticoides y el gen de timidina cinasa); y los activadores
del gen del adenovirus precoz y tardío principal; la zona del
activador precoz SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature
290:304-10); el activador contenido en la repetición
terminal larga 3' (LTR) del virus del sarcoma de Rous (RSV)
(Yamamoto, et al., 1980, Cell
22:787-97); el activador de timidina cinasa del
virus del herpes simple (HSV-TK) (Wagner et
al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A
78:1444-45); las secuencias reguladoras del gen de
metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature
296:39-42); los vectores de la expresión
procariótica tales como el activador de
beta-lactamasa (Villa-Kamaroff
et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,
75:3727-31); o el activador tac (DeBoer et
al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A,
80:21-25). Las zonas de control de la transcripción
de tejido y/o específicas de las células incluyen, por ejemplo, la
zona de control del gen de elastasa I que es activa en las células
acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell
38:639-46; Ornitz et al., 1986, Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409
(1986); MacDonald, 1987, Hepatology
7:425-515); la zona de control del gen de insulina
que se activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985,
Nature 315:115-22); la zona de control del
gen de inmunoglobulina que es activa en las células linfoides
(Grosschedl et al., 1984, Cell
38:647-58; Adames et al., 1985, Nature
318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol.
Cell. Biol., 7:1436-44); la zona de control del
virus del tumor de mama de ratón en las células testiculares, de
mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell
45:485-95); la zona de control del gen de albúmina
en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.
1:268-76); la zona de control del gen de la
alfa-feto-proteína en el hígado
(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol.,
5:1639-48; Hammer et al., 1987,
Science 235:53-58); la zona de control del
gen de alfa 1-antitripsina en el hígado (Kelsey
et al., 1987, Genes and Devel.
1:161-71); la zona de control del gen de
beetiquetalobina en las células mieloides (Mogram et al.,
1985, Nature 2315:338-40;Kollias et
al., 1986, Cell 46:89-94); la zona de
control del gen de la proteína básica mielina en los
oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987,
Cell 48:703-12); la zona de control del gen
de la cadena-2 ligera de miosina en el músculo
esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-86);
la zona de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica
en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science
234:1372-78) y el activador de tirosinasa en las
células de melanoma (Hart, I. Semin. Oncol. Febrero de 1996;
23(1):154-8; Siders, et al. Cancer
Gene Ther. septiembre-octubre de 1998;
5(5):281-91), entre otros. Otros activadores
adecuados son conocidos en la técnica.
Como se describió anteriormente, los
potenciadores pueden también ser secuencias adyacentes adecuadas.
Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN,
normalmente de 10 a 300 bp de longitud, que actúan sobre el
activador para aumentar la transcripción. Los potenciadores son
típicamente independientes de la orientación y de la posición
habiendo sido identificados tanto 5' como 3' para las secuencias de
codificación controladas. Se conocen varias secuencias
potenciadoras disponibles en los genes de mamífero (es decir,
globina, elastasa, albúmina,
alfa-feto-proteína e insulina).
Asimismo, el potenciador SV40, el potenciador del activador precoz
de citomegalovirus, el potenciador de polioma y los potenciadores de
adenovirus sirven con las secuencias activadoras eucarióticas.
Aunque como potenciador puede ser cortado y empalmado en el vector
en una posición 5' o 3' en la secuencia de codificación del ácido
nucleico, se sitúa típicamente en el punto 5' del activador. Otros
potenciadores son conocidos en la materia y serían aplicables a la
presente invención.
Mientras se preparan los reactivos de la
presente invención, pueden necesitarse células para ser
transfectadas o transformadas. La transfección se refiere a la
absorción de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula ha
sido transfectada cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro
de la membrana celular. Numerosas técnicas de transfección son bien
conocidas en la técnica (es decir, Graham et al., 1973,
Virology 52:456; Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories,
1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular
Biology (Elsevier, 1986); y Chu et al., 1981,
Gene 13:197). Dichas técnicas pueden utilizarse para
introducir uno o más grupos de ADN exógenos en células huésped
adecuadas.
Se describe que la transfección de una célula da
como resultado la transformación de esta célula. Una célula se
transforma cuando existe un cambio en una característica de la
célula, que se transforma cuando ha sido modificada por contener un
nuevo ácido nucleico. Después de la transfección, el ácido nucleico
transfectado puede recombinarse con el de la célula interactuando
físicamente en un cromosoma de la célula; puede mantenerse
temporalmente como elemento episómico sin ser replicado, o puede
replicarse independientemente como plásmido. Una célula se
transforma establemente cuando el ácido nucleico se replica con la
división de la célula.
Se describe también que las dianas inmunógenas
se aíslan en forma de polipéptido. Un polipéptido se considera
aislado cuando: (1) se ha separado de por lo menos aproximadamente
el 50 por ciento de los polinucleótidos, lípidos, carbohidratos u
otros materiales que se encuentran en la naturaleza cuando se aíslan
de la célula original; (2) no está unido (por interacción covalente
o no covalente) a toda o a una parte de un polipéptido al que el
"polipéptido aislado" está unido en la naturaleza; (3) está
operativamente unido (por interacción covalente o no covalente) a
un polipéptido con el que no está unido en la naturaleza; o, (4) no
se produce en la naturaleza. Preferentemente, el polipéptido
aislado está sustancialmente exento de cualquier otro polipéptido
contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su medio
natural que interferirían con su utilización terapéutica, de
diagnóstico, profiláctica o de
investigación.
investigación.
Los polipéptidos diana inmunógenos pueden ser
polipéptidos maduros, como se define en la presente memoria, y
pueden o no presentar un resto de metionina aminoterminal,
dependiendo del procedimiento por el que se preparen. Además se
contemplan los polipéptidos relacionados tales como, por ejemplo,
fragmentos, variantes (es decir, alélica, de corte y empalme),
ortólogos, homólogos y derivados, por ejemplo, que poseen por lo
menos una característica o actividad (es decir, actividad,
antigenicidad) de la diana inmunógena. Asimismo se relacionan los
péptidos, que se refieren a una serie de restos de aminoácidos
contiguos que tienen una secuencia correspondiente a por lo menos
una parte del polipéptido del que procede su secuencia. En las
formas de realización preferidas, el péptido comprende
aproximadamente 5 a 10 aminoácidos, 10 a 15 aminoácidos, 15 a 20
aminoácidos, 20 a 30 aminoácidos o 30 a 50 aminoácidos. En una
forma de realización más preferida, un péptido comprende 9 a 12
aminoácidos, adecuados para la presentación en las moléculas NHC de
clase I, por ejemplo.
Un fragmento de un ácido nucleico o polipéptido
comprende un truncamiento de la secuencia (es decir, ácido nucleico
o polipéptido) en el terminal amino (con o sin una secuencia
principal) y/o el terminal carboxi. Los fragmentos pueden incluir
también variantes (es decir, alélica, de corte y empalme),
ortólogos, homólogos y otras variantes que presentan una o más
adiciones o sustituciones de aminoácidos o deleciones internas en
comparación con la secuencia precursora. En las formas de
realización preferidas, los truncamientos y/o deleciones comprenden
aproximadamente 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30
aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos o más. Los fragmentos
de polipéptido así producidos modo comprenderán aproximadamente 10
aminoácidos, 25 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50
aminoácidos, 60 aminoácidos, 70 aminoácidos o más. Dichos
fragmentos de polipéptidos pueden comprender opcionalmente un resto
de metionina aminoterminal. Se apreciará que dichos fragmentos
puedan utilizarse, por ejemplo, para generar anticuerpos o
respuestas inmunitarias celulares a polipéptidos diana
inmunógenos.
inmunógenos.
Una variante es una secuencia que presenta una o
más sustituciones, deleciones y/o adiciones en la secuencia en
comparación con la presente secuencia. Las variantes pueden
producirse de forma natural o construirse artificialmente. Dichas
variantes pueden prepararse a partir de las correspondientes
moléculas de ácido nucleico. En las formas de realización
preferidas, la variante presenta de 1 a 3, o de 1 a 5, o de 1 a 10,
o de 1 a 15, o de 1 a 20, o de 1 a 25, o de 1 a 30, o de 1 a 40, o
de 1 a 50, o más de 50 sustituciones, inserciones, adiciones y/o
deleciones de amino-
ácidos.
ácidos.
Una variante alélica es la de varias formas
alternas naturales posibles de un gen que ocupa un locus dado en un
cromosoma de un organismo o una población de organismos. Una
variante de corte y empalme es un polipéptido generado a partir de
uno de varios transcritos de ARN procedentes del corte y empalme de
un transcrito primario. Un ortólogo es una secuencia de ácido
nucleico o polipéptido similar de otra especie. Por ejemplo, las
versiones de ratón y humana de un polipéptido diana inmunógeno
pueden considerarse ortólogos entre sí. Un derivado de una
secuencia es el que procede de una secuencia precursora a las
secuencias que presentan sustituciones, adiciones, deleciones o
variantes químicamente modificadas. Las variantes pueden también
incluir proteínas de fusión, que se refiere a la fusión de una o
más de las primeras secuencias (tales como un péptido) en el
terminal amino o carboxi de por lo menos una u otra secuencia (tal
como un péptido heterólogo).
"Similitud" es un concepto relacionado con
la identidad, con la excepción de que la similitud se refiere a una
medida de la relación que incluye tanto compatibilidades idénticas
como compatibilidades de sustitución conservadoras. Si dos
secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos
idénticos, y las restantes son todas sustituciones no
conservadoras, entonces el porcentaje de identidad y similitud sería
en ambas del 50%. Si en el mismo ejemplo, existen cinco posiciones
más cuando existen sustituciones conservadoras, entonces el
porcentaje de identidad continúa siendo del 50%, pero el porcentaje
de similitud sería del 75% (15/20). Por lo tanto, en los casos en
los que existen sustituciones conservadoras, el porcentaje de
similitud entre dos polipéptidos será mayor que el porcentaje de
identidad entre estos dos polipéptidos.
Las sustituciones pueden ser conservadoras, no
conservadoras o cualquier combinación de las mismas. Las
modificaciones conservadoras de aminoácidos para la secuencia de un
polipéptido (y las correspondientes modificaciones de los
nucleótidos codificantes) pueden producir polipéptidos con
características funcionales y químicas similares a las de un
polipéptido precursor. Por ejemplo, una "sustitución conservadora
de aminoácidos" puede implicar una sustitución de un resto de
aminoácido natural con un resto no natural de modo que exista poco o
ningún efecto sobre el tamaño, polaridad, carga, hidrofobia o
hidrofilia del resto de aminoácido en esta posición y, en
particular, no produzca disminución de la inmunogenicidad. En la
Tabla I se presentan sustituciones de aminoácidos
conservadoras
adecuadas.
adecuadas.
Un experto será capaz de determinar variantes
adecuadas de polipéptido utilizando técnicas bien conocidas. Para
identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin
destruir la actividad biológica (es decir, unión por MHC,
inmunogenicidad) un experto en la materia puede dirigir áreas que no
se considera que sean importantes para esta actividad. Por ejemplo,
cuando se conocen polipéptidos similares con actividades similares
de la misma especie o de otras especies, un experto en la materia
puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con
dichos polipéptidos similares. Al realizar dichos análisis, se
pueden identificar restos y partes de las moléculas que se
conservan entre polipéptidos similares. Se apreciará que los cambios
en las áreas de la molécula que no se conservan en comparación con
dichos polipéptidos similares es menos probable que afecten
desfavorablemente la actividad biológica y/o la estructura de un
polipéptido. Asimismo, los restos requeridos para la unión a MHC
son conocidos, y pueden modificarse para mejorar la unión. Sin
embargo, las modificaciones que se producen en la disminución de la
unión a MHC no serán apropiadas en la mayoría de las situaciones.
Un experto en la materia conocería también que, incluso en las zonas
relativamente conservadas, se pueden sustituir químicamente
aminoácidos similares para los restos naturales mientras se conserva
la actividad. Por consiguiente, incluso en las áreas que pueden ser
importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden
someterse a sustituciones de aminoácidos conservadoras sin destruir
la actividad biológica o sin afectar desfavorablemente la
estructura del polipéptido.
Otras variantes de polipéptido preferidas
incluyen variantes de glucosilación en las que el número y/o de
secuencias de glucosilación han sido alteradas en comparación con la
presente secuencia de aminoácidos. En una forma de realización, las
variantes de polipéptido comprenden un número mayor o menor de
secuencias de glucosilación unidas por N que la presente secuencia
de aminoácidos. Una secuencia de glucosilación unida por N se
caracteriza por la secuencia
Asn-X-Ser o
Asn-X-Thr, en las que el resto de
aminoácidos denominado X puede ser cualquier resto de aminoácidos
excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear
esta secuencia proporciona una secuencia nueva con potencial para la
adición de la cadena de carbohidrato unida por N. Alternativamente,
las sustituciones que eliminan la secuencia eliminarán una cadena de
carbohidratos unida por N existente. También se proporciona una
transposición de cadenas de carbohidrato unidas por N en la que se
eliminan una o más secuencias de glucosilación unidas por N
(típicamente las naturales) y se crean una o más secuencias nuevas
unidas por N. Para afectar la glucosilación unida por O de un
polipéptido, se modificarían los restos de serina y/o treonina.
Las variantes adicionales preferidas incluyen
las variantes de cisteína, en las que uno o más restos de cisteína
se eliminan o se sustituyen con otro aminoácido (p. ej., serina) en
comparación con el conjunto de la secuencia de aminoácidos
presente. Las variantes de cisteína son útiles cuando los
polipéptidos deben replegarse en una configuración biológicamente
activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión
insolubles. Las variantes de cisteína generalmente presentan restos
de cisteína más escasos que la proteína natural, y presentan
típicamente un número impar para minimizar las interacciones que
proceden de las cisteínas no emparejadas.
Como se describe también, los polipéptidos
aislados de la presente invención incluyen los segmentos del
polipéptido de fusión que ayudan a la purificación de los
polipéptidos. Las fusiones pueden realizarse en el terminal amino o
en el terminal carboxi de la presente variante de polipéptido de
ésta. Las fusiones pueden dirigirse sin enlazador o molécula
adaptadora o pueden ser mediante un enlazador o molécula adaptadora.
Un enlazador o molécula adaptadora puede ser uno o más restos de
aminoácidos, típicamente desde aproximadamente 20 hasta
aproximadamente 50 restos de aminoácidos. Un enlazador o molécula
adaptadora puede también denominarse con un punto de escisión para
la endonucleasa de restricción del ADN o para una proteasa que
permita la separación de los grupos fusionados. Se apreciará que
una vez construido los polipéptidos de fusión pueden derivarse
según los procedimientos descritos en la presente memoria. Los
segmentos de fusión adecuados incluyen, entre otros, dominios
metálicos de unión (p. ej., un segmento de
poli-histidina), dominios de unión de inmunoglobina
(es decir, proteína A, proteína G, linfocito T, linfocito B,
receptor de Fc o dominios de unión del anticuerpo proteína
complementaria), dominios que se unen al azúcar (p. ej., un dominio
que se une a maltosa) y/o un dominio "etiqueta" (es decir, por
lo menos una parte de
\alpha-galactosidasa, una etapa de péptido
etiqueta, un péptido T7 etiqueta, un péptido FLAG u otros dominios
que pueden purificarse utilizando compuestos que se unen al
dominio, tal como anticuerpos monoclonales). Esta etiqueta está
fusionada típicamente con el polipéptido en la expresión del
polipéptido, y puede servir como medio para la purificación por
afinidad de la secuencia del polipéptido de interés a partir de la
célula huésped. La purificación por afinidad puede realizarse, por
ejemplo, por cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra
la etiqueta como una matriz con afinidad. Opcionalmente, la
etiqueta puede eliminarse posteriormente de la secuencia purificada
del polipéptido de interés por varios medios tales como utilizando
determinadas peptidasas para la escisión. Como se describe a
continuación, pueden realizarse fusiones entre un TA y componentes
coestimulantes tales como las quimiocinas CXC10
(IP-10), CCL7 (MCP-3) o CCL5
(RANTES), por ejemplo.
Un motivo de fusión puede aumentar el transporte
de una diana inmunógena para un compartimento del tratamiento por
MHC, tal como un retículo endoplásmico. Estas secuencias,
denominadas secuencias de transducción o transcitosis, incluyen
secuencias procedentes de VIH (véase Kim et al. 1997 J.
Immunol. 159:1666), Drosophila antennapedia (véase
Schutze-Redelmeier et al. 1996 J.
Immunol. 157:650) o la proteína period-1 humana
(hPER1; en particular, SRRHHCRSKAKRSRHH).
Además, el polipéptido o variante del mismo
puede fusionarse a un polipéptido homólogo para formar un homodímero
o un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los
péptidos heterólogos y los polipéptidos incluyen, pero no se
limitan a: un epítopo que permita la detección y/o aislamiento de un
polipéptido de fusión; una proteína receptora transmembranaria o
una parte de la misma, tal como un dominio extracelular o un dominio
transmembranario e intracelular; un ligando o una parte del mismo
que se une a una proteína receptora transmembranaria; una enzima o
una parte de la misma que es catalíticamente activa; un polipéptido
o péptido que favorece la oligomerización, tal como un dominio
cremallera de leucina; un polipéptido o péptido que aumenta la
estabilidad, tal como una zona constante de inmunoglobulina; y un
polipéptido que presenta una actividad terapéutica diferente del
polipéptido o variante de la misma.
Puede presentar ventajas combinar una secuencia
de ácido nucleico que codifica una diana inmunógena, polipéptido o
derivado de la misma con uno o más componente(s)
coestimulante(s) tales como las proteínas de la superficie
de la célula, citocinas o quimiocinas en una composición de la
presente invención. El componente coestimulante puede estar
incluido en la composición como polipéptido o como ácido nucleico
que codifica el polipéptido, por ejemplo. Las moléculas
coestimulantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos que se unen a
miembros de la familia CD28 (es decir, CD28, ICOS; Hutloff, et
al. Nature 1999, 397: 263-265; Peach,
et al. J. Exp. Med. 1994, 180:
2049-2058) tales como los polipéptidos B7.1 que se
unen a CD28 (CD80; Schwartz, 1992; Chen et al., 1992; Ellis,
et al. J. Immunol., 156(8):
2700-9) y B7.2 (CD86; Ellis, et al., J.
Immunol., 156(8): 2700-9); polipéptidos
que se unen a miembros de la familia de las integrinas (es decir,
LFA-1 (CD11a/CD18); Sedwick, et al. J.
Immunol. 1999, 162: 1367-1375; Wülfing, et
al. Science 1998, 282: 2266-2269; Lub,
et al. Immunol. Today 1995, 16:
479-483) incluyendo los miembros de la familia ICAM
(es decir, ICAM-1, -2 ó -3); los polipéptidos que se
unen a los miembros de la familia CD2 (es decir, CD2, la molécula
de activación de linfocitos señalizadora (CDw150 o "SLAM";
Aversa, et al. J. Immunol. 1997, 158:
4036-4044)) tal como CD58 (LFA-3;
ligando CD2; Davis, et al. Immunol. Today 1996, 17:
177-187) o ligandos de SLAM (Sayos,
et al. Nature 1998, 395: 462-469); los
polipéptidos que se unen al antígeno estable al calor (HSA o CD24;
Zhou, et al. Eur. J. Immunol. 1997, 27:
2524-2528); los polipéptidos que se unen a los
miembros de la familia del receptor TNF (TNFR) (es decir,
4-1BB (CD137; Vinay, et al. Semin.
Immunol. 1998, 10: 481-489), OX40 (CD134;
Weinberg, et al. Semin. Immunol. 1998, 10:
471-480; Higgins, et al. J. Immunol.
1999, 162: 486-493), y CD27 (Lens, et al.
Semin. Immunol. 1998, 10: 491-499)) tal como
4-1BBL (ligando 4-1BB; Vinay, et
al. Semin. Immunol. 1998, 10: 481-48;
DeBenedette, et al. J. Immunol. 1997, 158:
551-559), factor-1 asociado a TNFR
(TRAF-1; ligando 4-1BB; Saoulli,
et al., J. Exp. Med. 1998, 187:
1849-1862, Arch, et al. Mol. Cell
Biol. 1998, 18: 558-565), TRAF-2
(4-1BB y ligando OX40; Saoulli, et al. J.
Exp. Med. 1998, 187: 1849-1862; Oshima, et
al. Int. Immunol. 1998, 10: 517-526,
Kawamata, et al. J. Biol. Chem. 1998, 273:
5808-5814), TRAF-3
(4-1BB y ligando OX40; Arch, et al. Mol.
Cell Biol. 1998, 18: 558-565; Jang, et
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613-620; Kawamata S., et al. J. Biol.
Chem. 1998, 273: 5808-5814), OX40L (ligando
OX40: Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161:
6510-6517), TRAF-5 (ligando OX40;
Arch, et al. Mol. Cell Biol. 1998, 18:
558-565; Kawamata, et al. J. Biol.
Chem. 1998, 273: 5808-5814), y CD70 (ligando
CD27; Couderc, et al. Cancer Gene Ther., 5(3):
163-75). CD154 (ligando CD40 o "CD40L";
Gurunathan, et al. J. Immunol., 1998, 161:
4563-4571; Sine, et al. Hum. Gene
Ther., 2001, 12: 1091-1102) pueden ser también
adecuados.
\newpage
Una o más citocinas pueden también ser
componentes coestimulantes adecuados o "adyuvantes", ya sea
como polipéptidos o que están codificados por ácidos nucleicos
contenidos dentro de las composiciones de la presente invención
(Parmiani, et al. Immunol. Lett. 15 de septiembre de
2000; 74(1): 41-4; Berzofsky, et al.
Nature Immunol. 1: 209-219). Las citocinas
adecuadas incluyen, por ejemplo, interleucina-2
(IL-2) (Rosenberg, et al. Nature Med.
4: 321-327 (1998)), IL-4,
IL-7, IL-12 (revisado por Pardoll,
1992; Harries, et al. J. Gene Med.
Julio-Agosto de 2000;
2(4):243-9; Rao, et al. J.
Immunol. 156: 3357-3365 (1996)),
IL-15 (Xin, et al. Vaccine,
17:858-866, 1999), IL-16
(Cruikshank, et al. J. Leuk. Biol. 67(6):
757-66, 2000), IL-18 (J. Cancer
Res. Clin. Oncol. 2001. 127(12):
718-726), GM-CSF (CSF (Disis, et
al. Blood, 88: 202-210 (1996)),
factor-alfa de la necrosis tumoral
(TNF-\alpha) o interferón-gamma
(INF-\gamma). Otras citocinas pueden también ser
adecuadas para poner en práctica la presente invención, como se
conoce en la técnica.
Pueden utilizarse también quimiocinas. Por
ejemplo, las proteínas de fusión que comprenden CXCL10
(IP-10) y CCL7 (MCP-3) fusionadas a
un autoantígeno tumoral se ha demostrado que producen inmunidad
antitumoral (Biragyn, et al. Nature Biotech. 1999,
17: 253-258). Las quimiocinas CCL3
(MIP-1\alpha) y CCL5 (RANTES) (Boyer, et
al. Vaccine, 1999, 17 (supl. 2): S53-S64)
pueden también ser de utilización en la puesta en práctica de la
presente invención. Otras quimiocinas adecuadas son conocidas en la
técnica.
Es también conocido en la técnica que los
mecanismos inmunitarios reguladores supresores o negativos pueden
bloquearse, produciendo aumento de las respuestas inmunitarias. Por
ejemplo, el tratamiento con
anti-CTLA-4 (Shrikant, et
al. Immunity, 1996, 14: 145-155;
Sutmuller, et al. J. Exp. Med., 2001, 194:
823-832), anti-CD25 (Sutmuller,
supra), anti-CD4 (Matsui, et al. J.
Immunol., 1999, 163: 184-193), la proteína de
fusión IL13Ra2-Fc (Terabe, et al. Nature
Immunol., 2000, 1: 515-520), y combinaciones de
la misma (es decir, anti-CTLA-4 y
anti-CD25, Sutmuller, supra) se ha demostrado
que aumentan las respuestas inmunitarias antitumorales y serían
adecuadas en la puesta en práctica de la presente invención.
Cualquiera de estos componentes puede utilizarse
solo o en combinación con otros agentes. Por ejemplo, se ha
demostrado que una combinación de CD80, ICAM-1 y
LFA-3 ("TRICOM") puede potenciar las respuestas
inmunitarias contra el cáncer (Hodge, et al. Cancer
Res. 59: 5800-5807 (1999). Otras combinaciones
eficaces incluyen, por ejemplo, IL-12 +
GM-CSF (Ahlers, et al. J. Immunol.,
158: 3947-3958 (1997); Iwasaki, et al. J.
Immunol. 158: 4591-4601 (1997)),
IL-12 + GM-CSF +
TNF-\alpha (Ahlers, et al. Int.
Immunol. 13: 897-908 (2001)), CD80 +
IL-12 (Fruend, et al. Int. J. Cancer,
85: 508-517 (2000); Rao, et al.
supra), y CD86 + GM-CSF +
IL-12 (Iwasaki, supra). Un experto en la
materia conoce las combinaciones adicionales útiles para llevar a
cabo la presente invención. Además, el experto conocerá los
reactivos adicionales o los procedimientos que pueden utilizarse
para modular dichos mecanismos. Estos reactivos y procedimientos,
así como otros conocidos por los expertos en la materia, pueden
utilizarse en la puesta en práctica de la presente invención.
Las estrategias adicionales para mejorar la
eficacia de la inmunización basada en ácido nucleico pueden también
utilizarse incluyendo, por ejemplo, la utilización de replicones
víricos de autorreplicación (Caley, et al. 1999.
Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et
al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner,
et al. 2000. Cancer Res. 60: 51-55),
optimización del codón (Liu, et al. 2000. Mol. Ther.,
1: 497-500; Dubensky, supra; Huang, et
al. 2001. J. Virol. 75: 4947-4951),
electroporación in vivo (Widera, et al. 2000. J.
Immunol. 164: 4635-3640), incorporación de
motivos estimulantes de CpG (Gurunathan, et al. Ann. Rev.
Immunol., 2000. 18: 927-974; Leitner,
supra), secuencias para la dirección de las series de
reacciones del tratamiento endocítico o con ubiquitina (Thomson,
et al. 1998. J. Virol. 72: 2246-2252;
Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166:
5366-5373), regímenes de refuerzo primario
(Gurunathan, supra; Sullivan, et al. 2000.
Nature, 408: 605-609; Hanke, et al.
1998. Vaccine, 16: 439-445; Amara, et
al. 2001. Science, 292: 69-74), y la
utilización de vectores de administración a las mucosas tales como
Salmonella (Darji, et al. 1997. Cell, 91:
765-775; Woo, et al. 2001. Vaccine,
19: 2945-2954). Otros procedimientos son conocidos
en la técnica tales como los que se describen a continuación.
Agentes quimioterapéuticos, radiación,
compuestos antiangiógenos u otros agentes pueden también utilizarse
en el tratamiento y/o prevención del cáncer utilizando dianas
inmunógenas (Sebti, et al. Oncogene 27 de diciembre
de 2000; 19(56):6566-73). Por ejemplo, en el
tratamiento del cáncer de mama metastásico, los agentes
quimioterapéuticos útiles incluyen ciclofosfamida, doxorrubicina,
paclitaxel, docetaxel, navelbina, capecitabina y mitomicina C,
entre otros. La combinación de agentes quimioterapéuticos se ha
demostrado eficaz incluyendo ciclofosfamida + metrotexato +
5-fluorouracilo; ciclofosfamida + doxorrubicina +
5-fluorouracilo; o, ciclofosfamida + doxorrubicina,
por ejemplo. Otros compuestos tales como prednisona, un taxano,
navelbina, mitomicina C o vinblastina se han utilizado por varias
razones. Una mayoría de los pacientes de cáncer de mama presentan
tumores positivos receptores de estrógeno (ER+) y en estos
pacientes, la terapia endocrina (es decir, tamoxifeno) se prefiere
sobre la quimioterapia. Para dichos pacientes, tamoxifeno o, como
segunda terapia lineal, se prefieren progestinas (acetato de
medroxiprogesterona o acetato de megestrol). Los inhibidores de
aromatasa (es decir, aminoglutetimida y análogos de los mismos tales
como letrozol) disminuyen la disponibilidad del estrógeno necesaria
para mantener el crecimiento tumoral y pueden utilizarse como
terapia endocrina de segunda o tercera línea en determinados
pacientes.
Otros cánceres pueden requerir diferentes
regímenes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el cáncer colorrectal
metastático se trata típicamente con Camptosar (irinotecan o
CPT-11), 5-fluorouracilo o
leucovorin, solos o en combinación con otro. Los inhibidores de
proteinasa e integrina tales como los inhibidores de MMP marimastato
(British Biotech), COL-3 (Collagenex), Neovastat
(Aeterna), AG3340 (Agouron), BMS-275291 (Bristol
Myers Squibb), CGS 27023A (Novartis) o los inhibidores de integrina
Vitaxin (Medimmune) o MED1522 (Merck KgaA) pueden también ser
adecuados para su utilización. Como tales, el direccionamiento
inmunológico de las dianas inmunógenas asociadas con el cáncer
colorrectal podría realizarse en combinación con un tratamiento
utilizando estos agentes quimioterapéuticos. Asimismo, los agentes
quimioterapéuticos utilizados para tratar otros tipos de cánceres
son bien conocidos en la técnica y pueden combinarse con las dianas
inmunógenas descritas en la presente memoria.
Muchos agentes antiangiógenos son conocidos en
la técnica y serían adecuados para la administración conjunta con
las vacunas de diana inmunógena (véase, por ejemplo, Timar, et
al. 2001. Pathology Oncol. Res., 7(2):
85-94). Dichos agentes incluyen, por ejemplo,
agentes fisiológicos tales como factores de crecimiento (es decir,
ANG-2, NK1,2,4 (HGF), factor beta de crecimiento
transformante (TGF-\beta)), citocinas (es decir,
interferones tales como INF-\alpha, -\beta,
-\gamma, factor 4 de plaquetas (PF-4),
PR-39), proteasas (es decir, AT-III
escindida, fragmento de colágeno XVIII (Endostatina)), fragmento de
plasmina HmwKallicrein-d5 (Angiostatina),
protrombina-F1-2,
TSP-1), inhibidores de proteasa (es decir, inhibidor
tisular de metaloproteasas tales como TIMP-1, -2 o
-3; maspin; inhibidores del activador del plasminógeno tales como
PAI-1; factor derivado del epitelio pigmentario
(PEDF)), Tumstatina (disponible en ILEX, Inc.), productos de
anticuerpo (es decir, los anticuerpos que se unen al colágeno
HUIV26, HUI77, XL313; anti-VEGF;
anti-integrina (es decir, Vitamina, (Lxsys))), y
glucosidasas (es decir, heparinasa-I, -III). Agentes
"químicos" o fisiológicos modificados conocidos o que se cree
que presentan potencial antiangiógeno incluyen, por ejemplo,
vinblastina, taxol, ketoconazol, talidomida, dolestatina,
combrestatina A, rapamicina (Guba, et al. 2002, Nature
Med., 8: 128-135), CEP-7055
(disponible en Cephalon, Inc.), ácido acético de flacona, Bay
12-9566 (Bayer Corp.), AG3340 (Agouron, Inc.), CGS
27023A (Novartis), derivados de tetraciclina (es decir,
COL-3 (Collagenix, Inc.)), Neovastat (Aeterna),
BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb),
5-FU a baja dosis, metrotexato a baja dosis (MTX),
irsofladina, radicicol, ciclosporina, captopril, celocoxib,
polisacárido sulfatado D45152, proteína catiónica (Protamina),
péptido catiónico-VEGF, Suramin (naftilurea
polisulfonada), compuestos que interfieren con la función o
producción de VEGF (es decir, SU5416 o SU6668 (Sugen),
PTK787/ZK22584 (Novartis)), Distamicina A, angiozima (ribozima),
isoflavinoides, derivados de estaurosporina, genisteína, EMD121974
(Merck KcgaA), tirfostinas, isoquinolonas, ácido retinoico,
carboxiamidotriazol, TNP-470, octreotida,
2-metoxiestradiol, aminoesteroles (es decir,
escualamina), análogos de glutatión (es decir,
N-acetil-L-cisteína),
combrestatina A-4 (Oxigene), agentes de bloqueo del
receptor Eph (Nature, 414:933-938, 2001),
Rh-angiostatina, Rh-endostatina
(documento WO 01/93897), péptido cíclico RGD,
accutina-disintegrina, benzodiazepanos,
anti-avb3 Ab humanizado,
Rh-PAI-2, amilorida,
p-amidobenzamidina, anti-uPA ab,
anti-uPAR Ab,
L-fanilalanin-N-metilamidas
(es decir, Batimistat, Marimastat), AG3340 y minociclina. Muchos
otros agentes adecuados son conocidos en la técnica y serían
suficientes para poner en práctica la presente invención.
La presente invención puede también utilizarse
en combinación con procedimientos "no tradicionales" de
tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se ha demostrado recientemente
que la administración de determinadas bacterias anaeróbicas puede
ayudar a disminuir el crecimiento tumoral. En un estudio, se
modificó Clostridium novyi para eliminar un gen de toxina
llevado a cabo en un episoma de fago y administrado a ratones con
tumores colorrectales (Dang, et al. P.N.A.S. USA,
98(26): 15155-15160, 2001). En combinación
con la quimioterapia, el tratamiento demostró que produce necrosis
tumoral en animales. Los reactivos y metodologías descritos en esta
aplicación pueden combinarse con dichas metodologías de
tratamiento.
Los ácidos nucleicos que codifican dianas
inmunógenas pueden administrarse a pacientes por cualquiera de
varias técnicas disponibles. Varios vectores víricos que han sido
utilizados con éxito para introducir un ácido nucleico a un huésped
incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), herpes
virus y poxvirus viruela, entre otros. Se entiende en la técnica
que muchos de dichos vectores víricos están disponibles en la
técnica. Los vectores de la presente invención pueden construirse
utilizando técnicas recombinantes habituales ampliamente
disponibles para un experto en la materia. Dichas técnicas pueden
encontrarse en referencias de la biología molecular corriente tales
como Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et
al. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene
Expression Technology (Methods in Enzymology, vol. 185,
editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) y
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis,
et al. 1990. Academic Press, San Diego,
CA).
CA).
Los vectores retrovíricos preferidos son
derivados de lentivirus así como derivados de retrovirus murino o
aviar. Ejemplos de vectores retrovíricos adecuados incluyen, por
ejemplo, el virus de la leucemia murina de Molones (MoMuLV), el
virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), el virus del tumor de
mama murino (MuMTV), SIV, BIV, HIV y el virus del sarcoma de Rous
(RSV). Numerosos vectores retrovíricos pueden incorporar secuencias
de ácido nucleico exógenas múltiples. Ya que los retrovirus
recombinantes son defectuosos, requieren asistencia con objeto de
producir partículas de vector infecciosas. Esta asistencia puede
proporcionarse por, por ejemplo, estirpes celulares colaboradoras
que codifican genes estructurales de retrovirus. Las estirpes
celulares colaboradoras adecuadas incluyen \psi2, PA317 y PA12,
entre otras. Los viriones del vector producidos utilizando dichas
estirpes celulares pueden utilizarse a continuación para infectar
una estirpe celular de tejido, tal como las células NIH 3T3, para
producir grandes cantidades de viriones retrovíricos híbridos. Los
vectores retrovíricos pueden administrarse por los procedimientos
tradicionales (es decir, inyección) o por implantación de una
"estirpe celular productora" en la proximidad de la población
de células diana (Culver, K., et al., 1994, Hum. Gene
Ther., 5 (3): 343-79; Culver, K., et al.,
Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 59:
685-90); Oldfield, E., 1993, Hum. Gene Ther.,
4 (1): 39-69). La estirpe celular productora se
modifica genéticamente para producir un vector vírico y libera
partículas víricas en la proximidad de la célula diana. Una parte
de las partículas víricas liberadas se pone en contacto con las
células diana e infecta aquellas células, liberando de este modo un
ácido nucleico de la presente invención para la célula diana.
Después de la infección de la célula diana, se produce la expresión
del ácido nucleico del vector.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se ha demostrado que los vectores adenovíricos
son especialmente útiles para la transferencia génica en las
células eucarióticas (Rosenfeld, M., et al., 1991,
Science, 252 (5004): 431-4; Crystal, R.,
et al., 1994, Nat. Genet., 8 (1):
42-51), el estudio de la expresión génica
eucariótica (Levrero, M., et al., 1991, Gene, 101
(2): 195-202), el desarrollo de vacunas (Graham, F.
y Prevec, L., 1992, Biotechnology, 20:
363-90), y en modelos animales
(Stratford-Perricaudet, L., et al., 1992,
Bone Marrow Transplant., 9 (supl. 1): 151-2;
Rich, D., et al., 1993, Hum. Gene Ther., 4 (4):
461-76). Las vías experimentales para administrar
Ad recombinante a tejidos diferentes in vivo han incluido la
instilación intratraqueal (Rosenfeld, M., et al., 1992,
Cell, 68 (1): 143-55) la inyección
intramuscular (Quantin, B., et al., 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A, 89 (7): 2581-4), la inyección
intravenosa periférica (Herz, J., y Gerard, R., 1993, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A, 90 (7): 2812-6) y la
inoculación estereotáctica en el cerebro (Le Gal La Salle, G.,
et al., 1993, Science, 259 (5097):
988-90), entre otras.
El virus adenoasociado (AAV) demuestra
infectividad de alto nivel, amplio intervalo de huésped y
especificidad en la integración en el genoma de la célula huésped
(Hermonat, P., et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A, 81 (20): 6466-70). Y el virus del herpes
simple tipo-1 (HSV-1) es todavía
otro sistema de vector atractivo, especialmente para su utilización
en el sistema nervioso debido a su propiedad neurótropa (Geller,
A., et al., 1991, Trends Neurosci., 14 (10):
428-32; Glorioso, et al., 1995, Mol.
Biotechnol., 4 (1): 87-99; Glorioso, et
al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49:
675-710).
El poxvirus es otro vector de expresión útil
(Smith, et al. 1983, Gene, 25 (1):
21-8; Moss, et al., 1992,
Biotechnology, 20: 345-62; Moss, et
al., 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:
25-38; Moss, et al. 1991, Science,
252: 1662-1667). Los poxvirus que se demuestra que
son útiles incluyen vacunas, NYVAC, avipox, viruela aviar, viruela
de los canarios, ALVAC y ALVAC(2), entre otros.
NYVAC (vP866) procedía de la cepa de la vacuna
de Copenhague del virus de la vacuna eliminando seis zonas no
esenciales del genoma que codifican factores de virulencia conocidos
o potenciales (véase, por ejemplo, las patentes U.S. nº 5.364.773 y
nº 5.494.807). Los loci de detección se modificaron también
genéticamente como loci del receptor para la inserción de genes
extraños. Las zonas eliminadas son: gen de timidina cinasa (TK;
J2R); zona hemorrágica (u; B13R+B14R); una zona corporal de tipo
inclusión (ATI; A26L); gen de hemoaglutinina (HA; A56R); zona del
gen del intervalo del huésped (C7L-K1L); y,
subunidad grande, ribonucleótido reductasa (I4L). NYVAC es una cepa
del virus de la vacuna modificado genéticamente que se generó
mediante la deleción específica de dieciocho marcos de lectura
abiertos que codifican los productos génicos asociados a la
virulencia y a la gama de huésped. Se ha demostrado que NYVAC sirve
para expresar los TA (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº
6.265.189). NYVAC (vP866), vP994, vCP205, vCP1433,
placZH6H4Linversa, pMPC6H6K3E3 y pC3H6FHVB se depositaron también
con el ATCC bajos las estipulaciones del tratado de Budapest,
números de registro VR-2559,
VR-2558, VR-2557,
VR-2556, ATCC-97913,
ATCC-97912 y ATCC-97914,
respectivamente.
Los virus recombinantes basados en ALVAC (es
decir, ALVAC-1 y ALVAC-2) son
también adecuados para su utilización en la puesta en práctica de
la presente invención (véase, por ejemplo, la patente U.S. nº
5.756.103). ALVAC(2) es idéntico a ALVAC(1) excepto
que el genoma de ALVAC(2) comprende la vacuna E3L y los genes
de K3L bajo el control de los activadores de la vacuna (patente
U.S. nº 6.130.066; Beattie et al. 1995a, 1995b, 1991; Chang
et al., 1992; Davies et al., 1993). Tanto
ALVAC(1) como ALVAC(2) se ha demostrado que sirven
para expresar las secuencias de ADN extraño, tales como las TA
(Tartagua et al., 1993 a,b; patente US nº 5.833.975). ALVAC
se depositó bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest con la
American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University
Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, número de
registro ATCC VR-2547.
Otro vector de poxvirus útil es TROVAC. TROVAC
se refiere a una viruela aviar atenuada que se aisló clonada en
placa procedente de la cepa de la vacuna FP-1 de los
virus de la viruela aviar que está autorizada para la vacunación de
pollitos de 1 día. TROVAC fue asimismo depositada bajo las
estipulaciones del Tratado de Budapest con el número de registro
2553 de la ATCC.
Los vectores de plásmido "no víricos"
pueden también ser adecuados en la puesta en práctica de la presente
invención. Los vectores del plásmido preferidos son compatibles con
células huésped de bacteria, insecto y/o de mamífero. Dichos
vectores incluyen, por ejemplo, PCR-II, pCR3 y
pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, CA), pBSII (Stratagene, La Jolla,
CA), pET15 (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto,
CA), pETL (BlueBAcII, Invitrogen), pDSR-alfa (PCT
pub. nº WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL,
Grand Island, NY) así como los derivados del plásmido Bluescript®
(un fagómido basado en COLE-1 de número de copia
grande, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), clonar los
productos de la PCR ampiados con Taq (por ejemplo, kit de clonación
TOPO^{TM} TA, derivados de plásmido PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad,
CA). Los vectores bacterianos pueden también utilizarse con la
invención actual. Estos vectores incluyen, por ejemplo,
Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille
calmette guérin (BCG) y Streptococcus (véase por
ejemplo, los documentos WO 88/6626; WO 90/0594; WO 91/13157;
WO 92/1796; y WO 92/21376). Muchos otros vectores y
sistemas de expresión de plásmido no vírico son conocidos en la
técnica y podrían utilizarse con la presente invención.
Las técnicas de administración de ácido nucleico
adecuadas incluyen complejos ADN-ligando, complejos
adenovirus-ligando-ADN, inyección
directa de ADN, precipitación con CaPO_{4}, técnicas de cañón
génico, electroporación y sistemas de dispersión coloidal, entre
otros. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos
macromoleculares, nanocapsulares, microesferas, lentejas y sistemas
basados en lípidos incluyendo emulsiones aceite en agua, micelas,
micelas mezcladas y liposomas. El sistema coloidal preferido de la
invención es un liposoma, que son vesículas de membrana artificial
útiles como vehículo de administración in vitro e in
vivo. El ARN, ADN y los viriones intactos pueden encapsularse
dentro del interior acuoso y liberarse a las células en una forma
biológicamente activa (Fraley, R., et al., 1981, Trends
Biochem. Sci., 6: 77). La composición de liposoma es
normalmente una composición de fosfolípidos, particularmente de
fosfolípidos de temperatura alta de la fase de transición,
normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol.
Pueden utilizarse también otros fosfolípidos u otros lípidos. Las
características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza
iónica y la presencia de cationes divalentes. Ejemplos de lípidos
útiles en la producción de liposoma incluyen los compuestos de
fosfatidil, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina,
fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos,
cerebrósidos y gangliósidos. Son particularmente útiles los
diacilfosfatidilgliceroles, en los que el grupo lípido contiene de
14 a 18 átomos de carbono, particularmente de 16 a 18 átomos de
carbono y está saturado. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen la
fosfatidilcolina del huevo, la dipalmitoilfosfatidilcolina y la
diestearoilfosfatidilcolina.
Para reforzar la respuesta inmunitaria puede
administrarse también una diana inmunógena en combinación con uno o
más adyuvantes. Se proporcionan adyuvantes a título de ejemplo en la
Tabla 1 a continuación:
Las dianas inmunógenas de la presente invención
pueden utilizarse también para generar anticuerpos destinados a su
utilización en análisis de identificación o para inmunoterapia.
Otras utilizaciones resultarán evidentes para un experto en la
materia. El término "anticuerpo" incluye fragmentos de
anticuerpo, como se conocen en la técnica incluyendo Fab,
Fab_{2}, anticuerpos de una sola cadena (Fv por ejemplo),
anticuerpos humanizados, anticuerpos híbridos, anticuerpos humanos,
producidos por varios métodos como se conocen en la técnica. Los
procedimientos de preparación y utilización de varios tipos de
anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la materia y
serían adecuados para poner en práctica la presente invención
(véase, por ejemplo, Harlow, et al. Antibodies: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow
et al. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Portable
Protocol nº 1, 1998; Kohler y Milstein, Nature, 256:495
(1975)); Jones et al. Nature,
321:522-525 (1986); Riechmann et al.
Nature, 332:323-329 (1988); Presta (Curr.
Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Verhoeyen
et al. (Science, 239:1534-1536 (1988);
Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991);
Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Cole
et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner et al., J.
Immunol., 147(1):86-95 (1991); Marks
et al., Bio/Technology 10, 779-783
(1992); Lonberg et al., Nature 368:
856-859 (1994); Morrison, Nature 368:
812-13 (1994); Fishwild et al., Nature
Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger,
Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar,
Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995); así
como las patentes U.S. nº 4.816.567; nº
5.545.807; nº 5.545.806; nº 5.569.825; nº 5.625.126; nº 5.633.425 y
nº 5.661.016). Los anticuerpos o derivados de los mismos pueden
también conjugarse con grupos terapéuticos tales como fármacos o
toxinas citotóxicos, o fragmentos activos de los mismos tales como
la cadena A de la difteria, la cadena A exotoxina, la cadena A de
ricino, la cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina,
enomicina, entre otros. Los agentes citotóxicos pueden incluir
asimismo radioquímicos. Los anticuerpos y sus derivados pueden
incorporarse en las composiciones de la invención para su
utilización in vitro o in vivo.
Los ácidos nucleicos, proteínas o derivados de
los mismos que representan una diana inmunógena pueden utilizarse
en análisis para determinar la presencia de un estado patológico en
un paciente, para pronosticar, o para determinar la eficacia de un
régimen quimioterapéutico u otro tratamiento. Los perfiles de
expresión, llevados a cabo como se conoce en la técnica, pueden
utilizarse para determinar el nivel relativo de expresión de la
diana inmunógena. El nivel de expresión puede correlacionarse a
continuación con los niveles básicos para determinar si una
enfermedad determinada está presente en el paciente, el pronóstico
del paciente, o si un régimen de tratamiento determinado es eficaz.
Por ejemplo, si el paciente está siendo tratado con un régimen
quimioterapéutico determinado, una disminución del nivel de
expresión de una diana inmunógena en los tejidos del paciente (es
decir, en la sangre periférica) pueden indicar que el régimen está
disminuyendo la carga de cáncer en este hospedador.
Asimismo, si el nivel de expresión está
aumentando, puede necesitarse utilizar otra modalidad terapéutica.
En una forma de realización, las sondas de ácido nucleico
correspondientes a un ácido nucleico que codifica una diana
inmunógena pueden unirse a un biochip, como se conoce en la técnica,
para la detección y cuantificación de la expresión en el huésped.
Asimismo es posible utilizar ácidos nucleicos, proteínas, derivados
de los mismos, o anticuerpos contra éstos como reactivos en
análisis de identificación de fármacos. Los reactivos pueden
utilizarse para determinar el efecto de un fármaco experimental en
la expresión de la diana inmunógena en una estirpe celular, o una
célula o tejido de un paciente. La técnica de perfil de la expresión
puede combinarse con técnicas de identificación de alta resolución
que permitan la identificación rápida de compuestos útiles y
controlar la eficacia del tratamiento con un fármaco experimental
(véase por ejemplo, Zlokarnik, et al., Science 279,
84-8 (1998)). Los fármacos experimentales pueden ser
compuestos químicos, ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos o
derivados de los mismos, si son naturales o sintéticos. Pueden
utilizarse fármacos experimentales identificados de este modo,
entre otras utilizaciones, como composiciones farmacéuticas para la
administración a pacientes o para su utilización en análisis de
identificación adicionales.
La administración de una composición de la
presente invención a un hospedador puede realizarse utilizando
cualquiera de entre una variedad de técnicas conocidas por los
expertos en la materia. La composición o composiciones
puede(n) procesarse según los procedimientos convencionales
de farmacia para producir agentes medicinales destinados a la
administración a pacientes, incluyendo el hombre y otros mamíferos
(es decir, una "composición farmacéutica"). La composición
farmacéutica se prepara preferentemente en forma de una dosis
unitaria que contiene una cantidad dada de ADN, partículas de
vector vírico, polipéptido o péptido, por ejemplo. Una dosis diaria
adecuada para un ser humano u otro mamífero puede variar ampliamente
dependiendo de la enfermedad del paciente y de otros factores,
pero, una vez más, puede determinarse utilizando procedimientos
rutinarios.
La composición farmacéutica puede administrarse
por vía oral, parenteral, por atomización para inhalación, por vía
rectal, por vía intranodal, o por vía tópica en formulaciones de
dosis unitarias que contienen portadores, adyuvantes y vehículos
farmacéuticamente convencionales. La expresión "portador
farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente
aceptable" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere
a uno o más materiales de la formulación adecuados para llevar a
cabo o aumentar la administración de un ácido nucleico, polipéptido
o péptido como composición farmacéutica. Una "composición
farmacéutica" es una composición que comprende una cantidad
terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico o polipéptido. Las
expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente
eficaz" se refieren cada una a la cantidad de un ácido nucleico o
polipéptido utilizado para provocar o potenciar una respuesta
inmunitaria eficaz. Se prefieren que las composiciones de la
presente invención proporcionen la producción o aumento de una
respuesta inmunitaria antitumoral en un huésped que proteja al
huésped del desarrollo de un tumor y/o permita al huésped eliminar
un tumor existente en el cuerpo.
Para la administración oral, la composición
farmacéutica puede ser de cualquiera de las diversas formas
incluyendo, por ejemplo, una cápsula, un comprimido, una suspensión
o líquido, entre otros. Los líquidos pueden administrarse por
inyección como composición con vehículos adecuados incluyendo
solución salina, dextrosa o agua. El término parenteral tal como se
utiliza en la presente memoria incluye la administración subcutánea,
intravenosa, intramuscular, intraesternal, por infusión o
intraperitoneal. Los supositorios para administración rectal del
fármaco pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no
irritante adecuado tal como manteca de cacao y polietilenglicoles
que son sólidos a las temperaturas ordinarias pero líquidos a la
temperatura rectal.
El régimen de dosificación para inmunizar un
huésped o si no tratar un trastorno o una enfermedad con una
composición de la presente invención está basado en una variedad de
factores, incluyendo el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo,
estado médico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de
administración y el compuesto concreto empleado. Por ejemplo, un
vector vírico de la viruela puede administrarse a una composición
que comprende 1 \times 10^{6} partículas infecciosas por dosis.
Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente,
pero puede determinarse de forma rutinaria utilizando los
procedimientos habituales.
Un régimen de refuerzo de una sola dosis puede
utilizarse también (documento WO 01/30382 A1) en el que el
inmunógeno objetivo se administra inicialmente en una etapa de
cebado en una forma seguida por una etapa de refuerzo en el que el
inmunógeno objetivo se administra en otra forma. La forma del
inmunógeno objetivo en las etapas de cebado y de refuerzo es
diferente. Por ejemplo, si la etapa de cebado utilizó un ácido
nucleico, el refuerzo puede administrar en forma de péptido.
Asimismo, cuando una etapa de cebado utilizó un tipo de virus
recombinante (es decir, ALVAC), la etapa de refuerzo puede utilizar
otro tipo de virus (es decir, NYVAC). Este método de
sonda-refuerzo de administración ha demostrado ser
válido para provocar respuestas inmunológicas potentes.
Aunque las composiciones de la invención pueden
administrarse como un único agente farmacéutico activo, pueden
también utilizarse en combinación con una u otras composiciones o
agentes más (es decir, otras dianas inmunógenas, moléculas
coestimulantes, adyuvantes). Cuando se administra como una
composición, los componentes individuales pueden formularse como
composiciones independientes administradas al mismo tiempo o en
diferentes momentos, o los componentes pueden combinarse como una
única composición.
Las preparaciones inyectables, tales como las
suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables, pueden formularse
según los procedimientos conocidos utilizando agentes de dispersión
o de humectación adecuados y agentes de suspensión. La preparación
inyectable puede ser también una solución o suspensión inyectable
esterilizada en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente
aceptable. Los vehículos y disolventes adecuados que pueden
emplearse son el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica
de cloruro sódico, entre otros. Por ejemplo, un vector vírico tal
como un poxvirus puede prepararse en NaCl al 0,4%. Además, se
emplean convencionalmente los aceites estables, esterilizados, como
medio disolvente o en suspensión. Con este objeto, puede emplearse
cualquier aceite estable blando, incluyendo mono- o diglicéridos
sintéticos. Además, los ácidos grasos pueden tales como el ácido
oleico encuentran utilización en la preparación de inyectables.
Para la administración tópica, una dosis tópica
adecuada de una composición puede administrarse una a cuatro veces
al día, y preferentemente dos o tres. La dosis puede administrarse
también días alternativos durante los que no se aplica. Las
composiciones adecuadas pueden comprender del 0,001% al 10% p/p, por
ejemplo, del 1% al 2% en peso de la formulación, aunque pueden
comprender como mucho el 10% p/p, pero preferentemente no más del
5% p/p, y más preferentemente del 0,1% al 1% de la formulación. Las
formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen las
preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración
a través de la piel (p. ej., linimentos, lociones, pomadas, cremas
o pastas), o gotas adecuadas para la administración a los ojos,
oído o
nariz.
nariz.
Las composiciones farmacéuticas pueden
prepararse también en forma sólida (incluyendo gránulos, polvos o
supositorios). Las composiciones farmacéuticas pueden someterse a
operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización
y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como
conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes,
tampones, etc. Las formas galénicas sólidas para administración oral
pueden incluir cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos.
En dichas formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede
administrarse por lo menos con un diluyente inerte tal como
sacarosa, lactosa o almidón. Dichas formas unitarias pueden
comprender también, como en la práctica normal, sustancias
adicionales distintas de diluyentes inertes, p. ej., agentes
lubricantes tal como el estearato de magnesio. En el caso de
cápsulas, comprimidos y píldoras las formas de dosificación pueden
comprender también agentes tamponantes. Los comprimidos y píldoras
pueden prepararse además con recubrimiento entérico. Las formas
galénicas líquidas para la administración oral pueden incluir
emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires
farmacéuticamente aceptables que contienen diluyentes inertes
utilizados normalmente en la técnica, tal como el agua. Dichas
composiciones pueden comprender también adyuvantes, tales como
humectantes, edulcorantes, saborizantes y agentes perfumantes.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
un ácido nucleico o polipéptido de la presente invención pueden
adoptar alguna de las varias formas y pueden ser administradas por
alguna de las varias vías. En las formas de realización preferidas,
las composiciones se administran por vía parenteral (intradérmica,
intramuscular o subcutánea) para provocar una respuesta inmunitaria
en el hospedador. Alternativamente, la composición puede
administrarse directamente en un ganglio linfático (intranodal) o
masa tumoral (es decir, administración intratumoral). Por ejemplo,
la dosis podría administrarse por vía subcutánea los días 0, 7 y 14.
Los procedimientos adecuados para la inmunización que utilizan las
composiciones que comprenden los TA son conocidas en la técnica,
como se presenta para p53
(Hollstein et al., 1991), p21-ras (Almoguera et al., 1988), HER-2 (Fendly et al., 1990), antígenos asociados al melanoma (MAGE-1; MAGE-2) (van der Bruggen et al., 1991), p97 (Hu et al., 1988) y antígeno carcinoembrionario (CEA) (Kantor et al, 1993; Fishbein et al., 1992; Kaufman et al., 1991), entre otros.
(Hollstein et al., 1991), p21-ras (Almoguera et al., 1988), HER-2 (Fendly et al., 1990), antígenos asociados al melanoma (MAGE-1; MAGE-2) (van der Bruggen et al., 1991), p97 (Hu et al., 1988) y antígeno carcinoembrionario (CEA) (Kantor et al, 1993; Fishbein et al., 1992; Kaufman et al., 1991), entre otros.
Las formas de realización preferidas de las
composiciones administrables incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos
o polipéptidos en preparaciones líquidas tales como suspensiones,
jarabes o elixires. Las preparaciones inyectables preferidas
incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos adecuados
para administración parenteral, subcutánea, intradérmica,
intramuscular o intravenosa tales como suspensiones o emulsiones
esterilizadas. Por ejemplo, un poxvirus recombinante puede ser una
mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado tal como
agua esterilizada, solución salina fisiológica, glucosa o similares.
La composición puede también proporcionarse en forma liofilizada
para redisolver, por ejemplo, en tampón salino acuoso isotónico.
Además, las composiciones pueden administrarse conjuntamente o
administrarse sucesivamente con otros agentes antineoplásicos,
antitumorales o anticancerosos y/o con agentes que reduzcan o
alivien los efectos de la enfermedad de agentes antineoplásicos,
antitumorales o anticancerosos.
Se proporciona también un kit que comprende una
composición de la presente invención. El kit puede incluir un
recipiente por separado que contiene un portador, diluyente o
excipiente adecuado, el kit puede incluir también un agente
anticanceroso, antitumoral o antineoplásico adicional y/o un agente
que reduzca o alivie los efectos de la enfermedad de agentes
antineoplásicos, antitumorales o anticancerosos para la
administración conjunta o sucesiva. Además, el kit puede incluir
instrucciones para mezclar o combinar los ingredientes y/o la
administración.
Una mejor comprensión de la presente invención y
de sus muchas ventajas se conseguirá a partir de los ejemplos
siguientes, proporcionados a título ilustrativo.
Ejemplo
1
Se ha documentado la presencia de formas
truncadas de CEA en las células después de la expresión de CEA
recombinante. Este estudio se publica para generar las secuencias
de ácido nucleico que codifican CEA que no dan como resultado la
expresión de CEA truncada después de la expresión en las células. La
generación y expresión de una nueva secuencia de ácido nucleico
codifica CEA, CAP(6D)-1,2, se describe a
continuación.
El plásmido p3'H6MCEA se obtuvo de Virogenetics,
Inc. Este plásmido contiene el gen MCEA con la modificación 6D bajo
el control del activador H6 parcial (Fig. 1A). El fragmento
NruI-BamHI de 912 bp procedente de p3'H6MCEA se
clonó en pUC18 para formar el plásmido pSE1544.9
(pUC18-mCEA repetición 1; Fig. 1B).
Los oligos 7254-7526,
7528-7533, 7535-7537 y
7567-7568 purificados por OPC se quinasaron e
hibridaron para crear dos fragmentos que se ligaron para dar como
resultado la repetición 1 de mCEA modificada sintética de 464 bp
flanqueada por las secuencias AccI y BamHI. Este fragmento de la
repetición 1 modificado sintético se clonó en pSE1544.9
AccI-BamHI para crear pSE1616.44 (repetición 1
modificada de pUC18-mCEA; Fig. 2). El fragmento
EcoRV-BamHI de 904 bp de pSE1616.44 se volvió a
clonar en p3'H6MCEA EcoRV-BamHI para formar
pSE1658.15 (repetición 1 modificada de p3'H6MCEA; Fig. 3).
Se creó el fragmento de la repetición 2
modificado sintético utilizando un procedimiento denominado corte y
empalme génico por extensión del solapamiento (SOE) y se clonó en
pBluescript-SK+, generando pBSmCEA (Fig. 4). Los
oligos utilizados para la modificación de la repetición 2 se
presentan a continuación (apartado IV, B). Los dos clones
diferentes (PBS-mCEA-3 y
PBS-mCEA-8) contenían varias
mutaciones puntuales.
El fragmento BamHI-EcoRI de 697
bp de PBS-mCEA-3 se clonó en pUC18
BamHI-EcoRI para crear pSE1671.8. El fragmento
SpeI-Bsu361 de 591 bp de PBS mCEA-8
se clonó en pSE1671.8 SpeI-Bsu361, generando el
plásmido denominado pSE1681.1. La muetiquetaénesis por PCR de dos
secuencias, que utiliza el kit de la muetiquetaénesis dirigida por
la secuencia Quikchange de Straetiquetaene con los oligos 7751
(GGACGGTAGTGTATGATGGAGA
TAGTTGGGTCGTCTGGGCC) y 7760 (CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC), se realizó para corregir las dos mutaciones puntuales restantes pSE1681.1. El clon corregido se denominó pSE1686.1 (repeticón 2 modificada de pUC18 mCEA; Fig. 5).
TAGTTGGGTCGTCTGGGCC) y 7760 (CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC), se realizó para corregir las dos mutaciones puntuales restantes pSE1681.1. El clon corregido se denominó pSE1686.1 (repeticón 2 modificada de pUC18 mCEA; Fig. 5).
Como se mencionó anteriormente, un codón de
alanina estaba ausente en el terminal 5' de la segunda repetición
en el plásmido p3'H6MCEA que contenía CEA. Para preservar la
consistencia de la secuencia de aminoácidos de CEA, el codón de
alanina presente en el plásmido pSE1686.1 que contiene la segunda
repetición modificada de CEA se modificó genéticamente. Esto se
realizó utilizando los oligos 7802
(CGTGACGACGATTACCGTGTATGAGC
CACCAAAACCATTCATAAC) y 7803 (GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTCACG) y el kit de muetiquetaénesis dirigida al sitio a la secuencia Quikchange de Straetiquetaene. El plásmido resultante, pSE1696.1 (repetición 2 modificada de pUC18 mCEA; Fig. 6) se confirmó por secuenciado.
CACCAAAACCATTCATAAC) y 7803 (GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTCACG) y el kit de muetiquetaénesis dirigida al sitio a la secuencia Quikchange de Straetiquetaene. El plásmido resultante, pSE1696.1 (repetición 2 modificada de pUC18 mCEA; Fig. 6) se confirmó por secuenciado.
\newpage
El fragmento Bsu36I-BamHI de 694
bp de pSE1696.1 se clonó en la secuencia
Bsu36I-BamHI de Pse1658.15 para combinar las
repeticiones 1 y 2 modificadas. El plásmido generado se denominó
p3'H6modMCEA-repeticiones 1ª y 2ª (Fig. 7).
El fragmento NruI/XhoI de 2,2 kb de
p3'H6modMCEA-repeticiones 1ª y 2ª se clonó en la
secuencia NruI/XhoI de pNVQH6LSP-18, generando
pNVQH6MCEA (6D1ª y 2ª; Fig. 8). La secuencia de CEA modificada
("CAP(6D)-1,2") contenida dentro de
pNVQH6MCEA se presenta en la Fig. 9.
Para determinar la estabilidad de la secuencia
CAP(6D)-1,2 en la expresión en una célula, el
gen junto con el activador H6 adyacente se amplió por PCR
utilizando pNVQH6MCEA(6D1ª y 2ª) como plantilla y dos oligos
(8034LZ:CTGGCGCGCCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG; y
8035LZ:CTGGTACCAGAAAAACTATATCAG
AGCAACCCCAAC). El producto de PCR se clonó a continuación en un plásmido donante NYVAC TK denominado pLZTK1 que contiene los genes marcadores LacZ y K1L. Este vector se preparó específicamente para la generación de virus recombinante en NYVAC utilizando el procedimiento de identificación azul/blanco. Después de la recombinación in vitro entre el plásmido donante pLCTK1mCEA (6D1ª y 2ª) y NYVAC, la secuencia CAP(6D)-1,2 extraña y los genes marcadores se integran en el genoma de NYVAC. Las placas que contienen NYVAC recombinante intermedio tanto con LacZ como con mCEA aparecieron azules. Se llevaron a cabo a continuación varias rondas de purificación en placa. El segundo episodio de recombinación expulsó los genes marcadores resultantes en las placas blancas finales que contienen recombinantes con solamente la secuencia CAP(6D)-1,2 pero no genes marcadores (Fig. 10).
AGCAACCCCAAC). El producto de PCR se clonó a continuación en un plásmido donante NYVAC TK denominado pLZTK1 que contiene los genes marcadores LacZ y K1L. Este vector se preparó específicamente para la generación de virus recombinante en NYVAC utilizando el procedimiento de identificación azul/blanco. Después de la recombinación in vitro entre el plásmido donante pLCTK1mCEA (6D1ª y 2ª) y NYVAC, la secuencia CAP(6D)-1,2 extraña y los genes marcadores se integran en el genoma de NYVAC. Las placas que contienen NYVAC recombinante intermedio tanto con LacZ como con mCEA aparecieron azules. Se llevaron a cabo a continuación varias rondas de purificación en placa. El segundo episodio de recombinación expulsó los genes marcadores resultantes en las placas blancas finales que contienen recombinantes con solamente la secuencia CAP(6D)-1,2 pero no genes marcadores (Fig. 10).
Las placas blancas recombinantes y las placas
azules se seleccionaron para la confirmación de la secuencia
CAP(6D)-1,2. Se realizó la infección
utilizando el virus de las placas respectivas y se recogieron las
células tres días después de la infección para preparar ADN celular
o lisado celular. Para el aislamiento del ADN de NYVAC
recombinante, se utilizó el reactivo DNAzol® (GibcoBRL). PCR
(condiciones de PCR: 95ºC (5 min.) \rightarrow [95ºC(30
s.) \rightarrow 49ºC(30 s.) \rightarrow 72ºC(1
min.)] 30 ciclos \rightarrow 72ºC (7 min.) \rightarrow 4ºC) se
realizó para confirmar la existencia de la secuencia
CAP(6D)-1,2 en el genoma recombinante de
NYVAC. Los cebadores utilizados fueron 7569LZ (cebador transcrito
5' ttggatccatggagtctccctcggcc 3') y 7570LZ (cebador complementario
5' ttggatccctatatcagagcaacccc 3'), que pudo ampliar la longitud
total de 2106 bp de CAP(6D)-1,2.
Todas las placas blancas recombinantes finales
PRBC-III-2, 3, 6, 8, 9, 10
demostraron la banda de secuencia
CAP(6D)-1,2 de 2,1 kb en PCR.
PRBC-III-N1 fue una placa azul tanto
con genes marcadores como con la secuencia
CAP(6D)-1,2 todavía en el genoma vírico en la
banda de la secuencia CAP(6D)-1,2 se amplió
también en la PCR. La banda PCR destacada ampliada procedente del
ADN vCP 307 (que contiene CEA natural integrada en el genoma de
ALVAC) se truncó CEA a 1,2 kb con una banda de CEA completa muy
débil. La muestra de células solamente (ninguna infección vírica)
se utilizó como referencia negativa y el plásmido pLZTK1MCEA (6D1ª y
2ª) se utilizó como referencia positiva en la reacción de PCR. Los
resultados de PCR presentaron claramente la
CAP(6D)-1,2 completa en el genoma vírico
recombinante sin ninguna otra forma truncada de CEA visible. Este
resultado indicó que CAP(6D)-1,2 había
aumentado la estabilidad relativa al CEA natural en el genoma de
ALVAC.
La expresión de la proteína se analizó también
por inmunotransferencia para confirmar la ausencia de la proteína
CEA truncada en las células que expresan
CAP(6D)-1,2 (Fig. 11). Para el aislamiento
del lisado celular, se lavaron en primer lugar las células con PBS
seguido de la adición de tampón de lisis (Reporter Gene Assay;
Boehriner Mannheim) y agitación durante 15 minutos. El lisado
celular se centrifugó a 13.000 rpm y se recogió el sobrenadante
para el análisis por transferencia Western. Las muestras se cargaron
en un gel de poliacrilamida al 10% y se introdujeron a 125 voltios.
La proteína se transfirió a continuación a una membrana filtrante
PVDF (Immobilon-P, Millipore). Un anticuerpo
monoclonal CEA de ratón unido a HRP (1:1000; Fitzgerald) se utilizó
para detectar la expresión de mCEA con el aumento del reactivo de
quimioluminiscencia (ADN Thunder^{TM}; NEN^{TM} Life Science
Products).
Las seis placas blancas recombinantes
CAP(6D)-1,2 finales
(PRBC-III-2,3,6,8,9,10) y una placa
azul intermedia (pRBC-III-N1)
presentaba solamente una banda CEA sin ninguna otra forma truncada
(Fig. 11). En cambio, la proteína de las placas vCP307 (ALVAC
recombinante que expresa CEA natural) presentó un producto CEA
truncado claro a \sim60 kDa además de la CEA completa. La
exposición prolongada de la película verificó la ausencia de
algunos polipéptidos de CEA truncados en los recombinantes
CAP(6D)-1,2. CEF se utilizó como referencia
negativa.
En conclusión, se generaron recombinantes
CAP(6D)-1,2 con la mCEA en lugar de la CEA
natural para impedir la expresión de las versiones múltiples de
CEA. CAP(6D)-1,2 expresada a partir de NYVAC
recombinante se demostró eficaz para eliminar la versión truncada
de CEA tanto por PCR como por transferencia Western.
Aunque la presente invención se ha descrito
desde el punto de vista de las formas de realización preferidas, se
apreciará que resultrarán evidentes variaciones y modificaciones
para los expertos en la materia. Por consiguiente, se pretende que
las reivindicaciones comprendan la totalidad de dichas variaciones
equivalentes que están comprendidas dentro del alcance de la
invención como se reivindica.
\global\parskip0.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 1; secuencia
nucleotídica
AAC2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 2; marco de lectura
abierto
AAC2-2
\newpage
SEC. ID. nº: 3;
7524
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 4;
7526
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 5;
7528
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 6;
7533
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 7;
7535
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 8;
7537
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 9;
7567
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 10;
7568
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 11;
7576
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 12;
7587
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 13;
7677
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 14;
7678
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 15;
7679
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 16;
7680
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 17;
7681
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 18;
7682
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 19;
7683
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 20;
7684
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 21;
7685
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC. ID. nº: 22;
7686
\newpage
SEC. ID. nº: 23;
CEA-CAP6D
\newpage
SEC. ID. nº: 24;
CAP6D-1,2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Aventis Pasteur, Limited
\hskip1cmTherion Biologics, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Ácido nucleico de CEA modificado y
vectores de expresión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P021352EP CLM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 03719662.3
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-04-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US03/10916
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-04-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/372,972
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-04-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente en versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3564
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia desconocida: secuencia nucleotídica
AAC2-1"
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1663)..(163)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es dudoso
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia desconocida: secuencia nucleotídica
AAC2-2"
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7524"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7526"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7528"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7533"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7535"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7537"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7567"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7568"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7576"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7587"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7677"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7678"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7679"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7680"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7681"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7682"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7683"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7684"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7685"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: 7686"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcaggttc acaggtgaag gccacagcat ccttgtcctc cacgggt
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: CEA-CAP6D"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Secuencia CEA modificada
(CAP(6D)-1,2) contenida dentro de
PNVQH6MCEA"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys
Arg Ser Arg His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7751"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacggtagt aggtgtatga tggagatata gttgggtcgt ctgggcc
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7760"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagaatgaat tatccgttga tcactcc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7802"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgacgacg attaccgtgt atgagccacc aaaaccattc ataac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Oligo 7803"
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<400> 29
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttatgaatg gttttggtgg ctcatacacg gtaatcgtcg tcacg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Cebador transcrito 8034LZ"
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggcgcgcc ttctttattc tatacttaaa aagtg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Cebador transcrito 8035LZ"
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<400> 31
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtaccag aaaaactata tcagagcaac cccaac
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Cebador transcrito 7569LZ"
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<400> 32
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggatccat ggagtctccc tcggcc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> fuente
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<223> /nota = "Descripción de la
secuencia artificial: Cebador complementario 7570LZ"
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<400> 33
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggatccct atatcagagc aacccc
\hfill26
Claims (13)
1. Vector de expresión que comprende la
secuencia de ácido nucleico CEA (6D)-1,2 como se
ilustra en la SEC. ID. nº: 24.
2. Vector de expresión según la reivindicación
1, en el que el vector es un plásmido o un vector vírico.
3. Vector de expresión según la reivindicación
2, en el que el vector vírico se selecciona de entre el grupo
constituido por poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvirus y
virus adenoasociados.
4. Vector de expresión según la reivindicación
3, en el que el vector vírico es un poxvirus seleccionado de entre
el grupo constituido por vacunas, NYVAC, avipox, viruela de los
canarios, ALVAC, ALVAC(2), viruela aviar y TROVAC.
5. Vector de expresión según la reivindicación
4, en el que el vector vírico es un poxvirus seleccionado de entre
el grupo constituido por NYVAC, ALVAC y ALVAC(2).
6. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos un
antígeno adicional asociado al tumor.
7. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos una
secuencia nucleica que codifica un antígeno asociado a la
angiogénesis.
8. Vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además por lo menos una
secuencia de ácido nucleico que codifica un componente
coestimulante.
9. Composición farmacéutica que comprende un
vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8
en un portador farmacéuticamente aceptable.
10. Utilización de un vector de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un
medicamento destinado a prevenir o tratar el cáncer.
11. Molécula de ADN aislada que comprende la
secuencia CEA(6D)-1,2 ilustrada en la SEC.
ID. Nº: 24.
12. Utilización de una composición según la
reivindicación 9 para la preparación de un medicamento destinado a
prevenir o tratar el cáncer.
13. Vector de expresión según la reivindicación
8, en el que el componente coestimulante es B7.1.
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