MXPA06003911A - Vector cea/b7 modificado - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con unácido nucleico que codifica para un polipéptido y la utilización deácido nucleico o polipéptido para prevenir y/o tratar el cáncer. En particular, la invención se relaciona con vectores mejorados para la inserción y expresión de genes extraños que codifican para antígenos tumorales ara utilizarse en el tratamiento inmunoterapéutico del cáncer.

Description

VECTOR CEA/B7 MODIFICADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido y la utilización del ácido nucleico o polipéptido para prevenir y/o tratar el cáncer. En particular, la invención se relaciona con vectores mejorados para la inserción y expresión de genes extraños que codifican para antígenos tumorales para utilizarse en el tratamiento inmunot erapéut ico del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Ha habido un aumento extraordinario en los últimos años en el desarrollo de vacunas contra el cáncer con antígenos asociados con tumores (TAAs, por sus siglas en inglés) debido a los grandes avances en la identificación de moléculas con base en los perfiles de expresión sobre tumores primarios y células normales con el auxilio de diversas técnicas tales como por ejemplo, micro-arreglo de alta densidad, SEREX, inmunohistoquímica (IHC, por sus siglas en inglés), RT-PCR, hibridación in -si t u (ISH, por sus siglas en inglés) y microscopía de captura láser (Rosenberg, Immunity, 1999; Sgroi et al, 1999, Schena et al, 1995, Offringa et al, 2000) . Los TAA son antígenos expresados o sobre-expresados por células tumorales y podrían ser específicos para uno o diversos tumores, por ejemplo el antígeno CEA se expresa en cánceres colorrectales , de mama y pulmonares. Sgroi et al (1999) identificaron diferencialmente diversos genes expresados en células invasivas y metastáticas de carcinoma con uso -combinado de microdisección por captura láser y micro-arreglos de ADNc. Se podrían utilizar diversos sistemas de suministro similares al ADN o virus para la vacunación terapéutica contra cánceres humanos (Bounet et al, 2000) y pueden producir respuestas inmunológicas y también la interrupción de la tolerancia inmunológica contra los TAA. Las células tumorales se pueden hacer más inmunogénicas al insertar transgenes que codifican para moléculas coestimuladoras de linfocitos T tales como por ejemplo, B7.1 o citoquinas, tales como por ejemplo, IFN-?, IL2, o GM-CSF, entre otras. La co-expresión de un TAA y una citoquina o molécula co-estimuladoras pueden desarrollar una vacuna terapéutica eficaz (Hodge et al, 95, Bronte et al, 1995, Cha berlain et al, 1996) .

Existe una necesidad en la técnica por reactivos y metodologías útiles para estimular una respuesta inmunológica para prevenir o tratar cánceres. La presente invención proporciona los reactivos y metodologías que superan muchas de las dificultades encontradas por otros para intentar tratar el enfermedades tales como el cáncer. En particular, la presente invención proporciona una secuencia novedosa de codificación para CEA según se expresa a partir de los vectores de expresión. Esta secuencia modificada se desea por aquellos expertos en la técnica para mejorar los protocolos de expresión e inmunización para CEA.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un blanco inmunogénico para la administración a un paciente para prevenir y/o tratar el cáncer. En particular, el blanco inmunogénico es un antígeno tumoral de CEA (??TA") y/o un antígeno asociado con angiogénesis ("AA") . En una modalidad, el blanco inmunogénico se codifica por una secuencia nucleotídica de CEA modificado ( CE ( 6D) -1 , 2 ) que mejora la expresión de CEA en células transfectadas. En ciertas modalidades el TA y/o AA se administran a un paciente como un ácido nucleico contenido dentro de un plásmido u otro vector, tal como por ejemplo un virus recombinante. El TA y/o AA también se administran en combinación con un inmuno estimulador, tal como por ejemplo, una molécula co-estimuladora o adyuvante.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1. A. Ilustración del plásmido p3'H6MCEA que comprende la secuencia codificante de CEA con la modificación 6D bajo el control del promotor H6 parcial. B. Ilustración del plásmido pSE1544.9 (püC18-CEAm repetición 1) . Figura 2. Ilustración del plásmido pSElßlß.44 (püCl 8-CEAm-modificado repetición 1) . Figura 3. Ilustración del plásmido PSE1658.15 (p3 ' HßCEAM- odificado repetición 1) . Figura 4. Ilustración del plásmido pBSCEAm. Figura 5. Ilustración del plásmido pSElßdß.l (pUC18 CEAm modificado repetición 2. Figura 6. Ilustración del plásmido pSE1696.1 (pUC18 CEAm modificado repetición 2. Figura 7. Ilustración del plásmido p3 ' HßmodMCEA-la . y 2a. repeticiones.

Figura 8. Ilustración del plásmido pNVQH6MCEA (6D la. y 2a.) . Figura 9A-D . Comparación de la secuencia nucleotídica de CAP(6D) y CAP(6D)-1, 2. Se subrayan las diferencias entre las secuencias . Figura 10. Análisis de PCR para confirmar la presencia de CAP (6D) -1,2 en ADN de NYVAC . Figura 11. Inmunotransferencia que ilustra la falta de CEA interrumpido en células que expresan CAP(6D)-1,2. Figura 12. Gen B7.1 humano en un plásmido donador ALVAC C6 bajo el control del promotor H6. Figura 13. secuencia de ADN de CAP(6D)-1,2 CEA en un plásmido donador ALVAC C3 bajo el control del promotor H6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona reactivos y metodologías útiles para el tratamiento y/o prevención del cáncer. Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan como referencia. En una modalidad, la presente invención se relaciona con la inducción o mejora de una respuesta inmunológica contra uno o más antígenos tumorales ("TA") para la prevención y/o tratamiento del cáncer.

En ciertas modalidades, se pueden combinar uno o más de los TA. En modalidades preferidas, la respuesta inmunológica es el resultado de la expresión de un TA en una célula hospedera después de la administración de un vector de ácido nucleico que codifica para el antígeno tumoral o el antígeno tumoral mismo en la forma de un péptido o polipéptido, por ejemplo. En el sentido en el que se utiliza en la presente, un "antígeno" es una molécula (tal como por ejemplo, un polipéptido) o una porción del mismo que produce una respuesta inmunológica en un hospedero a quien se le haya administrado el antígeno. La respuesta inmunológica puede incluir la producción de anticuerpos que se unen al menos a un epítope del antígeno y/o la generación de una respuesta inmunológica celular contra las células que expresan un epítope del antígeno. La respuesta puede ser una mejora de una respuesta inmunológica general, por ejemplo, provocando la producción aumentada de anticuerpos, la producción de anticuerpos con afinidad aumentada para el antígeno, o un aumento en la respuesta inmunológica celular (es decir, número aumentado o actividad de los linfocitos T inmunorreact ivos ) . ün antígeno que produce una respuesta inmunológica alternativamente se puede denominar como inmunogénico o inmunógeno. En la descripción de la presente invención, un TA se puede denominar como un "blanco inmunogénico". El término TA incluye tanto antígenos tumor- asociados (TAAs) como antígenos tumor-específicos (TSAs), donde una célula cancerosa es la fuente del antígeno. Un TAA es un antígeno que se expresa en la superficie de una célula tumoral en mayores cantidades que las observadas en células normales o un antígeno que se expresa en células normales durante el desarrollo fetal. Un TSA es un antígeno que es único para células tumorales y no se expresa en células normales. El TA incluye además los TAA o TSA, los fragmentos antigénicos de los mismos, y las versiones modificadas que conservan su antigenicidad. Los TA típicamente se clasifican en cinco categorías de acuerdo con su patrón de expresión, función, u origen genético: antígenos (es decir, MAGE, NY-ESO-1) de cáncer testicular (CT, por sus siglas en inglés); antígenos para diferenciación de melanocitos (es decir, Melan A/MART-1, tirosinasa, gplOO); antígenos mutacionales (es decir, MUM-1, p53, CDK-4); Xuto' antígenos sobre-expresados (es decir, HER-2/neu, p53); y, antígenos virales (es decir, HPV, EBV) . Con el fin de practicar la presente invención, un TA adecuado es cualquier TA que induzca o refuerce una respuesta inmunológica anti-tumoral en un hospedero a quien se le haya administrado el TA. Los TA adecuados incluyen, por ejemplo, gplOO (Cox et al., Science, 264:716-719 (1994)); MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med. , 180:347-352 (1994)); gp75 (TRP-1) (Wang et al., J. Exp. Med. r 186: 1131-1140 (1996)), tirosinasa (Wolfel et al., Eur. J. Immunol., 24:759-764 (1994); WO 200175117; WO 200175016; W0200175007 ) , NY-ESO-1 (W098/14464; WO99/18206; melanoma proteoglicano (Hellstrom et al., J. Immunol. , 130:1467-1472 (1983)), antígenos de la familia MAGE (es decir, MAGE-1 , 2 , 3 , 4 , 6 , 12 , 51 ; Vander Bruggen et al., Science, 254: 1643-1647 (1991); las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,235,525; CN 1319611), antígenos de la familia BAGE (Boel et al., Immunity, 2:167-175 (1995)), antígenos de la familia GAGE (es decir, GAGE-1,2; Van den Eynde et al., J. Exp. Med. , 182:689-698 (1995); patente de los Estados Unidos No. 6,013,765), antígenos de la familia RAGE (es decir, RAGE-1; Gaugler et al., Immunogenetics , 44:323-330 (1996); patente de los Estados Unidos No. 5,939,526) , N-acetilglucosaminiltransferasa-V (Guilloux et al., J. Exp. Med. , 183:1173-1183 (1996)), pl5 (Robbins et al., J. Immunol. 154:5944- 5950 (1995)), ß-catenina (Robbins et al., J. Exp. Med. , 183:1185-1192 (1996)), MUM-1 (Coulie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980 (1995)), cinasa-4 dependiente de ciclina (CDK4) (Wolfel et al., Science, 269:1281-1284 (1995)), p21-ras (Fossum et al., Int. J. Cáncer, 56:40-45 (1994)), BCR-abl (Bocchia et al., Blood, 85:2680-2684 (1995)), p53 (Theobald et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 92:11993-11997 (1995)), pl85 HER2/neu (erb-Bl; Fisk et al., J. Exp. Med. , 181:2109-2117 (1995)), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (Harris et al., Breast Cáncer Res. Treat, 29:1-2 (1994)), antígenos carcinoe briónicos (CEA) (Kwong et al., J. Nati. Cáncer Inst . , 85:982-990 (1995) patentes de los Estados Unidos Nos. 5,756,103; 5,274,087; 5,571,710; 6,071,716; 5,698,530; 6,045,802; EP 263933; EP 346710; y EP784483); mucinas mutadas asociadazas con carcinoma (es decir, productos del gen MUC-1; Jerome et al., J. Immunol. , 151:1654-1662 (1993)); productos del gen EBNA de EBV (es decir, EBNA-1; Rickinson et al., Cáncer Surveys, 13:53-80 (1992)); proteínas E7, E6 del virus de papiloma humano (Ressing et al., J. Immunol, 154:5934-5943 (1995)); antígeno próstata espefífico (PSA; Xue et al., The Prostate, 30:73-78 (1997)); antígeno membranoso próstata-específico (PSMA; Israeli, et al., Cán cer Res . 54:1807-1811 (1994)); epítopes o antígenos idiotípicos, por ejemplo, idiotipos de inmunoglobulina o idiotipos del receptor de linfocitos T (Chen et al., J. Imm un ol . , 153:4775-4787 (1994)); KSA (patente de los Estados Unidos No. 5,348,887), cinesina 2 (Dietz, et al., Biochem Biophys Res Común 2000 Sep 7 ; 275 ( 3 ) : 731- 8 ) , HIP-55, factor antiapoptótico TGFß-1 (Toomey, et al. Br J Biomed Sci 2001 ; 58 ( 3 ) : 177 -83 ) , proteína tumoral D52 (Bryne J.A., et al, Genomics, 35:523-532 (1996)), H1FT, NY-BR-1 (WO 01/47959), NY-BR-62, NY-BR-75, NY-BR-85, NY-BR-87, NY-BR-96 (Scanlan, M. Serologic and Bioformatic Approaches to the Identification of Human Tumor Antigens, in Cán cer Va ccin es 2000 , Cáncer Research Institute, New York, NY), incluyendo "tipo Silvestre" (es decir, codificado normalmente por el genoma, que se presenta en la naturaleza), modificado y versiones mutadas, así como también, otros fragmentos y derivados de los mismos. Cualquiera de estos TA se pueden utilizar solos o en combinación entre sí en un protocolo de co-inmuni zación . En ciertos casos, puede ser conveniente coinmunizar a pacientes tanto con TA como con otros antígenos, tales como por ejemplo, antígenos angiogénesis-asociados ("AA") . Un AA es una molécula inmunogénica (es decir, un péptido, un polipéptido) asociado con células implicadas en la inducción y/o el desarrollo continuo de vasos sanguíneos. Por ejemplo, un AA se puede expresar en una célula endotelial ("CE") que es un componente estructural primario de vasos sanguíneos . Cuando la enfermedad es cáncer, se prefiere que el AA se encuentre dentro o cerca de los vasos sanguíneos que facilitan la aparición de un tumor. La inmunización de un paciente contra un AA de preferencia da por resultado en una respuesta inmunológica anti-AA con la cual los procesos angiogénicos que ocurren cerca o dentro de los tumores se previenen y/o inhiben. Los AA de ejemplo incluyen, por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (es decir, VEGF; Bernardini, et al. J. Urol . , 2001, 166(4) :1275-9; Starnes, et al. J. Th ora c . Ca rdi ova sc . Surg . ; 2001, 122 (3) : 518-23) ; el receptor VEGF (es decir, VEGF-R, flk-1/KDR; Starnes, et al. J. Thora c . Cardi ova s c . Surg, 2001, 122 ( 3 ) : 518-23 ) , receptores EPH (es decir, EPHA2; Gerety, et al. 1999, Cell , 4:403-414), receptor de factor de crecimiento epidérmico (es decir, EGFR; Ciardeillo, et al. Cl in . Cán cer Re s . , 2001, 7 ( 10 ) : 2958-70 ) , factor de crecimiento fibroblást ico básico (es decir, bFGF; Davidson, et al. Clin. Exp. Metástasis 2000, 18(6) : 501-7; Poon, et al. Am J.^ Surg., 2001, 182(3) :298- 304), factor de crecimiento celular derivado de plaquetas (es decir, PDGF-B), factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF; Hong, et al. J. Mol. Med., 2001, 8(2) :141-8), factores de crecimiento transformante (es decir, TGF- a; Hong, et al. J. Mol. Med., 2001, 8(2) :141-8), endoglina (Balza, et al. Int. J. Cáncer, 2001, 94:579-585), proteínas Id (Benezra, R., Trends Cardiovasc. Med., 2001, 11 ( 6 ) : 237-41 ) , proteasas tales co o por ejemplo, uPA, uPAR, y metaloproteinasas matriz (MMP-2, MMP-9; Djonov, et al. J. Pathol. , 2001, 195 ( 2 ) : 147-55 ) , sintasa de óxido nítrico (Am. J. Ophthalmol., 2001, 132(4) : 551- 6), aminopeptidasa (Rouslhati, E., Nature Cáncer, 2:84-90, 2002), tro bospondinas (es decir, TSP-1, TSP-2; Alvarez, et al. Gynecol . Oncol., 2001, 82(2) :273-8; Seki, et al. Int. J. Oncol., 2001, 19 (2) : 305-10) , k-ras (Zhang, et al. Cáncer Res., 2001, 61 (16) : 6050-4) , Wnt (Zhang, et al. Cáncer Res., 2001, 61 (16) : 6050-4 ) , cinasas dependientes de ciclina ' (CDKs; Drug Resist. Updat . 2000, 3(2) :83-88), microtúbulos (Timar, et al. 2001. Path. Oncol. Res., 7(2) :85-94), proteínas de choque térmico (es decir, HSP90 (Timar, s upra ) ) , factores de unión con heparina (es decir, heparinasa; Gohji, et al. Int. J. Cáncer, 2001, 95 (5) : 295-301) , sintasas (es decir, ATP sintasa, timidilato sintasa), receptores de colágeno, integrinas (es decir, uß3, auß5, oílßl, 2ßl, a5ßl), proteolglicano superficial NG2, AAC2-1, (SEQ ID NO.:l), o AAC2-2 (SEQ ID NO . : 2 ) , entre otros, incluyendo las versiones "tipo silvestre" (es decir, codificado normalmente por el genoma, que se presenta en la naturaleza), modificadas, mutadas, así como también, otros fragmentos y derivados de las mismos. Cualquiera de estos blancos puede ser adecuado para practicar la presente invención, ya sea solo o en combinación entre sí o con otros agentes . En ciertas modalidades, se utiliza una molécula de ácido nucleico que codifica para un blanco imunogénico. La molécula de ácido nucleico puede comprender o consistir de una secuencia de nucleótidos que codifica para uno o más blancos inmunogénicos , o fragmentos o derivados de los mismos, tales como por ejemplo, aquellos contenidos en un inserto de ADN en un Depósito ATCC. El término "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. El término abarca las moléculas formadas de cualquiera de los análogos base conocidos de ADN y ARN tales como por ejemplo, de manera enunciativa: 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina , aziridinil-citosina, pseudoisocitosina , 5- ( carboxihidroxilmetil ) uracilo , 5-fluorouracilo , 5-bromouracilo , 5-carboximetilesinomet il-2-tiouracilo , 5-carboxi-metile sinometiluracilo , dihidrouracilo, inosina, N6-iso-penteniladenina , 1-met iladenina , 1-metilpseudouracilo , 1-metilguanina , 1-metilinosina , 2 , 2-dimetil-guanina , 2-metiladenina , 2-metilguanina , 3-metilcitosina, 5-metilcitosina , N6-metiladenina , 7-metilguanina , 5-metilesinometiluracilo , 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5 ' -metoxicarbonil-metiluracilo , 5-metoxiuracilo , 2-metilt io-N6-isopenteniladenina , metiléster del ácido uracil-5-oxiacético , ácido uracil-5-oxiacético , oxibut oxosina , pseudouracilo , queosína, 2-tiocitosina , 5-metil-2-tiouracilo , 2-tiouracilo, 4-tiouracilo , 5-metiluracilo , metiléster del ácido N-uracil-5-oxiacético , ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitoxina, y 2 , 6-diaminopurina , entre otros. Una molécula de ácido nucleico aislado es uno que: (1) se separa de al menos aproximadamente 50 por ciento de proteínas, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se encuentran en la naturaleza cuando el ácido nucleico total se aisla de células fuente; (2) no se enlaza a la totalidad o una porción de un polinucleótido al cual se enlaza la molécula de ácido nucleico en la naturaleza; (3) se enlaza operablemente a un polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza; y/o, (4) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia mayor de polinucleótidos. De preferencia, la molécula de ácido nucleico aislado de la presente invención está prácticamente libre de cualesquiera otras moléculas de ácido nucleico contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que pudieran interferir con su utilización en la producción de polipéptidos o su utilización terapéutica, de diagnóstico, profiláctica o de investigación. En el sentido en que se utiliza en la presente, el término "se presenta en la naturaleza" o "natural" o "encontrado naturalmente" cuando se utiliza junto con los materiales biológicos tales como por ejemplo, moléculas de ácido nucleico, polipéptídos , células hospederas, y lo semejante, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no se manipulan por el hombre. De manera similar, "que no se presenta en la naturaleza" o "no natural", en el sentido en que se utiliza en la presente se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado o sintetizado estructuralmente por el hombre . La identidad de dos o más secuencias de ácido nucleico o polipéptido se determina al comparar las secuencias. Como se sabe en la técnica, "identidad" significa el grado de relación de secuencias entre las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos según se determina por la coincidencia entre las unidades que constituyen las moléculas (es decir, nucleótidos o residuos de aminoácidos) . La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineamientos de separaciones (en su caso) dirigidas por un modelo matemático o programa de computadora particular (es decir, un algoritmo) . La identidad entre las secuencias de ácido nucleico también se puede determinar por la capacidad de la secuencia relacionada para hibridarse a la secuencia de ácido nucleido o molécula de ácido nucleico aislada. Para definir estas secuencias, el término "condiciones bastante severas" y "condiciones moderadamente severas" se refiere a procedimientos que permitan la hibridación de las cadenas de ácido nucleico cuyas secuencias son complementarias, y para excluir la hibridación de ácidos nucleicos que no coinciden significativamente. La ejemplos de "condiciones bastante severas" para la hibridación y lavado son cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M a 65-68°C o cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M, y formamida al 50% a 42°C. (véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Mol e cul ar Cloning: A Labora tory Manua l (2a. ed., Col Spring Harbor Laboratory, 1989); Anderson et al., Nu cl ei c Aci d Hybridi sa ti on : A Pra cti cal Approa ch C . 4 (IRL Press Limited) ) . El término "condiciones moderadamente severas" se refiere a las condiciones bajo las cuales es capaz de formarse un ADN dúplex con un grado mayor de falta de coincidencias de pares de bases que se podría presentar bajo "condiciones bastante severas". Las condiciones ligeramente severas de ejemplo son cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M C a 50-65°C o cloruro de sodio 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M, y 20% de formamida a 37-50°C. A manera del ejemplo, las condiciones ligeramente severas de 50°C en el ion de sodio 0.015 M permitirán aproximadamente una falta de coincidencia del 21%. Durante la hibridación, otros agentes se pueden incluir en la hibridación y amortiguadores de lavado con el fin de reducir la hibridación no específica y/o antecedente. Los ejemplos son albúmina de suero bovino al 0.1%, polivinil-pirrolidona al 0.1%, pirofosfato de sodio al 0.1%, dodeciisulfato de sodio al 0.1%, NaDodS04, (SDS), solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonido (u otro ADN no complementario), y sulfato de dextrano, aunque también se pueden utilizar otros agentes adecuados. La concentración y tipos de estos aditivos se pueden cambiar sin afectar sustancialmente la severidad de las condiciones de hibridación. Los experimentos de hibridación normalmente se llevan a cabo a pH 6.8-7.4; sin embargo, a las condiciones típicas de resistencia iónica, la velocidad de hibridación es casi independiente del pH . En las modalidades preferidas de la presente invención, se utilizan vectores para transferir una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido hacia una célula. Un vector es cualquier molécula utilizada para transferir una secuencia de ácido nucleico a una célula hospedera. En ciertos casos, se utiliza un vector de expresión. Un vector de expresión es una molécula de ácido nucleico que sea adecuada para la transformación de una célula hospedera y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de las secuencias de ácido nucleico transferidas. La expresión incluye, de manera enunciativa, procesos tales como por ejemplo, transcripción, traducción, y empalme, si están presentes intrones. Los vectores de expresión comprenden típicamente una o más secuencias de flanqueo enlazadas funcionalmente a una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido. Las secuencias de flanqueo pueden ser homologas (es decir, de la misma especie y/o cepa como la célula hospedera) , heterólogas (es decir, de una especie distinta a la especie o cepa de la célula hospedera), híbridas (es decir, una combinación de secuencias de flanqueo provenientes de más de una fuente), o sintéticas, por ejemplo. Una secuencia de flanqueo de preferencia es capaz de llevar a cabo la replicación, transcripción y/o traducción de la secuencia codificante y se enlaza funcionalmente a una secuencia codificante. En el sentido en que se utiliza en la presente, el término enlazado funcionalmente se refiere a una unión de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Por ejemplo, un promotor o intensificador se enlaza funcionalmente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Sin embargo, una secuencia de flanqueo no necesariamente tiene que estar contigua con la secuencia codificante, siempre y cuando funcione correctamente. De esta forma, por ejemplo, la intercalación de secuencias sin traducir todavía transcritas puede estar presente entre una secuencia promotora y la secuencia codificante y la secuencia promotora todavía se pueden considerar enlazadas funcionalment es a la secuencia codificante. De manera similar, una secuencia intensificadora se puede ubicar en la dirección 5' o la dirección 3' de la secuencia codificante y afectar la transcripción de la secuencia. En ciertas modalidades, se prefiere que la secuencia de flanqueo sea una región reguladora transcripcional que impulsa la expresión génica de alto nivel en la célula blanco. La región reguladora transcripcional puede comprender, por ejemplo, un elemento promotor, intensificador, lentificador , represor, o combinaciones de los mismos. La región reguladora transcripcional puede ser ya sea constitutiva, tejido-específica, específica tipo celular (es decir, la región se impulsa a niveles superiores de transcripción en un tipo de tejido o célula según se compara con otra), o regulable (es decir, sensible a la interacción con un compuesto tal como por ejemplo, tetraciclina) . La fuente de una región reguladora transcripcional puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia de flanqueo funcione en una célula provocando la transcripción de un ácido nucleico dentro de esa célula. Para la práctica de la presente invención se pueden utilizar una amplia variedad de regiones reguladoras transcripcionales . Las regiones reguladoras transcripcionales adecuadas incluyen el promotor CMV (es decir, el promotor inmediato anterior de CMV) ; los promotores provenientes de genes eucaríóticos (es decir, el gen de ovalbúmina de pollo estrógeno-inducible , los genes interferón, el gen de tirosina-aminotransferasa gluco-cort icoide-inducible , y el gen de timidina cinasa) ; y los promotores génicos de adenovirus temprano y tardío; la región promotora anterior SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Na t ure 290:304-10); el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' (LTR) del virus de sarcoma Rous (RSV) (Yamamoto, et al., 1980, Cel l 22:787-97) ; el promotor de timidina cinasa del virus de herpes simplex (HSV-TK) (Wagner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444- 45); las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39- 42); los vectores de expresión procariótica tales como por ejemplo, el promotor beta-lactamasa (Villa- Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. , 75:3727-31); o el promotor tac (DeBoer et al. , 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25) . Las regiones controladoras transcripcionales específicas de tejido y/o célula incluyen, por ejemplo, la región controladora del gen de elastasa I que es activo en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-46; Ornitz et al., 1983, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-514); la región controladora del gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-22); la región controladora del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoideas (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-58; Adames et al., 1985, Nature 318:533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-44); la región controladora del virus tumoral mamario de ratón en células testiculares , de mama, linfoideas y mamarias (Leder et al., 1986, Cel l 45:485-95); la región controladora del gen de albúmina en el hígado (Pinker et al., 1987, Gen er and Devel . 1:268-76); la región controladora del gen alfa-feto-proteína en el hígado (Krumlanf et al., 1985, Mol . Cel l . Bi ol . , 5:1639-48; Hammer et al., 1987, Sci en ce 235:53-58); la región controladora del gen alfa I-antitripsina en el hígado (Kelsey et al., 1987, Gen es and Devel . 1:161-71); la región controladora del gen beta-globina en células mieolodieas (Mogram et al., 1985, Na t ure 315:338-49; Kollias et al., 1986, Cel l 46:89-94); la región controladora del gen de la proteína básica de mielina en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cel l 48:703-12); la región controladora del gen de doble cadena ligera de miosina en el músculo esquelético (Sani, 1985, Na t ure 314:283-86); la región controladora del gen de la hormona liberadora gonadotrópica en el hipotáleso (Masón et al., 1986, Sci en ce 234: 1372-78), y el promotor de tirosinasa en células de melanoma (Hart, I. Semin Oncol 1996 Feb; 23(l) :154-8; Siders, et al. Cáncer Gene Ther 1998 Sep-Oct; 5 ( 5 ) : 281- 91 ) , entre otros. Se conocen en la técnica otros promotores adecuados. Como se describió anteriormente, los intensificadores también pueden ser secuencias de flanqueo adecuadas. Los intensificadores son elementos cis-interpretadores de ADN, por lo general de aproximadamente 10-300 pares de bases de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los intensificadores típicamente son independientes de la orientación y la posición, que se han identificado tanto 5' como 3' para las secuencias codificadoras controladas. Se conocen diversas secuencias intensificadoras disponibles de genes mamíferos (es decir, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . De manera similar, el intensíficador SV40, el promotor anterior intensificador de citomegalovirus, el intensificador de polioma, y los intensificadores de adenovirus son útiles con las secuencias promotoras eucarióticas. Mientras que un intensificador se puede empalmar en el vector en una posición 5' o 3' para el ácido nucleico que codifica para la secuencia, se localiza típicamente en un sitio 5' a partir del promotor. Se conocen en la técnica otros intensificadores adecuados, y se podrían aplicar en la presente invención . Mientras que se están preparando los reactivos de la presente invención, puede ser necesario que las células se transfecten o transformen. La transfección se refiere a la absorción de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha transfectado cuando el ADN exógeno se haya introducido dentro de la membrana celular. Se conocen en este campo varias técnicas de transfección (es decir, Graham et al., 1973, Vi rol ogy 52:456; Sambrook et al., Mol ecul a r Cl onin g, A Labora t ory Man ua l (Cold Spring Harbor Laboratories, 1989); Davis et al., Ba si c Methods in Mole cul ar Bi ol ogy, (Elsevier, 1986); y Chu et al., 1981, Gen e 13:197) . Estas técnicas se pueden utilizar para introducir una o más entidades de ADN exógeno en células hospederas adecuadas . En ciertas modalidades, se prefiere que la transfección de una célula dé por resultado en la transformación de esa célula. Una célula se transforma cuando existe un cambio en una característica de a célula, que se transforma cuando se haya modificado para contener un nuevo ácido nucleico. Después de la transfección, el ácido nucleico transfectado se puede recombinar con el de la célula al integrarlo físicamente en un cromosoma de la célula, se puede mantener transitoriamente como un elemento episomal sin replicarse, o se puede replicar independientemente como un plásmido. Una célula se transforma establemente cuando el ácido nucleico se replica con la división de la célula. La presente invención proporciona además los blancos inmunogénicos aislados en la forma de un polipéptido. Un polipéptido se considera aislado cuando: (1) se haya separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales se encuentran en la naturaleza cuando se aislan de la célula fuente; (2) no se enlaza (mediante una interacción covalente o no covalente) a la totalidad o una porción de un polipéptido al cual se enlaza el "polipéptido aislado" en la naturaleza; (3) se enlaza operablemente (mediante una interacción covalente o no covalente) a un poliéptido con el cual no se enlaza en la naturaleza; o, (4) no se presenta en la naturaleza. De preferencia, el polipéptido aislado está prácticamente libre de cualesquiera otros polipéptidos contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que pudieran interferir con su utilización terapéutica, de diagnóstico, profiláctica o de investigación. Los polipéptidos de blanco inmunogénicos pueden ser polipéptidos maduros, según se definen en la presente, y pueden o no tener un residuo de metionina amino terminal, dependiendo del método mediante el cual se preparan. Se contemplan además los polipéptidos relacionados tales como por ejemplo, fragmentos, variantes (es decir, alélicas, de empalme), ortólogas, homologas, y derivadas, por ejemplo, que posean al menos una característica o actividad (es decir, actividad, antigenicidad) del blanco inmunogénicos. También se relacionan péptidos, lo cual se refiere a una serie de residuos de aminoácidos contiguos que tienen una secuencia que corresponde al menos a una porción del polipéptido del cual se deriva su secuencia. En modalidades preferidas, el péptido comprende aproximadamente 5-10 aminoácidos, 10-15 aminoácidos, 15-20 aminoácidos, 20-30 aminoácidos, o 30-50 aminoácidos. En una modalidad más preferida, un péptido comprende 9-12 aminoácidos, adecuados para la presentación en las moléculas MHC Clase I, por ejemplo. Un fragmento de un ácido nucleico o polipéptido comprende una interrupción de la secuencia (es decir, ácido nucleico o polipéptido) en el término amino (con o sin una secuencia líder) y/o el término carboxi. Los fragmentos también pueden incluir las variantes (es decir, alélicas, de empalme), ortólogas, homologas, y otras variantes que tienen una o más adiciones o sustituciones de aminoácidos o supresiones internas en comparación con la secuencia parental. En modalidades preferidas, las interrupcones y/o supresiones comprenden aproximadamente 10 aminoácidos, 20 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, o más. Los fragmentos polipeptídicos así producidos comprenderán aproximadamente 10 aminoácidos, 25 aminoácidos, 30 aminoácidos, 40 aminoácidos, 50 aminoácidos, 60 aminoáidos, 70 aminoácidos, o más. Estos fragmentos polipeptídicos opcionalmente pueden comprenden un residuo de metionina amino terminal. Se apreciará que estos fragmentos se pueden utilizar, por ejemplo, para generar anticuerpos o respuestas inmunológicas celulares a los blancos inmunogénicos. Una variante es una secuencia que tiene una o más sustituciones, supresiones, y/o adiciones de la secuencia en comparación con la secuencia expuesta. Las variantes se pueden presentar en la naturaleza o se pueden construir artificialmente. Estas variantes se pueden preparar a partir de las moléculas de ácido nucleico correspondientes. En modalidades preferidas, las variantes tienen de 1 a 3, o de 1 a 5 , o de 1 a 10, o de 1 a 15, o de 1 a 20, o de 1 a 25, o de 1 a 30, o de 1 a 40, o de 1 a 50, o más de 50 sustituciones, inserciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos. Una variante alélica es una de diversas formas alternas posibles que se presentan en la naturaleza de una secuencia que ocupa un locus determinado en un cromosoma de un organismo o una población de organismos. Una variante de empalme es un polipéptido generado a partir de una de diversas transcripciones de ARN que resultan de empalmar una transcripción primaria. Un ortólogo es un ácido nucleico similar o secuencia polipeptídica de otra especie. Por ejemplo, las versiones de ratón y humano de un polipéptido blanco inmunogénico se pueden considerar ortólogas entre sí. Un derivado de una secuencia es uno que se deriva de una secuencia parental de aquellas secuencias que tienen sustituciones, adiciones, supresiones, o variantes modificadas químicamente. Las variantes también pueden incluir proteínas de fusión, lo cual se refiere a la fusión de una o más de primeras secuencias (tales como por ejemplo, un péptido) en el término amino o carboxi de al menos otra secuencia (tal como por ejemplo, un péptido heterólogo) . "Similitud" es un concepto relacionado con la identidad, excepto que la similitud se refiere a una medida de relación que incluye tanto coincidencias idénticas como coincidencias de sustitución conservadora. Si dos secuencias polipeptídicas , por ejemplo, tienen 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son todas sustituciones no conservadoras, entonces la identidad porcentual y la similitud podrían ser ambas del 50%. Si en el mismo ejemplo, existen cinco posiciones adicionales cuando existen sustituciones conservadoras, entonces la identidad porcentual sigue siendo del 50%, pero la similitud porcentual sería del 75% (15/20) . Por consiguiente, en los casos donde existen sustituciones conservadoras, la similitud porcentual entre dos polipéptidos será superior a la de la identidad porcentual entre aquellos mismos dos polipéptidos. Las sustituciones pueden ser conservadoras, o no conservadoras, o cualquier combinación de las mismas. Las modificaciones conservadoras de aminoácidos a la secuencia de un polipéptido' (y las modificaciones correspondientes a los nucleótidos codificantes) pueden producir polípéptídos que tengan las características funcionales y químicas similares a aquellas de un polipéptido parental. Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede implicar una sustitución de un residuo natural de aminoácidos con un residuo no natural de tal forma que existe poco o ningún efecto en el tamaño, polaridad, carga, hidrofobicidad, o hidrofilicidad del residuo de aminoácidos en esa posición y, en particular, no da por resultado en inmunogenicidad disminuida. En la Tabla I se muestran las sustituciones conservadoras de aminoácidos adecuados. TABLA I Un experto será capaz de determinar las variantes adecuadas de un blanco inmunogénico utilizando técnicas bien conocidas. Para la identificación de zonas adecuadas de la molécula que se pueden cambiar sin destruir la actividad biológica (es decir, unión, inmunogenicidad de MHC), alguien con experiencia en la técnica puede designar las zonas que no cree que sean importantes para esa actividad. Por ejemplo, cuando se conocen los blancos inmunogénicos con actividades similares de la misma especie o de otra especie, alguien con experiencia en la técnica puede comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para esos polipéptidos similares. Mediante la realización de estos análisis, se pueden identificar los residuos y porciones de las moléculas que se conservan. Se apreciará que los cambios en las zonas de la molécula que no se conservan con relación a estos blancos inmunogénicos similares podría ser menos probable que afecten adversamente la actividad y/o estructura biológica de un polipéptido. De manera similar, se conocen los residuos requeridos para la unión a MHC, y se pueden modificar para mejorar la unión. Sin embargo, las modificaciones que resultan de la unión disminuida a MHC no serán adecuadas en la mayoría de las situaciones. Alguien con experiencia en la técnica también sabría que, incluso en las regiones relativamente conservadas, se pueden sustituir químicamente los aminoácidos similares para los residuos que se presentan en la naturaleza mientras que conserven la actividad. Por lo tanto, incluso las zonas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden estar sujetas a sustituciones conservadoras de aminoácidos sin arruinar la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del blanco inmunogénico. Otras variantes polipeptídicas preferidas incluyen las variantes de glucosilación en donde el número y/o tipo de sitios de glucosilación se han alterado en comparación con la secuencia de aminoácidos sujeta. En una modalidad, las variantes polipeptídicas comprenden un número mayor o menor de sitios de glucosilación N-enlazados que la secuencia de aminoácidos sujeta. Un sitio de glucosilación N-enlazado se caracteriza por la secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácidos designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácidos excepto prolina. La sustitución de los residuos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato N-enlazada. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia suprimirán una cadena de carbohidrato N- enlazada existente. También se proporciona una reestructuración de cadenas de carbohidrato N- enlazadas en donde uno o más sitios de glucosilación N-enlazados (típicamente aquellos mismos que se presentan en la naturaleza) se eliminan y se crean uno o más sitios N-enlazados nuevos. Para afectar la glucosilación O-enlazada de un polipéptido, se podrían modificar los residuos de serina y/o treonina . Las variantes preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína, en donde se suprimen o sustituyen uno o más residuos de cisteína con otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con el conjunto de secuencias de aminoácidos sujetas. Las variantes de cisteína son útiles cuando se deben replegar péptidos o polipéptidos en una conformación biológi'camente activa tal como por ejemplo, después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína en general tienen menos residuos de cisteína que la proteína natural, y típicamente tienen un número igual para reducir al mínimo las interacciones que resultan de las cisteínas no pareadas. En otras modalidades, los polipéptidos aislados de la presente invención incluyen segmentos polipeptídicos de fusión que ayudan en la purificación de los polipéptidos. Las fusiones se pueden realizar, ya sea en el término amino o en el término carboxi de la variante polipeptídica sujeta de los mismos. Las fusiones se pueden dirigir sin ninguna molécula enlazante o adaptadora o se pueden realizar a través de una molécula enlazante o adaptadora. Una molécula enlazante o adaptadora puede ser uno o más residuos de aminoácidos, típicamente entre aproximadamente 20 y 50 residuos de aminoácidos. Una molécula enlazante o adaptadora también se puede diseñar con un sitio de escisión para una endonucleasa de restricción con ADN o para una proteasa para permitir la separación de las entidades fusionadas. Se apreciará que una vez construidos, los polipéptidos de fusión se pueden derivar de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Los segmentos de fusión adecuados incluyen, entre otros, dominios de unión metálica (por ejemplo, un segmento de poli-hist idina ) , dominios de unión con inmunoglobulina (es decir, Proteína A, Proteína G, linfocitos T, linfocitos B, receptor de Fc, o dominios de unión con anticuerpos proteínicos complementarios), dominios de unión con azúcares (por ejemplo, un dominio de unión con maltosa), y/o un dominio "etiqueta" (es decir, al menos una porción de -galactosidasa , un péptido de etiqueta estrep, un péptido de etiqueta T7, un péptido FLAG, u otros dominios que se pueden purificar utilizando los compuestos que se unen al dominio, tales como por ejemplo, anticuerpos monoclonales) . Esta etiqueta se fusiona típicamente al polipéptido en el momento de la expresión del polipéptido, y puede servir como un medio para la purificación por afinidad de la secuencia del polipéptido de interés de la célula hospedera. Por ejemplo, la purificación por afinidad se puede llevar a cabo mediante cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz por afinidad. Opcionalmente, la etiqueta se puede retirar posteriormente de la secuencia purificada del polipéptido de interés por diversos medios tales como por ejemplo, utilizando ciertas peptidasas para la escisión. Como se describirá más adelante, también se pueden realizar fusiones entre un TA y uno de los componentes co-estimuladores tales como por ejemplo, las quimiocinas CXC10 (IP-10), CCL7 (MCP-3), o CCL5 (RANTES), por ejemplo. Un motivo de fusión puede mejorar el transporte de un blanco inmunogénico a un compartimiento de procesamiento MHC, tal como por ejemplo, el retículo endoplásmico. Estas secuencias, denominadas como secuencias de tranducción y transcitosis , incluyen las secuencias derivadas del del VIH tat (véase, Kim et al. 1997 J. Immunol . 159:1666), Dros ophi l a antennapedia (véase, Schutze-Redelmeier et al. 1996 J. I munol. 157:650), o la proteína humana de período-1 (hPERl; en particular, SRRHHCRSKAKRSRHH) . Además, el polipéptido o variante del mismo se puede fusionar a un polipéptido homólogo para formar un homodímero o un polipéptido heterólogo para formar un heterodímero. Los péptidos y polipéptidos heterólogos incluyen, de manera enunciativa un epítope para permitir la detección y/o aislamiento de un polipéptido de fusión; una proteína receptora transmembrana o una porción de la misma, tal como por ejemplo, un dominio extracelular o un dominio transmembrana e intracelular; un ligando o una porción del mismo que se une a una proteína receptora transmembrana; una enzima o porción de la misma que es catalíticamente activa; un polipéptído o péptido que estimula la oligomerización, tal como por ejemplo, un dominio de cierre de leucina; un polipéptido o péptido que aumenta la estabilidad, tal como por ejemplo, una región constante de inmunoglobulina; un péptido o polipéptido que tiene una actividad terapéutica diferente del péptido o polipéptido; y/o variantes de los mismos. En ciertas modalidades, puede ser ventajoso combinar una secuencia de ácido nucleico que codifica para un blanco inmunogénico, polipéptido, o derivado de los mismos con uno o más componentes co-estimuladores tales como por ejemplo, las proteínas de superficie celular, citocinas - o quimiocinas en una composición de la presente invención. El componente co-esti uladox se puede incluir en la composición como un polipéptido o como un ácido nucleico que codifica para el polipéptido, por ejemplo. Las moléculas co-estimuladoras adecuadas incluyen, por ejemplo, los polípéptidos que unen los miembros de la familia CD28 (es decir, CD28, ICOS; Hutloff, et al. Na t ure 1999, 397:263-265; Peach, et al. J Exp Med 1994, 180: 2049-2058) tal como por ejemplo, polipéptidos B7.1 de unión con CD28 (CD80; Schwarz, 1992; Chen et al, 1992; Ellís, et al. J. Imm unol . , 156 (8) : 2700-9) , y B7.2 (CD86; Ellis, et al. J. Imm un ol . , 156(8) :; 2700-9); polipéptidos que unen miembros de la familia integrína (es decir, LFA-1 (CDlla/CDl8) ; Sedwick, et al. J Imm un ol 1999, 162: 1367-1375; Wülfíng, et al. Sci en ce 1998, 282:2266-2269; Lub, et al. Imm un ol Today 1995, 16:479-483) incluyendo los miembros de la familia ICAM (es decir, ICAM-1, -2 o -3) ; polipéptidos que unen los miembros de la familia CD2 (es decir, CD2, que señala la molécula de activación con linfocitos (CDwl50 o "SLAM"; Aversa, et al. J Imm un ol 1997, 158:4036-4044)) tal como por ejemplo CD58 (LFA-3; ligando CD2; Davis, et al. Imm un ol Today 1996, 17:177-187) o ligandos SLAM (Sayos, et al. Na t ure 1998, 395:462-469) ; polipéptidos que unen el antígeno estable al calor (HSA o CD24; Zhou, et al. Eur J Imm un ol 1997, 27:2524-2528); polipéptidos que se unen a los miembros de la familia del receptor TNF (TNFR) (es decir, 4-1BB (CD137; Vinay, et al. Semin Immun ol 1998, 10:481-489), OX40 (CD134; Weinberg, et al. Semin Immun ol 1998, 10:471-480; Higgins, et al. J Immun ol 1999, 162:486-493), y CD27 (Lens, et al. Semin Imm un ol 1998, 10:491-499)) tal como por ejemplo, 4-1BBL (ligando 4-1BB; Vinay, et al. Semin Imm un ol 19 98 , 10:481-48; DeBenedette, et al. J Immunol 1997, 158:551-559), factor-l asociado con TNFR (TRAF-1; ligando 4-1BB; Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187:1849-1862, Arch, et . al. Mol Cell Biol 1998, 18:558-565), TRAF-2 (4-1BB y el ligando OX40; Saoulli, et al. J Exp Med 1998, 187:1849-1862; Oshima, et al. Int Immunol 1998, 10:517-526, Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273:5808-5814), TRAF-3 (4-1BB y el ligando OX40; Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18:558-565; Jang, et al. Biochem Biophys Res Commun 1998, 242:613-620; Kawamata S, et al. J Biol Chem 1998, 273:5808-5814), OX40L (ligando OX40; Gramaglia, et al. J Immunol 1998, 161:6510-6517), TRAF-5 (ligando OX40; Arch, et al. Mol Cell Biol 1998, 18:558-565; Kawamata, et al. J Biol Chem 1998, 273:5808-5814), y CD70 (ligando CD27; Couderc, et al. Cáncer Gene Ther. , 5 ( 3 ) : 163-75 ) , ligando CD154 (ligando CD40 o "CD40L"; Gurunathan, et al. J. Immunol., 1998, 161:4563-4571; Sine, et al. Hum Gene Ther., 2001, 12:1091-1102) también pueden ser adecuados . Una o más citocinas también pueden ser componentes o "adyuvantes" co-estimuladores adecuados ya sea como polipéptidos o se pueden codificar por los ácidos nucleicos contenidos dentro de las composiciones de la presente invención (Parmiani, et al. Immunol Lett 2000 Sep 15; 74(l) :41-4; Berzofsky, et al. Nature Inmunol . 1:209-219) . Las citocinas adecuadas incluyen, por ejemplo, interleucina-2 (IL- 2) (Rosenberg, et al. Nature Med. 4: 321-327 (1998)), IL-4, IL-7, IL-12 (revisado por Pardoll, 1992; Harries, et al. J. Gene Med. 2000 jul-ago; 2 (4) .-243- 9; Rao, et al. J. Immunol . 156:3357-3365 (1996)), IL-15 (Xin, et al. Vaccine, 17:858-866, 1999), IL-16 (Cruikshank, et al. J. Leuk Biol. 67 ( 6 ) : 757 - 66 , 2000), IL-18 (J. Cáncer Res Clin. Oncol. 2001. 127 (12) : 718-726) , GM-CSF (CSF (Disis, et al. Blood, 88:202-210 (1996)), factor-alfa de necrosis tumoral (TNF-a) , o interferones tales como por ejemplo, IFN-o: o INF-?. Otras citocinas también pueden ser adecuadas para practicar la presente invención, como se sabe en la técnica. También se pueden utilizar quimiocinas, en cualquier forma de polipéptido o de ácido nucleico. Se ha mostrado que las proteínas de fusión que comprenden CXCL10 (IP-10) y CCL7 (MCP-3) fusionadas a un auto-antí geno tumoral inducen inmunidad anti-tumor (Biragyn, et al. Nature Biotech. 1999, 17:253-258) .

Las quimiocinas CCL3 (MlP-la) y CCL5 (RANTES) (Boyer, et al. Vaccine, 1999, 17. (Supp. 2) :S53-S64) también se pueden utilizar para la práctica de la presente invención. Se conocen en la técnica otras quimiocinas adecuadas . También se sabe en la técnica que se pueden bloquear los mecanismos inmunológicos reguladores supresores o negativos, dando por resultado en respuestas inmunológicas mejoradas. Por ejemplo, el tratamiento con anti-CTLA-4 (Shrikant, et al. Imm uni ty, 1996, 14:145-155; Sut uller, et al. J. Exp . Med . , 2001, 194:823-832), anti~CD25 (Sutmuller, s upra ) , anti-CD4 (Matsui, et al. J. Imm un ol . , 1999, 163:184-193), la proteína de fusión IL13Ra2-Fc (Terabe, et al. Na t ure Immun ol . , 2000, 1:515-520), y combinaciones de los mismos (es decir, anti-CTLA-4 y anti-CD25, Sutmuller, s upra ) se ha mostrado que sobre-regulan las respuestas inmunológicas anti-tumor y podrían ser adecuados para la práctica de la presente invención. Cualquiera de estos componentes se puede utilizar solo o en combinación con otros agentes. Por ejemplo, se ha mostrado que una combinación de CD80, ICAM-1 y LFA-3 ("TRICOM") puede potenciar las respuestas inmunológicas anti-cáncer (Hodge, et al. Cán cer Res . 59:5800-5807 (1999). Otras combinaciones eficaces incluyen, por ejemplo, IL-12 + GM-CSF (Ahlers, et al. J. Immun ol . , 158:3947-3958 (1997); Iwasaki, et al. J. Immunol . 158:4591-4601 (1997)), IL-12+GM-CSF+TNF-a (Ahlers, et al. Int. Inmunol. 13:897-908 (2001)), CD80 + IL-12 (Fruend, et al. Int. J. Cáncer, 85:508-517 (2000); Rao, et al. supra) , y CD86 + GM-CSF + IL-12 (Iwasaki, supra) . Alguien con experiencia en la técnica podría darse cuenta de combinaciones adicionales útiles para llevar a cabo la presente invención. Además, el experto podría darse cuenta de reactivos o métodos adicionales que se pueden utilizar para modular estos mecanismos. Estos reactivos y métodos, así como también otros conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, se pueden utilizar para la práctica de la presente invención . También se pueden utilizar estrategias adicionales para mejorar la eficacia de inmunización con base en ácido nucleico incluyendo, por ejemplo, el uso de replicones virales para autorreplicación (Caley, et al. 1999. Vaccine, 17: 3124-2135; Dubensky, et al. 2000. Mol. Med. 6: 723-732; Leitner, et al. 2000. Cáncer Res. 60:51-55), optimización de codones (Liu, et al. 2000. Mol. Ther., 1:497-500; Dubensky, supra; Huang, et al. 2001. J. Virol. 75: 7-4951), electroporación in vivo (Widera, et al. 2000. J. Immunol . 164: 4635-3640), incorporación de los motivos estimuladores CpG (Gurunathan, et al. Ann. Rev. Inmunol . , 2000, 18:927-974; Leitner, supra) , las secuencias para la designación de trayectorias endocíticas o de procesamiento con ubiquitina (Thomson, et al. 1998. J. Virol. 72:2246- 2252; Velders, et al. 2001. J. Immunol. 166:5366- 5373), los regímenes de refuerzo principal (Gurunathan, supra; Sullivan, et al. 2000. Nature, 408: 605-609; Hanke, et al. 1998. Vaccine, 16: 439- 445; Amara, et al. 2001. Science, 292: 69-74) , y el uso de vectores para suministro mucoso tales como por ejemplo, Salmonella (Darji, et al. 1997. Cell , 91:765-775; Woo, et al. 2001. Vaccine, 19:2945-2954) . Se conocen en la técnica otros métodos, algunos de los cuales se describirán más adelante. Los agentes quimioterapéuticos, radiación, compuestos anti-angiogénicos, u otros agentes también se pueden utilizar en tratamiento y/o prevención del cáncer utilizando blancos inmunogénicos (Sebti, et al. Oncogene 2000 Dic 27 ; 19 ( 56 ) : 6566- 73 ) . Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer mamario metastático, los agentes quimioterapéuticos útiles incluyen ciclofosfamida, doxorubicina, paclitaxel, docetaxel, navelbina, capecitabina , y mitomicina C, entre otros. La combinación regímenes quimioterapéuticos también han probado ser eficaces incluyendo ciclofosfamida + metotrexato + 5- fluorouracilo ; ciclofosfamida + doxorubicina + 5- fluorouracilo ; o, ciclofosfamida + doxorubicina, por ejemplo. Otros compuestos tales como por ejemplo, prednisona, un taxano, navelbina, mitomicina C, o vinblastina se han utilizado por diversas razones. Una mayoría de pacientes con cáncer de mama tienen tumores positivos estrógeno-receptores (ER+) y en estos pacientes, se prefiere la terapia endocrina (es decir, tamoxifeno) más que la quimioterapia. Para estos pacientes, el tamoxifeno o, como una segunda terapia lineal, se prefieren progestinas (acetato de medroxiprogesterona o acetato de megestrol) . Los inhibidores de Aromatasa (es decir, aminoglutetimida y los análogos de la misma tal como por ejemplo, letrozol) la disminución de la disponibilidad de estrógeno necesario para mantener el crecimiento tumoral y se puede utilizar como una segunda o tercera terapia endocrina lineal en ciertos pacientes . Otros cánceres pueden requerir diferentes regímenes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el cáncer colorrectal metastático típicamente se trata con Camptosar (irinotecano o CPT-11), 5-fluorouracilo o leucovorina, solo o en combinación entre si. Los inhibidores de proteinasa e integrina tales como por ejemplo, también pueden ser adecuados para utilizarse los inhibidores MMP arimastato (British Biotech), COL-3 (Collagenex) , Neovastat (Aeterna), AG3340 (Agouron) , BMS-275291 (Bristol Myers Squibb) , CGS 27023A (Novartis) o los inhibidores de integrina Vitaxin (Medimmune), o MED1522 (MerckKgaA) . Como tales, el blanco inmunológico de los blancos inmunogénicos asociados con el cáncer colorrectal se podría realizar en combinación con un tratamiento utilizando aquellos agentes quimioterapéuticos. De manera similar, los agentes quimioterapéuticos utilizados para tratar otros tipos de cánceres son muy conocidos en la técnica y se pueden combinar con los blancos inmunogénicos descritos en la presente. Se conocen en la técnica muchos agentes anti-angiogénicos y podrían ser adecuados para coadministración con las vacunas designadas inmunogénicas (véase, por ejemplo, Timar, et al. 2001. Pa th ol ogy On col . Re s . , 7(2) :85-94) . Estos agentes incluyen, por ejemplo, agentes fisiológicos tales como por ejemplo, los factores de crecimiento (es decir, ANG-2, NK1, 2,4 (HGF), el factor beta de crecimiento transformante (TGF-ß)), citocínas (es decir, interferones tales como por ejemplo, IFN-a, -ß, -y, factor 4 de plaquetas (PF-4), PR-39), las proteasas (es decir, AT-III escindida, fragmento de colágeno XVIII ( Endost atina )) , el fragmento de plasmina de HmwKalli krein-d5 (Angiost atina ) , protrombina-Fl-2 , TSP-1), inhibidores de proteasa (es decir, inhibidor de tejidos de metaloproteasas tal como por ejemplo, TIMP-1, -2, o -3; maspina; los inhibidores del activador de plasminógeno tales como por ejemplo, PAI-1; el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF)), Tumstatina (disponible a través de ILEX, Inc.), productos de anticuerpos (es decir, los anticuerpos de unión con colágeno HUIV26, HUI77, XL313; y anti-VEGF; anti-int egrina (es decir, Vitaxin, (Lxsys))), y glucosidasas (es decir, heparinasa-I , -III) . Se sabe o se cree que los agentes fisiológicos "químicos" o modificados tienen potencial anti-angiogénico e incluyen, por ejemplo, vinblastina, taxol, ketoconazol, talidomida, dolestatina, combrestatina A, rapamicina (Guba, et al. 2002, Na t ure Med . , 8: 128-135), CEP-7055 (disponible de Cephalon, Inc.), el ácido flavona acético, Bay 12-9566 (Bayer Corp.), AG3340 (Agouron, Inc.), CGS 27023A (Novartis), derivados de tetraciclina (es decir, COL-3 (Collagenix, Inc.)), Neovastat (Aeterna) , BMS-275291 (Bristol-Myers Squibb), dosis baja de 5-FU, dosis baja de metotrexato (MTX), irsofladina, radicicol, ciclosporina, captopril, celecoxib, polisacárido D45152-sulfatado, proteína catiónica (Protamina) péptido catiónico-VEGF, Suramina (naftil urea polisulfonada ) , compuestos que interfieren con la función o producción de VEGF (es decir, SU5416 o SU6668 (Sugen), PTK787 /ZK22584 (Novartis)), Distamicina A, Angiozima (ribozima), i soflavonoides , derivados del estaurosporina, genisteína, EMD121974 (Merck KcgaA) , tirfostinas, isoquinolonas , ácido retinoico, carboxiamidotriazol , TNP-470, octreotide, 2-met oxiestradiol , aminosteroles (es decir, esqualamina) , análogo de glutatión (es decir, N-acecil-L-cisteína) , combretastatina A-4 (Oxigene), agentes bloqueadores del receptor Eph ( Na t ure , 414:933-938, 2001), Rh-Angiostat ina , Rh-Endost atina (WO 01/93897), péptido cíclico-RGD, acutina-disintegrina , benzodiazepenos , anti-avb3 Ab humanizado, Rh-PAI-2, amiloríde, p-amidobenzamidina , anti-uPA ab, anti-uPAR Ab , L-fanilalanin-N-metilamidas (es decir, Batimistato, Marimastato ) , AG3340, y minociclina. Se conocen en la técnica otros muchos agentes adecuados y podrían bastar para la práctica de la presente invención. La presente invención también se puede utilizar en combinación con los métodos para el tratamiento del cáncer "no tradicionales". Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que la administración de ciertas bacterias anaeróbicas puede ayudar para retardar el crecimiento tumoral. En un estudio, se modificó Cl os tri di um n ovyi para eliminar un gen de toxina portado en un epitoma de fago y administrado a ratones con tumores colorrectales (Dang, et al. P . N. A . S . USA , 98(26) : 15155-15160, 2001) . En combinación con quimioterapia, se mostró que el tratamiento provoca necrosis tumoral en animales. Los reactivos y metodologías descritos en esta solicitud se pueden combinar con estas metodologías de tratamiento. Los ácidos nucleicos que codifican para blancos ' inmunogénicos se pueden administrar a pacientes mediante cualquiera de diversas técnicas disponibles. Se han utilizado con éxito varios vectores virales para introducir un ácido nucleico a un hospedero incluyendo retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado (AAV), virus de herpes, y poxvirus, entre otros. Se entiende en la técnica que muchos de estos vectores virales están disponibles en la técnica. Los vectores de la presente invención se pueden construir utilizando técnicas recombínantes estándar disponibles en general para alguien con experiencia en la técnica. Estas técnicas se pueden encontrar en referencias de biología molecular comunes tales como por ejemplo Mol e cul a r Cl oning : A Labora t ory Man ua l (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory) , Gen Expresi ón Techn ol ogy (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, CA) , y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicationes (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA) . Los vectores retrovirales preferidos son derivados de lentivirus así como también derivados de retrovirus murinos o aviares. Los ejemplos de vectores retrovirales adecuados incluyen, por ejemplo, virus de leucemia murina Molonay (MoMuLV) , virus de sarcoma murino Harvey (HaMuSV) , virus de tumor mamario de murino (MuMTV) , SIV, BIV, VIH y Virus de Sarcoma de Rous (RSV) . Varios de los vectores retrovirales pueden incorporar múltiples secuencias de ácido nucleico exógeno. Cuando los retrovirus recombinantes son imperfectos, los mismos requieren de ayuda para producir partículas de vectores infecciosos. Esta ayuda se puede proporcionar, por ejemplo, mediante líneas celulares auxiliadoras que codifican para genes estructurales de retrovirus. Las líneas celulares auxiliadoras adecuadas incluyen ?2 , PA317 y PA12, entre otras. Los viriones de vectores producidos utilizando estas líneas celulares entonces se pueden utilizar para infectar una línea celular de tejido, tal como por ejemplo, las células NIH3T3, para producir grandes cantidades de viriones retrovirales quiméricos . Los vectores retrovirales se pueden administrar mediante métodos tradicionales (es decir, inyección) o mediante la implantación de una "línea celular productora" en proximidad a la población celular blanco (Culver, K., et al., 1994, Hum Gen e Th er . , 5 (3) : 343-79; Culver, K., et al., Col d Sprin g Ha rb .

Sy p . Wuan t . Bi ol . , 59: 685-90); Oldfield, E., 1993, Hum . Gen e Ther . , 4 ( 1 ) : 39- 69 ) . La línea celular productora se diseña por ingeniería para que produzca un vector viral y libere partículas virales en la vecindad de la célula blanco. Una porción de las partículas virales liberadas se pone en contacto con las células blanco e infecta esas células, suministrando así un ácido nucleico de la presente invención a la célula blanco. Después de la infección de la célula blanco, se presenta la expresión de ácido nucleico del vector. Se ha demostrado que los vectores adenovirales son especialmente útiles para la transferencia del gen en células eucarióticas (Rosenfeld, M., et al., 1991, Science, 252 (5004) : 431-4; Crystal, R., et al., 1994, Nat. Genet. , 8(1) :42-51), la expresión del gen eucariótico de estudio (Levrero, M., et al., 1991, Gene, 101 ( 2 ): 195-202 ) , el desarrollo de vacunas (Graham, F., and Prevec, L., 1992, Biotechnology, 20:363-90), y en modelos animales ( Stratford-Perricaudet , L., et al., 1992, Bone Marrow Transplant. , 9 (Suppl. 1) :151-2; Rich, D., et al., 1993, Hum. Gen Ther., 4 ( 4 ) : 461-76 ) . Rutas experimentales para administrar Ad recombinante a diferentes tejidos in vivo han incluido instilación intratraqueal (Rosenfeld, M., et al., 1992, Cell, 68 ( 1 ): 143-55 ) inyección en el músculo (Quantin, B., et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89 (7) :2581-4), inyección intravenosa periférica (Herz, J. , and Gerard, R., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90 (7) : 2812-6) e inoculación estereotáct ica al cerebro (Le Gal La Salle, G., et al., 1993, Science, 259 (5097) : 988-90) , entre otros.

El virus adeno-asociado (AAV) demuestra un alto nivel de infectividad, una amplia gama de hospederos y especificidad de integración en el genoma de la célula hospedera (Hermonat, P., et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 81 (20): 6466-70) . Y el Tipo 1 del Virus de Herpes Simplex (HSV-1) todavía otro sistema atractivo de vectores, en especial para utilizarse en el sistema nervioso debido a su propiedad neurotrópica (Geller, et al., 1991, Trends Neurosci., 14(10) : 428-32; Glorioso, et al., 1995, Mol. Biotechnol., 4 (1) : 87-99; Glorioso, et al., 1995, Annu. Rev. Microbiol., 49: 675-710) . El poxvirus es otro vector de expresión útil (Smith, et al. 1983, Gene, 25(l) :21-8; Moss, et al, 1992, Biotechnology, 20: 345-62; Moss, et al, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 158:25-38; Moss, et al. 1991. Science , 252: 1662-1667) . Se muestra que los poxvirus son útiles para la inclusión en las vacunas, NYVAC, viruela aviar, viruela de aves de corral, viruela canaria, ALVAC, y ALVAC (2), entre otras . El virus de Vaccinia es el virus prototípico de la familia de virus de varicela y, al igual que otros miembros del grupo de virus de varicela, se distingue por su gran tamaño y complejidad. El ADN del virus de vaccinia es similarmente grande y complejo. Varios tipos de vaccinia son adecuadoss para utilizarse en la práctica de la presente invención. Uno de estos virus relacionados con vaccinia es el Virus de Vaccinia Modificado Ankara (MVA), como se describe en, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos 5,185,146 y 6,440,422. Otro virus relacionado con vaccinia adecuado es NYVAC. El NYVAC se derivó de la cepa vaccine Copenhague del virus de vaccinia al suprimir seis regiones no esencial del genome que codifica para los factores de virulencia conocidos o potenciales (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5,364,773 y 5,494,807) . Los sitios de supresión también se diseñaron como los sitios recipientes para la inserción de genes extraños. Las regiones suprimidas son: el gen de timidina cinasa (TK; J2R) ; la región hemorrágica (u; B13R+B14R); una región corporal de inclusión tipo A (ATI; A26L) ; el gen de he aglutinina (HA; A56R) ; la región génica de variación hospedera (C7L-K1L); y, la gran subunidad, ribonucleótido reductasa (I4L) . NYVAC es una cepa del virus de vaccinia manipulada por ingeniería genética que se generó mediante la supresión específica de dieciocho tramas de lectura abierta que codifican para los productos génicos asociados con la virulencia y rango hospedero. Se ha mostrado que NYVAC será útil para expresar los TA (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6,265,189) . NYVAC (vP866), vP994, vCP205, vCP1433, placZH6H4Linverso, pMPC6H6K3E3 y pC3H6FHVB también se depositaron con el ATCC de conformidad con las condiciones del Tratado de Budapest, números de acceso VR-2559, VR-2558, VR-2557, VR-2556, ATCC- 97913, ATCC-97912, y ATCC-97914, respectivamente. Los virus recombinantes con base en ALVAC (es decir, ALVAC-1 y ALVAC-2) también son adecuados para utilizarse en la práctica de la presente invención (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,756,103) . ALVAC ( 2 ) es idéntico a ALVAC(l) excepto que el genoma de ALVAC ( 2 ) comprende los genes de vaccinia E3L y K3L bajo el control de los promotores de vaccínia (patente de los Estados Unidos No. 6,130,066; Beattie et al., 1995a, 1995b, 1991; Chang et al., 1992; Davies et al., 1993) . Tanto ALVAC ( 1 ) como ALVAC (2) han demostrado que son útiles para expresar las secuencias de ADN extrañas, tales como por ejemplo, TAs (Tartaglia et al., 1993 a, b; patente de los Estados Unidos No. 5,833,975) . ALVAC se depositó de conformidad con las condiciones del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, número de acceso ATCC VR-2547. Otro vector de poxvirus útil es TROVAC .

TROVAC se refiere a una viruela de aves de corral atenuada que fue un aislado clonado en placas derivado de la cepa de la vacuna FP-1 del virus de viruela de aves de corral que se autorizó para vacunación de polluelos de 1 día de edad. TROVAC asimismo se depositó de conformidad con las condiciones del Tratado de Budapest con el número de acceso ATCC 2553. Los vectores del plásmido "no viral" también pueden ser adecuados para la práctica de la presente invención. Los vectores de plásmido preferidos son compatibles con células hospederas bacterianas, de insecto, y/o de mamífero. Estos vectores incluyen, por ejemplo, PCR-II, pCR3 , y pcDNA3.1 (Invitrogen, San Diego, C?) , pBSII (Stratagene, La Jolla, CA) , pETl5 (Novagen, Madison, Wl), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (BlueBacII, Invitrogen), pDSR-alfa (Pub. del PCT No. WO 90/14363) y pFastBacDual (Gibco-BRL, Grand Island, NY) , así como también, los derivados del plásmido Bluescript® (un fagémido con base en C0LE1 con gran número de copias, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) , plásmidos para clonación mediante PCR diseñados para clonar los productos de PCR amplificados mediante Taq (por ejemplo, derivados del plásmido TOPOMR cloning® kit, PCR2.1®, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Con la invención actual también se pueden utilizar vectores bacterianos. Por ejemplo, estos vectores incluyen Shi gell a , Sa lmonel l a , Vibri o chol era e, La ctoba ci l l us , Ba cill e ca lme t te guérín (BCG), y Streptococcus (véase, por ejemplo, W088/6626; WO90/0594; WO 91/13157; WO 92/1796; y W092/21376) . Se conocen en la técnica y se podrían utilizar con la presente invención muchos otros vectores y sistemas de expresión del plásmido no viral. Las técnicas adecuadas para suministro de ácido nucleico incluyen complejos con el ligando de ADN, complejos de adenovirus-ligando-AD , inyección directa de ADN, precipitación de CaP04, técnicas de aceleración génica, electroporación, y sistemas de dispersión coloidal, entre otros. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas , microesferas, perlas, y sistemas con base en lípidos entre los que se incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, y liposomas. El sistema coloidal preferido de esta invención es un liposoma, que son vesículas membranosas artificiales útiles como vehículos para suministro in vi tro e in vivo. Los viriones de ARN, ADN e intactos se pueden encapsular en el interior acuoso y se pueden suministrar a células en una forma biológicamente activa (Fraley, R, et al., 1981, Trends Bi o ch em . Sci . , 6: 77) . La composición del liposoma por lo general es una combinación de fosfolípidos, en particular los fosfolípidos a temperatura de transición de fase alta, usualmente en combinación con esteroides, en especial colesterol. También se pueden utilizar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, resistencia iónica, y la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como por ejemplo, fosfatidiíglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidil-serína, fosfat idiletanolamina , es fingolípidos , cerebrósidos , y gangliósidos . Los diacilfosfatidilgliceroles son particularmente útiles, donde la entidad de lípido contiene de 14-18 átomos de carbono, en particular de 16-18 átomos de carbono, y se satura. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y dí stearoilfosfat idil-colina . Un blanco inmunogénico también se puede administrar en combinación con uno o más adyuvantes para reforzar la respuesta inmunológica. En la siguiente Tabla I se muestran los adyuvantes de ej emplo : TABLA I TIPOS DE ADYUVANTES INMUNOLOGICOS Tipo de Ejemplos generales Ejemplos adyuvante específicos/referencias 1 Tipo gel Hidróxido/fosfato de (Aggerbec y Heron, 1995) aluminio ("Adyuvantes de alum" ) Fosfato de calcio (Relyveld, 1986) 2 Microbiano Dipéptido de muramilo (MDP) (Chedid et al., 1986) Exotoxinas bacterianas Toxina de cólera (CT) , toxina lábil de E. coli (LT) (Freytag y Clementes, 1999) Adyuvantes con base en lipido A de monofosforilo endotoxina (MPL) (Ulrico and Myers, 1995) Otras bacterias Oligonucleótidos CpG (Corral and Petray, 2000), secuencias BCG (Krieg, et al. Nature, 374:576), toxoide del tétanos (Rice, et al. J. Im unol . , 2001, 167: 1558-1565) 3 Macroparticula Microesferas poliméricas (Gupta et al., 1998) biodegradables Complejos (Morein and Bengtsson, inmunoestimuladores (ISCOMs) 1999) Liposomas (Wassef et al., 1994) 4 Adyuvantes con Adyuvante incompleto de (Jensen et al., 1998) base en emulsión Freund en aceite y surf ctante Emulsiones MF59 (Ott et al., 1995) microfluidizadas SAF (Allison and Byars, 1992) (Allison, 1999) Saponinas 0S-21 (Kensil, 1996) Sintético Derivados del péptido de Murabutide (Lederer, 1986) muramilo Threony-MDP (Allison, 1997) Copolimeros en bloque no L121 (Allison, 1999) iónico Polifosfazeno (PCPP) (Payne et al. , 1995) Polinucleótidos sintéticos Poly A:U, Poly I C (Johnson, 1994) Los blancos inmunogénicos de la presente invención también se pueden utilizar para generar anticuerpos para utilizarse en la selección de análisis o para inmunoterapia. Otros usos podrían ser evidentes para alguien con experiencia en la técnica. El término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpo, como se sabe en la técnica, incluyendo Fab, Fab2, anticuerpos de cadena individual (por ejemplo Fv) , anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, producidos mediandos diversos métodos como se sabe en la técnica. Los métodos para preparar y utilizar diversos tipos de anticuerpos son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica y podrían ser adecuados para la práctica de la presente invención (véase, por ejemplo, Harlow, et al. Antij odies: A Labora t ory Man ua l , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Harlow, et al. Using An tíbodi es : A Labora tory Man ual , Portabl e Prot ocol No . 1 , 1998; Kohier y Milstein, Nature, 256: 495 (1975)); Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332:323-329 (1988); Presta (Curr. Op . Struct. Biol., 2:593- 596 (1992); Verhoeyen et al. (Science, 239:1534-1536 (1988); Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Colé et al., Monoclonal Antibodíes and Cáncer Therapy, Alan R., Liss, p. 77(1985); Boerner et al., J. Inmunol., 147(1) :86-95 (1991); Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Inmunol. 13 65-93 (1995); así como también las patentes de los Estados Unidos 4,816,567; 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y, 5,661,016). También pueden conjugarse los anticuerpos o derivados de los mismos para las entidades terapéuticas tales como por ejemplo, fármacos citotoxicos o toxinas, o los fragmentos activos de los mismos tales como por ejemplo una cadena de difteria A, una cadena de exotoxina A, una cadena de ricina A, una cadena de abrina A, curcina, crotina, fenomicina, enomicina, entre otros. Los agentes citotóxicos también pueden incluir radí oquímicos . Los anticuerpos y sus derivados se pueden incorporar en las composiciones de la invención para utilizarse in vi tro o in vivo . Los ácidos nucleicos, proteínas, o derivados que representan un blanco inmunogénicos de los mismos se pueden utilizar en análisis para determinar la presencia de un estado de enfermedad en un paciente, para predecir el pronóstico, o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento quimioterapéutico u otro. Los perfiles de expresión, realizados como se sabe en la técnica, se pueden utilizar para determinar el nivel relativo de expresión del blanco inmunogénico. El nivel de expresión entonces se puede correlacionar con niveles base para determinar si una enfermedad particular está presente en el interior del paciente, el pronósticos del paciente, o si un régimen de tratamiento particular es eficaz. Por ejemplo, si el paciente se está tratando con un régimen quimioterapéutico particular, un nivel disminuido de expresión de un blanco inmunogénicos en los tejidos del paciente (es decir, en la sangre periférica) puede indicar que el régimen está disminuyendo la carga del cáncer en ese hospedero. De manera similar, si el nivel de expresión está aumentando, puede ser necesario que se utilice otra modalidad terapéutica. En una modalidad, las soluciones de ensayo de ácido nucleico que corresponden a un ácido nucleico que codifica para un blanco inmunogénicos se pueden unir a una bioquina como se sabe en la técnica, para la detección y cuantificación de la expresión en el hospedero. También es posible utilizar ácidos nucleicos, proteínas, derivados de los mismos, o anticuerpos para los mismos tales como por ejemplo, los reactivos en análisis para selección de fármacos. Los reactivos se pueden utilizar para determinar el efecto de un candidato a fármaco sobre la expresión del blanco inmunogénico en una línea celular, o una célula o tejido de un paciente. La técnica para perfilación de expresión se puede combinar con técnicas de selección de alto rendimiento para permitir la rápida identificación de compuestos útiles y supervisar la eficacia del tratamiento con un candidato a fármaco (véase, por ejemplo, Zlokarnik, et al., Science 279, 84-8 (1998)) . Los candidatos a fármaco pueden ser compuestos químicos, ácidos nucleicos, proteínas, anticuerpos, o derivados de los mismos, ya sea que se presentan en la naturaleza o que se puedan derivar sintéticamente. Los candidatos a fármacos así identificados se pueden utilizar, entre otros usos, como composiciones farmacéuticas para la administración a pacientes o para utilizarse en análisis de selección adicionales. La administración de una composición de la presente invención a un hospedero se puede llevar a cabo utilizando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por aquellos expertos en este campo. Las composiciones se pueden procesar de acuerdo con los métodos convencionales de la farmacia para producir agentes medicinales para la administración a pacientes, entre los que se incluyen seres humanos y otros mamíferos (es decir, una "composición farmacéutica). La composición farmacéutica de preferencia se produce en la forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad determinada de ADN, partículas del vector viral, polipéptido o péptido, por ejemplo. Una dosis diaria adecuada para un ser humano u otro mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la condición del paciente y otros factores, aunque, una vez más, se puede determinar utilizando métodos de rutina. La composición farmacéutica se puede administrar oral, parentalmente, mediante rocío para inhalación, rectal, intranodal, o tópicamente en formulaciones unitarias de dosificación que contienen portadores, adyuvantes, y vehículos farmacéuticamente aceptables y convencionales. El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable" en el sentido en que se utiliza en la presente se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para llevar a cabo o mejorar el suministro de un ácido nucleico, polipéptido, o péptido como una composición farmacéutica. Una "composición farmacéutica" es una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un ácido nucleico o polipéptido. Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" cada uno se refiere a la cantidad de un ácido nucleico o polipéptido utilizada para inducir o mejorar una respuesta inmunológica eficaz. Se prefiere que las composiciones de la presente invención se proporcionen para la inducción o mejora de una respuesta inmunológica anti-tumoral en un hospedero que protege al hospedero del desarrollo de un tumor y/o permite al hospedero eliminar un tumor existente del cuerpo . Para administración oral, la composición farmacéutica puede ser de cualquiera de diversas formas entre las que se incluyen, por ejemplo, una cápsula, una tableta, una suspensión, o líquido, entre otros. Los líquidos se pueden administrar mediante inyección como una composición con portadores adecuados entre los que se incluyen solución salina, glucosa, o agua. El término parenteral, en el sentido que se utiliza en la presente, incluye la administración subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal , infusión, o íntraperitoneal . Los supositorios para la administración rectal del fármaco se pueden preparar al mezclar el fármaco con un excipiente no irritante adecuado tal como por ejemplo, manteca de cacao y polietilenglicoles que sean sólidos a temperaturas normales pero líquidos a la temperatura rectal. El régimen de dosificación para inmunizar un hospedero o de otra manera para tratar un trastorno o enfermedad con una composición de esta invención, se basa en una variedad de factores, entre los que se incluyen el tipo de enfermedad, la edad, el peso, el sexo, la condición médica del paciente, la gravedad de la condición, la vía de administración, y el compuesto particular empleado. Por ejemplo, un vector poxviral se puede administrar como una composición que comprende 1 x 10d partículas infecciosas por dosis. De esta forma, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, aunque se puede determinar utilizando métodos estándares rutinarios . También se puede utilizar un régimen de refuerzo principal (WO 01/30382 Al) en el cual el inmunógeno blanco se administra inicialmente en un paso de cebado en una forma seguida por un paso de refuerzo en el cual el inmunógeno blanco se administra en otra forma. La forma del inmunógeno blanco en los pasos de cebado y refuerzo es diferente. Por ejemplo, si el paso de cebado utilizó un ácido nucleico, el refuerzo se puede administrar como un péptido. De manera similar, cuando se utiliza un paso de cebado, un tipo de virus recombinante (es decir, ALVAC), el paso de refuerzo puede utilizar otro tipo de virus (es decir, NYVAC) . Se ha mostrado que este método de administración de refuerzo principal induce fuertes respuestas inmunológicas . Mientras que las composiciones de la invención se pueden administrar como el agente farmacéutico activo único, las mismas también se pueden utilizar en combinación con una o más de otras composiciones o agentes (es decir, otros blancos inmunogénicos, moléculas co-esti uladoras , adyuvantes) . Cuando se administran como una combinación, los componentes individuales se pueden formular como composiciones por separado administradas al mismo tiempo o tiempos diferentes, o los componentes se pueden combinar como una composición individual. Las preparaciones inyectables tales como por ejemplo, las suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, se pueden formular, de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable también puede ser una solución inyectable estéril o suspensión en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable. Los vehículos y solventes adecuados que se pueden emplear son agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro de sodio, entre otros. Por ejemplo, un vector viral tal como por ejemplo, un poxvirus se puede preparar en NaCl al 0.4%. Además, se emplean convencionalmente aceites estériles, fijos como un solvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como por ejemplo el ácido oleico encuentran uso en la preparación de soluciones inyectables . Para administración tópica, se puede administrar una dosis tópica adecuada de una composición de una a cuatro, y de preferencia dos o tres veces al día. La dosis también se puede administrar con días intermedios durante los cuales no se aplica. Las composiciones adecuadas pueden comprender de 0.001% a 10% p/p, por ejemplo, de 1% a 2% en peso de la formulación, aunque puede comprender tanto como 10% p/p, pero de preferencia no más de 5% p/p, y de mayor preferencia de 0.1% a 1% de la formulación. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen preparaciones líquidas o se i-líquidas adecuadas para la penetración a través de la piel (por ejemplo, linimentos, lociones, ungüentos, cremas, o pastas) y gotas adecuadas para administración ocular, en la oreja, o la nariz.

Las composiciones farmacéuticas también se pueden preparar en una forma sólida (incluyendo granulos, polvos o supositorios) . Las composiciones farmacéuticas se pueden someter a operaciones farmacéuticas convencionales tales como por ejemplo, esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales, tales como por ejemplo, agentes conservadores, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, amortiguadores, etc. Las formas de dosificación sólida para administración oral pueden incluir cápsulas, tabletas, pildoras, polvos, y granulos. En estas formas de dosificación sólida, el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como por ejemplo, sacarosa, lactosa, o almidón. Estas formas de dosificación también pueden comprender, como en la práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, agentes lubricantes tales como por ejemplo, estearato de magnesio. En el caso de cápsulas, tabletas, y pildoras, las formas de dosificación pueden comprender también agentes amortiguadores . Las tabletas y pildoras se pueden preparar adicionalmente con recubrimientos entéricos. Las formas de dosificación líquida para administración oral pueden incluir emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y elíxires farmacéuticamente aceptables, que contienen diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como por ejemplo, agua. Estas composiciones también pueden comprender adyuvantes, tales como por ejemplo, agentes humectantes, edulcorantes, saborizantes, y aromatizantes. Las composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico o polipéptido de la presente invención pueden tomar cualquiera de diversas formas y se pueden administrar mediante cualquiera de diversas vías . En modalidades preferidas, las composiciones se administran vía una ruta parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea) para inducir una respuesta inmunológica en el hospedero. Alternativamente, la composición se puede administrar directamente en un nodo linfático (intranodal) o masa tumoral (es decir, administración intratumoral) . Por ejemplo, la dosis se podría administrar subcutáneamente en los días 0, 7, y 14. Se conocen en la técnica los métodos adecuados para inmunización utilizando las composiciones que comprenden los TA, como se muestra para p53 (Hollstein et al., 1991), p21-ras (Almoguera et al., 1988), HER-2 (Fendly et al., 1990), antígenos asociados con melanoma (MAGE-1; MAGE-2) (van der Bruggen et al., 1991), p97 (Hu et al., 1988), y antígeno ca cinoembriónico (CEA) (Kantor et al., 1993; Fishbein et al., 1992; Kaufman et al., 1991), entre otros . Las modalidades preferidas de composiciones administrables incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos en preparaciones líquidas tales como por ejemplo suspensiones, jarabes, o elíxires. Las preparaciones inyectables preferidas incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos adecuados . para la administración parental, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa tales como por ejemplo, suspensiones o emulsiones estériles. Por ejemplo, un poxvirus recombinante puede estar en combinación con un portador, diluyente, o excipiente adecuado tal como por ejemplo, agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o lo semejante. La composición también se puede proporcionar en forma liofilizada para reconstitución, por ejemplo, en amortiguador de solución salina acuosa, isotónica. Además, las composiciones se pueden co-administrar o se pueden administrar secuencialmente con otros agentes anti-neoplásicos, anti-tumorales o anti-cáncer y/o con agentes que reducen o alivian los efectos de la enfermedad de los agentes ant i-neoplásicos , antitumorales o anti-cáncer. También se proporciona un equipo que comprende una composición de la presente invención. El equipo puede incluir un recipiente por separado que contiene un portador, diluyente o excipiente adecuado. ?l equipo también puede incluir un agente anti-cáncer, anri-tumoral o anti-neoplásico adicional, y/o un agente que reduce o alivia los efectos de la enfermedad de los agentes anri-neoplásicos, anti-tumorales o anti-cáncer para la coadministración o administración secuencial. Adicionalmente, el equipo puede incluir las instrucciones para mezclar o combinar los ingredientes y/o la administración. Se obtendrá una mejor comprensión de la presente invención y de muchas de sus ventajas a partir de los siguientes ejemplos, proporcionados a manera de ilustración.

EJEMPLOS Ejemplo 1 A. Modificación de la repetición 1 de CEAm (6D) Se ha documentado la presencia de formas interrumpidas de CEA en células después de la expresión del CEA recombinante. Este estudio mostró la generación de secuencias de ácido nucleico que codifican para CEA y no dan por resultado en la expresión de CEA interrumpido después de la expresión en células. Se describirá más adelante la generación y expresión de una nueva secuencia de ácido nucleico que codifica para CEA, CAP(6D)-1,2. El plásmido p3'H6MCEA se obtuvo de Virogenetics , Inc. Este plásmido contiene el gen MCEA con la modificación 6D bajo el control del promotor H6 parcial (Fig. ÍA; SEQ ID NO. : 1) . El fragmento NruI-BamHI de 912 pares de bases a partir de p-3'H6MCEA se clonó en pUC18 para formar el plásmido pSEl544.9 (repetición 1 pUC18-CEAm; Fig. IB) . Los oligos OPC purificados 7524-7526, 7528-7533, 7535-7537, y 7567-7568 se trataron con cinasas y se fijaron para crear dos fragmentos que se ligaron para dar por resultado en una repetición 1 de CEAm modificado sintético de 464 pares de bases, flanqueada por los sitios Accl y BamHI . Este fragmento de la repetición 1 modificada sintética se clonó en pSE1544.9 AccI-BamHI para crear pSE1616.44 (repetición 1 modificada de pUC18-CEAm; Fig. 2) . El fragmento EcoRV-BamHI de 904 pares de bases de pSE1616.44 se clonó nuevamente en p3'H6MCEA EcoRV-BamHI para formar pSEl658.15 (repetición 1 de p3 'H6MCEA-modificado; Fig. 3) .

B. Modificación de la repetición 2 de CEAm(6D) Se creó un fragmento de la repetición 2 modificada sintética utilizando un método denominado empalme génico mediante una extensión de traslape (SOE) y se clonó en pBluescript-SK+ , generando el pBSCEAm (Fig. 4) . Los oligos utilizados para la modificación de la repetición 2 se muestran más adelante (sección IV, B) . Los dos clones diferentes (pBS-CEAm-3 y pBS-CEAm-8) contuvieron diversas mutaciones puntuales. El fragmento de BamHI-EcoRI de 697 pares de bases del pBS-CEAm-3 se clonó en el pUCl 8BamHI-EcoRI para crear el pSE1671.8. El fragmento de Spel-Bsu36l de 591 pares de bases del pBS CEAm-8 se clonó en pSE1671.8 Spel-Bsu36l, generando el plásmido designado pSE1681.1. Se realizó la mutagénesis de PCR de dos sitios, utilizando el equipo mutagénesis sitio dirigido Quikchange de Stratagene con los oligos 7751 (SEQ ID NO . : 2 ; GGACGGTAGTAGGTGTATGATGGAGATAT GTTGGGTCGTCTGGGCC) y 7760 (SEQ ID NO . : 3 ; CAGAATGAATTATCCGTTGATCACTCC ) , para corregir las dos mutaciones puntuales restantes pSE1681.1. Se designó el clon corregido pSE1686.1 (la repetición 2 modificada del pUC18 CEAm; Fig. 5) . Como se observó recientemente, estuvo ausente un codón de Alanina a partir del término 5' de la segunda repetición en el plásmido p3'H6MCEA que contuvo CEA. Para conservar la consistencia de la secuencia de amino ácidos de CEA, el codón de Alanina presente en el plásmido pSE1686.1 que contiene la segunda repetición modificada de CEA se inactivo. Esto se llevó a cabo utilizando los oligos 7802 (SEQ ID NO. : 4; CGTGACGACGATTACCGTGTATGAGCCACCAAAACCATTCATAAC) y 7803 (SEQ ID NO. : 5; GTTATGAATGGTTTTGGTGGCTCATACACGGTAATCGTCGTCACG) y el equipo mutagénesis sitio dirigido Quikchange de Stratagene. Se confirmó mediante secuenciación el plásmido resultante, pSE1696.1 (repetición 2 modificada del pUC18 CEAm; Fig. 6) .

El fragmento Bsu36I-BamHI de 694 pares de bases del pSE1696.1 se clonó en el sitio Bsu36I-BamHI del Psel658.15 para combinar las repeticiones 1 y 2 modificadas. El plásmido generado se designó la 1. y 2a. repeticiones de 3'H6modMCEA (Fig. 7) .

C. Construcción del plásmido donador pNVQH dMCEA (lo. y 2o. 6D) de ALVAC El fragmento Nrul/Xhol de 2.2 kb proveniente de la la y 2a. repeticiones del p3 ' H6modCEAM se clonó en el sitio Nrul/Xhol del pNVQHßLSP-18 , generando el pNVQH6MCEA (6D lo. y 2o.; Fig. 8). La secuencia CEA modificada ( "CAP ( 6D) -1 , 2" ; SEQ ID NO. 6) contenida dentro del pNVQH6MCEA se muestra en la Fig. 9.

D . Expresión del CEA modificado Para probar la estabilidad de la secuencia CAP (6D) -1,2 en el momento de la expresión en una célula, el gen junto con el promotor H6 de flanqueo se amplificó mediante PCR utilizando el pNVQHdMCEA (lo . y 2o. 6D) como el molde y dos oligos (8034LZ, SEQ ID NO . : 7 ; CTGGCGCGCCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG; y 8035LZ, SEQ ID NO.: 8: CTGGTACCAGAAAAACTATATCAGAGCAACCCCAAC ) . El producto de la PCR se clonó entonces en un plásmido 7! donador NYVAC TK designado pLZTKl que contiene los genes maradores LacZ y KIL. Este vector se produjo específicamente para la generación del virus recombinante en NYVAC al utilizar el método de selección blue/white. Después de la recombinación in vi tro entre el plásmido donador pLZTKlCEAm (lo. y 2o. 6D) y NYVAC, la secuencia CAP(6D)-1,2 extraña y los genes marcadores en el genoma de NYVAC. Las placas que contienen el intermediario recombinante NYVAC tanto con LacZ como con CEAm aparecen en color azul. Luego se realizaron varios ciclos de purificación en placa. El segundo caso de recombinación muestra los genes marcadores dando por resultado en las placas white finales que contienen los recombinantes sólo con la secuencia CAP(6D)-1,2 pero ninguno de los genes marcadores (Fig. 10) . Las placas white y las placas blue recombinantes se seleccionaron para la confirmación de la expresión de - la secuencia CAP(6D)-1,2. La infección se llevó a cabo utilizando el virus de las placas respectivas y las células se recolectaron tres días después de la infección para preparar ya sea un ADN celular o un lisado celular. Para el aislamiento del ADN de NYVAC recombinante, se utilizó el reactivo DNAzol® (GibcoBRL) . La PCR (PCR Condición: 95°C (5min) -> [95°C (30seg) -> 49°C (30seg) -> 72°C (Imin)] 30 ciclos -> 72°C (7min) -> 4°C) se ejecutó para confirmar la existencia de la secuencia CAP(6D)-1,2 en el genoma de NYVAC recombinante. Los cebadores utilizados fueron 7569LZ (cebador directo 5 ' ttggatccatggagtctccctcggcc 3'; SEQ ID NO.: 9) y 7570LZ (cebador inverso 5 ' ttggat ccctatat cagagcaacccc 3 ' ; SEQ ID NO.:10); que podría amplificar la longitud total de 2106 pares de bases CAP (6D)-1,2. Las placas white recombinantes finales PRBC- 1II-2, 3, 6, 8, 9, 10 todas demostraron la banda de secuencia CAP (6D)-1,2 de 2.1 kb en la PCR. PRBC-III-Nl fue una placa blue con ambos genes marcadores y la secuencia CAP (6D) -1,2 todavía en el genoma viral y la banda de secuencia CAP(6D)-1,2 también se amplificó en la PCR. La banda de PCR prominente amplificada a partir del ADN de vCP 307 (conteniendo el CEA natural integrado en el genoma ALVAC) fue el CEA interrumpido a 1.2 kb con una banda de CEA de longitud total muy débil. La muestra de células únicamente (sin infección viral) se utilizó como un control negativo y el plásmido pLZTKIMCEA (lo. y 2o. 6D1) fue un control positivo utilizado en la reacción de PCR. Los resultados de PCR mostraron claramente el CAP (6D) -1,2 de longitud total en el genoma viral recombinante sin otra forma interrumpida de CEA visible. Este resultado indicó que el CAP(6D)-1,2 tiene una estabilidad aumentada con relación al CEA natural en el genoma ALVAC. La expresión proteínica también se analizó mediante inmunotransferencia para confirmar la ausencia de la proteína CEA interrumpida en células que expresan CAP(6D)-1,2 (Fig. 11) . Para el aislamiento del lisado celular, las células se lavaron primero con PBS seguido por la adición del Amortiguador de Lysis (Análisis de Genes Reporteros; Boehringer Mannheim) y luego se agitaron vigorosamente durante 15 minutos. El lisado celular se hizo girar hacia abajo a 13,000 rpm y el sobrenadante se recolectó para análisis de transferencia Western. Las muestras se cargaron sobre un gel de poliacrilamida al 10% y se ejecutó a 125 voltios. La proteína luego se transfirió a una membrana de filtro PVDF ( Immobilon-P , Millipore). Se utilizó un anticuerpo monoclonal CEA de ratón HRP-vinculado (1:1000; Fitzgerald) para detectar la expresión de CEAm con la mejora a partir de un reactivo quimioluminiscent e (DNA ThunderMR; NEMMR Life Science Products) .

La totalidad de las seis placas white finales recombinantes de CAP(6D)-1,2 ( PRBC-II 1-2 , 3 , 6 , 8 , 9 , 10 ) y una placa blue intermediaria (pRBC-III-NI ) mostraron únicamente una banda CEA sin otra forma interrumpida (Fig. 11) . Por el contrario, la proteína proveniente de las placas vCP307 (ALVAC recombinante que expresa el CEA natural) mostró un producto CEA interrumpido claro a -60 kDa además del CEA longitud total. La exposición prolongada de la película verificó la ausencia de cualquier polipéptido CEA interrumpido el los recombinantes CAP(6D)-1,2. Se utilizó CEF como el control negativo . En conclusión, los recombinantes CAP(6D)-1,2 se generaron con el CEA en lugar del CEA natural para prevenir la expresión de múltiples versiones de CEA. El CAP(6D)-1,2 expresado a partir del NYVAC recombinante probó ser eficaz para eliminar la versión interrumpida del CEA tanto mediante PCR como mediante transferencia Western.

E. Vector ALVAC recombinante para la expresión de B7.1 y CA (6D) -1,2 CEA El gen B7.1 humano se insertó en un plásmido donador C6 de ALVAC bajo el control del promotor H6 como se muestra en la Fig. 12. Este plásmido donador luego se utilizó con ALVAC para generar el recombinante vCP306 de ALVAC utilizando técnicas estándar. El plásmido donador se inserta en el sitio C6 del genoma ALVAC. La secuencia de ADN CEA del CAP(6D)-1,2 se insertó en un plásmido donador C3 de ALVAC bajo el control del promotor H6 como se muestra en la Fig. 13. Este plásmido donador luego se utilizó con vCP306 para generar el recombinante VCP2140 de ALVAC (ALVAC-CAP ( 6D ) -1 , 2 CEA-B7.1) que expresa estos genes utilizando técnicas estándar. El plásmido donador se inserta en el sitio C3 del genoma ALVAC. Este vector se puede utilizar, por ejemplo, para expresar B7.1 y/o CEA in vi tro (es decir, en el cultivo celular) o in vi vo (para fines de inmunización) . Mientras la presente invención se ha descrito en los términos de las modalidades preferidas, se debe entender que se presentarán variaciones y modificaciones para aquellos experimentados en la técnica. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas cubran todas las variaciones equivalentes que estén dentro del alcance de la invención según se reivindica.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Un vector de expresión gue comprende la secuencia de ácido nucleico CAP(6D)-1,2 como se ilustra en la SEQ ID NO.: 8 y la Figura 9 o un fragmento de la misma y una secuencia de ácido nucleico codificando un gen B7.1 humano.
2. 2. El vector de expresión según la reivindicación 1, en donde la secuencia humana B7.1 es como se ilustra en la figura 12.
3. 3. El vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el vector es un plásmido o un vector viral .
4. . El vector de expresión según la reivindicación 3, en donde el vector viral se selecciona del grupo que consiste de poxvirus, adenovirus, retrovirus, herpesvirus, y el virus adeno-asociado .
5. 5. El vector de expresión según la reivindicación 4, en donde el vector viral es un poxvirus seleccionado del grupo que consiste de vaccinia, NYVAC , viruela aviar, viruela canaria, ALVAC, ALVAC(2), viruela de aves de corral, y TROVAC.
6. 6. El vector de expresión según la reivindicación 5, en donde el vector viral es un poxvirus seleccionado del grupo que consiste de ?YVAC , ALVAC , y ALVAC (2 ) .
7. 7. El vector de expresión según la reivindicación 1 que comprende además al menos un antígeno adicional tumor-asociado.
8. 8. El vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende además al menos una secuencia nucleica que codifica para un antígeno angiogénesis-asociado .
9. 9. Una molécula de AD? aislado que comprende la secuencia CEA(6D)-1,2 secuencia ilustrada en la SEQ ID ?O.: 8 y la Figura 9 y una secuencia de nucleótidos codificando un gen B7.1 humano .
10. 10. La secuencia de ADN según la reivindicación 9, en donde la secuencia de nucleótidos codificados humano B7.1 es como se ilustra en la figura 12.
11. 11. Un método para preparar un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos CAP (6D) -1,2 como se ilustra en la SEQ ID NO . : 8 y la Figura 9 y una secuencia de nucleótidos que comprende un B7.1 humano; el método comprende la recombinacíón de un plásmido teniendo la secuencia mostrada en la Figura 12 dentro de un primer sitio de un genoma de ALVAC y recombinando un plásmido teniendo la secuencia mostrada en la Figura 13 dentro de un segundo sitio del genoma ALVAC.
12. 12. El método según la reivindicación 10, en donde cualquiera de los dos plásmidos de los genomas de ALVAC además comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos adicional que codifica para un antígeno tumor-asociado.
13. 13. El método según la reivindicación 10', en donde cualquiera de los dos plásmidos de los genomas de ALVAC además comprende por lo menos una secuencia de nucleótidos adicional que codifica para un antígeno angiogénesis-asociado.