JP2877509B2 - メタロプロテイナーゼ阻害剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本願は、参考として本明細書中に包含する1989年５月
19日出願の特許出願第355,027号の部分継続出願であ
る。

本発明は一般にメタロプロテイナーゼ阻害剤及びこの
ような因子をコードするポリヌクレオチドに関する。特
に、本発明は哺乳類の新規なメタロプロテイナーゼ阻害
剤（MI）、その断片及びポリペプチド類縁体並びにそれ
らをコードするポリヌクレオチドに係る。

発明の背景 細胞での結合組成合成と細胞外での分解との相反する
作用により結合組織は動的平衡状態に維持される。細胞
外結合組織のマトリックスは主としてコラーゲンからな
り、その他にプロテオグリカン、フィブロネクチン、ラ
ミニン及び他の少量成分が存在する。

内在する結合組織及び細胞生理学的pHでマトリックス
巨大分子のほとんどを分解しうる侵入炎症細胞から中性
メタロプロテイナーゼが放出されることによりマトリッ
クスが分解される。プロテイナーゼには、哺乳類の組織
コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びプロテオグリカナー
ゼ；白血球のコラゲナーゼ及びゼラチナーゼ［Murphy
ら、Biochem.J.283,289−221（1982）;Hibbsら、J.Bio
l.Chem.260.2493−2500（1985）］；マクロファージの
コラゲナーゼ及びエラスターゼ［Werbら、J.Exp.Med.14
2,346−360（1975）;Bandaら、Biochem.J.193,589−605
（1981）］；及び腫瘍のコラゲナーゼ［Liottaら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 76 2268−2272（1979）;Liotta
ら、Biochem.Biophys.Res.Commun.98,124−198（198
1）；及びSaloら、J.Biol.Chem.258,3058−3063（198
3）］が含まれる。コラゲナーゼ及び、正常なまた病的
な結合組織代謝回転におけるその役割についての一般的
な総説はCollagenase in Normal and Pathological Con
nective Tisues,David E.WoolleyとJohn M.Evanson編、
John Wiley ＆ Son Ltd.（1988）を参照のこと。

５個以上の異なる型のコラーゲン（Ｉ、II、III、I
V、Ｖ、等）があり、これらは組織間で異なる分布を示
す。種々の型のコラーゲンの間にはかなり相同性や構造
上の同一性がある。特定のコラゲナーゼは特定の型のコ
ラーゲンに特異的である。コラゲナーゼ及び他のマトリ
ックス分解メタロプロテイナーゼの阻害については、実
際の酵素、基質及び阻害機構に応じて阻害剤が一つのみ
の、数個の、または全てのコラゲナーゼ及びメタロプロ
テイナーゼに作用しうることが可能である。

結合組織分解及びこのような分解が関与する疾患に関
する研究のほとんどはメタロプロテイナーゼからコラゲ
ナーゼの測定に限定されていた（このメタロプロテイナ
ーゼのグループについて最も広範に研究された）。しか
し、コラゲナーゼ単独に比べてコラゲナーゼと他のマト
リックス分解メタロプロテイナーゼとが同時に作用する
ことにより結合組織分解を悪化させるであろうと考えら
れる。

培養結合組織由来の粗製培地中で天然の特異的コラゲ
ナーゼ阻害剤が発見れた。TIMP（組織のメタロプロテイ
ナーゼ阻害剤）として公知のメタロプロテイナーゼ阻害
剤は物理化学的特性及びコラゲナーゼとの相互作用の生
化学について研究されており［Murphyら、J.Biochem.19
5,167−170（1981）;Cawstonら、J.Biochem.211,313−3
18（1983）;Stricklinら、J.Biol.Chem.258,12252−122
58（1983）］、またその遺伝子が単離されている［Doch
ertyら、Nature 318,65−69（1985）;Carmichaelら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 83,2407−2411（1986）］。天然
の基底膜を介した腫瘍細胞の移動のin vitroでの細胞培
養モデル中で、TIMPはコラゲナーゼ分泌腫瘍細胞系の移
動を阻止できた［Thorgeirssonら、J.Natl.Canc.Inst.6
9,1049−1054（1982）］。TIMPの注入によりマウスB16
−F10メラノーマ細胞によるin vivoでのマウス肺転移増
殖が抑制された［Schultzら、Cacner Research 48,5539
−5545（1988）］。欧州特許出願第189784号もTIPMに関
する。

McCartneyら［Eur.J.Biochem.130,79−83（1983）］
はヒト白血球からのメタロプロテイナーゼ阻害剤の精製
を報告している。

De Clerckら［Cancer Research 46,3580−3586（198
6）］はウシ大動脈内皮細胞由来のならし培地中で２つ
のコラゲナーゼ阻害剤の存在を示した。

Murrayら［J.Biol.Chem.261,4154−4159（1986）］は
ウシ軟骨由来のコラゲナーゼ阻害剤の精製及び部分的な
アミノ酸配列を報告した。本発明のウシMIのアミノ末端
アミノ酸配列はMurrayらがウシ軟骨由来コラゲナーゼ阻
害剤について報告したものと非常に類似しており（最初
の38残基については94％相同であり）、アミノ酸組成も
同様である。Murrayら（J.Biol.Chem.、上記）はウシ軟
骨由来阻害剤は初めの23残基についてヒトTIMPと65％以
上相同しており、アミノ末端配列は「極めて類似」して
いると指摘した。本研究がなされるまで、TIMPが単離さ
れた同じ種からTIMPに関連するまたは相同する他の分子
は単離されなかった。本研究で同じ種（ウシ）、実際に
は同じ細胞のならし培地から、２つのメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤が単離精製され、徹底的にその特性が明らか
にされた。従って、これらの阻害剤は、示されるよう
に、ウシのTIMP相同体に関係はしているが、両者ともが
ウシTIMP相同体ではありえないことはあきらかである。
また示されるように、その内の１つ（ピークII由来）は
恐らくウシTIMPであろう。従って、他方（ピークＩ由
来）は新規の他の分子に違いない。この発見により、ヒ
トゲノムでコードされるTIMP以外の相同の阻害剤が存在
することが先ず明らかである。このヒト遺伝子、すなわ
ちヒトMI遺伝子は実施例３に示す。

本明細書に記載のもののようなメタロプロテイナーゼ
阻害剤が治療上重要であることが証明され、従って市販
規模の量を入手する必要がある限り、天然細胞の培養物
からの単離は適切な材料源とはならないと思われる。

発明の概要 本発明により、新規なメタロプロテイナーゼ阻害剤
（MI）及びMI類縁体が提供される。また、MIの全体また
は一部をコードするDNA配列、このようなDNA配列を含有
するベクター及びこのようなベクターで形質転換または
トランスフェクションされた宿主細胞も提供される。組
換えMIの製造法及び疾患の治療法も本発明に包含する。
更に、MI含有医薬組成物及びMIに特異的に結合する抗体
も提供される。

図面の簡単な説明 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（PAGE）を示す全図面では、左に示す数
字は示した数の10³倍の分子量を有する標準の移動位置
を示していることを特記しておく。これらのマーカーは
ホスホリラーゼｂ（Mr97,400）、ウシ血清アルブミン
（BSA;Mr66,200）、オボアルブミン（Mr42,700）、炭酸
脱水酵素（Mr31,000）、大豆トリプシン阻害剤（Mr21,5
00）及びリゾチーム（Mr14,400）である。同じゲルにか
ける他の試料に未還元のものがあるときでも、これらの
標準は常時還元された。

第１図はウシメタロプロテイナーゼ阻害剤のcDNA配列
及びアミノ酸配列を示している。

第２図はヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤のcDNA配列
及びアミノ酸配列を示している。

第３図はピークＩから誘導されたウシメタロプロテイ
ナーゼ阻害剤（MI）の精製に使用された陰イオン交換ク
ロマトグラフィーを示している。

第４図はピークＩから誘導されたウシメタロプロテイ
ナーゼ阻害剤（MI）の精製に使用された等電点クロマト
グラフィーを示している。

第５図はピークＩから誘導されたウシメタロプロテイ
ナーゼ阻害剤（MI）及びピークIIから誘導されたウシメ
タロプロテイナーゼ阻害剤のSDS−PAGEを示している。
Ａは銀染色したSDS−PAGEであり、ＢはSDS−ゼラチンPA
GEであり、ＣはイムノブロッティングしたSDS−PAGEで
ある。

第６図はSDS−ゼラチンPAGEにかけたゼラチン分解性
プロテイナーゼに対するEDTA及びピークＩ由来のウシメ
タロプロテイナーゼ阻害剤（MI）の作用を示している。

第７図は特異的コラーゲン切断に対するピークＩ由来
ウシメタロプロテイナーゼ阻害剤（MI）の作用を示すオ
ートラジオグラフィーを示している。

第８図は大腸菌（Escherichia coli）内で組換えヒト
メタロプロテイナーゼ阻害剤を発現させるためのプラス
ミド構築図を示している。

第９図はリボソーム結合部位、開始メチオニンコドン
及び成熟蛋白質の最初の42個のアミノ酸用のコドンを含
む、大腸菌（E.coli）内での組換えヒトメタロプロテイ
ナーゼ阻害剤の発現に使用するために構築した合成DNA
断片を示している。

第10図は酵母菌内での組換えヒトメタロプロテイナー
ゼ阻害剤の発現に使用したベクターを示している。

第11図は酵母菌分泌突然変異体の単離に使用したベク
ターを示している。

第12図は哺乳類細胞の発現ベクターpDSRα２−MIの構
造を示している。

第13図はウシメタロプロテイナーゼ阻害剤及び大腸菌
内で産生された組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤
（MI）のSDS−ゼラチンPAGEを示している。

第14図はSDS−ゼラチンPAGEにかけたゼラチン分解性
プロテイナーゼに対するEDTA及び大腸菌産生組換えヒト
メタロプロテイナーゼ阻害剤（MI）の作用を示してい
る。

第15図はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞由
来の組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤が、転移細
胞が分泌するメタロプロテイナーゼによるＩ型コラーゲ
ン及びIV型コラーゲンの分解を阻害することを示してい
る。

第16図は平滑筋細胞によって沈着された結合組織マト
リックスの、腫瘍細胞の存在下で生じる分解に対する大
腸菌由来の組換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤の作
用を示している。

第17図は平滑筋細胞によって沈着された結合組織のマ
トリックスの、腫瘍細胞の存在下で生じる分解に対する
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞由来の組換え
ヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤の作用を示している。

第18図は腫瘍細胞の増殖及び接着に対する組換えヒト
メタロプロテイナーゼ阻害剤の作用を示している。

第19図は平滑筋層への腫瘍細胞による侵入に対する組
換えヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤の作用を示してい
る。

現在の所好ましい本発明の実施態様を説明する以下の
詳細説明を考慮すると、本発明の多くの態様や利点が当
業者に明らかになろう。

発明の詳細な説明 本発明によると、新規な蛋白質メタロプロテイナーゼ
阻害剤（MI）及びこのようなMIの全部及び部分をコード
するDNA配列が提供される。このような配列には、選択
した哺乳類以外の宿主が発現するのに「好適な」コドン
の導入；制限エンドヌクレアーゼ酵素により切断するた
めの部位の供給；及び容易に発現されるベクターの構築
を促進する他の先端、末端及び中間DNA配列の供給を含
む。本発明は、１つ以上のアミノ酸残基の同一性及び位
置の点で天然のものとは異なる（すなわち、MIに特有の
全残基を含有していない欠失類縁体；特有の残基１つ以
上が他の残基で置換されている置換類縁体；及び１つ以
上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中間部分
に付加されている付加類縁体）、そして天然型の特性の
全部または一部を有するMIのポリペプチド類縁体または
誘導体をコードするDNA配列も提供する。

本発明の新規なDNA配列には、天然のMIの一次構造コ
ンホメーションの少なくとも一部と生物学的特性の１つ
以上を有するポリペプチド産物を原核または真核宿主細
胞内で確実に発現させるために有用な配列も含んでい
る。本発明のDNA配列は特に：（ａ）第１図及び第２図
に示すDNA配列またはその相補鎖；（ｂ）（実施例３に
開示したハイブリッド形成条件またはより厳しい条件
で）第１図または第２図のDNA配列またはその断片とハ
イブリッド形成するDNA配列；及び（ｃ）遺伝子コード
の縮重がなければ、第１図または第２図のDNA配列とハ
イブリッド形成するDNA配列を包含する。（ｂ）及び
（ｃ）には、対立形質変異型のMIをコードする及び／ま
たは他の哺乳動物種由来のMIをコードするゲノムDNA配
列並びに、微生物宿主中でのメッセンジャーRNAの転写
及び翻訳を促進するコドンを含有しうるMI、MI断片及び
MI類縁体をコードする製造し得るDNA配列が特に含まれ
る。このような製造し得る配列はAltonらのPCT出願公表
WO83/04053の方法により容易に構築できる。

本発明のもう一つの態様によると、MIポリペプチドを
コードする本明細書に記載のDNA配列はこれまで入手で
きなかった哺乳類蛋白質のアミノ酸配列に関する情報を
提供する点で貴重である。DNA配列は種々の組換え技術
によりMIを大量合成するために有用な物質としても貴重
である。換言すれば、本発明が提供するDNA配列は新規
で有用なウィルス及び環状プラスミドDNAベクター、新
規で有用な形質転換及びトランスフェクションされた原
核及び真核宿主細胞（培養により増殖する細菌及び酵母
菌細胞及び哺乳類細胞を含む）、並びにMI及びその関連
産物を発現できるこのような宿主細胞を培養増殖させる
新規で有用な方法を生じさせるのに有用である。

本発明のDNA配列はMI及び関連蛋白質をコードするヒ
トゲノムDNA及びcDNA、並びに他の哺乳類のゲノムDNA配
列の単離に際し標識プローブとして使用するに適した物
質でもある。DNA配列は（例えば、昆虫細胞中での）蛋
白質合成の種々の変法またはヒト及び他の哺乳類での遺
伝子療法にも有用であろう。本発明のDNA配列はMI及びM
I生成物の大量生産用の真核「宿主」として働きうるト
ランスジェニックな哺乳動物種を開発するために有用で
あることが期待される。一般に、Palmiterら、Science
222,809−814（1983）を参照のこと。

本発明は対立形質変異体を含む天然MIの一次構造コン
ホメーション（すなわち、アミノ酸残基の連続配列）の
一部または全部と、１つ以上の生物学的特性（例えば、
免疫学的特性及びin vitroの生物学的活性）と物理的性
質（例えば、分子量）とを有する精製単離したポリペプ
チド産物を提供する。本明細書で使用している「精製単
離した」という表現は実質的に均質であるかまたは（例
えばSDA−PAGEで１つのバンドとなるように）明らかに
均質になるまで精製したことを意味している。これらペ
プチドは天然から精製した生成物、または化学合成手法
による生成物、またはゲノムもしくはcDNAクローニング
または遺伝子合成で得られた外因性DNA配列の（例え
ば、培養物中の細菌、酵母菌、高等植物、昆虫及び哺乳
類細胞による）原核または真核宿主での発現による生成
物であることも特徴とする。典型的な酵母菌（例えば、
Saccharomyces cerevisiae）または原核生物（例えば、
E.coli）宿主細胞中での発現産物はいかなる哺乳類蛋白
質とも結合していない。脊椎動物（例えば、ヒトではな
い哺乳類（例えば、COSまたはCHO）または鳥類）での発
現産物はヒトのいかなる蛋白質とも結合してない。使用
する宿主により、本発明ポリペプチドは哺乳類または他
の真核生物の炭水化物でグリコシル化されることもされ
ないこともある。本発明のポリペプチドは（位置−１
の）初めのメチオニンアミノ酸残基も含有してよい。

本発明は、MIの天然の対立形質型（allelic forms）
の他に、MIのポリペプチド類縁体及びMIの断片のような
他のMI産物も包含する。上記のAltonらの公表された出
願（WO83/04053）の手順に従って、１つ以上の残基の同
一性または位置について本明細書中に特定したものとは
異なる一次コンホメーションを有する（例えば、置換、
末端及び中間の付加及び欠失）ポリペプチドの細菌での
発現に関してコードする遺伝子を容易に設計し、製造で
きる。あるいは、よく知られている特定部位の突然変異
誘発手法によりcDNA及びゲノム遺伝子を容易に修飾で
き、これを使用してMIの類縁体及び誘導体を生成するこ
とができる。このような生成物はMIの生物学的特性の少
なくとも１つを有するであろうが、他の点では異なって
いることもある。例えば、本発明の提起した生成物に
は、例えば欠失により短くなったもの；または加水分解
に対しより安定な（従って、天然のものよりより強いま
たは持続した作用を有しうる）もの；または１つ以上の
Ｏ−グリコシル化可能な部位を欠失するように変化した
もの（その結果、酵母菌産生産物に関してより活性が高
くなりうる）；または１つ以上のシステイン残基が欠失
したまたは例えばアラニンまたはセリン残基で置換され
ており、細菌系から活性型でより容易に単離される可能
性のあるもの；または１つ以上のチロシン残基がフェニ
ルアラニンで置換されており、多かれ少なかれ標的蛋白
質にまたは標的細胞のレセプターに容易に結合するもの
を含んでいる。また、MI内の連続したアミノ酸配列また
は二次コンホメーションの一部のみを複製するポリペプ
チド断片も含まれ、この断片はMI活性の１つ（例えば、
レセプター結合）を有し、他（例えば、メタロプロテイ
ナーゼ阻害活性）は有していなくてもよい。１つ以上の
いずれの本発明生成物も治療用途［Weilandら、Blut 44
添付図面173−175（1982）］またはMI拮抗作用のアッセ
イのような他の目的の用途を有するためにこの活性を必
要としないことは特記すべきである。例えばMIの過剰産
生の場合に、競合拮抗剤が非常に有用でありうる。

本発明のMI断片及びポリペプチド類縁体の適用の可能
性のうち、天然の蛋白質、糖蛋白質及び核蛋白質中に存
在するアミノ酸配列を実質的に複製している合成ペプチ
ドの免疫学的活性について報告されている。より詳細に
は、比較的分子量の小さいポリペプチドが、ウィルス抗
原、ポリペプチドホルモン等のような生理学的に重要な
蛋白質の免疫反応と期間及び程度が同様である免疫反応
に関与することが示されている。このようなポリペプチ
ドの免疫反応には、免疫学的に活性な動物中での特異抗
体形成の誘発が含まれる。例えば、Lernerら、Cell 23,
309−310（1981）;Rossら、Nature 294,654−656（198
1）;Walterら、Proc.Natl.Acad.Sci,USA 77,5197−5200
（1980）;Lernerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78,3403
−3407（1981）;Walterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
8,4882−4886（1981）;Wongら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 79,5322−5326（1982）;Baronら、Cell 28,395−404
（1982）;Dressmanら、Nature 295,185−160（1982）；
及びLerner、Scientific American 248,66−74（1983）
参照のこと。また、ペプチドホルモンの二次構造はほぼ
有するが、その一次構造コンホメーションは有していな
いこともある合成ペプチドの生物学的及び免疫学的活性
に関するKaiserら［Science 223,249−255（1984）］も
参照のこと。

本発明は、ヒトのMIのcDNAまたはゲノムDNA配列の蛋
白質コード鎖と相補的なDNA部分がコードする種のポリ
ペプチド、すなわち、Tramontanoら［Nucleic Acid Re
s.12,5049−5059（1984）］が記載している「相補的逆
蛋白質（complement ary inverted proteins）」も包含
する。

また、本発明には、有効量の本発明ポリペプチド生成
物とMI療法に有用な好適な希釈剤、保存料、可溶化剤、
乳化剤、助剤及び／または担体とからなる医薬組成物も
含む。このような組成物は種々のバッファ成分（例え
ば、Tris−HCl、酢酸塩、燐酸塩）、pH及びイオン強度
の希釈剤；界面活性剤及び可溶化剤（例えば、Tween 8
0、Polysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビ
ン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例えば、Th
imersol、ベンジルアルコール）及び増料剤（例えば、
ラクトース、マンニトール）のような添加物；蛋白質へ
のポリエチレングリコールのようなポリマーの共有結合
（例えば、参考として本明細書に含まれる米国特許第4,
179,337号明細書参照）；ポリ乳酸、ポリグリコール酸
等の様なポリマー化合物の粒状製剤またはリポソームへ
の材料の導入を含んでいる。このような組成物はMIの物
理状態、安定性、iv vivo放出速度及びin vivoクリアラ
ンス速度に影響を与えよう。

本発明はTIMPの様な他のメタロプロテイナーゼ阻害剤
または低分子量の化学的阻害剤を含有する組成物も含
む。本発明は疾病状態の進展に影響する他の薬剤例えば
MIと同様に癌の転移を妨げるラミニン及び／またはフィ
ブロネクチン由来のペプチドを含有する組成物も含む。

本発明のポリペプチド生成物は検出可能なマーカー物
質（例えば、¹²⁵Iによる放射性標識）と結合させて「標
識」し、固体組織及び血液または尿のような液体試料中
でのMIの検出及び定量に有用な試薬を提供することもで
きる。本発明の核酸生成物も検出可能なマーカー（例え
ば、放射性標識及びビオチンのような非放射性標識）で
標識することができ、これをハイブリッド形成過程で使
用して染色体地図内のヒトMI遺伝子の位置及び／または
任意の関連遺伝子ファミリーの位置を決定することがで
きる。それらはまたDNAレベルでのヒトMI遺伝病の同定
に使用されるし、また隣接遺伝子やその病気を同定する
ための遺伝子マーカーとしても使用できる。

医薬処方物中に使用したときのMIは病因を軽減させ、
マトリックス分解を特徴とする結合組織の疾患に有効な
治療法を提供する。また、メタロプロテイナーゼ阻害剤
はメタロプロテイナーゼ活性によりマトリックス損失が
過剰になる疾患全ての治療及び、手術または他の障害状
態後の傷の治癒の促進に有用である。

本発明のポリペプチド生成物は、コラゲナーゼの過剰
産生に関連する栄養障害性表皮水疱症のような種々の疾
患の治療に、単独または他の薬剤と併用で、有用である
［Bauerら、J.Exp.Med.148,1378−1387（1978）］。本
発明の生成物は関節リウマチの治療にも有用である。Ev
ansonら［J.Clin.Invest.47,2639−2651（1968）］は、
切除したリウマチの滑膜組織を培養することにより大量
のコラゲナーゼが産生されることを示しており、これが
Woolleyら［Arthritis and Rheumatism 20,1231−1239
（1977）］の、ヒトリウマチ滑膜コラゲナーゼに対する
単一特異性抗体を使用したイムノローカリゼイションの
研究に導いた。この研究では、関節侵食部位（軟骨−パ
ンヌス接合部）で、高レベルの免疫反応性コラゲナーゼ
が検出されたが、軟骨細胞を伴う軟骨中及び、再吸収部
分の前面から離れた部位の滑膜中では検出されなかっ
た。ヒトのリウマチ関節由来の多くの他の異なる調製物
を使用して、並びに変形性関節炎、ライター症候群、偽
性痛風、若年性関節リウマチ及び強皮症のような他のタ
イプの関節炎を特徴とする組織を使用してもコラゲナー
ゼが示された。

歯を支える器官に影響する歯周病では、コラーゲン分
解酵素の上昇及びコーラーゲン及び結合組織の破壊が明
らかである［V.−J.Uttio,Proteinases in Inflammatio
n and Tumor Invasion,pp.211−223、H.Tscheshe編、Wa
lter de Gruyter ＆ Co.、Berlin、N.Y.（1988）参
照］。

コラゲナーゼは角膜、表皮または胃腸管の潰瘍を含む
潰瘍に関与しており［Brownら、American J.of Ophthal
mology 72,1139−1142（1971）］、実際にメタロプロテ
イナーゼ阻害剤が角膜潰瘍の治療に使用されている［Sl
anskyら、Annals of Ophthalmology 2,488−491（197
0）］。

潰瘍の侵入及び転移の分野では、ある種の特定の潰瘍
の転移能はコラゲナーゼの合成及び分泌能の上昇［Liot
taら、Nature 284,67−68（1980）］、及びメタロプロ
テイナーゼ阻害剤の有意な量の合成及び分泌が不能であ
ること［Hicksら、Int.J.Cancer 33,835−844（198
4）］と関連する。これらの過程は組織部位から結合組
織層（基底膜）を介して循環系へのまたはその反対の腫
瘍細胞の通過に関連し、これはMIで遅延させることがで
きよう。同様に、MIは原発腫瘍の除去の間、化学療法及
び放射線療法の間、汚染された骨髄の採取の間、及び癌
性腹水のシャンティング（shunting）の間に腫瘍細胞の
広がりを阻止する治療上の用途も有する。

骨髄が関与している多くの進行癌での骨髄移植の使用
を限定している要因は適切な浄化手法がないことであ
る。例えば、浄化が不適切な骨髄細胞の注入による転移
性間質性肺炎が示されている［Glorieuxら、Cancer 58,
2136−2139（1986）;Graeveら、Cancer 62,2125−2127
（1988）］。未浄化骨髄注入の間にMIを投与することに
より、高価な浄化手法を開発する必要性が減少するであ
ろう。

診断では、腫瘍試料中でMIが産生されないことと転移
の可能性との相関関係が予知の指標及び可能な予防療法
の指標として有用である。

癌細胞及び／または周辺の正常細胞の両者でコラーゲ
ンの沈着が増加する（または分解が阻害される）ことに
より腫瘍が多かれ少なかれ封入されまたは繊維性となる
こともある。MIで封入の増加を促進することにより確実
な腫瘍切除に役立つ。

過剰のコーラーゲン分解が関与しうる、従ってMIを使
用できる他の病的状態では、気腫、骨のパジェット病、
骨粗しょう症、強皮症、床ずれでの骨または距離の圧迫
萎縮、コレステリン腫、及び傷の異常な治癒が挙げられ
る。MIは、例えば癒合過程中のコラーゲンの代謝回転を
調節するための、他の傷治癒促進剤の助剤としても使用
できる。

MIは造血過程において赤血球増強活性（すなわち、初
期赤血球プロジェニターの分化の刺激）に基づいた役割
を演ずるため種々の貧血の治療に有用である。

更に、MIは、Piskoら［J.Immunol.136,2141−2150（1
986）］の方法で測定されたようなＢ細胞分化抑制能に
より自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、多発性硬化
症）のような免疫学的な障害の治療にも使用できる。

MI及び／またはTIMPは、その結合組織分解の阻止能及
び毛細管内皮細胞増殖の阻止能により、例えば腫瘍の予
防または腫瘍進行の遅延化において脈管形成の阻止が有
用な場合に使用できる。

本発明はメタロプロテイナーゼ阻害剤と特異的に結合
する抗体にも関する。下記実施例６はポリクローナル抗
体の作製を記載している。本発明のもう一つの実施態様
はMIに特異的に結合するモノクローナル抗体である。一
般に種々の抗原決定基（エピトープ）に対する種々の抗
体を含んでいる従来の抗体（ポリクローナル）調製物と
は対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の１つの抗
原決定基に対するものである。モノクローナル抗体は抗
原−抗体結合を使用する診断及び分析アッセイ法の選択
性及び特異性を改善するのに有用である。モノクローナ
ル抗体の第二の利点は、ハイブリドーマ培養により合成
され、他の免疫グロブリンに汚染されていないことであ
る。モノクローナル抗体は培養したハイブリドーマ細胞
の上清またはハイブリドーマ細胞をマウスに腹腔内摂取
して誘発した腹水から調製できる。ＫhlerとMilstein
［Eur.J.Immunol.6,511−519（1976）］が最初に記載し
たハイブリドーマ手法は多くの特異的抗原に対するモノ
クローナル抗体を大量に分泌するハイブリッド細胞系を
作製するために広く使用されている。

次の実施例は本発明を更に説明するものであるが、本
発明の範囲の限定を意図したものではない。

実施例１ ウシ大動脈内皮細胞ならし培地からのメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤の精製／特性化 1.ならし培地 MITO＋血清増量剤（２％、v/v;Collaborative Resear
ch Inc.,Bedford,MA）、ペニシリン（100U/ml）及びス
トレプトマイシン（100μg/ml）を補ったウシ胎児血清
（２％、v/v）を含有するイーグルの最少量必須培地（M
EM）中でウシ大動脈内皮細胞（細胞系NCACI₂;De Clerck
ら、Cancer Research、上記）を培養した。継代10と20
の間の細胞を800cm²の回転ビン（Costar）中で増殖させ
た。ならし用に、集密度80−90％の培養物を血清を含ま
ない培地で４−５時間かけて３回洗い、次に血清を含ま
ない新鮮な培地の存在下で48時間インキュベートした。
培地を集め、４℃で10分間、5,000×ｇで遠心し、アジ
化ナトリウム（0.02％、w/v）添加後４℃に維持した。
ならし後、細胞をトリプシン処理し、培地で1:4に希釈
し、再ならし用に集密度80％まで増殖させた。

2.阻害アッセイ Johnson−Wint［Anal.Biochem.104,175−181（198
0）］に記載の放射性標識コラーゲンフィルムアッセイ
を使用して測定した阻害活性により精製作業をモニター
した。使用した基質は¹⁴C−アセチル化したラット皮膚
コラーゲン（約300cpm/μｇ）であり、これはウェル当
り20μｌ（6,000cpm/ウェル）で96ウェルのマイクロタ
イタープレートに載置した。コラゲナーゼ源は約８単位
/ml（１単位は37℃で１分間当たり１μｇのコラーゲン
を分解する酵素量である）のコラゲナーゼ活性を有する
12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート
（TPA）処理したウサギ滑膜繊維芽細胞からの血清非含
有ならし培地である。プロエンザイムは22℃で30分間の
トリプシン（10μg/ml）で活性化され、次に重量が５倍
過剰の大豆トリプシン阻害剤でトリプシンを不活化し
た。種々の量の試験すべき試料を、pH7.5のTris−HCl
（50mM）及びCaCl₂（10mM）も含有する最終容量200μｌ
中の活性化酵素（40mU）と共にインキュベートした。次
に、これらの混合物を［¹⁴C］コラーゲンを含有する各
ウェルに加えた。37℃で３時間インキュベートした後、
上清を取り出し、ベータシンチレーションカウンタで計
測した。試験試料を含有するときに放出された放射活性
とコラゲナーゼのみを含有するときに放出された放射活
性とを比較して阻害率を計算した。全cpm値からバック
グラウンド（バッファのみの場合）のcpm値を差し引い
た。阻害剤が存在しないときには、全放射性標識基質の
60−70％が分解された。阻害剤１単位は、用量−阻害曲
線から決定して、２単位のコラゲナーゼを50％阻害する
量と定義する。

抗ゼラチナーゼ活性アッセイについては、¹⁴C−標識
コラーゲンを60℃で20分間熱変性させ、試験管内でアッ
セイを実施した［Murphyら、Biochem.J.192,517−525
（1980）］。抗IV型コラゲナーゼ活性は、マウスのEngl
ebreth−Holm−Swarm腫瘍から抽出した［¹⁴C］プロリン
標識IV型コラーゲンを使用して、記載（De Clerckら、C
ancer Res.、上記；及びDe Clerck,Arch.Biochem.Bioph
y.,上記）のように測定した。

3.精製 特記しない限り全ての精製作業は４℃で実施した。

a.濃縮 分子量分画範囲10,000のポリスルホン膜カセット（全
膜面積5ft²）を具備したMillipore Pelliconクロスフロ
ー限外濾過装置を使用して20リットルの培地を450mlの
容量に濃縮した。次に、Amicon YM10膜を具備したAmico
n TCF 10クロスフロー限外濾過ユニットを使用して試料
をさらに64mlまで濃縮した。次いで、非イオン界面活性
剤Brij−35を10％（w/v）保存液から加えて最終濃度0.0
5％（w/v）とし、TNC/Brij−35バッファ［50mM Tris−H
Cl,200mM NaCl,0.05％（w/v）Brij−35,10mM CaCl₂,pH
7.5］に対して試料を透析した。

b.ゲル濾過 透析した試料（60ml）を20mlずつ３つに分け、その各
々を４℃のTNC/Brij−35バッファで平衡化したSephadex
G−100ゲル濾過カラム（５×91cm）にかけた。流速は6
0ml/時であり、13mlずつ画分を集めた。各カラムについ
て、本質的にDe Clerckら、Cancer Research（上記）に
記載されたものと同じクロマトグラフィー・プロフィー
ル（280nmでの吸光度及びメタロプロテイナーゼ阻害剤
活性）が得られ、見かけの分子量70,000−75,000及び3
0,000−35,000に対応する２つの阻害活性のピークが認
められた。ゲル濾過カラムの各々からの活性画分を集め
てピークＩ物質（分子量が大きい）とピーク物質II（分
子量が小さい）を得た。

c.ピークＩの精製 1.陰イオン交換 ゲル濾過からのピークＩ物質（312ml;上記3b）を20mM
Tris−HCl,1mM CaCl₂,0.05％（w/v）Brij−35,pH7.5に
対して透析し、２つに分けて、同じバッファで平衡化し
たMono Q陰イオン交換カラム化（Pharmacia;1ml）クロ
マトグラフィーにかけた。次に、同じバッファ中の０−
0.5MのNaClの濃度勾配をかけ（全濃度勾配容量60ml）、
結合した物質を溶出した。クロマトグラフィーは室温で
実施した。流速は1ml/分、分画量は1mlであった。第３
図に得られた溶出プロフィールを示す。活性は指示した
画分からのアリコート（15μｌ）を使用して、上記２に
記載のように測定したコラゲナーゼ阻害を表す。試料を
かける間に集めた画分は示していない。これらの画分に
は阻害活性はなかった。

2.等電点クロマトグラフィー 阻害活性を有するMono Qカラムからの画分を合わせ、
そのプール（12ml）を25mM bis Tris−HCl,1mM CaCl₂,
0.05％（w/v）Brij−35,pH7.4に対して透析し、同じバ
ッファで平衡化したMono P等電点クロマトグラフィーカ
ラム（Pharmacia;4ml）に室温でかけた。試料をかける
間に集めた画分中には阻害活性は存在しなかった。10倍
に希釈し、HClでpH4に調製したポリバッファ74（Pharma
cia）溶液を使用してpH勾配を作ることにより結合した
物質を溶出した。1mlの画分を0.5ml/分の流速で集め、
直ちに、1M Tris−HCl（pH7.5）50μｌを加えてTris−H
Cl中50mMとし、さらに2MのTris塩基を加えてpH7.5に滴
定した溶出プロフィールは第４図に示す。指示した画分
からのアリコート（５μｌ）の阻害活性を上記２に示し
たように測定した。約pH5.5で溶出される画分（画分21
−27）及び後から溶出される画分（画分30−45）に阻害
活性のピークがあった。これらの後者の画分をプール
し、Mono P開始バッファに対して透析し、最初の試料と
同様にMono Pカラムで再びクロマトグラフィにかけた。
回収した活性はまた速く溶出するピーク（約pH5.5）と
遅く溶出する部分とに再び分配され、始めのピークが回
収活性の約1/3を占めた。この２回目のMono Pで後から
溶出される物質を再度クロマトグラフィーにかけると、
活性は同様に再分配された。３回のMono Pカラム全てか
らの初期に溶出れる画分（pH5.5のピーク）を合わせ
た。

3.ゲル濾過 Mono Pカラムからの合わせたプール（15ml）を、固定
アングルロータで5000×ｇで遠心されたAmicon Centric
on 10ユニットを使用して3mlに濃縮した。次に、濃縮し
た試料を、50mM Tris−HCl,200mM NaCl,10mM CaCl₂,pH
7.5で平衡化したSephadex G−100ゲル濾過カラム（1.5
×94cm）にかけた。2.1mlの画分を流速5ml/時で集め
た。阻害活性の１つのピークが回収され、カラム検量に
使用した分子量マーカー（ミオグロブリン、Mr17,000;
オボアルブミン、Mr44,000;ガンマ−グロブリン、Mr15
8,000）に対して24,000の見かけの分子量で溶出され、
約1,550U/mgの比活性を有していた。

ピークＩから誘導された阻害剤の精製では、この段階
では物質が最初のSephadex G−100カラムでのピークＩ
の活性について正しい70,000−75,000よりむしろ24,000
の見かけの分子量で挙動するため、第２回目のSephadex
G−100ゲル濾過ステップが有用であることは特記すべ
きである。

ピークＩから誘導された物質の精製のまとめを第１表
に示す。第１表。（次ページ参照）。ウシ大動脈内皮細
胞からの２つのメタロプロテイナーゼ阻害剤の精製。ス
テップ１及び２の後、阻害剤は指示したように別々に精
製された。回収率及び精製度はステップ２のSephadex G
−100ピークの各々について、夫々100％と１の値を割り
当てて２つの阻害剤について別々に計算した。

脚注： ａ 特記しない限り、標準としてBSAを使用するBradfor
dの方法［Anal.Bioch.72,248−254（1976）］で測定。

ｂ SDS−PAGE後の銀染色したバンドの強度に基づき概
算。

d.ピークIIの精製 1.ヘパリン−セファロース ゲル濾過からのピークII物質（465ml;上記3b）を25mM
カコジル酸ナトリウム−HCl,10mM CaCl₂,0.05％（w/
v）Brij−35,pH7.5に対して透析し、このバッファで平
衡化したヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフ
ィーにかけた。カラムを洗ったあと、同じバッファ中の
1M NaClまでの直線濃度勾配により結合物質を溶出した
［De Clerck,Arch.Biochem.Biophys.265,28−37（198
8）参照］。

２。陰イオン交換 ヘパリン−セファロースからの活性画分を合わせ（全
量7.5ml）、20mM Tris−HCl,1mM CaCl₂,pH7.5に対して
透析した。次に、物質を分けて、上記（c.1）のように
２つの別々なMono Qカラムクロマトグラフィーにかけ
た。回収した活性の80−90％は試料をかける間に集めた
画分（未結合）に存在し、約1,780U/mgの比活性を有す
る高度に精製されたピークII由来の阻害剤物質を表して
いた。活性の残部は塩勾配で初期（約0.065M NaCl）に
溶出された。

ピークIIから得られた物質の精製のまとめは第１表に
示す。

4.ピークＩ由来及びピークII由来の阻害剤の特性化 a.Laemmliの方法［Nature 227,680−685（1970）］によ
りSDS−PAGEを実施した。スタッキングゲルは４％（w/
v）のアクリルアミドを含有し、分離ゲルは12.5％（w/
v）のアクリルアミドを含有していた。試料は、還元ま
たは非還元条件、すなわち処理バッファ中に２−メルカ
プトエタノールを含むまたは含まない条件で調製した。
電気泳動実施後、ゲルを銀染色［Morrissey,Anal.Bioch
em.117,307−310（1981）］またはイムノブロッティン
グ［Burnette,Anal.Biochem.112,195−203（1981）］し
た。

1.ピークＩ由来の阻害剤 Sephadex G−100カラム（上記c.3）からの活性画分は
全て、SDS−PAGEにかけ銀染色すると明らかになるかな
りはっきりした主要なバンドを含有し、移動するこのバ
ンドは見かけ上の分子量24,000−28,000（還元）及び1
9,000−22,000（非還元）を示す。このバンドは前のス
テップ（上記c.2;Mono P）からの活性画分でも明らかで
あった。この位置に活性と物質のバンドとがこのように
同時に溶出されることはバンドが活性蛋白質を表してい
るという結論と一致する。このバンドは第５図Ａのレー
ン１及び２に見られる。これらのゲルでは、最終的なゲ
ル濾過プール（上記c.3;第１表、ステップ2.1.3）100μ
ｌを載置した。レーン１は還元型、レーン２は非還元型
であった。還元型と非還元型の移動の違いは恐らく非還
元型の場合の鎖内ジスルフィド結合の存在を反映してい
る。

第５図Ｃ、レーン１は同様の試料（250mU;非還元）に
ついてのイムノブロッティングしたSDS−PAGEの結果を
示している。イムノブロッティングの一次抗体はウシ血
管平滑筋細胞由来のTIMPに対するウサギポリクローナル
抗体（De Clerck,Arch.Biochem.Biophy.、上記）を1:50
0希釈して使用した。（検出に使用した二次抗体は西洋
わさびペルオキシダーゼと結合しているヤギ抗ウサギ抗
体であった。）この一次抗体の使用で可視化されるバン
ドは１つもなかった。第５図Ｃ、レーン３はウシ血管平
滑筋細胞由来のTIMP（160mU;非還元）はこの抗体の使用
により可視化されることを示していることと示してお
く。

2.ピークII由来の阻害剤 Mono Qクロマトグラフィー（上記d.2;表１、ステップ
2.2.2;75μｌ載置）からの未結合物質についての銀染色
したSDS−PAGEを第５図のレーン３（還元型）及び４
（非還元型）に示す。染色物質は分子量範囲30,000−3
4,000（還元型）及び27,000−31,000（非還元型）を表
すかなり広範な領域にわたり移動する。

第５図Ｃのレーン２は、ピークII由来の阻害剤（240m
U載置；非還元型）はウシ血管平滑筋細胞TIMPに対する
抗体を使用するイムノブロッティングを用いるSDS−PAG
Eで可視化されることを示している。

b.SDS−ゼラチンPAGE 銀染色で可視化されるようなSDS−PAGEの主要なバン
ドは、ゼラチン分解酵素阻害活性を有する蛋白質を同定
するSDS−ゼラチンポリアクリルアイドゲルを使用して
も同じ分子量位置で可視化される［Herronら、J.Biol.C
hem.261,2814−2818（1986）;De Clerckら、Cancer Res
earch、上記；及びDe Clerck,Arch.Biochem.Biophy.、
上記参照］。この方法では、10％（w/v）アクリルアミ
ド及び0.1％（w/v）ゼラチンを含むゲルを使用するSDS
−PAGEに試料をかける。次に、2.5％（w/v）Triton X−
100を２回替えてゲルを３時間インキュベートしてSDSを
除去し、ウサギ滑膜繊維芽細胞からの酢酸ｐ−アミノフ
ェニル第二水銀（APMA）で活性化したならし培地10ml
中、37℃で１時間インキュベートしてゼラチンを分解
し、次に50mM Tris−HCl,10mM CaCl₂,pH7.5中で一晩イ
ンキュベートした。次いで、ゲルをクーマシーブルーで
染色し、メタノール：酢酸：水（50:10:40）で脱色し
た。コラゲナーゼ／ゼラチナーゼ阻害活性を有するバン
ドは未分解のゼラチンを示す暗（青）域として現れる。
次の試料（すべて非還元型）についてこの方法を使用し
た結果を第５図Ｂに示す：レーン１、部分的に精製され
たピークＩ由来の阻害剤（50mU載置）；レーン２、ピー
クII由来の阻害剤（240mU載置）；レーン３、ウシ血管
平滑筋細胞TIMP（160mU載置）。前記のように、暗域は
ゼラチン分解酵素阻害活性を有する蛋白質を表す。結果
はさらに、精製された調製物中の主要な銀染色バンドは
メタロプロテイナーゼ阻害剤活性を有する蛋白質を表す
という結論を支持している。

c.プロテイナーゼ試料のSDS−ゼラチンPAGE ゼラチナーゼ、トリプシンまたはプラスミン阻害活性
について調製物をさらに調べるために、プロテイナーゼ
含有試料をSDS−ゼラチンゲル（上記）上で電気泳動し
た。次に、2.5％（w/v）Triton X−100を２回替えて、
その中でゲルをインキュベートしてSDSを除去し、次い
で阻害活性について調べる調製物を含むまたは含まない
50mM Tris−HCl,10mM CaCl₂,pH7.5中で一晩インキュベ
ートし、クーマシーブルーで染色し、そして脱色した
（上記のSDS−ゼラチンPAGE法と同様に）。第６図参
照。この図のレーン１、２及び３については、電気泳動
した試料は各々、TPA処理したウサギ滑膜繊維芽細胞か
らのAPMA活性化ならし培地（コラゲナーゼ活性1.2mU;本
実施例の２節を参照のこと）、ウシトリプシン（0.01μ
ｇ）及びヒトプラスミン（0.03μｇ）であった。標識し
た「MI」の場合には、ピークＩ由来の阻害剤（0.2U/m
l）も含めてゲルを一晩インキュベートした。透明域は
電気泳動したプロテイナーゼ試料のゼラチン分解活性を
示している。「対照」例と比較すると「MI」はコラゲナ
ーゼを阻害する（「対照」レーン１でMr約68,000及び9
2,000で透明域）が、トリプシンまたはプラスミン（メ
タロプロテイナーゼではない）を阻害しないことを特記
する。同様に、第６図では、予想通り、（20mM含む）キ
レート剤［EDTA］はコラゲナーゼを阻害したが、トリプ
シンまたはプラスミンを阻害しなかったことが判る。

d.種々のコラゲナーゼ及びメタロプロテイナーゼの阻害 第２表はピークＩ由来の物質がコラゲナーゼ、ゼラチ
ナーゼ及びIV型のコラゲナーゼを阻害したが、細菌のコ
ラゲナーゼを阻害しなかったことを示している。

ａ TPA処理したウサギ滑膜繊維芽細胞からのトリプシ
ン活性化ならし培地（40mU;実施例１、２節参照）。

ｂ Clostridium histolyticum由来のIII型（34mU）（A
dvance Biofacture Corp.,Lynbrook,NJ）。

ｃ マウス細網細胞肉腫細胞系からのトリプシン活性化
ならし培地（104倍濃縮した培地50μl;De Clerck,Arck.
Biochem.Biophy.、上記参照）。

ｄ 実施例１、２節参照。

ｅ 60℃で20分間熱変性。

e.ピークＩ由来の阻害剤の非存在下及び存在下でのＩ型
（古典的な）コラゲナーゼにより生じた¹⁴C−標識コラ
ーゲン分解産物のSDS−PAGEを第７図に示す。¹⁴C−標識
Ｉ型コラーゲン（30,000 cpm）を種々の添加物と共に、
実施例１の２節の阻害アッセイについて記載した条件
下、22℃で16時間インキュベートした。次に、EDTA（20
mM）を加えてメタロプロテイナーゼ反応を阻止し、試料
は勾配ゲル（５−15％アクリルアミド）を使用するSDS
−PAGEにかけた。ゲルをAutofluor（National Diagnosi
tics,Manville,NJ）中でインキュベートし、乾燥し、オ
ートラジオグラフィーにかけた。第７図：レーン１、添
加なし；レーン２、TPA処理したウサギ滑膜繊維芽細胞
からのAPMA活性化ならし培地（実施例１、２節に記載の
ように調製した、コラゲナーゼ活性40mUを含有した培地
５μｌ）；レーン３、レーン２と同様の試料で、さらに
部分的に精製したピークＩ由来の阻害剤（50mU）を含
む。図中、TC^a及びTC^bは全長のαコラーゲンポリペプチ
ド鎖を単一に特異的に切断した3/4長及び1/4長の断片を
表し［Grossら、Biochemistry 54,1197−1204（196
5）］、βは二量体α鎖を表す。この結果は、ピークＩ
由来の阻害剤の阻害活性はCOOH末端から４分の１に位置
する、哺乳類コラゲナーゼの特徴である単一のペプチド
結合切断に対するものであり得ることを示している。

f.熱、酸、還元−アルキル化及びトリプシン処理に対す
る感受性について、精製したピークＩ由来及びピークII
由来物質を特性化した。結果を第３表に示す。

ａ 阻害剤試料は指示した温度で１時間インキュベート
した。未処理試料と比較して阻害活性の損失を計算し
た。

ｂ 試料は指示したトリプシン：阻害剤比（w:w）で37
℃で１時間インキュベートした。次に、５倍重量過剰の
大豆トリプシン阻害剤で反応を止めた。トリプシン−大
豆トリプシン阻害剤混合物の存在下、37℃で１時間イン
キュベートした試料と比較して活性の損失を計算した。

ｃ ２−メルカプトエタノール（20mM）を加えて、４℃
で16時間試料を還元し、ヨードアセトアミド（20mM）に
より、30℃で１時間アルキル化した。同じ温度でインキ
ュベートした試料と比較して活性の損失を決定した。２
−メルカプトエタノール及びヨードアセトアミドはコラ
ゲナーゼ活性に影響しなかった。

実施例２ ピークＩ由来及びピークII由来の阻害剤のアミノ末端ア
ミノ酸配列分析；ピークＩ由来の阻害剤のアミノ酸組成
分析 Amicon Centricon 10限外濾過ユニットを使用して、
ピークＩ由来の阻害剤（4.8ml;表１、ステップ2.1.3）
を濃縮し、50mM重炭酸アンモニウム（pH7.8）中に導入
した。ポリブレンを前もって循環しておいたシークエン
サーカートリッジのガラスファイバーディスク上に試料
をスポットした。試料を含有するガラスファイバーディ
スクをN₂流下で乾燥させた。Applied Biosystems（Fost
er City,CA）が提供する標準プログラムを使用して、Ap
plied Biosystems 477型蛋白質シークエンサーにより、
発表された方法［Hewickら、J.Biol.Chem.256,7990−79
97（1981）］に従ってアミノ末端アミノ酸配列分析を実
施した。Brownlee逆相Ｃ−18カラムを使用する120型オ
ンラインPTH−アミノ酸分析機で放出されたフェニルチ
オヒダントイン（PTH）−アミノ酸を分析した。得られ
たクロマトグラムを900型データモジュールで解析し
た。平均反復収率94％で約158pmolの初回収率が得られ
た。42位でアミノ酸指示を得た。繰り返し配列を決定す
ると、さらに３つのアミノ酸（43−45位）が指示された
以外指示は初回の配列決定のものと完全に同一であっ
た。第４表は指示されたアミノ末端アミノ酸配列を示
す。

残基１、３及び13に関しては、これらのサイクルで何
ら他の指示がなされ得ず、また使用した配列決定法では
システインは検出できないため、これらをシステインと
指示した。

配列を比較するために、精製したピークII由来の阻害
剤調製物（2.25ml;第１表、ステップ2.2.2;ピークＩ由
来の阻害剤について記載したように調製した）もアミノ
末端配列分析にかけた。第５表に示す配列が得られた。

初回収量は約280pmolであり、平均反復収率は92％で
あった。残基１、３及び13は上記理由からシステインと
指示された。残基30も回収されず、続く配列 がAsnに結合されたグリコシル化部位と一致すると思わ
れるためにアスパラギンと指示された。43及び48位（括
弧内）の指示は完全に確実なものではなかった。

これらの様々な分析（実施例１及び２）に基づき、ピ
ークII由来の物質がウシTIMPであることはほぼ確かであ
る。ヒトTIMPは非常によく特徴付けられており、クロー
ン化されている（Dochertyら、Nature、上記;Carmichae
lら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、上記）。ヒトTIMPのア
ミノ末端配列とピークII由来の物質を比較すると、最初
の29個の残基についての相同性は93％であり、最初の49
個の残基についての相同性は80％である（第６表参
照）。また、単離したウシのピークII由来の物質はTIMP
の生化学的性質の多く、すなわち、種々の精製ステップ
での行動、SDS−PAGEでの挙動、及びイムノブロッティ
ングを使用するSDS−PAGE上でのウシ平滑筋TIMPに対す
る抗体による認識（実施例１）を有している。

ピークＩ由来の物質（MI）はTIMPとはアミノ酸配列が
明らかに違う（第６表）が、TIMPとの相同性はある。最
初の29個の残基についての相同性は65％であり、最初の
45個の残基についての相同性は47％である。これらの分
子のクロマトグラフィーでの挙動及びSDS−PAGE上での
移動度は異なり、SDS−PAGE後のイムノブロットにおい
てウシ平滑筋TIMPに対する抗体はピークＩ由来物質を可
視化しない（実施例）。この新規なピークＩから得られ
た阻害剤をメタロプロテイナーゼ阻害剤（MI）とする。

最初の45個の残基については、ピークＩ由来及びピー
クII由来のウシ阻害剤は互いに51％の相同性を有してい
る。

ａ Dochertyら、Nature、上記;Carmichaelら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA、上記から。

b,c 実施例２に記載の配列分析から。

ピークＩ由来のウシ阻害剤（MI）のアミノ酸組成を第
７表に示す。Amicon Centricon 10限外濾過ユニットを
使用して、ピークＩ由来の阻害剤試料（1.2ml;第１表、
ステップ2.1.3）を濃縮し、50mMの重炭酸アンモニウム
（pH7.8）中に導入した。次に、試料を乾燥させ、Luら
［J.Chromatog.368,215−231（1986）］が記載した方法
によりアミノ酸組成を分析した。これは、試料の酸加水
分解（24時間）後に生じるフェニルチオカルバミル−ア
ミノ酸のクロマトグラフィー分析を含む。３つの別々の
クロマトグラフィーによる分析データを使用して１分子
当たりの平均残基数を算定した。これらの分析の各々に
ついて、出発試料の10分の１から得られる量の物質を使
用した。１分子当たりの残基数を計算するために使用し
た全アミノ酸の値（178）は成熟ウシMIついての遺伝子
コード配列から得た（実施例３、第１図）。

ａ Arg及びThrは使用した方法では分離できなかった。

ｂ 測定せず。

ｃ 成熟ウシMIポリペプチドの遺伝子コード配列からの
値；実施例３、第１図参照。

実施例３ ウシ及びヒトのメタロプロテイナーゼ阻害剤遺伝子のク
ローニング 上記のように、ウシメタロプロテイナーゼ阻害剤のア
ミノ末端アミノ酸配列を決定し、DNAのセンス鎖（また
はmRNA）とハイブリッド形成するために３つのプローブ
を設計し、DNA合成装置（Applied Biosystems 380A型及
び380B型）で合成した。最初のプローブはアミノ酸４−
19に対応する領域を認識するために、Lahteの方法［J.M
ol.Biol.183,1−12（1985）］により長い非縮重プロー
ブとして設計され、これは次のようなものである： 第２及び第３プローブは４倍縮重の位置にイノシン塩基
を含む縮重プローブとして設計した。第２プローブはア
ミノ酸21−30に対応する領域を認識し、次の通りであ
る： 括弧は、プローブ調製において多数のオリゴヌクレオチ
ドに導く、２つの塩基の導入を示している。第３プロー
ブはアミノ酸32−41に対応する領域を認識し、次の通り
である： ウシ大動脈内皮細胞から単離したmRNAで作製したλgtll
cDNAライブラリーはCLONTECH Laboratories,Inc.（Pal
o Alto,CA）から購入した。約10⁶個のファージを、宿主
細菌株Y1090を有する８枚の23×23cm平方のプレートに
載せた。各プレートからの２つのリフトをGeneScreen P
lus（Dupont）ハイブリゼーショントランスファー膜上
に置いた。１組の膜を³²P−ホスホリル化プローブ２と
ハイブリッド形成させ、他の組の膜は³²P−ホスホリル
化プローブ３とハイブリッド形成させた。６×SSC,5×D
enhardts,0.5％（w/v）SDS,50μg/mlのせん断、変性さ
せたニシン精子のDNA中、50−55℃で一晩ハイブリッド
形成させた。約55℃で、６×SSC,0.5％（w/v）SDS中で
フィルターを洗った。オートラジオグラフィー後、両方
のプローブとハイブリッド形成した３つのクローンを同
定した。各々について単離プラークが得られるまでこれ
らのクローンを再度スクリーニングした。Promegaから
のLambdaSorb Phage Adsorbentを使用して３つのクロー
ンの各々についてミニλファージ調製物を作製した。数
個の制限酵素を使用して３つのクローンを制限エンドヌ
クレアーゼで消化すると、３つのクローン全部が同一で
あり、製造元によるcDNAライブラリー増幅によりそれら
のクローンが得られたことを示した。サザンブロッティ
ング分析により、同じ制限断片はプローブ２及び３のみ
とだけではなくプローブ１とも同様にハイブリッド形成
することが判った。

制限エンドヌクレアーゼ分析により、cDNAクローニン
グの間に右側のEcoRI部位が消失したことを示した。従
って、消失したEcoRI部位から約１キロベース（kb）の
λgtll中の左側のEcoRI部位からSstl部位のcDNA含有断
片をpUC 19にクローニングしてpUC BMIを生成させた。
次に、Sangerらのジデオキシ法［Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 74,5463−5467（1977）］を使用して、両方向の重な
り合った制限断片をpUC BMIからM13 mpベクターにクロ
ーニングして遺伝子の配列を得た。第１図に示すよう
に、遺伝子は26個のアミノ酸のリーダー配列を有する19
4アミノ酸の成熟蛋白質をコードする。成熟蛋白質の最
初の45個のアミノ酸は精製蛋白質（実施例２）について
決定したアミノ末端配列と正確に一致する。さらに、成
熟ウシMIポリペプチドの遺伝子コード配列から決定した
ようなアミノ酸組成はピークＩ由来のウシ阻害剤（実施
例２、第７表参照）について実験的に得たものに一致
し、クローニングした遺伝子が実施例１の精製したMIポ
リペプチドに相当するという証拠をさらに提供する。第
１図の遺伝子によってコードされた配列に基づく、成熟
ウシMIポリペプチド鎖の分子量は21,693である。

ヒトMI遺伝子配列用にヒトcDNAライブラリーをスクリ
ーニングするために、ウシメタロプロテイナーゼ阻害剤
をコードする領域のアンチセンス鎖配列と正確に一致す
る４つの長いオリゴヌクレオチドプローブ（51−mers）
をDNA合成装置（Applied Biosystems 380A型及び380B
型）で製造した。４つの配列は次の通りであった： ヒト心臓組織（胎児大動脈）から単離したmRNAを用い
て作製されたλgtll cDNAライブラリーをCLONTECH Labo
ratories,Inc.から購入した。宿主細菌株Y1090を有する
８枚の23×23cm平方のプレートに約10⁶のファージを載
せた。GeneScreen Plusハイブリダイゼーショントラン
スファー膜上に各プレートからの２つのリフトを載せ
た。上記のハイブリッド形成及び洗浄条件を使用して、
１組の膜は³²P−ホスホリル化したプローブ１と２の混
合物とハイブリッド形成させ、２組目の膜は³²P−ホス
ホリル化したプローブ３と４の混合物とハイブリッド形
成させた。３つのクローンが両組のプローブとハイブリ
ッド形成し、単離プラークが得られるまで、これらのク
ローンを再スクリーニングした。上記のようにミニλフ
ァージDNA調製物を作製し、DNAを制限エンドヌクレアー
ゼ消化した。３つのクローンは同様であったが長さが異
なり、従ってクローンの１つをλgtllから、両方向のEc
oRIからEcoRIまでのM13 mp9にサブクローニングした。
次に、このEcoRI断片をM13 mp9からPUC 19へクローニン
グしてpUC HMIを生成させた。Sangerのジデオキシ方法
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、上記）を使用して、M13 mp
9中の元のクローン及び、両方向でpUC HMIからM13 mpベ
クターへクローニングした他の重なり合った制限断片の
配列決定を行った。ヒトメタロプロテイナーゼ阻害剤遺
伝子の配列を第２図に示す。これは、ウシメタロプロテ
イナーゼ阻害剤遺伝子と同様に、別の26アミノ酸のリー
ダー配列を有する194アミノ酸の蛋白質をコードする。
２つの遺伝子は成熟蛋白質に対応する194アミノ酸の11
で異なるアミノ酸をコードする。第２図の遺伝子コード
配列に基づく成熟ヒトMIポリペプチドの分子量は21,730
である。

実施例４ 大腸菌における組換ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質
の発現 リーダー配列のアミノ酸１のNcoI部位と、成熟タンパ
ク質のアミノ酸42のBamHI部位と、終結コドンの下流のS
tuI部位３ヌクレオチドとを用いて、大腸菌（E.coli）
中に成熟ヒトメタロプロテイナーゼ阻害タンパク質を発
現させた。先ずNcoIからStuIまでのフラグメントを、pC
FM 1156 pLからなる発現ベクター（DNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントを用いてSstII部位で平滑化し
たもの）中のNcoIからSstIIまでの部位にクローン化し
てp1156 HMI1を形成した（第８図）。プラスミドpCFM 1
156 pLはプラスミドpCFM 836（本明細書に参考として含
まれる米国特許第4,710,473号参照）から誘導すること
ができ、その場合はT4ポリメラーゼ酵素での末端充填
（end filling）によって２つの内因性NdeI制限部位を
破壊し、次いでブラントエンド連結反応を行って、合成
pLプロモーターを含む非反復AatII制限部位及びClaI制
限部位間のDNA配列をpLプロモーターを含むpCFM 636
（米国特許第4,710,473号参照）由来の類似のフラグメ
ントで置換し、且つ非反復ClaI制限部位及びKpnI制限部
位の間の小さいDNA配列を下記のオリゴヌクレオチド で置換する。

挿入するpLプロモーターDNA配列は下記の通りである。

リボソーム結合部位と開始メチオニンコドンと成熟ヒト
MIの最初の42個のアミノ酸のコドンとを含む合成DNAフ
ラグメントを構築した（第９図）。先ず、このフラグメ
ントをM13mp11中のXbaIからBamHIまでの部位にクローン
化して、サンガーのジデオキシ法（前出のProc.Natl.Ac
ad.Sci.USA参照）により配列を確認した。次いでこのXb
aI〜BamHIフラグメントをM13 mp11からp1156 HM11にク
ローン化してp1156 HM12を形成した（第８図）。

このプラスミドを、染色体上に温度感受性λCIリプレ
ッサーを含む大腸菌株FM5（ATCC寄託no.53911）に取入
れて形質転換を起こした。このプラスミドは、λPLプロ
モーター／オペレータ領域を含み、温度感受性レプリコ
ンを有する。p1156 HMI12を抱えた大腸菌株FM5を28℃で
培養するとプラスミドコピー数が10〜20コピー／細胞に
維持され、λpLプロモーターからの転写が温度感受性リ
プレッサーによって調節される。42℃で増殖させるとコ
ピー数が増え、λpLプロモーターにおいてリプレッショ
ンが解除される。組換ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物
質はプロモーターの活性化及びプラスミドの増幅の結果
として高温で蓄積され始める。λpLプロモーターはリボ
ソーム結合部位及びヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質
のメチオニン開始コドンのすぐ上流に位置する。転写終
結因子ｔ−oopは遺伝子の３′端末の近傍の２つの翻訳
停止コドンのすぐ下流に位置する。プラスミドp1156 HM
I2を抱えた菌株FM5を、Tsaiらのデュアルフィード（dua
l−feed）培地〔J.Indust.Microbiol.2,181−187（198
7）〕を用いて増殖させた。誘導は600nmでの光学密度
（OD₆₀₀）が約30になった時点で温度を42℃にすること
により実施した。最終OD₆₀₀は約60であった。組換ヒトM
Iは15mg/OD−リットルのレベルまで発現された。ヒトMI
は、SDS−PAGE（湿潤重量0.4mgの細胞と等価の装入量；
還元）及びクーマシーブルー染色の後で、精製ウシMI
（実施例１）のバンドと共に移動するMr24,000〜28,000
の顕著なバンドとして示された。当業者には明らかなよ
うに、発現には他の大腸菌宿主細胞を使用することもで
きる。

実施例５ 大腸菌発現組換ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質の精
製 ヒトMIは不溶性、不活性形態（いわゆる封入体）で大
腸菌中に発現される。活性MIの単離には、封入体MIの可
溶化、精製、折たたみ及び酸化（ジスルフィド形成）と
いう手続きが必要である。このような手続きの一例を下
に挙げる。

プラスミドp1156 HMI2を抱えた大腸菌株FM5を実施例
４の方法で増殖させ、その細胞ペースト約400g（湿潤重
量）を1.5lのH₂O中に懸濁させた。この材料をManton−G
aulinホモジナイザーに３回通し、その後４℃、約4,000
xgで45分間遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。ペ
レットを1.5lのH₂O（４℃）中に再懸濁させ、前述のご
とく遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。ペレット
を120mlのH₂O中に再懸濁させ、pH9.5の20mMトリス−HCl
で10倍に希釈した。pHを（1N NaOHで）11.5に調整し、
この混合物を氷上に15分間放置し、４℃、11,300xgで30
分間遠心分離した。上清をpH9.5の20mMトリス−HClで４
倍に希釈した。pHを（1N NaOHで）10〜10.5に調整し、
この混合物を室温で一晩撹拌した。

この混合物のpHを（1N HClで）8.5に下げ、この混合
物をpH8.5の20mMトリス−HCl中で平衡化したDEAE−セフ
ァロースFast Flow（Pharmacia）イオン交換カラム（カ
ラム容積150ml）にかけた。結合した物質をトリス−HCl
バッファ中０〜0.3M NaClの2lグラジエントで溶離し
た。12mlのフラクションが8ml/分の流速で回収れた。回
収したフラクションのアリコート（25μｌ）をSDS−PAG
E（15％w/vアクリルアミド、非還元）にかけ、クーマシ
ーブルー染色した。MIポリペプチドに対応するかなり鮮
明なバンド（Mr約22,000〜23,000）を含むフラクション
38〜54をプールした（202ml）。やはりMIポリペプチド
を表すと考えられるが移動性が少し遅く且つSDS−PAGE
上でのバンド形成もそれほど鮮明ではない物質がグラジ
エントの後期で溶離されたが、これはプールに入れなか
った。

DEAE−セファロースFast Flow処理の後でプールした
物質を（YM5膜を有する）Amicon撹拌セルを用いて30ml
に濃縮した。pHを（50％酢酸で）5.4に調整し、この混
合物をpH5.4の20mM酢酸ナトリウムに対して透析した。
この物質を最終量が45mlになるまでH₂Oで希釈し、pH5.4
の20mM酢酸ナトリウム中で平衡化したCM−セファロース
Fast Flow（Pharmacia）イオン交換カラム（カラム容量
1ml）にかけた。酢酸ナトリウムバッファ中０〜0.4M Na
Clの20mlグラジエントを用いて結合物質を溶離した。1m
lずつのフラクションが流速0.1ml/分で回収された。こ
のフラクションのアリコート（10μｌ）を前述のSDS−P
AGEで分析し、MIを含むフラクション［フラクション11
−18（8ml）］をプールし、次いでリン酸緩衝塩水（PB
S）中で平衡化したSephacryl S−200 HRゲル過カラム
（カラム容量300ml）に直接かけた。4mlのフラクション
が流速20ml/時で回収された。このフラクションのアリ
コート（20μｌ）を再び前述のSDS−PAGEで分析した。
フラクション54〜60はMIを含んでいた。純度を最大にす
べく、フラクション56〜59だけをプールした（16ml）。
SDS−PAGEで評価されるプールのMI純度は、SDS−PAGE及
びクーマシーブルー染色後のゲルの視覚検査で90％以上
と判定された。BSAを標準として用いてBrad−fordの方
法（前述のAnal.Biochem.）で測定したプール中の総タ
ンパク質は約8mgであった。この物質の阻害活性は、実
施例１のセクション２で説明したＩ型コラゲナーゼ阻害
アッセイによって測定したところ約424U/ml（比活性約8
65U/mg）であった。大腸菌誘導ヒトMIの阻害活性は他に
も幾つかの方法で立証された（実施例11）。

前述したヒトMI調製物の試料（約6.5μｇ）を実施例
２に記載の方法で18サイクルを通してアミノ末端アミノ
酸配列決定にかけた。初期収率は135pmol、平均反復収
率は94％であった。得られた主要配列は、成熟ヒトMI遺
伝子のヌクレオチド配列から予想したものと正確に合致
していた（実施例３、第２図）。

この物質を、ウシMIに関する実施例１の方法又は当業
者に公知の他の方法によって、明らかに均質になるまで
精製する。

実施例６ ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質に対するウサギポリ
クローナル抗血清の形成 ２種類のメタロプロテイナーゼ阻害物質調製物を用い
てウサギポリクローナル抗血清を形成した。第１の調製
物（１日目、７日目及び21日目の注射に使用）は下記の
ように調製した。プラスミドp1156 HMI2を有する大腸菌
株FM5（実施例３）からの細胞ペースト約14g（湿潤重
量）を50mlのH₂O中に懸濁させ、フレンチプレスに２回
通した。遠心分離によって得たペレットフラクション
を、ナトリウムサルコシル（sodium sarko−syl）（２
％w/v）、トリス−HCl（50mM）、ジチオスレイトール
（50mM）を含むpH8.5の最終量10mlの溶液中に再懸濁さ
せ、50℃で10〜15分且つ室温で２時間インキュベートし
てMIを可溶化した。この混合物を遠心分離にかけるとMI
を含む上清フラクション（7.2ml）が得られた。これをp
H8の20mMトリス−HCl、１％（w/v）ナトリウムＮ−ラウ
ロイルサルコシン中で平衡化したSephacryl S−200カラ
ム（カラム容量265ml）でゲル過にかけた。2.9mlずつ
のフラクションが流速14ml/時で回収された。MIを含む
フラクション65〜75（31ml）［SDS−PAGE及び銀染色に
よって判定。このフラクションのアリコート（0.5μl;
還元）を12.5％（w/v）のアクリルアミドを含むゲルに
かけた］をプールし、pH8の20mMトリス−HClに対して完
全に透析し、（YM10膜を有する）Amicon撹拌セルを用い
て6.5mlに濃縮し、0.45μフィルタで過した。この調
製物のMI濃度は約1mg/mlであった。第２の調製物（35日
目及び56日目の注射に使用）は、MIを0.4〜0.5mg/mlの
濃度で含む実施例４の調製物である。

これらのMI調製物を３匹のニュージーランド白ウサギ
（初期体重５〜８ポンド）に注射した。各ウサギは一日
目に、0.2mgのMIを等量の完全フロイントアジュバント
中に乳濁させたもので免疫した。ウサギ当たり合計2ml
以下の調製物（MI:アジュバンント1:1）を後半部に沿っ
て６箇所以上に皮下注射した。同様の手順で、但し不完
全フロイントアジュバントを用いて、（７日目、21日
目、35日目及び56日目に）ブーストした。

最初の注射の前日に耳静脈穿刺によってウサギの血液
を採取し（免疫前血清）、28日目及び63日目にも同様の
採血を行った。血液を真空チューブに集め、室温で16時
間凝固させた。血餅を除去し、血清を2200rpmで10分間
回転させて残りの赤血球を完全に除去した。血清にアジ
化ナトリウムを最終濃度0.01％（w/v）で加え、−20℃
で貯蔵した。

固相ラジオイムノアッセイを用いて血清のタイターを
調べた。この測定についてはSelcted Methods in Cellu
lar Immunology,B.B.Mishel及びS.M.Shiigi編、Freema
n,San Francisco（1980）の373〜397ページに記載のTsu
らの“Solid Phase Radioimmunoassays"、並びにHybrid
oma Technology in the Biosciences and Medicine,Tim
othy A.Springer編、Plenum Press（1985）、29〜36ペ
ージを参照されたい。メタロプロテイナーゼ阻害物質を
pH9.2の炭酸塩−重炭酸塩バッファ中で0.5μg/50μｌに
希釈し、ポリスチレンのウェル内で（50μl/ウェル）室
温で２時間インキュベートした。抗原溶液を傾瀉した。
次いでウェルに５％（w/v）BSAを室温で30分間充填して
プラスチック上の残りの結合部位をブロックした。５％
（w/v）BSAを傾瀉により除去した後、１％（w/v）BSAを
含むPBSで希釈したウサギ血清をウェル内に加えた（50
μl/ウェル）。室温で２時間インキュベートした後、0.
02％（w/v）のTween 20を含むイミダゾール緩衝塩水で
ウェルを洗浄した。¹²⁵Iで標識したプロテインＡ（100,
000 cpm/50μｌ）をウェル内に加え、室温で30分間イン
キュベートし、その後２回目の洗浄を行った。ウェルを
たたいて水を切り、ガンマー計数器で計算した。cpm血
を抗血清希釈度に対するグラフで示し、50％タイター
（抗血清が最大結合数の半分と結合する希釈度）を測定
した。28日目の採血によって得た血清は1:200〜1:2500
のタイターを示した。63日目の採血によって得た血清は
1:800〜1:4500のタイターを有していた。

これらの抗血清をSDS−PAGE＋イムノブロッティング
操作にも使用した。実施例８及び９に示すように、この
抗体はウシMI、大腸菌発現組換ヒトMI及びCHO細胞発現
組換ヒトMIの調製物中で予想Mrのタンパク質バンドを認
識した。

実施例７ 酵母細胞による組換ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質
の発現 ヒトMI遺伝子をpUC HMIから得た（実施例３）。このM
I遺伝子はpUC HMIから586塩基対（bp）PstI〜StuI DNA
フラグメントとして単離された。HindIII及びPstI付着
端を有する合成DNAリンカーを用いてMI遺伝子をベクタ
ーpUC119αG4中で酵母MFα１に融合させた（第10図
Ａ）。

使用した合成DNAリンカーは下記の通りである。

ベクターpUC119αG4は酵母グリセルアルデヒド−３−
ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター（GPD−
Ｐ）とこれに続く酵母接合因子αのプレプロ（pre−pr
o）配列（αＦ−Ｓ）及び転写終結配列（αＦ−ｔ）と
を含む。

ベクターpUC119αG4は詳細には下記のものからなる
（第10図Ａ参照）： I.HindIII、SalISstI及びSmaI部位を欠失したpUC119:pU
C119をHindIII及びSalIで消化し、次いでSlヌクレアー
ゼ処理でブラントエンドを形成し、その後連結反応させ
た。得られたプラスミドを更にSstI及びSmaIで消化し、
次いでSlヌクレアーゼ処理し、その後連結反応させて、
HindIII、SalI、SstI及びSmaI部位を欠失させた。その
後、発現カセットを残りの非反復BamHI部位に導入し
た。

II.発現カセットは下記のものからなる： （ｉ）酵母グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼプロモーター（GPD−Ｐ）［Bitterら、Gen
e 32,263−278（1984）］を含む675bpのHindIII〜BamHI
フラグメントであって、HindIII部位を除去しBamHI部位
を加えたもの。これは、HindIIIでの消化とそれに次ぐD
NAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの末端充填
とによって行った。末端充填HindIII部位を含むDNAフラ
グメントをpUC19のSmaI部位にブラントエンド連結反応
させた。

（ii）GPD−α−因子リンカー （iii）ｐαC3に由来するα因子プレプロリーダー配列
を含む218bpのPstI〜HindIIIフラグメント［Zseboら、
J.Biol.Chem.261,5858−5865（1986）;Bitterら、Metho
ds in Enzymol.153,516−544（1987）］。

（iv）α因子プレプロリーダーを下記のようなα因子終
結配列 に接続するためのリンカー。

（ｖ）ｐαC3に由来する約250bpのSalI〜BamHIフラグメ
ントのα因子終結配列であって、SalI部位が（iv）で述
べたリンカーへの接続の後で破壊されたもの。

α因子−MI遺伝子融合は、pUC119αG4をHindIII及びS
maIで消化し、次いで合成DNAリンカー及びMI DNAフラグ
メントと連結反応させることにより実施した。得られた
プラスミドpUC119αG4−HMIは第10図Ａに示すように酵
母グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼプ
ロモーター（GPD−Ｐ）と、これに順次続く酵母MFα１
遺伝子からのα因子プレプロリーダー、前述の合成DNA
リンカー、ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質遺伝子DN
Aセグメント及びα因子転写終結因子とを含む。前述の
エレメントを含む1800bpのBamHI DNAフラグメントをBam
HIでの部分的消化によってpUC119αG4から単離し、酵母
−大腸菌シャトルベクターpYE3のBamHIに挿入してプラ
スミドpYE3αG4−HMIを得た（第10図Ｃ）。

プラスミドpYE3は第10図Ｂに示した。このプラスミド
は下記のものからなる。

I.2500bpのBamHI〜SalI LEU 2遺伝子セグメントをBam
HI及びSalIでの消化により欠失させ、次いでヤエナリ
（mungbean）ヌクレアーゼ処理によりブラントエンドを
形成し、その後連結反応させたpGT41中の酵母２μ（Ｂ
形態）プラスミド［Tschumperら、Gene 23,221−232（1
983）］。

II.下記の配列 をもつポリリンカーを第10図Ｂに示すように（Ｉ）で述
べた変形２μプラスミドのEcoRI部位に挿入した。

III.（II）で述べたポリリンカーのBglII及びEcoRI部位
に挿入したTRP 1遺伝子を含む852bpのBglII〜EcoRIフ
ラグメント［Tshumperら、Gene 10,157−166（198
0）］。

プラスミドpYE3αG4−HMIを大腸菌株DH5α中で増殖さ
せ、プラスミドDNAを単離し、このDNAをS.cerevisiae酵
母株EG45°に取入れて形質転換を起こした。当業者には
明らかなように、別の酵母宿主細胞を使用することもで
きる。

菌株EG45°（前出）は酵母株SE7−６の突然変異体で
ある。株SE7−６（Matα、trpl欠失、pep4−３、GAL、c
upl）は標準的酵母遺伝子工学技術によって形成した。
この株は、（１）PEP4遺伝子中の突然変異を含むYSDP4
（ATCC 20734）、（２）ガラクトース上で増殖できる株
［L.Gaurenteから入手したBWG1−7A、Gaurenteら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 79,7410−7414（1982）及びCell
36,503−511（1984）参照］、（３）TRP1遺伝子を欠失
した株（YNN282 Yeast Genetic Stock Center,Berkele
y,CA）及び（４）銅に感応する株（x36567D Yeast Gene
tic Stock Center,Berkeley,CA）を含む幾つかの酵母株
の交配から誘導された。SE7−６の選択は、ガラクトー
ス上で増殖する能力及び異種タンパク質を効果的に分泌
する能力に基づいて行った。

EG45°を単離するために、株SE7−６をプラスミドpCO
M（Ｇ）P/Pで形質転換した。プラスミドpCOM（Ｇ）P/P
は増幅可能コピー数システムを含む（第11図）。このプ
ラスミドはTRP1 ARS1酵母DNAセグメントを介してトリ
プトファンプロトトロフィーを選択することにより酵母
trp1細胞中に形質転換できる（前出のBitterらのMethod
s Enzymol.参照）。通常の条件では、このプラスミドは
細胞当たり１つのコピー数で安定である。銅含有培地で
増殖するとCUPプロモーター（CUP−Ｐ）から転写が誘導
され、そのため動原体（CEN3）機能が阻害される。CUP
−ＴはCUP終結領域である。従ってコピー数が増加し、
プラスミドの安定性が減少する。銅を除去すればプラス
ミドは安定する。コピー数は通常細胞当たり１つに戻
る。しかしながら、Tn5遺伝子を介してG418耐性に関し
て選択すると［Jiminezら、Nature 287,869−871（198
0）］［酵母PGKプロモーター（PGK−Ｐ）によって制御
される］細胞当たり５〜10個のプラスミドコピーを含む
細胞が得られる。これらの細胞は安定した状態で維持さ
れる。

EG45°の形質転換は、プラスミドDNAをBio−Rad遺伝
子パルサーにより900ボルト、25マイクロファラドで５
ミリ秒間酵母細胞中にエレクトロポレーション（electr
oporation）することによって実施した。エレクトロポ
レーションした細胞を、アミノ酸を含まない酵母窒素塩
基（Difco）6.7g/lと、グルコース２％（w/v）と、カザ
ミノ酸（casamino acid）（Difco）0.5％（w/v）と、寒
天２％（w/v）とを含むSD−CAA寒天上に配置し、30℃で
増殖させることによって形質転換細胞を得た。

これらの形質転換細胞を供給バッチ式発酵（fed−bat
chfermentation）を用いる15l発酵槽（fermentor）で増
殖させた。培地の組成は下記の通りである。

ａ 微量金属溶液及びビタミン溶液はTsaiらのJ.Indust
rial.Microbiol.2,181−187（1987）に記載のものと同
じである。

培地のpHは6.0に維持し、温度は25℃に維持した。溶
解酸素はエアレーション、背圧及び撹拌によって調節し
た。細胞はOD₆₀₀ が85〜95になるまで増殖した。

実施例８ 酵母分泌組換ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質の特徴
検査 酵母発現組換ヒトMIを含む培養培地を遠心分離によっ
て回収し細胞ペーストを除去した。上清フラクションを
SDS−PAGE（還元条件）及び銀染色にかけた。pYE3αG4
−HMIを含む酵母（株EG45°）形質転換細胞によって産
生された上清では約26,000（24,000〜28,000）のMrで移
動するバンドが観察された。このバンドによって表され
るポリペプチドは上清１当たり約25〜50mgで存在して
いた。Mr26,000バンドは対照発酵槽上清中には観察され
なかった。Mr26,000バンドはSDS−PAGE上でウシ内皮細
胞ならし培地から精製したMIと同じ移動度を有していた
（実施例１）。MI含有酵母上清のアリコート（10μｌ）
を非還元条件でSDS−PAGE及び銀染色にかけたところ、M
r26,000バンドは存在せず、代わりにMr22,000〜23,000
バンドが観察された。Mr22,000〜23,000バンドによって
表される物質は上清１当たり約２〜5mgで存在し、対
照上清中には見られなかった。Mr26,000バンド（還元）
及びMr22,000〜23,000バンド（非還元）がヒトMIを表す
ことを証明するために、大腸菌中で産生したヒトMIに対
してウサギ体内で産生されたポリクローナル抗体（実施
例６）を使用した。この抗体調製物と、ビオチニル化抗
ウサギイムノグロブリン、アビジン及びビオチニル化西
洋ワサビペルオキシダーゼを含むVectastain ABCキット
（Vector laboratories）とを用いてSDS−PAGE及びイム
ノブロッティング（前出のBurnette,Anal.Biochem.参
照）を行った。MI遺伝子含有プラスミド（10μｌ）でト
ランスフェクションした酵母株に由来する上清には免疫
反応性バンドが観察されたが、対照上清には観察されな
かった。［還元試料ではMr26,000及びMr18,000バンドが
存在し、非還元試料にはMr22,000〜23,000バンドが存在
していた。Mr18,000（還元）バンドはMIのタンパク質分
解フラグメントであると推測される。］この抗体はイム
ノブロット（immuno−blot）で、ウシ内皮細胞ならし培
地から精製したMI（350mU）及び大腸菌産生ヒトMI（0.3
μｇ）とも反応した。これは、酵母上清中に観察された
バンドが確かにヒトMIを表すという事実を意味する。

実施例９ チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるヒトメタロプ
ロテイナーゼ阻害物質の発現 1.発現ベクターの形成 発現プラスミドを形成すべく、ヒトMIの完全なコーデ
ィング配列［第２図の26アミノ酸リーダーをコードする
配列を含む］を含むpUC HMI（実施例３）のNcoI〜EcoRI
フラグメントを先ずNcoIからEcoRI制限部位までpCFM 11
56にサブクローニングしてプラスミドp1156 HMINRを得
た。プラスミドpCFM1156は、２つの内因性NdeI制限部位
を破壊し、T4 DNAポリメラーゼで末端充填を行い、次い
でブラントエンド連結反応を行って非反復ClaI及びKpnI
制限部位間の小さいDNA配列を下記のオリゴヌクレオチ
ド で置換することにより、プラスミドpCFM836（本明細書
に参考として含まれる米国特許第4,710,473号参照）か
ら誘導した。

ヒトMI cDNAはプラスミドp1156 HMINRから0.65kb Hin
dIII〜StuIフラグメントとして得た。次いでこのフラグ
メントを発現ベクターpDSRα２にクローン化し、プラス
ミドpDSFα２−MIを形成した。

プラスミドpDSRα２は下記の重要な特徴を有する（第
12図の地図を時計方向に見ながら説明する）。

（ａ）SV40初期プロモーター／エンハンサー及び複製開
始点；PvuII部位（SV40ヌクレオチド地図座標＃272）と
HindIII（地図座標＃5172）部位との間のSV40配列から
なる。［DNA Tumor Viruses,J.Tooze編、Cold Spring H
arbor Laboratories,Cold Spring Harbor,NY（1981）,p
p.801−804］。

（ｂ）ヒトＴ細胞１型白血病ウイルス（HTLV−１）のLT
R（long terminal repeat）の「Ｒ」エレメントと「U
5」配列の一部分とを含む267bpフラグメント。このフラ
グメントは「Ｒ」の正確な５′末端（位置354）でU5配
列中のSau3A部位（位置620）まで存在する［Seikiら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 80,3618−3622（1983）］。

（ｃ）SV40 16S 19Sスプライスドナー／アクセプターシ
グナルからなるフラグメント（BamHIリンカーで接続さ
れた地図座標＃502−560及び＃1410−1498）。

前記３つのセグメント（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の構
造は公知のベクターpCD−SRα［Takebeら、Mol.Cell.Bi
ol.8,466−472（1988）］と同じであるが、下記の点が
異なっている。（１）セグメント（ａ）の５′末端で、
HindIII部位がDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トを用いて行われた末端充填連結反応により破壊されて
いる。（２）セグメント（ａ）及び（ｃ）の間に元来存
在するXhoI部位がセグメント（ｂ）の挿入によって破壊
れている。（３）（ｃ）セグメントの３′末端で、元来
のPstI部位がHindIII部位に変わっている。

（ｄ）2.4kbのSalI〜BamHIフラグメント上にある転写終
結／ポリデニル化（polydenylation）シグナル。このフ
ラグメントはウシ下垂体糖タンパク質ホルモンα−FSH
（卵胞刺激ホルモン）のαサブユニットの３′部分から
得た。最終エクソンの冒頭のBstXI部位をSalI部位に突
然変異させた。このフラグメントの３′末端は最も近傍
の下流BamHI部位まで続いていた。この2.4kbフラグメン
トをpUCベクターにサブクローニングし、次いで発現ベ
クターを更に構築すべくSalI〜SmaIフラグメントとして
取出した。

（ｅ）内因性マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）
プロモーターと、cDNAコーディング配列と、2.5kbのEco
RI〜HindIIIフラグメントとして最初にプラスミドpMg1
［Gasserら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,6522−6526
（1982）］から得た全てのDHFR転写終結／ポリアデニル
化シグナルとを含むマウスDHFRミニ遺伝子（minigen
e）。２つの末端制限エンドヌクレアーゼ部位、即ち
５′EcoRI及び３′HindIIIは両方とも発現ベクターの構
築時に破壊された。

（ｆ）HindII部位（地図座標＃2448）からEcoRI部位
（地図座標＃4362）まで延び且つアンピシリン耐性マー
カー遺伝子と大腸菌中でのプラスミドの複製開始点とを
含む「無毒」のpBR322配列。

複数のサブクローニングステップを通してこれら６つ
のDNAセグメント［（ａ）〜（ｆ）］が最終的に連結反
応し、その結果発現ベクターpDSRα２が得られた。元来
の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の幾つかは操作中に
破壊されるか又は変化した。プラスミドpDSRα２−MIの
最終構造を第12図に示すが、この円形構造にはこれらの
変化が明白に示されている。

2.トランスフェクション条件 DHFR欠失（DHFR^-チャイニーズハムスター卵巣（CHO）
細胞［Chasin ＆ Urlaub,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77,4
216−4280（1980）］をルーチン操作に従って、５％（v
/v）ウシ胎児血清（FBS）、Ｌ−グルタミン（292μg/m
l）、非必須アミノ酸（100μＭ）、ヒポキサンチン（1
3.6μg/ml）、チミジン（7.6μg/ml）、ペニシリン（10
0U/ml）及びストレプトマイシンスルフェート（100μg/
ml）を加えてイーグル培地を改質したダルベッコの培地
中に維持した。

リン酸カルシウム沈澱法の一変形方法［Chenら、Mol.
Cell.Biol.7,2745−2752（1987）］に従い、百万個の細
胞（トランスフェクションの一日前に60mm皿上にプレー
トした）を別個に20μｇのpDSRα２−MI11又はpDSRα２
−MI14（２つの別個に単離したプラスミド）プラスミド
DNAでトランスフェクションした。トランスフェクショ
ンから３日後に細胞を８つの100mm皿に分けた。この時
点で、ヒポキサンチン及びチミジンを含まず且つ10％
（v/v）透析FBSを含む培地を使用してトランスフェクシ
ョン細胞（transfectant）を選択した。選択を確実に行
うべく培地は２〜３日おきに取り替えた。トランスフェ
クションから２週間経過した時点で、24個の安定なトラ
ンスフェクション細胞を各皿グループから選択し、MI遺
伝子の転写及び翻訳を分析した。

3.組換ヒトMI遺伝子から転写したmRNAの分析 トランスフェクションしたCHO細胞に由来する全細胞
質RNAをResendezらの方法［J.Cell Biol.103,2145−215
2（1986）］で調製した。細胞RNA（7.5μｇ）を１％ホ
ルムアルデヒド−ホルムアミド変性アガロースゲル電気
泳動によって分離し、Gene Screen Plus膜上に移動させ
た。放射性標識した、pDSRα２−MI11のHindIII〜PvuI
フラグメントを用いて、Linらのハイブリダイゼーショ
ン条件［Gene 44,201−209,（1986）］でヒトMI転写物
を同定した。分析した７つの個々の安定クローンのうち
４つに、単一のRNAバンドが観察された。メッセージの
サイズは構造から予想した通り1.5kbであった。

4.タンパク質の分析及び定量 実施例８で説明したようなSDS−PAGEとヒトMIに対す
る抗体でのイムノブロッティングとによって、組換ヒト
MIの同定及び定量を行った。安定なトランスフェクショ
ンしたクローンに由来するならし培地（無血清、10〜50
μｌアリコート）を分析した。その結果、トランスフェ
クションしたCHO細胞は抗体によって認識され得るMr26,
000（24,000〜28,000）（還元）タンパク質を分泌する
ことが判明した。このタンパク質は大腸菌産生組換ヒト
MIと共に移動する。MI発現度の最も高いトランスフェク
ション細胞は、集密的100mm組織培養皿上で増幅ないし
に約1mg/l/日で産生した。

5.発現の増幅 トランスフェクションしたCHO細胞クローンによるMI
発現をメトトレキセート［Kaufman及びSharp,J.Mol.Bio
l.159,601−621（1982）］を用いて濃度を段階的に増加
させながら（メトトレキセート濃度10nM、30nM、100nM
及び300nMで）増幅させた。10nMメソトレキセート増幅
にかけたトランスフェクションクローンからは、実施例
10で説明するようなローラーボルトで増殖すると、６〜
７日目の回収時に20〜30mg/lという高濃度でMIを含むな
らし培地が得られた。300nM増幅段階の後では、ローラ
ーボトルでの培養時に50〜60mg/lという高い濃度のMIを
得ることができた。

6.生物学的活性のアッセイ 実施例１で説明したＩ型コラゲナーゼ阻害アッセイに
よってトランスフェクションCHO細胞上清中に活性を検
出することができた。結果は実施例10（表８）に示す。

実施例10 チャイニーズハムスター卵巣細胞で発現された組換ヒト
メタロプロテイナーゼ阻害物質の精製 実施例９で説明したように、ヒトMI遺伝子を保有する
発現ベクターでトランスフェクションし且つ10nMメトト
レキセート増幅段階（実施例９）にかけたCHO細胞を下
記のように無血清培地中でローラーボトルで増殖させ
た。最初にスピナーフラスコ内で細胞を、透析したウシ
胎児血清（５％v/v）とグルタミンと非必須アミノ酸と
を加えたダルベッコ改質MEM並びにF12栄養培地を含む培
地で増殖させた。MEM及びF12培地は50:50（v:v）で使用
した。次いで細胞を、同じ培地が入っている850cm²ロー
ラーボトルに移した（2x10⁷細胞／ボトル）。37℃で３
〜４日おいた後、細胞単層をPBSで洗浄し、新しい培地
（150〜200ml/ボトル、前記と同じであるが血清は含ま
ない）を加えた。６〜７日後にならし培地を回収し、新
しい培地に取り替えた。６〜７日後に、ならし培地をも
う一度採取した。

以下の操作は、特に指示のない限り総て４℃で行っ
た。20lのならし培地に、アジ化ナトリウム（最終濃度
0.02％w/v）とプロテアーゼ阻害物質ペプスタチンＡ
（最終濃度１μg/ml）と塩化フェニルメタンスルホニル
（PMSF、最終濃度0.6mM）とを加えた。この培地を濃縮
し、分子量分画範囲10,000のポリスルホン膜カセット
（膜面積5ft²）を有するMillipore Pelliconクロスフロ
ー限外過装置を用いて、pH7.5（HClで調整）の1mMイ
ミダゾール、1M NaClに対して過した。ポンプ速度は
約500ml/分、過速度は約100ml/分であった。回収した
試料の最終量は１であった。この試料を、CuSO₄溶液
をカラムに通すことによってCu²⁺で飽和し且つpH7.5の1
mMイミダゾール、1M NaClバッファで平衡化したキレー
ティングセファロースFast Flow（Pharmacia）カラム
（カラム容量400ml）にかけた。流速は800ml/時にし
た。試料を通した後、カラムを約１のイミダゾール開
始バッファで洗浄した。カラムに結合したMIを開始バッ
ファから20mMイミダゾール、1M NaCl、pH7.5までの直線
グラジエント（総量20l）で溶離した。420〜600mlフラ
クションを集め、アリコート（フラクション量の0.0003
3％）をSDS−PAGE（12.5％w/v、アクリルアミド、還
元）及び銀染色にかけた。前記グラジエントで溶離量18
10〜2410mlを表す600mlのフラクションはMIポリペプチ
ド（Mr約26,000のバンドとして可視化）の大部分を含ん
でいた。このフラクションをAmicon YM10膜を有するAmi
con撹拌セルを用いて約100mlに濃縮し、pH8.5の20mMト
リス−HCl、1mM CaCl₂に対して透析し、同じバッファで
平衡化したＱ−セファロースFast Flow（Pharmacia）イ
オン交換カラム（カラム容量40ml）にかけた。流速は12
0ml/時であった。試料をかけた後で、カラムを約100ml
の開始トリス−HClバッファで洗浄した。カラムに結合
したMIを開始トリス−HClバッファ中０〜0.5M NaClの直
線グラジエント（総グラジエント量1200ml）で溶離し
た。12.6mlずつのフラクションを集めた。このフラクシ
ョンのアリコート（１μｌ）を前述のごとくSDS−PAGE
で再分析し、MIを含むもの（グラジエントのフラクショ
ン25〜32）をプールし（総量100ml）、前述のごとくAmi
con撹拌セルを用いて40mlに濃縮し、PBSで平衡化したSe
phacryl S−200 HR（Pharmacia）ゲル過カラム（5x14
6cm）にかけた。13mlずつのフラクションを流速80ml/時
で集めた。このフラクションのアリコート（２μｌ）を
前述のごとくSDS−PAGEで再分析し、MIを含むもの（フ
ラクション81〜94）をプールした（180ml）。プールのM
Iの純度はSDS−PAGE及び銀染色で95％以上と判定され
た。精製操作を表８にまとめて示す。

ａ 指示のない限り、BSAを基準としてBradfordの方法
（前出のAnal.Biochem.参照）で測定した。

ｂ 1mg/ml溶液の280nmでの吸光度の値を1.82としてA
_280nmにより測定した。

ｃ 活性はコラーゲンフィルムアッセイで測定した（実
施例１、セクション２）。

精製物質の阻害活性はＩ型コラゲナーゼ阻害アッセイ
（表８）と他の幾つかのin vitro方法（実施例11）及び
in vivo方法（実施例12）とによって立証された。

このヒトMI調製物の試料（約27μｇ）を、実施例２で
説明した方法に従い20サイクルを通してアミノ末端アミ
ノ酸配列決定にかけた。初期収率は923pmol、平均反復
収率は90〜93％であった。得られた主要配列はヒトMI遺
伝子のヌクレオチド配列に基づいて成熟ヒトMIについて
予想されたものと全く同じであった（実施例３、第２
図）。

CHO細胞ならし培地からのヒトMIの精製に有用な方法
としては更に、陽イオン交換クロマトグラフィー［例え
ばpH4.5でCM−セファロースFast Flow（Pharmacia）を
使用］、疎水性相互作用クロマトグラフィー［例えばフ
ェニル−セファロースCL−4B（Pharmacia）を使用］、
及び当業者に公知の他の方法が挙げられる。

実施例11 組換ヒトMI調製物におけるin vitro阻害活性の立証 この実施例に記載のデータは、大腸菌誘導組換ヒトMI
［指示のある場合は実施例５と同様に調製し、その他の
場合は使用大腸菌誘導物質を本質的には実施例５と同様
であるが、相異点として、ジチオエリトリトール（5m
M）を実施例５に記載のpH11.5処理の間存在させ、且つ
この物質を一晩pH11に維持し次いでCaCl₂中で2mMにし、
DEAE−セファロースクロマトグラフィーにかける前に遠
心分離によって清澄化する方法で製造した。この物質
は、実施例１、セクション２で説明したＩ型コラゲナー
ゼ阻害アッセイで測定して約369U/mlの阻害活性を有し
ていた（比活性は約355U/ml）］又は実施例10と同様に
製造したCHO誘導組換ヒトMIを用いて得たものである。

1.I型コラゲナーゼ阻害;SOS−ゼラチンPAGE;試料として
プロテイナーゼを用いるSDS−ゼラチンPAGE;特異的コラ
ーゲン開裂の阻害。

大腸菌誘導ヒトMIをSDS−ゼラチンPAGEでも分析した
（第13図；実施例１、セクション4bで説明した方法）。
第13図の説明は以下の通りである（試料は総て非還元で
あった）： レーン１、ウシ内皮細胞に由来するピークII誘導阻害物
質（24mU）； レーン２、ウシ内皮細胞に由来するピークＩ誘導阻害物
質（MI）（50mU）； レーン３、大腸菌から製造したヒトMI（実施例５、92m
U）； レーン４、大腸菌から製造したヒトMI（実施例５、420m
U）； レーン５及び６、バッファのみのレーン。

レーン１〜４の暗域の存在から、大腸菌で産生した組
換体を含む前述の総ての阻害物質調製物は、この方法に
よって判定される阻害活性を有する予想通りの分子量の
タンパク質を有することが明らかである。

プロテイナーゼを試料とするSDS−ゼラチンPAGE方法
（実施例１、セクション4c）を大腸菌産生組換ヒトMIの
分析にも使用した（第14図）。第14図では、「対照」と
いう印のあるレーンが阻害物質を加えずに一晩インキュ
ベートしたものであり、「EDTA」という印のあるレーン
が20mM EDTAを存在させてインキュベートしたものであ
り、「rMI」という印のあるレーンが大腸菌産生ヒトMI
（実施例４の調製物、423mU/ml）と共にインキュベート
したものである。一晩のインキュベーションに先立って
電気泳動した試料は、レーン１、ヒトプラスミン、50μ
g;レーン２、ウシトリプシン、0.3μg;レーン３、転移
性腫瘍細胞に由来する100倍に濃縮し且つAPMA活性化し
たならし培地［IV型コラゲナーゼ源としてのｃ−Ha−ra
s−トランスフェクションラット胚線維芽細胞;Canc.Re
s.47,1523−1528（1987）に記載のGarbisaらの方法で製
造したならし培地］、５μl;レーン４、TPA処理したウ
サギ滑膜線維芽細胞に由来するAPMA活性化ならし培地
（4mUのコラゲナーゼＩ活性を載置した、実施例１、セ
クション２参照）。組換MIは明らかにＩ型及びIV型コラ
ゲナーゼを阻害するが、プラスミド及びトリプシン（こ
れらはメタロプロテイナーゼではない）は阻害しない。
EDTAも予想通りコラゲナーゼを阻害する。

大腸菌で産生した組換ヒトMIは哺乳動物コラゲナーゼ
の特徴である特異的コラーゲン開裂も阻害する（実施例
１及び第７図参照）。これを立証する実験を、本質的に
実施例１、第７図に示した方法に従い、インキュベーシ
ョンで組換ヒトMI（実施例５）を約２μg/ml用いて行っ
た。結果は、内皮細胞に由来するウシMIについて第７図
に示したものと同じであった。

CHO細胞で産生したヒトMIは約1537 U/mlの阻害活性を
有していた（比活性は実施例１、セクション２で説明し
たＩ型コラゲナーゼ阻害アッセイで測定して約1067U/ml
であった）。この比活性及び以下に説明する他のアッセ
イでの比活性は、CHO細胞由来の組換ヒトMIの方が大腸
菌由来の組換ヒトMIより大きい。この差は、大腸菌誘導
調製物のポリペプチド鎖の一部分が天然コンフォーメー
ションになく、不正確なジスルフィド結合も有し得ると
いう事実に起因すると考えられる。また、当業者は、大
腸菌誘導ヒトMIがCHO細胞誘導ヒトMIに比肩し得る比活
性を有するように大腸菌誘導ヒトMIの可溶化、折たた
み、酸化（ジスルフィド結合形成）及び精製を行う方法
を開発し得ると考えられる。

CHO細胞からの組換ヒトMIはまた、SDS−ゼラチンPAGE
及び哺乳動物コラゲナーゼに特徴的な特異的コラーゲン
開裂の阻害によって判定される阻害活性も有していた。
いずれの場合も、得られた結果は大腸菌からの組換ヒト
MIについて先に述べた結果と類似していた。

2.転移性細胞によって分泌されるメタロプロテイナーゼ
の阻害 転移性の極めて高いｃ−Ha−rasトランスフェクショ
ンラット胚細胞（4R）［Pozzattiら、Science 243,947
−950（1986）］に由来する無血清ならし培地をメタロ
プロテイナーゼ源として使用した。第15図に示した実験
は、CHO細胞からの組換ヒトMIが4R細胞によって分泌さ
れるメタロプロテイナーゼによるＩ型及びIV型コラーゲ
ンの分解を完全に阻害することを立証するものである。
第15図の説明は下記の通りである。ペニシリン（100U/m
l）及びストレプトマイシン（100μg/ml）を含むMEMで4
R細胞を増殖させた。24時間のインキュベーションの後
で前記培地を回収し、YM10膜を有するAmicon撹拌セルを
用いて100倍濃縮し、APMA（1mM、37℃、30分）で処理し
てメタロプロテイナーゼを活性化した。次いで、¹⁴C標
識したラット皮膚Ｉ型コラーゲン［6,000cpm/ウェル
（比放射能300cpm/μｇ）；ウェル当たりの添加培地量5
0μl;第15図Ａ］又は¹⁴C標識したIV型コラーゲン［2,10
0cpm/ウェル（比放射能30,000cpm/μｇ）；ウェル当た
りの添加培地量100μl;第15図Ｂ］でコーティングした
ミクロタイターウェルに、組換ヒトMIを増量的に存在さ
せながら、前記活性化培地のアリコートを加えた。イン
キュベーションは50mMトリス−HCl、200mM NaCl、10mM
CaCl₂、pH7.5、及び10mM N−エチルマレイミド＋2mM PM
SFを含む総量200μｌで、37℃で３時間（IV型コラーゲ
ン）又は16時間（IV型コラーゲン）行った。上清に放出
れた放射能を測定し、結果を阻害物質が存在しない場合
の放出放射能に対する％（阻害％）で表した。

3.大腸菌誘導組換ヒトMI（表９）及びCHO細胞誘導組換
ヒトMI（表10）はどちらも、腫瘍細胞の存在下で起こる
Ｉ型コラーゲンの分解を阻害した。腫瘍細胞としてはｃ
−Ha−rasトランスフェクションラット胚線維芽細胞（4
R細胞）を使用した。この細胞は大量のメタロプロテイ
ナーゼを分泌し且つコラーゲン及び結合組織を盛んに分
解するからである（Alvarezら、J.National Cancer Ins
t.,in Press,1990）。

腫瘍細胞は、10％（v/v）FBS（血清プロテイナーゼ阻害
物質を不活性化すべく酸処理したもの）とペニシリン
（100U/ml）とストレプトマイシン（100μg/ml）とを加
えたイーグル最少必須培地200μｌの存在下で、¹⁴C標識
したラット皮膚Ｉ型コラーゲン（15,000cpm/ウェル；比
放射能300cpm/μｇ）上に10⁵／ミクロタイターウェルで
プレートされた。

37℃で24時間後にＩ型コラーゲンの分解を上清に放出
された放射能の測定によって調べた。μg/24時の値は３
つのウェルの平均値±標準偏差を表す。

実験の詳細は表９と同じである。

4.大腸菌誘導組換ヒトMI（表11;第16図）及びCHO細胞誘
導組換ヒトMI（表12;第17図）はどちらも、腫瘍細胞の
存在下で起こるラット平滑筋細胞によって沈着される結
合組織マトリクスの分解を阻害した。この場合も4R細胞
を使用した。前記マトリクスは糖タンパク質とＩ型及び
III型コラーゲンとを高度に架橋した天然の形態で含む
［Jones及びDe Clerck,Cancer Res.40,3220−3227（198
0）］。

培養ラット平滑筋細胞によって形成される［³H］プロリ
ン標識マトリクスを説明のように調製した（前出のJone
s及びDe Clerck,Cancer Res.）。これらのマトリクスは
［³H］プロリンを糖タンパク質形態で15％、Ｉ型及びII
I型コラーゲン形態で85％含んでいた。4R細胞を、表９
で説明した培地を2ml入れた35mm皿当たり２×10⁵細胞の
割合でマトリクス上にプレートした。培地はMIを指示濃
度で含む新しい培地と毎日取り替えた。マトリクスの分
解は上清に放出された放射能の測定によって調べた。cp
m/皿で示した結果は、６日後に４つの皿について調べた
累積［³H］プロリン放出（無細胞のバックグラウンドに
関する前記放出）の平均値である。

第16図は表11で説明した実験の累積分解を一日毎に示
している。第16図では符号がMI濃度に下記のように対応
する :o,0μg/ml;o,0.1μg/ml;1μg/ml;,10μg/ml;,25μg/m
l。

実験の詳細は表11と同じである。この実験では、阻害物
質の存在が細胞の増殖に全く影響しないことが判明し
た。これは、トリプシン処理してから６日目に存在する
細胞の数を計数することによって調べた（６日目の細胞
数の欄参照）。

第17図は表12で説明した実験に関する累積分解を一日
毎に示している。第17図では符号が使用MI濃度に下記の
ように対応する:o,0μg/ml;o,0.05μg/ml;,0.5μg/ml;,
5μg/ml;,5μg/ml;,5μg/ml（但し４日目及び５日目に
のにみ添加）。

5.腫瘍細胞の増殖及び接着に対する組換ヒトMIの作用 前記セクション３及び４の結果を説明すべく、腫瘍細
胞の増殖又は接着に対するMIの作用を下記の実験によっ
て更に調べる。10％（v/v）FBSを加えたMEM 2ml中に35m
m皿当たり10⁴個の割合で4R細胞をプレートした。大腸菌
誘導組換ヒトMIを培養物に毎日加えた。トリプシン処理
（trypsinization）とCoulter計数器での計算とによっ
て細胞の数を測定した。結果を第18図Ａに示す。この図
では「細胞／皿」の値が２つの皿の平均値±標準偏差を
表し、符号が種々の使用MI濃度を表す（o,0μg/ml;o,1
μg/ml;,10μg/ml）。MIは明らかに腫瘍細胞の増殖には
影響しなかった。

この実験では、CHO細胞誘導ヒト組換MIが再構築基底
膜調製物［Matrigel^TM（Collaborative Research,Bedfo
rd,MA）］への4R細胞の接着を阻害しないことも判明し
た。ミクロタイターウェルを50μｇのMatrigelでコーテ
ィングし、0.1％（w/v）BSAとペニシリン（100U/ml）と
ストレプトマイシン（100μg/ml）とを加えた200μｌの
MEM中にウェル当たり50,000個の細胞を加えた。指定の
時点（第18図Ｂ）で非接着細胞を穏やかなピペッティン
グ/PBSでの洗浄で除去し、計数した。残った接着細胞を
トリプシン処理により除去し、計数した。「接着細胞
％」（第18図）の値は総細胞数に対する接着細胞の％で
あり、３つのウェルの平均値±標準偏差を表す。符号は
MI（ｏ）の不在及び10μg/ml（ｏ）でのMIの存在を表
す。

6.腫瘍細胞による平滑筋細胞層への侵入の阻止 この作業はJonseらの方法［Cancer Res.41,4613−462
0（1981）］に従って行った。ラット平滑筋細胞（R22ク
ローンＦ）を35mm皿（培地量2ml）当たり2x10⁵細胞でプ
レートし、毎日アスコルビン酸（50μg/ml）を加えなが
ら２週間増殖させた。次いで、4R細胞を加え（2x10⁵細
胞／皿）、10％（w/v）FBS（酸処理したもの）を加えた
MEMの存在下で平滑筋細胞と共に培養した。共培養の21
日後の培養物を0.15M NaClで洗浄し、その場でpH7.3の
0.1Mリン酸塩バッファ中２％（w/v）のグルタルアルデ
ヒドにより固定した。固定された培養物を複数の段階的
エタノール洗浄によって脱水し、Epon:Araldite（50:5
0）中に埋め込んだ。厚い切片を表面と直角に切断し、
トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で調べた。結果
を第19図に示す。この図では、Ａが前記平滑筋細胞を表
し、Ｂが平滑筋細胞＋4R細胞を表し、ＣがＢにCHO細胞
誘導組換ヒトMIを10μg/mlの濃度で２日毎に加えたもの
を表す。Ｂでは腫瘍細胞（矢印）が平滑筋細胞層の両側
に存在しているが、Ｃでは平滑筋細胞層の上部にしか存
在していない。従って、MIが腫瘍細胞による平滑筋細胞
層への侵入を阻止するのは明白である。

この実施例のセクション１〜６のデータ、並びに大腸
菌産生ヒトMIに対するポリクローナル抗体を用いてウシ
MI、酵母発現組換ヒトMI及びCHO細胞発現組換ヒトMIに
ついて行ったSDS−PAGE及びイムノブロット分析から、
実施例３で説明した単離／クローン化ウシ及びヒト遺伝
子がMIの遺伝子を表すことは明白である。

実施例12 in vivoマウスモデルにおける組換ヒトMIによる転移の
阻止 B16マウス黒色腫瘍細胞［Fidler,Nature 242,148−14
9（1973）］を注射した後で肺への転移を起こしたマウ
スモデルを使用した。B16細胞（クローンF10）はDr.J.F
idler（Houston,Texas）から入手し、先ずC57BL6マウス
で皮下増殖させ、腫瘍一次性小結節からin vitro培養し
た。in vitro第２継代後の細胞を冷凍ストックとして貯
蔵した。冷凍ストックの細胞を、ピルビン酸ナトリウム
（1mM）、非必須アミノ酸（0.1mM）、Ｌ−グルタミン
（1mM）、ペニシリン（200U/ml）、ストレプトマイシン
（200μg/ml）、MEMビタミン溶液（１％、v/v）及び10
％（v/v）FBSを加えたMEM中で２日間培養した。集密に
近い状態の（subconfluent）培養物を短時間（１〜２
分）トリプシン処理し、血清含有培地中に集め、PBS中
に最終濃度5x10⁵細胞/mlで懸濁させた。トリパンブルー
排除によって調べた細胞生存率は97％であった。

モデルに使用した動物はJackson Laboratories（Main
e）から入手したC57BL6 Jマウスであり、実験を開始す
る前に動物施設で１週間観察した。MI処理動物（９）に
はCHO細胞誘導組換ヒトMI（実施例10の方法で製造した
もの、滅菌PBS中4.45mg/ml）を腹腔内に注射した（注射
１回当たり0.25ml＝1.1mg/注射）。対照動物には0.25ml
の滅菌PBSを注射した。注射は腫瘍細胞を注射する13時
間及び１時間前（７匹の動物）又は腫瘍細胞の注射と同
時（２匹の動物）に行った。次いで総ての動物に、MI注
射（処理動物）又はビヒクル注射（対照動物）を12時間
間隔で、腫瘍細胞注射後合計5.5日にわたって行った。
各マウスの尾の側方静脈にB16黒色腫細胞を注射した
（0.25ml中1.25x10⁵個の細胞）。総ての注射をMI処理動
物と対照動物との間で交互に行った。腫瘍細胞を注射し
てから２週間後にCO₂安楽死で動物を殺し、肺を検査し
てBouin溶液注射後の表面腫瘍コロニーの存在を調べ
た。各肺を５つの別個のローブに切り分け、各ローブ上
のコロニーを解剖用顕微鏡で数えた。結果を表13に示
す。

表13の結果は、MI処理によって肺腫瘍小結節の発生が
実質的に大幅に減少する（Wilcoxonランクサムテスト
（ranksum test）で0.01＜ｐ＜0.05）ことを示してい
る。

実施例13 組換ヒトメタロプロテイナーゼ阻害物質の造血活性 組換ヒトMIの赤血球増強活性を、BFU−Ｅ（burst fro
ming units−erythroid）のワンステップin vitroアッ
セイ［Dukesら,Experimental Hematology 13,59−66（1
985）］によって立証した。正常ボランティアドナーか
ら末梢血を入手し、ヘパリン処理した。400xgで30分間F
icoll−Hypaque（Pharmacia）で遠心分離することによ
り単核細胞を除去した。ダルベッコ培地をIscoveに従っ
て改質した培地、即ち0.8％（w/v）のメチルセルロース
と30％（v/v）のウシ胎児血清と1.27U/mlのエリスロポ
エチン（AM−EPO、PCグレード組換体、AmgenInc.）とを
含む培地中で細胞を35mm皿当たり4.1x10⁵個で培養し
た。細胞をプレーティングする前に、組換ヒトMI（CHO
細胞から誘導したもの、実施例10に従って調製）を指定
濃度（表14）で加えた。95％の空気と５％のCO₂とを含
む湿潤雰囲気中37℃で10日間インキュベートした後、３
つ以上の赤血球サブコロニー又は単一の赤血球蓄積物
（細胞数＞300）からなるコロニーをBFU誘導コロニーと
して計数した。各BFU−Ｅ測定毎に、５つの同一条件下
の皿の容量の20％にあたる中心部におけるコロニーを計
数した。結果を表14に示す。

この活性は該アッセイにおけるMI濃度が≧1nMの場合に
明らかである。

以上、本発明を好ましい実施例に基づいて説明してき
たが、本発明はこれらの実施例には限定されず様々な変
形が可能である。以下の請求の範囲によって規定される
本発明の範囲にはこれらの変形も含まれると理解された
い

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/99 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9/99 Ｐ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＵ Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＢＧ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ラングレー，キース・イー. アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 91320、ニユーベリー・パーク、ダンバ ーズ・サークル・714 (72)発明者 デクラーク，イブ・エイ. アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 90039、ロサンジエルス、ウエイバリ ー・ドライブ・2919 (72)発明者 ボーン，トーマス・シー. アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 91320、ニユーベリー・パーク、エルク ウツド・3913 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ 318（1985）ｐ．66− 69 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．261［９ ］（1986）ｐ．4154−4159 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．48（1988) ｐ．5539−5545 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (33)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】天然のメタロプロテイナーゼ阻害物質の生
   物学的特性と、第２図に示されるヒトメタロプロテイナ
   ーゼ阻害物質の一次構造コンフォーメーションのアミノ
   酸１−42を有する精製単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】ポリペプチドが外因性DNA配列の原核生物
   発現又は真核生物発現の産物である請求項１に記載のポ
   リペプチド。
3. 【請求項３】いかなる哺乳動物タンパク質とも結合して
   いないという特徴も有する請求項１に記載のポリペプチ
   ド。
4. 【請求項４】外因性DNA配列がcDNA配列である請求項２
   に記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】外因性DNA配列がゲノムDNA配列である請求
   項２に記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】外因性DNA配列が自律的に複製するDNAプラ
   スミド又はウイルスベクターに担持されている請求項２
   に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】天然のメタロプロテイナーゼ阻害物質の免
   疫学的活性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
8. 【請求項８】天然のメタロプロテイナーゼ阻害物質のin
   vitro生物学的活性を有する請求項１に記載のポリペプ
   チド。
9. 【請求項９】検出可能な標識物質と共有結合するという
   特徴も有する請求項１に記載のポリペプチド。
10. 【請求項１０】請求項１のメタロプロテイナーゼ阻害物
    質の一次構造コンフォーメーション及び生物学的特性を
    有するポリペプチドの原核又は真核宿主発現をコードす
    る精製単離されたDNA配列。
11. 【請求項１１】請求項10に記載のcDNA配列。
12. 【請求項１２】請求項10に記載のゲノムDNA配列。
13. 【請求項１３】DNA配列がヒトメタロプロテイナーゼ阻
    害物質をコードする請求項10に記載のDNA配列。
14. 【請求項１４】大腸菌細胞中での発現にとって好ましい
    １つ以上のコドンを含む請求項13に記載のDNA配列
15. 【請求項１５】第２図に示される配列を有する請求項10
    に記載のDNA配列。
16. 【請求項１６】酵母細胞中での発現にとって好ましい１
    つ以上のコドンを含む請求項10に記載のDNA配列。
17. 【請求項１７】検出可能な標識物質と共有結合する請求
    項10ないし16のいずれかに記載のDNA配列。
18. 【請求項１８】メチオニルメタロプロテイナーゼ阻害物
    質をコードする請求項10に記載のDNA配列。
19. 【請求項１９】請求項10ないし18のいずれかに記載のDN
    A配列を含む生物学的に機能するプラスミド又はウイル
    スDNAベクター。
20. 【請求項２０】請求項19に記載のDNAベクターで安定的
    に形質転換又はトランスフェクションした原核又は真核
    宿主細胞。
21. 【請求項２１】請求項10ないし18のいずれかに記載のDN
    A配列が原核又は真核宿主細胞において発現されたポリ
    ペプチド産物。
22. 【請求項２２】天然のメタロプロテイナーゼ阻害物質の
    一次構造コンフォメーションの一部分又は全部と生物学
    的特性の１つ又は複数とを有するポリペプチドの製造方
    法であって、請求項19に記載のDNAベクターで形質転換
    又はトランスフェクションした原核又は真核宿主細胞を
    適当な栄養条件下で増殖させ、前記ベクター内でのDNA
    配列発現の所望のポリペプチド産物を単離することを含
    む方法。
23. 【請求項２３】いかなるヒトタンパク質とも結合してい
    ないグリコシル化又は非グリコシル化形態の、請求項１
    ないし８のいずれかに記載の又は請求項22に記載の方法
    により産生される精製単離されたヒトメタロプロテイナ
    ーゼ阻害物質。
24. 【請求項２４】請求項１ないし８のいずれかに記載の又
    は請求項22に記載の方法により産生されるポリペプチド
    の有効量と、医薬的に許容し得る希釈剤、アジュバント
    又はキャリヤートを含む結合組織分解による疾患の治療
    のための医薬組成物。
25. 【請求項２５】哺乳動物体内における腫瘍細胞の広がり
    を阻害する医薬であって、請求項１に記載のポリペプチ
    ドの有効量を活性成分として有する医薬。
26. 【請求項２６】哺乳動物の慢性関節リウマチを治療する
    医薬であって、請求項１に記載のポリペプチドの有効量
    を活性成分として有する医薬。
27. 【請求項２７】ａ）［Met−１］メタロプロテイナーゼ
    阻害物質、及び ｂ）１つ以上のシステインがアラニン又はセリンで置換
    されているメタロプロテイナーゼ阻害物質 の中から選択される請求項１に記載のヒトメタロプロテ
    イナーゼ阻害物質の類縁体をコードするDNA配列。
28. 【請求項２８】請求項27に記載のDNA配列の原核又は真
    核宿主細胞中において発現されるポリペプチド産物。
29. 【請求項２９】請求項１ないし８のいずれかに記載の又
    は請求項22に記載の方法で産生され、メタロプロテイナ
    ーゼ阻害物質0.5mg当たり0.5ng以下の発熱物質を含む純
    度95％以上のメタロプロテイナーゼ阻害物質の結合組織
    分解による疾患の治療のための製剤。
30. 【請求項３０】請求項１に記載のメタロプロテイナーゼ
    阻害物質と特異的に結合する抗体。
31. 【請求項３１】モノクローナル抗体である請求項30に記
    載の抗体。
32. 【請求項３２】請求項２に記載の組換えメタロプロテイ
    ナーゼ阻害物質を含む、腫瘍細胞の広がりを阻止するた
    めの組成物。
33. 【請求項３３】請求項２に記載の組換えメタロプロテイ
    ナーゼ阻害物質を含む、慢性関節リウマチを治療するた
    めの組成物。