MXPA04009681A - Anticuerpos humanos neutralizantes anti-ligando de osteoprotegerina como inhibidores selectivos de la ruta del ligando de osteoprotegerina. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos monoclonales e hibridomas que los producen que interactuan con el ligando de osteoprotegerina (OPGL). Tambien se proporcionan metodos para tratar los trastornos osteopenicos al administrar una cantidad farmaceuticamente efectiva de anticuerpos a OPGL. Se proporcionan ademas metodos para detectar la cantidad de OPGL, en una muestra usando anticuerpos a OPGL.

Description

ANTICUERPOS HUMANOS NEUTRALIZANTES ANTI-LIGANDO DE OSTEOPROTEGERINA COMO INHIBIDORES SELECTIVOS DE LA RUTA DEL LIGANDO DE OSTEOPROTEGERINA Campo de la Invención Esta invención se refiere a anticuerpos que se unen al ligando de osteoprotegerina (OPGL) . También se proporcionan composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades óseas, tal como osteoporosis , pérdida ósea a partir de artritis, enfermedad de Paget y osteopenia.

Antecedentes de la Invención El tejido óseo vivo exhibe un equilibrio dinámico entre la formación del hueso, conocida como depósito, y el colapso del hueso, conocido como resorción. Estos procesos se pueden mediar por al menos dos tipos de células: los osteoblastos, que segregan moléculas que comprenden la matriz orgánica del hueso (depósito) ; y los osteoclastos , que promueven la disolución de la matriz ósea y la solubilización de las sales óseas (resorción) . En ciertos individuos, tal como mujeres post-menopáusicas, la velocidad de resorción puede exceder a la velocidad de depósito, lo que puede dar por resultado una masa ósea reducida y una resistencia ósea reducida, un riesgo incrementado de fracturas y lenta o incompleta reparación de REF: 159170 los huesos rotos. El ligando de osteoprotegerina (OPGL) es un miembro de la familia de TNF de las citosinas y promueve la formación de osteoclastos a través de la unión al activador del receptor de NF-kB (RAN , también llamado receptor de diferenciación y activación de osteoclastos, o ODAR) . La osteoprotegerina (OPG) , por otra parte, inhibe la formación de osteoclastos al secuestrar OPGL y al impedir la asociación de OPGL con ODAR. De esta manera, la cantidad de OPGL asociada con ODAR correlaciona con el equilibrio entre el depósito y resorción del hueso. Los individuos quienes sufren de enfermedades osteopénicas , tal como osteoporosis, muestran una mayor velocidad de resorción de hueso que de depósito, lo que puede resultar de niveles incrementados o actividad incrementada de OPGL. De esta manera, sería útil tener moléculas que regulen la actividad de OPGL en la osteoclastogénesis . También sería útil ser capaces de detectar la cantidad de OPGL en una muestra biológica, tal como una muestra sanguínea, para diagnosticar un trastorno osteopénico que se relacione a los altos niveles de OPGL.

Breve Descripción de la Invención La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen al ligando de osteoprotegerina (OPGL) . De manera preferente, los anticuerpos inhiben la unión de OPGL a un receptor de diferenciación y activación de osteoclastos (ODAR) . También se proporciona por esta invención líneas de células de hibridoma que producen, y de manera más preferente que segregan en el medio de cultivo de tejido, los anticuerpos monoclonales de la invención. Los anticuerpos de la invención son útiles para tratar varios trastornos asociados con baja densidad ósea. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, de manera preferente anticuerpos monoclonales, de manera más preferente anticuerpos humanos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región constante de cadena pesada de IgGi, IgG2 o IgG4. De manera preferente, un anticuerpo de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena pesada de IgGx como se expone en SEQ ID No. : 2 o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. La invención también proporciona anticuerpos, de manera preferente anticuerpos monoclonales, de manera más preferente, anticuerpos humanos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No . : 4 o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.

La invención se refiere de forma específica a anticuerpos humanos, de manera preferente anticuerpos monoclonales que tienen de manera específica a la región de asa de D-E del OPGL. La invención también se refiere a anticuerpos humanos, de manera preferente a anticuerpos monoclonales, que se unen a una región de ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E. Además, la invención se refiere a anticuerpos humanos, de manera preferente anticuerpos monoclonales, que se unen tanto a una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E. En un aspecto, los anticuerpos de la invención se unen a una primera región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y entonces, cuando permanece unido a la primer región, se une una segunda región que es toda o una porción de la región de asa de D-E. Esta unión se refiere en la presente como consecutiva. En otro aspecto, los anticuerpos de la invención pueden unirse a una primera región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y una segunda región que es toda una porción de la región de asa de D-E al mismo tiempo. Esta unión se refiere en la presente como simultánea. En ciertos aspectos, los anticuerpos de la invención comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 22, o SEQ ID No.: 26, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas. En otros aspectos, la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 24, o SEQ ID No.: 28, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas. En otros aspectos, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No. : 30, SEQ ID No.: 38, SEQ ID No.: 46 o SEQ ID No.: 50, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas. En aún aspectos adicionales, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No. : 32, SEQ ID No.: 40, SEQ ID No.: 48 o SEQ ID No . : 52, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional . La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID No.: 6 o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 8, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, (a) en donde la cadena pesada comprende una primera región variable, y en donde la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 6, y (b) en donde la cadena ligera comprende una segunda región variable, y en donde la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 8 y (c) en donde el anticuerpo interactúa con OPGL. En otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 6, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 8. En aún otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 6, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 8. La invención proporciona además anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID No . : 14 , o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No.: 16, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, (a) en donde la cadena pesada comprende una primera región variable, y en donde la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 14, y (b) en donde la cadena ligera comprende una segunda región variable, y en donde la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 16, y (c) en donde el anticuerpo interactua con OPGL. En otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 14, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 16. En aspectos adicionales, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 14, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 16. La invención proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID No. : 22, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 24, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, (a) en donde la cadena pesada comprende una primera región variable, en donde la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 22, y (b) en donde la cadena ligera comprende una segunda región variable, y en donde la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 24, y (c) en donde el anticuerpo interactúa con OPGL. En aspectos particulares, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 22, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 24. En aspectos adicionales, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 22, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 24. Además, la invención proporciona anticuerpos que sirven de manera específica a la región de asa de D-E del OPGL, en donde la cadena pesada comprende la región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID No. : 26, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 28, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina y inmunologicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, (a) en donde la cadena pesada comprende una primera región variable, en donde la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 26, y (b) en donde la cadena ligera comprende una segunda región variable, y en donde la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 28, y (c) en donde el anticuerpo interactúa con OPGL. En otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 26, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 28. En aspectos adicionales, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 26, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 28. La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 30, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 32, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma. La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 38, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 40, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional del mismo. La invención proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 46, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No.: 48, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma . La invención proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 50, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 52, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, y comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 10 o SEQ ID No. : 18, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. En otros aspectos, la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 12 o SEQ ID No. : 20, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 34 o SEQ ID No . : 42, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma. En otros aspectos, la región variable de cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No.: 36 o SEQ ID No. : 44, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma. La invención también proporciona además anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID No. : o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 12, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, (a) en donde la cadena pesada comprende una primera región variable, y en donde la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 10, y (b) en donde la cadena ligera comprende una segunda región variable, y en donde la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 12, y (c) en donde el anticuerpo interactúa como OPGL. En aspectos adicionales, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 10, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 12. En otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 10, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 12. La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID No. : 18, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglob lina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 20, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. En ciertos aspectos, la invención proporciona anticuerpos, que comprenden una cadena pesada y una cadena ligera, (a) en donde la cadena pesada comprende una primera región variable, y en donde la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No. : 18, y (b) en donde la cadena ligera comprende una segunda región variable, y en donde la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 20, y (c) en donde el anticuerpo interactúa con OPGL. En otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 18, la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 20. En aún otros aspectos, la primera región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 18, y la segunda región variable comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID No.: 20. La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 34, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No.: 36 o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma . La invención también proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No . : 42, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID No. : 44, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma . La invención también proporciona anticuerpos Fv de cadena única, anticuerpos Fab, anticuerpos Fab' , y (Fab')2- En aspectos particulares, la invención proporciona una cadena pesada que comprende una región variable y una región constante, en donde la región variable comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No. : 22, SEQ ID No . : 26, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de las mismas. Además, la invención también proporciona una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No. : 30, SEQ ID No. : 34, SEQ ID No.: 38, SEQ ID No.: 42, SEQ ID No.: 46, o SEQ ID No. : 50, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de las mismas. En ciertos aspectos, la invención proporciona una cadena ligera que comprende una región variable y una región constante, en donde la región variable comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 24, o SEQ ID No . : 28, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de las mismas. En otros aspectos, la invención proporciona una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID No.: 32, SEQ ID No.: 36, SEQ ID No.: 40, SEQ ID No.: 44, SEQ ID No.: 48, o SEQ ID No.: 52, o un fragmento inmunoglobulina de unión a antígeno o inmunológicamente funcional de las mismas. La invención también se refiere a anticuerpos humanos aislados que se unen de manera específica a OPGL, en donde el anticuerpo comprende: (a) regiones de marco de cadena pesada, humanas; una región CDR1 de cadena pesada humana, una región CDR2 de cadena pesada humana, y una región CDR3 de cadena pesada humana, y (b) regiones de marco de cadena ligera, humanas; una región CDR1 de cadena ligera humana, una región CDR2 de cadena ligera humana, y una región CDR3 de cadena ligera humana. En ciertos aspectos, la región CDR1 de cadena pesada humana puede ser la región CDR1 de cadena pesada de 16E1, 2D8, 22B3, o 9H7 como se muestra en la Figura 15 y la región CDR1 de cadena ligera humana puede ser la región CDR1 de cadena ligera de 16E1, 2D8, 22B3 o 9H7 como se muestra en la Figura 16. En otros aspectos, la región CDR2 de cadena pesada humana puede ser la región CDR2 de cadena pesada de 16E1, 2D8, 22B3, o 9H7 como se muestra en la Figura 15 y la región CDR2 de cadena ligera humana puede ser la región CDR2 de cadena ligera de 16E1, 2D8, 22B3, o 9H7 como se muestra en la Figura 16. En aún otros aspectos, la región CDR3 de cadena pesada humana es la región CDR3 de cadena pesada de 16E1, 2D8, 22B3, o 9H7 como se muestra en la Figura 15, y la región CDR3 de cadena ligera humana es la región CDR3 de cadena ligera de 16E1, 2D8, 22B3, o 9H7 como se muestra en la Figura 16. La invención también se refiere a anticuerpos humanos aislados que se unen de manera específica a OPGL, en donde el anticuerpo comprende: (a) regiones de marco de cadena pesada, humanas; una región CDRl de cadena pesada • humana, o una región CDR2 de cadena pesada humana, una región CDR3 de cadena pesada humana; y (b) regiones de marco de cadena ligera humanas; una región CDRl de cadena ligera humana, una región CDR2 de cadena ligera humana, y una región CDR3 de cadena ligera humana. En ciertos aspectos, la región CDRl de cadena pesada humana puede ser la región CDRl de cadena pesada de 2E11 o 18B2 como se muestra en la Figura 15 y la región CDRl de cadena ligera humana puede ser la región CDRl de cadena ligera de 2E11 o 18B2 como se muestra en la Figura 16. En otros aspectos, la región CDR2 de cadena pesada humaná puede ser la región CDR2 de cadena pesada de 2E11 o 18B2 como se muestra en la Figura 15 y la región CDR2 de cadena ligera humana puede ser la región CDR2 de cadena ligera de 2E11 o 18B2 como se muestra en la Figura 16. En aún otros aspectos, la región CDR3 de cadena pesada humana es la región CDR3 de cadena pesada de 2E11 o 18B2 como se muestra en la Figura 15, y la región CDR3 de cadena ligera humana es la región CDR3 de cadena ligera de 2E11 o 18B2 como se muestra en la Figura 16.

Además, la invención proporciona métodos para tratar un trastorno osteopénico, que comprende el paso de administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo monoclonal de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo a un individuo en necesidad del mismo. La invención se refiere adicionalmente a proteínas de fusión y a otras moléculas capaces de la unión a una región del ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E, o tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E, en donde la unión es consecutiva o simultánea (junto con los anticuerpos mencionados anteriormente, referidos colectivamente en la presente como "compañeros de unión específicos"), tal como se puede preparar usando los métodos como se describe, por ejemplo, en la WO 00/24782, que se incorpora por referencia. Estas moléculas se pueden expresar, por ejemplo, en células de mamífero (por ejemplo, células de ovario de hámster chino) , en células bacterianas (por ejemplo, células de E. coli) . La invención también proporciona métodos para detectar el nivel de OPGL en una muestra biológica, que comprende el paso de poner en contacto la muestra con un anticuerpo monoclonal de la invención o fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos anti-OPGL de la invención se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de intercalación directa o indirecta, ensayos de inmunoprecipitación y ensayos inmunosorbentes enlazados a enzimas (ELISA) (Ver, Sola, 1987, Monoclonal antibodies: A Manual of Techniques, p . 147-158, CRC Press, Inc.) para la detección y cuantificación de OPGL. Los anticuerpos pueden unirse a OPGL con una afinidad que es apropiada para el método del ensayo que se emplea. Las modalidades preferidas, específicas de la presente invención, llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción más detallada de ciertas modalidades preferidas y las reivindicaciones.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1B representan una secuencia de ADNc (Figura 1A) que codifica para la región constante de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL (SEQ ID No.: 1) y la secuencia de aminoácidos (Figura IB) de la región constante de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL (SEQ ID No. : 2) . Las Figuras 2A-2B representan una secuencia de ADNc (Figura 2A) que codifica para la región constante de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL (SEQ ID No.: 3) y la secuencia de aminoácidos (Figura 2B) de la región constante de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL (SEQ ID No. : 4) . Las Figuras 3A-3B representan una secuencia de ADNc (Figura 3A) que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 22B3 (SEQ ID No. : 5) y la secuencia de aminoácidos (Figura 3B) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 22B3 (SEQ ID No. : 6) . Las Figuras 4A-4B representan una secuencia de ADNc (Figura 4A) que codifica para la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 22B3 (SEQ ID No.: 7) y la secuencia de aminoácidos (Figura 4B) de la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 22B3 (SEQ ID No. : 8) . Las Figuras 5A-5B representan una secuencia de ADNc (Figura 5A) que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 2E11 (SEQ ID No.: 9) y la secuencia de aminoácidos (Figura 5B) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 2E11 (SEQ ID No. : 10) . Las Figuras 6A-6B representan una secuencia de ADNc (Figura 6A) que codifica para la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 2E11 (SEQ ID No. : 11) y la secuencia de aminoácidos (Figura 6B) de la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 2E11 (SEQ ID No. : 12) . Las Figuras 7A-7B representan una secuencia de ADNc (Figura 7A) que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 2D8 (SEQ ID No. : 13) y la secuencia de aminoácidos (Figura 7B) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 2D8 (SEQ ID No. : 14) . Las Figuras 8A-8B representan una secuencia de ADNc (Figura 8A) que codifica para la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 2D8 (SEQ ID No.: 15) y la secuencia de aminoácidos (Figura 8B) de la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 2D8 (SEQ ID No. : 16) . Las Figuras 9A-9B representan una secuencia de ADNc (Figura 9A) que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 18B2 (SEQ ID No. : 17) y la secuencia de aminoácidos (Figura 9B) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 18B2 (SEQ ID No. : 18) . Las Figuras 10A-10B representan una secuencia de ADNc (Figura 10A) que codifica para la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 18B2 (SEQ ID Ño. : 19) y la secuencia de aminoácidos (Figura 10B) de la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 18B2 (SEQ ID No. : 20) . Las Figuras 11A-11B representan una secuencia de ADNc (Figura 11A) que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 16E1 (SEQ ID No. : 21) y la secuencia de aminoácidos (Figura 11B) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 16E1 (SEQ ID No. : 22) . Las Figuras 12A-12B representan una secuencia de ADNc (Figura 12A) que codifica para la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 16E1 (SEQ ID No.: 23) y la secuencia de aminoácidos (Figura 12B) de la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 16E1 (SEQ ID NO. : 24) . Las Figuras 13A-13B representan una secuencia de ADNc (Figura 13A) que codifica para la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 9H7 (SEQ ID No . : 25) y la secuencia de aminoácidos (Figura 13B) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL 9H7 (SEQ ID No. : 26) . Las Figuras 14A-14B representan una secuencia de ADNc (Figura 14A) que codifica para la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 9H7 (SEQ ID No.: 27) y la secuencia de aminoácidos (Figura 14B) de la región variable de cadena kappa del anticuerpo anti-OPGL 9H7 (SEQ ID NO. : 28) . La Figura 15 representa la alineación de cadena pesada de los anticuerpos anti-OPGL designados 16E1, 2E11, 18B2, 2D8, 22B3 y 9H7. Los CDR están subrayados, y los aminoácidos sin consenso están sombreados y en negritas.

La Figura 16 representa la alineación de cadena ligera de los anticuerpos anti-OPGL designados 16E1, 2E11, 18B2, 2D8, 22B3 y 9H7 los CDR están subrayados, y los aminoácidos sin consenso están sombreados y en negritas. La Figura 17 representa un mapa de plásmidos circular del vector de expresión de la cadena kappa de pDSRal9: 9H7. La Figura 18 muestra un mapa de plásmido circular del vector de expresión de cadena pesada de pDSRal9:9H7 La Figura 19 representa un proceso de cultivo celular de e emplo para producir el anticuerpo anti-OPGL. La Figura 20 es una gráfica que muestra la densidad óptica contra la concentración del anticuerpo anti-OPGL que demuestra la inhibición de la formación de osteoblastos mediada por el anticuerpo de OPGL. La Figura 21 representa gráficas de concentraciones séricas de los anticuerpos anti-OPGL después de la administración subcutánea a 1.0 mg/kg en monos Cynomolgus . La Figura 22 representa gráficas que representan el cambio porcentual en NTx sérico desde la línea base después de la administración subcutánea a 1.0 mg/kg de anticuerpos anti-OPGL en monos Cynomolgus. La Figura 23 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos murinas (SEQ ID No. : 70) , humanas (SEQ ID No.: 71), y variante DE murina (SEQ ID No.: 72) en una región de OPGL entre las regiones D y E. La Figura 24 representa los resultados de un inmunoensayo enzimático que muestra seis anticuerpos anti-OPGL de la invención que se unen a OPGL murino (143-317) . La Figura 25 representa los resultados de un inmunoensayo enzimático que muestra cuatro de los anticuerpos anti-OPGL de la invención unidos a OPGL murino/DE-FLAG (158-316) .

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Los encabezados de sección usados en la presente son para propósitos de organización únicamente y no se van a considerar como limitantes de la materia descrita. Todas las referencias citadas en esta solicitud se incorporan expresamente con referencia en la presente para cualquier propósito .

Definiciones Se usaron técnicas normales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos , y cultivo y transformación de tejido (por ejemplo electroporación, lipofección) .. Se realizaron técnicas de purificación y reacciones enzimáticas de acuerdo a las especificaciones de los fabricantes o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizaron en general de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y analizan a todo lo largo de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL , 3d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en unión con, los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica y síntesis, y química farmacéutica y medicinal descritas en la presente son aquellos bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Se pueden usar técnicas normales para síntesis química, análisis químico, preparación farmacéutica, formulación y distribución y tratamiento de pacientes. Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, se deben entender que tienen los siguientes significados : El término "polinucleótido aislado" como se usa en la presente significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen el polinucleotido aislado (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleotido en el cual se encuentra en la naturaleza del polinucleotido aislado, (2) enlaza a un polinucleotido que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia mayor. El término "proteína aislada" referida en la presente significa que la proteína (1) está libre de al menos otras proteínas con las cuales se encuentra normalmente, (2) está esencialmente libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente 50 por ciento de polinucleótidos , líquidos, carbohidratos, u otros materiales con los cuales está asociado en la naturaleza, (5) no está asociado (por interacción covalente o no covalente) con porciones de una proteína con la cual se asocian en la naturaleza la "proteína aislada" , (6) está asociado en forma operable (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido en el cual no está asociada en la naturaleza, o (7) no se presentan a la naturaleza. Esta proteína aislada se puede codificar por ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. De manera preferente, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural que interferirán con su uso (terapéutico, diagnostico, profiláctico, investigación u otros) . Los términos "polipéptido" o "proteína" significan moléculas que tienen la secuencia de proteínas nativas, es decir, proteínas reducidas por células que se presentan de forma natural y específicamente no recombinantes, las células genéticamente manejadas o recombinantes, y comprenden moléculas que tienen las secuencias de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen supresión de, además de, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. El término "polipéptido" y "proteína" abarca de forma específica anticuerpos anti-OPGL, las secuencias que tienen supresiones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos del anticuerpo anti-OPGL. El término "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino- terminal , una supresión carboxil -terminal y/o una supresión interna. En ciertas modalidades, los fragmentos son al menos de 5 a aproximadamente 500 aminoácidos de largo. Se apreciará que en ciertas modalidades, los fragmentos son de al menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de largo. Los fragmentos de polipéptido particularmente útiles incluyen dominios funcionales, incluyendo dominios de unión. En el caso de un anticuerpo anti-OPGL, los fragmentos útiles incluyen de manera enunciativa y sin limitación una región de CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una porción de una cadena de anticuerpo o sólo su región variable que incluye dos CDR, y similar. El término "fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional" como se usa en la presente se refiere a un fragmento de polipeptido que contiene al menos los CDR de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la invención es capaz de la unión a un antígeno. En modalidades preferidas, el antígeno es un ligando que se une de manera específica a un receptor. En estas modalidades, la unión de un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la invención impide la unión de ligando a su receptor, interrumpiendo la respuesta biológica que resulta de la unión del ligando al receptor. De manera preferente, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la invención se une de manera específica a OPGL . De manera más preferente, el fragmento se une de manera específica a OPGL humano. El término "que se presenta de forma natural" como se usa en la presente y se aplica a un objeto se refiere al hecho que el objeto se puede encontrar en la naturaleza.

Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar y una fuente de la naturaleza que no se ha modificado de forma intencional por el hombre, se está presentando de forma natural . El término "operablemente enlazado" significa que los componentes a los cuales se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control "operablemente enlazada" a una secuencia de codificación se liga a ésta de modo que se logra la expresión de la secuencia de codificación de la proteína bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de la secuencia de control . El término "secuencia de control" como se usa en la presente se refiere a secuencias de polinucleótidos que pueden efectuar la expresión, procesamiento o localización intracelular de las secuencias de codificación a las cuales están ligadas. La naturaleza de esta secuencia de control puede diferir dependiendo del organismo hospedador. En modalidades particulares, las secuencias de control para procariotas pueden incluir promotor, sitio de unión ribosómica, y secuencia de terminación de trascripción. En otras modalidades particulares, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de trascripción, secuencias intensificadoras (de trascripción) , secuencias de terminación de trascripción y secuencias de poliadenilación . En ciertas modalidades, las "secuencias de control" pueden incluir secuencias vía y/o secuencias de compañeros de fusión. El término "polinucleótido" como se refiere en la presente significa polímeros de ácido nucleico de hebra individual o de doble hebra de al menos 10 bases de largo. En ciertas modalidades, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Estas modificaciones incluyen modificaciones base tal como bromuridina, modificaciones de ribosa tal como aradinósido y 2 ' , 3 ' -didesoxiribosa y modificaciones del enlace de internucleótido tal como fosforotioato , fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosoraniladato y fosforoamidato . El término "polinucleótido" incluye de manera específica formas de hebra individual y doble hebra de ADN. El término "oligonucleótido" como se usa en la presente incluye nucleótidos que se presentan de forma natural y modificados, enlazados conjuntamente con enlaces de oligonucleótidos que se presentan de manera natural y/o que no se presentan de manera natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que contienen miembros que son en general de hebra única y tienen una longitud de 200 bases o menos. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 10 a 60 nucleotidos de longitud. En ciertas modalidades, los oligonucleótidos son de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 nucleotidos de largo. Los oligonucleótidos pueden ser de hebra individual o doble hebra, por ejemplo, para el uso en la construcción de un gen mutante . Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos homosentido o antisentido con referencia a la secuencia de codificación de la proteína. El término "nucleotidos" que se presentan de forma natural" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos . El término "nucleotidos modificados" incluye nucleotidos con grupos azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" incluye enlaces de oligonucleótidos tal como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosoraniladato, fosforoamidato y similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche et al., 1986, Nucí. Acids Res. 14: 9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc . 106: 6077; Stein et al., 1988, Nucí. Acids. Res. 16 : 3209 ; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design 6 : 539 ; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES : A PRACTICAL APPROACH, (F.

Eckstein, ed.), Oxford University Press, Oxford England, pp . 87-108; Stec et al., patente de los Estados Unidos No. 5,151,510 ; Uhlmann y Peyman, 1990, Chemical Reviews 90: 543, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. Un oligonucleótido puede incluir una marca detectable para permitir la detección del oligonucleótido o hibridación del mismo . El término "vector" se usa para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) usada para transferir información de codificación a una célula hospedadora. El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedadora y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de las secuencias insertadas de ácido nucleico, heterólogas. La expresión incluye, de manera enunciativa y sin limitación, procesos tal como trascripción, traducción, empalme de ARN, si están presentes los intrones. El término "célula hospedadora" se usa para referirse a una célula que se ha transformado, o es capaz de ser transformada con una secuencia de ácido nucleico y entonces de la expresión de un gen seleccionado de interés. El término incluye la progenie de la célula de origen, ya sea si la progenie es idéntica en morfología o en constitución genética a la célula de origen, o no, en tanto que esté presente el gen seleccionado. El término "traducción" se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, usualmente por un fago. "Traducción" también se refiere a la adquisición y transferencia de secuencias celulares eucarióticas por retrovirus. El término "transfección" se refiere a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se introducido dentro de la membrana celular. Son bien conocidas varias técnicas de transfección y se describen en la presente. Ver, por ejemplo, Graham et al., 1973, Virology 5_2, 456, Sambrook et al., 2001, ibid. Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Elsevier) ; y chu et al., 1981, Gene 13: 197. Estas técnicas se pueden usar para introducir una o más porciones exógenas de ADN en células hospedadoras adecuadas. El término "transformación" como se usa en la presente se refiere a un cambio de las características genéticas de la célula, y una célula se ha transformado cuando se ha modificado para contener un nuevo ADN. Por ejemplo, se transforma una célula donde se modifica genéticamente de su estado nativo. Después de la transfección o traducción, el ADN de transformación puede recombinarse con aquel de la célula al integrarse físicamente en un cromosoma de la célula, se puede mantener de forma momentánea como un elemento episomal sin que se replique, o se puede replicar independientemente como un plásmido. Una célula se considera que se ha transformado de forma estable cuando el ADN se replica con la división de la célula . El término "que se presenta de forma natural" o "nativo" cuando se usa en unión con materiales biológicos tal como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos , células hospedadoras y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no se manipulan por el ser humano. De manera similar, "que no se presentan de manera natural" o "no nativo" como se usa en la presente se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza o que se ha modificado o sintetizado estructuralmente por el hombre . El término "antígeno" se refiere a una molécula o a una porción de una molécula capaz de ser unida por un agente de unión selectiva, tal como un anticuerpo, y capaz adicionalmente de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de la unión a un epítope de este antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopes. El término "identidad", como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina al comparar las secuencias de la misma. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de la secuencia entre las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos , como pueda ser el caso, como se determina por la correspondencia entre dos o más secuencias de nucleótidos o dos o más secuencias de aminoácidos. "Identidad" mide el por ciento de las correspondencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de separación (si las hay) dirigidas por un modelo matemático particular o programa de computadora (es decir, "algoritmo"). El término "similitud" se usa en la técnica con respecto a un concepto relacionado, pero en contraste a "identidad" , "similitud" se refiere a una medida de relación, que incluye tanto las correspondencias idénticas como las correspondencias de sustitución conservadoras. Si dos secuencias de polipéptidos tienen, por ejemplo, 10/20 aminoácidos idénticos, y el resto son sustituciones no conservadoras, entonces el por ciento de identidad y la similitud serán ambos 50%. Si, en el mismo ejemplo, hay cinco posiciones más donde hay sustituciones conservadoras, entonces el por ciento de identidad permanece 50%, pero el por ciento de similitud será de 75% (15/20) . Por lo tanto, en casos donde existan sustituciones conservadoras, el por ciento de similitud entre dos polipéptidos será mayor que el por ciento de identidad entre estos dos polipéptidos . La identidad y similitud de los polipéptidos relacionados se puede calcular fácilmente por métodos conocidos. Estos métodos incluyen de manera enunciativa y sin limitación, aquellos descritos en COMPUTACIONAL MOLECULAR BIOLOGY, (Lesk, A.M., ed . ) , 1988, New York: Oxford, University Press; BIOCOMPUTING : INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (Smith, D.S., ed.), 1993, New York: Academia Press COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART 1, (Griffin, A.M., y Griffin, H.C., eds . ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G. , 1987, SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, New York: Academia Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Gribskov, M. y Deverux, J. , eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; y Carrillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073; y Durban et al., 1998 BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press. Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar la mayor correspondencia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos preferidos de programa de computadora para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, el paquete del programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucí. Acid. Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, y FASTA, Altschul et al., 1990, j. Mol. Biol . 215: 403-410). El programa BLASTX está públicamente disponible del Centro Nacional de Información Biotecnologica (NCBI, por sus siglas en inglés) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, supra) . El algoritmo de Smith-Waterman bien conocido también se puede usar para determinar la identidad. Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos puede dar por resultado la correspondencia de sólo una región corta de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta, aunque no exista relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en ciertas modalidades, el método de alineación seleccionado (programa GAP) dará por resultado una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo. Por ejemplo, usando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University de Wisconsin, Madison, WI) , dos polipéptidos para los cuales se va a determinar el por ciento de identidad de secuencia se alinean para la correspondencia óptima de sus respectivos aminoácidos ("intervalo correspondido", como se determina por el algoritmo) . En ciertas modalidades, una penalidad de abertura de separación (que se calcula como tres veces la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la marcación o número asignado a cada correspondencia perfecta de aminoácido por la matriz de comparación particular) y una penalidad de extensión de separación (que usualmente es un décimo de la penalidad de abertura de separación) , así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan en unión con el algoritmo. En ciertas modalidades, también se usa por el algoritmo una matriz de comparación normal (ver, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352, para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Nati. Acad . Sci. USA 89: 10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 62) . En ciertas modalidades, los parámetros para una comparación de secuencia de polipéptidos incluyen lo siguiente : Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol . 48 :443-453 ; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al . , 1992 , supra; Penalidad de separación: 12 Penalidad de longitud de separación: 4 Umbral de similitud: 0. El programa GAP se puede usar con los parámetros anteriores. En ciertas modalidades, los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por omisión para las comparaciones de polipéptidos (junto con no penalidad para las separaciones terminales) usando e 1 algoritmo de GAP. Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaciones siguen el uso convencional. Ver IMMUNOLOGY—A SYNTESIS. 2a. Edition, (E.S. Golub y D. R. Gren, Eds . ) , 1991, Sinauer Associates, Sunderland, Mass., que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tal como aminoácidos a-, a-distribuidos, N-alquil-aminoácidos , ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetilisina , e-N-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3 -metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-?-metil-arginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4 -hidroxiprolina) . En la notación de polipéptidos usada en la presente, la dirección izquierda es la dirección amino-terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi -terminal , de acuerdo con el uso y convención normales. De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo izquierdo de las secuencias de polinucleótidos de hebra individual es el extremo 5'; la dirección izquierda de la secuencia de polinucleótido de doble hebra se refiere como la dirección 5'. La dirección de la adición de 5' a 3' de los transcriptos de ARN nacientes se refiere como la dirección de trascripción; las regiones de la secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el ARN y que están 5' al extremo 5' de trascripto de ARN se refieren como "secuencias en la dirección 5'"; las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia como el ARN y que está 3' al extremo 3' de trascripto de ARN se refieren como "secuencias en la dirección 3'". Los residuos que se presentan de forma natural se pueden dividir en clases basadas en propiedades comunes de las cadenas laterales. 1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, 2) hidrófilos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe . Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden abarcar residuos de aminoácidos que se presentan de forma no natural, que se incorporan típicamente por síntesis química de péptido en lugar de síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomimeticos y otras formas invertidas o volteadas de porciones de aminoácidos. Las sustituciones no conservadoras pueden comprender el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Estos residuos sustituidos se pueden introducir en regiones del anticuerpo humano que son homologas con anticuerpos no humanos, en las regiones no homologas de la molécula. Al hacer estos cambios, de acuerdo a ciertas modalidades, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos . Cada aminoácido se ha asignado a un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y características de carga. Estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.5); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cisteína (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). La importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir función de lógica interactiva en la proteína se entiende en la técnica (ver, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol . 157:105-131). Se conoce que ciertos aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o puntuación hidropática similar y retengan aún una actividad biológica similar. Al hacer cambios en base al índice hidropático, en ciertas modalidades, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2. En ciertas modalidades, aquellos que están dentro de +1 se incluyen, y en ciertas modalidades, se incluyen aquellos dentro de +0.5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede efectuar de forma efectiva en base a la hidrofilicidad, particularmente donde la proteína o péptido biológicamente funcional, creado de esta manera, se propone para el uso en modalidades inmunológicas , como en el presente caso. En ciertas modalidades, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, como se gobierna por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, correlaciona con su inmunogenicidad y unión a antígeno o inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a estos residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ±1); glutamato (+3.0 ± 1); serina (+3.0); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptofano (-3.4). Al hacer cambios en base a los valores similares de hidrofilicidad, en ciertas modalidades, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ± 2, en ciertas modalidades, incluyen aquellos que están dentro de + 1 y en ciertas modalidades, se incluyen aquellos dentro de + 0.5. También se pueden identificar epítopes de las secuencias primarias de aminoácidos en base a la hidrofilicidad. Estas regiones también se refieren como "regiones de núcleo epitopico" . Las sustituciones de aminoácidos de ejemplo se exponen en la Tabla 1.

Tabla 1 Sustituciones de Aminoácidos Residuos Sustituciones de Ejemplo Sustituciones Originales Preferidas Ala Val, Leu, lie Val Arg Lys, Glu, Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn Asn Gly Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu Norleucina Leu Norleucina, lie, Val, Met, lie ala, Phe Lys Arg, Gln, Asn, Ácido 1,4- Arg Diamina-butírico Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Ty , Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val lie, Met, Leu, Phe, Ala, Leu Norleucina Un experto en la técnica será capaz de determinar las variantes adecuadas del polipeptido como se expone en la presente usando técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que se puede cambiar sin definir la actividad al buscar regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. En otras modalidades, el experto en la técnica puede identificar residuos y porciones de las moléculas que estén conservadas entre los polipéptidos similares. En modalidades adicionales, aún áreas que son importantes para la actividad biológica o para la estructura, se pueden someter las sustituciones conservadoras de aminoácidos sin que se destruya la actividad biológica o sin que se afecte de manera adversa la estructura del polipéptido. Adicionalmente , un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura- función que identifican los residuos del polipéptido similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de esta comparación, el experto en la técnica puede prever la importancia de los residuos de aminoácido en una proteína que corresponden a residuos de aminoácidos importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones químicamente similares de aminoácidos para estos residuos de aminoácidos, importantes, previstos. Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos con relación a esa estructura en polipéptidos similares. En vista de esta información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de los residuos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales en residuos de aminoácidos que se prevé que estén en la superficie de la proteína, puesto que estos residuos pueden estar comprendidos en interacciones importantes por otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contengan una sustitución única de aminoácidos en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes entonces se pueden evaluar selectivamente usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la técnica. Estas variantes se pueden usar para obtener información acerca de las variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubrió que un cambio a un residuo particular de aminoácidos dio por resultado actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, se pueden evitar las variantes con este cambio. En otras palabras, en base a la información obtenida de estos experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos donde se deben evitar las sustituciones adicionales ya sea solas o en combinación con otras mutaciones. Se han enfocado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Ver Molt, 1996, Curr. Op . In Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13: 222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol . Relat. Areas Mol. Biol . 47: 45-148; Chou et al., 1978, Ann . Rev. Biochem. 47: 251-276 y Chou et al., 1979, Biophys . J. 26: 367-384. Además, los programas de computadora actualmente disponibles ayudan con la predicción de la estructura secundaria. Un método— a-ra—predee-i- —la—estruct-u-ra—se-cunda-ria—se—basa -en modelado por homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más de 30%, o similitud de más de 40% tiene frecuentemente topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de las bases de datos de estructuras de proteína (PDB) ha proporcionado predictibilidad mejorada de estructuras secundarias, incluyendo el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o proteína. Ver, Holm et al., 1999, Nucí. Acid. Res. 27: 244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., 1997, Curr, Op. Struct. Biol. 7: 369-376) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dada y que una vez que se ha resuelto el número crítico de estructura, llegará a ser dramáticamente más exacta la predicción estructural. Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "enhebramiento" (Jones, 1997, Curr, Opin. Struct. Biol . 7_: 377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4: 15-19) , "análisis de perfil" (Bowie et al., 1991, Science 253 : 164-170 ; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183 : 146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat . Acad . Sci. USA 84: 4355-4358), y "enlace evolutivo" (ver Holm, 1999, supra, y Brenner, 1997, supra) . En ciertas modalidades, las variantes de anticuerpos incluyen variantes de glicosilación en donde el número— o—fe-i-pe—de—si-t^i-e—de—gl-ÍGOS-i4.-actó comparación a las secuencias de aminoácidos del polipéptido de origen. En ciertas modalidades, las variantes proteicas comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación N-enlazados que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación N-enlazado se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de los residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato N-enlazada. De manera alternativa, las sustituciones que eliminan o alteran su frecuencia impedirán la adición de una cadena de carbohidratos N-enlazadas presentes en el polipéptido nativo. También se proporcionan re -arreglos de cadenas de carbohidrato N-enlazadas en donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación N-enlazados (típicamente aquellos que se presentan de forma natural) y se crean uno o más sitios N-enlazados. Las variantes adicionales de anticuerpos, preferidas, incluyen variantes de cisteína, en donde se suprimen uno o más residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos de origen, o nativa, de o se sustituyen por, otro aminoácido (por ejemplo serina) . Las variantes de cisteína son útiles, ínter alia, cuando se pueden replegar los anticuerpos en una con-for-mae-i-ón—b-i-ol-óg-i-eamente—aet-i-va-,—por—ej-emp.Lo-, de.sp_u.és_de_L_ aislamiento de los cuerpos de inclusión insolubles. En general, las variantes de cisteína tienen menos residuos de cisteína que la proteína nativa y tienen típicamente un número par para reducir al mínimo las interacciones que resulten de las cisternas sin aparear. En modalidades adicionales, las variantes de anticuerpos pueden incluir anticuerpos que comprendan un fragmento Fe modificado o una región constante de cadena pesada, modificada. Un fragmento Fe, que significa "fragmento que cristaliza", o una región constante de cadena pesada se puede modificar por mutación para conseguir en un anticuerpo características alteradas de unión. Ver, por ejemplo, Burton y Wolf, 1992, Advances in Immunology 5JL: 1-84; Ravetch y Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol . 19: 275-90; Shields et al . , 2001, Journal of Biol . Chem 276 : 6591-6604; Telleman y Junghans, 2000, Immunology 100 : 245-251; Medesan et al., 1998, Eur. J. Immunol . 28^: 2092-2100; todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Estas mutaciones pueden incluir sustituciones, o adiciones, supresiones, o cualquier combinación de las mismas, y se producen típicamente por mutagénesis dirigida al sitio usando uno o más oligonucleótidos mutagénicos de acuerdo a los métodos descritos en la presente, así como de acuerdo a métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Maniatis e —a-l-r-7 M0LEGULAR—GLONi-NG :—A LABORATORY MANUAL, 3a Ed_._,_ 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. y Berger y Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA. , que se incorporan en la presente como referencia) . De acuerdo a ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácidos son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, y (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión de ligando o antígeno y/o (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en estos polipéptidos . De acuerdo a ciertas modalidades, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos únicas o múltiples (en ciertas modalidades, sustituciones conservadoras de aminoácidos) en la secuencia que se presenta de forma natural (en ciertas modalidades, en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman algunos contactos intermoleculares) . En ciertas modalidades, una sustitución conservadora de aminoácido típicamente no cambia de forma sustancial las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se presenta en la secuencia de origen, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia de origen) . Los e-j-emp-l-e-s—de—estrue-tea-s—secundarias—y—terciarias de un. polipéptido, reconocidas en la técnica, se describen en PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES (Creighton, Ed.), 1984, . H. New York: Freeman and Company; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (Branden and Tooze, eds . ) , 1991, New York; Garland Publishing; y Thornton et al., 1991, Nature 354: 105, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia. Los análogos peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellos del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se llaman "imitadores de péptido" o "péptido-miméticos" . Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15: 29; Veber y Freidinger, 1985, TINS p. 392; y Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30: 1229, que se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. Estos compuestos frecuentemente se desarrollan con ayuda del modelado molecular computarizado . Los indicadores de péptidos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico, similar. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces pept£-d-i-eos reemp-l-a-zados opeionalmente por un enlace-seleccionado de - -CH2NH- - , --CH2S--, -CH2CH2--, --CH=CH-(cis y trans) , --COCH2--, - -CH (OH) CH2- - , y -CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar en ciertas modalidades para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia de consenso o una variación de secuencia de consenso sustancialmente idéntica se pueden generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 6_1: 387), incorporado en la presente como referencia para cualquier propósito) ; por ejemplo, al adicionar residuos internos de cisteína capaces de formar fuentes intramoleculares de disulfuro que ciclizan el péptido. "Anticuerpo" o "péptido (s) de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo, que compite con el anticuerpo intacto para la unión específica. En ciertas modalidades, los fragmentos de unión se producen por técnicas de ADN recombinante . En ciertas técnicas, se producen fragmentos de unión por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, Fab, Fab' , F(ab')2# Fv y compuestos de cadena ú-n-i-ea-^— —— El término "cadena pesada" incluye cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tiene una región constante de cadena pesada de una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad para un OPGL. El término "cadena ligera" incluye cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tiene una región constante de cadena ligera y una secuencia de región variable suficiente para conferir especificidad para un OPGL. Una cadena pesada de longitud completa incluye un dominio de región variable, VH, y tres dominios de región constante, ¾1 , CH2 y CH3. El dominio VH es el término amino del polipéptido, y el dominio CH3 es el término carboxilo. El termino "cadena pesada", como se usa en la presente, abarca una cadena pesada de longitud completa y fragmentos de la misma. Una cadena ligera de longitud completa incluye un dominio de región variable, VL, y un dominio de región constante, CL. Igual que la cadena pesada, el dominio de región variable de la cadena ligera está en el amino-término del polipéptido. El término "cadena ligera", como se usa en la presente, abarca una cadena ligera de longitud completa y fragmentos de la misma. Un fragmento F(ab) está comprendido de una cadena ligera y el CH1 y regiones variables de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de F(ab) no puede formar un enlace de disulfuro con otra molécula de cadena—pesada- Un—-f-ragmen o—F-(ab—)—contiene—una cadena. ligera y una cadena pesada que contiene más de la región constante, entre los dominios de CH1 y CH2 , tal que se puede formar un enlace de disulfuro inter-cadena entre dos cadenas pesadas para formar una molécula de F(ab' )2- La región Fv comprende las regiones variables tanto de las cadenas pesadas como ligeras, pero carece de carece de las regiones constantes. Estos anticuerpos de cadena única son moléculas de Fv en las cuales se han conectado regiones variables de cadena pesada y ligera por un ligador flexible para formar una cadena única de polipéptido que forma una región de unión al antígeno. Los anticuerpos de cadena única se describen en detalle en la WO 88/01649 y las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,946,778 y 5,260,203, incorporadas en la presente como referencia. Un anticuerpo divalente diferente de un anticuerpo "multiespecífico" o "multifuncional" ; en ciertas modalidades, se entiende que comprende sitios de unión que tienen especificidad antigénica idéntica. Al valorar la unión y especificidad del anticuerpo de acuerdo con la invención, un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un ligando a un receptor cuando un exceso del anticuerpo reduce la cantidad de ligando unido al receptor por al menos 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, o más (como se mide en un ensayo de unión competitiva El término "epítope" incluye cualquier determinante polipeptídico , de manera preferente un determinante polipeptídico, capaz de la unión específica a un receptor de i munoglobulina o células T. En ciertas modalidades, los determinantes de epítope incluyen agrupaciones superficiales clínicamente activas, de moléculas, tal como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo y sulfonilo, y en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales, específicas, y/o características específicas de carga. Un epítope es una región de un antígeno que se une por un anticuerpo. En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce de manera preferencial su antígeno objetivo en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas . En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une de manera específica a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1CT8 M, en ciertas modalidades, cuando la consten disociación es = 10"9 M, y en ciertas modalidades, cuando la constante de disociación es = 1CT10 M. El término "agente" se usa en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto elaborado de materiales biológicos. Gomo—se— sa—en—1-a—presente,—los—términos "mar_cail_,_ o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, por incorporación de un aminoácidos radiomarcado o unión a un polipéptido de porciones de biotina que se pueden efectuar por avidita marcada (por ejemplo, estreptavidina que comprende de manera preferente un marcado detectable tal como un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente , o una actividad enzimática que se puede detectar por métodos ópticos o colorimétricos) . En ciertas modalidades, la marca también puede ser terapéutica. Se conocen en la técnica varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas que se pueden usar de manera ventajosa en los métodos descritos en la presente. Los ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo 3H, 1C, 15N, 35S, 90Y, 90mTc, li:LIn, 125I, 131I) , marcas fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína o FIAC, rodamina, o fósforo de lantánido) , marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano, ß-galactosidas , luciferasa, fosfotasa alcalina) , marcas quimioluminiscentes , marcas de hapteno tal como grupos de biotinilo, y los epítopes predeterminados de polipéptidos reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a me-ftai——o—ma-r-eas-de—epí-fcepe- En—c-ie-r-ta-s—moda-l-idades-,—se—unen-marcas por brazos separadores (tal como (CH2)n/ donde n < aproximadamente 20) de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "muestra biológica" , como se usa en la presente, incluye de manera enunciativa y sin limitación, cualquier cantidad de una sustancia de una cosa viva o una cosa anteriormente viva. Estas cosas vivas incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Estas sustancias incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula ósea, nodulos linfáticos y piel. El término "trastorno osteopénico" incluye, de manera enunciativa y sin limitación, osteoporosis , osteopenia, enfermedad de Paget, metástasis ósea lítica, periodontitis , artritis reumatoide y pérdida ósea debido a inmov lización. Además de estos trastornos óseos, se conoce que ciertos cánceres incrementan la actividad de los osteoclastos e inducen la reabsorción del hueso, tal como cáncer de mama y próstata y mieloma múltiple. Estos cánceres ahora se conoce que produce factores que dan por resultado la sobre -expresión de OPGL en el hueso, y conducen a números incrementados de osteoclastos y actividad incrementada de osteoclastos. Ei—térmi-ne—^agenfee—f-a-r-maG&u-ti-co—o--fármaco"—como—se-usa en la presente se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir el efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. Como se usa en la presente, "parcialmente puro" o "sustancialmente purificado" significa un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) . En ciertas modalidades, una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde las especies objeto comprenden al menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En ciertas modalidades, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En ciertas modalidades, la especie se purifica a homogeneidad esencial (la especie contaminante no se puede detectar en la composición por métodos convencionales de detección) , en donde la composición consiste esencialmente de una especie macromolecular única. El término "paciente" incluye sujetos humanos y animales . A menos que se requiera por el contexto, todos los términos singulares deben incluir pluralidades y términos inrraires—deben—i-nci-ui-r—1?—s±nguiar- La invención proporciona anticuerpos, de manera preferente anticuerpos monoclonales, y de manera más preferente anticuerpos humanos, que son inmunológicamente específicos para el ligando de osteoprotegerina (OPGL) , un miembro de la familia de citocina del factor de necrosis tumoral (TNF) que está comprendido de la formación de osteoclastos . Actividad incrementada de los osteoclastos correlaciona con varios trastornos osteopénicos , que incluyen osteoporosis , post-menopáusica, enfermedad de Paget, metástasis ósea lítica y artritis reumatoide. De esta manera, una reducción en la actividad de OPGL pueda dar por resultado una disminución en la actividad de los osteoclastos y puede reducir la severidad de los trastornos osteopénicos . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, los compuestos dirigidos a OPGL se pueden usar para detectar, diagnosticar, prevenir y tratar trastornos osteopénicos, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, aquellos mencionados anteriormente. En ciertas modalidades de la presente invención, se proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano contra OPGL humano. En ciertas modalidades, se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican para, y secuencias de aminoácidos que comprenden, moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, particularmente secuencias que corresponden a 1-a-s -regiones variables En c.ier_tas_ modalidades, proporcionan secuencias que corresponden a las regiones de determinación de complementariedad (CDR) , específicamente de CDR1 hasta CDR3. Recuerda ciertas modalidades, también que proporciona una línea de células de hibridoma que expresa esta molécula de inmunoglobulina y anticuerpo monoclonal. En ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal, humano, purificado contra OPGL humano. La capacidad para clonar y reconstruir locus humanos con tamaño de mega base en cromosomas artificiales de levadura (YAC) y de introducirlos en la línea terminal de ratón proporciona un planteamiento para poner en claro los componentes funcionales de locus muy grandes o correlacionados de forma cruda asi como para generar modelos sutiles de la enfermedad humana. Además, la utilización de esta tecnología para su sustitución de los locus de ratón con sus equivalentes humanos proporciona entendimientos únicos de la expresión y regulación de los productos químicos humanos durante el desarrollo, su comunicación con otros sistemas, y su implicación en la inducción y progreso de la enfermedad. Una aplicación práctica importante de esta estrategia es la "humanización" del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción del locus de_ inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los cuales se han inactivado los genes de Ig endógenos ofrece la oportunidad de estudiar mecanismos que fundamentan la expresión programada y montaje de anticuerpos así como su papel en el desarrollo de células B. Además, esta estrategia proporciona una fuente para la producción de anticuerpos monoclonales completamente humanos (MAb) . Los anticuerpos completamente humanos se espera que reduzcan al mínimo las respuestas inmunogénicas o alérgicas intrínsecas a los MAb de ratón o derivatizados de ratón, y que incrementen de este modo la eficiencia y seguridad de los anticuerpos administrados. Se pueden usar, anticuerpos completamente humanos en el tratamiento de las enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tal como osteoporosis , inflamación, auto-inmunidad y cáncer, el tratamiento de las mismas que requiere administración repetida de anticuerpos. De esta manera, una ventaja particular de los anticuerpos anti-OPGL de la invención es que los anticuerpos son completamente humanos y se pueden administrar al paciente de una manera no exacta de modo que reducen al mínimo las reacciones adversas asociadas comúnmente con los anticuerpos humanos anti-ratón u otros anticuerpos no completamente humanos, previamente descritos, de especies no humanas. Un experto en la técnica puede manejar variedades de ratones eficiente en la producción de anticuerpos de ratón con mayores fragmentos de locus de Ig humanos puesto que los ratones producen anticuerpos humanos pero no de ratón. Los fragmentos Ig humanos grandes en la línea germinal de los ratones conservan la diversidad génica o variable así como la regulación apropiada de la producción y expresión de anticuerpos al explotar la maquinaria del ratón para la diversificación de anticuerpos y la selección y la carencia de tolerancia inmunológica a proteínas humanas, el repertorio reproducido de anticuerpos humanos en estas variedades de ratón produce anticuerpos de alta afinidad contra cualquier antígeno de interés, incluyendo antígenos humanos. Usando la tecnología de hibridoma, se pueden producir y seleccionar los mAb humanos específicos del antígeno con la especificidad deseada.

En ciertas modalidades, el experto en la técnica puede usar regiones constantes de especies diferentes de la humana junto con regiones variables humanas para producir anticuerpos quiméricos.

Estructura de anticuerpo que se presenta de forma natural Las unidades estructurales de anticuerpo que se presentan de forma natural comprenden típicamente un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto típicamente de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas modalidades, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas modalidades, aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye típicamente una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos y típicamente es responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi -terminal de cada cadena define típicamente una región constante que es responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican típicamente como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican típicamente como mu, delta, gamma, alfa, o epsilón y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La IgG tiene varias subclases, que incluyen de manera enunciativa y sin limitación IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. La IgM tiene subclases que incluyen de manera enunciativa y sin limitación IgMi e IgM2. La IgA se subdivide de manera similar en subclases que incluyen de manera enunciativa IgAi e IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, típicamente, las regiones variables y constantes se unen por uña región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Ver, por ejemplo FUNDAMENTAL INMMUNOLOGY, 2a. ed. , Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press (incorporada como referencia en su totalidad para todos los propósitos) . Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman típicamente el sitio de unión al antígeno. Las regiones variables exhiben típicamente la misma estructura general de las regiones de marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables , también llamadas regiones de determinación de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean típicamente por las regiones de marco, que pueden permitir la unión a un epítope específico. Desde N-terminal a C-terminal, las regiones variables tanto en cadena ligera como pesada comprenden los dominios FRl, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es típicamente de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Kabat de Proteínas de Interés Inmunológico (1987 y 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), o Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol . 196 : 901-914; Chothia et al., 1989, Nature 342 : 878-883.

Anticuerpos Biespecífieos o bifuncionales Un anticuerpo biespecífico o biofuncional típicamente es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera y dos diferentes sitios de unión. Los anticuerpos bioespecí fieos se pueden producir por una variedad de métodos que incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab' . Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol . 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553.

Preparación de Anticuerpos La invención proporciona anticuerpos que se unen de manera específica a OPGL humano. En ciertas modalidades, los anticuerpos se pueden producir por inmunización con OPGL de longitud completa, o un fragmento del mismo. Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales y/o pueden ser anticuerpos recombinantes . En modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanos preparados, por ejemplo, por inmunización de animales transgénicos capaces de producir anticuerpos humanos (ver, por ejemplo solicitud de PCT, publicada No. WO 93/12227) . Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-OPGL se pueden injertar a regiones de marco (FR) de los anticuerpos de la misma u otra especie. En ciertas modalidades, las CDR de las regiones variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-OPGL se pueden injertar a FR humanas de consenso. Para crear FR humana de consenso, en ciertas modalidades, las FR de varias secuencias de aminoácidos de cadena pesada o de cadena ligera, humanas se alinean para identificar una secuencia de aminoácidos de consenso. En ciertas modalidades, las FR de la cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo anti-OPGL se reemplazan con las FR de una diferente cadena pesada o cadena ligera. En ciertas modalidades, no se reemplazan los aminoácidos raros en las FR de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo anti-OPGL, en tanto que se reemplazan el resto de los aminoácidos de FR. Los aminoácidos raros son aminoácidos específicos que están en posiciones en las cuales usualmente no se encuentran en las FR. En ciertas modalidades, las regiones variables injertadas del anticuerpo anti-OPGL se pueden usar con una región constante que es diferente de la región constante del anticuerpo anti-OPGL. En ciertas modalidades, las regiones variables injertadas son parte de un anticuerpo Fv de cadena única. Se describe el injerto de CDR por ejemplo en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 y 5,5830,101, que se incorporan en la presente como referencia para cualquier propósito. Los anticuerpos de la invención se preparan usando ratones transgénicos que tienen una porción sustancial de locus productor del anticuerpo humano, injertado en las células productoras de anticuerpo de los ratones, y que se manejan adicionalmente para ver deficientes en la producción de anticuerpos endógenos murinos . Estos ratones son capaces de producir moléculas humanas de inmunoglobulina y anticuerpos y no producen, o producen cantidades sustancialmente reducidas de, moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos, murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr este resultado se describen en las patentes, solicitudes y referencias descritas en las patentes, solicitudes y referencias descritas en la especificación de la presente. En ciertas modalidades, el experto en la técnica puede emplear métodos como se describe en la publicación de la solicitud de patente internacional No. WO 98/24893, que se incorpora de este modo como referencia para cualquier propósito. Ver también, Méndez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156, que se incorpora de este modo como referencia para cualquier propósito. Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica normal de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, 1975, Nature 256 : 495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el ratón. Está bien establecida la producción de hibridomas en el ratón, y son bien conocidos en la técnica los protocolos y técnicas de inmunización para aislamiento de esplenocitos inmunizados por fusión. También se conocen los compañeros de fusión (por ejemplo células de mieloma murino) y procedimientos de fusión. En una modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra OPGL se pueden generar usando ratones transgénicos que tienen partes de sistema inmunitario humano en lugar del sistema murino. Estos ratones transgénicos, referidos en la presente como ratones "HuMab" , contienen un minilocus de gen de inmunoglobulina humano que codifica para las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y ligera k, humano, sin reaccionar junto con mutaciones buscadas que inactivan los locus de cadena µ y k endógenas (Lonberg et al., 1994, Nature 368 : 856-859) . Por consiguiente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM de ratón o k y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera, humanos, introducidos, se someten a una mutación somática y cambio de clase para generar anticuerpos monoclonales k IgG humanos de alta afinidad (Lonberg et al., supra . ; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immnunol 13. : 65-93; Harding y Lonberg 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci 764 : 536-546) . La preparación de ratones HuMab se describe en detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295; Chen et al., 1993, Internacional Immunology 5_: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol . 152: 2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368 ,- 856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113 : 49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6 : 579-591; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13 : 65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann N.Y. Acad. Sci. 764 : 536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14_: 845-851, los contenidos de todos los que se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Ver adicionalmente las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas de Lonberg y Kay, así como la patente de los Estados Unidos No. 5,545,807 de Surani et al., Publicaciones Internacionales No. WO 93/1227, publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22646, publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992, las descripciones de las cuales se incorporan como referencia en su totalidad. De manera alternativa, las variedades de ratones transgénicos HCo7 y HCol2, descritas en los ejemplos posteriores, se pueden usar para generar anticuerpos humanos anti-OPG. De acuerdo a ciertas modalidades, se producen como sigue anticuerpos monoclonales completamente humanos específicos para OPGL. Los ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglob lina humanos se inmunizan con el antígeno de interés. Se obtienen células linfáticas (tal como células B) de los ratones que expresan anticuerpos.

Estas células recuperadas se fusionan con una línea celular tipo mieloide para preparar líneas inmortales de células de mieloma, y estas líneas de células de hibridoma se evalúan selectivamente y se seleccionan para identificar las líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos específicos al antígeno de interés. En ciertas modalidades, se proporciona la producción de una línea de células de hibridoma que produce anticuerpos específicos a OPGL. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos se unen a OPGL con una constante disociación (Ka) de menos de 10"8 M. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se unen a OPGL con una ¾ de entre aproximadamente 10~8 M y 1CT10 M. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención son del isotipo IgGi. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos comprenden una cadena ligera kappa humana y una cadena pesada de IgGi humana. En ciertas modalidades, el ácido nucleico que codifica para las cadenas pesadas y ligeras que comprenden los anticuerpos de la invención se clonaron para la expresión en células de mamífero. En ciertas modalidades, las regiones variables de los anticuerpos se ligaron a una región constante en lugar de la región constante del isotipo IgGi- En ciertas modalidades, las modificaciones conservadoras a las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-OPGL (y modificaciones correspondientes a los ácidos nucleicos de codificación) producirán anticuerpos anti-OPGL que tienen características funcionales y bioquímicas similares a aquellas de un anticuerpo anti-OPGL. En contraste, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de un anticuerpo anti-OPGL se puede lograr al crear sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera y difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) de la estructura del armazón molecular en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, y (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede contener una sustitución de un residuo nativo de aminoácido con un residuo no nativo que tenga poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, también se puede sustituir cualquier residuo nativo en el polipéptido con alanina, como se ha descrito previamente para "mutagénesis de exploración de alanina" . Las sustituciones deseadas de aminoácidos (ya sea conservadoras o no conservadoras) se pueden determinar por aquellos expertos en la técnica en el momento en que se deseen estas sustituciones. En ciertas modalidades, se pueden usar sustituciones de aminoácidos para identificar importantes residuos del anticuerpo anti-OPGL, o para incrementar o disminuir la afinidad de los anticuerpos anti-OPGL descritos en la presente. En modalidades alternativas, los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar en líneas celulares diferentes de las líneas de células de hibridoma. En estas modalidades, se pueden usar frecuencias que codifican para anticuerpos particulares para la transformación de una célula hospedadora adecuada de mamífero. De acuerdo a estas modalidades, la transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora, incluyendo, por ejemplo el empaque del polipéptido en un virus (o en un vector viral) y la transducción de una célula hospedadora con el virus (o vector) o por procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,399,215, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (patentes que se incorporan de este modo como referencia en la presente para cualquier propósito) . En general, el procedimiento de transformación usado puede depender el hospedador que se va a transformar. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos también conocidos en la técnica e incluyen de manera enunciativa y sin limitación transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del (los) polinucleótido ( s) en liposomas, mezcla de ácido nucleico con lípidos positivamente cargados, y microinyeccion directa del ADN en núcleos . Una molécula de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena pesada, una región constante de cadena ligera, o una región variable de cadena ligera de un anticuerpo de OPGL de la invención, se inserta en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligación normales. En una modalidad preferida, la región constante de la cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo anti-OPGL se anexa al C-término de la región variable apropiada y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona típicamente para hacer funcional en la célula hospedadora particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedadora tal que pueda presentarse la amplificación del gen y/o la expresión del gen. Para una revisión de los vectores de expresión, ver ???? , ENZ . 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academia Press. Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospedadoras contienen secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias exógenas de nucleótidos. Estas secuencias, referidas colectivamente como "secuencias de flanqueo" en ciertas modalidades incluirán típicamente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos. Un promotor, una o más secuencias intensificadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional , una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de empalme aceptor y donador, una secuencia que codifica para una secuencia guía para la secreción de polipéptidos , un sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de poliligador para inyectar un ácido nucleico que codifica para el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable . Cada una de estas secuencias se analiza posteriormente. Opcionalmente , el vector puede comprender una secuencia de codificación de "marca", es decir, una molécula de oligonucleótido localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de codificación del polipéptido de OPGL; la secuencia de oligonucleótidos codifica para polyHis (tal como hexaHis) , u otra "marca" tal como FLAG, HA (virus de influenza de hemaglutinina) o myc, para los cuales existen anticuerpos comercialmente disponibles. Esta marca se aproxima típicamente al polipéptido en la expresión del polipéptido y puede seguir como un medio para la purificación por afinidad o detección del anticuerpo de OPGL de la célula hospedadora. Se puede lograr la purificación por afinidad, por ejemplo, por cromatografía en columna usando anticuerpos contra la marca como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la marca se puede remover de manera subsiguiente del polipéptido de OPGL purificado por varios medios tal como al usar ciertas peptidasas para la escisión . Las secuencias de flanqueo pueden ser homologas (es decir, de la misma especie y/o variedad como la célula hospedadora) , heterólogas (es decir, de una especie diferente de la especie o variedad de la célula hospedadora) , híbridas (es decir, una combinación de secuencias de flanqueo de más de una fuente) , sintéticas o nativas. Como tales, la fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición que la secuencia de flanqueo sea funcional en, y se pueda activar por, la maquinaria de la célula hospedadora. Las secuencias de flanqueo útiles en los vectores de esta invención se pueden obtener por cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias de flanqueo útiles en la presente se habrán identificado previamente por correlación y/o por digestión con endonucleasas de restricción y de esta manera se pueden aislar a partir de una fuente apropiada de tejido usando endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede conocer la secuencia completa de nucleótidos y una secuencia de flanqueo. Aquí, la secuencia de flanqueo se puede sintetizar usando los métodos descritos en la presente para síntesis o clonación de ácido nucleico. Si se conoce toda o sólo una porción de la secuencia de flanqueo, se puede obtener usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o al evaluar selectivamente una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un fragmento de secuencia de flanqueo y/o oligonucleótido de la misma u otra especie. Donde no se conocen las secuencias de flanqueo, se puede aislar un fragmento del ADN que contiene una secuencia de flanqueo a partir de una pieza mayor de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia de codificación o aun otro gen o genes. El aislamiento se puede lograr por digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento apropiado de ADN seguido por aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) , u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para un experto en la técnica. Un origen de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procarioticos, particularmente aquellos comprados de forma comercial, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula hospedadora. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, se puede sintetizar uno químicamente en base a una secuencia conocida, y ligar en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, A) es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas y son útiles varios orígenes (por ejemplo, SV40, virus de polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) , o papilomavirus tal como HPV o BPV) para clonar vectores en células de mamífero. En general, el componente de origen de replicación no se necesita para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 f ecuentemente se usa sólo debido a que contiene el promotor temprano) . Típicamente, una secuencia de terminación de trascripción se localiza 3' del extremo de una región de codificación de polipéptido y sirve para terminar la trascripción. Usualmente, una secuencia de terminación de trascripción en células procarióticas es un fragmento con alto contenido de G-C seguido por una secuencia de poli-T. En tanto que la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o aun se compra comercialmente como parte de un vector, también se puede sintetizar fácilmente usando métodos por síntesis de ácido nucleico tal como aquellos descritos en la presente. Un elemento de gen marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedadora cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección, típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para células hospedadoras procarióticas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de las células; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos. Los marcadores selecciónateles preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina, y el gen de resistencia a tetraciclina . También se puede usar un gen de resistencia a neomicina, bacteriano para la selección tanto en células hospedadoras procarió icas como eucarióticas . Se pueden usar otros genes de selección para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es un proceso por el cual los genes que no pueden ser expresados en copia única a altos niveles suficientes para permitir la supervivencia y crecimiento de células bajo ciertas condiciones de selección, que reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Los ejemplos de marcadores seleccionables , amplificables , adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato-reductasa (DHFR) y timidina-cinasa sin promotor. En el uso de estos marcadores, se colocan transformantes de células de mamífero bajo presión de selección en donde sólo se adaptan de forma única los transformantes para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. Se impone una presión de selección al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales se incrementa sucesivamente la concentración del agente de selección en el medio, conduciendo de este modo a la amplificación tanto del gen seleccionable como del ADN que codifica para el otro gen, tal como un anticuerpo que se une al polipéptido de OPGL. Como resultado, se sintetizan cantidades mayores de un polipéptido tal como un anticuerpo anti-OPGL del ADN amplificado. Usualmente es necesario un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción del ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas) . El elemento se localiza típicamente 3' al promotor 5' a la secuencia de codificación del polipéptido que se va a expresar . En algunos casos, por ejemplo, donde se desea la glicosilación en un sistema de expresión de células hospedadoras eucarióticas , se pueden manipular varias pre-secuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, el sitio de escisión de peptidasa de un péptido de señal particular se puede alterar, o adicionar pro-secuencias, que también puede afectar la glicosilación. El producto proteico final puede tener, en la posición -1 (con relación al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales incidentes a la expresión, que no pueden haber sido totalmente removidos. Por ejemplo, el producto proteico final puede tener uno o dos residuos de aminoácido encontrados en el sitio de escisión de peptidasa, unido al amino-término . De manera alternativa, el uso de algunos sitios de escisión de enzimas puede dar por resultado una forma ligeramente truncada, aun activa, del polipéptido deseado, si la enzima corta en esta área dentro del polipéptido maduro. Los vectores de expresión y clonación de la presente invención contendrán típicamente un promotor que se reconoce por el organismo hospedador que está enlazado operablemente al ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-OPGL. Los promotores son secuencias no transcriptas localizadas en la dirección 5' (es decir, 5') al codon de inicio de un gen estructural (en general, dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la trascripción del gen estructural. De manera convencional, los promotores se agrupan en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles crecientes de trascripción a partir del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otra parte, inician la producción continua del producto génico; es decir, hay poco o ningún control experimental sobre la expresión génica. Son bien conocidos un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células hospedadoras potenciales. Un promotor adecuado se enlaza operablemente al ADN que codifica para el anticuerpo anti-OPGL al remover el promotor del ADN fuente por digestión con enzimas de restricción o al amplificar el promotor por la reacción en cadena de la polimerasa e insertar la secuencia promotora deseada en el vector . Los promotores adecuados para el uso con hospedadores de levadura también son bien conocidos en la técnica. Los intensificadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para el uso con células hospedadoras de mamífero son bien conocidos e incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, aquellos obtenidos a partir de genomas de virus tal como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de hepatitis B y de manera más preferente Virus Simiesco 40 (SV40) . Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores heterólogos de mamífero, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina. Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, de manera enunciativa y sin limitación: la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambón, 1981, Nature 290 : 304-10); el promotor de CMV; el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22_: 787-97); el promotor de timidina-cinasa de herpes ( agner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45) ; las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brister et al., 1982, Nature 296: 39-42); vectores de expresión procarióticos tal como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 75: 3727-31) ; o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati Acad. Sci., U.S. A. 80_ 21-25) . También de interés son las siguientes regiones de control transcripcional animal, que exhiben especificidad a tejido y se han utilizado en animales transgénicos . La región de control del gen de elastasa I que está activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50^:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 1_: 425-515) ; la región de control del gen de insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315 : 115-22) ; la región de control del virus de tumor mamario de ratón que está activa en células testiculares, de mama, linfoides y células cebadas (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95); la región de control del gen de albúmina que está activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 268-76); la región de control del gen de alfa- feto-proteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol . 5; 1639-48; Hammer et al . , 1987, Science 235: 53-58); la región de control del gen de alfa- 1-antitripsina que está activa en el hígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-71); la región de control del gen de beta-globina que está activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Náture 315 : 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 4_6: 89-94); la región de control del gen de proteína básica de mielina que está activa en células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 4_8: 703-12); la región de control del gen de la cadena-2 ligera de miosina que está activa en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314; 283-86); la región de control del gen de hormona de liberación gonadotrópica que está activa en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science 234 : 1372-78); y de manera más particular, la región de control del gen de inmunoglobulina que está activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 3_8: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318 : 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 1436-44) . Se puede insertar una secuencia intensificadora en el vector para incrementar la trascripción de un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-OPGL de la presente invención por eucariotas superiores. Los intensificadores son elementos cis-actuantes del ADN, usualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan en promotores para incrementar la trascripción. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y posición. Se han encontrado 5' y 3' a la unidad de trascripción. Se conocen varias secuencias intensificadoras disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . Sin embargo, de forma típica, se usará un intensificador de un virus. El intensificador de SV40, el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador de polioma, y los intensificadores de adenovirus son elementos intensificadores de ejemplo para la activación de promotores eucarióticos . En tanto que un intensificador se puede empalmar en el vector en una posición 5' ó 3' a una molécula de ácido nucleico, típicamente se localiza en un sitio 5' del promotor. Los vectores de expresión de la invención se pueden construir a partir de un vector de inicio conveniente tal como un vector comercialmente disponible. Estos vectores pueden contener todas las secuencias de flaqueo deseadas, o no. Donde no estén ya presentes una o más de las secuencias de flanqueo descritas en la presente, en el vector, se pueden obtener de forma individual y ligar en el vector. Son bien conocidos por el experto en la técnica los métodos usados para obtener cada una de estas secuencias de flanqueo .

Después de que se ha construido el vector y se ha insertado una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-OPGL en el sitio apropiado del vector, el vector completo se puede insertar en una célula hospedadora adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para un anticuerpo anti-OPGL en una célula hospedadora seleccionada se puede lograr por métodos bien conocidos que incluyen métodos tal como transíección, infección, cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, método de DEAE-dext ano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedadora que se va a usar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el experto en la técnica y se exponen, por ejemplo en Sambrook et al., supra . En una célula hospedadora, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, la síntesis de un anticuerpo anti-OPGL que se puede recolectar subsecuentemente del medio de cultivo (si la célula hospedadora no segrega en el medio) o directamente de la célula hospedadora que los produce (si no se segrega) . La selección de una célula hospedadora apropiada dependerá de varios factores, tal como niveles deseados de expresión, modificaciones de polipéptidos que sean deseables o necesarias para la actividad (tal como glicosilación o fosforilación) y facilidad de plegado en una molécula biológicamente activa. Las líneas de células de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión, son bien conocidas en la técnica e incluyen de manera enunciativa y sin limitación, muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , tal como células de ovario de hámster chino (CHO) , células de HeLa, células de riñon de hámster neonato (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células humanas de carcinoma hepatocelular (por ejemplo Hep G2) , y varias otras líneas celulares. En ciertas modalidades, se pueden seleccionar líneas celulares a través de la determinación de que líneas celulares tienen los niveles altos de expresión y producen anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a OPGL. En otra modalidad, se puede seleccionar una línea celular a partir de un linaje de células B que no constituya su propio anticuerpo pero tenga la capacidad de constituir y segregar un anticuerpo heterólogo. Los anticuerpos de la invención son útiles para detectar OPGL en muestras biológicas y para la identificación de células o tejidos que producen la proteína. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen a OPGL y bloquean la interacción con otros compuestos de unión pueden tener uso terapéutico en la modulación de la diferenciación de osteoclastos y resorción ósea. En ciertas modalidades, los anticuerpos a OPGL pueden bloquear la unión de OPGL a ODAR (RANK) , lo que puede dar por resultado un bloque en la cascada de traducción de señales y pérdida de la activación de la trascripción mediada por NF-kB. Se conocen por aquellos expertos en la técnica los ensayos para medir la activación de trascripción mediada por NF-kB usando por ejemplo, ensayo de indicador de luciferasa. En ciertas modalidades, pueden ser útiles anticuerpos a OPGL en el tratamiento de enfermedades óseas tal como osteoporosis y enfermedad de Pager. En ciertas modalidades, se pueden probar los anticuerpos para la unión a OPGL en la ausencia o presencia de OPG y que caminan para su capacidad para inhibir la osteoclastogénesis y/o resorción ósea mediada por OPGL. Los anticuerpos anti-OPGL de la invención se pueden administrar solos o en combinación con otros agentes terapéuticos, en particular, en combinación con otros agentes de la terapia de cáncer. Estos agentes incluyen en general terapia de radiación o quimioterapia. Por ejemplo, la quimioterapia puede comprender el tratamiento con uno o más del os siguientes: antraciclinas , taxol, tamoxifeno, doxorrubicina , 5-fluorouracilo, y otros fármacos conocidos por el experto. Además, los anticuerpos anti-OPGL se pueden inyectar a pacientes en combinación con anticuerpos que se unen a células de tumor e inducen un efecto citostático y/o citotóxico en el crecimiento del tumor. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen aquellos que se unen a la proteína de superficie celular Her2 , CDC20, CDC33, glicoproteína tipo mucina y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) presente en células tumorales e incluye un efecto citostático y/o citotóxico en células tumorales que exhiben estas proteínas. Los ejemplos de estos anticuerpos incluyen HERCEPTIN para el tratamiento de cáncer de mama y RITUXAN para el tratamiento de linfoma no de Hodgkin. También, la terapia de combinación puede incluir como agentes de terapia de cáncer, polipéptidos que inducen de forma selectiva apoptosis en células de tumor, tal como el ensayo de polipéptido relacionado a TNF. Los fragmentos de unión a antígeno o anti-OPGL de la invención se pueden administrar antes de, concurrente con, o subsiguiente con tratamiento con un agente de terapia de cáncer. Los anticuerpos anti-OPGL se pueden ilustrar de manera profiláctica para impedir o mitigar el comienzo de la pérdida de la masa ósea por cáncer metastático o pueden darse para el tratamiento de una condición existente de pérdida de masa ósea debido a metástasis. Los anticuerpos anti-OPGL de la invención se pueden usar para prevenir y/o tratar el crecimiento de células de tumor en el hueso. El cáncer que metastatiza al hueso puede extenderse fácilmente puesto que las células tumorales estimulan los osteoclastos para resorber la matriz ósea interna. El tratamiento con un anticuerpo anti-OPGL mantendrá la densidad ósea al inhibir la resorción y disminuir la probabilidad de que las células tumorales se extiendan a todo lo largo del esqueleto. Cualquier cáncer que metastatice el hueso se puede prevenir y/o tratar con un anticuerpo anti-OPGL. En una modalidad, se puede prevenir y/o tratar mieloma múltiple con un anticuerpo anti-OPGL o fragmento de unión a antígeno del mismo. El mieloma múltiple se localiza al hueso. Los pacientes afectados exhiben típicamente una pérdida de masa ósea debida a activación creciente de osteoclastos en regiones localizadas. Las células de mieloma producen ya sea de forma directa o indirecta OPGL, que a su vez activa los osteoclastos dando por resultado lisis local del hueso que circunda las células de mieloma incrustadas en los espacios de la médula ósea. Los osteoclastos normales adyacentes a las células de mieloma a su vez producen IL-6, que conduce a crecimiento y proliferación de células de mieloma. Las células de mieloma se expanden de una manera clonal y ocupan espacios óseos que se están creando por resorción inapropiada del hueso. El tratamiento de un animal con un anticuerpo anti-OPGL bloquea la activación de osteoclastos que a su vez conduce a una disminución en la producción de IL-6 por los osteoclastos , y a una supresión del crecimiento completo de mieloma y/o proliferación. Se pueden usar anticuerpos anti-OPGL, solos, para el tratamiento de las condiciones referidas anteriormente que dan por resultado pérdida de la masa ósea o en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente promotor del crecimiento óseo (anabólico) o un agente anti-resorción ósea que incluye de manera enunciativa y sin limitación factores morfogénicos óseos designados BMP-1 a B P-12, que transforman el factor-ß de crecimiento y los miembros de la familia de TGF-ß, factores de crecimiento de fibroblastos FGF4-1 a FGF-10, inhibidores de interleucina- 1 , inhibidores de TNFa, hormona paratiroide, prostaglandinas de la serie E, bisfosfonatos y minerales de mejoramiento óseo tal como fluoruro y calcio. Los agentes anabólicos incluyen hormona paratiroide y el factor de crecimiento tipo insulina (IGF) , en donde este último agente está vuelto complejo de manera preferente con una proteína de unión a IFG. Las modalidades preferidas también incluyen la combinación de un anticuerpo anti-OPGL con un antagonista del receptor de interleucina- 1 (IL-1) o un anticuerpo anti-OPGL con un receptor de TNF soluble, tal como el receptor- 1 de TNF soluble o el receptor-2 de TNF soluble. Un antagonista del receptor de IL-1 de ejemplo se describe en la WO89/11540 y un receptor- 1 de TNF soluble de ejemplo se describe en la En modalidades preferidas, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos de la invención junto con un diluyente, portador, solubilizador, emulsionador, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En ciertas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpos anti-OPGL. Los materiales de formulación aceptables son de manera preferente no tóxicos a los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. Los materiales de formulación adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, aminoácidos (tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobianos ; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) ; amortiguadores (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes de volumen (tal como mannitol o glicina) ; agentes quelantes (tal como ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA) ) ; agentes de formación de complejos (tal como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil -beta-ciclodextrina) ; agentes de relleno; monosacáridos , disacáridos; y otros carbohidratos (tal como glucosa, mannosa o dextrina) ; proteínas (tal como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas) ; agentes colorantes, saborizantes y diluyentes; agentes emulsionadores ; polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona) ; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones de formación de sal (tal como sodio) ; conservadores tal como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) ; solventes (tal como glicerina, propilen-glicol o polietilenglicol) ; alcoholes de azúcar (tal como mannitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; agentes tensioactivos o agentes humectantes (tal como pluronics, PEG, esteres de sorbitan, polisorbatos tal como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, rometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de mejoramiento de la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol) ; agentes de mejoramiento de la tonicidad (tal como haluros de metales alcalinos, de manera preferente cloruro de sodio o potasio, manitol-sorbitol) ; vehículos de distribución; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company. En ciertas modalidades, se determinarán las composiciones farmacéuticas óptimas por un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta propuesta de administración, formato de distribución y dosis deseada. Ver, por ejemplo REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, ibid. Estas composiciones pueden tener influencia en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de depuración in vivo de los anticuerpos de la invención. El vehículo primario, o portador en una composición farmacéutica puede ser ya sea en la naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para la administración parenteral . La solución salina amortiguada, neutral, o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos adicionales de ejemplo. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender amortiguador Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o amortiguador de acetato de pH de aproximadamente 4.0-5.5, que puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. Se pueden preparar composiciones de anticuerpo anti-OPGL para almacenamiento al mezclar la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes óptimos de formulación (REMINGTON' S PHARMACEU ICAL SCIENCES, ibid.) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, el producto de anticuerpo anti-OPGL se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados tal como sacarosa. Los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables al sitio de administración. Los amortiguadores se usan de manera preferente para mantener la composición a pH fisiológico o un pH ligeramente menor, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden distribuir de forma parenteral. Cuando se contemple la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para el uso en esta invención pueden estar en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos que comprende el anticuerpo anti-OPGL deseado en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para la inyección parenteral es agua destilada estéril en la cual se formula el anticuerpo anti-OPGL como una solución isotónica, estéril, apropiadamente conservada. La preparación puede comprender la formulación de una molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bio-erosionables , compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , cuentas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto que entonces se puede distribuir mediante inyección de depósito. La formulación con ácido hialurónico tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Se pueden usar dispositivos implantables de distribución de fármacos para introducir la molécula deseada. Las composiciones se pueden seleccionar para inhalación. En estas modalidades, se formula un anticuerpo anti-OPGL como un polvo seco para inhalación, o se pueden formular suspensiones de inhalación de anticuerpo anti-OPGL con un propulsor para distribución en aerosol, tal como por nebulización. Adicionalmente , la administración pulmonar se describe en la solicitud de PCT No. PCT/US94/001875 , que describe distribución pulmonar de proteínas químicamente modificadas . Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden distribuir a través del tracto digestivo, tal como de manera oral . La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la habilidad de la técnica. Los anticuerpos anti-OPGL que se administran de esta manera se pueden formular con o sin estos portadores habitualmente usados en la composición de formas de dosis sólidas tal como tabletas y cápsulas. Se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal cuando se aumenta al máximo la biodisponibilidad y se reduzca al mínimo la degradación pre-sistémica . Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción del anticuerpo anti-OPGL. También se pueden emplear diluyentes, saborizantes , ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de desintegración de tabletas y aglutinantes. Una composición farmacéutica puede comprender una cantidad efectiva de anticuerpos anti-OPGL en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la elaboración de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril u otro vehículo apropiado, se pueden preparar soluciones en la forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa, o sulfato de calcio; o agentes de unión, tal como almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tal como estearato de magnesio, ácido esteárico, o talco. Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes por aquellos expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que comprenden anticuerpos anti-OPGL en formulaciones de distribución sostenida o controlada. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de distribución sostenida o controlada, tal como portadores de liposomas, micropartículas bio-erosionables o cuentas porosas e inyecciones de depósito, también se conocen por aquellos expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Solicitud de PCT No. PCT/US93/00829 , que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la distribución de composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas , poliésteres, hidrogeles, poliláctidos (U.S. 3,773,919 y EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil -L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2_2: 547-556), poli (2 -hidroxietil -metacrilato) (Langer et al., 1981, J.

Biomed. Mater. Res. 15: 167-277) y Langer, 1982, Chem. Tech. 12 : 98-105), acetato de etilen-vinilo (Langer et al., ibid.) o ácido poli-D(-) -3 -hidroxibutírico (EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar por cualquiera de los varios métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 82^: 3688-3692; EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949. La composición farmacéutica que se va a usar para la administración in vivo es típicamente estéril . En ciertas modalidades, esto se puede lograr por filtración a través de membranas de filtración estériles. En ciertas modalidades, donde la composición se liofiliza, la esterilización usando este método se puede llevar a cabo ya sea antes o después de la liofilización y reconstitución. En ciertas modalidades, la composición para una administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en solución. En ciertas modalidades, las composiciones parenterales se colocan en general en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, en la bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja hipodérmica de inyección. Una vez que se ha formulado la composición farmacéutica de la invención, se puede almacenar en frascos estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones se pueden alamacenar ya sea en una forma lista para el uso o en una forma (por ejemplo liofilizada) que se reconstituye antes de la administración. La invención también proporciona equipos para permitir una unidad de administración de dosis única. Los equipos de la invención pueden contener cada uno, tanto un primer recipiente que tiene una proteína seca, como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa, que incluye, por ejemplo, jeringas pre-rellenas individuales de cámara individual o múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas de líquidos, liojeringas o jeringas sin aguja). La cantidad efectiva de la composición farmacéutica de un anticuerpo anti-OPGL que se va a ampliar dependerá terapéuticamente, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles apropiados de dosis para el tratamiento, de acuerdo a ciertas modalidades, variará de esta manera dependiendo, en parte de la molécula distribuida, la indicación para la cual se esté usando el anticuerpo anti-OPGL, la ruta de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el clínico puede titular la dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. El intervalo típico de dosis de aproximadamente 0.1 Mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En ciertas modalidades, la dosis puede variar de 0.1 Mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg; o de 1 Mg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg ó de 5 µg/kg hasta aproximadamente 30 mg/kg. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del anticuerpo anti-OPGL de la formulación usada. Por ejemplo, un clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que logra el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede administrar como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) durante el tiempo, o como una infusión continua vía un dispositivo o catéter de implantación. El refinamiento adicional de la dosis apropiada se hace por rutina por aquellos expertos en la técnica y está dentro del ámbito de las tareas realizadas habitualmente por los mismos. Las dosis apropiadas se pueden averiguar a través del uso de datos apropiados de dosis-respuesta. Las rutas de administración para las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen oralmente, a través de inyección por ruta intravenosa, intraperitoneal , intracerebral (intra-parenquimal) , intracerebroventricular , intramuscular, intra-ocular, intra-arterial , intraportal o intralesional ; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por inyección de bolo o de forma continua por infusión, o por dispositivo de implantación. La composición farmacéutica también se puede administrar de manera local vía implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado, y la distribución de la molécula deseada puede ser mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua . También puede ser deseable usar composiciones farmacéuticas de anticuerpo anti-OPGL de acuerdo con la invención ex vivo. En estos casos, las células, tejidos u órganos que se han removido del paciente se exponen a las composiciones farmacéuticas de anticuerpos anti-OPGL después de lo cual las células, tejidos y/o órganos se implantan subsecuentemente de regreso en el paciente. En particular, el anticuerpo anti-OPGL se puede distribuir al implantar ciertas células que se han manejado genéticamente, usando métodos como aquellos descritos en la presente, para expresar y segregar el polipéptido. En ciertas modalidades, estas células pueden ser células animales o humanas, y pueden ser heterólogas, autólogas o xenogénicas, o pueden estar inmortalizadas. En ciertas modalidades, las células pueden estar inmortalizadas. En otras modalidades, a fin de disminuir la oportunidad de una respuesta inmunológica, las células se pueden encapsular para evitar infiltración de los tejidos circundantes. En modalidades adicionales, los materiales de encapsulación son típicamente biocompatibles , encierros poliméricos semipermeables, o membranas que permiten la liberación del producto proteico pero impiden la destrucción de las células con el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Ej emplos Los siguientes ejemplos, que incluyen los experimentos llevados a cabo y los resultados logrados se proporcionan para propósitos ilustrativos únicamente y no se van a considerar como que limiten la presente invención.

Ejemplo 1 Producción de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra OPGL Ratones HuMab Transgénicos Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos a OPGL usando las variedades HCo7, HCol2 y HCo7+HCol2 de ratones transgénicos, cada uno de los cuales expresa genes de anticuerpos humanos. En cada una de ¦ estas variedades de ratón, se ha interrumpido de manera homocigótica el gen endógeno de cadena ligera kappa de ratón (como se describe en Chen et al., 1993, EMBO J. 12: 811-820) y se ha interrumpido de manera homocigótica el gen endógeno de cadena pesada de ratón como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187 (incorporada como referencia) . Cada una de estas variedades de ratón tiene un transgen de cadena ligera kappa humanaa, KCo5 (como se describe en Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14 : 845-851) . La variedad HCo7 tiene el transgen de cadena pesada humana HCo7 como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806; 5,635,825 y 5,545,807 (incorporadas como referencia) . La variedad HCol2 tiene el transgen de cadena pesada humana HCol2 como se describe en el Ejemplo 2 de la Publicación PCT WO 01/09187 (incorporada como referencia) . La variedad HCo7+HCol2 tiene tanto el transgen de cadena pesada HCo7 como el HCol2 y es hemicigótica para cada transgen. Todas estas variedades se refieren en la presente como ratones HuMab.

Inmunizaciones HuMab: Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos a OPGL, se inmunizaron ratones HuMab con OPGL recombinante , purificado, derivado de células de E. col i ó CHO como el antígeno. Los esquemas de inmunización general para ratones HuMab se describen en Lonberg et al. 91994, Nature 368 : 856-859, Fishwild et al., ibid., y la Publicación PCT WO 98/24884 (las enseñanzas de los cuales se incorporan como referencia) . Los ratones eran de 6-16 semanas de edad en la primera infusión del antígeno. Se usó una preparación recombinante purificada (50-100 µg) del antígeno OPGL (por ejemplo, purificado de células de CHO o E. coli transíectadas que expresan OPGL) para inmunizar de forma intraperitoneal (IP) o subcutáneamente (Se) ratones HuMab. Se realizaron inmunizaciones en ratones transgénicos HuMab dos veces usando el antígeno en el adyuvante completo de Freund, debido por inmunización IP de 2-4 semanas (hasta un total de 9 inmunizaciones) con el antígeno en el adyuvante incompleto de Freund. Varias docenas de ratones se inmunizaron para cada antígeno. Un total de 136 ratones HuMab de las variedades HCo7, HCol2 y HCo7+HCol2 se inmunizaron con OPGL. Se monitorizó por sangrados retro-orbitales la respuesta inmunitaria. Para seleccionar ratones HuMab que producen anticuerpos que se unen a OPGL, se probaron sueros de ratones inmunizados por ELISA como se describe por Fishwild et al. supra. De forma breve, se revistieron placas de microtítulo con OPGL recombinante , purificado a partir de células CHO o E. coli a 1-2 µ?/mL en PBS y 50 µL/cavidad incubado a 4°C durante la noche, luego se bloquearon con 200 µL/ca idad con suero de pollo al 5 % de PBS/Tween (0.05 %) . Se adicionaron diluciones de plasma de ratones inmunizados con OPGL a cada cavidad y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con un reactivo policlonal específico de Fe anti-IgG humano de cabra conjugado a peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se revelaron con sustrato de ABTS (Sigma, A-1888, 0.22 mg/mL) y se analizaron a OD de 415-495. Los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-OPGL usando para producir anticuerpos monoclonales como se describe posteriormente.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos a OPGL Se preparan los ratones para la producción de anticuerpos monoclonales al reforzar con antígeno intravenosamente 2 días antes del sacrificio, y se removieron los vasos posteriormente. Se aislaron los esplenocitos de los ratones a partir de los ratones HuMab y se fusionaron con PEG a una línea de células de mieloma de ratón en base a protocolos normales. Típicamente, se realizaron 10-20 fusiones para cada antígeno. De forma breve, se fusionaron suspensiones de células únicas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados a un cuarto de células de mieloma de ratón no segregantes P3X63 -Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) usando PEG al 50 % (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) . Las células se colocaron en placa a aproximadamente 1x10s células/cavidad en placas de microtítulo de fondo plano, seguido por una incubación de aproximadamente 2 semanas en el medio selectivo que contiene 10 % de suero bovino fetal, 10 % de medio acondicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) y 3-5 % de origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio) más HEPES 5 mM, 2 -mercaptoetanol 0.055 mM, 50 mg/mL de gentamicina y lx HAT (Sigma, CRL P-7185) . Después de 1-2 semanas, se cultivaron las células que medio en el cual se remplazó el HAT con HT. Los hibridomas resultantes se evaluaron selectivamente para la producción de anticuerpos específicos al antígeno. Se evaluaron selectivamente cavidades individuales por ELISA (descrito anteriormente) para anticuerpos IgG monoclonales anti-OPGL, humanos. Una vez que se ha presentado el crecimiento extensivo de hibridomas se monitorizó el medio usualmente después del 10-14 días. Los hibridomas secretorios de anticuerpos se volvieron a colocar en placa, se evaluaron selectivamente duramente y si aun son positivos por ELISA para IgG humanos, se subclonaron los anticuerpos monoclonales anti-OPGL al menos dos veces al limitar la dilución. Los subclones estables entonces se cultivaron in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización.

Selección de Anticuerpos Monoclonales Humanos que se Unen a OPGL Un ensayo de ELISA como se describe anteriormente se usó para evaluar selectivamente los hibridomas que mostraron reactividad positiva con el inmunógeno de OPGL. Se subclonaron y adicionalmente se caracterizaron los hibridomas que segregan un anticuerpo monoclonal que se une con alta avidez a OPGL. Un clon de cada hibridoma, que retuvo la reactividad de las células de origen (como se determinó por ELISA) , se eligió para elaborar un banco de 5-células viales almacenado en nitrógeno líquido. Se realizó un ELISA específico del isotipo para determinar el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos como se describe en la presente. En estos experimentos, se revistieron las cavidades de la placa de microtítulo con 50 µ?/cavidad de una solución de 1 µg/mL de cadena ligera kappa anti -humana de ratón en PBS y se incubó a 4°C durante la noche. Después del bloqueo con suero de pollo al 5%, las placas se hicieron reaccionar con el sobrenadante de cada anticuerpo monoclonal probado y un control de isotipo purificado. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Las cavidades entonces se hicieron reaccionar con ya sea antisueros policlonales anti-humanos de cabra conjugados con peroxidasa de rábano específicos de IgGi o IgG3 humana y las placas se revelaron y analizaron como se describe anteriormente. Los anticuerpos monoclonales purificados a partir de seis sobrenadantes de hibridoma que mostraron unión significativa a OPGL como se detectó por ELISA se probaron adicionalmente para la actividad biológica usando ensayos de unión al receptor in vitro y ensayos de formación de osteoclastos in vitro dependientes de OPGL humano (como se describe en el ejemplo 6 posterior) . Los anticuerpos seleccionados se designaron 16E1, 2E11, 18B2, 2D8, 22B3, y 9H7. La alineación de cadena pesada de estos anticuerpos anti-OPGL se muestra en la Figura 15. La alineación de cadena ligera para los anticuerpos anti-OPGL se muestra en la Figura 16. Se muestran en negritas las secuencias no de consenso y están sombreadas, y están subrayadas las regiones de determinación de la complementariedad (CDR) .

Ejemplo 2 Clonación de cadenas pesada y ligera anti-OPGL de 9H7 Clonación de la cadena ligera del MAb anti-OPGL de 9H7 Tres ADNc de cadena ligera de hibridoma anti-OPGL (9H7, 16E1 y 18B2) se clonaron en el vector de expresión de células de mamífero pDSR19. La construcción de un plásmido que codifica para la cadena ligera kappa de 9H7 se describe explícitamente; se realizó la clonación de las otras especies de cadena ligera usando procedimientos similares. La región variable de cadena ligera kappa anti -OPGL- 9H7 se obtuvo usando métodos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc de primera hebra de preparado del ARN total del hibridoma 9H7. Se preparó el ADNc de primera hebra a partir del ARN total de 9H7 usando un cebador aleatorio con un 5-adaptador extendido (5 ' GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3 ' , SEQ ID NO: 53) y los materiales y métodos provistos por el Gibco SuperScript IIMR Preamplification System para el equipo de Síntesis de ADNc de Primera Hebra (Número de Catálogo 18089-011) . Los oligonucleótidos a continuación se usaron para la PCR: Cebador 51 GeneRacerMR (Invitrogen) (SEQ ID NO:54): 5'-GGA CAC TGA CAT GGA CTG AAG GAG TA - 3 ' ; cebador 3 ' kappa RACE, 2310-03 (SEQ ID NO:55): 51 -GGG GTC AGG CTG GGA CTG AGG - 3 ' ; Los ADN amplificados se clonaron en pCRII-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron los plásmidos resultantes. La secuencia de consenso de cadena kappa se usó para diseñar los cebadores para la amplificación por PCR en la región variable de la cadena kappa de 9H7. Para generar la secuencia de señal, se realizó una PCR de tres pasos. Primero, se usaron los cebadores 2669-73 y 2708-53 (expuestos posteriormente) con una plantilla del clon de cadena ligera de ADNc de 9H7. Las condiciones usadas para la reacción fueron: 94 °C durante 1 minuto; 94 °C durante 20 segundos, 42 °C durante 30 segundos, 74 °C durante 150 segundos por 2 ciclos; 94 °C durante 20 segundos; 56°C durante 30 segundos, 74°C durante 150 segundos por 25 ciclos; y 74 °C durante 7 minutos con Pfu-polimerasa y el amortiguador apropiado y los nucleótidos apropiados.

Entonces el producto de PCR se amplificó con los cebadores 2663-07 y 2703-53 seguido por amplificación con los cebadores 2663-08 y 2708-53. Estos cebadores se muestran a continuación . 2663-08 (SEQ ID NO:56) Hwdill Xbal Kmssk 5'-C AGC AO ÁÁGCITCTAGA CCACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GG-3'; 266347 (SEQ ID NO: 5?) 5'-CC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCC AGAT-3*; 2669-73 (SEQ ID NO: 58) 5'-G TGG TTG AGA GGT GCC AGA TGT GAA ATT GTG CTG ACC CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TGT C-3 2708*53 (SEQ BD NO: 59) Salí 5 *-CTT GTC GAC TCA ACA CTC CC CCT GTT GAA GCT C-3*. Las reacciones de PCR generaron un fragmento de 741 pb que codifica para 238 residuos de aminoácidos (que incluyen la secuencia de señal de 22 aminoácidos) que se purificó usando un equipo de Purificación de PCR QIAquick (Qiagen Cat . NO. 28104) , se cortó con Xbal y Salí, y se purificó nuevamente con Qiagen. Este fragmento, que contienen la cadena ligera completa con un sitio 5 ' Kozak (iniciación transduccional ) y la siguiente secuencia de señal para la expresión del mamífero: MDMRV^PAQLLGLLLWLRGA C <SEQ ID NO: 60), se ligó en pDSRal9 para generar el plásmido pDSR l9:9H7 kappa (Figura 17) . El pDSRccl9 se ha descrito de forma previa (ver, Solicitud Internacional, número de Publicación O 90/14363, que se incorpora en la presente como referencia para cualquier propósito) . De forma breve, para elaborar pDSRal9, se modificó pDSRa2 de las siguientes manera: la secuencia que contiene la señal de terminación de trascripción/poliadenilación de la subunidad alfa de la hormona de licoproteína de pituitaria bovina alfa-FSH (hormona de estimulación al folículo) se acortó por aproximadamente 1400 pares de base, a 885 pares de base, y termina en el sitio Ndel después de la modificación; el promotor de dihidrofolato-reductasa (DHFR) contuvo 209 pares de base, que se han acortado desde el extremo 5' por aproximadamente 1 kilobase; y se suprimió un fragmento de Bgll de aproximadamente 550 pares de base de la secuencia de poliA de DHFR. El clon de expresión de cadena ligera kappa de 9H7 se secuenció para confirmar que codificó el mismo péptido que se identificó en el hibridoma 9H7. El vector de expresión final, pDSRal9:9H7 es de 5479 pb y contiene las 7 regiones funcionales descritas en la Tabla 2.

Número de Pares de Base de Plásmido : 2 a 881 Una señal de terminación de trascripción/poliadenilación de la -subunidad de la hormona de glicoproteína de pituitaria bovina (ct-FSH) (Goodwin, et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11: 6873 -82; No de Acceso Genbank X00004) 882 a 2027 Un minigen de dihidrofolato-reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR de ratón endógeno, las secuencias de codificación de ADNc, y las señales de terminación de trascripción/poliadenilación de DHFR (Gasser et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355- 64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen para la replicación del plásmido en E. coli (No de Acceso del Genbank J01749) 3949 a 4292 Un promotor temprano de SV40, intensificador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol . 8:466-72, No de Acceso del Genbank J02400) 4299 a 4565 Elemento intensificador transduccional del dominio de LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80^:3618-22, No de Acceso del Genbank J02029) 4574 a 4730 Un intrón de las señales de donador/aceptor de empalme 16S, 19S de SV40 (Okayama y Berg, 1983. Mol. Cell. Biol. 3:280-9, No de Acceso del Genbank J02400) 4755 a 5479 El ADNc de cadena ligera kappa de 9H7D4 entre los sitios Xbal y Salí Construcción de pDSR19:hIgGl CH Se construyó un plásmido de IgGi de región constante humana/región variable de rata:pDSR19 usando una ligación de tres piezas de una secuencia de región variable de rata, la región constante de humano (CH1, bisagra, CH2 , y CH3 dominios) y pDSR19. El plásmido pDSRctl9 : hlgGl CH lineal se preparó al digerir el plásmido de IgG de región constante de humano/región variable de rata:pDSR19 con las enzimas de restricción Xbal y BsMBI para remover la porción de codificación ee la región variable de rata. El plásmido lineal resultante que contiene el dominio de región constante de IgGi humana de 1.0 kpb (CH1, bisagra, CH2 y CH3 dominio) se aisló en gel y se usó para secar las regiones variables aOPGL derivadas de hibridoma.

Clonación de la cadena pesada de MAb anti-OPGL de 9H7 Se clonaron tres ADNc de cadena pesada de IgGi de hibridoma anti-OPGL, 9H7, 16E1 y 18B2 en el vector de expresión de células de mamífero pDSR19. La construcción de un plásmido que codifica para la región pesada de IgGi de 9H7 se describe de forma explícita en la presente; las otras cadenas pesadas de hibridoma se clonaron usando procedimientos similares. La región variable de cadena pesada anti-OPGL-9H7 se obtuvo usando métodos de amplificación por PCR del ADNc de primera hebra preparado del ARN total de 9H7 de hibridoma . El ADNc de primera hebra se preparó a partir del ARN total de 9H7 usando un cebador aleatorio con un 5 ' -adaptador extendido (5'-GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-31 , SEQ ID NO: 53) y los materiales y métodos proporcionados por el Sistema de Preamplificación Gibco SuperScript II MR para el equipo de Síntesis de ADNc de Primera Hebra (Número de Catálogo 18089-011) . Los oligonucleótidos posteriores se usaron para la PCR: cebador RACE de cadena pesada 5', 2508-02 (SEQ ID NO: 61) : 5' - (CG)AG GT(CG) CAG(CT)T(GT) GTG (CG)AOTC- 3'; cebador RACE de cadena pesada 3', 2420-54 (SEQ ID NO: 62) : 5' -CTG AGT TCC ACGACA CC - 3'. Se clonó el ADN amplificado en pCRII-TOPO (Invitrogen) y se secuenciaron los plásmidos resultantes. La secuencia de consenso de cadena pesada se usó para diseñar los cebadores para la amplificación por PCR de la subregión variable de la cadena pesada de 9H7. Para generar la secuencia de señal, se realizó una PCR de tres pasos.

Primero, se usaron los cebadores 2512-98 y 2673-14 con una plantilla del clon de ADNc de cadena pesada de 9H7. Las condiciones usadas para la reacción fueron: 94 °C durante 1 minuto; 94°C durante 20 segundos, 42°C durante 30 segundos, 74 °C durante 150 segundos por 2 ciclos; 94 °C durante 20 segundos; 56°C durante 30 segundos, 74°C durante 150 segundos por 25 ciclos; y 74 °C durante 7 minutos con Pfu-polimerasa y el amortiguador apropiado y los nucleótidos apropiados. Entonces el producto de PCR se amplificó con los cebadores 2663-07 y 2663-14 seguido por amplificación con los cebadores 2663-08 y 2663-14. Los cebadores se muestran a continuación . 2663-08 (SEQ ID NO:63) HinAlñ Xbal ozak S'-C AGC AG AAGCTXCTAGA CCACC ATO GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GG-3'; 2663-07 (SEQ ID NO: 64) 5'-CC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCC AGA T-3'; 2512*98 (SEQ lü NO: 65) 5'-G TGG TTG ACA GGT GCC AGA TGT GAC GTG CAG CTG GTG CAG TCT -3'; 2673-14 (SEQ ID NO: 66) 5'-GT GGA GGC ACT AGA GAC GGT GAC CAG GGC TCC CTG GCC CCA GGG GTC GAA -3*.

Las reacciones de PCR generaron un fragmento de 443 pb que codifica para 138 residuos de aminoácido (que incluyen la secuencia de señal de 22 aminoácidos) que se purificó usando el equipo de Purificación por PCR QIAquick (Qiagen Cat . No. 28104) , se cortó con Xbal y Salí, y se purificó nuevamente con Qiagen. Este fragmento, que contienen la cadena pesada con un sitio 5' Kozak (inició transducción) y la siguiente secuencia de señal para la expresión del mamífero: DM VPAQI1X3LLLLWL GARC (SEQ IDNO: 60), se ligó en pDSRal9 : hIgGlCH para generar el plásmido pDSRal9:9H7 IgGl (Figura 18) . El clon de expresión de cadena pesada de IgGi de 9H7 se secuenció para confirmar que codificó el mismo péptido que se identificó en el hibridoma 9H7. El vector de expresión final, pDSRal9 : región variable de rata/región constante de humano IgGx es 6158 pb y contiene las 7 regiones funcionales descritas en la Tabla 3.

Tabla 3 Número de Par De Base de Plásmido : 2 a 881 Una señal de terminación de trascripción/poliadenilación de la a-subünidad de la hormona de glicoproteina de pituitaria bovina (a-FSH) (Goodwin, et al., 1983, Nucleic Acids Res. _11: 6873-82; No de Acceso Genbank X00004) 882 a 2027 Un minigen de dihidrofolato-reductasa (DHFR) de ratón que contiene el promotor de DHFR de ratón endógeno, las secuencias de codificación de ADNc, y las señales de terminación de trascripción/poliadenilación de DHFR (Gasser et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. 79:6522-6; Nunberg et al., 1980, Cell 19:355- 64; Setzer et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5143-7; McGrogan et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:2307-14) 2031 a 3947 secuencias de pBR322 que contienen el gen marcador de resistencia a ampicilina y el origen para la replicación del plásmido en E. coli (No de Acceso del Genbank J01749) 3949 a 4292 Un promotor temprano de SV40, intensificador y origen de replicación (Takebe et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8:466-72, No de Acceso del Genbank J02400) 4299 a 4565 Elemento intensificador transduccional del dominio de LTR de HTLV-1 (Seiki et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:3618-22, No de Acceso del Genbank J02029) 4574 a 4730 Un intrón de las señales de donador/aceptor de empalme 16S, 19S de SV40 (Okayama y Berg, 1983. Mol. Cell. Biol. 3:280-9, No de Acceso del Genbank J02400) 4755 a 5479 El ADNc de cadena pesada de rVh/hChl entre lo sit ios Xbal y Salí. Las secuencias de lo cuales siguen ( SEQ ID NO : 67 ) : Xhal TCTA ACCACCATGG ACATCAGGCT CAGCT AGTT TCCTTGTCC ????????? AGGTGTCCAG TGTGAGGTAG ÁACTGGTGGA GTCTGGGGGC GGCTTAGTAC AÁCCTGGAAG GTCCATGACA CTCTCCTGTG G¾GCCTCGGG ATTCACHTC AG AAOCTAT0 GCATGGCCTG ÚGTCCGCCAG CGCCAACGA AGGGTCTGGA GTGGGTCTCA. TCÁÁTFÁCTG C AGTGGTGG TACCACCTAC TATCG AGACT CC6TG AAGGG AGCACCTCIGGGGGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGCTCA AGGACTACT CCCCGAACCG GTGACGGTOT OJTGGAACTC AGGCGCCCTG ACCAGCGGCG TGCACACC T CC GGCTGTC C1ACAGTCCT CAQG ACTC Á CjrcCCTCAGC ÁGCGTCGTGACrGTGCCCTC CAGCAGCrre GGCACCCAÜA. CCTACATCXG CAACQIGAATCACAAGOCCA GCAACACCAA GGTGGÁCAAG AAAGTTGAGC OCAAAI TO TOACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA CTCCTGGGGG OACOQTCAGT C HÍ XTC1TCCCCCCAAÁAC CCAAGGACAC OCTCA GA C TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATOCGTGGTG GTGGACGTGA GC ACGAAGACCCTGAGGTC AAGTTCAACT GGTACGTGGA OGGOG GGAÜ dTGCATAATO CCÁAGACAAA GGCGCGGGAG GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCQTCCTCA ' XX3 CCT0CA CCAGGACTGG CTGÁATGGC ÁGGAGTACAAGTG AGe C TCCÁACAAAG CCC CCCAGC CCCCATCGAG AAAACCA Ci'CCAAAGCCAA ÁGGGCAGCCC CGAOÁÁCCAC AGGTGTÁCÁC CCTCHXXX A TCCCGOGATG AGCTQACCAÁ GAACCAGOTC AGCCTGACCT GCC1X3GTCAA AGGCTTC AT CCCAGGGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATG0GCAG0C6GAQAACAA CTACAAGAOC ACGCCTCCCG TGCTGGACTC OG ACGGCTCC TTCTTCCTCT ATAGCAAGCT CACCGTGGAC AAGAGCAGGT GGCAGCÁGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCFGGAC A CCÁCTACA CGC&GAAGAG ocTcrcccro TCTCCGGGTA Salí AATGATAAGT CG AC Ej emplo 3 Expres ión de MAb anti -OPGL de 9H7 de células CHO Se producen anticuerpos ant i -OPGL recombinantes por células de ovario de hámster chino especí f icamente AM-1 /D de CHO , como se describe en la patente de los Estados Unidos número 6,210,924 (incorporada como referencia) . Las secuencias de ADN que codifican para las cadenas ligera o pesada, completas de cada anticuerpo anti-OPGL de la invención se clonan en vectores de expresión tal como aquellos descritos anteriormente. Las células AM-l/D de CHO se co-transfectan con un vector de expresión capaz de expresar una cadena pesada completa y un vector de expresión que expresa la cadena ligera completa del anticuerpo anti-IOPGL apropiado. Por ejemplo, para generar el anticuerpo 22B3, las células se co-transfectan con un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 30 y un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 32. Para generar el anticuerpo 2E11, las células se co-transfectan como un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 34 y un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36. Para generar el anticuerpo 2D8, las células se co-transfectan con un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 38 y un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 40. Para generar el anticuerpo 18B2, las células se co-transíectan con un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone SEQ ID NO: 42 y un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 44. Para generar el anticuerpo 16E1, las células se co-transfectan con un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 46 y un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 48. Para generar el anticuerpo 9H7, las células se co-transfectan con un vector capaz de expresar una cadena pesada completa que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 50 y un vector capaz de expresar una cadena ligera completa que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 52. La Tabla 4 resume las cadenas pesadas y ligeras completas para los varios anticuerpos de OPGL.

Tabla 4 La expresión estable del MAb anti-OPGL de 9H7 se logró por co-transfección de la IgGi de pDSRocl9:9H7 y los plásmidos kappa de pDSR l9:9H7 en células de ovario de hámster chino adaptadas, libres de suero, deficientes en dihidrofolato-reductasa (DHFR" ) (CHO AM-l/d, patente de los Estados Unidos Número 6,210,924) usando el método de fosfato de calcio reconocido en la técnica. Las células transfectadas se seleccionaron en placas de 96 cavidades en medio que contiene suero dial izado pero que no contiene hipoxantina- timidina para asegurar el crecimiento de las células que expresan la enzima DHFR. Se separaron selectivamente más de 5000 clones transfectados usando ensayos tal como HTRF (fluorescencia resuelta en tiempo homogéneo) y ELISA a fin de detectar la expresión del MAb anti-OPGL de 9H7 en el medio acondicionado. Los clones de expresión más alta se seleccionaron para la clonación de células únicas y la creación de bancos celulares.

Ejemplo 4 Producción de anticuerpos anti-OPGL Los anticuerpos anti-OPGL se producen por expresión en una línea clonal de células CHO. Para cada corrida de producción, las células de un frasco individual se descongelaron en medio de cultivo de células libre de suero. Las células se cultivan inicialmente en un matraz T y se expanden en serie a través de una serie de matraces giratorios hasta que sea generado suficiente inoculo para sembrar un bioreactor de 20L. Después del crecimiento durante 5-10 días, el cultivo entonces se usa para inocular un bioreactor de 300 L. Después del crecimiento durante 5-10 días adicionales, el cultivo se usa para inocular un bioreactor de 2000 L. se lleva a cabo la producción en un bioreactor de 2000 L usando un cultivo de lote alimentado, en el cual se adiciona una alimentación nutriente que contiene los componentes concentrados del medio para mantener el crecimiento celular y la viabilidad del cultivo. La producción dura aproximadamente dos semanas tiempo durante el cual se produce constitutivamente el anticuerpo anti-OPGL por las células y se segrega el medio de cultivo celular . El reactor de producción se controla a pH ajustado, temperatura, y nivel de oxígeno disuelto: el pH se controla por gas de dióxido de carbono y adición de carbonato de sodio; el oxígeno disuelto se controla por los flujos de aire, nitrógeno y gas oxígeno. Al final de la producción, el caldo celular se alimenta en una centrífuga de pila de discos y el sobrenadante de cultivo se separa de las células. El concentrado se clarifica adicionalmente a través de un filtro profundo seguido por un filtro de 0.2 µ??. el medio acondicionado, clarificado entonces se concentra por ultrafiltración de flujo tangencial. El medio condicionado se concentra 15a 30 veces. El medio condicionado, concentrado, resultante entonces ya sea se procesa a través de purificación o se congela por purificación en una fecha posterior. La Figura 19 representa un proceso de cultivo de células de ejemplo para producir un anticuerpo anti-OPGL.

Ejemplo 5 Evaluación selectiva de anticuerpos para la unión a OPGL por BIAcore Se realizaron todos los experimentos en BIAcore 2000 de acuerdo a las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente usando un amortiguador de corrida que contiene Hepes 10 mM (ph 7.4), NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, y Tween 20 al 0.005%. Se inmovilizó la proteína G a 50 µ9/?t?_. en acetato 10 mM pH 4.5 a un nivel de 1600 unidades de respuesta ( U) en un circuito sensor grado Investigación CM5 (BIAcore, Inc.) . Se capturaron los anticuerpos (8-20 µg/mL) en el circuito de proteína G a un nivel de 300-400 RU. Se hicieron pasar OPGL humano de CHO (hOPGL) 140 o OPGL de ratón de E. coli (mOPGL) 158 sobre los anticuerpos inmovilizados a concentraciones de 0.25 - 62nM. SE usó el modelo de Langmuir 1:1 para determinar las cinéticas de unión. Se usó la proteína G inmovilizada a 1600 RU como una superficie en blanco. Se usó un anticuerpo monoclonal de ratón con un control positivo para mostrar la unión a hOPGL 140 y para monitorizar la estabilidad de superficie. Todos los anticuerpos anti-OPGL mostraron fuerte unión a CHO hOPGL 140. 22B3 parece tener una velocidad más lenta que los otros anticuerpos probados. No se detectó unión de E. coli mOPGL 158. Los resultados se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5 Ejemplo 6 Actividad Neutralizante de Anticuerpo Anti-OPGL Inhibición de formación de osteoclastos El RAW 264.7 (Número de Acceso TIB-Type Culture Collection, Manassas , VA) es una línea de células macrofas murinas que se derivó del tumor inducido por virus de leucemia murina de Abelson. Las células RAW 264.7 se diferenciaran a células tipo osteoclastos en la presencia de OPGL. Un ensayo para la generación de osteoclastos en cultivo de células RAW en la presencia de OPGL se ha descrito en detalle por Hsu et al., 1999, Proc . Nati. Acad. Sci . U.S. A. 96 : 3540 -3545 , que se incorpora como referencia en la presente. Se pueden estimular células RAW por el ligando de OPGL para diferenciación en células tipo osteoclastos y la diferenciación se puede medir por actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) , una propiedad de los osteoclastos. Esta actividad proporciona la base de los anticuerpos anti-OPGL caracterizantes producidos de acuerdo con la invención, al valorar el efecto de los anticuerpos en la osteoclastogénesis . Se incubaron células RAW durante 4 días en la presencia de una cantidad constante de OPGL (40 ng/mL) y cantidades variables de anticuerpo anti-OPGL (6.3 ng/mL a 200 ng/ml) en medio de cultivo celular (DMEM, FBS al 10%, 0.3 mg/ml de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G, 10 µg/mL de sulfato de estreptomicina) . Al final de 4 días, las células se tiñeron para la actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) por permeabilización y acidificación, seguido por tratamiento con p-nitrofenilfosfato (PNPP) durante 5 minutos. De forma breve, el medio se aspiró de las células, y se adicionaron 100 µ??? de amortiguador de citrato (que tiene una fórmula de 410 mL de ácido cítrico 0.1M, 590 mL de citrato 0.1M, sal trisódica y 1 mL de Tritón X-100) a cada cavidad y las placas se incubaron durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. Cien microlitros de solución PNPP (que tiene una fórmula de 157.8 mg de reactivo de fosfatasa acida (Sigma 104-100), 7.2 mL de solución de tartrato (Sigma número de catálogo 387-3) , y 22.8 mL de amortiguador de citrato) entonces se adicionó, y las placas se incubaron durante 3 a 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se terminó por adición de 50 µL de solución de NaOH 0.5 M. La TRAP convierte p-nitrofenilfosfato a para-nitrofenol, que se puede cuantificar por medición de densidad óptica a 405 nm. La actividad de TRAP, que es un marcador sustituto para el desarrolló de osteoclastos, correlaciona por lo tanto con la densidad óptica a 405 nm. En la Figura 20 se muestra una gráfica de la densidad óptica contra la concentración de anticuerpos anti-OPGL y demuestra que el anticuerpos anti-OPGL inhibió la formación de osteoclastos en este ensayo de una manera dependiente de la dosis. Los valores de IC50 se calcularon usando la función de pronóstico, y se muestran en la Tabla 6. UN anticuerpo anti-OPGL humano, policlonal de rata enlazado a fosfatasa alcalina (AP Ra-anti-HuOPGL Ab) con actividad neutralizante de OPGL se usó como un control positivo para el ensayo de actividad neutralizante del anticuerpo anti-huOPGL.

Tabla 6 Muestra IC50 (ng/mL) AP Ra-anti- 112 HuOPGL Ab 9H7 129 18B2 80 2D8 611 2E11 77 16E1 352 22B3 146 IC5o (ng/mL) de Corrida Promedio AP Ra-anti-HuOPGL Ab Promedio 140 Stdev 35.8 CV 26% Cuenta 25 Ejemplo 7 Farmacocinética en Monos Cynomolgus La actividad in vivo y la farmacocinética de los anticuerpos anti-OPGL de la invención se caloraron usando monos Cynomolgus. Tres monos Cynomolgus hembra, no mayores de cinco años de edad y que pesan de 2 a 5 kilogramos recibieron cada uno dosis subcutáneas únicas (SC) de 1 mg/kg de anticuerpo anti-OPGL. Los animales se dosificaron con el anticuerpo anti-OPGL expresado de células de ovario de hámster chino (CHO) transíectadas y se tomaron muestras séricas para la determinación de los niveles del anticuerpo anti-OPGL, para los análisis del anticuerpo anti-terapéutico, y los análisis del marcador de producción ósea, en suero N-telopéptido (N-Tx sérico) , fosfatasa alcalina (ALP) , y calcio sérico (Ca sérico) . Los perfiles de concentración en suero-tiempo después de la administración SC se muestran en la Figura 21. Los perfiles de concentración de N-Tx en suero-tiempo después de la administración de SC se muestran en la Figura 22.

Ejemplo 8 Identificación de un Epítope para anticuerpos en OPGL Producción de OPGL murino, variante Se produjo OPGL humano [143-317] como se describe en el Ejemplo 1 de la WO 01/62932, publicada el 30 de Agosto del 2001, que se incorpora de este modo como referencia en su totalidad. El OPGL murino [158-316] que contiene los residuos 158 hasta 316 de aminoácidos del OPGL murino (como se muestra en la Figura 1 de la Solicitud Internacional, Número de Publicación W098/46751, incorporada en la presente como referencia) precedido por un residuo de metionina N-terminal introducido se produjo en E. coli. Se purificó el OPGL murino [158-316] de la fracción soluble de bacterias como se describió previamente (Lacey et al., 1998, Cell 93_: 165-176) . Se produjo el OPGL murino marcado con FLAG [158-316] al introducir un ácido nucleico que codifica para una metionina N-terminal seguida pro una secuencia de marca de FLAG fusionada al N-término de los residuos 158-316 como se muestra en la Figura 1 de la Solicitud Internacional, Número de Publicación W098/46751 usando técnicas convencionales de ingeniería genética. La molécula de OPGL marcada con FLAG [158-316] se clonó en el vector de expresión bacteriano pAMG21 (pAMG21 se depositó con la American Type Culture Collection y tiene Número de Acceso 98113) . Se construyó la variante de polipéptido de OPGL murino marcado con FLAG [158-316] en la cual los residuos de aminoácidos SVPTD (SEQ IN NO: 68) en las posiciones 229-233 (como se muestra en la Figura 1 de la Solicitud Internacional, Número de Publicación W098/46751 se sustituyeron con los correspondientes residuos de aminoácido DLATE ((SEQ IN NO: 69) en las posiciones 230-234 (como se muestra en la Figura 4 de la Solicitud Internacional, Número de Publicación W098/46751) . La construcción resultante referida como "OPGL murino-FLAG [158-316] /DE" tiene la secuencia de ácido nucleico y proteínas como se muestra en la Figura 23 (SEQ ID NO: 72) (que muestra sólo donde se localizan las mutaciones) . Los cambios de la secuencia de aminoácidos se localizan en una región de OPGL entre las regiones D y E. La Figura 23 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos murina (SEQ ID NO: 70), humana (SEQ ID NO: 71), y de la variante DE murina (SEQ ID NO: 72) en esta región. Los cambios de la secuencia en la variante murina son S231D, V232L, P233A y D235E con la T en la posición 234 sin cambio. Las secuencias de flanqueo en esta región son virtualmente idénticas entre OPGL murino y humano . Esta molécula se construyó usando una reacción de PCR de dos pasos, donde el primer paso contuvo dos reacciones de PCR separadas, designadas reacción A y reacción B. Tanto para la reacción A como para la reacción B, se usó ADN de pAMG21-OPGL murino-FLAG [158-316] como una plantilla para PCR. La reacción A empleó los nucleótidos #2640-90 y #2640-91 para PCR, en tanto que la reacción B empleó los oligonucleótidos #2640-92 y #2640-93. «2040*90 (SEQ-ID MC¾ ?3); #20 0-91 (líQ. H> NO 74): #¾>40-§2 (SEQ 110 NO: 75): CTG<X:TACTGAATATCXtCAQCTGAl X> t3í #W40^5 (SEQ 1 NO:76>: Las condiciones para las reacciones A y B fueron: 95°C durante 1 minuto; 95°C durante 20 segundos, 44°C durante 30 segundos, 72 °C durante 45 segundos por 5 ciclos; 95°C durante 20 segundos; 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos por 25 ciclos; y 72 °C durante 10 minutos con Pfu-Turbo-polimerasa (Stratagene) y el amortiguador y nucleótidos apropiados. Después de que se realizó el termociclado, los productos de PCR de las regiones A y B se purificaron a partir de un gel de agarosa usando métodos convencionales. La reacción de PCR de segundo paso, designada reacción C, utilizó los productos de PCR de la reacción A y reacción B purificados como una plantilla y los oligonucleótidos #2640-90 y #2640-93 como cebadores. Las condiciones para la reacción C fueron: 95 °C durante 1 minuto; 95°C durante 20 segundos, 37°C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 minuto por 5 ciclos,- y 72 °C durante 10 minutos con Pfu- urbo-polimerasa y el amortiguador y nucleótidos apropiados. Después del termociclado, el producto de la reacción C se clonó en el vector de clonación pCRII-TOPO (Invitrogen) y se sometió a electroforesis en células DHlOb (Gibco) usando los métodos proporcionados por el fabricante. Se seleccionaron los clones y se secuenciaron para confirmar la secuencia de aminoácidos SVPTD (SEQ ID NO: 68) en OPGL murino [158-316] se cambió a DLATE (SEQ ID NO: 69) . El ADN verificado por secuencia entonces se digirió con Ndel y Xhol, se purificó y se sub-clonó en el vector de expresión bacteriano pAMG21 que da el plásmido pA G21 -OPGL murino-FLAG [158-316] /DE . El hospedador GM 94 de E. coli (depositado con American Type Culture Collection bajo el número de Acceso 202173) que contiene el pAMG21-OPGL murino-FLAG [158-316] /DE se cultivó en el medio 2XYT a una fase de crecimiento exponencial y se indujo para expresar la proteína de OPGL murino marcado con FLAF [158-316] /DE por la adición del autoinductor sintético de V. fischeri a 100 mg/mL. Aproximadamente 3-6 horas después de la incubación, las células se sedimentaron y se purificó la proteína de OPGL murino-FLAG [158-316] /DE recombinante de la fracción soluble de E. coli usando los métodos descritos en Lacey et al., ibid.

Unión de Anticuerpos Anti-OPGL humano a OPGL humano [143-317], OPGL murino [158-316], OPGL murino-FLAG [158-316] /DE Placas Costar E . I .A. /R.UI .A. (Fiat Bottom High Binding, Cat# 3590) se revistieron con 100 µ?/cavidad de ya sea proteínas de OPGL humano [143-317] , proteína de OPGL murino [158-316] , o proteína de OPGL murino marcado con PLAG [158-316] /DE a 3 µ9/?t^ en PBS, durante la noche a 4°C con agitación. Después de la incubación durante la noche, las soluciones de las proteínas se removieron de la placa y se adicionaron 200 µL de Suero de Pollo al 5% (Gibco/BRL Cat# 16110-082) en PBST (PBS más Tween 20 al 0.05%) se adicionó a cada cavidad de la placa y las placas se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 3 horas con agitación. Después de la incubación y bloqueo, las placas se lavaron 4 veces con solución de lavado K-P IX en dH20 (número de Catálogo 50-63-00, Kirkegaard & Perry Laboratories) y se secaron. La proteína de OPGL humano [22-194] -Fe o de anticuerpo-OPGL purificado se diluyó en serie 1:1 a partir de 2 µg/mL a 1.953 ng/mL en Suero de Pollo al 5% en PBST y se adicionaron 100 L/cavidad a las cavidades apropiadas de la placa de microtítulo revestidas con ya sea OPGL humano [143-317] , OPGL murino [158-316] , o proteína de OPGL murino marcado con FLAG [ 158 - 316] /DE . Se incubaron las placas durante 2.25 horas a temperatura ambiente con agitación, se lavaron cuatro veces con solución de lavado IX K-P y se secaron. Se diluyó la IgG snti-humano de cabra (Fe) (Jackson ImmunoResearch, Cat# 109-036-098) 1:3000 en Suero de Pollo al 5% en PBST y se adicionaron 100 µ?? a cada cavidad. Las placas se incubaron durante 1.25 horas a temperatura ambiente con agitación, y se lavaron seis veces con solución de lavado IX K-P y se secaron. Se adicionaron 100 µ?? de sustrato ABTS sin diluir (Kirkegaard & Perry, Cat# 50-66-00) a cada cavidad y la placa se incubó a temperatura ambiente hasta que se desarrolló un color azul-verde suficiente. El desarrollo de color se detuvo por la adición de 100 µ?. de SDS al 1 %. Se realizó la cuantificación del desarrollo de color usando un lector de placa de microtítulo con detección a 405 nm. Los resultados del inmunoensayo enzimático se muestran en las Figuras 24 y 25. Los seis anticuerpos anti-OPGL de la invención se unen a OPGL humano [143-317] . Sin embargo, sólo el anticuerpo 22B3 muestra unión detectable a OPGL murino [158-316] sobre el intervalo de concentración probado (Figura 24) . En tanto que la unión del anticuerpo 22B3 a OPGL murino [158-316] se presenta con una mucho menor afinidad a OPGL humano [143-317] , los anticuerpos 2D8, 9H7, 16E1, y 22B3 que unen a OPGL murino marcado con FLAG [158-316] /DE (Figura 25) casi también como a OPGL humano [143-317] bajo las condiciones de ensayo anteriores. De esta manera, los cambios de aminoácidos en OPGL murino [158-316] /DE en comparación a OPGL murino [158-316] son importantes a la actividad de unión de los anticuerpos 2D8 , 9H7, 16E1 y 22B3. Los anticuerpos 2E11 y 18B2 no muestran unión detectable a ya sea OPGL murino [158-316] u OPGL murino [158 -316] /DE . Se valoró el OPGL murino-FLAG [158-316] /DE para la actividad en un ensayo de células RAW como se describe en el Ejemplo 6 y se observó que tiene una ED50 similar para la formación de osteoclastos como el OPGL humano [143-317], indicando que la variante DE se activa en la promoción de la actividad de los osteoclastos in vitro. Por lo tanto, la unión de los anticuerpos anti-OPGL a OPGL murino [158-316] /DE probablemente va a inhibir la formación de osteoclastos . El epítope de los anticuerpos anti-OPGL humano, 2D8, 9H7, 16E1, y 22B3 se localiza a una región de OPGL humano que incluye al menos los residuos de aminoácidos DLATE (residuos 230 hasta 234 del OPGL humano como se muestra en la Figura 4 de la Solicitud Internacional, Número de Publicación 098/46751) llamados la asa de D-E. Los anticuerpos anti-OPGL humano 2E11 y 18B2 no se unen a los fragmentos peptídicos que corresponde a la región de asa de D-E por si mismos. Sin embargo, se reconocerá que en la molécula nativa de estos anticuerpos pueden unirse a un epítope fuera de la región de asa de D-E o pueden unirse a toda una porción de la región de asa de D-E en combinación con otras porciones de la molécula. Se debe entender que la descripción anterior enfatiza ciertas modalidades específicas de la invención y que todas las modificaciones o alternativas equivalentes a la misma se están dentro del espíritu y el alcance de la invención como se expone en las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (73)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22 Ó SEQ ID NO : 26, O un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas.
2. 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado en que el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E del ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
3. 3. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10 ó SEQ ID NO: 18, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
4. 4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región del ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E.
5. 5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica tanto a una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E, en donde la unión es consecutiva o simultánea .
6. 6. Un anticuerpo humano aislado que se une específicamente al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24 ó SEQ ID NO: 28, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas.
7. 7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a la región de asa de D-E de osteoprotegerina (OPGL) .
8. 8. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica anidando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12 ó SEQ ID NO: 20, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional del misma.
9. 9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región del ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E.
10. 10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la unión tanto en una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E como a toda o una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea.
11. 11. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 45 ó SEQ ID NO : 50, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas.
12. 12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E de ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
13. 13. Un anticuerpo humano asilado que tiene de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 34 ó SEQ ID NO: 32, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas.
14. 14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región de ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E.
15. 15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la unión tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea.
16. 16. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48 ó SEQ ID NO: 62, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional del mismo.
17. 17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E de ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
18. 18. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 36 ó SEQ ID NO: 44, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional del mismo.
19. 19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región de ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E.
20. 20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado poique la unión tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E como a toda o una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea.
21. 21. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque el anticuerpo comprende: a. una cadena pesada que tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 6, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 8, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma; b. una cadena pesada que tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 14; un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que tiene una región variable de cadena ligera que contiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma. c. una cadena pesada que tiene la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 22, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 24, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma; d. una cadena pesada que tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 26, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 18, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma; e. una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 30, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 32, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma; f. una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 38, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 40, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma; g. una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 46, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 48, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma; o h. una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 50, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 52, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
22. 22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E del ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
23. 23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pesada comprende la región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO : 6, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 8, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
24. 24. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, y en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 8, y en donde el anticuerpo se une de manera específica a un ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
25. 25. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 14, un fragmento de unión a antígeno de la misma, un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
26. 26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 14, y en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 16, en donde el anticuerpo se une de manera específica a un ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
27. 27. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 22, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos, como se expone en SEQ ID NO: 24, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
28. 28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 22, y en donde la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 24, en donde el anticuerpo se une de manera específica a un ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
29. 29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pasada comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 26, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 28, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
30. 30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la región variable de cadena pasada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 26, y en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 28, en donde el anticuerpo se une de manera específica a un ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
31. 31. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pasada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 30, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 32, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
32. 32. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pasada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 38, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 40, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
33. 33. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pasada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 46, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 48, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
34. 34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cadena pasada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 50, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 52, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
35. 35. Un anticuerpo humano aislado que se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) , caracterizado porque el anticuerpo comprende: a. una cadena pesada que tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera que tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma; b. una cadena pesada que tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 18, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que tiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 20, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma; c. una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 34, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 36, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma; o d. una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 42, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de la misma, y la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 44, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
36. 36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región de ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E como a toda o una porción de la región de asa de D-E.
37. 37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la unión tanto a una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea.
38. 38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
39. 39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 10, y en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 12, y en donde el anticuerpo se une de manera específica a un ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
40. 40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 18, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 20, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
41. 41. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 18, y en donde la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 20, y en donde el anticuerpo se une de manera específica a un ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
42. 42. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 34, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 36, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
43. 43. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 42, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma, y la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 44, un fragmento de unión a antígeno de la misma, o un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de la misma.
44. 44. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21 ó 35, caracterizado porque la cadena pesada y la cadena ligera se conectan por un ligador flexible para formar un anticuerpo de cadena única.
45. 45. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque es un anticuerpo Fv de cadena única.
46. 46. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque es un anticuerpo Fab.
47. 47. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21 ó 35, caracterizado porque es un anticuerpo Fab' .
48. 48. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21 ó 35, caracterizado porque es un anticuerpo (Fab')2.
49. 49. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21 ó 35, caracterizado porque el anticuerpo es completamente humano.
50. 50. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 21 ó 35, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la unión de OPGL a un receptor de diferenciación y estimación de osteoclastos (ODAR) .
51. 51. Un método para tratar un trastorno osteopénico en el paciente, caracterizado porque comprende administrar a un paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 50.
52. 52. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 50.
53. 53. Un método para tratar un trastorno osteopénico en un paciente, caracterizado porque comprende administrar a un paciente la composición farmacéutica de la reivindicación 52.
54. 54. Un método para detectar OPGL en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: a. poner en contacto una muestra en el anticuerpo de la reivindicación 21 a 35, bajo condiciones que permitan la unión del anticuerpo a OPGL; b. y medir el nivel de anticuerpo unido en la muestra .
55. 55. Una cadena pesada que comprende una región variable de una región constante, caracterizada porque la región variable comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, O un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunológicamente funcional de las mismas.
56. 56. Una cadena pesada caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ'I¾.NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 50, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de las mismas.
57. 57. Una cadena ligera que comprende una región variable de una región constante, caracterizada porque la región variable comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, O un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de las mismas.
58. 58. Una cadena ligera caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en cualquiera de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO : 52, o un fragmento de unión a antígeno o de inmunoglobulina inmunologicamente funcional de las mismas.
59. 59. Un anticuerpo humano, aislado, caracterizado porque comprende : a. regiones de marco de cadena pesada, humanas, una región CDRl de cadena pesada humana, una región CDR2 de cadena pesada humana, y una región CDR3 de cadena pesada humana, en donde la región CDR3 de cadena pesada humana es la región CDR3 de cadena pesada de 16E1, 2D8, 22B3 ó 9H7 como se muestra en la Figura 15; y b. regiones de marco de cadena ligera, humana, una región CDRl de cadena ligera, humana, una región CDR2 de cadena ligera humana, y una región CDR3 de cadena ligera humana, en donde la región CDR3 de cadena ligera humana es la región CDR3 de cadena ligera de 16E1, 2D8, 22B3 ó 9H7 como se muestra en la Figura 16; en donde el anticuerpo se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
60. 60. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E del ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
61. 61. El anticuerpo humano aislado de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la región CDR2 de cadena pesada humana es la región CDR2 de cadena pesada de 16E1, 2D8, 22B3 ó 9H7 como se muestra en la Figura 15 y la región CDR2 de cadena ligera humana de la región CDR2 de cadena ligera de 16E1, 2D8, 22B3 ó 9H7 como se muestra en la Figura 16.
62. 62. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E del ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
63. 63. El anticuerpo humano aislado de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la región CDRl de cadena pesada humana es la región CDRl de cadena pesada de 16E1, 2D8, 22B3 ó 9H7 como se muestra en la Figura 15 y la región CDRl de cadena ligera humana es la región CDRl de cadena ligera de 16E1, 2D8, 22B3 ó 9H7 , como se muestra en la Figura 16.
64. 64. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a la región de asa de D-E del ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
65. 65. Un anticuerpo humano aislado, caracterizado porque comprende : a. regiones de marco de cadena pesada, humanas, una región CRDl de cadena pesada humana, una región CDR2 de cadena pesada humana, y una región CDR3 de cadena pesada humana, en donde la región CDR3 de cadena pesada humana es la región CDR3 de cadena pesada de 2E11 ó 18B2, como se muestra en la Figura 15; y b. regiones de marco de cadena ligera humana, una región CDRl de cadena ligera humana, una región CDR2 de cadena ligera humana, y una región CDR3 de cadena ligera humana, en donde la región CDR3 de cadena ligera humana es la región CDR3 de cadena ligera de 2E11 ó 18B2 como se muestra en la Figura 16; en donde el anticuerpo se une de manera específica al ligando de osteoprotegerina (OPGL) .
66. 66. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región de ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E, en donde la unión es consecutiva o simultánea.
67. 67. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la unión tanto a una región de OPGL está fuera de la región de asa de D-E y toda una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea .
68. 68. El anticuerpo humano aislado de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la región CDR2 de cadena pesada humana es la región CDR2 de cadena pesada de 2E11 ó 18B2 como se muestra en la Figura 15 y la región CDR2 de cadena ligera humana es la región CDR2 de cadena ligera de 2E11 ó 18B2 como se muestra en la Figura 16.
69. 69. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a: a. una región de ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E, en donde la unión es consecutiva o simultánea.
70. 70. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la unión tanto a una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E como toda o una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea.
71. 71. El anticuerpo humano aislado de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la región CDR1 de cadena pesada humana es la región CDR1 de cadena pesada de 2E11 ó 18B2 como se muestra en la Figura 15 y la región CDR1 de cadena ligera humana en la región CDR1 de cadena ligera de 2E11 ó 18B2 como se muestra en la Figura 16.
72. 72. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el anticuerpo se une de manera específica a: a. una región del ligando de osteoprotegerina (OPGL) que está fuera de la región de asa de D-E; o b. tanto una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E como toda o una porción de la región de asa de D-E, donde la unión es consecutiva o simultánea.
73. 73. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la unión tanto a una región de OPGL que está fuera de la región de asa de D-E y toda o una porción de la región de asa de D-E es consecutiva o simultánea.